RU2716574C1 - Method for adrift freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 °c with a solution of hemodiolite - Google Patents
Method for adrift freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 °c with a solution of hemodiolite Download PDFInfo
- Publication number
- RU2716574C1 RU2716574C1 RU2019101883A RU2019101883A RU2716574C1 RU 2716574 C1 RU2716574 C1 RU 2716574C1 RU 2019101883 A RU2019101883 A RU 2019101883A RU 2019101883 A RU2019101883 A RU 2019101883A RU 2716574 C1 RU2716574 C1 RU 2716574C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stage
- minus
- freezing
- holder
- freezer
- Prior art date
Links
- 238000007710 freezing Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000008014 freezing Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- FWQTWRXMADAWFI-UHFFFAOYSA-N 5-[3-hydroxy-2-methyl-5-(phosphonooxymethyl)pyridin-4-yl]pyrrolidine-2,4,4-tricarboxylic acid Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C2C(CC(N2)C(O)=O)(C(O)=O)C(O)=O)=C1O FWQTWRXMADAWFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000698776 Duma Species 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004836 hexamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) с комбинированным криоконсервантом Гекмодиолит (дальше - ГД)* (*Гекмодиолит (ГД) - комбинирований криоконсервант для замораживания ГСК костного мозга млекопитающих при низкой температуре (Костяев А.А. Автореф. дис. … докт. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2003. - С.4, 5, 6, 8, 14 и др.)) на основе гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) 20,0-40,0 и α-пропиленгликоля (1,2-ПД) 1,0-2,0; кроме того, в составе ГД динатриевая соль ЭДТА 0,05-0,15; лимонная кислота 0,5-1,5; бидистиллированная вода - Остальное. Имеет рН - 7,0-7,3 (см. патент RU №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995), и может быть использовано в гематологических и онкологических центрах для лечения больных трансплантацией консервированных КППК. Включает выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом ГД в равных пропорциях в полимерном криопакете (ПК), его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (TA), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с TA плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем проводят размораживание биообъекта. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ обеспечивает высокую сохранность морфологической и функциональной полноценности деконсервированных КППК после 100 суток хранения. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность готового криоконсерванта, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и удобен для применения (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - 80 с.).The invention relates to medicine, namely to the technology of freezing peripheral blood precursor cells (CPPK) with the combined cryopreservative Hekmodiolite (hereinafter - HD) * (* Hekmodiolite (HD) - combinations of cryopreservative for freezing mammalian bone marrow HSC at low temperature (Kostyaev A. A. Abstract of thesis ... doctor of medical sciences - St. Petersburg, 2003. - P. 4, 5, 6, 8, 14, etc.)) based on hexamethylene bistetraoxyethylurea (GMBTOEM) 20,0-40,0 and α-propylene glycol (1,2-PD) 1.0-2.0; in addition, in the composition of the State Duma the disodium salt of EDTA is 0.05-0.15; citric acid 0.5-1.5; bidistilled water - The rest. It has a pH of 7.0-7.3 (see RU patent No. 1772911 dated 06/17/1993. Publish. 04/10/1995), and can be used in hematological and oncological centers for the treatment of patients with canned CPPT transplantation. It includes the isolation of freshly prepared nuclear cell concentrate (QFC), mixing of QQ with a cryopreservative of HD in equal proportions in a polymer cryopackage (PC), its sealing, labeling, packing of PCs in a metal pencil holder, stage-by-stage freezing of KPPK in the presence of HD from + 4 ° С to minus 80 ° C according to a three-stage program in electric refrigerators with a set temperature of isothermal cold adaptation of cells (T A ), and at the first stage of freezing, the holder with CPPP is placed for 10 min in an electric freezer with T A plus 4 ± 1 ° С, at the second stage, the holder is transferred for 10 minutes to an electric freezer with T A minus 7 ± 1 ° C, at the third stage, the holder is transferred to an electric freezer with T A minus 28 ± 1 ° C, kept under these conditions for 25 minutes, and then transferred to storage - a freezer with a temperature of minus 80 ± 2 ° С for complete freezing of cell suspension and long-term preservation, then a biological object is thawed. Defrosting is carried out by shaking the PC in a 20-liter aqueous medium with a temperature of plus 39 ° C for 20-25 seconds to a temperature of plus 2 ° C in a cell suspension. Technical result: the method provides high preservation of the morphological and functional usefulness of the deconserved KPPK after 100 days of storage. The presence in the cryopreservative of HD of two low toxicity cryophylactics with different mechanisms of action on the body and nuclear cells - endo-exocellular HMBTOEM and exocellular α-propylene glycol (1,2-PD) minimizes the toxicity of the finished cryopreservative, does not require washing it from the defrosted K application (Swedentsov EP Cryopreservatives for living cells. - Syktyvkar, 210. - 80 p.).
Изобретение относится к медицине, а именно способам криоконсервирования КППК, и может найти применение в центрах лечения больных с депрессией кроветворения различного генеза. Важными составляющими в повышении эффективности замораживания КППК во всем мире являются сохранность большого процента гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), безвредность, простота выполнения и экономичность медикотехнической процедуры в целом.The invention relates to medicine, namely to methods for cryopreservation of CPPP, and can find application in treatment centers for patients with hematopoietic depression of various origins. Important components in improving the efficiency of freezing CPPCs around the world are the safety of a large percentage of hematopoietic stem cells (HSCs), the safety, ease of implementation and the cost-effectiveness of the medical procedure as a whole.
В технологии замораживания КППК, костного мозга или эмбриональной кордовой крови известны способы их длительной консервации, например, техническое решение по RU 2624214 C1 03.07.2017 A01N 1/02, «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток». Опубл.: 03.07.2017 г., Бюл. №19, включающий смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ЯК в полимерном криопакете, холодовую адаптацию при температуре плюс 4°С в течение 10 мин, замораживание смеси от плюс 4°С до минус 80°С в режиме быстрой двухступенчатой программы в хладоагенте из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой плюс 4±1°С и минус 28±1°С. Недостатками такого способа криоконсервирования ГСК являются использование токсичного криопротектора ДМСО, трудоемкость медицинской технологии и другие факторы.Methods for their long-term preservation are known in the technology for freezing CPPP, bone marrow or embryonic cord blood, for example, technical solution according to RU 2624214 C1 07/03/2017 A01N 1/02, "Method for the cryopreservation of hematopoietic stem cells". Published: 07/03/2017, Bull. No. 19, including mixing a cryoprotective 10% DMSO solution with UC concentrate in a polymer cryopack, cold adaptation at a temperature of plus 4 ° C for 10 min, freezing the mixture from plus 4 ° C to minus 80 ° C in a fast two-stage program in a refrigerant from dry disinfected Lab Armor thermogranules with the set temperature plus 4 ± 1 ° С and minus 28 ± 1 ° С. The disadvantages of this method of cryopreservation of HSCs are the use of toxic cryoprotectant DMSO, the complexity of medical technology and other factors.
За прототип взят патент RU №1772911 С от 10.04.1995 г. МПК6 A01N 1/02 «Раствор для консервирования костного мозга млекопитающих при низкой температуре», в котором используется криоконсервант одинакового с заявляемым изобретением состава (содержит в основе ГМБТОЭМ и α-пропиленгликоль (1,2-ПД); предусматривает смешивание криоконсерванта с КЯК в ПК в соотношении 1:1, выдерживание при комнатной температуре в течение 20 мин, замораживание в жидкоазотном программном замораживателе по трехступенчатой программе до минус 80°С со скоростью: на первом этапе - минус 1°С/мин до минус 7°С, на втором - минус 10°С/мин до минус 40°С и на третьем - минус 20°С/мин до минус 90°С, после чего подвергают длительному хранению в этих условиях с последующим размораживанием. Обеспечивает сохранность 92% ядросодержащих клеточных элементов (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - С. 61).The patent RU No. 1772911 C dated 04/10/1995, IPC 6 A01N 1/02 “Solution for preserving the bone marrow of mammals at low temperature”, which uses a cryopreservative of the same composition as the claimed invention (contains GMBTOEM and α-propylene glycol, is used as a prototype) (1,2-ПД); provides for mixing a cryopreservative with QNK in a PC in the ratio 1: 1, keeping at room temperature for 20 minutes, freezing in a liquid-nitrogen program freezer according to a three-stage program to minus 80 ° С at a speed of: at the first stage - minus 1 ° C / min to minus 7 ° C, on the second - minus 10 ° C / min to minus 40 ° C and on the third - minus 20 ° C / min to minus 90 ° C, and then subjected to long-term storage under these conditions with defrosting ensures the safety of 92% of nucleated cells (Swedentsov EP Cryopreservatives for living cells. - Syktyvkar, 210. - P. 61).
Недостатками такой технологии замораживания КППК являются: потребность в дефицитном, токсичном жидком азоте, сложности при работе с криогенной техникой, человеческий фактор, риск инфицирования обслуживающего персонала.The disadvantages of such a technology for freezing KPPK are: the need for scarce, toxic liquid nitrogen, difficulties when working with cryogenic equipment, the human factor, the risk of infection of maintenance personnel.
Целью изобретения является исключение из технологии криоконсервирования КППК вредного для здоровья жидкого азота, снижение влияния негативного человеческого фактора, повышение сохранности деконсервированных ЯК.The aim of the invention is the exclusion from the technology of cryopreservation KPPK harmful to health liquid nitrogen, reducing the impact of negative human factors, increasing the safety of deconserved UC.
Этот результат достигается тем, что суспензию клеток в присутствии раствора криоконсерванта ГД в пластиковом криопакете герметизируют, помещают в пенал-холдер и замораживают от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной TA, причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с ТА плюс 4±1°С, на втором этапе переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электрический морозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, а затем переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем биообъект размораживают. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ способствует лучшим результатам криоконсервации КППК. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность криоконсерванта ГД, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и делает удобным для практического применения.This result is achieved by the fact that the cell suspension in the presence of a solution of cryopreservative HD in a plastic cryopackage is sealed, placed in a pencil holder and frozen from plus 4 ° C to minus 80 ° C according to a three-stage program in electric refrigerators with installed T A , and at the first stage freezing a holder with a CPPP is placed for 10 min in an electric refrigerator with T A plus 4 ± 1 ° C, in the second stage it is transferred for 10 min to an electric freezer with T A minus 7 ± 1 ° C, in the third stage the holder is transferred to an electric freezer with T A minus 28 ± 1 ° C, in It is kept under these conditions for 25 minutes, and then transferred to the storage - freezer with a temperature of minus 80 ± 2 ° С for complete freezing of the cell suspension and long-term preservation, then the bioobject is thawed. Defrosting is carried out by shaking the PC in a 20-liter aqueous medium with a temperature of plus 39 ° C for 20-25 seconds to a temperature of plus 2 ° C in a cell suspension. Technical result: the method contributes to better results of cryopreservation of KPPK. The presence in the cryopreservative of HD of two low toxicity cryophylactics with different mechanisms of action on the body and nuclear cells - endoexocellular HMBTOEM and exocellular α-propylene glycol (1,2-PD) minimizes the toxicity of the cryopreservation of HD, does not require washing it from the defrosted K and transplant for practical use.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - предоперационное охлаждение приготовленного криоконсерванта ГД в электрическом холодильнике до плюс 4°С; Б - выделение свежезаготоаленного КЯК; В - смешивание КЯК с ГД в КП в равных пропорциях в ПК; герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной ТА; Д - полное замораживание клеточной взвеси и длительная консервация при температуре минус 80°С, Е - размораживание биообъекта в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси.The essential features of the proposed method, which coincide with the known features, are: A - preoperative cooling of the prepared cryopreservative HD in an electric refrigerator to plus 4 ° C; B - the allocation of freshly prepared QAC; B - mixing QAC with the main engine in the KP in equal proportions in the PC; sealing, certification, laying of PCs in a metal pencil holder, stage-by-stage freezing of the KPPK in the presence of high pressure from + 4 ° С to minus 80 ° С according to a three-stage program in electric refrigerators with installed T A ; D - complete freezing of the cell suspension and long-term preservation at a temperature of minus 80 ° C, E - defrosting of the biological object in a 20-liter aqueous medium with a temperature of plus 39 ° C for 20-25 seconds to a temperature of + 2 ° C in the cell suspension.
Существенными отличительными признаками заявляемого способа замораживания КППК являются: Д - исключение из технологии криоконсервирования КППК хладоагента жидкого азота, Е - использование для холодовой адаптации смеси КЯК с ГД в качестве хладоагента морозильной камеры электрохолодильника с регулируемой TA; И - снижение влияния негативного человеческого фактора; К - повышение сохранности деконсервированных ЯК.Salient features of the proposed method for freezing KPPK are: D - the exception from the technology of cryopreservation of KPPK of the refrigerant liquid nitrogen, E - the use for the cold adaptation of the mixture of QAC with HD as a coolant in the freezer of an electric refrigerator with adjustable T A ; And - reducing the impact of negative human factors; K - increase the safety of deconserved UC.
Пример выполнения заявляемого способа замораживания КППК: производят охлаждение ГД в электрохолодильнике при температуре плюс 4±°С, заготовку концентрата ядерных клеток (КЯК) в полимерный криопакет (ПК), смешивание КЯК с криоконсервантом в ПК в соотношении 1:1, герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной TA: плюс 4±1°С, минус 7±1°С; минус 28±1°С. На первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с TA плюс 4±1°С, на втором - переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем - холдер переносят в электрический морозильник с ТА минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Берут пробы размороженного клеточного материала одноразовым шприцем для контрольных морфологических и функциональных тестов.An example of the implementation of the proposed method of freezing KPPK: they perform the cooling of the main cylinder in an electric refrigerator at a temperature of + 4 ± ° C, the preparation of nuclear cell concentrate (QW) in a polymer cryopackage (PC), mixing QW with a cryopreservative in PC in a ratio of 1: 1, sealing, certification, placing the PC in a metal pencil holder, stage-by-stage freezing of KPPK in the presence of high pressure from plus 4 ° С to minus 80 ° С according to a three-stage program in electric refrigerators with installed T A : plus 4 ± 1 ° С, minus 7 ± 1 ° С; minus 28 ± 1 ° C. At the first stage of freezing, the holder with the PPC is placed for 10 minutes in an electric refrigerator with T A plus 4 ± 1 ° C, at the second stage it is transferred for 10 minutes to an electric freezer with T A minus 7 ± 1 ° C, at the third stage the holder is transferred to electric a freezer with TA minus 28 ± 1 ° C, is kept under these conditions for 25 minutes, and then transferred to the storage - a freezer with a temperature of minus 80 ± 2 ° C for complete freezing of the cell suspension and long-term preservation. Defrosting is carried out by shaking the PC in a 20-liter aqueous medium with a temperature of plus 39 ° C for 20-25 seconds to a temperature of plus 2 ° C in a cell suspension. Samples of thawed cell material are taken with a disposable syringe for control morphological and functional tests.
Сравнительный анализ результатов замораживания КППК с ГСК известным и заявляемым способами представлен в табл.1.A comparative analysis of the results of freezing KPPK with HSC known and claimed methods are presented in table 1.
Использование технического решения «Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови» с раствором Гекмодиолит при температуре минус 80°С по сравнению с прототипом позволяет исключить осложнения криогенной природы, обеспечивает сохранность до 90,71% ядерных клеток, из которых насчитывается до 92,30% - эозинорезистентных и 87,63% - CD34+ клеток. Техническое решение доступно и безопасно при реализации в центрах, использующих трансплантации замороженных КППК.Using the technical solution "Method of freezing peripheral blood precursor cells" with a solution of Hekmodiolite at a temperature of minus 80 ° C in comparison with the prototype allows to exclude complications of a cryogenic nature, ensures the safety of up to 90.71% of nuclear cells, of which up to 92.30% are eosin-resistant and 87.63% - CD34 + cells. The technical solution is available and safe when implemented in centers using transplantation of frozen KPPK.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа замораживания КППК.When using funds of scientific and technical literature, equivalent solutions were not found, which confirms the novelty of the proposed method of freezing KPPK.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.The use of simple techniques and available equipment confirms industrial applicability.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.The non-obviousness and original approach to solving the problem confirms the inventive step.
Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».The studies were performed on the basis of the laboratory of cellular technologies of the Federal State Budget Scientific Institution Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion FMBA of Russia.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019101883A RU2716574C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Method for adrift freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 °c with a solution of hemodiolite |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019101883A RU2716574C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Method for adrift freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 °c with a solution of hemodiolite |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2716574C1 true RU2716574C1 (en) | 2020-03-12 |
Family
ID=69898793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019101883A RU2716574C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Method for adrift freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 °c with a solution of hemodiolite |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2716574C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144290C1 (en) * | 1998-08-26 | 2000-01-20 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method of bone marrow preservation |
| RU2464991C1 (en) * | 2011-07-15 | 2012-10-27 | Учреждение Российской академии наук Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН | Frost protection solution for nuclear blood cell freezing |
| RU2554405C2 (en) * | 2012-03-22 | 2015-06-27 | Борис Лаврович Макеев | Method for cryogenic preservation of haematopoietic umbilical cord stem cells |
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| RU2639892C1 (en) * | 2017-07-05 | 2017-12-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for human nucleated blood cells cryopreservation at temperature of minus 80°c |
-
2019
- 2019-01-24 RU RU2019101883A patent/RU2716574C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144290C1 (en) * | 1998-08-26 | 2000-01-20 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method of bone marrow preservation |
| RU2464991C1 (en) * | 2011-07-15 | 2012-10-27 | Учреждение Российской академии наук Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН | Frost protection solution for nuclear blood cell freezing |
| RU2554405C2 (en) * | 2012-03-22 | 2015-06-27 | Борис Лаврович Макеев | Method for cryogenic preservation of haematopoietic umbilical cord stem cells |
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| RU2639892C1 (en) * | 2017-07-05 | 2017-12-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for human nucleated blood cells cryopreservation at temperature of minus 80°c |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108207930B (en) | A kind of cocktail type cryoprotectant and its application | |
| CA2719806A1 (en) | Method, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue | |
| RU2416197C1 (en) | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood | |
| CN103548814B (en) | Non-programmable-controlled cooling cryopreservation method and protection agent for hematopoietic stem cells at minus 80DEG C | |
| RU2624214C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| JP2024098028A (en) | Compositions for transport and/or cryopreservation of cells and/or tissues | |
| Bissoyi et al. | Effects of non-toxic cryoprotective agents on the viability of cord blood derived MNCs | |
| Matsumoto et al. | Successful liquid storage of peripheral blood stem cells at subzero non-freezing temperature | |
| CN113490414B (en) | Stem Cell Preservation | |
| RU2716574C1 (en) | Method for adrift freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 °c with a solution of hemodiolite | |
| Choudhery et al. | Stem cell banking of adipose tissue | |
| RU2639892C1 (en) | Method for human nucleated blood cells cryopreservation at temperature of minus 80°c | |
| RU2184449C1 (en) | Cryoprotective solution to freeze leucocytes at moderate-low temperature | |
| CN111972397A (en) | Skin cold storage preservation solution and application thereof | |
| RU2711152C1 (en) | Method for unstructured freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c with a hemicolite solution | |
| RU2563117C1 (en) | Combination cryoprotector "dimethyl sulphoxide/rheopolyglucin" for stem cell cryopreservation and method for cryopreservation thereof for clinical applications | |
| Reddoch‐Cardenas et al. | Novel anticoagulant‐preservative solution maintained the hemostatic function of cold stored whole blood for 56 days | |
| RU2263448C1 (en) | Method of cryopreservation of umbilical blood | |
| RU2720771C1 (en) | Method for unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at temperature of minus 80 °c with gemgel solution | |
| RU2230454C2 (en) | Cold-safety solution for freezing platelets at moderately low temperature | |
| NL2034495B1 (en) | Stem cell cryopreservation protective agent, preparation method, and application thereof | |
| RU2707921C1 (en) | Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid | |
| RU2569834C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| RU2158759C2 (en) | Method for storing cellular cultures in suspension | |
| RU2621295C2 (en) | Solution for cell suspensions preservation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210125 |