[go: up one dir, main page]

RU2716574C1 - Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гекмодиолит - Google Patents

Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гекмодиолит Download PDF

Info

Publication number
RU2716574C1
RU2716574C1 RU2019101883A RU2019101883A RU2716574C1 RU 2716574 C1 RU2716574 C1 RU 2716574C1 RU 2019101883 A RU2019101883 A RU 2019101883A RU 2019101883 A RU2019101883 A RU 2019101883A RU 2716574 C1 RU2716574 C1 RU 2716574C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
stage
minus
freezing
holder
freezer
Prior art date
Application number
RU2019101883A
Other languages
English (en)
Inventor
Андрей Александрович Костяев
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства"
Priority to RU2019101883A priority Critical patent/RU2716574C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2716574C1 publication Critical patent/RU2716574C1/ru

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10Preservation of living parts
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к консервированию культуры клеток. Для замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) производят выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом Гекмодиолит (ГД) в полимерном криопакете (ПК) в равных пропорциях, его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (T), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с Tплюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с Tминус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с Tминус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Изобретение позволяет повысить сохранность ядерных клеток. 1 табл. 1 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) с комбинированным криоконсервантом Гекмодиолит (дальше - ГД)* (*Гекмодиолит (ГД) - комбинирований криоконсервант для замораживания ГСК костного мозга млекопитающих при низкой температуре (Костяев А.А. Автореф. дис. … докт. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2003. - С.4, 5, 6, 8, 14 и др.)) на основе гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) 20,0-40,0 и α-пропиленгликоля (1,2-ПД) 1,0-2,0; кроме того, в составе ГД динатриевая соль ЭДТА 0,05-0,15; лимонная кислота 0,5-1,5; бидистиллированная вода - Остальное. Имеет рН - 7,0-7,3 (см. патент RU №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995), и может быть использовано в гематологических и онкологических центрах для лечения больных трансплантацией консервированных КППК. Включает выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом ГД в равных пропорциях в полимерном криопакете (ПК), его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (TA), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с TA плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем проводят размораживание биообъекта. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ обеспечивает высокую сохранность морфологической и функциональной полноценности деконсервированных КППК после 100 суток хранения. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность готового криоконсерванта, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и удобен для применения (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - 80 с.).
Изобретение относится к медицине, а именно способам криоконсервирования КППК, и может найти применение в центрах лечения больных с депрессией кроветворения различного генеза. Важными составляющими в повышении эффективности замораживания КППК во всем мире являются сохранность большого процента гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), безвредность, простота выполнения и экономичность медикотехнической процедуры в целом.
В технологии замораживания КППК, костного мозга или эмбриональной кордовой крови известны способы их длительной консервации, например, техническое решение по RU 2624214 C1 03.07.2017 A01N 1/02, «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток». Опубл.: 03.07.2017 г., Бюл. №19, включающий смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ЯК в полимерном криопакете, холодовую адаптацию при температуре плюс 4°С в течение 10 мин, замораживание смеси от плюс 4°С до минус 80°С в режиме быстрой двухступенчатой программы в хладоагенте из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой плюс 4±1°С и минус 28±1°С. Недостатками такого способа криоконсервирования ГСК являются использование токсичного криопротектора ДМСО, трудоемкость медицинской технологии и другие факторы.
За прототип взят патент RU №1772911 С от 10.04.1995 г. МПК6 A01N 1/02 «Раствор для консервирования костного мозга млекопитающих при низкой температуре», в котором используется криоконсервант одинакового с заявляемым изобретением состава (содержит в основе ГМБТОЭМ и α-пропиленгликоль (1,2-ПД); предусматривает смешивание криоконсерванта с КЯК в ПК в соотношении 1:1, выдерживание при комнатной температуре в течение 20 мин, замораживание в жидкоазотном программном замораживателе по трехступенчатой программе до минус 80°С со скоростью: на первом этапе - минус 1°С/мин до минус 7°С, на втором - минус 10°С/мин до минус 40°С и на третьем - минус 20°С/мин до минус 90°С, после чего подвергают длительному хранению в этих условиях с последующим размораживанием. Обеспечивает сохранность 92% ядросодержащих клеточных элементов (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - С. 61).
Недостатками такой технологии замораживания КППК являются: потребность в дефицитном, токсичном жидком азоте, сложности при работе с криогенной техникой, человеческий фактор, риск инфицирования обслуживающего персонала.
Целью изобретения является исключение из технологии криоконсервирования КППК вредного для здоровья жидкого азота, снижение влияния негативного человеческого фактора, повышение сохранности деконсервированных ЯК.
Этот результат достигается тем, что суспензию клеток в присутствии раствора криоконсерванта ГД в пластиковом криопакете герметизируют, помещают в пенал-холдер и замораживают от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной TA, причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с ТА плюс 4±1°С, на втором этапе переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электрический морозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, а затем переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем биообъект размораживают. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ способствует лучшим результатам криоконсервации КППК. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность криоконсерванта ГД, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и делает удобным для практического применения.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - предоперационное охлаждение приготовленного криоконсерванта ГД в электрическом холодильнике до плюс 4°С; Б - выделение свежезаготоаленного КЯК; В - смешивание КЯК с ГД в КП в равных пропорциях в ПК; герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной ТА; Д - полное замораживание клеточной взвеси и длительная консервация при температуре минус 80°С, Е - размораживание биообъекта в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси.
Существенными отличительными признаками заявляемого способа замораживания КППК являются: Д - исключение из технологии криоконсервирования КППК хладоагента жидкого азота, Е - использование для холодовой адаптации смеси КЯК с ГД в качестве хладоагента морозильной камеры электрохолодильника с регулируемой TA; И - снижение влияния негативного человеческого фактора; К - повышение сохранности деконсервированных ЯК.
Пример выполнения заявляемого способа замораживания КППК: производят охлаждение ГД в электрохолодильнике при температуре плюс 4±°С, заготовку концентрата ядерных клеток (КЯК) в полимерный криопакет (ПК), смешивание КЯК с криоконсервантом в ПК в соотношении 1:1, герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной TA: плюс 4±1°С, минус 7±1°С; минус 28±1°С. На первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с TA плюс 4±1°С, на втором - переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем - холдер переносят в электрический морозильник с ТА минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Берут пробы размороженного клеточного материала одноразовым шприцем для контрольных морфологических и функциональных тестов.
Сравнительный анализ результатов замораживания КППК с ГСК известным и заявляемым способами представлен в табл.1.
Figure 00000001
Использование технического решения «Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови» с раствором Гекмодиолит при температуре минус 80°С по сравнению с прототипом позволяет исключить осложнения криогенной природы, обеспечивает сохранность до 90,71% ядерных клеток, из которых насчитывается до 92,30% - эозинорезистентных и 87,63% - CD34+ клеток. Техническое решение доступно и безопасно при реализации в центрах, использующих трансплантации замороженных КППК.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа замораживания КППК.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.
Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Claims (1)

  1. Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови, включающий выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом Гекмодиолит (ГД) в полимерном криопакете (ПК) в равных пропорциях, его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание клеток-предшественников периферической крови (КППК) в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (TA), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с TA плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации.
RU2019101883A 2019-01-24 2019-01-24 Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гекмодиолит RU2716574C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019101883A RU2716574C1 (ru) 2019-01-24 2019-01-24 Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гекмодиолит

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019101883A RU2716574C1 (ru) 2019-01-24 2019-01-24 Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гекмодиолит

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2716574C1 true RU2716574C1 (ru) 2020-03-12

Family

ID=69898793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019101883A RU2716574C1 (ru) 2019-01-24 2019-01-24 Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гекмодиолит

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2716574C1 (ru)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2144290C1 (ru) * 1998-08-26 2000-01-20 Кировский НИИ гематологии и переливания крови Способ консервирования костного мозга
RU2464991C1 (ru) * 2011-07-15 2012-10-27 Учреждение Российской академии наук Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН Хладоограждающий раствор для замораживания ядерных клеток крови
RU2554405C2 (ru) * 2012-03-22 2015-06-27 Борис Лаврович Макеев Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
RU2624214C1 (ru) * 2016-04-28 2017-07-03 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток
RU2639892C1 (ru) * 2017-07-05 2017-12-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека при температуре минус 80оС

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2144290C1 (ru) * 1998-08-26 2000-01-20 Кировский НИИ гематологии и переливания крови Способ консервирования костного мозга
RU2464991C1 (ru) * 2011-07-15 2012-10-27 Учреждение Российской академии наук Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН Хладоограждающий раствор для замораживания ядерных клеток крови
RU2554405C2 (ru) * 2012-03-22 2015-06-27 Борис Лаврович Макеев Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
RU2624214C1 (ru) * 2016-04-28 2017-07-03 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток
RU2639892C1 (ru) * 2017-07-05 2017-12-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека при температуре минус 80оС

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108207930B (zh) 一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用
CA2719806A1 (en) Method, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue
RU2416197C1 (ru) Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
CN103548814B (zh) 造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂
RU2624214C1 (ru) Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток
JP2024098028A (ja) 細胞および/または組織の輸送用組成物および/または凍結保存用組成物
Bissoyi et al. Effects of non-toxic cryoprotective agents on the viability of cord blood derived MNCs
Matsumoto et al. Successful liquid storage of peripheral blood stem cells at subzero non-freezing temperature
CN113490414B (zh) 干细胞的保存
RU2716574C1 (ru) Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гекмодиолит
RU2543534C2 (ru) Способ криоконсервирования лейкоцитов с ксеноном
Choudhery et al. Stem cell banking of adipose tissue
RU2639892C1 (ru) Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека при температуре минус 80оС
RU2184449C1 (ru) Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре
CN111972397A (zh) 一种皮肤冷藏保存液及其应用
RU2711152C1 (ru) Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80 oC с раствором Гекмолит
Reddoch‐Cardenas et al. Novel anticoagulant‐preservative solution maintained the hemostatic function of cold stored whole blood for 56 days
RU2263448C1 (ru) Способ криоконсервирования пуповинной крови
RU2720771C1 (ru) Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС с раствором Гемжел
RU2230454C2 (ru) Хладоограждающий раствор для замораживания тромбоцитов при умеренно-низкой температуре
RU2707921C1 (ru) Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80оС под защитой диметилсульфоксида
RU2569834C1 (ru) Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток
RU2158759C2 (ru) Способ хранения клеточных культур в суспензии
RU2621295C2 (ru) Раствор для консервирования клеточных взвесей
CN108094410A (zh) 一种皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20210125