RU2563117C1 - Combination cryoprotector "dimethyl sulphoxide/rheopolyglucin" for stem cell cryopreservation and method for cryopreservation thereof for clinical applications - Google Patents
Combination cryoprotector "dimethyl sulphoxide/rheopolyglucin" for stem cell cryopreservation and method for cryopreservation thereof for clinical applications Download PDFInfo
- Publication number
- RU2563117C1 RU2563117C1 RU2014152389/15A RU2014152389A RU2563117C1 RU 2563117 C1 RU2563117 C1 RU 2563117C1 RU 2014152389/15 A RU2014152389/15 A RU 2014152389/15A RU 2014152389 A RU2014152389 A RU 2014152389A RU 2563117 C1 RU2563117 C1 RU 2563117C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cryopreservation
- dmso
- stem cells
- cryoprotector
- stem cell
- Prior art date
Links
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 86
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 title 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 33
- 238000010257 thawing Methods 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 8
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- QMGALPCDHIETLP-SZRPRPAPSA-N OP(O)(O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O Chemical compound OP(O)(O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O QMGALPCDHIETLP-SZRPRPAPSA-N 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000005496 eutectics Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в работе банков стволовых клеток для клинического применения.The invention relates to medicine and can be used in the work of stem cell banks for clinical use.
Одним из наиболее перспективных направлений является поиск оптимального комбинированного криопротектора, способного сохранить стволовые клетки из различных источников (пуповинная/периферическая кровь, костный мозг, плацента и др.) для дальнейшего клинического применения.One of the most promising areas is the search for an optimal combined cryoprotectant that can save stem cells from various sources (cord / peripheral blood, bone marrow, placenta, etc.) for further clinical use.
Для длительного хранения заготовленных образцов стволовых клеток из различных источников (например, гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), мезенхимальных стволовых клеток или др.) необходимо применение методов криоконсервации. Криоконсервация (воздействие низких температур) - это комплекс мероприятий, обеспечивающих хранение биологических объектов при сверхнизких температурах, с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания. Этапы замораживания и размораживания клеточных концентратов являются наиболее ответственными моментами для сохранения стволовых клеток в жизнеспособном состоянии.For long-term storage of prepared stem cell samples from various sources (for example, hematopoietic stem cells (HSC), mesenchymal stem cells, etc.), the use of cryopreservation methods is necessary. Cryopreservation (exposure to low temperatures) is a set of measures ensuring the storage of biological objects at extremely low temperatures, with the possibility of restoring their biological functions after thawing. The stages of freezing and thawing of cell concentrates are the most critical moments for maintaining stem cells in a viable state.
Даже простое охлаждение клетки до 0°C существенно ограничивает время ее жизни, что обусловлено изменениями фазового состояния липидов в клеточной мембране, изменением pН среды, выключением «Na-насоса» и набуханием клеток. И только использование сверхнизких температур с соблюдением точных режимов охлаждения позволяет обратимо приостановить все биохимические процессы в клетке.Even a simple cooling of a cell to 0 ° C significantly limits its lifetime, which is due to changes in the phase state of lipids in the cell membrane, a change in the pH of the medium, the shutdown of the Na pump and cell swelling. And only the use of ultra-low temperatures with the observance of precise cooling regimes allows reversibly suspend all biochemical processes in the cell.
Поэтому разработка и усовершенствование методов криоконсервации стволовых клеток являются наиболее актуальными задачами.Therefore, the development and improvement of stem cell cryopreservation methods are the most urgent tasks.
В период криоконсервации факторами, ответственными за развитие различных криоповреждений, являются:During the period of cryopreservation, the factors responsible for the development of various cryo-injuries are:
1. образование кристаллов льда и их размеры (фаза кристаллизации);1. the formation of ice crystals and their sizes (crystallization phase);
2. обезвоживание клетки;2. cell dehydration;
3. осмотический шок из-за увеличения концентрации электролитов в клетке.3. osmotic shock due to an increase in the concentration of electrolytes in the cell.
На сегодняшний день оптимальной температурой для длительного хранения стволовых клеток принята температура жидкого азота от -80° до -196°C.Today, the temperature of liquid nitrogen from -80 ° to -196 ° C is accepted as the optimum temperature for long-term storage of stem cells.
Под воздействием данных факторов в клетке возникают первичные криоповреждения, заключающиеся в изменении формы и размера клеток, нарушении целостности мембраны, изменении конформации макромолекул.Under the influence of these factors, primary cryo-injuries occur in the cell, consisting in a change in the shape and size of cells, a violation of the integrity of the membrane, and a change in the conformation of macromolecules.
В процессе рекристаллизации и оттаивания первичные криоповреждения могут явиться причиной вторичных изменений, которые, в свою очередь, вызовут лизис клетки и приведут к несостоятельности трансплантата.In the process of recrystallization and thawing, primary cryo-damage can cause secondary changes, which, in turn, will cause cell lysis and lead to graft failure.
Однако, несмотря на существующие проблемы, в настоящее время удается успешно замораживать и размораживать стволовые клетки, сохраняя при этом их биологические свойства. Это обеспечивается проведением ряда мероприятий по подготовке пуповинной крови перед криоконсервацией:However, despite the existing problems, it is now possible to successfully freeze and thaw stem cells, while maintaining their biological properties. This is ensured by a series of measures for the preparation of cord blood before cryopreservation:
- введение комбинированных криопротекторов;- the introduction of combined cryoprotectants;
- соблюдение методов замораживания и размораживания;- Compliance with the methods of freezing and thawing;
- соблюдение строгих температурных режимов хранения криоконсервированных образцов пуповинной крови.- compliance with strict temperature conditions for storage of cryopreserved cord blood samples.
Криопротекторы - это вещества с низкой температурой замерзания, которые способны предупреждать развитие криоповреждений в клетке. Молекулы криопротекторов начинают взаимодействовать с мембранами стволовых клеток уже при комнатной температуре, приводя к изменению их физико-химических характеристик и температуры главного фазового перехода. Также в присутствии криопротекторов отмечается понижение температуры, при которой регистрируется формирование внутриклеточного льда.Cryoprotectants are substances with a low freezing temperature that can prevent the development of cryogenic damage in the cell. Cryoprotectant molecules begin to interact with stem cell membranes already at room temperature, leading to a change in their physicochemical characteristics and the temperature of the main phase transition. Also, in the presence of cryoprotectants, a decrease in temperature is observed at which the formation of intracellular ice is recorded.
Основные механизмы действия всех криопротекторов обусловлены следующими феноменами:The main mechanisms of action of all cryoprotectants are due to the following phenomena:
- частичная осмотическая дегидратация клеток;- partial osmotic dehydration of cells;
- витрификация клеточной воды благодаря замедлению образования внутриклеточных кристаллов льда, что позволяет сохранить внутриклеточную воду при взаимодействии с макромолекулами, необходимую для их гидратации и стабилизации.- vitrification of cellular water by slowing down the formation of intracellular ice crystals, which allows you to save intracellular water when interacting with macromolecules, necessary for their hydration and stabilization.
Обязательные качества, которыми должны обладать криопротекторы при заготовке стволовых клеток, это:Mandatory qualities that cryoprotectants should possess when harvesting stem cells are:
1. безопасность по отношению к криоконсервированному материалу и биологическому объекту;1. safety in relation to cryopreserved material and biological object;
2. высокая гидрофильность;2. high hydrophilicity;
3. снижение количества вымораживаемой воды и предотвращение кристаллизации воды в криозащитной смеси;3. reducing the amount of frozen water and preventing crystallization of water in the cryoprotective mixture;
4. поддержание белков и солей в растворенном состоянии вплоть до эвтектического перехода в аморфное состояние.4. maintaining proteins and salts in a dissolved state until the eutectic transition to an amorphous state.
Все известные криопротекторы в зависимости от их молекулярной массы и способности проникать внутрь клетки разделены на экстра-, эндоцеллюлярные и смешанные. Выбор криопротектора зависит от его химического строения, типа криоконсервированных клеток и условий криоконсервации.All known cryoprotectants, depending on their molecular weight and ability to penetrate into the cells, are divided into extra-, endocellular and mixed. The choice of cryoprotectant depends on its chemical structure, type of cryopreserved cells and cryopreservation conditions.
Общепринятым криопротектором для стволовых клеток является эндоцеллюлярный криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО), который способен легко проникать через мембрану клеток и образовывать большое количество водородных связей с молекулами жидкой фазы клетки. Это приводит к снижению кристаллообразования внутри клетки, а также к снижению концентрации внутриклеточных солей при сверхнизких температурах, что уменьшает степень криоповреждения клетки. Его рекомендуют добавлять в клеточную суспензию при постоянной скорости и перемешивании непосредственно перед этапом замораживания. Это обеспечивает равномерное распределение криопротектора во всем объеме концентрата клеток и максимально сокращает время его контакта со стволовыми клетками. Для нейтрализации выделяющегося тепла в результате экзотермической реакции при введении ДМСО, клеточные концентраты рекомендовано охлаждать до температуры от 0 до 4°C.A common cryoprotectant for stem cells is the endocellular cryoprotector dimethyl sulfoxide (DMSO), which is able to easily penetrate through the cell membrane and form a large number of hydrogen bonds with the molecules of the liquid phase of the cell. This leads to a decrease in crystal formation inside the cell, as well as to a decrease in the concentration of intracellular salts at ultra-low temperatures, which reduces the degree of cryoamage of the cell. It is recommended to add to the cell suspension at a constant speed and stirring immediately before the freezing step. This ensures uniform distribution of the cryoprotectant in the entire volume of the cell concentrate and minimizes the time of its contact with stem cells. To neutralize the heat generated as a result of an exothermic reaction with the introduction of DMSO, it is recommended that cell concentrates be cooled to a temperature of 0 to 4 ° C.
Для реципиента ДМСО является относительно нетоксичным веществом. Однако, при увеличении его концентрации в конечном растворе возможно развитие токсических реакций у пациента. В литературе встречаются немногочисленные публикации, в которых описано развитие острых токсических реакций непосредственно на фоне инфузии или после введения размороженных стволовых клеток. В основном нежелательные симптомы были кратковременными и проявлялись в виде тошноты, рвоты, болей в животе, головокружения. В двух исследованиях были описаны случаи с развитием тяжелых неврологических осложнений (токсической комы) и случай со смертельным исходом, непосредственно связанным с введением ДМСО.For the recipient, DMSO is a relatively non-toxic substance. However, with an increase in its concentration in the final solution, the development of toxic reactions in the patient is possible. There are few publications in the literature that describe the development of acute toxic reactions directly on the background of infusion or after the introduction of thawed stem cells. Mostly undesirable symptoms were short-term and manifested in the form of nausea, vomiting, abdominal pain, dizziness. Two studies described cases with the development of severe neurological complications (toxic coma) and a fatal case directly related to the administration of DMSO.
В 2005 году были опубликованы результаты многоцентрового исследования трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток из 97 трансплантационных центров ЕВМТ, где сообщалось о развитии побочных эффектов после введения криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток в конечной концентрации ДМСО от 5-10%. Развитие тяжелых токсических осложнений было отмечено в 1 случае, что составило 2,1% от всех зарегистрированных случаев. В основном побочные эффекты наблюдались со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем (27% и 17% соответственно), нейро- и нефротоксичность были зарегистрированы в 5% случаев.In 2005, the results of a multicenter study of hematopoietic stem cell transplantation from 97 EBMT transplant centers were published, which reported the development of side effects after the introduction of cryopreserved hematopoietic stem cells in a final concentration of DMSO from 5-10%. The development of severe toxic complications was noted in 1 case, which amounted to 2.1% of all recorded cases. Generally, side effects were observed on the part of the cardiovascular and respiratory systems (27% and 17%, respectively), neuro- and nephrotoxicity were recorded in 5% of cases.
Для снижения токсичности ДМСО на организм пациента рядом авторов были проведены исследования по удалению ДМСО из криоконсервированной пуповинной крови непосредственно после ее размораживания различными методами, при этом была отмечена существенная потеря ГСК - до 30%.To reduce the toxicity of DMSO on the patient’s body, several authors conducted studies to remove DMSO from cryopreserved umbilical cord blood immediately after thawing it by various methods, while a significant loss of HSC was noted - up to 30%.
Для компенсации токсического действия и повышения цитопротективных свойств ДМСО необходим подбор оптимальной его концентрации, обеспечивающей максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на клетки.To compensate for the toxic effect and increase the cytoprotective properties of DMSO, it is necessary to select its optimal concentration, which provides maximum cryoprotective properties with minimal damage to the cells.
Наиболее безопасной и эффективной для криоконсервации стволовых клеток и применения в клинической практике признана 10% концентрация ДМСО в конечном растворе.The safest and most effective for cryopreservation of stem cells and their use in clinical practice is the 10% concentration of DMSO in the final solution.
Рядом авторов были проведены исследования по уменьшению конечной концентрации ДМСО. В результате данных работ было показано, что снижение концентрации ниже 7-5% способно привести к существенным потерям стволовых (в ряде исследований наблюдалась фатальная гибель клеток).Several authors have conducted studies to reduce the final concentration of DMSO. As a result of these studies, it was shown that a decrease in concentration below 7-5% can lead to significant stem losses (in a number of studies, fatal cell death was observed).
Вопрос об оптимальном составе комбинированных криоконсервирующих растворов ДМСО для хранения стволовых клеток в жидком азоте остается открытым. На сегодняшний день наиболее перспективным направлением является модификация методик криоконсервации стволовых клеток, направленная на уменьшение токсичности ДМСО за счет его сочетания с различными непроникающими криопротекторами (человеческий альбумин, аутологичная сыворотка, гидроксиэтилкрахмали др.).The question of the optimal composition of the combined cryopreservation DMSO solutions for storing stem cells in liquid nitrogen remains open. To date, the most promising direction is the modification of stem cell cryopreservation methods aimed at reducing the toxicity of DMSO due to its combination with various non-penetrating cryoprotectants (human albumin, autologous serum, hydroxyethyl starch, etc.).
Однако поскольку отсутствуют какие-либо нормативные документы по использованию ДМСО в качестве криопротектора, большинство исследователей разрабатывают свои собственные протоколы для криоконсервации стволовых клеток.However, since there are no regulatory documents on the use of DMSO as a cryoprotectant, most researchers are developing their own protocols for cryopreservation of stem cells.
Поэтому исследования, направленные на поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных материалов, которые обеспечивали бы достаточное количество и функциональную сохранность стволовых клеток после криохранения, остаются актуальными.Therefore, studies aimed at finding new optimal combined cryoprotectants using domestic materials that would ensure a sufficient number and functional safety of stem cells after cryopreservation remain relevant.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (RU 2416197, 20.04.2011), согласно которому проводят добавление криопротектора - 55% раствора диметилсульфоксида с 5% декстран 40 в концентрацию взвеси ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, размещенными в криопакете.The closest analogue of the claimed invention is a method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells (RU 2416197, 04/20/2011), according to which cryoprotectant is added - a 55% solution of dimethyl sulfoxide with 5% dextran 40 to a suspension concentration of nucleated cells with hematopoietic stem cells placed in cryopoietic stem cells placed in cryopoietic stem cells .
Недостатками прототипа являются использование декстрана с более высокой молекулярной массой, что приводит к развитию нежелательных побочных эффектов при размораживании клеток. Кроме того, использование высокой концентрации ДМСО в исходном растворе приводит к такому соотношению ДМСО и декстрана в конечном растворе, при котором удаление криопротектора при размораживании затруднено и приводит к гибели части деконсервированных клеток вследствие малого объема размораживаемой взвеси.The disadvantages of the prototype are the use of dextran with a higher molecular weight, which leads to the development of undesirable side effects when thawing cells. In addition, the use of a high concentration of DMSO in the initial solution leads to such a ratio of DMSO and dextran in the final solution, in which the removal of the cryoprotectant during thawing is difficult and leads to the death of some of the deconserved cells due to the small volume of the defrosted suspension.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка криопротектора, содержащего декстран с более низкой молекулярной массой и более низкой концентрацией ДМСО, что позволит обеспечить максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на клетки.An object of the present invention is to provide a cryoprotectant containing dextran with a lower molecular weight and lower DMSO concentration, which will ensure maximum cryoprotective properties with minimal damage to the cells.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание криопротектора с более низкой молекулярной массой и более низкой концентрацией ДМСО для улучшения сохранности ГСК после размораживания и способа использования разработанного криопротектора для криоконсервации ГСК, позволяющего максимально сохранить ГСК при минимальном их повреждении. Заявленный криопротектор обеспечивает высокую жизнеспособность (89,93±0,69%) гемопоэтических стволовых клеток при длительном (3 года и более) криохранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика размораживания клеток для трансплантации.The technical result of the claimed invention is the creation of a cryoprotectant with a lower molecular weight and lower concentration of DMSO to improve the safety of HSCs after thawing and the method of using the developed cryoprotectant for cryopreservation of HSCs, which allows the HSC to be retained as much as possible with minimal damage. The claimed cryoprotectant provides high viability (89.93 ± 0.69%) of hematopoietic stem cells with prolonged (3 years or more) cryopreservation in the frozen state, while there is no cell adhesion, the technique of defrosting cells for transplantation is simplified.
В процессе решения технической задачи нами был разработан способ криоконсервации стволовых клеток, включающий получение взвеси стволовых клеток и добавление к ней комбинированного криопротектора, представляющего собой 50% раствор ДМСО в реополиглюкине, представляющем собой декстран со средней молекулярной массой 30000-40000 в 0,9% растворе натрия хлорида, до конечной концентрации ДМСО в получившейся суспензии 10%, с последующим ее криоконсервацией.In the process of solving the technical problem, we developed a method for cryopreservation of stem cells, which includes suspension of stem cells and adding a combined cryoprotectant to it, which is a 50% solution of DMSO in reopoliglukin, which is a dextran with an average molecular weight of 30,000-40000 in a 0.9% solution sodium chloride, to a final concentration of DMSO in the resulting suspension of 10%, followed by its cryopreservation.
Также мы предлагаем разработанный нами комбинированный криопротектор, представляющий собой 50% раствор ДМСО в реополиглюкине представляющем собой 10% декстрана со средней молекулярной массой 30000-40000 в 0,9% растворе натрия хлорида.We also offer a combined cryoprotectant developed by us, which is a 50% DMSO solution in reopoliglucin representing 10% dextran with an average molecular weight of 30,000-40000 in a 0.9% sodium chloride solution.
Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is as follows.
1. Сбор материала стволовых клеток, например пуповинной крови (ПК), после получения информированного согласия донора (роженицы, рождения ребенка и отделения его от последа) и проверке на носительство гепатита B, C, ВИЧ, сифилис, осуществляют стандартным способом. В частности, можно использовать закрытые системы для сбора крови с гемоконсервантом CPDA (цитрат-фосфат-декстроза-аденин). Обработка полученных образцов проводится не позднее, чем через 24 часа от момента сбора стволовых клеток. Из полученной крови выделяют концентрат ядросодержащих клеток стандартным методом, например описанным в статье Гришина В.В. «Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия». №1(3), с. 52-59, где пуповинную кровь разделяют на фракции путем добавления равного объема полиглюкина. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение 50-60 минут, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, плазму удаляют. В результате получают осадок, представляющий собой концентрат ядросодержащих клеток.1. The collection of stem cell material, for example, umbilical cord blood (PC), after obtaining the informed consent of the donor (woman in childbirth, childbirth and separation from the placenta) and checking for hepatitis B, C, HIV, syphilis, is carried out in a standard way. In particular, closed blood collection systems with the blood preservative CPDA (citrate-phosphate-dextrose-adenine) can be used. Processing of the obtained samples is carried out no later than 24 hours after the collection of stem cells. From the obtained blood, a concentrate of nucleated cells is isolated by the standard method, for example, described in the article by V. V. Grishin “Development of optimal methods for cryopreservation of hematopoietic cells of human cord blood for transplantation. Cell transplantology and tissue engineering. " No. 1 (3), p. 52-59, where the umbilical cord blood is divided into fractions by adding an equal volume of polyglucin. The mixture is thoroughly mixed and incubated for 50-60 minutes, the supernatant is separated, centrifuged at 2000 rpm, the plasma is removed. The result is a precipitate, which is a concentrate of nucleated cells.
Сепарацию столовых клеток можно провести и любым другим методом, например методом выделения стволовых клеток в градиенте плотности фиколла или ускоренной седиментации с использованием раствора желатина или гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), которые позволяют получить от 80% до 90% стволовых клеток.The separation of table cells can be carried out by any other method, for example, the method of isolation of stem cells in the density gradient of ficoll or accelerated sedimentation using a solution of gelatin or hydroxyethyl starch (HES), which allows you to get from 80% to 90% of stem cells.
К полученной взвеси стволовых клеток (концентрат ядросодержащих клеток пуповинной крови) в условиях постоянного перемешивания добавляют разработанный нами комбинированный криопротектор, представляющий собой 50% раствор ДМСО в реополиглюкине (10% декстрана ср. молекулярная масса 30000-40000 в 0,9% растворе натрия хлорида), до конечной концентрации ДМСО в получившейся суспензии 10% по объему, после чего ее подвергают криоконсервации, например, в автоматизированной системе «BioArchive» или любым другим стандартным методом.To the resulting suspension of stem cells (cord blood core concentrate) under constant stirring, we add the combined cryoprotectant developed by us, which is a 50% solution of DMSO in reopoliglyukin (10% dextran cf. molecular weight 30000-40000 in 0.9% sodium chloride solution) , to a final concentration of DMSO in the resulting suspension of 10% by volume, after which it is subjected to cryopreservation, for example, in the automated BioArchive system or by any other standard method.
2. Способ приготовления комбинированного криопротектора.2. The method of preparation of the combined cryoprotectant.
Приготовление комбинированного криопротектора «Диметилсульфоксид/реополиглюкин» осуществляется следующим способом: ДМСО смешивается со стерильным раствором реополиглюкина в объемном соотношении 1:1. В комбинированном криопротекторе конечная концентрация ДМСО в реополиглюкине составляет 50% по объему.The preparation of the combined dimethyl sulfoxide / reopoliglukin cryoprotectant is carried out in the following way: DMSO is mixed with a sterile reopoliglukin solution in a volume ratio of 1: 1. In the combined cryoprotectant, the final concentration of DMSO in reopolyglucin is 50% by volume.
ПримерExample
Для оценки влияния разработанного нами комбинированного криопротектора ДМСО/реоплогиглюкин, было изъято из автоматизированной системы «BioArchive®» 100 ранее криоконсервированных концентратов пуповинной крови с применением данного криоконсервирующего раствора ДМСО/реополиглюкин (50% раствор ДМСО в реополиглюкине (10% декстрана ср. мол. масса 30000-40000 в изотоническом растворе) - 100 образцов пуповинной крови.To assess the effect of the DMSO / reoplogiglukin combined cryoprotector developed by us, 100 previously cryopreserved cord blood concentrates were removed from the BioArchive® automated system using this cryopreserved DMSO / reopoliglukin solution (50% DMSO solution in reopoliglukin (10% dextran mol. 30000-40000 in isotonic solution) - 100 cord blood samples.
Характеристика криоконсервированных концентратов пуповинной крови представлена в табл. 1. Как видно из представленной таблицы, медиана криохранения концентратов пуповинной крови составила 2 года (1-3). Методом автоматического выделения клеток (МАВК) было обработано 64 образца. 36 образцов пуповинной крови были обработаны методом двойного центрифугирования (МДЦ). Концентрация ДМСО в концентратах пуповинной крови составила 10,1% (9,8-10,2).The characteristics of cryopreserved cord blood concentrates are presented in table. 1. As can be seen from the table, the median cryopreservation of cord blood concentrates was 2 years (1-3). 64 samples were processed by automatic cell isolation (MABC). 36 cord blood samples were processed by double centrifugation (MDC). The concentration of DMSO in cord blood concentrates was 10.1% (9.8-10.2).
При анализе абсолютного количества клеток до и после криохранения, а также процента сохранения клеток в концентрате пуповинной крови после криохранения были получены результаты, представленные в табл. 2.When analyzing the absolute number of cells before and after cryopreservation, as well as the percentage of cells retained in cord blood concentrate after cryopreservation, the results were obtained, which are presented in table. 2.
Сравнение содержания жизнеспособных ядросодержащих стволовых клеток (ЯСК) до и после криохранения представлено в табл. 3.A comparison of the content of viable nucleated stem cells (YSC) before and after cryopreservation is presented in table. 3.
При оценке абсолютного количества CD45+/CD34+ до и после криохранения, а также процента их сохранения после криохранения концентратов пуповинной крови представлено в табл. 4.When assessing the absolute amount of CD45 + / CD34 + before and after cryopreservation, as well as the percentage of their preservation after cryopreservation of cord blood concentrates, are presented in table. four.
Колониеобразующая активность ГСК ПК до и после криохранения представлена в табл. 5.The colony forming activity of HSC PK before and after cryopreservation is presented in table. 5.
В проведенном исследовании достоверных различий в клеточном составе концентратов пуповинной крови, количестве CD45+/CD34+, жизнеспособности ЯСК и колониеобразующей активности ГСК пуповинной крови до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» выявлено не было.In the study, there were no significant differences in the cellular composition of cord blood concentrates, the number of CD45 + / CD34 +, the viability of UCS and the colony forming activity of cord blood HSCs before and after cryopreservation in the BioArchive® automated system.
Таким образом, экспериментальными исследованиями показано, что комбинированный криопротектор ДСМО/реополюглюкин обеспечивает высокую жизнеспособность (89,93±0,69%) стволовых клеток при длительном (3 года и более) криохранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика размораживания клеток для трансплантации, клетки менее травмированы.Thus, experimental studies have shown that the combined cryoprotectant DSMO / reopolyuglukin provides high viability (89.93 ± 0.69%) of stem cells during prolonged (3 years or more) cryopreservation in the frozen state, while cell adhesion is absent, the defrosting technique is simplified cells for transplantation, cells are less injured.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014152389/15A RU2563117C1 (en) | 2014-12-24 | 2014-12-24 | Combination cryoprotector "dimethyl sulphoxide/rheopolyglucin" for stem cell cryopreservation and method for cryopreservation thereof for clinical applications |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014152389/15A RU2563117C1 (en) | 2014-12-24 | 2014-12-24 | Combination cryoprotector "dimethyl sulphoxide/rheopolyglucin" for stem cell cryopreservation and method for cryopreservation thereof for clinical applications |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2563117C1 true RU2563117C1 (en) | 2015-09-20 |
Family
ID=54147687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014152389/15A RU2563117C1 (en) | 2014-12-24 | 2014-12-24 | Combination cryoprotector "dimethyl sulphoxide/rheopolyglucin" for stem cell cryopreservation and method for cryopreservation thereof for clinical applications |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2563117C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2686107C1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-04-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method of optimal cryoprotector selection having glycogen content in preserved blood leukocytes |
| RU2744614C1 (en) * | 2020-02-25 | 2021-03-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for reducing toxicity of cryopreservation solution based on dimethyl sulfoxide after thawing of hematopoietic stem cells |
-
2014
- 2014-12-24 RU RU2014152389/15A patent/RU2563117C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEN R., et al., [Effects of different cryoprotectants on biological properties of hematopoietic cells derived from cord blood]. [Article in Chinese] Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2000 Aug;21(8):412-3. ODAVIC R., et al., Cryoprotection of human bone marrow committed stem cells (CFU-c) by dextran, glycerol and dimethyl sulfoxide. Experientia. 1980 Sep 15;36(9):1122-4. STYLIANOU J., et al., Novel cryoprotectant significantly improves the post-thaw recovery and quality of HSC from CB. Cytotherapy. 2006;8(1):57-61. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2686107C1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-04-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method of optimal cryoprotector selection having glycogen content in preserved blood leukocytes |
| RU2744614C1 (en) * | 2020-02-25 | 2021-03-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for reducing toxicity of cryopreservation solution based on dimethyl sulfoxide after thawing of hematopoietic stem cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2271209B1 (en) | Materials and methods for hypothermic collection of whole blood | |
| Jahan et al. | Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells | |
| CN108617638A (en) | Tissue and/or cell cryopreservation protection liquid and its preparation and application | |
| CA2598366A1 (en) | Compositions and methods for the storage of red blood cells | |
| Buchanan et al. | Preservation of differentiation and clonogenic potential of human hematopoietic stem and progenitor cells during lyophilization and ambient storage | |
| RU2563117C1 (en) | Combination cryoprotector "dimethyl sulphoxide/rheopolyglucin" for stem cell cryopreservation and method for cryopreservation thereof for clinical applications | |
| Johnson et al. | A deep eutectic solvent is an effective cryoprotective agent for platelets | |
| Wagner et al. | Biochemical stabilization enhances red blood cell recovery and stability following cryopreservation | |
| Matsumoto et al. | Successful liquid storage of peripheral blood stem cells at subzero non-freezing temperature | |
| CN114190368B (en) | Serum-free immune cell cryopreservation liquid, preparation method and immune cell cryopreservation method | |
| Sputtek et al. | Cryopreservation in transfusion medicine and hematology | |
| CN113490414B (en) | Preservation of Stem cells | |
| Berz et al. | Cryopreservation of hematopoietic and non-hematopoietic stem cells–a review for the clinician | |
| Larasati et al. | Can Cryoprotectant’s modification in spermatozoa cryopreservation be an alternative to improve embryo quality? a review | |
| Arav et al. | Freeze drying (lyophilization) of red blood cells | |
| WO2019175596A1 (en) | Cryopreserving processes | |
| Setia et al. | Outcome of 51 autologous peripheral blood stem cell transplants after uncontrolled-rate freezing (“dump freezing”) using− 80 C mechanical freezer | |
| RU2263448C1 (en) | Method of cryopreservation of umbilical blood | |
| Kim et al. | Application of phosphoenolpyruvate into canine red blood cell cryopreservation with hydroxyethyl starch | |
| WO2021003254A1 (en) | Cryopreservation medium comprising a tissue extract | |
| Liu et al. | Engineered supercooling systems for enhanced long-term preservation of large-volume red blood cells in commercial blood bags | |
| Pereira et al. | Principles of cryopreservation and applicabilities in intestinal organoids | |
| Hvozdiuk et al. | Research in comparative aspect of cryoprotective action of glycerin-based cryopreservatives in combination with polyvinyl alcohol of different molecular weights at fast and slow cooling of human donor blood | |
| US6218101B1 (en) | Enzymatic method for removal of cryoprotectants from cryopreserved animal cells | |
| Hatte et al. | New application for biohydrogels: myoblast cryopreservation for cell therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161225 |