[go: up one dir, main page]

RU2263448C1 - Method of cryopreservation of umbilical blood - Google Patents

Method of cryopreservation of umbilical blood Download PDF

Info

Publication number
RU2263448C1
RU2263448C1 RU2004116209/15A RU2004116209A RU2263448C1 RU 2263448 C1 RU2263448 C1 RU 2263448C1 RU 2004116209/15 A RU2004116209/15 A RU 2004116209/15A RU 2004116209 A RU2004116209 A RU 2004116209A RU 2263448 C1 RU2263448 C1 RU 2263448C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
polyglucin
mixture
equal volume
cord blood
kept
Prior art date
Application number
RU2004116209/15A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Д.М. Мхеидзе (RU)
Д.М. Мхеидзе
В.В. Гришина (RU)
В.В. Гришина
Original Assignee
Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН filed Critical Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН
Priority to RU2004116209/15A priority Critical patent/RU2263448C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2263448C1 publication Critical patent/RU2263448C1/en

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: cryobiology.
SUBSTANCE: method, which can be utilized when performing allotransplantation in oncology and hematology, is characterized by that to freshly collected umbilical blood equal volume of polyglucin is added, after which mixture is stirred, and kept for 50-60 min until clear boundary appears. Separated supernatant is then centrifuged to obtain precipitate, to which equal volume of 10-12% dimethylsulfoxide dissolved in polyglucin is added at continuous stirring. Mixture is placed in thermostatically controlled space while lowering temperature at a rate of 1-2°C/min for 1-2 h, after which kept at extremely low temperatures.
EFFECT: maximally preserved vitality of nucleus-bearing cells and thereby enabled transplantations at many severe hematological diseases, including oncological diseases.

Description

Изобретение относится к области криобиологии, а именно к способам криоконсервации пуповинной крови, и может быть использовано при ауто- и аллотрансплантации в онкологии и гематологии. В последние годы широкое развитие получила трансплантация периферических ядросодержащих клеток (ЯСК), извлеченных из пуповинной крови (ПК) человека.The invention relates to the field of cryobiology, and in particular to methods for cryopreservation of cord blood, and can be used for auto- and allotransplantation in oncology and hematology. In recent years, the transplantation of peripheral nucleated cells (YSC), extracted from human umbilical cord blood (PC), has been widely developed.

Многочисленные исследования показали, что ПК является богатым источником гемопоэтических ЯСК, и что лимфоидные клетки ПК менее иммунореактивны, поэтому частичная несовместимость по антигенам HLA-системы при трансплантации гемопоэтических клеток допустима, а частота тяжелой реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) встречается реже, чем при аллогенных трансплантациях периферических стволовых клеток и костного мозга.Numerous studies have shown that PK is a rich source of hematopoietic UCS and that lymphoid cells of the PC are less immunoreactive, therefore partial incompatibility of the HLA system antigens during hematopoietic cell transplantation is acceptable, and the frequency of the graft versus host disease (GVHD) is less common than with allogeneic transplantations of peripheral stem cells and bone marrow.

Использование пуповинной крови для пересадок имеет ряд преимуществ по сравнению с другими источниками гемопоэтических клеток:The use of umbilical cord blood for transplants has several advantages over other sources of hematopoietic cells:

Отсутствует риск здоровью матери и ребенка (донора) и не требуется общая анестезия при сборе ПК.There is no risk to the health of the mother and child (donor) and general anesthesia is not required when collecting the PC.

Появляется возможность длительного хранения гемопоэтических клеток в замороженном состоянии как аллогенного трансплантата.There is the possibility of long-term storage of hematopoietic cells in a frozen state as an allogeneic transplant.

Выявлена большая возможность использования не полностью совместимых по HLA-системе (от 1 до 3 антигенов) трансплантатов.A great possibility of using grafts that are not fully compatible with the HLA system (from 1 to 3 antigens) was revealed.

Увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов, что имеет большую значимость для этнических меньшинств.The likelihood of finding rare HLA-type grafts increases, which is of great importance for ethnic minorities.

Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем.Significantly reduced the risk of transmission of some latent infections transmitted by transmission.

Требуются меньшие затраты времени для поиска необходимого HLA-типа трансплантата.Less time is required to find the necessary HLA-type graft.

Появляется недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток пуповинной крови в качестве аутологичного трансплантата.An inexpensive form of biological life insurance is emerging due to the possibility of using cord blood cells as an autologous transplant.

В связи с малым объемом ПК, получаемым при разовом сборе, и невозможностью повторного сбора основной задачей при заготовке ПК является максимальный забор ПК, максимальное выделение ядросодержащих клеток из ПК и оптимальный способ замораживания их. Известны способы криоконсервирования ПК, описанные в работах К.М.Абдулкадырова и др. [1, 2, 3]. Как следует из упомянутых работ, в мировой современной практике криоконсервирования для выделения ЯСК и удаления эритроцитов используют как различные седиментирующие средства, например фиккол, метилцеллюлозу, желатин, гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) и т.д., так и центрифугирование, а также сочетание указанных приемов.Due to the small amount of PC obtained during one-time collection and the impossibility of re-collection, the main task when preparing the PC is to maximize the collection of PCs, the maximum isolation of nucleated cells from PCs and the best way to freeze them. Known methods of cryopreservation of PCs described in the works of K. M. Abdulkadyrov and others [1, 2, 3]. As follows from the aforementioned works, in the modern world cryopreservation practice, various sedimentation agents, for example, ficcol, methylcellulose, gelatin, hydroxyethyl starch (HES), etc., and centrifugation, as well as a combination of these techniques, are used to isolate UAS and erythrocytes.

На этапе замораживания используются различные криопротекторы: ДМСО или ДМСО в сочетании с ГЭК, человеческим альбумином и другие. Однако известные способы криоконсервирования пуповинной крови длительны, трудоемки, требуют отмывания седиментирующих средств, дорогостоящи и ненадежны за счет использования программных замораживателей (возможный отказ электронных микросхем). Задачей настоящего изобретения является создание способа криоконсервирования пуповинной крови, лишенного указанных недостатков, позволяющего обеспечить максимальное сохранение жизнеспособности ядросодержащих клеток при одновременном ускорении и упрощении способа, и абсолютной надежности процесса криоконсервации.At the freezing stage, various cryoprotectants are used: DMSO or DMSO in combination with HES, human albumin, and others. However, the known methods of cryopreservation of umbilical cord blood are long, laborious, require washing of sedimentation agents, are expensive and unreliable due to the use of software freezers (possible failure of electronic circuits). The objective of the present invention is to provide a method for cryopreservation of umbilical cord blood, devoid of these drawbacks, to ensure maximum preservation of the viability of nucleated cells while accelerating and simplifying the method, and the absolute reliability of the cryopreservation process.

Сущность способа заключается в том, что к свежесобранной пуповинной крови добавляют равный объем полиглюкина, перемешивают, смесь выдерживают в течение 50-60 минут до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его, отделяют осадок, к полученному осадку добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании, смесь помещают в термостатируемый объем, где температура биоматериала понижается со скоростью 1-2°С в минуту в течение 1-2 часов, после чего его хранят при ультранизких температурах.The essence of the method is that an equal volume of polyglucin is added to freshly collected umbilical cord blood, mixed, the mixture is kept for 50-60 minutes until a clear interface appears, the supernatant is separated, centrifuged, the precipitate is separated, an equal volume of 10-12 is added to the obtained precipitate % solution of dimethyl sulfoxide in polyglucin with constant stirring, the mixture is placed in a thermostatically controlled volume, where the temperature of the biomaterial decreases at a speed of 1-2 ° C per minute for 1-2 hours, after which it is stored at ultra low at high temperatures.

Способ осуществляется следующим образом: свежесобранную пуповинную кровь разделяют на фракции путем добавления равного объема полиглюкина, тщательно перемешивают, вертикально подвешивают контейнер, содержащий полученную смесь. Смесь выдерживают в течение 50-60 минут до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, в течение 10 минут при +18°С, плазму удаляют, а к оставшемуся осадку, представляющему собой концентрат ядросодержащих клеток, добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании, затем смесь в запаянном криомешке помещают в контейнер для замораживания, выполненный из многослойной фанеры (общая толщина 10 мм) с плотно закрывающейся крышкой и соответствующий размеру криомешка. Контейнер с криомешком помещают в пары жидкого азота. Скорость охлаждения материала составляет 1-2°С в минуту, время охлаждения 1-2 часа. Затем криомешок из контейнера переносят в основное хранилище с жидким азотом, где он сохраняется до трансплантации.The method is as follows: freshly collected umbilical cord blood is divided into fractions by adding an equal volume of polyglucin, mixed thoroughly, a container containing the resulting mixture is suspended vertically. The mixture is kept for 50-60 minutes until a clear interface appears, the supernatant is separated, centrifuged at 2000 rpm, for 10 minutes at + 18 ° C, the plasma is removed, and the remaining sediment, which is a concentrate of nucleated cells, is added equal volume of a 10-12% solution of dimethyl sulfoxide in polyglucin with constant stirring, then the mixture in a sealed cryobag is placed in a freezing container made of multilayer plywood (total thickness 10 mm) with a tight-fitting lid and corresponding to the size of iomeshka. The cryosack container is placed in a pair of liquid nitrogen. The cooling rate of the material is 1-2 ° C per minute, the cooling time is 1-2 hours. Then the cryobag from the container is transferred to the main storage with liquid nitrogen, where it is stored until transplantation.

По предложенному способу было произведено выделение ядросодержащих клеток в 50 образцах пуповинной крови. Процент выделенных ядросодержащих клеток в среднем составил 84,53±8,51% от исходного количества,% удаленных эритроцитов в среднем составил 97,27±2,43% от исходного (в известных способах 82,6%; 97,9% соответственно). Потерь ЯСК после размораживания не наблюдалось (оценивали количество ядросодержащих клеток до и после замораживания).According to the proposed method, nucleated cells were isolated in 50 cord blood samples. The percentage of selected nucleated cells on average was 84.53 ± 8.51% of the initial amount,% of red blood cells removed was on average 97.27 ± 2.43% of the initial (in the known methods, 82.6%; 97.9%, respectively) . Losses of YSC after thawing were not observed (the number of nucleated cells was estimated before and after freezing).

В РОНЦ РАМН в отделениях взрослой и детской трансплантации проведено около 200 пересадок ядросодержащих клеток, у всех больных было восстановлено кроветворение. Кроме того, криоконсервированный по предложенному способу биоматериал, успешно применялся для трансплантаций больным, находящимся на лечении в ГНЦ РАМН, ГНЦ-институте биофизики МЗ России, госпитале им.Бурденко МО РФ.About 200 transplantations of nucleated cells were performed at the RONTs RAMS in the departments of adult and pediatric transplantation; hematopoiesis was restored in all patients. In addition, the cryopreserved biomaterial according to the proposed method has been successfully used for transplantation to patients undergoing treatment at the SSC RAMS, SSC Institute of Biophysics of the Ministry of Health of Russia, Burdenko Hospital of the Ministry of Defense of the Russian Federation.

Технический результатTechnical result

Предложенный способ позволяет максимально сохранить жизнеспособность ядросодержащих клеток, что обеспечивает восстановление кроветворения реципиента при лечении заболеваний крови, в том числе после высокодозной полихимиотерапии, и в то же время достигается упрощение и ускорение способа за счет сокращения числа манипуляций. Используемый полиглюкин является доступным для любого медицинского учреждения. Благодаря физиологичности полиглюкина способ не требует отмывания клеточной взвеси. Кроме того, остающийся после седиментации эритроцитов осадок используется в качестве образцов для различных анализов, необходимых для тестирования пуповинной крови; в настоящее время для тестирования используют цельную пуповинную кровь.The proposed method allows maximum preservation of the viability of nucleated cells, which ensures the restoration of the blood formation of the recipient in the treatment of blood diseases, including after high-dose chemotherapy, and at the same time, the simplification and acceleration of the method is achieved by reducing the number of manipulations. Used polyglucin is available for any medical institution. Due to the physiological nature of polyglucin, the method does not require washing of the cell suspension. In addition, the sediment remaining after sedimentation of erythrocytes is used as samples for various analyzes necessary for testing cord blood; Whole cord blood is currently used for testing.

Таким образом, предлагаемый способ криоконсервации пуповинной крови, позволяющий максимально сохранить жизнеспособность ядросодержащих клеток, прост в исполнении, не требует дорогостоящей аппаратуры и может успешно применяться для трансплантаций при многих тяжелых заболеваниях крови, включая онкологические.Thus, the proposed method for cryopreservation of umbilical cord blood, which allows maximum preservation of the viability of nucleated cells, is simple to implement, does not require expensive equipment and can be successfully used for transplantations in many serious blood diseases, including oncological ones.

ЛитератураLiterature

1) К.М.Абдулкадыров и др. "Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови", "Вопросы онкологии 2000". т.46, №4, с.513-536.1) K.M. Abdulkadyrov et al. "Obtaining and clinical use of peripheral hematopoietic stem cells from umbilical cord blood", "Questions of Oncology 2000". t. 46, No. 4, p. 513-536.

2) К.М.Абдулкадыров и др. "Плацентарная кровь: альтернативный источник кроветворных стволовых клеток для трансплантаций. Создание банков пуповинной крови", ж-л "Терапевтический архив", 2001 г., т.73, №7, с.76-78.2) K.M. Abdulkadyrov et al. "Placental blood: an alternative source of hematopoietic stem cells for transplantations. Creation of cord blood banks", Zh. Therapeutic Archive, 2001, v. 73, No. 7, p. 76 -78.

3) К.М.Абдулкадыров "Гематология. Новейший справочник". М., 2004 г, с.890-901.3) K.M. Abdulkadyrov "Hematology. The latest reference book." M., 2004, p. 890-901.

Claims (1)

Способ криоконсервирования пуповинной крови, заключающийся в том, что к свежесобранной пуповинной крови добавляют равный объем полиглюкина, перемешивают, смесь выдерживают в течение 50-60 мин до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его, отделяют осадок, к полученному осадку добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании, смесь помещают в термостатируемый объем, снижая температуру со скоростью 1-2°С в минуту в течение 1-2 ч, после чего ее хранят при ультранизких температурах.The method of cryopreservation of umbilical cord blood, which consists in adding an equal volume of polyglucin to freshly harvested umbilical cord blood, mixing, the mixture is kept for 50-60 minutes until a clear interface appears, the supernatant is separated, centrifuged, the precipitate is separated, an equal volume is added to the obtained precipitate 10-12% solution of dimethyl sulfoxide in polyglucin with constant stirring, the mixture is placed in a temperature-controlled volume, lowering the temperature at a speed of 1-2 ° C per minute for 1-2 hours, after which it is stored at ultran viscous temperatures.
RU2004116209/15A 2004-05-28 2004-05-28 Method of cryopreservation of umbilical blood RU2263448C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004116209/15A RU2263448C1 (en) 2004-05-28 2004-05-28 Method of cryopreservation of umbilical blood

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004116209/15A RU2263448C1 (en) 2004-05-28 2004-05-28 Method of cryopreservation of umbilical blood

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2263448C1 true RU2263448C1 (en) 2005-11-10

Family

ID=35865364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004116209/15A RU2263448C1 (en) 2004-05-28 2004-05-28 Method of cryopreservation of umbilical blood

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2263448C1 (en)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2343928C1 (en) * 2007-04-03 2009-01-20 Открытое акционерное общество "Институт стволовых клеток человека" Method of obtaining of blasts from funic blood
RU2416197C1 (en) * 2009-12-11 2011-04-20 Александр Борисович Смолянинов Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood
RU2554405C2 (en) * 2012-03-22 2015-06-27 Борис Лаврович Макеев Method for cryogenic preservation of haematopoietic umbilical cord stem cells
RU2639892C1 (en) * 2017-07-05 2017-12-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" Method for human nucleated blood cells cryopreservation at temperature of minus 80°c

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4004975A (en) * 1975-12-30 1977-01-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method of isolating and cryopreserving human white cells from whole blood
RU2146088C1 (en) * 1995-03-08 2000-03-10 Селокс Лабораториз, Инк. Concentrated solution for cryogenic storage (versions), method for cryogenic storage of cells (versions), method for cryogenic storage and regeneration of viable cells, and method for cryogenic storage, regeneration and therapeutic utilization of cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4004975A (en) * 1975-12-30 1977-01-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method of isolating and cryopreserving human white cells from whole blood
RU2146088C1 (en) * 1995-03-08 2000-03-10 Селокс Лабораториз, Инк. Concentrated solution for cryogenic storage (versions), method for cryogenic storage of cells (versions), method for cryogenic storage and regeneration of viable cells, and method for cryogenic storage, regeneration and therapeutic utilization of cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Абдулкадыров К. М. Гематология. Новейший справочник. М., 2004, с. 898-901. *
Прокопюк О. С. и др. Криоконсервированные эритроциты пуповинной крови - антианемическая гемотрансфузионная среда. Влияние охлаждения на биологические объекты. Харьков, 1990, с. 121-124. Donaldson C. et al. Optimal cryopreservation of human umbilical cord blood. Bone Marrow Transplant. 1996 Oct, 18(4), p. 725-31. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2343928C1 (en) * 2007-04-03 2009-01-20 Открытое акционерное общество "Институт стволовых клеток человека" Method of obtaining of blasts from funic blood
RU2416197C1 (en) * 2009-12-11 2011-04-20 Александр Борисович Смолянинов Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood
RU2554405C2 (en) * 2012-03-22 2015-06-27 Борис Лаврович Макеев Method for cryogenic preservation of haematopoietic umbilical cord stem cells
RU2639892C1 (en) * 2017-07-05 2017-12-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" Method for human nucleated blood cells cryopreservation at temperature of minus 80°c

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hubel Parameters of cell freezing: implications for the cryopreservation of stem cells
US8642255B2 (en) Materials and methods for hypothermic collection of whole blood
Jahan et al. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells
JP6531256B2 (en) Method for cryopreservation of cord blood and peripheral blood and solution for cryopreservation
RU2160112C1 (en) Method for producing cellular transplant from fetus tissues
CN112753695A (en) Immune cell cryopreservation method
US20230028798A1 (en) Adipose tissue cryopreservation protective agent
CN109913416B (en) Preparation method of protective agent used after recovery of frozen umbilical cord blood hematopoietic stem cells
RU2263448C1 (en) Method of cryopreservation of umbilical blood
RU2343928C1 (en) Method of obtaining of blasts from funic blood
CN115968863A (en) Menstrual blood preservative fluid and cryopreservation method of menstrual blood stem cells
Dhot et al. Cord blood stem cell banking and transplantation
Beaujean et al. Characteristics of peripheral blood progenitor cells frozen after 24 hours of liquid storage
Hubel et al. Cryopreservation of cord blood after liquid storage
EP1399018A1 (en) Preservation of blood platelets at cold temperatures
Weinberg Hematopoietic progenitor cell products derived from bone marrow and peripheral blood
Akbar et al. Factors influencing post-cryopreserved CD34+ cells viability in the harvested products of autologous haematopoietic stem cells
NL2034495B1 (en) Stem cell cryopreservation protective agent, preparation method, and application thereof
Iancu-Rubin et al. Hematopoietic Progenitor Cell Products Derived From Bone Marrow and Peripheral Blood
Flaifel et al. Cryopreservation of Autologous Adipose Tissue From Liposuction: A Review
US20250197814A1 (en) Method for preserving cells
Henkelman et al. Does modern combat still need fresh whole blood transfusions?
RU2799019C1 (en) Method of storage of non-cryopreserved autologous hematopoietic stem cells from peripheral blood
NL2033449B1 (en) Adipose tissue cryopreservation protective agent
RU2744614C1 (en) Method for reducing toxicity of cryopreservation solution based on dimethyl sulfoxide after thawing of hematopoietic stem cells