RU2158759C2 - Method for storing cellular cultures in suspension - Google Patents
Method for storing cellular cultures in suspension Download PDFInfo
- Publication number
- RU2158759C2 RU2158759C2 RU98116715/13A RU98116715A RU2158759C2 RU 2158759 C2 RU2158759 C2 RU 2158759C2 RU 98116715/13 A RU98116715/13 A RU 98116715/13A RU 98116715 A RU98116715 A RU 98116715A RU 2158759 C2 RU2158759 C2 RU 2158759C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- suspension
- cell
- atm
- hydrostatic pressure
- storing
- Prior art date
Links
- 239000000725 suspension Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title abstract 2
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 13
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 abstract description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000009931 pascalization Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при хранении пространственно организованных клеточных структур и клеточных ассоциаций (суспензий). The invention relates to biology and medicine and can be used for storing spatially organized cell structures and cell associations (suspensions).
Известен способ хранения культуры клеток в замороженном с криопротектором (глицерин или ДМСО) состоянии при -196oC (жидкий азот) [1,2], а также способы хранения клеток крови в жидком состоянии при +4oC с консервантом ЦОЛИПК-7Б [3].A known method of storing a cell culture in a frozen state with a cryoprotectant (glycerin or DMSO) at -196 o C (liquid nitrogen) [1,2], as well as methods of storing blood cells in a liquid state at + 4 o C with the preservative TSOLIP-7B [ 3].
Недостатком сохранения клеточной культуры в случае ее хранения в жидком азоте при температуре -196oC является сохранение низкого процента жизнеспособных клеток (55-60%). Препарат ДМСО является токсичным, что требует его полного удаления из суспензии клеток после размораживания. Кроме того, при этом идет потеря до 30% клеток. Использование глицерина также приводит к разрушению клеток после размораживания.The disadvantage of preserving the cell culture when stored in liquid nitrogen at a temperature of -196 o C is the preservation of a low percentage of viable cells (55-60%). DMSO is toxic, which requires its complete removal from the cell suspension after thawing. In addition, there is a loss of up to 30% of the cells. The use of glycerol also leads to cell destruction after thawing.
Известен способ хранения культур клеток в жидком состоянии под давлением 400-500 атм с охлаждением до (-5) - (-6)oC [прототип].A known method of storing cell cultures in a liquid state under a pressure of 400-500 atm with cooling to (-5) - (-6) o C [prototype].
Однако этот способ не обеспечивает сохранности пространственной структурной организации клеточных ассоциаций и высокого уровня их жизнеспособности. However, this method does not ensure the preservation of the spatial structural organization of cell associations and the high level of their viability.
Задачей изобретения является обеспечение хранения клеточных культур в жидком состоянии с сохранением их пространственной 3-мерной структурной организации, возникшей в результате межклеточной адгезии и межклеточной кооперации. The objective of the invention is to ensure the storage of cell cultures in a liquid state while maintaining their spatial 3-dimensional structural organization that arose as a result of intercellular adhesion and intercellular cooperation.
Поставленная задача решается тем, что в способе хранения клеточных культур в суспензии путем охлаждения до (-3) - (-5)oC при повышенном гидростатическом давлении согласно изобретению добавляют защитную питательную среду RPMI-1640 с добавлением 20%-ной фетальной сыворотки при поддерживании гидростатического давления в интервале от 450 до 550 атм.The problem is solved in that in the method of storing cell cultures in suspension by cooling to (-3) - (-5) o C under increased hydrostatic pressure according to the invention add a protective nutrient medium RPMI-1640 with the addition of 20% fetal serum while maintaining hydrostatic pressure in the range from 450 to 550 atm.
Существенными признаками изобретения являются:
- смешивание клеточной суспензии со свежей питательной средой RPMI-1640 с добавлением 20% фетальной сыворотки;
- применение повышенного гидростатического давления 450 - 550 атм.The essential features of the invention are:
- mixing the cell suspension with fresh nutrient medium RPMI-1640 with the addition of 20% fetal serum;
- application of high hydrostatic pressure 450 - 550 atm.
Данный способ сохранения пространственной организации клеточных культур неизвестен из доступных литературных источников, что свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень". This method of maintaining the spatial organization of cell cultures is unknown from available literature, which indicates the compliance of the claimed invention with the criterion of "novelty" and "inventive step".
Далее следует пример конкретного выполнения способа: культуры клеток человека, образующие 3-мерные структуры в суспензионном состоянии (лимфоцитарные и макрофагальные клеточные суспензии) смешивают со свежей питательной средой RPMI-1640 с добавлением в нее 20%-ной фетальной сыворотки и заполняют в стерильный пластиковый контейнер объемом 5 мл без воздушного зазора. Пластиковый контейнер помещают в камеру высокого давления, которая представляет собой цилиндр с завинчивающимися пробками и с электровводами для измерения давления, контроля температуры и термоэлементом для ее поддержания в заданном режиме. Полость камеры высокого давления заполнена селиконовым маслом, которое бесконтактно передает создаваемое в камере ручным способом давление (450-550 атм) образцу. Охлаждение образцов в камере достигается либо подачей через проточную систему камеры жидкого азота, либо в криостате до заданной температуры. Образец с клеточной культурой необходимый период времени (например, 6 мес или 1 год) хранится при заданных условиях. По окончании сроков хранения камеру либо вынимают из криостата, либо подогревают до комнатной температуры включением термоэлемента, после чего плавно в режиме 10-20 атм/мин сбрасывается гидростатическое давление до атмосферного. Указанная последовательность операций и плавный сброс давления необходимы для предотвращения повреждающего действия высокого давления на клеточные ассоциации и предотвращения их замерзания. В случае сброса давления до уровня атмосферного без предварительного повышения температуры образцов до комнатной температуры культура клеток может подвергнуться замерзанию при отрицательной (ниже 0oC) температуре. Учет результатов производят до и после воздействия по жизнеспособности клеток окрашиванием 0,4%-ным раствором трипанового синего и последующим подсчетом живых и мертвых клеток в камере Горяева по обычной методике, а также по сохранности организации тестируемых клеточных субпопуляций в 3-мерных клеточных структурах (кластерах), - процент которых определяют в сравнении с контрольными клеточными культурами.The following is an example of a specific implementation of the method: human cell cultures forming 3-dimensional structures in suspension (lymphocytic and macrophage cell suspensions) are mixed with fresh RPMI-1640 nutrient medium with the addition of 20% fetal serum and filled into a sterile
В таблице приведены экспериментальные данные по конкретному выполнению заявленного изобретения. The table shows the experimental data on the specific implementation of the claimed invention.
Анализ таблицы показывает, что при известном способе (прототип) не сохраняется полная жизнеспособность клеток и 3-мерная структурная организация клеточной культуры нарушается уже через 24 ч их хранения в указанных условиях, а применение предлагаемого способа позволяет сохранять нативную структуру клеток долгое время. Analysis of the table shows that with the known method (prototype), the full viability of the cells is not preserved and the 3-dimensional structural organization of the cell culture is violated after 24 hours of storage under the indicated conditions, and the application of the proposed method allows you to maintain the native cell structure for a long time.
Литература
1. Авторское свидетельство СССР N 1822782 "Способ консервирования тромбоцитов", опубликовано БИ 23, 93.Literature
1. USSR author's certificate N 1822782 "Method for the preservation of platelets", published BI 23, 93.
2. Кривохарченко А.С., Серобян Г.А., Садовников В.Б. Криоэмбриобанки - перспективная технология консервации генетических ресурсов лабораторных, домашних и диких животных для практического использования. Труды IV Международной конференции и дискуссионный научный клуб. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф: "IT+ME'98", 1998, т.1, с.380-383. 2. Krivokharchenko A.S., Serobyan G.A., Sadovnikov V.B. Cryoembryobanks - a promising technology for the conservation of laboratory, domestic and wild animals' genetic resources for practical use. Proceedings of the IV International Conference and Discussion Scientific Club. Ukraine, Crimea, Yalta-Gurzuf: "IT + ME'98", 1998, v. 1, p. 380-383.
3. Гаврилов O.K., Кулешов Ю.Я. Массовая заготовка крови и ее компонентов. М.: Медицина, 1982. 3. Gavrilov O.K., Kuleshov Yu.Ya. Mass preparation of blood and its components. M .: Medicine, 1982.
4. Авторское свидетельство СССР N 1124974 "Способ хранения крови", опубликовано БИ 43, 84. 4. USSR author's certificate N 1124974 "Method for the storage of blood", published BI 43, 84.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98116715/13A RU2158759C2 (en) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | Method for storing cellular cultures in suspension |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98116715/13A RU2158759C2 (en) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | Method for storing cellular cultures in suspension |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98116715A RU98116715A (en) | 2000-07-20 |
| RU2158759C2 true RU2158759C2 (en) | 2000-11-10 |
Family
ID=20210221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98116715/13A RU2158759C2 (en) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | Method for storing cellular cultures in suspension |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2158759C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2194753C2 (en) * | 2001-01-18 | 2002-12-20 | Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН | Medium for conservation of splenic cells |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1124974A1 (en) * | 1982-09-27 | 1984-11-23 | Институт Биофизики Со Ан Ссср | Method of storing blood |
| SU1708835A1 (en) * | 1989-11-22 | 1992-01-30 | Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР | Method of constant cell lines conversion |
-
1998
- 1998-09-07 RU RU98116715/13A patent/RU2158759C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1124974A1 (en) * | 1982-09-27 | 1984-11-23 | Институт Биофизики Со Ан Ссср | Method of storing blood |
| SU1708835A1 (en) * | 1989-11-22 | 1992-01-30 | Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР | Method of constant cell lines conversion |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983, с. 230 и 231. Там же, с. 98 - 100. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2194753C2 (en) * | 2001-01-18 | 2002-12-20 | Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН | Medium for conservation of splenic cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jang et al. | Cryopreservation and its clinical applications | |
| KR100328742B1 (en) | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tisse equivalents | |
| CN112638157B (en) | Effective low-temperature preservation device for preventing direct contact between sample and extracellular ice | |
| US7939316B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| AU2009228141A1 (en) | Mehtod, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue | |
| US20080176326A1 (en) | Delivery of high cell mass in a syringe and related methods of cryopreserving cells | |
| Franks | Biological freezing and cryofixation | |
| CN108617638A (en) | Tissue and/or cell cryopreservation protection liquid and its preparation and application | |
| JP2021511080A (en) | Devices and methods for lyophilizing biological samples | |
| JP2019527050A (en) | Ice nucleation formulations for cryopreservation and stabilization of biological materials | |
| Buchanan et al. | Preservation of differentiation and clonogenic potential of human hematopoietic stem and progenitor cells during lyophilization and ambient storage | |
| CN111602648B (en) | A kind of immune cell serum-free cryopreservation solution and cryopreservation method | |
| KR20120117209A (en) | Cryopreservation medium for stem cells and cryopreservation method for stem cells using the same | |
| RU2583179C2 (en) | Method for preservation of cells and cell cultures | |
| WO2024026996A1 (en) | Cell preservation solution and cell preservation method | |
| Ehrhart et al. | A comparative study of freezing single cells and spheroids: towards a new model system for optimizing freezing protocols for cryobanking of human tumours | |
| RU2158759C2 (en) | Method for storing cellular cultures in suspension | |
| RU2577996C2 (en) | Method of biomaterial preservation | |
| CN113490414B (en) | Preservation of Stem cells | |
| JP6329468B2 (en) | Vitrification cryopreservation method of fibroblasts | |
| EP3035798B1 (en) | Boron added cell cryopreservation medium | |
| Ugraitskaya et al. | Cryopreservation of hela cells at a high hydrostatic pressure of 1.0–1.5 kBar | |
| CN107164306A (en) | Cornea model Cord blood solid medium and preparation method and application method | |
| CN117981747B (en) | Cell freezing solution and application thereof in cell preparation | |
| WO2024015037A2 (en) | Compositions, methods, and associated devices for cryopreservation of biological specimens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040908 |