RU2569834C1 - Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells - Google Patents
Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2569834C1 RU2569834C1 RU2014151351/13A RU2014151351A RU2569834C1 RU 2569834 C1 RU2569834 C1 RU 2569834C1 RU 2014151351/13 A RU2014151351/13 A RU 2014151351/13A RU 2014151351 A RU2014151351 A RU 2014151351A RU 2569834 C1 RU2569834 C1 RU 2569834C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- suspension
- stem cells
- cells
- cryopreservation
- temperature
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 12
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002826 coolant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 9
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 7
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 abstract 1
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001755 vocal effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к технологии криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) крови человека, и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения химиолучевого происхождения. Проводят добавление криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в окружении слоя толщиной 3 см из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±0,1°C. После холодовой адаптации криопакет с суспензией клеток герметизируют, помещают в металлический пенал-холдер, подвергают программному замораживанию до -196°C с последующим отогреванием биообъекта.The invention relates to medicine, namely to the technology of cryopreservation of hematopoietic stem cells (HSC) of human blood, and can be used in hematological, oncological, surgical and other centers for the treatment of patients with depression of hemopoiesis of chemoradiation origin. A cryoprotectant dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to the concentrate of nucleated cells with HSCs and the media are mixed at + 4.0 ° C, programmed freezing of the cell suspension is from + 4.0 ° C to -196 ° C, followed by heating. Mixing of the media is carried out surrounded by a layer of a thickness of 3 cm from dry disinfected Lab Armor thermogranules with a given temperature of + 4 ± 0.1 ° C. After cold adaptation, a cryopackage with a suspension of cells is sealed, placed in a metal pencil holder, subjected to program freezing to -196 ° C, followed by heating of the biological object.
Изобретение позволяет повысить технологичность замораживания ГСК и их сохранность за счет обеспечения стерильности и сохранности максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.The invention improves the manufacturability of freezing HSCs and their safety by ensuring the sterility and safety of the maximum number of full cryopreserved nucleated cells.
В технологии консервирования гемопоэтических стволовых клеток известны способы их криоконсервирования, например, см. пп. РФ №246197 «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови» или №2233589, A01N 1/02, дата публикации патента 10.08.2004 г. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток человека», который взят за прототип, предусматривает добавление криопротектора - 10% раствора ДМСО в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в криопакете, который установлен в кристаллы замороженной воды (тающий лед или снег).In the technology of preservation of hematopoietic stem cells, methods for their cryopreservation are known, for example, see paragraphs. RF №246197 "Method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells" or No. 2233589, A01N 1/02, patent publication date 08/10/2004, "Method of cryopreservation of human hematopoietic stem cells", which is taken as a prototype, provides for the addition of a cryoprotectant - 10% solution DMSO into a concentrate of nucleated cells with HSCs and mixing the media at + 4.0 ° C, programmatically freeze the cell suspension from + 4.0 ° C to -196 ° C, followed by heating. The media are mixed in a cryopackage, which is installed in crystals of frozen water (melting ice or snow).
Недостатками такого способа криоконсервирования ядросодержащих клеток являются: способ нетехнологичен, использование в ледяной бане в качестве хладагента кристаллов замороженной воды для охлаждения критичной для ГСК экзотермической реакции, развивающейся в процессе добавления криопротектора - 10% ДМСО во взвесь ядросодержащих клеток, не только неудобно и непрактично, но и опасно из-за риска микробной контаминации биообъекта при контакте с каплями воды растаявших кристаллов льда (снега); способ не способен поддерживать во взвеси ядросодержащих клеток с ГСК температуру в диапазоне 4,0°±1°C на протяжении всего этапа подготовки к замораживанию и холодовой адаптации и не обеспечивает сохранность максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.The disadvantages of this method of cryopreservation of nucleated cells are: the method is not technologically advanced, the use of frozen water crystals as a coolant to cool an exothermic reaction critical for HSC, which develops when a cryoprotectant - 10% DMSO is added to a suspension of nucleated cells, is not only inconvenient and impractical, but and it is dangerous due to the risk of microbial contamination of a biological object when melted ice (snow) crystals come in contact with water drops; the method is not able to maintain a suspension in the suspension of nucleated cells with HSC temperature in the range of 4.0 ° ± 1 ° C throughout the entire preparation for freezing and cold adaptation and does not ensure the safety of the maximum number of full cryopreserved nucleated cells.
Техническим результатом предложенного решения является: повышение технологичности криоконсервирования клеточной взвеси с использованием современного промышленного оборудования, снижение риска инфицирования взвеси ГСК при добавлении к ней криопротектора ДМСО, повышение количества криоконсервированных ядросодержащих клеток, устойчивых к витальному красителю клеточной мембраны.The technical result of the proposed solution is: increasing the adaptability of cryopreservation of cell suspension using modern industrial equipment, reducing the risk of infection of HSC suspension by adding a DMSO cryoprotectant to it, increasing the number of cryopreserved nucleated cells resistant to vital dye of the cell membrane.
Этот результат достигается за счет помещения криопакета со взвесью ядросодержащих клеток в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4,0±1°C, после смешивания взвеси ядросодержащих клеток с криопротектором ДМСО и холодовой адаптации клеточной суспензии при +4,0°C в течение 10 мин осуществляют ее программное замораживание до -196°C с последующим отогреванием.This result is achieved by placing a cryopackage with a suspension of nucleated cells in the refrigerant from dry disinfected Lab Armor thermogranules with a set temperature of + 4.0 ± 1 ° C, after mixing the suspension of nucleated cells with a DMSO cryoprotectant and cold adaptation of the cell suspension at + 4.0 ° C for 10 min carry out its program freezing to -196 ° C, followed by heating.
После отогрева в водяной бане все пробы ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.After heating in a water bath, all samples of nucleated cells with hematopoietic stem cells were sterile, the number of morphologically preserved nuclear cells ranged from 95.3% to 98.6%, from 73.3% to 94.5% of nuclear cells were resistant to vital membrane dye. blood cells.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в суспензию ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C; Б - подготовка полученной смеси к замораживанию, включающая холодовую адаптацию суспензии при +4,0°C в течение 10 мин; В - многоэтапное замораживание суспензии со стволовыми клетками до температуры -196°C с последующим отогреванием.The essential features of the proposed method, which coincides with the known features, are: A - adding a cryoprotectant dimethyl sulfoxide enclosing solution to the suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells at a temperature of + 4.0 ° C; B - preparing the resulting mixture for freezing, including cold adaptation of the suspension at + 4.0 ° C for 10 minutes; B - multi-stage freezing of a suspension with stem cells to a temperature of -196 ° C, followed by heating.
Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови являются: Г - в качестве хладагента клеточной взвеси используют сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor с заданной температурой +4±1°C; Д - подготовка термогранул к работе включает фасовку изделий в стеклянные 250-500 мл флаконы и термообработку в сушильном шкафу при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4°C.The salient features of the cryopreservation method of hematopoietic blood stem cells are: G - dry disinfected Lab Armor thermogranules with a predetermined temperature of + 4 ± 1 ° C are used as a cell suspension refrigerant; D - preparation of thermogranules for work includes packing products in glass 250-500 ml bottles and heat treatment in an oven at a temperature of + 180 ° C for 5 minutes, followed by cooling to + 4 ° C.
Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови заключается в следующем. Перед криоконсервированием ГСК проводят подготовку клеточной суспензии, являющейся концентратом ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, к замораживанию. Концентрат ядросодержащих клеток получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3±7,3) мл в стандартные полимерные контейнеры, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты, герметизируют, после чего переносят в емкость для охлаждения клеточной взвеси, помещают в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1,0°C. Для этого термогранулы фасуют в стеклянные 250-500 мл флаконы, подвергают термообработке в сушильном шкафе при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4C, достигают обеззараживания термогранул, после чего охлаждают до рабочей температуры +4°±1,0°C. Термогранулы, охлажденные до температуры +4±1,0°C, способны сохранить заданный температурный режим охлажденным клеткам в течение всего этапа подготовки к замораживанию. Далее суспензию ГСК замораживают поэтапно до - 196°C. После отогрева в водяной бане при +38°C все пробы суспензии ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, а устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.The method of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells is as follows. Before cryopreservation of HSCs, a cell suspension, which is a concentrate of nucleated cells with hematopoietic stem cells, is prepared for freezing. The concentrate of nucleated cells is obtained by separation on an Amicus apparatus in a volume of 38.0 to 81.0 (56.3 ± 7.3) ml into standard polymer containers, from where they are transferred into plastic cryopackages in a closed way, sealed, and then transferred to a container for cooling the cell suspension, is placed in the refrigerant from the dry disinfected Lab Armor thermogranules with the set temperature + 4 ± 1.0 ° C. To do this, the thermogranules are packed in 250-500 ml glass bottles, heat treated in an oven at a temperature of + 180 ° C for 5 min, followed by cooling to + 4C, the thermogranules are decontaminated, and then cooled to a working temperature of + 4 ° ± 1, 0 ° C. Thermogranules cooled to a temperature of + 4 ± 1.0 ° C are able to maintain a predetermined temperature regime for chilled cells during the entire stage of preparation for freezing. Next, the suspension of HSCs is frozen in stages to - 196 ° C. After heating in a water bath at + 38 ° C, all samples of the suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells were sterile, the number of morphologically preserved nuclear cells ranged from 95.3% to 98.6%, and resistance to vital membrane dye had from 73.3 % to 94.5% of nuclear blood cells.
Сравнительный анализ используемых критериев при оценке заявляемого и известного способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови представлен в таблице 1.A comparative analysis of the criteria used in assessing the claimed and known methods of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells is presented in table 1.
Предлагаемый «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток» крови по сравнению с прототипом:The proposed "Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells" of blood compared with the prototype:
а) обладает повышенной технологичностью;a) has high manufacturability;
б) обеспечивает стерильность криоконсервированной клеточной суспензии;b) provides sterility of cryopreserved cell suspension;
в) обеспечивает морфологическую сохранность большего количества ядерных клеток;c) ensures the morphological safety of a larger number of nuclear cells;
г) обеспечивает высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества криоконсервированных ядерных клеток.g) provides high resistance to vital dye membranes of a larger number of cryopreserved nuclear cells.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови.When using funds of scientific and technical literature, no equivalent solutions were found, which confirms the novelty of the proposed method for cryopreservation of hematopoietic blood stem cells.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.The use of simple techniques and available equipment confirms industrial applicability.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.The non-obviousness and original approach to solving the problem confirms the inventive step.
Исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей, гематологической клиники ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России» и кафедры физики и методики обучения физике факультета информатики, математики и физики ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет Минобрнауки России».The studies were carried out on the basis of the blood and tissue preservation laboratory, the hematology clinic of the Federal State Budgetary Scientific Institution Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion, Federal Medical and Biological Agency of Russia and the Department of Physics and Methods of Physics Education, Faculty of Informatics, Mathematics and Physics, Federal State Budgetary Educational Establishment of Higher Vocational Education Vyatka State Humanitarian University of the Russian Ministry of Education and Science.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014151351/13A RU2569834C1 (en) | 2014-12-17 | 2014-12-17 | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014151351/13A RU2569834C1 (en) | 2014-12-17 | 2014-12-17 | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2569834C1 true RU2569834C1 (en) | 2015-11-27 |
Family
ID=54753646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014151351/13A RU2569834C1 (en) | 2014-12-17 | 2014-12-17 | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2569834C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| RU2829777C2 (en) * | 2017-09-11 | 2024-11-05 | Ново Нордиск А/С | Enrichment with cells co-expressing nkx6.1 and c-peptide obtained in vitro from stem cells |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2233589C2 (en) * | 2002-01-14 | 2004-08-10 | Галина Степановна Лобынцева | Method for cryopreserving human hemopoietic cells |
| RU2416197C1 (en) * | 2009-12-11 | 2011-04-20 | Александр Борисович Смолянинов | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
| US8709797B2 (en) * | 2006-06-20 | 2014-04-29 | Cook General Biotechnology Llc | Systems and methods for cryopreservation of cells |
-
2014
- 2014-12-17 RU RU2014151351/13A patent/RU2569834C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2233589C2 (en) * | 2002-01-14 | 2004-08-10 | Галина Степановна Лобынцева | Method for cryopreserving human hemopoietic cells |
| US8709797B2 (en) * | 2006-06-20 | 2014-04-29 | Cook General Biotechnology Llc | Systems and methods for cryopreservation of cells |
| RU2416197C1 (en) * | 2009-12-11 | 2011-04-20 | Александр Борисович Смолянинов | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| RU2829777C2 (en) * | 2017-09-11 | 2024-11-05 | Ново Нордиск А/С | Enrichment with cells co-expressing nkx6.1 and c-peptide obtained in vitro from stem cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2588438T3 (en) | Materials and methods for hypothermic whole blood collection | |
| RU2416197C1 (en) | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood | |
| Arav et al. | New methods for cooling and storing oocytes and embryos in a clean environment of− 196 C | |
| Moskovtsev et al. | Cryopreservation of human spermatozoa by vitrification vs. slow freezing: Canadian experience | |
| RU2624214C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| Criado et al. | Experimental contamination assessment of a novel closed ultravitrification device | |
| Rienzi et al. | Perspectives in gamete and embryo cryopreservation | |
| Sciorio et al. | Review of human oocyte cryopreservation in ART programs: Current challenges and opportunities | |
| RU2569834C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| Baudot et al. | Towards whole sheep ovary cryopreservation | |
| Gallardo et al. | Thermal and clinical performance of a closed device designed for human oocyte vitrification based on the optimization of the warming rate | |
| Todorovic et al. | Sperm cryopreservation | |
| Paynter et al. | Cryopreservation of mammalian oocytes | |
| Aquino et al. | Ovarian tissue vitrification: the use of a novel metal closed system for clinical grade cryopreservation | |
| RU2639892C1 (en) | Method for human nucleated blood cells cryopreservation at temperature of minus 80°c | |
| Isachenko et al. | Human ovarian tissue: vitrification versus conventional freezing | |
| Chakrabarty et al. | Autologus or allogenic uses of umbilical cord blood whole or RBC transfusion-a review | |
| RU2711152C1 (en) | Method for unstructured freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c with a hemicolite solution | |
| Aoyama | Transportation of mesenchymal stem cells for clinical applications | |
| Becherucci et al. | Leukapheresis for autologous stem cell transplantation: Comparative study of two different thawing methods WSCFD® Stem Cell Fast Thawer KW versus 37° C thermostatic bath | |
| Shin et al. | Sperm cryopreservation | |
| Khamsuk et al. | The effect of folic acid on post-thaw quality of human spermatozoa | |
| Fakhrildin et al. | Effect of two types and two concentrations of cryoprotectants on ovine oocytes morphology and viability post-vitrification | |
| RU2720771C1 (en) | Method for unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at temperature of minus 80 °c with gemgel solution | |
| Schiewe et al. | Liquid nitrogen vapor sealing of straw containers can be unsafe and detrimental to embryo survival |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161218 |