RU2707921C1 - Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid - Google Patents
Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid Download PDFInfo
- Publication number
- RU2707921C1 RU2707921C1 RU2018143718A RU2018143718A RU2707921C1 RU 2707921 C1 RU2707921 C1 RU 2707921C1 RU 2018143718 A RU2018143718 A RU 2018143718A RU 2018143718 A RU2018143718 A RU 2018143718A RU 2707921 C1 RU2707921 C1 RU 2707921C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- freezing
- stage
- minus
- temperature
- peripheral blood
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
- A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине - трансфузиологии, а именно к технологии криоконсервирования клеток-предшественников периферической крови (КППК) при температуре минус 80°С под защитой криоконсерванта на основе 10% диметилсульфоксида (10% ДМСО). Первоначально при температуре плюс 4°С проводят разбавление 100% раствора ДМСО до 10% концентрации. При тех же условиях проводят добавление криоконсерванта во взвесь аферезных ядросодержащих клеток с КППК, размещенными в криопакете, перемешивают, криопакет запаивают, маркируют и помещают в алюминиевый пенал-холдер. Осуществляют нерегламентированное многоэтапное замораживание клеточной взвеси от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С в электрических рефрижераторах с установленной температурой изотермической холодовой адаптации (TA) в режиме трехступенчатой программы, на первом этапе которой биообъект выдерживают 10 мин при плюс 4°С, на втором этапе биообъект быстро переносят в морозильник с Та минус 28±1°С, t=25 мин., по завершении которого биообъект незамедлительно переносят в морозильник-хранилище с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК. Замороженные КППК отогревают покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 38 плюс 43°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 плюс 4°С. Изобретение позволяет повысить выход устойчивых к действию факторов криоповреждения клеток-предшественников периферической крови и их приживаемость при трансплантации реципиентам.The invention relates to medicine - transfusiology, and in particular to the technology of cryopreservation of peripheral blood precursor cells (PPC) at a temperature of minus 80 ° C under the protection of a cryopreservative based on 10% dimethyl sulfoxide (10% DMSO). Initially, at a temperature of plus 4 ° C, a 100% DMSO solution is diluted to a 10% concentration. Under the same conditions, a cryopreservative is added to a suspension of apheresis of nucleated cells with CPPC placed in a cryopackage, mixed, the cryopacket is sealed, labeled and placed in an aluminum holder. An unregulated multi-stage freezing of cell suspension is carried out from plus 17 ÷ plus 25 ° С to minus 80 ° С in electric refrigerators with a set temperature of isothermal cold adaptation (T A ) in a three-stage program mode, at the first stage of which the bioobject is kept for 10 min at + 4 ° С , at the second stage, the biological object is quickly transferred to the freezer with Ta minus 28 ± 1 ° С, t = 25 min., at the end of which the biological object is immediately transferred to the storage freezer with the set temperature minus 80 ± 2 ° С for final freezing azhivaniya and long-term cryopreservation of PBPC. Frozen KPPK are heated by swaying a cryopackage in an aqueous medium at a temperature of plus 38 plus 43 ° C until a temperature in the cell suspension is reached plus 2 plus 4 ° C. EFFECT: invention allows increasing the yield of cryo-damage factors of peripheral blood precursor cells that are resistant to the action and their survival during transplantation to recipients.
Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С под защитой диметилсульфоксида относится к медицине, в частности к трансфузиологии.The method of unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 ° C under the protection of dimethyl sulfoxide relates to medicine, in particular to transfusion.
В нашей стране и за рубежом все активнее разрабатываются новые и совершенствуются известные способы сохранения КППК при отрицательных температурах для клинических целей. Достигнуты успехи в трансплантации криоконсервированных аутологичных, сингенных и аллогенных гемопоэтическихз стволовых клеток (ГСК). Клеточные взвеси активно используются при лечении лейкозов, апластической анемии, сепсиса, миелодиспластического синдрома, некоторых солидных опухолей, иммунных, радиационных поражений и других патологий у людей и животных. Ключевыми вопросами в криомедицине являются разработка и изучение новых нетоксичных или малотоксичных криоконсервантов, повышающих эффективность криоконсервирования клеток крови и костного мозга.In our country and abroad, more and more are actively developing new and improving well-known methods of preserving KPPK at low temperatures for clinical purposes. Success has been achieved in the transplantation of cryopreserved autologous, syngeneic and allogeneic hematopoietic stem cells (HSCs). Cell suspensions are actively used in the treatment of leukemia, aplastic anemia, sepsis, myelodysplastic syndrome, some solid tumors, immune, radiation injuries and other pathologies in humans and animals. The key issues in cryomedicine are the development and study of new non-toxic or low-toxic cryopreservatives that increase the efficiency of cryopreservation of blood cells and bone marrow.
Несмотря на то, что замораживание и хранение в жидком азоте с контролируемой скоростью охлаждения являются стандартной процедурой для криоконсервации КППК, в трансфузиологии получили развитие технологии замораживания КППК при температуре минус 80°С в электрических рефрижераторах без контроля скорости охлаждения КППК под защитой 10% ДМСО (А.А. Цуцаева и соавт. Криоконсервирование клеточных суспензий. - Киев, Наук, думка. - 1983; Е.А. Гордиенко, Н.С. Пушкарь. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. - Киев, Наук, думка, - 1994. - С. 68-76; Е.П. Сведенцов. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - 80 с. (Коми научный центр УрО РАН) и др.).Despite the fact that freezing and storage in liquid nitrogen with a controlled cooling rate is a standard procedure for cryopreservation of KPPK, transfusiology developed the technology of freezing KPPK at a temperature of minus 80 ° C in electric refrigerators without controlling the cooling rate of KPPK under the protection of 10% DMSO (A .A. Tsutsaeva et al. Cryopreservation of cell suspensions. - Kiev, Science, Dumka. - 1983; EA Gordienko, NS Pushkar. Physical principles of low-temperature preservation of cell suspensions. - Kiev, Science, Dumka, - 1994. - S. 68-76; EP Swedentsov. Cryopreservatives for living cells. - Syktyvkar, 2010. - 80 pp. (Komi Scientific Center, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences), etc.).
Недостатками таких технологий замораживания КППК являются: недостаточная технологичность, испытаны в лаборатории на стадии эксперимента, в качестве криоконсервантов используется 10% ДМСО с показателем поглощения (ПП) в УФ-диапазоне при длине волны 275 нм в пределах порядка 0,325 (что значит вещество токсичное), а дальнейшее разведение криоконсерванта сопряжено с риском контаминации биообъекта, разработаны технологии, где в качестве хладоагентов используются инфицированный тающий лед, дефицитный и опасный для здоровья жидкий азот или токсичные для организма обслуживающего персонала растворы этилового спирта-ректификата с заданной TA (см. пат. РФ №2569834 A01N 1/02. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток», опубл. 27.11. 2015 г., Бюл. №33; см. пат. РФ №2195111, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования клеточных суспензий», опубл. 27.12.2002 г., Бюл. №36). (Е.П. Сведенцов. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - 80 с. (Коми научный центр УрО РАН) и др.).The disadvantages of such KPPK freezing technologies are: lack of manufacturability, tested in the laboratory at the experimental stage, 10% DMSO with absorption coefficient (PP) in the UV range at a wavelength of 275 nm in the range of about 0.325 (which means a toxic substance) is used as cryopreservatives and further dilution of the cryopreservative is associated with the risk of biological object contamination, technologies have been developed where infected melting ice, scarce and hazardous liquid nitrogen or toxic substances are used as refrigerants nye organism for maintenance personnel solutions rectified ethyl alcohol with a given T A (see RF Patent №2569834 A01N 1/02 «Method for cryopreservation of hematopoietic stem cells", publ 27.11 2015 Bul №33;...... cm. Patent of the Russian Federation No. 2195111, A01N 1/02, "Method for the cryopreservation of cell suspensions", published on December 27, 2002, Bull. No. 36). (EP Svedentsov. Cryopreservatives for living cells. - Syktyvkar, 2010. - 80 pp. (Komi Scientific Center, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences), etc.).
В качестве прототипа нами использована технология неконтролируемого замораживания образцов периферической крови при температуре минус 80°С (Uncontrolled-rate freezing and storage at - 80oC, with only 3.5% DMSO in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations / P. Halle, O. Tournilhac, W. Knopinska-Posluzny et al. // Transfusion.- 2001.- Vol. 41.- P. 467-473). В работе дана оценка 109 аутологичных трансплантаций. Криоконсервант содержал 1% человеческого сывороточного альбумина, 2,5% гидроксиэтилкрахмала и 3,5% ДМСО с ПП в пределах 0,325 в конечной концентрации (это токсичное вещество). После смешивания криоконсерванта с суспензией КППК в равных пропорциях биообъект переносили непосредственно в камеру морозильника-хранилища при температуре минус 80°С. Продолжительность криоконсервации в среднем составляла 7 недель, способствовала успешному приживлению трансплантата из расчета средней величины на 1 кг массы тела: NC в среднем 6,34×108 (диапазон 0,02-38,3×108), CD34+ клеток (0,23-58,5×104), CFU-GM (1,38-405,7) и была сравнимой с той, которая была получена при стандартной процедуре контролируемого замораживания КППК. Подбор температуры замораживания КППК был подобран эмпирически лабораторным путем.As a prototype, we used the technology of uncontrolled freezing of peripheral blood samples at a temperature of minus 80 ° C (Uncontrolled-rate freezing and storage at - 80oC, with only 3.5% DMSO in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations / P. Halle, O Tournilhac, W. Knopinska-Posluzny et al. // Transfusion.- 2001.- Vol. 41.- P. 467-473). The paper estimates 109 autologous transplantations. The cryopreservative contained 1% human serum albumin, 2.5% hydroxyethyl starch and 3.5% DMSO with PP in the range of 0.325 at the final concentration (this is a toxic substance). After mixing the cryopreservative with the KPPK suspension in equal proportions, the biological object was transferred directly to the chamber of the storage freezer at a temperature of minus 80 ° С. The duration of cryopreservation on average was 7 weeks; it contributed to the successful graft engraftment based on the average value per 1 kg of body weight: NC on average 6.34 × 108 (range 0.02-38.3 × 108), CD34 + cells (0.23- 58.5 × 104), CFU-GM (1.38–405.7) and was comparable to that obtained using the standard controlled CPPC freezing procedure. The selection of the KPPK freezing temperature was empirically determined by laboratory means.
Недостатком такого способа замораживания КППК являются: способ не отработан для промышленного производства, недостаточно технологичен, использует ДМСО с ПП порядка 0,325, обеспечивает сохранность недостаточного количества полноценных консервированных КППК для трансплантации.The disadvantage of this method of freezing KPPK are: the method is not worked out for industrial production, not technologically advanced, it uses DMSO with PP of the order of 0.325, ensures the safety of an insufficient number of full-fledged canned KPPK for transplantation.
Техническим результатом предложенного решения является: повышение эффективности замораживания взвеси клеток-предшественников периферической крови с использованием криоконсерванта на основе диметилсульфоксида низкой токсичности и современных технических средств.The technical result of the proposed solution is: increasing the efficiency of suspension suspension of peripheral blood precursor cells using a cryopreservative based on low toxicity dimethyl sulfoxide and modern technical means.
Этот результат достигается тем, что в способе нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С под защитой диметилсульфоксида, включающем приготовление раствора криоконсерванта, добавление его с концентрацию взвеси аферезных клеток-предшественников периферической крови со стволовыми клетками в равных пропорциях, подготовку к замораживанию, включающую охлаждение взвеси с клетками-предшественниками периферической крови в камере охлаждения до температуры плюс 4°С и замораживание взвеси с клетками-предшественниками периферической крови в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной на каждом этапе контрольной температурой изотермической холодовой адаптации, при этом в качестве криоконсерванта используют 10% раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с 1111 в пределах 0,200-0,220 при длине волны 275 нм, который в условиях гипотермии добавляют в ареактогенный раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10%, перемешивают при плюс 4°С, выпускают избыточный воздух и часть клеточной взвеси из криопакета, запаивают, маркируют, помещают в алюминиевый пенал-холдер и осуществляют нерегламентированное замораживание клеток-предшественников периферической крови в режиме трехступенчатой программы, на первом этапе которой биообъект выдерживают 10 мин при плюс 4°С, на втором этапе биообъект быстро переносят в морозильник с TA минус 28±1°С, t=25 мин., по завершении которого биообъект незамедлительно переносят в морозильник-хранилище с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК. Замороженные КППК отогревают интенсивным покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 38 ÷ плюс 43°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 ÷ плюс 4°С.This result is achieved by the fact that in the method of unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 ° C under the protection of dimethyl sulfoxide, including the preparation of a cryopreservative solution, adding it with a concentration of suspension of peripheral blood apheresis progenitor cells with stem cells in equal proportions, preparing for freezing, including cooling the suspension with peripheral blood precursor cells in the cooling chamber to a temperature of plus 4 ° C and freezing suspension with peripheral blood precursor cells in a three-stage program mode in electric refrigerators with an isothermal cold adaptation set at each stage of the control temperature, while a 10% high-purity solution of Dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich, France) is used as a cryopreservative (≥ 99.99%) from 1111 within the range of 0.200-0.220 at a wavelength of 275 nm, which is added to the areactogenic solution for infusion of sodium chloride 2.25 g and water for injection up to 250 ml in a plastic container under floor conditions under hypothermia DMSO concentration studies of 10%, mix at plus 4 ° C, release excess air and part of the cell suspension from the cryopackage, seal, mark, place in an aluminum pencil holder and carry out unregulated freezing of peripheral blood progenitor cells in a three-stage program, at the first stage which the bioobject can withstand for 10 minutes at plus 4 ° С, in the second stage the bioobject is quickly transferred to the freezer with T A minus 28 ± 1 ° С, t = 25 min., after which the bioobject is immediately transferred to the storage freezer e with a predetermined temperature of minus 80 ± 2 ° С for final freezing and long-term cryopreservation of CPPP. Frozen KPPKs are heated by intensive swaying of a cryopackage in an aqueous medium at a temperature of plus 38 ÷ plus 43 ° C until a temperature in the cell suspension plus 2 ÷ plus 4 ° C is reached.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - приготовление криоконсерванта в камере охлаждения при плюс 4±1°С; Б - добавление криоконсерванта в концентрат клеток-предшественников периферической крови в равных пропорциях в условиях гипотермии плюс 4±1°С; В - многоэтапное замораживание взвеси с КППК от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК с использованием электрорефрижераторов с установленной контрольной температурой на каждом этапе замораживания.The essential features of the proposed method, which coincide with the known features, are: A - preparation of the cryopreservative in the cooling chamber at plus 4 ± 1 ° C; B - the addition of a cryopreservative to the concentrate of peripheral blood precursor cells in equal proportions under hypothermia plus 4 ± 1 ° C; C - multi-stage freezing of suspension with KPPK from plus 17 ÷ plus 25 ° С to minus 80 ° С for final freezing and long-term cryopreservation of KPPK using electric refrigerators with a set control temperature at each freezing stage.
Существенными отличительными признаками способа нерегламентированного замораживания КППК при температуре минус 80°С под защитой 10% DMSO являются: Г - низкая токсичность криоконсерванта: в известном способе использовали ДМСО с ПП порядка 0,325 (это вещество токсичное), в заявляемом способе используют раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с ПП порядка 0,200-0,220 (это очень чисто); в известном способе 100% ДМСО разбавляли 1% раствором человеческого альбумина с риском развития аллергических реакций в виде крапивницы, анафилактического шока и других жизнеугрожающих осложнений; в заявляемом способе ДМСО разводят аректогенным раствором для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10%, который медленно добавляют в концентрат аферезных КППК в равных пропорциях, постоянно перемешивая в пластиковом криопакете, удаляют из него избыточный воздух и часть клеточной взвеси для лабораторных исследований, после чего криопакет герметизируют, маркируют и помещают в алюминиевый пенал-холдер. Д - осуществляют нерегламентированное замораживание, на первом этапе которого биообъект выдерживают 10 мин в электрическом холодильнике марки Sanyo MBR-506D с установленной температурой плюс 4±1°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник марки Sanyo MDF-U5411 с заданной ТА минус 28±1°С и выдерживают в этих условиях в течение 25 мин., на третьем этапе биообъект переносят в морозильник-хранилище марки Sanyo MDF-U53 с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК.Salient features of the method of unregulated freezing of KPPK at a temperature of minus 80 ° C under the protection of 10% DMSO are: G - low toxicity of the cryopreservative: in the known method, DMSO with PP of the order of 0.325 (this substance is toxic) was used in the present method using a solution of Dimethylsulfoxide (Sigma -Aldrich ”, France) with a high degree of purification (≥99.99%) with PP of the order of 0.200-0.220 (this is very pure); in the known method, 100% DMSO was diluted with 1% solution of human albumin with the risk of allergic reactions in the form of urticaria, anaphylactic shock and other life-threatening complications; in the inventive method, DMSO is diluted with an aretogenic solution for infusion from sodium chloride 2.25 g and water for injection up to 250 ml in a plastic container until a DMSO concentration of 10% is obtained, which is slowly added to the apheresis concentrate PPCC in equal proportions, constantly mixing in a plastic cryopack, excess air and part of the cell suspension for laboratory tests are removed from it, after which the cryopack is sealed, marked and placed in an aluminum pencil case. D - carry out an unregulated freezing, at the first stage of which the biological object is kept for 10 min in an Sanyo MBR-506D brand electric refrigerator with a set temperature plus 4 ± 1 ° С, at the second stage, the biological object is transferred to a Sanyo MDF-U5411 brand electric freezer with a set TA minus 28 ± 1 ° C and maintained under these conditions for 25 min., At the third stage, the biological object is transferred to a Sanyo MDF-U53 brand freezer-storage with a predetermined temperature of minus 80 ± 2 ° C for final freezing and long-term cryopreservation of KPPK.
Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре -80оС под защитой DMSO заключается в следующем (пример выполнения):The method of unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of -80 ° C under the protection of DMSO is as follows (example of execution):
- производят заготовку концентрата КППК. Концентрат КППК получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 80,0 до 150,0 (96,30±7,3) мл в стандартную эластичную полимерную упаковку, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты;- produce the preparation of KPPK concentrate. KPPK concentrate is obtained by separation on an Amicus apparatus in a volume of 80.0 to 150.0 (96.30 ± 7.3) ml in a standard flexible polymer package, from where they are transferred to plastic cryopackages in a closed way;
- готовят криоконсервирующий раствор, для чего берут раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) без запаха с ПП в пределах 0,200-0,220 и в условиях гипотермии плюс 4°С медленно добавляют его в плазмозамещающий ареактогенный раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения конечной концентрации DMSO 10%, постоянно перемешивая, герметизируют, маркируют и помещают его для охлаждения в электрический холодильник до температуры плюс 4°С;- prepare a cryopreservation solution, for which they take a solution of Dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich, France) with a high degree of purification (≥99.99%), odorless with PP in the range of 0.200-0.220 and slowly add it to hypothermia plus 4 ° С in plasma substituting areactogenic solution for infusions from sodium chloride 2.25 g and water for injection up to 250 ml in a plastic container until a final concentration of DMSO of 10% is obtained, constantly mixing, seal, mark and place it to cool in an electric refrigerator to a temperature of + 4 ° C ;
- производят подготовку полученной клеточной взвеси к замораживанию: для этого охлажденный до температуры плюс 4°С 10% раствор DMSO медленно добавляют в концентрат аферезных КППК в равных пропорциях, постоянно перемешивая в пластиковом криопакете, удаляют из него избыточный воздух, разливают по пробиркам для криоконсервации по 1,5 мл в каждую, герметизируют, маркируют и через порт-луер берут пробу одноразовым шприцем для количественной и качественной оценки клеточного материала, криопакет помещают в алюминиевый пенал-холдер;- the resulting cell suspension is prepared for freezing: for this, a 10% DMSO solution cooled to a temperature of + 4 ° C is slowly added to the apheresis concentrate in equal proportions, constantly mixing in a plastic cryopack, excess air is removed from it, and poured into cryopreservation tubes according to 1.5 ml in each, sealed, labeled and through a port luer take a sample with a disposable syringe for quantitative and qualitative assessment of the cellular material, the cryopackage is placed in an aluminum pencil case;
- производят нерегламентированное замораживание КППК от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С. Криобиологическую технологию осуществляют в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной температурой изотермической холодовой адаптации (TA), на первом этапе которого биообъект выдерживают 10 мин в электрическом холодильнике Sanyo MBR-506D с установленной температурой плюс 4±1°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник Sanyo MDF-U5411 с заданной TA минус 28±1°С и выдерживают в этих условиях в течение 25 мин., на третьем этапе биообъект переносят в морозильник-хранилище Sanyo MDF-U53 с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК;- produce unregulated freezing KPPK from plus 17 ÷ plus 25 ° C to minus 80 ° C. Cryobiological technology is carried out in a three-stage program mode in electric refrigerators with a set temperature of isothermal cold adaptation (T A ), at the first stage of which the biological object is kept for 10 minutes in an Sanyo MBR-506D electric refrigerator with a set temperature of + 4 ± 1 ° С, at the second stage, the biological object transferred into elektromorozilnik Sanyo MDF-U5411 with a given T a -28 ± 1 ° C and maintained under these conditions for 25 min., in the third step bioobject transferred to freezer storage Sanyo MDF-U53 with a predetermined temperature minutes minus 80 ± 2 ° C for final freezing and long-term cryopreservation PBPC;
- замороженные КППК отогревают интенсивным покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 38 ÷ плюс 43°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 ÷ плюс 4°С.- frozen KPPK are heated by intensive swaying of a cryopackage in an aqueous medium at a temperature of plus 38 ÷ plus 43 ° С until the temperature in the cell suspension is reached plus 2 ÷ plus 4 ° С.
После замораживания КППК известным способом в режиме Та минус 28±1°С, t=25 мин количество МКЦ (миелокариоцитов) составляло 89,85±7,8%, мононуклеаров (в т.ч. бласты, промиелоциты, миелоциты, лимфоцитф, моноциты) - 82,3±11,8%, из них жизнеспособных (устойчивых к витальному красителю) - 87,5±19,8%, CD34+клеток - 73,93±17,6%, КОЕс (колониеобразующих единиц) - 54,2±2,7%, КлОЕ (кластерообразующих единиц) - 30,60±16,5%.After freezing KPPK in a known manner in the Ta mode minus 28 ± 1 ° С, t = 25 min, the number of MCC (myelocaryocytes) was 89.85 ± 7.8%, mononuclear cells (including blasts, promyelocytes, myelocytes, lymphocytes, monocytes ) - 82.3 ± 11.8%, of which viable (resistant to vital dye) - 87.5 ± 19.8%, CD34 + cells - 73.93 ± 17.6%, CFU (colony forming units) - 54 , 2 ± 2.7%, ClOE (cluster-forming units) - 30.60 ± 16.5%.
После замораживания КППК предлагаемым способом в режиме Та минус 28±1°С, t=25 мин количество МКЦ (миелокариоцитов) составляло 89,85±7,8%, мононуклеаров (в т.ч. бласты, промиелоциты, миелоциты, лимфоцитф, моноциты) - 82,3±11,8%, из них жизнеспособных (устойчивых к витальному красителю) - 87,5±19,8%,After freezing KPPK with the proposed method in Ta mode minus 28 ± 1 ° С, t = 25 min, the number of MCC (myelocaryocytes) was 89.85 ± 7.8%, mononuclear cells (including blasts, promyelocytes, myelocytes, lymphocytes, monocytes ) - 82.3 ± 11.8%, of which viable (resistant to vital dye) - 87.5 ± 19.8%,
CD34+клеток - 73,93±17,6%, КОЕс (колониеобразующих единиц) - 54,2±2,7%, КлОЕ (кластерообразующих единиц) - 30,60±16,5%.CD34 + cells - 73.93 ± 17.6%, CFUc (colony forming units) - 54.2 ± 2.7%, ClOE (cluster forming units) - 30.60 ± 16.5%.
Сравнительный анализ результатов криоконсервирования КППК, замороженных известным и заявляемым способами предоставлен в табл.1.A comparative analysis of the results of cryopreservation of KPPK frozen by known and claimed methods is provided in Table 1.
Примечание: выделенные жирным петитом цифры имеют p<0,05 к известному способу замораживания КППК.Note: the numbers highlighted in bold petite have p <0.05 to the known method of freezing KPPK.
Использование технического решения «Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С под защитой диметилсульфоксида» по сравнению с прототипом позволяет повысить сохранность клеток-предшественников периферической крови, жизнеспособность при криоконсервации благодаря тому, что в качестве криоконсерванта используют 10% Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,9%) с ПП в пределах 0,200-0,220, который разбавляют в плазмозамещающем ареактогенном растворе для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций (заменитель 1% альбумина и аутоплазмы), что позволяет снизить токсичность криоконсервирующего раствора и риски посттрансфузионных осложнений. Использование современных лицензионных электрических рефрижераторов иностранного производства (Франции) позволяет повысит технологичность процесса нерегламентированного замораживания, провести охлаждение биообъектов согласно контрольных режимов температуры холодовой адаптации, повысить в конечном итоге получение более качественного продукта.Using the technical solution "Method of unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 ° C under the protection of dimethyl sulfoxide" in comparison with the prototype allows to increase the safety of peripheral blood precursor cells, viability during cryopreservation due to the fact that 10% Dimethylsulfoxide is used as a cryopreservative ( Sigma-Aldrich, France) with a high degree of purification (≥99.9%) with PP in the range of 0.200-0.220, which is diluted in a plasma-replacing areactogenic solution for infusion 2.25 g of sodium chloride and water for injection (a substitute for 1% albumin and autoplasma), which reduces the toxicity of the cryopreservation solution and the risks of post-transfusion complications. The use of modern licensed electric refrigerators of foreign manufacture (France) makes it possible to increase the manufacturability of the process of unregulated freezing, to cool biological objects in accordance with the control temperature regimes of cold adaptation, and ultimately to obtain a better product.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования КППК.When using funds of scientific and technical literature, equivalent solutions were not found, which confirms the novelty of the proposed method of cryopreservation of KPPK.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.The use of simple techniques and available equipment confirms industrial applicability.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.The non-obviousness and original approach to solving the problem confirms the inventive step.
Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».The studies were carried out on the basis of the laboratory of cellular technologies of the Federal State Budget Scientific Institution Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion FMBA of Russia
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143718A RU2707921C1 (en) | 2018-12-10 | 2018-12-10 | Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143718A RU2707921C1 (en) | 2018-12-10 | 2018-12-10 | Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2707921C1 true RU2707921C1 (en) | 2019-12-02 |
Family
ID=68836344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018143718A RU2707921C1 (en) | 2018-12-10 | 2018-12-10 | Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2707921C1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144290C1 (en) * | 1998-08-26 | 2000-01-20 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method of bone marrow preservation |
| UA56085C2 (en) * | 2002-11-08 | 2005-06-15 | Halyna Stepanivna Lobintseva | Method of obtaining a preparation of placenta cell suspension |
| RU2416197C1 (en) * | 2009-12-11 | 2011-04-20 | Александр Борисович Смолянинов | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
| CN104705291A (en) * | 2015-04-03 | 2015-06-17 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | Mononuclear cell frozen stock solution of cord blood, application and preparation method |
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| US20170202212A1 (en) * | 2016-01-14 | 2017-07-20 | DePuy Synthes Products, Inc. | Composition and methods for cryopreservation of hutc |
-
2018
- 2018-12-10 RU RU2018143718A patent/RU2707921C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144290C1 (en) * | 1998-08-26 | 2000-01-20 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method of bone marrow preservation |
| UA56085C2 (en) * | 2002-11-08 | 2005-06-15 | Halyna Stepanivna Lobintseva | Method of obtaining a preparation of placenta cell suspension |
| RU2416197C1 (en) * | 2009-12-11 | 2011-04-20 | Александр Борисович Смолянинов | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
| CN104705291A (en) * | 2015-04-03 | 2015-06-17 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | Mononuclear cell frozen stock solution of cord blood, application and preparation method |
| US20170202212A1 (en) * | 2016-01-14 | 2017-07-20 | DePuy Synthes Products, Inc. | Composition and methods for cryopreservation of hutc |
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jang et al. | Cryopreservation and its clinical applications | |
| Berz et al. | Cryopreservation of hematopoietic stem cells | |
| Balint et al. | The cryopreservation protocol optimal for progenitor recovery is not optimal for preservation of marrow repopulating ability | |
| Yao et al. | Cryopreservation of NK and T cells without DMSO for adoptive cell-based immunotherapy | |
| ES2588438T3 (en) | Materials and methods for hypothermic whole blood collection | |
| RU2416197C1 (en) | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood | |
| RU2624214C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| RU2707921C1 (en) | Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid | |
| US20220354108A1 (en) | Preservation methods using trehalose with other cryoprotectants being absent from the cryopreservation protocol | |
| Woods et al. | Cord blood stem cell cryopreservation | |
| RU2639892C1 (en) | Method for human nucleated blood cells cryopreservation at temperature of minus 80°c | |
| RU2711152C1 (en) | Method for unstructured freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c with a hemicolite solution | |
| Balint et al. | Cellular cryobiology: A review of basic concepts and" operating design" of cryopreserved cells | |
| RU2263448C1 (en) | Method of cryopreservation of umbilical blood | |
| RU2569834C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| RU2744614C1 (en) | Method for reducing toxicity of cryopreservation solution based on dimethyl sulfoxide after thawing of hematopoietic stem cells | |
| Mantri et al. | Trehalose: effect on cryopreservation of umbilical cord blood-derived hematopoietic stem cells | |
| Fakhrildin et al. | Effect of two types and two concentrations of cryoprotectants on ovine oocytes morphology and viability post-vitrification | |
| RU2716574C1 (en) | Method for adrift freezing of peripheral blood precursor cells at a temperature of minus 80 °c with a solution of hemodiolite | |
| McKenna et al. | Cellular Engineering: Hematopoietic Transplant, Immune Cell Therapy, and Regenerative Medicine | |
| Holter et al. | Successful autologous stem-cell transplantation after 21 years of cryopreservation | |
| Kozlowska-Skrzypczak et al. | Analysis of the effect of cryoprotectant medium composition to viability of autologous hematopoietic cells collected by leukapheresis | |
| RU2720771C1 (en) | Method for unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at temperature of minus 80 °c with gemgel solution | |
| KR101101308B1 (en) | Cryopreservation medium composition of human-derived mononuclear cells | |
| Woods et al. | 61. Cryopreservation of dental pulp for recovery of stem cell populations—A preliminary study |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201211 |