ES2620131T3 - Nucleótidos marcados - Google Patents

Abstract

Una molécula de nucleótido o nucleósido, que tiene una base que se une a un marcador detectable a través de un enlazador escindible, en donde la molécula tiene una porción de azúcar ribosa o desoxirribosa que comprende un grupo protector unido a través del átomo de oxígeno 2' o 3' y el enlazador escindible y el grupo protector son escindibles bajo condiciones idénticas y en donde el enlazador puede ser escindido por exposición a radicales, metales, agentes reductores o agentes oxidantes.

Description

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Antraceno), 7.48 (d, J = 7.9 Hz, 1 H, H-3), 7.95 (dd, J = 8.1 Hz, J = 1.9 Hz, 1 H, H-2) 8.13 (d, J = 1.9 Hz, 1 H, H-1).+ve electro pulverización (C30H31N3O6S2): esperado 593.17; encontrado 594.3 [M+H], 616.2 [M+Na].

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20 A una solución de 25.8 mg de 1c (43.4 µmol) en 3 mL de DMF (seco) se añadió 9.9 mg N-hidroxi succinimida (86.8 µmol) y 9.7 mg de DCC (47.1 µmol).La mezcla se agitó durante 5 h en la oscuridad a temperatura ambiente y después se puso en la nevera durante toda la noche. La mezcla se filtró a través de un tapón de algodón en un nuevo matraz y a esto se añadió una solución de 865 µL de propargilamino dUTP (14.7 µmol, 17 µmol en 1 mL de H2O) y 3 mL de amortiguador borato sódico (solución 0.1 M, pH 9).La mezcla se agitó toda la noche. Después de la eliminación de los

25 disolventes el residuo se disolvió en tan poca agua como fue posible y se purificó mediante HPLC. Se usó una columna Zorbax C18 con bicarbonato de trietilamonio 0.1 M (TEAB) y acetonitrilo como amortiguadores. 31P NMR (400 MHz, D2O) : δ = -4.73 (d), -9.93 (d), 19.03 (t).-ve electro pulverización (C42H47N6O19P3S2 asumiendo 4 H+ contra iones): esperado 1096.16; encontrado 1092.9.UV en Agua: λ(max) = 555 nm A(555) = 0.885 (c = 0.036 µmol).

30 Se incorporó satisfactoriamente trifosfato (1) usando ADN polimerasa de Klenow.La reacción se realizó en las siguientes condiciones:50 mM Tris.HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 2µM compuesto 3, 100 nM DNA molde (marcado previamente con P32 y T4 polinucleótido quinasa) y 10 unidades de exo-Klenow comercial (Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA).Los moldes de ADN fueron horquillas auto complementarias (5'-TACCgTCgACgTCgACgCTggCg-AgCgTgCTgCggTTTTT(C6-amino)TTACCgCAgCACgCTCgCCAgCg; Sec. con núm.

35 de ident:1).La reacción se realizó en un volumen de 100 µL a 37 ºC con puntos de tiempo tomados a 0, 1, 3, 5 y 10 min. Los productos de reacción se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (8 M de urea) al 20 % y se formaron imágenes en un PhosphorImager para Typhoon. Se observó una extensión de una sola base completa en 1 minuto que indica una incorporación eficiente de la polimerasa (gel de enlace disulfuro Figura. 4). Un segundo conjunto de carriles se muestra en el que el material se expone al DTT después de la incorporación. Un

40 cambio de banda diferente puede observarse el cual muestra la eliminación del colorante del constructo de ADN, de este modo se ha mostrado un ciclo de incorporación de la polimerasa y de escisión que usa este compuesto de disulfuro.

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Claims (1)

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