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ES2407681T3 - Nucleótidos modificados para la secuenciación de polinucleótidos. - Google Patents

Nucleótidos modificados para la secuenciación de polinucleótidos. Download PDF

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ES2407681T3
ES2407681T3 ES03792519T ES03792519T ES2407681T3 ES 2407681 T3 ES2407681 T3 ES 2407681T3 ES 03792519 T ES03792519 T ES 03792519T ES 03792519 T ES03792519 T ES 03792519T ES 2407681 T3 ES2407681 T3 ES 2407681T3
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nucleotides
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ES03792519T
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John Milton
Xiaolin Wu
Mark Smith
Joseph Brennan
Colin Barnes
Xiaohai Liu
Silke Ruediger
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Solexa Ltd Great Britain
Illumina Cambridge Ltd
Original Assignee
Solexa Ltd Great Britain
Illumina Cambridge Ltd
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Abstract

Una molécula de nucleótido modificada que comprende una base purina o pirimidina y una porción de azúcarribosa o deoxiribosa con un grupo de bloqueo 3'-OH removible covalentemente unido a ella, tal que el átomo decarbono 3' tiene unido un grupo de la estructura-O-Zen donde Z es cualquiera de -C(R')2-N(R")2'C(R')2-N(H)R", y -C(R')2-N3,en donde cada R" es, o es parte de un grupo protector removible; cada R' es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo, alquenilo,alquinilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, acilo, ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido, o un marcadordetectable unido a través de un grupo de enlace; o (R')2 representa un grupo alquilideno de la fórmula >=C(R''')2en donde cada R''' puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que comprende átomos de hidrógeno yhalógeno y grupos alquilo; y en donde dicha molécula puede reaccionar para producir un producto intermedio en el cual cada R" se intercambia porH, dicho producto intermedio se disocia bajo condiciones acuosas para proporcionar una molécula con un 3'OHlibre.

Description

Nucleótidos modificados para la secuenciación de polinucléotidos
La invención se relaciona con nucleótidos modificados. Particularmente, esta invención describe nucleótidos que tienen un grupo protector removible, su uso en los métodos de secuenciación de polinucleótidos y un método para la desprotección química del grupo protector.
Los avances en el estudio de moléculas se han dirigido, en parte, por el mejoramiento en las tecnologías usadas para caracterizar las moléculas o sus reacciones biológicas. En particular, el estudio de los ácidos nucleicos ADN y ARN se ha beneficiado de tecnologías en desarrollo usadas para el análisis de secuencia y el estudio de eventos de hibridación.
Un ejemplo de las tecnologías que han mejorado el estudio de los ácidos nucleicos es el desarrollo de matrices fabricadas de ácidos nucleicos inmovilizados. Estas matrices consisten típicamente en una matriz de alta densidad de polinucleótidos inmovilizados sobre un material de soporte sólido. Ver, por ejemplo, Fodor y otros, Trends Biotech. 12:1926, 1994, que describe formas de ensamblar los ácidos nucleicos usando una superficie de vidrio sensibilizada químicamente protegida por una máscara, pero expuesta en áreas definidas para permitir la unión de fosforamiditas de nucleótidos modificados adecuadamente. Las matrices fabricadas también se pueden producir mediante la técnica de "impresión" de polinucleótidos conocidos sobre un soporte sólido en posiciones predeterminadas (por ejemplo, Stimpson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 92:6379-6383, 1995).
La secuenciación por síntesis de ADN requiere idealmente la incorporación controlada (es decir, uno a la vez) del nucleótido complementario correcto opuesto al oligonucleótido que está siendo secuenciado. Esto permite la secuenciación precisa mediante la adición de nucleótidos en múltiples ciclos ya que cada residuo de nucleótido se secuencia de uno en uno, evitando así que ocurra una serie no controlada de incorporaciones. El nucleótido incorporado se lee usando un marcador adecuado unido a este antes de la separación de la porción del marcador y la siguiente ronda posterior de la secuenciación. Con el fin de garantizar que se produzca solamente una única incorporación, se requiere una modificación estructural ("grupo de bloqueo") de los nucleótidos de secuenciación para asegurar una incorporación de un único nucleótido, pero esto impide después cualquier incorporación de nucleótidos adicional en la cadena de polinucleótidos. El grupo de bloqueo debe entonces ser eliminado, bajo condiciones de reacción que no interfieren con la integridad del ADN que se secuencia. El ciclo de secuenciación puede continuar después con la incorporación del siguiente nucleótido marcado, bloqueado. Con el fin de ser de uso práctico, el proceso entero debe consistir en etapas enzimáticas y químicas altamente específicas, y de alto rendimiento para facilitar múltiples ciclos de secuenciación.
Para ser útiles en la secuenciación del ADN, los nucleótidos, y más usualmente los trifosfatos de nucleótidos, generalmente requieren un grupo de bloqueo 3' OH para evitar que la polimerasa usada para incorporarla en una cadena de polinucleótidos continúe replicándose una vez que se añade la base en el nucleótido. Existen muchas limitaciones sobre la idoneidad de una molécula como un grupo de bloqueo. Esta debe ser tal como para impedir que las moléculas de nucleótido adicionales se añadan a la cadena de polinucleótidos mientras que al mismo tiempo sean fácilmente extraíbles de la porción de azúcar sin causar daño a la cadena de polinucleótidos. Además, el nucleótido modificado debe ser tolerado por la polimerasa u otra enzima adecuada que se usa para incorporar en la cadena de polinucleótidos. El grupo de bloqueo ideal por lo tanto exhibirá una estabilidad a largo plazo, eficientemente incorporado por la enzima polimerasa, causará un bloqueo total de incorporación secundaria o adicional y tendrá la capacidad de ser eliminado bajo condiciones suaves que no causen daño a la estructura del polinucleótido, preferentemente en condiciones acuosas. Estos estrictos requerimientos son obstáculos formidables para el diseño y la síntesis de los nucleótidos modificados requeridos.
Los grupos de bloqueo reversibles para este fin se han descrito anteriormente, pero ninguno de ellos generalmente reúne los criterios anteriores para los polinucleótidos, por ejemplo, la química compatible con el ADN.
Metzker y otros, (Nucleic Acids Research, 22(20): 4259-4267, 1994) describe la síntesis y uso de ocho 5'-trifosfatos de 2deoxiribonucleósido 3'-modificado (dNTP 3'-modificado) y la prueba en dos ensayos del molde de ADN para la actividad de incorporación. Los dNTP 3' modificados incluyen el 3' alil 5'-trifosfato de deoxiriboadenosina (3'-alil dATP). Sin embargo, el compuesto 3' alilo bloqueado no se usó para demostrar un ciclo completo de la terminación, la desprotección y la reiniciación de la síntesis de ADN: los únicos resultados de la prueba presentados fueron los que mostraron la capacidad de este compuesto para terminar la síntesis de ADN en un ensayo único de terminación, de esos ocho ensayos realizados, cada uno con una ADN polimerasa diferente.
La solicitud de patente internacional WO02/29003 (The Trustees of Columbia University in the City of New York) describe un método de secuenciación el cual, puede incluir el uso de un grupo protector alilo para tapar el grupo 3'-OH en una cadena creciente de ADN en una reacción de la polimerasa. El grupo alilo se introduce de acuerdo con el procedimiento de Metzker (más abajo) y se dice que se eliminó usando la metodología reportada por Kamal y otros (Tet. Let, 40, 371372, 1999).
La metodología de desprotección de Kamal emplea yoduro de sodio y clorotrimetilsilano a fin de generar yodotrimetilsilano in situ, en disolvente de acetonitrilo, inactivando el tiosulfato de sodio. Después de la extracción en acetato de etilo y el secado (sulfato de sodio), a continuación la concentración a presión reducida y la cromatografía en columna (acetato de etilo:hexano; 2:3 como eluyente), se obtuvieron alcoholes libres al 90-98% de rendimiento.
En WO02/29003, la desprotección del alilo de Kamal se sugiere como directamente aplicable en la secuenciación del ADN sin modificación, siendo las condiciones de Kamal suaves y específicas.
Aunque Metzker informa la preparación de un nucleótido o el nucleósido 3' alilo bloqueado y la solicitud de patente internacional WO02/29003 sugiere el uso de la funcionalidad alilo como una caperuza 3' OH durante la secuenciación, ninguno de estos documentos enseña realmente la desprotección del grupo hidroxilo 3'-alilado en el contexto de un protocolo de secuenciación. Aunque el uso de un grupo alilo como un grupo protector de hidroxilo es bien conocido es fácil de introducir y es estable a través de todo el intervalo de pH y a temperaturas elevadas, no existe hasta la fecha, una modalidad concreta de la escisión exitosa de un grupo 3' alilo en condiciones compatibles del ADN, es decir, las condiciones en las que la integridad del ADN no esté total o parcialmente destruida. En otras palabras, no ha sido posible hasta ahora usar nucleótidos 3' alilo OH bloqueados para llevar a cabo la secuenciación del ADN.
La metodología de Kamal es inadecuada para realizarla en medios acuosos, ya que el cloruro de TMS se hidrolizará previniendo la generación in situ de yoduro de TMS. Los intentos para llevar a cabo la desprotección de Kamal (en acetonitrilo) en la secuenciación no han tenido éxito en nuestras manos.
La presente invención se basa en el sorprendente desarrollo de un número de grupos de bloqueo reversibles y los métodos de desprotección de ellos en condiciones compatibles con el ADN. Algunos de estos grupos de bloqueo son nuevos per se, mientras que otros se han descrito en la técnica anterior, pero, como se señaló anteriormente, no ha sido posible usar estos grupos de bloqueo en la secuenciación del ADN.
Una característica de la invención se deriva del desarrollo de un método completamente nuevo de desprotección de alilo. Nuestro procedimiento es de amplia aplicabilidad para la desprotección de prácticamente toda la funcionalidad del hidroxilo protegido con alilo y se puede efectuar en solución acuosa, en contraste a la metodología de Kamal y otros (que se lleva a cabo en acetonitrilo) y a los otros métodos conocidos generalmente en la técnica anterior que son altamente sensibles al oxígeno y a la humedad. Una característica adicional de la invención se deriva de la elaboración de una nueva clase de grupos protectores. Estos se basan en acetales y grupos protectores relacionados, pero que no sufren de algunas de las desventajas de la desprotección del acetal conocida en la técnica anterior.
La metodología de desprotección de alilo hace uso de un catalizador de metal de transición soluble en agua formado a partir de un metal de transición y ligandos al menos parcialmente solubles en agua. En solución acuosa, estos forman complejos de metales de transición al menos parcialmente solubles en agua. Por solución acuosa en la presente descripción se entiende un líquido que comprende al menos 20 % en vol, preferentemente al menos 50%, por ejemplo al menos 75 % en vol, particularmente al menos 95 % en vol y especialmente mayor que por encima de 98 % en vol, idealmente 100 % en vol de agua como la fase continua.
Como los expertos en la técnica apreciarán, el grupo alilo puede ser usado no solamente para proteger el grupo hidroxilo sino también las funcionalidades tiol y amina. Además se pueden formar ésteres alílicos a partir de la reacción entre ácidos carboxílicos y haluros de alilo, por ejemplo. Las amidas primarias o secundarias también pueden protegerse usando métodos conocidos en la técnica. La nueva metodología de desprotección descrita en la presente se puede usar en la desprotección de todos estos compuestos alilados, por ejemplo, ésteres de alilo y aminas primarias mono o bialilada o amidas aliladas, o en la desprotección de aminas secundarias aliladas. El método también es adecuado en la desprotección de ésteres y tioéteres de alilo.
Los grupos protectores que comprenden la funcionalidad acetal se han usado anteriormente como grupos de bloqueo. Sin embargo, la eliminación de tales grupos y éteres requiere desprotecciones fuertemente ácidas perjudiciales para las moléculas de ADN. La hidrólisis de un acetal sin embargo, resulta en la formación de un intermediario inestable hemiacetal que se hidroliza bajo condiciones acuosas para el grupo hidroxilo natural. Los inventores han usado este concepto y se aplica adicionalmente de tal manera que esta característica de la invención reside en la utilización de grupos de bloqueo que incluyen grupos protectores para proteger moléculas intermedias que normalmente se hidrolizan en condiciones acuosas. Estos grupos protectores comprenden un segundo grupo funcional que estabiliza la estructura del intermediario pero que pueden ser eliminados en una etapa posterior seguida de la incorporación en el polinucleótido. Los grupos protectores se han usado en reacciones de síntesis orgánica para enmascarar temporalmente la química característica de un grupo funcional, porque interfiere con otra reacción.
Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto, se proporciona una molécula de nucleótido o nucleósido modificado que comprende una base de purina o pirimidina y una porción de azúcar ribosa o desoxirribosa que tiene un grupo de bloqueo 3'-OH removible unido covalentemente a ella, de tal manera que el átomo de carbono 3' tiene unido un grupo de la estructura
-O-Z
en donde Z es cualquiera de -C(R')2-O-R". -C(R')2-N(R")2,-C(R')2-N(H)R", -C(R')2-S-R" y -C(R')2-F, en donde cada R" es, o es parte de un grupo protector removible; cada R' es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, acilo, ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido, o un marcados detectable unido a través de un grupo de enlace; o (R')2 representa un grupo alquilideno de la fórmula =C(R"')2 en donde cada R''' puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que comprende átomos de hidrógeno y halógeno y grupos alquilo; y en donde dicha molécula puede reaccionar para producir un producto intermedio en el cual cada R" se intercambia por H o, donde Z es -C(R')2-F, el F se intercambia por OH, SH o NH2, preferentemente OH, dicho producto intermedio se disocia bajo condiciones acuosas para proporcionar una molécula con un 3'OH libre; siempre que donde Z sea -C(R')2-S-R", ambos grupos R' no son H.
Visto desde otro aspecto, la descripción proporciona un nucleótido o nucleósido 3'-O-alilo cuyo nucleótido o nucleósido comprende un marcador detectable unido a la base del nucleósido o nucleótido, preferentemente por un enlazador escindible.
En un aspecto adicional, la descripción proporciona un polinucleótido que comprende un nucleótido o nucleósido 3'-Oalilo cuyo nucleótido o nucleósido comprende un marcador detectable unido a la base del nucleósido o nucleótido, preferentemente por un enlazador escindible.
Visto aún desde otro aspecto adicional, la descripción proporciona un método para convertir un compuesto de la fórmula R-O-alilo, R2N (alilo), RNH (alilo), RN (alilo)2 o R-S-alilo en un compuesto correspondiente en el cual el grupo alilo se elimina y se reemplaza por hidrógeno, dicho método comprende las etapas de reaccionar un compuesto de la fórmula RO-alilo, R2N (alilo), RNH(alilo), RN (alilo)2 o R-S-alilo en solución acuosa con un metal de transición que comprende un metal de transición y uno o más ligandos seleccionados del grupo que comprende fosfina soluble en agua y ligandos de fosfina que contienen nitrógeno solubles en agua, en donde el o cada R es una molécula biológica soluble en agua.
En un aspecto adicional la descripción proporciona un método para controlar la incorporación de una molécula de nucleótido complementaria al nucleótido en un polinucleótido objetivo de cadena sencilla en una reacción de secuenciación o síntesis que comprende incorporar en el polinucleótido creciente complementario una molécula de acuerdo con la invención, la incorporación de dicha molécula previene o bloquea la introducción de moléculas de nucleósidos o nucleótidos posteriores en dicho polinucleótido creciente complementario.
En un aspecto adicional la descripción proporciona un método para determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla, que comprende monitorear la incorporación secuencial de nucleótidos complementarios, en donde al menos una incorporación, y preferentemente todas las incorporaciones es de un nucleótido de acuerdo con la invención como se describió anteriormente que comprende preferentemente un marcador detectable unido a la base de los nucleósidos o nucleótido por un enlazador escindible y en donde la identidad del nucleótido incorporado se determina detectando el marcador, dicho grupo de bloqueo y dicho marcador se eliminan antes de la introducción del siguiente nucleótido complementario.
A partir de un aspecto adicional, la descripción proporciona un método para determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla, que comprende:
(a)
proporcionar una pluralidad de diferentes nucleótidos de conformidad con la invención anteriormente descrita donde los nucleótidos están unidos preferentemente de la base a un marcador detectable por un enlazador escindible y en donde el marcador detectable unido a cada tipo de nucleótido puede distinguirse tras la detección del marcador detectable usado para otros tipos de nucleótidos;
(b)
incorporar el nucleótido en el complemento del polinucleótido objetivo de cadena sencilla;
(c)
detectar el marcador del nucleótido de (b), y de ese modo determinar el tipo de nucleótido incorporado;
(d)
eliminar el marcador del nucleótido de (b) y el grupo de bloqueo; y
(e)
opcionalmente repetir las Etapas (b)-(d) una o más veces; y de ese modo determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla.
Además, en otro aspecto, la descripción proporciona un estuche, que comprende:
(a)
una pluralidad de nucleótidos individuales diferentes de la invención; y
(b)
materiales de empaque para ello.
Los nucleósidos o nucleótidos de acuerdo con o usados en los métodos de la presente descripción comprenden una base de purina o pirimidina y una porción de azúcar ribosa o desoxirribosa que tiene un grupo de bloqueo unido covalentemente a ella, preferentemente en la posición 3'O, que hace las moléculas útiles en las técnicas que requieren el bloqueo del grupo 3'-OH para evitar la incorporación de nucleótidos adicionales, como por ejemplo en reacciones de secuenciación, la síntesis de polinucleótidos, la amplificación de ácidos nucleicos, los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, los estudios de polimorfismo de un solo nucleótido y otras técnicas similares.
Donde el término "grupo de bloqueo" se usa en la presente descripción, este abarca tanto los grupos de bloqueo alilo y "Z" descritos en la presente. Sin embargo, se apreciará que, en los métodos como se describen y reivindican en la presente, donde se usan las mezclas de nucleótidos, estos muy preferentemente comprenden cada uno el mismo tipo de bloqueo, es decir, alilo bloqueado o "Z" bloqueado. Donde se usan los nucleótidos "Z" bloqueados, cada grupo "Z" será generalmente el mismo grupo, excepto en aquellos casos donde el marcador detectable forma parte del grupo "Z", es decir, no está unido a la base.
Una vez que se elimina el grupo de bloqueo, es posible incorporar otro nucleótido para el grupo 3'-OH libre.
La molécula puede estar unida a través de la base a un marcador detectable por un enlazador deseable, cuyo marcador puede ser un fluoróforo, por ejemplo. El marcador detectable puede en cambio, si se desea, ser incorporado en los grupos de bloqueo de la fórmula "Z". El enlazador puede ser sensible en medio ácido, fotolábil o contener, un enlace disulfuro. Otros enlaces, en particular los enlazadores fosfina escindibles que contienen azida, se pueden emplear descritos en mayor detalle.
Los marcadores y enlaces preferentes incluyen los descritos en WO 03/048387.
En los métodos donde se incorporan los nucleótidos, por ejemplo, donde la incorporación de una molécula de nucleótidos complementaria a los nucleótidos en un polinucleótido objetivo de cadena sencilla es controlada en una reacción de síntesis o secuenciación de la invención, la incorporación de la molécula se puede lograr a través de una transferasa terminal, una polimerasa o una transcriptasa inversa.
Preferentemente, la molécula se incorpora por una polimerasa y particularmente de Thermococcus sp., tal como 9°N. Aún más preferentemente, la polimerasa es un mutante 9°N A485L y aún más preferentemente es un doble mutante Y409V y A485L.
En los métodos para determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla que comprende monitorear la incorporación secuencial de nucleótidos complementarios de la invención, se prefiere que el grupo de bloqueo y el marcador se puedan eliminar en una etapa única de tratamiento químico. Así, en una modalidad preferente de la invención, el grupo de bloqueo se escinde simultáneamente con el marcador. Esto, por supuesto, será una característica inherente a los grupos de bloqueo de la fórmula Z, que incorporan un marcador detectable.
Además, preferentemente las construcciones de nucleótidos bloqueados y marcados modificados de las bases de los nucleótidos A, T, C y G son reconocidos como sustratos por la misma enzima polimerasa.
En los métodos descritos en la presente, cada uno de los nucleótidos se puede poner en contacto con el objetivo secuencialmente, con la eliminación de los nucleótidos no incorporados antes de la adición del siguiente nucleótido, donde la detección y eliminación del marcador y del grupo de bloqueo se lleva a cabo ya sea después de la adición de cada nucleótido o después de la adición de los cuatro nucleótidos.
En los métodos, todos los nucleótidos se pueden poner en contacto con el objetivo simultáneamente, es decir, una composición que comprende todos los diferentes nucleótidos se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo.
Los métodos pueden comprender una primera etapa y una segunda etapa, donde en la primera etapa, una primera composición que comprende dos de los cuatro tipos de nucleótidos modificados se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo, y donde en la segunda etapa, una segunda composición que comprende los dos nucleótidos no incluidos en la primera composición se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo, y donde las primera y segunda etapas pueden repetirse opcionalmente una o más veces.
Los métodos descritos en la presente también pueden comprender una primera etapa y una segunda etapa, donde en la primera etapa, una composición que comprende uno de los cuatro nucleótidos se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo, y donde en la segunda etapa, una segunda composición, que comprende los tres nucleótidos no incluidos en la primera composición se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo, y donde las primera y segunda etapas pueden repetirse opcionalmente una o más veces.
Los métodos descritos en la presente también pueden comprender una primera etapa y una segunda etapa, donde en la primera etapa, una primera composición que comprende tres de los cuatro nucleótidos se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y donde en la segunda etapa, una composición que comprende el nucleótido no incluido en la primera composición se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo, y donde las primera y segunda etapas pueden repetirse opcionalmente una o más veces.
La etapa de incorporación en los métodos de la invención se puede lograr a través de una transferasa terminal, una polimerasa o una transcriptasa inversa como se definió anteriormente. El marcador detectable y/o el enlazador escindible pueden ser de un tamaño suficiente para evitar la incorporación de un segundo nucleósido o nucleótido en la molécula de ácido nucleico.
En determinados métodos descritos en la presente para determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla, cada uno de los cuatro nucleótidos, uno de los cuales será complementario a la primera base no apareada en el polinucleótido objetivo, puede ponerse en contacto con el objetivo secuencialmente, opcionalmente con la eliminación de los nucleótidos no incorporados antes de la adición del siguiente nucleótido. La determinación del éxito de la incorporación se puede llevar a cabo o bien después de la provisión de cada nucleótido, después de la adición de todos los nucleótidos añadidos. Si se determina después de la adición de menos de cuatro nucleótidos que uno se ha incorporado, no es necesario proporcionar nucleótidos adicionales para detectar los nucleótidos complementarios al nucleótido incorporado.
Alternativamente, todos los nucleótidos se pueden poner en contacto con el objetivo simultáneamente, es decir, una composición que comprende todos los diferentes nucleótidos (es decir, A, T, C y G o A, U, C y G) se pone en contacto con el blanco, y los nucleótidos no incorporados eliminado antes de la detección y eliminación de marcador(es). Los métodos que implican la adición secuencial de nucleótidos pueden comprender una primera subetapa y, opcionalmente, una o más subetapas posteriores. En la primera subetapa una composición que comprende uno, dos o tres de los cuatro nucleótidos posibles se proporciona, es decir, se pone en contacto con, el objetivo. Después de eso los nucleótidos no incorporados se pueden retirar y una etapa de detección puede llevarse a cabo para determinar si uno de los nucleótidos se ha incorporado. Si uno se ha incorporado, se puede efectuar la escisión del enlazador. De esta manera se puede determinar la identidad de un nucleótido en el polinucleótido objetivo. El polinucleótido naciente se puede después extender para determinar la identidad del siguiente nucleótido no apareado en el oligonucleótido objetivo.
Si la primera subetapa anterior no conduce a la incorporación de un nucleótido, o si no se conoce, ya que la presencia de nucleótidos incorporados no se busca inmediatamente después de la primera subetapa, se pueden realizar una o más subetapas posteriores en las que algunos o todos, de los nucleótidos no proporcionados en la primera subetapa se proporcionan de forma adecuada, simultánea o posteriormente. Después de eso cualquiera de los nucleótidos no incorporados se puede retirar y llevar a cabo una etapa de detección para determinar si una de las clases de nucleótidos que se ha incorporado. Si uno se ha incorporado, se puede efectuar la escisión del enlazador. De esta manera, se puede determinar la identidad de un nucleótido en el polinucleótido objetivo. El polinucleótido naciente se puede después extender para determinar la identidad del siguiente nucleótido no apareado en el oligonucleótido objetivo. Si es necesario, se puede efectuar una tercera y opcionalmente una cuarta subetapa de una manera similar a la segunda subetapa. Obviamente, una vez que cuatro subetapas se han llevado a cabo, los cuatro nucleótidos posibles se han proporcionado y uno se habrá incorporado.
Es deseable determinar si un tipo o clase de nucleótido se ha incorporado después de cualquier combinación particular que comprende uno, dos o tres nucleótidos que se han proporcionado. De esta manera el costo innecesario y el tiempo gastado en proporcionar el (los) otro(s) nucleótido(s) se obvia. Esto, sin embargo no es una característica necesaria de la invención.
También es deseable, cuando el método para la secuenciación comprende una o más subetapas, eliminar cualquiera de los nucleótidos no incorporados antes de proporcionar el nucleótido adicional. Una vez más, esto no es una característica necesaria de la invención. Obviamente, es necesario que al menos algunos y preferentemente tantos como sea posible de los nucleótidos no incorporados se eliminen antes de la detección del nucleótido incorporado.
Los kits de la invención incluyen: (a) los nucleótidos individuales de acuerdo con la invención descrita anteriormente, donde cada uno de los nucleótidos tiene una base que está unida a un marcador detectable por un enlazador escindible,
o un marcador detectable unido a través de un revestimiento escindible opcionalmente a un grupo de bloqueo de la fórmula Z, y donde el marcador detectable unido a cada nucleótido se puede distinguir en la detección del marcador detectable usado para otros tres nucleótidos, y (b) los materiales de envase para ello . El kit puede incluir además una enzima para la incorporación de los nucleótidos en la cadena de nucleótidos complementaria y tampones apropiados para la acción de la enzima, además de los productos químicos adecuados para la eliminación del grupo de bloqueo y el marcador detectable, que preferentemente se puede eliminar por la misma etapa de tratamiento químico.
Los nucleótidos/nucleósidos son adecuados para el uso en muchas diferentes metodologías basadas en el ADN, incluyendo la síntesis de ADN y los protocolos de secuenciación de ADN.
La invención puede entenderse con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 muestra ejemplos de estructuras de nucleótidos útiles en la invención. Para cada estructura, X puede ser H, fosfato, difosfato o trifosfato. R1 y R2 pueden ser los mismos o diferentes, y pueden seleccionarse de H, OH, o cualquier grupo de la reivindicación 1 que puede transformarse en un OH. Algunos grupos funcionales adecuados para R1 y R2 incluyen las estructuras mostradas en la Figura 3 y la Figura 4. La Figura 2 muestra las estructuras de enlazadores útiles en ciertos aspectos de la invención, incluyendo enlazadores de disulfuro (1) y enlazadores sensibles a ácido, (2) enlazadores de dialcoxibenzilo, (3) enlazadores Sieber, (4) enlazadores de indol y (5) enlazadores Sieber de t-butilo. La Figura 3 muestra algunas moléculas funcionales útiles en la invención, incluyendo algunos enlazadores escindibles y algunos grupos protectores de hidroxilo adecuados. En estas estructuras, R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes, y pueden seleccionarse de H, OH, o cualquier grupo de la reivindicación 1 que puede transformarse en un grupo OH. R3 representa uno o más sustituyentes independientemente seleccionados de grupos alquilo, alcoxilo, amino o halógeno. R4 y R5 pueden ser H o alquilo, y R6 puede ser alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo o bencilo. X puede ser H, fosfato, difosfato o trifosfato. La Figura 4 es una ilustración esquemática de algunos de los grupos de bloqueo Z que pueden usarse de acuerdo con ciertos aspectos de la invención. La Figura 5 muestra dos ciclos de incorporación de DGTP, DCTP y dATP marcados y bloqueados respectivamente (compuestos 18, 24 y 32). La Figura 6 muestra seis ciclos de incorporación de DTTP marcado y bloqueado (compuesto 6). La Figura 7 muestra el bloqueo efectivo por el compuesto 38 (un nucleótido 3'-O alilo)
La presente descripción se refiere a moléculas de nucleótidos o nucleósidos que están modificadas por la unión covalente reversible de un grupo 3'-OH de bloqueo a la misma, y cuyas moléculas se pueden usar en las reacciones donde se requieren moléculas de nucleótido o nucleósido bloqueadas, tales como en las reacciones de secuenciación, síntesis de polinucleótidos y similares.
Como se usa en la presente, el término molécula biológica se usa para abarcar cualquiera de las moléculas o clase de molécula que ejecuta un papel biológico. Tales moléculas incluyen, por ejemplo, polinucleótidos tales como los oligonucleótidos de ADN y el ARN, y nucleótidos sencillos. Adicionalmente, los péptidos y los miméticos de péptidos, tales como enzimas y hormonas etc., son aceptados por la invención. Los compuestos que comprenden un enlace secundario de amida, tal como péptidos, o una amina secundaria, donde tales compuestos son alilados en el átomo de
5 nitrógeno de la amina secundaria o la amida, son ejemplos de compuestos de fórmula R2N(alilo) en el que ambos grupos R pertenecen a la misma molécula biológica. Particularmente, los compuestos preferidos sin embargo son los polinucleótidos, (incluyendo oligonucleótidos) y nucleótidos y nucleósidos, preferentemente aquellos que contienen una base que une un marcador detectable unido a través de un enlazador escindible. Tales compuestos son útiles en la determinación de secuencias de oligonucleótidos como se describe en la presente.
10 Los ligandos apropiados son cualquier fosfina o ligandos mezclados nitrógeno-fosfina conocidos por aquellos expertos en la materia, se caracterizan en que los ligandos se derivatizan para hacerlos solubles en agua, por ejemplo por la introducción de uno o más residuos sulfonato, amina, hidroxilo (preferentemente una pluralidad de hidroxils) o carboxilato. Cuando los residuos amina se presentan, la formación de sales de amina puede ayudar a la solubilización
15 del ligando y así del complejo metal-alilo. Los ejemplos de ligandos adecuados son las triaril fosfinas, por ejemplo trifenil fosfina, derivatizados para hacerlos solubles en agua. También se prefieren las trialquil fosfinas, por ejemplo, tri-C1-6alquil fosfinas tales como trietil fosfinas; dichas trialquil fosfinas se derivatizan del mismo modo para hacerlas solubles en agua. Las fosfinas que contienen carboxilato y sulfonato son particularmente preferidas; un ejemplo de la 3,3',3"fosfinidinatris (ácido bencenosulfónico) que está disponible comercialmente de Aldrich Chemical Company como la sal
20 trisódica; y un ejemplo preferente del último es la tris(2-carboxietil)fosfina que está disponible de Aldrich como la sal clorhidrato.
Las fosfinas solubles en agua y las fosfinas que contienen nitrógeno descritas en la presente se pueden usar como sus sales (por ejemplo como clorhidrato o sales de sodio) o, por ejemplo, en el caso de las fosfinas que contienen ácido
25 sulfónico y carboxílico descritas en la presente, como los ácidos libres. Así 3,3',3"-fosfinidinatris (ácido bencenosulfónico) y tris(2-carboxietil)fosfinas se pueden introducir tanto como los triácidos o sales trisódicas. Otras sales apropiadas serán evidentes para los expertos en la técnica. La existencia en forma de sal no es particularmente importante siempre que las fosfinas sean solubles en solución acuosa.
30 Otros ligandos que pueden usarse para incluir son los siguientes: El experto en la materia será consciente de que los átomos quelados para el metal de transición en el complejo soluble en agua pueden ser parte de ligandos mono o polidentados. Algunos de tales ligandos polidentados se muestran anteriormente. Aunque se prefieren ligandos monodentados, la invención también abarca métodos que usan fosfina soluble en agua bi, tri, tetra, penta y hexadentada y ligandos de fosfina solubles en agua que contienen nitrógeno
El experto en la materia será capaz de determinar la cantidad de ligando que mejor se ajusta a cualquier reacción individual.
Donde el grupo de bloqueo es cualquiera de C(R')2-N(R")2 o -C(R')2-N(H)R", es decir de la fórmula Z, cada R' puede ser independientemente H o un alquilo
Los productos intermedios producidos favorablemente de manera espontánea se disocian bajo condiciones acuosas nuevamente a la estructura 3' hidroxi natural, que permite la incorporación posterior de otro nucleótido. Cualquier grupo protector adecuado puede usarse, como se discutió en la presente descripción. Preferentemente, Z es de la fórmula C(R')2-N(R")2 o -C(R')2-N(H)R". Particularmente preferido, Z es de la fórmula, -C(R')2-N(R")2. R" R" puede ser un grupo bencilo o un grupo bencilo sustituido.
Un ejemplo de los grupos de estructura -O-Z en donde Z es -C(R')2-N(R")2 son aquellos en los cuales -N(R")2 es azido (-N3). Un ejemplo preferido es azidometilo en donde cada R' es H. Alternativamente, R' en los grupos Z de la fórmula C(R')2-N3 y otros grupos Z puede ser cualquiera de los otros grupos mencionados en la presente.
Los ejemplos de grupos R' típicos incluyen C1-6 alquilo, particularmente metilo y etilo, y los siguientes (en el que cada estructura muestra el enlace que conecta la porción R' al átomo de carbono al que está unido en los grupos Z; el asterisco (*) indica los puntos de unión): (en donde cada R es un grupo C1-10 alquilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido, un átomo de halógeno o grupo funcional tal como hidroxilo, amino, ciano, nitro, carboxilo y similares) y "Het" es un heterocíclico (el
10 cual puede ser por ejemplo un grupo heteroarilo). Estos grupos R' mostrados anteriormente son preferidos donde el otro grupo R' es igual que el primero o es hidrógeno. Los grupos Z preferidos son de la fórmula C(R')2N3 en la cual los grupos R' se seleccionan de las estructuras que se dan anteriormente e hidrógeno, o en la cual (R')2 representa un grupo alquilideno de la fórmula =C(R'")2, por ejemplo =C(Me)2.
15 Cuando las moléculas contienen grupos Z de fórmula C(R')2N3, el grupo azido se puede convertir en amino al contactar tales moléculas con la fosfina o ligandos de fosfinas que contienen nitrógeno descritos en detalle en la presente. Alternativamente, el grupo azido en los grupos Z de fórmula C(R')2N3 se pueden convertir en amino al contactar tales moléculas con los tioles, en particular, tioles solubles en agua tales como ditiotreitol (DTT).
20 Cuando un grupo R' representa un marcador detectable unido a través de un grupo de unión, el otro grupo R' o cualquier otro componente de "Z" generalmente no contienen un marcador detectable, ni la base del nucleósido o nucleótido contiene un marcador detectable. Los grupos adecuados de enlaces para conectar el marcador detectable al grupo de bloqueo 3' serán conocido por un experto en la materia y los ejemplos de tales grupos se describen en mayor detalle en la presente.
25 Los enlaces ilustrativos en los grupos R' que contienen marcadores detectables son aquellos que contienen uno o más enlaces amida. Tales enlazadores pueden contener también un grupo arileno, por ejemplo, fenileno, en la cadena (es decir, una porción de unión Ar donde el anillo de fenilo es parte del enlazador por medio de sus átomos de carbono dispuestos 1,4). El anillo de fenilo puede ser sustituido en su posición no enlazada con uno o más sustituyentes tales
30 como alquilo, hidroxilo, alquiloxi, haluro, nitro, carboxilo o ciano y similares, particularmente grupos aceptores de electrones, cuya acción electroaceptora es tanto por inducción como por resonancia. El enlace en el grupo R' puede incluir además las porciones tales como -O-, -S(O)q, en donde q es 0, 1 o 2 o NH o Nalquilo. Los ejemplos de tales grupos Z son los siguientes: (en donde EWG se destaca como grupo aceptor de electrones, n es un número entero del 1 al 50, preferentemente 2-20, por ejemplo, 3 a 10, y flúor indica un fluoróforo). Un ejemplo de un grupo aceptor de electrones por resonancia es el nitro, un grupo que actúa mediante inducción es el fluoro. El experto en la materia será consciente de otros grupos aceptores de electrones apropiados. Adicionalmente, se entenderá que mientras un fluoróforo se indica como el marcador detectable presente, otros grupos detectables como se discute en mayor detalle más adelante se pueden incluir en su lugar.
Cuando un marcador detectable está unido a un nucleótido en la posición 3' de bloqueo, el enlazador no necesita ser escindible para tener utilidad en estas reacciones, tales como la secuenciación de ADN, descritas en la presente que requieren que el marcador se "lea" y se retire antes de la siguiente etapa de la reacción. Esto se debe a que el marcador, cuando se une al bloque 3', se separará del nucleótido cuando los compuestos intermedios descritos en la presente colapsen con el fin de sustituir el grupo "Z" con un átomo de hidrógeno. Como se destacó anteriormente, cada R" es, o es parte de un grupo protector removible. R" puede ser un grupo bencilo o un grupo bencilo sustituido es una modalidad alternativa.
Se apreciará que cuando sea posible incorporar un marcador detectable en un grupo R", la invención abarca esta posibilidad. Así, cuando R"es un grupo bencilo, el anillo fenilo puede llevar un grupo enlazador al que está unido un fluoróforo u otro grupo detectable. La introducción de tales grupos no impide la capacidad de eliminar tales R" y no impide la generación de los intermediarios deseados inestables durante la desprotección de los grupos de bloqueo de fórmula Z.
Como se conoce en la técnica, un "nucleótido" consiste de una base nitrogenada, un azúcar, y uno o más grupos fosfato. Ellos son unidades monoméricas de una secuencia de ácido nucleico. En el ARN, el azúcar es una ribosa, y en el ADN una deoxiribosa, es decir un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de purina o pirimidina. Las purinas son adenina (A) y guanina (G), y las pirimidinas son citosina (C) y timina (T) (o en el contexto del ARN, uracilo (U)). El átomo de C-1 de la desoxirribosa está unido al N-1 de una pirimidina o N-9 de una purina. Un nucleótido es también un éster de fosfato o un nucleósido, con esterificación que ocurre en el grupo hidroxilo unido al C-5 del azúcar. Los nucleótidos son usualmente mono, di o trifosfatos.
Un "nucleósido" es estructuralmente similar a un nucleótido, pero carece de las porciones fosfato. Un ejemplo de un análogo de nucleósido sería uno en el que se vincula el marcador a la base y no hay ningún grupo fosfato unido a la molécula de azúcar.
Aunque la base se refiere generalmente como una purina o pirimidina, el experto en la materia apreciará que los derivados y análogos están disponibles los cuales no alteran la capacidad de experimentar el apareamiento de bases de nucleótido o nucleósido de Watson-Crick. "Derivado" o "análogo" significa un compuesto o molécula cuya estructura central es la misma que, o se parece mucho a la de, un compuesto parental, pero que tiene una modificación química o física, como un grupo lateral diferente o adicional, o grupos de bloqueo 2' y/o 3', lo que permite que el derivado de nucleótido o nucleósido se enlace a otra molécula. Por ejemplo, la base puede ser una desazapurina. Los derivados deben ser capaces de experimentar apareamiento de Watson-Crick. "Derivado" y "análogo" también significa un derivado sintético de nucleótido o nucleósido que tiene porciones de base modificadas y/o porciones de azúcar modificados. Tales derivados y análogos se discuten en, por ejemplo, Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) y Uhlman y otros, Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los análogos de nucleótidos pueden comprender también enlaces fosfodiéster modificados, incluyendo enlaces fosforotioato, fosforoditioato, alquil-fosfonato, fosforanilidato y fosforamidato. Los análogos deben ser capaces de experimentar apareamiento de bases de Watson-Crick. "Derivado"," análogo " y "modificado "como se usa en la presente, se pueden usar indistintamente, y son abarcados por los términos "nucleótido" y "nucleósido" definidos en la presente.
En el contexto de la presente invención, el término "incorporar" significa formar parte de un ácido nucleico (por ejemplo el ADN) o molécula de oligonucleótido o cebador. Un oligonucleótido se refiere a una molécula sintética o natural que comprende una secuencia de nucleótidos unidos covalentemente que se forman mediante un enlace fosfodiéster o fosfodiéster modificado entre la posición 3' de la pentosa en un nucleótido y la posición 5' de la pentosa en un nucleótido adyacente. El término "alquilo" cubre grupos de cadena recta, cadena ramificada y cicloalquilo. A menos que el contexto lo indique de cualquier otra forma, el término "alquilo" se refiere a grupos que tienen 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo 1 a 8 átomos de carbono, y típicamente de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, ter-butilo, n-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2metil butilo, 3-metil butilo, y n-hexilo y sus isómeros.
Los ejemplos de grupos cicloalquilo son aquellos que tienen de 3 a 10 átomos del anillo, los ejemplos particulares incluyen aquellos derivados de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano y cicloheptano, bicicloheptano y decalina.
Donde los grupos alquilo (que incluye cicloalquilo) son sustituidos, particularmente donde estos forman ambos grupos R' de las moléculas de la invención, los ejemplos de los sustituyentes adecuados incluyen sustituyentes halógeno o grupos funcionales tales como hidroxilo, amino, ciano, nitro, carboxilo y similares. Tales grupos pueden ser además sustituyentes, donde sea apropiado, de los otros grupos R' en las moléculas de la invención.
El término amino se refiere a grupos del tipo NR*R**, en donde R* y R** son independientemente seleccionados de hidrógeno, un grupo C1-6 alquilo (además denominado como C1-6 alquilamino o di-C1-6 alquilamino).
El término "halógeno" como se usa en la presente incluye flúor, cloro, bromo y yodo.
Las moléculas de nucleótidos de la presente invención son adecuadas para usar en muchos métodos diferentes donde se requiere la detección de nucleótidos.
Los métodos de secuenciación del ADN, tales como los esbozados en la patente de Estados Unidos núm. 5,302,509 pueden llevarse a cabo usando los nucleótidos.
La presente invención puede hacer uso de marcadores detectables convencionales. Detección puede realizarse por cualquier método adecuado, que incluyen espectroscopia de fluorescencia o por otros medios ópticos. El marcador preferido es un fluoróforo, el cual, después de la absorción de energía, emite radiación a una longitud de onda definida. Se conocen muchos marcadores fluorescentes adecuados. Por ejemplo, Welch y otros (Chem. Pat Eur. J. 5(3):951-960, 1999) describe porciones fluorescentes dansil-funcionalizadas que pueden usarse en la presente invención. Zhu y otros (Cytometry 28:206-211, 1997) describe el uso de los marcadores fluorescentes Cy3 y Cy5, los cuales pueden usarse además en la presente invención. Los marcadores adecuados para usar se describen además en Prober y otros, (Science 238:336-341, 1987); Connell y otros (BioTechniques 5(4):342-38.4, 1987), Ansorge y otros (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) y Smith y otros (Nature 321:674, 1986). Otros marcadores fluorescentes disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, la fluoresceína, rodamina (incluyendo TMR, Texas Red y Rox), alexa, bodipy, acridina, cumarina, pireno, benzantraceno y las cianinas.
Múltiples marcadores pueden usarse además en la invención. Por ejemplo, casetes FRET bi-fluoróforo (Tet. Let. 46:8867-8871, 2000) son bien conocidos en la técnica y se pueden usar en la presente invención. Los sistemas dendriméricos multi-flúor (J. Amer. Chem. Soc. 123:8101-8108, 2001) también pueden ser usados.
Aunque los marcadores fluorescentes son preferentes, otras formas de marcadores detectables serán evidentes como útiles para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, las micropartículas, que incluyen puntos cuánticos (Empodocles y otros, Nature 399:126-130, 1999), nanopartículas de oro (Reichert y otros, Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000) y microglóbulos (Lacoste y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(17):9461-9466, 2000) pueden ser usadas.
Los marcadores de componentes múltiples también se pueden usar en la invención. Un marcador de componentes múltiples es uno que es dependiente de la interacción con un compuesto adicional para la detección. El marcador de componentes múltiples más común que se usa en biología es el sistema biotina-estreptavidina. La biotina se usa como el marcador adherido a la base del nucleótido. La estreptavidina se añade después por separado para permitir que ocurra la detección. Otros sistemas de múltiples componentes están disponibles. Por ejemplo, el dinitrofenol tiene un anticuerpo fluorescente disponible en el mercado que se puede usar para la detección.
La invención ha sido y será descrita adicionalmente con referencia a los nucleótidos. Sin embargo, a menos que se indique lo contrario, también se pretende que la referencia a los nucleótidos sea aplicable a los nucleósidos. La invención
se describirá adicionalmente con referencia al ADN, aunque la descripción será también aplicable al ARN, ANP y otros ácidos nucleicos, a menos que se indique lo contrario. Los nucleótidos modificados de la invención pueden usar un enlazador escindible para unir el marcador al nucleótido. El uso de un enlazador escindible asegura que el marcador puede, si es necesario, ser retirado después de la detección, evitando cualquier señal de interferencia con cualquier nucleótido marcado incorporado posteriormente.
Generalmente, el uso de enlazadores escindibles es preferente, en particular en los métodos de la invención descritos en la presente anteriormente, excepto donde el marcador detectable está unido al nucleótido formando parte del grupo "Z".
Los expertos en la técnica serán conscientes de la utilidad de los trifosfatos de didesoxinucleósido en los denominados métodos de secuenciación de Sanger y los protocolos relacionados (de tipo Sanger), que dependen de la terminación de la cadena al azar en un tipo particular de nucleótido. Un ejemplo de un protocolo de secuenciación de tipo Sanger es el método BASS descrito por Metzker (más abajo). Otros métodos de secuenciación tipo Sanger serán conocidos para los expertos en la técnica.
Los métodos de Sanger y de tipo Sanger generalmente operan por la conducción de un experimento en el que se proporcionan ocho tipos de nucleótidos, cuatro de los cuales contienen un grupo 3'OH y cuatro de los cuales omiten el grupo OH y que están marcados de manera diferente el uno del otro. Los nucleótidos usados que omiten el grupo 3'OH de didesoxi nucleótidos se abrevian convencionalmente como ddNTP. Como es conocido por el experto en la materia, ya que los ddNTP están marcados de forma diferente, mediante la determinación de las posiciones de los nucleótidos terminales incorporados y combinando esta información, se puede determinar la secuencia del oligonucleótido objetivo.
Los nucleótidos de la presente invención, será reconocida, que pueden ser de utilidad en métodos de Sanger y protocolos relacionados ya que el mismo efecto conseguido usando ddNTP puede conseguirse mediante el uso de grupos de bloqueo 3'-OH nuevos descritos en la presente: ambos evitan la incorporación de nucleótidos subsiguientes.
El uso de los nucleótidos de acuerdo con la presente invención en los métodos de secuenciación de Sanger y de tipo Sanger, en donde el enlazador que conecta el marcador detectable al nucleótido puede o no puede ser escindible, forma un aspecto adicional de la presente invención. Visto desde este aspecto, la invención proporciona el uso de tales nucleótidos en un método de secuenciación de Sanger o de tipo Sanger.
Cuando se usan los nucleótidos Z-bloqueados 3'-OH de acuerdo con la presente invención, se apreciará que los marcadores detectables unidos a los nucleótidos no necesitan estar conectados a través de enlazadores escindibles, ya que en cada caso donde un nucleótido marcado de la invención se incorpora, ningún nucleótido necesita ser posteriormente incorporado y por lo tanto el marcador no necesita ser eliminado del nucleótido.
Además, se apreciará que monitorear la incorporación de nucleótidos bloqueados 3'OH se puede determinar mediante el uso de 32P radiactivo en los grupos fosfato unidos. Estos pueden estar presentes en cualquiera de los ddNTP por sí mismos o en los cebadores usados para la extensión. Donde los grupos de bloqueo son de la fórmula "Z", esto representa un aspecto adicional de la invención.
Visto desde este aspecto, la invención proporciona el uso de un nucleótido que tiene un grupo 3' OH bloqueado con un grupo "Z" en un método de secuenciación de de Sanger o tipo Sanger. En esta modalidad, un marcador detectable de32P puede estar presente en cualquiera de los ddNTP empleados en el cebador usado para la extensión.
Los enlazadores escindibles son conocidos en la técnica, y se puede aplicar la química convencional para fijar un enlazador a una base de nucleótido y un marcador. El enlazador puede ser escindido por cualquier método adecuado, incluyendo la exposición a ácidos, bases, nucleófilos, electrófilos, radicales, metales, reductores o agentes oxidantes, luz, temperatura, enzimas, etc. El enlazador tal como se discute en la presente también se puede escindir con el mismo catalizador usado para escindir el enlace del grupo de bloqueo 3'O. Los enlazadores adecuados se pueden adaptar a partir de los grupos químicos estándar de bloqueo, como se describe en Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. Los enlazadores escindibles adicionales adecuados usados en la síntesis en fase sólida se describen en Guillier y otros (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000).
El uso del término "enlazador escindible" no pretende implicar que se necesita que todo el enlazador sea eliminado de por ejemplo, la base del nucleótido. Cuando el marcador detectable está unido a la base, el sitio de escisión del nucleósido se puede situar en una posición en el enlazador que asegura que parte del enlazador permanece unido a la base del nucleótido después de la escisión.
Cuando el marcador detectable está unido a la base, el enlazador puede estar unido a cualquier posición en la base de nucleótidos siempre que el apareamiento de base de Watson-Crick aún pueda llevarse a cabo. En el contexto de las bases de purina, es preferente que el enlazador esté unido a través de la posición 7 de la purina o el análogo desazapurina preferente, a través de una purina modificada en posición 8, a través de una adenosina modificada N-6 o una guanina modificada N-2. Para las pirimidinas, la unión es preferentemente a través de la posición 5 en la citosina, la timidina o el uracilo y la posición N-4 de la citosina. Las estructuras de nucleótidos adecuados se muestran en la Figura
1. Para cada estructura en la Figura 1 X puede ser H, fosfato, difosfato o trifosfato. R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes, y se seleccionan de H, OH, O-alilo, o la Fórmula Z como se describió en la presente o cualquier otro grupo que pueda transformarse en un OH, que incluye, pero sin limitarse a, un carbonilo, siempre que al menos uno de R1 y R2 sea O-alilo o la Fórmula Z como se describió en la presente. Algunos grupos funcionales adecuados para R1 y R2 incluyen las estructuras mostradas en las Figuras 3 y 4.
Los enlazadores adecuados se muestran en la Figura 3 e incluye, pero sin limitarse a, enlazadores bisulfuro (1), enlazadores sensibles a ácidos (2, 3, 4 y 5; que incluyen enlazadores de dialcoxibenzilo (por ejemplo, 2), enlazadores Sieber (por ejemplo, 3), enlazadores de indol (por ejemplo, 4), enlazadores Sieber t-butilo (por ejemplo, 5)), enlazadores escindibles electrofílicamente, enlazadores escindibles nucleofílicamente, enlazadores fotoescindibles, escisión en condiciones reductoras, condiciones oxidantes, escisión mediante el uso de enlazadores de cierre de seguridad, y la escisión por mecanismos de eliminación.
A. Enlazadores electrofílicamente escindibles.
Los enlazadores electrofílicamente escindibles se escinden típicamente por protones e incluyen escisiones sensibles a los ácidos. Los enlazadores adecuados incluyen los sistemas bencílicos modificados tales como tritilo, ésteres de palcoxibencilo y amidas de p-alcoxibencilo. Otros enlazadores adecuados incluyen los grupos ter-butiloxicarbonilo (Boc) y el sistema acetal.
El uso de metales tiofílicos, tales como el níquel, la plata o el mercurio, en la escisión del tioacetal u otros grupos protectores que contienen azufre también se pueden considerar para la preparación de moléculas de enlace adecuadas.
B. Enlazadores nucleofílicamente escindibles.
La escisión nucleofílica también es un método bien reconocido en la preparación de moléculas de enlace. Los grupos tales como ésteres que son lábiles en agua (es decir, se pueden escindir simplemente a pH básico) y los grupos que son lábiles a nucleófilos no acuosos, se pueden usar. Los iones fluoruro se pueden usar para escindir enlaces silicio-oxígeno en grupos tales como silano triisopropilo (TIPS) o silano t-butildimetilo (TBDMS).
C. Enlazadores fotoescindibles.
Los enlazadores fotoescindibles se han usado ampliamente en la química de los carbohidratos. Se prefiere que la luz requerida para activar la escisión no afecte a los otros componentes de los nucleótidos modificados. Por ejemplo, si se usa un fluoróforo como el marcador, es preferible si este absorba luz de una longitud de onda diferente a la requerida, escindir la molécula de enlace. Los enlazadores adecuados incluyen los basados en compuestos O-nitrobencilo y compuestos nitroveratrilo. Los enlazadores basados en la química de la benzoina también se pueden usar (Lee y otros,
J. Org. Chem. 64:3454-3460, 1999).
D. Escisión en condiciones reductoras
Hay muchos enlazadores conocidos que son susceptibles a la escisión reductora. La hidrogenación catalítica usando los catalizadores a base de paladio se han usado para escindir el bencilo y grupos benciloxicarbonilo. La reducción de enlaces disulfuro se conoce también en la técnica.
E. Escisión en condiciones oxidantes
Los enfoques a base de la oxidación son bien conocidos en la técnica. Estos incluyen la oxidación de grupos palcoxibencilo y la oxidación de los enlazadores de azufre y selenio. El uso de yodo acuoso para escindir enlazadores de disulfuros y otros a base de azufre o selenio también están dentro del alcance de la invención.
F. Enlazadores de cierre de seguridad
Los enlazadores de cierre de seguridad son aquellos que se escinden en dos etapas. En un sistema preferido, la primera etapa es la generación de un centro reactivo nucleofílico seguido por una segunda etapa que implica una ciclación intramolecular que da lugar a la escisión. Por ejemplo, los enlaces éster levulínico pueden tratarse con hidrazina o fotoquímica para liberar una amina activa, que puede ciclarse para escindir un éster en otra parte de la molécula (Burgess y otros, J. Org. Chem. 62:5165-5168, 1997).
G. Escisión por mecanismos de eliminación
Las reacciones de eliminación también se pueden usar. Por ejemplo, se puede usar la eliminación catalizada con bases de grupos tales como Fmoc y cianoetilo, y la eliminación reductora catalizada por paladio de los sistemas alílicos.
Así como el sitio de escisión, el enlazador puede comprender una unidad espaciadora. Las distancias del espaciador por ejemplo, la base del nucleótido desde el sitio de escisión o el marcador. La longitud del enlazador no es importante siempre que el marcador se mantenga a una distancia suficiente del nucleótido para no interferir con ninguna interacción entre el nucleótido y una enzima.
En una modalidad preferida, el enlazador puede constar de la misma funcionalidad que el bloqueo. Esto hará que el proceso de desprotección y desbloqueo sea más eficiente, ya que sólo un único tratamiento se requiere para eliminar el marcador y el bloqueo.
Los enlazadores particularmente preferidos son los enlazadores fosfina escindibles que contienen azida.
Un método para determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo se puede llevar a cabo al contactar el polinucleótido objetivo separadamente con los diferentes nucleótidos para formar el complemento al del polinucleótido objetivo y detectar la incorporación de los nucleótidos. Tal método usa la polimerización, con lo que una enzima polimerasa extiende la cadena complementaria incorporando el nucleótido correcto complementario al del objetivo. La reacción de polimerización también requiere un cebador específico para iniciar la polimerización.
Para cada ciclo, la incorporación del nucleótido modificado se lleva a cabo por la enzima polimerasa, y después se determina el evento de incorporación. Existen muchas enzimas polimerasa diferentes, y será evidente para el experto en la materia cual es la más apropiada para usar. Las enzimas preferidas incluyen la ADN polimerasa I, el fragmento de Klenow, ADN polimerasa III, ADN polimerasa T4 o T7, Taq polimerasa o Vent polimerasa. Las polimerasas modificadas genéticamente para tener propiedades específicas también se pueden usar. Como se señaló anteriormente, la molécula se incorpora preferentemente por una polimerasa y particularmente de Thermococcus sp., tal como 9°N. incluso más preferentemente, la polimerasa es un mutante 9°N A485L y aún más preferentemente es un doble mutante Y409V y A485L. Un ejemplo de una enzima preferida de este tipo es Thermococcus sp. 9°N exo -Y409V A485L disponible de New England Biolabs. Los ejemplos de tales polimerasas adecuadas se describen en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996(93), págs. 5281-5285, Nucleic Acids Research, 1999(27), págs. 2454-2553 y Acids Research, 2002(30), págs. 605
613.
Los métodos de secuenciación se realizan preferentemente con el polinucleótido objetivo dispuesto en un soporte sólido. Los polinucleótidos objetivo múltiples se pueden inmovilizar sobre el soporte sólido a través de moléculas de enlace, o se puede unir a partículas, por ejemplo, microesferas, que también se pueden unir a un material de soporte sólido. Los polinucleótidos pueden unirse al soporte sólido por una serie de medios, incluyendo el uso de interacciones biotinaavidina. Los métodos para la inmovilización de polinucleótidos sobre un soporte sólido son bien conocidos en la técnica, e incluyen técnicas litográficas e "impresión" de polinucleótidos individuales en posiciones definidas sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados son conocidos en la técnica, e incluyen portaobjetos de vidrio y perlas, superficies de silicio y cerámica y materiales plásticos. El soporte es por lo general una superficie plana aunque también se pueden usar perlas microscópicas (microesferas) y pueden a su vez estar unidas a otro soporte sólido por medios conocidos. Las microesferas pueden ser de cualquier tamaño adecuado, típicamente en el intervalo de 10 nm a 100 nm de diámetro. En una modalidad preferida, los polinucleótidos se unen directamente sobre una superficie plana, preferentemente una superficie de vidrio plana. La unión será preferentemente por medio de un enlace covalente. Preferentemente, las matrices que se usan son matrices de una sola molécula que comprenden polinucleótidos en distintas áreas ópticamente resueltas, por ejemplo, como se describe en la solicitud internacional núm. WO00/06770.
El método de secuenciación se puede realizar en matrices moleculares tanto de una sola molécula de polinucleótido como múltiples polinucleótidos, es decir, matrices de distintas moléculas de polinucleótido individuales y matrices de regiones distintas que comprenden copias múltiples de una molécula de polinucleótido individual. Las matrices de una sola molécula permiten que cada polinucleótido individual se resuelva por separado. El uso de matrices de una sola molécula es preferido. La secuenciación de matrices de una sola molécula permite que se forme una matriz espacialmente direccionable no destructiva.
El método hace uso de la reacción de polimerización para generar la secuencia complementaria del objetivo. Las condiciones compatibles con las reacciones de polimerización serán evidentes para las personas expertas en la materia.
Para llevar a cabo la reacción de la polimerasa habitualmente será necesario hibridar primero una secuencia del cebador con el polinucleótido objetivo, la secuencia del cebador que es reconocida por la enzima polimerasa y actúa como un sitio de iniciación para la extensión posterior de la cadena complementaria. La secuencia del cebador se puede añadir como un componente separado con respecto al polinucleótido objetivo. Alternativamente, el cebador y el polinucleótido objetivo pueden ser cada uno parte de una molécula de cadena sencilla, con la porción de cebador que forma un dúplex intramolecular con una parte del objetivo, es decir, una estructura de bucle en horquilla. Esta estructura se puede inmovilizar en el soporte sólido en cualquier punto de la molécula. Otras condiciones necesarias para llevar a cabo la reacción de la polimerasa, incluyendo temperatura, pH, composiciones tampón, etc., serán evidentes para los expertos en la técnica.
Los nucleótidos modificados de la invención se ponen después en contacto con el polinucleótido objetivo, para permitir que se produzca la polimerización. Los nucleótidos se pueden añadir secuencialmente, es decir, la adición separada de cada tipo de nucleótido (A, T, G o C) o añadirse conjuntamente. Si se añaden juntos, es preferente para cada tipo de nucleótidos que se marque con un marcador diferente.
Esta etapa de polimerización se deja proceder durante un tiempo suficiente para permitir la incorporación de un nucleótido.
Los nucleótidos no incorporados se eliminan a continuación, por ejemplo, sometiendo la matriz a una etapa de lavado, y después se puede llevar a cabo la detección de los marcadores incorporados.
La detección puede ser por medios convencionales, por ejemplo, si el marcador es una porción fluorescente, la detección de una base incorporada se puede llevar a cabo mediante el uso de un microscopio de barrido confocal para explorar la superficie de la matriz con un láser, para representar la imagen de un fluoróforo unido directamente a la base incorporada. Alternativamente, un detector 2-D sensible, tal como una detector de carga acoplado (CCD), se puede usar para visualizar las señales individuales generadas. Sin embargo, otras técnicas tales como la microscopía óptica de barrido en campo cercano (SNOM) están disponibles y se pueden usar cuando se forman las imágenes de las matrices densas. Por ejemplo, usando SNOM, los polinucleótidos individuales se pueden distinguir cuando se separan por una distancia de menos de 100 nm, por ejemplo, 10 nm a 10μm. Para una descripción de la microscopía óptica de barrido de campo cercano, ver Moyer y otros, Laser Focus World 29:10, 1993. Un aparato adecuado usado para formar las imágenes de las matrices de polinucleótidos se conocen y la técnica de configuración será evidente para el experto en la materia.
Después de la detección, el marcador se puede eliminar usando condiciones adecuadas que escinden el enlazador y el bloqueo de 3'OH para permitir la incorporación de nuevos nucleótidos modificados de la invención. Las condiciones apropiadas pueden ser las descritas en la presente para el grupo alilo y para las desprotecciones del grupo "Z". Estas condiciones pueden servir tanto para desproteger el enlazador (si es escindible) y el grupo de bloqueo. Alternativamente, el enlazador se puede desproteger por separado del grupo alilo mediante el empleo de métodos de escisión del enlazador conocidos en la técnica (que no cortan el enlace del grupo bloqueo O) seguido de la desprotección.
Esta invención puede entenderse adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos que sirven para ilustrar la invención y no para limitar su ámbito de aplicación.
3'-OH protegido con un grupo azidometil como una forma protegida de un hemiaminal:
Los nucleótidos que contienen este grupo de bloqueo en la posición 3' se sintetizaron, se muestran incorporados exitosamente por las ADN polimerasas, bloquean de manera eficiente y pueden ser eliminados posteriormente en condiciones acuosas, neutras usando fosfinas o tioles solubles en agua, lo que permite la extensión adicional:
5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiuridina (1).
A una solución de 5-yodo-2'-deoxiuridina (1.05 g, 2.96 mmol) y CuI (114 mg, 0.60 mmol) en DMF seco (21 ml) se añadió
10 trietilamina (0.9 ml). Después de agitar por 5 min se añadieron trifluoro-N-prop-2-inil-acetamida (1.35 g, 9.0 mmol) y Pd(PPh3)4 (330 mg, 0.29 mmol) a la mezcla y la reacción se agitó a temperatura ambiente en la oscuridad por 16 h. Se añadieron a la mezcla de reacción metanol (MeOH) (40 ml) y bicarbonato en dowex y se agitó por 45 min. La mezcla se filtró y el filtrado se lavó con MeOH y el disolvente se eliminó al vacío. La mezcla cruda se purificó por cromatografía en sílice (acetato de etilo (EtOAc) a EtOAc:MeOH 95:5) para dar cristales ligeramente amarillos (794 mg, 71 %). 1H NMR (d6
15 dimetilsulfóxido (DMSO)) 0 2.13-2.17 (m, 2H, H-2'), 3.57-3.65 (m, 2H, H-5'), 3.81-3.84 (m, 1H, H-4'), 4.23-4.27 (m, 3H, H3', CH2N), 5.13 (t, J = 5.0 Hz, 1H, OH), 5.20 (d, J = 4.3 Hz, 1H, OH), 6.13 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 8.23 (s, 1H, H-6),
10.11 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para CuH14F3N3O6 377.08, encontrada 376.
5'-O-(ter-butidimetilsilil)-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiuridina (2).
A una solución de(1) (656 mg, 1.74 mmol) en DMF seco (15 ml) se añadió t-butildimetilsililcloruro (288 mg, 1.91 mmol)
25 en porciones pequeñas, seguido por imidazol (130 mg, 1.91 mmol). La reacción continuó con TLC y se completó después de agitar por 8h a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de NaCl saturada acuosa Se añadió EtOAc (25 ml) a la mezcla de reacción y la capa acuosa se extrajo con EtOAc tres veces. Después de secar los productos orgánicos combinados (MgSO4), el disolvente se eliminó al vacío. La purificación por cromatografía en sílice (EtOAc:éter de petróleo 8:2) dio (2) como cristales ligeramente amarillos (676 mg, 83 %). 1H NMR (d6 DMSO) 0 0.00
30 (s, 6H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.93 -2.00 (m, 1H, H-2'), 2.06- 2.11 (m, 1H, H-2'), 3.63-3.75 (m, 2H, H-5'), 3.79-3.80 (m, 1H, H-4'), 4.12-4.14 (m, 3H, H-3', CH2N), 5.22 (d, J = 4.1 Hz, 1H, OH), 6.03 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'). 7.86 (s, 1H, H-6),
9.95 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH), 11.61 (br s, 1H, NH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C20H28F3N3O6Si
5'-O-(terc-butildimetilsilil)-3'-O-metiltiometil-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiuridina (3).
A una solución de(2) (1.84 g, 3.7 mmol) en DMSO seco (7 ml) se añadió ácido acético (3.2 ml) y anhídrido acético (10.2 ml). La mezcla se agitó por 2 días a temperatura ambiente, antes que se inactivara con NaHCO3 saturado acuoso, Se añadió EtOAc (50 ml) y la capa acuosa se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de NaHCO3saturada acuosa y se secaron (MgSO4) después de eliminar el disolvente a presión
5 reducida, el producto (3) se purificó por cromatografía en sílice (EtOAc: éter de petróleo 8:2) produciendo un aceite claro pegajoso (1.83 g, 89 %) . 1H NMR (d6 DMSO) : 0 0.00 (s, 6H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.96-2.06 (m, 1H, H-2'), 1.99 (s, 3H, SCH3), 2.20-2.26 (m, 1H, H-2'), 3.63-3.74 (m, 2H, H-5'), 3.92-3.95 (m, 1H, H-4'), 4.11-4.13 (m, 2H, CH2), 4.28-4.30 (m, 1H, H-3'), 4.59 (br s, 2H, CH2), 5.97 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'), 7.85 (s, 1H, H-6), 9.95 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH), 11.64 (s, 1H, NH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C22H32F3N3O6SSi 551.17, encontrada 550.
3'-O-azidometil-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiuridina (4).
15 A una solución de(3) (348 mg, 0.63 mmol) y ciclohexeno (0.32 ml, 3.2 mmol) en CH2Cl2 seco (5 ml) a 4 °C, se añadió sulfurilcloruro (1M en CH2Cl2, 0.76 ml, 0.76 mmol) en forma de gotas bajo N2. Después de 10 min la TLC indicó el consumo total de los nucleósidos (3). El disolvente se evaporó y el residuo se sometió a alto vacío por 20 min. Este se disolvió después nuevamente en DMF seco (3 ml) y se trató con NaN3 (205 mg, 3.15 mmol). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente por 2h. La reacción se inactivó con CH2Cl2 y las capas orgánicas se lavaron con solución
20 de NaCl. saturada acuosa Después de eliminar el solvente, la goma amarilla resultante se disolvió nuevamente en THF (2 ml) y se trató con TBAF (1 M en THF, 0.5 ml) a temperatura ambiente por 30 min. El disolvente se eliminó y la reacción se trató finalmente con CH2Cl2 y solución de NaHCO3 saturada acuosa. La capa acuosa se extrajo tres veces con CH2Cl2. La purificación por cromatografía en sílice (EtOAc: éter de petróleo 1:1 a EtOAc) dio (4) (100 mg, 37 %) como una espuma amarilla pálida. 1H NMR (d6 DMSO) 0 2.15-2.26 (m, 2H, H-2'), 3.47-3.57 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.90 (m,
25 1H, H-4'), 4.14 (d, J = 4.7 Hz, 2H, CH2NH), 4.24-4.27 (m, 1H, H-3'), 4.75 (s, 2H, CH2N3), 5.14 (t, J = 5.2 Hz, 1H, OH), 5.96-6.00 (m, 1H, H-1'), 8.10 (s, 1H, H-6), 10.00 (s, 1H, NHCOCF3)), 11.26 (s, 1H, NH).
30 Preparación de bis (tri-n-butilamonio) pirofosfato (0.5 M solución en DMF)
El tetrasodio difosfato decahidratado (1.5 g, 3.4 mmol) se disolvió en agua (34 ml) y la solución se aplicó a una columna de dowex en forma de H+. La columna se eluyó con agua. El eluyente se goteó directamente en una solución agitada y fría (baño de hielo) de tri-n-butilamina (1.6 ml, 6.8 mmol) en EtOH (14 ml). La columna se lavó hasta que el pH del
35 eluyente aumentó hasta 6. La solución de etanol acuosa se evaporó hasta secarse y después se co-evaporó dos veces con etanol y dos veces con DMF anhidro. El residuo se disolvió en DMF (6.7 ml). La solución de color amarillo pálido sealmacenó sobre tamices moleculares de 4Å.
3'-O-azidometil-5-(3-amino-prop-1-inil)-2'-deoxiuridina 5'-O-nucleósido trifosfato (5).
El nucleósido (4) y la esponja de protones se secó sobre P2O5 al vacío durante la noche. Una solución de (4) (92 mg,
0.21 mmol) y esponja de protones (90 mg, 0.42 mmol) en trimetilfosfato (0.5 ml) se agitó con tamices moleculares de 4Å por 1 h. Se añadió POCl3 recientemente destilado (24 μl, 0.26 mmol) y la solución se agitó a 4°C por 2h. La mezcla se calentó lentamente hasta la temperatura ambiente y se añadieron el bis (tri-n-butil amonio) pirofosfato (1.7 ml, 0.85
45 mmol) y tri-n-butil amina anhidra (0.4 ml, 1.7 mmol). Después de 3 min, la reacción se inactivó con tampón TEAB
(trietilamonio bicarbonato) 0.1 M (15 ml) y se agitó por 3h. El agua se eliminó a presión reducida y el residuo resultante se disolvió en amoniaco concentrado (p 0.88, 15 ml) y se agitó a temperatura ambiente por 16 h. La mezcla de reacción se evaporó después hasta secarse. El residuo se disolvió en agua y la solución se aplicó a una columna DEAE-Sephadex A-25. Se realizó la MPLC con un gradiente lineal de TEAB. El trifosfato se eluyó en tampón entre 0.7 M y 0.8 5 M. Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se evaporaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua y se purificó adicionalmente por HPLC. HPLC: tr(5): 18.8 min (columna preparativa Zorbax C18, gradiente: 5% a 35% B en 30 min, tampón A de TEAB0.1M, tampón B MeCN). El producto se aisló como una espuma blanca (76 O.D.,
7.6 μmol, 3.8%, E280 = 10000). 1H NMR (D2O) 0 1.79 (s, CH2), 2.23-2.30; 2.44-2.50 (2 x m, 2H, H-2'), 3.85 (m, CH2NH), 4.10-4.18 (m, 2H, H-5'), 4.27 (br s, H-4'), 4.48-4.50 (m, H-3'), 4.70-4.77 (m, CH2N3), 6.21 (t, J = 6.6 Hz, H-1'), 8.32 (s, 1H,
10 H-6). 31P NMR (D2O) 0 -6.6 (m, 1P, Py), -10.3 (d, J =18.4 Hz, 1P, Pa), -21.1 (m, 1P, P�). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C13H19N6O14P3 576.02, encontrada 575.
15 Enlazador Cy-3disulfuro.
El disulfuro de partida (4.0 mg, 13.1 μmol) se disolvió en DMF (300 μl) y se añadió lentamente diisopropiletilamina (4 μl). La mezcla se agitó a temperatura ambiente y se añadió una solución del colorante Cy-3 (5 mg, 6.53 μmol) en DMF (300 μl) durante 10 min. Después de 3.5 h, con la reacción completa, los volátiles se evaporaron a presión reducida y el 20 residuo crudo se purificó por HPLC en una columna analítica Zorbax SB-C18 con un régimen de flujo de 1ml/min en tampón de trietilamonio bicarbonato 0.1M (tampón A) y CH3CN (tampón B) usando el siguiente gradiente:,5 min B al 2% ;.31min B al 55% ; 33 min B al 95% ;.37 min al 95%;.39 min Bal 2% ;.44 min. B al 2%. El enlazador Cy3-disulfuro esperado se eluyó con a tr: 21.8 min. con 70% de rendimiento (basado en una medición UV; E550 150,000 cm-1 M-1 en H2O) como un sólido higroscópico. 1H NMR (D2O) 0 1.31-1.20 (m + t, J = 7.2 Hz, 5H, CH2 + CH3), 1.56-1.47 (m, 2H, 25 CH2), 1.67 (s, 12H, 4 CH3), 1.79-1.74 (m, 2H, CH2), 2.11 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 2.37 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 2.60 (t, J =
6.3 Hz, 2H, CH2), 2.67 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 3.27 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 4.10-4.00 (m, 4H, 2CH2), 6.29 (dd, J =13.1,
8.1 Hz, 2H, 2 =CH), 7.29 (dd, 2H, J = 8.4, 6.1 Hz, 2 =CH), 7.75-7.71 (m, 2H, 2 =CH), 7.78 (s, 2H, =CH), 8.42 (t, J =12.8 Hz, 1H, =CH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C36H47N3O9S4 793.22, encontrada 792 (M-H), 396 [M/2]
.
Una mezcla del enlazador de disulfuro Cy3 (2.5 μmol), disuccinimidil carbonato (0.96 mg, 3.75 μmol) y DMAP (0.46 mg,
5 3.75 μmol) se disolvieron en DMF seco (0.5 ml) y se agitó a temperatura ambiente por 10 min. La reacción se monitoreó por TLC (MeOH:CH2Cl2 3:7) hasta que el enlazador colorante se consumió. Después, una solución de (5) (7.5 μmol) y n-BU3N (30 μl, 125 μmol) en DMF (0.2 ml) se añadió a la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente por 1 h. La TLC (MeOH:CH2Cl2 4:6) mostró el consumo completo del éster activado y una mancha roja oscura apareció en la línea base. La reacción se inactivó con TEAB tampón (0.1M, 10 ml) y se cargó en una columna DEAE Sephadex (2 x 5 cm).
10 La columna se eluyó primero con tampón TEAB 0.1 M (100 ml) para lavar los residuos orgánicos y después tampón TEAB 1 M (100 ml). El análogo de trifosfato deseado (6) se eluyó con tampón TEAB 1 M. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, se evaporaron y se purificaron por HPLC. Condiciones de la HPLC: tr(6): 16.1 min (columna preparativa Zorbax C18, gradiente: 2% B al 55% en 30 min, tampón A TEAB 0.1M, tampón B MeCN). El producto se aisló como un sólido rojo oscuro (1.35 μmol, 54%, E550 = 150000). 1H NMR (D2O) 8 1.17-1.28 (m, 6H 3 × CH2), 1.41-1.48
15 (m, 3 H, CH3), 1.64 (s, 12H, 4 x CH3), 1.68-1.71 (m, 2H, CH2), 2.07-2.10 (m, 3H, H-2', CH2), 2.31-2.35 (m, 1H, H-2'), 2.50
2.54 (m, 2H, CH2), 2.65 (t, J = 5.9 Hz, 2H, CH2), 2.76 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2), 3.26-3.31 (m, 2H, CH2), 3.88-3.91 (m, 2H CH2), 3.94-4.06 (m, 3H, CH2N, H-5'), 4.16 (br s, 1H, H-4'), 4.42-4.43 (m, 1H, H-3'), 4.72-4.78 (m, 2H, CH2N3), 6.24 (dd, J = 5.8, 8.2 H2, H-1'), 6.25 (dd, J = 3.5, 8.5 Hz, 2H, HAr), 7.24, 7.25 (2d, J = 14.8 Hz, 2 x =CH), 7.69-7.86 (m, 4H, HAr, H-6),
8.42 (t, J =13.4 Hz, =CH) . 31P NMR (D2O) 0 -4.85 (m, 1P, Py), -9.86 (m, 1P, Pa), -20.40 (m, 1P, P ). Masa
20 (electronebulización negativa) calcul. para C49H64N9O22P3S4 1351.23, encontrada 1372 (M-2H+Na), 1270 [M-80], 1190 [M-160]
.
5-[3-(2,2,2-Trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina (7).
A una solución de 5-yodo-2'-deoxicitidina (10 g, 28.32 mmol) en DMF (200 ml) en un matraz de fondo redondo protegido de la luz bajo una atmósfera de argón, se añadió CuI (1.08 g, 5.67 mmol), trietilamina (7.80 ml, 55.60 mmol), 2,2,2trifluoro-N-prop-2-inil-acetamida (12.8 g, 84.76 mmol) y al final Pd(PPh)3)4 (3.27 g, 2.83 mmol). Después de 18 horas a temperatura ambiente, se añadió bicarbonato en dowex (20 mg) y la mezcla se agitó por 1 h adicional. La filtración y
10 evaporación de los volátiles a presión reducida dio un residuo que se purificó por cromatografía rápida en gel de sílice (CH2Cl2, CH2Cl2:EtOAc 1:1, EtOAc:MeOH 9:1). El producto esperado (7) se obtuvo como un sólido beige con rendimiento cuantitativo. 1H NMR (D2O) 0 2.24-2.17 (m, 1H, H-2'), 2.41-2.37 (m, 1H, H-2'), 3.68 (dd, J = 12.5, 5.0 Hz, 1H, H-5'), 3.77 (dd, J = 12.5, 3.2 Hz, 1H, H-5'), 3.99 (m, 1H, H-4'), 4.27 (s, 2H, CH2N), 4.34 (m, 1H, H-3'), 6.11 (t, J = 6.3 Hz, 1H, H-1'), 8.1 (br s, 1H, NH); MS (ES) : m/z (%) (M-H) 375 (100).
5'-O-(terc-Butildimetilsilil)-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina (8).
20 A una solución del material de partida (7) (1.0 g, 2.66 mmol) e imidazol (200 mg, 2.93 mmol) en DMF (3.0 ml) a 0 °C, se añadió lentamente TBDMSCl (442 mg, 2.93 mmol) en cuatro porciones durante 1 h. Después de 2 h, los volátiles se evaporaron a presión reducida y el residuo se adsorbió en gel de sílice y se purificó por cromatografía rápida (EtOAc, EtOAc:MeOH 9.5:0.5). El producto esperado (8) se aisló como un sólido cristalino (826 mg, 64%). 1H NMR (d6 DMSO) 0
0.00 (s, 1H, CH3); 0.01 (s, 1H, CH3), 0.79 (s, 9 H, tBu), 1.87-1.80 (m, 1H, H-2'), 2.12 (ddd, J = 13.0, 5.8 and 3.0 Hz, 1H,
25 H-2'), 3.65 (dd, J = 11.5, 2.9 Hz, 1H, H-5'), 3.74 (dd, J = 11.5, 2.5 Hz, 1H, H-5'), 3.81-3.80 (m, 1H, H-4'), 4.10-4.09 (m, 1H, H-3'), 4.17 (d, 2H, J = 5.1 Hz, NCH2), 5.19 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 3'-OH), 6.04 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 6.83 (br s, 1H, NHH), 7.78 (br s, 1H, NHH), 7.90 (s, 1H, H-6), 9.86 (t, J = 5.1 Hz, 1H, -H2CNH); MS (ES) : m/z (%) (MH)+ 491 (40%).
4-N-Acetil-5'-O-(terc-butildimetilsilil)-3'-O-(metiltiolmetil)-5-[3-(2,2,2-trifluoroacatamida)-prop-1-inil]-2'deoxicitidina (9).
A una solución del material de partida (8) (825 mg, 1.68 mmol) en DMSO (6.3 ml) y atmósfera de N2, se añadió lentamente ácido acético (AcOH) (1.3 ml, 23.60 mmol) seguido por anhídrido acético (AC2O) (4.8 ml, 50.50 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente por 18 h y se inactivó a 0 °C por la adición de NaHCO3 saturado (20 ml). El producto se extrajo en EtOAc (3 x 30 ml), los extractos orgánicos se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron y los volátiles se evaporaron. El residuo crudo se purificó por cromatografía rápida en gel de sílice (EtOAc: éter de petróleo 1:1) para dar el producto esperado como un aceite incoloro (9) (573 mg, 62%). 1H NMR (d6 DMSO) 0 0.00 (s, 6H, 2 x CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 2.01 (s, 3H, SCH3), 2.19-1.97 (m, 2H, 2 x H2'), 2.25 (s, 3H, COCH3), 3.67 (dd, 1H, J = 11.5 Hz, H5'), 3.78 (dd, 1H, J = 11.5, 3.3 Hz, H-5'), 4.06-4.05 (m, 1H, H-4'), 4.17 (d, 2H, J = 5.1 Hz, N-CH2), 4.30-4.28 (m, 1H, H-3'),
4.63 (s, 2H; CH2-S), 5.94 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H-1'), 8.17 (s, 1H, H-6), 9.32 (s, 1H, NHCO), 9.91 (t, 1H, J = 5.4 Hz, NHCH2); MS (ES): m/z (%) (MH)+ 593.
4-N-Acetil-3'-O-(azidometil)-5'-O-(terc-butildimetileilil)-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamida)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina (10).
A una solución del material de partida (9) (470 mg, 0.85 mmol) en diclorometano (DCM) (8 ml) bajo una atmósfera de N2 y enfriada hasta 0 °C, se añadió ciclohexeno (430 μl, 4.27 mmol) seguido por SO2Cl2 (1 M en DCM, 1.0 ml, 1.02 mmol). La solución se agitó por 30 minutos a 0 °C, y los volátiles se evaporaron. El residuo se disolvió inmediatamente en DMF (8 ml), se agitó bajo N2 y se añadió lentamente azida de sodio (275 mg, 4.27 mmol). Después de 18 h, el producto crudo se evaporó hasta secarse, se disolvió en EtOAc (30 ml) y se lavó con Na2CO3 (3 x 5 ml). La capa orgánica combinada se mantuvo separada. Una segunda extracción del producto de la capa acuosa se realizó con DCM (3 x 10 ml). Todas las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y y los volátiles se evaporaron a presión reducida para dar un aceite identificado como el producto esperado (10) (471 mg, 94 % de rendimiento). Este se usó sin ninguna purificación adicional. 1H NMR (d6 DMSO) 0 0.11 (s, 3H, CH3), 0.11 (s, 3H, CH3), 0.88 (s, 9H, tBu), 2.16-2.25 (m, 1H, H2'), 2.35 (s, 3H, COCH3), 2.47-2.58 (m, 1H, H-2'), 3.79 (dd, J = 11.6, 3.2 Hz, 1H, H-5'), 3.90 (dd, J = 11.6, 3.0 Hz, 1H, H5'), 4.17-4.19 (m, 1H, H-4'), 4.28 (s, 2H, NCH2), 4.32-4.35 (m, 1H, H-3'), 4.89 (dd, J = 14.4, 6.0 Hz, 2H, CH2-N3), 6.05 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 8.25 (s, 1H, H-6), 9.46 (br s, 1H, NHH), 10.01 (br s, 1H, NHH).
4-N-Acetil-3'-O-(azidometil)-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina y 3'-O-(azidometil)-5-[3(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina (11).
A una solución del material de partida (11) (440 mg, 0.75 mmol) en THF (20 ml) a 0 °C y atmósfera de N2, se añadió TBAF en THF 1.0 M (0.82 ml, 0.82 mmol). Después de 1.5 h, los volátiles se evaporaron a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía rápida en gel de sílice (EtOAc:éter de petróleo 8:2 a EtOAc 100 % a EtOAc:MeOH 8:2). Los dos compuestos se aislaron e identificaron como se describió anteriormente. El primer 4-N-acetilo (11) eluyó, (53 mg, 15 %) y el segundo 4-NH2 (12) (271 mg, 84 %). El compuesto 4-N-Acetil (11): 1H NMR (d6 DMSO) 0 1.98 (s, 3H, CH3CO),
2.14-2.20 (m, 2H, HH-2'), 3.48-3.55 (m, 1H, H-5'), 3.57-3.63 (m, 1H, H-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.19 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2-NH), 4.23-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.77 (s, 2H, CH2-N3), 5.2 (t, 1H, J = 5.1 Hz, 5'-OH), 5.95 (t, J = 6.2 Hz, 1H, H-1'),
8.43 (s, 1H, H-6), 9.34 (s, 1H, CONH), 9.95 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NHCH2). El compuesto 4-NH2 (12): 1H NMR (d6 DMSO) 0 1.98-2.07(2H, CHH-2'), 3.50-3.63 (m, 2H, CHH-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H4'), 4.09 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2-NH), 4.24-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2-N3), 5.13 (t, J = 5.3 Hz, 1H, 5'-OH), 5.91 (br s, 1H, NHH), 6.11 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 8.20 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NCH2), 8.45 (s, 1H, H-6), 11.04 (br s, 1H, NRH).
4-N-Henzoil-5'-O-(terc-butildimetilsilil)-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina (13).
El material de partida (8) (10g, 20.43 mmol) se azeotropizó en piridina seca (2 x 100 ml), después se disolvió en piridina seca (160 ml) bajo una atmósfera de N2. Se añadió clorotrimetilsilano (10 ml, 79.07 mmol) en forma de gotas a la solución y se agitó por 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió después cloruro de benzoilo (2.6 ml, 22.40 mmol) a la solución y se agitó por una hora adicional. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0°C, se añadió agua destilada (50 ml) lentamente a la solución y se agitó por 30 minutos. Se evaporaron la piridina y el agua de la mezcla bajo alto vacío para producir un gel marrón que se particionó entre 100 ml de una solución de NaHCO3 saturada acuosa y DCM (100 ml). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con (2 x 100 ml) adicionales de DCM. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron y los volátiles se evaporaron a presión reducida. El aceite marrón resultante se purificó por cromatografía rápida en gel de sílice (DCM:MeOH 99:1 a 95:5) para producir un sólido cristalino amarillo claro (13) (8.92 g, 74%). 1H NMR (d6 DMSO): 0 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.94 (m, 1H, H-2'), 2.27 (m, 1H, H-2'), 3.64 (d, 1H, J = 11.6 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.6 Hz, H-5'), 3.91 (m, 1H, H-4'), 4.09 (br m, 3H, CH2NH, H3'), 5.24 (s, 1H, 3'-OH), 6.00 (m, 1H, H-1'), 7.39 (m, 2H, Ph), 7.52 (m, 2H, Ph), 7.86 (m, 1H, Ph), 8.0 (s, 1H, H-6), 9.79 (t, 1H, J = 5.4 Hz, NHCH2), 12.67 (br s, 1H, NH). La masa (electronebulización positiva) calcul. para C27H33F3N4O6Si 594.67, encontrada 595.
4-N-Benzoil-5'-O-(terc-butildimetilsilil)-3'-O-metiltiometil-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'deoxicitidina (14).
El material de partida (13) (2.85 g, 4.79 mmol) se disolvió en DMSO seco (40 ml) bajo una atmósfera de N2. Se añadieron ácido acético (2.7 ml, 47.9 mmol) y anhídrido acético (14.4 ml, 143.7 mmol) secuencialmente y lentamente al material de partida, el cual se agitó después por 18 h a temperatura ambiente. Una solución de NaHCO3 saturada (150 ml) se añadió cuidadosamente a la mezcla de reacción. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron y se evaporaron para producir un líquido naranja que se azeotropizó posteriormente con tolueno (4 x 150 ml) hasta que el material se solidificó. El residuo crudo se purifìcó en gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc 2:1 a 3:1) para producir un sólido cristalino amarillo (14) (1.58 g, 50%). 1H NMR (d6 DMSO): 0 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.99 (s, 3H, CH3), 2.09 (m, 1H, H-2'), 2.28 (m, 1H, H-2'), 3.66 (d, 1H, J = 11.5, 2.9 Hz, H-5'), 3.74 (dd, 1H, J = 11.3, 2.9 Hz, H-5'), 3.99 (m, 1H, H-4'), 4.09 (m, 1H, CH2NH), 4.29 (m, 1H, H-3'), 4.61 (s, 2H, CH2S), 6.00 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.80 (d, 1H, J = 7.55 Hz, HAr), 7.97 (s, 1H, H-6), 9.79 (br t, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C29H37F3N4O6SSi 654.79, encontrada 653.2.
4-N-Benzoil-5'-O-(terc-butildimetilsilil)-3'-O-azidometil-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina
(15).
El material de partida (14) (1.65 g, 2.99 mmol) se disolvió en DCM (18 ml) y se enfrió hasta 0°C. Se añadieron
10 ciclohexeno (1.5 ml, 14.95 mmol) y SO2Cl2 (0.72 ml, 8.97 mmol) y se agitaron 1 h en un baño de hielo. La TLC indicó que todavía está presente material de partida con lo cual se añadió una alícuota adicional de SO2Cl2 (0.24 ml) y la mezcla se agitó por 1 h a 0°C. Los volátiles se eliminaron por evaporación para producir un sólido marrón claro que se disolvió nuevamente en 18 ml de DMF seco (18 ml) bajo N2. Se añadió azida de sodio (0.97 g, 14.95 mmol) después a la solución y se agitó por 2.5 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se pasó a través de una almohadilla de
15 sílice y se eluyó con EtOAc y los volátiles se eliminaron por evaporación a alto vacío. El gel marrón resultante se purificó por cromatografía rápida (éter de petróleo:EtOAc 2:1 a 4:1) para producir el producto deseado como un sólido cristalino blanco (15) (0.9 g, 55%). 1H NMR (d6 DMSO): 0 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 2.16 (m, 1H, H-2'), 2.22 (m, 1H, H2'), 3.70 (d, 1H, J = 11.5 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.3 Hz, H-5'), 4.01 (m, 1H, H-4'), 4.10 (m, 1H, CH2NH), 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2S), 5.99 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.81 (d, 1H, J = 7.4 Hz, Ph), 7.95 (s, 1H,
20 H-6), 9.78 (br s, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C28H34F3N7O6Si 649.71, encontrada 648.2
25 4-N-Benzoil-3'-O-azidometil-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxicitidina (16).
El material de partida (15) (140 mg, 0.22 mmol) se disolvió en THF (7.5 ml). Se añadió TBAF (1M sol. en THF, 0.25 ml) lentamente y se agitó por 2 h a temperatura ambiente. El material volátil se eliminó a presión reducida para producir un gel marrón que se purificó por cromatografía rápida (EtOAc:DCM 7:3) para producir el producto deseado (16) como un 30 sólido cristalino de color claro (0.9 g, 76%). 1H NMR (d6 DMSO): 0 2.16 (m, 1H, H-2'), 2.22 (m, 1H, H-2'), 3.70 (d, 1H, J =
11.5 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.3 Hz, H-5'), 4.01 (m, 1H, H-4'), 4.10 (m, 1H, CH2NH), 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2S), 5.32 (s, 1H, 5' OH), 5.99 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.81 (d, 1H, J = 7.35 Hz, Ph), 7.95 (s, 1H, H-6), 9.78 (br s, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C22H20F3N7O6 535.44, encontrada 534.
5-(3-Amino-prop-1-inil)-3'-O-azidometil-2'-deoxicitidina 5'-O-nucleósido trifosfato (17).
A una solución de (11) y (12) (290 mg, 0.67 mmol) y esponja de protones (175 mg, 0.82 mmol) (ambos secados previamente bajo P2O5 por al menos 24 h) en PO(OMe)3 (600 μl), a 0 °C bajo una atmósfera de argón, se añadió lentamente POCl3 (destilado recientemente) (82 μl, 0.88 mmol). La solución se agitó vigorosamente por 3 h a 0 °C y después se inactivó por la adición de tetra-tributilamonio difosfato (0.5 M) en DMF (5.2 ml, 2.60 mmol), seguido por 10 nBu3N (1.23 ml, 5.20 mmol) y trietilamonio bicarbonato (TEAB) 0.1 M (20 ml). Después de 1 h a temperatura ambiente, se añadió a la mezcla una solución de amoniaco acuosa (p 0.88, 20 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente por 15 h, los volátiles se evaporaron a presión reducida y el residuo se purificó por MPLC con un gradiente de TEAB de 0.05M a 0.7M. El trifosfato esperado se eluyó de la columna a aprox. TEAB 0.60 M. Se realizó una segunda purificación por HPLC en una columna Zorbax SB-C18 (21.2 mm i.d. x 25 cm) eluida con TEAB 0.1M (bomba A) y 30% CH3CN en 15 TEAB 0.1M (bomba B) usando un gradiente como sigue: B al 5% 0-5 min, 0.2 ml; B al 80% 5-25 min, 0.8 ml; B al 95 % 25-27 min, 0.8 ml; B al 95 % 27-30 min, 0.8 ml; B al 5 % 30-32 min, 0.8 ml; B al 95 % 32-35 min, 0.2 ml, proporcionando el producto descrito anteriormente con un rt(17): 20.8 (14.5 μmoles, 2.5% de rendimiento); 31p NMR (D2O, 162 MHz) 0
5.59 (d, J = 20.1 Hz, Px), -10.25 (d, J = 19.3 Hz, 1P, Pa), -20.96 (t, J = 19.5 Hz, 1P, P ); 1H NMR (D2O) 0 2.47-2.54 (m, 1H, H-2'), 2.20-2.27 (m, 1H, H-2'), 3.88 (s, 2H, CH2N), 4.04-4.12 (m, 1H, RH-5'), 4.16-4.22 (m, 1H, HH-5'), 4.24-4.30 (m,
20 1H, H-4'), 4.44-4.48 (m, 1H, H-3'), 6.13 (t, J = 6.3 Hz, 1H, H-1'), 8.35 (s, 1H, H-6); MS (ES): m/z (%) (M-H) 574 (73%), 494 (100 %).
25 Enlazador de disulfuro Alexa488.
Se disolvió Alexa Fluor 488-NHS comercialmente disponible (35 mg, 54 μmol) en DMF (700 μl) y, para garantizar una completa activación, se añadieron secuencialmente 4-DMAP (7 mg, 59 μmol) y N,N'-disuccinimidil carbonato (15 mg, 59 μmol). Después de 15 min en activación completa, se añadió una solución del disulfuro de partida (32.0 mg, 108 μmol)
en DMF (300 μl) conteniendo diisopropiletilamina (4 μl) sobre la solución del colorante activado. Se realizó otra adición de diisopropiletilamina (20 μl) a la mezcla final, se ultrasonicó por 5 min y reaccionó por 18 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los volátiles se evaporaron a presión reducida y el residuo crudo se purificó primero pasándolo a través de una columna corta de resina de intercambio de iones Sephadex -DEAE A-25 (40-120 μ), eluida primero con TEAB 0.1 M (25 ml), y después TEAB 1.0M (75 ml). La última que contenía los dos compuestos finales se concentró y el residuo se purificó por HPLC en una columna Zorbax SB-C18 (21.2 mm i.d. x 25 cm) eluida con TEAB 0.1M (bomba A) y CH3CN (bomba B) usando un gradiente como sigue: B al 2% 0-2 min, 0.2 ml; B al 2% 2-4 min, 0.8 ml; B al 23 % 4-15 min, 0.8 ml; B al 23 % 15-24 min, 0.8 ml; B al 95 % 24-26 min, 0.8 ml; B al 95 % 26-28 min, 0.8 ml, B al 2 % 28-30 min, 0.8 ml, B al 2 % 30-33 min, 0.2 ml proporcionando los dos compuestos detallados anteriormente con tr: 19.0 (regioisómero izquierdo) y tr: 19.5 (regioisómero derecho). Los dos regioisómeros se pasaron respectivamente a través de una columna de resina dowex de intercambio de iones, proporcionando 16.2 μmol y 10.0 μmol respectivamente, 62% de rendimiento total (basado en Alexa Fluor 488-NHS comercialmente disponible de 76% de pureza); E493 = 71,000 cm-1 M-1 en H2O. 1H NMR (D2O) (regioisómero izquierdo) 0 2.51 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.66 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.71 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2),
3.43 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2), 6.64 (d, J = 9.2 Hz, 2H, HAr), 6.77 (d, J = 9.2 Hz, 2H, HAr), 7.46 (s, 1H, HAr), 7.90 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1H, HAr), 8.20 (d, J = 8.1 Hz, 1H, HAr). 1H NMR (D2O) (regioisómero derecho) 0 2.67 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2),
2.82 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2. 93 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 3.68 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 6.72 (d, J = 9.3 Hz, 2H, HAr),
6.90 (d, J = 9.3 Hz, 2H, HAr), 7.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H, HAr), 8.03 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H, HAr), 8.50 (d, J = 1.8 Hz, 1H, HAr) Masa (electronebulización negativa) calcul. para C26H23N3O12S4 697.02, encontrada 692 (M-H), 347 [M/2].
A una solución de enlazador de disulfuro de Alexa Fluor 488 (3.4 μmol, 2.37mg) en DMF (200 μl) se añadieron 4-DMAP
(0.75 mg, 5.1 μmol) y N,N-disuccinimidil carbonato (1.70 mg, 5.1 μmol). La mezcla se agitó por 15 para una completa activación del ácido, después se añadió a una solución del nucleótido (17) (3.45 mg, 6.0 μmol) en DMF (0.3 ml) que contenía nBu3N (40 μl) a 0 °C. La mezcla se sonicó por 3 min y después se agitó continuamente por 16 h en ausencia de luz. Los volátiles se evaporaron a presión reducida y el residuo se purificó primero por filtración a través de una columna corta de resina de intercambio de iones Sephadex -DEAE A-25, primero eluida con TEAB 0.1 M (50 ml) eliminando el colorante-enlazador sin reaccionar, después TEAB 1.0 M (100 ml) para recoger el producto esperado (18). Después de la concentración el residuo se purificó por HPLC en una columna Zorbax SB-C18 (21.2 mm i.d. x 25 cm) eluida con TEAB 0.1M (bomba A) y CH3CN (bomba B) usando un gradiente como sigue: B al 2% 0-2 min, 0.2 ml; B al 2% 2-4 min,
0.8 ml; B al 23 % 4-15 min, 0.8 ml; B al 23 % 15-24 min, 0.8 ml; B al 95 % 24-26 min, 0.8 ml; B al 95 % 26-28 min, 0.8 ml, B al 2 % 28-30 min, 0.8 ml, B al 2 % 30-33 min, 0.2 ml proporcionando el producto detallado anteriormente con a rt(18):
19.8 (0.26 μmoles, 12% de rendimiento basado en una medición UV); Amax = 493 nm, E 71,000 cm-1 M-1 en H2O); 31P NMR (D2O, 162 MHz) 0 -5.06 (d, J = 20.6 Hz, 1P, Px), -10.25 (d, J = 19.3 Hz, 1P, Pa), -21.21 (t, J = 19.5 Hz, 1P, P ); 1H NMR (D2O) 0 2.09-2.17 (m, 1H, HH-2'), 2.43-2.50 (m, 1H, HH-2'), 2.61 (t, J = 6.8 Hz, 2H, H2C-S), 2.83 (2H, S-CH2), 3.68 (t, J = 6.0 Hz, 2H, ArCONCH2), 4.06 (s, 2H, CH2N), 4.08-4.17 (m, 4H, HH-5'), 4.25-4.29 (m, 1H, H-4'), 4.46-4.50 (m, 1H, H-3'), 6.09 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 6.88 (d, J = 9.1 Hz, 1H, HAr), 6.89 (d, J = 9.3 Hz, 1H, HAr), 7.15 (d, J = 9.3 Hz, 1H, HAr), 7.17 (d, J = 9.1 Hz, 1H, HAr), 7.64 (br s, 1H, HAr), 8.00-7.94 (m, 2H, HAr), 8.04 (s, 1H, H-6); MS (ES): m/z (%) (M-H) 1253 (46%), (M-H+ Na)- 1275 (100 %).
7-Deaza-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiguanosina (19).
Se agitó en N2, una suspensión de 7-deaza-7-yodo-guanosina (2 g, 2.75 mmol), Pd(PPh3)4 (582 mg, 0.55 mmol), CuI (210 mg, 1.1 mmol), Et3N (1.52 ml, 11 mmol) y la propagilamina (2.5 g, 16.5 mmol) en DMF (40 ml) a temperatura 10 ambiente por 15 h bajo N2. La reacción se protegió de la luz con una lámina de aluminio. Después de la TLC indicando el consumo total del material de partida, la mezcla de reacción se concentró. El residuo se diluyó con MeOH (20 ml) y se trató con dowex-HCO3-. La mezcla se agitó por 30 min y se filtró. La solución se concentró y se purificó por comatografía en gel de silice (éter de petróleo:EtOAc 50:50 a éter de petróleo: EtOAc:MeOH 40: 40: 20), dando (19) como un polvo amarillo (2.1 g, 92%). 1H NMR (d6 DMSO) 0 2.07-2.11 (m, 1H, H-2'), 2.31-2.33 (m, 1H, H-2'), 3.49-3.53 (m, 2H, H-5'),
15 3.77 (br s, 1H, H-4'), 4.25 (d, J = 4.3 Hz, 2H, =CCH2), 4.30 (br s, 1H, H-3'), 4.95 (t, J = 5.2 Hz, 1H, 5'-OH), 5.25 (d, J = 3.4 Hz, 1H, 3'-OH), 6.27-6.31 (m, 1H, H-1'), 6.37 (s, 2H, NH2), 7.31 (s, 1H, H-8), 10.10 (br s, 1H, NHCOCF3), 10.55 (s, 1H, NH). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C16H16F3N5O5 415, encontrada 414.
5'-O-(terc-Butildifenil)-7-deaza-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiguanosina (20).
Una solución de (19) (2.4 g, 5.8 mmol) en piridina (50 ml) se trató con cloruro de ter-butildifenilsililo (TBDPSCl) (1.65 ml,
6.3 mmol) en forma de gotas a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó después hasta la temperatura ambiente. Después
25 de 4h, se añadió otra porción de TBDPSCl (260 μl, 1 mmol). La reacción se monitoreó por TLC, hasta el consumo total del material de partida. La reacción se inactivó con MeOH (-5 ml) y se evaporó hasta secarse. El residuo se disolvió en DCM y se añadió NaHCO3 saturado acuoso. La capa acuosa fue extraída con DCM tres veces. Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío. La purificación por cromatografía en sílice (EtOAc a EtOAc:MeOH 85:15) dio (20) una espuma amarilla (3.1 g, 82%). 1H NMR (d6 DMSO) 0 1.07 (s, 9H, CH3), 2.19-2.23 (m,
30 1H, H-2'), 2.38-2.43 (m, 1H, H-2'), 3.73-3.93 (m, 2H, H-5'), 4.29 (d, J = 5.0 Hz, 2H, CH2N), 4.42-4.43 (m, 1H, H-3'), 5.41 (br s, 1H, OH), 6.37 (t, J = 6.5 Hz, H-1'), 6.45 (br s, 2H, NH2), 7.24-7.71 (m, 11H, H-8, HAr), 10.12 (t, J = 3.6 Hz, 1H, NH),
10.62 (s, 1H, H-3). Masa (electronebulización positiva) calcul. para C32H34F3N5O5Si 653, encontrada 654. 5'-O-(terc-Butildifenil)-7-deaza-3'-O-metiltiolmetil-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiguanosina (21).
Una solución de (20) (1.97 g, 3.0 mmol) en DMSO (15 ml) se trató con Ac2O (8.5 ml, 90 mmol), y AcOH (2.4 ml, 42 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 15 h, después 2 h a 40°C. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (200 ml) y se agitó con NaHCO3 saturado acuoso (200 ml) por 1 h. La capa acuosa se lavó con EtOAc dos veces. La capa orgánica se combinó, se secó (MgSO4) y se concentró al vacío. La purificación por cromatografía en sílice (EtOAc:Hexano 1:1 a EtOAc:Hexano:MeOH 10:10:1) dio (21) como una espuma amarilla (1.3 g, 60%). 1H NMR (CDCl3)
0 1.04 (s, 9H, CH3), 2.08 (s, 3H, SCH3), 2.19-2.35 (m, 2H, H-2), 3.67-3.71 (m, 2H, H-5'), 3.97-3.99 (m, 2H, H-4', H-3'),
4.23 (br s, 2H, CH2N), 4.58 (s, 2H; CH2S), 6.31 (dd, J = 5.7, 7.9 Hz, H-1'), 7.19-7.62 (m, 11H, H8, HAr). Masa (electronebulización positiva) calcul. para C34H38F3N5O5SSi 713, encontrada:
714.
3'-O-Azidometil-7-deaza-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiguanosina (22).
A una solución de (21) (1.3 mg, 1.8 mmol), se añadió ciclohexeno (0.91 ml, 9 mmol) en CH2Cl2 (10 ml) a 4 °C, sulfurilcloruro (1M en CH2Cl2) (1.1 ml, 1.1 mmol) en forma de gotas bajo N2. Después de 30 min., la TLC indicó el consumo total de los nucleósidos (22). Después de la evaporación para eliminar el solvente, el residuo se sometió después a alto vacío por 20 min, y después se trató con NaN3 (585 mmol, 9 mmol) y DMF (10 ml). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente por 2h. La extracción con CH2Cl2/NaCl (10%) dio una goma amarilla, la cual se trató con TBAF en THF (1 M, 3 ml) y THF (3 ml) a temperatura ambiente por 20 min. La evaporación para eliminar solventes, la extracción con EtOAc/NaHCO3saturado acuoso, seguido por la purificación por cromatografía en sílice (EtOAc a EtOAc:MeOH 9:1) dio (22) como una espuma amarilla (420 mg, 50%). 1H NMR (d6 DMSO): 0 2.36-2.42 (m, 1H, H-2'), 2.49-2.55 (m, 1H, H-2'), 3.57-3.59 (m, 2H, H-5'), 3.97-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.29 (m, 2H, CH2N), 4.46-4.48 (m, 1H, H3'), 4.92-4.96 (m, 2H, CH2N3), 5.14 (t, J = 5.4 Hz, 1H, 5'-OH), 5.96-6.00 (dd, J = 5.7, 8.7 Hz, 1H, H-1'), 6.46 (br s, 2H, NH2), 7.39 (s, 1H, H-6), 10.14 (s, 1H, NH), 10.63 (s, 1H, H-3).
3'-O-Azidometil-7-deaza-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiguanosina 5'-O-nucleósido trifosfato (23).
Tetrasodio difosfato decahidratado (1.5 g, 3.4 mmol) se disolvió en agua (34 ml) y la solución se aplicó a una columna de dowex 50 en forma de H+. La columna se lavó con agua. El eluyente se goteó directamente en una solución agitada y fría (baño de hielo) de tri-n-butil amina (1.6 ml, 6.8 mmol) en EtOH (14 ml). La columna se lavó hasta que el pH del eluyente aumentó hasta 6. La solución de etanol acuosa se evaporó hasta secarse y después se coevaporó dos veces con etanol y dos veces con DMF anhidro. El residuo se disolvió en DMF (6.7 ml). La solución de color amarillo pálido sealmacenó sobre tamices moleculares de 4Å. El nucleósido (22) y la esponja de protones se secaron sobre P2O5 al vacío
durante la noche. Una solución de (22) (104 mg, 0.22 mmol) y la esponja de protones (71 mg, 0.33 mmol) en trimetilfosfato (0.4 ml) se agitaron con tamices moleculares de 4Å por 1 h. El POCl3 recientemente destilado (25 μl, 0.26 mmol) se añadió y la solución se agitó a 4°C por 2h. La mezcla se calentó lentamente hasta la temperatura ambiente y se añadieron bis (tri-n-butil amonio) pirofosfato (1.76 ml, 0.88 mmol) y tri-n-butil amina anhidra (0.42 ml, 1.76 mmol). 5 Después de 5 min, la reacción se inactivó con tampón TEAB (trietilamonio bicarbonato) 0.1 M (15 ml) y se agitó por 3 h. El agua se eliminó a presión reducida y el residuo resultante se disolvió en amoniaco concentrado (p 0.88, 10 ml) y se agitó a temperatura ambiente por 16 h. La mezcla de reacción se evaporó después hasta secarse. El residuo se disolvió en agua y la solución se aplicó a una columna DEAE-Sephadex A-25. Se realizó la MPLC con un gradiente lineal de 2 l de TEAB cada uno de 0.05 M y 1 M. El trifosfato se eluyó con tampón entre 0.7 M y 0.8 M. Las fracciones que contienen 10 el producto se combinaron y se evaporaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua y se purificó adicionalmente por HPLC. tr(23) = 20.5 min (columna preparativa Zorbax C18, gradiente: B al 5% a 35% en 30 min, tampón A TEAB 0.1M, tampón B MeCN). El producto se aisló como una espuma blanca (225 O.D., 29.6 μmol, 13.4%, E260 = 7,600). 1H NMR (D2O) 0 2.43-2.5 (m, 2H, H-2'), 3.85 (m, 2H, CH2N), 3.97-4.07 (m, 2H, H-5'), 4.25 (br s, 1H, H-4'), 4.57 (br s, 1H, H3'), 4.74-4.78 (m, 2H, CH2N3), 6.26-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.41 (s, 1H, H-8). 31P-NMR (D2O) 0 -8.6 (m, 1P, Py), -10. 1 (d, J 15 =19.4 Hz, 1P, Pa), -21.8 (t, J = 19.4 Hz, 1P, P ). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C15H21N8O13P3 614,
encontrada 613.
Una mezcla de Cy3 enlazado con disulfuro (2.5 μmol), hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC)
(0.95 mg, 5 μmol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0.68 mg, 5 μmol) y N-metil-morfolina (0.55 μl, 5 μmol) en DMF (0.9 ml) se agitó a temperatura ambiente por 1 h. Una solución de (23) (44 O.D., 3.75 μmol) en 0.1 ml de agua se añadió a la mezcla de reacción a 4°C, y se dejó a temperatura ambiente por 3 h. La reacción se inactivó con tampón TEAB (0.1M,
25 10 ml) y se cargó en una columna DEAE Sephadex (2 x 5 cm). La columna se eluyó primero con tampón TEAB 0.1 M (100 ml) y después tampón TEAB 1 M (100 ml). El producto de trifosfato deseado se eluyó con tampón TEAB 1 M. Se concentró la fracción que contenía el producto y se aplicó a HPLC. tr(24) = 23.8 min (columna Zorbax C18 preparativa, gradiente: B al 5% a 55% en 30 min, tampón A TEAB 0.1M, tampón B MeCN). El producto se aisló como una espuma roja (0.5 μmol, 20%, Emax = 150,000). 1H NMR (D2O) 0 1.17-1.71 (m, 20H, 4 x CH2, 4 x CH3), . 2.07-2.15 (m, 1H, H-2'), 2.21-2.30 (m, 1H, H-2'), 2.52-2.58 (m, 2H, CH2), 2.66-2.68 (m, 2H, CH2), 2.72-2.76 (m, 2H, CH2), 3.08-3.19 (m, 2H, CH2), 3.81-3.93 (m, 6H, CH2, H-5'), 4.08-4.16 (m, 1H, H-4'), 4.45-4.47 (m, 1H, H-3'), 4.70-4.79 (m, 2H, CH2N3), 6.05-6.08 (m,
5 2H, HAr), 6.15-6.18 (m, 1H, H-1'), 7.11 (s, 1H, H-8), 7.09-7.18 (m, 2H, CH), 7.63-7.72 (m, 4H, HAr), 8.27-8.29 (m, 1H, CH). 31P NMR (D2O) 0 -4.7 (m, 1P, Py), - 9.8 (m, 1P, Pa), -19.7 (m, 1P, P ). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C51H66N11O21P3S41389.25, encontrada 1388 (M-H), 694 [M-2H], 462 [M-3H].
7-Deaza-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiadenosina (25).
A una suspensión de 7-deaza-7-yodo-2'-deoxiadenosina (1 g, 2.65 mmol) y CuI (100 mg, 0.53 mmol) en DMF seco (20
ml) se añadió trietilamina (740 μl, 5.3 mmol). Después de agitar por 5 min, se añadieron trifluoro-N-prop-2-inil-acetamida 15 (1.2 g, 7.95 mmol) y Pd(PPh3)4 (308 mg, 0.26 mmol) a la mezcla y la reacción se agitó a temperatura ambiente en la
oscuridad por 16 h. Se añadieron MeOH (40 ml) y bicarbonato en dowex a la mezcla de reacción y se agitó por 45 min.
La mezcla se filtró. El filtrado se lavó con MeOH y el disolvente se eliminó al vacío. La mezcla cruda se purificó por
cromatografía en sílice (EtOAc to EtOAc: MeOH 95:20) para dar un polvo ligeramente amarillo (25) (1.0 g, 95 %). 1H
NMR (d6 DMSO) 0 2.11-2.19 (m, 1H, H-2'), 2.40-2.46 (m, 1H, H-2'), 3.44-3.58 (m, 2H, H-5'), 3.80 (m, 1H, H-4'), 4.29 (m, 20 3H, H-3', CH2N), 5.07 (t, J = 5.5 Hz, 1H, OH), 5.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H, OH), 6.45 (dd, J = 6.1, 8.1 Hz, 1H, H-1'), 7.74 (s,
1H, H-8), 8.09 (s, 1H, H-2), 10.09 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH).
25 5'-O-(terc-Butildifenilsilil)-7-deaza-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiadenosina (26).
El nucleósido (25) (1.13 g, 2.82 mmol) se co-evaporó dos veces en piridina seca (2 x 10ml) y se disolvió en piridina seca (18 ml). A esta solución se añadió cloruro de t-butildifenilsililo (748 μl, 2.87 mmol) en porciones pequeñas a 0°C. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y se dejó agitar durante la noche. La reacción se 30 inactivó con solución de NaCl saturada acuosa. Se añadió EtOAc (25 ml) a la mezcla de reacción y la capa acuosa se extrajo con EtOAc tres veces. Después de secar los extractos orgánicos combinados (MgSO4) el disolvente se eliminó al vacío. La purificación por cromatografía en sílice (DCM después EtOAc a EtOAc: MeOH 85:15) dio (26) como un polvo ligeramente amarillo (1.76 g, 97 %). 1H NMR (d6 DMSO) 0 1.03 (s, 9H, tBu), 2.25-2.32 (m, 1H, H-2'), 2.06-2.47 (m, 1H, H2'), 3.71-3.90 (m, 2H, H-5'), 3.90-3.96 (m, 1H, H-4'), 4.32 (m, 2H, CH2N), 4.46 (m, 1H, H-3'), 5.42 (br s, 1H, OH), 6.53 (t, J
35 = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 7.38-7.64 (m, 11H, H-8 y HAr), 8.16 (s, 1H, H-2), 10.12 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH).
5 5'-O-(terc-Butildifenilsilil)-7-deaza-4-N,N-dimetilformadin-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'deoxiadenosina (27). Una solución del nucleósido (26) (831 mg, 1.30 mmol) se disolvió en una mezcla de MeOH:N,Ndimetilacetal (30 ml: 3ml) y se agitó a 40°C. La reacción monitoreada por TLC, se completó después de 1 h. Se eliminó el disolvente a vacío. La purificación por cromatografía en sílice (EtOAc: MeOH 95:5) dio (27) como un polvo ligeramente marrón (777 mg, 86 %). 1H NMR (d6 DMSO) 0 0. 99 (s, 9H, tBu), 2.22-2.29 (m, 1H, H-2'), 2.50-2.59 (m, 1H, H-2'), 3.13 (s.
10 3H, CH3), 3.18 (s. 3H, CH3), 3.68-3.87 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.92 (m, 1H, H-4'), 4.25 (m, 2H, CH2N), 4.43 (m, 1H, H-3'), 6.56 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 7.36-7.65 (m, 10H, HAr), 7.71 (s, 1H, H-8), 8.33 (s, 1H, CH), 8.8 (s, 1H, H-2), 10.12 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH).
5'-O-(terc-Butildifenilsilil)-7-deaza-4-N,N-dimetilformadin-3'-O-metiltiometoxi-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop
1-inil]-2'-deoxiadenosina (28).
A una solución de(27) (623 mg, 0.89 mmol) en DMSO seco (8 ml) se añadieron ácido acético (775 μl, 13.35 mmol) y
20 anhídrido acético (2.54ml, 26.7 mmol). La mezcla se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La reacción se vertió después en EtOAc y solución de NaHCO3 saturada acuosa (1:1) y se agitó vigorosamente. La capa orgánica se lavó una vez más con NaHCO3 saturado acuoso y se secó sobre MgSO4. Después de eliminar el disolvente a presión reducida, el producto (28) se purificó por cromatografía en sílice (EtOAc: éter de petróleo 1:2, después EtOAc) produciendo (28) (350 mg, 52 %). 1H NMR (d6 DMSO): 0, 1.0 (s, 9H, tBu), 2.09 (s, 3H, SCH3), 2.41-2.48 (m, 1H, H-2'), 2.64-2.72 (m, 1H, H-2'),
25 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.66-3.89 (m, 2H, H-5'), 4.04 (m, 1H, H-4'), 4.26 (m, J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 4.67 (m, 1H, H-3'), 4.74 (br s, 2H, CH2), 6.49 (t, J = 6.1, 8.1 Hz, 1H, H-1'), 7.37-7.48 (m, 5H, HAr), 7.58-7.67 (m, 5H, HAr), 7.76 (s, 1H, H-8), 8.30 (s, 1H, CH), 8.79 (s, 1H, H-2), 10.05 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH).
3'-O-Azidometil-5'-O-(ter-butildifenilsilil)-7-deaza-4-N,N-dimetilformadin-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1
inil]-2'-deoxiadenosina (29).
A una solución de(28) (200 mg, 0.26 mmol) y ciclohexeno (0.135 ml, 1.3 mmol) en CH2Cl2 seco (5 ml) a 0 °C, se añadió
35 cloruro de sulfurilo (32 μl, 0.39 mmol) bajo N2. Después de 10 min, la TLC indicó el consumo total de los nucleósidos (28). El disolvente se evaporó y el residuo se sometió a alto vacío por 20 min. Este se disolvió después nuevamente en
DMF seco (3 ml), se enfrió hasta 0°C y se trató con NaN3 (86 mg, 1.3 mmol). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente por 3h. La reacción se particionó entre EtOAc y agua. Las fases acuosas se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se combinaron y se secaron sobre MgSO4. Después de eliminar el disolvente a presión reducida, la mezcla se purificó por cromatografía en sílice (EtOAc) produciendo un aceite (29) (155 mg, 80 %), 1H NMR (d6 DMSO): 0 0.99 (s, 9H, tBu), 2.45-2.50 (m, 1H, H-2'), 2.69-2.78 (m, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.67-3.88 (m, 2H, H-5'), 4.06 (m, 1H, H-4'), 4.25 (m, 2H, CH2), 4.61 (m, 1H, H-3'), 4.84-4.97 (m, 2H, CH2), 6.58 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 7.35-7.47 (m, 5H, HAr), 7.58-7.65 (m, 5H, HAr), 7.77 (s, 1H, H-8), 8.30 (s, 1H, CH), 8.79 (s, 1H, H-2),
10.05 (br s, 1H, NH).
3'-O-Azidometil-7-deaza-4-N,N-dimetilformadin-7-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-prop-1-inil]-2'-deoxiadenosina (30).
Una solución de (29) (155 mg, 0.207 mmol) en solución en tetrahidrofurano (THF) (3 ml) se trató con TBAF (1 M en THF, 228 μl) a 0°C. El baño de hielo se eliminó después y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 h la TLC indicó el consumo total de los nucleósidos. El disolvente se eliminó. La purificación por cromatografía en sílice (EtOAc:MeOH 95:5) dio (30) (86 mg, 82 %) como un aceite marrón pálido. 1H NMR (d6 DMSO) 0 2.40-2.48 (dd, J = 8.1,
13.6 Hz, 1H, H-2'), 2.59-2.68 (dd, J = 8.3, 14 Hz, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.52-3.62 (m, 2H, H-5'), 4.02 (m, 1H, H-4'), 4.28 (d, J = 5.6 Hz, 2H, CH2NH), 4.47 (m, 1H, H-3'), 4.89 (s, 2H, CH2N3), 5.19 (t, J = 5.6 Hz, 1H, OH),
6.49 (dd, J = 8.1, 8.7 Hz, 1H, H-1'), 7.88 (s, 1H, H-8), 8.34 (s, 1H, CH), 8.80 (s, 1H, H-2), 10.08 (s, 1H, NH).
7-(3-Aminoprop-1-inil)-3'-O-azidometil -7-deaza-2'-deoxiadenosina 5'-O-nucleósido trifosfato (31).
El nucleósido (30) y la esponja de protones se secaron sobre P2O5 al vacío durante la noche. Una solución de (30) (150 mg, 0.294 mmol) y esponja de protones (126 mg, 0.588 mmol) en trimetilfosfato (980 μl) se agitó con tamices moleculares de 4Å por 1 h. El POCl3 recientemente destilado (36 μl, 0.388 mmol) se añadió y la solución se agitó a 4°C por 2h. La mezcla se calentó lentamente hasta la temperatura ambiente y se añadieron la solución de bis (tri-n-butil amonio) pirofosfato 0.5 M en DMF (2.35 ml, 1.17 mmol) y tri-n-butil amina anhidra (560 μl, 2.35 mmol). Después de 5 min, la reacción se inactivó con tampón TEAB (trietilamonio bicarbonato) 0.1 M (15 ml) y se agitó por 3h. El agua se eliminó a presión reducida y el residuo resultante se disolvió en amoniaco concentrado (p 0.88, 15 ml) y se agitó a temperatura ambiente por 16 h. La mezcla de reacción se evaporó después hasta secarse. El residuo se disolvió en agua y la solución se aplicó a una columna DEAE-Sephadex A-25. Se realizó la MPLC con un gradiente lineal de TEAB
0.05 M a 1 M . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se evaporaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua y se purificó adicionalmente por HPLC. HPLC: tr(31) : 19.94 min (columna preparativa Zorbax C18, gradiente: B al 5% a 35% en 20 min, tampón A TEAB 0.1M, tampón B MeCN). El producto (31) se aisló como una espuma blanca (17.5 μmol, 5.9%, E280 = 15000). 1H NMR (D2O) 0 2.67-2.84 (2m, 2H, H-2'), 4.14 (m, 2H, CH2NH), 4.17
4.36 (m, 2H, H-5'), 4.52 (br s, H-4'), 6.73 (t, J = 6.6 Hz, H-1'), 8.06 (s, 1H, H-8), 8.19 (s, 1H, H-2). 31P NMR (D2O) 0 -5.07 (d, J = 21.8 Hz, 1P, Py), -10.19 (d, J =19.8 Hz, 1P, Pa), -21.32 (t, J = 19.8 Hz, 1P, P ). Masa (electronebulización negativa) calcul. para C15H21N8O12P3 598.05, encontrada 596.
Al enlazador de disulfuro Cy3 (1.3 μmol) en solución en DMF (450 μl) se añadió a 0°C 50 μl de una mezcla de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 1-hidroxibenzotriazol hidratado y N-metilmorfolina (26 μM cada uno) en DMF. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se monitoreó por TLC (MeOH:CH2Cl2 3:7) hasta que el enlazador colorante se consumió. Después se añadió DMF (400 μl) a 0°C, seguido por el nucleótido (31) (1.2 μmol) en solución en agua (100 μl) y la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La TLC (MeOH:CH2Cl2 4:6) mostró el consumo completo del éster activado y una mancha roja oscura apareció en la línea base. La reacción se inactivó con tampón TEAB (0.1M, 10 ml) y se cargó en una columna DEAE Sephadex (2 x 5 cm). La columna se eluyó primero con tampón TEAB 0.1 M (100 ml) para lavar los residuos orgánicos y después tampón TEAB 1 M (100 ml). El trifosfato deseado (32) se eluyó con tampón TEAB 1 M. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, se evaporaron y se purificaron por HPLC. Condiciones de la HPLC: tr(32): 22.44 min (columna preparativa Zorbax C18, gradiente: B al 5% a 35% en 20 min, tampón A TEAB 0.1M, tampón B MeCN). El producto se aisló como un sólido rosa oscuro (0.15 μmol, 12.5%, E550 = 150000). 1H NMR (D2O) 0 2.03 (t, 2H, CH2), 2.25 (m, 1H, H-2'), 2.43 (m, 1H, H-2'), 2.50 (m, 2H, CH2), 2.66 (m, 2H, CH2), 3.79 (m, 2H CH2), 3.99 (m, 4H, CH2N, H-5'), 4.18 (br s, 1H, H-4'), 6.02, 6.17 (2d, J = 13.64 Hz, 2H, HAr), 6.30 (dd, J = 6.06, 8.58 Hz, H-1'), 7.08, 7.22 (2d, 2H, 2 x =CH), 7.58-7.82 (m, 5H, HAr, H-2, H-8), 8.29 (m, =CH). 31P NMR (D2O) 0 -4.83 (m, 1P, Py), -10.06 (m, 1P, Pa), -20.72 (m, 1P, P ).
Incorporación de la enzima de los 3'-Azidometil dNTP
A un ADN cebador/molde 100 nM (cebador previamente marcado con 32P y polinucleótido quinasa T4) en Tris-HCl pH
8.8 50 mM, Tween-20 0. 01%, y MgSO4 4 mM, adicionar 2 μM del compuesto 6 y polimerasa 100 nM (Thermococcus sp. 9°N exo -Y409V A485L suministrado por New England Biolabs). El patrón consiste de una corrida de 10 bases de adenina para mostrar el efecto del bloqueo. La reacción se calienta hasta 65 C por 10 min. Para mostrar el bloqueo completo, se realiza un seguimiento con los cuatro trifosfatos nucleósidos nativos, desbloqueados. La incorporación cuantitativa de un solo azidometilo que bloquea al dTTP se puede observar y por lo tanto el grupo azidometil se puede ver que actúa como un bloqueo efectivo para la incorporación posterior.
Al unir un ADN en horquilla (cebador auto complementario unido covalentemente / molde) a una perla de estreptavidina la reacción se puede realizar a través de múltiples ciclos, como se muestra en las Figuras 5 y 6.
Preparación de las perlas de estreptavidina
Eliminar el tampón de almacenamiento y lavar las perlas 3 veces con tampón TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM y EDTA, 1 mM). Resuspender en tampón B & W (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA y 2.0 M NaCl), adicionar ADN en horquilla marcado con 32P biotinilado con una secuencia patrón colgante adecuada. Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 minutos. Eliminar el tampón y lavar las perlas 3 veces con tampón TE.
Incorporación del nucleósido trifosfato completamente funcional (FFN)
A una solución de Tris-HCl pH 8.8 50 mM, Tween-20 0.01%, MgSO4 4 mM, MnCl2 0.4 mM (excepto el ciclo 1, 0.2 mM), adicionar 2 μM de FFN y 100 nM de polimerasa. Esta solución se añade después a las perlas y se mezcla vigorosamente y se incuba a 65°C por 10-15 minutos. La mezcla de reacción se elimina y las perlas se lavan 3 veces con tampón TE.
Etapa de desbloqueo
La sal trisódica de tris-(2-carboxietil)fosfinas (TCEP) (0.1M) se añade a las perlas y se mezcla vigorosamente. La mezcla se incubó después a 65°C por 15 minutos. La solución de desbloqueo se elimina y las perlas se lavan 3 veces con tampón TE.
Etapa de recubrimiento
Se añade yodoacetamida (431 mM) en fosfato 0.1 mM pH 6.5 a las perlas y se mezcla vigorosamente, después esto se deja a temperatura ambiente por 5 minutos. La solución de recubrimiento se elimina y las perlas se lavan 3 veces con tampón TE.
Repetir según sea necesario
Los productos de reacción se pueden analizar mediante la colocación de la solución de perlas en el pocillo de un gel de secuenciación estándar de ADN de poliacrilamida al12% en tampón de carga de formamida al 40%. Correr el gel en condiciones desnaturalizantes provoca que el ADN se libere de las perlas y sobre el gel. Los cambios de banda del ADN se ven afectados tanto por la presencia del colorante como por la adición de nucleótidos adicionales y por lo tanto la escisión del colorante (y el bloqueo) con la fosfina causa un cambio de movilidad en el gel.
Dos ciclos de incorporación con los compuestos 18 (C), 24 (G) y 32 (A) y seis ciclos con el compuesto 6 pueden observarse en las Figuras 5 y 6.

Claims (29)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de nucleótido modificada que comprende una base purina o pirimidina y una porción de azúcar ribosa o deoxiribosa con un grupo de bloqueo 3'-OH removible covalentemente unido a ella, tal que el átomo de carbono 3' tiene unido un grupo de la estructura
    -O-Z
    en donde Z es cualquiera de -C(R')2-N(R")2'C(R')2-N(H)R", y -C(R')2-N3,
    en donde cada R" es, o es parte de un grupo protector removible;
    cada R' es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, acilo, ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido, o un marcador detectable unido a través de un grupo de enlace; o (R')2 representa un grupo alquilideno de la fórmula =C(R''')2 en donde cada R''' puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que comprende átomos de hidrógeno y halógeno y grupos alquilo; y
    en donde dicha molécula puede reaccionar para producir un producto intermedio en el cual cada R" se intercambia por H, dicho producto intermedio se disocia bajo condiciones acuosas para proporcionar una molécula con un 3'OH libre.
  2. 2.
    Una molécula de acuerdo con la reivindicación 1 en donde R' es un alquilo o alquilo sustituido.
  3. 3.
    Una molécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde - Z es de la fórmula -C(R')-N3.
  4. 4.
    Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde Z es un grupo azidometilo.
  5. 5.
    Una molécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde R" es un grupo bencilo o bencilo sustituido.
  6. 6.
    Una molécula de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde dicha base se une a un marcador detectable a través de un enlazador escindible o un enlazador no escindible.
  7. 7.
    Una molécula de acuerdo con la reivindicación 6 en donde dicho enlazador es escindible.
  8. 8.
    Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde un marcador detectable está unido a la molécula a través del grupo de bloqueo por un enlazador escindible o no escindible.
  9. 9.
    Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en donde dicho marcador detectable es un fluoróforo.
  10. 10.
    Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en donde dicho enlazador sensible a ácido, fotolábil o contiene un enlace disulfuro.
  11. 11.
    Una molécula de nucleótido modificada como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende uno o más átomos 32P en su porción fosfato.
  12. 12.
    Un método para controlar la incorporación de un nucleótido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y complementario a un segundo nucleótido en un polinucleótido objetivo de cadena sencilla en una reacción de secuenciación o síntesis que comprende incorporar en el polinucleótido creciente complementario dicho nucleótido, la incorporación de dicho nucleótido previene o bloquea la introducción de moléculas de nucleósidos o nucleótidos posteriores en dicho polinucleótido creciente complementario.
  13. 13.
    El método de la reivindicación 12, en donde la incorporación de dicho primer nucleótido se realiza por una transferasa o polimerasa terminal o una transcriptasa inversa.
  14. 14.
    El método de la reivindicación 13 en donde la polimerasa es un Thermococcus sp
  15. 15.
    El método de la reivindicación 14 en donde el Thermococcus sp es 9°N o un mutante simple o mutante doble del mismo.
  16. 16.
    El método de la reivindicación 15 en donde el mutante doble es -Y409V A485L.
  17. 17.
    Un método para determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla, que comprende monitorear la incorporación secuencial de los nucleótidos complementarios, en donde al menos una incorporación es de un nucleótido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y en donde la identidad del nucleótido incorporado se determina detectando el marcador enlazado a la base, y el grupo de bloqueo y dicho marcador se eliminan antes de la introducción del siguiente nucleótido complementario.
  18. 18.
    El método de acuerdo con la reivindicación 17 en donde el marcador del nucleótido y el grupo de bloqueo se eliminan en una sola etapa de tratamiento químico.
  19. 19.
    El método de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende:
    (a)
    proporcionar una pluralidad de diferentes nucleótidos en donde dicha pluralidad de diferentes nucleótidos son como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y en donde el marcador detectable unido a cada tipo de nucleótido puede ser distinguido tras la detección del marcador detectable usado para otros tipos de nucleótidos;
    (b)
    incorporar el nucleótido en el complemento del polinucleótido objetivo de cadena sencilla;
    (c)
    detectar el marcador del nucleótido de (b), y de ese modo determinar el tipo de nucleótido incorporado;
    (d)
    eliminar el marcador del nucleótido de (b) y el grupo de bloqueo; y
    (e)
    opcionalmente repetir las etapas (b)-(d) una o más veces; y de ese modo determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla.
  20. 20.
    El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde cada uno de los nucleótidos se ponen en contacto con el objetivo secuencialmente, con la eliminación de los nucleótidos no incorporados antes de la adición del siguiente nucleótido, y en donde la detección y eliminación del marcador y el grupo de bloqueo se lleva a cabo después de la adición de cada nucleótido, o después de la adición de los cuatro nucleótidos.
  21. 21.
    El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde cada uno de los nucleótidos se ponen en contacto con el objetivo simultáneamente, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo.
  22. 22.
    El método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende una primera etapa y una segunda etapa, en donde la primera etapa, una primera composición que comprende dos de los cuatro nucleótidos se pone en contacto con el objetivo y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador, y en donde en la segunda etapa, una segunda composición que comprende los dos nucleótidos no incluidos en la primera composición se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y después de la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo, y en donde las etapas primera y segunda se repiten opcionalmente una o más veces.
  23. 23.
    El método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende una primera etapa y una segunda etapa, en donde la primera etapa, una primera composición que comprende uno de los cuatro nucleótidosse pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la segunda etapa, una segunda composición que comprende los tres nucleótidos no incluidos en la primera composición se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la primera y segunda etapas se repiten opcionalmente una o más veces.
  24. 24.
    El método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende una primera etapa y una segunda etapa, en donde la primera etapa, una primera composición que comprende tres de los cuatro nucleótidos se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la segunda etapa, una composición que comprende el nucleótido no incluido en la primera composición se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la primera y segunda etapas se repiten opcionalmente una o más veces.
  25. 25.
    Un kit que comprende:
    (a)
    una pluralidad de diferentes nucleótidos en donde dicha pluralidad de diferentes nucleótidos son como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10; y
    (b)
    materiales de empaque para ello.
  26. 26.
    Un kit de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el marcador detectable en cada nucleótido puede distinguirse tras la detección del marcador detectable usado para cualquiera de los otros tipos de nucleótidos.
  27. 27. El kit de la reivindicación 25 ó 26, comprende además una enzima y tampones adecuados para la acción de la 5 enzima.
  28. 28. Uso de un nucleótido como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en un método de secuenciación de Sanger o del tipo Sanger.
    10 29. Un oligonucleótido que comprende un nucleótido modificado de las reivindicaciones 1-11.
  29. 30. Un nucleótido trifosfato que comprende un nucleótido modificado de las reivindicaciones 1-11.
    FIG. 1
    FIG. 2
    FIG. 3
    FIG. 4
    FIG. 5
    FIG. 6
    FIG. 7
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US (9) US7541444B2 (es)
EP (6) EP3587433B1 (es)
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SI (3) SI3363809T1 (es)
WO (1) WO2004018497A2 (es)

Families Citing this family (834)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60127162T2 (de) * 2000-10-06 2008-04-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
US7057026B2 (en) * 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
DK3002289T3 (en) 2002-08-23 2018-04-23 Illumina Cambridge Ltd MODIFIED NUCLEOTIDES FOR POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
DE60327649D1 (de) 2002-08-23 2009-06-25 Illumina Cambridge Ltd Markierte nukleotide
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0321306D0 (en) * 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
EP1725572B1 (de) 2003-11-05 2017-05-31 AGCT GmbH Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung
CA2557818A1 (en) 2004-03-03 2005-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
JP4627625B2 (ja) * 2004-03-11 2011-02-09 三井化学株式会社 Ｎ−アセチルシチジン類の製造方法
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
EP2003214B1 (en) 2005-02-01 2013-04-10 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing
EP2241637A1 (en) 2005-02-01 2010-10-20 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
GB0507835D0 (en) * 2005-04-18 2005-05-25 Solexa Ltd Method and device for nucleic acid sequencing using a planar wave guide
EP1888743B1 (en) 2005-05-10 2011-08-03 Illumina Cambridge Limited Improved polymerases
EP3257949A1 (en) 2005-06-15 2017-12-20 Complete Genomics Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
US9169510B2 (en) * 2005-06-21 2015-10-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compositions
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
JP4621921B2 (ja) * 2005-07-27 2011-02-02 国立大学法人群馬大学 新規核酸誘導体及びそれを用いたポリヌクレオチドの製造方法
GB0517097D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Solexa Ltd Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof
WO2007050811A2 (en) 2005-10-27 2007-05-03 The President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for labeling nucleic acids
WO2007053719A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-dntp-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
GB2446084B (en) 2005-10-31 2011-03-02 Univ Columbia Synthesis of four color 3-o-allyl modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
GB0524069D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
AU2006335290A1 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
EP2623610B1 (en) 2006-02-10 2015-04-29 Life Technologies Corporation Labeling and detection of post translationally modified proteins
US8114636B2 (en) * 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
EP3722409A1 (en) 2006-03-31 2020-10-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
ES2545264T3 (es) 2006-04-04 2015-09-09 Keygene N.V. Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP4190448A3 (en) 2006-05-11 2023-09-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic devices
WO2007135368A2 (en) * 2006-05-18 2007-11-29 Solexa Limited Dye compounds and the use of their labelled conjugates
WO2008002502A2 (en) 2006-06-23 2008-01-03 Illumina, Inc. Devices and systems for creation of dna cluster arrays
DE602007009233D1 (de) 2006-07-12 2010-10-28 Keygene Nv Genomische kartierung mit hohem durchsatz unter verwendung von aflp
EP3536396B1 (en) 2006-08-07 2022-03-30 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008037568A2 (en) * 2006-09-04 2008-04-03 Quiatech Ab Reversible terminators for efficient sequencing by synthesis
WO2008042067A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
US8568979B2 (en) 2006-10-10 2013-10-29 Illumina, Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids from complex mixtures using hybridization
US7883869B2 (en) 2006-12-01 2011-02-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US7897737B2 (en) * 2006-12-05 2011-03-01 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
US7893227B2 (en) * 2006-12-05 2011-02-22 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
US11940413B2 (en) 2007-02-05 2024-03-26 IsoPlexis Corporation Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
EP2940029B1 (en) 2007-10-19 2023-11-29 The Trustees of Columbia University in the City of New York Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
EP2209911B1 (en) 2007-10-19 2013-10-16 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators and a deoxyinosine analogue with a reversible terminator group
CN101925366B (zh) 2007-11-21 2015-02-04 乔治亚大学研究基金公司 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法
WO2009097368A2 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
CA2718905A1 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Expressive Research B.V. Expression-linked gene discovery
US8883999B2 (en) * 2008-03-19 2014-11-11 Intelligent Bio Systems, Inc. Methods and solutions for inhibiting undesired cleaving of labels
US9017973B2 (en) 2008-03-19 2015-04-28 Intelligent Biosystems, Inc. Methods and compositions for incorporating nucleotides
EP2279263B1 (en) 2008-04-30 2013-09-04 Integrated Dna Technologies, Inc. Rnase-h-based assays utilizing modified rna monomers
US8911948B2 (en) 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
US8039817B2 (en) 2008-05-05 2011-10-18 Illumina, Inc. Compensator for multiple surface imaging
US20110105356A1 (en) * 2008-05-07 2011-05-05 Derosier Chad F Compositions and methods for providing substances to and from an array
EP2297344B1 (en) 2008-05-16 2018-03-14 Life Technologies Corporation Dual labeling methods for measuring cellular proliferation
ES2625938T3 (es) * 2008-05-27 2017-07-21 Trilink Biotechnologies Nucleósidos 5¿-trifosfatos modificados químicamente para replicación de ácido nucleico iniciada térmicamente
CN102264917B (zh) 2008-06-11 2015-06-10 激光基因公司 核苷酸和核苷以及将其用于dna测序的方法
US8198028B2 (en) 2008-07-02 2012-06-12 Illumina Cambridge Limited Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US8728764B2 (en) 2008-10-02 2014-05-20 Illumina Cambridge Limited Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
WO2010048337A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Illumina, Inc. Preservation of information related to genomic dna methylation
EP2358913B1 (en) 2008-11-03 2017-03-22 The Regents of The University of California Methods for detecting modification resistant nucleic acids
US20100151473A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Yeakley Joanne M Methods and compositions for hybridizing nucleic acids
EP2379748A4 (en) 2008-12-23 2012-08-29 Illumina Inc MULTIBASE RELEASE FOR LONG READINGS IN SEQUENCING BY SYNTHESIS PROTOCOLS
WO2010082815A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Keygene N.V. Novel genome sequencing strategies
EP3415235B1 (en) 2009-03-23 2025-11-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
WO2010111686A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Life Technologies Corp Labeled enzyme compositions, methods & systems
US20100330569A1 (en) * 2009-04-23 2010-12-30 Intelligent Bio-Systems, Inc. Hydroxymethyl Linkers For Labeling Nucleotides
WO2010126614A2 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
US12129514B2 (en) 2009-04-30 2024-10-29 Molecular Loop Biosolutions, Llc Methods and compositions for evaluating genetic markers
US20100279882A1 (en) * 2009-05-01 2010-11-04 Mostafa Ronaghi Sequencing methods
US8632975B2 (en) 2009-06-05 2014-01-21 Life Technologies Corporation Nucleotide transient binding for sequencing methods
US10036063B2 (en) 2009-07-24 2018-07-31 Illumina, Inc. Method for sequencing a polynucleotide template
DK2669387T3 (en) 2009-08-25 2016-09-19 Illumina Inc Methods of selection and amplification of polynucleotides
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
US9315860B2 (en) 2009-10-26 2016-04-19 Genovoxx Gmbh Conjugates of nucleotides and method for the application thereof
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US8422031B2 (en) 2010-02-01 2013-04-16 Illumina, Inc. Focusing methods and optical systems and assemblies using the same
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2011100604A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US8603741B2 (en) 2010-02-18 2013-12-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps
US8759037B2 (en) 2010-02-23 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Amplification methods to minimise sequence specific bias
CN202281746U (zh) 2010-03-06 2012-06-20 伊鲁米那股份有限公司 检测来自样品光信号的测定设备及其光学组件和光学系统
WO2011123246A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US9371598B2 (en) 2010-04-05 2016-06-21 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
WO2012034007A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Size selection of dna for chromatin analysis
US8483969B2 (en) 2010-09-17 2013-07-09 Illuminia, Inc. Variation analysis for multiple templates on a solid support
US8759038B2 (en) 2010-09-29 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing nucleic acids
WO2012045012A2 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
WO2012055929A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Illumina, Inc. Sequencing methods
EP2632593B1 (en) 2010-10-27 2021-09-29 Illumina, Inc. Flow cells for biological or chemical analysis
US8575071B2 (en) 2010-11-03 2013-11-05 Illumina, Inc. Reducing adapter dimer formation
EP2635679B1 (en) 2010-11-05 2017-04-19 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2643484A4 (en) 2010-11-22 2014-04-16 Univ California METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN
WO2013082164A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Life Technologies Corporation Enhanced ligation reactions
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
EP2670864B1 (en) 2011-01-31 2017-03-08 Illumina, Inc. Methods for reducing nucleic acid damage
EP2670894B1 (en) 2011-02-02 2017-11-29 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel continguity mapping
EP3859011A1 (en) 2011-02-11 2021-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012135053A2 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Integrated Dna Technologies, Inc. Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP2702171A1 (de) 2011-04-27 2014-03-05 Cherkasov, Dmitry Methoden und komponenten zur detektion von nukleinsäureketten
WO2012150035A1 (de) 2011-05-04 2012-11-08 Genovoxx Gmbh Nukleosid-triphosphat-konjugate und methoden zu deren anwendung
US9624539B2 (en) 2011-05-23 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US8778848B2 (en) 2011-06-09 2014-07-15 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
WO2013009175A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Keygene N.V. Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
MX342195B (es) 2011-09-13 2016-09-20 Lasergen Inc Nucleótidos de terminación de rápida fotodescomposición 5-metoxi, 3' -oh no bloqueados y métodos para secuenciación de ácido nucleico.
PL3623481T3 (pl) 2011-09-23 2022-01-17 Illumina, Inc. Kompozycje do sekwencjonowania kwasów nukleinowych
WO2013049135A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Gen-Probe Incorporated Algorithms for sequence determinations
US10378051B2 (en) 2011-09-29 2019-08-13 Illumina Cambridge Limited Continuous extension and deblocking in reactions for nucleic acids synthesis and sequencing
WO2013058907A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
US8778849B2 (en) 2011-10-28 2014-07-15 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
EP2776165A2 (en) 2011-11-07 2014-09-17 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
EP2788499B1 (en) 2011-12-09 2016-01-13 Illumina, Inc. Expanded radix for polymeric tags
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
US9176031B2 (en) 2012-02-24 2015-11-03 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
NO2694769T3 (es) 2012-03-06 2018-03-03
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
CA3138752C (en) 2012-04-03 2024-02-06 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US9444880B2 (en) 2012-04-11 2016-09-13 Illumina, Inc. Cloud computing environment for biological data
US20130274148A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Illumina, Inc. Portable genetic detection and analysis system and method
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
EP2844774B1 (en) 2012-05-02 2018-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
US10202642B2 (en) 2012-05-02 2019-02-12 Ibis Biosciences, Inc. DNA sequencing
EP2844775B1 (en) 2012-05-02 2018-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
EP2870264A4 (en) 2012-07-03 2016-03-02 Sloan Kettering Inst Cancer QUANTITATIVE ASSESSMENT OF THE RECOVERY OF HUMAN T-CELL REPERTOIR AFTER TRANSPLANTATION OF ALLOGENIC BLOOD-GENERATING STEM CELLS
US9092401B2 (en) 2012-10-31 2015-07-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
EP3243937A1 (en) 2012-07-17 2017-11-15 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
CA3040684C (en) 2012-08-20 2023-02-07 Hod Finkelstein Method and system for fluorescence lifetime based sequencing
US9150896B2 (en) * 2012-09-06 2015-10-06 Illumina, Inc. Nucleotides and primers with removable blocking groups
EP3511423B2 (en) 2012-10-17 2024-05-29 Spatial Transcriptomics AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
US9181583B2 (en) 2012-10-23 2015-11-10 Illumina, Inc. HLA typing using selective amplification and sequencing
US9116139B2 (en) 2012-11-05 2015-08-25 Illumina, Inc. Sequence scheduling and sample distribution techniques
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
US9805407B2 (en) 2013-01-25 2017-10-31 Illumina, Inc. Methods and systems for using a cloud computing environment to configure and sell a biological sample preparation cartridge and share related data
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
WO2014135669A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Roche Diagnostics Gmbh Egfr mutation blood testing
EP2964624B1 (en) 2013-03-08 2017-01-04 Illumina Cambridge Limited Rhodamine compounds and their use as fluorescent labels
WO2014135221A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
WO2014142841A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Illumina, Inc. Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication
EP3919617A1 (en) 2013-03-13 2021-12-08 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments
US8778609B1 (en) 2013-03-14 2014-07-15 Good Start Genetics, Inc. Methods for analyzing nucleic acids
EP2971070B2 (en) 2013-03-14 2021-03-03 Illumina, Inc. Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
US9591268B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Qiagen Waltham, Inc. Flow cell alignment methods and systems
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
US20140274747A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Illumina, Inc. Super resolution imaging
US9193998B2 (en) 2013-03-15 2015-11-24 Illumina, Inc. Super resolution imaging
CA2903095C (en) 2013-03-15 2018-02-13 Xiaohai Liu Modified nucleosides or nucleotides
WO2014171899A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Agency For Science, Technology And Research Tunable fluorescence using cleavable linkers
WO2014197377A2 (en) 2013-06-03 2014-12-11 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
LT3013983T (lt) 2013-06-25 2023-05-10 Prognosys Biosciences, Inc. Erdviniai koduoti biologiniai tyrimai, naudojant mikrofluidinį įrenginį
DK3431614T3 (da) 2013-07-01 2021-12-06 Illumina Inc Katalysator fri overfladefunktionalisering og polymerpodning
ES2719579T3 (es) 2013-07-03 2019-07-11 Illumina Inc Sistema para secuenciación por síntesis ortogonal
MX370560B (es) 2013-08-08 2019-12-17 Illumina Inc Sistema de fluidos para distribución de reactivo a una celda de flujo.
US9352315B2 (en) 2013-09-27 2016-05-31 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
CN103601778A (zh) * 2013-10-17 2014-02-26 上海交通大学 7-去氮-7-取代鸟嘌呤核苷的合成方法
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
US11041203B2 (en) 2013-10-18 2021-06-22 Molecular Loop Biosolutions, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
US10540783B2 (en) 2013-11-01 2020-01-21 Illumina, Inc. Image analysis useful for patterned objects
EP2876166B1 (en) 2013-11-20 2016-12-14 Roche Diagnostics GmbH New compound for sequencing by synthesis
PT3077943T (pt) 2013-12-03 2020-08-21 Illumina Inc Métodos e sistemas para analisar dados de imagem
MX360883B (es) 2013-12-10 2018-11-21 Illumina Inc Biosensores para análisis biológico o químico y métodos para fabricarlos.
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
CN106414765A (zh) 2013-12-20 2017-02-15 Illumina公司 在片段化的基因组dna样品中保留基因组连接信息
US20180073065A1 (en) 2013-12-23 2018-03-15 Illumina, Inc. Structured substrates for improving detection of light emissions and methods relating to the same
WO2015103367A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Raindance Technologies, Inc. System and method for detection of rna species
US10537889B2 (en) 2013-12-31 2020-01-21 Illumina, Inc. Addressable flow cell using patterned electrodes
BR112016016546B1 (pt) 2014-01-16 2022-09-06 Illumina, Inc Método de preparação de amplicon e métodos para determinação da presença de um gene associado a câncer e de uma variante de sequência de ácidos nucleicos verdadeira
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
WO2015123444A2 (en) 2014-02-13 2015-08-20 Illumina, Inc. Integrated consumer genomic services
MX379233B (es) 2014-02-18 2025-03-10 Illumina Inc Métodos y composiciones para el perfilado de adn.
US10767219B2 (en) 2014-03-11 2020-09-08 Illumina, Inc. Disposable, integrated microfluidic cartridge and methods of making and using same
FR3020071B1 (fr) 2014-04-17 2017-12-22 Dna Script Procede de synthese d'acides nucleiques, notamment d'acides nucleiques de grande longueur, utilisation du procede et kit pour la mise en œuvre du procede
WO2015168161A2 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Illumina, Inc. Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation
GB201408077D0 (en) 2014-05-07 2014-06-18 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
WO2015175530A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Gore Athurva Methods for detecting aneuploidy
SG11201610168YA (en) 2014-05-16 2017-01-27 Illumina Inc Nucleic acid synthesis techniques
AU2015267189B2 (en) 2014-05-27 2019-12-05 Illumina, Inc. Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge
CA2950298C (en) 2014-06-03 2024-01-09 Illumina, Inc. Compositions, systems, and methods for detecting events using tethers anchored to or adjacent to nanopores
US20150353989A1 (en) 2014-06-09 2015-12-10 Illumina Cambridge Limited Sample preparation for nucleic acid amplification
EP3715468A1 (en) 2014-06-13 2020-09-30 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for preparing sequencing libraries
US10829814B2 (en) 2014-06-19 2020-11-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for single cell genomics
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
PL3161154T3 (pl) 2014-06-27 2020-10-19 Illumina, Inc. Zmodyfikowane polimerazy do ulepszonego włączania analogów nukleotydów
ES2713153T3 (es) 2014-06-30 2019-05-20 Illumina Inc Métodos y composiciones que utilizan la transposición unilateral
CN107075579B (zh) 2014-07-15 2021-10-08 亿明达股份有限公司 生物化学激活的电子装置
CA2955382C (en) 2014-07-21 2023-07-18 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
GB201414098D0 (en) 2014-08-08 2014-09-24 Illumina Cambridge Ltd Modified nucleotide linkers
WO2016025818A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Good Start Genetics, Inc. Systems and methods for genetic analysis
CN107076739B (zh) 2014-08-21 2018-12-25 伊卢米纳剑桥有限公司 可逆表面官能化
FR3025201B1 (fr) 2014-09-02 2018-10-12 Dna Script Nucleotides modifies pour la synthese d'acides nucleiques, un kit renfermant de tels nucleotides et leur utilisation pour la production de genes ou sequences d'acides nucleiques synthetiques
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
WO2016040602A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Epicentre Technologies Corporation Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv
EP3191606B1 (en) 2014-09-12 2020-05-27 Illumina, Inc. Methods for detecting the presence of polymer subunits using chemiluminescence
WO2016044233A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Illumina, Inc. Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data
JP2017536087A (ja) 2014-09-24 2017-12-07 グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド 遺伝子アッセイのロバストネスを増大させるためのプロセス制御
DK3201355T3 (en) 2014-09-30 2019-10-14 Illumina Inc Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
US9897791B2 (en) 2014-10-16 2018-02-20 Illumina, Inc. Optical scanning systems for in situ genetic analysis
JP6808617B2 (ja) 2014-10-17 2021-01-06 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 連続性を維持した転位
WO2016064880A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Molecular Assemblies, Inc. Modified template-independent enzymes for polydeoxynucleotide systhesis
US10190162B2 (en) 2014-10-23 2019-01-29 Complete Genomics, Inc. Signal confinement sequencing (SCS) and nucleotide analogues for signal confinement sequencing
ES2905706T3 (es) 2014-10-31 2022-04-11 Illumina Cambridge Ltd Polímeros y recubrimientos de copolímeros de ADN
US10000799B2 (en) 2014-11-04 2018-06-19 Boreal Genomics, Inc. Methods of sequencing with linked fragments
EP3215616B1 (en) 2014-11-05 2019-12-18 Illumina Cambridge Limited Reducing dna damage during sample preparation and sequencing using siderophore chelators
GB201419731D0 (en) 2014-11-05 2014-12-17 Illumina Cambridge Ltd Sequencing from multiple primers to increase data rate and density
CN107208019B (zh) 2014-11-11 2021-01-01 伊鲁米纳剑桥有限公司 用于核酸单克隆簇的产生和测序的方法和阵列
CN107109495B (zh) 2014-11-11 2021-12-24 伊鲁米那股份有限公司 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增
US20160160169A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 IsoPlexis Corporation Analysis and screening of poly-functional secretion profiles
EP3234187B1 (en) 2014-12-15 2021-02-17 Illumina, Inc. Method for single molecular placement on a substrate
EP4095261B1 (en) 2015-01-06 2025-05-28 Molecular Loop Biosciences, Inc. Screening for structural variants
EP3725893A1 (en) 2015-02-10 2020-10-21 Illumina, Inc. Compositions for analyzing cellular components
GB201503534D0 (en) * 2015-03-03 2015-04-15 Nuclera Nucleics Ltd Novel method
EP3271073B1 (en) 2015-03-20 2019-06-12 Illumina, Inc. Fluidics cartridge for use in the vertical or substantially vertical position
EP4089398B1 (en) 2015-03-24 2024-09-04 Illumina, Inc. Carrier assemblies and systems for imaging samples for biological or chemical analysis
EP3277839B1 (en) 2015-03-31 2020-12-02 Illumina Cambridge Limited Surface concatamerization of templates
SG11201707515SA (en) 2015-04-10 2017-10-30 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
EP3283870B1 (en) 2015-04-14 2020-05-06 Illumina, Inc. Structured substrates for improving detection of light emissions and methods relating to the same
US10844428B2 (en) 2015-04-28 2020-11-24 Illumina, Inc. Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS)
US9868947B2 (en) 2015-05-04 2018-01-16 Washington University Compositions and methods for the construction of a random allelic series
WO2016182984A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 Centrillion Technology Holdings Corporation Disulfide-linked reversible terminators
ES2826880T3 (es) 2015-05-11 2021-05-19 Illumina Inc Plataforma para el descubrimiento y análisis de agentes terapéuticos
GB201508858D0 (en) 2015-05-22 2015-07-01 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels
EP3303614B1 (en) 2015-05-29 2020-03-11 Illumina Cambridge Limited Enhanced utilization of surface primers in clusters
WO2016196358A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Epicentre Technologies Corporation Methods of analyzing nucleic acids
KR102134953B1 (ko) 2015-05-29 2020-07-16 일루미나, 인코포레이티드 지정된 반응을 수행하기 위한 샘플 캐리어 및 검정 시스템
WO2016196755A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Illumina, Inc. Compositions, systems, and methods for sequencing polynucleotides using tethers anchored to polymerases adjacent to nanopores
WO2016201142A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Life Technologies Corporation Methods, systems, compositions, kits, apparatus and computer-readable media for molecular tagging
CN107922966B (zh) 2015-07-06 2022-06-28 伊卢米纳剑桥有限公司 用于核酸扩增的样品制备
HK1253950A1 (zh) 2015-07-07 2019-07-05 Illumina, Inc. 经由纳米压印的选择性表面图案化
GB201512372D0 (en) * 2015-07-15 2015-08-19 Nuclera Nucleics Ltd Novel method
EP3325648B1 (en) 2015-07-17 2023-03-29 Illumina, Inc. Polymer sheets for sequencing applications
ES2888626T3 (es) 2015-07-27 2022-01-05 Illumina Inc Cartografiado espacial de información de secuencia de ácidos nucleicos
WO2017019278A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Illumina, Inc. Orthogonal deblocking of nucleotides
IL295355B2 (en) 2015-08-14 2023-11-01 Illumina Inc Systems And Methods Using Magnetically-Responsive Sensors For Determining A Genetic Characteristic
CN116338219A (zh) 2015-08-24 2023-06-27 亿明达股份有限公司 用于生物和化学测定的线路内蓄压器和流量控制系统
ES2988429T3 (es) 2015-08-28 2024-11-20 Illumina Inc Análisis de secuencia de ácidos nucleicos de células individuales
CN107921432A (zh) 2015-09-02 2018-04-17 伊卢米纳剑桥有限公司 改善流控系统中的液滴操作的系统和方法
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
EP4006150A1 (en) 2015-09-09 2022-06-01 QIAGEN GmbH Polymerase enzyme
US10450598B2 (en) 2015-09-11 2019-10-22 Illumina, Inc. Systems and methods for obtaining a droplet having a designated concentration of a substance-of-interest
GB201516987D0 (en) 2015-09-25 2015-11-11 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
WO2017058953A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Design and synthesis of novel disulfide linker based nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
US10577643B2 (en) 2015-10-07 2020-03-03 Illumina, Inc. Off-target capture reduction in sequencing techniques
US10465232B1 (en) 2015-10-08 2019-11-05 Trace Genomics, Inc. Methods for quantifying efficiency of nucleic acid extraction and detection
CN108513581B (zh) 2015-10-13 2022-02-08 国立研究开发法人海洋研究开发机构 双链rna的片段化方法及其利用
KR102663563B1 (ko) 2015-11-09 2024-05-03 레디액션 엘티디. 방사선 차폐 장치 및 그 적용
US10253352B2 (en) 2015-11-17 2019-04-09 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
CN109072300B (zh) 2015-12-17 2023-01-31 伊路敏纳公司 区分复杂生物样品中的甲基化水平
DE202017100081U1 (de) 2016-01-11 2017-03-19 Illumina, Inc. Detektionsvorrichtung mit einem Mikrofluorometer, einem fluidischen System und einem Durchflusszellen-Rastklemmenmodul
CN108474744B (zh) 2016-03-24 2019-11-05 伊鲁米那股份有限公司 在发光成像中使用的基于光子超晶格的设备和组成物及其使用方法
US10961573B2 (en) 2016-03-28 2021-03-30 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex target capture
DK3377226T3 (da) 2016-03-28 2021-04-26 Illumina Inc Mikrorækker i flere niveauer
ES2952832T3 (es) 2016-03-28 2023-11-06 Ncan Genomics Inc Captura de dianas dúplex enlazadas
WO2017177017A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Omniome, Inc. Methods of quantifying target nucleic acids and identifying sequence variants
US10988501B2 (en) 2016-04-22 2021-04-27 Mgi Tech Co., Ltd. Reversibly blocked nucleoside analogues and their use
IL262447B2 (en) 2016-04-22 2023-09-01 Illumina Inc Photonic structure-based devices and compositions for use in luminescent imaging of sites in a pixel and methods of using the devices and compositions
WO2017197027A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems
ES2861478T3 (es) 2016-05-18 2021-10-06 Illumina Inc Estampación de autoensamblado que utiliza superficies hidrófobas estampadas
CN116656795A (zh) 2016-05-23 2023-08-29 纽约哥伦比亚大学董事会 核苷酸衍生物及其使用方法
SG11201810907UA (en) 2016-06-06 2019-01-30 Redvault Biosciences Lp Target reporter constructs and uses thereof
CN109312492B (zh) 2016-06-16 2022-10-04 哈斯达克科学公司 寡核苷酸指导和记录的编码探针分子的组合合成
AU2017299803B2 (en) 2016-07-22 2023-06-29 Illumina, Inc. Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof
WO2018049418A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 IsoPlexis Corporation System and methods for multiplexed analysis of cellular and other immunotherapeutics
CA3037917C (en) 2016-09-22 2024-05-28 Illumina, Inc. Somatic copy number variation detection
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
US10385214B2 (en) 2016-09-30 2019-08-20 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes and their uses as biomarkers
MY194951A (en) 2016-10-14 2022-12-28 Illumina Inc Cartridge assembly
ES2927350T3 (es) 2016-10-19 2022-11-04 Illumina Inc Métodos para la ligadura química de ácidos nucleicos
JP7348066B2 (ja) 2016-11-11 2023-09-20 アイソプレキシス コーポレイション 単一細胞のゲノム、トランスクリプトームおよびプロテオームの同時解析のための組成物および方法
BR112019009949A2 (pt) 2016-11-16 2019-08-20 Illumina Inc método implantado por computador para validar chamadas de variante e sistema para validar chamadas de variante
GB201619458D0 (en) 2016-11-17 2017-01-04 Spatial Transcriptomics Ab Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
US11525783B2 (en) 2016-11-22 2022-12-13 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
DK3551753T3 (da) 2016-12-09 2022-09-05 Broad Inst Inc Diagnostik baseret på crispr-effektorsystem
WO2018104908A2 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Boreal Genomics, Inc. Linked ligation
KR102586847B1 (ko) 2016-12-22 2023-10-10 일루미나, 인코포레이티드 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물을 포함하는 어레이
WO2018114710A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Illumina Cambridge Limited Coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
EP3559262B1 (en) 2016-12-22 2025-04-09 Illumina, Inc. Arrays with quality control tracers
KR102512186B1 (ko) 2016-12-22 2023-03-20 일루미나, 인코포레이티드 수지 필름 및 패턴화된 중합체층을 포함하는 어레이
US11248254B2 (en) 2016-12-30 2022-02-15 Omniome, Inc. Method and system employing distinguishable polymerases for detecting ternary complexes and identifying cognate nucleotides
GB201704754D0 (en) 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
WO2018128544A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Agendia N.V. Biomarkers for selecting patient groups, and uses thereof.
EP3566158B1 (en) 2017-01-06 2022-04-20 Illumina, Inc. Phasing correction
WO2018132389A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Omniome, Inc. Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent dna binding
US20200090784A1 (en) 2017-01-17 2020-03-19 Illumina, Inc. Oncogenic splice variant determination
JP7051900B2 (ja) 2017-01-18 2022-04-11 イルミナ インコーポレイテッド 不均一分子長を有するユニーク分子インデックスセットの生成およびエラー補正のための方法およびシステム
AU2017394645B2 (en) 2017-01-20 2020-01-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Genotyping by polymerase binding
CA3050695C (en) 2017-01-20 2024-02-20 Omniome, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow
US10415029B2 (en) 2017-01-20 2019-09-17 Omniome, Inc. Allele-specific capture of nucleic acids
GB201701689D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials of non-closed shapes
WO2018144531A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Illumina, Inc. System and method with fiducials responding to multiple excitation frequencies
GB201701686D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illunina Inc System & method with fiducials having offset layouts
GB201701688D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials in non-recliner layouts
WO2018148724A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus
WO2018148723A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi
WO2018148727A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from 9°n
WO2018148726A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from phage t4
US20200002689A1 (en) 2017-02-13 2020-01-02 Qiagen Sciences, Llc Polymerase enzyme from 9°n
US11492666B2 (en) 2017-02-15 2022-11-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation
US20190360051A1 (en) 2017-02-17 2019-11-28 Stichting Vumc Swarm intelligence-enhanced diagnosis and therapy selection for cancer using tumor- educated platelets
SG11201810639RA (en) 2017-02-21 2018-12-28 Illumina Inc Tagmentation using immobilized transposomes with linkers
EP3596099B1 (en) 2017-03-06 2024-07-24 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid sequencing-by-synthesis (sbs) methods that combine sbs cycle steps
KR20190140918A (ko) 2017-03-15 2019-12-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 검출을 위한 crispr 이펙터 시스템 기반 진단
US11174515B2 (en) 2017-03-15 2021-11-16 The Broad Institute, Inc. CRISPR effector system based diagnostics
US11021740B2 (en) 2017-03-15 2021-06-01 The Broad Institute, Inc. Devices for CRISPR effector system based diagnostics
US11104937B2 (en) 2017-03-15 2021-08-31 The Broad Institute, Inc. CRISPR effector system based diagnostics
CN110612351B (zh) 2017-03-20 2023-08-11 Illumina公司 用于制备核酸文库的方法和组合物
EP3601611B1 (en) 2017-03-24 2022-01-05 Life Technologies Corporation Polynucleotide adapters and methods of use thereof
US12018325B2 (en) 2017-03-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York 3′-O-modified nucleotide analogues with different cleavable linkers for attaching fluorescent labels to the base for DNA sequencing by synthesis
US10737267B2 (en) 2017-04-04 2020-08-11 Omniome, Inc. Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions
SG11201909914RA (en) 2017-04-23 2019-11-28 Illumina Cambridge Ltd Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
CA3059952C (en) 2017-04-23 2023-04-18 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
EP3615692A1 (en) 2017-04-23 2020-03-04 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
AU2018260627B2 (en) 2017-04-23 2024-08-22 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
CN110799653B (zh) 2017-05-01 2025-01-03 伊鲁米那股份有限公司 用于多重大规模平行测序的最佳索引序列
WO2018204420A1 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Haystack Sciences Corporation Molecules for verifying oligonucleotide directed combinatorial synthesis and methods of making and using the same
EP3622089B1 (en) 2017-05-08 2024-07-17 Illumina, Inc. Method for sequencing using universal short adapters for indexing of polynucleotide samples
RU2770879C2 (ru) 2017-06-07 2022-04-22 Орегон Хэлт Энд Сайенс Юниверсити Полногеномные библиотеки отдельных клеток для бисульфитного секвенирования
GB2578038B (en) 2017-06-16 2022-11-23 Life Technologies Corp Control nucleic acids, and compositions, kits, and uses thereof
EP3642362B1 (en) 2017-06-20 2025-10-15 Illumina, Inc. Methods for addressing inefficiencies in amplification reactions
GB201711219D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Illumina Cambridge Ltd Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications
WO2019018366A1 (en) 2017-07-18 2019-01-24 Omniome, Inc. METHOD OF CHEMICAL MODIFICATION OF PLASTIC SURFACES
WO2019027767A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Illumina Inc. SEQUENCING SYSTEM COMPRISING AGGREGATION OF MULTIPLEXED BIOLOGICAL SAMPLES
CN111032883B (zh) 2017-08-01 2024-05-03 深圳华大智造科技有限公司 核酸测序方法
JP7032452B2 (ja) 2017-08-01 2022-03-08 イルミナ インコーポレイテッド ヌクレオチド配列決定のためのヒドロゲルビーズ
FI3662083T3 (fi) 2017-08-01 2024-11-20 Illumina Inc Geneettisen materiaalin ja kirjastovalmisteen spatiaalinen indeksointi hydrogeelihelmiä ja virtauskennoja käyttämällä
JP6998404B2 (ja) 2017-08-01 2022-02-04 深▲セン▼恒特基因有限公司 標的ヌクレオチド配列の富化及び決定方法
JP2021500531A (ja) 2017-08-15 2021-01-07 オムニオム インコーポレイテッドＯｍｎｉｏｍｅ， Ｉｎｃ． 化学的および生物学的検体の検出に有用なスキャン装置および方法
US20190077726A1 (en) * 2017-09-13 2019-03-14 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of synthesizing labeled nucleosides
US11447818B2 (en) 2017-09-15 2022-09-20 Illumina, Inc. Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers
EP3684955A1 (en) 2017-09-20 2020-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapy methods for patients whose tumors carry a high passenger gene mutation burden
WO2019079166A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Illumina, Inc. TECHNIQUES BASED ON DEEP LEARNING LEARNING OF NEURONAL NETWORKS WITH DEEP CONVOLUTION
GB201716931D0 (en) 2017-10-16 2017-11-29 Illumina Cambridge Ltd New fluorescent compounds and their use as biomarkers
AU2018350909B2 (en) 2017-10-16 2021-09-23 Illumina, Inc. Aberrant splicing detection using convolutional neural networks (CNNS)
KR102500210B1 (ko) 2017-11-06 2023-02-15 일루미나, 인코포레이티드 핵산 색인 기술
JP6955035B2 (ja) 2017-11-16 2021-10-27 イルミナ インコーポレイテッド マイクロサテライト不安定性を決定するためのシステム及び方法
US12040047B2 (en) 2017-11-30 2024-07-16 Illumina, Inc. Validation methods and systems for sequence variant calls
JP6868541B2 (ja) * 2017-12-05 2021-05-12 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド
US11378544B2 (en) 2018-01-08 2022-07-05 Illumina, Inc. High-throughput sequencing with semiconductor-based detection
CA3065934A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Illumina, Inc. High-throughput sequencing with semiconductor-based detection
JP6862581B2 (ja) 2018-01-15 2021-04-21 イルミナ インコーポレイテッド 深層学習ベースのバリアント分類器
DK3746568T5 (da) 2018-01-29 2024-08-26 Broad Inst Inc Crispr-effektorsystembaseret diagnostik
JP2021512648A (ja) 2018-02-06 2021-05-20 オムニオム・インコーポレイテッド 核酸プライマー伸長のための組成物および技術
SG11201911985UA (en) 2018-02-13 2020-01-30 Illumina Inc Dna sequencing using hydrogel beads
US12215124B2 (en) 2018-02-21 2025-02-04 Singular Genomics Systems, Inc. Fluorinated nucleotides and uses thereof
CN112218640A (zh) 2018-03-15 2021-01-12 哥伦比亚大学董事会 核苷酸类似物及其在核酸测序和分析中的用途
JP6974504B2 (ja) 2018-04-02 2021-12-01 イルミナ インコーポレイテッド 配列に基づく遺伝子試験のための対照を作製するための組成物及び方法
US20190318806A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Illumina, Inc. Variant Classifier Based on Deep Neural Networks
NL2020861B1 (en) 2018-04-12 2019-10-22 Illumina Inc Variant classifier based on deep neural networks
CA3097583A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Omniome, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
KR20200026250A (ko) 2018-04-20 2020-03-10 일루미나, 인코포레이티드 단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도
JP7554117B2 (ja) 2018-04-26 2024-09-19 パシフィック・バイオサイエンシズ・オブ・カリフォルニア・インク． 核酸－ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体を安定化するための方法及び組成物
WO2019222264A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Illumina, Inc. Compositions and methods for chemical cleavage and deprotection of surface-bound oligonucleotides
IL271454B2 (en) 2018-05-17 2025-04-01 Illumina Inc Rapid single-cell genetic sequencing with low Aggregation bias
CN110785499B (zh) 2018-05-25 2024-12-03 伊鲁米那股份有限公司 对先兆子痫具有特异性的循环rna标识
WO2019231568A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Omniome, Inc. Increased signal to noise in nucleic acid sequencing
US11180794B2 (en) 2018-05-31 2021-11-23 Omniome, Inc. Methods and compositions for capping nucleic acids
US20210102194A1 (en) 2018-06-04 2021-04-08 Illumina, Inc. High-throughput single-cell transcriptome libraries and methods of making and of using
NL2021377B1 (en) 2018-07-03 2020-01-08 Illumina Inc Interposer with first and second adhesive layers
US12073922B2 (en) 2018-07-11 2024-08-27 Illumina, Inc. Deep learning-based framework for identifying sequence patterns that cause sequence-specific errors (SSEs)
EP3826762A1 (en) 2018-07-23 2021-06-02 DNA Script Massively parallel enzymatic synthesis of nucleic acid strands
CN112567048A (zh) 2018-07-24 2021-03-26 欧姆尼欧美公司 三元复合物种类的连续形成
WO2020022891A2 (en) 2018-07-26 2020-01-30 Stichting Vumc Biomarkers for atrial fibrillation
EP3836967A4 (en) 2018-07-30 2022-06-15 ReadCoor, LLC METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PROCESSING OR ANALYSIS
WO2020028882A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 10X Genomics, Inc. Methods and systems to minimize barcode exchange
BR112021002779A2 (pt) 2018-08-15 2021-05-04 Illumina, Inc. composições e métodos para melhorar o enriquecimento de bibliotecas
US12098419B2 (en) 2018-08-23 2024-09-24 Ncan Genomics, Inc. Linked target capture and ligation
WO2020047005A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
CN113366117B (zh) 2018-08-28 2025-08-05 10X基因组学股份有限公司 用于生物样品中转座酶介导的空间标记和分析基因组dna的方法
WO2020056044A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Singular Genomics Systems, Inc. Modified archaeal family b polymerases
US11242512B2 (en) 2018-09-17 2022-02-08 Omniome, Inc. Engineered polymerases for improved sequencing
US12258368B2 (en) 2018-09-28 2025-03-25 Centrillion Technology Holdings Corporation Disulfide-linked reversible terminators
WO2020073734A1 (zh) 2018-10-12 2020-04-16 深圳市真迈生物科技有限公司 一种生物芯片及其制备方法
SG11201911777QA (en) 2018-10-15 2020-05-28 Illumina Inc Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks
US12145960B2 (en) 2018-10-25 2024-11-19 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleotide analogues
BR112021005976A2 (pt) 2018-10-26 2021-06-29 Illumina, Inc. modulação de microesferas de polímero para processamento de dna
IL299237B2 (en) 2018-10-31 2024-12-01 Illumina Inc Polymerases, compositions, and methods of use
KR102749871B1 (ko) 2018-11-07 2025-01-07 칭다오 엠쥐아이 테크 컴퍼니 리미티드 폴리뉴클레오티드의 시퀀싱 방법
NL2022043B1 (en) 2018-11-21 2020-06-03 Akershus Univ Hf Tagmentation-Associated Multiplex PCR Enrichment Sequencing
US12104281B2 (en) 2018-11-30 2024-10-01 Illumina, Inc. Analysis of multiple analytes using a single assay
GB2585608B (en) 2018-12-04 2021-11-03 Omniome Inc Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays
US11001816B2 (en) 2018-12-05 2021-05-11 Illumina, Inc. Polymerases, compositions, and methods of use
AU2019391274B2 (en) 2018-12-05 2025-10-30 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification
CN117680210A (zh) 2018-12-07 2024-03-12 元素生物科学公司 流动池装置、匣盒和系统
WO2020123316A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
GB201820341D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for transposase-mediated spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
GB201820300D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
CN113423841A (zh) 2018-12-13 2021-09-21 Dna斯克瑞普特公司 细胞和生物分子上的直接寡核苷酸合成
ES2973302T3 (es) 2018-12-14 2024-06-19 Illumina Cambridge Ltd Disminución del ajuste de fase con nucleótidos sin marcar durante la secuenciación
ES3032918T3 (en) 2018-12-17 2025-07-28 Illumina Cambridge Ltd Method of polynucleotide sequencing
SG11202012758WA (en) 2018-12-17 2021-01-28 Illumina Cambridge Ltd Primer oligonucleotide for sequencing
EP3899041A1 (en) 2018-12-18 2021-10-27 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for paired end sequencing using a single surface primer
EP3899037B1 (en) 2018-12-19 2023-10-18 Illumina, Inc. Methods for improving polynucleotide cluster clonality priority
US11440933B2 (en) 2018-12-19 2022-09-13 Roche Sequencing Solutions, Inc. 3′ protected nucleotides
EP3899032A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Omniome, Inc. Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes
US11293061B2 (en) 2018-12-26 2022-04-05 Illumina Cambridge Limited Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group
WO2020142556A1 (en) 2019-01-02 2020-07-09 Yifat Jonathan Radiation protection apparatus and materials therefor
KR102838675B1 (ko) 2019-01-02 2025-07-24 레디액션 엘티디. 환자 머리 보호 장치
DK3884071T3 (da) 2019-01-03 2025-06-10 Ncan Genomics Inc Sammenkædet måloptagelse
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3908286A4 (en) * 2019-01-08 2022-10-12 Singular Genomics Systems, Inc. NUCLEOTIDE CLEAVABLE LINKERS AND THEIR USES
BR112021006038A2 (pt) 2019-01-11 2021-10-26 Illumina Cambridge Limited Complexos de stranspossomas ligados à superfície do complexo
WO2020163630A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Singular Genomics Systems, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
CN113423840B (zh) 2019-02-12 2024-03-08 Dna斯克瑞普特公司 多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解
EP3924513B1 (en) 2019-02-14 2023-04-12 Pacific Biosciences of California, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
EP3927467A4 (en) 2019-02-20 2022-12-14 Pacific Biosciences of California, Inc. SCANNING APPARATUS AND METHODS FOR DETECTING CHEMICAL OR BIOLOGICAL ANALYTES
CN114174531A (zh) 2019-02-28 2022-03-11 10X基因组学有限公司 用空间条码化寡核苷酸阵列对生物分析物进行概况分析
WO2020178231A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina, Inc. Multiplexed fluorescent detection of analytes
NL2023327B1 (en) 2019-03-01 2020-09-17 Illumina Inc Multiplexed fluorescent detection of analytes
JP7587424B2 (ja) 2019-03-01 2024-11-20 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 環外アミン置換クマリン化合物およびそれらの蛍光標識としての使用
MX2021003746A (es) 2019-03-01 2021-06-23 Illumina Inc Genotecas de núcleos únicos y células únicas de alto rendimiento y métodos para elaborarlas y usarlas.
US12110546B2 (en) 2019-03-01 2024-10-08 Illumina Cambridge Limited Tertiary amine substituted coumarin compounds and uses as fluorescent labels
CN114127309A (zh) 2019-03-15 2022-03-01 10X基因组学有限公司 使用空间阵列进行单细胞测序的方法
US11676685B2 (en) 2019-03-21 2023-06-13 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based quality scoring
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
NL2023312B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based base calling
WO2020191387A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based base calling
NL2023311B9 (en) 2019-03-21 2021-03-12 Illumina Inc Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
NL2023314B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based quality scoring
NL2023310B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
NL2023316B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based sequencing
EP3887542A1 (en) 2019-03-22 2021-10-06 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11421271B2 (en) 2019-03-28 2022-08-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels
WO2020210370A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Roche Sequencing Solutions, Inc. Nucleic acid sequencing by synthesis using magnetic sensor arrays
US11738336B2 (en) 2019-04-12 2023-08-29 Western Digital Technologies, Inc. Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing
US11579217B2 (en) 2019-04-12 2023-02-14 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors
US11327073B2 (en) 2019-04-12 2022-05-10 Western Digital Technologies, Inc. Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11112468B2 (en) 2019-04-12 2021-09-07 Western Digital Technologies, Inc. Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11609208B2 (en) 2019-04-12 2023-03-21 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles
CA3139169A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Egi Tech (Shen Zhen) Co., Limited Single-channel sequencing method based on self-luminescence
US11423306B2 (en) 2019-05-16 2022-08-23 Illumina, Inc. Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US11644406B2 (en) 2019-06-11 2023-05-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Calibrated focus sensing
KR20220059467A (ko) 2019-07-02 2022-05-10 레디액션 엘티디. 전개형 방사선 차폐부 커버
US20220154173A1 (en) 2019-07-12 2022-05-19 Iiiumina Cambridge Limited Compositions and Methods for Preparing Nucleic Acid Sequencing Libraries Using CRISPR/CAS9 Immobilized on a Solid Support
AU2020312787A1 (en) 2019-07-12 2021-06-17 Illumina Cambridge Limited Nucleic acid library preparation using electrophoresis
WO2021011803A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Omniome, Inc. Synthetic nucleic acids having non-natural structures
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
JP7523526B2 (ja) 2019-08-20 2024-07-26 チンタオ エムジーアイ テック カンパニー リミテッド 発光標識及び二次発光信号の光信号速度論に基づくポリヌクレオチドの配列決定方法
EP4265628B1 (en) 2019-09-10 2025-11-05 Pacific Biosciences of California, Inc. Reversible modification of nucleotides
WO2021050962A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cancer detection and classification
US11512295B2 (en) 2019-09-12 2022-11-29 Singular Genomics Systems, Inc. Modified thermoccocus polymerases
US11208682B2 (en) 2019-09-13 2021-12-28 Western Digital Technologies, Inc. Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags
EP4468252A3 (en) 2019-10-01 2025-02-19 10x Genomics, Inc. Systems and methods for identifying morphological patterns in tissue samples
CN118186063A (zh) 2019-10-18 2024-06-14 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于对核酸加帽的方法和组合物
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US20210139867A1 (en) 2019-11-08 2021-05-13 Omniome, Inc. Engineered polymerases for improved sequencing by binding
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
WO2021102003A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 10X Genomics, Inc. Systems and methods for tissue classification
CN115210760B (zh) 2019-11-21 2023-08-01 10X基因组学有限公司 分析物的空间分析
JP2023501760A (ja) 2019-11-22 2023-01-19 イルミナ インコーポレイテッド 子癇前症に特異的な循環ｒｎａシグネチャー
US11747329B2 (en) 2019-11-22 2023-09-05 Western Digital Technologies, Inc. Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection
EP4065646A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Illumina Cambridge Limited Cyclooctatetraene containing dyes and compositions
DE202019106695U1 (de) 2019-12-02 2020-03-19 Omniome, Inc. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum
DE202019106694U1 (de) 2019-12-02 2020-03-19 Omniome, Inc. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum
AU2020396889A1 (en) 2019-12-04 2021-09-30 Illumina, Inc. Preparation of DNA sequencing libraries for detection of DNA pathogens in plasma
WO2021118349A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Prinses Máxima Centrum Voor Kinderoncologie B.V. Methods of typing germ cell tumors
AU2020407267A1 (en) * 2019-12-18 2022-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of sequencing by synthesis using a consecutive labeling scheme
KR20220118295A (ko) 2019-12-19 2022-08-25 일루미나, 인코포레이티드 고 처리량 단일 세포 라이브러리, 및 이의 제조 방법 및 사용 방법
US11498078B2 (en) 2019-12-23 2022-11-15 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell receiver and methods of use
CN115038794A (zh) 2019-12-23 2022-09-09 10X基因组学有限公司 在基于分区的测定中使用固定生物样品的组合物和方法
CN121022991A (zh) 2019-12-23 2025-11-28 10X基因组学有限公司 使用rna模板化连接进行空间分析的方法
EP4081653B1 (en) 2019-12-23 2024-07-03 Singular Genomics Systems, Inc. Methods for long read sequencing
US11747262B2 (en) 2019-12-23 2023-09-05 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell carrier and methods of use
CN115667507A (zh) 2019-12-31 2023-01-31 奇异基因组学系统公司 用于长读出测序的多核苷酸条形码
US12365942B2 (en) 2020-01-13 2025-07-22 10X Genomics, Inc. Methods of decreasing background on a spatial array
US12405264B2 (en) 2020-01-17 2025-09-02 10X Genomics, Inc. Electrophoretic system and method for analyte capture
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
CN115362264A (zh) 2020-01-29 2022-11-18 10X基因组学有限公司 用于分析物检测的组合物和方法
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US12110548B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Bi-directional in situ analysis
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US12112833B2 (en) 2020-02-04 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for index hopping filtering
US20230054204A1 (en) 2020-02-04 2023-02-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Flow cells and methods for their manufacture and use
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
WO2021158925A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US12421558B2 (en) 2020-02-13 2025-09-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for joint interactive visualization of gene expression and DNA chromatin accessibility
US12281357B1 (en) 2020-02-14 2025-04-22 10X Genomics, Inc. In situ spatial barcoding
CN115485391A (zh) 2020-02-17 2022-12-16 10X基因组学有限公司 染色质相互作用的原位分析
IL295560A (en) 2020-02-20 2022-10-01 Illumina Inc Artificial intelligence-based many-to-many base calling
US20210265015A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 Illumina, Inc. Hardware Execution and Acceleration of Artificial Intelligence-Based Base Caller
US20210265016A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 Illumina, Inc. Data Compression for Artificial Intelligence-Based Base Calling
US12354008B2 (en) 2020-02-20 2025-07-08 Illumina, Inc. Knowledge distillation and gradient pruning-based compression of artificial intelligence-based base caller
EP4106913A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Compositions, methods and systems for sample processing
EP4107285B1 (en) 2020-02-21 2024-10-09 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for integrated in situ spatial assay
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11034942B1 (en) 2020-02-27 2021-06-15 Singular Genomics Systems, Inc. Modified pyrococcus polymerases and uses thereof
CN115516104A (zh) 2020-03-03 2022-12-23 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于对双链核酸进行测序的方法和组合物
US12188085B2 (en) 2020-03-05 2025-01-07 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial transcriptomics with sequencing readout
WO2021178893A2 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Singular Genomics Systems, Inc. Linked paired strand sequencing
KR20220151101A (ko) 2020-03-09 2022-11-14 일루미나, 인코포레이티드 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법
CN115297964A (zh) 2020-03-10 2022-11-04 西部数据技术公司 用于核酸定序的磁性传感器阵列以及制造及使用其的方法
JP2023520203A (ja) 2020-03-30 2023-05-16 イルミナ インコーポレイテッド 核酸ライブラリを調製するための方法及び組成物
CN113512083B (zh) * 2020-04-10 2023-05-23 深圳华大生命科学研究院 合成核苷酸或核苷酸类似物的方法
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
WO2021221500A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Agendia N.V. Treatment of her2 negative, mammaprint high risk 2 breast cancer.
US11739359B2 (en) 2020-05-01 2023-08-29 Microsoft Technology Licensing, Llc Universal template strands for enzymatic polynucleotide synthesis
US11188778B1 (en) 2020-05-05 2021-11-30 Illumina, Inc. Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator
US20230183798A1 (en) 2020-05-05 2023-06-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for modifying polymerase-nucleic acid complexes
US20230203592A1 (en) 2020-05-05 2023-06-29 Akershus Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing bowel cancer
JP2023525470A (ja) 2020-05-08 2023-06-16 イルミナ インコーポレイテッド ゲノムシーケンシング及び検出手法
CA3177286A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Illumina Inc. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
EP4150066A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Illumina, Inc. Thermostable terminal deoxynucleotidyl transferase
ES2989052T3 (es) 2020-05-22 2024-11-25 10X Genomics Inc Medición espacio-temporal simultánea de la expresión génica y la actividad celular
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
US11702683B2 (en) 2020-05-28 2023-07-18 Microsoft Technology Licensing, Llc De novo polynucleotide synthesis with substrate-bound polymerase
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
ES2981265T3 (es) 2020-06-08 2024-10-08 10X Genomics Inc Métodos para determinar un margen quirúrgico y métodos de uso del mismo
US20230193356A1 (en) 2020-06-08 2023-06-22 The Broad Institute, Inc. Single cell combinatorial indexing from amplified nucleic acids
WO2021252617A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Illumina, Inc. Methods for increasing yield of sequencing libraries
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021252800A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Nautilus Biotechnology, Inc. Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities
JP2023531009A (ja) 2020-06-22 2023-07-20 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ３’アセタールブロッキング基を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
EP4172362B1 (en) 2020-06-25 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
CN111732623B (zh) * 2020-06-30 2022-01-18 中国科学院化学研究所 一种三异丙基硅乙炔修饰的脱氧胞苷亚磷酰胺单体及其制备方法与应用
WO2022006081A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Illumina, Inc. Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless dna
US12168801B1 (en) 2020-07-02 2024-12-17 10X Genomics, Inc. Hybrid/capture probe designs for full-length cDNA
US20230242967A1 (en) 2020-07-02 2023-08-03 Illumina, Inc. A method to calibrate nucleic acid library seeding efficiency in flowcells
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US12209280B1 (en) 2020-07-06 2025-01-28 10X Genomics, Inc. Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis
CN116018412A (zh) 2020-07-08 2023-04-25 Illumina公司 作为转座体载体的小珠
WO2022015600A2 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
WO2022019836A1 (en) 2020-07-21 2022-01-27 Illumina Singapore Pte Ltd Base-modified nucleotides as substrates for tdt-based enzymatic nucleic acid
US11981964B2 (en) 2020-07-28 2024-05-14 Illumina Cambridge Limited Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels
CA3190588A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Illumina, Inc. Preparation of rna and dna sequencing libraries using bead-linked transposomes
US12297499B2 (en) 2020-08-17 2025-05-13 10X Genomics, Inc. Multicomponent nucleic acid probes for sample analysis
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
WO2022040176A1 (en) 2020-08-18 2022-02-24 Illumina, Inc. Sequence-specific targeted transposition and selection and sorting of nucleic acids
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US20220067489A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Illumina, Inc. Detecting and Filtering Clusters Based on Artificial Intelligence-Predicted Base Calls
ES3004943T3 (en) 2020-09-11 2025-03-13 Illumina Cambridge Ltd Methods of enriching a target sequence from a sequencing library using hairpin adaptors
EP4211508B1 (en) 2020-09-14 2025-11-26 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and systems for multidimensional imaging
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
KR20230091116A (ko) 2020-10-21 2023-06-22 일루미나, 인코포레이티드 다수의 삽입체를 포함하는 시퀀싱 주형, 및 시퀀싱 처리량을 개선하기 위한 조성물 및 방법
EP4208470A4 (en) 2020-10-22 2024-10-30 Singular Genomics Systems, Inc. NUCLEIC ACID CIRCULARIZATION AND AMPLIFICATION ON A SURFACE
EP4200444A4 (en) 2020-10-30 2024-09-25 Singular Genomics Systems, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING NUCLEOTIDE IMPURITIES CONTENT
EP4237581A4 (en) 2020-10-30 2025-03-26 Element Biosciences, Inc. REAGENTS FOR MASSIVELY PARALLEL NUCLEIC ACID SEQUENCED ANALYSIS
US12071667B2 (en) 2020-11-04 2024-08-27 10X Genomics, Inc. Sequence analysis using meta-stable nucleic acid molecules
US12391970B2 (en) 2020-11-11 2025-08-19 Microsoft Technology Licensing, Llc Spatial control of polynucleotide synthesis by strand capping
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US20230416832A1 (en) * 2020-11-20 2023-12-28 The General Hospital Corporation Methods for dna methylation analysis
US20220170010A1 (en) 2020-12-02 2022-06-02 Illumina Software, Inc. System and method for detection of genetic alterations
EP4012046A1 (en) 2020-12-11 2022-06-15 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
EP4264231A4 (en) 2020-12-16 2024-11-13 Singular Genomics Systems, Inc. Kinematic imaging system
US20220195196A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Alkylpyridinium coumarin dyes and uses in sequencing applications
US20220195516A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing
US20220195517A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Long stokes shift chromenoquinoline dyes and uses in sequencing applications
CA3205944C (en) 2020-12-21 2025-02-11 Singular Genomics Systems, Inc. MULTICOLOR IMAGING SYSTEMS AND METHODS
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20220195518A1 (en) 2020-12-22 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing
TW202243733A (zh) 2021-01-13 2022-11-16 美商加州太平洋生物科學公司 經膠態組裝之表面結構化
US12060603B2 (en) 2021-01-19 2024-08-13 10X Genomics, Inc. Methods for internally controlled in situ assays using padlock probes
US20220235403A1 (en) 2021-01-26 2022-07-28 10X Genomics, Inc. Nucleic acid analog probes for in situ analysis
EP4284944A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Illumina, Inc. Methods, compositions and kits to improve seeding efficiency of flow cells with polynucleotides
FI4288562T3 (fi) 2021-02-04 2025-02-17 Illumina Inc Pitkien indeksoitujen ja linkitettyjen readien tuottaminen transposomiin sitoutuneille helmille
EP4251770A4 (en) 2021-02-08 2024-05-29 Singular Genomics Systems, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCING COMPLEMENTARY POLYNUCLEOTIDES
WO2022174054A1 (en) 2021-02-13 2022-08-18 The General Hospital Corporation Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof
US20220282319A1 (en) 2021-03-03 2022-09-08 10X Genomics, Inc. Analyte detection in situ using nucleic acid origami
US11884977B2 (en) 2021-03-12 2024-01-30 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
WO2022192671A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
WO2022197752A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Illumina, Inc. Tile location and/or cycle based weight set selection for base calling
CN117222747A (zh) 2021-03-22 2023-12-12 伊鲁米纳剑桥有限公司 用于改善核酸簇克隆性的方法
MX2023011219A (es) 2021-03-29 2023-10-02 Illumina Inc Composiciones y métodos para evaluar el daño del adn en una genoteca y normalizar el sesgo del tamaño del amplicón.
AU2022252197A1 (en) 2021-03-29 2023-09-21 Illumina, Inc. Improved methods of library preparation
AU2022246579A1 (en) 2021-03-30 2023-09-21 Illumina, Inc. Improved methods of isothermal complementary dna and library preparation
AU2022248999A1 (en) 2021-03-31 2023-02-02 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based base caller with contextual awareness
IL307159A (en) 2021-03-31 2023-11-01 Illumina Cambridge Ltd Nucleic acid library sequencing techniques with adapter dimer detection
IL307164A (en) 2021-03-31 2023-11-01 Illumina Inc Methods for preparing sequence libraries for directional labeling using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction
JP7719206B2 (ja) 2021-04-02 2025-08-05 イルミナ インコーポレイテッド 配列決定のためのヌクレオチド－試料スライド内の泡を検出するための機械学習モデル
EP4428246B1 (en) 2021-04-14 2025-12-24 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
US20220336057A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Illumina, Inc. Efficient voxelization for deep learning
US12217829B2 (en) 2021-04-15 2025-02-04 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based analysis of protein three-dimensional (3D) structures
US12070744B2 (en) 2021-04-22 2024-08-27 Illumina, Inc. Valve assemblies and related systems
EP4294920A4 (en) 2021-04-27 2025-01-22 Singular Genomics Systems, Inc. HIGH-DENSITY SEQUENCING AND MULTIPLEX PRIMING
WO2022232425A2 (en) 2021-04-29 2022-11-03 Illumina, Inc. Amplification techniques for nucleic acid characterization
EP4334706A4 (en) 2021-05-05 2025-08-06 Singular Genomics Systems Inc MULTIOMICS ANALYSIS DEVICE AND METHODS OF USE THEREOF
EP4334327A1 (en) 2021-05-05 2024-03-13 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes containing bis-boron fused heterocycles and uses in sequencing
WO2022236054A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
EP4334475A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Agendia N.V. Endocrine treatment of hormone receptor positive breast cancer typed as having a low risk of recurrence
CN117858959A (zh) 2021-05-10 2024-04-09 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 滚环扩增期间的dna扩增缓冲液补充
WO2022240764A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single-molecule seeding and amplification on a surface
US20220372468A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Microsoft Technology Licensing, Llc Real-time detection of errors in oligonucleotide synthesis
US20220396832A1 (en) * 2021-05-20 2022-12-15 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing by synthesis
AU2022280886A1 (en) 2021-05-28 2023-12-07 Illumina, Inc. Oligo-modified nucleotide analogues for nucleic acid preparation
CN117396613A (zh) 2021-06-01 2024-01-12 10X基因组学有限公司 用于分析物检测和探针解析的方法和组合物
WO2022256422A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Sample analysis using asymmetric circularizable probes
EP4582555A3 (en) 2021-06-03 2025-10-22 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
US20220403450A1 (en) 2021-06-03 2022-12-22 Illumina Software, Inc. Systems and methods for sequencing nucleotides using two optical channels
US20230016633A1 (en) 2021-06-15 2023-01-19 Illumina, Inc. Hydrogel-free surface functionalization for sequencing
EP4359555A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Illumina, Inc. Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents
CN117580959A (zh) 2021-06-24 2024-02-20 因美纳有限公司 用于基于小珠的核酸的组合索引的方法和组合物
BR112023026615A2 (pt) 2021-06-29 2024-03-05 Illumina Inc Métrica de relação sinal-ruído para determinar chamadas de bases de nucleotídeos e qualidade de chamadas de bases
WO2023278609A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Self-learned base caller, trained using organism sequences
WO2023278184A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites
WO2023278966A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Machine-learning model for generating confidence classifications for genomic coordinates
US20230005253A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Illumina, Inc. Efficient artificial intelligence-based base calling of index sequences
WO2023287617A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Illumina, Inc. Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites
WO2023288225A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for preparing polymerized matrix with controllable thickness
WO2023003757A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 Illumina Software, Inc. Intensity extraction with interpolation and adaptation for base calling
US11455487B1 (en) 2021-10-26 2022-09-27 Illumina Software, Inc. Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling
US20230116852A1 (en) 2021-07-23 2023-04-13 Illumina, Inc. Methods for preparing substrate surface for dna sequencing
US20230021577A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Illumina Software, Inc. Machine-learning model for recalibrating nucleotide-base calls
EP4377960A1 (en) 2021-07-28 2024-06-05 Illumina, Inc. Quality score calibration of basecalling systems
CA3224093A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Jorge Ivan Hernandez Neuta Methods and compositions for synchronizing reactions in situ
US12139751B2 (en) 2021-07-30 2024-11-12 10X Genomics, Inc. Circularizable probes for in situ analysis
CN118043476A (zh) 2021-08-03 2024-05-14 10X基因组学有限公司 核酸多联体及其稳定和/或压缩方法
KR20240035413A (ko) 2021-08-03 2024-03-15 일루미나, 인코포레이티드 다중 염기 호출자 모델을 사용한 염기 호출
US12460251B2 (en) 2021-08-03 2025-11-04 10X Genomics, Inc. Stabilization and/or compaction of nucleic acid molecules
US12391984B2 (en) 2021-08-03 2025-08-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for rolling circle amplification
US12077789B2 (en) 2021-08-14 2024-09-03 Illumina, Inc. Polymerases, compositions, and methods of use
EP4326898B1 (en) 2021-08-16 2024-07-31 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
AU2022331421A1 (en) 2021-08-17 2024-01-04 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying methylated cytosines
WO2023023638A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Singular Genomics Systems, Inc. Chemical and thermal assisted nucleic acid amplification methods
WO2023034076A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Illumina, Inc. Flow cell with enhanced well imaging resolution
CN117580961A (zh) 2021-09-01 2024-02-20 Illumina公司 用于加速碱基判读的幅度调制
ES3011462T3 (en) 2021-09-01 2025-04-07 10X Genomics Inc Methods for blocking a capture probe on a spatial array
EP4396372A2 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Singular Genomics Systems, Inc. Amplification oligonucleotides
US20240417791A1 (en) 2021-09-07 2024-12-19 Mgi Tech Co., Ltd. Method for analyzing sequence of target polynucleotide
WO2023035108A1 (zh) 2021-09-07 2023-03-16 深圳华大智造科技股份有限公司 一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法
CN117561573A (zh) 2021-09-17 2024-02-13 因美纳有限公司 从碱基判读错误模式自动鉴定核苷酸测序中的故障来源
JP2024535664A (ja) 2021-09-21 2024-10-02 イルミナ インコーポレイテッド 帰属ハプロタイプを用いたグラフ参照ゲノム及び塩基コールアプローチ
WO2023049215A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Illumina, Inc. Compressed state-based base calling
WO2023056328A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Illumina, Inc. Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples
US12480157B2 (en) 2021-09-30 2025-11-25 Illumina, Inc. Polynucleotide sequencing
WO2023069927A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Illumina, Inc. Methods for capturing library dna for sequencing
WO2023076832A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Singular Genomics Systems, Inc. Manipulating and detecting biological samples
WO2023076833A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Singular Genomics Systems, Inc. Multiplexed targeted amplification of polynucleotides
US20230158469A1 (en) * 2021-11-01 2023-05-25 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for synthesis
WO2023081485A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Stepwise sequencing of a polynucleotide with a homogenous reaction mixture
EP4419707A1 (en) 2021-11-10 2024-08-28 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2023085932A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Omnigen B.V. Prediction of response following folfirinox treatment in cancer patients
EP4305195A2 (en) 2021-12-01 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
KR20240116364A (ko) 2021-12-02 2024-07-29 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레오티드 염기 호출을 결정하기 위한 클러스터별 신호 교정 생성
WO2023107622A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Illumina, Inc. Parallel sample and index sequencing
CN117813397A (zh) 2021-12-21 2024-04-02 因美纳有限公司 蜡-微球基质组合物及其制备和使用方法
US20230215515A1 (en) 2021-12-23 2023-07-06 Illumina Software, Inc. Facilitating secure execution of external workflows for genomic sequencing diagnostics
WO2023122363A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Illumina Software, Inc. Dynamic graphical status summaries for nucelotide sequencing
AU2022421978A1 (en) 2021-12-23 2024-01-18 Illumina, Inc. Systems and related temperature calibration methods
WO2023129898A2 (en) 2021-12-27 2023-07-06 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
US20230207050A1 (en) 2021-12-28 2023-06-29 Illumina Software, Inc. Machine learning model for recalibrating nucleotide base calls corresponding to target variants
CA3242624A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Shannon Whitmore Automatically switching variant analysis model versions for genomic analysis applications
AU2022424380A1 (en) 2021-12-29 2024-01-18 Illumina, Inc. Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers
WO2023141154A1 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Illumina Cambridge Limited Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing
EP4466376A1 (en) 2022-01-21 2024-11-27 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
US20240254537A1 (en) 2022-02-23 2024-08-01 Insitro, Inc. Pooled optical screening and transcriptional measurements of cells comprising barcoded genetic perturbations
WO2023164660A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Illumina, Inc. Calibration sequences for nucelotide sequencing
AU2023225949A1 (en) 2022-02-25 2024-01-18 Illumina, Inc. Machine-learning models for detecting and adjusting values for nucleotide methylation levels
US20250188521A1 (en) 2022-03-10 2025-06-12 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid delivery scaffolds
WO2023175021A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Illumina, Inc. Methods of preparing loop fork libraries
WO2023183937A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Illumina, Inc. Sequence-to-sequence base calling
US20230304086A1 (en) 2022-03-28 2023-09-28 Illumina Cambridge Limited Labeled avidin and methods for sequencing
EP4500157A1 (en) 2022-03-29 2025-02-05 Nautilus Subsidiary, Inc. Integrated arrays for single-analyte processes
US20230313292A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing
EP4499870A1 (en) 2022-03-31 2025-02-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
EP4499659A1 (en) 2022-03-31 2025-02-05 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis
AU2023243205A1 (en) 2022-04-01 2024-09-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
CN119234045A (zh) 2022-04-06 2024-12-31 10X基因组学有限公司 用于多重细胞分析的方法
WO2023196572A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Illumina Singapore Pte. Ltd. Altered cytidine deaminases and methods of use
WO2023196528A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Illumina, Inc. Aptamer dynamic range compression and detection techniques
EP4515547A1 (en) 2022-04-26 2025-03-05 Illumina, Inc. Machine-learning models for selecting oligonucleotide probes for array technologies
WO2023209606A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres
EP4519674A1 (en) 2022-05-06 2025-03-12 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
EP4523215A1 (en) 2022-05-10 2025-03-19 Illumina Inc. Adaptive neural network for nucelotide sequencing
WO2023225095A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Illumina Cambridge Limited Preparation of size-controlled nucleic acid fragments
EP4526471A1 (en) 2022-05-19 2025-03-26 Agendia N.V. Dna repair signature and prediction of response following cancer therapy
WO2023224487A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Agendia N.V. Prediction of response to immune therapy in breast cancer patients
WO2023232829A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Illumina, Inc Compositions and methods for nucleic acid sequencing
US20230392207A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Illumina, Inc. Circulating rna biomarkers for preeclampsia
EP4537344A1 (en) 2022-06-09 2025-04-16 Illumina, Inc. Dependence of base calling on flow cell tilt
US20240035071A1 (en) 2022-06-17 2024-02-01 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
US20230420080A1 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Illumina Software, Inc. Split-read alignment by intelligently identifying and scoring candidate split groups
EP4544554A1 (en) 2022-06-27 2025-04-30 Illumina, Inc. Improved human leukocyte antigen (hla) genotyping
EP4544552A1 (en) 2022-06-27 2025-04-30 Illumina Inc. Accelerators for a genotype imputation model
US20230420082A1 (en) 2022-06-27 2023-12-28 Illumina Software, Inc. Generating and implementing a structural variation graph genome
EP4547675A1 (en) 2022-06-28 2025-05-07 Illumina, Inc. Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing
WO2024015962A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Blocked asymmetric hairpin adaptors
EP4562638A1 (en) 2022-07-26 2025-06-04 Illumina, Inc. Rapid single-cell multiomics processing using an executable file
CN115260262B (zh) * 2022-08-09 2024-09-27 深圳赛陆医疗科技有限公司 一种胞嘧啶叠氮化合物的制备方法
US20240101978A1 (en) 2022-08-12 2024-03-28 10X Genomics, Inc. Puma1 polymerases and uses thereof
CN119677873A (zh) 2022-08-16 2025-03-21 10X基因组学有限公司 Ap50聚合酶及其用途
US20250361558A1 (en) 2022-08-19 2025-11-27 Illumina, Inc. Third dna base pair site-specific dna detection
EP4588051A1 (en) 2022-09-16 2025-07-23 Illumina, Inc. Cluster segmentation and conditional base calling
CN118974830A (zh) 2022-09-29 2024-11-15 因美纳有限公司 用于推算靶变体的靶变体参考组
CN120153070A (zh) 2022-09-30 2025-06-13 因美纳有限公司 解旋酶-胞苷脱氨酶复合物及其使用方法
EP4595059A1 (en) 2022-09-30 2025-08-06 Illumina, Inc. Machine-learning model for refining structural variant calls
WO2024073047A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024073043A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides
CN119213083A (zh) 2022-09-30 2024-12-27 伊路米纳有限公司 用于减少测序期间的光损伤的组合物和方法
US20240141427A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 Illumina, Inc. Polymerases, compositions, and methods of use
US20240127905A1 (en) 2022-10-05 2024-04-18 Illumina, Inc. Integrating variant calls from multiple sequencing pipelines utilizing a machine learning architecture
EP4599080A2 (en) 2022-10-06 2025-08-13 Illumina, Inc. Probes for improving environmental sample surveillance
WO2024077162A2 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Illumina, Inc. Probes for improving coronavirus sample surveillance
EP4482978A1 (en) 2022-10-06 2025-01-01 Illumina, Inc. Probes for depleting abundant small noncoding rna
EP4602608A1 (en) 2022-10-11 2025-08-20 Illumina, Inc. Detecting and correcting methylation values from methylation sequencing assays
EP4602344A1 (en) 2022-10-14 2025-08-20 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples
WO2024098185A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 GeneSense Technology Inc., Shanghai (CN) Nucleic acid sequencing using self-luminescence
US20240167081A1 (en) 2022-11-08 2024-05-23 10X Genomics,Inc. Immobilization methods and compositions for in situ detection
WO2024107887A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for assessing performance of in situ assays
US12372771B2 (en) 2022-11-18 2025-07-29 10X Genomics, Inc. Systems and methods for actively mitigating vibrations
EP4627113A1 (en) 2022-11-30 2025-10-08 Illumina, Inc. Chemoenzymatic correction of false positive uracil transformations
EP4627583A1 (en) 2022-11-30 2025-10-08 Illumina, Inc. Accurately predicting variants from methylation sequencing data
WO2024123866A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3´ blocking groups and cleavable linkers
WO2024129672A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 The Broad Institute, Inc. Trafficked rnas for assessment of cell-cell connectivity and neuroanatomy
WO2024129969A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Illumina, Inc. Systems and methods for capture and enrichment of clustered beads on flow cell substrates
US20240218437A1 (en) 2022-12-16 2024-07-04 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for assessing performance
WO2024130031A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Illumina, Inc. Boranes on solid supports
US20240218424A1 (en) 2022-12-21 2024-07-04 10X Genomics, Inc. Methods for tethering ribonucleic acids in biological samples
WO2024137886A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Illumina, Inc. Context-dependent base calling
US20240229131A1 (en) 2022-12-22 2024-07-11 Illumina, Inc. Transition-metal catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis
AU2023409219A1 (en) 2022-12-22 2024-10-03 Illumina, Inc. Palladium catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis
US20240271206A1 (en) 2022-12-27 2024-08-15 Illumina, Inc. Methods of sequencing using 3' allyl blocked nucleotides
WO2024147904A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Illumina, Inc. Reducing uracils by polymerase
US20240263219A1 (en) 2023-01-06 2024-08-08 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of variant sequences
AU2024219208A1 (en) 2023-02-06 2025-01-16 Illumina, Inc. Determining and removing inter-cluster light interference
US20250361562A1 (en) 2023-02-17 2025-11-27 Illumina, Inc. Cell-free dna signals as biomarkers of preeclampsia
AU2024235961A1 (en) 2023-03-10 2025-01-09 Illumina, Inc. Aptamer detection techniques
CN119452044A (zh) 2023-03-29 2025-02-14 因美纳公司 萘酰亚胺染料以及其在核酸测序中的用途
AU2024247902A1 (en) 2023-03-30 2024-12-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
WO2024206848A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Illumina, Inc. Tandem repeat genotyping
US20240368678A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for spatial assay
CN119744419A (zh) 2023-05-03 2025-04-01 因美纳有限公司 用于重新校准来自现有测序数据文件的基因型检出的机器学习模型
WO2024249200A1 (en) 2023-05-26 2024-12-05 Illumina, Inc. Methods for preserving methylation status during clustering
US20240404624A1 (en) 2023-05-31 2024-12-05 Illumina, Inc. Structural variant alignment and variant calling by utilizing a structural-variant reference genome
WO2024249466A1 (en) 2023-05-31 2024-12-05 Illumina, Inc. False positive reduction by translesion polymerase repair
US20240401129A1 (en) 2023-05-31 2024-12-05 Illumina, Inc. Methods for double-stranded sequencing by synthesis
WO2024249973A2 (en) 2023-06-02 2024-12-05 Illumina, Inc. Linking human genes to clinical phenotypes using graph neural networks
WO2024254003A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Illumina, Inc. Identification and mapping of methylation sites
WO2025006432A1 (en) 2023-06-26 2025-01-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for nucleic acid extension
WO2025006565A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Illumina, Inc. Variant calling with methylation-level estimation
WO2025006487A1 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Illumina, Inc. Using flowcell spatial coordinates to link reads for improved genome analysis
WO2025006874A1 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Illumina, Inc. Machine-learning model for recalibrating genotype calls corresponding to germline variants and somatic mosaic variants
WO2025006464A1 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Illumina, Inc. Systems and methods of sequencing polynucleotides with alternative scatterplots
WO2025006460A1 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Illumina, Inc. Systems and methods of sequencing polynucleotides with modified bases
WO2025006466A1 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Illumina, Inc. Systems and methods of sequencing polynucleotides with four labeled nucleotides
WO2025010160A1 (en) 2023-07-06 2025-01-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for stabilizing concatemers
WO2025029831A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 10X Genomics, Inc. Methods and systems for targeted rna cleavage and target rna-primed rolling circle amplification
GB202312147D0 (en) 2023-08-08 2023-09-20 Syndex Bio Ltd Methylation method
US20250075269A1 (en) 2023-08-31 2025-03-06 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
WO2025049720A2 (en) 2023-08-31 2025-03-06 Illumina, Inc. Aptamer dynamic range compression and detection techniques
WO2025049331A2 (en) 2023-08-31 2025-03-06 Illumina, Inc. Aptamer detection techniques
WO2025054389A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Illumina, Inc. Identification of methylated cytosine using landmarks
WO2025050463A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 The Regents Of The University Of Michigan MICRORNA-DERIVED RNAs AND POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
WO2025059045A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Illumina, Inc. Systems and methods for determining linkage of sequence reads on a flow cell
WO2025058517A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Levels Diagnostics Holding B.V. Biomarkers for typing a sample of an individual for hepatocellular carcinoma.
WO2025061922A1 (en) 2023-09-20 2025-03-27 Illumina, Inc. Methods for sequencing
WO2025061942A1 (en) 2023-09-20 2025-03-27 Illumina, Inc. Sequencing error identification and correction
WO2025072783A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Illumina, Inc. Altered cytidine deaminases and methods of use
WO2025072368A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Illumina, Inc. Capture and selective release of biological material
US20250111898A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Illumina, Inc. Tracking and modifying cluster location on nucleotide-sample slides in real time
US20250111899A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Illumina, Inc. Predicting insert lengths using primary analysis metrics
WO2025081064A2 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Illumina, Inc. Thermophilic deaminase and methods for identifying modified cytosine
US20250137048A1 (en) 2023-10-26 2025-05-01 Illumina, Inc. 4,5-substituted naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing
WO2025090883A1 (en) 2023-10-27 2025-05-01 Illumina, Inc. Detecting variants in nucleotide sequences based on haplotype diversity
WO2025106431A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Illumina, Inc. Determining structural variants
WO2025106629A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Illumina, Inc. Structural variant detection using spatially linked reads
US20250163505A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Illumina, Inc. Conjugated polymers or polymer dots as fluorescent labels
US20250163502A1 (en) 2023-11-22 2025-05-22 10X Genomics, Inc. Methods for processing ribonucleic acids in biological samples
WO2025117738A1 (en) 2023-11-28 2025-06-05 Illumina, Inc. Methods of improving unique molecular index ligation efficiency
WO2025123005A2 (en) 2023-12-07 2025-06-12 Illumina, Inc. Preparation and compositions of cot-1 nucleic acid
EP4567128A1 (en) 2023-12-07 2025-06-11 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Improved method and means for spatial nucleic acid detection in-situ
WO2025129074A2 (en) 2023-12-14 2025-06-19 Illumina, Inc. Indexing techniques for tagmented dna libraries
WO2025129133A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Illumina, Inc. Minimal residual disease (mrd) models for determining likelihoods or probabilities of a subject comprising cancer
US20250201346A1 (en) 2023-12-18 2025-06-19 Illumina, Inc. Using machine learning models for detecting minimum residual disease (mrd) in a subject
US20250197933A1 (en) 2023-12-18 2025-06-19 Illumina, Inc. Hydrogel nanoparticles as labeling scaffold in sequencing
WO2025137222A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Illumina, Inc. Methylation detection assay
US20250210137A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Illumina, Inc. Directly determining signal-to-noise-ratio metrics for accelerated convergence in determining nucleotide-base calls and base-call quality
WO2025136105A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Stichting Amsterdam UMC Intestinal tissue-adherent microbial signatures predictive of response to anti-tnf-alpha in crohn's disease
US20250207203A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 10X Genomics, Inc. In situ detection of copy number variations in biological samples
WO2025137268A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for reducing gc bias
WO2025137647A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Illumina, Inc. Enhanced mapping and alignment of nucleotide reads utilizing an improved haplotype data structure with allele-variant differences
WO2025136717A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Illumina, Inc. Improving mapping resolution using spatial information of sequenced reads
WO2025144626A1 (en) 2023-12-28 2025-07-03 Illumina, Inc. Sequencing with single-stranded binding proteins
US20250215493A1 (en) 2023-12-28 2025-07-03 Illumina, Inc. Nucleotides with enzymatically cleavable 3'-o-glycoside blocking groups for sequencing
WO2025144711A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Illumina, Inc. Tricyclic polymethine dyes for nucleic acid sequencing
WO2025160089A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Illumina, Inc. Custom multigenome reference construction for improved sequencing analysis of genomic samples
WO2025174774A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Illumina, Inc. Determining offline corrections for sequence specific errors caused by low complexity nucleotide sequences
WO2025174708A1 (en) 2024-02-13 2025-08-21 Illumina, Inc. Design and method for cross-sequencing platform compatibility of flow cells
WO2025178951A1 (en) 2024-02-22 2025-08-28 Illumina, Inc. Techniques for dynamic range compression grouping in analyte assays
WO2025184234A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Illumina, Inc. A personalized haplotype database for improved mapping and alignment of nucleotide reads and improved genotype calling
WO2025184226A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Illumina, Inc. Nucleotides with terminal phosphate capping
WO2025189105A1 (en) 2024-03-08 2025-09-12 Illumina, Inc. Size thresholding of dna fragments
WO2025188906A1 (en) 2024-03-08 2025-09-12 Illumina, Inc. Modified adenosine nucleotides
WO2025193747A1 (en) 2024-03-12 2025-09-18 Illumina, Inc. Machine-learning models for ordering and expediting sequencing tasks or corresponding nucleotide-sample slides
CN117886850B (zh) * 2024-03-14 2024-07-05 深圳赛陆医疗科技有限公司 一种叠氮化合物的制备方法
WO2025194033A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 10X Genomics, Inc. Systems and methods for covering and sealing an open well
WO2025198469A1 (en) 2024-03-18 2025-09-25 Agendia N.V. Prediction of response to immune therapy in triple negative breast cancer patients.
WO2025207535A1 (en) 2024-03-26 2025-10-02 Illumina, Inc. Photo-switchable surfaces
WO2025207886A1 (en) 2024-03-28 2025-10-02 Illumina, Inc. Kits and methods for on-flow cell library preparation and methylation detection
WO2025217057A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Illumina, Inc. Variant detection using improved sequence data alignments
US20250320550A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Robert Bosch Gmbh Sequencing by synthesis using electroactively labeled 3-oh-modified nucleotides
WO2025221895A1 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Illumina, Inc. Water soluble polymer scaffolds for dye labeling
WO2025230914A1 (en) 2024-04-29 2025-11-06 Illumina, Inc. Nucleotides with enzyme-triggered self-immolative linkers for sequencing by synthesis
WO2025240241A1 (en) 2024-05-13 2025-11-20 Illumina, Inc. Modifying sequencing cycles during a sequencing run to meet customized coverage estimations for a target genomic region
WO2025240918A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for generating codebooks
WO2025240924A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 Illumina, Inc. Blind equalization systems for base calling applications
WO2025250794A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Illumina, Inc. Two-copy allele detection
WO2025250996A2 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Illumina, Inc. Call generation and recalibration models for implementing personalized diploid reference haplotypes in genotype calling
WO2025255457A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for improved on-target spatial profiling

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US227131A (en) 1880-05-04 Heney o
GB230037A (en) 1924-02-27 1925-10-01 Panhard & Levassor Improvements in internal combustion engines provided with valve sleeves
GB303924A (en) 1927-10-13 1929-01-14 Gregorio John Boonzaier Improvements in or relating to carburettors for internal combustion engines
US4711955A (en) * 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US5175269A (en) * 1984-01-30 1992-12-29 Enzo Diagnostics, Inc. Compound and detectable molecules having an oligo- or polynucleotide with modifiable reactive group
US5118605A (en) * 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US4824775A (en) * 1985-01-03 1989-04-25 Molecular Diagnostics, Inc. Cells labeled with multiple Fluorophores bound to a nucleic acid carrier
US4772691A (en) * 1985-06-05 1988-09-20 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Chemically cleavable nucleotides
US4863849A (en) * 1985-07-18 1989-09-05 New York Medical College Automatable process for sequencing nucleotide
US4888274A (en) 1985-09-18 1989-12-19 Yale University RecA nucleoprotein filament and methods
US5242796A (en) 1986-07-02 1993-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method, system and reagents for DNA sequencing
US5047519A (en) 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US4971903A (en) 1988-03-25 1990-11-20 Edward Hyman Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids
US5174962A (en) * 1988-06-20 1992-12-29 Genomyx, Inc. Apparatus for determining DNA sequences by mass spectrometry
GB8910880D0 (en) 1989-05-11 1989-06-28 Amersham Int Plc Sequencing method
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
WO1991006678A1 (en) 1989-10-26 1991-05-16 Sri International Dna sequencing
WO1993005183A1 (en) 1991-09-09 1993-03-18 Baylor College Of Medicine Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme
DE4141178A1 (de) 1991-12-13 1993-06-17 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren
GB9208733D0 (en) 1992-04-22 1992-06-10 Medical Res Council Dna sequencing method
GB9210176D0 (en) * 1992-05-12 1992-06-24 Cemu Bioteknik Ab Chemical method
US5436143A (en) * 1992-12-23 1995-07-25 Hyman; Edward D. Method for enzymatic synthesis of oligonucleotides
US5516664A (en) * 1992-12-23 1996-05-14 Hyman; Edward D. Enzymatic synthesis of repeat regions of oligonucleotides
US6074823A (en) * 1993-03-19 2000-06-13 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
FR2703052B1 (fr) * 1993-03-26 1995-06-02 Pasteur Institut Nouvelle méthode de séquençage d'acides nucléiques.
US5959089A (en) 1993-07-19 1999-09-28 Hannessian; Stephen Amino-cyclodextrin syntheses
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
US5547859A (en) * 1993-08-02 1996-08-20 Goodman; Myron F. Chain-terminating nucleotides for DNA sequencing methods
JPH09505397A (ja) * 1993-11-17 1997-05-27 アマーシャム・インターナショナル・ピーエルシー プライマー伸長質量分光分析による核酸配列決定法
US6214987B1 (en) * 1994-09-02 2001-04-10 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent formation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5808045A (en) * 1994-09-02 1998-09-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5763594A (en) 1994-09-02 1998-06-09 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US5872244A (en) * 1994-09-02 1999-02-16 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US6232465B1 (en) * 1994-09-02 2001-05-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
ATE191917T1 (de) 1994-10-14 2000-05-15 Stratagene Inc Porphyrin-markierung von polynukleotiden
US5681940A (en) 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
DE4438918A1 (de) 1994-11-04 1996-05-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
SE9500342D0 (sv) 1995-01-31 1995-01-31 Marek Kwiatkowski Novel chain terminators, the use thereof for nucleic acid sequencing and synthesis and a method of their preparation
WO1996027025A1 (en) 1995-02-27 1996-09-06 Ely Michael Rabani Device, compounds, algorithms, and methods of molecular characterization and manipulation with molecular parallelism
EP0745686A1 (en) * 1995-06-01 1996-12-04 Roche Diagnostics GmbH The use of DNA polymerase 3'-intrinsic editing activity
US5728528A (en) 1995-09-20 1998-03-17 The Regents Of The University Of California Universal spacer/energy transfer dyes
US6312893B1 (en) * 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
EP0992511B1 (en) 1996-01-23 2009-03-11 Operon Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US6613508B1 (en) * 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US5821356A (en) * 1996-08-12 1998-10-13 The Perkin Elmer Corporation Propargylethoxyamino nucleotides
US5885775A (en) * 1996-10-04 1999-03-23 Perseptive Biosystems, Inc. Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry
CA2277545A1 (en) 1997-01-08 1998-07-16 Proligo Llc Bioconjugation of oligonucleotides
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
US6136543A (en) * 1997-01-31 2000-10-24 Hitachi, Ltd. Method for determining nucleic acids base sequence and apparatus therefor
JP3489991B2 (ja) 1997-07-07 2004-01-26 理化学研究所 ３’−デオキシリボヌクレオチド誘導体
EP2267165B1 (en) * 1997-07-28 2016-11-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence analysis
US6008379A (en) * 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
JP2001519538A (ja) 1997-10-10 2001-10-23 プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ 核酸アレイのレプリカ増幅
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
GB9815163D0 (en) 1998-07-13 1998-09-09 Brax Genomics Ltd Compounds
AU3199699A (en) 1998-03-23 1999-10-18 Invitrogen Corporation Modified nucleotides and methods useful for nucleic acid sequencing
CA2330673C (en) * 1998-05-01 2009-05-26 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and dna molecules
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6218530B1 (en) * 1998-06-02 2001-04-17 Ambergen Inc. Compounds and methods for detecting biomolecules
US6287821B1 (en) * 1998-06-11 2001-09-11 Orchid Biosciences, Inc. Nucleotide analogues with 3'-pro-fluorescent fluorophores in nucleic acid sequence analysis
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
US6218118B1 (en) * 1998-07-09 2001-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method and mixture reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids by mass spectrometry
CA2339121A1 (en) 1998-07-30 2000-02-10 Shankar Balasubramanian Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US6787308B2 (en) * 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
GB0002310D0 (en) 2000-02-01 2000-03-22 Solexa Ltd Polynucleotide sequencing
DE19844931C1 (de) * 1998-09-30 2000-06-15 Stefan Seeger Verfahren zur DNS- oder RNS-Sequenzierung
US6221592B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Wisconsin Alumi Research Foundation Computer-based methods and systems for sequencing of individual nucleic acid molecules
US6451525B1 (en) 1998-12-03 2002-09-17 Pe Corporation (Ny) Parallel sequencing method
AU772281B2 (en) 1998-12-14 2004-04-22 Li-Cor Inc. A system and methods for nucleic acid sequencing of single molecules by polymerase synthesis
US6380378B1 (en) * 1998-12-24 2002-04-30 Toagosei Company, Ltd. Nucleotide compound, nucleotide block oligonucleotide, and method for producing them
US6087112A (en) 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
DE60044490D1 (de) * 1999-02-23 2010-07-15 Caliper Life Sciences Inc Manipulation von mikroteilchen in mikrofluiden systemen
EP1961826A3 (en) 1999-03-10 2008-09-17 ASM Scientific, Inc. A method for direct nucleic acid sequencing
US7037654B2 (en) * 1999-04-30 2006-05-02 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6242193B1 (en) * 1999-07-30 2001-06-05 Hitachi, Ltd. Apparatus for determining base sequence of nucleic acid
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
WO2001016375A2 (en) 1999-08-30 2001-03-08 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
AU7537200A (en) 1999-09-29 2001-04-30 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
US6309836B1 (en) * 1999-10-05 2001-10-30 Marek Kwiatkowski Compounds for protecting hydroxyls and methods for their use
JP2003516129A (ja) 1999-11-04 2003-05-13 カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジー ポリヌクレオチド配列を解析する方法および装置
WO2001048184A2 (de) * 1999-12-23 2001-07-05 Axaron Bioscience Ag Verfahren zur parallelen sequenzierung eines nukleinsäuregemisches an einer oberfläche
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
KR20030005197A (ko) 2000-02-18 2003-01-17 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 뉴클레오시드유도체를 이용한 플라비바이러스 감염의 치료또는 예방 방법
EP1182267B1 (en) 2000-03-30 2012-01-18 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Method of determining base sequence of single nucleic acid molecule
GB0013276D0 (en) 2000-06-01 2000-07-26 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Nucleotide analogues
GB0016473D0 (en) 2000-07-05 2000-08-23 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Sequencing method
DE10041539A1 (de) * 2000-08-24 2002-03-07 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Neue Amiditderivate zur Synthese von Polymeren auf Oberflächen
WO2002022883A1 (en) 2000-09-11 2002-03-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
DE60127162T2 (de) 2000-10-06 2008-04-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA
AU2002241803A1 (en) 2000-10-20 2002-06-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transient electrical signal based methods and devices for characterizing molecular interaction and/or motion in a sample
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
US20030027140A1 (en) 2001-03-30 2003-02-06 Jingyue Ju High-fidelity DNA sequencing using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
DE10120797B4 (de) 2001-04-27 2005-12-22 Genovoxx Gmbh Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten
DE10120798B4 (de) 2001-04-27 2005-12-29 Genovoxx Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Genexpression
US6613523B2 (en) 2001-06-29 2003-09-02 Agilent Technologies, Inc. Method of DNA sequencing using cleavable tags
EP1415001A4 (en) * 2001-07-13 2008-02-20 Ambergen Inc NUCLEOTIDE COMPOSITIONS COMPRISING PHOTOCLEADABLE MARKERS AND METHODS OF PREPARATION
AU2002337030A1 (en) 2001-08-29 2003-03-18 Genovoxx Gmbh Method for analyzing nucleic acid sequences and gene expression
GB0128526D0 (en) 2001-11-29 2002-01-23 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Nucleotide analogues
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
WO2003066812A2 (en) 2002-02-05 2003-08-14 Baylor College Of Medecine Substituted 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene compounds for 8-color dna sequencing
WO2003085135A1 (en) 2002-04-04 2003-10-16 Biotage New method
EP1497304B1 (en) * 2002-04-12 2014-06-25 Catalyst Assets LLC Dual-labeled nucleotides
US7074597B2 (en) 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
DE60327649D1 (de) 2002-08-23 2009-06-25 Illumina Cambridge Ltd Markierte nukleotide
DK3002289T3 (en) 2002-08-23 2018-04-23 Illumina Cambridge Ltd MODIFIED NUCLEOTIDES FOR POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
CA2557818A1 (en) 2004-03-03 2005-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
US7393533B1 (en) 2004-11-08 2008-07-01 La Jolla Institute For Allergy And Immunology H3L envelope protein immunization methods and H3L envelope passive protection methods
GB0517097D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Solexa Ltd Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof
US8481259B2 (en) 2007-02-05 2013-07-09 Intelligent Bio-Systems, Inc. Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches
EP2209911B1 (en) 2007-10-19 2013-10-16 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators and a deoxyinosine analogue with a reversible terminator group
US8883999B2 (en) 2008-03-19 2014-11-11 Intelligent Bio Systems, Inc. Methods and solutions for inhibiting undesired cleaving of labels
US9309569B2 (en) 2010-08-26 2016-04-12 Intelligent Bio-Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing nucleic acid using charge
WO2012083249A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using modified nucleotides and nanopore detection
US9624539B2 (en) 2011-05-23 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection
CA2903095C (en) 2013-03-15 2018-02-13 Xiaohai Liu Modified nucleosides or nucleotides

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