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CN116656795A - 核苷酸衍生物及其使用方法 - Google Patents

核苷酸衍生物及其使用方法 Download PDF

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CN116656795A
CN116656795A CN202310098650.3A CN202310098650A CN116656795A CN 116656795 A CN116656795 A CN 116656795A CN 202310098650 A CN202310098650 A CN 202310098650A CN 116656795 A CN116656795 A CN 116656795A
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陈鑫
李晓旭
李增民
谢旻刚
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史顺娣
任健怡
郭诚
希夫·库马尔
詹姆士·J·鲁索
传娟·陶
斯蒂芬·卓库兹
谢尔盖·卡拉什尼科夫
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Abstract

本发明尤其公开了化合物、组合物以及使用它们进行核酸测序的方法。

Description

核苷酸衍生物及其使用方法
本申请是申请日为2017年5月23日、中国专利申请号为201780045730.5且发明名称为“核苷酸衍生物及其使用方法”的中国专利申请的分案申请。本申请要求享有US62/340,419，US62/365,321和US62/477,945的优先权。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月23日提交的第62/340,419号美国临时申请、2016年7月21日提交的第62/365,321号美国临时申请和2017年3月28日提交的第62/477,945号美国临时申请的权益，其通过引用整体并入本文并且用于全部目的。
引用“序列表”，即作为ASCII文件提交的表格或计算机程序清单附录
特此通过引用将序列表并入，序列表记载在于2017年3月27日创建的文件51385-502001WO_ST25.txt中，5,636个字节，计算机版本IBM-PC，MS Windows操作系统。
背景技术
DNA测序是生物学和医学研究的基本工具，它是个性化精准医学范式的必备技术。在各种新的DNA测序方法中，合成测序(SBS)是实现1000美元基因组测序目标的主要方法。目前，广泛使用的高通量SBS技术(Bentley DR，et al.Nature，2008,456,53-59)通过使用以前开发的可切割的荧光标记的核苷酸可逆终止子(NRT)测序化学反应在聚合酶反应期间确定DNA序列(Ju J et al.2003,美国专利6664079；Ju J et al.Proc Natl Acad SciUSA,2006,103,19635-19640)。这些可切割的荧光NRT基于以下原理设计：通过将特有的可切割荧光团连接至特定位置的碱基并用小的可逆保护部分对3’-OH进行加帽来对核苷酸中的每一种进行改性，因此它们仍然能够作为底物被DNA聚合酶识别。上述SBS方法的缺点是在从聚合酶反应中掺入的核苷酸切割荧光染料后，在核苷酸碱基处产生小分子“疤”(例如炔丙胺或修饰的炔丙基氨基部分)。通过相继的每一轮的SBS这些疤在生长中的DNA链累积。在某些时候，残留的疤可能足以干扰DNA双螺旋结构，从而对DNA聚合酶识别产生负面影响，从而限制了读段长度。累积的研究工作表明这种方法的主要挑战是，由于在由聚合酶与互补核苷酸和带有引物的模板形成的三元复合物状态下，核苷酸的脱氧核糖上的3’位置非常靠近DNA聚合酶的活性位点处的氨基酸残基，因此DNA聚合酶难以接受3’-O大分子染料修饰的核苷酸作为底物。因此，需要合成3’-O修饰的核苷酸和核苷及其在无疤SBS的使用，所述3’-O修饰的核苷酸和核苷可作为底物被DNA聚合酶有效识别，在SBS期间被高效且准确地掺入生长中的DNA链中，具有在温和条件下可切割的3’-O保护基团(其中切割可产生3’-OH)，并允许长的SBS读段长度。本文尤其公开了本领域中这些问题以及其他问题的解决方案。
发明内容
本发明一方面提供了具有下式的核苷酸类似物：
B为碱基或其类似物；L1为共价接头。L2为共价接头。L4为共价接头。X为键、O、NR6A或S；R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分；R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分；R12为互补的亲和锚部分结合子；R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。
在一个方面，提供了嗜热核酸聚合酶复合物，其中所述嗜热核酸聚合酶与具有下式的核苷酸类似物结合：
B为碱基或其类似物。L1为共价接头。L2为共价接头。L4为共价接头。R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R4B为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-X-R6，取代或未取代烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。X为键、O、NR6A或S。R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分。R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。R12为互补的亲和锚部分结合子。R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。
在另一个方面，提供了嗜热核酸聚合酶复合物(例如，9°N核酸聚合酶复合物)，其中核酸聚合酶(例如，嗜热的)与核苷酸类似物结合，其中核苷酸类似物包括分子量为至少约140道尔顿的荧光染料，其中荧光染料在核苷酸类似物的3’位共价结合。
在一个方面，提供了将核苷酸类似物掺入核酸序列的方法，所述方法包括在反应容器内将嗜热核酸聚合酶、与核酸模板杂交的引物和包含可检测标签的核苷酸类似物合并，并使嗜热核酸聚合酶将核苷酸类似物掺入引物中，从而将核苷酸类似物掺入核酸序列中。
在一个方面，提供了一种核酸测序方法，其包括：(i)在反应容器内，使用嗜热核酸聚合酶按顺序将四种不同的标记的核苷酸类似物中的一种掺入引物中以产生延伸链，其中所述引物与所述核酸杂交，其中四种不同的标记的核苷酸类似物中的每一种包含特有的可检测标签；(ii)检测每个掺入的核苷酸类似物的所述特有的可检测标签，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，从而对核酸进行测序；其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的每一种具有以下结构式：
其中，在所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的第一种中，B为胸腺嘧啶杂交碱基或尿嘧啶杂交碱基；在所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的第二种中，B为腺嘌呤杂交碱基；在所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的第三种中，B为鸟嘌呤杂交碱基；在所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的第四种中，B为胞嘧啶杂交碱基。B为碱基或其类似物。L1为共价接头。L2为共价接头。L4为共价接头。X为键、O、NR6A或S。R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分。R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。R12为互补的亲和锚部分结合子。R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。
在另一个方面，提供了将核苷酸类似物掺入核酸序列的方法，所述方法包括在反应容器内将嗜热核酸聚合酶、与核酸模板杂交的引物和核苷酸类似物合并，并使所述嗜热核酸酸聚合酶将核苷酸类似物掺入引物中，从而将核苷酸类似物掺入核酸序列中，其中核苷酸类似物包括分子量为至少约140道尔顿的荧光染料，其中荧光染料共价结合在核苷酸类似物的3’位置处。
附图说明
图1：使用3’-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP和相应的标记的结合分子(其中“DTM”指二硫基甲基)的无疤SBS。(步骤1)将DNA聚合酶添加至带有引物的模板部分(以上仅示出引物链)使得在引物的3’末端以较高的效率和特异性掺入互补的3’-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP。(步骤2)向相应的引物延伸产物添加标记的结合分子使标记的结合分子与引物延伸产物的3’末端上的相应“锚”部分正交结合；在洗去未结合的标记的分子后，检测连接于引物延伸产物的特有标签以确定掺入的核苷酸的身份。(步骤3)添加TCEP或THP以切割二硫键，因此使得引物延伸产物上的标签被去除，并再次产生引物延伸产物上的3’-OH。重复步骤1到步骤3使得能够进行连续的DNA序列测定。“锚”部分和标记的结合分子包括可以形成共价键或稳定的非共价键的任何特异反应性的配对物。该标签可以是荧光分子、FRET盒或荧光树状大分子。
图2A-2E：3’-O-生物素-DTM-dNTP(3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dTTP)的结构，以Cy5染料标记的链霉亲和素作为实例(其中“DTM”指二硫基甲基)。图2A：Cy5标记的链霉亲和素。图2B：3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dATP。图2C：3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dCTP。图2D：3′-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dGTP。图2E：3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
图3A-3B：使用3'-O-生物素-SS(DTM)-dNTP和Cy5标记的链霉亲和素的无疤单色SBS。通过使用四种3'-O-生物素-SS-dNTP中的一种进行DNA聚合酶掺入反应，随后添加Cy5标记的链霉亲和素并成像以确定DNA序列，如步骤1至步骤4中所述(如3.1所示，并在3.2、3.3和3.4中重复)。每个步骤由三部分组成：(a部分)加入聚合酶和四种3'-O-生物素-SS-dNTP中的一种，然后洗涤；如果添加的核苷酸与模板上紧邻引物3'末端的核苷酸互补，则添加的核苷酸将掺入引物中以产生在3'末端具有生物素的DNA延伸产物。(b部分)添加Cy5标记的链霉亲和素，其将与DNA延伸产物的3'末端的生物素结合。(c部分)在洗去未结合的Cy5标记的链霉亲和素后，进行成像以检测Cy5信号从而鉴定掺入的核苷酸。在步骤4之后，向DNA延伸产物添加THP将切割二硫键并在DNA延伸产物的3'末端重新生成游离的3'-OH基团。依次重复所述由步骤1至步骤4组成的过程，然后进行THP切割，这使得可以连续进行序列测定。箭头上的文字如下：3.1：1.(a)加入3'-O-生物素-SS-dATP和DNA聚合酶；(b)加入Cy5-链霉亲和素；(c)成像；2.(a)加入3'-O-生物素-SS-dTTP和DNA聚合酶；(b)加入Cy5-链霉亲和素；(c)成像；3.(a)加入3'-O-生物素-SS-dGTP和DNA聚合酶；(b)加入Cy5标记的链霉亲和素；(c)成像；4.(a)加入3'-O-生物素-SS-dCTP和DNA聚合酶；(b)加入Cy5标记的链霉亲和素；(c)成像。3.2：重复步骤1、2、3和4。3.3：重复步骤1、2、3和4。3.4：重复步骤1、2、3和4。
图4：3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-PBA-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基-dTTP)的结构。在这组核苷酸类似物中，通过DTM连接分别将四种不同的“锚”部分TCO、PBA、生物素和叠氮基连接到dATP、dCTP、dGTP和dTTP的3'-O上，如该图所示。
图5：与图4中所列的核苷酸类似物(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-PBA-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基-dTTP)中的四种“锚”部分特异性结合的四色标记的正交结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5-标记的链霉亲和素和R6G-标记的二苯并环辛炔)的结构如下所示：Rox连接到四嗪(四嗪与TCO发生特异性反应)；Alexa488连接到SHA(SHA与PBA形成稳定的复合物)；Cy5连接到链霉亲和素(链霉亲和素与生物素形成稳定的复合物)；R6G连接到二苯并环辛炔(DBCO，其与N3基团快速形成三唑部分)。因此，可使用特有的荧光染料对图4中列出的每种核苷酸类似物进行标记。
图6A-6D：DNA产物之间的缀合物或复合物，其中通过使用四种相应匹配的标记的结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5-标记的链霉亲和素和R6G-标记的二苯并环辛炔)掺入3'-O“锚”标记的核苷酸(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-PBA-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基-dTTP)产生所述DNA产物。在3'末端含有四种“锚”部分的DNA延伸产物与四种相应匹配的标记的结合分子的反应导致DNA延伸产物中的每个掺入的核苷酸被特有的染料标记。因此，Rox将通过特异性的四嗪TCO连接与DNA延伸产物的3'末端连接以形成产物1；Alexa488将通过稳定的PBA-SHA复合物与DNA延伸产物的3'末端连接形成产物2；Cy5将通过生物素链霉亲和素复合物连接到DNA延伸产物的3'末端以形成产物3；R6G将通过二苯并环辛炔和叠氮基之间发生点击反应形成三唑连接至DNA延伸产物的3'末端以形成产物4。
图7：使用3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-PBA-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP、3′-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP)和四种相应匹配的染料标记的结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5-标记的链霉亲和素和R6G-标记的二苯并环辛炔)的无疤SBS。将DNA聚合酶和四种3′-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-PBA-SS-dCTP、3'-O-生物素-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，加入染料标记的结合分子，这些分子将特异性地与每个DNA延伸产物的3'末端处的四种特有“锚”部分中的每一种连接，以使得能够使用四种不同的荧光染料来标记由四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止的每种DNA产物。检测源自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号使得能够鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应(如图7中后续步骤所示)做好准备。箭头上的文字如下：1.3′-O-TCO-SS-dATP、3′-O-PBA-SS-dCTP、3'-O-生物素-SS-dGTP、3'-O-N3-SS-dTTP、DNA聚合酶。2.Rox-四嗪、cy5-链霉亲和素，Atexa488-SHA、R6G-DBCO，洗涤，成像。3.THP切割。4.为进行后续测序循环，重复步骤1、2和3。
图8：荧光(Cy5)树状聚合物缀合的四嗪(A和B)和3'-O-TCO-SS(DTM)-dNTP的结构。在聚合酶反应中将四种3'-O-TCO-SS(DTM)-dNTP中的每一种掺入生长中的DNA链中以终止DNA合成，产生具有以TCO基团作为3'末端的DNA产物。具有以TCO基团作为3'末端的DNA产物通过TCO-四嗪连接与具有四嗪部分的分子A或分子B(如上所示)偶联，使得DNA产物能够被多个荧光染料标记，由此促进检测信号放大从而在单分子水平或整体水平上进行SBS(按照类似于图3A-3B中所示方案的方案进行)。
图9：基于肽的荧光(Cy5)树状聚合物缀合的四嗪(分子A)和聚合物缀合的四嗪(分子B)的实例。在聚合酶反应中将四种3'-O-TCO-SS(DTM)-dNTP中的每一种掺入生长中的DNA链中以终止DNA合成，产生具有以TCO基团作为3'末端的DNA产物。具有以TCO基团作为3'末端的DNA产物与具有四嗪部分的分子A或分子B(如上所示)通过TCO-四嗪连接结合，使得DNA产物可以被多个荧光染料标记，从而促进检测信号放大从而在单分子水平或整体水平上进行SBS(按照类似于图3A-3B中所示方案的方案进行)。
图10A-10D：FRET盒标记的结合分子的实例。FRET盒通过改变供体和受体荧光团之间的距离来提供许多不同的FRET信号特征。与这种具有四个特有的FRET信号特征的FRET盒缀合的结合分子使得这种FRET盒能够使用“锚”部分连接反应与DNA延伸产物的3'末端结合；这使得能够通过FRET使用具有不同发射的两种不同荧光染料来进行无疤2-色SBS以鉴定四种DNA碱基。在上面显示的一组FRET盒标记的结合分子中，分别充当供体和受体的Rox和Cy5与7个或3个dSpacer单体连接以产生两个不同的FRET盒：FRET盒A(连接到SHA的Rox-7-Cy5)，其在Rox和Cy5之间具有7个dSpacer单体的长间隔距离，从供体(Rox)到受体(Cy5)的能量转移效率较低，由此产生弱的Cy5发射信号和强的Rox发射信号；FRET盒B(与反式环辛烯TCO连接的Rox-3-Cy5)在Rox和Cy5之间具有3个dSpacer单体的短间隔距离，从供体(Rox)到受体(Cy5)的能量转移效率将较高，从而产生强的Cy5信号和弱的Rox信号。在标记分子C中，其中单个Rox连接到四嗪，只有Rox信号是可检测的。在标记分子D中，其中单个Cy5连接至链霉亲和素，仅Cy5信号是可检测的。根据与图7所示方案类似的方案，通过执行以下步骤进行SBS以对DNA进行测序：将DNA聚合酶和四种3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-PBA-SS-dCTP、3'-O-生物素-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使互补核苷酸类似物能够掺入生长中的DNA链以终止DNA合成。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，添加染料标记的结合分子(A、B、C、D)，这些分子将与每个DNA延伸产物的3'末端处的四个特有“锚”部分中的一种特异性连接，使得能够使用四种不同的荧光特征来标记由四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的每种DNA产物。检测源自标记的DNA产物的特有的荧光特征以鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而除去荧光标签并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。
图11：FRET盒标记的结合分子(例如SHA、四嗪、DBCO、链霉亲和素等)的一般方案。通过改变供体和受体荧光团之间的距离，FRET盒的使用提供了许多不同的FRET信号特征(A、B、C、D)。按照与图7所示的方案类似的方案，通过进行以下步骤执行SBS以对DNA进行测序：将DNA聚合酶和四个3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-PBA-SS-dCTP、3'-O-生物素-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板，使得能够将互补核苷酸类似物掺入生长中的DNA链以终止DNA合成。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，添加染料标记的结合分子(A、B、C、D)，这些分子将与每种DNA延伸产物的3'末端处的四种特有“锚”部分中的每一种特异性连接，使得能够使用四种不同的荧光特征来标记由四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的每种DNA产物。检测源自标记的DNA产物的特有的荧光特征以鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光标签并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。
图12：3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP和3'-O-BodipyFL-叔丁基二硫基甲基-dCTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基-dGTP和3'-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基-dTTP)以及它们相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的二苯并环辛炔)的实例结构。
图13A-13B：使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dCTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dTTP和3'-O-TCO-SS-dGTP)以及它们相应的染料标记的结合分子(Rox-四嗪和BodipyFL-二苯并环辛炔)进行2-色DNA SBS。将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dCTP、3'-O-N3-SS-dTTP和3'-O-TCO-SS-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板，使得能够将互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链以终止DNA合成(步骤1)。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，检测源自Rox和BodipyFL的荧光信号以鉴定掺入的核苷酸为A(由Rox标记)和C(由BodipyFL标记)。接下来，将染料标记的结合分子(Rox-四嗪和BodipyFL-二苯并环辛炔)加入DNA延伸产物(步骤2)，这些分子将与每个DNA延伸产物的3'末端处的两个特有的“锚”部分(TCO和N3)特异性连接，使得由两种核苷酸类似物(G和T)中的每一种终止的每个DNA产物能够被两种不同的荧光染料标记(以G终止的情况下用Rox标记，以T终止的情况下用BodipyFL标记)。检测源自DNA延伸产物上的Rox和BodipyFL的新产生的特有荧光信号(除来自步骤1的信号外)，以将新掺入的核苷酸分别鉴定为G或T。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团(步骤3)，这为下一个循环的DNA测序反应(如图13A-13B的后续步骤所示)做好准备。图13A中的文字如下：3'-O-ROX-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dCTP、3'-O-N3-SS-dGTP、3'-O-TCO-SS-dGTP、DNA聚合酶。图13B中的文字如下：为进行后续的测序循环，重复步骤1、2和3。
图14：通过不同的可切割叔丁基二硫基甲基部分(在本图括号中突出显示)与荧光染料缀合的标记的结合分子的结构。通过偶氮连接将四嗪连接至ATTO647N(四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N)，偶氮连接可以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)切割；链霉亲和素经由二甲基缩酮连接至ATTO647N(链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N)，二甲基缩酮连接可以在弱酸性条件(如柠檬酸缓冲液(pH4))下被切割；通过可光切割的硝基苄基连接将SHA连接至ATTO647N(SHA-2-硝基苄基(接头)-ATTO647N)，硝基苄基连接可通过光照射被切割；通过烯丙基连接将DBCO连接至ATTO647N(二苯并环辛炔-烯丙基(接头)-ATTO647N)，烯丙基连接可被Pd(0)切割；也可以通过Dde连接将DBCO连接到ATTO647N(二苯并环辛炔-Dde(接头)-ATTO647N)，Dde连接可以被肼切割。ATTO647N标记的链霉亲和素(链霉亲和素-ATTO647N)也可以与通过不同的可切割叔丁基二硫基甲基部分与荧光染料缀合的三种其他结合分子组合使用。
图15：用于在单分子水平或在整体水平执行单色SBS的3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dATP、3'-O-TCO-SS-dTTP、3'-O-生物素-SS-dCTP)以及它们相应的、通过不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记的结合分子[DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ATTO647N、四嗪-Dde(接头)-ATTO647N和链霉亲和素-ATTO647N]、以及3'-O-叔丁基-SS(DTM)-dGTP(3'-O-SS-dGTP)的实例结构。
图16A-16C：(1)在DNA聚合酶存在下，将三种3'-锚核苷酸[3'-SS(DTM)N3-dATP、3'-SS(DTM)TCO-dTTP、3'-SS(DTM)生物素-dCTP]和3'-叔丁基-SS(DTM)-dGTP(如图15所示)加入带有引物的DNA模板以使得能够掺入引物；(2)通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-ATTO647N、四嗪-Dde(接头)-ATTO647N、链霉亲和素-ATTO647N(如图15所示)添加到含有掺入的3'-锚核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标签(例如ATTO647N)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)由于特异性的锚-结合分子相互作用而在它们的3'末端处被标记；(3)洗涤后，进行第一轮成像，由A、C和T终止的DNA产物均显示相同的颜色，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止；(4)通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠(Na2S2O4)仅切割偶氮键以从由A核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第二轮成像。如果荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了A核苷酸；(5)通过用肼(N2H4)处理进行第二次切割(II)，肼切割将切割Dde键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第三轮成像。如果荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。具有未改变的荧光信号的DNA产物通过推断鉴定为由C核苷酸终止；(6)用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并除去C上的染料，因此在THP处理后信号的变化将DNA产物确定为由C核苷酸终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。(7)重复步骤1-6以继续后续的单色DNA SBS循环。箭头上的文字如下：图16A：1.3'-O-N3-SS-dATP、3'-O-TCO-SS-dTTP、3'-O-生物素-SS-dCTP、3'-O-SS-dGTP、DNA聚合酶。2.DBCO-偶氮-ATT0647N、四嗪-Dde-ATT0647N、链霉亲和素-ATT0647N，洗涤，成像。图16B：3.用Na2S2O4切割I；洗涤，成像。4.用N2H4切割II，洗涤，成像。图16C：用THP切割III，洗涤，成像。
图17：用于在单分子水平或整体水平上进行单色SBS的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP)、3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dTTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)及它们相应的、经由不同的可切割接头与一种荧光染料缀合的标记的结合分子[DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-Rox和链霉亲和素-Rox]，以及3'-O叔丁基-SS(DTM)-dGTP(3'-O-SS-dGTP)的实例结构。
图18A-18C：(1)在DNA聚合酶存在下，将两种3'-锚核苷酸[(3'-O-N3-SS(DTM)-dTTP、3'-O-生物素-SS(DTM)-dCTP)]、3'-O-Rox-SS(DTM)-dATP和3'-O-叔丁基-SS(DTM)-dGTP(如图17所示)添加到带有引物的DNA模板以使得能够掺入到引物中；(2)洗涤后，进行第一轮成像，由A核苷酸类似物终止的DNA产物显示Rox信号，因此确定已掺入A核苷酸，而其他由G、C、T终止的DNA产物不会显示任何荧光信号；(3)通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox、链霉亲和素-Rox(如图17所示)添加到含有掺入的3′-锚核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标记(例如Rox)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)由于特异性的锚-结合分子相互作用而在它们的3'末端处被标记；(4)洗涤后，进行第二轮成像，由A、C和T终止的DNA产物都显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止；(5)通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠(Na2S2O4)仅切割偶氮键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸；(6)用THP进行第二次切割(II)以切割二硫键并从由核苷酸A和C终止的DNA延伸产物中除去染料，因此在THP处理后信号的变化将DNA产物确定为由C核苷酸终止，因为已经在上述第一轮成像中确定了由A核苷酸终止的DNA产物。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH，这为随后的单色DNASBS循环做好准备。重复步骤1-6以继续随后的单色DNA SBS循环。箭头上的文字如下：图18A：1.3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dCTP、3'-O-N3-SS-dTTP、3'-O-SS-dGTP、DNA聚合酶，洗涤，成像。2.链霉亲和素-Rox，DBCO-偶氮-Rox，洗涤，成像。图18B：3.用Na2S2O4切割I，洗涤，成像。4.用THP切割II，洗涤，成像。图18C：为进行后续的测序循环，重复步骤1、2、3、4。
图19A-19B：用于在单分子水平或在整体水平执行单色SBS的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP)、3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dTTP、3'-O-生物素-SS-dCTP和3'-O-N3-SS-dGTP)及它们的相应的、通过不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记的结合分子[四嗪-Dde(接头)-Rox、链霉亲和素-Rox和DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-Rox]的实例结构。
图20A-20C：(1)在DNA聚合酶存在下，将三种3'-锚核苷酸[3'-O-N3-SS(DTM)-dGTP、3'-O-生物素-SS(DTM)-dCTP、3'-O-TCO-SS(DTM)-dTTP]和3'-O-Rox-SS(DTM)-dATP(如图19A-19B所示)加入带有引物的DNA模板以使得能够掺入引物；(2)洗涤后，进行第一轮成像，由A核苷酸类似物终止的DNA产物显示Rox信号，因此确定已掺入A核苷酸，而其他由G、C、T终止的DNA产物不会显示任何荧光信号；(3)通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox、四嗪-Dde-Rox和链霉亲和素-Rox(如图19A-19B所示)添加到含有掺入的3'-锚核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标签(例如Rox)，这使得所有掺入的核苷酸由于特异性的锚-结合分子相互作用而在它们的3'末端处被标记；(4)洗涤后，进行第二轮成像，由A、G、T、C终止的DNA产物均显示相同的Rox信号。从在第一轮成像中被确定为由A核苷酸终止的DNA产物中减去Rox信号，结果显示由G、T、C终止的DNA产物；(5)通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠仅切割偶氮键以从由G核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了G核苷酸；(6)用肼(N2H4)进行第二次切割(II)，肼切割将切割Dde键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第四轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后保留，则确定DNA产物掺入了C核苷酸；(7)用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A和核苷酸C终止的DNA延伸产物中除去Rox染料，因此在THP处理后信号的变化也证实DNA产物由C核苷酸终止，因为已经在上述第一轮成像中确定了由A核苷酸终止的DNA产物。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-7以继续随后的单色DNA SBS循环。箭头下的文字如下：图20A：1.3′-O-Rox-SS-dATP，3′-O-生物素-SS-dCTP，3′-O-TCO-dTTP，3'-O-N3-SS-dGTP，DNA聚合酶，洗涤，成像。2.链霉亲和素-Rox，DBCO-偶氮-Rox，四嗪-Dde-ROX，洗涤，成像。图20B：3.用Na2S2O4切割I，洗涤，成像。4.用THP切割II，洗涤，成像。图20C：5.用THP切割III，洗涤，成像。为进行后续的测序循环，重复步骤1、2、3、4、5。
图21：3'-O-接头-标签-dNTP[3'-O-Rox-SS(DTM)-dATP、3'-O-Rox-烯丙基-dTTP、3'-O-Rox-硝基苄基-dCTP]和3'-O-SS(DTM)-dGTP的结构。
图22：(1)在DNA聚合酶存在下，将三种3'-O-可切割接头-标签-dNTP[3'-O-Rox-SS(DTM)-dATP、3'-O-Rox-烯丙基-dTTP、3'-O-Rox-硝基苄基-dCTP]和3'-O-叔丁基-SS-dGTP(如图21所示)加入带有引物的DNA模板以使得能够掺入引物；(2)洗涤后，进行第一轮成像，由C、T和A终止的DNA产物均显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止；(3)通过～350nm的光照射进行第一次切割(I)，以从由C核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了C核苷酸；(4)用Pd(0)进行第二次切割(II)，Pd(0)将切割烯丙基连接以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后仍然存在，则确定DNA产物掺入了A核苷酸；(5)用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A终止的DNA延伸产物中除去Rox染料，因此在THP处理后信号的变化证实DNA产物由A核苷酸终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-5以继续随后的单色DNA SBS的循环。箭头上方的文字如下：1.3'-O-SS-dGTP，3′-O-Rox-SS-dATP，3'-O-Rox-烯丙基-dTTP，3′-O-Rox-硝基苄基-dCTP，DNA聚合酶，洗涤，成像。2.光照射切割I，洗涤，成像。3.切割II，钯/TPPTS，洗涤，成像。4.THP切割III，洗涤，成像。为进行后续的测序循环，重复步骤1、2、3和4。
图23A-23B：使用3'-O-Rox-SS-dATP进行5、10和30次循环的聚合酶反应的DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱。在5个循环后，约5％的引物用3'-O-Rox-SS-dATP延伸。大约80％的引物在10个循环后延伸，并且引物在30个循环后完全延伸。
图24：使用3'-O-叔丁基-SS-dATP的聚合酶反应的DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱显示延伸在5个延伸循环后完成。
图25A-25C：使用3'-O-叔丁基-SS-dATP和3'-O-Rox-SS-dATP的混合物以1:1的比例进行聚合酶反应的DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱。延伸反应在5个循环后完成，使用3'-O-叔丁基-SS-dATP的延伸产物峰(延伸产物1，分子量(M.W.)6532)的高度是使用3'-O-Rox-SS-dATP的延伸产物峰(延伸产物2，M.W.7064)的高度的2倍以上，表明用相对较小的3'-O保护基团修饰的3'-O-叔丁基-SS-dATP通过聚合酶掺入的效率远高于用大体积Rox染料标记的3′-O-Rox-SS-dATP。图25B：3'-O-叔丁基-SS-dATP(M.W.625)。图25C：3'-O-Rox-SS-dATP(M.W.1157)。
图26：使用3'-O-TCO-SS-dTTP的聚合酶反应的DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱。结果显示，在38个循环后，引物通过3'-O-TCO-SS-dTTP完成延伸，得到5765道尔顿的延伸产物(M.W.计算值为5767)。
图27A-27B：使用3'-O-生物素-dCTP进行的聚合酶反应的DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱。大部分引物(M.W.5136)被延伸以产生在5801道尔顿处检测到的单一延伸产物(M.W.计算值为5811)。
图28A-28C：使用3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP的比例为1:1的混合物的聚合酶反应的DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱。具有3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP的7311道尔顿(M.W.计算值为7314)的延伸产物2的峰值远高于具有3'-O-Rox-SS-dATP的7063道尔顿(M.W.计算值7064)延伸产物1的峰值。该结果表明通过PEG4接头的Rox修饰的核苷酸类似物是比没有PEG接头的Rox修饰的核苷酸类似物更好的DNA聚合酶底物。
图29：3'-O-叔丁基二硫基甲基-dNTP的结构。
图30A-30D：四种3'-O-染料-DTM-dNTP的结构。图30A：3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP。图30B：3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP。图30C：3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP。图30D：3'-O-R6G-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
图31A-31D：在染料和DTM之间具有PEG4的四种3'-O-染料-DTM-dNTP的结构。
图32：掺有3'-O-染料(标签)-DTM-dNTP的DNA延伸产物的切割产生游离的3'-OH基团和没有任何修饰的延伸的DNA链。
图33A-33E：使用3'-O-Rox-DTM-dATP作为可逆终止子的连续DNA聚合酶延伸和切割的实验方案。第一延伸(产物1，M.W.计算值为7076)、第一次切割(产物2，M.W.计算值为6400)和第二延伸(产物3，M.W.计算值为7382)的MALDI-TOF MS谱。
图34A-34C：使用3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP作为可逆终止子的DNA聚合酶延伸和切割。延伸产物和切割产物的MALDI-TOF MS谱。
图35A-35C：使用3'-O-Bodipy-DTM-dTTP作为可逆终止子的DNA聚合酶延伸和切割。延伸产物和切割产物的MALDI-TOF MS谱。
图36A-36C：使用3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP作为可逆终止子的DNA聚合酶延伸和切割。延伸产物和切割产物的MALDI-TOF MS谱。
图37：锚部分和结合部分，它们彼此进行共价反应或形成复合物。
图38：四种3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP的结构。
图39：三种3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP和3'-O-SS(DTM)-dATP的结构。
图40：与结合分子连接的四种纳米标签的实例结构，在NanoSBS中，当这些纳米标签连接于锚部分时将给出特有的电流阻断信号。纳米标签可以基于修饰的寡核苷酸、肽、聚乙二醇(PEG)或其组合。
图41：缀合有纳米标签的结合分子的结构，其将与连接于3'-O-SS-接头核苷酸的锚部分反应。
图42：在2-标签纳米孔SBS中使用的两种3'-O-锚-2NB(2-硝基苄基)-dNTP(上图)和两种3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(下图)的结构。
图43：制备TAG(标签)1标记的四嗪的合成方案。可商购的四嗪NHS酯与氨基修饰的寡聚物Tag1偶联，生成Tag1-四嗪缀合物。
图44：制备SHA(水杨基羟基甲酸)标记的TAG2的合成方案。SHA的氨基衍生物与琥珀酸酐反应，得到SHA的酸衍生物，通过与N-羟基琥珀酰亚胺和DCC反应将酸衍生物转化为NHS酯。然后可以将SHA NHS酯与氨基修饰的寡聚物Tag2偶联以生成Tag2-SHA缀合物。
图45：制备镍双(二硫纶)标记的TAG3的合成方案。在EDC存在下将镍双(二硫纶)酸与氨基修饰的寡聚物Tag3一起孵育，得到Tag3-镍双(二硫纶)缀合物。
图46：制备DBCO标记的TAG4的合成方案。可商购的DBCO NHS酯与氨基修饰的寡聚物Tag4偶联，生成Tag4-DBCO缀合物。
图47：使用3'-O-锚-DTM-dNTP和标记的结合分子构建用于纳米孔上的SBS的纳米孔-聚合酶-DNA双链体复合物(A)和纳米孔-DNA双链体复合物(B)。在(B)中，将聚合酶加入到溶液中的复合物中(未示出)。
图48A-48B：使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS；从DNA聚合酶-纳米孔缀合物开始的4锚4标签方案。以本文所示的纳米孔-聚合酶-DNA双链体复合物为例，1)添加3'-O-PBA-SS-dATP、3'-O-四环庚烷(QC)-SS-dCTP、3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP，通过DNA聚合酶掺入互补的3'-O-N3-SS-dTTP，2)添加4种标签标记的结合分子(四嗪-TAG1、SHA-TAG2、Ni-双(二硫纶)-TAG3和DBCO-TAG4)。由于N3和DBCO之间的正交相互作用，只有Tag4连接于T的3'末端，3)随后的纳米孔电子检测仅显示Tag4信号，表明掺入了dTTP。4)使用TCEP或THP切割从3'末端除去标签，同时重新生成游离的3'OH以为下一个测序循环做准备。在该程序的每个步骤之后进行洗涤步骤。重复步骤1)和2)。仅掺入3'-O-TCO-SS-dGTP并连接四嗪-TAG1，使得3)检测到Tag1信号，表明掺入了G。使用TCEP或THP切割从3'末端除去Tag1，再次重新生成游离的3′OH。重复步骤1)和2)。掺入3'-O-QC-SS-dCTP并连接Ni-双(二硫纶)-TAG3，使得3)检测到Tag3信号，表明掺入了C。重复步骤1)和2)。掺入3'-O-PBA-SS-dATP并且SHA-TAG2被连接到3'末端，3)纳米孔电子检测产生Tag2信号，表明掺入了A。
图49A-49B：使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS；从DNA聚合酶-纳米孔缀合物开始的3锚3标签方案。以本文所示的纳米孔-聚合酶-DNA双链体复合物为例，1)添加3'-O-SS-dATP、3'-O-PBA-SS-dCTP、3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP，通过DNA聚合酶掺入互补的3'-O-N3-SS-dTTP，2)添加3种标签标记的结合分子(四嗪-TAG1、SHA-TAG2和DBCO-TAG3)。由于N3和DBCO之间的正交相互作用，只有Tag3连接于T的3'末端，3)随后的纳米孔电子检测仅显示Tag3信号，表明掺入了dTTP。4)使用TCEP或THP切割从3'末端除去标签，同时重新生成游离的3'OH以为下一个测序循环做准备。在该程序的每个步骤之后进行洗涤步骤。重复步骤1)和2)。仅掺入3'-O-TCO-SS-dGTP并连接四嗪-TAG1，使得3)检测到Tag1信号，表明掺入了G。使用TCEP或THP的切割从3'末端除去Tag1，再次重新生成游离的3'OH。重复步骤1)和2)。掺入3'-O-SS-dATP并且没有标签被连接到A的3'末端，因此3)纳米孔电子检测显示没有标签信号，表明掺入了A。重复步骤1)和2)。掺入3'-O-PBA-SS-dCTP并连接SHA-TAG2，使得3)检测到Tag2信号，表明掺入了C。
图50A-50B：使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS；从DNA引物-纳米孔缀合物开始的4锚4标签方案。以本文所示的纳米孔-引物复合物为例，1)添加DNA聚合酶、3'-O-PBA-SS-dATP、3'-O-QC-SS-dCTP、3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP，通过DNA聚合酶掺入互补的3'-O-N3-SS-dTTP，2)添加4种标签标记的结合分子(四嗪-TAG1、SHA-TAG2、Ni-双(二硫纶)-TAG3和DBCO-TAG4)。由于N3和DBCO之间的正交相互作用，只有Tag4连接于T的3'末端，3)随后的纳米孔电子检测仅显示Tag4信号，表明掺入了dTTP。4)使用TCEP或THP切割从3'末端除去标签，同时重新生成游离的3'OH以为下一个测序循环做准备。在该程序的每个步骤之后进行洗涤步骤。重复步骤1)和2)。仅掺入3'-O-TCO-SS-dGTP并连接四嗪-TAG1，使得3)检测到Tag1信号，表明掺入了G。使用TCEP或THP切割从3'末端除去Tag1，再次重新生成游离的3'OH。重复步骤1)和2)。掺入3'-O-QC-SS-dCTP并连接Ni-双(二硫纶)-TAG3，使得3)检测到Tag3信号，表明掺入了C。重复步骤1)和2)。掺入3'-O-PBA-SS-dATP并将SHA-TAG2连接到3'末端，3)纳米孔电子检测产生Tag2信号，表明掺入了A。
图51A-51B：使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS；从DNA引物-纳米孔缀合物开始的3锚3标签方案。以本文所示的纳米孔-引物复合物为例，1)添加DNA聚合酶、3'-O-SS-dATP、3'-O-PBA-SS-dCTP、3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP，通过DNA聚合酶掺入互补的3'-O-N3-SS-dTTP，2)添加3种标签标记的结合分子(四嗪-TAG1、SHA-TAG2和DBCO-TAG3)。由于N3和DBCO之间的正交相互作用，只有Tag3连接于T的3'末端，3)随后的纳米孔电子检测仅显示Tag3信号，表明掺入了dTTP。4)使用TCEP或THP切割从3'末端除去标签，同时重新生成游离的3'OH以为下一个测序循环做准备。在该程序的每个步骤之后进行洗涤步骤。重复步骤1)和2)。仅掺入3'-O-TCO-SS-dGTP并连接四嗪-TAG1，使得3)检测到Tag1信号，表明掺入了G。使用TCEP或THP切割从3'末端除去Tag1，再次重新生成游离的3'OH。重复步骤1)和2)。掺入3'-O-SS-dATP并且没有标签被连接到A的3'末端，因此3)纳米孔电子检测显示没有标签信号，表明掺入了A。重复步骤步骤1)和2)。掺入3'-O-TBA-SS-dCTP并连接SHA-TAG2，使得3)检测到Tag2信号，表明掺入了C。
图52A-52C：使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS：从DNA引物-纳米孔缀合物开始的2锚2标签方案。以本文所示的纳米孔-聚合酶复合物为例，1)添加3'-O-N3-SS-dATP、3'-O-TCO-SS-dCTP、3'-O-TCO-2NB-dTTP和3'-O-N3-2NB-dGTP，通过DNA聚合酶掺入互补的3'-O-N3-SS-dATP(上)或3'-O-N3-2NB-dGTP(下)；2)加入两个标签标记的结合分子四嗪-TAG1和DBCO-TAG2。由于N3和DBCO之间的正交相互作用，TAG2连接于A或G的3'末端，3)随后的纳米孔电子检测仅显示Tag2信号，表明dATP或dGTP掺入了生长中的引物链中。4)使用340nm光的光切割从G中除去标签并恢复其3'-OH基团(由于其具有2-硝基苄基(2NB)可切割基团)。5)信号检测表明Tag2信号消失，表明掺入了dGTP，或者仍存在Tag2信号，表明掺入了dATP。6)用THP切割SS基团恢复A上的3'-OH，为第二个循环做准备。每个步骤之后进行洗涤。重复步骤1)-6)以进行第二个测序循环。在这种情况下，1)将发生3'-O-TCO-SS-dCTP(上)或3'-O-TCO-2NB-dTTP(下)的掺入。2)添加两个标签标记的结合分子四嗪-TAG1和DBCO-TAG2；由于TCO和四嗪之间的正交相互作用，只有TAG2连接于C或T的3'末端，3)随后的纳米孔电子检测仅显示Tag1信号，表明dCTP或dTTP掺入了生长中的引物链中。4)使用340nm光的光切割从T中除去标签并恢复其3'-OH基团(由于其具有2NB可切割基团)。5)信号检测表明Tag1信号消失，表明掺入了dTTP，或者仍存在Tag1信号，表明掺入了dCTP。6)用THP切割SS基团恢复dCTP上的3'-OH。重复步骤1)-6)以进行其它的测序循环。
图53：3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3′-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)在连续SBS中的使用，所述连续SBS采用MALDI-TOF MS检测中间产物。用两种3'-染料修饰的核苷酸(3'-SS-Rox-dATP和3'-SS-BodipyFL-dTTP)和两种3'-锚修饰的核苷酸(3'-SS-生物素-dCTP和3'-SS-TCO-dGTP)的混合物在溶液中进行反应。复制反应产物由经历了在65℃持续30秒、45℃持续30秒的条件下进行的38个循环的下列物质组成：在20μl的1XThermo Pol缓冲液中的20pmol的如下所示的51聚物(51mer)模板、100pmol引物或碱基延伸引物(13-16mer)、150pmol 3'-O-染料(锚)-dNTP混合物、2单位Therminator IX DNA聚合酶和2mM锰。合并来自多个复制管的反应产物，使用HPLC除去未使用的3'-染料(锚)-dNTP和盐，并获得MALDI-TOF MS验证的纯的掺入产物。用100pmol三羟丙基膦(THP)在65℃下切割5分钟使得能恢复3'OH。用OligoClean&ConcentratorTM试剂盒(ZymoResearch，USA)处理样品以除去盐和切割的基团，用MALDI-TOF MS检测产物的大小。下面所示的13聚物(13mer)用于初始反应。在随后的循环中，使用来自前一循环的、在3'末端用碱基延伸的引物。如左图所示，进行了4个循环的延伸(a、c、e、g)和切割(b、d、f、g)，将A、C、G和T加到这些引物的3'末端(与5'方向上紧挨着模板中带下划线的引物结合位点的以粗体字母显示的4个碱基互补)。MALDI-TOF MS分析的结果证实添加了正确的核苷酸，然后在每个循环中转化为含有游离3'-OH基团的天然核苷酸。将核苷酸混合物添加到退火结合至DNA模板的13聚物(13mer)引物中使得3'-SS-PEG4-Rox-dATP完全掺入引物中，如质谱(MS)中单个观察到的5188Da(预计5188Da)处的峰所证明的(a)。在用THP处理以切割3'-SS-PEG4-Rox基团后，在4264Da(预计4272Da)处观察到单个MS峰(b)。在第二个循环中14聚物(14mer)引物的延伸表明3′-SS-生物素-dCTP掺入生长中的引物链中(观察到4941Da处的单个MS峰，预计4939Da)(c)。用THP处理后，观察到4564Da处的单个切割峰(预计4561Da)(d)。在第三个循环中，3'-SS-TCO-dGTP的掺入产生了5184Da处的MS峰(预计5194Da)(e)，并且通过MS显示锚的完全切割和3'-OH基团的恢复(在4894Da处的MS峰，预计4890Da)(f)。最后，在第四个循环中，新形成的16聚物(16mer)DNA链用作3'-SS-BodipyFL-dTTP掺入的引物。MS结果(g和h)显示3'-SS-BodipyFL-dTTP掺入的分子量为5621Da(预计为5620Da)的单峰和切割后分子量为5197Da(预计为5195Da)的单峰。
51聚物模板：
5'-TACATCAACTACCCGGAGGCCAAGTACGGCGGGTACGTCCTTGACAATGTG-3’
13聚物引物：
5'-CACATTGTCAAGG-3'MW：3959
在每次掺入后，产物的预期大小应该是起始引物加上进入的核苷酸的总和减去焦磷酸酯基团的MW(175)，得到的MW为5188Da、4939Da、5194Da和5620Da。
图54：使用四色方法获得四碱基读段。使用图中顶部所示的环状引发模板，其中接下来要加入的四个碱基是C、A、T、C，按照图70的方案进行反应。将5'-NH2-修饰的模板固定在来自Surmodics的NHS酯修饰的载玻片上(如本专利中前面所述)。每个循环如下进行：(1)用60μl的下列物质在65℃下延伸15分钟：0.02μM 3'-O-Rox-SS-dATP、0.05μM 3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、0.5μM 3'-O-生物素-SS-dCTP、0.5μM 3'-O-TCO-SS-dGTP、1X ThermoPol反应缓冲液(NEB)、2mM MnCl2、2-10单元Therminator IX DNA聚合酶；(2)用1X ThermoPol反应缓冲液洗涤；(3)用60μl的下列物质在65℃下追加反应10分钟：4μM的四种3'-O-SS(DTM)-dNTP中的每一种、1X Thermo Pol反应缓冲液、2mM MnCl2、2-10单元Therminator IXDNA聚合酶；(4)用1X Thermo Pol反应缓冲液洗涤；(5)用60μl的下列物质在pH7.4、37℃下标记15分钟：10μM四嗪-PEG4-TAMRA(在该特定实验中用作四嗪-Cy3的替代物)、4μM链霉亲和素-Cy5、1X PBS，；(6)用1X Thermo Pol反应缓冲液、1X SPSC缓冲液和水洗涤；(7)在488nm、543nm、594nm和633nm发射设置下扫描经空气干燥的载玻片，记录斑点的荧光强度；(8)用10mM THP在65℃下切割10分钟；(9)用水洗涤，用1X SPSC洗涤，并用水再次洗涤；(10)扫描经空气干燥的载玻片以确定背景(必要时重复洗涤以使背景最小化)。以上所述进行4次以获得条形图底部所示的延伸引物的前四个碱基的原始图像强度读数。
图55：在使用图70中描述的方法进行4-色DNA SBS时采用的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(TAMRA标记的四嗪和Cy5标记的链霉亲和素)的结构。
图56：使用2-色方法获得的四个和六个碱基读段。使用图中顶部显示的环状引发模板，其中接下来要添加的四个碱基是T、A、G、A或使用图中部所示的环状引发模板，其中接下来的六个碱基是C、A、T、C、A、A，反应按照图71的方案进行。将5'-NH2-修饰的模板固定在购自Surmodics的NHS酯修饰的载玻片上(如本专利中前面所述)。每个循环如下进行：(1)用60μl的下列物质在65℃下延伸15分钟：0.02μM 3'-O-Rox-SS-dATP、0.05μM 3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、0.5μM 3'-O-生物素-SS-dCTP、0.2μM 3'-O-TCO-SS-dGTP、1X ThermoPol反应缓冲液(NEB)、2mM MnCl2、2-10单位Therminator IX DNA聚合酶；(2)用1X ThermoPol反应缓冲液洗涤；(3)用60μl的下列物质在65℃下追加反应10分钟：4μM的四种3'-O-SS(DTM)-dNTP中的每一种、1X Thermo Pol反应缓冲液、2mM MnCl2、2-10单位的TherminatorIX DNA聚合酶；(4)用1X Thermo Pol反应缓冲液洗涤；(5)在488nm和594nm发射设置下扫描经空气干燥的载玻片，记录斑点的荧光强度；(6)用60μl的下列物质在pH7.4、37℃下标记10分钟：10μM四嗪-PEG4-Alexa488、4μM链霉亲和素-Alexa594、1X PBS；(7)用1X Thermo Pol反应缓冲液、1X SPSC缓冲液和水洗涤；(8)在488nm和594nm发射设置下扫描空气干燥的载玻片，记录斑点的荧光强度；(9)用10mM THP在65℃下切割10分钟；(10)用水洗涤，用1XSPSC洗涤，并用水再次洗涤；(11)扫描经空气干燥的载玻片以确定背景(必要时重复洗涤以使背景最小化)。将以上所述进行4-6次以获得模板结构下方条形图中所示的原始图像强度读数。在每个循环中，E表示延伸后的成像结果，L表示标记后的成像结果。因此，在上图中，由于直接连接到dTTP的3'-O-的BodipyFL染料的存在，在初始延伸后确定T，第二循环和第四循环中的A的情况也是如此；然而，直到标记反应才观察到第三个循环中的G，在标记反应中Alexa488-四嗪与dGTP的3'-O-上的锚分子(TCO)缀合。类似地，在下部条形图中，A和T的信号在延伸后立即可观察到，但是在进行标记反应之前观察不到C的信号。
图57：在使用图71中的描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3′-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(Alexa488标记的四嗪和Alexa594标记的链霉亲和素)的结构。
图58：在使用图72中描述的方法进行4-色测序时采用的3′-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)和3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)的结构。
图59：在使用图73中描述的方法进行4-色DNA SBS时采用的3′-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP和3′-O-生物素-SS-dTTP)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)和相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)的结构。
图60：在使用图74中描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3’-O-TCO-SS-dATP和3’-O-生物素-SS-dTTP)、3’-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3’-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3’-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)和相应的染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)的结构。
图61：在使用图75中描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3′-O-BodipyFL-SS-dTTP)和3'-O-DTM(SS)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox或3'-O-SS-dGTP-7-SS-偶氮-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL或3'-O-SS-dCTP-5-SS-偶氮-BodipyFL)的结构。
图62：用于2-色DNA SBS的3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox和3'-O-SS-dUTP-5-SS-BodipyFL)和3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox或3'-O-SS-dGTP-7-SS-偶氮-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL或3'-O-SS-dCTP-5-SS-偶氮-BodipyFL)。
图63：在使用图76中描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dCTP和3'-O-N3-SS-dATP)、3'-O-锚-2NB-dNTP(3'-O-TCO-2NB-dTTP和3'-O-N3-2NB-dGTP)及其相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的DBCO)。
图64：3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP、3'-O-锚-烯丙基-dNTP和3'-O-锚-2NB-dNTP的结构。组合使用来自具有相同锚的一个类别中的两个、来自具有另一个锚的另一个类别中的两个以及它们相应的两个染料标记的结合分子使得可进行2-色DNA SBS。一种具体方法在图71中作为实例示出。
图65：偶氮接头的合成和合成3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-偶氮-染料的一般方法。使用公认的重氮偶联反应合成偶氮接头分子的氨基酸衍生物。将所得化合物与染料NHS酯偶联，得到染料标记的偶氮接头的酸衍生物，其可通过用DSC和TEA处理进一步转化为NHS酯。然后将产物与3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-NH2的氨基偶联，得到3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-偶氮-染料。
图66：3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-偶氮-Rox和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-偶氮-BodipyFL的示例合成。Rox和BodipyFL标记的偶氮接头NHS酯与3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-NH2和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-NH2偶联，得到3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-偶氮-Rox和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-偶氮-BodipyFL。
图67：3'-O-SS(DTM)-dATP-SS-Rox的合成。
图68：3'-O-SS(DTM)-dUTP-SS-BodipyFL的合成。
图69：3'-O-锚-2NB-dNTP(3'-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP和3'-O-叠氮基-2-硝基苄基-dGTP)的示例合成。
图70：使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3′-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3′-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(TAMRA标记的四嗪和Cy5标记的链霉亲和素)进行4-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到在步骤1中没有被染料或锚标记的dNTP中的一种延伸的生长的DNA链中。生长的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止或由不具有染料或锚的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(TAMRA标记的四嗪和Cy5标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(G和C)中的每一种终止的各DNA产物(在用G终止的情况下用TAMRA标记，在用C终止的情况下用Cy5标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图55所示。
图71：使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-PEG4-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(Alexa488-PEG4标记的四嗪和Alexa594标记的链霉亲和素)进行2-色DNA SBS。显示在经固定化的DNA模板上使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP和3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP及其相应的染料标记的结合分子的组合进行的成功的2-色连续测序(方案Z2和图56)。使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-PEG4-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(Alexa488-PEG4标记的四嗪和Alexa594标记的链霉亲和素)进行2-色DNA SBS。尽管在该实验中使用了4种不同的染料，但Rox和Alexa594具有非常相似的吸收和发射光谱，BodipyFL和Alexa488也是如此。因此，这被描述为2-色实验。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-PEG4-SS-dCTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到在步骤1中没有被染料或锚标记的dNTP中的一种延伸的生长的DNA链中。生长的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料或锚的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(Alexa488-PEG标记的四嗪和Alexa594标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(G和C)中的每一种终止的各DNA产物(在用G终止的情况下用Alexa488标记，在用C终止的情况下用Alexa594标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图57所示。
图72：3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于4-色DNA SBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于4-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G、3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的染料标记的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链。用四种不同的荧光染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种来终止生长中的DNA链。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种不同的荧光染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。接下来，在步骤4中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图58所示。
图73：3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)用于进行4-色DNASBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)用于进行4-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G、3'-O-TCO-SS-dATP和3'-O-生物素-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料或锚标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(A和T)中的每一种终止的各DNA产物(在用A终止的情况下用Rox标记，在用T终止的情况下用BodipyFL标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Rox信号表示A的掺入，BodipyFL信号表示T的掺入，Cy5信号表示G的掺入，R6G信号表示C的掺入。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图59所示。
图74：3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)用于进行2-色DNA SBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)用于进行2-色DNA SBS的用途。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G、3′-O-TCO-SS-dATP和3'-O-生物素-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定，Cy5信号表明掺入了G，R6G信号表明掺入了C。步骤4，接下来，将染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(A和T)中的每一种终止的各DNA产物(以A终止的情况下用Cy5标记，以T终止的情况下用R6G标记)。步骤5，在洗去未结合的标签后，对源自DNA产物上的每种荧光染料的特有荧光信号的第二轮检测，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Cy5信号的出现表明掺入了A，R6G信号表明掺入了T。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图60所示。
图75：3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于进行2-色DNA SBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于进行2-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL、3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Rox信号表示掺入了A或G，BodipyFL信号表示掺入了C或T。步骤4，通过向延长的DNA链添加连二亚硫酸钠(Na2S2O4)来切割偶氮接头，从而从掺入的G中去除Rox并从掺入的C中去除BodipyFL。步骤5，在洗去切割的染料后，对源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号进行第二轮检测，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Rox信号的消失表明掺入了G，BodipyFL信号的消失表明掺入了C。仍然存在的Rox信号表示掺入了A，仍然存在的BodipyFL信号表明掺入了T。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。在偶氮基团和碱基之间存在另外的SS连接导致在THP处理后在掺入的核苷酸上产生较短的疤，这会导致更长的读段。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图61所示。
图76：3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dATP和3'-O-TCO-SS-dCTP)和3'-O-锚-2-硝基苄基-dNTP(3'-O-N3-2-硝基苄基-dGTP和3'-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP)及它们的相应的染料标记的结合分子(BodipyFL标记的DBCO和Rox标记的四嗪)用于进行2-色DNASBS。3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dATP和3'-O-TCO-SS-dCTP)和3'-O-锚-2-硝基苄基-dNTP(3'-O-N3-2-硝基苄基-dGTP和3'-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP)及它们的相应的染料标记的结合分子(BodipyFL标记的DBCO和Rox标记的四嗪)用于进行2-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-N3-SS-dATP、3'-O-TCO-SS-dCTP、3'-O-N3-2-硝基苄基-dGTP和3'-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到在所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料或锚标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的DBCO)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和N3)特异性连接，使得能够使用两种染料中的一种标记由四种核苷酸类似物中的每一种终止的各DNA产物(以A和G终止的情况下用BodipyFL标记，以C和T终止的情况下用Rox标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。BodipyFL信号表示掺入了A或G，Rox信号表示掺入了T或C。接下来，在步骤5中，用340nm光处理DNA产物以切割2-硝基苄基接头，从而去除荧光染料并在用G或T延伸的DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团。洗涤后，在步骤6中进行第二次进行成像以检测仍然存在的荧光信号。BodipyFL信号的消失表明掺入的核苷酸是G，Bodipy FL信号仍然存在表明掺入的核苷酸是A；类似地，Rox信号的消失表明掺入的核苷酸是T，Rox信号仍然存在表明掺入的核苷酸是C。最后，在步骤7中，用THP处理以切割残留在掺入的A或C上的任何染料，并恢复这些核苷酸上的3'-OH。此时，延伸产物已准备好进行下一个DNA测序循环反应。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图63所示。
图77：(方案A)3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-SS-Alexa488)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)和适当的染料标记的锚结合分子(四嗪-Rox、链霉亲和素-Alexa488)用于进行2-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-SS-Alexa488、3'-O-TCO-SS-dATP和3'-O-生物素-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3′-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸类似物后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以精确鉴定两种掺入的核苷酸类似物用于序列测定。Rox信号表明掺入了G，Alexa488信号表明掺入了C。步骤4，加入四嗪-Rox和链霉亲和素-Alexa488使得可以标记具有3'锚的两种核苷酸类似物。步骤5，在洗去多余的标记分子后，对源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号进行第二轮检测，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。先前未检测到的Rox信号的出现表明掺入了A，而先前未检测到的Alexa488信号的出现表明掺入了T。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团。步骤7，在洗去THP后，任选的成像步骤使得可以确认不存在任何剩余的荧光标签，表明已准备好进行下一个DNA测序反应循环。尽管方案A在此作为整体SBS方法呈现，但它也可以用于具有适当成像设置的单分子SBS测序。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图78所示。
图78：用于如方案A中的2-色DNA SBS的3'-O-DTM(SS)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-SS-Alexa488)、3'-O-锚-SS-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)和标记的结合分子(Rox标记的四嗪和Alexa 488标记的链霉亲和素)的结构。
图79：(方案B)3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox)和3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP)用于进行2-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox和3'-O-Rox-SS-dATP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)或不具有染料的等同的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸类似物后，检测DNA产物上荧光染料的荧光信号，使得可以鉴定两种掺入的核苷酸类似物用于序列测定。Rox信号表示掺入了A或G，BodipyFL信号表明掺入了C或T。步骤4，用连二亚硫酸钠处理以切割偶氮接头。步骤5，在洗去切割的染料后，对任何剩余荧光信号的第二轮检测使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。BodipyFL信号的消失表明掺入了C，仍然存在的BodipyFL信号表明掺入了T。Rox信号的消失表明掺入了G，仍然存在的Rox信号表明掺入了A。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团。尽管方案B在此作为整体SBS方法呈现，但它也可以用于具有适当成像设置的单分子SBS测序。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图80所示。
图80：用于如方案B中的2-色DNA SBS的3'-O-染料-DTM(SS)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL)和3'-O-DTM(SS)-dNTP-SS-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL)的结构。
图81：(方案C)3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP、3'-O-生物素-SS-dCTP)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料簇(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox簇、3'-O-SS-dTTP-5-SS-Alexa488簇)和适当的染料标记的锚结合分子(四嗪-Rox簇、链霉亲和素-Alexa488簇)用于进行2-色DNA SBS的用途。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3′-O-TCO-SS-dGTP、3'-O-生物素-SS-dCTP、3′-O-SS-dATP-7-SS-Rox簇和3′-O-SS-dTTP-5-SS-Alexa488簇)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得如果在步骤1中引物没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸，掺入互补的3′-O-SS-核苷酸类似物。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)或不具有染料的等同的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止。在单分子测序的情况下，不会识别(call)在生长中的DNA链中该位置处的碱基，但是因为在步骤6中将恢复3′-OH，所以仍然可以在这点之外进行测序。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸类似物后，检测DNA产物上荧光染料的荧光信号，使得可以鉴定两种掺入的核苷酸类似物用于序列测定。Rox信号表示掺入了A，Alexa488信号表示掺入了T。步骤4，添加分别与TCO和生物素锚结合的Rox簇标记的四嗪和Alexa488簇标记的链霉亲和素。步骤5，在洗去多余的标记分子后，对任何新的荧光信号的第二轮检测使得可以鉴定掺入的剩余的两种核苷酸类似物用于序列测定。Rox信号的出现表明掺入了G，Alexa488信号的出现表明掺入了C。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团。尽管方案C在此作为单分子SBS方法呈现，但它也可用于整体测序而无需任何设计变化。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图82(1-3)所示。
图82：图82-1：用于如方案C中的2-色DNA SBS的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-SS-染料簇(3′-O-SS-dATP-7-SS-Rox簇和3'-O-SS-dTTP-5-SS-Alexa488簇)的结构。图82-2：用于如方案C中的2-色DNASBS的相应的染料标记的结合分子(Rox簇标记的四嗪)的结构。图82-3：用于如方案C中的2-色DNA SBS的Alexa488簇标记的链霉亲和素的结构。
图83：方案D 3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3′-O-TCO-SS-dGTP、3'-O-生物素-SS-dCTP)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS(DTM)-染料(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-ET盒(3'-O-SS-dTTP-5-SS-[Rox---Cy5])和适当的染料标记的锚结合分子(链霉亲和素-Rox，四嗪-[Rox---Cy5])用于进行2-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-TCO-SS-dGTP、3'-O-生物素-SS-dCTP、3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox和3′-O-SS-dTTP-5-SS-[Rox---Cy5])加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)或不具有染料的等同的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止。步骤3，洗去未掺入的染料标记的核苷酸类似物后，检测DNA产物上荧光染料的荧光信号，使得可以鉴定两种掺入的核苷酸类似物用于序列测定。Rox信号表示掺入了A，Cy5信号表示掺入了T。步骤4，添加分别与TCO和生物素锚结合的Rox标记的链霉亲和素和[Rox...Cy5]盒标记的四嗪。步骤5，在洗去多余的标记分子后，对任何新的荧光信号的第二轮检测使得可以鉴定掺入的剩余的两种核苷酸类似物用于序列测定。Rox信号的出现表明掺入了C，Cy5信号的出现表明掺入了G。要注意的是，供体染料Rox的特定激发将导致在与受体染料Cy5的吸收光谱重叠的波长处发射光。如图84所示，选择Rox和Cy5在连接于碱基的聚合物分子上的位置以产生最佳的能量转移。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团。尽管方案D在此作为整体SBS方法呈现，但它也可以用于具有适当成像设置的单分子SBS测序。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图84所示。
图84：用于如方案D中的2-色DNA SBS的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-SS-ET盒(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox和3'-O-SS-dTTP-5-SS-Rox----Cy5 ET盒)及相应的染料标记的结合分子(Rox标记的链霉亲和素和Rox----Cy5 ET盒标记的四嗪)的结构。
图85：(方案E)3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-锚(3'-O-SS-dATP-7-偶氮-TCO、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-生物素)、3′-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP、3'-O-生物素-SS-dTTP)和适当的染料标记的锚结合分子(四嗪-ATTO647N、链霉亲和素-ATTO647N)用于进行1-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dATP-7-偶氮-TCO、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-生物素、3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。用四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)或不具有染料的等同的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止生长中的DNA链。步骤3，加入ATTO647N标记的链霉亲和素，其通过生物素锚与核苷酸类似物结合。步骤4，在洗去剩余的标记分子后，检测荧光信号表明掺入了T或C。步骤5，加入ATTO647N标记的四嗪，其通过TCO锚与核苷酸类似物结合。步骤6，在洗去多余的标记分子后，先前不存在的荧光信号的出现证实掺入了A或G。步骤7，用连二亚硫酸钠处理以切割A和C核苷酸类似物上的偶氮接头。在洗涤之后，在步骤8中进行第三次成像以检测剩余的荧光信号。如果我们已经确定掺入的核苷酸可能是T或C，则荧光消失表明其为C，而仍然存在荧光表明其为T。同样，对于先前确定为A或G的信号，荧光消失表明掺入了A，而仍然存在荧光表明掺入了G。接下来，在步骤9中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团。步骤10，在洗去THP后，任选的成像步骤使得可以确认不存在任何剩余的荧光标签，表明已准备好进行下一个DNA测序反应循环。尽管方案E在此作为整体SBS方法呈现，但它也可以用于具有适当成像设置的单分子SBS测序。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图86所示。
图86：用于如方案E中的1-色DNA SBS的3′-O-DTM(SS)-dNTP-偶氮-锚(3'-O-SS-dATP-7-偶氮-TCO和3′-O-SS-dCTP-5-偶氮-生物素)、3'-O-锚-DTM(SS)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dTTP)和染料标记的锚结合分子(ATTO647N标记的链霉亲和素)。
图87：(方案F)3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-锚(3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-TCO)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dTTP-5-偶氮-Rox)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP)和适当的染料标记的锚结合分子(四嗪-Rox)用于进行1-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-TCO、3'-O-TCO-SS-dGTP、3'-O-SS-dTTP-5-偶氮-Rox和3'-O-Rox-SS-dATP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)或由不具有染料的等同的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，进行成像以检测掺入的核苷酸类似物的荧光。Rox荧光表明掺入了A或T。步骤4，加入Rox标记的四嗪，其通过TCO锚与核苷酸类似物结合。步骤5，在洗去剩余的标记分子后，检测到先前缺失的Rox信号证实掺入了C或G。步骤6，用连二亚硫酸钠处理以切割T和C核苷酸类似物上的偶氮接头。在洗涤之后，在步骤7中进行第三次成像以检测剩余的荧光信号。如果我们已经确定掺入的核苷酸可能是A或T，则荧光消失表明其为T，而仍然存在荧光表明其为A。类似地，对于先前确定为C或G的信号，荧光消失表明掺入了C，而仍然存在荧光表明掺入了G。接下来，在步骤8中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，准备进行下一个DNA测序反应循环。尽管方案F在此作为整体SBS方法呈现，但它也可以用于具有适当成像设置的单分子SBS测序。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图88所示。
图88：用于如方案F中的1-色DNA SBS的3'-O-染料-DTM(SS)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dTTP-5-偶氮-Rox)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-偶氮-锚(3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-TCO)和3'-O-锚-SS-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP)以及染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪)的结构。
图89：方案G 3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-ATTO647N)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-生物素-SS-dCTP)、3'-O-锚-烯丙基-dNTP(3'-O-生物素-烯丙基-dATP)和3'-O-锚-2NB-dNTP(3'-O-生物素-2NB-dTTP)以及适当的染料标记的锚结合分子(链霉亲和素-ATTO647N)用于进行单色整体DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-ATTO647N、3'-O-生物素-SS-dCTP、3'-O-生物素-烯丙基-dATP、和3'-O-生物素-2NB-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)或不具有染料的等同的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，进行成像以检测掺入的核苷酸类似物的荧光。ATTO647N荧光表明掺入了G。步骤4，加入ATTO647N标记的链霉亲和素，其通过生物素锚与核苷酸类似物结合。步骤5，在洗去剩余的标记分子后，进行任选的成像步骤。检测到新的ATTO647N信号证实掺入了A、C或T中的任何一个。步骤6，用Pd(0)处理以切割A上的烯丙基接头。洗涤后，在步骤7中进行成像以检测剩余的荧光信号。ATTO647N信号消失表明掺入了A。步骤8，用340nm光处理以在T上切割2-硝基苄基接头。洗涤后，在步骤7中进行成像以检测剩余的荧光信号。ATTO647N信号的消失表明掺入了T。在两个切割步骤之后仍然存在信号表明掺入了C，因为在第一成像步骤中已经看到G。接下来，在步骤9中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，为下一个DNA测序反应循环做好准备。显示不存在荧光的任选成像步骤将确认掺入了C。尽管方案G在此作为整体SBS方法呈现，但它也可以用于具有适当成像设置的单分子SBS测序。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图90所示。
图90：用于如方案G中的1-色DNA SBS的3'-O-锚-可切割接头-dNTP(3'-O-生物素-烯丙基-dATP、3'-O-生物素-SS-dCTP、3'-O-生物素-NB-dTTP)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-ATTO647N)和相应的染料标记的结合分子(ATTO647N标记的链霉亲和素)的结构。
图91：(方案H)3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP、3′-O-生物素-SS-dCTP)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料簇(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox簇)、3′-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-染料簇(3'-O-SS-dTTP-5-偶氮-Rox簇)和适当的染料标记的锚结合分子(四嗪-Rox簇、链霉亲和素-Rox簇)用于进行1-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-TCO-SS-dGTP、3'-O-生物素-SS-dCTP、3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox簇和3'-O-SS-dTTP-5-偶氮-Rox簇)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得如果在步骤1中引物没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸，则能够掺入互补的3'-O-SS-核苷酸类似物。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)或不具有染料的等同的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止。在单分子测序的情况下，不会识别(call)在生长中的DNA链中该位置处的碱基，但是因为在步骤10中将恢复3'-OH，所以仍然可以在这点之外进行测序。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸类似物后，检测DNA产物上荧光染料的荧光信号，使得可以鉴定两种掺入的核苷酸类似物中的任何一种用于序列测定。Rox信号表示掺入了A或T。步骤4，添加Rox簇标记的链霉亲和素以与生物素锚结合。步骤5，在洗去多余的标记分子后，进行第二轮检测。新的Rox信号的出现证实掺入了C。步骤6，添加Rox簇标记的四嗪以与TCO锚结合。步骤7，在洗去多余的标记分子后，进行第三轮检测。新的Rox信号的出现证实掺入了G。步骤8，用连二亚硫酸钠处理以切割T核苷酸类似物上的偶氮接头。步骤9，洗涤后，Rox信号消失表明掺入了T；仍然存在Rox信号表明掺入了A。最后，在步骤10中，用THP处理DNA产物以切割DTM接头，从T核苷酸类似物中除去荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团。此时，DNA已准备好进行下一个测序循环。虽然方案H在这里作为单分子SBS方法呈现，但它也可以用于整体测序而无需任何设计变化。该方案中使用的修饰的核苷酸类似物的结构如图92-1和92-2所示。
图92：图92-1：用于如方案H中的单色DNA SBS的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-SS-染料簇(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox簇)、3'-O-DTM(SS)-dNTP-偶氮-染料簇(3'-O-SS-dTTP-5-偶氮-Rox簇)和相应的染料标记的结合分子(Rox簇标记的链霉亲和素(图92-2)和Rox簇标记的四嗪(图82-2))的结构。图92-2：用于如方案H中的单色DNA SBS的Rox簇标记的链霉亲和素的结构。
图93：3'-O-SS-dTTP-SS-(Rox---Cy5 ET盒)的合成。可以通过使用标准寡核苷酸合成方法常规合成炔基-Rox-Cy5 ET盒。
图94：3'-SS-dNTP-偶氮-染料簇的一般合成(以dATP作为实例)。
图95：3'-O-SS-dTTP-偶氮-(Rox簇)的合成。可以通过使用标准寡核苷酸合成方法常规合成炔基-Rox簇。
图96：3'-O-SS-dATP-SS-(Rox簇)的合成。可以通过使用标准寡核苷酸合成方法常规合成炔基-Rox簇。
图97：Rox簇标记的四嗪的合成。可以通过使用标准寡核苷酸合成方法常规合成5'-氨基-Rox簇。
图98：3'-O-SS-dNTP-偶氮-染料(锚)的一般合成。
图99：3'-O-SS-dTTP-5-偶氮-BodipyFL和3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox的合成。
图100：3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-生物素和3'-O-SS-dATP-7-偶氮-TCO的合成。
具体实施方式
本发明提供了新型核苷酸类似物，其含有3'-O-标记的可可逆去除的部分，该可可逆去除的部分通过DNA聚合酶有效地掺入生长中的DNA链中以暂时终止反应并产生携带荧光标签的DNA延伸产物。通过检测源自荧光团的信号，确定掺入的核苷酸的身份(例如，通过合成测序(SBS)的方法)。然后通过在水性缓冲溶液中用三(3-羟丙基)膦(THP)处理除去DNA延伸产物3'上的染料-DTM部分以重新生成3'-OH基团，这使得重新引发聚合酶反应以高效掺入下一个进入的3'-O-染料-DTM-dNTP。使用3'-O-染料-DTM-dNTP作为可逆终止子的连续SBS生成天然DNA链，使得可以产生具有长的读段长度的准确的DNA测序数据。
本发明提供了含有3′-O-修饰的新型核苷酸类似物，其可以通过DNA聚合酶有效地掺入生长中的DNA链中以暂时终止反应并产生携带可检测标签的DNA延伸产物。本发明进一步提供了新型核苷酸类似物，其包含3′-O-标记的可可逆去除的部分和锚部分，该锚部分是与碱基的身份相关的预定的小化学基团，并且与互补的结合分子正交且快速地反应，从而将锚和结合分子连接以形成缀合物。互补的结合分子包含可检测标签和与核苷酸上的锚和可检测标签结合的结合子。无论可检测标签是连接于掺入的核苷酸类似物，还是连接于已与核苷酸类似物形成缀合物的结合分子上，掺入的核苷酸的身份可通过检测源自可检测标签的信号而确定。然后通过在水性缓冲溶液中用水溶性膦处理除去DNA延伸产物的3'-O部分以重新生成3'-OH基团，这使得重新引发聚合酶反应以掺入下一个进入的核苷酸类似物。描述了以各种组合使用以下核苷酸类似物来进行SBS：(a)具有通过可切割接头连接在3'-O位置处的荧光团的核苷酸类似物，(b)在3'-O位置处具有用于随后连接荧光团的可切割锚的核苷酸类似物，以及(c)在碱基上具有可切割的荧光团，在3'-OH上具有可逆的保护基团的核苷酸类似物。使用所公开的核苷酸类似物作为可逆终止子的连续SBS生成天然DNA链，使得可以产生具有长的读段长度的准确DNA测序数据。
I.定义
本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域中的常规含义。本文所述的化学结构和化学式是根据化学领域已知的化学价的标准规则构建的。
在取代基由其常规化学式具体指明的情况下，从左至右书写的化学式同样地涵盖由从右向左书写结构而产生的化学上相同的取代基，例如-CH2O-相当于-OCH2-。
除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分是指直链(即非支链)或支链碳链(或碳)或其组合，其可以为完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括具有指定数目的碳原子(即，C1-C10表示1-10个碳)的单价、二价和多价基团。烷基是一个非环化链。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下基团的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高级的同系物和异构体。烷氧基是通过氧接头(-O-)与分子其余部分连接的烷基。烷基部分可以是烯基部分。烷基部分可以是炔基部分。烷基部分可以完全饱和。烯基可以包括多于一个的双键和/或除一个或多个双键之外还包括一个或多个三键。炔基可以包括多于一个三键和/或除一个或多个三键之外还包括一个或多个双键。
除非另有说明，否则术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指衍生自烷基的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-。通常，烷基(或亚烷基)基团将具有1-24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团在本文中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”通常为具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烃基(alkelyene)(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)。除非另有说明，否则术语“亚烯基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烯烃的二价基团。除非另有说明，否则术语“亚炔基”自身或作为另一取代基的一部分是指衍生自炔的二价基团。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与其他术语组合意指包括至少一个碳原子和至少一个杂原子(例如O、N、P、Si、B和S)的稳定的直链或支链或其组合，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子(例如，O、N、S、Si、B或P)可以位于杂烷基的任何内部位置处或在烷基与分子的其余部分连接的位置。杂烷基是一个非环化链。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3和-CN。多达两个或三个的杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。杂烷基部分可以包括一个杂原子(例如O、N、S、Si、B或P)。杂烷基部分可以包括两个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si、B或P)。杂烷基部分可以包括三个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si、B或P)。杂烷基部分可以包括四个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si、B或P)。杂烷基部分可以包括五个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si、B或P)。杂烷基部分可以包括多达8个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si、B或P)。除非另有说明，否则术语“杂烯基”本身或与另一术语组合意指包含至少一个双键的杂烷基。杂烯基可以任选地包含多于一个的双键和/或除一个或多个双键之外还包含一个或多个三键。除非另有说明，否则术语“杂炔基”自身或与另一术语组合意指包含至少一个三键的杂烷基。杂炔基可以任选地包含多于一个三键和/或除一个或多个三键之外还包含一个或多个双键。
类似地，除非另有说明，术语“亚杂烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基基团，杂原子也可占据链末端中的任一个或两个(例如亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。此外，对于亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)连接基团和亚杂烃基连接基团，连接基团的书写方向并不暗示连接基团的取向。例如，式-C(O)2R'-代表-C(O)2R'-和-R'C(O)2-。如上所述，本文所用的杂烷基包括通过杂原子与分子的其余部分连接的那些基团，例如-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R”、-OR'、-SR'和/或-SO2R'。当列举“杂烷基”，随后列举具体杂烷基(如-NR′R”等)时，应理解术语杂烷基和-NR′R”不是多余的或相互排斥的。而是，列举具体的杂烷基以使描述更加清楚。因此，在本文中术语“杂烷基”不应被解释为排除具体杂烷基，例如-NR'R”等。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合意指分别为“烷基”和“杂烷基”的环状形式。环烷基和杂环烷基不是芳香族的。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。“亚环烷基”和“亚杂环烷基”，单独地或作为另一取代基的一部分，分别表示衍生自环烷基和杂环烷基的二价基团。
除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤代烷基”旨在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，术语“酰基”是指-C(O)R，其中R是取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
除非另有说明，否则术语“芳基”是指多不饱和的芳族烃取代基，其可以是单环、或稠合在一起的或共价连接的多个环(优选1-3个环)(即稠环芳基)。稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中至少一个稠合的环是芳基环。术语“杂芳基”是指含有至少一个杂原子(如N、O或S)的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合在一起的多个环，其中至少一个稠合的环是杂芳环)。5,6-稠环亚杂芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为5元环，另一个环为6元环，并且其中至少一个环是杂芳基环。同样地，6,6-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环为6元环，另一个环为6元环，并且其中至少一个环是杂芳基环。6,5-稠环亚杂芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为6元环，另一个环为5元环，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基可以通过碳原子或杂原子连接到分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、萘基、吡咯基、吡唑基、哒嗪基、三嗪基、嘧啶基、咪唑基、吡嗪基、嘌呤基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、异喹啉基、喹喔啉基、喹啉基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。每个上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下面描述的可接受的取代基。单独或作为另一取代基的一部分的“亚芳基”和“亚杂芳基”分别表示衍生自芳基和杂芳基的二价基团。杂芳基取代基可以与环杂原子氮-O-键合。
螺环是两个或更多个环，其中相邻的环通过单个原子连接。螺环内的各个环可以相同或不同。螺环中的单个环可以是取代的或未取代的，并且在一组螺环内单个环可以具有与其它单个环不同的取代基。螺环内的各个环的可能取代基为当该环不是螺环的一部分时可能具有的取代基(例如环烷基或杂环烷基环的取代基)。螺环可以是取代或未取代的环烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的杂环烷基、或者取代或未取代的亚杂环烷基，螺环基团内的单个环可以是前面所列的任何一个，包括所有环均为一种类型的情况(例如，所有环均为取代的亚杂环烷基，其中每个环可以是相同或不同的取代的亚杂环烷基)。当提到螺环体系时，杂环螺环是指下述的螺环，其中至少一个环是杂环，并且其中每个环可以是不同的环。当提到螺环体系时，取代的螺环意指至少一个环被取代，并且每个取代基可以任选地不同。
符号表示化学部分与分子或化学式的其余部分的连接点。
本文所用的术语“氧基”是指与碳原子双键结合的氧。
术语“亚烷基芳基”为共价键合到亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)部分(在本文中也称为亚烃基)的亚芳基部分。在实施方案中，亚烷基芳基具有下式：
亚烷基芳基部分可以在亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)部分或亚芳基接头上(例如在2、3、4或6位碳上)被以下基团取代：卤素、氧基、-N3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-CHO、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2CH3、-SO3H、-OSO3H、-SO2NH2、 取代或未取代的C1-C5烷基、或者取代或未取代的2-5元杂烷基。在实施方案中，亚烷基芳基未被取代。
每个上述术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“环烷基”、“杂环烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括所指基团的取代形式和未取代形式。下面提供了每种类型基团的优选取代基。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是但不限于选自以下各种基团的一种或多种：-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、 -CN、-NO2、-NR'SO2R”、-NR'C(O)R”、-NR′C(O)-OR”、-NR'OR”，其数量范围从0到(2m'+1)，其中m'是这种基团中碳原子的总数。优选R、R'、R”、R”'和R””各自独立地表示氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如，由1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。当本文描述的化合物包含多于一个R基团时，例如，当存在多于1个这些基团时，每个R基团独立地选为R'、R”、R”'和R””。当R'和R”连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子结合形成4-元环、5-元环、6-元环或7-元环。例如，-NR'R”包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上关于取代基的讨论中，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意指包括与除氢基以外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与描述的烷基取代基类似，芳基和杂芳基的取代基是变化的并且选自例如：-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、 -CN、-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基、-NR'SO2R”、-NR'C(O)R”、-NR'C(O)-OR”、-NR'OR”，其数量范围从0至芳环体系上的开放化合价的总数；并且其中优选R'、R”、R”'和R””各自独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。当本文所述的化合物包含多于一个R基团时，例如，当存在多于1个这些基团时，每个R基团独立地选为R'、R”、R”'和R””。
环(例如环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基)的取代基可以描述为环上的取代基而不是环上的特定原子上的取代基(通常称为浮动取代基)。在这种情况下，取代基可以与任何环原子连接(遵守化学价的规则)并且在稠合环或螺环的情况下，被描述为与稠合环或螺环的一个成员相连的取代基(单环上的浮动取代基)可以是任何稠合环或螺环(多环上的浮动取代基)上的取代基。当取代基连接到环而不是特定原子(浮动取代基)，并且取代基的下标是大于1的整数时，多个取代基可以在相同的原子、相同的环、不同的原子、不同的稠环、不同的螺环上，并且每个取代基可以任选地不同。当环与分子其余部分的连接点不限于单个原子时(浮动取代基)，连接点可以是环的任何原子，并且在稠环或螺环的情况下，连接点可以是任何稠环或螺环的原子，与此同时遵守化学价的规则。当环、稠环或螺环含有一个或多个环杂原子时，显示环、稠合环或螺环有一个浮动取代基(包括但不限于与分子其余部分的连接点)，浮动取代基可以键合到杂原子上。当在具有浮动取代基的结构或结构式中显示环杂原子与一个或多个氢结合时(例如，环上的氮与环原子形成两个键并与氢形成第三个键)，当杂原子与浮动取代基键合，取代基将被理解为取代氢，同时遵守化学价的规则。
两个或更多个取代基可以任选地连接形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基。这种所谓的成环取代基通常(但不一定是)与环状基本结构相连。在一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的相邻成员。例如，连接到环状基本结构的相邻成员上的两个成环取代基产生稠环结构。在另一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的单个成员。例如，连接到环状基本结构的单个成员上的两个成环取代基产生螺环结构。在又一个实施方案中，成环取代基连接于基本结构的非相邻成员。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选形成式-T-C(O)-(CRR')q-U-的环，其中T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR'-或单键，并且q是0-3的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基取代，其中A和B独立地为-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-或单键，并且r是1-4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键取代。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CRR′)s-X'-(C”R”R”')d-的取代基取代，其中s和d独立地为0-3的整数，并且X'为-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR'-。优选取代基R、R'、R”和R”'独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。
本文所用的术语“杂原子”或“环杂原子”意在包括硼(B)、氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
本文所用的“取代基”或“取代基团”是指选自以下部分的基团：
(A)氧基、卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基(例如，C1-C20、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、未取代的杂烷基(例如，2-20元、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)、未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)、未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)、未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)；以及
(B)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基(例如，C1-C20、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、杂烷基(例如，2-20元、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)、环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)、芳基(例如，C6-C10或苯基)、杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)：
(i)氧基、卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基(例如，C1-C20、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、未取代的杂烷基(例如，2-20元、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)、未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)、未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)、未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)，以及
(ii)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基(例如，C1-C20、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、杂烷基(例如，2-20元、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)、环烷基(例如、C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)、芳基(例如，C6-C10或苯基)、杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)：
(a)氧基、卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基(例如，C1-C20、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、未取代的杂烷基(例如，2-20元、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)、未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)、未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)、未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)，以及
(b)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基(例如，C1-C20、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、杂烷基(例如，2-20元、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)、环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)、芳基(例如，C6-C10或苯基)、杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)：氧基、卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、 -NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基(例如，C1-C20、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、未取代的杂烷基(例如，2-20元、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)、未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)、未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)、未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。
本文所用的“低级取代基”或“低级取代基团”是指选自上文针对“取代基团”所述的所有取代基基团，其中每个取代或未取代的烷基为取代或未取代的C1-C8烷基，各取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2-8元杂烷基，各取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C7环烷基，各取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3-7元杂环烷基，各取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，且各取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5-9元杂芳基。
在一些实施方案中，本文化合物中描述的每个取代的基团被至少一个取代基取代。更具体地，在一些实施方案中，在本文化合物中描述的各取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的亚杂烷基、取代的亚环烷基、取代的亚杂环烷基、取代的亚芳基和/或取代的亚杂芳基被至少一个取代基取代。在其他实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个尺寸受限的取代基取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低级取代基取代。
在本文化合物的其他实施方案中，各取代或未取代的烷基可为取代或未取代的C1-C20烷基，各取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2-20元杂烷基，各取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C8环烷基，各取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3-8元杂环烷基，各取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，和/或各取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5-10元杂芳基。在本文化合物的一些实施方案中，各取代或未取代的亚烃基(例如亚烷基，亚烯基或亚炔基)为取代或未取代的C1-C20亚烷基，各取代或未取代的亚杂烷基为取代或未取代的2-20元亚杂烷基，各取代或未取代的亚环烷基是取代或未取代的C3-C8亚环烷基，各取代或未取代的亚杂环烷基是取代或未取代的3-8元亚杂环烷基，各取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，和/或各取代或未取代的亚杂芳基是取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
在一些实施方案中，各取代或未取代的烷基为取代或未取代的C1-C8烷基，各取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2-8元杂烷基，各取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C7环烷基，各取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3-7元杂环烷基，各取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，和/或各取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5-9元杂芳基。在一些实施方案中，各取代或未取代的亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)为取代或未取代的C1-C8亚烷基，各取代或未取代的亚杂烷基为取代或未取代的2-8元亚杂烷基，各取代或未取代的亚环烷基是取代或未取代的C3-C7亚环烷基，各取代或未取代的亚杂环烷基是取代或未取代的3-7元亚杂环烷基，各取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，和/或各取代或未取代的亚杂芳基是取代或未取代的5-9元亚杂芳基。在一些实施方案中，该化合物是下面的实施例部分、附图或表格中列出的化学物质。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；可以根据绝对立体化学将对映体、外消旋体、非对映体、互变异构体、几何异构体、立体异构体形式定义为(R)-或(S)-，或定义为(D)-或(L)-(针对氨基酸)，并且各个异构体包含在本发明的范围内。本发明的化合物不包括本领域已知的对于合成和/或分离而言太不稳定的化合物。本发明意在包括外消旋和光学纯形式的化合物。光学活性(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术进行分析。当本文所述的化合物含有烯键或其他几何不对称中心时，除非另有说明，所述化合物旨在包括E和Z几何异构体。
本文所用的术语“异构体”是指具有相同的原子数量和原子种类的化合物，因此具有相同的分子量，但在原子的结构排列或构型方面不同。
本文所用的术语“互变异构体”是指存在于平衡中且易于从一种异构体形式转化为另一种异构体形式的两种或更多种结构异构体中的一种。
本领域技术人员将会明白，本发明的某些化合物可以以互变异构形式存在，所有这些化合物的互变异构形式都在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文所述的结构还意味着包括该结构的所有立体化学形式；即每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映体和非对映体混合物在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文所述的结构还意味着包括不同仅在于存在一个或多个同位素富集的原子的化合物。例如，除了用氘或氚代替氢或用13C或14C富集的碳代替碳之外具有本结构的化合物都在本发明的范围内。
本发明化合物还可以在构成这些化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)对化合物进行放射性标记。本发明化合物的所有同位素变体，不管是否是放射性的，都包括在本发明的范围内。
应该注意的是，在整个申请中，替代选择被写入马库什组中，例如，包括多于一种可能的氨基酸的每个氨基酸位置。特别考虑到马库什组的每个成员应该被分开考虑，由此构成另一个实施方案，并且马库什组不应被视为单个单元。
根据其在化学和生物学中的普通含义，使用“类似物”，并且类似物是指与另一种化合物(即所谓的“参比”化合物)在结构上相似但组成不同的化学化合物，不同组成例如一个原子被不同元素的原子置换，或存在的特定官能团不同，或一个官能团被另一个官能团替换或参比化合物的一个或多个手性中心的绝对立体化学不同。因此，类似物是在功能和外观上相似或相当的化合物，但其结构或来源与参比化合物不同。
本文使用的术语“一个/一种(a/an)”意味着一种或多种。另外，本文所用的短语“被……取代”意指指定的基团可以被一个或多个任何或所有指名的取代基取代。例如，当诸如烷基或杂芳基的基团“被未取代的C1-C20烷基或未取代的2-20元杂烷基取代”时，该基团可含有一个或多个未取代的C1-C20烷基和/或一个或多个未取代的2-20元杂烷基。
此外，当部分被R取代基取代时，该基团可以被称为“R-取代的”。当部分被R取代时，该部分被至少一个R取代基取代，并且每个R取代基可选地不同。在化学类(例如式(I))的描述中存在特定的R基的情况下，可以使用罗马字母符号来区分该特定R组的每次出现。例如，在存在多个R13取代基的情况下，每个R13取代基可以被区分为R13A、R13B、R13C、R13D等，其中R13A、R13B、R13C、R13D等各自被定义为在R13的范围内，并且任选地不同。
“可检测剂”或“可检测化合物”或“可检测标签”或“可检测部分”是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁共振成像或其他物理手段可检测的成分。例如，可检测剂包括18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154- 1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、32P，荧光团(例如荧光染料)、修饰的寡核苷酸(例如，PCT/US2015/022063中描述的部分，其通过引用并入本文)、高电子密度试剂、酶(例如ELISA中通常使用的酶)、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米颗粒、超小型超顺磁性氧化铁(“USPIO”)纳米颗粒、USPIO纳米颗粒聚集体、超顺磁性氧化铁(“SPIO”)纳米颗粒、SPIO纳米颗粒聚集体、单晶氧化铁纳米颗粒、单晶氧化铁、纳米颗粒造影剂、脂质体或含有钆螯合物(“Gd-螯合物”)分子的其他递送载体、钆、放射性同位素、放射性核素(例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如，氟-18标记的)、发射γ射线的任何放射性核素、发射正电子的放射性核素、放射性标记的葡萄糖、放射性标记的水、放射性标记的氨、生物胶体、微泡(例如包括微泡壳，其包括白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物；微泡气芯，其包括空气、重质气体、全氟化碳、氮气、八氟丙烷、全氟己烷(perflexane)脂质微球、全氟丙烷(perflutren)等)、碘化造影剂(例如碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘帕醇、碘普兰、碘普胺、泛影酸盐、甲泛影酸盐、碘克沙酸盐)、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米颗粒、金纳米颗粒聚集体、荧光团、双光子荧光团或半抗原和蛋白质或其他可以被检测到的实体，例如通过将放射性标签掺入到与靶肽进行特异性反应的肽或抗体中。
根据本文描述的实施方案，可用作可检测成像和/或标记试剂的放射性物质(例如放射性同位素)包括但不限于18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。根据本发明的实施方案可用作附加成像剂的顺磁性离子包括但不限于过渡金属离子和镧系金属的离子(例如原子序数为21-29、42、43、44或57-71)。这些金属包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。
可检测试剂的实例包括显像剂，包括荧光和发光物质，包括但不限于通常称为“染料”、“标签”或“指示剂”的各种有机或无机小分子。实例包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料和花青染料。在实施方案中，可检测部分是荧光分子(例如吖啶染料、花青染料、氟染料、噁嗪染料、菲啶染料或罗丹明染料)。在实施方案中，可检测部分是荧光分子(例如吖啶染料、花青染料、氟染料、噁嗪染料、菲啶染料或罗丹明染料)。在实施方案中，可检测部分是荧光素异硫氰酸酯部分、四甲基罗丹明-5-(和6)-异硫氰酸酯部分、Cy2部分、Cy3部分、Cy5部分、Cy7部分、4',6-二脒基-2-苯基吲哚部分、Hoechst 33258部分、Hoechst 33342部分、Hoechst 34580部分、碘化丙锭部分或吖啶橙部分。在实施方案中，可检测部分是Indo-1、Ca饱和部分、Indo-1 Ca2+部分、级联蓝BSApH 7.0部分、级联蓝部分、LysoTracker Blue部分、Alexa 405部分、LysoSensor Blue pH 5.0部分、LysoSensor Blue部分、DyLight 405部分、DyLight 350部分、BFP(蓝色荧光蛋白)部分、Alexa 350部分、7-氨基-4-甲基香豆素pH7.0部分、氨基香豆素部分、AMCA缀合物部分、香豆素部分、7-羟基-4-甲基香豆素部分、7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0部分、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0部分、Hoechst33342部分、太平洋蓝(Pacific Blue)部分、Hoechst 33258部分、Hoechst 33258-DNA部分、太平洋蓝抗体缀合物pH 8.0部分、PO-PRO-1部分、PO-PRO-1-DNA部分、POPO-1部分、POPO-1-DNA部分、DAPI-DNA部分、DAPI部分、Marina Blue部分、SYTOX Blue-DNA部分、CFP(青色荧光蛋白)部分、eCFP(增强型青色荧光蛋白)部分、1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)部分、Indo-1、无Ca部分、1,8-ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)部分、BO-PRO-1-DNA部分、BOPRO-1部分、BOBO-1-DNA部分、SYTO 45-DNA部分、evoglow-Pp1部分、evoglow-Bs1部分、evoglow-Bs2部分、Auramine O部分、DiO部分、LysoSensor Green pH 5.0部分、Cy2部分、LysoSensor Green部分、Fura-2、高Ca部分、Fura-2 Ca2+部分、SYTO 13-DNA部分、YO-PRO-1-DNA部分、YOYO-1-DNA部分、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)部分、LysoTracker Green部分、GFP(S65T)部分、BODIPYFL、MeOH蓝色部分、蓝宝石(Sapphire)部分、BODIPY FL缀合物部分、MitoTracker绿色部分、MitoTracker绿色FM、MeOH部分、荧光素0.1M NaOH部分、钙黄绿素pH9.0部分、荧光素pH9.0部分、钙黄绿素部分、Fura-2、无Ca部分、Fluo-4部分、FDA部分、DTAF部分、荧光素部分、CFDA部分、FITC部分、Alexa Fluor 488酰肼-水部分、DyLight 488部分、5-FAM pH 9.0部分、Alexa 488部分、罗丹明110部分、罗丹明110pH 7.0部分、吖啶橙部分、BCECF pH 5.5部分、PicoGreendsDNA定量试剂部分、SYBR Green I部分、罗丹明绿pH 7.0部分、CyQUANT GR-DNA部分、NeuroTrace 500/525、绿色荧光Nissl染色-RNA部分、丹酰基尸胺部分、氟-祖母绿(Fluoro-Emerald部分)、Nissl部分、荧光素葡聚糖pH8.0部分、罗丹明绿部分、5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素pH9.0部分、丹酰基尸胺、MeOH部分、eYFP(增强型黄色荧光蛋白)部分、Oregon Green 488部分、Fluo-3部分、BCECF pH 9.0部分、SBFI-Na+部分、Fluo-3Ca2+部分、罗丹明123MeOH部分、FlAsH部分、钙绿(Calcium Green)-1Ca2+部分、镁绿部分、DM-NERFpH4.0部分、钙绿部分、柠檬色(Citrine)部分、LysoSensor Yellow pH9.0部分、TO-PRO-1-DNA部分、镁绿Mg2+部分、钠绿Na+部分、TOTO-1-DNA部分、俄勒冈绿(Oregon Green)514部分、俄勒冈绿514抗体缀合物pH8.0部分、NBD-X部分、DM-NERF pH7.0部分、NBD-X、MeOH部分、CI-NERF pH 6.0部分、Alexa 430部分、CI-NERF pH 2.5部分、萤黄(Lucifer yellow)、CH部分、LysoSensor Yellow pH 3.0部分、6-TET、SE pH 9.0部分、曙红抗体缀合物pH 8.0部分、曙红部分、6-羧基罗丹明6G pH 7.0部分、6-羧基罗丹明6G、盐酸盐部分、Bodipy R6G SE部分、BODIPY R6G MeOH部分、6JOE部分、级联黄部分、mBanana部分、Alexa 532部分、赤藓红-5-异硫氰酸酯pH9.0部分、6-HEX、SE pH9.0部分、mOrange部分、mHoneydew部分、Cy 3部分、罗丹明B部分、DiI部分、5-TAMRA-MeOH部分、Alexa 555部分、DyLight 549部分、BODIPY TMR-X、SE部分、BODIPY TMR-X MeOH部分、PO-PRO-3-DNA部分、PO-PRO-3部分、罗丹明部分、POPO-3部分、Alexa 546部分、钙橙Ca2+部分、TRITC部分、钙橙部分、罗丹明标记鬼笔环肽(Rhodaminephalloidin)pH 7.0部分、MitoTracker橙部分、MitoTracker橙MeOH部分、藻红蛋白部分、镁橙部分、R-藻红蛋白pH7.5部分、5-TAMRA pH7.0部分、5-TAMRA部分、Rhod-2部分、FM1-43部分、Rhod-2Ca2+部分、FM1-43脂质部分、LOLO-1-DNA部分、dTomato部分、DsRed部分、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺部分、四甲基罗丹明葡聚糖pH7.0部分、Fluor-Ruby部分、试卤灵(Resorufin)部分、试卤灵pH 9.0部分、mTangerine部分、LysoTracker Red部分、丽丝胺罗丹明(Lissamine rhodamine)部分、Cy 3.5部分、罗丹明红-X抗体缀合物pH 8.0部分、苏尔罗丹胺(Sulforhodamine)101EtOH部分、JC-1pH 8.2部分、JC-1部分、mStrawberry部分、MitoTracker Red部分、MitoTracker Red、MeOH部分、X-Rhod-1 Ca2+部分、Alexa 568部分、5-ROX pH 7.0部分、5-ROX(5-羧基-X-罗丹明、三乙基铵盐)部分、BO-PRO-3-DNA部分、BOPRO-3部分、BOBO-3-DNA部分、溴化乙锭部分、ReAsH部分、钙深红(calcium crimson)部分、深红钙Ca2+部分、mRFP部分、mCherry部分、HcRed部分、DyLight 594部分、乙锭均二聚物-1-DNA部分、乙锭均二聚物部分、碘化丙啶部分、SYPRO Ruby部分、碘化丙啶-DNA部分、Alexa594部分、BODIPY TR-X、SE部分、BODIPY TR-X、MeOH部分、BODIPY TR-X类鬼笔环肽pH7.0部分、Alexa Fluor 610R-藻红蛋白链霉亲和素pH 7.2部分、YO-PRO-3-DNA部分、Di-8 ANEPPS部分、Di-8-ANEPPS-脂质部分、YOYO-3-DNA部分、尼罗红-脂质部分、尼罗红部分、DyLight633部分、mPlum部分、TO-PRO-3-DNA部分、DDAO pH 9.0部分、Fura红高Ca部分、别藻蓝蛋白pH 7.5部分、APC(别藻蓝蛋白)部分、尼罗蓝、EtOH部分、TOTO-3-DNA部分、Cy5部分、BODIPY650/665-X、MeOH部分、Alexa Fluor 647R-藻红蛋白链霉亲和素pH 7.2部分、DyLight 649部分、Alexa 647部分、Fura红Ca2+部分、Atto 647部分、Fura红、低Ca部分、羧基萘并荧光素pH 10.0部分、Alexa 660部分、Cy 5.5部分、Alexa 680部分、DyLight 680部分、Alexa 700部分、FM 4-64、2％CHAPS部分或FM 4-64部分。
在一些实施方案中，可检测部分是1,1-二乙基-4,4-羰花青碘化物、1,2-二苯基乙炔、1,4-二苯基丁二烯、1,4-二苯基丁二炔、1,6-二苯基己三烯、1,6-二苯基己三烯、1-苯胺基萘-8-磺酸、2,7-二氯荧光素、2,5-二苯基噁唑、2-二-1-ASP、2-十二烷基试卤灵、2-甲基苯并噁唑、3,3-二乙基硫代二羰花青碘化物、4-二甲基氨基-4-硝基二苯乙烯、5(6)-羧基荧光素、5(6)-羧基萘并荧光素、5(6)-羧基四甲基罗丹明B、5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素、5-(和-6)-羧基-2,7-二氯荧光素、5-(N-十六酰基)氨基曙红、5-(N-十六酰基)氨基曙红、5-氯甲基荧光素、5-FAM、5-ROX、5-TAMRA、5-TAMRA、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、6-羧基罗丹明6G、6-HEX、6-JOE、6-JOE、6-TET、7-氨基放线菌素D、7-苄氨基-4-硝基苯-2-氧-1,3-二唑、7-甲氧基香豆素-4-乙酸、8-苄氧基-5,7-二苯基喹啉、8-苄氧基-5,7-二苯基喹啉、9,10-双(苯基乙炔基)蒽、9,10-二苯基蒽、9-甲基咔唑、(CS)2Ir(μ-Cl)2Ir(CS)2、AAA、吖啶橙、吖啶橙、吖啶黄、Adams Apple Red(亚当苹果红)680、Adirondack Green 520、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 480、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor488酰肼、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 610-R-PE、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 647-R-PE、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 680-APC、Alexa Fluor 680-R-PE、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、别藻蓝蛋白、AmCyan1、氨基甲基香豆素、Amplex Gold(产品)、Amplex Red试剂、Amplex UltraRed、蒽、APC、APC-Seta-750、AsRed2、ATTO 390、ATTO 425、ATTO 430LS、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 490LS、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO 590、ATTO 594、ATTO 610、ATTO620、ATTO 633、ATTO 635、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、ATTO Oxa12、ATTO Rho3B、ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTORho13、ATTO Rho14、ATTO Rho101、ATTO Thio12、Auramine O、Azami Green、Azami Green单体、B-藻红蛋白、BCECF,BCECF、Bex1、联苯、桦木黄580、蓝绿藻、BO-PRO-1、BO-PRO-3、BOBO-1、BOBO-3、BODIPY 630 650-X、BODIPY 650/665-X、BODIPY FL、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、BODIPY TR-X Ph 7.0、BODIPY TR-X类鬼笔环肽、BODIPY-DiMe、BODIPY-苯基、BODIPY-TMSCC、C3-靛青、C3-靛青、C3-氧化花青、C3-噻青染料(EtOH)、C3-噻青染料(PrOH)、C5-靛青、C5-氧化花青、C5-噻青、C7-靛青、C7-氧化花青、C545T、C-藻蓝蛋白、钙黄绿素、钙黄绿素红橙、钙深红、钙绿-1、钙橙、卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor White)2MR、羧基SNARF-1pH 6.0、羧基SNARF-1pH 9.0、羧基萘荧光素、级联蓝、级联黄、卡茨基尔绿(Catskill Green)540、CBQCA、CellMask橙、CellTrace BODIPY TR甲基酯、CellTrace钙黄绿素紫、CellTraceTM Far Red、CellTracker Blue、CellTrackerRed CMTPX、CellTracker Violet BMQC、CF405M、CF405S、CF488A、CF543、CF555、CFP、CFSE、CFTM 350、CFTM485、叶绿素A、叶绿素B、Chromeo 488、Chromeo 494、Chromeo 505、Chromeo546、Chromeo 642、柠檬黄、柠檬黄、ClOH丁氧基氮杂-BODIPY、ClOH C12氮杂-BODIPY、CM-H2DCFDA、香豆素1、香豆素6、香豆素6、香豆素30、香豆素314、香豆素334、香豆素343、香豆素545T、甲酚紫高氯酸盐、CryptoLight CF1、CryptoLight CF2、CryptoLight CF3、CryptoLight CF4、CryptoLight CF5、CryptoLight CF6、结晶紫、香豆素153、Cy2、Cy3、Cy3、Cy3.5、Cy3B、Cy3B、Cy3Cy5 ET、Cy5、Cy5、Cy5.5、Cy7、花青3NHS酯、花青5羧酸、花青5NHS酯、Cyclotella meneghinianaKützing、CypHer5、CypHer5 pH 9.15、CyQUANT GR、CyTrakOrange、Dabcyl SE、DAF-FM、DAMC(Weiss)、丹酰基尸胺、丹酰甘氨酸(二噁烷)、DAPI、DAPI、DAPI、DAPI、DAPI(DMSO)、DAPI(H2O)、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺、DCI、DCM、DCM、DCM(乙腈)、DCM(MeOH)、DDAO、深紫、di-8-ANEPPS、DiA、二氯三(1,10-菲咯啉)钌(II)、DiClOH C12氮杂-BODIPY、DiClOH丁氧基氮杂-BODIPY、DiD、DiI、DiIC18(3)、DiO、DiR、Diversa Cyan-FP、Diversa Green-FP、DM-NERF pH 4.0、DOCI、多柔比星、DPP pH探针590-7.5、DPP pH探针590-9.0、DPP pH探针590-11.0、DPP pH探针590-11.0、Dragon Green、DRAQ5、DsRed、DsRed、DsRed、DsRed-Express、DsRed-Express2、DsRed-Express T1、dTomato、DY-350XL、DY-480、DY-480XL MegaStokes、DY-485、DY-485XL MegaStokes、DY-490、DY-490XL MegaStokes、DY-500、DY-500XL MegaStokes、DY-520、DY-520XL MegaStokes、DY-547、DY-549P1、DY-549P1、DY-554、DY-555、DY-557、DY-557、DY-590、DY-590、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-636、DY-647、DY-649P1、DY-649P1、DY-650、DY-651、DY-656、DY-673、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-750、DY-751、DY-776、DY-782、Dye-28、Dye-33、Dye-45、Dye-304、Dye-1041、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight633、DyLight 649、DyLight 680、E2-深红(E2-Crimson)、E2-橙、E2-红/绿、EBFP、ECF、ECFP、ECL Plus、eGFP、ELF 97、Emerald、Envy Green、曙红、曙红Y、epicocconone、EqFP611、赤藓红-5-异硫氰酸酯、溴化乙锭、乙锭二聚体-1、乙基曙红、乙基曙红、乙基尼罗蓝A、对二甲基氨基苯甲酸乙酯、对二甲基氨基苯甲酸乙酯、Eu2O3纳米颗粒、Eu(Soini)、Eu(tta)3DEADIT、EvaGreen、EVOblue-30、EYFP、FAD、FITC、FITC、FlAsH(Adams)、FLAsH Red EX、FLAsH-CCPGCC、FlAsH-CCXXCC、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-5F、荧光素、荧光素0.1NaOH、荧光素-Dibase、氟-祖母绿(fluoro-emerald)、氟5G(Fluorol 5G)、FluoSpheres蓝、FluoSpheres深红、FluoSpheres暗红、FluoSpheres橙、FluoSpheres红、FluoSpheres黄绿、CTC中的FM4-64、SDS中的FM4-64、FM 1-43、FM 4-64、Fort橙600、Fura Red、Fura Red无钙、fura-2、Fura-2无钙、钆双胺、Gd-Dtpa-Bma、钆双胺、Gd-Dtpa-Bma、GelGreenTM、GelRedTM、H9-40、HcRed1、HemoRed 720、HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750、HiLyte Plus 555、HiLyte Plus 647、HiLyte Plus 750、HmGFP、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst-33258、Hoechst-33258、Hops Yellow 560、HPTS、HPTS、HPTS、HPTS、HPTS、indo-1、Indo-1无Ca、Ir(Cn)2(acac)、乙酰丙酮酸二铯铱(Ir(Cs)2(acac))、IR-775氯化物、IR-806、Ir-OEP-CO-Cl、650炔烃、650叠氮化物、650羧酸酯、650DBCO、650马来酰亚胺、650NHS酯、680LT羧酸酯、680LT马来酰亚胺、680LT NHS酯、680RD炔烃、680RD叠氮化物、680RD羧酸酯、680RD DBCO、680RD马来酰亚胺、680RD NHS酯、700亚磷酰胺、700DX、700DX、700DX羧酸酯、700DX NHS酯、750羧酸酯、750马来酰亚胺、750NHS酯、800亚磷酰胺、800CW、800CW炔、800CW叠氮化物、800CW羧酸酯、800CW DBCO、800CW马来酰亚胺、800CW NHS酯、800RS、800RS羧酸酯、800RS NHS酯、QC-1羧酸酯、QC-1NHS Ester、球等鞭金藻-Parke、JC-1、JC-1、JOJO-1、Jonamac Red Evitag T2、Kaede绿、Kaede红、kusabira橙、普莱西德湖490(Lake Placid490)、LDS 751、丽丝胺罗丹明(Weiss)、LOLO-1、荧光黄CH、路西法黄CH、荧光黄CH、路西法黄CH二锂盐、Lumio Green、Lumio Red、Lumogen F Orange、Lumogen Red F300、Lumogen RedF300、LysoSensor Blue DND-192、LysoSensor Green DND-153、LysoSensor Green DND-153、LysoSensor Yellow/Blue DND-160pH 3、LysoSensor YellowBlue DND-160、LysoTracker Blue DND-22、LysoTracker Blue DND-22、LysoTracker Green DND-26、LysoTracker Red DND-99、LysoTracker Yellow HCK-123、Macoun Red Evitag T2、Macrolex荧光红G、Macrolex荧光黄10GN、Macrolex荧光黄10GN、镁绿、八乙基卟啉镁、镁橙、酞菁镁、酞菁镁、四(均三甲苯基)卟啉镁、四苯基卟啉镁、孔雀石绿异硫氰酸酯、枫树红橙620、Marina blue、mBanana、mBBr、mCherry、部花青540、甲基绿、甲基绿、甲基绿、亚甲蓝、亚甲蓝、mHoneyDew、MitoTracker Deep Red 633、MitoTracker Green FM、MitoTrackerOrange CMTMRos、MitoTracker Red CMXRos、一溴bimane、一氯bimane、单针藻属(Monoraphidium)、mOrange、mOrange2、mPlum、mRaspberry、mRFP、mRFP1、mRFP1.2(Wang)、mStrawberry(Shaner)、mTangerine(Shaner)、N,N-双(2,4,6-三甲基苯基)-3,4:9,10-苝二(二甲酰亚胺)、NADH、萘、萘、萘并荧光素、萘并荧光素、NBD-X、NeuroTrace 500525、Nilblau高氯酸盐、尼罗蓝、尼罗蓝、尼罗蓝(EtOH)、尼罗红、尼罗红、尼罗红、尼罗红、尼罗蓝A、NIR1、NIR2、NIR3、NIR4、NIR820、八乙基卟啉、OH丁氧基氮杂-BODIPY、OHC12氮杂BODIPY、橙色荧光蛋白、俄勒冈绿488、俄勒冈绿488DHPE、俄勒冈绿514、Oxazin1、噁嗪750、噁嗪1、噁嗪170、P4-3、对四联苯、对三联苯、PA-GFP(活化后)、PA-GFP(预活化)、太平洋橙、钯(II)间四苯基四苯并卟啉、PdOEPK、PdTFPP、PerCP-Cy5.5、苝、苝、苝双酰亚胺pH-探针550-5.0、苝双酰亚胺pH-探针550-5.5、苝双酰亚胺pH-探针550-6.5、苝绿pH-探针720-5.5、苝绿标签pH-探针720-6.0、苝橙pH-探针550-2.0、苝橙标签550、苝红pH-探针600-5.5、苝二酰亚胺、苝绿pH-探针740-5.5、苯酚、苯丙氨酸、pHrodo、琥珀酰亚胺酯、酞菁、PicoGreen双链DNA定量试剂、频哪氰醇碘化物、吡罗昔康、四苯基四苯并卟啉铂(II)、李子紫(Plum Purple)、PO-PRO-1、PO-PRO-3、POPO-1、POPO-3、POPOP、卟吩、PPO、原黄素、PromoFluor-350、PromoFluor-405、PromoFluor-415、PromoFluor-488、PromoFluor-488 Premium、PromoFluor-488LSS、PromoFluor-500LSS、PromoFluor-505、PromoFluor-510LSS、PromoFluor-514LSS、PromoFluor-520LSS、PromoFluor-532、PromoFluor-546、PromoFluor-555、PromoFluor-610、PromoFluor-633、PromoFluor-647、PromoFluor-670、PromoFluor-680、PromoFluor-700、PromoFluor-750、PromoFluor-770、PromoFluor-780、PromoFluor-840、碘化丙啶、原卟啉IX、PTIR475/UF、PTIR545/UF、PtOEP、PtOEPK、PtTFPP、芘、QD525、QD565、QD585、QD605、QD655、QD705、QD800、QD903、QD PbS 950、QDot 525、QDot 545、QDot 565、Qdot 585、Qdot605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、QpyMe2、QSY 7、QSY 7、QSY 9、QSY 21、QSY35、奎宁、硫酸奎宁、硫酸奎宁、R-藻红蛋白、R-藻红蛋白、ReAsH-CCPGCC、ReAsH-CCXXCC、RedBeads(Weiss)、雷德蒙红(Redmond Red)、试卤灵、试卤灵、rhod-2、罗丹明700高氯酸盐、罗丹明、罗丹明6G、罗丹明6G、罗丹明101、罗丹明110、罗丹明123、罗丹明123、罗丹明B、罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明pH-探针585-7.0、罗丹明pH-探针585-7.5、罗丹明鬼笔环肽、罗丹明红-X、罗丹明红-X、罗丹明标签pH-探针585-7.0、罗多尔绿、核黄素、玫瑰红、蓝宝石(Sapphire)、SBFI、SBFI零Na、栅列藻属、SensiLight PBXL-1、SensiLight PBXL-3、Seta633-NHS、Seta-633-NHS、SeTau-380-NHS、SeTau-647-NHS、蛇眼红900、SNIR1、SNIR2、SNIR3、SNIR4、钠绿、沙拉菲尼尔嫩黄(Solophenyl flavine)7GFE 500、Spectrum Aqua、SpectrumBlue、Spectrum FRed、Spectrum Gold、Spectrum Green、Spectrum Orange、Spectrum Red、方酸染料III、Stains All、茋(Stilben)衍生物、茋、Styryl8高氯酸盐、磺基-花青3羧酸、磺基-花青3羧酸、磺基-花青3NHS酯、磺基-花青5羧酸、磺基-罗丹明101、磺基-罗丹明101、磺基-罗丹明B、磺基-罗丹明G、Suncoast Yellow、SuperGlo BFP、SuperGlo GFP、Surf GreenEX、SYBR Gold核酸凝胶染料、SYBR Green I、SYPRO Ruby、SYTO 9、SYTO 11、SYTO 13、SYTO16、SYTO 17、SYTO 45、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62,SYTO 82、SYTO RNASelect、SYTO RNASelect、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、T-蓝宝石(T-Sapphire)、Tb(Soini)、tCO、tdTomato、Terrylen、Terrylendiimid、testdye、四叔丁基氮杂卟啉、四叔丁基萘酞菁、并四苯(Tetracen)、四(邻氨基苯基)卟啉、四(均三甲苯基)卟啉、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明、四苯基卟啉、四苯基卟啉、Texas Red、Texas Red DHPE、TexasRed-X、ThiolTracker紫、乙酸硫堇酯、TMRE、TO-PRO-1、TO-PRO-3、甲苯、Topaz(Tsien1998)、TOTO-1、TOTO-3、三(2,2'-联吡啶基)氯化钌(II)、三(4,4-二苯基-2,2-联吡啶)氯化钌(II)、三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)钌(II)TMS、TRITC(Weiss)、TRITC葡聚糖(Weiss)、色氨酸、酪氨酸、Vex1、Vybrant Dyecycle Green(绿)染料、Vybrant Dyecycle Orange(橙)染料、Vybrant Dyecycle Violet(紫)染料、WEGFP(活化后)、WellRED D2、WellRED D3、WellRED D4、WtGFP、WtGFP(Tsien1998)、X-rhod-1、Yakima Yellow(黄)、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YoYo-1、YoYo-1双链DNA、YoYo-1单链DNA、YOYO-3、八乙基卟啉锌、酞菁锌、四(均三甲苯基)卟啉锌、四苯基卟啉锌、ZsGreen1或ZsYellow1。
在实施方案中，可检测标记是荧光染料。在实施方案中，可检测标记是能够与另一种荧光染料交换能量的荧光染料(例如荧光共振能量转移(FRET)发色团)。
在一些实施方案中，可检测部分是上文刚刚描述过的可检测部分之一的衍生物的部分，其中所述衍生物与上文刚刚描述过的可检测部分中的一个的不同之处在于通过将可检测部分缀合至本文所述的化合物而进行修饰。
如本文所述的术语“花青”或“花青部分”是指含有被聚次甲基链分隔的两个氮基的化合物。在实施方案中，花青部分具有3个次甲基结构(即花青3或Cy3)。在实施方案中，花青部分具有5个次甲基结构(即花青5或Cy5)。在实施方案中，花青部分具有7个次甲基结构(即花青7或Cy7)。
本发明化合物的描述受到本领域技术人员已知的化学键合原理的限制。因此，在一个基团可以被一个或多个取代基取代的情况下，选择这种取代以符合化学键合的原理，并且给出的化合物在环境条件下(例如水性、中性和一些已知的生理条件)不是固有不稳定的和/或普通的本领域技术人员已知其可能不稳定。例如，杂环烷基或杂芳基与分子的其余部分根据本领域技术人员已知的化学键合原理经由环杂原子连接，从而避免固有不稳定的化合物。
术语“药学上可接受的盐”意指包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于本文描述的化合物上存在的具体取代基。当本发明化合物含有相对较酸性的官能团时，可以通过使这些化合物的中性形式与足够量的所需碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。当本发明化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过使这些化合物的中性形式与足够量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等)的那些盐，以及衍生自相对无毒的有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等)的那些盐。还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及有机酸(如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐(参见例如Berge et al.,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本发明的某些具体化合物同时含有碱性官能团和酸性官能团，使得化合物可以转化为碱加成盐或酸加成盐。
因此，本发明的化合物可以以盐的形式存在，例如与药学上可接受的酸形成的盐。本发明包括这样的盐。这些盐的非限制性实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、丙酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物在内)、琥珀酸盐、苯甲酸盐，以及与氨基酸(如谷氨酸)形成的盐和季铵盐(如甲基碘，乙基碘等)。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而重新生成化合物的中性形式。化合物的母体形式可以与各种盐形式在某些物理性质上不同，例如在极性溶剂中的溶解度。
除了盐形式之外，本发明提供了呈前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下易于发生化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。本文所述化合物的前药可以在施用后在体内进行转化。另外，前药可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转化为本发明化合物，例如当与合适的酶或化学试剂接触时。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及包括水合形式在内的溶剂化形式存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且包括在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本发明所考虑的用途而言是等同的，并且旨在落入本发明的范围内。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指有助于向个体施用活性剂并有助于活性剂被个体吸收的物质，并且可以包含在本发明的组合物中而不会对病人引起显著的毒理学副作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(例如林格氏液)、醇、油、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和色素等。这样的制剂可以是经灭菌的，并且如果需要，将制剂与不会和本发明的化合物有害地发生反应的助剂(如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等)混合。本领域技术人员会认识到其他药物赋形剂可用于本发明。
术语“制剂”旨在包括活性化合物剂与包封材料的制剂，该包封材料作为提供胶囊的载体，在胶囊中与或不与其他载体在一起的活性成分被载体包围，因此载体与活性成分结合在一起。同样，包括扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适于口服给药的固体剂型。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物，其中该聚合物可任选地缀合至不是由氨基酸组成的部分。这些术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物，并适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
当多肽或细胞是人造的或被工程化的，或衍生自人造或工程化蛋白或核酸或含有人造或工程化蛋白或核酸(例如非天然或非野生型)时，多肽或细胞是“重组的”。例如，下述的多核苷酸是重组多核苷酸的实例：所述多核苷酸被插入载体或任何其他异源位置(例如重组生物体的基因组中)使得其与天然存在的多核苷酸正常侧接的核苷酸序列不相关联。由重组多核苷酸体外或体内表达的蛋白质是重组多肽的一个例子。同样，天然不存在的多核苷酸序列(例如天然存在的基因的变体)是重组的。
所使用的“接触”与其普通含义一致，是指使至少两种不同物质(例如包括生物分子或细胞在内的化学化合物)变得足够近以进行反应、相互作用或物理接触的过程。然而，应理解的是，所得到的反应产物可以直接由加入的试剂之间的反应制备或由可以在反应混合物中产生的来自一种或多种加入的试剂的中间体来制备。术语“接触”可以包括使两种物质反应，相互作用或物理接触，其中两种物质可以是如本文所述的化合物和蛋白质或酶。在一些实施方案中，接触包括使本文所述的化合物与参与信号传导途径的蛋白质或酶相互作用。
如本文所定义的，涉及蛋白质的术语“活化”、“激活”等是指蛋白质从初始无活性或失活状态转化为具有生物活性的衍生物。所述术语涉及激活、敏化或上调信号转导或酶活性或在疾病中减少的蛋白的量。
术语“激动剂”、“活化剂”、“上调剂”等是指能够可检测地增加给定基因或蛋白质的表达或活性的物质。与不存在激动剂时的对照相比，激动剂可以增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的表达或活性。在某些情况下，表达或活性是不存在激动剂时的表达或活性的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更高。
如本文所定义的，关于蛋白质-抑制剂相互作用的术语“抑制”等意指相对于不存在抑制剂的情况下蛋白质的功能，对蛋白质的活性或功能有负面影响(例如降低)。在实施方案中，抑制意指相对于不存在抑制剂时蛋白质的浓度或水平，对蛋白质的浓度或水平产生负面影响(例如降低)。在实施方案中，抑制是指减少疾病或疾病症状。在实施方案中，抑制是指特定蛋白质靶标的活性降低。因此，抑制包括至少部分地、部分地或完全地阻断刺激、降低、预防或延迟活化、或失活、脱敏或下调信号转导或酶活性或蛋白质的量。在实施方案中，抑制是指由直接相互作用(例如抑制剂结合靶蛋白)导致的靶蛋白活性的降低。在实施方案中，抑制是指由间接相互作用(例如，抑制剂结合激活靶蛋白的蛋白质，从而阻止靶蛋白激活)导致的靶蛋白活性的降低。
术语“抑制剂”、“阻遏物”或“拮抗剂”或“下调剂”可互换地指能够可检测地降低给定基因或蛋白质的表达或活性的物质。与不存在拮抗剂时的对照相比，拮抗剂可以使表达或活性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些情况下，表达或活性是不存在拮抗剂时的表达或活性的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更低。
术语“链霉亲和素”和是指能够结合生物素的四聚体蛋白(包括其同源物、同种型和功能片段)。该术语包括维持链霉亲和素活性(例如与野生型链霉亲和素相比，具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的活性)的任何重组或天然形式的链霉亲和素变体。
术语“表达”包括涉及产生多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。可以使用用于检测蛋白质的常规技术(例如ELISA、蛋白质免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光、免疫组织化学等)检测表达。
“有效量”是相对于不存在化合物时，足以使该化合物实现所述目的的量(例如达到施用其所要达到的效果，即治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性、减少信号传导途径、或减少疾病或病症的一种或多种症状)。本文所用的“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂而言降低酶活性所需的拮抗剂的量。本文所用的“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂而言破坏酶或蛋白质功能所需的拮抗剂的量。
本文所用的“细胞”是指执行代谢功能或其他功能的细胞，其足以保存或复制其基因组DNA。细胞可以通过本领域熟知的方法鉴定，包括例如完整膜的存在。由特定染料染色、产生后代的能力或者在配子的情况下能够与第二配子结合产生一个可存活的后代。细胞可以包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和来源于植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如夜蛾(Spodoptera))和人类细胞。当细胞天然为非粘附性的或已被处理(例如通过胰蛋白酶消化)从而不粘附至表面时，它们可能是有用的。
使用的“对照”或“对照实验”与其平常的普通含义一致，是指这样的实验，其中将实验的个体或试剂如在平行实验中一样进行处理，不同之处在于省略了实验的步骤、试剂、或变量。在某些情况下，将对照用作评估实验效果的比较标准。在一些实施方案中，对照是在不存在本文所述的化合物(包括实施方案和实施例)的情况下测量蛋白质的活性。
所用术语“调节”与其普通含义一致，是指改变或变化一种或多种性质的行为。“调节”是指改变或变化一种或多种性质的过程。例如，当应用于调节剂对靶蛋白质的作用时，调节是指通过增强或减弱靶分子的性质或功能或靶分子的量进行改变的手段。
本文使用的术语“异常”是指与正常不同。当用于描述酶活性或蛋白质功能时，异常是指活性或功能大于或小于正常对照或正常非患病对照样品的平均值。
本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法上的对等词表示共价连接在一起的至少两个核苷酸。术语“核酸”包括其单链、双链或多链DNA、RNA及其类似物(衍生物)。寡核苷酸的长度通常为约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸的长度，至多约100个核苷酸的长度。核酸和多核苷酸是任何长度的聚合物，包括更长的长度，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000等。在某些实施方案中，本文的核酸含有磷酸二酯键。在其他实施方案中，包括具有可替代的骨架的核酸类似物，可替代的骨架包含例如氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键或O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press)；和肽核酸骨架和键。其他类似物核酸包括具有阳性骨架；非离子骨架和非核糖骨架的核酸，包括在第5,235,033号和第5,034,506号美国专利中以及ASC Symposium Series 580,Carbohydrate Modifications in Antisense Research,Sanghui&Cook,eds,第6、7章中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义中。可以出于各种原因对核糖磷酸骨架进行修饰，例如为了增加这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或作为生物芯片上的探针。可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。本文所提及的核酸的残基是核酸的单体(例如，核苷酸)。
特定的核酸序列也包括“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白质包括由该核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。顾名思义，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。转录后，可以剪接初始核酸转录物，使得不同的(替代的)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制各不相同，但包括外显子的交替剪接。该定义也包括通过读出转录从相同核酸衍生的可选多肽。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式在内，都包括在该定义中。在Leicher,et al.,J.Biol.Chem.273(52):35095-35101(1998)中描述了钾通道剪接变体的一个实例。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地连接”的。例如，如果将前导序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，则其表达为参与多肽分泌的前蛋白；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果放置核糖体结合位置以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下，被连接的DNA序列是连续的并处于阅读框中。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过人工比对和目测检查(参见例如NCBI网站等)进行测量时，两个或更多个序列或子序列相同，或者两个或更多个序列具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域内比较和比对最大对应性时，在指定区域上具有约60％同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。那么认为这样的序列是“基本相同的”。该定义还涉及或可以应用于测试序列的补体。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可以解决缺口等问题。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上，或更优选地在长度为10-50个氨基酸或20-50个核苷酸的区域上。本文所使用的氨基酸序列同一性百分比(％)被定义为在比对序列和引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为了确定序列同一性百分比，可以以本领域技术范围内的各种方式实现比对，例如使用公众可获取的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
本文所用的“比较窗口”是指由选自10-600、通常约50至约200、更通常约100-150的任何一个数目的连续位置组成区段，在该比较窗口中，在序列与相同数目连续位置的参考序列以最佳方式对齐后，可以将两个序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法进行，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法进行，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)中的相似性搜索方法进行，通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)中，基因计算机组，575科学博士，麦迪逊，威斯康星州)进行，或通过人工比对和可视化检查(例如参见Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995 supplement)进行。
本文所用的术语“生物缀合物”或“生物缀合物接头”是指生物缀合物反应性基团的原子之间或分子之间产生的结合。该结合可以是直接或间接的。例如，本文提供的第一生物缀合物反应性基团(例如-NH2、-COOH、-N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺)与第二生物缀合物反应性基团(例如巯基、含硫氨基酸、胺、含胺侧链的氨基酸、或羧酸盐)之间的缀合可以是直接的，例如通过共价键或接头(例如第一接头或第二接头)，或是间接的，例如通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导偶极、伦敦分散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等)。在实施方案中，当生物缀合反应性基团的原子之间或分子之间的缔合是直接的(例如共价键、接头)情况时，生物缀合物是点击化学反应的反应物部分。
在实施方案中，使用生物缀合物化学反应(即两个生物缀合物反应性基团的结合)形成生物缀合物或生物缀合物接头，生物缀合物化学反应包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)以及对碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德加成)。这些反应和其他有用的反应在例如下述文献中进行了讨论：March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY,3rd Ed.,John Wiley&Sons,纽约,1985；Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic Press,圣地亚哥,1996；以及Feeney et al.,MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series,198卷,American Chemical Society(美国化学会),华盛顿特区,1982。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如马来酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合物反应性基团(例如卤代乙酰基部分)共价连接至第二生物缀合物反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如吡啶基部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如胺)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如马来酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如胺)。
本文中用于生物缀合物化学反应的有用生物缀合物反应性基团包括例如：(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；(b)可以转化成酯、醚、醛等的羟基；(c)卤代烷基，其中随后卤素可用亲核基团(例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子)取代，从而使新基团共价连接于卤原子的位置；(d)能够参与狄尔斯-阿尔德反应的亲二烯体基团，例如马来酰亚胺基或马来酰亚胺基团；(e)醛或酮基，从而通过形成羰基衍生物(例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)或通过例如格氏加成或烷基锂加成的机制可进行随后的衍生化；(f)磺酰卤基团，用于随后与胺反应，例如形成磺酰胺；(g)硫醇基，其可以转化为二硫化物，与酰基卤反应，或与金等金属键合，或与马来酰亚胺反应；(h)胺或巯基(例如存在于半胱氨酸中)，其可以例如酰化、烷基化或氧化；(i)烯烃，其可以经历例如环加成反应、酰化反应、迈克尔加成等；(j)环氧化物，其可与例如胺和羟基化合物反应；(k)亚磷酰胺和用于核酸合成的其他标准官能团；(l)金属硅氧化物结合；和(m)与反应性磷基(例如膦)键合形成例如磷酸二酯键的金属；(n)叠氮化物，其通过铜催化的环加成点击化学与炔烃偶联；(o)生物素缀合物，其可以与抗生物素蛋白或链霉亲和素反应以形成抗生物素蛋白-生物素复合物或链霉亲和素-生物素复合物。
可选择生物缀合物反应性基团，使得它们不参与或干扰本文所述的缀合物的化学稳定性。或者，通过保护基团的存在可以保护反应性官能团免于参与交联反应。在实施方案中，生物缀合物包含衍生自不饱和键(例如马来酰亚胺)和巯基的反应的分子实体。
使用的术语“单磷酸酯”与其在本领域中的普通含义一致，指具有下式的部分：术语“多磷酸酯”是指至少两个磷酸酯基团，具有下式：其中np是1或更大的整数。在实施方案中，np是0-5的整数。在实施方案中，np是0-2的整数。在实施方案中，np是2。
本文所用的术语“碱基”是指可以作为核酸(即DNA或RNA或其衍生物)的组成部分的二价嘌呤或嘧啶化合物或其衍生物。在实施方案中，碱基是天然存在的DNA或RNA碱基的衍生物(例如碱基类似物)。在实施方案中，碱基是杂交碱基。在实施方案中，碱基与互补碱基杂交。在实施方案中，所述碱基能够与互补碱基形成至少一个氢键(例如腺嘌呤与胸腺嘧啶的氢键、腺嘌呤与尿嘧啶的氢键、与胞嘧啶配对的鸟嘌呤)。碱基的非限制性实例包括胞嘧啶或其衍生物(例如胞嘧啶类似物)、鸟嘌呤或其衍生物(例如鸟嘌呤类似物)、腺嘌呤或其衍生物(例如腺嘌呤类似物)、胸腺嘧啶或其衍生物(例如胸腺嘧啶类似物)、尿嘧啶或其衍生物(例如尿嘧啶类似物)、次黄嘌呤或其衍生物(例如次黄嘌呤类似物)、黄嘌呤或其衍生物(例如黄嘌呤类似物)、7-甲基鸟嘌呤或其衍生物(例如7-甲基鸟嘌呤类似物)、脱氮腺嘌呤或其衍生物(例如脱氮腺嘌呤类似物)、脱氮鸟嘌呤或其衍生物(例如脱氮鸟嘌呤类似物)、脱氮次黄嘌呤或其衍生物、5,6-二氢尿嘧啶或其衍生物(例如5,6-二氢尿嘧啶类似物)、5-甲基胞嘧啶或其衍生物(例如5-甲基胞嘧啶类似物)或5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物(例如5-羟甲基胞嘧啶类似物)部分。在实施方案中、所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、可可碱、咖啡因、尿酸或异鸟嘌呤。在实施方案中，碱基为：
所用术语“非共价接头”与其普通含义一致，是指包含彼此不共价连接但通过非共价键相互作用(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)或范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极-诱导偶极、伦敦分散)的至少两个分子的二价部分。
本文所用的术语“锚部分”是指能够与任选不同的第二化学部分(例如互补锚部分结合子)相互作用(例如，共价或非共价)的化学部分。在实施方案中，锚部分是能够与互补的生物缀合物反应性基团(例如，互补的锚部分反应性基团)相互作用(例如，共价地)的生物缀合物反应性基团。在实施方案中，锚部分是点击化学反应的反应物部分。在实施方案中，锚部分(“亲和锚部分”)能够与第二化学部分(例如互补性的亲和锚部分结合子)以非共价的方式相互作用。锚部分的非限制性实例包括生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)和苯基硼酸(PBA)。在实施方案中，亲和锚部分(例如生物素部分)与互补性的亲和锚部分结合子(例如链霉亲和素部分)以非共价的方式相互作用。在实施方案中，锚部分(例如叠氮部分、反式环辛烯(TCO)部分、苯基硼酸(PBA)部分)共价结合互补性的锚部分结合子(例如二苯并环辛炔(DBCO)部分、四嗪(TZ)部分、水杨基异羟肟酸(SHA)部分)。
本文所用的术语“可切割接头”或“可切割部分”分别指能够被分离(例如解离、分解、断开、水解、该部分内的稳定键被断裂)为不同实体的二价部分或一价部分。可切割接头是响应于外部刺激(例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化剂)而可切割的(例如，可特异性切割)。可化学切割的接头是指能够响应于化学物质(例如，酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三-(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、肼(N2H4))而被分解的接头。可化学切割的接头不是可酶切割的。在实施方案中，通过使可切割接头与切割剂接触来切割可切割接头。在实施方案中，切割剂是连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、弱酸、肼(N2H4)、Pd(0)或光照射(例如紫外线照射)。
可光切割的接头(例如，包括邻硝基苄基或由邻硝基苄基组成)是指能够响应于光照射(例如紫外线照射)而被分解的接头。可酸切割的接头是指能够响应于pH变化(例如酸度增加)而被分解的接头。碱可切割的接头是指能够响应于pH变化(例如酸度降低)而被分解的接头。氧化剂可切割的接头是指响应于氧化剂的存在而能够被分解的接头。可还原剂切割的接头是指响应于还原剂(例如，三(3-羟丙基)膦)的存在而能够被分解的接头。在实施方案中，可切割接头是二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头
本文所用的术语“正交可切割接头”指可被两种或更多种不同切割剂的混合物中的第一切割剂(例如酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂、氧化剂)切割且不被该两种或更多种切割剂的混合物中的任何其他不同切割剂切割的可切割接头。例如，当两种不同的可切割接头的混合物与两种不同的切割剂反应时，每种可切割接头仅被一种切割剂切割而不被另一种切割剂切割，则这两种不同的可切割接头都是正交可切割接头。在实施方案中，在正交可切割接头被切割后，两个分离的实体(例如荧光染料、生物缀合物反应性基团)不进一步反应并且也不会形成新的正交可切割接头。
本文所用的术语“正交结合基团”或“正交结合分子”是指能够结合两种或更多种不同的互补结合基团的混合物中的第一互补结合基团(例如，互补性锚部分结合子或锚部分)且不能结合该两种或更多种互补结合基团的混合物中的任何其他不同的互补结合基团的结合基团(例如锚部分或互补锚部分结合子)。例如，当两个不同结合基团的混合物与两个互补结合基团反应时，每个结合基团仅结合一个互补结合基团而不结合另一个互补结合基团，则两个不同的结合基团都是正交结合基团。一组四个正交结合基团和一组正交互补结合基团的实例是：结合基团生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)和苯基硼酸(PBA)，它们分别特异性且有效地结合互补结合基团链霉亲和素、二苯并环辛炔(DBCO)、四嗪(TZ)和水杨基异羟肟酸(SHA)或与它们反应。
本文所用的术语“正交可检测标签”或“正交可检测部分”是指在两种或更多种不同的可检测标签的混合物或实验组(不同样本的集合)中能够被检测和鉴定(例如，通过使用检测手段(例如发射波长、物理特性测量))的可检测标签(例如荧光染料或可检测染料)。例如，当两种不同荧光染料的实验组受到被一种荧光染料吸收而不被另一种荧光染料吸收的一定波长的光照射时，吸收所述光的荧光染料发射光，而其他荧光染料不发射光，则作为荧光染料的两种不同的可检测标签都是正交可检测标签。正交可检测标签可以通过相互比较正交可检测标签的不同吸光度或发射强度而分别鉴定，而不仅仅是通过信号绝对存在或不存在来鉴定。一组四个正交可检测标签的实例是Rox标记的四嗪、Alexa488标记的SHA、Cy5标记的链霉亲和素和R6G标记的二苯并环辛炔的组。
本文所用的术语“聚合酶相容的可切割部分”是指不干扰聚合酶(例如DNA聚合酶、修饰的DNA聚合酶)功能的可切割部分。用于确定本文考虑的聚合酶功能的方法描述于B.Rosenblum et al.(Nucleic Acids Res.1997 Nov 15；25(22):4500–4504)和Z.Zhu etal.(Nucleic Acids Res.1994 Aug 25；22(16):3418–3422)，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。在实施方案中，相对于不存在聚合酶-相容的可切割部分的情况，聚合酶-相容的可切割部分不降低聚合酶的功能。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分不会不利地影响DNA聚合酶识别。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分不会不利地影响(例如，限制)DNA聚合酶的读取长度。聚合酶相容的可切割部分的其他实例可以在下述文献中找到：第6,664,079号美国专利；Ju J.等人(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(52)：19635-19640；Ruparel H.等人(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102(17)：5932-5937；WuJ.等人(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104(104)：16462-16467；Guo J.等人(2008)ProcNatl Acad Sci USA 105(27)：9145-9150；Bentley D.R.等人(2008)Nature 456(7218)：53-59；或Hutter D.等人(2010)Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids 29：879-895，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分包括叠氮基部分或二硫基连接部分。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分是-NH2、-CN、-CH3、C2-C6烯丙基(例如，-CH2-CH＝CH2)、甲氧基烷基(例如，-CH2-O-CH3)或–CH2N3。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分为：
如本文所述的术语“烯丙基”是指与乙烯基(即-CH＝CH2)连接的未取代的亚甲基，其具有式“烯丙基接头”是指二价的与乙烯基连接的未取代亚甲基，具有式
本文所用的术语“聚合酶相容的部分”是指不干扰聚合酶(例如DNA聚合酶，修饰的DNA聚合酶)功能的部分。用于确定本文考虑的聚合酶功能的方法描述于B.Rosenblum etal.(Nucleic Acids Res.1997Nov 15；25(22):4500–4504)和Z.Zhu et al.(NucleicAcids Res.1994Aug 25；22(16):3418–3422)，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。在实施方案中，相对于不存在聚合酶相容的部分的情况，聚合酶相容的部分不降低聚合酶的功能。在实施方案中，聚合酶相容的部分不会不利地影响DNA聚合酶识别。在实施方案中，聚合酶相容的部分不会不利地影响(例如，限制)DNA聚合酶的读取长度。聚合酶相容的部分的其他实例可以在下述文献中找到：第6,664,079号美国专利；Ju J.等人(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(52)：19635-19640；Ruparel H.等人(2005)Proc Natl AcadSci USA 102(17)：5932-5937；Wu J.等人(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104(104)：16462-16467；Guo J.等人(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(27)：9145-9150；BentleyD.R.等人(2008)Nature 456(7218)：53-59；或Hutter D.等人(2010)NucleosidesNucleotides&Nucleic Acids 29：879-895，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。
如本文所用的术语“嗜热核酸聚合酶”是指DNA聚合酶家族(例如，9°NTM)及其突变体，其衍生自最初从在东太平洋海隆(East Pacific Rise)所处纬度的热液喷口中发现的超嗜热古菌，深海嗜热古菌(Thermococcus sp.9° N-7)分离的DNA聚合酶(Southworth MW,et al.PNAS.1996；93(11):5281-5285)。嗜热核酸聚合酶是B族DNA聚合酶的成员。将3'-5'exo基序I(Asp-Ile-Glu)定点诱变为Asp-Ile-Asp导致3'-5'外切核酸酶活性降低至小于野生型的1％，同时保持包括高链置换活性在内的聚合酶的其他特性。随后对关键氨基酸的诱变导致酶的掺入双脱氧核苷酸、核糖核苷酸和无环核苷酸的能力增强(例如具有D141A/E143A/Y409V/A485L突变的购自New England Biolabs的Therminator II酶)；酶的掺入3'-氨基-dNTP、3'-叠氮基-dNTP和其他3'-修饰的核苷酸的能力增强(例如，具有D141A/E143A/L408S/Y409A/P410V突变的NEB Therminator III DNA聚合酶、NEB Therminator IX DNA聚合酶)，或酶的掺入γ-磷酸基团标记的核苷酸的能力增强(例如，Therminatorγ：D141A/E143A/W355A/L408W/R460A/Q461S/K464E/D480V/R484W/A485L)。通常，这些酶不具有5'-3'核酸外切酶活性。关于嗜热核酸聚合酶的其他信息可参见(Southworth MW，et al.，PNAS.1996；93(11)：5281-5285；Bergen K et al.，ChemBioChem.2013；14(9)：1058-1062；Kumar S，et al.Scientific Reports.2012；2：684；Fuller CW，et al。2016；113(19)：5233-5238；Guo J，et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of the States America.2008；105(27)：9145-9150)，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。
如本文所用，术语“引物”定义为与核酸模板特异性杂交的一个或多个核酸片段。取决于它将用于的特定技术，引物可以是任何长度。例如，PCR引物的长度通常为10至40个核苷酸。固定在核酸模板上的核酸的长度和复杂性对本发明并不重要。技术人员可以调整这些因子以为给定的杂交程序提供最佳的杂交和信号生成，并在不同基因或基因组位置之间提供所需的分辨率。
术语“严格杂交条件”是指引物与其靶子序列杂交但不与其他序列杂交的条件，通常在核酸的复杂混合物中。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛的指南参见Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)。通常，严格条件选择为在确定的离子强度pH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm是这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下50％的与靶互补的探针在平衡时与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡时被占据)。加入诸如甲酰胺的去稳定剂也可以获得严格条件。对于选择性杂交或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选是背景杂交的10倍。示例性严格杂交条件可以如下所述：50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，在42℃孵育，或5x SSC，1％SDS，在65℃孵育，在65℃下在0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。
如果核酸编码的多肽基本上相同，则在严格条件下彼此不杂交的所述核酸仍然基本相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸的拷贝时，会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在适度严格杂交条件下杂交。示例性的“适度严格杂交条件”包括在37℃下在含有40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，以及在45℃下在1XSSC中洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。普通技术人员将容易理解，可以利用选择性的杂交条件和洗涤条件来提供类似严格性的条件。用于确定杂交参数的其他指南在许多参考文献中提供，例如，Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等人，同上。
II.组合物
一方面，本发明提供了具有下式的核苷酸类似物：
B为碱基或其类似物。L1为共价接头。L2为共价接头。L4为共价接头。X为键、O、NR6A或S。R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分。R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。R12为互补的亲和锚部分结合子。R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。
在实施方案中，核苷酸类似物具有下式：
其中R3、B、R7、L1、R4A、X、R6、L2和R5如本文所述。在实施方案中，R5为可检测标签或锚部分。
在实施方案中，核苷酸类似物具有下式：
其中R3、B、R7、L1、R4A、X、R6、L2、R5、R12、L4和R13如本文所述。在实施方案中，R5为亲和锚部分。符号“----”是非共价键。
一方面，本发明提供了具有下式的核苷酸类似物：
其中L3为可切割接头；R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸；B为碱基或其类似物；R5为可检测标签或锚部分；R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。
一方面，提供了具有下式的核苷酸类似物：
其中L3为可切割接头；R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸；B为碱基或其类似物；R5为可检测标签或锚部分；R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。L4为共价接头。R12为互补的亲和锚部分结合子。R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。
一方面，提供了包含非嗜热或嗜热聚合酶的核酸聚合酶，其与带有引物的模板和核苷酸类似物形成三元复合物，其中核酸聚合酶与具有下式的核苷酸类似物结合：
其中R3，B，R7，L1，R4A，X，R6，L2，和R5如本文所述，或者
其中R3、B、R7、L1、R4A、R6、L2、R5、R12、L4和R13如本文所述。
在实施方案中，核苷酸类似物具有下式：
其中R3、B、R7、L1、R4A、X、R6、L2和R5如本文所述。在实施方案中，R5为可检测标签或锚部分。在实施方案中，R4A不为氢。在实施方案中，R4B不为氢。在实施方案中，R4A和R4B不为氢。
在实施方案中，核苷酸类似物具有下式：
其中R3、B、R7、L1、R4A、R6、L2、R5、R12、L4和R13如本文所述。在实施方案中，R5为亲和锚部分。符号“----”是非共价键。在实施方案中，R4A不为氢。在实施方案中，R6不为氢。在实施方案中，R4A和R6不为氢。
一方面，提供了核酸聚合酶(例如，嗜热的，9°N及其突变体，Phi29及其突变体)复合物，其中嗜热核酸聚合酶与具有下式的核苷酸类似物结合：
B为碱基或其类似物。L1为共价接头。L2为共价接头。L4为共价接头。R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R4B为氢、-OH、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-X-R6、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。X为键、O、NR6A或S。R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分。R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。R12为互补的亲和锚部分结合子。R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。
一方面，提供了嗜热核酸聚合酶复合物，其中嗜热核酸聚合酶与具有下式的核苷酸类似物结合：
B为碱基或其类似物。L1为共价接头。L2为共价接头。L4为共价接头。R3是-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R4B为氢、-OH、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-X-R6、取代或未取代烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。X为键、O、NR6A或S。R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分。R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。R12为互补的亲和锚部分结合子。R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。
在实施方案中，嗜热核酸聚合酶与具有下式的核苷酸类似物结合：
其中R3，B、R7、L1、R4A、R4B、L2和R5如本文所述。在实施方案中，R5为可检测标签或锚部分。
在实施方案中，嗜热核酸聚合酶与具有下式的核苷酸类似物结合：
其中R3、B、R7、L1、R4A、R4B、L2、R5、R12、L4和R13如本文所述。在实施方案中，R5为亲和锚部分。符号“----”是非共价键。
另一方面，提供了嗜热核酸聚合酶复合物(例如，9°N核酸聚合酶复合物)，其中嗜热核酸聚合酶与核苷酸类似物结合，其中核苷酸类似物包括具有分子量为至少约140道尔顿的荧光染料，其中荧光染料在核苷酸类似物的3'位共价结合。在实施方案中，荧光染料通过接头(例如-S(O)2-、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-NHC(O)NH-、-C(O)O-、-OC(O)、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基，取代或未取代的杂环亚烷基，取代或未取代的亚芳基，或者取代或未取代的杂亚芳基)在核苷酸类似物的3′位共价结合。
在实施方案中，B为胞嘧啶或其衍生物、鸟嘌呤或其衍生物、腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、尿嘧啶或其衍生物、次黄嘌呤或其衍生物、黄嘌呤或其衍生物、脱氮腺嘌呤或其衍生物、脱氮鸟嘌呤或其衍生物、脱氮次黄嘌呤或其衍生物、7-甲基鸟嘌呤或其衍生物、5,6-二氢尿嘧啶或其衍生物、5-甲基胞嘧啶或其衍生物或者5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物。
在实施方案中，B为胞嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B为鸟嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为腺嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为胸腺嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B为尿嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B为次黄嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为黄嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为脱氮腺嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为脱氮鸟嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为脱氮次黄嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为7-甲基鸟嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B为5,6-二氢尿嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B为5-甲基胞嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B为5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物。
在实施方案中，B为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、脱氮腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、脱氮次黄嘌呤或其衍生物、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在实施方案中，B为胞嘧啶。在实施方案中，B为鸟嘌呤。在实施方案中，B为腺嘌呤。在实施方案中，B为胸腺嘧啶。在实施方案中，B为尿嘧啶。在实施方案中，B为次黄嘌呤。在实施方案中，B为黄嘌呤。在实施方案中，B为脱氮腺嘌呤。在实施方案中，B为脱氮鸟嘌呤。在实施方案中，B为脱氮次黄嘌呤。在实施方案中，B为7-甲基鸟嘌呤。在实施方案中，B为5,6-二氢尿嘧啶。在实施方案中，B为5-甲基胞嘧啶。在实施方案中，B为5-羟甲基胞嘧啶。
在实施方案中，B为 在实施方案中，B为在实施方案中，B为在实施方案中，B为在实施方案中，B为在实施方案中，B为在实施方案中，B为在实施方案中，B为
在实施方案中，L1为L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1为取代或未取代的亚甲基，其中L1被取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2至6元杂亚烷基、取代或未取代的C3-C6环亚烷基、取代或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂亚芳基取代。在实施方案中，L1为键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元杂亚烷基、取代或未取代的C3-C6环亚烷基、取代或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂亚芳基。
在实施方案中，L1为取代或未取代的亚甲基，其中L1被取代或未取代的C1-C6亚烷基或者取代或未取代的2-6元杂亚烷基取代。在实施方案中，L1为取代或未取代的C1-C6亚烷基或者取代或未取代的2-6元杂亚烷基。在实施方案中，L1为取代或未取代的亚甲基，其中L1被取代或未取代的C1-C6亚烷基取代。在实施方案中，L1为未取代的亚甲基。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元杂亚芳基；其中，L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂亚芳基；其中，L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L1为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元杂亚芳基。
在实施方案中，L1为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂亚芳基。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烯基(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚烯基；其中，L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烯基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元杂亚烯基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烯基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂亚烯基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烯基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚烯基。在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C8亚烯基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元杂亚烯基。在实施方案中，L1为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C6亚烯基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂亚烯基。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚炔基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚炔基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚炔基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元杂亚炔基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚炔基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂亚炔基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚炔基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂亚炔基。在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C8亚炔基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元杂亚炔基。在实施方案中，L1为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C6亚炔基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂亚炔基。
在实施方案中，L1为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6亚烃基(例如亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、亚烯基或亚炔基)、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。在实施方案中，L1是未取代的C1-C4亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)。在实施方案中，L1未被可切割部分取代。在实施方案中，L1未被单价可切割部分取代。
在实施方案中，L1是聚合物。在实施方案中，L2是聚合物。在实施方案中，L2包括聚合物。在实施方案中，L2包括PEG。在实施方案中，L4是聚合物。在实施方案中，L4包括聚合物。在实施方案中，L4包括PEG。术语“聚合物”是指包括重复的子单元(例如聚合单体)的分子。例如，聚合物分子可以基于聚乙二醇(PEG)、四聚乙二醇(TEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(二甲苯)或聚(对二甲苯)。使用的术语“可聚合单体”与其在聚合物化学领域中的含义一致，是指可以与其他单体分子(例如相同或不同的其他可聚合单体)化学共价结合以形成聚合物的化合物。
在实施方案中，L2是可切割接头。在实施方案中，L2是不可切割接头。在实施方案中，L2是可化学切割的接头。在实施方案中，L2是可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L2是可切割接头，包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头或硝基苄基接头。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代的或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元杂亚烷基、取代或未取代的C3-C20环亚烷基、取代或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基、或取代或未取代的5-20元杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C10亚烷基，取代或未取代的2-10元杂亚烷基，取代或未取代的C3-C8环亚烷基，取代或未取代的3-8元杂环亚烷基，取代或未取代的C6-C10亚芳基，或取代或未取代的5-10元杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元杂亚烷基、取代或未取代的C3-C6环亚烷基、取代或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代或未取代的苯基、或取代或未取代的5-6元杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基；L2B为键、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基；L2C为键、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基；L2D为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基；L2E为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L2为键、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元杂亚烷基、取代或未取代的C3-C20环亚烷基、取代或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元杂亚芳基。
在实施方案中，L2为键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元杂亚烷基、取代或未取代的C3-C8环亚烷基、取代或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基、或者取代或未取代的5-10元杂亚芳基。
在实施方案中，L2为键，取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元杂亚烷基、取代或未取代的C3-C6环亚烷基、取代或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代或未取代的苯基、或取代或未取代的5-6元杂亚芳基。
在实施方案中，L2为取代或未取代的4-10元杂亚烷基。在实施方案中，L2为取代或未取代的4-8元杂亚烷基。
在实施方案中，L2为其中R5如本文所述。在实施方案中，L2为其中R5如本文所述。在实施方案中，L2为其中R5如本文所述，ne是0-20的整数。
在实施方案中，L2为其中R5如本文所述。在实施方案中，L2为其中R5如本文所述。在实施方案中，L2为其中R5如本文所述，ne是0-20的整数。
在实施方案中，ne是0-18的整数。在实施方案中，ne是0-12的整数。在实施方案中，ne是0-10的整数。在实施方案中，ne是0-8的整数。在实施方案中，ne是1-18的整数。在实施方案中，ne是1-12的整数。在实施方案中，ne是1-10的整数。在实施方案中，ne是1-10的整数。在实施方案中，ne是1-4的整数。在实施方案中，ne是2-18的整数。在实施方案中，ne是2-12的整数。在实施方案中，ne是1-4的整数。在实施方案中，ne是2-8的整数。在实施方案中，ne是0-4的整数。在实施方案中，ne是0。在实施方案中，ne是1。在实施方案中，ne是2。在实施方案中，ne是3。在实施方案中，ne是4。在实施方案中，ne是5。在实施方案中，ne是6。在实施方案中，ne是7。在实施方案中，ne是8。在实施方案中，ne是9。在实施方案中，ne是10。在实施方案中，ne是11。在实施方案中，ne是12。在实施例中，ne是13。在实施方案中，ne是14。在实施方案中，ne是15。在实施方案中，ne是16。在实施方案中，ne是17。在实施方案中，ne是18。在实施方案中，ne是19。在实施方案中，ne是20。
在实施方案中，L2为-C(CH3)2CH2NHC(O)-。在实施方案中，L2为
在实施方案中，L2包括
在实施方案中，L2是可切割接头。在实施方案中，L2是可化学切割的接头。在实施方案中，L2是可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L2是可光切割的接头。在实施方案中，L2是可酸切割的接头。在实施方案中，L2是可碱切割的接头。在实施方案中，L2是可氧化剂切割的接头。在实施方案中，L2是可还原剂切割的接头。在实施方案中，L2是可氟化物切割的接头。
在实施方案中，L2包括可切割接头。在实施方案中，L2包括可化学切割的接头。在实施方案中，L2包括可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L2包括可光切割的接头。在实施方案中，L2包括可酸切割的接头。在实施方案中，L2包括碱可切割的接头。在实施方案中，L2包括可氧化剂切割的接头。在实施方案中，L2包括可还原剂切割的接头。在实施方案中，L2包括可氟化物切割的接头。
在实施方案中，L2是可切割接头，包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头或硝基苄基接头。在实施方案中，L2是包括二烷基缩酮接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括偶氮接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括烯丙基接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括氰乙基接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括硝基苄基接头的可切割接头。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基，尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-20元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C20环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C20亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-20元杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C10亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-10元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C10亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-10元杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基、或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的的3-6元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。L2B为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；L2C为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；L2D为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)；L2E为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基。在实施方案中，L2为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-20元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C20环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C20亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-20元杂亚芳基。在实施方案中，L2为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-8元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C10亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-10元亚杂芳基。在实施方案中，L2为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂亚芳基。
在实施方案中，L2为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的4-10元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。在实施方案中，L2为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的4-8元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。在实施方案中，L2为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的4-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。
在实施方案中，L2是正交可切割接头或非共价接头。在实施方案中，L2包括正交可切割接头或非共价接头。在实施方案中，L2是正交可切割接头。在实施方案中，L2是非共价接头。
在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为
在实施方案中，-L2-为其中z是0-10的整数。在实施方案中，z是1-8的整数。在实施方案中，z是2-4的整数。在实施方案中，z是0。在实施方案中，z是1。在实施方案中，z是2。在实施方案中，z是3。在实施方案中，z是4。在实施方案中，z是5。在实施方案中，z是6。在实施方案中，z是7。在实施方案中，z是8。在实施方案中，z是9。在实施方案中，z是10。
在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为在实施方案中，L2A、L2B、L2C、L2D和L2E各自独立地为
在实施方案中，-L2-R5为
；z为0-10的整数。
在实施方案中、-L2-R5为
z为0-10的整数。
在实施方案中，-L2-R5为在实施方案中，-L2-R5为在实施方案中，-L2-R5为在实施方案中，-L2-R5为在实施方案中，-L2-R5为在实施方案中，-L2-R5为
在实施方案中，-L2-R5为
在实施方案中，-L2-R5为其中z是0-10的整数。在实施方案中，z是1-8的整数。在实施方案中，z是2-4的整数。在实施方案中，z是0。在实施方案中，z是1。在实施方案中，z是2。在实施方案中，z是3。在实施方案中，z是4。在实施方案中，z是5。在实施方案中，z是6。在实施方案中，z是7。在实施方案中，z是8。在实施方案中，z是9。在实施方案中，z是10。在实施方案中，-L2-R5为在实施方案中，-L2-R5为在实施方案中，-L2-R5为
在实施方案中，-L2-R5为
在实施方案中，-L2-R5为
在实施方案中，L3为其中L1为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基，取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基。L2为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基、可切割接头、正交可切割接头、非共价接头、或-L2A-L2B-L2C-L2D-，其中L2A为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。L2B为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基。L2C为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基。L2D为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如，杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)，其中L2A、L2B、L2C、L2D中的至少一个不是键。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。X为键、O、NR6A或S。
在实施方案中，L3为其中L1、R4A、X、R6和L2如本文所示。在实施方案中，L3为其中L2如本文所示。在实施方案中，L3为其中L2如本文所示。
在实施方案中，L4是正交可切割接头。在实施方案中，L4是可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L4是可切割接头、包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头、或硝基苄基接头。
在实施方案中，L4为L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；L4A、L4B、L4C、L4D、和L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；其中L4A，L4B，L4C，L4D，和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4为L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；L4A为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基；L4B为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基；L4C为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基；L4D为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基；L4E为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4A为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L4为取代或未取代的3-10元杂亚烷基。
在实施方案中，L4是正交可切割接头。在实施方案中，L4是可切割接头。在实施方案中，L4是可化学切割的接头。在实施方案中，L4是可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L4是可光切割的接头。在实施方案中，L4是可酸切割的接头。在实施方案中，L4是可碱切割的接头。在实施方案中，L4是可氧化剂切割的接头。在实施方案中，L4是可还原剂切割的接头。在实施方案中，L4是可氟化物切割的接头。在实施方案中，L4是可切割接头，包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头或硝基苄基接头。在实施方案中，L4是包括二烷基缩酮接头的可切割接头。在实施方案中，L4是偶氮接头。在实施方案中，L4是烯丙基接头。在实施方案中，L4是氰乙基接头。在实施方案中，L4是1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头或硝基苄基接头。
在实施方案中，L4包括正交可切割接头。在实施方案中，L4包括可切割接头。在实施方案中，L4包括可化学切割的接头。在实施方案中，L4包括可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L4包括可光切割的接头。在实施方案中，L4包括可酸切割的接头。在实施方案中，L4包括可碱切割的接头。在实施方案中，L4包括可氧化剂切割的接头。在实施方案中，L4包括可还原剂切割的接头。在实施方案中，L4包括可氟化物切割的接头。在实施方案中，L4包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头、或硝基苄基接头。在实施方案中，L4包括二烷基缩酮接头。在实施方案中，L4包括偶氮接头。在实施方案中，L4包括烯丙基接头。在实施方案中，L4包括氰乙基接头。在实施方案中，L4包括1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头。在实施方案中，L4包括硝基苄基接头。
在实施方案中，L4为L4A-L4B-L4C-L4D-L4E。L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4为L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-20元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C20环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C20亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-20元杂亚芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4为L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C10亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-10元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C10亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-10元杂亚芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4为L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂亚芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4为L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；其中L4A为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)；L4B为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；L4C为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；L4D为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)；L4E为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L4为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-20元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C20环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C20亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-20元杂亚芳基。
在实施方案中，L4为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-8元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C10亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-10元杂亚芳基。
在实施方案中，L4为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂亚芳基。
在实施方案中，L4为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-10元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。在实施方案中，L4为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。在实施方案中，L4为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。
在实施方案中，L4z是正交可切割接头。在实施方案中，L4z是可切割接头。在实施方案中，L4z是可化学切割的接头。在实施方案中，L4z是可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L4z是可光切割的接头。在实施方案中，L4z是可酸切割的接头。在实施方案中，L4z是可碱切割的接头。在实施方案中，L4z是可氧化剂切割的接头。在实施方案中，L4z是可还原剂切割的接头。在实施方案中，L4z是可切割接头，包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头或硝基苄基接头。
在实施方案中，L4z包括正交可切割接头。在实施方案中，L4z包括可切割接头。在实施方案中，L4z包括可化学切割的接头。在实施方案中，L4z包括可光切割的接头、可酸切割的接头、可碱切割的接头、可氧化剂切割的接头、可还原剂切割的接头或可氟化物切割的接头。在实施方案中，L4z包括可光切割的接头。在实施方案中，L4z包括可酸切割的接头。在实施方案中，L4z包括可碱切割的接头。在实施方案中，L4z包括可氧化剂切割的接头。在实施方案中，L4z包括可还原剂切割的接头。在实施方案中，L4z包括可切割接头，其包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基接头或硝基苄基接头。
在实施方案中，L4z为L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE。L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z为L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-20元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C20环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C20亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-20元杂亚芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z为L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C10亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-10元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C10亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-10元杂亚芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z为L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂亚芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD、和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z为L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；其中L4zA为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)；L4zB为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；L4zC为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；L4zD为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如亚烷基，亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)；L4zE为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L4z为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-20元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C20环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-20元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C20亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-20元杂亚芳基。
在实施方案中，L4z为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-8元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C8环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C6-C10亚芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-10元杂亚芳基。
在实施方案中，L4z为键、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环亚烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂亚芳基。
在实施方案中，L4z为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-10元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。在实施方案中，L4z为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-8元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。在实施方案中，L4z为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂亚烷基(例如杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基)。
在实施方案中，L4为-C(CH3)2CH2NHC(O)-、
在实施方案中，X为O、NR6A或S。在实施方案中，X为键。在实施方案中，X为O。在实施方案中，X为NR6A。在实施方案中，X为NH。在实施方案中，X为S。在实施方案中，X为O、NH或S。在实施方案中，X不是键。
在实施方案中，R3为-OH、单磷酸酯或多磷酸酯。在实施方案中，R3为-OH。在实施方案中，R3为单磷酸酯。在实施方案中，R3为多磷酸酯。在实施方案中，R3为二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯。在实施方案中，R3为二磷酸酯。在实施方案中，R3为三磷酸酯。在实施方案中，R3为四磷酸酯。在实施方案中，R3为五磷酸酯。在实施方案中，R3为六磷酸酯。在实施方案中，R3为三磷酸酯或更高级的多磷酸酯(例如，四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯)。
在实施方案中，R4A为氢、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的杂烷基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的C1-C6烷基、或者取代或未取代的2-6元杂烷基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R4A为未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R4A为未取代的甲基。
在实施方案中，R4A为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4A为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-OH、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R4A为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-OH、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R4A为氢。在实施方案中，当X为键时，R4A不为氢。在实施方案中，当X为键时，R4B不为氢。在实施方案中，当X为键时，R4A和R4B不为氢。
在实施方案中，R4A为氢、-CH3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4A为氢、-CH3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph，取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4A为氢、-CH3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基。在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)烷基。在实施方案中，R4A为未取代的烷基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在实施方案中，R4A为取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在实施方案中，R4A为未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。
在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基。在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂烷基。在实施方案中，R4A为未取代的杂烷基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。在实施方案中，R4A为取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。在实施方案中，R4A为未取代的杂烷基(例如、2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。
在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基。在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)环烷基。在实施方案中，R4A为未取代的环烷基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。在实施方案中，R4A为取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。在实施方案中，R4A为未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。
在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基。在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂环烷基。在实施方案中，R4A为未取代的杂环烷基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。在实施方案中，R4A为取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。在实施方案中，R4A为未取代的杂环烷基(例如、3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。
在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基。在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)芳基。在实施方案中，R4A为未取代的芳基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。在实施方案中，R4A为取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。在实施方案中，R4A为未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。
在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R4A为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂芳基。在实施方案中，R4A为未取代的杂芳基。在实施方案中，R4A为取代或未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。在实施方案中，R4A为取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。在实施方案中，R4A为未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。
在实施方案中，R4B为氢、-OH、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，R4B为-X-R6。在实施方案中，R4B为氢。
在实施方案中，R4B为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的杂烷基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的C1-C6烷基、或者取代或未取代的2-6元杂烷基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R4B为未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R4B为未取代的甲基。
在实施方案中，R4B为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、OH、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R4B为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、OH、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R4B为氢。
在实施方案中，R4B为氢、-CH3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4B为氢、-CH3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4B为氢、-CH3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2至6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基。在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)烷基。在实施方案中，R4B为未取代的烷基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在实施方案中，R4B为取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在实施方案中，R4B为未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。
在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基。在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂烷基。在实施方案中，R4B为未取代的杂烷基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。在实施方案中，R4B为取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。在实施方案中，R4B为未取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。
在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基。在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)环烷基。在实施方案中，R4B为未取代的环烷基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。在实施方案中，R4B为取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。在实施方案中，R4B为未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。
在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基。在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂环烷基。在实施方案中，R4B为未取代的杂环烷基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。在实施方案中，R4B为取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。在实施方案中，R4B为未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。
在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基。在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)芳基。在实施方案中，R4B为未取代的芳基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。在实施方案中，R4B为取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。在实施方案中，R4B为未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。
在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R4B为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂芳基。在实施方案中，R4B为未取代的杂芳基。在实施方案中，R4B为取代或未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。在实施方案中，R4B为取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。在实施方案中，R4B为未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。
在实施方案中，R5为可检测标签。在实施方案中，R5为荧光染料。
在实施方案中，R5为生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)或苯基硼酸(PBA)。在实施方案中，R5为生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)、苯基硼酸(PBA)、四环庚烷或降冰片烯。
在实施方案中，R5是分子量为至少约130道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为至少约135道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为至少约140道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为至少约145道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为至少约150道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约130道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约135道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约145道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约150道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约146道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R5是分子量为约140至约3000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约2500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约2000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约1000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约900道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约800道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约700道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约600道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约400道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约300道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约140至约200道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R5是分子量为约200至约3000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约2500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约2000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约1000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约900道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约800道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约700道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约600道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约400道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约200至约300道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R5是分子量为约300至约3000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约2500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约2000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约1000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约900道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约800道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约700道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约600道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R5是分子量为约300至约400道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R5是分子量为约140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2810、2820、2830、2840、2850、2860、2870、2880、2890、2900、2910、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990或约3000道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R5为
在实施方案中，R5是可检测标签。在实施方案中，R5是荧光染料。在实施方案中，R5是锚部分。在实施方案中，R5是点击化学反应的反应物部分。在实施方案中，R5是反式环辛烯部分或叠氮化物部分。在实施方案中，R5是亲和锚部分。在实施方案中，R5是生物素部分。在实施方案中，R5是用于生物缀合物反应的反应物，该生物缀合物反应在R5和第二生物缀合物反应的反应物之间形成共价键。
在实施方案中，R5是荧光染料。在实施方案中，R5是Alexa350部分、Alexa405部分、Alexa430部分、Alexa488部分、Alexa532部分、Alexa546部分、Alexa555部分、Alexa568部分、594部分、610部分、633部分、635部分、647部分、660部分、680部分、700部分、750部分或790部分。在实施方案中，可检测部分是Alexa488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分或Cy5部分。
在实施方案中，R5是FAMTM部分、TETTM部分、JOETM部分、部分、HEXTM部分、NEDTM部分、部分、ROXTM部分、TAMRATM部分、TETTM部分、Texas部分、Alexa488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。在实施方案中、R5是罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。
在实施方案中，R5是FAMTM部分。在实施方案中，R5是TETTM部分。在实施方案中，R5是JOETM部分。在实施方案中，R5是部分。在实施方案中，R5是HEXTM部分。在实施方案中，R5是NEDTM部分。在实施方案中，R5是部分。在实施方案中，R5是ROXTM部分。在实施方案中，R5是TAMRATM部分。在实施方案中，R5是TETTM部分。在实施方案中，R5是Texas部分。在实施方案中，R5是Alexa488部分。在实施方案中，R5是罗丹明6G(R6G)部分。在实施方案中，R5是ROX Reference Dye(ROX)部分。在实施方案中，R5是Sulfo-Cy5。在实施方案中，R5是Cy5部分。
在实施方案中，R5是生物素部分。在实施方案中，R5是生物素部分，并且R12是链霉亲和素部分。
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是-N3。在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是未取代的乙炔基、
在实施方案中，R5是未取代的乙炔基、在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是修饰的寡核苷酸。在实施方案中，R5是如Kumar et alScientific Reports(2012)2,684；Fuller et al,PNAS USA(2016)113,5233-5238；美国专利申请US20150368710中所述的修饰的寡核苷酸，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。在实施方案中，R5是如实施例3中所观察到的修饰的寡核苷酸。在实施方案中，R5是如图40和图43-46中所示的修饰的寡核苷酸。
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
其中j1、j2和j3独立地为0-30的整数。
在实施方案中，R5是其中j1、j2和j3独立地为0-30的整数。
在实施方案中，R5是：
其中j1为0-30的整数。
在实施方案中，R5是其中j1、j2，和j3独立地为0-30的整数。
在实施方案中，R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的杂烷基。在实施方案中，R6为取代或未取代的C1-C6烷基、或者取代或未取代的2-6元杂烷基。在实施方案中，R6为取代或未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R6为未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R6为未取代的甲基。在实施方案中，R6为氢。在实施方案中，R6为-CF3。在实施方案中，R6为-CCl3。在实施方案中，R6为-CBr3。在实施方案中，R6为-CI3。在实施方案中，R6为-CHF2。在实施方案中，R6为-CHCl2。在实施方案中，R6为-CHBr2。在实施方案中，R6为-CHI2。在实施方案中，R6为-CH2F。在实施方案中，R6为-CH2Cl。在实施方案中，R6为-CH2Br。在实施方案中，R6为-CH2I。在实施方案中，R6为-CN。
在实施方案中，R6为氢、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R6为氢、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R6为氢。
在实施方案中，R6为氢、-CH3、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R6为氢、-CH3、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R6为氢、-CH3、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基。在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)烷基。在实施方案中，R6为未取代的烷基。在实施方案中，R6为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在实施方案中，R6为取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在实施方案中，R6为未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。
在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基。在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂烷基。在实施方案中，R6为未取代的杂烷基。在实施方案中，R6为取代或未取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。在实施方案中，R6为取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。在实施方案中，R6为未取代的杂烷基(例如，2-8元、2-6元、4-6元、2-3元或4-5元)。
在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基。在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)环烷基。在实施方案中，R6为未取代的环烷基。在实施方案中，R6为取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。在实施方案中，R6为取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。在实施方案中，R6为未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)。
在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基。在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂环烷基。在实施方案中，R6为未取代的杂环烷基。在实施方案中，R6为取代或未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。在实施方案中，R6为取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。在实施方案中，R6为未取代的杂环烷基(例如，3-8元、3-6元、4-6元、4-5元或5-6元)。
在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基。在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)芳基。在实施方案中，R6为未取代的芳基。在实施方案中，R6为取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。在实施方案中，R6为取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。在实施方案中，R6为未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)。
在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R6为取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)杂芳基。在实施方案中，R6为未取代的杂芳基。在实施方案中，R6为取代或未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。在实施方案中，R6为取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。在实施方案中，R6为未取代的杂芳基(例如，5-10元、5-9元或5-6元)。
在实施方案中，R6A为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的杂烷基。在实施方案中，R6A为取代或未取代的C1-C6烷基，或者取代或未取代的2-6元杂烷基。在实施方案中，R6A为取代或未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R6A为未取代的C1-C6烷基。在实施方案中，R6A为未取代的甲基。在实施方案中，R6A为氢。在实施方案中，R6A为-OH。
在实施方案中，R6A为氢、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-OH、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R6A为氢、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-OH、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R6A为氢。
在实施方案中，R6A为氢、-CH3、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph，取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R6A为氢、-CH3、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R6A为氢、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R7为氢。在实施方案中，R7为-OH。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为氢。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的部分。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分。
在实施方案中，R7为-OR7A；R7A是包括叠氮基部分的聚合酶相容的部分。
在实施方案中，R7为-OR7A；R7A是包括二硫醇接头、烯丙基、偶氮基或2-硝基苄基的聚合酶相容的部分。
在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A是包括叠氮基部分的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A是包括二硫醇接头、烯丙基、偶氮基或2-硝基苄基的聚合酶相容的可切割部分。
在实施方案中，R7A为氢、聚合酶相容的部分或聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7A为氢。在实施方案中，R7A为聚合酶相容的部分。在实施方案中，R7A为聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7A是包括叠氮基部分的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7A是包括二硫醇接头、烯丙基、偶氮基或2-硝基苄基的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7A是包括二硫醇接头的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7A是包括烯丙基的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7A是包括偶氮基的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7A是包括2-硝基苄基的聚合酶相容的可切割部分。
在实施方案中，R7为氢。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为氢。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A是包括叠氮基部分的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A是包括二硫醇接头的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分；聚合酶相容的可切割部分为-CH2N3。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A是包括二硫醇接头、烯丙基、或2-硝基苄基的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7为-NH2、-CH2N3、或-CH2-O-CH3。
在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分；聚合酶相容的可切割部分为：在实施方案中，R7A为R8C为氢、-CX8C 3、-CHX8C 2、-CH2X8C、-OCX8C 3、-OCH2X8C、-OCHX8C 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。符号X8C独立地为卤素。在实施方案中，R8C独立地为未取代的苯基。在实施方案中，R8C为-CX8C 3、-CHX8C 2、-CH2X8C、-CH2OCX8C 3、-CH2OCH2X8C、-CH2OCHX8C 2、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8A独立地为氢、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CH2OCX8C 3、-CH2OCH2X8C、-CH2OCHX8C 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R8A独立地为氢、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R8A独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。在实施方案中，R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。在实施方案中，R8A独立地为氢、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
R8B独立地为氢、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R8B独立地为氢、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基，取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R8B独立地为氢、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8A独立地为氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph，取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph，取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8A和R8B独立地为氢或未取代的烷基。在实施方案中，R8A和R8B独立地为氢或未取代的C1-C4烷基。在实施方案中，R8A和R8B独立地为氢。
在实施方案中，R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN，取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基；R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。在实施方案中，R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的烷基或未取代的杂烷基。在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的甲基或未取代的甲氧基。在实施方案中，R8A、R8B、R9、R10和R11独立地为氢或未取代的甲基。在实施方案中，R8A和R8B为氢，R9、R10和R11为未取代的甲基。
在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分；聚合酶相容的可切割部分为：其中R8A为氢、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基；R8B独立地为氢、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基；R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基；R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基；R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C1-C6烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的2-6元杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的C3-C6环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的3-6元杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的苯基、或取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的5-6元杂芳基；X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分；聚合酶相容的可切割部分为：其中R8A、R8B、R9、R10和R11独立地为氢或未取代的甲基。在实施方案中，R7为-OR7A；R7A为聚合酶相容的可切割部分；聚合酶相容的可切割部分为：
在实施方案中，R7A为氢。在实施方案中，R7A为在实施方案中，R7A为在实施方案中，R7A为
在实施方案中，R8A独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R8A独立地为氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8A独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
在实施方案中，R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R8B为氢，-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8B独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
在实施方案中，-CR9R10R11为未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
在实施方案中，R9独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、或-Ph。在实施方案中，R9为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R10独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、或-Ph。R10为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R11独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、或-Ph。在实施方案中，R11为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基、取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的芳基、或者取代的(例如，被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R12选自： 链霉亲和素部分或
在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为链霉亲和素部分。在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为链霉亲和素、二苯并环辛炔(DBCO)、四嗪(TZ)或水杨基异羟肟酸(SHA)。
在实施方案中，R12为未取代的乙炔基、
在实施方案中，R12为未取代的乙炔基。在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为在实施方案中，R12为链霉亲和素、二苄基环辛烯(dibenzylcyclooctene(DBCO))、四嗪、水杨基羟肟酸(salicylhydroxamic acid(SHA))、双(二硫代苯偶酰)镍(II)、或氧化腈。
在实施方案中，R13为荧光染料。在实施方案中，R13为Alexa350部分、Alexa405部分、Alexa430部分、Alexa488部分、Alexa532部分、Alexa546部分、Alexa555部分、568部分、594部分、610部分、633部分、635部分、647部分、660部分、680部分、700部分、750部分、或790部分。在实施方案中，可检测部分是Alexa488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分或Cy5部分。
在实施方案中，R13是FAMTM部分、TETTM部分、JOETM部分、部分、HEXTM部分、NEDTM部分、部分、ROXTM部分、TAMRATM部分、TETTM部分、Texas部分、Alexa488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。在实施方案中，R13是罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。
在实施方案中，R13是可检测标签。在实施方案中，R13是荧光染料。
在实施方案中，R13是分子量为至少约130道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为至少约135道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为至少约140道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为至少约145道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为至少约150道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约130道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约135道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约145道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约150道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约146道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R13是分子量为约140-约3000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约2500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约2000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约1000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约900道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约800道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约700道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约600道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约400道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约300道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约140-约200道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R13是分子量为约200-约3000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约2500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约2000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约1000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约900道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约800道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约700道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约600道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约400道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约200-约300道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R13是分子量为约300-约3000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约2500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约2000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约1000道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约900道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约800道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约700道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约600道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约500道尔顿的荧光染料。在实施方案中，R13是分子量为约300-约400道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R13是分子量为约100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2810、2820、2830、2840、2850、2860、2870、2880、2890、2900、2910、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990、或约3000道尔顿的荧光染料。
在实施方案中，R13为
在实施方案中，R13是可检测标签。在实施方案中，R13是荧光染料。在实施方案中，R13是锚部分。在实施方案中，R13是点击化学反应的反应物部分。在实施方案中，R13是反式环辛烯部分或叠氮部分。在实施方案中，R13是亲和锚部分。在实施方案中，R13是生物素部分。在实施方案中，R13是用于生物缀合物反应的反应物，生物缀合物反应在R13和第二生物缀合物反应的反应物之间形成共价键。
在实施方案中，R13是FAMTM部分。在实施方案中，R13是TETTM部分。在实施方案中，R13是JOETM部分。在实施方案中，R13是部分。在实施方案中，R13是HEXTM部分。在实施方案中，R13是NEDTM部分。在实施方案中，R13是部分。在实施方案中，R13是ROXTM部分。在实施方案中，R13是TAMRATM部分。在实施方案中，R13是TETTM部分。在实施方案中，R13是Texas部分。在实施方案中，R13是Alexa488部分。在实施方案中，R13是罗丹明6G(R6G)部分。在实施方案中，R13是ROX Reference Dye(ROX)部分。在实施方案中，R13是Sulfo-Cy5。在实施方案中，R13是Cy5部分。
在实施方案中，R13为
在实施方案中，R13为
在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为-N3。在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为
在实施方案中，R13是修饰的寡核苷酸。在实施方案中，R13是如Kumar et alScientific Reports(2012)2,684；Fuller et al,PNAS USA(2016)113,5233-5238；美国专利申请US20150368710中所述的修饰的寡核苷酸，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。在实施方案中，R13是如实施例3中所观察到的修饰的寡核苷酸。在实施方案中，R13是如图40和图43-46中所示的修饰的寡核苷酸。
在实施方案中，R13为
在实施方案中，R13为
在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为在实施方案中，R13为
在实施方案中，R13为
其中j1、j2和j3独立地为0-30的整数。
在实施方案中，R13为
其中j1、j2和j3独立地为0-30的整数。
在实施方案中，R13为：
其中j1为0-30的整数。
在实施方案中，R13为
其中j1、j2和j3独立地为0-30的整数。
在实施例中，j1为10-30的整数。在实施例中，j1为15-30的整数。在实施例中，j1为10-30的整数。在实施例中，j1为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。在实施方案中，j2为10-30的整数。在实施方案中，j2为15-30的整数。在实施方案中，j2为10-30的整数。在实施方案中，j2为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在实施方案中，j3为10-30的整数。在实施方案中，j3为15-30的整数。在实施方案中，j3为10-30的整数。在实施方案中，j3为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。。
在实施方案中，X3独立地为-F。在实施方案中，X3独立地为-Cl。在实施方案中，X3独立地为-Br。在实施方案中，X3独立地为-I。在实施方案中，X4独立地为-F。在实施方案中，X4独立地为-Cl。在实施方案中，X4独立地为-Br。在实施方案中，X4独立地为-I。在实施方案中，X5独立地为-F。在实施方案中，X5独立地为-Cl。在实施方案中，X5独立地为-Br。在实施方案中，X5独立地为-I。在实施方案中，X6独立地为-F。在实施方案中，X6独立地为-Cl。在实施方案中，X6独立地为-Br。在实施方案中，X6独立地为-I。在实施方案中，X7独立地为-F。在实施方案中，X7独立地为-Cl。在实施方案中，X7独立地为-Br。在实施方案中，X7独立地为-I。在实施方案中，X8C独立地为-F。在实施方案中，X8C独立地为-Cl。在实施方案中，X8C独立地为-Br。在实施方案中，X8C独立地为-I。
在实施方案中，z为0-20的整数。在实施方案中，z为0-10的整数。在实施方案中，z为0-15的整数。在实施方案中，z为5-10的整数。在实施方案中，z为0。在实施方案中，z为1。在实施方案中，z为2。在实施方案中，z为3。在实施方案中，z为4。在实施方案中，z为5。在实施方案中，z为6。在实施方案中，z为7。在实施方案中，z为8。在实施方案中，z为9。在实施方案中，z为10。在实施方案中，z为11.在实施方案中，z为12。在实施方案中，z为13。在实施方案中，z为14。在实施方案中，z为15。在实施方案中，z为16。在实施方案中，z为17。在实施方案中，z为18。在实施方案中，z为19。在实施方案中，z为20。在实施方案中，m为1-4的整数。在实施方案中，m为1。在实施方案中，m为2。在实施方案中，m为3。在实施方案中，m为4。
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，R12-L4-R13具有下式：
在实施方案中，核苷酸类似物具有下式：
一方面，本发明提供了具有下式的化合物：R12z-R14。R12z为互补性的锚部分反应性基团。R14为R15-取代的烷基、R15-取代的杂烷基、R15-取代的环烷基、R15-取代的杂环烷基、R15-取代的芳基、或R15-取代的杂芳基。R15独立地为R16-取代的烷基、R16-取代的杂烷基、R16-取代的环烷基、R16-取代的杂环烷基、R16-取代的芳基、R16-取代的杂芳基或可检测的染料。R16独立地为R17-取代的烷基、R17-取代的杂烷基、R17-取代的环烷基、R17-取代的杂环烷基、R17-取代的芳基、R17-取代的杂芳基或可检测的染料。R17独立地为R18-取代的烷基、R18-取代的杂烷基、R18-取代的环烷基、R18-取代的杂环烷基、R18-取代的芳基、R18-取代的杂芳基或可检测的染料。R18为可检测的染料。在实施方案中，R14被多个R15部分取代，R15被多个R16部分取代，并且R16被多个R17部分取代。
在实施方案中，R12z为
链霉亲和素部分或在实施方案中，R12z为在实施方案中，R12z为在实施方案中，R12z为在实施方案中，R12z为在实施方案中，R12z为在实施方案中，R12z为在实施方案中，R12z为在实施方案中，R12z为链霉亲和素部分。在实施方案中，R12z为
在实施方案中，可检测染料为荧光染料。在实施方案中，可检测染料包括荧光共振能量转移供体荧光染料。在实施方案中，可检测染料包括荧光共振能量转移受体荧光染料。在实施方案中，可检测染料包括通过接头连接的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。在实施方案中，可检测染料包括一个由接头连接并间隔0.1nm-10nm的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
在实施方案中，可检测染料是
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中R12z如本文所述。
在实施方案中，R13为修饰的寡核苷酸、肽、PEG、碳水化合物或其组合。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中np、R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中np、L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中np、R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中np、L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：其中np、R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中np、L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中np、L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中np、R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中np、B、R4A、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中np和B如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
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其中B如本文所述。
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其中B、R4A、X和R6如本文所述。
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其中B如本文所述。
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其中B、R4A、X和R6如本文所述。
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其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
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其中B、R4A、X和R6如本文所述。
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其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
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其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
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其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
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其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4A、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B如本文所述。
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在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B和R5如本文所述。
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其中R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R5如本文所述。
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其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、R12、L4、R13、L2、R5、和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、L2、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、R12、L4、R13、L2、R5、和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、R12、L4、R13、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、L2、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、L2、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R4A、R12、L4、R13、L2、R5、和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4、R12、L4、R13、X、和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中B、R4、X、R12、L4、R13、和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
，其中R12、L4、R13、B、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、B、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、R4A、L2、R5、和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、L2、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、L2和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、L2、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、L2、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、R4A、L2、R5和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、B、R4、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、B、R4、X和R6如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
，其中R12、L4、R13、np、B、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、和R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物具有下式：
其中R12、L4、R13、np、R5如本文所述。
在实施方案中，该核苷酸类似物是本文(例如，一方面、实施方案、实施例、图、表、方案或权利要求中)所述的核苷酸类似物。
III.使用方法
一方面，本发明提供了将核苷酸类似物掺入核酸序列的方法，所述方法包括在反应容器内将嗜热核酸聚合酶、与核酸模板杂交的引物和包含可检测标签的核苷酸类似物合并，并使所述嗜热核酸聚合酶将所述核苷酸类似物掺入所述引物中，从而将核苷酸类似物掺入核酸序列中。
一方面，本发明提供了将核苷酸类似物掺入核酸序列的方法，所述方法包括在反应容器内将核酸聚合酶(例如，嗜热的，9°N及其突变体，Phi29及其突变体)、与核酸模板杂交的引物和包含可检测标签的核苷酸类似物合并，并使所述嗜热核酸聚合酶将所述核苷酸类似物掺入所述引物中，从而将核苷酸类似物掺入核酸序列中。
一方面，本发明提供了用于测序核酸的方法，所述方法包括：(i)在反应容器内使用核酸聚合酶(例如，嗜热的，9°N及其突变体，Phi29及其突变体)将四种不同的标记的核苷酸类似物中的一种顺序地掺入引物中以形成延伸链，其中所述引物与核酸杂交，并且其中四种不同的标记的核苷酸类似物中的每一种包括特有的可检测标记；(ii)检测每个掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标记，从而鉴定延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，从而对核酸进行测序；其中四种不同的标记的核苷酸类似物中的每一种具有以下结构式：
其中，在四种不同的标记的核苷酸类似物中的第一种中，B是胸腺嘧啶杂交碱基或尿嘧啶杂交碱基；在四种不同的标记的核苷酸类似物中的第二种中，B是腺嘌呤杂交碱基；在四种不同的标记的核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟嘌呤杂交碱基；在四种不同的标记的核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。B为碱基或其类似物。L1为共价接头。L2为共价接头。L4为共价接头。X为键、O、NR6A或S。R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。在实施方案中，R3为三磷酸酯或更高级的多磷酸酯。R4A和R6A独立地为氢、-OH、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分。R6为氢、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分。R12为互补的亲和锚部分结合子。R13为可检测标签。符号“----”是非共价键。在实施方案中，核酸聚合酶是嗜热核酸聚合酶。在实施方案中，核酸聚合酶是9°N及其突变体。在实施方案中，核酸聚合酶是Phi29及其突变体。
另一方面，本发明提供了将核苷酸类似物掺入核酸序列的方法，所述方法包括在反应容器内将嗜热核酸聚合酶、与核酸模板杂交的引物和核苷酸类似物合并，并使该嗜热核酸聚合酶将该核苷酸类似物掺入该引物中，从而将核苷酸类似物掺入核酸序列中，其中该核苷酸类似物包括分子量为至少约140道尔顿的荧光染料，其中该荧光染料共价结合在该核苷酸类似物的3'位置处。
一方面，本发明提供了将核苷酸类似物掺入核酸序列的方法，所述方法包括在反应容器内将核酸聚合酶、与核酸模板杂交的引物和核苷酸类似物合并，并使该核酸聚合酶将该核苷酸类似物掺入该引物中，从而将核苷酸类似物掺入核酸序列中，其中该核苷酸类似物包含分子量为至少约140道尔顿的荧光染料，其中该荧光染料共价结合在用于序列测定的该核苷酸类似物的3'位置处，其中在通过切割3'-O接头去除荧光染料以在DNA延伸产物上重新生成3’-OH后，使得连续进行核苷酸类似物掺入和多个碱基的检测。
在实施方案中，四种不同的标记的核苷酸类似物中的至少一种是包括可切割接头(例如，DTM)的正交可切割的标记的核苷酸类似物，具有本文所述结构的正交可切割的标记的核苷酸类似物，并且其中该方法还包括在每个掺入步骤之后，向反应容器中加入能够切割可切割接头(例如DTM)的切割试剂。在实施方案中，该切割试剂是酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三-(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。在实施方案中，核酸序列是单链DNA。
在实施方案中，该方法包括与单链DNA接触，其中该单链DNA与聚合酶结合，聚合酶又与电解质溶液中的膜包埋纳米孔连接，其中该单链DNA具有与其一部分杂交的引物，并根据以下步骤确定单链DNA模板的序列：(a)添加包括与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸。将通过DNA聚合酶在引物的3′末端核苷酸残基处掺入与所述单链DNA(模板)的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O被可切割接头和锚部分保护，仅有单个3′-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到引物中，从而阻止在该步骤中进一步掺入；(b)将连接有对应于4种锚的不同的结合分子的4种不同的纳米孔标签添加至延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(a)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；(c)跨膜施加电压并测量由步骤(b)中形成的连接于其上的标签迁移通过纳米孔造成的跨过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的带标签的核苷酸互补的、单链模板DNA中的核苷酸残基；(d)通过用合适的切割剂处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH；(e)对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(a)-(d)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(a)中将3'-O-可切割锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(d)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
在实施方案中，该方法包括与单链DNA模板接触，其中待测序的单链DNA与引物杂交，其中单链引物与电解质溶液中的膜包埋的纳米孔缀合，并根据以下步骤确定单链DNA模板的序列：(a)添加聚合酶和包括与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸。通过DNA聚合酶在引物的3’末端核苷酸残基处将与在5'方向上紧邻单链DNA的核苷酸残基的单链DNA(模板)的核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物掺入，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O被可切割接头和锚部分保护，仅有单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到引物中，从而阻止在该步骤中进一步掺入；(b)将连接有对应于4种锚的不同的结合分子的4种不同的纳米孔标签添加到延伸的引物上；具有标签的合适的结合分子将与步骤(a)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；(c)跨膜施加电压并测量由于步骤(b)中形成的连接在纳米孔上的标签迁移通过纳米孔造成的跨过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的标记的核苷酸互补的单链模板DNA中的核苷酸残基；(d)通过用合适的切割剂处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签，从而生成准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH；(e)对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(a)-(d)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(a)中将3'-O-可切割锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(d)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
在实施方案中，该方法包括对核酸进行测序，该方法包括：a)提供与引物杂交的核酸模板；b)用标记的核苷酸或核苷酸类似物延伸与核酸模板杂交的引物，其中该标记的核苷酸或核苷酸类似物包括具有与碱基连接的标签和3'-羟基上的保护基团的核苷酸类似物，以及具有保护3'OH的可切割标签的核苷酸或核苷酸类似物；c)鉴定该标记的核苷酸，以便对核酸进行测序。在实施方案中，核酸聚合酶是嗜热核酸聚合酶。在实施方案中，核酸聚合酶是9°N及其突变体。在实施方案中，核酸聚合酶是Phi29及其突变体。
在实施方案中，至少四种核苷酸类似物(例如，3'-O-锚-可切割接头核苷酸)包括三磷酸酯或多磷酸酯，为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或它们各自的衍生物的碱基，以及与包括3'-O-位处的可切割接头的核苷酸糖部分的3'-O-位共价偶联的锚分子。
在实施方案中，该方法包括同时对多种不同的核酸进行测序，该方法包括：a)通过掺入标记的核苷酸，延伸与模板DNA杂交的多个引发DNA链，每个模板DNA包括一个引发DNA链；b)鉴定每种标记的核苷酸，以便同时对多种不同的核酸进行测序。
在实施方案中，R5是锚部分，该方法进一步包括，在掺入后，用可检测标签标记核苷酸类似物。在实施方案中，R5是亲和锚部分。在实施方案中，标记包括向反应容器中加入具有式R12-L4-R13的化合物，其中R12是互补的亲和锚部分结合子；R13是可检测标签；L4是共价接头。
在实施方案中，R5是化学反应性锚部分。在实施方案中，R5是生物缀合物反应性基团。
在实施方案中，标记包括向反应容器中加入具有式R12z-L4z-R13的化合物，其中R12z是互补的锚部分反应性基团；R13是可检测标签；L4z是共价接头。在实施方案中，R12z-L4z-R13具有如本文所述的结构。在实施方案中，L4z是可切割接头。
在实施方案中，该方法进一步包括，在掺入后，用切割试剂切割可切割接头(例如DTM)。在实施方案中，切割试剂是酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三-(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。
在实施方案中，该方法通过合成方法形成测序的一部分。在实施方案中，核苷酸类似物是3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP或3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
在实施方案中，嗜热核酸聚合酶是Taq聚合酶，Therminatorγ、9°N聚合酶(外切)、Therminator II、Therminator III或Therminator IX。在实施方案中，嗜热核酸聚合酶是Therminatorγ。在实施方案中，嗜热核酸聚合酶是9°N聚合酶(外切)。在实施方案中，嗜热核酸聚合酶是Therminator II。在实施方案中，嗜热核酸聚合酶是Therminator III。在实施方案中，嗜热核酸聚合酶是Therminator IX。在实施方案中，嗜热核酸聚合酶是Taq聚合酶。在实施方案中，核酸聚合酶是嗜热核酸聚合酶。在实施方案中，核酸聚合酶是9°N及其突变体。在实施方案中，核酸聚合酶是Phi29及其突变体。在实施方案中，聚合酶是非嗜热核酸聚合酶。
在实施例中，该方法是图中和相应的附图说明中描述的方法(例如，图3A-3B、图13A-13B、图16A-16C、图18A-18C、图20A-图20C、图22、图47、图48A-48B、图49A-49B、图50A-50B、图51A-51B、图52A-52C、图74、图75、图76、图77、图78、图79或图80)。
应当理解，本文描述的示例和实施方案仅用于说明的目的，并且启发本领域技术人员其进行各种修改或改变，该修改和改变将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文并入本文用于所有目的。
实施方案
本文定义的术语仅指该“实施方案”部分内的方面和实施方案。
对于下面的实施方案，本文公开的每个实施方案意为适用于每个其他公开的实施方案。此外，化合物实施方案中列举的要素可用于本文所述的组合物和方法实施方案中，反之亦然。
如本文所用，除非另有说明，下列术语中的每一个应具有如下所述的定义：A＝腺嘌呤；C＝胞嘧啶；G＝鸟嘌呤；T＝胸腺嘧啶；U＝尿嘧啶；DNA＝脱氧核糖核酸；RNA＝核糖核酸；除非另有说明，否则“核酸”意指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA及其杂交体。在一个实施方案中，形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U及其衍生物。这些碱基的衍生物或类似物(在本文中也称为同型物)在本领域中是众所周知的，并且在PCR系统、试剂和消耗品中举例说明(Perkin Elmer Catalogue 1996-1997，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，New Jersey，USA)。
“核苷酸残基”是在掺入多核苷酸并因此成为多核苷酸的单体后存在的状态下的单核苷酸。因此，核苷酸残基是多核苷酸(例如，DNA)的核苷酸单体，通过其糖的3'位的磷酸二酯键与多核苷酸的相邻核苷酸单体结合，并通过其磷酸基团与第二个相邻的核苷酸单体结合，例外的是(i)3'末端核苷酸残基仅通过来自其磷酸基团的磷酸二酯键与多核苷酸的一个相邻核苷酸单体结合，和(ii)5'末端核苷酸残基仅通过来自其糖的3'位的磷酸二酯键与多核苷酸的一个相邻核苷酸单体结合。
“基质”或“表面”是指固相中存在的核酸或试剂可以附着于其上的任何合适的介质。非限制性实例包括芯片、珠、纳米孔结构和柱。在一个实施方案中，固体基质可以存在于溶液中，包括水溶液、凝胶或流体。
“杂交”意指基于序列互补性的公知原理将一个单链核酸(例如引物)与另一种核酸退火。在一个实施方案中，另一种核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向取决于它们的温度和离子强度、核酸的长度和互补程度。这些参数对杂交的影响是本领域众所周知的(参见Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.1989.Molecular cloning：a laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约)。如本文所用，引物序列或DNA延伸产物与另一种核酸的杂交应意指足够的退火，使得引物或DNA延伸产物分别可通过与可形成磷酸二酯键的可用的核苷酸或核苷酸类似物形成磷酸二酯键而延伸。
如本文所用，除非另有说明，“特有的”或“不同于”另一碱基或所列举的碱基列表的碱基应意指该碱基具有与其他碱基不同的结构。例如，“特有的”或“不同于”腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的碱基应包括鸟嘌呤碱基或尿嘧啶碱基。
如本文所用，除非另有说明，“引物”是指在与多核苷酸模板形成双链体时能够充当聚合酶掺入的点并从其3'端沿模板延伸的寡核苷酸，从而得到延伸的双链体。
如本文所用，除非另有说明，与参考分子的标签或标签部分不同的标签或标签部分意指该标签或标签部分具有与其他/参考的标签或标签部分的化学结构不同的化学结构。
在本发明的一些实施方案中，使用振动光谱检测掺入的核苷酸类似物的存在。振动光谱是一种光谱分析，其中样品用入射辐射照射，以激发分子振动。检测并且可以测量由吸收、反射或散射特定离散量的能量的样品分子引起的振动激发。振动光谱的两种主要类型是红外(通常是FTIR)和拉曼。如果使用FTIR，则测量核苷酸类似物的IR光谱。如果使用拉曼，则测量核苷酸类似物的拉曼光谱(例如本文所述的核苷酸类似物和方法)。这些方法在专利申请20150080232和20160024570(Ju et al)中公开。
在某些实施方案中，聚合酶、单链多核苷酸、RNA或引物通过1，3-偶极叠氮化物-炔烃环加成化学反应与固体基质结合。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA或引物通过聚乙二醇分子与固体基质结合。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA、引物或探针是炔烃标记的。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA、引物或探针通过聚乙二醇分子与固体基质结合，并且固体基质是叠氮化物官能化的。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA或引物通过叠氮基连接、炔基连接或生物素-链霉亲和素相互作用固定在固体基质上。核酸的固定描述于Immobilization of DNA on Chips II，Christine Wittmann编辑(2005)，SpringerVerlag，柏林，其通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，DNA是单链多核苷酸。在一个实施方案中，RNA是单链RNA。
在其他实施方案中，固体基质是芯片、珠、孔、毛细管、载玻片、晶片、过滤器、纤维、多孔介质、多孔纳米管或柱的形式。本发明还提供了本方法，其中固体基质是金属、金、银、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃或金刚石。本发明还提供了本方法，其中固体基质是多孔非金属物质，其上连接有或浸渍有金属或金属的组合。固体表面可以是包括芯片、珠、管、基质、纳米管的非限制性实例的不同的形式。固体表面可以由DNA微阵列常用的材料制成，包括玻璃或尼龙作为非限制性实例。固体表面，例如珠/微珠，可以依次固定到另一个固体表面例如芯片上。
在一个实施方案中，表面或基质是专门为检测标记的核苷酸而设计制备的表面增强拉曼散射(SERS)表面或基质。表面可包括一个或多个纳米等离子体天线，其中该纳米等离子体天线可以是纳米等离子体蝴蝶结天线。在一个实施方案中，纳米等离子体蝴蝶结天线包括交叉蝴蝶结结构，其中一对三角形耦合到入射场，而另一对三角形以正交偏振耦合到拉曼散射场。纳米等离子体天线还可以构思为天线阵列。另外，纳米等离子体天线可以包括DNA功能化位点，并且可以具有50nm-1nm的间隙尺寸。在另一个实施方案中，核苷酸聚合酶固定在间隙内。
在另一个实施方案中，专门为检测标记的核苷酸和/或核苷而制备和设计核苷酸聚合酶SERS。表面可包括一个或多个纳米等离子体天线，其中该纳米等离子体天线可以是纳米等离子体蝴蝶结天线。在一个实施方案中，纳米等离子体蝴蝶结天线包括交叉蝴蝶结结构，其中一对三角形耦合到入射场，而另一对三角形以正交偏振耦合到拉曼散射场。纳米等离子体天线还可以意指天线阵列。另外，纳米等离子体天线可以具有12nm-1nm的间隙尺寸。在另一个实施方案中，核苷酸聚合酶固定在表面上、基质上或表面上的纳米等离子体天线上。
在另一个实施方案中，表面包含DNA折纸支架或DNA折纸支架的阵列。DNA折纸支架还可构思为进一步包含位于Au纳米颗粒和Ag纳米颗粒之间的引物分子和位于特定结合位点处的纳米棒。
在另一个实施方案中，表面包含等离子体晶体或等离子体结构的阵列。例如，等离子体结构可以是周期性的TiO-Au-TiO结构。
在各种实施方案中，聚合酶、核酸样品、DNA、RNA、引物或探针在表面上的离散区室、孔或凹陷中分离。
在本发明中，提供了其中约1000或更少拷贝的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物与基质结合的方法。本发明还提供了本方法，其中2×107、1×107、1×106或1×104或更少拷贝的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物与基质或表面结合。
在一些实施方案中，固定化的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物以高密度固定。本发明还提供了本方法，其中多于或高达1×107、1×108、1×109拷贝的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物与基质或表面结合。
在本发明的方法和/或组合物的其他实施方案中，DNA是单链的。在本文所述方法或组合物的其他实施方案中，单链多核苷酸被单链RNA取代。
由于易于理解的碱基配对规则，确定掺入引物或DNA延伸产物中的dNTP类似物的拉曼光谱峰的波数，从而确定掺入的dNTP类似物的身份，允许鉴定与引物或DNA延伸产物杂交的单链多核苷酸中的互补核苷酸残基。因此，如果掺入的dNTP类似物在拉曼光谱峰中具有特有的波数，将其鉴定为包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤，那么单链多核苷酸中的互补核苷酸残基分别被鉴定为胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。嘌呤腺嘌呤(A)与嘧啶胸腺嘧啶(T)配对。嘧啶胞嘧啶(C)与嘌呤鸟嘌呤(G)配对。类似地，对于RNA，如果掺入的dNTP类似物包含腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤，那么单链RNA中的互补核苷酸残基分别被鉴定为尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。
将核苷酸和/或核苷类似物掺入寡核苷酸或多核苷酸(例如引物或DNA延伸链)意指在多核苷酸的3'末端核苷酸残基的3'碳原子和dNTP类似物的5'碳原子之间形成磷酸二酯键，导致dNTP类似物中焦磷酸基团的丢失。
可以在本文描述的方法中使用的拉曼光谱系统通常包括激发源(例如包括适当配置的激光二极管的激光器，或两个或更多个激光器)、样品照明系统和光收集光学系统、波长选择器(例如滤波器或分光光度计)和检测装置(例如CCD，光电二极管阵列或光电倍增管)。具有来自激光谱线的±80-120cm-1的截止光谱范围的干涉(陷波)滤波器可用于消除杂散光。可以使用全息光栅。双重光谱仪和三重光谱仪允许在不使用陷波滤波器的情况下获取拉曼光谱。光电二极管阵列(PDA)或电荷耦合器件(CCD)可用于检测拉曼散射光。
在一个实施方案中，使用表面增强拉曼光谱(SERS)，其采用用本领域已知的一种或多种某些金属处理的表面以引起SERS效应。在一个实施方案中，表面是连接有本文所述方法的聚合酶、多核苷酸、单链多核苷酸、单链DNA多核苷酸、单链RNA、引物、DNA延伸链或寡核苷酸探针的表面。许多合适的金属是本领域中已知的。在一个实施方案中，表面是电化学蚀刻的银，或表面用平均粒度低于20nm的银和/或金胶体处理过/表面包含平均粒度低于20nm的银和/或金胶体。通过用激发源(例如激光)照射实体并使用检测装置收集得到的拉曼光谱来识别实体的拉曼光谱峰的波数。拉曼光谱峰的波数由拉曼光谱确定。在一个实施方案中，测定的光谱为2000cm-1-2300cm-1，拉曼光谱峰波数是该光谱范围内的峰波数。在一个实施方案中，测定的光谱是2000cm-1-2300cm-1的子范围，拉曼光谱峰波数是该光谱子范围内的峰波数。
在提供一定范围的值的情况下，应理解的是除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的值的每个中间整数，和值的每个中间整数的每个十分之一，以及所述范围内的任何其他所述值或中间值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本发明内，受限于所述范围内的任何特别排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，不包括那些所包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
如本文所用，“烷基”包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂肪族烃基，并且可以是未取代的或取代的。因此，“C1-Cn烷基”中的C1-Cn包括具有直链或支链排列的1个、2个、......、n-1个或n个碳的基团。例如，“C1-C5烷基”包括具有直链或支链排列的1个、2个、3个、4个或5个碳的基团，具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和戊基。
如本文所用，“烯基”是指直链或支链的非芳香族烃基，其含有至少1个碳碳双键，可以存在最多可能数量的非芳香族碳碳双键，并且可以是未取代的或取代的。例如，“C2-C5烯基”是指分别具有2个、3个、4个或5个碳原子和至多1个、2个、3个或4个碳碳双键的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基和丁烯基。
术语“炔基”是指直链或支链的烃基，其含有至少1个碳碳三键，可以存在最多可能数量的非芳香族碳碳三键，并且可以是未取代的或取代的。因此，“C2-C5炔基”是指具有2个或3个碳原子和1个碳碳三键，或者具有4个或5个碳原子和至多2个碳碳三键的炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。
术语“取代的”是指如上所述的官能团，例如烷基或烃基，其中包含在其中的至少一个与氢原子的键被与非氢原子或非碳原子的键取代，只要保持正常的价态并且取代导致了稳定的化合物即可。取代的基团还包括其中与碳原子或氢原子的一个或多个键被与杂原子的一个或多个键(包括双键或三键)取代的基团。取代基的非限制性实例包括上述官能团，例如N，以便形成-CN。
应当理解，本领域普通技术人员可以选择本发明的化合物上的取代基和取代模式，以提供化学稳定且可以通过本领域已知技术以及如下面列出的那些方法，由容易获得的原料容易地合成的化合物。如果取代基本身被多于一个基团取代，则应理解这些多个基团可以在相同的碳上或不同的碳上，只要产生稳定的结构即可。
在选择本发明的化合物时，本领域普通技术人员将认识到，各种取代基，即R1、R2等，应根据众所周知的化学结构连接原理进行选择。
在本文描述的化合物结构中，通常未显示除核糖和脱氧核糖外的氢原子。然而，应理解，在代表碳原子上存在足够的氢原子以满足八隅体规则。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所用，除非另有说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。还应注意，起草权利要求书时可以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与权利要求要素的叙述有关的专有术语或者使用“否定式限定”的前置基础。
如本文所用，“锚”是指与携带可检测标签的另一化学基团正交且快速反应的小的化学部分。除非另有说明，本文所用的“可切割基团”是指可通过化学方法或光化学方法切割的小的化学部分。
如本文所用，除非另有说明，否则与参考分子的标签或标签部分“不同”的标签或标签部分意指该标签或标签部分具有与其他/参考的标签或标签部分的化学结构不同的化学结构。
本文描述的各种要素的所有组合都在本发明的范围内。本文描述的各种要素的所有子组合也在本发明的范围内。
通过参考下面的实验细节将更好地理解本发明，但是本领域技术人员将容易理解，详述的具体实验仅仅是对本发明的说明，更全面地描述参见后面的权利要求书。
本发明提供核苷酸类似物，其由(i)碱基、(ii)可以为脱氧核糖或核糖的糖、(iii)与脱氧核糖或核糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基接头、和(iv)与叔丁基二硫基甲基接头结合的可检测标签组成。
本发明还提供了用于确定目标核酸中预定位置处的核苷酸的身份的方法，该方法包括：
a)提供
1)目标核酸，
2)核酸聚合酶，
3)能够与在3'方向上紧邻该预定位置的所述核酸杂交的引物，
4)权利要求1的四种不同的核苷酸类似物，每种核苷酸类似物由腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、硫胺素或硫胺素类似物中的一种和特有的可检测标签组成；
b)将所述核苷酸类似物中的一种掺入所述引物的末端以形成延伸链；
c)检测掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标签，从而鉴定在所述延伸链的末端上掺入的核苷酸类似物；以及
d)基于掺入的核苷酸的身份，确定该预定位置处的核苷酸的身份。
本发明还提供了制备3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，
3)乙酸酐，和
4)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy FL-NHS酯接触。
本发明还提供了制备3'-O-Bodipy-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，
3)乙酸酐，和
4)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
本发明还提供了制备3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸和乙酸酐，以及
3)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-NHS酯接触。
本发明还提供了制备3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸和乙酸酐，以及
3)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
本发明还提供了制备3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸和乙酸酐，以及
3)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-NHS酯接触。
本发明还提供了制备3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸和乙酸酐，以及
3)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-PEG4-NHS酯、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
本发明还提供了制备3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷与乙酸、乙酸酐和DMSO接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
f)在允许生成3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-NHS接触。
本发明还提供了制备3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷与乙酸、乙酸酐和DMSO接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
在允许生成3′-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3′-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-PEG4-NHS接触。
本发明提供核苷酸类似物，其由(i)碱基、(ii)可以为脱氧核糖或核糖的糖、(iii)与脱氧核糖或核糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基接头和(iv)与叔丁基二硫基甲基接头结合的可检测标签组成。
在一个实施方案中，糖是脱氧核糖。在一个实施方案中，糖是核糖。在一个实施方案中，核苷酸类似物是核苷单磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。在一个实施方案中，碱基是腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物、或者尿嘧啶或尿嘧啶类似物。
在一个实施方案中，叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中R代表由一个或多个原子组成的结构，其中一个原子与可检测标签共价结合；其中标签代表可检测标签。
在一个实施方案中，叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3′-氧连接的点；其中n是整数，可以是1、2、3、4或5；其中R′代表与可检测标签共价连接的结构。
在一个实施方案中，可检测标签是染料、荧光团、荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物(electrophore)、单核苷酸、寡核苷酸或它们的组合。在另一个实施方案中，可检测标签是荧光团。在另一个实施方案中，荧光团是BodipyFL、R6G、ROX、Cy5或Alexa488。
在一个实施方案中，核苷酸类似物是3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP、或3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
在一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
在一个实施方案中，本发明包括含有至少两种不同的核苷酸类似物的组合物，其中每种核苷酸类似物由与组合物中存在的每种其他的核苷酸类似物不同的碱基和不同的可检测标签组成。
本发明还提供了用于确定目标核酸中预定位置处的核苷酸的身份的方法，该方法包括：
a)提供
1)目标核酸，
2)核酸聚合酶，
3)能够与所述核酸于紧邻该预定位置处在3′方向上杂交的引物，
4)权利要求1的四种不同的核苷酸类似物，每种核苷酸类似物由腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、硫胺素或硫胺素类似物中的一种和特有的可检测标签组成；
b)将所述核苷酸类似物中的一种掺入所述引物的末端以形成延伸链；
c)检测掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标签，从而鉴定在所述延伸链的末端上掺入的核苷酸类似物；以及
d)基于掺入的核苷酸的身份，确定该预定位置处的核苷酸的身份。
在一个实施方案中，该方法还包括处理步骤(b)的延伸链，以切割与糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基接头，从而在糖上产生3'-OH，并且为形成延伸，从延伸链中除去标签，另一种核苷酸类似物可以加入该延伸连。
在一个实施方案中，处理还包括使延伸链与三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)接触。
在一个实施方案中，每种核苷酸类似物是核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。在一个实施方案中，核苷酸类似物包含脱氧核糖。在一个实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，核酸是DNA。在一个实施方案中，聚合酶是逆转录酶，核酸是RNA。在一个实施方案中，核苷酸类似物包含核糖。在一个实施方案中，聚合酶是基于DNA的RNA聚合酶，核酸是DNA。在一个实施方案中，聚合酶是基于RNA的RNA聚合酶，核酸是RNA。
在一个实施方案中，叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3′-氧连接的点；其中R代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接；其中标签是可检测标签。
在一个实施方案中，叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中n为1、2、3、4或5；其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
在一个实施方案中，可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物(electrophore)、单核苷酸、寡核苷酸、或它们的组合。在另一个实施方案中，可检测标签是荧光团。在另一个实施方案中，荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
在一个实施方案中，每种核苷酸类似物选自3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3′-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP、3′-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
在一个实施方案中，每种标记的核苷酸类似物的结构选自：
在一个实施方案中，将目标核酸固定在固体支持物上。
在另一个实施方案中，通过叠氮基连接、炔基连接、1,3-偶极环加成连接或生物素-链霉亲和素相互作用将目标核酸固定在固体支持物上。
在另一个实施方案中，固体支持物为芯片、珠、孔、毛细管或载玻片的形式。在另一个实施方案中，固体支持物包含金、石英、二氧化硅或塑料。在进一步的实施方案中，固体支持物是多孔的。
在一个实施方案中，本发明包括对目标核酸进行测序的方法，其包括重复确定目标核酸中存在的每个核苷酸的身份。
在另一个实施方案中，本发明包括同时对多种不同的目标核酸进行测序的方法，其包括同时对每种这样的核酸进行测序。
本发明还提供了制备3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3′-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，
3)乙酸酐，和
4)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy FL-NHS酯接触。
在一个实施方案中，3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dATP或其类似物、3′-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP或其类似物、3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dGTP或其类似物、或3′-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dCTP。
在另一个实施方案中，3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
本发明还提供了制备3'-O-Bodipy-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3′-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，
3)乙酸酐，和
4)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3′-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
在一个实施方案中，3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dATP或其类似物、3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP或其类似物、3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dGTP或其类似物、或3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dCTP。
在另一个实施方案中，3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
本发明还提供了制备3′-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸、乙酸酐、以及DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3′-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-NHS酯接触。
本发明还提供了制备3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸、乙酸酐，以及DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
本发明还提供了制备3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸、乙酸酐、以及DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐、和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-NHS酯接触。
本发明还提供了制备3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸、乙酸酐、以及DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-PEG4-NHS酯、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
本发明还提供了制备3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷与乙酸、乙酸酐和DMSO接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
f)在允许生成3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-NHS接触。
本发明还提供了制备3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷与乙酸、乙酸酐和DMSO接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐、和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺、碘溶液和氢氧化铵接触；
f)在允许生成3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-PEG4-NHS接触。
在本发明的某些实施方案中，标签包含多个相同的拉曼散射部分。在其他实施方案中，标签包含多个不同的拉曼散射部分。在某些具体实施方案中，标签包含3个、9个或27个拉曼散射部分。在一个实施方案中，多个拉曼散射部分形成线性标签。在另一个实施方案中，多个拉曼散射部分形成非线性标签。在优选的实施方案中，非线性标签是树状聚合物标签。在一个实施方案中，标签具有波数为2125cm-1-2260cm-1的拉曼光谱峰。
在另一个实施方案中，聚合酶与贵金属纳米颗粒连接。在另一个实施方案中，贵金属纳米颗粒是银和/或金纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶具有1个或多个连接的和/或缀合的贵金属纳米颗粒，其中贵金属纳米颗粒是表面增强拉曼光谱(SERS)基质。在另一个实施方案中，贵金属纳米颗粒是金或银纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒在3nm和10nm之间。在另一个实施方案中，聚合酶具有2个、3个、4个或5个金属纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒与聚合酶在距离聚合酶的活性位点1nm-3nm处连接和/或缀合。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒与聚合酶在距离聚合酶的活性位点1nm-3nm处的连接和/或缀合，从而在活性位点处形成对表面增强拉曼光谱(SERS)的灵敏度增强的区域。在另一个实施方案中，金属纳米颗粒与聚合酶连接和/或缀合，使得当核苷和/或核苷酸处于聚合酶的活性位点，并且其中核苷和/或核苷酸被拉曼活性分子标记时，金属纳米颗粒位于距离拉曼活性分子1nm-3nm处。在另一个实施方案中，与聚合酶连接的和/或缀合的金属纳米颗粒在拉曼活性分子的位置处形成对表面增强拉曼光谱(SERS)的灵敏度增强的区域。
本发明提供核苷酸类似物，其由(i)碱基、(ii)糖和(iii)与糖的脱氧核糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基接头组成。
本文还公开了一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，其中锚的身份是预先确定的并且与碱基的身份相关，
b)使步骤a)的单链DNA和与步骤a)的核苷酸类似物的锚互补的结合分子接触，其中该结合分子具有以下结构：
其中结合子是与锚部分正交且快速地反应的化学基团，从而形成结合分子和锚部分的缀合物，标签是可检测标签，
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测任何可检测标签的存在以便由此确定步骤a)的核苷酸类似物是否被掺入，从而由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果核苷酸类似物a)的碱基不与单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则反复地使用第二类的核苷酸类似物、第三类的核苷酸类似物和第四类的核苷酸类似物重复步骤a)至c)直至核苷酸类似物具有互补的碱基，其中每种不同类型的核苷酸类似物具有与每种其他类型的核苷酸类似物不同的碱基，
e)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
f)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至e)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中每种类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，其中每种类型的核苷酸类似物的锚独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的锚，其中每种类型的核苷酸类似物的锚与不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的结合分子正交且快速地反应；
b)在允许步骤a)中掺入的核苷酸类似物的锚与互补的结合分子正交且快速地反应从而将结合分子结合到锚上的条件下，使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子接触。
其中第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子各自具有以下结构：
其中结合子是与锚正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子类型的身份相关的预定的可检测标签，其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余三种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，第三类结合分子和第三类核苷酸类似物，以及第四类结合分子和第四类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而形成每种单独类型的结合分子和单独类型的核苷酸类似物的缀合物；
c)确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的可检测标签的身份，从而由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物的标签与第二类核苷酸类似物的标签不同，其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物的每一种的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的每一种的碱基，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第三类核苷酸类似物的锚不同于第四类核苷酸类似物的锚；
b)去除任何步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测步骤a)中掺入的第一类核苷酸类似物或第二类核苷酸类似物的可检测标签的存在，以便由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果第一类核苷酸和第二类核苷酸的碱基不互补，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与锚正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子的身份相关的预定的可检测标签，其中第一类结合分子的可检测标签与第一类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第二类结合分子的可检测标签与第二类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第一类结合分子的结合子与第三类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，其中第二类结合分子与第四类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，
除去任何未结合的结合分子，并检测第一结合分子或第二结合分子的存在，以便由此确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子接触，每种类型的结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余两种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与单独类型的核苷酸类似物结合；
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
e)如果在步骤d)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
f)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
g)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
h)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
i)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而由此产生3'-OH；以及
j)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至i)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物的锚不同于第二类核苷酸类似物的锚，
其中第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第三类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，以及第二类结合分子和第二类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与单独类型的核苷酸类似物结合；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述机构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子接触，其中第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与单独类型的核苷酸类似物结合；
e)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签；
f)使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
i)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
j)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
k)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至j)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
本发明的另一个实施方案是用于确定目标核酸中预定位置处的核苷酸的身份的方法，该方法包括：
a)提供
1)目标核酸，
2)核酸聚合酶，
3)能够与所述核酸于紧邻该预定位置处在3’方向上杂交的引物，
4)四种不同的核苷酸类似物，其中每种核苷酸类似物包含(i)碱基、(ii)糖、以及(iii)与糖的3'-氧共价连接的可切割叔丁基二硫基甲基部分，
其中每种类似物的碱基由腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、硫胺素或硫胺素类似物中的一种和特有的可检测标签组成；
b)将所述核苷酸类似物中的一种掺入所述引物的末端以形成延伸链；
c)检测掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标签，从而鉴定在所述延伸链的末端上掺入的核苷酸类似物；以及
d)基于掺入的核苷酸的身份，确定该预定位置处的核苷酸的身份。
3'-O修饰的核苷酸和测序方法：
本文描述了使用3'-O-可逆保护的核苷酸类似物进行DNA合成测序(SBS)的各种方法。这些核苷酸类似物包括具有以下结构的分子：3′-O-可切割接头-标签-dNTP、3′-O-可切割接头-锚-dNTP和3′-O-可切割基团-dNTP。可切割接头包括可化学切割的接头和可光切割的接头。“锚”是指与携带可检测标签的另一化学基团正交且快速地反应的小的化学部分。可切割基团是指可通过化学方法或光化学方法切割的小的化学部分。提供了许多方案以使用包含三种类型的核苷酸类似物的分子(如上所述)以1-色、2-色或4-色的形式进行SBS。
本文还公开了具有各种3'-O-叔丁基二硫基甲基(3'-O-DTM)修饰的新型3'可逆标记的核苷酸的设计、合成和用途，所述3′-O-DTM修饰用作将报道分子连接至核苷酸的接头，从而允许核苷酸成为用于DNA合成测序(SBS)的“无疤”核苷酸可逆终止子(NRT)。3′连接的报道分子可以是荧光的。这种新型NRT可以以组的形式用于SBS中，其中每个NRT的3′-O由DTM基团可逆地保护，所述DTM基团用荧光染料标记，所述荧光染料具有对应于每种核苷酸的碱基类型的特有的荧光发射(例如，分别针对A、T、G和C的单独发射)，从而为3′-O-修饰的核苷酸类似物装配双重功能(用作可逆保护剂和可切割荧光报道分子)。在SBS期间，在掺入核苷酸并且荧光报道分子成像后，3'-O-DTM-染料将被切割(切割剂可包括THP或TCEP)以产生3′-OH基团，准备用于随后的延伸反应。当通过DTM接头与这些核苷酸类似物的3'-O连接时，许多荧光染料物质(其中几种在本文中被鉴定)适合于聚合酶掺入。
本文还描述了前面提到的三类核苷酸类似物(3'-O-可切割接头-标签-dNTP、3'-O-可切割接头-锚-dNTP和3'-O-可切割基团-dNTP)，其中基于核苷酸类似物3'-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧核苷-5′-三磷酸酯[3'-O-SS(DTM)-dNTP]的结构设计和合成类似物。更具体地，荧光染料与核苷酸类似物3'-O-SS(DTM)-dNTP的3'末端处的DTM基团的连接产生3'-O-DTM-染料-dNTP；“锚”部分与核苷酸类似物3′-O-SS(DTM)-dNTP的3'末端处的DTM基团连接产生3'-O-DTM-锚-dNTP；当可切割基团是核苷酸类似物的3'末端处的DTM本身时，核苷酸类似物本身具有母体结构[3'-O-SS(DTM)-dNTP]，无需在水性缓冲溶液中用三(3-羟丙基)膦(THP)进一步处理DNA延伸产物(如上所述)来切割DTM(SS)键从而除去核苷酸3'-O位置处的保护基团，使得重新生成游离的OH基团以准备用于随后的聚合酶延伸反应而进行连续DNA测序。可以使用这些核苷酸类似物精确测序具有均聚物区域的DNA模板。
另外，本文公开了核苷酸类似物的设计、用途和合成，所述核苷酸类似物的3'-O位置通过DTM接头连接有小的“锚”部分。由于将较小的基团连接到核苷酸类似物的3'-O位置基本上不会干扰这些分子作为底物的聚合酶识别，因此在SBS中这些NRT被更有效地掺入生长中的DNA链中。核苷酸掺入后，与荧光染料连接的相应的标记结合分子将与DNA延伸产物的3'-O末端处的锚正交反应。在该DNA延伸产物上荧光染料的成像将鉴定掺入的核苷酸从而进行序列测定。图1显示了将这些分子用于SBS的一般方案。
锚部分包括具有高效率和特异性的各种正交反应性或亲和性官能团，例如生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)和苯基硼酸(PBA)，它们将分别有效地与以下物质结合或与其反应：链霉亲和素、二苯并环辛炔(DBCO)(John(2010)；Shieha(2014))、四嗪(TZ)(Marjoke(2013)；Bergseid(2000))和水杨基异羟肟酸(SHA)(Bergseid(2000))。DNA聚合酶将容易地把这些3'-O-锚修饰的核苷酸掺入到生长中的DNA链以终止DNA合成。将标记的结合分子(例如不同荧光团标记的链霉亲和素、DBCO、TZ和SHA)添加至相应的引物延伸产物导致标记的结合分子与引物延伸产物的3'末端中的相应“锚”部分正交结合；在洗去未结合的标记分子后，检测连接到引物延伸产物的3'末端的特有标签以确定掺入的核苷酸的身份。
除了使用上述核苷酸类似物进行四色SBS外，这些分子还允许在单分子水平或整体水平上进行的一系列的新的DNA测序方法，包括单色或2-色SBS。除了将单一染料连接到标记的结合分子上，也可以通过与携带多种染料的标记的结合分子(或用多种染料标记的树状聚合物)缀合，将多种染料连接到掺入的核苷酸上，从而可以实现荧光信号的放大以促进通过SBS对DNA延伸产物进行的单分子检测。可通过将结合分子连接至由具有不同发射的两种不同的荧光染料形成的荧光共振能量转移(FRET)盒实现2-色SBS，其产生四种不同的FRET信号特征以鉴定四种DNA碱基(A、C、G、T)(Anthony(2001),Ju(1999))。如果每个标记的结合分子如下构建：使用用于标记DNA延伸产物的特有的可切割接头与染料报道分子缀合，则可以使用不同的切割方法从DNA延伸产物中选择性去除染料；因此检测到的信号变化将在单分子水平或整体水平上确定掺入的核苷酸以进行SBS。已知的可切割接头工具箱[偶氮(Leriche(2010),Budin(2010))、二甲基缩酮(Bindaulda(2013))、Dde((4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基)(Ellis(2003))、烯丙基和硝基苄基(Ju(2003),Li(2003),Ju(2006),Wu(2007))]可用于形成标记的结合分子与报道分子染料之间的连接。通过分别使用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、弱酸、肼(N2H4)、Pd(0)和光照的温和处理，可以在特定条件下容易地切割这些接头。
本发明提供核苷酸类似物，其包含(i)碱基、(ii)糖和(iii)与糖的脱氧核糖的3'-氧结合的可切割叔丁基二硫基甲基部分。在一个实施方案中，糖是脱氧核糖。在一个实施方案中，糖是核糖。
在一个实施方案中，核苷酸类似物是核苷单磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
在另一个实施方案中，类似物的碱基是腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物或者尿嘧啶或尿嘧啶类似物。
在另一个实施方案中，可切割部分可以被水溶性膦切割，从而产生3'-OH。在另一个实施方案中，水溶性膦是三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)。
在另一个实施方案中，可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点。
在另一个实施方案中，可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点，其中n是整数，可以是1、2、3、4或5。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
在另一个实施方案中，核苷酸类似物可以进一步包含可检测标签。在另一个实施方案中，可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中R代表由一个或多个原子组成的结构，其中一个原子与可检测标签共价结合；其中标签代表可检测标签。
在另一个实施方案中，可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中n是整数，可以是1、2、3、4或5；其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，其中标签代表可检测标签，其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
在另一个实施方案中，可检测标签是染料、荧光团、荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物(electrophore)、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种或它们的组合。
在另一个实施方案中，可检测标签是荧光团。在另一个实施方案中，荧光团是BodipyFL、R6G、ROX、Cy5或Alexa488。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物是3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP或3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
在另一个实施方案中，核苷酸类似物可以进一步包含锚，其中锚是与碱基的身份相关的预定的小的化学部分，其与互补的结合分子正交且快速地反应，从而将锚与结合分子结合。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，其中锚是锚部分，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与叔丁基二硫基甲基可切割部分和锚部分共价结合。
在核苷酸类似物的另一个实施方案中，锚具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物的锚与互补的结合分子正交且快速地反应，从而形成锚和结合分子的缀合物，其中结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，其与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签。
在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种或其组合。
在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签包含一种或多种荧光能量转移标签。在另一个实施方案中，互补的结合分子还包含一个或多个FRET盒。在另一个实施方案中，FRET盒包含一种或多种dSpacer单体。在另一个实施方案中，互补的结合分子具有以下结构：
其中T1是连接一个或多个荧光能量供体或受体的点，T2是将一个或多个互补的能量供体或受体与T1中的那些连接的点，其中n是1和20之间的整数，R代表与结合分子的结合子连接的点。
在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签是一种或多种荧光团。在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签的荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
在本发明的某些实施方案中，标签包含多个相同的拉曼散射部分。在其他实施方案中，标签包含多个不同的拉曼散射部分。在某些具体实施方案中，标签包含3个、9个或27个拉曼散射部分。在一个实施方案中，多个拉曼散射部分形成线性标签。在另一个实施方案中，多个拉曼散射部分形成非线性标签。在另一个实施方案中，非线性标签是树状聚合物标签。在一个实施方案中，标签具有波数为2125cm-1-2260cm-1的拉曼光谱峰。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物与核苷酸聚合酶联合使用，所述核苷酸聚合酶与贵金属纳米颗粒连接。在另一个实施方案中，贵金属纳米颗粒是银和/或金纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶具有1个或多个连接的和/或缀合的贵金属纳米颗粒，其中贵金属纳米颗粒是表面增强拉曼光谱(SERS)基质。在另一个实施方案中，贵金属纳米颗粒是金或银纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒在3nm和10nm之间。在另一个实施方案中，聚合酶具有2个、3个、4个或5个金属纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒与距离聚合酶的活性位点1nm-3nm处的聚合酶连接和/或缀合。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒与聚合酶在距离聚合酶的活性位点1nm-3nm处连接和/或缀合，从而在活性位点处形成对表面增强拉曼光谱(SERS)的灵敏度增强的区域。在另一个实施方案中，金属纳米颗粒与聚合酶连接和/或缀合，使得当核苷和/或核苷酸处于聚合酶的活性位点，并且其中用拉曼活性分子标记核苷和/或核苷酸时，金属纳米颗粒位于距离拉曼活性分子1nm-3nm处。在另一个实施方案中，与聚合酶连接的和/或缀合的金属纳米颗粒在拉曼活性分子的位置处形成对表面增强拉曼光谱(SERS)的灵敏度增强的区域。
在另一个实施方案中，互补的结合分子的结合子包含：
a)包含链霉亲和素的化合物，其结构如下：
b)包含以下结构的化合物：
其中α代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
在另一个实施方案中，如果核苷酸类似物的锚具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚可以与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子包含链霉亲和素，并具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
在另一个实施方案中，与核苷酸类似物互补的结合分子包含链霉亲和素，其中互补的结合分子具有以下结构：
在另一个实施方案中，如果核苷酸类似物的锚具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚可以与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
在另一个实施方案中，与核苷酸类似物互补的结合分子具有以下结构：
在另一个实施方案中，其中如果锚具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在核苷酸类似物的另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
在另一个实施方案中，与核苷酸类似物互补的结合分子具有以下结构：
在另一个实施方案中，如果锚具有以下结构：其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚可以与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
在另一个实施方案中，与核苷酸类似物互补的结合分子具有以下结构：
本文还公开了一种测定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，其中锚的身份是预先确定的并且与碱基的身份相关，
b)使步骤a)的单链DNA和与步骤a)的核苷酸类似物的锚互补的结合分子接触，其中该结合分子具有以下结构：其中结合子是与锚部分正交且快速地反应的化学基团，从而形成结合分子和锚部分的缀合物，标签是可检测标签，
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测任何可检测标签的存在以便由此确定步骤a)的核苷酸类似物是否被掺入，从而由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份，其中如果核苷酸类似物a)的碱基不与单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则反复地使用第二类的核苷酸类似物、第三类的核苷酸类似物和第四类的核苷酸类似物重复步骤a)至c)直至核苷酸类似物具有互补的碱基，其中每种不同类型的核苷酸类似物具有与每种其他类型的核苷酸类似物不同的碱基，
e)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
f)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至e)，从而确定单链DNA的序列。
在该方法的另一个实施方案中，步骤b)和c)同时进行，或者按照步骤b)之后步骤c)的顺序或者步骤c)之后步骤b)的顺序进行。
在该方法的另一个实施方案中，不同的核苷酸类似物具有不同的锚，并且每个不同的锚与不同的结合分子互补。
在该方法的另一个实施方案中，不同的结合分子各自具有不同的可检测标签。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中每种类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，其中每种类型的核苷酸类似物的锚独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的锚，其中每种类型的核苷酸类似物的锚与来自其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的不同结合分子正交且快速地反应；
b)在允许步骤a)中掺入的核苷酸类似物的锚与互补的结合分子正交且快速地反应的条件下，使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子接触，从而将结合分子结合到锚上，其中第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子各自具有以下结构：
其中结合子是与锚正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子类型的身份相关的预定的可检测标签，其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余三种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，第三类结合分子和第三类核苷酸类似物，以及第四类结合分子和第四类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而形成每种单独类型的结合分子和每种单独类型的核苷酸类似物的缀合物；
c)确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的可检测标签的身份，从而由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物的标签与第二类核苷酸类似物的标签不同，其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物的每一种的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的每一种的碱基，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第三类核苷酸类似物的锚不同于第四类核苷酸类似物的锚；
b)去除任何步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测步骤a)中掺入的第一类核苷酸类似物或第二类核苷酸类似物的可检测标签的存在，以便由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果第一类核苷酸和第二类核苷酸的碱基不互补，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与锚正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子的身份相关的预定的可检测标签，其中第一类结合分子的可检测标签与第一类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第二类结合分子的可检测标签与第二类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第一类结合分子的结合子与第三类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，其中第二类结合分子与第四类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，
除去任何未结合的结合分子，并检测第一结合分子或第二结合分子的存在，以便由此确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子接触，每种类型的结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余两种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与每种单独类型的核苷酸类似物结合；
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
e)如果在步骤d)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
f)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
g)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
h)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
i)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而由此产生3'-OH；以及
j)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至i)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物的锚不同于第二类核苷酸类似物的锚，
其中第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第三类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，以及第二类结合分子和第二类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与每种单独类型的核苷酸类似物结合；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，且由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子接触，其中第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与每种单独类型的核苷酸类似物结合；
e)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签；
f)使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
i)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
j)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
k)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至j)，从而确定单链DNA的序列。
本文公开了另一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
在前述方法的另一个实施方案中，具有与互补的结合分子形成缀合物的锚的每种类型的核苷酸类似物的所述锚，各自单独地具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种或它们的组合。
在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签包含一个或多个荧光能量转移标签。
在另一个实施方案中，互补的结合分子还包含一个或多个FRET盒。在另一个实施方案中，FRET盒包含一种或多种dSpacer单体。
在另一个实施方案中，互补的结合分子具有以下结构：
其中T1是连接一个或多个荧光能量供体或受体的点，T2是将一个或多个互补的能量供体或受体与T1中的能量供体或受体连接的点，其中n是1和20之间的整数，R代表与结合分子的结合子连接的点。
在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签是一种或多种荧光团。在另一个实施方案中，互补的结合分子的可检测标签的荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
在本发明的某些实施方案中，标签包含多个相同的拉曼散射部分。在其他实施方案中，标签包含多个不同的拉曼散射部分。在某些具体实施方案中，标签包含3个、9个或27个拉曼散射部分。在一个实施方案中，多个拉曼散射部分形成线性标签。在另一个实施方案中，多个拉曼散射部分形成非线性标签。在另一个实施方案中，非线性标签是树状聚合物标签。在一个实施方案中，标签具有波数为2125cm-1-2260cm-1的拉曼光谱峰。
在另一个实施方案中，聚合酶与贵金属纳米颗粒连接。在另一个实施方案中，贵金属纳米颗粒是银和/或金纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶具有1个或多个连接的和/或缀合的贵金属纳米颗粒，其中贵金属纳米颗粒是表面增强的拉曼光谱(SERS)基质。在另一个实施方案中，贵金属纳米颗粒是金或银纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒在3nm和10nm之间。在另一个实施方案中，聚合酶具有2个、3个、4个或5个金属纳米颗粒。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒与聚合酶在距离聚合酶的活性位点1nm-3nm处连接和/或缀合。在另一个实施方案中，聚合酶的金属纳米颗粒与聚合酶在距离聚合酶的活性位点1nm-3nm处连接和/或缀合，从而在活性位点处形成对表面增强拉曼光谱(SERS)的灵敏度增强的区域。在另一个实施方案中，金属纳米颗粒与聚合酶连接和/或缀合，使得当核苷和/或核苷酸处于聚合酶的活性位点，并且其中用拉曼活性分子标记核苷和/或核苷酸时，金属纳米颗粒位于距离拉曼活性分子1nm-3nm处。在另一个实施方案中，与聚合酶连接的和/或缀合的金属纳米颗粒在拉曼活性分子的位置处形成对表面增强拉曼光谱(SERS)的灵敏度增强的区域。
在本发明的一些实施方案中，使用振动光谱检测掺入的核苷酸类似物的存在。振动光谱是一种光谱分析，其中样品用入射辐射照射，以激发分子振动。检测并且可以测量由吸收、反射或散射特定离散量的能量的样品分子引起的振动激发。振动光谱的两种主要类型是红外(通常是FTIR)和拉曼。如果使用FTIR，则测量核苷酸类似物的IR光谱。如果使用拉曼，则测量核苷酸类似物的拉曼光谱(例如本文所述的核苷酸类似物和方法)。
由于易于理解的碱基配对规则，确定掺入引物或DNA延伸产物中的dNTP类似物的拉曼光谱峰的波数，从而确定掺入的dNTP类似物的身份，允许鉴定与引物或DNA延伸产物杂交的单链多核苷酸中的互补核苷酸残基。因此，如果掺入的dNTP类似物在拉曼光谱峰中具有特有的波数，将其鉴定为包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤，那么单链多核苷酸中的互补核苷酸残基分别被鉴定为胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。嘌呤腺嘌呤(A)与嘧啶胸腺嘧啶(T)配对。嘧啶胞嘧啶(C)与嘌呤鸟嘌呤(G)配对。类似地，对于RNA，如果掺入的dNTP类似物包含腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤，那么单链RNA中的互补核苷酸残基分别被鉴定为尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。
在另一个实施方案中，具有锚的每种类型的核苷酸类似物的互补的结合分子的结合子包含：
a)包含链霉亲和素的化合物，其结构如下：或
b)包含以下结构的化合物： 其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
在另一个实施方案中，如果一种类型的核苷酸类似物的锚具有以下结构：其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子包含链霉亲和素，并具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，使用柠檬酸/Na2HPO4从包含所述类型的核苷酸类似物和结合分子的缀合物切割标签。
在另一个实施方案中，所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其衍生物中的一种。
在另一个实施方案中，互补的结合分子包含链霉亲和素，其中互补的结合分子具有以下结构：
在另一个实施方案中，一种类型的核苷酸类似物的锚具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，使用Na2S2O4/H2O从包含所述类型的核苷酸类似物和结合分子的缀合物切割标签。
在另一个实施方案中，所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其衍生物中的一种。
在另一个实施方案中，互补的结合分子具有以下结构：
在另一个实施方案中，如果一种类型的核苷酸类似物的锚具有以下结构：其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，并且其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其衍生物中的一种。
在另一个实施方案中，互补的结合分子具有以下结构：
在另一个实施方案中，如果一种类型的核苷酸类似物的锚具有以下结构：其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，则该锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
在另一个实施方案中，使用柠檬酸/Na2HPO4从包含所述类型的核苷酸类似物和结合分子的缀合物切割标签。
在另一个实施方案中，所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其衍生物中的一种。
在另一个实施方案中，互补的结合分子具有以下结构：
在另一个实施方案中，每种类型的核苷酸类似物的可切割叔丁基二硫基甲基部分是叔丁基二硫基甲基接头，其具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点。
在另一个实施方案中，可切割叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中n是整数，可以为1、2、3、4或5。
在另一个实施方案中，可切割叔丁基二硫基甲基部分可以被水溶性膦切割，从而产生3'-OH。在另一个实施方案中，水溶性膦是三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)，其中可切割叔丁基二硫基甲基部分可以被水溶性膦切割，从而产生3'-OH。
在前述方法的另一个实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
核苷酸类似物可以具有以下结构：
本发明的另一个实施方案是用于确定目标核酸中预定位置处的核苷酸的身份的方法，该方法包括：
a)提供
1)目标核酸，
2)核酸聚合酶，
3)能够与所述核酸于紧邻该预定位置处在3’方向上杂交的引物，
4)四种不同的核苷酸类似物，其中每种核苷酸类似物包含(i)碱基、(ii)糖、以及(iii)与糖的3'-氧共价连接的可切割叔丁基二硫基甲基部分，
其中每种类似物的碱基由腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、硫胺素或硫胺素类似物中的一种和特有的可检测标签组成；
b)将所述核苷酸类似物中的一种掺入所述引物的末端以形成延伸链；
c)检测掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标签，从而鉴定在所述延伸链的末端上掺入的核苷酸类似物；以及
d)基于掺入的核苷酸的身份，确定该预定位置处的核苷酸的身份。
在另一个实施方案中，对步骤(b)的延伸链进行处理，以切割与糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基部分，从而在糖上产生3'-OH，并且为形成延伸，从可以添加另一种核苷酸类似物的延伸链中除去标签。在另一种方法中，处理包括使延伸链与三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)接触。
在另一个实施方案中，叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中R代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接；其中标签是可检测标签。
在另一个实施方案中，叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中n为1、2、3、4或5；其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
在每种前述方法的另一个实施方案中，核苷酸类似物是核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
在每种前述方法的另一个实施方案中，核苷酸类似物包含脱氧核糖。在另一种方法中，聚合酶是DNA聚合酶，核酸是DNA。在每种前述方法的另一种方法中，核苷酸类似物包含核糖。在每种前述方法的另一个实施方案中，聚合酶是逆转录酶，核酸是RNA。在每种前述方法的另一个实施方案中，聚合酶是基于DNA的RNA聚合酶，核酸是DNA。在每种前述方法的另一个实施方案中，聚合酶是基于RNA的RNA聚合酶，核酸是RNA。
在另一个实施方案中，叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3′-氧连接的点；其中R代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接；其中标签是可检测标签。
在另一个实施方案中，可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物(electrophore)、单核苷酸、寡核苷酸、或它们的组合。在另一个实施方案中，可检测标签是荧光团。在另一个实施方案中，荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
在另一个实施方案中，每种核苷酸类似物选自3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
在另一个实施方案中，每种标记的核苷酸类似物的结构选自：
在另一个实施方案中，本文公开了对目标核酸进行测序的方法，该方法包括根据前述方法中的任何方法重复测定目标核酸中存在的每个核苷酸的身份。
在每种前述测序方法的另一个实施方案中，对多种不同的目标核酸同时进行测序，其包括同时对每种这样的核酸进行测序。
在每种前述方法的另一个实施方案中，核苷酸类似物是核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
在每种前述方法的另一个实施方案中，核苷酸类似物包含脱氧核糖。在另一个实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，核酸是DNA。在每种前述方法的另一个实施方案中，核苷酸类似物包含核糖。在每种前述方法的另一个实施方案中，聚合酶是逆转录酶，核酸是RNA。在每种前述方法的另一个实施方案中，聚合酶是基于DNA的RNA聚合酶，核酸是DNA。在每种前述方法的另一个实施方案中，聚合酶是基于RNA的RNA聚合酶，核酸是RNA。
在每种前述方法的另一个实施方案中，将目标核酸固定在固体支持物上。在另一个实施方案中，通过1,3-偶极环加成连接、酰胺键或生物素-链霉亲和素相互作用将目标核酸固定在固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物为芯片、珠、孔、毛细管或载玻片的形式。在另一个实施方案中，固体支持物包含金、石英、二氧化硅或塑料。在另一种方法中，固体支持物是多孔的。
在某些实施方案中，聚合酶、单链多核苷酸、DNA或引物通过1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成化学反应与固体基质结合。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA或引物通过聚乙二醇分子与固体基质结合。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA或引物是炔烃标记的。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA或引物通过聚乙二醇分子与固体基质结合，并且固体基质是叠氮化物官能化的。在一个实施方案中，聚合酶、DNA、RNA或引物通过叠氮基连接、炔基连接或生物素-链霉亲和素相互作用固定在固体基质上。核酸的固定描述于Immobilizationof DNA on Chips II，Christine Wittmann编辑(2005)，Springer Verlag，柏林，其通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，DNA是单链多核苷酸。在一个实施方案中，RNA是单链RNA。
在其他实施方案中，固体基质是芯片、珠、孔、毛细管、载玻片、晶片、过滤器、纤维、多孔介质、多孔纳米管或柱的形式。本发明还提供任何前述方法，其中固体基质是金属、金、银、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃或金刚石。本发明还提供了本方法，其中固体基质是多孔非金属物质，其上连接有或浸渍有金属或金属的组合。固体表面可以是不同的形式，包括非限制性实例芯片、珠、管、基质、纳米管。固体表面可以由DNA微阵列常用的材料制成，包括非限制性实例玻璃或尼龙。固体表面，例如珠/微珠，可以依次固定到另一个固体表面例如芯片上。
在一个实施方案中，表面或基质是专门为检测标记的核苷酸而设计制备的SERS表面或基质。表面可包括一个或多个纳米等离子体天线，其中该纳米等离子体天线可以是纳米等离子体蝴蝶结天线。在一个实施例中，纳米等离子体蝴蝶结天线包括交叉蝴蝶结结构，其中一对三角形耦合到入射场，而另一对三角形以正交偏振耦合到拉曼散射场。纳米等离子体天线还可以构思为天线阵列。另外，纳米等离子体天线可以包括DNA功能化位点，并且可以具有50nm-1nm的间隙尺寸。在另一个实施方案中，核苷酸聚合酶固定在间隙内。
在另一个实施方案中，专门为检测标记的核苷酸和/或核苷而制备和设计核苷酸聚合酶SERS。表面可包括一个或多个纳米等离子体天线，其中该纳米等离子体天线可以是纳米等离子体蝴蝶结天线。在一个实施例中，纳米等离子体蝴蝶结天线包括交叉蝴蝶结结构，其中一对三角形耦合到入射场，而另一对三角形以正交偏振耦合到拉曼散射场。纳米等离子体天线还可以构思为天线阵列。另外，纳米等离子体天线可以具有12nm-1nm的间隙尺寸。在另一个实施方案中，核苷酸聚合酶固定在表面上、基质上或表面上的纳米等离子体天线上。
在另一个实施方案中，表面包含DNA折纸支架或DNA折纸支架的阵列。DNA折纸支架还可构思为进一步包含位于Au纳米颗粒和Ag纳米颗粒之间的引物分子和位于特定结合位点处的纳米棒。
在另一个实施方案中，表面包含等离子体晶体或等离子体结构的阵列。例如，等离子体结构可以是周期性的TiO-Au-TiO结构。
在各种实施方案中，聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物在表面上的离散区室、孔或凹陷中分离。
在本发明中，提供了其中约1000或更少拷贝的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物与基质结合的方法。本发明还提供了本方法，其中2×107、1×107、1×106或1×104或更少拷贝的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物与基质或表面结合。
在前述方法的其他实施方案中，可以实时(即，当它们发生时)检测核苷酸掺入事件。
前述方法的其他实施方案可以是单分子方法。也就是说，检测到的信号是由单个分子(即，单核苷酸掺入)产生的，而不是由多个克隆分子产生的。该方法可以不需要DNA扩增。
在前述方法的其他实施方案中，同时对多个相同的单链DNA或RNA分子进行测序，从而产生集合信号。
在前述方法的其他实施方案中，通过使用纳米孔来检测和/或产生由核苷酸掺入事件产生的信号。本发明的这种纳米孔装置和系统可以与其他纳米孔装置和方法组合或被其修改，例如美国专利第7,005,264B2；7,846,738；6,617,113；6,746,594；6,673,615；6,627,067；6,464,842；6,362,002；6,267,872；6,6015,714；5,795,782号；和美国公开第2015/0111759和2015/0368710号中描述的那些，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，固定化的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物以高密度固定。本发明还提供了本方法，其中多于或高达1×107、1×108、1×109拷贝的聚合酶、核酸样品、DNA、RNA或引物与基质或表面结合。
在本发明的方法和/或组合物的其他实施方案中，DNA是单链的。在本文所述方法或组合物的其他实施方案中，单链多核苷酸被单链RNA取代。
将核苷酸和/或核苷类似物掺入寡核苷酸或多核苷酸(例如引物或DNA延伸链)意指在多核苷酸的3'末端核苷酸残基的3'碳原子和dNTP类似物的5'碳原子之间形成磷酸二酯键，导致dNTP类似物中焦磷酸基团的丢失。
可以在本文描述的方法中使用的拉曼光谱系统通常包括激发源(例如包括适当配置的激光二极管的激光器，或两个或更多个激光器)、样品照明系统和光收集光学系统、波长选择器(例如滤波器或分光光度计)和检测装置(例如CCD，光电二极管阵列或光电倍增管)。具有来自激光谱线的±80-120cm-1的截止光谱范围的干涉(陷波)滤波器可用于消除杂散光。可以使用全息光栅。双重光谱仪和三重光谱仪允许在不使用陷波滤波器的情况下获取拉曼光谱。光电二极管阵列(PDA)或电荷耦合器件(CCD)可用于检测拉曼散射光。
在一个实施方案中，使用表面增强拉曼光谱(SERS)，其采用用本领域已知的一种或多种某些金属处理的表面以引起SERS效应。在一个实施方案中，表面是连接有本文所述方法的聚合酶、多核苷酸、单链多核苷酸、单链DNA多核苷酸、单链RNA、引物、DNA延伸链或寡核苷酸探针的表面。许多合适的金属是本领域中已知的。在一个实施方案中，表面是电化学蚀刻的银，或表面用平均粒度低于20nm的银和/或金胶体处理过/表面包含平均粒度低于20nm的银和/或金胶体。通过用激发源(例如激光)照射实体并使用检测装置收集得到的拉曼光谱来识别实体的拉曼光谱峰的波数。拉曼光谱峰的波数由拉曼光谱确定。在一个实施方案中，测定的光谱为2000cm-1-2300cm-1，拉曼光谱峰波数是该光谱范围内的峰波数。在一个实施方案中，测定的光谱是2000cm-1-2300cm-1的子范围，拉曼光谱峰波数是该光谱子范围内的峰波数。
在提供一定范围的值的情况下，应理解的是除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的值的每个中间整数，和值的每个中间整数的每个十分之一，以及所述范围内的任何其他所述值或中间值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本发明内，受限于所述范围内的任何特别排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，不包括那些所包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
应当理解，本领域普通技术人员可以选择本发明的化合物上的取代基和取代模式，以提供化学稳定的、且可以通过本领域已知技术以及如下面列出的那些方法由容易获得的原料容易地合成的化合物。如果取代基本身被多于一个基团取代，则应理解这些多个基团可以在相同的碳上或不同的碳上，只要产生稳定的结构即可。
在选择本发明的化合物时，本领域普通技术人员将认识到，各种取代基，即R1、R2等，应根据众所周知的化学结构连接原理进行选择。
在本文描述的化合物结构中，通常未显示除核糖和脱氧核糖外的氢原子。然而，应理解，在所述的碳原子上存在足够的氢原子以满足八隅体规则。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所用，除非另有说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。还应注意，撰写权利要求书时可以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与权利要求要素的叙述有关的专有术语或者使用“否定式限定”的前置基础。
本文所述的方法可以在必要的变更后应用于使用适当的dNTP及其类似物对RNA进行的测序。
本文描述的各种要素的所有组合都在本发明的范围内。本文描述的各种要素的所有子组合也在本发明的范围内。本文公开的每个实施方案构思为适用于每个其他的公开的实施方案。此外，化合物实施方案中列举的要素可用于本文所述的组合物和方法实施方案中，反之亦然。
通过参考下面的实验细节将更好地理解本发明，但是本领域技术人员将容易理解，详细的具体实验仅仅是用作说明本发明，在后面的权利要求中更全面地描述了本发明。
实施方案P1.核苷酸类似物，其由(i)碱基、(ii)可以为脱氧核糖或核糖的糖、(iii)与脱氧核糖或核糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基接头和(iv)与叔丁基二硫基甲基接头结合的可检测标签组成。
实施方案P2.实施方案P1的核苷酸类似物，其中所述糖是脱氧核糖。
实施方案P3.实施方案P1的核苷酸类似物，其中所述糖是核糖。
实施方案P4.实施方案P1-P3中任一个的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物是核苷单磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷酸五磷酸或核苷酸六磷酸。
实施方案P5.实施方案P1-P4中任一个的核苷酸类似物，其中所述碱基是腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物、或者尿嘧啶或尿嘧啶类似物。
实施方案P6.实施方案P1-P5中任一个的核苷酸类似物，其中所述叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3′-氧连接的点；其中R代表由一个或多个原子组成的结构，其中一个原子与可检测标签共价结合；其中标签代表可检测标签。
实施方案P7.实施方案P6的核苷酸类似物，其中所述叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构： 其中α代表与3'-氧连接的点；其中n是整数，可以是1、2、3、4或5；其中R'代表与可检测标签共价连接的结构。
实施方案P8.实施方案P1-P7中任一个的核苷酸类似物，其中所述可检测标签是染料、荧光团、荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸或它们的组合。
实施方案P9.实施方案P8的核苷酸类似物，其中所述可检测标签是荧光团。
实施方案P10.实施方案P9的核苷酸类似物，其中所述荧光团是BodipyFL、R6G、ROX、Cy5或Alexa488。
实施方案P11.实施方案P1的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物是3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP或3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
实施方案P12.实施方案P1的核苷酸类似物，其具有以下结构：
实施方案P13.包含实施方案1-12中任一项的至少两种不同的核苷酸类似物的组合物，其中每种核苷酸类似物由与该组合物中存在的每种其他核苷酸类似物不同的碱基和不同的可检测标签组成。
实施方案P14.用于确定目标核酸中预定位置处的核苷酸的身份的方法，该方法包括：
a)提供
1)目标核酸，
2)核酸聚合酶，
3)能够与所述核酸于紧邻该预定位置处在3’方向上杂交的引物，
4)实施方案1的四种不同的核苷酸类似物，每种核苷酸类似物由腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、硫胺素或硫胺素类似物中的一种和特有的可检测标签组成；
b)将所述核苷酸类似物中的一种掺入所述引物的末端以形成延伸链；
c)检测掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标签，从而鉴定在所述延伸链的末端上掺入的核苷酸类似物；以及
d)基于掺入的核苷酸的身份，确定该预定位置处的核苷酸的身份。
实施方案P15.实施方案P14的方法还包括处理步骤(b)的延伸链，以切割与糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基接头，从而在糖上产生3'-OH，并且为形成延伸，从可以添加另一种核苷酸类似物的延伸链中除去标签。
实施方案P16.实施方案P14-P15中任一项的方法，其中处理包括使延伸链与三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)接触。
实施方案P17.实施方案P14-P16中任一项的方法，其中每种核苷酸类似物是核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
实施方案P18.实施方案P14-P17中任一项的方法，其中所述核苷酸类似物包含脱氧核糖。
实施方案P19.实施方案P18的方法，其中聚合酶是DNA聚合酶，核酸是DNA。
实施方案P20.实施方案P18的方法，其中聚合酶是逆转录酶，核酸是RNA。
实施方案P21.实施方案P14-P20中任一项的方法，其中所述核苷酸类似物包含核糖。
实施方案P22.实施方案P21的方法，其中聚合酶是基于DNA的RNA聚合酶，核酸是DNA。
实施方案P23.实施方案P21的方法，其中聚合酶是基于RNA的RNA聚合酶，核酸是RNA。
实施方案P24.实施方案P14-P23中任一项的方法，其中所述叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中R代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接；其中标签是可检测标签。
实施方案P25.实施方案P14-P24中任一项的方法，其中所述叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构： 其中α代表与3'-氧连接的点；其中n为1、2、3、4或5；其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
实施方案P26.实施方案P14-P25中任一项的方法，其中可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸或它们的组合。
实施方案P27.实施方案P26的方法，其中可检测标签是荧光团。
实施方案P28.实施方案P27的方法，其中荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
实施方案P29.实施方案P14-P23中任一项的方法，其中每种核苷酸类似物选自3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3′-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
实施方案P30.实施方案P14-P23中任一项的方法，其中每种标记的核苷酸类似物的结构选自：
实施方案P31.实施方案P14-P30中任一项的方法，其中将目标核酸固定在固体支持物上。
实施方案P32.实施方案P31的方法，其中通过叠氮基连接、炔基连接、1,3-偶极环加成连接或生物素-链霉亲和素相互作用将目标核酸固定在固体支持物上。
实施方案P33.实施方案P31-P32中任一项的方法，其中固体支持物为芯片、珠、孔、毛细管或载玻片的形式。
实施方案P34.实施方案P31-P33中任一项的方法，其中固体支持物包含金、石英、二氧化硅或塑料。
实施方案P35.实施方案P31-P34中任一项的方法，其中固体支持物是多孔的。
实施方案P36.对目标核酸进行测序的方法，其包括根据实施方案P14-P35中任一项的方法重复确定目标核酸中存在的每个核苷酸的身份。
实施方案P37.同时对多种不同的目标核酸进行测序的方法，其包括根据实施方案P36的方法同时对每种这样的核酸进行测序。
实施方案P38.制备3′-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，和
3)乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy FL-NHS酯接触。
实施方案P39.实施方案P38的方法，其中3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dATP或其类似物、3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP或其类似物、3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dGTP或其类似物、或3′-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dCTP。
实施方案P40.实施方案P39的方法，其中3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
实施方案P41.制备3'-O-Bodipy-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3′-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，和
3)乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、
对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
实施方案P42.实施方案41的方法，其中3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dATP或其类似物、3′-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP或其类似物、3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dGTP或其类似物、或3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dCTP。
实施方案P43.实施方案42的方法，其中3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
实施方案P44.制备3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-NHS酯接触。
实施方案P45.制备3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3′-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
实施方案P46.制备3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3′-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-NHS酯接触。
实施方案P47.制备3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-PEG4-NHS酯、N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
实施方案P48.制备3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷与乙酸和乙酸酐接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
f)在允许生成3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-NHS接触。
实施方案P49.制备3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷与乙酸和乙酸酐接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2，2，-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
f)在允许生成3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-PEG4-NHS接触。
实施方案R1.核苷酸类似物，其由(i)碱基、(ii)糖和(iii)与糖的3'-氧共价连接的可切割叔丁基二硫基甲基部分组成。
实施方案R2.实施方案R1的核苷酸类似物，其中所述糖是脱氧核糖。
实施方案R3.实施方案R1的核苷酸类似物，其中所述糖是核糖。
实施方案R4.实施方案R1-R3中任一项的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物是核苷单磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
实施方案R5.实施方案R1-R4中任一项的核苷酸类似物，其中所述碱基是腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物或者尿嘧啶或尿嘧啶类似物。
实施方案R6.实施方案R1-R5中任一项的核苷酸类似物，其中所述可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点。
实施方案R7.实施方案R7的核苷酸类似物，其中所述可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中n是整数，可以是1、2、3、4或5。
实施方案R8.实施方案6的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
实施方案R9.实施方案R1-R8中任一项的核苷酸类似物，其还包含可检测标签。
实施方案R10.实施方案R9的核苷酸类似物，其中可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；
其中R代表由一个或多个原子组成的结构，其中一个原子与可检测标签共价结合；
其中标签代表可检测标签。
实施方案R11.实施方案R10的核苷酸类似物，其中可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3′-氧连接的点；
其中n是整数，可以是1、2、3、4或5；
其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
实施方案R12.实施方案R9-R11中任一项的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，
其中标签代表可检测标签，
其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
实施方案R13.实施方案R9-R12中任一项的核苷酸类似物，其中可检测标签是染料、荧光团、荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸或它们的组合。
实施方案R14.实施方案R13的核苷酸类似物，其中可检测标签是荧光团。
实施方案R15.实施方案R14的核苷酸类似物，其中荧光团是BodipyFL、R6G、ROX、Cy5或Alexa488。
实施方案R16.实施方案R15的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物是3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3′-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP或3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
实施方案R17.实施方案R15的核苷酸类似物，具有以下结构：
实施方案R18.包含实施方案R11-R17中任一项的至少两种不同的核苷酸类似物的组合物，其中每种核苷酸类似物由与该组合物中的每种其他的核苷酸类似物不同的碱基和不同的可检测标签组成。
实施方案R19.实施方案R1-R9中任一项的核苷酸类似物，其还包含锚部分，其中所述锚部分是与碱基的身份相关的预定的小的化学部分，其与互补的结合分子正交且快速地反应从而形成锚部分与结合分子的缀合物。
实施方案R20.实施方案R19的核苷酸，其具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，
其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，
其中锚是锚部分，
其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与叔丁基二硫基甲基可切割部分和锚部分共价结合。
实施方案R21.实施方案R20或实施方案R21的核苷酸类似物，其中锚部分具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R22.实施方案R19-R21中任一项的核苷酸类似物，其中所述锚与互补的结合分子正交且快速地反应，从而将锚和结合分子结合，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中结合分子具有以下结构：
其中标签是可检测标签，
其中结合子是与可检测标签的身份相关的小的化学基团，其与锚部分正交且快速地反应，从而形成锚部分与结合分子的缀合物。
实施方案R23.实施方案R22的核苷酸类似物，其中互补的结合分子的可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种或它们的组合。
实施方案R24.实施方案R23的核苷酸类似物，其中互补的结合分子的可检测标签包含一个或多个荧光能量转移标签。
实施方案R25.实施方案R24的核苷酸类似物，其中互补的结合分子还包含一个或多个FRET盒。
实施方案R26.实施方案R25的核苷酸类似物，其中FRET盒包含一种或多种dSpacer单体。
实施方案R27.实施方案R26的核苷酸类似物，其中互补的结合分子具有以下结构：
其中T1是连接一个或多个荧光能量供体或受体的点，T2是将一个或多个互补的能量供体或受体与T1中的那些连接的点，其中n是1和20之间的整数，R代表与结合分子的结合子连接的点。
实施方案R28.实施方案R24的核苷酸类似物，其中互补的结合分子的可检测标签是一种或多种荧光团。
实施方案R29.实施方案R28的核苷酸类似物，其中互补的结合分子的可检测标签的荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
实施方案R30.实施方案R22-R29中任一项的核苷酸类似物，其中互补的结合分子的结合子包含：
a)包含链霉亲和素的化合物，其结构如下：或
b)包含以下结构的化合物：
其中α代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
实施方案R31.实施方案30的核苷酸类似物，其中锚部分具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，
锚部分与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子包含链霉亲和素，并具有以下结构：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R32.实施方案R31的核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
实施方案R33.实施方案R31或R32的核苷酸类似物，其中互补的结合分子的结合子包含链霉亲和素，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R34.实施方案R30的核苷酸类似物，其中锚部分具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，锚部分与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R35.实施方案R34的核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、或其类似物中的一种。
实施方案R36.实施方案R34-R35中任一项的核苷酸类似物，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R37.实施方案R30的核苷酸类似物，其中锚部分具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，
锚部分与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，
从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R38.实施方案R37的核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其衍生物中的一种。
实施方案R39.实施方案R37-R38中任一项的核苷酸类似物，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R40.实施方案R30的核苷酸类似物，其中锚具有以下结构：其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R41.实施方案R40的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、或其类似物中的一种。
实施方案R42.实施方案R40-R41中任一项的核苷酸类似物，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R43.实施方案R1-R42中任一项的核苷酸类似物，其中可切割叔丁基二硫基甲基部分可被水溶性膦切割，从而产生3'-OH。
实施方案R44.实施方案R43的核苷酸类似物，其中水溶性膦是三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)。
实施方案R45.包含R1-R44中任一项的至少两种核苷酸类似物的组合物，其中每种核苷酸类似物具有不同的碱基。
实施方案R46.包含实施方案19-44中任一项的至少两种核苷酸类似物的组合物，其中每种核苷酸类似物具有不同的碱基，并且其中每种核苷酸类似物具有不同的锚部分。
实施方案R47.制备3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，和
3)乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy FL-NHS酯接触。
实施方案R48.实施方案R47的方法，其中3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dATP或其类似物、3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP或其类似物、3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dGTP或其类似物或3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dCTP。
实施方案R49.实施方案R48的方法，其中3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
实施方案R50.制备3'-O-Bodipy-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，该方法包括：
a)在允许生成3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，和
3)乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B是核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
实施方案R51.实施方案50的方法，其中3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dATP或其类似物、3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP或其类似物、3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dGTP或其类似物、或3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dCTP。
实施方案R52.实施方案51的方法，其中3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP是3'-O-PEG4-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dTTP。
实施方案R53.制备3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许产生3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-NHS酯接触。
实施方案R54.制备3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dATP与ROX-PEG4-酸、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
实施方案R55.制备3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3′-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-NHS酯接触。
实施方案R56.制备3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷的条件下，使
1)N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷，与
2)乙酸和乙酸酐反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
d)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤c)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
e)在允许生成3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP的条件下，使步骤d)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dCTP与Alexa488-PEG4-NHS酯、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲基氨基吡啶接触。
实施方案R57.制备3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷与乙酸和乙酸酐接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2，2，-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
f)在允许生成3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-NHS接触。
实施方案R58.制备3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的方法，该方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷的条件下，使
1)2'-脱氧鸟苷，与
2)叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的N4-DMF-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷与乙酸和乙酸酐接触：
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)的产物与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸盐和2,2,2,-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
d)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤c)的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
e)在允许生成3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤d)的产物与四丁基焦磷酸铵、1-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁胺和碘溶液接触；
f)在允许生成3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP的条件下，使步骤e)中制备的3'-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dGTP与Cy5-PEG4-NHS接触。
实施方案R59.用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中锚部分的身份是预先确定的并且与碱基的身份相关，
b)使步骤a)的单链DNA和与步骤a)的核苷酸类似物的锚部分互补的结合分子接触，其中该结合分子具有以下结构：
其中结合子是与锚部分正交且快速地反应的化学基团，从而形成结合分子和锚部分的缀合物，标签是可检测标签，
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测任何可检测标签的存在以便由此确定步骤a)的核苷酸类似物是否被掺入，从而由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果核苷酸类似物a)的碱基不与单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则反复地使用第二类的核苷酸类似物、第三类的核苷酸类似物和第四类的核苷酸类似物重复步骤a)至c)直至核苷酸类似物具有互补的碱基，其中每种不同类型的核苷酸类似物具有与每种其他类型的核苷酸类似物不同的碱基，
e)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
f)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至e)，从而确定单链DNA的序列。
实施方案R60.实施方案R59的方法，其中步骤b)和c)可以同时进行，或者按照步骤b)之后步骤c)的顺序或者步骤c)之后步骤b)的顺序进行。
实施方案R61.实施方案R59或实施方案R60的方法，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物具有不同的锚部分，并且其中每个不同的锚部分与不同的结合分子互补。
实施方案R62.实施方案R61的任一种方法，其中不同的结合分子各自具有不同的可检测标签。
实施方案R63.用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中每种类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，其中每种类型的核苷酸类似物的锚部分独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的锚部分，其中每种类型的核苷酸类似物的锚部分与来自其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的不同结合分子正交且快速地反应；
b)在允许步骤a)中掺入的核苷酸类似物的锚与互补的结合分子正交且快速地反应的条件下，使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子接触，从而形成结合分子与锚部分的缀合物，
其中第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子各自具有以下结构：
其中结合子是与锚部分正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子类型的身份相关的预定的可检测标签，其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余三种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，第三类结合分子和第三类核苷酸类似物，以及第四类结合分子和第四类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而形成每种单独类型的结合分子和每种单独类型的核苷酸类似物的缀合物；
c)确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的可检测标签的身份，从而由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
实施方案R64.用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物的标签与第二类核苷酸类似物的标签不同，其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物的每一种的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的每一种的碱基，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第三类核苷酸类似物的锚部分不同于第四类核苷酸类似物的锚部分；
b)去除任何步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测步骤a)中掺入的第一类核苷酸类似物或第二类核苷酸类似物的可检测标签的存在，以便由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果第一类核苷酸和第二类核苷酸的碱基不互补，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与锚正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子的身份相关的预定的可检测标签，其中第一类结合分子的可检测标签与第一类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第二类结合分子的可检测标签与第二类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第一类结合分子的结合子与第三类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，其中第二类结合分子与第四类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，
除去任何未结合的结合分子，并检测第一结合分子或第二结合分子的存在，以便由此确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
实施方案R65.用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子接触，每种类型的结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应以形成缀合物，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余两种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与每种单独类型的核苷酸类似物结合；
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
e)如果在步骤d)中检测到可检测标签，则将单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
f)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
g)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
h)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
i)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
j)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至i)，从而确定单链DNA的序列。
实施方案R66.用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物的锚不同于第二类核苷酸类似物的锚，
其中第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第三类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，以及第二类结合分子和第二类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与每种单独类型的核苷酸类似物结合以形成缀合物；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，且由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
实施方案R67.用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类型的结合分子接触，其中第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚部分正交且快速地反应以形成缀合物，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与每种单独类型的核苷酸类似物结合以形成缀合物；
e)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签；
f)使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
i)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
j)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
k)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至j)，从而确定单链DNA的序列。
实施方案R68.用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3′-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸类似物的身份，并由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
实施方案R69.实施方案R59-R67中任一项的方法，其中具有与互补的结合分子形成缀合物的锚的每种类型的核苷酸类似物的所述锚，各自单独地具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R70.实施方案R69的方法，其中互补的结合分子的可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种或它们的组合。
实施方案R71.实施方案R70的方法，其中互补的结合分子的可检测标签包含一个或多个荧光能量转移标签。
实施方案R72.实施方案R71的方法，其中互补的结合分子还包含一个或多个FRET盒。
实施方案R73.实施方案R72的方法，其中FRET盒包含一种或多种dSpacer单体。
实施方案R74.实施方案R73的方法，其中互补的结合分子具有以下结构：
其中T1是连接一个或多个荧光能量供体或受体的点，T2是将一个或多个互补的能量供体或受体与T1中的那些连接的点，其中n是1和20之间的整数，R代表与结合分子的结合子连接的点。
实施方案R75.实施方案R69的方法，其中互补的结合分子的可检测标签是一种或多种荧光团。
实施方案R76.实施方案R75的方法，其中互补的结合分子的可检测标签的荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
实施方案R77.实施方案R69-R76中任一项的方法，其中每种类型的核苷酸类似物的互补的结合分子的结合子具有包含以下化合物的锚：
a)包含链霉亲和素的化合物，其结构如下：
b)包含以下结构的化合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
实施方案R78.实施方案R77的方法，其中一种类型的核苷酸类似物具有锚，所述锚具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，
所述锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子包含链霉亲和素，并具有以下结构：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R79.实施方案R78的方法，其中使用柠檬酸/Na2HPO4从包含所述类型的核苷酸类似物和结合分子的缀合物切割标签。
实施方案R80.实施方案R78或R79的方法，其中所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
实施方案R81.实施方案R78-R80中任一项的方法，其中互补的结合分子包含链霉亲和素，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R82.实施方案R77的方法，其中一种类型的核苷酸类似物具有锚部分，所述锚部分具有以下结构：
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，
所述锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R83.实施方案R82的方法，其中使用Na2S2O4/H2O从包含所述类型的核苷酸类似物和结合分子的缀合物切割标签。
实施方案R84.实施方案R82或R83的方法，其中所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
实施方案R85.实施方案R82-R84中任一项的方法，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R86.实施方案R77的方法，其中一种类型的核苷酸类似物具有锚部分，所述锚部分具有以下结构
其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，
所述锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R87.实施方案R86的方法，其中所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种。
实施方案R88.实施方案R86或R87的方法，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R89.实施方案R77的方法，其中一种类型的核苷酸类似物具有锚，所述锚具有以下结构：其中ω代表一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接，
所述锚与互补的结合分子的结合子正交且快速地反应，其中所述结合子具有以下结构：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，从而形成具有以下结构的缀合物：
其中α是一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接，其中ω是一个或多个原子，通过所述原子与可切割叔丁基二硫基甲基部分建立共价连接。
实施方案R90.实施方案R89的方法，其中使用柠檬酸/Na2HPO4从包含所述类型的核苷酸类似物和结合分子的缀合物切割标签。
实施方案R91.实施方案R89或R90的方法，其中所述类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其衍生物中的一种。
实施方案R92.实施方案R89-R91中任一项的方法，其中互补的结合分子具有以下结构：
实施方案R93.实施方案R58-R92中任一项的方法，其中可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3′-氧连接的点。
实施方案R94.实施方案R93的方法，其中可切割叔丁基二硫基甲基部分具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；其中n是整数，可以为1、2、3、4或5。
实施方案R95.实施方案R65-R66或R68中任一项的方法，其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
实施方案R96.实施方案R68-R95中任一项的方法，其中可切割叔丁基二硫基甲基部分可被水溶性膦切割，从而产生3'-OH。
实施方案R97.实施方案R96的方法，其中水溶性膦是三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)。
实施方案R98.用于确定目标核酸中预定位置处的核苷酸的身份的方法，该方法包括：
a)提供
1)目标核酸，
2)核酸聚合酶，
3)能够与所述核酸于紧邻该预定位置处在3’方向上杂交的引物，
4)实施方案9的四种不同的核苷酸类似物，其中每种核苷酸类似物由腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、硫胺素或硫胺素类似物中的一种和特有的可检测标签组成；
b)将所述核苷酸类似物中的一种掺入所述引物的末端以形成延伸链；
c)检测掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标签，从而鉴定在所述延伸链的末端上掺入的核苷酸类似物；以及
d)基于掺入的核苷酸的身份，确定该预定位置处的核苷酸的身份。
实施方案R99.实施方案R98的方法进一步包括，对步骤(b)的延伸链进行处理，以切割与糖的3'-氧结合的叔丁基二硫基甲基部分，从而在糖上产生3'-OH，并且为了形成延伸，从可以添加另一种核苷酸类似物的延伸链中除去标签。
实施方案R100.实施方案R99的方法，其中所述处理包括使延伸链与三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)接触。
实施方案R101.实施方案R98-R100中任一项的方法，其中每种核苷酸类似物是核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
实施方案R102.实施方案R98-R101中任一项的方法，其中核苷酸类似物包含脱氧核糖。
实施方案R103.实施方案R102的方法，其中聚合酶是DNA聚合酶，核酸是DNA。
实施方案R104.实施方案R98-R101中任一项的方法，其中核苷酸类似物包含核糖。
实施方案R105.实施方案R104的方法，其中聚合酶是逆转录酶，核酸是RNA。
实施方案R106.实施方案R102的方法，其中聚合酶是基于DNA的RNA聚合酶，核酸是DNA。
实施方案R107.实施方案R104的方法，其中聚合酶是基于RNA的RNA聚合酶，并且核酸是RNA。
实施方案R108.实施方案R98-R108中任一项的方法，其中叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；
其中R代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接；
其中标签是可检测标签。
实施方案R109.实施方案R98-R108中任一项的方法，其中叔丁基二硫基甲基接头具有以下结构：
其中α代表与3'-氧连接的点；
其中n为1、2、3、4或5；
其中R'代表一个或多个原子，通过所述原子与可检测标签建立共价连接。
实施方案R110.实施方案R98-R109中任一项的方法，其中可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、亲电化合物、单核苷酸、寡核苷酸或它们的组合。
实施方案R111.实施方案R110的方法，其中可检测标签是荧光团。
实施方案R112.实施方案R112的方法，其中荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX、Cy5和Alexa488。
实施方案R113.实施方案R98-R112中任一项的方法，其中每种核苷酸类似物选自3'-O-Alexa488-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-Cy5-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-Rox-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-RG6-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Alexa488-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-RG6-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dTTP、3'-O-Rox-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-Cy5-PEG4-叔丁基二硫基甲基-dGTP。
实施方案R114.实施方案R98-R110中任一项的方法，其中每种标记的核苷酸类似物的结构选自：
实施方案R115.实施方案R98-R114中任一项的方法，其中将目标核酸固定在固体支持物上。
实施方案R116.实施方案R115的方法，其中通过叠氮基连接、炔基连接、1,3-偶极环加成连接或生物素-链霉亲和素相互作用将目标核酸固定在固体支持物上。
实施方案R117.实施方案R115-R116中任一项的方法，其中固体支持物为芯片、珠、孔、毛细管或载玻片的形式。
实施方案R118.实施方案R115-R117中任一项的方法，其中固体支持物包含金、石英、二氧化硅或塑料。
实施方案R119.实施方案R115-R117中任一项的方法，其中固体支持物是多孔的。
实施方案R120.对目标核酸进行测序的方法，其包括根据实施方案R98-R119中任一项的方法重复确定目标核酸中存在的每个核苷酸的身份。
实施方案R121.同时对多种不同的目标核酸进行测序的方法，其包括根据实施方案R120的方法同时对每种这样的核酸进行测序。
用于SBS的3'锚标签的实施方案：
实施方案J1.确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
与单链DNA接触，其中该单链DNA与聚合酶结合，聚合酶又与电解质溶液中的膜包埋纳米孔连接，其中该单链DNA具有与其一部分杂交的引物，并根据以下步骤确定单链DNA模板的序列：
(a)添加包括与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸。通过DNA聚合酶在引物的3’末端核苷酸残基处将掺入与所述单链DNA(模板)的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O-被可切割接头和锚部分保护，仅有单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到引物中，从而阻止在该步骤中的进一步掺入；
(b)将连接有对应于4种锚的不同的结合分子的4种不同的纳米孔标签添加到延伸的引物上；具有标签的合适的结合分子将与步骤(a)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；
(c)跨膜施加电压并测量由于步骤(b)中形成的连接在纳米孔上的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的带标签的核苷酸互补的单链模板DNA中的核苷酸残基；
(d)通过用合适的切割剂处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签，从而生成准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH。
(e)对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(a)-(d)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(a)中该3'-O-可切割锚核苷酸被掺入前一次重复的步骤(d)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
实施方案J2.实施方案J1的方法，其中所述至少四种3'-O-锚-可切割接头核苷酸中的每一种包括三磷酸酯或多磷酸酯，为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其各自的衍生物的碱基，以及共价偶联至核苷酸糖部分的3’-O-位置处的锚分子，所述核苷酸糖部分包括3’-O-位置处的可切割接头。
实施方案J3.实施方案J1的方法，其中可切割接头是基于二硫基甲基(SS(DTM))、烯丙基、偶氮或2-硝基苄基的接头。
实施方案J4.实施方案J1的方法，其中可切割接头被DTT、THP、TCEP、Pd(0)、连二亚硫酸钠或约340nm的UV光切割。
实施方案J5.实施方案J1的方法，其中锚部分包括生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)、苯基硼酸(PBA)、四环庚烷或降冰片烯。
实施方案J6.实施方案J1的方法，其中锚结合配体分子包括链霉亲和素、二苄基环辛烯(DBCO)、四嗪、水杨基羟肟酸(SHA)、双(二硫代苯偶酰)镍(II)和含氧化腈的化合物。
实施方案J7.实施方案J1的方法，其中纳米孔标签是寡核苷酸、肽、PEG、碳水化合物或它们的组合。
实施方案J8.确定单链DNA的核苷酸序列的方法，该方法包括：
与单链DNA模板接触，其中待测序的单链DNA与引物杂交，其中单链引物与电解质溶液中的膜包埋纳米孔缀合，并根据以下步骤确定单链DNA模板的序列：
(a)添加聚合酶和包括与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸。通过DNA聚合酶在引物的3’末端核苷酸残基处将掺入与所述单链DNA(模板)的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5′方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3′-O-被可切割接头和锚部分保护，仅有单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到引物中，从而阻止在该步骤中的进一步掺入；
(b)将连接有对应于4种锚的不同的结合分子的4种不同的纳米孔标签添加至延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(a)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；
(c)跨膜施加电压并测量由步骤(b)中形成的连接于其上的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的带标签的核苷酸互补的单链模板DNA中的核苷酸残基；
(d)通过用合适的切割剂处理来切割3′-O-可切割接头连接的标签，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH；
(e)对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(a)-(d)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5′方向上紧邻单链DNA中与DNA延伸产物的3′末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(a)中该3'-O-可切割锚核苷酸被掺入前一次重复的步骤(d)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
实施方案J9.实施方案J8的方法，其中所述至少四种3'-O-锚-可切割接头核苷酸中的每一种包括三磷酸酯或多磷酸酯，为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其各自的衍生物的碱基，以及共价偶联至核苷酸糖部分的3’-O-位置处的锚分子，所述核苷酸糖部分包括3’-O-位置处的可切割接头。
实施方案J10.实施方案J8的方法，其中可切割接头是基于二硫基甲基(SS(DTM))、烯丙基、偶氮基或2-硝基苄基的接头。
实施方案J11.实施方案J8的方法，其中可切割接头被DTT、THP、TCEP、Pd(0)、连二亚硫酸钠或约340nm的UV光切割。
实施方案J12.实施方案J8的方法，其中锚部分包括生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)、苯基硼酸(PBA)、四环庚烷或降冰片烯。
实施方案J13.实施方案J8的方法，其中锚结合配体分子包括链霉亲和素、二苄基环辛烯(DBCO)、四嗪、水杨基羟肟酸(SHA)、双(二硫代苯偶酰)镍(II)、和含氧化腈的化合物。
实施方案J14.实施方案J8的方法，其中纳米孔标签是寡核苷酸、肽、PEG、碳水化合物或它们的组合。
实施方案J15.实施方案J1和实施方案J8的方法，其中添加4种与包括4种不同锚分子的可切割接头连接的核苷酸类似物，然后添加与4种不同纳米孔标签连接的4种匹配的(comparable)锚结合分子。
实施方案J16.实施方案J1和实施方案J8的方法，其中添加3种与包括3种不同锚分子的可切割接头连接的核苷酸类似物，以及1种与缺少锚分子的可切割接头连接的核苷酸类似物，然后添加与3种不同纳米孔标签连接的3种匹配的锚结合分子。
实施方案J17.实施方案J1和实施方案J8的方法，其中4种核苷酸中的每一种具有锚和可切割接头的不同组合，以及连接于2种不同的纳米孔标签的2种不同的结合分子。
实施方案J18.实施方案J17的方法，其中核苷酸之一为叠氮基锚和SS(DTM)可切割接头，第二种核苷酸为TCO锚和SS(DTM)可切割接头，第三种核苷酸为叠氮基锚和2-硝基苄基可切割接头，第四种核苷酸为TCO锚和2-硝基苄基可切割接头。
实施方案J19.实施方案J17的方法，其中核苷酸之一为叠氮基锚和SS(DTM)可切割接头，第二种核苷酸为TCO锚和SS(DTM)可切割接头，第三种核苷酸为叠氮基锚和偶氮基可切割接头，第四种核苷酸为TCO锚和偶氮基可切割接头。
实施方案J20.实施方案J17的方法，其中核苷酸之一为叠氮基锚和SS(DTM)可切割接头，第二种核苷酸为TCO锚和SS(DTM)可切割接头，第三种核苷酸为叠氮基锚和烯丙基可切割接头，第四种核苷酸为TCO锚和烯丙基可切割接头。
实施方案J21.实施方案J17-J20的方法，其中锚结合分子包括连接于一个纳米孔标签的DBCO和连接于一个不同的纳米孔标签的四嗪。
实施方案J22.实施方案J17-J20的方法，其中纳米孔标签是寡核苷酸、PEG、肽或碳水化合物链。
实施方案J23.实施方案J1和实施方案J8的方法，其中四种核苷酸包括3'-O-锚-可切割接头(DTM)核苷酸；
实施方案J24.实施方案J1和实施方案J8的方法，其中与3'-O-DTM核苷酸连接的锚部分选自叠氮化物、反式环辛烯(TCO)、PBA和四环庚烷(QC)。
实施方案J25.实施方案J1和实施方案J8的方法，其中连接于纳米孔标签的锚结合分子选自DBCO、四嗪、SHA和镍双(二硫纶)(Ni-bis(dithioline))化合物。
实施方案J26.实施方案J1和实施方案J8的方法，其中可切割接头(DTM)被DTT、TCEP或THP切割。
对于在碱基上具有染料以及在3'位置上具有标签(染料或锚)的核苷酸类似物的 混合物(图70-76)
实施方案K1.一种对核酸进行测序的方法，其包括：a)通过将标记的核苷酸掺入引发链中来延伸DNA的引发链；b)鉴定标记的核苷酸，以便对核酸进行测序。
实施方案K2.实施方案K1的方法，其中标记的核苷酸具有与碱基连接的标签以及3'-羟基上的可切割保护基团。
实施方案K3.实施方案K1的方法，其中标记的核苷酸具有通过可切割接头与3'OH连接的标签。
实施方案K4.实施方案K2的方法，其中标签通过可切割接头与碱基连接。
实施方案K5.实施方案K2-K4的方法，其中可化学切割的接头是二硫基甲基SS(DTM)、偶氮基、烯丙基或2-硝基苄基。
实施方案K6.实施方案K2-K3的方法，其中3'OH保护基团为SS(DTM)、叠氮甲基、偶氮基、烯丙基或2-硝基苄基。
实施方案K7.实施方案K1的方法，其中核苷酸类似物包括脱氮嘌呤碱基。
实施方案K8.一种对核酸进行测序的方法，其包括：a)提供与引物杂交的核酸模板；b)用标记的核苷酸或核苷酸类似物延伸与核酸模板杂交的引物，其中标记的核苷酸或核苷酸类似物包括具有与碱基连接的标签和3'-羟基上的保护基团的核苷酸类似物，以及具有保护3'OH的可切割标签的核苷酸或核苷酸类似物；c)鉴定标记的核苷酸，以便对核酸进行测序。
实施方案K9.实施方案K8的方法，其中标记的核苷酸或核苷酸类似物包括具有与碱基连接的标签和3'-羟基上的保护基团的核苷酸类似物，以及具有保护3'OH的可切割标签的核苷酸或核苷酸类似物。
实施方案K10.实施方案K9的方法，其中标签与碱基连接或用可切割接头保护3'OH基团。
实施方案K11.实施方案K10的方法，其中可切割接头是可化学切割的接头。
实施方案K12.实施方案K10的方法，其中可化学切割的接头是二硫基甲基SS(DTM)、偶氮基、烯丙基或2-硝基苄基。
实施方案K13.实施方案K8的方法，其中核苷酸类似物包括脱氮嘌呤碱基。
实施方案K14.一种同时测序多种不同核酸的方法，包括：a)通过掺入标记的核苷酸，使与模板DNA杂交的多个引发DNA链延伸，其中每个模板DNA包括一个引发DNA链；b)鉴定每种标记的核苷酸，以便同时测序多种不同的核酸。
实施方案K15.实施方案K14的方法，其中标记的核苷酸或核苷酸类似物包括具有与碱基连接的标签和3'-羟基上的保护基团的核苷酸类似物，以及具有保护3'OH的可切割标签的核苷酸或核苷酸类似物。
实施方案K16.实施方案K15的方法，其中标签通过可切割接头与碱基连接。
实施方案K17.实施方案K14的方法，其中3'OH保护基团通过可切割接头与脱氧核糖连接。
实施方案K18.实施方案K14的方法，其中可切割接头是可化学切割的接头。
实施方案K19.实施方案K18的方法，其中可化学切割的接头是二硫基甲基SS(DTM)、偶氮基、烯丙基或2-硝基苄基。
实施方案K20.实施方案K14的方法，其中3'OH保护基团为SS(DTM)、叠氮甲基、偶氮基、烯丙基或2-硝基苄基。
实施方案K21.实施方案K14的方法，其中核苷酸类似物包括脱氮嘌呤碱基。
实施例
在各种新的DNA测序方法中，合成测序(SBS)是实现1000美元基因组测序目标的主要方法。目前广泛使用的高通量SBS技术(Bentley(2008))使用以前开发的可切割荧光标记的核苷酸可逆终止子(NRT)测序化学过程来确定聚合酶反应期间的DNA序列(Ju et al.(2003)；Ju et al.(2006))。这些可切割的荧光NRT被如此设计以便通过将特有的可切割荧光团连接至特定位置的碱基并用小的可逆保护部分对3’-OH基团进行加帽(这使得它们仍然能够作为底物被DNA聚合酶识别)来对四种核苷酸(A、C、G、T)中的每一种进行改性。因此，可切割的荧光NRT涉及核苷酸的单独位置处的两个修饰(Ju et al.(2003)；Ju et al.(2006))；Bentley et al.2008)：(1)在碱基上用作报道分子的荧光染料；和(2)用于加帽3'-OH基团以在用于序列测定的核苷酸掺入后暂时终止聚合酶反应的小的化学部分。在掺入和信号检测之后，切下荧光团并除去3'-OH加帽部分以在下一个循环中恢复聚合酶反应。已证明这些可切割的荧光NRT是再造工程化聚合酶的良好底物，并已广泛用于下一代DNA测序系统(Ju(2006)；Bentley(2008))。此外，因为在每个循环中仅识别一个碱基，可切割的荧光NRT使得能够准确地测定均聚物序列。
基于荧光的方法在检测灵敏度方面具有许多优点。然而，由于荧光团的尺寸大，需要针对测序反应优化特定的聚合酶和反应条件。此外，当前在SBS中使用的可切割荧光NRT在切去荧光团后在生长中的DNA链的碱基上留下修饰的基团，限制了测序读段长度。
作为基于荧光的DNA SBS的替代方案，以前已经报道了一种方法，该方法使用叠氮基部分(N3)(其在2125cm-1处具有强且窄的特有的拉曼位移，其中几乎所有生物分子都是透明的)作为SBS的标签(Palla(2014))。叠氮基标签是所述部分的一部分，其也用作核苷酸的3'-OH基团的可逆保护基团。得自这些核苷酸的延伸的DNA链与天然DNA相同。这与许多当前的SBS方法不同，后者需要使用修饰的核苷酸，其在切下荧光标签后留下接头的短的残余物(Ju(2006)；Bentley(2008)；Harris(2008))；随着这些残余物在延伸的DNA链中累积，它们越来越可能改变DNA结构并阻碍进一步通过聚合酶将核苷酸掺入。
已报道在3'-OH处具有以下保护基团的荧光NRT：3'-O-烯丙基-dNTP(Bentley(2008))、3'-O-叠氮甲基-dNTP(Wu(2007)；Guo(2008)；Bentley(2008))、3'-O-NH2-dNTP(Hunter(2010))和3'-O-氰乙基-dNTP(Knapp(2011))，其可分别被Pd(0)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、稀亚硝酸和氟化物切割以产生游离的3'-OH基团。
报道了对核苷进行的基于3'-O-烷基二硫基甲基(3'-O-DTM)的各种修饰(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2010))，以用于合成寡核苷酸。已经建立了导致由O-DTM基团产生羟基的稳定性和还原切割(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2010))，但是它们在DNA测序应用中的用途尚未见报道。这是因为没有报道具有保护3'-OH基团的大分子荧光染料的核苷酸类似物在模板指导的DNA合成中通过DNA聚合酶而被掺入的事实。
DNA测序是生物学和医学研究中的基本工具，它是个性化精准医学范式的必备技术。在各种新的DNA测序方法中，合成测序(SBS)是实现$1000基因组测序目标的主要方法。SBS在聚合酶反应期间确定DNA序列。目前广泛使用的高通量SBS技术(Bentley(2008))使用以前已开发的可切割荧光标记的核苷酸可逆终止子(NRT)测序化学过程来确定聚合酶反应期间的DNA序列(Ju et al.(2003)；Ju et al.(2006))。这些可切割的荧光NRT基于以下原理设计：通过将特有的可切割荧光团连接至特定位置的碱基并用小的可逆保护部分对3’-OH基团进行加帽(这使得它们仍然能够作为底物被DNA聚合酶识别)以对四种核苷酸(A、C、G、T)中的每一种进行改性。因此，可切割的荧光NRT涉及在核苷酸的单独位置处的两个修饰(Ju et al.(2003)；Ju et al.(2006)；Bentley et al.(2008))：(1)在碱基上用作报道分子的荧光染料；和(2)用于加帽3'-OH基团以在用于序列测定的核苷酸掺入后暂时终止聚合酶反应的小的化学部分。在核苷酸掺入和信号检测以鉴定掺入的核苷酸后，切下荧光团并除去3'-OH加帽部分以在下一个循环中恢复聚合酶反应。已证明这些可切割的荧光NRT是再造工程化聚合酶的良好底物，并已广泛用于下一代DNA测序系统(Ju(2006)；Bentley(2008))。此外，因为在每个循环中仅识别一个碱基，使得能够准确地测定均聚物序列。
已知在嘧啶(T和C)的5-位处和嘌呤的7-位处用大体积的基团例如能量转移染料修饰的核苷酸仍可被工程化DNA聚合酶识别为底物(Rosenblum(1997)；Zhu(1994)。已经确定了大鼠DNA聚合酶，DNA模板引物和双脱氧胞苷三磷酸的三元复合物(Pelletier(1994))，其支持这些发现。因此，如果一个特有的荧光染料通过可切割接头与嘧啶(T和C)的5-位和嘌呤(G和A)的7-位连接，并使用小的化学部分对3'-OH基团进行加帽，得到的核苷酸类似物应可作为终止子掺入到生长中的DNA链中。基于这一基本原理，开发了一种使用可切割荧光核苷酸类似物作为可逆终止子来测序表面固定化DNA的SBS方法(Ju(2003)；Ruparel(2005)；Marguiles(2005)；Ju(2006)；Wu(2007)；Guo(2008))。在这种方法中，核苷酸在两个特定位置处被修饰，使得它们仍然能够作为底物被DNA聚合酶识别：(i)具有不同荧光发射的不同荧光团通过可切割接头与四种碱基中的每一种的特定位置连接，和(ii)3'-OH基团被小的化学可逆部分加帽。DNA聚合酶仅将下述单核苷酸类似物掺入：所述单核苷酸类似物与共价连接于表面的DNA模板上的碱基互补。掺入后，检测特有的荧光发射以鉴定掺入的核苷酸。随后除去荧光团并化学再生3'-OH基团，这允许进行聚合酶反应的下一个循环。因为可以在DNA芯片的大的表面上点状分布(spot)高密度的不同DNA模板，所以每个循环可以并行识别许多碱基，允许同时测序大量的DNA分子。
基于荧光的方法在检测灵敏度方面具有许多优点。然而，由于荧光团的尺寸大，需要针对测序反应优化具体的聚合酶和反应条件。上述SBS方法的另一个缺点是在从聚合酶反应中掺入的核苷酸切去荧光染料后，在核苷酸碱基处产生小分子“疤”(通常是炔丙基胺或修饰的炔丙基氨基部分)。生长中的DNA链通过每一轮连续的SBS累积这些疤。在某种情况下，残留的痕可能足以干扰DNA双螺旋结构，从而对DNA聚合酶识别产生负面影响，结果限制了读段长度。
由于需要增加SBS读段长度，已经探索了SBS方案，其中“报道分子”(reporter)染料通过可切割接头直接连接到核苷酸类似物的3'-OH基团，这将允许无疤SBS发生。在这种无疤SBS过程中，在掺入核苷酸以及为进行序列测定而对在掺入的3'-O修饰的核苷酸上的报道分子部分进行成像后，接头的切割将在生长中的DNA链上产生游离的3'-OH基团以用于随后的延伸反应。早期的工作集中在设计和合成可切割的化学部分，该化学部分与荧光染料连接以便使用3'-O-酯连接对核苷酸的3'-OH基团进行加帽(Cheeseman(1994)；Canard(1994))。然而，因为DNA聚合酶难以接受这些核苷酸类似物作为底物，这些核苷酸类似物在SBS方案中基本上是不成功的。为了创建高通量DNA测序平台，其他组织也采用用可逆的3'-O荧光染料进行修饰的核苷酸(Welch(1999)；Metzker(2005)；Lu(2006))。累积的研究工作表明，由于当在由聚合酶与互补核苷酸和带有引物的模板形成的三元复合物状态下，核苷酸的脱氧核糖上的3’位置非常靠近DNA聚合酶的活性位点处的氨基酸残基，这种方法的主要挑战是DNA聚合酶难以接受3’-O大体积染料修饰的核苷酸作为底物。最近，Kim等报道了使用烯丙基接头与小的荧光染料(香豆素，Pacific Blue和BodipyFL)连接的3'-O-荧光修饰的核苷酸，它们是Therminator II DNA聚合酶的非常好的底物。然而，使用相同的接头用大体积染料或高电荷染料(例如Alexa 488)修饰的核苷酸不是DNA聚合酶的合适底物(Kim(2010)；Kim(2014)。
为了在SBS中实现长的读段长度，可切割接头在测序反应期间必需保持稳定，具有最小的循环数量并且在切割反应后在碱基上不留下疤。具有通过可切割接头与3'-O连接的报道分子的核苷酸类似物对于此目的而言是理想的；这种修饰的核苷酸在DNA合成过程中会产生天然延长的DNA。然而，主要的挑战是设计和合成这种作为底物被DNA聚合酶接受的修饰的核苷酸类似物。已经报道了在核苷酸的3'-OH处具有以下保护基团的NRT，并且表明它们是DNA聚合酶的良好底物：3'-O-(2-硝基苄基)-dNTP(Wu(2007))、3'-O-烯丙基-dNTP(Ju(2003)；Ju(2006))、3'-O-叠氮甲基-dNTP(Guo(2008)；Bentley(2008))、3'-O-NH2(Hutter(2010))和3'-O-氰乙基(Diana(2011))。可以容易地切割所有这些分子中的3'保护部分以重新生成3'-OH基团。该组合研究表明，具有与3'-OH基团连接的小的化学部分的3'-O-NRT是DNA聚合酶的良好底物，并且是进行DNA SBS的理想选择。已经报道了用于合成寡核苷酸的、对核苷进行的基于3'-O-叔丁基二硫基甲基(3’-O-DTM)的各种修饰(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2006))。已经很好地建立了由O-DTM基团产生羟基的还原切割(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2006))，但是具有3'-O-DTM修饰的这些类型的分子在DNA SBS应用中的用途尚未见报道。因此，需要合成在无疤SBS中使用的3’-O修饰的核苷酸和核苷，所述3’-O修饰的核苷酸和核苷可作为底物被DNA聚合酶有效识别，在SBS期间被有效且准确地掺入生长中的DNA链中，具有在温和条件下可切割的3’-O保护基团(其中切割可产生3’-OH)，并允许长的SBS读段长度。
实施例1：3'-O-染料-DTM-dNTP的合成和表征
基于荧光的DNA合成测序方法在检测灵敏度方面具有许多优点。然而，由于荧光团的尺寸大，需要针对测序反应优化具体的聚合酶和反应条件。此外，当前在SBS中使用的可切割荧光核苷酸可逆终止子在切去荧光团后在生长中的DNA链的碱基上留下修饰的基团或疤，这又限制了读段长度。
已报道在3'-OH处具有以下保护基团的荧光NRT：3'-O-烯丙基-dNTP(Bentley(2008))、3'-O-叠氮甲基-dNTP(Wu(2007)；Guo(2008)；Bentley(2008))、3'-O-NH2-dNTP(Hunter(2010))和3'-O-氰乙基-dNTP(Knapp(2011))，其可分别被Pd(0)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、稀亚硝酸和氟化物切割以产生游离的3'-OH基团。
已经报道了用于合成寡核苷酸的对核苷的各种基于3'-O-烷基二硫基甲基(3'-O-DTM)的修饰(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2010))。还已经建立了由O-DTM基团产生羟基的稳定性和还原切割(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2010))，但是它们在DNA测序应用中的用途尚未见报道。这是由于报道了具有保护3'-OH基团的大分子荧光染料的核苷酸类似物在模板指导的DNA合成中通过DNA聚合酶没有被掺入。
通过连接至荧光染料以保护核苷酸的3'-OH基团的可切割接头的特有的化学设计，并结合特定的聚合酶反应条件，本文公开了修饰的3'-O-二硫基甲基(3'-O-DTM)是成功的可逆连接基团，其用于连接荧光染料报道分子以保护用于DNA SBS的核苷酸的3'-OH基团。为此，本文公开了新型的3'可逆标记的核苷酸作为无痕可逆终止子，这是为DNA SBS而设计和合成的。在这些新型的核苷酸类似物中，只有核苷酸的3'-OH基团被DTM接头可逆地保护，该接头与荧光标签连接，从而实现核苷酸的3'-O-修饰的双重功能，即作为可逆终止子的功能和作为可切割荧光报道分子的功能。
本文进一步公开了在SBS循环中，这种3'-O-染料-DTM-dNTP作为底物被DNA聚合酶Therminator(9°N DNA聚合酶变体)很好地识别并掺入生长中的DNA链中。在通过其荧光信号确定掺入的核苷酸的身份后，进行TCEP或三(3-羟丙基)膦(THP)处理来切割DMT部分中的二硫键，导致荧光报道分子的去除和重新生成3'-OH基团，以允许连续测序。在每次掺入和切割后，产生延伸的天然DNA链，以允许在SBS期间无缝掺入进入的互补3'-O-染料-DTM-dNTP。
将3'-O-染料-DTM-dNTP用于SBS具有令人惊讶的优点。如本文所公开的，已经进行了使用3'-O-染料-DTM-dNTP与合成模板和引物的连续聚合酶延伸反应。在单碱基延伸和DTM部分的切割以及从DNA延伸产物的3'-O处除去染料后，所得的引物延伸产物可以用另外的3'-O-染料-DTM-dNTP进一步延伸，从而获得高产率掺入和准确的序列测定。因为这些3'-O-染料-DTM-dNTP不需要在碱基上连接荧光标签，所以它们的合成更简单，因此更具成本效益。此外，延伸的DNA链与天然DNA相同。对于SBS而言，3'-O-染料-DTM-dNTP的使用将获得非常长且准确的读段长度。
3'-O-Bodipy-DTM-dTTP和3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP的合成
3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T2)：在搅拌下将乙酸(2.6mL)和乙酸酐(8.6mL)添加到5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T1，1.07g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(48小时)，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯提取(3×30mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1/2)纯化所需化合物的残余物得到纯产物T2(0.97g，74％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:8.16(s,1H),7.48(s,1H),6.28(m,1H),4.62(m,2H),4.46(m,1H),4.10(m,1H),3.78–3.90(m,2H),2.39(m,1H),2.14(s,3H),1.97(m,1H),1.92(s,3H),0.93(s,9H),0.13(s,3H)；HRMS(Fab+)C18H33N2O5SSi[(M+H)+]：计算值：417.1879，实验值：417.1890。
化合物T3：将3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T2,625mg,1.50mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后添加三乙胺(0.3mL)和分子筛(2g)。在室温下搅拌0.5小时后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.12mL，1.50mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后向混合物中加入对甲苯硫代磺酸钾(0.61g，2.25mmol)的无水DMF(3mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，然后添加2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(403mg，2.01mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩得到粗化合物T3。
化合物T4：未经分离，将粗化合物T3溶解在THF(10mL)中，然后添加四丁基氟化铵(1.0M，1.0mL，1.0mmol)的THF溶液。将混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后，将混合物真空浓缩，添加饱和NaHCO3溶液(50mL)，将混合物用二氯甲烷提取。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化得到化合物T4(199mg，由化合物T2进行制备的产率为27％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.41(s,1H),7.44(s,1H),7.07(t,J＝6.6Hz,1H),6.11(t,J＝7.0Hz,1H),4.88–4.80(m,2H),4.57(m,1H),4.14(q,J＝2.9Hz,1H),3.93(m，1H),3.82(m,1H),3.49(d,J＝6.2Hz,2H),3.10(t,J＝6.2,4.1Hz,1H),2.42–2.39(m,2H),1.91(s,3H),1.31(m,6H).13CNMR(75MHz,CDCl3)δ164.39,158.22,150.95,137.33,111.61,87.33,85.30,80.39,78.65,77.66,62.84,50.70,48.24,37.28,25.74,12.86；MS(APCI+)C17H24F3N3O6S2：计算值：487.51，实验值：487.6。
3'-O-NH2-DTM-dTTP(T5)：将化合物T4(50mg，103μmol)、四丁基焦磷酸铵(150mg，0.27mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(33mg，0.17mmol)在室温下高真空下分别干燥过夜。在氩气中将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后添加三丁胺(1.5mL)。在氩气中将混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF溶液(DMF，2mL)中。搅拌1小时后，将反应混合物加入到3'-O-乙基二硫基甲基胸苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，添加水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。将水层真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物，得到T5，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C15H28N3O14P3S2：计算值：631.45，实验值：631.0。
3'-O-Bodipy-DTM-dTTP(化合物T6)：向搅拌的Bodipy FL-NHS酯(1.5mg，3.9μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的3'-O-DTM-dTTP(化合物T5，4.0μmol)。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗产物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-Bodipy-dTTP T6，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C29H41BF2N5O15P3S2：计算值：905.5，实验值：904.1。
3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP(化合物T7)：向搅拌的Bodipy-PEG4-酸(2.1mg，3.8μmol)的无水DMF(200μl)溶液中加入N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(1.03mg，4.0μmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.48mg，4.0μmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。TLC表明Bodipy-PEG4-酸完全转化为化合物Bodipy-PEG4-NHS酯，其直接用于在NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH8.9，0.1M)(300μl)中与氨基-3'-O-DTM-dTTP(3.8μmol)偶联。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-PEG4-Bodipy-dTTP T7，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C40H62BF2N6O20P3S2：计算值：1152.8，实验值：1151.4。
3'-O-Rox-DTM-dATP和3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP的合成
N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷(A2)：在搅拌下将乙酸(3mL)和乙酸酐(9mL)添加到N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷(A1，1.41g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(48小时)，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯提取(3×30mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)对所需化合物的残余物进行纯化，得到纯产物A2(1.39g，88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.81(s,1H),8.35(s,1H),8.10–8.01(m,2H),7.68(m,1H),7.49(m,2H),6.53(dd,J＝7.5,6.0Hz,1H),4.78–4.65(m,3H),4.24(dt,J＝4.3,3.1Hz,1H),3.98–3.81(m,2H),2.80–2.60(m，2H),2.21(s,3H)，0.94(s,10H),0.13(s,6H)；MS(APCI+)C25H35N5O4SSi：计算值：529.73，实验值：529.4.。
化合物A3：将N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷(A2,550mg，1.04mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(2g)。在室温下搅拌0.5小时后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.12mL，1.50mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后向混合物中加入对甲苯硫代磺酸钾(0.61g，2.25mmol)的无水DMF(3mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，然后添加2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(302mg，1.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩，得到粗化合物A3：MS(APCI+)C30H41F3N6O5S2Si：计算值：714.89，实验值：714.6。
化合物A4：未经分离，将粗化合物A3溶解在THF(10mL)中，然后添加四丁基氟化铵(1.0M，1.0mL，1.0mmol)的THF溶液。将混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后，将混合物真空浓缩，添加饱和NaHCO3溶液(50mL)，将混合物用二氯甲烷提取。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化，得到化合物A4(128mg，由化合物A2进行制备的产率为20％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.16(s,1H),8.77(s,1H),8.11(s,1H),8.07–8.00(m,2H),7.61(m,1H),7.56-7.52(m,2H),6.91(m,1H),6.33(dd,J＝9.4,5.5Hz,1H),5.83(d,J＝10.7Hz,1H),4.88(d,J＝2.6Hz,2H),4.75(dt,J＝5.4,1.2Hz,1H),4.36(q,J＝1.7Hz,1H),4.03(dd,J＝12.8,1.8Hz,1H),3.81(t,J＝10.9Hz,1H),3.51(d,J＝6.2Hz，2H),3.10(m,1H),2.56–2.46(m,1H),1.36(s,6H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.91,152.49,151.03,150.71,142.95,133.82,133.33,129.29,128.29,125.00,118.23,114.41,88.01,87.10,80.37,80.19,63.91,60.76,50.66,47.99,38.17,25.82,25.75；MS(APCI+)C24H27F3N6O5S2：计算值：600.6，实验值：600.7。
3'-NH2-DTM-dATP(A5)：将化合物A4(50mg，103μmol)、四丁基焦磷酸铵(150mg，0.27mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(33mg，0.17mmol)在室温下高真空下分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后添加三丁胺(1.5mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液中。搅拌1小时后，将反应混合物加入到3'-O-乙基二硫基甲基胸苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，添加水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。将水层真空浓缩至约20mL，然后添加浓NH4OH(20ml)，在室温下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到A5，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C15H27N6O12P3S2：计算值：640.45，实验值：639.6。
3′-O-Rox-DTM-dATP(化合物A6)：向搅拌的ROX-NHS酯(2mg，3.2μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的氨基3'-O-DTM-dATP(化合物A5，3.0μmol)。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗产物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-Rox-dATP A6，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C48H55N8O16P3S2：计算值：1157.0，实验值：1155.4。
3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP(化合物A7)：向搅拌的ROX-PEG4-酸(2.6mg,3.3μmol)的无水DMF(200μl)溶液中加入N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.90mg,3.5μmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.43mg，3.5μmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。TLC表明ROX-PEG4-酸完全转化为化合物ROX-PEG4-NHS酯，其直接用于在NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH8.9，0.1M)(300μl)中与氨基-3'-O-DTM-dATP(3.5μmol)偶联。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-PEG4-Rox-dATP A7，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C59H76N9O21P3S2：计算值：1404.3，实验值：1401.6。
3'-O-Alexa488-DTM-dCTP和3'-O-PEG4-Alexa488-DTM-dCTP的合成
N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷(C2)：在搅拌下将乙酸(8mL)和乙酸酐(20mL)添加到N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧胞苷(C1，2.25g，2.51mmol)的DMSO(20mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(24小时)，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(3×50mL)提取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(DCM/MeOH:1/30)纯化所需化合物的残余物，得到纯产物C2(2.13g，83％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.92(d，J＝7.6Hz,2H),7.66(m,1H)，7.53(m,3H)，6.30(t,J＝6.0Hz,1H),4.69(dd,J＝32Hz；7.6Hz,2H),4.50(m,1H),4.18(m,1H),3.98–3.83(m,2H)，2.74(m,1H)，2.21-2.12(m，4H),0.93(s,9H),0.15(m,6H).MS(APCI+)C24H35N3O5SSi：计算值：505.70，实验值：505.6。
化合物C3：将N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷(C2，0.87mg，1.72mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(2g)。在室温下搅拌0.5小时后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.15mL，1.80mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后向混合物中加入对甲苯硫代磺酸钾(0.68g，2.5mmol)的无水DMF(3mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，然后添加2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(402mg，2.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，浓缩有机级分，得到粗化合物C3：MS(APCI-)C29H41F3N4O6S2Si：计算值：690.87，实验值：689.8[M-H]。
化合物C4：未经分离，将粗化合物C3溶解在THF(10mL)中，然后添加四丁基氟化铵THF溶液(1.0M，1.0Ml，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后，将混合物真空浓缩，添加饱和NaHCO3溶液(50mL)并将混合物用二氯甲烷提取。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，并将获得的粗混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)纯化，得到化合物C4(171mg，由化合物C2进行制备的产率为17％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.94(br,1H),8.32(d,J＝7.5Hz,1H),7.90–7.83(m,2H),7.65–7.55(m,2H),7.49(dd,J＝8.4,7.1Hz,2H),7.12(t,J＝6.3Hz,1H),6.15(t,J＝6.4Hz,1H),4.93–4.78(m,2H),4.58(dt,J＝6.5,3.3Hz,1H),4.24(q,J＝3.0Hz,1H),4.02(dd,J＝12.1,3.0Hz,1H),3.86(dd,J＝12.1,2.9Hz,1H),3.66(br,1H),3.50(d,J＝6.2Hz,2H),2.71(m,1H),2.40(m,1H),1.34(s,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ162.82,158.20,157.72,155.45,146.01,133.63,129.40,127.98,97.24,89.14,86.04,80.46,78.25,62.47,50.72,48.04,38.47,25.78；MS(APCI+)C23H27F3N4O6S2：计算值：576.61，实验值：576。
3'-NH2-DTM-dCTP(C5)：将化合物C4(50mg，87μmol)，四丁基焦磷酸铵(140mg，0.25mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(30mg，0.15mmol)在室温高真空下分别干燥过夜。在氩气氛下将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后添加三丁胺(1.5mL)。在氩气氛下将混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液中。搅拌1小时后，将反应混合物加入到3′-O-乙基二硫基甲基胸苷的溶液中，并在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，添加水(30mL)并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。将含水层真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化得到C5，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C14H29N4O13P3S2：计算值：618.4，实验值：616.7。
3'-O-Alexa488-DTM-dCTP和3'-O-PEG4-Alexa488-DTM-dCTP可以通过将3'-NH2-DTM-dCTP(C5)与Alexa488的NHS酯偶联来合成。
3′-O-Cy5-DTM-dGTP和3′-O-Cy5-PEG4-DTM-dGTP的合成
N4-DMF-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷(G2)：将2′-脱氧鸟苷(G1，1.33g，5mmol)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(825mg，5.5mmol)和咪唑(370mg，5.5mmol)的混合物溶于无水DMF(20mL)中，并在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后除去溶剂，将残余物加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(2.5mL)的无水DMF(10mL)溶液中。在室温下再继续搅拌10小时，然后将反应混合物倒入搅拌的冰水(200mL)中，通过抽滤收集沉淀物，用水和己烷洗涤。所得粗产物用柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化，得到N4-DMF-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G2，1.76g，81％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.52(s,1H),8.60–8.55(m,1H),7.91(s,1H),6.43(t,J＝6.7Hz,1H),4.68(d,J＝4.6Hz,1H),4.16–4.08(m,1H),3.94–3.87(m,1H),3.87–3.77(m,2H),3.16(s,3H),3.07(s,3H),2.63–2.49(m,2H),0.91(s,9H),0.09(d,J＝0.8Hz,6H).MS(APCI+):MS(APCI+)C19H32N6O4Si：计算值：436.58，实验值：436.6。
N4-DMF-3'-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G3)：在搅拌下将乙酸(3mL)和乙酸酐(9mL)添加到N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧腺苷(G2，1.31g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(48小时)，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(3×30mL)提取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化所需化合物的残余物，得到纯产物G3(1.16g，78％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.76(s,1H),8.61(s,1H),7.85(s,1H),6.33(dd,J＝7.4,6.4Hz，1H)，4.74–4.63(m，2H),4.63–4.58(m，1H)，4.13(m，1H),3.84–3.71(m，2H),3.19(d，J＝0.7Hz,3H),3.10(d，J＝0.7Hz,3H),2.58–2.46(m，2H)，2.17(s,3H),0.91(s,9H)，0.09(s,6H)；MS(APCI+)C21H36N6O4SSi：计算值：496.7，实验值：496.8。制备目标化合物3′-O-Cy5-DTM-dGTP和3'-O-Cy5-PEG4-DTM-dGTP。
使用3'-O-Rox-DTM-dATP可逆终止子的连续聚合酶延伸和通过MALDI-TOF质谱法 进行的表征(结果如图33中所示)
使用200pmol的可逆终止子(3'-O-Rox-DTM-dATP)、2单位的TherminatorTM IX DNA聚合酶(购自NEB的9°NTM DNA聚合酶变体)、100pmol的DNA引物(5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3')(SEQ ID NO：2)、和60pmol的DNA模板(5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTGCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATC CTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3′)(SEQ ID NO:1)在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行第一次延伸反应。在ABI GeneAmpPCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行38个如下的循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。进行多次反应，使用C18 ZipTip柱(密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州)将一部分反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
使用购自NEB的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)使残留的可逆终止子核苷酸失活，并使用THP(三-羟丙基-膦)从DNA延伸产物的3′末端去除Rox-叔丁基-SS基团以重新生成3'-OH基团准备用于下一个延伸反应。通过将延伸反应混合物与最终浓度为5mM的THP进行温育并在65℃温育5分钟来进行切割反应。
将THP处理后的反应混合物通过反相HPLC在XTerra MS C18、2.5μm 4.6mm×50mm柱(沃特世公司，马萨诸塞州)上纯化以获得纯的切割产物。流动相：A，8.6mM三乙胺/100mM1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的水溶液(pH8.1)；B，甲醇。在40℃下以0.5mL/min的流速以如下线性梯度洗脱90分钟：从88％A/12％B至65.5％A/34.5％B。纯化产物用于随后的延伸反应。
由于在DNA引物结合位点之后DNA模板上有两个连续的Ts，所以第二次延伸反应以与第一次延伸反应相同的方式进行。总体结果如图33所示。每个步骤后引物的MALDI TOFMS表明3′-Rox-SS-dATP的准确掺入、SS键的有效切割和3′OH的再生，以及又一3'-Rox-SS-dATP的掺入。
使用3′-O-Rox-PEG4-DTM-dATP可逆终止子的DNA聚合酶延伸，使用THP的切割反应 和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征(结果如图34A-34C中所示)。
使用200pmol的可逆终止子(3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP)、2单位的TerminatorTM IXDNA聚合酶(NEB)、100pmol的引物(5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3')(SEQ ID NO:2)和60pmol的DNA模板(5′-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTGCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3′)(SEQ ID NO:3)在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mMMnCl2，pH 8.8，25℃)中进行DNA聚合酶延伸。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行如下的38个循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。然后使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
使用购自NEB的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)使残留的可逆终止子核苷酸失活，并使用THP从DNA延伸产物的3'末端去除保护基团以重新生成3'-OH基团。通过将延伸反应混合物与最终浓度为5mM的THP进行温育并在65℃温育5分钟来进行切割反应。
使用3′-O-Bodipy-DTM-dTTP或3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP可逆终止子的DNA聚 合酶延伸，使用THP的切割反应，和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征(结果如图35A-35C和 图36A-36C中所示)
与源自超嗜热原始菌(Thermococcus kodakaraensis)的9°N及密切相关的KODDNA聚合酶结合的DNA的二元结构已被发表(Bergen K,Betz K,Welte W，Diederichs K，Marx A.Structures of KOD and 9oN DNA polymerases complexed with primertemplate duplex.ChemBioChem.2013；14(9):1058-1062.)。这些作者推测了这些酶对修饰的核苷酸更耐受的原因。与A家族聚合酶相比小沟似乎相对较少受到空间位阻限制，这可能解释了它们在利用具有小的C4'修饰的核苷酸时相对容易的原因。类似地，可能存在更容易接近的大沟，这可以解释这些酶能够在嘧啶的C5位置处和7-脱氮嘌呤的C7位置处接受具有大体积的修饰的核苷酸的能力。不幸的是，尚未获得与古菌B家族聚合酶的三元复合物的晶体结构，因此很难说关于于进入的核苷酸周围的位置的确定性，且尚未发表9°N的突变形式(例如，Therminator III和IX)的晶体。我们已经成功地使用了几种9°N聚合酶突变体来掺入脱氧核苷酸类似物，该脱氧核苷酸类似物在末端磷酸基团处(Therminator γ(Kumar S，Tao C，Chien M，et al.PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for SingleMolecule DNA Sequencing by Synthesis.Scientific Reports.2012；2:684.doi:10.1038/srep00684.,Fuller CW，Kumar S，Porel M,et al.Real-time single-moleculeelectronic DNA sequencing by synthesis using polymer-tagged nucleotides on ananopore array.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America.2016；113(19):5233-5238.doi:10.1073/pnas.1601782113)和碱基处(9°N聚合酶(外切)A485L/Y409V(Guo J，Xu N，Li Z,et al.Four-color DNA sequencingwith 3′-O-modified nucleotide reversible terminators and chemically cleavablefluorescent dideoxynucleotides.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America.2008；105(27):9145-9150.doi:10.1073/pnas.0804023105,Ruparel et al 20105)和Therminator II)以及糖的3'氧处(Therminator III和最近的Therminator IX)具有多种有时相当大的修饰。
使用200pmol的可逆终止子(3'-O-Bodipy-DTM-dTTP或3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP)、2单位的TerminatorTM IX DNA聚合酶(NEB)、100pmol的引物(5’-GATAGGACTCATCACCA-3’)(SEQ ID NO:4)、和60pmol的DNA模板(5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTGCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3')(SEQ ID NO:5)在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行DNA聚合酶延伸。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行如下的38个循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
使用购自NEB的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)使延伸反应混合物中残留的可逆终止子核苷酸失活，并使用THP从DNA延伸产物的3'末端去除保护基团以重新生成3'-OH基团。通过将延伸反应混合物与最终浓度为5mM的THP进行温育并在65℃温育5分钟来进行切割反应。使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
实施例1的参考文献：1.Hyman E.D.(1988)A new method of sequencingDNA.Anal Biochem 174(2):423-436.,2.Ronaghi M,Uhlén M,Nyrén P(1998)Asequencing method based on real-time pyrophosphate.Science 281(5375):363-365.,3.Ju J,Li Z,Edwards J.R.,Itagaki Y(2003)US Patent 6,664,079.,4.Li Z,etal.(2003)A photocleavable fluorescent nucleotide for DNA sequencing andanalysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100(2):414-419.,5.Braslavsky I,Hebert B，Kartalov E,Quake S(2003)Sequence information can be obtained from single DNAmolecules.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(7):3960-3964.,6.Ruparel H，et al.(2005)Design and synthesis of a 3’-O-allyl photocleavable fluorescent nucleotide asa reversible terminator for DNA sequencing by synthesis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(17):5932-5937.，7.Margulies M，et al.(2005)Genome sequencing inmicrofabricated high-density picolitre reactors.Nature 437(7057):376-380.，8.Ju J，et al.(2006)Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavablefluorescent nucleotide reversible terminators.Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(52):19635-19640.,9.Wu J，et al.(2007)3’-O-modified nucleotides as reversibleterminators for pyrosequencing.Proc.Natl.Acad.Sci.USA104(104):16462-16467.,10.Guo J，et al.(2008)Four-color DNA sequencing with 3’-O-modified nucleotidereversible terminators and chemically cleavable fluorescent dideoxynucleotides.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(27):9145-9150.,11.Bentley D.R.,et al.(2008)Accurate whole human genome sequencing using reversible terminatorchemistry.Nature 456(7218):53-59.，12.Harris T.D.,et al.(2008)Single-moleculeDNA sequencing of a viral genome.Science 320(5872):106-109.，13.Eid J，et al.(2009)Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.Science 323(5910):133-138.，14.Rothberg J.M.,et al.(2011)An integrated semiconductordevice enabling non-optical genome sequencing.Nature 475(7356):348-352.,15.Palla M，etal.(2014).DNA sequencing by synthesis using 3'-O-azidomethylnucleotide reversible terminators and surface-enhanced Raman spectroscopicdetection.RSC Adv.Jan 1；4(90):49342-49346.,16.Hutter D，et al.(2010)Labelednucleoside triphosphates with reversibly terminating aminoalkoxygroups.Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids 29:879-895.，17.Knapp D.C.，et al.(2011)Fluoride-Cleavable，Fluorescently Labeled Reversible Terminators:Synthesis and Use in Primer Extension.Chem.Eur.J.,17，2903–2915.,18.Kwiatkowski M.(2007)Compounds for protecting hydroxyls and methods fortheir use.US Patent 7,279,563.,19.Muller S,Matthaus J.(2011)Method forproducing trinucleotides.Patent Application WO 2011061114.,20.Semenyuk A,etal.(2006)Synthesis of RNA using 2’-O-DTM protection.JACS,128,12356-12357；JuJ,et al(2016)Raman Cluster Tagged Molecules for Biological Imaging.美国专利20160024570；Ju J,et al(2015)DNA Sequencing by Synthesis Using Raman andInfrared Spectroscopy Detection.美国专利申请20150080232。
实施例2：使用3'-O-修饰的核苷酸类似物通过合成方法测序
基于荧光的DNA合成测序方法在检测灵敏度方面具有许多优点。然而，由于荧光团的尺寸大，需要针对测序反应优化具体的聚合酶和反应条件。此外，当前在SBS中使用的可切割荧光核苷酸可逆终止子在切去荧光团后在生长中的DNA链的碱基上留下修饰的基团或疤，这又限制了读段长度。
已报道在3'-OH处具有以下保护基团的荧光NRT：3'-O-烯丙基-dNTP(Bentley(2008))、3'-O-叠氮甲基-dNTP(Wu(2007)；Guo(2008)；Bentley(2008))、3'-O-NH2-dNTP(Hunter(2010))、和3'-O-氰乙基-dNTP(Knapp(2011))，其可分别被Pd(0)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、稀亚硝酸和氟化物切割以产生游离的3'-OH基团。
已经报道了对核苷的各种基于3'-O-烷基二硫基甲基(3'-O-DTM)的修饰(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2010))，以用于合成寡核苷酸。还已经建立了由O-DTM组产生羟基的稳定性和还原切割(Kwiatkowski(2007)；Muller(2011)；Semenyuk(2010))，但是它们在DNA测序应用中的用途尚未见报道。这是因为据报道，具有保护3'-OH基团的大分子荧光染料的核苷酸类似物在模板指导的DNA合成中通过DNA聚合酶没有被掺入。
通过连接至荧光染料以保护核苷酸的3'-OH基团的可切割接头的特有的化学设计，并结合特定的聚合酶反应条件，本文公开了修饰的3'-O-二硫基甲基(3'-O-DTM)是成功的可逆连接基团，其用于连接荧光染料报道分子以保护用于DNA SBS的核苷酸的3'-OH基团。为此，本文公开了新型的3'可逆标记的核苷酸作为无痕可逆终止子，这是为DNASBS设计和合成的。在这些新型的核苷酸类似物中，只有核苷酸的3'-OH基团被DTM接头可逆地保护，该接头与荧光标签连接，从而实现核苷酸的3'-O-修饰的双重功能，即作为可逆终止子的功能和作为可切割荧光报道分子的功能(图1和图2A-2E)。
本文进一步公开了在SBS循环中，这种3'-O-染料-DTM-dNTP作为底物被DNA聚合酶Therminator(9°N DNA聚合酶变体)很好地识别并掺入生长中的DNA链中。在通过其荧光信号确定掺入的核苷酸的身份后，进行TCEP或三(3-羟丙基)膦(THP)处理来切割DMT部分中的二硫键，从而去除荧光报道分子并重新生成3′-OH基团(图3A-3B)，以允许连续测序。在每次掺入和切割后，产生延伸的天然DNA链，以允许在SBS期间无缝掺入进入的互补3'-O-染料-DTM-dNTP。
将3'-O-染料-DTM-dNTP用于SBS具有令人惊讶的优点。如本文所公开的，已经进行了使用3'-O-染料-DTM-dNTP与合成模板和引物的连续聚合酶延伸反应。在单碱基延伸和DTM部分的切割以及从DNA延伸产物的3'-O处除去染料后，所得的引物延伸产物可以用另外的3'-O-染料-DTM-dNTP进一步延伸，从而获得高产量掺入和准确的序列测定。因为这些3'-O-染料-DTM-dNTP不需要在碱基上连接荧光标签，所以它们的合成更简单，因此更具成本效益。此外，延伸的DNA链与天然DNA相同。对于SBS而言，3'-O-染料-DTM-dNTP的使用将获得非常长且准确的读段长度。
本文公开的并且在下面更详细地解释的是各种新的DNA测序方法，其基于3'-O-可切割接头-标签-dNTP、3'-O-可切割接头-锚-dNTP和3'-O-可切割基团-dNTP以及它们的正交报道分子染料标记的结合分子对应物或可切割的报道分子的组合使用。3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP和3'-O-SS(DTM)-dNTP以及与荧光染料缀合(或使用不同的可切割连接与荧光染料缀合)的正交结合分子的组合使用使得能够构建用于单分子水平或整体水平上的4-色、2-色和单色DNA SBS的多种新方法。
实施例A：单色DNA SBS(图3A-3B)
使用3'-O-生物素-SS(DTM)-dNTP和Cy5标记的链霉亲和素的无疤单色SBS(图2A-2E)。通过使用四种3'-O-生物素-SS-dNTP中的一种进行DNA聚合酶掺入反应，然后添加Cy5标记的链霉亲和素并进行成像以确定步骤1-步骤4中所述的DNA序列(如图3A-3B所示)。每个步骤由三部分组成：(a部分)添加聚合酶和四种3'-O-生物素-SS-dNTP中的一种，然后洗涤；如果添加的核苷酸与模板上紧邻引物3′末端的核苷酸互补，则添加的核苷酸将掺入引物中以产生在3'末端具有生物素的DNA延伸产物。(b部分)添加Cy5标记的链霉亲和素，其将与DNA延伸产物的3′末端的生物素结合。(c部分)洗去未结合的Cy5标记的链霉亲和素后，进行成像以检测Cy5信号用于鉴定掺入的核苷酸。在步骤4之后，向DNA延伸产物中加入THP将切割二硫键并在DNA延伸产物的3'末端重新生成游离的3'-OH基团。依次重复该过程，包括步骤1至步骤4，然后进行THP切割，以继续进行序列测定。
实施例B.四色DNA SBS(图7)
使用3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-PBA-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP、3'-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP)(图4)和四种相应匹配的染料标记的结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5-标记的链霉亲和素和R6G-标记的二苯并环辛炔)(图5)的无疤SBS。将DNA聚合酶和四种3'-O-“锚”-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-PBA-SS-dCTP、3'-O-生物素-SS-dGTP和3'-O-N3-SS-dTTP)加入到经固定化的带有引物的DNA模板中，使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链以终止DNA合成。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，加入染料标记的结合分子，这些分子将与每个DNA延伸产物的3'末端处的四个特有“锚”部分中的每一个特异性连接，以使得能够使用四种不同的荧光染料标记由四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的每种DNA产物。检测源自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号使得能够鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应(如图7中后续步骤所示)做好准备。
图6A-6D示出DNA产物之间的缀合物或复合物的形成，其中通过使用四种相应匹配的标记的结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5-标记的链霉亲和素和R6G-标记的二苯并环辛炔)掺入3'-O“锚”标记的核苷酸(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基-dATP、3'-O-PBA-叔丁基二硫基甲基-dCTP、3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基-dTTP)产生所述DNA产物。
实施例C.2-色DNA SBS(图13A-13B)
使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dCTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dTTP和3'-O-TCO-SS-dGTP)以及它们相应的染料标记的结合分子(Rox-四嗪和BodipyFL-二苯并环辛炔)进行2-色DNA SBS(图12)。将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dCTP、3'-O-N3-SS-dTTP和3'-O-TCO-SS-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板，使得能够将互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链以终止DNA合成(步骤1)。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，检测源自Rox和BodipyFL的荧光信号以鉴定掺入的核苷酸为A(由Rox标记)和C(由BodipyFL标记)。接下来，将染料标记的结合分子(Rox-四嗪和BodipyFL-二苯并环辛炔)添加到DNA延伸产物中(步骤2)，这些分子将与每个DNA延伸产物的3'末端处的两个特有的“锚”部分(TCO和N3)特异性连接，使得由两种核苷酸类似物(G和T)中的每一种终止的每个DNA产物能够被两种不同的荧光染料标记(以G终止的情况下用Rox标记，以T终止的情况下用BodipyFL标记)。检测源自DNA延伸产物上的Rox和BodipyFL的新产生的特有荧光信号(除来自步骤1的信号外)，以将新掺入的核苷酸分别鉴定为G或T。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团(步骤3)，这为下一个循环的DNA测序反应(如图13A-13B的后续步骤所示)做好准备。
将3'-O-可切割接头-标签-dNTP、3'-O-可切割接头-锚-dNTP和3'-O-可切割基团-dNTP与经由不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记的结合分子的组合使用能够构建单分子或整体分子水平上的单色SBS。在掺入3'-锚-DTM-dNTP和3'-DTM-dNTP后，使用与荧光染料(ATTO647N、Cy5、Rox等)通过不同的可切割连接(偶氮基、Dde、硝基苄基、二甲基缩酮等)(图14)缀合的正交标记的结合分子进行处理使得在DNA延伸产物的3'末端处掺入的3'-锚核苷酸由于特异性锚-结合分子反应而被标记。进行连续的特异性切割，然后进行成像，以从DNA延伸产物的3'末端去除染料，从而能够准确检测信号变化。每种切割方法仅切割与标记的结合分子之一特异性连接的一种类型的接头，因此可使用每种切割方法来编码针对该特定核苷酸类似物的其相应的3'-O-锚部分上的DNA碱基之一。通常，四种DNA碱基(A、C、G、T)中只有三种需要具有标签以进行选择性检测。一旦这些碱基中的前三种碱基被标记，第四种碱基不需要标签来与其他三种进行区分以进行序列测定，如以下方案中所举例说明的。
实施例D.单色DNA SBS(图16A-16C)
1：在DNA聚合酶存在下，将三种3'-锚核苷酸[3'-SS(DTM)N3-dATP、3'-SS(DTM)TCO-dTTP、3'-SS(DTM)生物素-dCTP]和3'-叔丁基-SS(DTM)-dGTP(如图15所示)加入带有引物的DNA模板以使得能够掺入引物。
2：通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-ATTO647N、四嗪-Dde(接头)-ATTO647N、链霉亲和素-ATTO647N(如图15所示)添加到含有掺入的3'-锚核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标签(例如ATTO647N)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)由于特异性的锚-结合分子相互作用而在它们的3'末端处被标记。
3：洗涤后，进行第一轮成像，由A、C和T终止的DNA产物均显示相同的颜色，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止。
4：通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠(Na2S2O4)仅切割偶氮键以从由A核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第二轮成像。如果荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了A核苷酸。
5：通过用肼(N2H4)处理进行第二次切割(II)，肼切割将切割Dde键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第三轮成像。如果荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。具有未改变的荧光信号的DNA产物通过推断鉴定为由C核苷酸终止。
6：用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并除去C上的染料，因此在THP处理后信号的变化将DNA产物确定为由C核苷酸终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。
7：重复步骤1-6以继续后续的单色DNA SBS循环。
实施例E.单色DNA SBS(图18A-18C)
1：在DNA聚合酶存在下，将两种3'-锚核苷酸[(3'-O-N3-SS(DTM)-dTTP、3'-O-生物素-SS(DTM)-dCTP)]、3'-O-Rox-SS(DTM)-dATP和3'-O-叔丁基-SS(DTM)-dGTP(如图17所示)添加到带有引物的DNA模板以使得能够掺入到引物中。
2：通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox、链霉亲和素-Rox(如图17所示)添加到含有掺入的3'-锚核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标签(例如Rox)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)由于特异性的锚-结合分子相互作用而在它们的3'末端处被标记。
3：洗涤后，进行第二轮成像，由A、C和T终止的DNA产物均显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止。
4：通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠(Na2S2O4)仅切割偶氮键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。
5：用THP进行第二次切割(II)以切割二硫键并从由核苷酸A和核苷酸C终止的DNA延伸产物中除去染料，因此在THP处理后信号的变化将DNA产物确定为由C核苷酸终止，因为已经在上述第一轮成像中确定了由A核苷酸终止的DNA产物。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复上述步骤以继续随后的单色DNA SBS循环。
实施例F.单色DNA SBS(图20A-20C)
1：在DNA聚合酶存在下，将三种3′-锚核苷酸[3'-O-N3-SS(DTM)-dGTP、3'-O-生物素-SS(DTM)-dCTP、3'-O-TCO-SS(DTM)-dTTP]和3'-O-Rox-SS(DTM)-dATP(如图19A-19B所示)加入带有引物的DNA模板以使得能够掺入引物。
2：洗涤后，进行第一轮成像，由A核苷酸类似物终止的DNA产物显示Rox信号，因此确定已掺入A核苷酸，而其他由G、C、T终止的DNA产物不会显示任何荧光信号。
3：通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox、四嗪-Dde-Rox和链霉亲和素-Rox(如图19A-19B所示)添加到含有掺入的3'-锚核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标签(例如Rox)，这使得所有掺入的核苷酸由于特异性的锚-结合分子相互作用而在它们的3'末端处被标记。
4：洗涤后，进行第二轮成像，由A、G，T，C终止的DNA产物均显示相同的Rox信号。从在第一轮成像中被确定为由A核苷酸终止的DNA产物中减去Rox信号，结果显示由G、T、C终止的DNA产物。
5：通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠仅切割偶氮键以从由G核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了G核苷酸。
6：用肼(N2H4)进行第二次切割(II)，肼切割将切割Dde键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后保留，则确定DNA产物已经掺入C核苷酸。
7：用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A和核苷酸C终止的DNA延伸产物中除去Rox染料，因此在THP处理后信号的变化也证实DNA产物由C核苷酸终止，因为已经在上述第一轮成像中确定了由A核苷酸终止的DNA产物。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-7以继续随后的单色DNA SBS循环。
实施例G单色DNA SBS(图22)
(1)在DNA聚合酶存在下，将三种3'-O-可切割接头-标签-dNTP[3'-O-Rox-SS(DTM)-dATP、3'-O-Rox-烯丙基-dTTP、3'-O-Rox-硝基苄基-dCTP]和3'-O-叔丁基-SS-dGTP(如图21所示)加入带有引物的DNA模板以使得能够掺入引物。
(2)洗涤后，进行第一轮成像，由C、T和A终止的DNA产物均显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止。
(3)通过～350nm的光照射进行第一次切割(I)，以从由C核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物已经掺入C核苷酸。
(4)用Pd(0)进行第二次切割(II)，Pd(0)将切割烯丙基连接以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后仍然存在，则确定DNA产物已经掺入A核苷酸。
(5)用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A终止的DNA延伸产物中除去Rox染料，因此在THP处理后信号的变化也证实DNA产物由A核苷酸终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH，这为随后的单色DNASBS循环做好准备。重复步骤1-5以继续随后的单色DNA SBS的循环。
所有上述示例性测序方法(实施例A-G)都可通过使用3'-O-叔丁基-SS-dNTP的未标记的核苷酸可逆终止子的追加延伸来修饰(Ju(2006))。在该步骤中，在使用3'-O-可切割接头-标签-dNTP和3'-O-可切割接头-锚-dNTP的每步聚合酶延伸反应后，使用3'-O-叔丁基-SS-dNTP来进行聚合酶延伸以确保在3'-末端的完全引物延伸以进行整体SBS。
对使用一些上述核苷酸类似物的聚合酶反应的DNA延伸产物进行MALDI-TOF质谱分析，结果如图23A-23B至图28A-28C中所示。结果表明，用相对较小的3'-O保护基团修饰的3'-O-叔丁基-SS-dATP通过聚合酶掺入的效率远高于用大体积的Rox染料标记的3'-O-Rox-SS-dATP的掺入效率。与没有PEG接头的由Rox修饰的核苷酸类似物相比，通过PEG4接头由Rox修饰的核苷酸类似物证明是更好的DNA聚合酶底物。
使用3'-O-DTM-dNTP、3'-O-锚-DTM-dNTP和3′-O-染料-DTM-dNTP的聚合酶延伸和 通过MALDI-TOF质谱法进行的表征
使用3'-O-SS-Rox-dATP进行5个、10个和30个循环的聚合酶延伸反应。使用200pmol的可逆终止子3'-O-SS-Rox-dATP、2单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、20pmol的DNA引物(分子量6084)和100pmol的DNA模板在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％ Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行延伸反应。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行5个、10个或30个如下的循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用OligoClean&ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABIVoyager，德拉维尔州)进行分析，结果如图23A-23B中所示。DNA模板：5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTCCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3'(SEQ ID NO:6)。DNA引物(分子量6084)：5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3'(SEQ ID NO:7)。
使用3'-O-叔丁基-SS-dATP的聚合酶延伸反应(5个循环)。使用200pmol的可逆终止子3'-O-叔丁基-SS-dATP、2单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、20pmol的DNA引物(分子量6084)和100pmol的DNA模板在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％ Triton X-100、和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行延伸反应。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行5个如下循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用Oligo Clean&ConcentratorTM(ZYMOResearch)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析，结果如图24所示。DNA模板：5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTCCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3'(SEQ ID NO:8)。DNA引物(分子量6084)：5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3'(SEQ ID NO:9)
使用比例为1:1的3'-O-叔丁基-SS-dATP和3'-O-Rox-SS-dATP的聚合酶延伸反应。使用100pmol的可逆终止子3'-O-叔丁基-SS-dATP、100pmol的可逆终止子3'-O-Rox-SS-dATP、2单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、20pmol的DNA引物(分子量6084)和100pmol的DNA模板在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mMMgSO4、0.1％ Triton X-100、和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行延伸反应。在ABI GeneAmpPCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行38个如下的循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用Oligo Clean&ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析，结果如图25A-25C中所示。DNA模板：5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTCCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3'(SEQ ID NO:10)。DNA引物(分子量6084)：5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3’(SEQ ID NO:11)。
使用3'-O-SS-TCO-dTTP的聚合酶延伸反应。使用100pmol的可逆终止子3'-O-SS-TCO-dTTP、2单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、20pmol的DNA引物(分子量5163)和100pmol的DNA模板在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mMMgSO4、0.1％Triton X-100、和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行延伸反应。在ABI GeneAmpPCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行38个如下的循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用Oligo Clean&ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析，结果如图26所示。DNA模板：5′-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTCCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3'(SEQ ID NO:12)。DNA引物(分子量5163)：5’-GATAGGACTCATCACCA-3’(SEQ ID NO:13)。
使用3'-O-生物素-SS-dCTP的聚合酶延伸反应。使用100pmol的可逆终止子3'-O-生物素-dCTP、2单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、20pmol的DNA引物(分子量6131)和100pmol的DNA模板在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mMMgSO4、0.1％Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行延伸反应。在ABI GeneAmpPCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行如下的38个循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用Oligo Clean&ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析，结果如图27A-27B中所示。DNA模板：5’-TACCCGGAGGCCAAGTACGGCGGGTACGTCCTTGACAATGTGTACATCAACATCACCTACCACCATGTCAGTCTCGGTTGGATCCTCTATTGTGTCCGGG-3’(SEQ ID NO:14)。DNA引物(分子量6131)：5’-GTTGATGTACACATTGTCAA-3’(SEQ ID NO:15)。
使用比例为1:1的3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP的混合物的聚合酶延伸反应(5个循环)。使用100pmol的可逆终止子3'-O-Rox-SS-dATP、100pmol的可逆终止子(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP)、2单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、20pmol的DNA引物(分子量6084)和100pmol的DNA模板在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行延伸反应。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行如下的5个循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用Oligo Clean&ConcentratorTM(ZYMOResearch)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析，结果如图28A-28C中所示。DNA模板：5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTCCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3'(SEQ IDNO:16)。DNA引物(分子量6084)：5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3'(SEQ ID NO:17)。
3'-O-叔丁基-SS-dNTP的结构如图29所示，这些分子根据下述方案合成。
3'-O-修饰的核苷酸类似物的合成
本文公开的并且在下面更详细地解释的是具有以下一般结构3'-O-可切割接头-标签-dNTP、3'-O-可切割接头-锚-dNTP和3'-O-可切割基团-dNTP的三组核苷酸的设计和合成如下所述：3'-O-DTM-染料-dNTP、3'-O-锚-DTM-dNTP(图2A-2E和图4)和3'-O-DTM-dNTP，其中荧光染料或小的锚部分通过DTM可切割接头与核苷酸的3'-O-位连接。每个掺入的核苷酸类似物含有3'-O-DTM基团，其在序列测定的每个循环后被切割；然后重新生成掺入的核苷酸的3'-OH用于随后的SBS循环。使用MALDI-TOF MS分析在聚合酶反应中使用上述核苷酸所产生的DNA延伸产物，我们确定这些3'-O修饰的核苷酸类似物是DNA聚合酶的有效底物以终止DNA合成。这些结果还证实在水溶液中可将荧光团(或锚部分)和3'-O-DTM基团在一步中高效除去，并且在掺入的核苷酸上没有任何残留的疤。因此，在每次核苷酸掺入和切割后，天然核苷酸被恢复，产生不具有修饰的生长中的DNA链，并且不会阻碍进一步的聚合酶反应。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-dTTP(5a)的合成(方案30)
3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T2)：在搅拌下将乙酸(2.6mL，45mmol)和乙酸酐(8.6mL，90mmol)添加到5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T1，1.07g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到饱和碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(3×30mL)提取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1:2)将化合物纯化得到纯产物T2(0.97g，74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.16(s,1H),7.48(s,1H),6.28(m,1H),4.62(m,2H),4.46(m,1H),4.10(m,1H),3.78–3.90(m,2H),2.39(m,1H),2.14(s,3H),1.97(m,1H),1.92(s,3H),0.93(s,9H),0.13(s,3H)；HRMS(FAB+)C18H33N2O5SSi[(M+H)+]：计算值：417.1879，实验值：417.1890。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T3)：将3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T2，420mg，1mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后添加三乙胺(0.18mL，1.31mmol，1.2当量)和分子筛(2g)。混合物在室温下搅拌30分钟后，在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(重蒸馏，0.1mL，1.31mmol，1.2当量)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，并将反应混合物再搅拌30分钟。然后将对甲苯硫代磺酸钾(375mg，1.65mmol)的无水DMF(2mL)溶液加入混合物中。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩得到粗产物T3。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷(T4)：不经分离，将粗化合物T3溶解在THF(10mL)中，加入四丁基氟化铵(1.0M，1.0mL，1.0mmol)的THF溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)，并用二氯甲烷提取混合物(3×20mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化得到3'-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷T4(132mg，由化合物T2进行制备的产率为35％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.41(q,J＝1.2Hz,1H),6.15(dd,J＝7.4,6.5Hz,1H),4.89-4.82(m,2H),4.62–4.54(m,1H),4.15(q,J＝3.0Hz,1H),3.97-3.86(m,2H),2.42(ddd,J＝7.5,4.8,2.5Hz,2H),1.95(d,J＝1.2Hz,3H),1.36(s,8H)。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-dTTP(T5)：将3'-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷(T4，50mg，0.13mmol)，四丁基焦磷酸铵(197mg，0.36mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)在室温下在高真空下分别干燥过夜。在氩气中将四丁基焦磷酸铵溶解于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，然后加入三丁胺(1mL)。在氩气中将该混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF溶液中(DMF，2mL)。搅拌1小时后，将反应混合物加入到3'-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取(2×30mL)。将水层在真空下浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物，得到T5，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C15H27N2O14P3S2：计算值：616.4，实验值：615.4。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP的合成(方案31)
N2-异丁酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷(G2)：向搅拌的N2-异丁酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷(G1，1.31g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(2.6mL，45mmol)和乙酸酐(8.6mL，90mmol)。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯提取(3×30mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(DCM/甲醇：20:1)将化合物纯化，得到纯产物G2(75％，1.15g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.10(d,J＝2.9Hz,1H),9.17(d，J＝3.0Hz,1H),8.03(m，1H),6.18(td，J＝6.9,2.9Hz,1H),4.74–4.60(m,3H),4.13(dq,J＝6.8,3.3Hz，1H),3.84–3.75(m,2H),2.78(m,1H),2.54(m,2H),2.16(s,3H),1.33–1.22(m,6H),0.96–0.87(m，9H)，0.09(dd,J＝6.7,3.8Hz，6H)。
N2-异丁酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷(G3)：将N2-异丁酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷(G2，511mg，1.0mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后加入三乙胺(0.17mL，1.2mmol)和分子筛(2g)。在室温下搅拌30分钟后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.095mL，1.2mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌30分钟。然后向混合物中加入4-甲苯硫代磺酸钾(341mg，1.5mmol)的无水DMF(2mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，然后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并快速通过硅藻土过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩，得到粗产物G3。
N2-异丁酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧鸟苷(G4)：未经分离，将粗化合物G3溶解在THF(10mL)中，添加四丁基氟化铵(1.0M，1.04Ml，1.04mmol)的THF溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物真空浓缩，添加饱和NaHCO3溶液(50mL)，将混合物用二氯甲烷提取(3×20mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化得到N2-异丁酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧鸟苷G4(155mg，由化合物G2进行制备的产率为33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.19(s,1H),9.44(s,1H),7.97(s,1H),6.17(dd,J＝8.4,5.9Hz,1H),5.04(s,1H),4.92–4.80(m,2H),4.76–4.64(m,1H),4.26(q,J＝2.6Hz,1H),3.98(dd,J＝12.2,2.8Hz,1H),3.80(d,J＝12.3Hz,1H),2.91–2.73(m,2H),2.49(m,1H),1.35(s,9H),1.36–1.22(m,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ179.60,155.80,148.10,147.96,139.11,122.30,86.29,81.22,78.96,63.21,48.07,38.18,36.64,30.29,19.39,19.34。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP(G5)：将N2-异丁酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧鸟苷(G4，50mg，0.11mmol)、四丁基焦磷酸铵(180mg，0.33mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)在室温下在高真空下分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后添加三丁胺(1mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液中。搅拌1小时后，将反应混合物加入到N2-异丁酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧鸟苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。将水层真空浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，在室温下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物，得到G5。HRMS(ESI-)C15H25N5O13P3S2[(M-H)-]：计算值：640.0103，实验值：640.0148。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-dATP的合成(方案32)
N6-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3'-O-甲硫基甲基-2'-脱氧腺苷(A2)：在搅拌下将乙酸(3mL)和乙酸酐(9mL)添加N6-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷(A1，1.41g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯提取(3×30mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化所需化合物的残余物，得到纯产物A2(1.39g，88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.81(s,1H),8.35(s,1H),8.10–8.01(m,2H),7.68(m,1H),7.49(m,2H),6.53(dd,J＝7.5,6.0Hz,1H),4.78–4.65(m,3H),4.24(dt,J＝4.3,3.1Hz,1H),3.98–3.81(m,2H),2.80–2.60(m,2H),2.21(s,3H)，0.94(s,10H),0.13(s,6H)；MS(APCI+)C26H36N4O4SSi：计算值：528.74，实验值：529.4[M+H]+。
N6-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3′-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A3)：将N6-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3'-O-甲硫基甲基-2'-脱氧腺苷(A2，529mg，1.0mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后加入三乙胺(0.17mL，1.2mmol)和分子筛(2g)。在室温下搅拌30分钟后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.095mL，1.2mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌30分钟。然后向混合物中加入4-甲苯硫代磺酸钾(341mg，1.5mmol)的无水DMF(2mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，然后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩，得到粗产物A3。
N6-苯甲酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧腺苷(A4)：未经分离，将粗化合物A3溶解在THF(10mL)中，添加四丁基氟化铵(1.0M，1.04Ml，1.04mmol)的THF溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)，将混合物用二氯甲烷提取(3×20mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化，得到N6-苯甲酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧腺苷A4(128mg，由化合物A2进行制备的产率为26％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.18(s,1H),8.77(s,1H),8.71(s,1H),8.10–8.02(m,2H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.56(t,J＝7.6Hz2H),6.47(dd,J＝8.0,6.0Hz,1H),5.15(t,J＝5.5Hz,1H),5.00(s,2H)，4.65(dt,J＝5.4,2.4Hz,1H),4.12(td,J＝4.7,2.2Hz,1H)，3.02–2.88(m，1H),2.84(q,J＝7.3Hz,2H),2.61(m,1H),1.35(s,9H)。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-dATP(A5)：将N6-苯甲酰基-3′-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧腺苷(A4，50mg，0.10mmol)、四丁基焦磷酸铵(180mg，0.33mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)在室温下高真空下分别干燥过夜。在氩气中将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后加入三丁胺(1mL)。在氩气中将混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF溶液中(DMF，2mL)。搅拌1小时后，将反应混合物加入到N6-苯甲酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧腺苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。将水层真空浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，在室温下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到A5，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C15H26N5O12P3S2：计算值：625.4，实验值：625.0。
3'-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP的合成(方案33)
N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷(C2)：在搅拌下将乙酸(2.91mL)和乙酸酐(9.29mL)添加到N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C1,1.5g,3.4mmol)的DMSO(6.5mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(2天)。然后将反应混合物滴加到碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯提取(50ml×3)。所得粗产物通过柱层析(乙酸乙酯/己烷：8/2)进行纯化，得到为白色固体的纯产物5(1.26g，74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.43(d,J＝7.4Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,2H),7.69–7.50(m,4H)，6.31(t,J＝6.1Hz,1H),4.75–4.59(m,2H),4.51(dt,J＝6.2,3.9Hz,1H),4.20(dt,J＝3.7,2.6Hz,1H),4.01(dd,J＝11.4,2.9Hz,1H),3.86(dd,J＝11.4，2.4Hz,1H),2.72(ddd,J＝13.8,6.2,4.1Hz,1H),2.18(s,4H),0.97(s,9H),0.17(d,J＝3.9Hz,6H).HRMS(ESI+)C24H35N3O5SSi[(M+H)+]：计算值：506.2145，实验值：506.2146。
N4-苯甲酰基-3′-O-叔丁基二硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C3)：将N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷(C2，1.01g，2mmol)溶解在无水二氯甲烷(8mL)中，然后加入三乙胺(278Ml，2mmol)和分子筛(1g)。在室温下搅拌0.5小时后，将混合物在冰浴中冷却，然后滴加磺酰氯(161μL,2.2mmol)的无水二氯甲烷(8mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后将对甲苯硫代磺酸钾(678mg，3mmol)的无水DMF(1mL)溶液加入混合物中。在室温下继续搅拌1小时，然后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，快速过滤。减压除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯中，用盐水(3×50mL)洗涤。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析使用3:7(v/v)-5:5(v/v)的乙酸乙酯-己烷梯度将所需化合物的残余物纯化，得到959mg为白色泡沫的C3(83％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.43(d,J＝7.4Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,2H),7.69–7.50(m,4H),6.31(t,J＝6.1Hz,1H),4.75–4.59(m,2H),4.51(dt,J＝6.2,3.9Hz,1H),4.20(dt,J＝3.7,2.6Hz,1H),4.01(dd,J＝11.4,2.9Hz,1H),3.86(dd,J＝11.4,2.4Hz,1H),2.72(ddd,J＝13.8,6.2,4.1Hz,1H),2.18(s,4H),0.97(s,9H),0.17(d,J＝3.9Hz,6H),0.10(s,2H).HRMS(ESI+)C27H41N3O5S2Si[(M+Na)+]：计算值：602.2155，实验值：602.2147。
N4-苯甲酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧胞苷(C4)：向搅拌的N4-苯甲酰基-3′-O-叔丁基二硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C3，958mg，1.66mmol)的四氢呋喃(24ml)混合物的溶液中以小份加入四丁基氟化铵(1.0M，2.48mL)，在室温下搅拌3小时。将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液(50mL)中，用乙酸乙酯提取(3×50mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析使用乙酸乙酯-己烷梯度(从5:5(v/v)开始)对所需化合物的残余物进行纯化，得到435mg(56％)C4，为白色固体粉末。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.52(d,J＝7.5Hz,1H),8.04–7.96(m,2H),7.71–7.60(m,2H),7.61–7.51(m,2H),6.28–6.19(m,1H),4.95–4.86(m,2H),4.54(dt,J＝6.0,3.0Hz,1H),4.23(q,J＝3.4Hz,1H),3.92–3.76(m,2H),2.70(ddd,J＝13.9,6.0,2.9Hz,1H),2.25(ddd,J＝13.6,7.2,6.2Hz,1H),1.37(s,9H).HRMS(ESI+)C21H27N3O5S2[(M+Na)+]：计算值：488.1290，实验值：488.1297。
3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP(C5)：在室温和高真空下将N4-苯甲酰基-3'-O-叔丁基二硫基甲基-2'-脱氧胞苷(C4，50mg，0.11mmol)、四丁基焦磷酸铵(180mg，0.33mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，随后加入三丁胺(1mL)。在氩气下将该混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。在搅拌1小时后，将反应混合物加入到N4-苯甲酰基-3′-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧胞苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。将水层真空浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)并在室温下搅拌过夜。真空浓缩所得混合物，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物，得到C5。HRMS(ESI-)C14H25N3O13P3S2[(M-H)-]：计算值：600.0042，实验值：600.0033。
3'-O-Bodipy-DTM-dTTP和3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP的合成(方案34)
3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T2)：在搅拌下将乙酸(2.6mL)和乙酸酐(8.6mL)添加到5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T1，1.07g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(48小时)，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯提取(3×30mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1/2)对所需化合物的残余物进行纯化，得到纯产物T2(0.97g，74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.16(s,1H),7.48(s,1H),6.28(m,1H),4.62(m,2H),4.46(m,1H),4.10(m,1H),3.78–3.90(m,2H),2.39(m,1H),2.14(s,3H),1.97(m,1H),1.92(s,3H),0.93(s,9H),0.13(s,3H)；HRMS(Fab+)C18H33N2O5SSi[(M+H)+]：计算值：417.1879，实验值：417.1890。
化合物T6：将3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(T2,625mg，1.50mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(2g)。在室温下搅拌0.5小时后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.12mL，1.50mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后向混合物中加入对甲苯硫代磺酸钾(0.61g，2.25mmol)的无水DMF(3mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，然后加入2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(403mg，2.01mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩得到粗化合物T6。
化合物T7：不经分离，将粗化合物T6溶于THF(10mL)中，然后加入四丁基氟化铵(1.0M，1.0mL，1.0mmol)的THF溶液。将混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后，将混合物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)并将混合物用二氯甲烷提取。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化得到化合物T7(199mg，由化合物T2进行制备的产率为27％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.41(s,1H),7.44(s,1H),7.07(t,J＝6.6Hz,1H)，6.11(t,J＝7.0Hz,1H),4.88–4.80(m,2H),4.57(m,1H),4.14(q,J＝2.9Hz,1H),3.93(m，1H),3.82(m,1H),3.49(d,J＝6.2Hz,2H),3.10(t,J＝6.2,4.1Hz,1H),2.42–2.39(m,2H),1.91(s,3H)，1.31(m,6H).13CNMR(75MHz,CDCl3)δ164.39,158.22,150.95,137.33,111.61,87.33,85.30,80.39,78.65,77.66,62.84,50.70,48.24,37.28,25.74,12.86；MS(APCI+)C17H24F3N3O6S2：计算值：487.51，实验值：487.6。
3'-O-NH2-DTM-dTTP(T8)：将化合物T7(50mg，103μmol)、四丁基焦磷酸铵(150mg，0.27mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(33mg，0.17mmol)在室温下高真空下分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后加入三丁胺(1.5mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液中。搅拌1小时后，将反应混合物加入到3'-O-叔丁基二硫基甲基胸苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。然后加入浓NH4OH(20ml)并在室温下搅拌过夜。将水层真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物，得到T8，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C15H28N3O14P3S2：计算值：631.45，实验值：631.0。
3'-O-Bodipy-DTM-dTTP(化合物T9)：向搅拌的Bodipy FL-NHS酯(1.5mg，3.9μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的3'-O-DTM-dTTP(化合物T8，4.0μmol)。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗产物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-Bodipy-dTTP T9，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C29H41BF2N5O15P3S2：计算值：905.5，实验值：904.1。
3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP(化合物T10)：向搅拌的Bodipy-PEG4-酸(2.1mg，3.8μmol)的无水DMF(200μl)中加入N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(1.03mg，4.0μmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.48mg，4.0μmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。TLC表明Bodipy-PEG4-酸完全转化为化合物Bodipy-PEG4-NHS酯，其直接用于在NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH8.9，0.1M)(300μl)中与氨基-3'-O-DTM-dTTP(3.8μmol)偶联。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-PEG4-Bodipy-dTTP T10，通过MALDI-TOFMS对其进行表征：C40H62BF2N6O20P3S2：计算值：1152.8，实验值：1151.4。
3'-O-Rox-DTM-dATP和3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP的合成(方案35)
N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷(A2)：在搅拌下将乙酸(3mL)和乙酸酐(9mL)添加到N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷(A1，1.41g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(48小时)，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯提取(3×30mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)对所需化合物的残余物进行纯化，得到纯产物A2(1.39g，88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.81(s,1H),8.35(s,1H),8.10–8.01(m,2H),7.68(m,1H),7.49(m,2H),6.53(dd,J＝7.5,6.0Hz,1H)，4.78–4.65(m,3H),4.24(dt,J＝4.3,3.1Hz,1H),3.98–3.81(m,2H),2.80–2.60(m,2H),2.21(s,3H),0.94(s,10H),0.13(s,6H)；MS(APCI+)C25H35N5O4SSi：计算值：529.73，实验值：529.4。
化合物A6：将N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧腺苷(A2，550mg，1.04mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(2g)。在室温下搅拌0.5小时后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.12mL，1.50mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后向混合物中加入对甲苯硫代磺酸钾(0.61g，2.25mmol)的无水DMF(3mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，然后加入2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(302mg，1.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩，得到粗化合物A6：MS(APCI+)C30H41F3N6O5S2Si：计算值：714.89，实验值：714.6。
化合物A7：不经分离，将粗化合物A6溶于THF(10mL)中，然后加入四丁基氟化铵(1.0M，1.0mL，1.0mmol)的THF溶液。将混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后，将混合物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)，将混合物用二氯甲烷提取。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化，得到化合物A7(128mg，由化合物A2进行制备的产率为20％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.16(s,1H),8.77(s,1H),8.11(s,1H),8.07–8.00(m,2H),7.61(m,1H),7.56-7.52(m,2H),6.91(m,1H),6.33(dd,J＝9.4,5.5Hz,1H),5.83(d,J＝10.7Hz,1H),4.88(d,J＝2.6Hz,2H),4.75(dt,J＝5.4,1.2Hz,1H),4.36(q,J＝1.7Hz,1H),4.03(dd,J＝12.8,1.8Hz,1H),3.81(t,J＝10.9Hz,1H),3.51(d,J＝6.2Hz,2H),3.10(m,1H),2.56–2.46(m,1H),1.36(s,6H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.91,152.49,151.03,150.71,142.95,133.82,133.33,129.29,128.29,125.00,118.23,114.41,88.01,87.10,80.37,80.19,63.91,60.76,50.66,47.99,38.17,25.82,25.75；MS(APCI+)C24H27F3N6O5S2：计算值：600.6，实验值：600.7。
3′-NH2-DTM-dATP(A8)：将化合物A7(50mg，103μmol)、四丁基焦磷酸铵(150mg，0.27mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(33mg，0.17mmol)在室温下高真空下分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后加入三丁胺(1.5mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1,3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液中。搅拌1小时后，将反应混合物加入到3'-O-叔丁基二硫基甲基胸苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。然后加入浓NH4OH(20ml)，在室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯提取所得溶液。将水层真空浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，在室温下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到A8，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C15H27N6O12P3S2：计算值：640.45，实验值：639.6。
3'-O-Rox-DTM-dATP(化合物A9)：向搅拌的ROX-NHS酯(2mg，3.2μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的氨基3'-O-DTM-dATP(化合物A8，3.0μmol)。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗产物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-Rox-dATP A9，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C48H55N8O16P3S2：计算值：1157.0，实验值：1155.4。
3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP(化合物A10)：向搅拌的ROX-PEG4-酸(2.6mg，3.3μmol)的无水DMF(200μl)溶液中加入N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.90mg，3.5μmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.43mg，3.5μmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。TLC表明ROX-PEG4-酸完全转化为化合物ROX-PEG4-NHS酯，将ROX-PEG4-NHS酯直接用于在NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH8.9，0.1M)(300μl)中进行的与氨基-3'-O-DTM-dATP(3.5μmol)的偶联。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。通过制备型硅胶TLC板(二氯甲烷/甲醇，4:1)纯化反应混合物。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-DTM-PEG4-Rox-dATPA10，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C59H76N9O21P3S2：计算值：1404.3，实验值：1401.6。
3'-O-TCO-DTM-dTTP的合成(方案36)：将化合物T8(1mg，1.6μmol)溶于0.1MNaHCO3/Na2CO3(500μL，pH＝8.8)，然后添加反式环辛烯基NHS酯(1mg，3.7μmol)的酸酐DMF(500μL)溶液，在室温下搅拌4个小时。将产物通过反相HPLC进行纯化，得到纯T11，通过HRMS对其进行表征：C21H33N6O16P3[M-H]：计算值：717.1088，实验值：717.1100。
3'-O-生物素-DTM-dCTP的合成(方案37)
N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷(C2)：在搅拌下将乙酸(8mL)和乙酸酐(20mL)添加到N4-苯甲酰基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷(C1，2.25g，2.51mmol)的DMSO(20mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(24小时)，通过TLC监测反应。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯提取(3×50mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(DCM/MeOH：1/30)对所需化合物的残余物进行纯化，得到纯产物C2(2.13g，83％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,2H),7.66(m,1H),7.53(m,3H),6.30(t,J＝6.0Hz,1H),4.69(dd,J＝32Hz；7.6Hz,2H),4.50(m,1H),4.18(m,1H),3.98–3.83(m,2H),2.74(m,1H),2.21-2.12(m,4H),0.93(s,9H),0.15(m,6H).MS(APCI+)C24H35N3O5SSi：计算值：505.70，实验值：505.6。
化合物C6：将N4-苯甲酰基-3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧胞苷(C2，0.87mg，1.72mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，然后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(2g)。在室温下搅拌0.5小时后，将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加磺酰氯(0.15mL，1.80mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。移去冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后将对甲苯硫代磺酸钾(0.68g，2.5mmol)的无水DMF(3mL)溶液加入混合物中。在室温下继续搅拌1小时，然后加入2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(402mg，2.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并通过硅藻土快速过滤。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩得到粗化合物C6：MS(APCI-)C29H41F3N4O6S2Si：计算值：690.87，实验值：689.8[M-H]-。
化合物C7：不经分离，将粗化合物C6溶于THF(10mL)中，然后加入四丁基氟化铵(1.0M，1.0mL，1.0mmol)的THF溶液。将混合物在室温下搅拌直至反应完成，通过TLC监测反应。然后，将混合物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)，并将混合物用二氯甲烷提取。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得的粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化，得到化合物C7(171mg，由化合物C2进行制备的产率为17％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.94(br,1H),8.32(d,J＝7.5Hz,1H),7.90–7.83(m，2H),7.65–7.55(m,2H),7.49(dd,J＝8.4,7.1Hz,2H),7.12(t,J＝6.3Hz,1H),6.15(t,J＝6.4Hz,1H),4.93–4.78(m,2H),4.58(dt,J＝6.5,3.3Hz,1H),4.24(q,J＝3.0Hz,1H),4.02(dd,J＝12.1,3.0Hz,1H),3.86(dd,J＝12.1,2.9Hz，1H),3.66(br,1H),3.50(d,J＝6.2Hz,2H),2.71(m,1H),2.40(m,1H),1.34(s,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ162.82,158.20,157.72,155.45,146.01,133.63,129.40,127.98,97.24,89.14,86.04,80.46,78.25,62.47,50.72,48.04,38.47,25.78；MS(APCI+)C23H27F3N4O6S2：计算值：576.61，实验值：576。
3'-NH2-DTM-dCTP(C8)：将化合物C7(50mg，87μmol)、四丁基焦磷酸铵(140mg，0.25mmol)和2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(30mg，0.15mmol)在室温下在高真空下分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶解在二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，然后加入三丁胺(1.5mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液中。搅拌1小时后，将反应混合物加入到3'-O-叔丁基二硫基甲基胸苷的溶液中，并在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。用乙酸乙酯提取所得溶液。将水层真空浓缩，用5ml水稀释残余物。然后于4℃下在DEAE-SephadexA-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗制混合物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到C8，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C14H29N4O13P3S2：计算值：618.4，实验值：616.7
3'-生物素-DTM-dCTP(C9)：向搅拌的生物素-NHS酯(2mg，3.2μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的氨基3'-O-DTM-dCTP(化合物C8，3.0μmol)。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3小时。然后于4℃下在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)将粗产物纯化，并通过反相HPLC进一步纯化，得到3'-O-生物素-DTM-dATP C9，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：计算值：842，实验值：842.5。
3'-O-DTM-锚-SS(DTM)-dNTP(结构如图4中所示)的合成如下面方案中所述。
染料标记的结合分子的合成
通过将可商购的结合分子原料与各种活化的染料结合来进行与荧光染料缀合的标记的结合分子的合成。方案42中显示了Rox标记的四嗪、Alexa488标记的SHA和R6G标记的二苯并环辛炔(DBCO)合成的实施例。
多染料缀合的结合分子(以Cy5-四嗪为例)的合成如方案43-45中所示。
Rox-7-Cy5标记的SHA(示于图10A)的合成。
Cy5标记的CPG(Glen Research)用于在DNA合成仪上启动固相寡核苷酸合成。将dSpacer亚磷酰胺用作连续七个结合循环的构建模块，然后在下一个结合循环中使用Rox标记的dT亚磷酰胺。在最后的结合循环中使用C5氨基修饰剂亚磷酰胺。在GlenResearch方案之后于温和条件下进行切割，之后产生氨基修饰的Rox-7-Cy5产物并通过HPLC对其进行纯化。在DMSO/NaCO3、NaHCO3缓冲液(pH8.9)中将SHA NHS酯与氨基修饰的Rox-7-Cy5偶联得到Rox-7-Cy5标记的SHA。
Rox-3-Cy5标记的DBCO(示于图10B)的合成
Cy5标记的CPG(Glen Research)用于在DNA合成仪上启动固相寡核苷酸合成。将dSpacer亚磷酰胺用作三个连续结合循环的构建模块，然后在下一个结合循环中使用Rox标记的dT亚磷酰胺。在最后的结合循环中使用C5氨基修饰剂亚磷酰胺。在GlenResearch方案之后于温和条件下进行切割，之后产生氨基修饰的Rox-3-Cy5产物并通过HPLC对其进行纯化。将DBCO NHS酯与氨基修饰的Rox-3-Cy5在DMSO/NaCO3、NaHCO3缓冲液(pH8.9)中偶联得到Rox-3-Cy5标记的DBCO。
通过不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记的结合分子的合成(图12中显示了这些分子的结构)显示在方案46-52中。
与荧光染料缀合的标记的结合分子的合成是通过将可商购的活化的染料与含有可切割连接部分的结合分子结合来实现的，所述可切割连接部分使用可商购的材料合成。
方案46显示了SHA-2-硝基苄基(接头)-ATTO647N的示例性合成。方案47显示了四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N的示例性合成，并使用文献方法41完成了偶氮接头部分的构建。方案48显示了链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N的示例性合成，并使用文献方法42完成二甲基缩酮接头部分的构建。方案49显示了二苯并环辛炔(DBCO)-烯丙基(接头)-ATTO647N的示例性合成。方案50显示了二苯并环辛炔(DBCO)-Dde(接头)-ATTO647N的示例性合成，并且使用文献方法43完成了Dde接头部分的构建。方案51显示了四嗪-Dde(接头)-ATTO647N和四嗪-Dde(接头)-ROX的示例性合成。方案52显示了DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ATTO647N和DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ROX的示例性合成。
以四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N、链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N和二苯并环辛炔-Dde(接头)-ATTO647N为例，方案55显示了在温和条件下(分别使用N2S2O4、柠檬酸和N2H4)的详细切割反应和使用由偶氮、二甲基缩酮和Dde构建的接头的切割产物。
3'-O-Rox-硝基苄基-dCTP和3'-O-Rox-烯丙基-dTTP的示例性合成分别示于方案53和方案54中。
使用3'-O-Rox-DTM-dATP可逆终止子的连续聚合酶延伸和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征(结果如图34A-34C中所示)
使用200pmol的可逆终止子(3'-O-Rox-DTM-dATP)、2单位的TherminatorTM IX DNA聚合酶(购自NEB的9°NTM DNA聚合酶变体)、100pmol的DNA引物(5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3')(SEQ ID NO:18)和60pmol的DNA模板(5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTGCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3')(SEQ ID NO:19)在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行该延伸反应。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行38个如下的循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。进行多次反应，使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将一部分反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
使用购自NEB的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)使残留的可逆终止子核苷酸失活，并使用THP从DNA延伸产物的3'末端去除Rox-叔丁基-SS基团以重新生成3'-OH基团准备用于下一个延伸反应。通过将延伸反应混合物与最终浓度为5mM的THP温育并在65℃温育5分钟来进行切割反应。
将THP处理后的反应混合物通过反相HPLC在XTerra MS C18、2.5μm 4.6mm×50mm柱(沃特世公司，马萨诸塞州)上纯化以获得纯的切割产物。流动相：A，8.6mM三乙胺/100mM1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的水溶液(pH8.1)；B，甲醇。使用从88％A/12％B至65.5％A/34.5％B的线性梯度在40℃下以0.5mL/min的流速洗脱90分钟。纯化产物用于随后的延伸反应。
由于在DNA引物结合位点之后在DNA模板上有两个连续的T，所以第二次延伸反应以与第一次延伸反应相同的方式进行。总体结果如图34A-34C所示。每个步骤后引物的MALDI TOF MS表明3'-Rox-SS-dATP的准确掺入，SS键的有效切割和3'OH的再生，以及又一3′-Rox-SS-dATP的掺入。
使用3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP可逆终止子的DNA聚合酶延伸，使用THP的切割反应和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征(结果如图35A-35C中所示)。
使用200pmol的可逆终止子(3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP)、2单位的TerminatorTM IXDNA聚合酶(NEB)、100pmol的引物(5'-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3')(SEQ ID NO:20)和60pmol的DNA模板(5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTGCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3')(SEQ ID NO:21)在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行DNA聚合酶延伸。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行38个如下的循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。然后使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
使用购自NEB的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)使残留的可逆终止子核苷酸失活，并使用THP从DNA延伸产物的3'末端去除保护基团以重新生成3'-OH基团。通过将延伸反应混合物与最终浓度为5mM的THP进行温育并在65℃温育5分钟来进行切割反应。
使用3'-O-Bodipy-DTM-dTTP或3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP可逆终止子的DNA聚合酶延伸，使用THP的切割反应和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征(结果如图10A-10D和图11中所示)
使用200pmol的可逆终止子(3'-O-Bodipy-DTM-dTTP或3'-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP)、2单位的TerminatorTM IX DNA聚合酶(NEB)、100pmol的引物(5’-GATAGGACTCATCACCA-3’)(SEQ ID NO:22)和60pmol的DNA模板(5'-GAAGGAGACACGCGGCCAGAGAGGGTCCTGTCCGTGTTTGTGCGTGGAGTTCGACAAGGCAGGGTCATCTAATGGTGATGAGTCCTATCCTTTTCTCTTCGTTCTCCGT-3′)(SEQ ID NO:23)在20μl缓冲液(含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mM MnCl2，pH 8.8，25℃)中进行DNA聚合酶延伸。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃下温育30秒，然后进行38个如下的循环：在65℃持续30秒、45℃持续30秒、65℃持续30秒。使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
使用购自NEB的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)使延伸反应混合物中残留的可逆终止子核苷酸失活，并使用THP从DNA延伸产物的3'末端去除保护基团以重新生成3′-OH基团。通过将延伸反应混合物与最终浓度为5mM的THP进行温育并在65℃温育5分钟来进行切割反应。使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将反应混合物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。
实施例2的参考文献：1.Hyman E.D.,“A new method of sequencing DNA.AnalBiochem”174(2):423-436(1988).；2.Ronaghi M.,Uhlén M.,Nyrén P.,“A sequencingmethod based on real-time pyrophosphate”Science 281(5375):363-365(1998).；3.JuJ.,Li Z.,Edwards J.R.,Itagaki Y.,美国专利第6,664,079号(2003).；4.Li Z.et al.,“A photocleavable fluorescent nucleotide for DNA sequencing and analysis”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2):414-419(2003).；5.Braslavsky I.,Hebert B.,Kartalov E.,Quake S.,“Sequence information can be obtained from single DNAmolecules”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(7):3960-3964(2003).；6.Ruparel H.et al.,“Design and synthesis of a 3’-O-allyl photocleavable fluorescent nucleotideas a reversible terminator for DNA sequencing by synthesis”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(17):5932-5937(2005).；7.Margulies M.et al.,“Genomesequencing in microfabricated high-density picolitre reactors”,Nature 437(7057):376-380(2005).；8.Ju J.et al.，“Four-color DNA sequencing by synthesisusing cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(52):19635-19640(2006).；9.Wu J.et al.,“3’-O-modified nucleotides as reversible terminators for pyrosequencing”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(104):16462-16467(2007).；10.Guo J.et al.,“Four-color DNA sequencing with 3’-O-modified nucleotide reversible terminators andchemically cleavable fluorescent dideoxynucleotides”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105(27):9145-9150(2008).；11.Bentley D.R.et al.,“Accurate whole human genomesequencing using reversible terminator chemistry”,Nature 456(7218):53-59(2008).；12.Harris T.D.et al.,“Single-molecule DNA sequencing of a viralgenome”,Science 320(5872):106-109(2008).；13.Eid J.et al.,“Real-time DNAsequencing from single polymerase molecules”,Science 323(5910):133-138(2009).；14.Rothberg J.M.et al.,“An integrated semiconductor device enablingnon-optical genome sequencing”,Nature 475(7356):348-352(2011).；15.RosenblumB.B.et al.,“New dye-labeled terminators for improved DNAsequencing patterns”,Nucleic Acids Res.,25,4500–4504(1997).；16.Zhu Z.et al.,“Directly labeled DNAprobes using fluorescent nucleotides with different length linkers”,NucleicAcids Res.,22,3418-3422(1994).；17.Pelletier H.et al.,“Structures of ternarycomplexes of rat DNApolymerase beta,a DNA template-primer,and ddCTP”,Science,264,189-1903(1994).；18.Cheeseman P.,“Method for sequencing polynucleotides”,U.S.Patent No.5,302,509(1994).；19.Canard B.et al.,“DNApolymerase fluorescentsubstrates with reversible 3’-tags”,Gene.,148,1-6(1994).；20.Welch M.B.et al.,“Synthesis of nucleosides designed for combinatorial DNA sequencing”,Chem.Eur.J.,5,951-960(1999).；21.Metzker M.L.，“Emerging technologies in DNAsequencing”,Genome Res.,15,1767–1776(2005).；22.Lu G.et al.,“A diversityoriented synthesis of 3’-O-modified nucleoside triphosphates for DNAsequencing by synthesis.Bioorg”,Med.Chem.Lett.,16,3902-3905(2006).；23.KimT.S.et al.，“Novel 3’-O-fluorescently modified nucleotides for reversibletermination of DNA synthesis”,ChemBiochem,11,75-78(2010).；24.Kim D.R.et al.,“Synthesis of 3’-O-fluorescently mono-modified reversible terminators andtheir uses in sequencing-by-synthesis”,Bioorg.Med.Chem.Lett.,24,209-213(2014).；25.Hutter D.et al.,“Labeled nucleoside triphosphates with reversiblyterminating aminoalkoxy groups”,Nucleos.Nucleot.Nucl.，29,879-895(2010).；26.Diana C.et al.,“Fluoride-Cleavable,Fluorescently Labelled ReversibleTerminators:Synthesis and Use in Primer Extension”,Chem.Eur.J.,17,2903-2915(2011).；27.Kwiatkowski M.,“Compounds for protecting hydroxyls and methods fortheir use”,U.S.Patent No.7,279,563(2007).；28.Muller S.et al.,“Method forproducing trinucleotides”,PCT International Application Publication No.WO2011/061114(2011).；29.Semenyuk A.et al.,“Synthesis of RNA using 2’-O-DTMprotection”,J.Am.Chem.Soc.,128,12356-12357(2006).；30.John C.et al.,“Rapid Cu-Free Click Chemistry with Readily Synthesized Biarylazacyclooctynones”,J.Am.Chem.Soc.,132,3688-3690(2010).；31.Shieha P.et al.,“Design strategies forbioorthogonal smart probes”,Org.Biomol.Chem.,12,9307-9320(2014).；32.MelissaL.et al.,“Tetrazine Ligation:Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity”,J.Am.Chem.Soc.,130,13518-13519(2008).；33.Marjoke F.et al.,“Bioorthogonal labelling of biomolecules:new functionalhandles and ligation methods”,Org.Biomol.Chem.,11,6439-6455(2013).；34.Bergseid M.et al.,“Small molecule-based chemical affinity system for thepurification of proteins”,BioTechniques,29,1126-1133(2000).；35.Anthony K.etal.,“Triple Fluorescence Energy Transfer in Covalently Trichromophore-LabeledDNA”,J.Am.Chem.Soc.,123,12923–12924(2001).；36.Ju J.,“Sets of labeled energytransfer fluorescent primers and their use in multi component analysis”,U.S.Patent No.5,952,180(1999).；37.Leriche G.et al.,“Optimization of theAzobenzene Scaffold for Reductive Cleavage by Dithionite；Development of anAzobenzene Cleavable Linker for Proteomic Applications”,Eur.J.Org.Chem.,23,4360-64(2010).；38.Budin G.et al.,“Nondenaturing Chemical Proteomics forProtein Complex Isolation and Identification”ChemBioChem,11,2359-2361(2010).；39.Binaulda S.et al.,“Acid-degradable polymers for drug delivery:a decade ofinnovation”,Chem.Commun.,49,2082-2102(2013).；40.Ellis R.A.et al.,“Chemicalconstructs”,European Patent No.EP 1119529 B1(2003).；41.Rathod K.M.et al.,“Synthesis and antimicrobial activity of azo compounds containing m-cresolmoiety”,Chem.Sci.Tran.,2,25-28(2013).；42.Shenoi R.A.et al.,“BranchedMultifunctional Polyether Polyketals:Variation of Ketal Group StructureEnables Unprecedented Control over Polymer Degradation in Solution and withinCells”,J.Am.Chem.Soc.,134,14945-14957(2012).；43.Chhabra S.R.et al.,“Anappraisal of new variants of Dde amine protecting group for solid phasepeptide synthesis Tetra”,Lett.,39,1603-1606(1998).
实施例3：使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸/聚合物标签和纳米孔检测的单分子电子合成测序
先前已经开发了通过合成方法的基于纳米孔的电子单分子实时DNA测序(Kumar等，Scientific Reports(2012)2,684；Fuller et al,PNAS USA(2016)113,5233-5238)。已经报道了纳米孔SBS测序方法，该方法将SBS与对连接于核苷酸的末端磷酸酯的不同大小的聚合物标签进行的基于纳米孔的鉴定相结合。将四个不同长度的PEG标签中的一个连接到每个核苷酸的末端磷酸酯上。尽管具有16-36个PEG单体单元的长标签，这些标记的核苷酸可通过DNA聚合酶被有效地掺入。在DNA聚合酶反应的磷酰基转移步骤期间，标签作为多磷酸酯副产物的一部分而被释放，因此只有天然核苷酸保留在生长中的DNA链中。在电压梯度下当标签通过包埋在脂质膜中的单蛋白纳米孔(α-溶血素)时，通过监测孔电流来检测和鉴定该标签。取决于PEG标签的长度，孔电流被降低到不同的水平，并且迁移需要不同的时间(Kumar等，Scientific Reports(2012)2,684)，使得能够区分这些标签并使得能够鉴定在SBS过程中掺入的每个核苷酸。
为了进一步开发这种纳米孔SBS方法并优化标签，Fuller等(PNAS USA(2016)113,5233-5238)报道了用修饰的寡核苷酸标记的核苷酸的设计和合成及其在纳米孔SBS中的应用。这些标签具有结构修饰，产生不同的离子电流阻塞，使用基于电子芯片的包埋在脂质双层膜中的纳米孔的的阵列来测量。使用Huisgen环加成叠氮化物/炔烃偶联化学过程(Fuller等人，美国专利申请US20150368710)将标签连接到2'-脱氧核苷-5'-六磷酸酯的末端磷酸基团上。利用这些标记的核苷酸，通过纳米孔SBS进行了单碱基分辨率的连续单分子电子DNA测序。在聚合酶催化循环期间进行电流测量，所述期间从互补的标记的核苷酸被结合在DNA聚合酶与引物/模板以及二价金属阳离子的复合物之内时起，持续至聚合酶催化步骤完成并释放标记的多磷酸酯产物为止。一旦该产物被释放，聚合物标签就可以自由地离开孔，从而结束该特定DNA合成步骤的阻断信号。为了增加每个标签按顺序测量的可能性，单个聚合酶分子以适当的距离共价连接于纳米孔，以允许纳米孔快速捕获标签。四种标签中的每一种具有独特的结构，其与αHL通道中的最窄缢缩部位相互作用，从而使通过通道的离子电流以不同的程度减小(Fuller等，PNAS USA(2016)113,5233-5238)。在这种方法中，关键是控制聚合酶反应的相对速度、纳米孔捕获标签以及离子电流监测以确保按顺序识别(call)每个碱基。如果不这样做将导致“插入”或“缺失”人为现象(artifact)。
我们认为可以通过添加一种核苷酸有目的地暂停反应来克服上述问题，该核苷酸具有包含锚的可切割的3'-OH保护基团(接头)，具有锚结合分子的纳米孔标签可以被连接到锚上。随后对这种标签的电子检测将导致一次识别(call)一个碱基，即使在同聚物序列段(homopolymeric tract)(具有相同碱基的核苷酸的片段(run)，例如An或Cn，其中n>1)中也是这样。存在一些这样的3'-O-可切割接头，其仍然允许将带有这种接头的核苷酸掺入生长中的DNA链中，包括本文所述的3'-O-二硫基甲基接头。
具有与本申请中所述的可切割接头连接的锚部分的3'-O-可切割接头(二硫基甲基，DTM)核苷酸可用于此类基于纳米孔的测序方法。与DTM接头上的锚相容的结合分子将连接于对四种核苷酸(A、C、G和T/U)中的每一种特异的纳米孔标签。简而言之，在由于与模板链上的互补核苷酸碱基配对而在引物中掺入带有锚的3'-O-可切割接头核苷酸之一后，用含有锚结合配体的纳米孔标签进行标记将揭示在该步中添加了哪个核苷酸；随后切割接头将释放标签以准备下一次掺入。在这个过程中，将重新生成3'-OH基团，以使生长中的DNA链仅具有天然核苷酸。
使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸的基于纳米孔的单分子SBS(一般方法)
因此，在本发明的一个实施方案中，在核苷酸的3'-O-位包含可切割接头(DTM)的核苷酸类似物与锚部分(例如生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)、苯基硼酸(PBA)、四环庚烷、降冰片烯)共价连接。这些锚部分可以与它们的结合配体(例如链霉亲和素、二苄基环辛烯(DBCO)、四嗪、水杨基羟肟酸(SHA)、双(二硫代苯偶酰)镍(II)化合物和含氧化腈的化合物(Zheng et al,Molecules(2015)20,3190-3205；Springer et al J.Biomol.Tech.(2003)14,183-190；Sletten and Bertozzi(2011)133,17570；Gutsmiedl et al,Org Lett(2009)11,2405))以双正交方式反应。一些上述分子可以作为锚置于核苷酸的3'-位或作为结合分子置于标签上。例如，PBA或苯基二硼酸(PDBA)与SHA分子在各种条件下反应形成复合物；生物素与链霉亲和素复合；叠氮基与DBCO反应；四嗪以有效率的方式与反式环辛烯和降冰片烯反应；四环庚烷与双(二硫代苯偶酰)镍(II)化合物复合，降冰片烯与氧化腈缀合(参见图37中的实例)；
其中，所述至少四种3'-O-锚-DTM核苷酸中的每一种包含三磷酸酯或多磷酸酯、碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其各自的衍生物)以及与在3'-O-位包含可切割接头(DTM)的核苷酸糖部分的3'-O-位共价结合的锚分子(图38、图39和图42中的实例)。
其中(i)每种锚连接的核苷酸中的碱基类型与其他三种锚标记的核苷酸中的每一种中的碱基类型不同，以及(ii)确定在第一步中哪个锚核苷酸已被掺入引物以形成DNA延伸产物，该确定步骤通过添加与不同的结合配体(其将与通过3'-O-可切割接头(DTM)部分连接的相应锚部分共价连接或复合)连接的四种不同的标签来完成。
其中锚和/或结合部分选自叠氮基、二苯并环辛炔、四嗪、环辛烯、降冰片烯、生物素、SHA、PBA、四环庚烷、氧化腈、双(二硫代苯偶酰)镍(II)化合物或链霉亲和素(图37)。
其中纳米孔标签是寡核苷酸、肽、PEG、碳水化合物或它们的组合(Fuller等，美国专利申请US20150368710)(图40中的实例)。
其中纳米孔标签与结合分子缀合(图41)，使用例如图43-46中所示的合成方案。
使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸的通过纳米孔进行的单分子SBS的变型
在以下四个实施方案中，聚合酶(图47A、图48和图49)或引物(图47B、图50和图51)与纳米孔连接。前者的优点是纳米孔捕获标签应该是快速的，并且就待测序的DNA的长度而言基本上具有无限的灵活性，因为酶活性位点从而标签释放位点将始终位于纳米孔通道附近。因此，这种方法对于长序列读段是理想的。在后一种情况下，该方法适用于短序列，包括单碱基基因分型测定。此外，在以下两个实施方案中(图48和图50)，4个标签将连接到4个锚上，这4个锚又连接到4个不同的核苷酸上。在另外两个实施方案中(图49和图51)，3个标签将连接到3个锚上，这3个锚又连接到3个核苷酸上，而第4个核苷酸仅具有可逆的保护基团(接头)而没有锚或标签。所有四种测序方案都允许添加四种核苷酸的混合物和四种或三种标签的混合物，从而减少反应步骤的数量。在以下实施方案中，在过程的每个步骤之后进行洗涤步骤。
使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS(由DNA聚合酶-纳 米孔缀合物启动的4锚4标签方案)(图48)
在本发明的一个实施方案中，单个聚合酶分子以适当的距离共价连接至纳米孔，使得纳米孔能够快速捕获标签。向包埋在脂质双层中的聚合酶偶联的纳米孔加入待测序的模板DNA以及合适的引物，随后进行以下步骤：
1)添加包含与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸(图38中的示例组)。将通过DNA聚合酶在引物的3'末端核苷酸残基处掺入与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O被可切割接头和锚部分保护，仅单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到引物中，从而防止在该步骤中进一步掺入；
2)将连接有对应于4种锚的不同的结合分子的4种不同的纳米孔标签添加至延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(1)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；
3)跨膜施加电压并测量由于步骤(2)中形成的连接于纳米孔的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的标记的核苷酸互补的、单链模板DNA中的核苷酸残基；
4)通过用合适的切割剂(例如DTT、TCEP或THP)处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH。对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(1)-(4)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(1)中将3′-O-可切割锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(4)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS(由DNA聚合酶-纳 米孔缀合物启动的3锚3标签方案)(图49)
在本发明的另一个实施方案中，单个聚合酶分子以适当的距离共价连接至纳米孔，使得纳米孔能够快速捕获标签。向包埋在脂质双层中的聚合酶偶联的纳米孔加入待测序的模板DNA与合适的引物，随后进行以下步骤：
1)添加四种核苷酸，其包括一种不含锚的3′-O-可切割接头(DTM)核苷酸和三种通过可切割接头与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)核苷酸(图39中的示例组)。将通过DNA聚合酶在引物的3’末端核苷酸残基处掺入与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O被无锚的可切割接头或具有锚部分的可切割接头保护，仅单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸或一种3'-O-可切割接头(DTM)核苷酸(不包含锚)将添加到引物中，从而防止在该步骤中进一步掺入；
2)将连接有对应于3种锚的不同的结合分子的3种不同的纳米孔标签添加至延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(1)中掺入的3′-O-锚核苷酸共价结合或复合；
3)跨膜施加电压并测量由于步骤(2)中形成的连接于纳米孔的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的标记的核苷酸互补的单链模板DNA中的核苷酸残基；如果在跨膜施加电压后不能测量到通过纳米孔的电子变化，则掺入的核苷酸将被确定为不包含锚的3'-O-可切割接头核苷酸；
4)通过用合适的切割剂(例如DTT、TCEP或THP)处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签或3'-O-可切割接头，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH。
对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(1)-(4)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸或者不包含锚的3'-O-可切割接头核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(1)中将3'-O-可切割锚核苷酸或者不包含锚的3'-O-可切割接头锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(4)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS(由DNA引物-纳米 孔缀合物启动的4锚4标签方案)(图50)
在本发明的另一个实施方案中，与待测序的单链DNA互补的单链引物共价连接至纳米孔。向该包埋在脂质双层中的引物偶联的纳米孔加入待测序的模板DNA与DNA聚合酶，随后进行以下步骤：
1)添加包含与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸(图38中的示例组)。将通过DNA聚合酶在引物的3’末端核苷酸残基处掺入与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O被可切割接头和锚部分保护，仅单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到引物中，从而防止在该步骤中进一步掺入；
2)将连接有对应于4种锚的不同的结合分子的4种不同的纳米孔标签添加至延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(1)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；
3)跨膜施加电压并测量由于步骤(2)中形成的连接于纳米孔的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的标记的核苷酸互补的单链模板DNA中的核苷酸残基；
4)通过用合适的切割剂(例如DTT、TCEP或THP)处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH。
对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(1)-(4)，其中如果3′-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(1)中将3'-O-可切割锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(4)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS(由DNA引物-纳米 孔缀合物启动的3锚3标签方案)(图51)
在本发明的另一个实施方案中，与待测序的单链DNA互补的单链引物共价连接至纳米孔。向该包埋在脂质双层中的、引物偶联的纳米孔加入待测序的模板DNA与DNA聚合酶，随后进行以下步骤：
1)添加四种核苷酸，其包括一种不含锚的3′-O-可切割接头(DTM)核苷酸和三种通过可切割接头与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)核苷酸(图39中的示例组)。将通过DNA聚合酶在引物的3’末端核苷酸残基处掺入与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O被无锚的可切割接头或具有锚部分的可切割接头保护，仅单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸或一种不包含锚的3'-O-可切割接头(DTM)核苷酸将被添加到引物中，从而防止进一步掺入；
2)将连接有对应于3种锚的不同的结合分子的3种不同的纳米孔标签添加至延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(1)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；
3)跨膜施加电压并测量由于步骤(2)中形成的连接于纳米孔的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的标记的核苷酸互补的、单链模板DNA中的核苷酸残基；如果在跨膜施加电压后不能测量到通过纳米孔的电子变化，则掺入的核苷酸将被确定为不包含锚的3'-O-可切割的接头核苷酸；
4)通过用合适的切割剂(例如DTT、TCEP或THP)处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签或者不包含标签的3'-O-可切割接头，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH。
对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(1)-(4)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸或者不包含锚的3′-O-可切割接头核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(1)中将3'-O-可切割锚核苷酸或者不包含锚的3'-O-可切割接头锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(4)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
使用3'-O-锚-可切割接头核苷酸通过纳米孔进行的单分子SBS(由DNA聚合酶-纳 米孔缀合物启动的2锚2标签2可切割接头方案)(图52A-52C)
除了基于纳米孔的四标签和三标签单分子SBS的上述四个实施方案之外，我们提出了二标签方法(图52)，其涉及使用两对3'-O-锚可切割接头核苷酸，一对带有DTM(SS)可切割接头，另一对带有正交可切割接头(2-硝基苄基(2NB)形式(图42)，但有包括烯丙基和偶氮形式的其他可能性)。这种方法的另一个方面是两种核苷酸带有一种类型的与接头连接的锚分子，其他两种核苷酸带有第二种类型的锚分子(本文中我们示出了N3锚和TCO锚，但其他可能的锚包括生物素、PBA、四环庚烷和降冰片烯)。最后使用两种不同的标签产生不同的纳米孔电子(离子电流)信号(本文我们示出了连接于DBCO的TAG1和连接于四嗪的TAG2，但是其他可能的锚结合分子包括链霉亲和素、SHA、双(二硫代苯偶酰)镍(II)化合物和氧化腈)。TAG1上的DBCO基团与N3锚缀合，而TAG2上的四嗪基团与TCO锚缀合。重要的是，每种核苷酸将具有可切割接头和锚的特有组合：在所示实例中，我们在dATP上使用N3锚和SS可切割接头，在dCTP上使用TCO锚和SS可切割接头，在dGTP上使用N3锚和2NB可切割接头，在dTTP上使用TCO锚和2NB可切割接头。最后，虽然如图47a所示，以聚合酶分子共价连接到纳米孔上来说明以下实施方案，但也可以如图47b所示将引物连接到纳米孔上来进行。在以下实施方案中，在过程的每个步骤之后进行洗涤步骤。
在本发明的一个实施方案中，单个聚合酶分子以适当的距离共价连接于纳米孔，以允许纳米孔快速捕获标签。向该包埋在脂质双层中的聚合酶偶联的纳米孔加入待测序的模板DNA与合适的引物，随后进行以下步骤：
1)添加如下所述的包含可切割接头和锚部分的四种核苷酸(3'-O-N3-SS-dATP、3'-O-TCO-SS-dCTP、3'-O-N3-2NB-dGTP和3'-O-TCO-2NB-dTTP)(图42中的示例组)。将通过DNA聚合酶在引物的3’末端核苷酸残基处掺入与单链DNA(模板)的下述核苷酸残基互补的合适的核苷酸类似物：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，从而形成DNA延伸产物。由于3'-O被可切割接头和锚部分保护，仅单个3'-O-锚可切割接头核苷酸将添加到引物中，从而防止在该步骤中进一步掺入；
2)将连接有对应于2种锚的不同的结合分子的2种不同的纳米孔标签(DBCO-TAG1和四嗪-TAG2)添加至延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(1)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合，因此，A和G将接收TAG1，C和T将接收TAG2。
3)跨膜施加电压并测量由于步骤(2)中形成的连接于纳米孔的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于两种不同的标签而言是不同的，从而部分地鉴定与掺入的标记的核苷酸互补的单链模板DNA中的核苷酸残基，因此，TAG1信号将表明A或G被掺入，TAG2信号将表明C或T被掺入。
4)通过用～340nm的光处理来切割3'-O-2-硝基苄基接头连接的标签，从而产生游离3'-OH准备在用G或T延伸的引物上进行下一个延伸反应，同时在留下A和C上的标签。
5)跨膜施加电压并测量由于步骤(2)中形成的任何仍连接于纳米孔的标签迁移通过纳米孔所造成的通过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于两种不同的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的标记的核苷酸互补的单链模板DNA中的核苷酸残基，因此，在步骤(3)中看到的TAG1信号的消失将表明掺入了G，而TAG1信号仍然存在将表明掺入了A；在步骤(3)中看到的TAG2信号的消失将表明掺入了T，而TAG2信号仍然存在将表明掺入了C。
6)通过用DTT或TCEP或THP处理来从任何仍存在的标签切割3'-O-SS(DTM)接头，以重新生成3'-OH基团，为下一个SBS测序循环做好准备。
对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(1)-(6)，其中其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(1)中将3'-O-可切割锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(4)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
实施例3的参考文献包括：Kumar et al.PEG-labeled nucleotides andnanopore detection for single molecule DNA sequencing by synthesis.ScientificReports(2012)2,684.Fuller et al.Real-time single-molecule electronic DNAsequencing by synthesis using polymer-tagged nucleotides on a nanoporearray.Proceedings of the National Academy of Sciences U,S,A,(2016)113,5233-5238.Fuller et al.Chemical methods for producing tagged nucleotides.US专利申请US20150368710.Zheng et al.Development of bioorthogonal reactions and theirapplications in bioconjugation.Molecules(2015)20,3190-3205.Springer etal.Salicylhydroxamic acid functionalized affinity membranes for specificimmobilization of proteins and oligonucleotides.Journal of BiomolecularTechniques(2003)14,183-190.Sletten EM,Bertozzi CR.A bioorthogonalquadricyclane ligation.Journal of the American Chemical Society(2011)133,17570-17573.Gutsmiedl K et al.Copper-free“click”modification of DNA vianitrile oxide—norbornene1,3-dipolar cycloaddition.Organic Letters(2009)11,2405-2408。
实施例4：使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP和3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP的基于荧光的SBS测序
我们提出了两种上述方案的结果，涉及针对四种碱基中的两种(例如，A和T(或U))的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP对和针对其他两种碱基(例如，C和G)的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP对。首先，我们证明了使用基于溶液的鉴定和MALDI-TOF MS读数能够连续掺入所有这四种核苷酸(图53)。接下来，我们展示了四-色SBS方案(图70)能够获得4碱基读段(图54)，其中模板固定在载玻片上，并使用具有不同发射光谱的四种染料进行荧光扫描。然后我们展示了使用一组仅产生两种颜色信号的染料获得的4碱基读段和6碱基读段(图56)(图71)。
我们还在本文中提出了利用以下类型的核苷酸类似物的各种组合的七种新方案：(1)具有通过偶氮连接于嘧啶碱基的5位或嘌呤碱基的7位的染料并且在3'-O-位具有连接有染料的二硫基甲基保护基团的那些核苷酸类似物(3'-O-DTM-dNTP-SS-染料和3'-O-DTM-dNTP-偶氮染料)；(2)具有通过基于二硫基甲基接头直接与糖上的3'-O-基团连接的染料的那些核苷酸类似物(3′-O-染料-SS(DTM)-dNTP)；(3)具有通过二硫基甲基、烯丙基或2-硝基苄基连接至3'-O-位的锚的那些核苷酸类似物，所述锚用于随后与染料连接(3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP、3'-O-锚-烯丙基-dNTP、3′-O-锚-2-硝基苄基-dNTP)。使用这些核苷酸组描述SBS测序反应的4-色变型和2-色变型：对于4-色形式，描述了使用来自组(1)的两种和来自组(2)的两种核苷酸的形式(图72)或者使用来自组(1)的两种和来自组(3)的两种核苷酸的形式(图73)。对于2-色形式，给出以下实例：使用来自组(1)的两种和来自组(3)的两种核苷酸的形式(图74)，使用来自组(1)的两种和来自组(2)的两种核苷酸的形式(图75)，或者使用来自组(3)的四种核苷酸的形式(图76)，其中两种具有SS且两种具有2NB(或其他)连接。
掺入两种3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP和两种3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP以在溶液中获得连续四碱基序列的示例：
图53.3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)在连续SBS中的使用，所述连续SBS采用MALDI-TOF MS检测中间产物。用两种3'-染料修饰的核苷酸(3'-SS-Rox-dATP和3'-SS-BodipyFL-dTTP)和两种3'-锚修饰的核苷酸(3'-SS-生物素-dCTP和3'-SS-TCO-dGTP)的混合物在溶液中进行反应。复制反应产物由经历了在65℃持续30秒、45℃持续30秒的条件下进行的38个循环的下列物质组成：在20μl的1XThermo Pol缓冲液中的20pmol的如下所示的51聚物模板、100pmol引物或碱基延伸引物(13-16mer)、150pmol 3'-O-染料(锚)-dNTP混合物、2单位Therminator IX DNA聚合酶和2mM锰。合并来自多个复制管的反应产物，使用HPLC除去未使用的3'-染料(锚)-dNTP和盐，并获得MALDI-TOF MS验证的纯的掺入产物。用100pmol三羟丙基膦(THP)在65℃下切割5分钟使得能恢复3'OH。用OligoClean&ConcentratorTM试剂盒(ZymoResearch，USA)处理样品以除去盐和切割的基团，用MALDI-TOF MS检测产物的大小。下面所示的13聚物用于初始反应。在随后的循环中，使用来自前一循环的、在3'末端用碱基延伸的引物。
如左图所示，进行了4个循环的延伸(a、c、e、g)和切割(b、d、f、g)，将A、C、G和T加到这些引物的3′末端(与5'方向上紧挨着模板中带下划线的引物结合位点的以粗体字母显示的4个碱基互补)。MALDI-TOF MS分析的结果证实添加了正确的核苷酸，然后在每个循环中转化为含有游离3'-OH基团的天然核苷酸。将核苷酸混合物添加到退火结合至DNA模板的13聚物引物中使得3'-SS-PEG4-Rox-dATP完全掺入引物中，如质谱(MS)中单个观察到的5188Da(预计5188Da)处的峰所证明的(a)。在用THP处理以切割3′-SS-PEG4-Rox基团后，在4264Da(预计4272Da)处观察到单个MS峰(b)。在第二个循环中14聚物引物的延伸表明3'-SS-生物素-dCTP掺入生长中的引物链中(观察到4941Da处的单个MS峰，预计4939Da)(c)。用THP处理后，观察到4564Da处的单个切割峰(预计4561Da)(d)。在第三个循环中，3'-SS-TCO-dGTP的掺入产生了5184Da处的MS峰(预计5194Da)(e)，并且通过MS显示锚的完全切割和3'-OH基团的恢复(在4894Da处的MS峰，预计4890Da)(f)。最后，在第四个循环中，新形成的16聚物DNA链用作3'-SS-BodipyFL-dTTP掺入的引物。MS结果(g和h)显示3'-SS-BodipyFL-dTTP掺入的分子量为5621Da(预计为5620Da)的单峰和切割后分子量为5197Da(预计为5195Da)的单峰。
51聚物模板：
5'-TACATCAACTACCCGGAGGCCAAGTACGGCGGGTACGTCCTTGACAATGTG-3’
13聚物引物：
5'-CACATTGTCAAGG-3'MW：3959
在每次掺入后，产物的预期大小应该是起始引物加上进入的核苷酸的总和减去焦磷酸酯基团的MW(175)，得到的MW为5188Da、4939Da、5194Da和5620Da。
在固定于玻璃载玻片上的DNA引物环状模板上使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP和3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP与它们的相应的染料标记的结合分子的组合进行的4-色测序的示例(图70和图54)
方案1.使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(TAMRA标记的四嗪和Cy5标记的链霉亲和素)进行4-色DNASBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、3'-O-TCO-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3′-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到在步骤1中没有被染料或锚标记的dNTP中的一种延伸的生长的DNA链中。生长的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止或由不具有染料或锚的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(TAMRA标记的四嗪和Cy5标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(G和C)中的每一种终止的各DNA产物(在用G终止的情况下用TAMRA标记，在用C终止的情况下用Cy5标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图55所示。
图56：使用四-色方法对固定在载玻片上的DNA进行的SBS的四碱基读段。使用图中顶部所示的引物-环状模板，其中接下来要添加的四个碱基是C、A、T、C，反应按照图70的方案进行。将5'-NH2-修饰的模板固定在购自Surmodics的NHS酯修饰的载玻片上。每个循环如下进行：(1)用60μl的下列物质在65℃下延伸15分钟：0.02μM 3'-O-Rox-SS-dATP、0.05μM3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、0.5μM 3'-O-生物素-PEG4-SS-dCTP、0.5μM 3'-O-TCO-SS-dGTP、1X Thermo Pol反应缓冲液(NEB)、2mM MnCl2、6单位的Therminator IX DNA聚合酶；(2)用1X Thermo Pol反应缓冲液洗涤；(3)用60μl的下列物质在65℃下追加反应10分钟：4μM的四种3'-O-SS(DTM)-dNTP中的每一种、1X Thermo Pol反应缓冲液、2mM MnCl2、2-10单元Therminator IX DNA聚合酶；(4)用1X Thermo Pol反应缓冲液洗涤；(5)用60μl的10μM四嗪-PEG4-TAMRA、4μM链霉亲和素-Cy5、和1X PBS，在pH7.4，37℃下标记10分钟；(6)用1XThermo Pol反应缓冲液、1X SPSC缓冲液(1X PBS，pH 7.4，0.5M NaCl，0.1％吐温-20)和水洗涤；(7)以488nm、543nm、594nm和633nm激发波长和每种染料合适的发射波长设置下扫描空气干燥的载玻片，以记录斑点的荧光强度；(8)用10mM THP在65℃下切割10分钟；(9)用水、1X SPSC和水再次洗涤；(10)扫描经空气干燥的载玻片以确定背景(必要时重复洗涤以使背景最小化)。以上所述进行4次以获得延伸引物的前四个碱基的底部条形图中所示的原始图像强度读数。
图55：在使用图70中描述的方法进行4-色DNA SBS时采用的3′-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)及它们的相应的染料标记的结合分子(TAMRA或Cy3标记的四嗪和Cy5标记的链霉亲和素)的结构。
在固定的DNA模板上使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP和3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP与它们的相应的染料标记的结合分子的组合成功进行的2-色连续测序的示例(图71和图56)：
图71.使用3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3′-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-PEG4-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(Alexa488-PEG4标记的四嗪和Alexa594标记的链霉亲和素)进行2-色DNA SBS。尽管在该实验中使用了4种不同的染料，但Rox和Alexa594具有非常相似的吸收和发射光谱，BodipyFL和Alexa488也是如此。因此，这被描述为2-色实验。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-PEG4-SS-dCTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物掺入到在步骤1中没有被染料或锚标记的dNTP中的一种延伸的生长的DNA链中。生长的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料或锚的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。进行成像以鉴定3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP的掺入。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(Alexa488-PEG4标记的四嗪和Alexa594标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(G和C)中的每一种终止的各DNA产物(在用G终止的情况下用Alexa488标记，在用C终止的情况下用Alexa594标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图71所示。
图56：在固定于载玻片的引物-环状模板DNA上使用2-色方法进行的SBS的四碱基读段和六碱基读段。使用图中顶部显示的环状引发模板，其中接下来要添加的四个碱基是T、A、G、A或使用图中部所示的环状引发模板，其中接下来的六个碱基是C、A、T、C、A、A，反应按照图71的方案进行。将5'-NH2-修饰的模板固定在购自Surmodics的NHS酯修饰的载玻片上。每个循环如下进行：(1)用60μl的下列物质在65℃下延伸15分钟：0.02μM 3'-O-Rox-SS-dATP、0.05μM 3'-O-BodipyFL-SS-dTTP、0.5μM 3'-O-生物素-SS-dCTP、0.2μM 3'-O-TCO-SS-dGTP、1X Thermo Pol反应缓冲液(NEB)、2mM MnCl2、6单位的Therminator IX DNA聚合酶；(2)用1X Thermo Pol反应缓冲液洗涤；(3)用60μl的下列物质在65℃下追加反应10分钟：4μM的四种3'-O-SS(DTM)-dNTP中的每一种、1X Thermo Pol反应缓冲液、2mM MnCl2、2-10单位的Therminator IX DNA聚合酶；(4)用1X Thermo Pol反应缓冲液洗涤；(5)使用合适的发射设置在488nm和594nm激发下扫描经空气干燥的载玻片，记录斑点的荧光强度；(6)用60μl的下列物质在pH7.4、37℃下标记10分钟：0.5μM四嗪-PEG4-Alexa488、0.5μM链霉亲和素-Alexa594、1X PBS；(7)用1X Thermo Pol反应缓冲液、1X SPSC缓冲液和水洗涤；(8)使用合适的发射设置在488nm和594nm激发下扫描空气干燥的载玻片，记录斑点的荧光强度；(9)用5mM THP在65℃下切割10分钟；(10)用水洗涤，用1X SPSC洗涤，并用水再次洗涤；(11)扫描经空气干燥的载玻片以确定背景(必要时重复洗涤以使背景最小化)。以上所述进行4-6次以获得模板结构下方条形图中所示的原始图像强度读数。在每个循环中，E表示延伸后的成像结果，L表示标记后的成像结果。因此，在上图中，由于直接连接到dTTP的3'-O-的BodipyFL染料的存在，在初始延伸后确定T，第二循环和第四循环中的A的情况也是如此；然而，直到标记反应才观察到第三个循环中的G，在标记反应中Alexa488-四嗪与dGTP的3'-O-上的锚分子(TCO)缀合。类似地，在下部条形图中，A和T的信号在延伸后立即可观察到，但是在进行标记反应之前观察不到C的信号。。
图57：在使用图71中的描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-PEG4-SS-dGTP和3'-O-生物素-SS-dCTP)及其相应的染料标记的结合分子(Alexa488标记的四嗪和Alexa594标记的链霉亲和素)的结构。
图72：3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于4-色DNA SBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于4-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G、3'-O-Rox-PEG4-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的染料标记的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链。用四种不同的荧光染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种来终止生长中的DNA链。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种不同的荧光染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。接下来，在步骤4中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图58所示。。
图58：在使用图72中描述的方法进行4-色测序时采用的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)和3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)的结构。
图73：3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)用于进行4-色DNASBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)用于进行4-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G、3′-O-TCO-SS-dATP和3'-O-生物素-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料或锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料或锚标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(A和T)中的每一种终止的各DNA产物(在用A终止的情况下用Rox标记，在用T终止的情况下用BodipyFL标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Rox信号表示A的掺入，BodipyFL信号表示T的掺入，Cy5信号表示G的掺入，R6G信号表示C的掺入。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图59所示。
图59：在使用图73中描述的方法进行4-色DNA SBS时采用的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP和3'-O-生物素-SS-dTTP)、3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)和相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的链霉亲和素)的结构。
图74：3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)用于进行2-色DNA SBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)、3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dATP、3'-O-生物素-SS-dTTP)及其相应的染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)用于进行2-色DNA SBS的用途。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-R6G、3′-O-TCO-SS-dATP和3'-O-生物素-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定，Cy5信号表明掺入了G，R6G信号表明掺入了C。步骤4，接下来，将染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和生物素)特异性连接，使得能够使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(A和T)中的一种终止的各DNA产物(以A终止的情况下用Cy5标记，以T终止的情况下用R6G标记)。步骤5，在洗去未结合的标签后，对源自DNA产物上的每种荧光染料的特有荧光信号的第二轮检测，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Cy5信号的出现表明掺入了A，R6G信号表明掺入了T。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图60所示。
图60：在使用图74中描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3′-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3’-O-TCO-SS-dATP和3’-O-生物素-SS-dTTP)、3’-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3’-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3’-O-SS-dCTP-5-SS-R6G)和相应的染料标记的结合分子(Cy5标记的四嗪和R6G标记的链霉亲和素)的结构。
图75：3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL)、3′-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于进行2-色DNA SBS。3'-O-SS(DTM)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL)、3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP、3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)用于进行2-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox、3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL、3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3′-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，在洗去未掺入的染料标记的核苷酸后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Rox信号表示掺入了A或G，BodipyFL信号表示掺入了C或T。步骤4，通过向延长的DNA链添加连二亚硫酸钠(Na2S2O4)来切割偶氮接头，从而从掺入的G中去除Rox并从掺入的C中去除BodipyFL。步骤5，在洗去切割的染料后，对源自DNA产物上每种荧光染料的特有荧光信号进行第二轮检测，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。Rox信号的消失表明掺入了G，BodipyFL信号的消失表明掺入了C。仍然存在的Rox信号表示掺入了A，仍然存在的BodipyFL信号表明掺入了T。接下来，在步骤6中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除剩余的荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。在偶氮基团和碱基之间存在另外的SS连接导致在THP处理后在掺入的核苷酸上产生较短的疤，这会导致更长的读段。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图61所示。
图61：在使用图75中描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3'-O-染料-SS(DTM)-dNTP(3'-O-Rox-SS-dATP和3'-O-BodipyFL-SS-dTTP)和3'-O-DTM(SS)-dNTP-偶氮-染料(3'-O-SS-dGTP-7-偶氮-Rox或3'-O-SS-dGTP-7-SS-偶氮-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-偶氮-BodipyFL或3'-O-SS-dCTP-5-SS-偶氮-BodipyFL)的结构。
涉及用于将染料连接在脱氧核苷酸的3'-O-位的两种不同的锚和两种不同的可切割接头的2-色SBS方案：
在这种情况下可以使用多种不同的可切割接头。两种核苷酸将带有SS(DTM)接头，其他两种将包括2-硝基苄基(2NB)接头(或偶氮接头或烯丙基接头)。这两种接头将与两种锚/结合分子对交叉组合使用(核苷酸的3'-OH上的TCO锚与其结合配体四嗪连接于一种荧光染料；N3锚与其配体结合分子连接于第二种染料)。关键是四种核苷酸中的每一种都具有不同的锚和接头组合：例如dATP可以具有N3锚和SS接头；dCTP可以具有TCO锚和SS接头；dGTP可以具有N3锚和2NB接头；dTTP可以具有TCO锚和2NB接头。虽然在下面的方案中(图76)我们使用SS接头(用DTT、TCEP或THP切割)和2-硝基苄基接头(用～340nm光切割)，但是其他可能的选择是SS接头和偶氮接头(用连二亚硫酸钠切割)或SS接头和烯丙基接头(用Pd(0)切割)。
图76：3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dATP和3'-O-TCO-SS-dCTP)和3'-O-锚-2-硝基苄基-dNTP(3'-O-N3-2-硝基苄基-dGTP和3'-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP)及它们的相应的染料标记的结合分子(BodipyFL标记的DBCO和Rox标记的四嗪)用于进行2-色DNASBS。3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-N3-SS-dATP和3'-O-TCO-SS-dCTP)和3'-O-锚-2-硝基苄基-dNTP(3'-O-N3-2-硝基苄基-dGTP和3'-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP)及它们的相应的染料标记的结合分子(BodipyFL标记的DBCO和Rox标记的四嗪)用于进行2-色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-N3-SS-dATP、3'-O-TCO-SS-dCTP、3'-O-N3-2-硝基苄基-dGTP和3'-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。步骤2，追加：将DNA聚合酶和4种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的3'-O-SS(DTM)-核苷酸类似物掺入到在所有DNA链中的、在步骤1中没有被任何一种染料或锚标记的dNTP延伸的生长中的DNA链的子集中。生长中的DNA链由四种锚标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或由不具有染料或锚标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。步骤3，接下来，将染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的DBCO)添加到DNA延伸产物中，其将与各DNA延伸产物上的两种特有的“锚”部分(TCO和N3)特异性连接，使得能够使用两种染料中的一种标记由四种核苷酸类似物中的一种终止的各DNA产物(以A和G终止的情况下用BodipyFL标记，以C和T终止的情况下用Rox标记)。步骤4，在洗去未结合的染料标记的结合分子后，检测源自DNA产物上每种荧光染料的荧光信号，使得可以鉴定掺入的核苷酸用于序列测定。BodipyFL信号表示掺入了A或G，Rox信号表示掺入了T或C。接下来，在步骤5中，用340nm光处理DNA产物以切割2-硝基苄基接头，从而去除荧光染料并在用G或T延伸的DNA延伸产物上重新生成游离的3'-OH基团。洗涤后，在步骤6中进行第二次进行成像以检测仍然存在的荧光信号。BodipyFL信号的消失表明掺入的核苷酸是G，Bodipy FL信号仍然存在表明掺入的核苷酸是A；类似地，Rox信号的消失表明掺入的核苷酸是T，Rox信号仍然存在表明掺入的核苷酸是C。最后，在步骤7中，用THP处理以切割残留在掺入的A或C上的任何染料，并恢复这些核苷酸上的3'-OH。此时，延伸产物已准备好进行下一个DNA测序循环反应。该方案中使用的修饰的核苷酸的结构如图63所示。
图63：在使用图76中描述的方法进行2-色DNA SBS时采用的3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP(3'-O-TCO-SS-dCTP和3'-O-N3-SS-dATP)、3'-O-锚-2NB-dNTP(3'-O-TCO-2NB-dTTP和3'-O-N3-2NB-dGTP)及其相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和BodipyFL标记的DBCO)。
图64：3'-O-锚-SS(DTM)-dNTP、3'-O-锚-烯丙基-dNTP和3'-O-锚-2NB-dNTP的结构。组合使用来自具有相同锚的一个类别中的两个、来自具有另一个锚的另一个类别中的两个以及它们相应的两个染料标记的结合分子使得可进行2-色DNA SBS。一种具体方法在图76中作为实例示出。
图66：3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-偶氮-Rox和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-偶氮-BodipyFL的示例合成。Rox和BodipyFL标记的偶氮接头NHS酯与3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-NH2和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-NH2偶联，得到3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-偶氮-Rox和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-偶氮-BodipyFL。
图67：3'-O-SS(DTM)-dATP-SS-Rox的合成。
图68：3'-O-SS(DTM)-dUTP-SS-BodipyFL的合成。
图69：3′-O-锚-2NB-dNTP(3′-O-TCO-2-硝基苄基-dTTP和3′-O-叠氮基-2-硝基苄基-dGTP)的示例合成。
合成方案
方案1.3'-O-Bodipy-DTM-dTTP和3′-O-Bodipy-PEG4-DTM-dTTP的合成。
方案2.3'-O-Rox-DTM-dATP和3'-O-Rox-PEG4-DTM-dATP的合成。
方案3.3'-O-Alexa488-DTM-dCTP和3'-O-PEG4-Alexa488-DTM-dCTP的合成。
方案4.3'-O-Cy5-DTM-dGTP和3'-O-Cy5-PEG4-DTM-dGTP的合成。
方案30.3'-O-叔丁基二硫基甲基-dTTP(5a)的合成。
方案31.3'-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP(G5)的合成。
方案32.3'-O-叔丁基二硫基甲基-dATP(A5)的合成。
方案33.3'-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP(C5)的合成。
方案34.
方案35.
方案36.3'-O-TCO-SS(DTM)-dTTP(T11)的合成。
方案37.3'-O-生物素-SS(DTM)-dCTP的合成。
方案38.3'-O-叠氮基-SS(DTM)-dTTP(3'-O-叠氮基-叔丁基二硫基甲基-dTTP)的合成。
方案39.3'-O-生物素-SS(DTM)-dGTP(3'-O-生物素-叔丁基二硫基甲基-dGTP)的合成。
方案40.3'-O-PBA-SS(DTM)-dCTP(3'-O-PBA-叔丁基二硫基甲基-dCTP)的合成。
方案41.3'-O-TCO-SS(DTM)-dATP(3'-O-TCO-叔丁基二硫基甲基-dATP)的合成。
方案42.与荧光染料缀合的标记的结合分子的合成。示出了使用可商购的原料合成Rox标记的四嗪、Alexa488标记的SHA和R6G标记的二苯并环辛炔(DBCO)。
方案43.由可商购的原料合成荧光(Cy5)树状聚合物缀合的四嗪(图8中的A)。Trebler亚磷酰胺和Cy5亚磷酰胺购自GlenResearch公司。首先，使用trebler亚磷酰胺与四嗪结合以产生四嗪-Trebler。在DMT去保护后，将Cy5亚磷酰胺与四嗪-Trebler结合得到Cy5标记的树状聚合物A。对于图8所示的Cy5标记的树状聚合物B的合成，将第二个trebler亚磷酰胺结合到四嗪-Trebler，接着进行DMT去保护以及与Cy5亚磷酰胺的结合，将产生期望的产物。
方案44.与四嗪缀合的基于肽的荧光(Cy5)树状聚合物(图9中的分子A)的合成(Fmoc为芴甲氧羰基)。
方案45.与四嗪缀合的基于肽的多荧光染料(Cy5)(图9中的分子B)的合成(Boc为叔丁氧羰基)。
方案46.通过不同的可切割叔丁基二硫基甲基部分(在该方案的括号中突出显示)与荧光染料缀合的标记的结合分子的合成。由可商购原料合成SHA-2-硝基苄基(接头)-ATTO647N(Fmoc-OSu为芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺)。
方案47.通过不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记的结合分子的合成。使用可商购原料合成四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N。
方案48.使用可商购原料合成链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N。
方案49.使用可商购原料合成二苯并环辛炔(DBCO)-烯丙基(接头)-ATTO647N。
方案50.使用可商购原料合成二苯并环辛炔(DBCO)-Dde(接头)-ATTO647N。
方案51.使用可商购原料合成四嗪-Dde(接头)-ATTO647N和四嗪-Dde(接头)-ROX。
方案52.使用可商购原料合成DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ATTO647N和DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ROX。
方案53.3'-O-Rox-硝基苄基-dCTP的合成。
方案54.3'-O-Rox-烯丙基-dTTP的合成。
方案55.切割偶氮接头、二甲基缩酮接头和Dde接头的特异性切割反应的实例。通过用连二亚硫酸钠处理，将偶氮接头化合物(四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N)还原成两个苯胺部分。用柠檬酸/Na2HPO4缓冲液(pH 4.1)处理，将酸敏感的二甲基缩酮接头化合物(链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N)水解为两个醇部分和丙酮。通过用2％N2H4处理，快速切割二苯并环辛炔-Dde(接头)-ATTO647N中的Dde接头，得到含胺的片段和含染料的片段。
在3'位和碱基上均具有修饰的核苷酸类似物的其他实例
本文提供了使用包括3'修饰(染料或锚)以及碱基修饰(锚或直接连接的染料)的核苷酸类似物的其他的8种SBS方案。包括两个主要针对单分子测序的实例，其中染料簇被置于这些位置(通过3'位处的锚或直接连接在碱基上)。染料簇包括放置在线性聚合物以及支化聚合物(树状聚合物)上的不同位置处的多种染料。
在所述方案中，即使核苷酸类似物的3′位未被进一步修饰，它也会被二硫基甲基(DTM)部分保护，该部分可以用THP特异性切割。在以下方案中，使用偶氮、烯丙基和2-硝基苄基作为非DTM可切割接头的实例；连二亚硫酸钠、Pd(0)和340nm光分别示为切割方法的实例；ATTO647N、Rox、Alexa488、BodipyFL和Cy5用作荧光团的实例；生物素或TCO用作锚的实例；链霉亲和素或四嗪用作锚结合分子的实例。然而，接头中的各种其他可切割基团、切割剂、荧光团、锚(例如DBCO、N3、四嗪)和锚结合分子(例如N3、DBCO、TCO)也是可行的。
前四种方案(A-D)是需要两个荧光检测步骤的2-色SBS方案；方案E-H是需要三个荧光检测步骤来确定掺入的核苷酸的单色荧光方案。在这些方案中的一些方案中包括可选的确认成像步骤。与所有先前描述的方案一样，在添加核苷酸类似物之后进行追加以保证每个引物已经被延伸从而避免异步反应，并且在各个步骤之间需要洗涤以去除上个组的试剂和/或释放的染料。
方案A：2-色SBS：在掺入和标记后成像(图77)。在方案A中，使用一组核苷酸类似物，其中一种核苷酸类似物具有通过二硫基甲基(DTM)可切割接头连接至糖的3'位的锚1，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至3'位的锚2，一种核苷酸类似物具有通过DTM接头连接至碱基的染料1，一种核苷酸类似物具有通过DTM接头连接至碱基的染料2。加入四种核苷酸类似物后的成像将表明特异性地掺入两种核苷酸类似物中的任一种。在用染料1标记的锚1结合分子和染料2标记的锚2结合分子标记后，成像将揭示其他两种核苷酸类似物之一的特异性掺入。然后用THP切割除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。在所示的实例中，染料1是Alexa488，染料2是Rox，锚1是生物素，锚2是TCO。也可以使用染料和锚的其他组合。
方案B：2-色SBS：在掺入和切割后成像(图79)。在方案B中，使用一组核苷酸类似物，其中一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至糖的3'位的染料1，一种核苷酸类似物具有通过DTM接头连接至碱基的染料2，一种核苷酸类似物具有通过偶氮可切割接头连接至碱基的染料1，一种核苷酸类似物具有通过偶氮可切割接头连接至碱基的染料2。与先前的一些方案相比，本文的三种核苷酸类似物在碱基上具有染料，仅有一种核苷酸类似物在3'位处具有染料。掺入后，染料1信号将表明两种核苷酸类似物中的任一种的掺入，而染料2信号将表明其他两种核苷酸类似物中的任一种的掺入。接下来，偶氮接头的特异性切割将特异地揭示两对中的哪一个被掺入。然后用THP切割除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。在所示的实例中，染料1是Rox，染料2是BodipyFL。也可以使用其他染料。
方案C：使用染料簇的2-色SBS：在掺入和标记后成像(图81)。在方案C中，使用一组不同的核苷酸类似物：一种核苷酸类似物在与锚1连接的3′位处具有DTM可切割接头，一种核苷酸类似物在与锚2连接的3′位处具有DTM可切割接头，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至碱基的染料1簇，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至碱基的染料2簇。掺入后立即成像将具体地揭示两种核苷酸类似物。接下来，使用连接于染料1簇的锚1结合分子和连接于染料2簇的锚2结合分子进行标记。在该步骤之后出现染料1荧光或染料2荧光将具体地鉴定剩余的两种核苷酸类似物的掺入。使用由以避免猝灭的方式排列的多个染料(例如4个、5个或可能8个或更多个相同的荧光团)组成的染料簇将使得能够进行整体测序和单分子测序。然后用THP切割除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。在所示的实例中，染料1簇是Rox簇，染料2簇是Alexa488簇，锚1是TCO，锚2是生物素。也可以使用染料和锚的其他组合。
方案D：使用能量转移染料的2-色SBS：在掺入和标记后成像(图83)。在方案D中，核苷酸类似物组由以下核苷酸类似物组成：一种核苷酸类似物在与锚1连接的3'位处具有DTM可切割接头，一种核苷酸类似物在与锚2连接的3'位处具有DTM可切割接头，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至碱基的荧光团，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至碱基的荧光团的供体-受体能量转移对。掺入后对供体染料的激发将特异地揭示两种碱基，如果检测到供体发射则揭示一种碱基，如果受体发射占优势则揭示另一种碱基。接下来，使用连接于供体染料的锚1结合分子和连接于能量转移染料对盒的锚2结合分子进行标记。以供体吸收波长的光照射将揭示剩余的两种核苷酸类似物的特异性掺入。然后用THP切割除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。在所示的实例中，锚1是生物素，锚2是TCO，染料1是Rox，染料对盒具有作为供体的Rox和作为受体的Cy5。也可以使用染料和锚的其他组合。
方案E：单色SBS：在2个标记步骤和切割后成像(图85)。在方案E中，使用具有正交可切割接头-锚组合的一组核苷酸类似物：一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至3'位的锚1，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至3'位的锚2，一种核苷酸类似物具有通过偶氮可切割接头连接至碱基的锚1，一种核苷酸类似物具有通过偶氮可切割接头连接至碱基的锚2。在用与染料1连接的锚1结合分子标记后，成像揭示了两种可能掺入的碱基。接下来，在用与染料1连接的锚2结合分子标记后，成像证实了其他两种可能掺入的碱基的掺入。最后，用连二亚硫酸钠处理将切割偶氮接头，特异地揭示添加了哪种核苷酸。然后用THP切割除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。在所示的实例中，染料1是ATTO647N，锚1是TCO，锚2是生物素。也可以使用染料和锚的其他组合。
方案F：单色SBS：在掺入、标记和切割后成像(图87)。在方案F中，核苷酸类似物组由以下核苷酸类似物组成：一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至3'位的染料1，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至3'位的锚1，一种核苷酸类似物具有通过偶氮可切割接头连接至碱基的染料1，一种核苷酸类似物具有通过偶氮可切割接头连接至碱基的锚1。掺入后的染料1检测揭示了两种可能掺入的核苷酸类似物中的任一种。在用连接于染料1的锚1结合分子标记后，成像证实了其他两种可能的核苷酸类似物中的任一种的掺入。最后，用连二亚硫酸钠处理将切割偶氮接头，特异地揭示添加了哪种核苷酸。然后用THP切割除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。在所示的实例中，染料1是Rox，锚1是TCO。也可以使用其他染料和锚。
方案G：单色SBS：在标记和2个切割步骤后成像(图89)。在方案G中，三种核苷酸类似物具有通过三种不同的可切割接头(烯丙基、2-硝基苄基和DTM)中的任一种连接至3'位的相同的锚1分子；第四种核苷酸具有通过DTM接头连接至碱基的染料1。掺入后，成像特异地揭示了核苷酸类似物中的一种。在用连接于染料1的锚1结合分子标记后，成像表明剩余的三种核苷酸类似物中的任一种已被掺入的可能性。接下来，一个接一个地进行特异性切割反应，用Pd(0)切割烯丙基接头，用340nm光切割2-硝基苄基接头，最后用THP切割DTM接头，除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。在这些步骤中的任何一个步骤中荧光的消失将特异地揭示掺入了哪种核苷酸。在所示的实例中，染料1是ATTO647N，锚1是生物素。也可以使用其他的染料和锚。
方案H：单色SBS：在掺入、标记和切割后成像(图91)。在方案H中，使用具有正交可切割接头-锚-染料簇组合的一组核苷酸类似物：一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至碱基的染料1簇，一种核苷酸类似物具有通过偶氮可切割接头连接至碱基的染料1簇，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至3'位的锚1，一种核苷酸类似物具有通过DTM可切割接头连接至3'位的锚2。掺入后，荧光表明两种核苷酸类似物中的任一种的可能性。在用连接于锚1结合分子的染料1簇标记后，成像将特异地揭示剩余的两种核苷酸类似物中的一种，在随后用连接于锚2结合分子的染料1簇标记后，成像将特异地揭示剩余的两种核苷酸类似物中的另一种。在用连二亚硫酸钠切割以除去具有偶氮接头的染料后，成像将特异地揭示已掺入的前两种核苷酸类似物中的任一种。最后，用THP切割将除去剩余的染料并重新生成3'-OH基团以用于随后的测序循环。与方案C一样，使用具有多个染料(例如4个、5个或可能8个或更多个相同的荧光团)的染料簇将使得能够进行整体测序和单分子测序。在所示的实例中，染料1簇是Rox簇，锚1是生物素，锚2是TCO。也可以使用染料和锚的其他组合。

Claims (10)

1.一种方法，其包括与单链DNA接触，其中所述单链DNA与聚合酶结合，所述聚合酶又与电解质溶液中的膜包埋纳米孔连接，其中单链DNA具有与其一部分杂交的引物，以及根据以下步骤确定单链DNA模板的序列：
(a)添加包括与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸，其中所加入的合适的核苷酸类似物与所述单链DNA(模板)的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，
并通过DNA聚合酶在所述引物的3'末端核苷酸残基处掺入从而形成DNA延伸产物，其中由于3'-O被可切割接头和锚部分保护，仅有单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到所述引物中，从而阻止在该步骤中进一步掺入；
(b)将连接有对应于步骤(a)中的4种锚的不同结合分子的4种不同的纳米孔标签添加至经延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(a)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；
(c)跨膜施加电压并测量由步骤(b)中形成的连接于其上标签迁移通过纳米孔所造成的跨过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的带标签的核苷酸互补的、单链模板DNA中的核苷酸残基；
(d)通过用合适的切割剂处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH；
(e)对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(a)-(d)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(a)中将3'-O-可切割锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(d)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物具有下式：
其中，
符号“----”是非共价键；
B为碱基或其类似物；
L1为共价接头；
L2为共价接头；
L4为共价接头；
X为键、O、NR6A或S；
R3为三磷酸酯或更高级的多磷酸酯；
R4A为氢、-CF3、-CC13、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；R6A为氢、-OH、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R5为可检测标签、锚部分或亲和锚部分；
R6为-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CHF2、-CHCl2、-CHBr2、-CHI2、-CH2F、-CH2C1、-CH2Br、-CH2I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的部分；
R12为互补的亲和锚部分结合子；
R13为可检测标签，
其中所述可检测标签为分子量为至少140道尔顿的荧光染料。
3.一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，其中锚的身份是预先确定的并且与碱基的身份相关，
b)使步骤a)的单链DNA和与步骤a)的核苷酸类似物的锚互补的结合分子接触，其中所述结合分子具有以下结构：
其中结合子是与锚部分正交且快速地反应的化学基团，从而形成结合分子和锚部分的缀合物，标签是可检测标签，
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测任何可检测标签的存在以便由此确定步骤a)的核苷酸类似物是否被掺入，从而由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果核苷酸类似物a)的碱基不与单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则反复地使用第二类的核苷酸类似物、第三类的核苷酸类似物和第四类的核苷酸类似物重复步骤a)至c)直至核苷酸类似物具有互补的碱基，其中每种不同类型的核苷酸类似物具有与每种其他类型的核苷酸类似物不同的碱基，
e)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
f)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至e)，从而确定单链DNA的序列。
4.一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中每种类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，其中每种类型的核苷酸类似物的锚独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的锚，其中每种类型的核苷酸类似物的锚与不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的结合分子正交且快速地反应；
b)在允许步骤a)中掺入的核苷酸类似物的锚与互补的结合分子正交且快速地反应从而将结合分子结合到锚上的条件下，使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子接触，
其中第一类结合分子、第二类结合分子、第三类结合分子和第四类结合分子各自具有以下结构：
其中结合子是与锚正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子类型的身份相关的预定的可检测标签，其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余三种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，第三类结合分子和第三类核苷酸类似物，以及第四类结合分子和第四类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，由此形成每种单独类型的结合分子和单独类型的核苷酸类似物的缀合物；
c)确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的可检测标签的身份，从而由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
5.一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物的标签与第二类核苷酸类似物的标签不同，其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物中的每一种的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第三类核苷酸类似物的锚不同于第四类核苷酸类似物的锚；
b)去除任何步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测步骤a)中掺入的第一类核苷酸类似物或第二类核苷酸类似物的可检测标签的存在，以便由此确定掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果第一类核苷酸和第二类核苷酸的碱基不互补，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与锚正交且快速地反应的小的化学基团，其中标签是与结合分子的身份相关的预定的可检测标签，其中第一类结合分子的可检测标签与第一类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第二类结合分子的可检测标签与第二类核苷酸类似物的可检测标签相同，其中第一类结合分子的结合子与第三类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，其中第二类结合分子与第四类核苷酸类似物的锚正交且快速地反应，以及
除去任何未结合的结合分子，并检测第一结合分子或第二结合分子的存在，以便由此确定步骤a)中掺入的核苷酸类似物的身份和单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
e)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。
6.一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)使步骤a)的单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子接触，每种类型的结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子不同于其余两种类型的结合分子的结合子，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与单独类型的核苷酸类似物结合；
c)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
d)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
e)如果在步骤d)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
f)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
g)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
h)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
i)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
j)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至i)，从而确定单链DNA的序列。
7.一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物和第二类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物的锚不同于第二类核苷酸类似物的锚，
其中第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除任何步骤a)中未掺入引物的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第三类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子和第二类结合分子接触，其中第一类结合分子和第二类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，以及第二类结合分子和第二类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与单独类型的核苷酸类似物结合；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
8.一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的任何一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中锚是锚部分，其是与互补的结合分子正交且快速地反应的小的化学部分，从而形成锚部分与结合分子的缀合物，其中ω代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和锚部分共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物各自独立地具有彼此不同的锚，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，则使单链DNA与第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子接触，其中第一类结合分子、第二类结合分子和第三类结合分子具有以下结构：
其中结合子是与结合分子类型的身份相关的小的化学基团，并且与锚正交且快速地反应，其中标签是可检测标签，
其中每种类型的结合分子的结合子彼此不同，其中第一类结合分子和第一类核苷酸类似物，第二类结合分子和第二类核苷酸类似物，以及第三类结合分子和第三类核苷酸类似物分别互补，从而正交且快速地反应，从而将每种单独类型的结合分子与单独类型的核苷酸类似物结合；
e)检测是否存在与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签；
f)使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)如果在步骤f)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签和/或结合分子的物质(means)接触；
i)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
j)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
k)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至j)，从而确定单链DNA的序列。
9.一种用于确定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与核苷酸聚合酶和第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物、第三类核苷酸类似物和第四类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述单链DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，从而形成DNA延伸产物，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中接头是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中标签是预定的可检测标签，其中R代表由一个或多个原子组成的结构，所述结构与可切割叔丁基二硫基甲基部分和可检测标签共价结合，
其中第一类核苷酸类似物、第二类核苷酸类似物和第三类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基，
其中第四类核苷酸类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物中的一种，其中可切割部分是可切割叔丁基二硫基甲基部分，当与3'-O结合时，所述可切割叔丁基二硫基甲基部分防止核苷酸聚合酶催化与核苷酸类似物的3'-O的聚合酶反应，其中第四类核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物中的每一种的碱基；
b)去除所有的步骤a)中未掺入的核苷酸类似物；
c)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸的身份是第四类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
d)如果在步骤c)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第一类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
e)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
f)如果在步骤e)中检测到可检测标签，则使单链DNA与从第二类核苷酸类似物切割可检测标签的物质(means)接触；
g)检测是否缺少与步骤a)中掺入的核苷酸结合的可检测标签，从而确定掺入的核苷酸类似物的身份，由此确定单链DNA中互补核苷酸残基的身份；
h)切割可切割叔丁基二硫基甲基部分，从而产生3'-OH；以及
i)针对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至h)，从而确定单链DNA的序列。
10.一种制备3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，所述方法包括：
a)在允许生成3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷的条件下，使
1)5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷，
2)乙酸，
3)乙酸酐，和
4)DMSO反应；
b)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤a)中制备的3'-O-甲硫基甲基-5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷与三甲胺、分子筛、硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和2,2,2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触：
其中B为核碱基；
c)在允许生成具有以下结构的产物的条件下，使步骤b)中制备的产物与四丁基氟化铵THF溶液接触：
其中B是核碱基；
d)在允许生成3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤c)中制备的产物与四丁基焦磷酸铵、2-氯-4-H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、碘溶液和氢氧化铵接触；
e)在允许生成3'-O-Bodipy-叔丁基二硫基甲基-dNTP的条件下，使步骤d)的3-O-NH2-叔丁基二硫基甲基-dNTP与Bodipy FL-NHS酯接触。
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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9624539B2 (en) 2011-05-23 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection
ES2906186T3 (es) 2012-04-09 2022-04-13 Univ Columbia Método para la preparación de nanoporo y usos del mismo
WO2013191793A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
US9605309B2 (en) 2012-11-09 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Nucleic acid sequencing using tags
CN106715453B (zh) 2014-03-24 2021-04-30 哥伦比亚大学董事会 用于生产带标签的核苷酸的化学方法
WO2017058953A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Design and synthesis of novel disulfide linker based nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
CN116656795A (zh) 2016-05-23 2023-08-29 纽约哥伦比亚大学董事会 核苷酸衍生物及其使用方法
US10662413B2 (en) * 2016-11-01 2020-05-26 Personal Genomics, Inc. Recombinant DNA polymerase for improved incorporation of nucleotide analogues
EP3596099B1 (en) 2017-03-06 2024-07-24 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid sequencing-by-synthesis (sbs) methods that combine sbs cycle steps
US12018325B2 (en) 2017-03-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York 3′-O-modified nucleotide analogues with different cleavable linkers for attaching fluorescent labels to the base for DNA sequencing by synthesis
US12215124B2 (en) 2018-02-21 2025-02-04 Singular Genomics Systems, Inc. Fluorinated nucleotides and uses thereof
CN112218640A (zh) * 2018-03-15 2021-01-12 哥伦比亚大学董事会 核苷酸类似物及其在核酸测序和分析中的用途
WO2019222264A1 (en) * 2018-05-15 2019-11-21 Illumina, Inc. Compositions and methods for chemical cleavage and deprotection of surface-bound oligonucleotides
EA202092684A1 (ru) 2018-08-27 2021-03-11 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Применение рамановской спектроскопии для последующей очистки
WO2020056044A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Singular Genomics Systems, Inc. Modified archaeal family b polymerases
US12145960B2 (en) 2018-10-25 2024-11-19 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleotide analogues
EP3908286A4 (en) 2019-01-08 2022-10-12 Singular Genomics Systems, Inc. NUCLEOTIDE CLEAVABLE LINKERS AND THEIR USES
WO2020181129A1 (en) * 2019-03-07 2020-09-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High accuracy nanopore-based single molecule sequencing by synthesis with tagged nucleotides
EP3947659A4 (en) * 2019-04-02 2022-12-28 The Trustees of Columbia University in the City of New York SEQUENCING BY SYNTHESIS WITH PAIRS OF ENERGY TRANSFER DYE
EP3997101A4 (en) * 2019-07-09 2024-03-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York NOVEL NUCLEOTIDE ANALOGUES AND METHODS OF USE THEREOF
CN110379467B (zh) * 2019-07-17 2022-08-19 成都火石创造科技有限公司 一种化学分子式切分方法
US11512295B2 (en) 2019-09-12 2022-11-29 Singular Genomics Systems, Inc. Modified thermoccocus polymerases
CN115667507A (zh) 2019-12-31 2023-01-31 奇异基因组学系统公司 用于长读出测序的多核苷酸条形码
US11034942B1 (en) 2020-02-27 2021-06-15 Singular Genomics Systems, Inc. Modified pyrococcus polymerases and uses thereof
WO2021178893A2 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Singular Genomics Systems, Inc. Linked paired strand sequencing
CA3175996A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 Julie KARPENKO Fluorogenic dimer compound, useful as a probe for detection of endogenous receptors
WO2022015600A2 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
GB2599729A (en) * 2020-10-12 2022-04-13 Sumitomo Chemical Co Method comprising light emitting marker
EP4208470A4 (en) 2020-10-22 2024-10-30 Singular Genomics Systems, Inc. NUCLEIC ACID CIRCULARIZATION AND AMPLIFICATION ON A SURFACE
EP4200444A4 (en) 2020-10-30 2024-09-25 Singular Genomics Systems, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING NUCLEOTIDE IMPURITIES CONTENT
WO2022098141A1 (ko) * 2020-11-06 2022-05-12 한국과학기술원 비천연 아미노산이 잔기-선택적으로 도입된 유전자 편집 단백질 및 이를 이용한 유전자 편집 방법
KR102748180B1 (ko) * 2020-11-06 2024-12-31 한국과학기술원 비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질 및 이를 이용한 유전자 편집 방법
KR102748173B1 (ko) * 2020-11-06 2024-12-31 한국과학기술원 비천연 아미노산이 잔기-선택적으로 도입된 유전자 편집 단백질 및 이를 이용한 유전자 편집 방법
EP4251770A4 (en) 2021-02-08 2024-05-29 Singular Genomics Systems, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCING COMPLEMENTARY POLYNUCLEOTIDES
WO2022192671A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
US11884977B2 (en) 2021-03-12 2024-01-30 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
CN115197291B (zh) * 2021-04-01 2025-03-07 深圳华大生命科学研究院 用于测序的核苷酸类似物
EP4294920A4 (en) 2021-04-27 2025-01-22 Singular Genomics Systems, Inc. HIGH-DENSITY SEQUENCING AND MULTIPLEX PRIMING
WO2023023638A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Singular Genomics Systems, Inc. Chemical and thermal assisted nucleic acid amplification methods
WO2023076833A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Singular Genomics Systems, Inc. Multiplexed targeted amplification of polynucleotides
WO2023107673A2 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Singular Genomics Systems, Inc. Cleavable disulfide linkers and uses thereof
US20250188521A1 (en) 2022-03-10 2025-06-12 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid delivery scaffolds

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034036A (en) 1990-11-13 1991-07-23 Navistar International Transportation Corp. Device for separating water from engine intake air
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
US5804386A (en) 1997-01-15 1998-09-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Sets of labeled energy transfer fluorescent primers and their use in multi component analysis
US5876936A (en) 1997-01-15 1999-03-02 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6309836B1 (en) * 1999-10-05 2001-10-30 Marek Kwiatkowski Compounds for protecting hydroxyls and methods for their use
US6627748B1 (en) 2000-09-11 2003-09-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and their applications for multiplex genetic analyses
US20060057565A1 (en) 2000-09-11 2006-03-16 Jingyue Ju Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
WO2002022883A1 (en) 2000-09-11 2002-03-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
DE60127162T2 (de) 2000-10-06 2008-04-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
US20030027140A1 (en) 2001-03-30 2003-02-06 Jingyue Ju High-fidelity DNA sequencing using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
US7057026B2 (en) * 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US7074597B2 (en) 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
DK3002289T3 (en) 2002-08-23 2018-04-23 Illumina Cambridge Ltd MODIFIED NUCLEOTIDES FOR POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE
GB0324456D0 (en) 2003-10-20 2003-11-19 Isis Innovation Parallel DNA sequencing methods
CA2557818A1 (en) 2004-03-03 2005-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
US20080103053A1 (en) 2005-11-22 2008-05-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for sequencing a nucleic acid
US8114973B2 (en) 2004-05-25 2012-02-14 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US20070009980A1 (en) 2004-06-01 2007-01-11 Applera Corporation Continuous fluorogenic analyte assays with dendritic amplification of signal
US20060003383A1 (en) 2004-06-07 2006-01-05 Applera Corporation Fluorogenic enzyme activity assay methods and compositions using fragmentable linkers
US9035035B2 (en) * 2004-11-05 2015-05-19 Genovoxx Gmbh Macromolecular nucleotide compounds and methods for using the same
US9169510B2 (en) 2005-06-21 2015-10-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compositions
WO2007053719A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-dntp-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
GB2446084B (en) 2005-10-31 2011-03-02 Univ Columbia Synthesis of four color 3-o-allyl modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
AU2006323745B2 (en) * 2005-12-09 2012-11-22 Riken Method for replicating nucleic acids and novel unnatural base pairs
US20080269476A1 (en) 2006-04-26 2008-10-30 Helicos Biosciences Corporation Molecules and methods for nucleic acid sequencing
CN101495656B (zh) 2006-06-07 2017-02-08 纽约哥伦比亚大学理事会 采用带修饰的核苷酸通过纳米通道进行dna序列测定
WO2008037568A2 (en) 2006-09-04 2008-04-03 Quiatech Ab Reversible terminators for efficient sequencing by synthesis
WO2008043426A2 (de) 2006-09-20 2008-04-17 Genovoxx Gmbh Komponenten und verfahren zur enzymatischen synthese von nukleinsäuren
WO2008042067A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
US7883869B2 (en) 2006-12-01 2011-02-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US8481259B2 (en) 2007-02-05 2013-07-09 Intelligent Bio-Systems, Inc. Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches
EP2209911B1 (en) 2007-10-19 2013-10-16 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators and a deoxyinosine analogue with a reversible terminator group
EP2940029B1 (en) 2007-10-19 2023-11-29 The Trustees of Columbia University in the City of New York Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
US20130053252A1 (en) * 2009-09-25 2013-02-28 President & Fellows Of Harvard College Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
US10397639B1 (en) 2010-01-29 2019-08-27 Sitting Man, Llc Hot key systems and methods
US9670243B2 (en) 2010-06-02 2017-06-06 Industrial Technology Research Institute Compositions and methods for sequencing nucleic acids
WO2012083249A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using modified nucleotides and nanopore detection
US9624539B2 (en) 2011-05-23 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection
MX342195B (es) 2011-09-13 2016-09-20 Lasergen Inc Nucleótidos de terminación de rápida fotodescomposición 5-metoxi, 3' -oh no bloqueados y métodos para secuenciación de ácido nucleico.
PL3623481T3 (pl) 2011-09-23 2022-01-17 Illumina, Inc. Kompozycje do sekwencjonowania kwasów nukleinowych
ES2906186T3 (es) 2012-04-09 2022-04-13 Univ Columbia Método para la preparación de nanoporo y usos del mismo
WO2013191793A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
CA2903095C (en) 2013-03-15 2018-02-13 Xiaohai Liu Modified nucleosides or nucleotides
US10732183B2 (en) 2013-03-15 2020-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for detecting multiple predetermined compounds in a sample
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
CN105722850B (zh) * 2013-08-19 2020-03-06 雅培分子公司 核苷酸类似物
EP2876166B1 (en) 2013-11-20 2016-12-14 Roche Diagnostics GmbH New compound for sequencing by synthesis
EP3105354B1 (en) 2014-02-12 2020-05-06 The Trustees of Columbia University in the City of New York Single molecule electronic multiplex snp assay and pcr analysis
CN106715453B (zh) 2014-03-24 2021-04-30 哥伦比亚大学董事会 用于生产带标签的核苷酸的化学方法
GB201414098D0 (en) 2014-08-08 2014-09-24 Illumina Cambridge Ltd Modified nucleotide linkers
WO2016064880A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Molecular Assemblies, Inc. Modified template-independent enzymes for polydeoxynucleotide systhesis
GB201418718D0 (en) 2014-10-21 2014-12-03 Cambridge Epigenetix Ltd Improved nucleic acid re-sequencing using a reduced number of identified bases
WO2016144973A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pore-forming protein conjugate compositions and methods
CN107922968B (zh) 2015-03-23 2022-05-17 哥伦比亚大学董事会 用于单分子电子snp测定的聚合物标记的核苷酸
WO2016182984A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Centrillion Technology Holdings Corporation Disulfide-linked reversible terminators
WO2017058953A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Design and synthesis of novel disulfide linker based nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
US10172620B2 (en) 2015-09-30 2019-01-08 Ethicon Llc Compressible adjuncts with bonding nodes
US11421264B2 (en) 2015-11-06 2022-08-23 IsoPlexis Corporation Thiol-containing cleave reagents and oxidative wash
EP3370731A4 (en) 2015-11-06 2019-06-12 Qiagen Sciences, LLC nucleotide analogs
US20180327828A1 (en) 2015-11-18 2018-11-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Ion sensor dna and rna sequencing by synthesis using nucleotide reversible terminators
WO2017176679A1 (en) 2016-04-04 2017-10-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis with nucleotide analogues and raman detection
WO2017176677A1 (en) 2016-04-04 2017-10-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Flourescence energy transfer-based single molecule/ensemble dna sequencing by synthesis
CN116656795A (zh) 2016-05-23 2023-08-29 纽约哥伦比亚大学董事会 核苷酸衍生物及其使用方法
RU2760737C2 (ru) 2016-12-27 2021-11-30 Еги Тек (Шэнь Чжэнь) Ко., Лимитед Способ секвенирования на основе одного флуоресцентного красителя
US12018325B2 (en) 2017-03-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York 3′-O-modified nucleotide analogues with different cleavable linkers for attaching fluorescent labels to the base for DNA sequencing by synthesis
CN111741967A (zh) 2017-11-30 2020-10-02 深圳市真迈生物科技有限公司 核苷类似物、制备方法及应用
US10768173B1 (en) 2019-09-06 2020-09-08 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis

Also Published As

Publication number Publication date
US12337009B2 (en) 2025-06-24
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