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ES2989052T3 - Medición espacio-temporal simultánea de la expresión génica y la actividad celular - Google Patents

Medición espacio-temporal simultánea de la expresión génica y la actividad celular Download PDF

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ES2989052T3
ES2989052T3 ES21733274T ES21733274T ES2989052T3 ES 2989052 T3 ES2989052 T3 ES 2989052T3 ES 21733274 T ES21733274 T ES 21733274T ES 21733274 T ES21733274 T ES 21733274T ES 2989052 T3 ES2989052 T3 ES 2989052T3
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Cedric Uytingco
Layla Katiraee
Kristen Pham
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10X Genomics Inc
Original Assignee
10X Genomics Inc
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Abstract

Se proporcionan métodos para la medición espacio-temporal simultánea de la expresión genética y la actividad celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medición espacio-temporal simultánea de la expresión génica y la actividad celular
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 63/029,121, presentada el 22 de mayo de 2020 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 63/044,028, presentada el 25 de junio de 2020.
Antecedentes
Las células dentro de un tejido de un sujeto tienen diferencias en la morfología y/o función celular debido a niveles variados de analito (por ejemplo, expresión génica y/o proteica) dentro de las diferentes células. La posición específica de una célula dentro de un tejido (por ejemplo, la posición de la célula con relación a las células vecinas o la posición de la célula con relación al microentorno del tejido) puede afectar, por ejemplo, la morfología, diferenciación, destino, viabilidad, proliferación, comportamiento, y señalización y diafonía de la célula con otras células en el tejido.
La heterogeneidad espacial se ha estudiado previamente mediante el uso de técnicas que solo proporcionan datos para un pequeño número considerable de analitos en el contexto de un tejido intacto o una porción de un tejido, o proporcionan muchos datos de analitos para células únicas, pero no proporcionan información con respecto a la posición de la célula única en una muestra biológica parental (por ejemplo, muestra de tejido).
La tecnología de expresión génica espacial generalmente permite la captura de transcritos génicos a partir de tejidos congelados o fijos mientras se mantiene el posicionamiento espacial de los transcritos génicos dentro de los tejidos. Sin embargo, la naturaleza congelada y/o fija de la muestra limita los experimentos simultáneos asociados con el aspecto temporal de la expresión génica, particularmente en células vivas y durante las condiciones en las que se manipula la muestra, por ejemplo, mediante el uso de composiciones farmacológicas. Además, los flujos de trabajo de la tecnología de expresión génica espacial generalmente no son susceptibles al uso de tejidos o células vivos; como tal, el estudio o seguimiento de las actividades celulares no está disponible. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar dispositivos y métodos novedosos que aborden una situación en la que pueden usarse matrices de expresión génica espacial para detectar la expresión génica y la actividad celular simultáneamente en tejidos vivos o vivos. En la presente descripción se describen sistemas y métodos que utilizan una cámara de perfusión o una placa de múltiples pocillos junto con secciones de tejido vivo (por ejemplo, generadas a través de un vibrátomo) o células (por ejemplo, cultivadas directamente sobre el sustrato) que permiten el registro de la actividad celular en condiciones estándar o en presencia de manipulaciones farmacológicas.
El documento WO2019/113457 describe reacciones de hardware y enzimáticas usadas en análisis de células individuales. El documento WO2016/172362 describe un dispositivo microfabricado que define una matriz de alta densidad de micropocillos para cultivar células a partir de una muestra. El documento WO2018/064640 describe aparatos, composiciones y procesos para la deconvolución de códigos de barras de ADN. Liuy otros(2019, bioRxiv, DOI: 10.1101/788992) describen la secuenciación del atlas multiómico de alta resolución espacial de embriones de ratón mediante códigos de barras deterministas en tejido.
Resumen
La presente invención proporciona un método para identificar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra biológica, el método comprende:
(a) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra biológica, en donde la muestra biológica se ubica dentro de una cámara de perfusión de una pluralidad de cámaras de perfusión, en donde la cámara de perfusión comprende un sustrato y una junta;
(b) poner en contacto la muestra biológica con el sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito;
(c) extender la sonda de captura mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida;
(d) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y
(e) determinar (i) toda la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de la misma, y (ii) toda o parte de la secuencia del analito, o un complemento de la misma, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la ubicación y/o la abundancia del analito en la muestra biológica;
en donde el método comprende además:
montar la junta sobre el sustrato,
en donde el sustrato comprende una pluralidad de regiones de sustrato, en donde una región de sustrato de la pluralidad de regiones de sustrato comprende la sonda de captura que comprende (i) el código de barras espacial y (ii) el dominio de captura que se une específicamente a la secuencia presente en el analito,
en donde la junta comprende (i) una pluralidad de aberturas correspondientes a la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente, (ii) una pluralidad de canales de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y (iii) una pluralidad de canales de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y
en donde la pluralidad de aberturas de la junta se alinean con la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato cuando la junta se monta sobre el sustrato; y montar una cubierta sobre la junta para definir una pluralidad de cámaras de perfusión,
en donde la cubierta incluye una entrada y una salida, la entrada se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada cuando la cubierta se monta sobre la junta, la salida se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de salida cuando la cubierta se monta sobre la junta, y
en donde la pluralidad de cámaras de perfusión se definen por (i) la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato, (ii) la pluralidad de aberturas de la junta que se monta sobre el sustrato, y (iii) la cubierta que se monta sobre la junta.
La presente invención proporciona un método para determinar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra de tejido o célula viva, el método comprende:
(a) proporcionar una pluralidad de cámaras de perfusión, en donde una cámara de perfusión de la pluralidad de cámaras de perfusión comprende un sustrato, una junta montada sobre el sustrato y una cubierta montada sobre la junta, en donde la muestra de tejido o célula viva se ubica dentro de la cámara de perfusión de la pluralidad de cámaras de perfusión, en donde
(1) el sustrato comprende una pluralidad de regiones de sustrato, en donde una región de sustrato de la pluralidad de regiones de sustrato comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito;
(2) la junta comprende (i) una pluralidad de aberturas correspondientes a la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente, (ii) una pluralidad de canales de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y (iii) una pluralidad de canales de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y en donde la pluralidad de aberturas de la junta se alinean con la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato cuando la junta se monta sobre el sustrato;
(3) la cubierta comprende una entrada y una salida, la entrada se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada cuando la cubierta se monta sobre la junta, la salida se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de salida cuando la cubierta se monta sobre la junta; y
(4) la pluralidad de cámaras de perfusión se definen por (i) la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato, (ii) la pluralidad de aberturas de la junta que se monta sobre el sustrato, y (iii) la cubierta que se monta sobre la junta;
(b) perfundir uno o más compuestos de prueba a través de la cámara de perfusión;
(c) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra de tejido o célula viva,
(d) permeabilizar la muestra de tejido o célula viva de manera que el analito se une específicamente al dominio de captura de la sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura;
(e) extender la sonda de captura en el extremo 3' mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida;
(f) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y
(g) secuenciar (i) toda la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de la misma, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de la misma, y mediante el uso de las secuencias determinadas de (i) y (ii) determinar la ubicación y la ubicación y/o abundancia del analito en la muestra de tejido o célula viva.
La presente descripción describe métodos para rastrear información temporal, por ejemplo, mediante el registro de la actividad celular y la expresión génica, en combinación con matrices de expresión génica espacial para mediciones simultáneas espaciales-temporales. La presente descripción también describe dispositivos, por ejemplo, un sistema de cámara de perfusión o célula de flujo montado en la matriz espacial, y un sistema de placas de múltiples pocillos, para tales mediciones. En algunas modalidades, se describen en la presente descripción métodos de tamizaje de fármacos mediante el uso de las mediciones espaciales-temporales para generar una comprensión multiómica completa del impacto del fármaco sobre el cultivo de tejidos o células.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para identificar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra biológica, el método comprende: (a) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra biológica, y en algunas modalidades, la muestra biológica se ubica dentro de una cámara de perfusión en una pluralidad de cámaras de perfusión, y la cámara de perfusión comprende un sustrato; (b) poner en contacto la muestra biológica con el sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, y en algunas modalidades, una sonda de captura de la pluralidad de las sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito; (c) extender la sonda de captura mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida; (d) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y (e) determinar (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de la misma, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de la misma, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la ubicación y/o abundancia del analito en la muestra biológica.
En algunas modalidades, en la presente descripción se describe el método para identificar una ubicación de un analito en una muestra biológica, que comprende además: montar una junta sobre el sustrato y montar una cubierta sobre la junta para definir una pluralidad de cámaras de perfusión. En algunas modalidades, el sustrato comprende una pluralidad de regiones de sustrato. En algunas modalidades, una región de sustrato de la pluralidad comprende la sonda de captura que comprende (i) el código de barras espacial y (ii) el dominio de captura que se une específicamente a la secuencia presente en el analito. En algunas modalidades, la junta incluye (i) una pluralidad de aberturas correspondientes a la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente, (ii) una pluralidad de canales de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y (iii) una pluralidad de canales de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente. En algunas modalidades, la pluralidad de aberturas de la junta se alinean con la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato cuando la junta se monta sobre el sustrato. En algunas modalidades, la cubierta incluye una entrada y una salida, la entrada se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada cuando la cubierta se monta sobre la junta, la salida se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de salida cuando la cubierta se monta sobre la junta. En algunas modalidades, la pluralidad de cámaras de perfusión se definen por (i) la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato, (ii) la pluralidad de aberturas de la junta que se monta sobre el sustrato, y (iii) la cubierta que se monta sobre la junta.
En algunas modalidades, el montaje de una junta sobre el sustrato y el montaje de una cubierta sobre la junta para definir una pluralidad de cámaras de perfusión se producen antes del registro de la actividad celular o el registro de la expresión génica intracelular.
En algunas modalidades, el método comprende además perfundir un compuesto de prueba a través de la cámara de perfusión antes de la etapa de registro. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un agonista. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un antagonista. En algunas modalidades, el compuesto de prueba activa la actividad celular. En algunas modalidades, el compuesto de prueba inhibe la actividad celular.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para identificar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra biológica, el método comprende: (a) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra biológica, y en algunas modalidades, la muestra biológica se ubica dentro de un pocillo de una placa de múltiples pocillos; (b) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, y en algunas modalidades, una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito; (c) extender la sonda de captura mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida; (d) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y (e) determinar (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de la misma, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de la misma, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la ubicación y/o abundancia del analito en la muestra biológica.
En algunas modalidades, en la presente descripción se describe el método para identificar una ubicación de un analito en una muestra biológica, que comprende además tratar la muestra biológica con uno o más fármacos.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para determinar el efecto de uno o más fármacos aplicados sobre una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico en una muestra biológica, el método comprende: (a) cultivar la muestra biológica sobre un sustrato, y en algunas modalidades, el sustrato comprende una pluralidad de sondas de captura, y
en algunas modalidades, una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que es capaz de unirse específicamente a un analito asociado con la actividad celular y/o la expresión génica intracelular en la muestra biológica; (b) tratar la muestra biológica con el uno o más fármacos; (c) registrar la actividad celular y/o la expresión génica intracelular del ácido nucleico de la muestra biológica; (d) capturar el analito de la muestra biológica, y en algunas modalidades, el analito se captura por el dominio de captura de la sonda de captura; y (e) determinar el efecto del uno o más fármacos aplicados sobre la actividad celular y/o la expresión génica intracelular en la muestra biológica, en función del nivel del analito capturado.
En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos es una placa de 6 pocillos, una placa de 8 pocillos, una placa de 12 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 48 pocillos o una placa de 96 pocillos. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos es resistente al calor. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos es capaz de detectar automáticamente la actividad celular y/o la expresión génica intracelular.
En algunas modalidades, la pluralidad de sondas de captura se unen directamente a una superficie del pocillo. En algunas modalidades, la pluralidad de sondas de captura se unen al sustrato. En algunas modalidades, el sustrato está dentro del pocillo. En algunas modalidades, el sustrato es un cubreobjetos. En algunas modalidades, el cubreobjetos comprende plástico, metal o vidrio. En algunas modalidades, la sonda de captura se une al sustrato a través de un grupo de enlace. En algunas modalidades, el grupo de enlace es un grupo amida.
En algunas modalidades, el pocillo o el sustrato comprende un marcador fiducial.
En algunas modalidades, la etapa de tratamiento se produce antes de la etapa de registro. En algunas modalidades, la etapa de tratamiento y la etapa de registro se producen sustancialmente al mismo tiempo.
En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con el uno o más fármacos sustancialmente al mismo tiempo. En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con el uno o más fármacos en diferentes momentos. En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con uno o más fármacos aproximadamente 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas o 48 horas antes de fijar la muestra biológica.
En algunas modalidades, un fármaco del uno o más fármacos es un agonista. En algunas modalidades, un fármaco del uno o más fármacos es un antagonista.
En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con un fármaco y el fármaco es una molécula pequeña.
En algunas modalidades, un fármaco del uno o más fármacos activa la actividad celular y/o la expresión génica intracelular. En algunas modalidades, un fármaco del uno o más fármacos inhibe la actividad celular y/o la expresión génica intracelular.
En algunas modalidades, un fármaco del uno o más fármacos se conjuga con un fluoróforo y/o un oligonucleótido. En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende una secuencia que identifica de manera única el fármaco.
En algunas modalidades, proporcionadas en la presente descripción, que comprende además cultivar la muestra biológica en la cámara de perfusión o el pocillo antes de la etapa de registro.
En algunas modalidades, la muestra biológica se cultiva en un medio de cultivo para mantener su viabilidad. En algunas modalidades, el medio de cultivo se reemplaza en un intervalo apropiado manual o automáticamente.
En algunas modalidades, la muestra biológica se cultiva estáticamente.
En algunas modalidades, la muestra biológica se cultiva en la cámara de perfusión, y el método comprende además perfundir el medio de cultivo dentro de la cámara de perfusión.
En algunas modalidades, el medio de cultivo se complementa con oxígeno.
En algunas modalidades, el medio de cultivo comprende un reactivo de bloqueo. En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con el reactivo de bloqueo. En algunas modalidades, el agente de bloqueo es albúmina sérica bovina (BSA), suero, gelatina (por ejemplo, gelatina de pescado), leche (por ejemplo, leche seca sin grasa), caseína, polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), o polivinilpirrolidona (PVP), reactivo de bloqueo de biotina, un reactivo de bloqueo de peroxidasa, levamisol, solución de Carnoy, glicina, lisina, borohidruro de sodio, azul cielo de pontamina, negro de Sudan, azul de tripán, agente de bloqueo de FITC y/o ácido acético.
En algunas modalidades, la actividad celular comprende actividad proteica, actividad de fosforilación, actividad relacionada con el receptor acoplado a proteína G, actividad de canales iónicos, actividad de la unión ligandoreceptor, actividad neuronal, síntesis de proteínas, expresión y ubicación de proteínas, actividad óptica transitoria, interacciones célula a célula, morfología celular o sus combinaciones.
En algunas modalidades, el registro comprende el registro óptico. En algunas modalidades, el registro óptico comprende poner en contacto la muestra biológica con un colorante químico. En algunas modalidades, el colorante químico es un colorante sensible a la tensión, un colorante sensible al pH, un colorante sensible a la temperatura, un colorante sensible a la luz, un colorante sensible al oxígeno o un colorante sensible a metales. En algunas modalidades, el colorante químico es un colorante sensible a metales (por ejemplo, un colorante sensible a calcio).
En algunas modalidades, el registro óptico comprende etiquetar la muestra biológica con un indicador. En algunas modalidades, el indicador es un indicador genéticamente codificado. En algunas modalidades, el indicador codificado genéticamente es un indicador de actividad neuronal codificado genéticamente, un indicador de tensión codificado genéticamente (GEVI) o un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI o GCaMP).
En algunas modalidades, el colorante químico o el indicador comprende además un fluoróforo.
En algunas modalidades, el registro óptico se logra mediante hibridación in situ. En algunas modalidades, el registro óptico se logra mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).
En algunas modalidades, el registro óptico comprende la hibridación de una pluralidad de sondas marcadas ópticamente a (a) una proteína, un lípido, un ácido nucleico o una de sus combinaciones asociadas con la actividad celular; o (b) el ácido nucleico asociado con la expresión génica intracelular.
En algunas modalidades, una sonda marcada ópticamente de la pluralidad es una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) marcada con un fluoróforo.
En algunas modalidades, la sonda de PNA es de al menos 10 ácidos nucleicos, al menos 15 ácidos nucleicos, al menos 20 ácidos nucleicos, al menos 25 ácidos nucleicos, al menos 30 ácidos nucleicos o más. En algunas modalidades, el ácido nucleico hibridado con la sonda de PNA es ADN. En algunas modalidades, el ácido nucleico hibridado con la sonda de PNA es ARN. En algunas modalidades, el ARN es ARNm.
En algunas modalidades, el registro óptico se realiza mediante el uso de microscopía fluorescente en lapso de tiempo.
En algunas modalidades, la etapa de registro se produce antes de la etapa de contacto. En algunas modalidades, la etapa de contacto se produce antes de la etapa de registro. En algunas modalidades, la etapa de registro y la etapa de contacto se producen sustancialmente al mismo tiempo.
En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de tejido. En algunas modalidades, la muestra de tejido es una sección de tejido vivo.
En algunas modalidades, la muestra de tejido es una muestra de organoide o una muestra de cultivo de esferoides.
En algunas modalidades, la muestra de tejido es una muestra de organoide. En algunas modalidades, la muestra de organoide comprende organoides normales y/u organoides neoplásicos. En algunas modalidades, la muestra de organoide comprende organoides neoplásicos. En algunas modalidades, la muestra de organoide comprende organoides intestinales, organoides hepáticos, organoides pulmonares y/o organoides neuronales. En algunas modalidades, la muestra de organoide se origina de tejidos afectados por enfermedad (por ejemplo, tejidos neoplásicos), tejido normal, células afectadas por enfermedad (por ejemplo, células neoplásicas), células normales, células diferenciadas (por ejemplo, células somáticas) y/o células madre. En algunas modalidades, la muestra de organoide se origina de células madre. En algunas modalidades, las células madre son células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas y/o células madre somáticas.
En algunas modalidades, la muestra de tejido se incorpora en hidrogeles.
En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de cultivo celular. En algunas modalidades, la muestra celular es una muestra de cultivo celular primario. En algunas modalidades, la muestra de cultivo celular primario comprende células individuales que se aíslan de un tejido fresco. En algunas modalidades, la muestra celular comprende una pluralidad de células adherentes. En algunas modalidades, la muestra celular comprende una pluralidad de células en suspensión. En algunas modalidades, la muestra celular se transfiere al pocillo desde un cultivo celular separado. En algunas modalidades, la muestra celular comprende una pluralidad de células afectadas por enfermedad. En algunas modalidades, una o más células de la muestra celular se transfectan o infectan. En algunas modalidades, la muestra biológica es de un paciente humano o un modelo animal (por ejemplo, un ratón).
En algunas modalidades, el analito comprende una mutación. En algunas modalidades, el analito comprende un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En algunas modalidades, el analito comprende una repetición de trinucleótidos. En algunas modalidades, el analito se asocia con una enfermedad o afección.
En algunas modalidades, el analito es una molécula de ADN. En algunas modalidades, el analito es un ADN complementario (ADNc). En algunas modalidades, el analito es una molécula de ARN. En algunas modalidades, la molécula de ARN es una molécula de ARNm.
En algunas modalidades, el dominio de captura de la sonda de captura se bloquea antes de la etapa de contacto.
En algunas modalidades, el dominio de captura es bloqueado por una sonda de bloqueo.
En algunas modalidades, la muestra biológica comprende una pluralidad de células vivas, y las células vivas se tiñen con inmunofluorescencia antes de la etapa de registro. En algunas modalidades, la una o más células vivas se tratan con proteasa K y/o tripsina.
En algunas modalidades, la muestra biológica se tiñe mediante el uso de un marcador detectable. En algunas modalidades, el marcador detectable es Can-Grunwald, Giemsa, hematoxilina y eosina (H&E), Jenner's, Leishman, tricromo de Masson, Papanicolaou, Romanowsky, plata, Sudan, Wright y/o Ácido peryódico de Schiff (PAS). En algunas modalidades, el marcador detectable es un H&E.
En algunas modalidades, se obtienen imágenes de la muestra biológica. En algunas modalidades, se obtienen imágenes de la muestra biológica mediante el uso de técnicas de obtención de imágenes de campo claro.
En algunas modalidades, la muestra biológica se permeabiliza después de la etapa de registro con un agente de permeabilización seleccionado de un solvente orgánico, un agente de reticulación, un detergente, y una enzima, o una de sus combinaciones.
En algunas modalidades, la muestra biológica se fija después de poner en contacto la muestra biológica con el sustrato, o cultivar la muestra biológica sobre el sustrato. En algunas modalidades, la muestra biológica se fija con etanol, metanol, acetona, formaldehído (por ejemplo, formaldehído al 2 %), paraformaldehído-Tritón, glutaraldehído o sus combinaciones.
En algunas modalidades, la sonda de captura comprende además una secuencia funcional. En algunas modalidades, la secuencia funcional es una secuencia de cebador o un complemento de esta. En algunas modalidades, la sonda de captura comprende además una secuencia molecular única o un complemento de esta. En algunas modalidades, la sonda de captura comprende además una secuencia de unión al cebador adicional o un complemento de esta. En algunas modalidades, el dominio de captura comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a la secuencia del analito. En algunas modalidades, el dominio de captura comprende una secuencia que es parcialmente complementaria a la secuencia del analito. En algunas modalidades, el dominio de captura comprende una secuencia oligo d(T).
En algunas modalidades, en la etapa de extensión, la sonda de captura se extiende en el extremo 3'. En algunas modalidades, la etapa de extensión utiliza una transcriptasa inversa. En algunas modalidades, la etapa de extensión utiliza nucleótidos marcados con fluorescencia.
En algunas modalidades, la muestra biológica se elimina después de la etapa de amplificación. En algunas modalidades, la muestra biológica se elimina enzimáticamente después de la etapa de amplificación.
En algunas modalidades, la etapa de amplificación comprende amplificar (i) toda o parte de la secuencia del analito unido al dominio de captura, o un complemento de esta, y (ii) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de esta.
En algunas modalidades, la etapa de amplificación comprende la amplificación en círculo rodante.
En algunas modalidades, la etapa de amplificación utiliza una ADN polimerasa, una pluralidad de cebadores y una pluralidad de nucleótidos.
En algunas modalidades, la amplificación no es isotérmica. En algunas modalidades, la amplificación es isotérmica. En algunas modalidades, el ácido nucleico producido se libera de la sonda de captura extendida.
En algunas modalidades, la etapa de determinación comprende secuenciación. En algunas modalidades, la etapa de determinación comprende la secuenciación de (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial o el complemento de esta, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito. En algunas modalidades, la secuenciación es una secuenciación de alto rendimiento. En algunas modalidades, la etapa de secuenciación comprende secuenciación in situ, métodos de secuenciación de Sanger, métodos de secuenciación de nueva generación y secuenciación de nanoporos.
En algunas modalidades, la secuenciación comprende ligar un adaptador al ácido nucleico.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para determinar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra de tejido o célula viva, el método comprende:
(a) proporcionar una pluralidad de cámaras de perfusión, en donde una cámara de perfusión de la pluralidad de cámaras de perfusión comprende un sustrato, una junta montada sobre el sustrato y una cubierta montada sobre la junta, en donde la muestra de tejido o célula viva se ubica dentro de la cámara de perfusión de la pluralidad de cámaras de perfusión, en donde
(1) el sustrato comprende una pluralidad de regiones de sustrato, en donde una región de sustrato de la pluralidad comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito;
(2) la junta comprende (i) una pluralidad de aberturas correspondientes a la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente, (ii) una pluralidad de canales de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y (iii) una pluralidad de canales de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y en donde la pluralidad de aberturas de la junta se alinean con la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato cuando la junta se monta sobre el sustrato;
(3) la cubierta comprende una entrada y una salida, la entrada se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada cuando la cubierta se monta sobre la junta, la salida se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de salida cuando la cubierta se monta sobre la junta; y
(4) la pluralidad de cámaras de perfusión se definen por (i) la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato, (ii) la pluralidad de aberturas de la junta que se monta sobre el sustrato, y (iii) la cubierta que se monta sobre la junta;
(b) perfundir uno o más compuestos de prueba a través de la cámara de perfusión;
(c) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra de tejido o célula viva,
(d) permeabilizar la muestra de tejido o célula viva de manera que el analito se une específicamente al dominio de captura de la sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura;
(e) desmontar la junta y la cubierta del sustrato;
(f) extender la sonda de captura en el extremo 3' mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida;
(g) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y
(h) secuenciar (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de la misma, y mediante el uso de las secuencias determinadas de (i) y (ii) determinar la ubicación y la ubicación y/o abundancia del analito en la muestra de tejido o célula viva.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para identificar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra de tejido o célula viva, el método comprende:
(a) proporcionar una placa de múltiples pocillos que comprende un sustrato y una junta montada sobre el sustrato, en donde el sustrato comprende una pluralidad de regiones de sustrato, en donde una región de sustrato de la pluralidad de regiones de sustrato comprende sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito; en donde la junta comprende una pluralidad de aberturas, en donde la junta se configura para montarse sobre el sustrato de manera que la pluralidad de aberturas se alinea con la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente; en donde un pocillo de la placa de múltiples pocillos se define por una región de sustrato del sustrato y una abertura de la junta; en donde la muestra de tejido o célula viva se ubica dentro del pocillo de la placa de múltiples pocillos;
(b) tratar la muestra de tejido o célula viva con uno o más compuestos de prueba;
(c) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra de tejido o célula viva;
(d) permeabilizar la muestra de tejido o célula viva de manera que el analito se une específicamente al dominio de captura de la sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura;
(e) desmontar la junta del sustrato;
(f) extender la sonda de captura en el extremo 3' mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida;
(g) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y
(h) secuenciar (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de esta, y mediante el uso de las secuencias determinadas de (i) y (ii) identificar la ubicación y/o abundancia del analito en la muestra de tejido o célula viva.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para identificar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra de tejido o célula viva, el método comprende:
(a) proporcionar una placa de múltiples pocillos, en donde un pocillo de la placa de múltiples pocillos comprende un sustrato, en donde el sustrato comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito; en donde la muestra de tejido o célula vivas se ubica dentro del pocillo de la placa de múltiples pocillos;
(b) tratar la muestra de tejido o célula viva con uno o más compuestos de prueba;
(c) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra de tejido o célula viva;
(d) permeabilizar la muestra de tejido o célula viva de manera que el analito se une específicamente al dominio de captura de la sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura;
(e) extender la sonda de captura en el extremo 3' mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida;
(f) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y
(g) secuenciar (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de esta, y mediante el uso de las secuencias determinadas de (i) y (ii) identificar la ubicación y/o abundancia del analito en la muestra de tejido o célula viva.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un kit que comprende a) una matriz que comprende una pluralidad de sondas de captura; b) una cámara de perfusión definida mediante el montaje de una junta en la matriz, y una cubierta montada sobre la junta, en donde la cubierta incluye: (i) una entrada que se conecta fluídicamente a una pluralidad de canales de entrada, y (ii) una salida que se conecta fluídicamente a una pluralidad de canales de salida; y c) una instrucción para usar el kit.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un kit que comprende a) una placa de múltiples pocillos que comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde la pluralidad de sondas de captura se unen directamente (por ejemplo, se imprimen) a una superficie de un pocillo de la placa de múltiples pocillos; y b) una instrucción para usar el kit.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un kit que comprende a) un cubreobjetos que comprende una pluralidad de sondas de captura; b) una placa de múltiples pocillos, en donde el cubreobjetos se une a una superficie de un pocillo de la placa de múltiples pocillos; y c) una instrucción para usar el kit. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos es una placa de 6 pocillos, una placa de 8 pocillos, una placa de 12 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 48 pocillos o una placa de 96 pocillos.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un kit que comprende a) un portaobjetos que comprende una pluralidad de matrices, en donde una matriz de la pluralidad de matrices comprende sondas de captura; b) una junta que comprende una pluralidad de aberturas, en donde la junta se configura para montarse sobre el portaobjetos de manera que la pluralidad de aberturas se alinea con la pluralidad de matrices; y c) una instrucción para usar el kit.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un aparato para medir la actividad celular y/o la expresión génica, que comprende: una junta que incluye una pluralidad de aberturas, una pluralidad de canales de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y una pluralidad de canales de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente; y una cubierta configurada para montarse sobre la junta, la cubierta comprende: una entrada configurada para conectarse fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada de la junta cuando la cubierta se monta sobre la junta, y una salida configurada para conectarse fluídicamente a la pluralidad de canales de salida de la junta cuando la cubierta se monta sobre la junta.
En algunas modalidades, la pluralidad de aberturas incluye: puertos de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada, respectivamente; y puertos de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de canales de salida, respectivamente.
En algunas modalidades, el aparato descrito en la presente descripción comprende además un sustrato que tiene una pluralidad de regiones de sustrato. En algunas modalidades, la junta se configura para montarse sobre el sustrato de manera que la pluralidad de aberturas se alinea con la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente. En algunas modalidades, la cubierta se configura para montarse sobre la junta opuesta al sustrato. En algunas modalidades, una pluralidad de cámaras de perfusión se definen por (i) la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato, (ii) la pluralidad de aberturas de la junta que se monta sobre el sustrato, y (iii) la cubierta que se monta sobre la junta
En algunas modalidades, la junta está hecho de silicona.
En algunas modalidades, cada una de las regiones de sustrato se configura para unir una sonda de captura que incluye (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une a una secuencia presente en un analito.
En algunas modalidades, la junta tiene un grosor que varía entre 0,6 mm y 1,0 mm.
En algunas modalidades, la junta incluye un orificio aguas arriba y un orificio aguas abajo. En algunas modalidades, la pluralidad de canales de entrada se extiende entre el orificio aguas arriba y los puertos de entrada de la pluralidad de aberturas, respectivamente. En algunas modalidades, la pluralidad de canales de salida se extiende entre el orificio aguas abajo y los puertos de salida de la pluralidad de aberturas, respectivamente.
En algunas modalidades, la pluralidad de canales de entrada tienen diferentes longitudes entre el orificio aguas arriba y los puertos de entrada de la pluralidad de aberturas, respectivamente.
En algunas modalidades, la pluralidad de canales de salida tiene diferentes longitudes entre el orificio aguas abajo y los puertos de salida de la pluralidad de aberturas, respectivamente.
En algunas modalidades, el orificio aguas arriba se ubica para ser opuesto al orificio aguas abajo con respecto a un centro de la junta. En algunas modalidades, el orificio aguas arriba se configura para alinearse con la entrada de la cubierta. En algunas modalidades, el orificio aguas abajo se configura para alinearse con la salida de la cubierta.
En algunas modalidades, cada una de la pluralidad de aberturas incluye al menos una porción que tiene un ancho que varía entre el puerto de entrada y el puerto de salida.
En algunas modalidades, cada una de la pluralidad de aberturas incluye: una primera porción que incluye el puerto de entrada y que tiene un primer ancho; y una segunda porción que incluye el puerto de salida y que tiene un segundo ancho.
En algunas modalidades, el primer ancho de la primera porción varía entre el puerto de entrada y la segunda porción. En algunas modalidades, el primer ancho de la primera porción aumenta gradualmente desde el puerto de entrada a una interfaz entre la primera porción y la segunda porción. En algunas modalidades, el segundo ancho de la segunda porción es consistente. En algunas modalidades, el primer ancho de la primera porción es idéntico al segundo ancho de la segunda porción en la interfaz entre la primera porción y la segunda porción.
Cuando los valores se describen en términos de intervalos, debe entenderse que la descripción incluye la descripción de todos los posibles subintervalos dentro de tales intervalos, así como también valores numéricos específicos que caen dentro de tales intervalos independientemente de si se indica expresamente un valor numérico específico o un subintervalo específico.
El término “cada uno”, cuando se usa en referencia a una recopilación de artículos, pretende identificar un artículo individual en la recopilación, pero no necesariamente se refiere a cada artículo en la recopilación, a menos que se indique expresamente de cualquier otra manera, o a menos que el contexto del uso indique claramente de cualquier otra manera.
En la presente descripción se describen diversas modalidades de las características de esta descripción.
Descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos ilustran ciertas modalidades de las características y ventajas de esta descripción. Los símbolos de referencia similares en los dibujos indican elementos similares.
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de una sonda de captura con código de barras, como se describe en la presente descripción.
La figura 2 es un esquema que ilustra una sonda de captura escindible, en donde la sonda de captura escindida puede entrar en una célula no permeabilizada y unirse a analitos diana dentro de la muestra.
La Figura 3 es un diagrama esquemático de un elemento con códigos de barras espaciales multiplexado ilustrativo.
La Figura 4 es un diagrama esquemático de un agente de captura del analito ilustrativo.
La Figura 5 es un diagrama esquemático que representa una interacción ilustrativa entre una sonda de captura inmovilizada por elemento 524 y un agente de captura del analito 526.
Las Figuras 6A, 6B y 6C son esquemas que ilustran cómo pueden utilizarse las etiquetas de células de estreptavidina en un sistema basado en matrices para producir células o contenidos celulares con códigos de barras espaciales.
La Figura 7 es un esquema que ilustra una vista lateral de un medio resistente a la difusión.
Las Figura 8A y 8B son esquemas que ilustran la Figura 8A expandida y vistas laterales Figura 8B de un sistema electroforético de transferencia configurado para dirigir los analitos transcritos hacia una matriz de sondas de captura con códigos de barras espaciales.
Las Figuras 9A-9G muestran un esquema que ilustra un protocolo de flujo de trabajo ilustrativo que utiliza un sistema electroforético de transferencia. NGS: secuenciación de nueva generación.
La Figura 10A muestra una vista en perspectiva esquemática de un sistema de ejemplo.
La Figura 10B muestra una vista despiezada de un sistema de ejemplo en la Figura 10A.
La Figura 11A muestra una vista superior de una junta de ejemplo.
La Figura 11B muestra una vista superior de un sustrato ilustrativo.
La Figura 11C muestra una vista superior de una junta de ejemplo dispuesto sobre un sustrato ilustrativo.
La Figura 12A muestra un vibrátomo representativo para cortar tejidos.
La Figura 12B muestra la preparación de secciones de tejido vivo.
Las Figuras 12C y 12D muestran una cámara de perfusión representativa y el ensamblaje de la cámara a un microscopio.
Las Figuras 13A-13C muestran un esquema que ilustra mecanismos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). La Figura 13A muestra el solapamiento espectral durante la excitación de FRET. La Figura 13B demuestra que la excitación de FRET se produce a distancias entre el donante de emisión y el aceptor de excitación de menos de 10 nm. La Figura 13C muestra la orientación de las moléculas donante de emisión y aceptora de excitación.
La Figura 14 muestra un esquema de detección de la hibridación de sondas de oligo marcadas con fluorescencia a una secuencia de ARNm diana mediante el uso de FRET.
La Figura 15 muestra un resultado de registro ilustrativo y el estado de hibridación correspondiente para detectar la expresión génica de una secuencia de ARNm diana a través de FRET.
La Figura 16 muestra un resultado de registro ilustrativo y un flujo de trabajo esquemáti
respuesta en tiempo real durante el tratamiento farmacológico a través de FRET.
Las Figuras 17A-17D muestran configuraciones de junta ilustrativas.
La Figura 18 muestra configuraciones ilustrativas de placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos.
La Figura 19 muestra un esquema del tamizaje de fármacos mediante el uso de muestras de pacientes. Células iPS: células madre pluripotentes inducidas.
La Figura 20A muestra una imagen fusionada de células teñidas, núcleos de células teñidas (por DAPI) y huella de ADNc de células A549 que se cultivaron sobre un portaobjetos de matriz espacial. A la derecha se muestra una imagen ampliada de la imagen fusionada.
La Figura 20B muestra imágenes en grupos de canales individuales en la Figura 20A. Las imágenes monocanal de núcleos de células teñidas mediante DAPI, células teñidas, huella de ADNc se muestran de izquierda a derecha, respectivamente.
La Figura 20C muestra una imagen fusionada de células teñidas y núcleos de células teñidas (por DAPI) de las imágenes monocanal mostradas en la Figura 20B (izquierda); y una imagen fusionada de núcleos de células teñidas (por DAPI) y huella de ADNc de las imágenes monocanal mostradas en la Figura 20B (derecha).
La Figura 21A muestra una imagen de campo claro de células A549 que se cultivaron sobre un portaobjetos de matriz espacial. A la izquierda se muestra una imagen ampliada. Los puntos redondos de los bordes son marcadores fiduciales.
La Figura 21B muestra imágenes fusionadas de la imagen de campo claro ampliada en la Figura 21A superpuestas con puntos en el portaobjetos de matriz espacial que muestran recuentos relativos de identificadores moleculares únicos (UMI). Las regiones de mayor densidad celular se indican con flechas.
La Figura 22A muestra gráficos de UMI espaciales sin procesar. Las células A549 cultivadas sobre las matrices espaciales no se trataron (izquierda) o se trataron con Linsitinib durante 24 horas antes de la cosecha (derecha). Se obtuvo una réplica (repl) para cada cultivo para detectar los recuentos de UMI. Los límites aproximados de los gráficos se indican mediante líneas discontinuas.
La Figura 22B muestra gráficos de UMI espaciales sin procesar. Las células A549 cultivadas sobre las matrices espaciales se trataron con Osimertinib durante 24 horas antes de la cosecha. Se obtuvieron dos réplicas (repl y rep2) de cultivos tratados con Osimertinib para detectar recuentos de UMI. Los límites aproximados de los gráficos se indican mediante líneas discontinuas.
La Figura 22C muestra gráficos de genes espaciales sin procesar. Las células A549 cultivadas sobre las matrices espaciales no se trataron (izquierda) o se trataron con Linsitinib durante 24 horas antes de la cosecha (derecha). Se obtuvo una réplica (rep1) para cada cultivo para detectar los recuentos de genes. Los límites aproximados de los gráficos se indican mediante líneas discontinuas.
La Figura 22D muestra gráficos de genes espaciales sin procesar. Las células A549 cultivadas sobre las matrices espaciales se trataron con Osimertinib durante 24 horas antes de la cosecha. Se obtuvieron dos réplicas (rep1 y rep2) de cultivos tratados con Osimertinib para detectar recuentos de genes. Los límites aproximados de los gráficos se indican mediante líneas discontinuas.
Las Figuras 23A-23C muestran curvas de saturación por tratamiento con fármaco. Osimertinib-1 y Osimertinib-2 son dos réplicas de células tratadas con Osimertinib.
La Figura 23D muestra métricas de complejidad basadas en la matriz agregada por tratamiento con fármaco.
La Figura 23E muestra el gráfico de UMAP gris por columna (proyección y aproximación uniforme del colector) por tratamiento con fármaco. Los diferentes conglomerados de tratamiento se indican con flechas.
La Figura 24A muestra gráficos de dispersión de genes a través del tratamiento con fármaco. Los genes expresados diferencialmente se indican en los gráficos.
La Figura 24B muestra los máximos genes expresados diferencialmente entre diferentes cultivos de tratamiento.
La Figura 25 muestra gráficos de UMAP grises por columna por tratamiento. Los diferentes conglomerados de tratamiento se indican con flechas.
Descripción detallada
I. Introducción
En la presente descripción se describen métodos y aparatos para medir la actividad y/o la expresión génica celular (por ejemplo, mediante registros ópticos) para rastrear la información temporal así como también para identificar una ubicación de un analito diana (por ejemplo, mediante el uso de sondas de captura unidas a una superficie (por ejemplo, un sustrato) dentro de una cámara de perfusión, o un pocillo de una placa de múltiples pocillos) para rastrear la información espacial en una muestra biológica (por ejemplo, un cultivo celular o secciones de tejido vivo). Aquí, la cámara de perfusión y la placa de múltiples pocillos son dos tipos ilustrativos de sistemas de cultivo que permiten registrarin situmuestras de tejidos/células vivas, y el medio de cultivo puede perfundirse o reemplazarse para mantener la viabilidad de tejidos/células. Una aplicación directa de los métodos descritos en la presente descripción es determinar el efecto de los fármacos sobre la actividad y/o la expresión génica celular, y correlacionar el efecto determinado con la información espacial como se obtiene mediante el uso de sondas de captura, proporcionando de esta manera una comprensión profunda del efecto del fármaco sobre la muestra biológica.
Las metodologías y composiciones de análisis espacial descritas en la presente descripción pueden proporcionar una gran cantidad de analito y/o datos de expresión para una variedad de analitos dentro de una muestra biológica con alta resolución espacial, lo que mantiene al mismo tiempo el contexto espacial nativo. Los métodos y composiciones de análisis espacial pueden incluir, por ejemplo, el uso de una sonda de captura que incluye un código de barras espacial (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre la ubicación o posición de un analito dentro de una célula o una muestra de tejido (por ejemplo, una célula de mamífero o una muestra de tejido de mamífero) y un dominio de captura que es capaz de unirse a un analito (por ejemplo, una proteína y/o un ácido nucleico) producido por y/o presente en una célula. Los métodos y composiciones de análisis espacial también pueden incluir el uso de una sonda de captura que tiene un dominio de captura que captura un agente intermedio para la detección indirecta de un analito. Por ejemplo, el agente intermedio puede incluir una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un código de barras) asociada con el agente intermedio. Por lo tanto, la detección del agente intermedio es indicativa del analito en la muestra de células o tejido.
Los aspectos no limitantes de las metodologías y composiciones de análisis espacial se describen en las patentes de Estados Unidos núms 10,774,374, 10,724,078, 10,480,022, 10,059,990, 10,041,949, 10,002,316, 9,879,313, 9,783,841, 9,727,810, 9,593,365, 8,951,726, 8,604,182, 7,709,198, publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos núms 2020/239946, 2020/080136, 2020/0277663, 2020/024641, 2019/330617, 2019/264268, 2020/256867, 2020/224244, 2019/194709, 2019/161796, 2019/085383, 2019/055594, 2018/216161, 2018/051322, 2018/0245142, 2017/241911, 2017/089811, 2017/067096, 2017/029875, 2017/0016053, 2016/108458, 2015/000854, 2013/171621, WO 2018/091676, WO 2020/176788, Rodriques y otros, Science 363(6434): 1463-1467, 2019; Leey otros,Nat. Protoc. 10(3):442-458, 2015; Trejo y otros, PLoS ONE 14(2):e0212031, 2019; Chen y otros, Science 348(6233):aaa6090, 2015; Gao y otros, BMC Biol. 15:50, 2017; y Gupta y otros, Nature Biotechnol. 36:1197-1202, 2018; la Guía del usuario de los kits de reactivos de expresión genética espacial de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020) y/o la Guía del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020), ambas disponibles en el sitio web de documentación de soporte de 10x Genomics y puede usarse en la presente descripción en cualquier combinación. En la presente descripción se describen aspectos adicionales no limitantes de las metodologías y composiciones de análisis espacial.
Alguna terminología general que puede usarse en esta descripción puede encontrarse en la Sección (I)(b) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Típicamente, un “código de barras” es una etiqueta o identificador que transmite o es capaz de transmitir información (por ejemplo, información sobre un analito en una muestra, una perla y/o una sonda de captura). Un código de barras puede ser parte de un analito o independiente de un analito. Un código de barras puede unirse a un analito. Un código de barras particular puede ser único con relación a otros códigos de barras. A los efectos de esta descripción, un “analito” puede incluir cualquier sustancia, estructura, resto o componente biológico a analizar. El término “diana” puede referirse de manera similar a un analito de interés.
Los analitos pueden clasificarse en términos generales en uno de dos grupos: analitos de ácidos nucleicos y analitos no ácidos nucleicos. Los ejemplos de analitos no ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitarse a, lípidos, carbohidratos, péptidos, proteínas, glicoproteínas (unidas a N o unidas a O), lipoproteínas, fosfoproteínas, variantes específicas de proteínas fosforiladas o acetiladas, variantes de amidación de proteínas, variantes de hidroxilación de proteínas, variantes de metilación de proteínas, variantes de ubiquitinación de proteínas, variantes de sulfatación de proteínas, proteínas virales (por ejemplo, cápside viral, envoltura viral, cubierta viral, accesorio viral, glicoproteínas virales, pico viral, etc.), proteínas extracelulares e intracelulares, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) localizarse en ubicación(ones) subcelular(es), incluida(s), por ejemplo, orgánulos, por ejemplo, mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, cloroplastos, vesículas endocíticas, vesículas exocíticas, vacuolas, lisosomas, etc. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) ser péptidos o proteínas, incluidos sin limitación, anticuerpos y enzimas. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de analitos en la Sección (I)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663. En algunas modalidades, un analito puede detectarse indirectamente, tal como mediante la detección de un agente intermedio, por ejemplo, una sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligazón) o un agente de captura del analito (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con oligonucleótido), tales como aquellos descritos en la presente descripción.
Una “muestra biológica” se obtiene típicamente del sujeto para su análisis mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, biopsia, cirugía y microscopía de captura láser (LCM), y generalmente incluye células y/u otro material biológico del sujeto. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una sección de tejido. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una muestra biológica fijada y/o teñida (por ejemplo, una sección de tejido fijada y/o teñida). Los ejemplos no limitantes de tinciones incluyen tinciones histológicas (por ejemplo, hematoxilina y/o eosina) y tinciones inmunológicas (por ejemplo, tinciones fluorescentes). En algunas modalidades, pueden obtenerse imágenes de una muestra biológica (por ejemplo, una muestra biológica fijada y/o teñida). Las muestras biológicas también se describen en la Sección (I)(d) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
En algunas modalidades, una muestra biológica se permeabiliza con uno o más reactivos de permeabilización. Por ejemplo, la permeabilización de una muestra biológica puede facilitar la captura del analito. Las condiciones y agentes de permeabilización ilustrativos se describen en la Sección (I)(d)(ii)(13) o la Sección de modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
Los métodos de análisis espacial basados en matrices implican la transferencia de uno o más analitos de una muestra biológica a una serie de elementos en un sustrato, donde cada elemento está asociado con una ubicación espacial única en la matriz. El análisis subsecuente de los analitos transferidos incluye determinar la identidad de los analitos y la ubicación espacial de los analitos dentro de la muestra biológica. La ubicación espacial de un analito dentro de la muestra biológica se determina basándose en el elemento al que está unido el analito (por ejemplo, directa o indirectamente) en la matriz, y la ubicación espacial relativa del elemento dentro de la matriz.
Una “sonda de captura” se refiere a cualquier molécula capaz de capturar (directa o indirectamente) y/o marcar un analito (por ejemplo, un analito de interés) en una muestra biológica. En algunas modalidades, la sonda de captura es un ácido nucleico o un polipéptido. En algunas modalidades, la sonda de captura incluye un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial y/o un identificador molecular único (UMI)) y un dominio de captura). En algunas modalidades, una sonda de captura puede incluir un dominio de escisión y/o un dominio funcional (por ejemplo, un sitio de unión a cebador, tal como para secuenciación de nueva generación (NGS)).
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra una sonda de captura ilustrativa, como se describe en la presente descripción. Como se muestra, la sonda de captura 102 está opcionalmente acoplada a un elemento 101 por un dominio de escisión 103, tal como un enlazador disulfuro. La sonda de captura puede incluir una secuencia funcional 104 que sea útil para su procesamiento subsecuente. La secuencia funcional 104 puede incluir toda o una parte de la secuencia de unión a celdas de flujo específicas del secuenciador (por ejemplo, una secuencia P5 o P7), toda o una parte de una secuencia de cebador de secuenciación (por ejemplo, un sitio de unión al cebador R1, un sitio de unión al cebador R2), o sus combinaciones. La sonda de captura también puede incluir un código de barras espacial 105. La sonda de captura también puede incluir una secuencia de identificador molecular único (UMI) 106. Mientras que la Figura 1 muestra el código de barras espacial 105 como ubicado aguas arriba (5') de la secuencia UMI 106, debe entenderse que las sondas de captura en donde la secuencia UMI 106 está ubicada aguas arriba (5') del código de barras espacial 105 también son adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. La sonda de captura también puede incluir un dominio de captura 107 para facilitar la captura de un analito diana. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de un analito de ácido nucleico. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una sonda conectada descrita en la presente descripción. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de control de captura presente en un agente de captura del analito. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a un oligonucleótido de férula. Tal oligonucleótido de férula, además de tener una secuencia complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura, puede tener una secuencia de un analito de ácido nucleico, una secuencia complementaria a una porción de una sonda conectada descrita y/o una secuencia de control de captura descrita en la presente descripción.
Las secuencias funcionales generalmente pueden seleccionarse para compatibilidad con cualquiera de una variedad de sistemas de secuenciación diferentes, por ejemplo, Ion Torrent Proton o PGM, instrumentos de secuenciación Illumina, PacBio, Oxford Nanopore, etc., y los requisitos de los mismos. En algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse por compatibilidad con sistemas de secuenciación no comercializados. Ejemplos de tales sistemas y técnicas de secuenciación, para los cuales pueden usarse secuencias funcionales adecuadas, incluyen (pero no se limitan a) secuenciación Ion Torrent Proton o PGM, secuenciación Illumina, secuenciación PacBio SMRT y secuenciación Oxford Nanopore. Además, en algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse para que sean compatibles con otros sistemas de secuenciación, incluidos sistemas de secuenciación no comercializados.
En algunas modalidades, el código de barras espacial 105 y las secuencias funcionales 104 son comunes a todas las sondas unidas a un elemento dado. En algunas modalidades, la secuencia UMI 106 de una sonda de captura unida a un elemento determinado es diferente de la secuencia UMI de una sonda de captura diferente unida al elemento dado.
La Figura 2 es un esquema que ilustra una sonda de captura escindible, en donde la sonda de captura escindida puede entrar en una célula no permeabilizada y unirse a analitos dentro de la muestra. La sonda de captura 201 contiene un dominio de escisión 202, un péptido penetrantes en células 203, una molécula indicadora 204, y un enlace disulfuro (-S-S-). 205 representa todas las demás partes de una sonda de captura, por ejemplo, un código de barras espacial y un dominio de captura.
La Figura 3 es un diagrama esquemático de un elemento con código de barras espacial multiplexado ilustrativo. En la Figura 3, el elemento 301 puede acoplarse a sondas de captura con códigos de barras espaciales, en donde las sondas con códigos de barras espaciales de un elemento particular pueden poseer el mismo código de barras espacial, pero tienen diferentes dominios de captura diseñados para asociar el código de barras espacial del elemento con más de un analito diana. Por ejemplo, un elemento puede acoplarse a cuatro tipos diferentes de sondas de captura con códigos de barras espaciales, donde cada tipo de sonda de captura con códigos de barras espaciales posee el código de barras espacial 302. Un tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura poli(T) 303, diseñado para capturar analitos diana de ARNm. Un segundo tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura N-mer aleatorio 304 para análisis de ADNg. Un tercer tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura complementario a una secuencia de control de captura de un agente de captura del analito de interés 305. Un cuarto tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura que puede unirse específicamente a una molécula de ácido nucleico 306 que pueden funcionar en un ensayo CRISPR (por ejemplo, CRISPR/Cas9). Si bien solo se muestran cuatro constructos diferentes con códigos de barras de sonda de captura en la Figura 3, los constructos con código de barras de sonda de captura se pueden adaptarse para el análisis de cualquier analito determinado asociado con un ácido nucleico y capaz de unirse a tal constructo. Por ejemplo, los esquemas mostrados en la Figura 3 también puedes usarse para el análisis simultáneo de otros analitos descritos en la presente descripción, incluidos, pero sin limitarse a: (a) ARNm, un constructo de rastreo de linaje, proteínas y metabolitos de la superficie celular o intracelulares, y ADNg; (b) ARNm, proteínas y metabolitos intracelulares o de superficie celular con cromatina accesible (por ejemplo, ATAC-seq, DNase-seq y/o MNase-seq), y un agente de perturbación (por ejemplo, una nucleasa ARNcr/ARNgu CRISPR, TALEN, dedos de zinc y/u oligonucleótido antisentido como se describe en la presente descripción); (c) ARNm, proteínas y/o metabolitos de la superficie celular o intracelulares, un agente de marcado con código de barras (por ejemplo, los multímeros de MHC descritos en la presente descripción) y una secuencia V(D)J de un receptor de células inmunitarias (por ejemplo, receptor de células T). En algunas modalidades, un agente de perturbación puede ser una molécula pequeña, un anticuerpo, un fármaco, un aptámero, un miARN, un entorno físico (por ejemplo, cambio de temperatura) o cualquier otro agente de perturbación conocido. Ver, por ejemplo, la Sección (II)(b) (por ejemplo, las subsecciones (i)-(vi)) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663. La generación de sondas de captura puede lograrse mediante cualquier método apropiado, incluidos los descritos en la Sección (M)(d)(ii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
En algunas modalidades, puede detectarse más de un tipo de analito (por ejemplo, ácidos nucleicos y proteínas) de una muestra biológica (por ejemplo, simultánea o secuencialmente) mediante el uso de cualquier técnica en formato múltiple apropiada, tales como las descritas en la Sección (IV) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
En algunas modalidades, la detección de uno o más analitos (por ejemplo, analitos proteicos) puede realizarse mediante el uso de uno o más agentes de captura del analito. Como se usa en la presente, un “agente de captura del analito” se refiere a un agente que interactúa con un analito (por ejemplo, un analito en una muestra biológica) y con una sonda de captura (por ejemplo, una sonda de captura unida a un sustrato o un elemento) para identificar el analito. En algunas modalidades, el agente de captura del analito incluye: (i) un resto de unión al analito (por ejemplo, que se une a un analito), por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este; (ii) código de barras del resto de unión al analito; y (iii) una secuencia de control de captura. Como se usa en la presente, el término “código de barras del resto de unión al analito” se refiere a un código de barras que está asociado con, o de cualquier otra manera, identifica el resto de unión al analito. Como se usa en la presente, el término “secuencia de captura del analito” o “secuencia de control del analito” se refiere a una región o resto configurado para hibridarse, unirse, acoplarse o interactuar de cualquier otra manera con un dominio de captura de una sonda de captura. En algunas modalidades, una secuencia de control de captura es complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura. En algunos casos, un código de barras del resto de unión al analito (o una porción del mismo) puede eliminarse (por ejemplo, escindirse) del agente de captura del analito.
La Figura 4 es un diagrama esquemático de un agente de captura del analito ilustrativo 402 compuesto de un resto de unión al analito 404 y un dominio de código de barras del resto de unión al analito 408. El resto de unión al analito ilustrativo 404 es una molécula capaz de unirse a un analito 406 y el agente de captura del analito es capaz de interactuar con una sonda de captura con código de barras espacial. El resto de unión al analito puede unirse al analito 406 con alta afinidad y/o con alta especificidad. El agente de captura del analito puede incluir un dominio de código de barras del resto de unión al analito 408, una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un oligonucleótido), que puede hibridarse con al menos una porción o una totalidad de un dominio de captura de una sonda de captura. El dominio de código de barras del resto de unión al analito 408 puede comprender un código de barras del resto de unión al analito y una secuencia de control de captura descrita en la presente descripción. El resto de unión al analito 404 puede incluir un polipéptido y/o un aptámero. El resto de unión al analito 404 puede incluir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno).
La Figura 5 es un diagrama esquemático que representa una interacción ilustrativa entre una sonda de captura inmovilizada por elemento 524 y un agente de captura del analito 526. La sonda de captura inmovilizada por elemento 524 puede incluir un código de barras espacial 508 así como también secuencias funcionales 506 y UMI 510, como se describió en otra parte en la presente descripción. La sonda de captura también puede incluir un dominio de captura 512 que es capaz de unirse a un agente de captura del analito 526. El agente de captura del analito 526 puede incluir una secuencia funcional 518, un código de barras del resto de unión al analito 516 y una secuencia de control de captura 514 que es capaz de unirse al dominio de captura 512 de la sonda de captura 524. El agente de captura del analito también puede incluir un enlazador 520 que permite que el dominio de código de barras del agente de captura 516 se acople al resto de unión al analito 522.
Las Figuras 6A, 6B y 6C son esquemas que ilustran cómo pueden utilizarse las etiquetas de células de estreptavidina en un sistema basado en matrices para producir una célula con código de barras espacial o contenidos celulares. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 6A, el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) unido a péptidos puede asociarse individualmente con la biotina (I32m) y unirse a un resto de estreptavidina de manera que el resto de estreptavidina comprende múltiples restos de pMHC. Cada uno de estos restos puede unirse a un TCR de manera que la estreptavidina se una a una célula T diana a través de múltiples interacciones de unión a MHC/TCR. Múltiples interacciones se sinergizan y pueden mejorar sustancialmente la afinidad de unión. Tal afinidad mejorada puede mejorar el marcaje de las células T y también reducir la posibilidad de que los marcadores se disociarán de las superficies de las células T. Como se muestra en la Figura 6B, un dominio de código de barras del agente de captura 601 puede modificarse con estreptavidina 602 y ponerse en contacto con múltiples moléculas de MHC biotiniladas 603 de manera que las moléculas de MHC biotiniladas 603 se acoplan con el dominio de código de barras del agente de captura conjugado con estreptavidina 601. El resultado es un complejo de multímeros de MHC con código de barras 605. Como se muestra en la Figura 6B, la secuencia del dominio de código de barras del agente de captura 601 puede identificar el MHC como su marcador asociado y también incluye secuencias funcionales opcionales tales como secuencias para la hibridación con otros oligonucleótidos. Como se muestra en la Figura 6C, un oligonucleótido de ejemplo es la sonda de captura 606 que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, rGrGrG correspondiente a C C C), una secuencia de código de barras y otras secuencias funcionales, tales como, por ejemplo, una UMI, una secuencia adaptadora (por ejemplo, que comprende una secuencia de cebador de secuenciación (por ejemplo, R1 o un R1 parcial (“pRl”), R2), una secuencia de unión a células de flujo (por ejemplo, P5 o P7 o secuencias parciales de estas)), etc. En algunos casos, la sonda de captura 606 puede asociarse al principio con un elemento (por ejemplo, una perla de gel) y liberarse del elemento. En otras modalidades, la sonda de captura 606 puede hibridarse con un dominio de código de barras del agente de captura 601 del complejo de MHC-oligonucleótidos 605. Se generan los oligonucleótidos hibridados (Separador C C C y Separador rGrGrG) pueden entonces extenderse en reacciones de extensión del cebador de manera que se generen constructos que comprenden secuencias que corresponden a cada una de las dos secuencias de código de barras espaciales (el código de barras espacial asociado con la sonda de captura, y el código de barras asociado con el complejo oligonucleotídico MHC). En algunos casos, una o ambas de las secuencias correspondientes pueden ser un complemento de la secuencia original en la sonda de captura 606 o el dominio de código de barras del agente de captura 601. En otras modalidades, la sonda de captura y el dominio de código de barras del agente de captura se ligan entre sí. Los constructos resultantes pueden procesarse opcionalmente adicionalmente (por ejemplo, para añadir cualquier secuencia adicional y/o para la limpieza) y someterse a secuenciación. Como se describió en otra parte en la presente descripción, una secuencia derivada de la secuencia de código de barras espacial de la sonda de captura 606 puede usarse para identificar un elemento y la secuencia derivada de la secuencia de código de barras espacial en el dominio de código de barras del agente de captura 601 puede usarse para identificar el complejo de MHC peptídico particular 604 unido a la superficie de la célula (por ejemplo, cuando se usan bibliotecas de péptidos de MHC para tamizar células inmunitarias o poblaciones de células inmunitarias).
Puede encontrarse una descripción adicional de los agentes de captura del analito en la Sección (II)(b)(ix) del documento WO 2020/176788 y/o en la Sección (M)(b)(viii) de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
Existen al menos dos métodos para asociar un código de barras espacial con una o más células vecinas, de manera que el código de barras espacial identifique la una o más células, y/o el contenido de la una o más células, como asociado con una ubicación espacial particular. Un método es promover analitos o sustitutos de analitos (por ejemplo, agentes intermedios) fuera de una célula y hacia una matriz con código de barras espacial (por ejemplo, incluyendo sondas de captura con código de barras espaciales). Otro método consiste en escindir sondas de captura con códigos de barras espaciales de una matriz y promover las sondas de captura con códigos de barras espaciales hacia y/o dentro o sobre la muestra biológica.
En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para cebar, replicar y, en consecuencia, producir productos de extensión opcionalmente con códigos de barra a partir de una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio (por ejemplo, una sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligazón) o un agente de captura del analito), o una porción de este), o derivados de estos (ver, por ejemplo, la Sección (II)(b)(vii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663 con respecto a sondas de captura extendidas). En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para formar una sonda conectada (por ejemplo, producto de ligazón) con una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio, o una porción de este), para crear de esta manera productos de ligazón que sirvan como sustitutos de una plantilla.
Como se usa en la presente, una “sonda de captura extendida” se refiere a una sonda de captura que tiene nucleótidos adicionales añadidos al extremo (por ejemplo, extremo 3' o 5') de la sonda de captura, para extender de esta manera la longitud total de la sonda de captura. Por ejemplo, un “extremo 3' extendido” indica que se añadieron nucleótidos adicionales al nucleótido más 3' de la sonda de captura para extender la longitud de la sonda de captura, por ejemplo, mediante reacciones de polimerización usadas para extender moléculas de ácido nucleico, incluida la polimerización con plantilla catalizada por una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa o una transcriptasa inversa). En algunas modalidades, extender la sonda de captura incluye añadir a un extremo 3' de una sonda de captura una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de un analito o agente intermedio unido específicamente al dominio de captura de la sonda de captura. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de transcripción inversa. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de una o más ADN polimerasas. Las sondas de captura extendidas incluyen la secuencia de la sonda de captura y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura.
En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas se amplifican (por ejemplo, en solución a granel o en la matriz) para producir cantidades que son suficientes para el análisis aguas abajo, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN. En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas (por ejemplo, moléculas de ADN) actúan como plantillas para una reacción de amplificación (por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa).
Variantes adicionales de métodos de análisis espacial, que incluyen, en algunas modalidades, una etapa de obtención de imágenes, se describen en la Sección (II)(a) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663. Análisis de analitos capturados (y/o agentes intermedios o porciones de los mismos), por ejemplo, incluyendo extracción de muestras, extensión de sondas de captura, secuenciación (por ejemplo, de una sonda de captura extendida escindida y/o una molécula de ADNc complementaria a una sonda de captura extendida), la secuenciación en la matriz (por ejemplo, mediante el uso de, por ejemplo, enfoques de hibridación in situ o ligazón in situ), análisis temporal y/o captura de proximidad, se describe en la Sección (II)(g) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663. Algunas mediciones de control de calidad se describen en la Sección (II)(h) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica y/o médica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: la identificación de uno o más biomarcadores (por ejemplo, de diagnóstico, pronóstico y/o para la determinación de la eficacia de un tratamiento) de una enfermedad o trastorno; identificación de una diana farmacológica candidato para el tratamiento de una enfermedad o trastorno; identificación (por ejemplo, diagnóstico) de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno; identificación de la etapa y/o pronóstico de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de un sujeto que tiene una mayor posibilidad de desarrollar una enfermedad o trastorno; seguimiento de la progresión de una enfermedad o trastorno en un sujeto; determinación de la eficacia de un tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de una subpoblación de pacientes para la cual un tratamiento es efectivo para una enfermedad o trastorno; modificación de un tratamiento de un sujeto con una enfermedad o trastorno; selección de un sujeto para la participación en un ensayo clínico; y/o selección de un tratamiento para un sujeto con una enfermedad o trastorno.
La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: identificación de perfiles de expresión del transcriptoma y/o proteoma (por ejemplo, en tejido sano y/o enfermo); identificación de múltiples tipos de analitos muy cercanos (por ejemplo, análisis del vecino más cercano); determinación de genes y/o proteínas regulados positivamente y/o negativamente en tejido enfermo; caracterización de microambientes tumorales; caracterización de respuestas inmunitarias tumorales; caracterización de tipos celulares y su coubicación en tejido; e identificación de variantes genéticas dentro de los tejidos (por ejemplo, basadas en los perfiles de expresión de genes y/o proteínas asociados con biomarcadores de enfermedades o trastornos específicos).
Típicamente, para los métodos basados en matrices espaciales, un sustrato funciona como soporte para la unión directa o indirecta de sondas de captura a elementos de la matriz. Un “elemento” es una entidad que actúa como soporte o depósito para varias entidades moleculares usadas en el análisis espacial. En algunas modalidades, algunas o todos los elementos de una matriz están funcionalizados para la captura del analito. Se describen sustratos ilustrativos en la Sección (II)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663. Pueden encontrarse elementos y atributos geométricos ilustrativos de una matriz en las Secciones (II)(d)(i), (M)(d)(iii) y (II)(d)(iv) del documento w O 2020/176788 y/ o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
Generalmente, los analitos y/o agentes intermedios (o porciones de los mismos) pueden capturarse cuando se pone en contacto una muestra biológica con un sustrato que incluye sondas de captura (por ejemplo, un sustrato con sondas de captura incrustadas, manchadas, impresas, fabricadas sobre el sustrato, o un sustrato con elementos (por ejemplo, perlas, pocillos) que comprenden sondas de captura). Como se usa en la presente descripción, “contacto”, “contactado” y/o “que entra en contacto”, una muestra biológica con un sustrato se refiere a cualquier contacto (por ejemplo, directo o indirecto) de manera que las sondas de captura pueden interactuar (por ejemplo, unirse covalente o no covalentemente (por ejemplo, hibridar)) con analitos de la muestra biológica. La captura puede lograrse activamente (por ejemplo, mediante el uso de electroforesis) o pasivamente (por ejemplo, mediante el uso de difusión). La captura de analitos se describe además en la Sección (II)(e) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la unión y/o introducción de una molécula (por ejemplo, un péptido, un lípido o una molécula de ácido nucleico) que tiene un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial) a una muestra biológica (por ejemplo, a una célula en una muestra biológica). En algunas modalidades, una pluralidad de moléculas (por ejemplo, una pluralidad de moléculas de ácido nucleico) que tienen una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras espaciales) se introducen en una muestra biológica (por ejemplo, en una pluralidad de células en una muestra biológica) para su uso en análisis espacial. En algunas modalidades, después de unir y/o introducir una molécula que tiene un código de barras a una muestra biológica, la muestra biológica puede separarse físicamente (por ejemplo, disociarse) en células individuales o grupos de células para su análisis. Algunos de estos métodos de análisis espacial se describen en la Sección (III) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la detección de múltiples oligonucleótidos que se hibridan con un analito. En algunos casos, por ejemplo, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de ligazón con plantilla de ARN (RTL). Los métodos de RTL se han descrito anteriormente. Ver, por ejemplo, Credle y otros,Nucleic Acids Res.21 de agosto de 2017;45(14):el28. Típicamente, RTL incluye la hibridación de dos oligonucleótidos con secuencias adyacentes en un analito (por ejemplo, una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm). En algunos casos, los oligonucleótidos son moléculas de ADN. En algunos casos, uno de los oligonucleótidos incluye al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3' y/o el otro oligonucleótido incluye un nucleótido fosforilado en el extremo 5'. En algunos casos, uno de los dos oligonucleótidos incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(A), una secuencia no homopolimérica). Después de la hibridación con el analito, una ligasa (por ejemplo, la ligasa SplintR) liga los dos oligonucleótidos juntos, creando una sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligazón). En algunos casos, los dos oligonucleótidos se hibridan con secuencias que no son adyacentes entre sí. Por ejemplo, la hibridación de los dos oligonucleótidos crea un espacio entre los oligonucleótidos hibridados. En algunos casos, una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa) puede extender uno de los oligonucleótidos antes de la ligazón. Después de la ligazón, la sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligazón) se libera del analito. En algunos casos, la sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligazón) se libera mediante el uso de una endonucleasa (por ejemplo, ARNasa H). La sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligazón) liberada puede entonces capturarse mediante sondas de captura (por ejemplo, en lugar de la captura directa de un analito) en una matriz, opcionalmente amplificada, y secuenciada, lo que determina por lo tanto la ubicación y opcionalmente la abundancia del analito en la muestra biológica.
Durante el análisis de información espacial, se obtiene información de secuencia para un código de barras espacial asociado con un analito, y la información de secuencia puede usarse para proporcionar información sobre la distribución espacial del analito en la muestra biológica. Pueden usarse varios métodos para obtener la información espacial. En algunas modalidades, sondas de captura específicas y los analitos que capturan están asociados con ubicaciones específicas en una serie de elementos en un sustrato. Por ejemplo, pueden asociarse códigos de barras espaciales específicos con ubicaciones de matriz específicas antes de la fabricación de la matriz, y las secuencias de los códigos de barras espaciales pueden almacenarse (por ejemplo, en una base de datos) junto con información de ubicación de matriz específica, de modo que cada código de barras espacial se asigne de forma única a una ubicación particular de la matriz.
Alternativamente, pueden depositarse códigos de barras espaciales específicos en ubicaciones predeterminadas en una serie de elementos durante la fabricación, de manera que en cada ubicación, solo esté presente un tipo de código de barras espacial, de modo que los códigos de barras espaciales estén asociados de forma única con un único elemento de la matriz. Cuando sea necesario, las matrices pueden decodificarse mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción de modo que los códigos de barras espaciales se asocien de forma única con las ubicaciones de los elementos de la matriz, y este mapeo puede almacenarse como se describió anteriormente.
Cuando se obtiene información de secuencia para sondas y/o analitos de captura durante el análisis de información espacial, las ubicaciones de las sondas y/o analitos de captura pueden determinarse haciendo referencia a la información almacenada que asocia de forma única cada código de barras espacial con una ubicación del elemento de matriz. De esta manera, las sondas de captura específicas y los analitos capturados se asocian con ubicaciones específicas en el conjunto de elementos. Cada ubicación de elemento de matriz representa una posición con relación a un punto de referencia de coordenadas (por ejemplo, una ubicación de matriz, un marcador fiducial) para la matriz. En consecuencia, cada ubicación de elemento tiene una “dirección” o ubicación en el espacio de coordenadas de la matriz.
Algunos flujos de trabajo de análisis espacial ilustrativos se describen en la sección modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663. Ver, por ejemplo, la Modalidad ilustrativa que comienza con “En algunos ejemplos no limitantes de los flujos de trabajo descritos en la presente descripción, la muestra puede sumergirse...” del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Ver también, por ejemplo, la Guía del usuario de los kits de reactivos de expresión génica espacial de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020) y/o la Guía del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020). En algunas modalidades, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de hardware y/o software dedicado, tal como cualquiera de los sistemas descritos en las Secciones (M)(e)(ii) y/o (V) de los documentos WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663, o cualquiera de uno o más de los dispositivos o métodos descritos en las SeccionesControl Slide for Imaging, Methods of Using Control Slides and Substrates for, Systems of Using Control Slides y Substrates for Imaging,y/oSample and Array Alignment Devices and Methods, Informational labelsdel documento WO 2020/123320.
Los sistemas adecuados para realizar análisis espacial pueden incluir componentes tales como una cámara (por ejemplo, una celda de flujo o una cámara hermética y sellable) para contener una muestra biológica. La muestra biológica puede montarse, por ejemplo, en un soporte para muestras biológicas. Pueden conectarse una o más cámaras de fluido a la cámara y/o al portamuestras a través de conductos de fluido, y los fluidos se pueden suministrar a la cámara y/o al portamuestras a través de bombas fluídicas, fuentes de vacío u otros dispositivos acoplados a los conductos de fluido que crean un gradiente de presión para impulsar el flujo de fluido. También pueden conectarse una o más válvulas a conductos de fluido para regular el flujo de reactivos desde los depósitos hasta la cámara y/o el portamuestras.
Los sistemas pueden incluir opcionalmente una unidad de control que incluye uno o más procesadores electrónicos, una interfaz de entrada, una interfaz de salida (tal como una pantalla) y una unidad de almacenamiento (por ejemplo, un medio de almacenamiento de estado sólido tal como, pero sin limitarse a, un medio de almacenamiento magnético, óptico u otro de estado sólido, persistente, grabable y/o regrabable). Opcionalmente, la unidad de control puede conectarse a uno o más dispositivos remotos a través de una red. La unidad de control (y sus componentes) generalmente puede realizar cualquiera de las etapas y funciones descritos en la presente descripción. Cuando el sistema está conectado a un dispositivo remoto, el dispositivo (o dispositivos) remoto(s) puede(n) realizar cualquiera de las etapas o características descritas en la presente descripción. Los sistemas pueden incluir opcionalmente uno o más detectores (por ejemplo, CCD, CMOS) usados para capturar imágenes. Los sistemas también pueden incluir opcionalmente una o más fuentes de luz (por ejemplo, basadas en LED, basadas en diodos, láseres) para iluminar una muestra, un sustrato con elementos, analitos de una muestra biológica capturada en un sustrato y diversos medios de control y calibración.
Los sistemas pueden incluir opcionalmente instrucciones de software codificadas y/o implementadas en uno o más medios de almacenamiento tangibles y componentes de hardware tales como circuitos integrados de aplicaciones específicas. Las instrucciones de software, cuando son ejecutadas por una unidad de control (y en particular, un procesador electrónico) o un circuito integrado, pueden hacer que la unidad de control, circuito integrado u otro componente que ejecuta las instrucciones de software realice cualquiera de las etapas o funciones del método descritos en la presente descripción.
En algunos casos, los sistemas descritos en la presente descripción pueden detectar (por ejemplo, registrar una imagen) la muestra biológica en la matriz. En la solicitud PCT núm 2020/061064 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2021/0150707 se describen métodos ilustrativos para detectar la muestra biológica en una matriz.
Antes de transferir analitos de la muestra biológica al conjunto de elementos en el sustrato, la muestra biológica puede alinearse con la matriz. La alineación de una muestra biológica y una matriz de elementos que incluyen sondas de captura pueden facilitar el análisis espacial, que puede usarse para detectar diferencias en la presencia y/o nivel de analito dentro de diferentes posiciones en la muestra biológica, por ejemplo, para generar un mapa tridimensional de la presencia y/o nivel del analito. En la solicitud PCT núm 2020/053655 se describen métodos ilustrativos para generar un mapa bidimensional y/o tridimensional de la presencia y/o nivel del analito y los métodos de análisis espacial se describen generalmente en el documento WO 2020/061108 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2021/0155982.
En algunos casos, un mapa de presencia y/o nivel de analito puede alinearse con una imagen de una muestra biológica mediante el uso de uno o más marcadores fiduciales, por ejemplo, objetos colocados en el campo de visión de un sistema de imágenes que aparecen en la imagen producida, como se describe en la SecciónSubstrate Attributes, Control Slide for Imagingdel documento WO 2020/123320, solicitud PCT núm. 2020/061066 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2021/018522. Los marcadores fiduciales pueden usarse como punto de referencia o escala de medición para la alineación (por ejemplo, para alinear una muestra y una matriz, para alinear dos sustratos, para determinar una ubicación de una muestra o matriz en un sustrato con respecto a un marcador fiducial) y/o para mediciones cuantitativas de tamaños y/o distancias.
II. Medición simultánea espacio-temporal de la expresión génica y la actividad celular
La transcriptómica espacial se realiza en muestras biológicas, por ejemplo, secciones de tejido que se procesan de alguna manera antes del ensayo. Los flujos de trabajo espaciales permiten la detección de, por ejemplo, la expresión génica a partir de tejidos congelados o fijos mientras se mantiene la posición espacial de la expresión génica dentro del tejido. Los métodos y sistemas descritos permiten la utilización de una plataforma de ensayo espacial junto con secciones o células de tejido vivo para el estudio de, por ejemplo, descubrimiento farmacológico de fármacos, interacciones proteicas u otras actividades celulares que se estudian mejor mediante el uso de tejidos o células vivas como material de partida.
(a) Muestra biológica
En algunas modalidades, se describen en la presente descripción métodos para detectar la actividad celular y/o la expresión génica en una muestra biológica. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra de tejido. En algunas modalidades, la muestra de tejido es una sección de tejido vivo. En algunas modalidades, la muestra de tejido vivo se corta en secciones (por ejemplo, mediante el uso de un vibrátomo o cualquier instrumento de corte conocido en la técnica) a partir de un tejido fresco. En algunas modalidades, la sección de tejido vivo puede tratarse (por ejemplo, una disociación enzimática) para liberar células individuales, de manera que las células individuales aisladas pueden analizarse mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, la muestra de tejido es un tejido intacto. En algunas modalidades, la muestra de tejido es un tejido semiintacto.
En algunas modalidades, la muestra de tejido vivo se cultiva (por ejemplo, en un medio de cultivo de tejido) en la
cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción antes de una etapa de
registro. El registro como se usa en la presente descripción incluye, pero no se limita a, determinar o medir la abundancia de un analito o actividad biológica en una muestra. En algunos casos, el registro incluye obtener imágenes de la muestra biológica mediante el uso de cualquiera de las etapas de métodos descritos en la presente descripción. En algunos casos, el registro incluye determinar la abundancia de un analito (por ejemplo, proteína,
ARN, ADN) o actividad biológica en una muestra. En algunos casos, el registro (por ejemplo, determinación) se
realiza mediante el uso de técnicas cualitativas. En algunos casos, el registro (por ejemplo, determinación) se
realiza mediante el uso de técnicas cuantitativas. En algunos casos, el registro incluye detectar la presencia y/o abundancia de un indicador o marcador detectable (por ejemplo, detección de proteínas fluorescentes). Registrar
una actividad celular o biológica incluye medir la presencia o abundancia de una actividad en una célula. Las actividades incluyen, pero sin limitarse a, la actividad proteica (por ejemplo, actividad cinasa), actividad de fosforilación, actividad relacionada con el receptor acoplado a proteína G, actividad del canal iónico (por ejemplo, cambiar entre conformación abierta y cerrada), actividad de la unión ligando-receptor, actividad neuronal (por ejemplo, potenciales de acción neuronal), actividad de síntesis de proteínas (por ejemplo, transcripción o traducción), expresión y ubicación de proteínas (por ejemplo, expresión y tráfico de proteínas en organelos subcelulares), actividad óptica transitoria (por ejemplo, expresión génica del indicador óptico), interacción célula a
célula, morfología celular, tráfico vesicular (por ejemplo, exocitosis o endocitosis), translocación de proteínas y/o modificaciones postraduccionales de proteínas (por ejemplo, ubiquitinación o glicosilación). En algunas modalidades, la actividad celular incluye procesos en vías o cascadas de señalización celular. En algunas modalidades, la actividad celular incluye cambios conformacionales de biomoléculas (por ejemplo, proteínas o
ácidos nucleicos).
En algunas modalidades, la muestra de tejido vivo se cultiva en un cultivo de tejido separado o un sustrato (por ejemplo, un cubreobjetos, geles de esponja, etc.), a continuación se transfiere a la cámara de perfusión o a la placa
de múltiples pocillos descrita en la presente descripción. En algunas modalidades, se suplementan compuestos adicionales (por ejemplo, fluido cefalorraquídeo artificial) al medio de cultivo de tejidos para mantener la viabilidad
celular de la muestra de tejido vivo (por ejemplo, un tejido neuronal). En algunas modalidades, la muestra de tejido
vivo se coloca directamente en la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos, sin cultivo antes de la etapa
de registro. Por ejemplo, la muestra de tejido vivo puede cortarse en secciones a partir de un tejido fresco y colocarse directamente en la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos antes de la etapa de registro. En
algunas modalidades, la muestra de tejido vivo seccionada se coloca en un medio oxigenado en suspensión para mantener la viabilidad del tejido.
En algunas modalidades, la muestra de tejido es una muestra de organoide. Un organoide es una versión miniaturizada y simplificada de un órgano producidoin vitroen tres dimensiones que muestran una microanatomía
realista. Por ejemplo, algunos organoides pueden derivarse de una o pocas células de un tejido, células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas, que pueden autoorganizarse en cultivo tridimensional debido
a sus capacidades de autorrenovación y diferenciación. En algunas modalidades, la muestra de organoide es un organoide cerebral, organoide intestinal, organoide del intestino (por ejemplo, organoide del intestino delgado), organoide estomacal (o gástrico), organoide lingual, organoide tiroideo, organoide tímico, organoide testicular, organoide hepático, organoide pancreático, organoide epitelial, organoide hepático, organoide pulmonar, organoide neuronal, organoide cerebral, organoide pulmonar, organoide renal, organoide embrionario, organoide
similar a blastocisto, organoide cardíaco, organoide de la retina, o cualquiera de sus combinaciones. En algunas modalidades, la muestra de organoide se origina a partir de tejidos afectados por enfermedad (por ejemplo, tejidos neoplásicos) o tejidos normales. En algunas modalidades, la muestra de organoide se origina a partir de células afectadas por enfermedad (por ejemplo, células neoplásicas) o células normales. En algunas modalidades, el organoide se origina a partir de células madre (por ejemplo, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas y/o células madre somáticas) o células diferenciadas (por ejemplo, células somáticas).
Pueden encontrarse detalles, por ejemplo, en Xu,y otros, Journal of Hematology & Oncology11.1 (2018): 116; y Clevers, Hans,Cell165.7 (2016): 1586-1597.
En algunas modalidades, la viabilidad tisular total de las células en la muestra de tejido es al menos o aproximadamente 60 %, al menos o aproximadamente 65 %, al menos o aproximadamente 70 %, al menos o aproximadamente 75 %, al menos o aproximadamente 80 %, al menos o aproximadamente 85 %, al menos o aproximadamente 90 %, al menos o aproximadamente 95 %, al menos o aproximadamente 96 %, al menos o aproximadamente 97 %, al menos o aproximadamente 98 %, al menos o aproximadamente 99 % o 100 %.
En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra celular (por ejemplo, células presentes en un cultivo celular). En algunas modalidades, la muestra celular se cultiva en la cámara de perfusión o la placa de múltiples
pocillos antes de la etapa de registro, por ejemplo, durante al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas,
al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al
menos 4 días, al menos 5 días, al menos una semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas o más. En
algunas modalidades, las células de la muestra celular se cultivan directamente en la cámara de perfusión o la
placa de múltiples pocilios, por ejemplo, al sembrar las células a una densidad apropiada conocida en la técnica. La cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos pueden servir como un recipiente de cultivo celular y un medio de cultivo puede perfundirse (o añadirse) dentro de la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos para mantener la viabilidad de las células. En algunas modalidades, la muestra celular se transfiere a la cámara de perfusión o a la placa de múltiples pocillos desde un cultivo celular separado. En algunas modalidades, la muestra celular es una línea celular.
En algunas modalidades, al menos una célula en la muestra celular se transfecta o infecta mediante métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, la muestra celular se infecta por un vector viral, por ejemplo, un virus que incluye un ácido nucleico que codifica al menos una proteína de interés. Los vectores virales ilustrativos incluyen adenovirus (revisados en Altarasy otros,2005,Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.,99:193-260), virus adenoasociado (revisado en Parky otros, 2008, Front. Biosci.,13:2653-59; ver también Williams,2007,Mol. Ther.,15:2053-54), parvovirus, lentivirus, retrovirus (revisado en Taiy otros,2008,Front. Biosci.,13:308395) y el virus del herpes simple. Los métodos de suministro de ácidos nucleicos se revisan en Patily otros, 2005, AAPS J.,7:E61-77.
En algunas modalidades, la muestra celular es una muestra de cultivo celular primario. La muestra de cultivo celular primario comprende células disociadas de muestras de tejido fresco. Pueden complementarse nutrientes adicionales al medio de cultivo de acuerdo con tipos celulares específicos (por ejemplo, neuronas, células epiteliales o células endoteliales) para mantener la viabilidad celular. En algunas modalidades, la muestra celular es una muestra de línea celular inmortalizada (por ejemplo, una línea celular humana). En algunas modalidades, la muestra celular comprende células adherentes y/o células en suspensión.
En algunas modalidades, la viabilidad general de las células en la muestra celular es al menos o aproximadamente 60 %, al menos o aproximadamente 65 %, al menos o aproximadamente 70 %, al menos o aproximadamente 75 %, al menos o aproximadamente 80 %, al menos o aproximadamente 85 %, al menos o aproximadamente 90 %, al menos o aproximadamente 95 %, al menos o aproximadamente 96 %, al menos o aproximadamente 97 %, al menos o aproximadamente 98 %, al menos o aproximadamente 99 % o 100 %.
En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de cultivo tridimensional (3D). En algunas modalidades, la muestra de cultivo 3D es una muestra de organoide (por ejemplo, que comprende uno o más tipos de organoides). En algunas modalidades, la muestra de cultivo 3D es una muestra esferoidea (por ejemplo, que comprende uno o más tipos de esferoides). En algunas modalidades, la muestra biológica se incorpora en hidrogeles.
En algunas modalidades, la muestra biológica es de un ser humano (por ejemplo, pacientes humanos). En algunas modalidades, la muestra biológica es de un modelo animal (por ejemplo, ratones).
El analito puede ser cualquier analito descrito en la presente descripción, o múltiplos de este. En algunos casos, el analito es un ácido nucleico. En algunos casos, el analito es una proteína. En algunos casos, tanto un analito de ácido nucleico como un analito de proteína se miden a partir de la misma muestra. En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción incluyen medir y/o determinar la abundancia relativa de un analito en comparación con una muestra de referencia. En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción incluyen determinar la estructura terciaria o cuaternaria del analito. En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción identifican una o más modificaciones postraduccionales en un analito. Esto incluye, sin limitación, la presencia y abundancia de una o más modificaciones postraduccionales. En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción determinan la actividad enzimática de un analito.
En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción determinan la ubicación de un analito. En algunos casos, la ubicación del analito es fluida en el tiempo. Es decir, la ubicación de un analito puede variar en dependencia de su función. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción permiten a un usuario determinar la translocación de analitos o el tráfico a través de cualquier orgánulo en la célula (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, la translocación o tráfico se produce en o alrededor de un retículo endoplasmático (ER) en una célula. En algunos casos, la translocación o tráfico se produce en o alrededor de un aparato Golgi en una célula. En algunos casos, un analito puede detectarse como asociado con una célula o superficie de membrana nuclear.
En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con un reactivo de bloqueo descrito en la presente descripción. En algunos casos, el reactivo de bloqueo puede evitar la adhesión molecular (por ejemplo, compuestos de prueba o fármacos descritos en la presente descripción) o celular (por ejemplo, células vivas) a una sonda de captura.
(b) Cámara de perfusión
Con referencia a las Figuras 10A-10B y 11A-11C, se describe un sistema ilustrativo 3000 que puede usarse para capturar aspectos temporales de la expresión génica en una muestra biológica. La Figura 10<a>es una vista en perspectiva esquemática del sistema 3000, y la Figura 10B es una vista despiezada del sistema 3000 de la Figura 10A. Como se describe en la presente descripción, el sistema 3000 se configura para definir una o más cámaras que pueden usarse para medir la actividad celular o la expresión génica en una muestra biológica. En algunas modalidades, una cámara es un área de matriz de un portaobjetos de transcriptoma espacial, por ejemplo un área de matriz de un portaobjetos de expresión génica de Visio en donde el área de matriz comprende una pluralidad de sondas de captura como se describe en la presente descripción.
El sistema 3000 puede incluir una junta 3002 y una cubierta 3004. El sistema 3000 puede incluir además un sustrato 3006. En general, como se ilustra en la Figura 10A, la junta 3002 y la cubierta 3004 se configuran para montarse reversiblemente sobre el sustrato 3006 para definir cámaras que contienen muestras biológicas colocadas sobre el sustrato 3006. Tales cámaras pueden usarse como cámaras de perfusión en las que se introducen fluidos para diversos análisis, tales como medir las actividades celulares o la expresión génica. Como se describe en la presente descripción, el sistema 3000 se configura para ser capaz de lograr el flujo laminar de manera que múltiples muestras (por ejemplo, células, tejidos, etc.) puedan ponerse en contacto con el fluido al mismo tiempo.
Como se muestra en las Figuras 10B y 11B, el sustrato 3006 incluye una o más regiones de sustrato 3008, cada una de las cuales se configura para recibir una muestra biológica. En algunas implementaciones, el sustrato 3006 incluye una pluralidad de regiones de sustrato 3008 para colocar una pluralidad de muestras. Las regiones de sustrato 3008 pueden comprender una pluralidad de sondas de captura, como se describe en la presente descripción. Las sondas de captura pueden incluir un código de barras espacial y un dominio de captura que se une a una secuencia presente en un analito. Las regiones de sustrato 3008 pueden disponerse sobre el sustrato 3006 en varias matrices bidimensionales. En el ejemplo ilustrado, el sustrato 3006 tiene cuatro regiones de sustrato 3008 dispuestas en línea (es decir, una matriz de uno por cuatro). Sin embargo, son posibles otras configuraciones. A manera de ejemplo, ocho regiones de sustrato 3008 pueden disponerse en una matriz de dos por cuatro. En algunos casos, el sustrato 3006 incluye al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16 o más regiones de sustrato 3008. En algunos casos, las regiones de sustrato 3008 se disponen en una fila (por ejemplo, una matriz de uno por dos, uno por tres, uno por cuatro, o una matriz de uno por cualquier número adecuado). En algunos casos, las regiones de sustrato 3008 se disponen en dos hileras (por ejemplo, una matriz de dos por dos, dos por tres, dos por cuatro o una matriz de dos por cualquier número adecuado). Las regiones de sustrato 3008 pueden disponerse en una matriz simétrica (por ejemplo, una matriz de dos por dos, dos por tres, dos por cuatro, etc.) o una matriz no simétrica (por ejemplo, una matriz que tiene un primer número de regiones de sustrato en una primera columna y un segundo número (diferente del primer número) de regiones de sustrato en una segunda columna).
La junta 3002 incluye un cuerpo de junta 3012 y una o más aberturas 3014 definidas en el cuerpo de junta 3012. La junta 3002 se configura para disponerse reversiblemente sobre el sustrato 3006. En algunas implementaciones, la junta 3002 incluye el mismo número de aberturas 3014 que las regiones de sustrato 3008 del sustrato 3006. Alternativamente, la junta 3002 puede tener más o menos aberturas 3014 que el número de regiones de sustrato 3008. Las aberturas 3014 se disponen para corresponder a las regiones de sustrato 3008 cuando la junta 3002 se posiciona sobre el sustrato 3006. Por ejemplo, cuando la junta 3002 se dispone sobre el sustrato 3006, las aberturas 3014 de la junta 3002 se alinean con las regiones de sustrato 3008 del sustrato 3006, respectivamente, definiendo de esta manera una pluralidad de cámaras 3016, como se muestra en la Figura 11C. Como se describe en la presente descripción, la pluralidad de cámaras 3016 se usan como cámaras de perfusión para muestras biológicas en el sustrato 3006. En algunas modalidades, la pluralidad de cámaras 3016 permiten experimentos o réplicas independientes que se ejecutan sobre un sustrato 3006.
Cada abertura 3014 puede tener al menos dos puertos a través de los cuales el fluido puede fluir hacia dentro y hacia fuera de la abertura 3014. Por ejemplo, la abertura 3014 puede incluir un puerto de entrada 3018 y un puerto de salida 3020 como se muestra en la Figura 11A. Por el contrario, la abertura 3014 puede incluir un puerto de entrada 3020 y un puerto de salida 3018. El puerto de entrada 3018 se configura para permitir que el fluido entre en la abertura 3014 (o la cámara 3016 definida al menos por la abertura 3014), y el puerto de salida 3020 se configura para permitir que el fluido salga de la abertura 3014 (o la cámara 3016 definida al menos por la abertura 3014).
La junta 3002 incluye además uno o más canales de entrada 3022 y uno o más canales de salida 3024. Los canales de entrada 3022 pueden ser encerrados al menos parcialmente por el sustrato 3006 y la cubierta 3004 cuando la junta 3002 se intercala entre el sustrato 3006 y la cubierta 3004, de manera que el fluido puede fluir a lo largo de los canales de entrada 3022. De manera similar, los canales de salida 3024 pueden ser encerrados al menos parcialmente por el sustrato 3006 y la cubierta 3004 cuando la junta 3002 se dispone entre el sustrato 3006 y la cubierta 3004, de manera que el fluido puede fluir a lo largo de los canales de salida 3024.
Los puertos de entrada 3018 se conectan fluídicamente a los canales de entrada 3022, respectivamente. En consecuencia, los canales de entrada 3022 se conectan fluídicamente a las aberturas 3014 a través de los puertos de entrada 3018, respectivamente. Los puertos de salida 3020 se conectan fluídicamente a los canales de salida 3024, respectivamente. En consecuencia, los canales de salida 3024 se conectan fluídicamente a las aberturas 3014 a través de los puertos de salida 3020, respectivamente. La Figura 11A muestra que la junta 3002 puede incluir un orificio aguas arriba 3026 y un orificio aguas abajo 3028, oviceversa.El orificio aguas arriba 3026 se conecta fluídicamente a los canales de entrada 3022 de manera que los canales de entrada 3022 se extienden comúnmente desde el orificio aguas arriba 3026. En consecuencia, los canales de entrada 3022 se extienden entre el orificio aguas arriba 3026 y los puertos de entrada 3018 de las aberturas 3014, respectivamente. El orificio aguas abajo 3028 se conecta fluídicamente a los canales de salida 3024 de manera que los canales de salida 3024 se extienden comúnmente desde el orificio aguas abajo 3028. En consecuencia, los canales de salida 3024 se extienden entre el orificio aguas abajo 3028 y los puertos de salida 3020 de las aberturas 3014, respectivamente.
Aunque la junta 3002 se describe principalmente como que tiene un único orificio aguas arriba 3026 para todos los canales de entrada 3022 y un único orificio aguas abajo 3028 para todos los canales de salida 3024, son posibles configuraciones alternativas. Por ejemplo, la junta 3002 puede incluir múltiples orificios aguas arriba 3026, y al menos uno de los múltiples orificios aguas arriba 3026 se conecta fluídicamente a múltiples canales de entrada 3022. De manera similar, la junta 3002 puede incluir múltiples orificios aguas abajo 3028, y al menos uno de los múltiples orificios aguas abajo 3028 se conecta fluídicamente a múltiples canales de salida 3024. En otros ejemplos, la junta 3002 puede incluir múltiples orificios aguas arriba 3026 para los canales de entrada 3022 respectivos, y/o múltiples orificios aguas abajo 3028 para los canales de salida 3024 respectivos.
En algunas implementaciones, al menos dos o más de los canales de entrada 3022 tienen diferentes longitudes entre el orificio aguas arriba 3026 y los respectivos puertos de entrada 3018. Por ejemplo, en el ejemplo ilustrado de la Figura 11A, los canales de entrada 3022 incluyen el primer, segundo, tercer y cuarto canales de entrada 3022A-3022D, y el primer, segundo, tercer y cuarto canales de entrada 3022A-3022D tienen diferentes longitudes L1-L4 que se determinan como distancias de rutas o trayectorias entre el orificio aguas arriba 3026 y los respectivos puertos de entrada 3018 de las aberturas 3014. Alternativamente o adicionalmente, al menos dos de los canales de entrada 3022 pueden tener la misma longitud entre el orificio aguas arriba 3026 y los respectivos puertos de entrada 3018. A manera de ejemplo, el orificio aguas arriba 3026 puede colocarse entre un grupo de primera y segunda aberturas 3014A-B y un grupo de tercera y cuarta aberturas 3014C-D (por ejemplo, donde el orificio aguas arriba 3026 se coloca a lo largo de una línea hipotética que divide los dos grupos), y el primer y segundo canales de entrada 3022A-B pueden tener las mismas longitudes que el tercer y cuarto canales de entrada 3022C-D, respectivamente.
Adicional o alternativamente, al menos dos o más de los canales de salida 3024 tienen diferentes longitudes entre el orificio aguas abajo 3028 y los puertos de salida respectivos 3020. Por ejemplo, en el ejemplo ilustrado de la Figura 11A, los canales de salida 3024 incluyen el primer, segundo, tercer y cuarto canales de entrada 3024A-D, y el primer, segundo, tercer y cuarto canales de entrada 3024A-D tienen diferentes longitudes L5-L8 que se determinan como distancias de rutas o trayectorias entre el orificio aguas abajo 3028 y los respectivos puertos de salida 3020 de las aberturas 3014. Alternativamente o adicionalmente, al menos dos de los canales de salida 3024 pueden tener la misma longitud entre el orificio aguas abajo 3028 y los puertos de salida respectivos 3020. A manera de ejemplo, el orificio aguas abajo 3028 puede posicionarse entre el grupo de la primera y segunda aberturas 3014A-B y el grupo de la tercera y cuarta aberturas 3014C-D (por ejemplo, donde el orificio aguas abajo 3028 se posiciona a lo largo de una línea hipotética que divide los dos grupos), y el primer y segundo canales de salida 3024A-B pueden tener las mismas longitudes que el tercer y cuarto canales de salida 3024C-D, respectivamente.
El orificio aguas arriba 3026 y el orificio aguas abajo 3028 pueden disponerse en varias posiciones en la junta 3002. En algunas implementaciones, como se ilustra en la Figura 11 A, el orificio aguas arriba 3026 puede posicionarse para ser opuesto al orificio aguas abajo 3028 con respecto al grupo de aberturas 3014. Por ejemplo, la junta 3004 tiene una forma rectangular del cuerpo de la junta 3012 con cuatro esquinas 3030A-D. El orificio aguas arriba 3026 puede posicionarse en una primera esquina 3030A del cuerpo de junta 3012, y el orificio aguas abajo 3028 puede colocarse en una tercera esquina 3030C que está opuesta a la primera esquina 3030A. En otras implementaciones, el orificio aguas arriba 3026 puede posicionarse para ser opuesto al orificio aguas abajo 3028 con relación a un centro C de la junta 3002. Otras posiciones del orificio aguas arriba 3026 y el orificio aguas abajo 3028 también son posibles para proporcionar una corriente de fluido adecuada dentro y fuera de las aberturas 3014.
En algunas implementaciones, los elementos de entrada/entrada (por ejemplo, el puerto de entrada 3018, los canales de entrada 3022, el orificio aguas arriba 3026, etc.) pueden invertirse con los elementos de salida/salida (por ejemplo, el puerto de salida 3020, los canales de salida 3024, el orificio aguas abajo 3028, etc.). Por ejemplo, los elementos de salida/salida pueden usarse para recibir fluido y los elementos de entrada/entrada pueden usarse para descargar el fluido.
La junta 3002 puede estar hecha de uno o más materiales diversos. La junta 3002 puede fabricarse de un material que proporcione sellos apropiados en la interfaz entre la junta 3002 y el sustrato 3006, y en la interfaz entre la junta 3002 y la cubierta 3004, de manera que las trayectorias de fluido se definen de manera sellada a lo largo de los canales de entrada 3022, las cámaras 3016 (definidas al menos por las aberturas 3014) y los canales de salida 3024 en el sistema 3000 sin fugas entre trayectorias de fluido adyacentes o fugas del sistema 3000 como un todo. En algunas implementaciones, la junta 3002 puede estar hecho de silicona. Alternativamente, la junta 3002 puede fabricarse de caucho natural, caucho de nitrilo, politetrafluoroetileno (PTFE), por ejemplo. En algunos casos, la junta se aplica y se conecta reversiblemente a la cubierta 3004 y/o al sustrato 3006.
La junta 3002 puede configurarse en varias dimensiones. En algunas implementaciones, la junta 3002 tiene un grosor T que varía entre 0,1 mm y 5,0 mm. En otras implementaciones, el grosor T de la junta 3002 puede variar entre 0,6 mm y 1,0 mm. En otras implementaciones más, el grosor T de la junta 3002 puede ser menor que 0,1 mm. En otras implementaciones más, el grosor T de la junta 3002 puede ser mayor que 5,0 mm.
Las aberturas 3014 de la junta 3002 pueden configurarse en varias dimensiones. Cada abertura 3014 puede tener un área que varía entre 40 mm2 y 90 mm2. Cada abertura 3014 puede tener un volumen que varía entre 2 mm3 y 175 mm3. Las aberturas 3014 pueden tener la misma área y volumen. Alternativamente, al menos una de las aberturas 3014 tiene un área o volumen diferente de las otras aberturas 3014.
Las aberturas 3014 de la junta 3002 pueden configurarse en varias formas. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 11A, cada abertura 3014 tiene una longitud L y un ancho W. En algunas implementaciones, la abertura 3014 puede tener el ancho W que varía al menos parcialmente a lo largo de la longitud L. Por ejemplo, la abertura 3014 incluye una primera porción 3032 y una segunda porción 3034. La primera porción 3032 de la abertura 3014 incluye el puerto de entrada 3018, y la segunda porción 3034 de la abertura 3014 incluye el puerto de salida 3020. La primera porción 3032 tiene un primer ancho Wl, y la segunda porción tiene un segundo ancho W2. En algunas implementaciones, el primer ancho Wl de la primera porción 3032 puede variar entre el puerto de entrada 3018 y la segunda porción 3034 (por ejemplo, un extremo de la segunda porción 3034 que interconecta el puerto de entrada 3018). Por ejemplo, el primer ancho Wl de la primera porción 3032 puede aumentar gradualmente desde el puerto de entrada 3018 a la interfaz entre la primera porción 3032 y la segunda porción 3034, de manera que la primera porción 3032 tiene generalmente una forma triangular. Adicional o alternativamente, el segundo ancho W2 de la segunda porción 3034 puede ser consistente en la dirección de la longitud L. El primer ancho Wl de la primera porción 3032 puede ser idéntico al segundo ancho W2 de la segunda porción 3034 en la interfaz entre la primera porción 3032 y la segunda porción 3034.
En otros ejemplos, la abertura 3014 de la junta 3002 puede tener diferentes configuraciones. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 17D, la abertura 3014 puede conformarse como un cuadrado o rectángulo que tiene un ancho consistente a lo largo de la longitud. También son posibles otras formas adecuadas, tales como circulares, ovaladas, hexagonales, etc.
En algunas implementaciones, la junta 3002 puede incluir el número de aberturas 3014 que es idéntico al número de regiones de sustrato 3008 del sustrato 3006, de manera que las aberturas 3014 se alinean con las regiones de sustrato respectivas 3008, como se muestra en las Figuras 11C y 17D. En otras implementaciones, la junta 3002 puede tener las aberturas 3014 menores que las regiones de sustrato 3008 del sustrato 3006 de manera que al menos una de las aberturas 3014 se alinea con una pluralidad de regiones de sustrato 3008. Por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 17A y 17C, cuando el sustrato 3006 tiene cuatro regiones de sustrato 3008, la junta 3002 puede tener dos aberturas 3014 que se configuran cada una para alinearse con dos de las regiones de sustrato 3008. En esta configuración, el fluido que se introduce en cada abertura 3014 corre a través de dos regiones de sustrato 3008. En otro ejemplo, como se ilustra en la Figura 17B, la junta 3002 tiene una única abertura 3014 configurada para alinearse con cuatro regiones de sustrato 3008 del sustrato 3006, de manera que el fluido que se introduce en la abertura 3014 se suministra comúnmente a las cuatro regiones de sustrato 3008. En otras implementaciones más, la junta 3002 puede tener las aberturas 3014 más que las regiones de sustrato 3008 del sustrato 3006 de manera que al menos una de las regiones de sustrato 3008 puede alinearse con dos o más aberturas 3014.
En algunas implementaciones, cada abertura 3014 puede tener un único canal de entrada 3022 y un único canal de salida 3024, como se muestra en la Figura 11A. En otras implementaciones, cada abertura 3014 puede tener múltiples canales de entrada 3022 y/o múltiples canales de salida 3024. A manera de ejemplo, en las Figuras 17B-17D, cada abertura 3022 tiene dos canales de entrada 3022.
En algunas implementaciones, los canales de entrada 3022 y/o los canales de salida 3024 pueden tener un ancho consistente a lo largo de sus longitudes, como se ilustra en las Figuras 11A y 17B-17D. En otras implementaciones, los canales de entrada 3022 y/o los canales de salida 3024 pueden tener anchos variados a lo largo de sus longitudes. A manera de ejemplo, como se ilustra en la Figura 17C, los canales de salida 3024 pueden tener un ancho que disminuye desde el puerto de salida 3020 al orificio aguas abajo 3028.
Con referencia a las Figuras 10A-10B, la cubierta 3004 se configura para posicionarse sobre la junta 3002. Por ejemplo, la cubierta 3004 puede montarse sobre la junta 3002 opuesta al sustrato 3006, de manera que la pluralidad de cámaras 3016 se definen en el sistema 3000.
La cubierta 3004 puede incluir una entrada 3036 y una salida 3038. La entrada 3036 se posiciona de manera que la entrada 3036 se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada 3022 de la junta 3002 cuando la cubierta 3004 se monta sobre la junta 3002. La entrada 3036 puede usarse para introducir fluido en el sistema 3000 (por ejemplo, en las cámaras 3016 definidas al menos parte por las aberturas 3014 de la junta 3002). Por ejemplo, la entrada 3036 puede alinearse con el orificio aguas arriba 3026 de la junta 3002 cuando la cubierta 3004 se dispone sobre la junta 3002.
La salida 3038 se posiciona de manera que la salida 3038 se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de salida 3024 de la junta 3002 cuando la cubierta 3004 se monta sobre la junta 3002. La salida 3038 puede usarse para descargar fluido del sistema 300 (por ejemplo, de las cámaras 3016 definidas al menos parte por las aberturas 3014 de la junta 3002). Por ejemplo, la salida 3038 puede alinearse con el orificio aguas abajo 3028 de la junta 3002 cuando la cubierta 3004 se dispone sobre la junta 3002.
En el ejemplo ilustrado, la cubierta 3004 incluye una única entrada 3036 y una única salida 3038 para múltiples cámaras 3016 (Figura 11C). En otras implementaciones, la cubierta 3004 puede tener múltiples entradas 3036 y/o múltiples salidas 3038 para las respectivas cámaras de al menos algunas de las múltiples cámaras 3016.
La cubierta 3004 puede fabricarse de uno o más materiales diversos. En algunas implementaciones, la cubierta 3004 se fabrica de plástico. En otras implementaciones, la cubierta 3004 puede fabricarse de vidrio de sílice, cuarzo, poliestireno, PLA (ácido poliláctico), acrílico o metacrilato de polimetilo (PMMA), policarbonato (PC), polietileno (PE), polipropileno (PP), tereftalato de polietileno (PETE o PET), cloruro de polivinilo (PVC) y/o acrilonitrilo-butadieno-estireno (ABS), u otros materiales adecuados.
En algunas implementaciones, como se ilustra en las Figuras 10A-10B, la cubierta 3004 se fabrica y dispone por separado sobre la junta 3002. Alternativamente, la cubierta 3004 y la junta 3002 pueden fabricarse en una pieza única que puede colocarse sobre un sustrato de la misma manera o similar a como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, la cubierta 3004 y la junta 3002 se colocan reversiblemente sobre el sustrato, por ejemplo, para retirarse durante el procesamiento aguas abajo de la muestra ubicada en una o más de las cámaras sobre el sustrato.
(c) Sustratos que comprenden placas de múltiples pocillos
En algunas modalidades, un sustrato descrito en la presente descripción comprende una placa de múltiples pocillos e incluye uno o más pocillos, cada uno de los cuales se configura para recibir una muestra biológica. En algunas implementaciones, la placa de múltiples pocillos incluye una pluralidad de pocillos para colocar una pluralidad de muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de sondas de captura, como se describe en la presente descripción, se unen directamente a los pocillos. Por ejemplo, las sondas de captura se imprimen directamente en una superficie (por ejemplo, una superficie inferior) en los pocillos. En algunas modalidades, la pluralidad de sondas de captura se unen (por ejemplo, se imprimen) a un sustrato, por ejemplo, un cubreobjetos, y el sustrato se coloca dentro de los pocillos. En algunas modalidades, los cubreobjetos se fabrican a medida para ajustarse dentro de la placa de múltiples pocillos. En algunas modalidades, el cubreobjetos comprende plástico (por ejemplo, plástico de poliestireno), metal, vidrio o cualquier material compatible para la unión de las sondas de captura. En algunas modalidades, las sondas de captura se unen a los pocillos o al sustrato químicamente, por ejemplo, a través de uno o más grupos de enlace. En algunas modalidades, los grupos de enlace incluyen grupos amida, epóxidos, tiol, Acrydite™. En algunas modalidades, el pocillo o el sustrato tienen química superficial adicional para facilitar el crecimiento y/o unión de células como se conoce en la técnica. En algunas modalidades, el pocillo (por ejemplo, un pocillo de microplaca de poliestireno) o el sustrato (por ejemplo, un cubreobjetos de poliestireno) se expone a un gas plasmático para modificar la superficie plástica hidrófoba para hacerla más hidrófila. La superficie resultante porta una carga negativa neta debido a la presencia de grupos funcionales que contienen oxígeno (por ejemplo, grupos hidroxilo y/o carboxilo). En algunas modalidades, el pocillo o el sustrato se recubren con polilisina y/o colágeno. Pueden encontrarse detalles, por ejemplo, en Curtisy otros, The Journal of Cell Biology97.5 (1983): 1500-1506.
En algunas modalidades, los pocillos pueden disponerse en la placa de múltiples pocillos de varias maneras bidimensionales. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 18, una placa de múltiples pocillos puede tener un solo pocillo; dos pocillos dispuestos en línea (es decir, uno por dos placas); o cuatro pocillos dispuestos en línea (es decir, placa de uno por cuatro). Sin embargo, son posibles otras configuraciones. A manera de ejemplo, pueden disponerse ocho pocillos en una placa de dos por cuatro. En algunos casos, la placa de múltiples pocillos incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 24, 48, 96, 384 o más de uno o más pocillos. En algunos casos, los pocillos se disponen en una hilera (por ejemplo, uno por dos, uno por tres, uno por cuatro placas, o una placa de uno por cualquier número adecuado). En algunos casos, los pocillos se disponen en dos hileras (por ejemplo, placa de dos por dos, dos por tres, dos por cuatro, o una placa de dos por cualquier número adecuado). Los pocillos pueden disponerse en una placa simétrica (por ejemplo, una placa de dos por dos, dos por tres, dos por cuatro, etc.) o una matriz no simétrica (por ejemplo, una placa que tiene un primer número de pocillos en una primera columna y un segundo número (diferente del primer número) de pocillos en una segunda columna).
En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción se ensambla mediante el montaje de una junta que comprende una pluralidad de aberturas (por ejemplo, cualquiera de las juntas descritas en la presente descripción) sobre un sustrato que comprende una pluralidad de regiones de sustrato (por ejemplo, un portaobjetos de matriz espacial). Por lo tanto, un pocillo de la placa de múltiples pocillos ensamblada se define por la región de sustrato del sustrato, y la abertura de la junta. En algunas modalidades, la junta se configura para montarse sobre el sustrato de manera que la pluralidad de aberturas se alinea con la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente. La configuración de las regiones de sustrato y las aberturas de la placa de múltiples pocillos ensamblada puede ser cualquiera de las configuraciones descritas en la presente descripción. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos ensamblada se desmonta después de permeabilizar la muestra biológica (por ejemplo, una muestra de tejido vivo o muestra celular), y el sustrato (por ejemplo, el portaobjetos de matriz espacial) se somete a análisis espacial.
En algunas modalidades, las placas de cultivo de tejidos útiles en los métodos descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, placas de 35 mm, 60 mm, 100 mm, 150 mm de diámetro así como también matraces T-25, T-27, T-175, T-225. En algunas modalidades, las placas de múltiples pocillos incluyen matraces de múltiples capas. Los métodos descritos en la presente descripción pueden incluir además chips de cultivo microfluídicos (por ejemplo, chips fabricados por Darwin Microfluidics, Francia).
En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos está disponible comercialmente. Por ejemplo, la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción es una placa de 6 pocillos, una placa de 8 pocillos, una placa de 12 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 48 pocillos, una placa de 96 pocillos o una placa de 384 pocillos. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos se fabrica a medida, por ejemplo, para acomodar necesidades específicas (por ejemplo, detección automática de actividades celulares o expresiones génicas intracelulares). En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos es resistente al calor, de manera que la placa es compatible con una o más etapas del análisis espacial descrito aquí (por ejemplo, transcripción inversa y/o amplificación por PCR). En algunas modalidades, la expresión génica espacial de tejidos o células se obtiene dentro de cada pocillo individual de la placa de múltiples pocillos. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos es capaz de detectar automáticamente (por ejemplo, escaneo basado en placas) de la actividad celular y/o la expresión génica intracelular como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, el pocillo o el sustrato descrito en la presente descripción comprende uno o más marcadores fiduciales. Por ejemplo, los marcadores fiduciales pueden permitir una orientación, detección y/o rotación adecuadas de la muestra en el sustrato. En algunos casos, los marcadores fiduciales proporcionan una referencia visual de la muestra biológica (por ejemplo, una o más células en la muestra biológica) con respecto al sustrato.
(d) Métodos para medir la actividad celular
En un aspecto, la actividad celular de una muestra biológica puede registrarse mediante el uso de los métodos como se describe en la presente descripción. Los ejemplos de actividad celular pueden incluir, pero no se limitan a: actividad proteica (por ejemplo, actividad cinasa), actividad de fosforilación, actividad relacionada con el receptor acoplado a proteína G, actividad del canal iónico (por ejemplo, cambio entre conformación abierta y cerrada), actividad de la unión ligando-receptor, actividad neuronal (por ejemplo, potenciales de acción neuronal), actividad de síntesis de proteínas (por ejemplo, transcripción o traducción), expresión y ubicación de proteínas (por ejemplo, expresión y tráfico de proteínas en orgánulos subcelulares), actividad óptica transitoria (por ejemplo, expresión génica del indicador óptico), interacción célula a célula, morfología celular, tráfico vesicular (por ejemplo, exocitosis o endocitosis), translocación de proteínas y/o modificaciones postraduccionales de proteínas (por ejemplo, ubiquitinación o glicosilación). En algunas modalidades, la actividad celular incluye procesos en vías o cascadas de señalización celular. En algunas modalidades, la actividad celular incluye cambios conformacionales de biomoléculas (por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos). En algunas modalidades, la actividad celular es la que se produce al poner en contacto una o más células con un compuesto farmacológico. Por ejemplo, la detección de la apoptosis de una o más células se registra antes y después de la adición de, por ejemplo, un fármaco que puede o no ser útil para tratar cánceres u otras enfermedades de proliferación celular anormal. Como tal, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse en el descubrimiento farmacológico. Adicionalmente, los presentes métodos pueden usarse para rastrear o monitorear el éxito o el fracaso de un paciente que se trata con un fármaco o medicamento, por ejemplo al rastrear la presencia o ausencia de la actividad celular deseada que se espera que se produzca cuando un paciente se trata con el fármaco o medicamento deseado. Por lo tanto, los presentes métodos pueden usarse para ayudar a determinar un régimen de tratamiento para un paciente, rastrear o monitorear el éxito de ese tratamiento durante la terapia y rastrear o monitorear el éxito o la recaída posterapéutica del tratamiento.
En algunas modalidades, los métodos incluyen una etapa de registro de la muestra biológica. En algunos casos, la muestra biológica es una sección de tejido vivo como se describe en la presente descripción. En algunos casos, la muestra biológica es un cultivo de células como se describe en la presente descripción. El registro detecta una o más de las actividades celulares descritas en la presente descripción. En algunos casos, la etapa de registro comprende el registro óptico. En algunos casos, el registro óptico incluye medir la actividad de potencial de la membrana. En algunos casos, el registro óptico captura la actividad eléctrica celular rápida (aproximadamente 1 ms) tal como la actividad de canales iónicos (por ejemplo, el cambio entre la conformación abierta y cerrada) o la actividad neuronal (por ejemplo, los potenciales de acción neuronal). En algunos casos, el registro óptico incluye el uso de colorantes o indicadores químicos. En algunas modalidades, el colorante o indicador químico comprende un fluoróforo, de manera que la señal fluorescente, o la falta de esta, puede registrarse para detectar una o más actividades celulares. En algunos casos, la etapa de registro comprende el registro eléctrico.
En algunas modalidades, el colorante químico es un colorante sensible a la tensión, un colorante sensible al pH, un colorante sensible a la temperatura, un colorante sensible a la luz, un colorante sensible al oxígeno, un colorante sensible a metales o cualquier colorante químico que pueda usarse para rastrear una o más actividades celulares como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, el colorante químico es un colorante sensible a la tensión. Los colorantes sensibles al tensión, también conocidos como colorantes potenciométricos, son colorantes que cambian sus propiedades espectrales en respuesta a los cambios en la tensión. Son capaces de proporcionar mediciones lineales de la actividad de activación neuronal individuales, poblaciones neuronales grandes o actividad de los miocitos. Muchos procesos fisiológicos se acompañan de cambios en el potencial de membrana celular que pueden detectarse con colorantes sensibles al tensión. Las mediciones pueden indicar el origen del potencial de sitio de acción, y pueden obtenerse mediciones de la velocidad y dirección del potencial de acción.
En algunos casos, pueden usarse colorantes potenciométricos para monitorear la actividad eléctrica dentro de los organelos celulares donde no es posible insertar un electrodo, tal como la mitocondria y la columna dendrítica. Esta tecnología es potente para el estudio de patrones de actividad en preparaciones multicelulares complejas. También hace posible la medición de variaciones espaciales y temporales en el potencial de membrana a lo largo de la superficie de células individuales.
En algunas modalidades, el colorante sensible a la tensión puede ponerse en contacto con la muestra biológica mediante el uso de un método de contacto elegido de: inyección intravenosa; inyección intramuscular; inyección intraventricular; derivación espinal; craniotomía con contacto directo del colorante con la superficie cortical de la muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de tejido cerebral).
Los ejemplos no limitantes de colorantes sensibles a la tensión adecuados incluyen, pero no se limitan a: colorantes de merocianina-rodamina que incluyen NK 2761; colorantes de minonaftilenilpiridinio que incluyen Di-4-ANEPPS, di-8-ANEPPS, DÍ-2-ANE<p>E<q>, Di-8-ANEPPQ y Di-12- ANEPPQ; colorantes de dialquilaminofenilpolienilpiridinio que incluyen RH 160, RH 237, RH 414, RH 421 y RH 795; colorantes de oxonol que incluyen RH 155, RH 482, RH 1691, RH 1692 y RH 1838; y dipicilamina (DPA).
En algunos casos, el tinte sensible a la tensión incluye una proteína sensible a la tensión ubicada en la membrana acoplada a una proteína de captura. En algunas modalidades, la proteína de captura se organiza y dispone para capturar colorantes fluorescentes de molécula pequeña. En algunas modalidades, la proteína sensible a la tensión es una opsina, tal como, pero sin limitarse a, una opsina microbiana. Las opsinas microbianas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, QuasAr2, Ace2N, o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, la proteína sensible a la tensión incluye al menos un dominio de detección de tensión seleccionado del grupo que consiste en un dominio de detección de tensión deCiona intestinalis(CiVSD), dominio de detección de tensión deDanio rerio(DrVSD), dominio de detección de tensión deGallus gallus(GgVSD), o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, una proteína de captura es una proteína de captura covalente. En una modalidad, la proteína de captura covalente se selecciona del grupo que consiste en HaloTag, SNAP-tag, TMP-tag, pLac-tag, CLIP-tag o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, la proteína de captura es una proteína de captura no covalente. En una modalidad, la proteína de captura no covalente se selecciona del grupo que consiste en TMP-tag, biotina-avidina y sus combinaciones. Puede encontrarse una descripción detallada, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 10,405,750, y en la publicación de solicitud PCT núm. 2018102577A1.
En algunas modalidades, el colorante químico es un colorante sensible al calcio, por ejemplo, un colorante fluorescente sensible al calcio (o indicador). La obtención de imágenes de indicadores fluorescentes sensibles a Ca2+ proporciona un enfoque común para estudiar señales de Ca2+ en muchos contextos. Los indicadores fluorescentes son particularmente útiles para medir los cambios agudos de Ca2+ de una manera relativamente no invasiva. La disponibilidad de indicadores que pueden dirigirse a dominios celulares específicos, junto con variaciones en la afinidad, el brillo o las características espectrales, proporciona herramientas para explorar señales de Ca2+ espacial y temporalmente diversas, y además, multiplexar la lectura de Ca2+ con otras funciones celulares. Los ejemplos no limitantes de indicadores fluorescentes para monitorear la concentración intracelular de Ca2+ incluyen indicadores proteicos fluorescentes tales como pericams, camaleons, camaleons amarillos modificados (YC) y camgaroos. Las señales de Ca2+ también pueden medirse con indicadores sintéticos tales como Fura-2, Indol-1 y Fluo-4. Los procedimientos descritos pueden aplicarse a muchas modalidades de obtención de imágenes, que incluyen microscopía de campo amplio, confocal y de reflexión interna total (TIRF). Se conoce en la técnica que los detalles experimentales pueden variar en dependencia del tipo de célula, el sistema de obtención de imágenes y las características de las señales de Ca2+ que se estudian. Mediante el uso de la tecnología adecuada y los indicadores adecuados, es posible monitorear las señales de Ca2+ que se extienden desde las células subcelulares a las multicelulares, a alta velocidad o lapso de tiempo, dentro de las células vivas. Los detalles pueden encontrarse en, por ejemplo, Bootman, Martin D.,y otros Cold Spring Harbor Protocols2013.2 (2013): pdb-top066050.
En algunas modalidades, el indicador es un indicador codificado genéticamente, por ejemplo, un indicador de actividad neuronal codificado genéticamente, un indicador de tensión codificado genéticamente (GEVI) o un indicador de calcio codificado genéticamente (GCaMP). El indicador de tensión genéticamente codificado (o GEVI) es una proteína que puede detectar el potencial de membrana en una célula y relacionar el cambio en la tensión con una forma de salida, frecuentemente nivel fluorescente. Un GEVI es una herramienta de registro optogenético que permite exportar señales electrofisiológicas de células cultivadas, animales vivos, incluido el cerebro humano.
Los ejemplos de GEVI notables incluyen ArcLight, ASAP1, ASAP3 y Ace2N-mNeon.
GEVI puede tener muchos diseños de configuración para realizar la función de detección de tensión. Una característica esencial de la estructura GEVI es que debe colocarse en la membrana celular. Conceptualmente, la estructura de un GEVI debe permitir la función de detectar la diferencia de tensión e informarla mediante el cambio en la fluorescencia. Usualmente, el dominio de detección de tensión (VSD) de un GEVI se extiende a través de la membrana y se conecta a la(s) proteína(s) fluorescente(s).
En algunos casos, por estructura, los GEVI incluyen al menos cuatro categorías: (1) GEVI que contienen un par FRET de proteína fluorescente, por ejemplo, VSFP1, (2) GEVI de opsina única, por ejemplo, Arch, (3) GEVI de par FRET de opsina-FP, por ejemplo, MacQ-mCitrine, y (4) FP única con tipos especiales de dominios de detección de tensión, por ejemplo, ASAP1. En algunos casos, el GEVI contiene un par FRET de proteína fluorescente. En algunos casos, el GEVI es un GEVI de única opsina. En algunos casos, el GEVI es un GEVI de par FRET opsina-FP. En algunos casos, el GEVI es un única F<p>con tipos especiales de dominios de detección de tensión. La mayoría de los GEVI se basan en la fosfatasa sensible a la tensión de Ciona intestinalis (Ci-VSP o Ci-VSD (dominio)). Algunos GEVI pueden tener componentes similares, pero con un posicionamiento diferente de los mismos. Por ejemplo, ASAP1 y ArcLight usan ambos un VSD y una FP, pero la FP de ASAP1 está en el exterior de la célula mientras que la de ArcLight está en el interior, y las dos FP de VSFP-Butterfly están separadas por el VSD, mientras que las dos FP de Mermaid están relativamente cerca entre sí.
Los ejemplos no limitantes de GEVI incluyen FlaSh, VSFP1, SPARC, Flare, VSFP3.1, Mermaid, hVOS, Red-shifted VSFP's, PROPS, Zahra, Zahra 2, ArcLight, Arch, ElectricPk, VSFP-Butterfly, VSFP-CR, Mermaid2, Mac GEVIs, QuasArl, QuasAr2, Archer, ASAP1, Ace GEVIs, ArcLightning, Pado, ASAP2f, FlicRl, Bongwoori, ASAP2s, ASAP-Y, (pa)QuasAr3(-s), Voltron(-ST), y/o ASAP3. Pueden encontrarse descripciones detalladas, por ejemplo, en Xu y otros,Current Opinión in Chemical Biology39 (2017): 1-10; Bando y otrosCell Reports26.3 (2019): 802-813.
En algunas modalidades, el indicador codificado genéticamente es un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI, o GCaMP). GECI proporciona una alternativa a los indicadores sintéticos. Los GECI pueden dirigirse fácilmente a tipos celulares específicos o compartimentos subcelulares, y son compatibles con medicionesin vivorepetidas a largo plazo. Los GECI consisten en un dominio de unión a calcio tal como calmodulina o troponina C, fusionada a una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más) proteínas fluorescentes (FP). En los GECI de una única FP, la intensidad de fluorescencia de una FP permutada circularmente (cpFP) se modula mediante cambios dependientes de la unión al calcio en el entorno del cromóforo. En GECI de dos FP y GECI de múltiples FP, la unión a calcio modula la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre FP. En algunas modalidades, los GECI son útiles para tamizar agonistas o antagonistas del receptor acoplado a proteína G (GPCR) o canales iónicos y monitorear la actividad neuronal. Como ejemplo no limitante, los cambios en el nivel de calcio intracelular inducidos por la activación del receptor acoplado a proteína G pueden indicarse mediante cambios en las señales fluorescentes emitidas por el GAcMP. Puede encontrar una descripción adicional, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 9,518,980 B2.
En algunas modalidades, el indicador discrimina entre células vivas y muertas. Por ejemplo, los colorantes de vitalidad tales como los colorantes de células muertas LIVE-OR-DYE son impermeables a la membrana celular y reactivos a la amina. Tales tinciones de vitalidad pueden entrar en las células con membranas celulares dañadas, marcar proteínas intracelulares y exhibir altos niveles de fluorescencia. Estos colorantes de vitalidad también pueden reaccionar a las proteínas de la superficie celular, sin embargo, debido a que las proteínas de la superficie celular son menos abundantes que las proteínas intracelulares, la fluorescencia asociada con las células vivas es muy baja. Los indicadores adicionales incluyen colorantes no fluorescentes que solo fluorescen cuando entran en células tales como colorantes de marcaje o seguimiento de células vivas y colorantes de proliferación celular, por ejemplo, los colorantes de células vivas Cytopainter son compuestos hidrofóbicos que penetran a través de las membranas celulares y se vuelven altamente fluorescentes una vez dentro de la célula.
En algunos casos, la etapa de registrar una o más actividades celulares incluye obtener imágenes de la muestra biológica. En algunos casos, la muestra se registra antes de que la muestra se proporcione con uno o más colorantes o indicadores. En algunos casos, la muestra se registra al mismo tiempo que cuando la muestra se proporciona con uno o más colorantes o indicadores. En algunos casos, la muestra se registra después de que la muestra se proporciona con uno o más colorantes o indicadores. En algunos casos, la muestra se registra antes, durante y/o después de que la muestra se proporciona con uno o más colorantes o indicadores. En algunas modalidades, la formación temporal de actividades celulares puede evaluarse mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, la formación temporal (por ejemplo, en tiempo real) de la actividad celular diana puede registrarse mediante la detección y medición de la actividad celular (por ejemplo, mediante el uso de colorantes) mediante una microscopía fluorescente en lapso de tiempo. La obtención de imágenes puede realizarse mediante el uso de cualquiera de las técnicas de microscopía descritas en la presente descripción. En algunos casos, la obtención de imágenes se realiza mediante el uso de microscopía de fluorescencia, microscopía de lapso de tiempo fluorescente, microscopía confocal, microscopía multifotón (por ejemplo, microscopía de excitación de dos fotones) o cualquier técnica de microscopía conocida en la técnica.
En algunos casos, después de registrar la actividad celular, la muestra se fija. En algunos casos, los analitos en la muestra pueden hibridarse con una pluralidad de sondas en una matriz (por ejemplo, sustrato) como se describe en la presente descripción. En algunos casos, la secuencia de poliadenilación (poli(A)) de un ARNm se híbrida con una secuencia de dominio de captura de politiramina (poli(T)) en una sonda de captura. En algunos casos, la sonda de captura se extiende mediante el uso del analito que se une específicamente unido al dominio de captura como una plantilla para generar una sonda de captura extendida. En algunos casos, la sonda de captura extendida se amplifica para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas. En algunos casos, se secuencia la pluralidad de sondas de captura extendidas, o bibliotecas creadas a partir de estas. En algunos casos, se determina toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de esta. En algunos casos, se determina toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de esta. En algunos casos, las secuencias determinadas se usan para identificar la ubicación del analito en la muestra biológica.
(e) Métodos para medir la expresión génica
En algunas modalidades, la expresión génica intracelular de un ácido nucleico de una muestra biológica puede registrarse mediante el uso de los métodos como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el método implica múltiples colorantes moleculares unidos a una única sonda (por ejemplo, una sonda que puede hibridarse con un ácido nucleico diana) para aumentar la relación señal a ruido. En algunas modalidades, se usan sondas dobles que contienen proteínas fluorescentes divididas. En algunas modalidades, se usa la generación de señales basada en la transferencia de energía por resonancia Forster (FRET). En algunas modalidades, puede producirse una desactivación fluorescente cuando la sonda se une al ácido nucleico diana para restringir la señal. En algunas modalidades, la sonda contiene nucleótidos fluorescentes. Pueden encontrarse detalles, por ejemplo, en Wuy otros, Chemical Science11.1 (2020): 62-69; Spille y Ulrich,Journal of Cell Science128.20 (2015): 3695 3706. En algunas modalidades, el ácido nucleico descrito en la presente descripción (por ejemplo, un ARN) puede visualizarsein vivo.En algunas modalidades, el ácido nucleico descrito en la presente descripción (por ejemplo, un ARN) puede visualizarsein vitro.
En algunas modalidades, la expresión génica intracelular puede registrarse ópticamente mediante el uso de hibridaciónin situ(por ejemplo, hibridación fluorescentein situ(FISH)). El objetivo de la hibridaciónin situes determinar la presencia o ausencia de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en ubicaciones espaciales particulares en una célula o sitios cromosómicos. Las secuencias de ácidos nucleicos particulares se identifican dentro de las células al aprovechar una propiedad de los ácidos nucleicos (es decir, su capacidad de aparearse específicamente entre sí para formar híbridos). Este proceso puede usarse para hibridar dos hebras complementarias de ADN, una hebra de ARN a una hebra de ADN y dos hebras complementarias de ARN. En algunos casos, la hibridación de hebras se produce entre los ácidos nucleicos naturales y artificiales. Por lo tanto, en algunos casos, la detección de la expresión génica examina un transcrito de interés particular.
En algunos casos, el transcrito se asocia con una fisiología normal. En algunos casos, el transcrito se asocia con una fisiopatología (por ejemplo, cáncer o desarrollo anormal u otro estado de enfermedad). En algunos casos, una sonda FISH se diseña para detectar una o más mutaciones. Por ejemplo, y sin limitación, una sonda FISH puede diseñarse para detectar una mutación puntual, un polimorfismo de un solo nucleótido, una inserción, una eliminación y/o una translocación. En algunos casos, la sonda se diseña para detectar uno o más exones en un analito de ARNm que se corta y empalma alternativamente.
En algunos casos, la sonda se marca directamente con un marcador detectable como se describe en la presente descripción. En algunos casos, el marcador detectable es un marcador detectable fluorescente, radiactivo, quimioluminiscente o colorimétrico. En algunos casos, la sonda no se marca directamente con un marcador detectable. En este caso, un segundo resto (por ejemplo, que comprende un fluoróforo) se asocia con los ácidos nucleicos complementarios hibridados. En algunos casos, el segundo resto incluye un marcador detectable fluorescente, radiactivo, quimioluminiscente o colorimétrico.
Después de que una sonda de ácido nucleico se hibrida con secuencias complementarias en células o tejido, se visualiza la sonda hibridada. Cuando se marca una de las dos hebras, los híbridos hibridados pueden detectarse mediante varios métodos, que incluyen enfoques isotópicos y no isotópicos (fluorescentes y no fluorescentes). Se encuentra una descripción adicional en, por ejemplo, Jensen,The Anatomical Record297.8 (2014): 1349-1353.
En algunas modalidades, la expresión génica intracelular puede evaluarse ópticamente mediante el uso de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (o transferencia de energía de resonancia Forster, FRET). La técnica de FRET cuando se aplica a microscopía óptica, permite la determinación del enfoque entre dos moléculas dentro de una distancia (varios nanómetros (por ejemplo, 10 nm)) suficientemente cerca para que se produzcan interacciones moleculares. El mecanismo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia implica un fluoróforo donante en un estado electrónico excitado, que puede transferir su energía de excitación a un fluoróforo aceptor cercano de manera no radiante a través de interacciones dipolo-dipolar de largo alcance. Por ejemplo, las incorporaciones de nucleótidos pueden detectarse a través de FRET, como se describió, por ejemplo, en Levene y otros,Science(2003), 299, 682-686, Lundquist y otros,Opt. Lett.(2008), 33, 1026-1028, y Korlach y otros,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2008), 105, 1176-1181.
En algunas modalidades, la etapa de registro comprende hibridar una pluralidad de sondas marcadas ópticamente con un ácido nucleico diana. En algunas modalidades, las sondas marcadas ópticamente comprenden un marcador óptico, por ejemplo, un fluoróforo. En algunas modalidades, las sondas marcadas ópticamente son sondas marcadas con fluorescencia, por ejemplo, sondas de ácido nucleico peptídico (PNA) marcadas con fluorescencia. Los PNA son análogos de ácidos nucleicos sintéticos (por ejemplo, a Dn ) en los que la cadena principal fosfodiéster se reemplaza por unidades repetitivas de N-(2-aminoetil) glicina a las que se unen las bases de purina y pirimidina a través de un enlazador de metilcarbonilo. Los procedimientos para la síntesis de PNA son similares a los empleados para la síntesis de péptidos, mediante el uso de síntesis manual o automatizada de fase sólida estándar. En algunos casos, las moléculas de PNA se marcan con biotina o fluoróforos. Por lo tanto, en algunos casos, la molécula de PNA descrita en la presente descripción incluye un resto de detección tal como un marcador detectable fluorescente, radioactivo, quimioluminiscente o colorimétrico. En algunos casos, la molécula de PNA se asocia con (por ejemplo, se conjuga con) una molécula de biotina que puede detectarse mediante el uso de, por ejemplo, un ensayo de captura con avidina o estreptavidina, como se describe en la presente descripción. Una generación subsecuente de PNA implica la modificación de la cadena principal de N-(2-aminoetil) glicina (analógicos de PNA) o la arquitectura quimérica, como las quimeras del péptido de PNA o las quimeras del ADN de PNA desarrolladas para mejorar la solubilidad y la captación celular de PNA o para exhibir nuevas propiedades biológicas. La cadena principal sintética proporciona al PNA características de hibridación únicas. A diferencia del ADN y el ARN, la cadena principal de PNA no está cargada. Consecuentemente, no hay repulsión electrostática cuando los PNA se hibridan con su secuencia de ácido nucleico diana, lo que proporciona una mayor estabilidad a los dúplex de PNA-ADN o PNA-ARN que los homo o heterodúplex naturales. Esta mayor estabilidad se refleja en una temperatura de fusión térmica (Tm) más alta, en comparación con los correspondientes dúplex de ADN-ADN o ADN-ARN. Puede encontrarse una descripción detallada, por ejemplo, en Pellestor y Paulasova,European Journal of Human Genetics,12.9 (2004): 694-700.
En algunas modalidades, las sondas marcadas ópticamente (por ejemplo, sondas de PNA marcadas con fluorescencia) pueden unirse a un ácido nucleico diana en la muestra biológica. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es un ADN. En algunos casos, el ADN diana se ha desnaturalizado. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es un ARN. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es un ADN o ARN de hebra única. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es un ADN de doble hebra o ARN de doble hebra. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es un dúplex de ADN/ARN. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es un ARNm, un ARNip, un microARN o un derivado de este.
En algunas modalidades, la sonda marcada ópticamente (por ejemplo, una sonda de PNA marcada con fluorescencia) tiene al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 ácidos nucleicos.
En algunas modalidades, la sonda marcada ópticamente (por ejemplo, una sonda de PNA marcada con fluorescencia) puede usarse a una concentración final de al menos o aproximadamente 0,1 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 0,5 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 1 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 2x 10-6 M, al menos o aproximadamente 3 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 4 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 5 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 10 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 20 x 10-6 M, al menos o aproximadamente 50x 10-6 M, al menos o aproximadamente 100 x 10-6 M, o mayor.
En algunas modalidades, una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más) sondas marcadas ópticamente pueden hibridarse con diferentes porciones del ácido nucleico diana. En algunas modalidades, una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más) sondas marcadas ópticamente se usan para la detección del ácido nucleico diana con una estructura dúplex, en cuyo caso cada sonda se hibrida específicamente con la hebra sentido o antisentido del ácido nucleico diana.
En algunas modalidades, el marcador óptico puede detectarse directamente por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede detectarse indirectamente, por ejemplo, al catalizar alteraciones químicas de un compuesto o composición de sustrato químico, cuyo compuesto o composición de sustrato químico es detectable directamente. Los marcadores ópticos pueden ser adecuados para la detección a pequeña escala y/o adecuados para el tamizaje de alto rendimiento. Como tal, los marcadores ópticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, fluoróforos, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y colorantes.
El marcador óptico puede detectarse cualitativamente (por ejemplo, ópticamente o espectralmente), o puede cuantificarse. La detección cualitativa incluye generalmente un método de detección en el que se confirma la existencia o presencia del marcador óptico, mientras que la detección cuantificable incluye generalmente un método de detección que tiene un valor cuantificable (por ejemplo, que puede informarse numéricamente) tal como una intensidad, duración, polarización y/u otras propiedades.
En algunas modalidades, las sondas marcadas ópticamente comprenden uno o más marcadores ópticos, 1, 2, 3, 4 o más. Por ejemplo, pueden incorporarse marcadores ópticos durante la polimerización o amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos marcados con Cy5®, tales como Cy5®-dCTP). Puede usarse cualquier marcador óptico adecuado. En algunas modalidades, el marcador óptico es un fluoróforo. Por ejemplo, el fluoróforo puede ser de un grupo que incluye: 7-AAD (7-aminoactinomicina D), naranja de acridina (+ADN), naranja de acridina (+ARN), Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, aloficocianina (APC), AMCA / AMCA-X, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), 7-amino-4- metilcoumarina, 6-aminoquinolina, azul de anilina, ANS, APC-Cy7, ATTO-TAG™ CBQCA, ATTO-TAG™ FQ, auramina O-Feulgen, BCE<c>F (pH alto), BFP (proteína fluorescente azul), BFP/ GFP FRET, BOBO™-1 / BO-PRO™-1, BOBO™-3 / BO-PRO™-3, BODIPY® FL, BODIPY® TMR, BODIPY® TR-X, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 564/570, BODIPY® 581/591, BODIPY® 630/650-X, BODIPY® 650- 665-X, BTC, calceína, azul calceína, Calcium Crimson™, Calcium Green-1™, Calcium Orange™, Calcofluor® White, 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 5-carboxinaftofluoresceína, 6-carboxirodamina 6G, 5-carboxitetrametilrodamina (5- TAMRA), carboxi-X-rodamina (5-ROX), Cascade Blue®, Cascade Yellow™, CCF2 (GeneBLAzer™), CFP (proteína fluorescente Cyan), CFP / YFP FReT, cromomicina A3, Cl- NERF (pH bajo), CPM, 6-CR 6G, CTC Formazan, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy7®, cicromo (PE-Cy5), dansilamina, dansil cadaverina, cloruro de dansilo, DAPI, dapoxilo, d Cf H, DHR, DiA (4-Di-16-ASP), DiD (DilC18(5)), DIDS, Dil (DilC18(3)), DiO (DiOC18(3)), DiR (DilC18(7)), Di-4 ANEPPS, Di-8 ANEPPS, DM-NERF (pH 4,5-6,5), DsRed (proteína fluorescente roja), EBFP, ECFP, EGFP, alcohol ELF® -97, eosina, eritrosina, bromuro de etidio, homodímero de etidio-1 (EthD-1), cloruro de europio (III), 5-FAM (5- carboxifluoresceína), Fast Blue, fosforamidita de fluoresceína-dT, FITC, Fluo-3, Fluo-4, FluorX®, Fluoro-Gold™ (pH alto), Fluoro-Gold™ (pH bajo), Fluoro-Jade, FM® 1-43, Fura- 2 (alto contenido de calcio), Fura-2 / BCECF, Fura Red™ (alto contenido de calcio), Fura Red™ / Fluo-3, GeneBLAzer™ (CCF2), GFP desplazada al rojo (rsGFP), GFP de tipo silvestre, GFP / BFP FRET, GFP/DsRed FRET, Hoechst 33342 y 33258, 7-hidroxi-4-metilcoumarina (pH 9), 1,5 IAEDANS, indo-1 (alto contenido de calcio), Indo-1 (bajo contenido de calcio), indodicarbocianina, indotricarbocianina, JC-1, 6-JOE, JOJO™-1 / JO-PRO™-1, LDS 751 (+ADN), LDS 751 (+ARN), LOLO™-1 / LO-PRO™-1, amarillo Lucifer, azul LysoSensor™ (pH 5), verde LysoSensor™ (pH 5), amarillo/azul LysoSensor™ (pH 4,2), verde LysoTracker®, rojo LysoTracker®, amarillo LysoTracker®, Mag-Fura-2, Mag-Indo-1, Magnesium Green™, Marina Blue®, 4-metilumbeliferona, mitramicina, verde MitoTracker®, naranja MitoTracker®, rojo MitoTracker®, NBD (amina), Rojo Nilo, Oregon Green® 488, Oregon Green® 500, Oregon Green® 514, Azul pacífico, PBF1, PE (R-ficoeritrina), p E-Cy5, PE-Cy7, PE-rojo Texas, PerCP (proteína peridinina clorofila), PerCP-Cy5.5 (TruRed), PharRed (APC-Cy7), C-ficocianina, R-ficocianina, R-ficoeritrina (PE), IP (yoduro de propidio), PKH26, PKH67, pOPO™-1 /Po -PRO™-1, POPO™-3 / PO-PRO™-3, yoduro de propidio (P<i>), PyMPO, pireno, pironina Y, Quantam Red (PE-Cy5), mostaza de quinacrina, R670 (PE-Cy5), rojo 613 (PE-Texas Red), proteína fluorescente roja (DsRed), resorufina, RH 414, Rhod-2, rodamina B, Rhodamine Green™, Rhodamine Red™, rodamina faloidina, rodamina 110, rodamina 123, 5-ROX (carboxi-X-rodamina), S65A, S65C, S65L, S65T, SBFI, SITS, SNAFL®-1 (pH alto), SNAFL®-2, SNARF®-1 (pH alto), SNARF®-1 (pH bajo), Sodium Green™, SpectrumAqua®, SpectrumGreen® #1, SpectrumGreen® #2, SpectrumOrange®, SpectrumRed®, SYTO® 11, SYTO® 13, SYTO® 17, SYTO® 45, azul SYTOX®, verde SYTOX®, naranja S<y>T<o>X®, 5-TAMRA (5-carboxitetrametilrodamina), tetrametilrodamina (TRITC), Texas Red® / Texas Red®-X, Texas Red®-X (éster n Hs ), tiadicarbocianina, naranja Tiazol, TOTO®-1/TO-PRO®-1, TOTO®-3 / TO-PRO®-3, TO-PRO®-5, Tri-color (PE-Cy5), TRITC (tetrametilrodamina), TruRed (PerCP-Cy5.5), WW 781, X-rodamina (XRITC), Y66F, Y66H, Y66W, YFP (proteína fluorescente amarilla), YOYO®-1 / YO-PRO®-1, YOYO®-3 / YO-PRO®-3, 6-FAM (fluoresceína), 6-FAM (éster NHS), 6-FAM (azida), HEX, TAMRA (éster NHS), amarillo Yakima, MAX, TET, TEX615, ATTO 488, ATTO 532, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 633, ATTO 647N , TYE 563, TYE 665, TYE 705, 5' IRDye® 700, 5' IRDye® 800, 5' IRDye® 800CW (éster NHS), colorante WellRED D4, colorante WellRED D3, colorante WellRED D2, Lightcycler® 640 (éster NHS), y Dy 750 (éster NHS).
Como se describe en la presente descripción, en algunas modalidades, un marcador óptico es o incluye un resto luminiscente o quimioluminiscente. Los restos luminiscentes/quimioluminiscentes comunes incluyen, pero no se limitan a, peroxidasas tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), peroxidasa de soja (SP), fosfatasa alcalina, y luciferasa. Estos restos de proteínas pueden catalizar reacciones quimioluminiscentes dados los sustratos químicos apropiados (por ejemplo, un reactivo oxidante más un compuesto quimioluminiscente). Se conoce que una serie de familias de compuestos proporcionan quimioluminiscencia bajo una variedad de condiciones. Los ejemplos no limitantes de familias de compuestos quimioluminiscentes incluyen 2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona luminol, 5-amino-6,7,8-trimetoxi- y el análogo dimetilamino[ca]benz. Estos compuestos pueden emitir luminiscencia en presencia de peróxido de hidrógeno alcalino o hipoclorito de calcio y base. Otros ejemplos de familias de compuestos quimioluminiscentes incluyen, por ejemplo, 2,4,5-trifenilimidazoles, sustituyentes para-dimetilamino y -metoxi, oxalatos tales como ésteres activos de oxalilo, p-nitrofenilo, ésteres de N-alquilacridinio, luciferinas, lucigeninas o ésteres de acridinio.
En algunas modalidades, la formación temporal de transcritos específicos puede evaluarse mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, una o más sondas de PNA marcadas con fluorescencia (por ejemplo, una primera sonda marcada con un fluoróforo donante y una segunda sonda marcada con un fluoróforo aceptor) pueden hibridarse con diferentes porciones (por ejemplo, dos secuencias adyacentes) de un transcrito diana. La formación temporal (por ejemplo, en tiempo real) del transcrito diana puede registrarse mediante la medición del estado de excitación del fluoróforo aceptor durante un período de tiempo apropiado, por ejemplo, mediante microscopía fluorescente en lapso de tiempo. Los fluoróforos donantes y aceptores pueden ser cualquier par FRET conocido en la técnica, como se describe en Bajary otros, Sensors16.9 (2016): 1488.
En algunas modalidades, la actividad celular como se describió anteriormente puede medirse al mismo tiempo o mediante el uso de la misma muestra que una muestra en la que se registra la expresión génica. En algunos casos, una actividad celular se asocia con un biomarcador (por ejemplo, un color fluorescente) y la expresión génica (por ejemplo, detección de un gen particular) se asocia con un segundo biomarcador (por ejemplo, un marcador fluorescente diferente). En algunos casos, tanto la actividad celular como la expresión génica pueden registrarse ópticamente mediante el uso de microscopía de fluorescencia, microscopía de lapso de tiempo fluorescente, microscopía confocal, microscopía de múltiples fotones (por ejemplo, microscopía de excitación de dos fotones), microscopía de reflexión interna total, microscopía de superresolución o cualquier técnica de microscopía conocida en la técnica.
En algunas modalidades, la actividad celular y la expresión génica pueden registrarse simultáneamente, por ejemplo, mediante el uso de uno o más marcadores ópticos (por ejemplo, fluoróforos) para etiquetar los colorantes químicos, indicadores o sondas marcadas ópticamente, de manera que la actividad celular y la expresión génica pueden registrarse con interferencias cruzadas mínimas.
En algunos casos, después de registrar la expresión génica, la muestra se fija. En algunos casos, los analitos en la muestra pueden hibridarse con una pluralidad de sondas en una matriz (por ejemplo, sustrato) como se describe en la presente descripción. En algunos casos, la secuencia de poliadenilación (poli(A)) de un ARNm se hibrida con una secuencia de politimina (poli(T)) de un dominio de captura en una sonda de captura. En algunos casos, la sonda de captura se extiende mediante el uso del analito que se une específicamente unido al dominio de captura como una plantilla para generar una sonda de captura extendida. En algunos casos, la sonda de captura extendida se amplifica para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas (por ejemplo, una pluralidad de ácidos nucleicos). En algunos casos, se secuencia la pluralidad de sondas de captura extendidas, o bibliotecas creadas a partir de estas. En algunos casos, se determina toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de esta. En algunos casos, se determina toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de esta. En algunos casos, las secuencias determinadas se usan para identificar la ubicación del analito en la muestra biológica.
(f) Métodos para usar la cámara de perfusión y la placa de múltiples pocillos
(i) Cultivo de la muestra biológica
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción incluyen cultivar la muestra biológica en la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos. En algunas modalidades, la muestra biológica se cultiva en un medio de cultivo para mantener su viabilidad. En algunas modalidades, el medio de cultivo se reemplaza en un intervalo apropiado (por ejemplo, aproximadamente cada 12 horas, aproximadamente cada día, aproximadamente cada 2 días, aproximadamente cada 3 días, aproximadamente cada 4 días, aproximadamente cada 5 días, aproximadamente cada 6 días o aproximadamente cada semana). En algunas modalidades, el medio de cultivo se reemplaza manualmente (por ejemplo, mediante pipeteado) o automáticamente. En algunas modalidades, la muestra biológica se cultiva estáticamente. En algunas modalidades, la muestra biológica se cultiva en una cámara de perfusión con entradas y salidas como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el medio de cultivo se perfunde a la cámara de perfusión a un régimen de flujo constante. En algunas modalidades, un medio de cultivo (por ejemplo, un medio de cultivo de tejido o célula, solución salina, fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF)) puede perfundirse a la cámara de perfusión para mantener la viabilidad de la muestra biológica (por ejemplo, una muestra de tejido o célula).
En algunas modalidades, el medio de cultivo se oxigena. En algunas modalidades, se suplementan nutrientes o compuestos adicionales al medio de cultivo para mantener la viabilidad de la muestra biológica. En algunas modalidades, el medio de cultivo incluye el reactivo de bloqueo descrito en la presente descripción. En algunos casos, el reactivo de bloqueo puede evitar la adhesión de la molécula (por ejemplo, los compuestos de prueba o fármacos descritos en la presente descripción) o célula (por ejemplo, células vivas) a las sondas de captura. En algunas modalidades, un reactivo de bloqueo puede ser albúmina sérica bovina (BSA), suero, gelatina (por ejemplo, gelatina de pescado), leche (por ejemplo, leche seca sin grasa), caseína, polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), o polivinilpirrolidona (PVP), reactivo de bloqueo de biotina, un reactivo de bloqueo de peroxidasa, levamisol, solución de Carnoy, glicina, lisina, borohidruro de sodio, azul cielo de pontamina, negro de Sudan, azul de tripán, agente de bloqueo de FITC, ácido acético y/u oligonucleótidos que incluyen una secuencia complementaria a los oligos de captura.
En algunas modalidades, los tejidos o células vivas se cultivan en la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción y se cultivan en condiciones para mantener la viabilidad celular. Por ejemplo, las temperaturas y las concentraciones de CO<2>para cultivar tejidos y células se conocen bien en la técnica y los métodos descritos en la presente descripción practican esas condiciones para mantener la viabilidad de las muestras. En algunas modalidades, las incubadoras de cultivo de tejidos se utilizan durante el crecimiento y la perfusión de las células o tejidos vivos, condiciones típicas para mantener la viabilidad celular que son, por ejemplo, 37 °C y 5 % de CO<2>.
En algunas modalidades, los colorantes químicos, indicadores o sondas marcadas ópticamente como se describe en la presente descripción pueden añadirse al medio de cultivo, y perfundirse a la cámara de perfusión (o añadirse a la placa de múltiples pocillos) para interactuar con la muestra biológica. En algunas modalidades, los colorantes químicos, indicadores o sondas marcadas ópticamente pueden añadirse a la muestra biológica antes de colocar la muestra biológica en la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos. En algunas modalidades, los colorantes químicos, indicadores o sondas marcadas ópticamente pueden añadirse a la muestra biológica después de colocar la muestra biológica en la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos. En algunas modalidades, los colorantes químicos, indicadores o sondas marcadas ópticamente pueden internalizarse a las células (por ejemplo, células de una sección de tejido vivo) mediante electropermeabilización, internalización endocítica o permeabilización basada en lípidos, mientras se mantiene la viabilidad celular.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para medir la obtención de imágenes de FRET transcripcional dinámica. En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para la detección de transcritos en tiempo real durante el tratamiento farmacológico.
En algunas modalidades, la muestra biológica (por ejemplo, células de un cultivo celular) se crece o cultiva sobre un sustrato (o una superficie) dentro de una cámara de perfusión o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. En algunas modalidades, las sondas de captura descritas en la presente descripción se imprimen directamente en el sustrato (o la superficie). En algunas modalidades, la existencia de sondas de captura en el sustrato (o la superficie) no afecta el crecimiento de la muestra biológica. En algunas modalidades, el crecimiento o cultivo de la muestra biológica en el sustrato con sondas de captura unidas no afecta la calidad de los datos del análisis espacial, por ejemplo, UMI espacial y gráficos génicos; saturación de secuenciación; mediana de genes por células; mediana recuentos por célula; o mediana de UMI por célula.
(ii) Marcaje de células vivas
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción comprenden marcar una pluralidad de células vivas de la muestra biológica. En algunas modalidades, las células vivas se marcan mediante tinción. En algunas modalidades, las células vivas se tiñen mediante inmunofluorescencia (IF). En algunas modalidades, las células vivas se tiñen intracelularmente (por ejemplo, mediante la tinción de un organelo subcelular que incluye retículo endoplasmático (ER), Golgi, lisosoma, mitocondrias y/o núcleo). En algunas modalidades, las células vivas se tiñen extracelularmente (por ejemplo, tinción de membrana plasmática).
En algunas modalidades, las células vivas se marcan mediante un anticuerpo marcado con fluorescencia o fragmentos de anticuerpo de este. En algunas modalidades, las células vivas se marcan mediante los colorantes químicos, indicadores o sondas marcadas ópticamente descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, las células vivas se marcan mediante indicadores fluorescentes (por ejemplo, las células vivas se transfectan para incluir un gen indicador). En algunas modalidades, las células vivas teñidas se detectan (por ejemplo, se registran) mediante microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo.
En algunas modalidades, las células vivas se tratan con proteinasa K y/o tripsina. Por ejemplo, el tratamiento puede facilitar la entrada (por ejemplo, por absorción o endocitosis) del anticuerpo marcado con fluorescencia o fragmentos de este.
(iii) Bloqueo de sondas
En algunas modalidades, las sondas de captura se bloquean antes de poner en contacto la muestra biológica con el sustrato. En algunas modalidades, los dominios de captura de las sondas de captura se bloquean al bloquear las sondas. En algunos casos, las sondas de captura se bloquean para evitar la adhesión de la molécula (por ejemplo, los compuestos de prueba o fármacos descritos en la presente descripción) o célula (por ejemplo, células vivas).
En algunas modalidades, se usa la sonda de bloqueo para bloquear o modificar el extremo 3' libre del dominio de captura. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo pueden hibridarse con las sondas de captura para enmascarar el extremo 3' libre del dominio de captura, por ejemplo, sondas en horquilla, sondas parcialmente de doble hebra o secuencias complementarias. En algunas modalidades, el extremo 3' libre del dominio de captura puede bloquearse mediante modificación química, por ejemplo, la adición de un grupo azidometilo como un resto protector químicamente reversible, de manera que las sondas de captura no incluyen un extremo 3' libre. El bloqueo o modificación de las sondas de captura, particularmente en el extremo 3' libre del dominio de captura, antes de poner en contacto la muestra biológica con el sustrato, evita la modificación de las sondas de captura, por ejemplo, evita la adición de una cola de poli(A) al extremo 3' libre de las sondas de captura. En algunas modalidades, el bloqueo del dominio de captura reduce la tinción de fondo inespecífica. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo son reversibles, de manera que las sondas de bloqueo pueden retirarse de los dominios de captura durante o después del tiempo que los dominios de captura se pongan en contacto con la muestra biológica. En algunas modalidades, la sonda de bloqueo puede eliminarse con el tratamiento con ARNasa (por ejemplo, tratamiento con ARNasa H).
(iv) Fijación
En algunas modalidades, la muestra biológica (por ejemplo, una muestra de tejido vivo o muestra celular) puede fijarse en cualquiera de una variedad de fijadores para conservar la estructura biológica de la muestra antes del análisis. Por ejemplo, una muestra puede fijarse mediante inmersión en etanol, metanol, acetona, formaldehído (por ejemplo, 2 % de formaldehído), paraformaldehído-Tritón, y sus combinaciones. En algunos casos, la muestra biológica se fija después de registrar la actividad celular. En algunos casos, la muestra biológica se fija después de registrar la expresión génica. En algunos casos, la muestra biológica se fija después de registrar la actividad celular y la expresión génica. En algunas modalidades, después de la fijación, la cámara de perfusión puede desmontarse de manera que el sustrato (por ejemplo, una matriz espacial) puede someterse al análisis espacial como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos se somete directamente al análisis espacial, o el sustrato individual (por ejemplo, uno o más cubreobjetos) puede transferirse a una plataforma adecuada (por ejemplo, un portaobjetos), ya sea manualmente o automáticamente, para el análisis espacial. En algunas modalidades, la muestra biológica puede fijarse durante la etapa de registro, seguido del análisis espacial como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, dos o más fracciones de la muestra biológica, ubicadas en cámaras de perfusión separadas, pueden fijarse en diferentes puntos de tiempo durante la etapa de registro.
En algunas modalidades, la muestra biológica se fija durante el tratamiento con el compuesto de prueba (por ejemplo, fármaco). Por ejemplo, dos o más fracciones de la muestra biológica, cada una ubicada en cámaras de perfusión separadas (o placas de múltiples pocillos), pueden fijarse en diferentes puntos de tiempo durante el tratamiento con el compuesto de prueba (por ejemplo, fármaco). En algunas modalidades, la muestra biológica se fija después del tratamiento con el compuesto de prueba (por ejemplo, fármaco), a continuación se somete al análisis espacial como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, una o más etapas (por ejemplo, extensión de sondas de captura por transcripción inversa) del análisis espacial se llevan a cabo directamente en la placa de múltiples pocillos. Por ejemplo, la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción puede fabricarse a medida (por ejemplo, resistente al calor), para ser compatible de esta manera con las etapas de análisis espacial.
(g) Métodos para el tratamiento con compuestos de prueba o el tamizaje de fármacos
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción comprenden perfundir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) compuestos de prueba a través de la cámara de perfusión. En algunas modalidades, los compuestos de prueba comprenden uno o más fármacos. En algunas modalidades, uno o más compuestos de prueba pueden perfundirse a través de la cámara de perfusión, antes de registrar la actividad celular o la expresión génica como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, uno o más compuestos de prueba pueden perfundirse a través de la cámara de perfusión, sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, simultáneamente) de registrar la actividad celular o la expresión génica como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, la perfusión y el registro se realizan automáticamente para el tamizaje de alto rendimiento de compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos). En algunas modalidades, la actividad celular en tiempo real o los cambios en la expresión génica se registran inmediatamente después de la perfusión de los compuestos de prueba. En algunas modalidades, el medio de cultivo (por ejemplo, sin ningún compuesto de prueba) se perfunde para eliminar un compuesto de prueba de la cámara de perfusión, seguido de la perfusión del mismo o de un compuesto de prueba diferente.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción comprenden tratar una muestra biológica con uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) compuestos de prueba dentro de una placa de múltiples pocillos o un sustrato en cámara. En algunas modalidades, los compuestos de prueba comprenden uno o más fármacos. En algunas modalidades, los compuestos de prueba se añaden a la placa de múltiples pocillos o sustrato en cámara manualmente (por ejemplo, mediante pipeteado) o automáticamente. En algunas modalidades, se añaden uno o más compuestos de prueba a la placa de múltiples pocillos o sustrato en cámara antes de registrar la actividad celular o la expresión génica como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, uno o más compuestos de prueba se añaden a la placa de múltiples pocillos o sustrato en cámara sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, simultáneamente) de registrar la actividad celular o la expresión génica como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el tratamiento con el compuesto de prueba y/o el registro de la actividad celular o la expresión génica se realizan automáticamente para el tamizaje de alto rendimiento de los compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos). En algunas modalidades, la actividad celular en tiempo real o los cambios en la expresión génica se registran inmediatamente después del tratamiento de los compuestos de prueba. En algunas modalidades, se elimina un compuesto de prueba (por ejemplo, mediante pipeteado), seguido de la adición del mismo o de un compuesto de prueba diferente.
En algunas modalidades, los compuestos de prueba se premezclan y perfunden a la cámara de perfusión (o se añaden a la placa de múltiples pocillos) al mismo tiempo. En algunas modalidades, los compuestos de prueba se perfunden o añaden secuencialmente. En algunas modalidades, uno o más compuestos de prueba se perfunden (o añaden) repetidamente para inducir una actividad celular o un cambio en la expresión génica. En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con uno o más compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos) sustancialmente al mismo tiempo. En algunas modalidades, la muestra biológica se trata con uno o más compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos) en diferentes momentos.
En algunas modalidades, el compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco) puede ser un agonista. En algunas modalidades, el compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco) puede ser un antagonista. En algunas modalidades, el compuesto de prueba puede ser un fármaco, por ejemplo, un fármaco de molécula pequeña, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, un agente farmacológico o cualquier compuesto de prueba de interés. En algunas modalidades, el compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco) activa o estimula una o más actividades celulares. En algunas modalidades, el compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco) inhibe una o más actividades celulares. En algunas modalidades, el compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco) aumenta la expresión génica intracelular de un ácido nucleico. En algunas modalidades, el compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco) disminuye la expresión génica intracelular de un ácido nucleico. En algunas modalidades, el compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco) disminuye la viabilidad y, por lo tanto, la expresión génica u otra actividad celular dentro de una célula o tejido.
En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un fármaco contra el cáncer. Como se usa en la presente, el término “cáncer” se refiere a células que tienen la capacidad de crecimiento autónomo, es decir, un estado o afección anormal caracterizado por un crecimiento celular que prolifera rápidamente. El término pretende incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados malignamente, independientemente del tipo histopatológico o etapa de invasión. Los cánceres descritos en la presente descripción incluyen neoplasias malignas de los diversos sistemas de órganos, tales como que afectan el pulmón, mama, tiroides, linfoide, tracto gastrointestinal y tracto genitourinario, así como también adenocarcinomas que incluyen neoplasias malignas tales como la mayoría de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de células no pequeñas del pulmón, cáncer del intestino delgado y cáncer del esófago. En algunas modalidades, los compuestos de prueba descritos en la presente descripción se diseñan para tratar o diagnosticar un carcinoma en un sujeto. El término “carcinoma” se reconoce en la técnica y se refiere a neoplasias malignas de tejidos epiteliales o endocrinos que incluyen carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. En algunas modalidades, el cáncer es carcinoma renal o melanoma. Los carcinomas ilustrativos incluyen aquellos que se forman a partir de tejido del cuello uterino, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon y ovario. El término también incluye carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un “adenocarcinoma” se refiere a un carcinoma derivado de tejido glandular o en el que las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles. El término “sarcoma” se reconoce en la técnica y se refiere a tumores malignos de derivación mesenquimal.
En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, por ejemplo, Muromonab- CD3, Efalizumab, Tositumomab-1131, Nebacumab, Edrecolomab, Catumaxomab, Daclizumab, Abciximab, Rituximab, Basiliximab, Palivizumab, Infliximab, Trastuzumab, Adalimumab, Ibritumomab tiuxetan, Omalizumab, Cetuximab, Bevacizumab, Natalizumab, Panitumumab, Ranibizumab, Eculizumab, Certolizumab pegol, Ustekinumab, Canakinumab, Golimumab, Ofatumumab, Tocilizumab, Denosumab, Belimumab, Ipilimumab, Brentuximab vedotin, Pertuzumab, Ado-trastuzumab emtansine, Raxibacumab, Obinutuzumab, Siltuximab, Ramucirumab, Vedolizumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Blinatumomab, Alemtuzumab, Evolocumab, Idarucizumab, Necitumumab, Dinutuximab, Secukinumab, Mepolizumab, Alirocumab, Daratumumab, Elotuzumab, Ixekizumab, Reslizumab, Olaratumab, Bezlotoxumab, Atezolizumab, Obiltoxaximab, Brodalumab, Dupilumab, Inotuzumab ozogamicin, Guselkumab, Sarilumab, Avelumab, Emicizumab, Ocrelizumab, Benralizumab, Durvalumab, Gemtuzumab ozogamicin, Erenumab, erenumab- aooe, Galcanezumab, galcanezumab-gnlm, Burosumab, burosumab-twza, Lanadelumab, lanadelumab-flyo, Mogamulizumab, mogamulizumab-kpkc, Tildrakizumab; tildrakizumab- asmn, Fremanezumab, fremanezumab-vfrm, Ravulizumab, ravulizumab-cwvz, Cemiplimab, cemiplimab-rwlc, Ibalizumab, ibalizumab-uiyk, Emapalumab, emapalumab-lzsg, Moxetumomab pasudotox, moxetumomab pasudotox-tdfk, Caplacizumab, caplacizumab- yhdp, Risankizumab, risankizumab-rzaa, Polatuzumab vedotin, polatuzumab vedotin-piiq, Romosozumab, romosozumab-aqqg, "Brolucizumab, brolucizumab-dbll", Crizanlizumab; crizanlizumab-tmca, Enfortumab vedotin, enfortumab vedotinejfv, [fam-]trastuzumab deruxtecan, fam-trastuzumab deruxtecan-nxki, Teprotumumab, teprotumumab-trbw, Eptinezumab, eptinezumab-jjmr, Isatuximab, isatuximab-irfc, Sacituzumab govitecan; sacituzumab govitecan-hziy, Inebilizumab, inebilizumab-cdon, "Tafasitamab, tafasitamab- cxix", Belantamab mafodotin, belantamab mafodotinblmf, Satralizumab, satralizumab- mwge, Atoltivimab, maftivimab, and odesivimab-ebgn, Naxitamab-gqgk, Margetuximab- cmkb, Ansuvimab-zykl, Evinacumab, Dostarlimab, dostarlimab-gxly, Loncastuximab tesirine, loncastuximab tesirine-lpyl, Tanezumab, Aducanumab, Tralokinumab, Teplizumab, Narsoplimab, Retifanlimab, Oportuzumab monatox, Anifrolumab, Inolimomb, Bimekizumab, Balstilimab, Sutimlimab (BIVV009), Ublituximab, Amivantamab, Tisotumab vedotin, Toripalimab, Omburtamab o Balstilimab. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico). En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es un fragmento variable de cadena única (scFv). En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este es parte de un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un fármaco de molécula pequeña. En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se diseña para tratar el cáncer. Por ejemplo, la diana molecular del fármaco de molécula pequeña puede seleccionarse de tirosina y serina / treonina cinasas (por ejemplo, Imanitib, Gefitinib, Erlotinib, Sunitinib, Lapatinib, Nilotinib, Sorafenib, Temsirolimus, Everolimus, Pazopanib, Crizotinib, Ruxolitinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Ponatinib, Regorafenib, Ibrutinib, Trametinib y Perifosina); proteasomas (por ejemplo, Bortezomib y Carfilzomib); metaloproteinasas de matriz y proteínas de choque térmico (por ejemplo, Batimastat, Ganetespib, y NVP-AUY922); y apoptosis (por ejemplo, Obatoclax y Navitoclax). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se selecciona de Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Certinib, Crizotinib, Dasatinib, Erlotinib, Gefitinib, Ibrutinib, Imatinib, Lapatinib, Linsitinib, Lenvatinib, Osimertinib, Pazopanib, Ponatinib, Regorafenib, Rucaparib, Ruxolitinib, Sunitinib y Vandetanib. Pueden encontrarse detalles, por ejemplo, en Pathak, Akshat,y otros Vivechan International Journal of Research9.1 (2018): 36.
En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer de mama, por ejemplo, Ribociclib (Kisqali), Alpelisib (Piqray), Abemaciclib (Verzenio), Talazoparib (Talzenna), Nertinib (Nerlynx), Palbociclib (Ibrance), Ixabepilona (Ixempra), Anastrazol (Arimidex), Lapatinib (Tykerb), Toremifeno (Fareston), Letrozol (Femara), Raloxifeno (Evista), Tamoxifeno líquido oral (Soltamax), Exemestano (Aromasina), Cipionato de testosterona (Depo-Testosterona), Fluoximesterona (halotestina/androxi), Fadrozol (Afema), Tamibaroteno (Amnolake) y Propionato de Testosterona. En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer de leucemia, por ejemplo, Gilteritinib (Xospata), Venetoclax (Venclexta), Bosutinib (Bosulif), Nilotinib (Tasigna), Tretinoína (Vesanoid), Clofarabina (Clolar), Citarabina/Daunorubicina (Vyxeos), Dasatinib (Sprycel), Ponatinib (Iclusig), Enasidenib (Idhifa), Ivosidenib (Tibsovo), Cladribina (Mavenclad/Leustatina), suspensión oral de mercaptopurina (Purixan), solución oral de metotrexato (Xatmep), Pentostatina (Nipent), trióxido arsénico (Trisenox), Quizartinib (Vanflyta), Inyección de dihidrocloruro de histamina (Ceplene), Ubenimix (Bestatin), mepesuccinato de omacetaxina (Synribo) y Radotinib (Supect). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer de pulmón, por ejemplo, Gefitinib (Irresa), Entrectinib (Rozlytrek), Osimertinib (Tagrisso), Erlotinib (Tarceva), Brigatinib (Alunbirg), Lorbrena (Lorlatinib), Vinorelbine (Navelbine), Zykadia (Certinib), Pemetrexed (Alimta), Alectinib (Alecensa), Xalkori (Crizotinib), Nintedanib (Ofev), Anlotinib (Focus V), Amrubicin (Calsed) y Icotinib (Conmana). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar linfomas, por ejemplo, Copanlisib (Aliqopa), solución de metoxsaleno (Uvadex), Pralatrexato (Folotyn), Bexaroteno tópico (Targretin Gel), Pixantrone (Pixuvri), Belinostat (Beleodaq), Zanubrutinib (Brukinsa), Vorinostat (Zolinza), Romidepsin (Istodax), Bexaroteno (Targretin) y Mecloretamina (Valchlor/Ledaga). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el mieloma, por ejemplo, Ixazomib (Ninlaro), Melphalan Intravenoso (Evomela/Chemostat), Talidomida (Thalomid), Selinexor (Xpovio), Panobinostat (Farydak), Bortezomib (Velcade), Pomalidomida (Pomalyst) y Dexametasona alta dosis (Neofordex).
En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer de próstata, por ejemplo, Xtandi (Enzalutamide), Apalutamida (Erleada), Ertafitinib (Balversa), Darolutamida (Nubeqa), Bicalutamida (Casodex), Nilutamida (Nilandron), Abiraterona (Zytiga), Xofigo (Radium Ra 223 dichloride) y Pedeliporfina (Tookad). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer gástrico, por ejemplo, avapritinib (Ayvakit), Rivoceranib (Aitan), Gimeracil/Oteracil/Tegafur (Teysuno/TS-1) y Eptaplatina/Heptaplatina. En algunas modalidades, el fármaco molecular pequeño se usa para tratar el diagnóstico de cáncer, por ejemplo, Fluciclovine 18F (Axumin), Tc 99m Tilmanocept (Lymphoseek), Perflubutan (Sonazoid), Aminolevulinato de hexilo (Cysview), Fluorocolina 18F (IASOcholine/Pcolina) y Gadobuterol (Gadavist). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer de piel, por ejemplo, Benimetinib (Mektovi), Cobimetinib (Cotellic), Sonidegib (Odomzo), Vismodegib (Erivedge), Imiquimod (Aldara/Zyclara), Ácido amivolevulínico (Ameluz), Aminolevulínico de Metilo (Metvixia/Metvix PDT) y Vemurafenib (Zelboraf). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer de páncreas, por ejemplo, inyección de liposoma de Irinotecán (Onivyde). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar tumores de tiroides, por ejemplo, Vendetanib (Caprelsa). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer renal, por ejemplo, axitinib (Inlyta). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar el cáncer de endometrio, por ejemplo, Tipi racil/T rifluridina (Lonsurf), Irinotecan (Camptosar), Oxaliplatina (Eloxatin), Raltitrexed (Tomudex), Perlas de elución de Irinotecan (Paragon Beads/Debiri) y Fruquintinib (Elunate). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se usa para tratar tumores sólidos, por ejemplo, Larotectinib (Viktravi). En algunas modalidades, el fármaco de molécula pequeña se dirige a múltiples cánceres, por ejemplo, Fludarabin (Fludara/Oforta), Gemcitabina (Gemzar), Sorafnib (Nexavar), Rucaparib (Rubraca), Doxorrubicina (Aridamycin), Acalabrutinib (Calquence), Ibrutinib (Imbruvica), Azacitidina (Vidaza), Lenalidomide (Revlimid), Doxorrubicina Liposomal (Doxil), Tazemetostat (Tazverik), Busulfan (Busulfex), Afatinib (Gilotrif), Gemcitabina (Infugem), Carmustina Polifeprosan 20 wafer (Gliadel), Eribulin (Halaven), Enlace Paclitaxel-Proteína (Abraxane), Trabectedina (Yondelis), Paclitaxel (Taxol), Docetaxel (Taxotere), Idelalisib (Zydelig), Duvelisib (Copiktra), Regorafenib (Stivagra), Nelarabina (Arranon), Capecitabina (Xeloda), Lenvatinib (Lenvima), Olaparib (Lynparza), Niraparib (Zejula), Pazopanib (Votrient), Alitretinoin tópica (Panretin), Mitotano (Lysodren), Valrubicina (Valstar), Hidroxiurea (Hydrea), Mitoxantrona (Novantrone), ácido zoledrónico (Zometa/Reclast), Fotemustina (Muforan), Nanopartícula de aclitaxel (Nanoxel), Topotecan (Hycamtin), Decitabina (Decogen), Tivozanib (Fotivda), Telotristat Etiprate (Xermelo), Imatinib (Gleevec), Trametinib (Mekinist), Cabozantinib (Cabometyx), Encorafenib (Braftovi), Dabrafenib (Tafinlar), Sunintab (Sutent), Levoleucovorin (Fusilev/Khapzory), Bendamustina (Treanda/Belrapzo/Bendeka), Forodesina (Fodosine/Mundesine), Talaporfin (Laserphyrin), Tucidinostat (Epidaza), Perlas de elución de doxorrubicina (DC Beads), Temozolomida (Temodar), Formulación de micelas poliméricas de paclitaxel (GenexolPM), micela polimérica de docetaxel (Nanoxel M), Metotrexato, Treosulfan (Ovastat/Tercondi), Belotecan (Camtobell), Paclitaxel Liposomal(Lipusu/Bevetex), Amsacrine (Amsa PD/Amekrin), Ciclofosfamida, Nanósoma de docetaxel (DoceAqualip), Ácido pamidrónico (Aredia), Mopidamol (Rapenton), Nedaplatin (Aqupla), Citarabin/Citarabin Liposomal (DepoCyt) y Dianhidrogalactitol (DAG para inyección).
En algunas modalidades, el fármaco antineoplásico es una quimioterapia, por ejemplo, campotecina, doxorrubicina, cisplatino, carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, adriamicina, ifosfamida, melfalan, clorambucilo, bisulfano, nitrosurea, dactinomicina, daunorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido, verampilo, podofilotoxina, tamoxifeno, taxol, transplatino, 5-fluruouracilo, vincristina, vinblastina y/o metotrexato.
En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un fármaco anti-viral, por ejemplo, Aciclovir, Brivudin, Cidofovir, Famciclovir, Fomivirsen, Foscarnet, Ganciclovir, Penciclovir, Valaciclovir, Valganciclovir, Vidarabina, Amantadina, Rimantadina, Oseltamivir, Zanamivir, Interferones, Ribavirin, Adefovir, Emtricitabina, Entecavir, Lamivudina, Telbivudina, Tenofovir, Boceprevir o Telaprevir. Los detalles de los fármacos anti-virales pueden encontrarse, por ejemplo, en Razonable, R. R.Mayo Clinic Proceedings.Vol. 86. No. 10. Elsevier, 2011; De Clercq, E.,y otros, Clinical Microbiology Reviews 29.3(2016): 695-747; y De Clercq, E.Annual Review of Pharmacology and Toxicology51 (2011): 1-24.
Si bien no pretende unirse a ninguna teoría, se cree que el compuesto de prueba descrito en la presente descripción puede ser cualquier molécula que tenga funciones deseadas (por ejemplo, funciones antineoplásicas) o funciones a determinar. En algunas modalidades, cuando el compuesto de prueba se aplica a una muestra biológica, se cambian la actividad celular (por ejemplo, cualquiera de las actividades celulares descritas en la presente descripción) y/o la expresión génica (por ejemplo, cualquiera de las detecciones de expresión génica descritas en la presente descripción) de la muestra biológica.
También se incluyen en la presente descripción métodos para tamizar compuestos de prueba, por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos, compuestos de prueba de molécula grande o pequeña inorgánica u orgánica, para identificar agentes útiles en el tratamiento de trastornos o enfermedades.
Como se usa en la presente, “moléculas pequeñas” se refiere a moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas de peso molecular por debajo de aproximadamente 3000 daltons. En general, las moléculas pequeñas útiles para la invención tienen un peso molecular de menos de 3000 daltons (Da). Las moléculas pequeñas pueden ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente 100 Da a aproximadamente 3000 Da (por ejemplo, de entre aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2500 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2000 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1750 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1250 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 750 Da, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 Da, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1500, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 Da, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 Da).
Los compuestos de prueba pueden ser, por ejemplo, productos naturales o miembros de una biblioteca de química combinatoria. Un conjunto de moléculas diversas debe usarse para cubrir una variedad de funciones tales como carga, aromaticidad, unión de hidrógeno, flexibilidad, tamaño, longitud de la cadena lateral, hidrofobicidad y rigidez. Las técnicas combinatorias adecuadas para sintetizar moléculas pequeñas se conocen en la técnica, por ejemplo, como se ejemplifica por Obrecht y Villalgordo, Solid- Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries,Pergamon-Elsevier Science Limited(1998), e incluyen las técnicas de síntesis “dividido y en grupo” o “en paralelo”, técnicas en fase sólida y en fase de solución, y técnicas de codificación (ver, por ejemplo, Czarnik,Curr. Opinion. Chem. Bio.1:60-6 (1997)). Además, varias bibliotecas de moléculas pequeñas están disponibles comercialmente. Varios compuestos de prueba de molécula pequeña adecuados se enumeran en la patente de Estados Unidos núm. 6,503,713.
Las bibliotecas tamizadas mediante el uso de los métodos de la presente invención pueden comprender una variedad de tipos de compuestos de prueba. Una biblioteca dada puede comprender un conjunto de compuestos de prueba estructuralmente relacionados o no relacionados. En algunas modalidades, los compuestos de prueba son moléculas peptídicas o peptidomiméticas. En algunas modalidades, los compuestos de prueba son ácidos nucleicos.
En algunas modalidades, los compuestos de prueba y sus bibliotecas pueden obtenerse alterando sistemáticamente la estructura de un primer compuesto de prueba, por ejemplo, un primer compuesto de prueba que es estructuralmente similar a una pareja de unión natural conocida del polipéptido diana, o una primera molécula pequeña identificada como capaz de unirse al polipéptido diana, por ejemplo, usar métodos conocidos en la técnica o los métodos descritos en la presente descripción, y correlacionar esa estructura con una actividad biológica resultante, por ejemplo, un estudio de relación estructura-actividad. Como apreciará un experto en la técnica, hay una variedad de métodos estándar para crear tal relación estructura-actividad. Por lo tanto, en algunos casos, el trabajo puede ser en gran medida empírico, y en otros, la estructura tridimensional de un polipéptido endógeno o porción de este puede usarse como un punto de partida para el diseño racional de un compuesto o compuestos de molécula pequeña. Por ejemplo, en una modalidad, se tamiza una biblioteca general de moléculas pequeñas, por ejemplo, mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción.
En algunas modalidades, un compuesto de prueba se aplica a una muestra de prueba, por ejemplo, una célula o tejido vivo, y se evalúan uno o más efectos del compuesto de prueba.
En algunas modalidades, la muestra de prueba es, o se deriva de (por ejemplo, una muestra tomada de) un modeloin vivode un trastorno como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, puede usarse un modelo animal, por ejemplo, un roedor tal como una rata.
Los métodos para evaluar cada uno de estos efectos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de modular la expresión de una proteína puede evaluarse a nivel de gen o proteína, por ejemplo, mediante el uso de métodos de PCR cuantitativa o inmunoensayo. En algunas modalidades, métodos de alto rendimiento, por ejemplo, proteína o chips génicos como se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Cap. 12, Genomics, en Griffithsy otros, Eds. Modern Genetic Analysis,1999, W. H. Freeman and Company; Ekins and Chu,Trends in Biotechnology,1999, 17:217-218; MacBeath y Schreiber,Science2000, 289(5485): 1760-1763; Simpson,Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman,Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts,DNA Press, 2003).
Un compuesto de prueba que se ha tamizado mediante un método descrito en la presente descripción y que se determina que es efectivo, puede considerarse un compuesto candidato. Un compuesto candidato que se ha tamizado, por ejemplo, en un modeloin vivode un trastorno, y se determina que tiene un efecto conveniente sobre el trastorno, por ejemplo, sobre uno o más síntomas del trastorno, puede considerarse un agente terapéutico candidato. Los agentes terapéuticos candidatos, una vez tamizados en un entorno clínico, son agentes terapéuticos. Los compuestos candidatos, agentes terapéuticos candidatos y agentes terapéuticos pueden optimizarse y/o derivatizarse opcionalmente, y formularse con excipientes fisiológicamente aceptables para formar composiciones farmacéuticas.
Por lo tanto, los compuestos de prueba identificados como “aciertos” (por ejemplo, compuestos de prueba que activan o inhiben una o más actividades celulares; alternativamente, los compuestos de prueba que aumentan o disminuyen la expresión génica intracelular de un ácido nucleico) en un primer tamizaje pueden seleccionarse y alterarse sistemáticamente, por ejemplo, mediante el uso de un diseño racional, para optimizar la afinidad de unión, avidez, especificidad u otros parámetros. Tal optimización también puede tamizarse para usar los métodos descritos en la presente descripción. Por lo tanto, en una modalidad, la descripción incluye tamizar una primera biblioteca de compuestos mediante el uso de un método conocido en la técnica y/o descrito en la presente descripción, identificar uno o más aciertos en esa biblioteca, someter esos aciertos a una alteración estructural sistemática para crear una segunda biblioteca de compuestos estructuralmente relacionados con el acierto, y tamizar la segunda biblioteca mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción.
Los compuestos de prueba identificados como aciertos pueden considerarse compuestos terapéuticos candidatos, útiles para tratar trastornos o enfermedades descritos en la presente descripción. Una variedad de técnicas útiles para determinar las estructuras de “aciertos” pueden usarse en los métodos descritos en la presente descripción, por ejemplo, RMN, espectrometría de masas, cromatografía de gases equipada con detectores de captura de electrones, fluorescencia y espectroscopía de absorción. Por lo tanto, la descripción también incluye compuestos identificados como “aciertos” por los métodos descritos en la presente descripción, y métodos para su administración y uso en el tratamiento, prevención, o retardo del desarrollo o progresión de un trastorno descrito en la presente descripción.
Los compuestos de prueba identificados como compuestos terapéuticos candidatos pueden tamizarse adicionalmente mediante la administración a un sujeto (por ejemplo, un modelo animal) de un trastorno o enfermedad como se describe en la presente descripción. El animal puede monitorearse para un cambio en el trastorno, por ejemplo, para una mejora en un parámetro del trastorno, por ejemplo, un parámetro relacionado con el resultado clínico. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para examinar la respuesta farmacológica y/o dependiente del estímulo en tiempo real de la muestra biológica. En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden examinar el impacto farmacológico sobre la expresión génica. En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse junto con indicadores fluorescentes basados en la actividad (por ejemplo, sondas de calcio y sondas activadas por tensión).
En algunas modalidades, la muestra biológica descrita en la presente descripción se trata con uno o más compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos) antes de registrar la actividad celular y/o la expresión génica intracelular como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, la muestra biológica descrita en la presente descripción se trata con uno o más compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos) sustancialmente al mismo tiempo que se registra la actividad celular y/o la expresión génica intracelular como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, el compuesto de prueba se conjuga con un fluoróforo. En algunas modalidades, el compuesto de prueba se conjuga con un oligonucleótido. En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende una secuencia que identifica de manera única el compuesto de prueba. En algunos casos, la muestra biológica puede tratarse con dos o más compuestos de prueba, y cada compuesto de prueba se conjuga con una secuencia de código de barras que identifica de manera única el compuesto de prueba. Los detalles pueden encontrarse, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 62/963,897.
En algunas modalidades, los resultados de medición temporal (por ejemplo, los registros de actividad celular o expresión génica) pueden combinarse con los resultados del análisis de expresión génica espacial para proporcionar información espacio-temporal en la muestra biológica (por ejemplo, en respuesta al tratamiento con fármaco). En algunas modalidades, la información espacio-temporal proporciona una evaluación completa de los efectos del fármaco.
(h) Medios / Cubiertas resistentes a la difusión
Para aumentar la eficiencia al fomentar la difusión de analitos hacia las sondas de captura con código de barras espacial, puede usarse un medio resistente a la difusión. En general, la difusión molecular de analitos biológicos puede ocurrir en todas las direcciones, incluso hacia las sondas de captura (es decir, hacia la matriz con código de barras espacial) y lejos de las sondas de captura (es decir, hacia la solución a granel). El aumento de la migración de analito hacia la matriz con código de barras espacial reduce la difusión de analito lejos de la matriz con código de barras espacial y aumenta la eficiencia de captura de las sondas de captura, aumentando así la resolución de la matriz espacial.
En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión se coloca sobre una muestra biológica (por ejemplo, la muestra de tejido vivo o muestra de célula descrita en la presente descripción) que se coloca o cultiva sobre un sustrato con código de barras espacial. Por ejemplo, el medio resistente a la difusión puede colocarse sobre una matriz en la que se ha cultivado una muestra biológica en la parte superior. En algunas modalidades, el medio resistente a la difusión y la matriz con código de barras espacial son el mismo componente. Por ejemplo, el medio resistente a la difusión puede contener sondas de captura con código de barras espacial dentro o sobre el medio resistente a la difusión (por ejemplo, cubreobjetos, portaobjetos, hidrogel o membrana). En algunas modalidades, se coloca o cultiva una muestra biológica sobre un sustrato y se coloca un medio resistente a la difusión encima de la muestra biológica. Adicionalmente, una matriz de sondas de captura con código de barras espacial puede colocarse muy cerca sobre un medio resistente a la difusión. Por ejemplo, un medio resistente a la difusión puede intercalarse entre una matriz con código de barras espacial y una muestra biológica en un sustrato. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión se dispone o se aplica sobre una muestra biológica. En otras modalidades, un medio resistente a la difusión se coloca cerca de una muestra biológica.
En general, un medio resistente a la difusión puede ser cualquier material conocido por limitar la difusividad de los analitos biológicos. Por ejemplo, un medio resistente a la difusión puede ser una cubierta sólida (por ejemplo, un cubreobjetos o un portaobjetos de vidrio). En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión puede fabricarse de vidrio, silicio, papel, monolitos de polímero de hidrogel u otro material. En algunas modalidades, el portaobjetos de vidrio puede ser un portaobjetos de vidrio acrilado. En algunas modalidades, el medio resistente a la difusión es una membrana porosa. En algunas modalidades, el material puede ser naturalmente poroso. En algunas modalidades, el material puede tener poros o pocillos grabados en material sólido. En algunas modalidades, el volumen de los poros puede manipularse para minimizar la pérdida de analitos diana. En algunas modalidades, la composición química de la membrana puede manipularse para minimizar la pérdida de analitos diana. En algunas modalidades, el medio resistente a la difusión (por ejemplo, hidrogel) se une a un sustrato (por ejemplo, portaobjetos de vidrio), por ejemplo, mediante medios covalentes o no covalentes. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión puede ser cualquier material conocido por limitar la difusividad de los transcritos de poli(A). En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión puede ser cualquier material conocido por limitar la difusividad de las proteínas. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión puede ser cualquier material conocido para limitar la difusividad de los constituyentes macromoleculares.
En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión incluye uno o más medios resistentes a la difusión. Por ejemplo, uno o más medios resistentes a la difusión pueden combinarse de diversas maneras antes de colocar el medio en contacto con una muestra biológica que incluye, sin limitación, revestimiento, estratificación o aplicación. Como otro ejemplo, un hidrogel puede colocarse sobre una muestra biológica seguido de la colocación de una cubierta (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio) sobre el hidrogel.
En algunas modalidades, se aplica una fuerza (por ejemplo, presión hidrodinámica, vibración ultrasónica, contrastes de solutos, radiación con microondas, circulación vascular u otras fuerzas eléctricas, mecánicas, magnéticas, centrífugas y/o térmicas) para controlar la difusión y mejorar la captura del analito. En algunas modalidades, una o más fuerzas y uno o más medios resistentes a la difusión se usan para controlar la difusión y mejorar la captura. Por ejemplo, una fuerza centrífuga y un portaobjetos de vidrio pueden usarse simultáneamente. Cualquiera de una variedad de combinaciones de una fuerza y un medio resistente a la difusión puede usarse para controlar o mitigar la difusión y mejorar la captura de analitos.
En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión, junto con la matriz con código de barras espacial y la muestra biológica, se sumerge en una solución a granel. En algunas modalidades, una solución a granel incluye reactivos de permeabilización. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión incluye al menos un reactivo de permeabilización. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión (es decir, hidrogel) se empapa en reactivos de permeabilización antes de poner en contacto el medio resistente a la difusión con la muestra. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión puede incluir pocillos (por ejemplo, micro, nano o picopocillos) que contienen un tampón o reactivos de permeabilización. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión puede incluir reactivos de permeabilización. En algunas modalidades, un medio resistente a la difusión puede contener reactivos o monómeros secos para suministrar reactivos de permeabilización cuando el medio resistente a la difusión se aplica a una muestra biológica. En algunas modalidades, se añade un medio resistente a la difusión al conjunto de matriz con código de barras espacial y muestra antes de que el conjunto se sumerja en una solución a granel. En algunas modalidades, se añade un medio resistente a la difusión al conjunto de matriz con código de barras espacial y muestra después de que la muestra se haya expuesto a reactivos de permeabilización. En algunas modalidades, los reactivos de permeabilización se hacen fluir a través de una cámara o canal microfluídico sobre el medio resistente a la difusión. En algunas modalidades, el flujo controla el acceso de la muestra a los reactivos de permeabilización. En algunas modalidades, los analitos diana se difunden fuera de la muestra y hacia una solución a granel y se incorporan en un medio resistente a la difusión incorporado en la sonda de captura con código de barras espacial. En algunas modalidades, se intercala una solución libre entre la muestra biológica y un medio resistente a la difusión.
La Figura 7 es una ilustración de un uso ilustrativo de un medio resistente a la difusión. Un medio/tapa resistente a la difusión 702 puede ponerse en contacto con una muestra 703. En la Figura 7, un portaobjetos de vidrio 704 se rellena con sondas de captura con código de barras espacial 706, y la muestra 703, se pone en contacto con la matriz 704 y las sondas de captura con código de barras espacial 706. Un medio/cubierta resistente a la difusión 702 puede aplicarse a la muestra 703, en donde la muestra 703 se intercala entre un medio resistente a la difusión 702 y un portaobjetos recubierto de la sonda de captura 704. Cuando se aplica una solución de permeabilización 701 a la muestra, el uso del medio/cubierta resistente a la difusión 702 dirige la migración de los analitos 705 hacia las sondas de captura 706 al reducir la difusión de los analitos hacia el medio. Alternativamente, el medio/cubierta resistente a la difusión puede contener reactivos de permeabilización.
(i) Transferencia electroforética
En algunas modalidades, la transferencia electroforética de analitos puede realizarse mientras se retienen las ubicaciones espaciales relativas de los analitos en una muestra biológica mientras se minimiza la difusión pasiva de un analito lejos de su ubicación en una muestra biológica. En algunas modalidades, un analito capturado por una sonda de captura (por ejemplo, sondas de captura en un sustrato) retienen la ubicación espacial del analito presente en la muestra biológica de la que se obtuvo (por ejemplo, la ubicación espacial del analito que se captura mediante una sonda de captura en un sustrato cuando el analito se migra activamente a la sonda de captura mediante transferencia electroforética puede ser más precisa o representativa de la ubicación espacial del analito en la muestra biológica que cuando el analito no se migra activamente a la sonda de captura). En algunas modalidades, el proceso de transporte y unión electroforéticos se describe por el número Damkoohler (Da), que es una relación de velocidades de reacción y transporte de masa. La fracción de analitos unida y la forma de la muestra biológica dependerán de los parámetros en el Da. Los parámetros incluyen la velocidad de electromigraciónUe(en dependencia de la movilidad electroforética del analito |Je y la intensidad del campo eléctrico E), la densidad de las sondas de captura (por ejemplo, oligonucleótidos con código de barras)po,la tasa de unión entre las sondas (por ejemplo, oligonucleótidos con código de barras) y los analitoskasoc,y el grosor del área de capturaL.
La migración rápida (por ejemplo, electromigración) puede reducir el tiempo de ensayo y puede minimizar la difusión molecular de analitos.
En algunas modalidades, la transferencia electroforética de analitos puede realizarse mientras se mantiene la alineación espacial relativa de los analitos en la muestra. Como tal, un analito capturado por las sondas de captura (por ejemplo, sondas de captura en un sustrato) retiene la información espacial de la célula o la muestra biológica de la que se obtuvo. La aplicación de un campo electroforético a analitos también puede dar como resultado un aumento de la temperatura (por ejemplo, calor). En algunas modalidades, el aumento de temperatura (por ejemplo, calor) puede facilitar la migración de los analitos hacia una sonda de captura.
En algunos ejemplos, se usa una matriz de microelectrodos direccionables espacialmente para la captura con limitaciones espaciales de al menos un analito de interés cargado por una sonda de captura. Por ejemplo, una matriz de microelectrodos que puede abordarse espacialmente puede permitir la aplicación discreta (por ejemplo, localizada) de un campo eléctrico en lugar de un campo eléctrico uniforme. La matriz de microelectrodos direccionables espacialmente puede abordarse independientemente. En algunas modalidades, el campo eléctrico puede aplicarse a una o más regiones de interés en una muestra biológica. Los electrodos pueden ser adyacentes entre sí o distantes entre sí. La matriz de microelectrodos puede configurarse para incluir una alta densidad de sitios discretos que tienen un área pequeña para aplicar un campo eléctrico para promover la migración de analito(s) cargado(s) de interés. Por ejemplo, la captura electroforética puede realizarse en una región de interés mediante el uso de una matriz de microelectrodos direccionables espacialmente.
Puede usarse una alta densidad de sitios discretos en una matriz de microelectrodos. La superficie puede incluir cualquier densidad adecuada de sitios discretos (por ejemplo, una densidad adecuada para procesar la muestra en el sustrato conductor en una cantidad de tiempo dada). En una modalidad, la superficie tiene una densidad de sitios discretos mayor que o igual a aproximadamente 500 sitios por 1 mm2. En algunas modalidades, la superficie tiene una densidad de sitios discretos de aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1000, aproximadamente 3000, aproximadamente 4000, aproximadamente 5000, aproximadamente 6000, aproximadamente 7000, aproximadamente 8000, aproximadamente 9000, aproximadamente 10 000, aproximadamente 20 000, aproximadamente 40,000, aproximadamente 60 000, aproximadamente 80 000, aproximadamente 100 000 o aproximadamente 500 000 sitios por 1 mm2. En algunas modalidades, la superficie tiene una densidad de sitios discretos de al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 2000, al menos aproximadamente 3000, al menos aproximadamente 4000, al menos aproximadamente 5000, al menos aproximadamente 6000, al menos aproximadamente 7000, al menos aproximadamente 8000, al menos aproximadamente 9000, al menos aproximadamente 10 000, al menos aproximadamente 20 000, al menos aproximadamente 40 000, al menos aproximadamente 60 000, al menos aproximadamente 80000, al menos aproximadamente 100000, o al menos aproximadamente 500000 sitios por 1 mm2.
Los esquemas que ilustran un sistema electroforético de transferencia configurado para dirigir analitos de ácido nucleico (por ejemplo, transcritos de ARNm) hacia una matriz de sondas de captura con código de barras espacial se muestran en la Figura 8A y la Figura 8B. En esta configuración ilustrativa de un sistema electroforético, una muestra 802 se intercala entre el cátodo 801 y la matriz de sondas de captura con código de barras espacial 804, 805, y la matriz de sondas de captura con código de barras espacial 804, 805 se intercala entre la muestra 802 y el ánodo 803, de manera que la muestra 802, 806 está en contacto con las sondas de captura con código de barras espacial 807. Cuando se aplica un campo eléctrico al sistema electroforético de transferencia, los analitos de ácido nucleico cargados negativamente 806 se tirarán hacia el ánodo cargado positivamente 803 y hacia la matriz con códigos de barras espaciales 804, 805 que contiene las sondas de captura con códigos de barras espaciales 807. Las sondas de captura con códigos de barras espaciales 807 interactúan con los analitos de ácido nucleico (por ejemplo, los transcritos de ARNm se hibridan con sondas de captura de ácido nucleico con códigos de barras espaciales que forman híbridos de ADN/ARN) 806, lo que hace que la captura de analito sea más eficiente. La configuración del sistema electroforético puede cambiar en dependencia del analito diana. Por ejemplo, las proteínas pueden ser positivas, negativas, neutras o polares en dependencia de la proteína, así como también de otros factores (por ejemplo, punto isoeléctrico, solubilidad, etc.). El profesional experto tiene el conocimiento y la experiencia para disponer el sistema electroforético de transferencia para facilitar la captura de un analito diana particular.
Las Figuras 9A-9G es una ilustración que muestra un protocolo de flujo de trabajo ilustrativo que utiliza un sistema electroforético de transferencia. En el ejemplo, la Figura 9A representa una matriz de elementos flexible con códigos de barras espaciales que se pone en contacto con una muestra. La matriz de elementos puede ser una matriz flexible, en donde la muestra se inmoviliza en un hidrogel, membrana u otro sustrato. La Figura 9B representa el contacto de la matriz con la muestra y la obtención de imágenes del conjunto de matriz-muestra. La imagen del conjunto de muestra/matriz puede usarse para verificar la colocación de la muestra, elegir una región de interés o cualquier otra razón para obtener imágenes de una muestra en una matriz como se describe en la presente descripción. La Figura 9C representa la aplicación de un campo eléctrico mediante el uso de un sistema electroforético de transferencia para ayudar en la captura proximal de un analito diana por las sondas de captura en la matriz. Aquí, los analitos diana del ARNm cargados negativamente migran hacia el ánodo cargado positivamente. La Figura 9D representa la aplicación de reactivos de transcripción inversa y la síntesis de ADNc de la primera hebra de los analitos diana capturados. La Figura 9E representa la eliminación y preparación de matrices para la construcción de bibliotecas (Figura 9F) y secuenciación de nueva generación (Figura 9G).
(o) Kits
En algunas modalidades, también se describen en la presente descripción kits que incluyen uno o más reactivos para detectar uno o más analitos descritos en la presente descripción. En algunos casos, el kit incluye un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura que comprenden un código de barras espacial y el dominio de captura. En algunos casos, el kit incluye cualquiera del aparato o componentes del mismo como se describe en la presente descripción.
Un ejemplo no limitante de un kit usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye: a) una matriz que comprende una pluralidad de sondas de captura; b) una cámara de perfusión definida por el montaje de una junta en la matriz, y una cubierta montada sobre la junta, en donde la cubierta incluye: (i) una entrada que se conecta fluídicamente a una pluralidad de canales de entrada, y (ii) una salida que se conecta fluídicamente a una pluralidad de canales de salida; y c) una instrucción para usar el kit.
Un ejemplo no limitante de un kit usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye: a) una placa de múltiples pocillos que comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde la pluralidad de sondas de captura se unen directamente (por ejemplo, se imprimen) a una superficie de un pocillo de la placa de múltiples pocillos; y b) una instrucción para usar el kit. Otro ejemplo no limitante de un kit usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye: a) un cubreobjetos que comprende una pluralidad de sondas de captura; b) una placa de múltiples pocillos, en donde el cubreobjetos se une a una superficie de un pocillo de la placa de múltiples pocillos; y c) una instrucción para usar el kit. En algunas modalidades, la placa de múltiples pocillos es una placa de 6 pocillos, una placa de 8 pocillos, una placa de 12 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 48 pocillos o una placa de 96 pocillos.
Un ejemplo no limitante de un kit usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye: a) una corredera que comprende una pluralidad de matrices, en donde una matriz de la pluralidad de matrices comprende sondas de captura; b) una junta que comprende una pluralidad de aberturas, en donde la junta se configura para montarse sobre el portaobjetos de manera que la pluralidad de aberturas se alinea con la pluralidad de matrices; y c) una instrucción para usar el kit.
Ejemplos
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1.Preparación de muestras vivas y configuración del sistema
Las muestras vivas pueden prepararse para mediciones espacio-temporales como se muestra en las Figuras 12A-12D. Las muestras vivas (por ejemplo, secciones de tejido vivo) pueden generarse mediante el uso de un Vibrátomo (Figura 12A) y la viabilidad mantenida (Figura 12B) en medio oxigenado. Las cámaras tradicionales equipadas con un puerto de entrada y salida para un flujo constante de medios pueden diseñarse para promover el flujo laminar como se ejemplifica en la Figura 12C. Tales cámaras pueden adaptarse para ensamblarse con la matriz espacial descrita en la presente descripción. Alternativamente, el conjunto de cámara de perfusión puede fabricarse a medida, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 10A-10B. Las pruebas pueden producirse, por ejemplo, al colocar la cámara de perfusión bajo un microscopio u otro dispositivo o aparato para capturar la actividad celular o la expresión génica después de la prueba de la muestra viva (Figura 12d ).
Ejemplo 2. Medir la actividad celular mediante el uso de la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos
Como ejemplo no limitante, la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción pueden usarse para medir la actividad celular. Por ejemplo, la muestra de tejido cerebral vivo puede cortarse en secciones a partir de un tejido cerebral fresco mediante el Vibrátomo y cultivarse en una cámara de perfusión o una placa de múltiples pocillos descrita aquí. El medio de cultivo de tejidos específico para muestras de cerebro vivo puede perfundirse a través de (o añadirse mediante pipeteado) para mantener la viabilidad tisular. Pueden añadirse colorantes sensibles a la tensión al medio de cultivo y perfundirse a la cámara de perfusión (o añadirse a la placa de múltiples pocillos mediante pipeteado) para interactuar con la muestra de tejido cerebral. Los cambios rápidos del potencial de membrana, por ejemplo, los potenciales de acción en neuronas individuales, pueden registrarse ópticamente mediante microscopía fluorescente en lapso de tiempo. Inmediatamente después del registro, la muestra de tejido cerebral puede fijarse en paraformaldehído al 2 %. Tras la fijación, la cubierta y la junta se desensamblan. La muestra de tejido puede entonces someterse a un flujo de trabajo de análisis espacial como se describe en la presente descripción.
Ejemplo 3.Medir la expresión génica intracelular mediante el uso de la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos
Como ejemplo no limitante, una cámara de perfusión (o una placa de múltiples pocillos) descrita en la presente descripción puede usarse para la medición de la expresión génica intracelular, por ejemplo, el corte y empalme de un transcrito por FRET. Por ejemplo, las células que expresan el transcrito génico pueden sembrarse directamente en la cámara de perfusión (o la placa de múltiples pocillos) y cultivarse durante al menos 2 días cuando la confluencia celular alcanza aproximadamente el 80 %. Dos sondas de PNA marcadas con fluorescencia pueden perfundirse a la cámara de perfusión (o añadirse a la placa de múltiples pocillos mediante pipeteado) para interactuar con las células. La primera sonda que se dirige a un exón aguas arriba puede marcarse con Proteína Fluorescente Cyan (CFP) y la segunda sonda que se dirige a un exón aguas abajo puede marcarse con Proteína Fluorescente Venus (VFP o Venus). Tras el corte y empalme, los exones aguas arriba y aguas abajo ligados están lo suficientemente cerca (por ejemplo, dentro de 10 nm) de manera que la emisión de CFP puede excitar VFP, lo que da como resultado señales de emisión de fluorescencia específicas de VFP. Los fármacos que interfieren con el corte y empalme también pueden perfundirse (o añadirse mediante pipeteado) para interactuar con las células y pueden registrarse señales de emisión específicas de VFP. Inmediatamente después del registro, las células pueden fijarse por paraformaldehído al 2 %. Tras la fijación, la cubierta y la junta se desensamblan. La muestra celular puede someterse a continuación a un flujo de trabajo de análisis espacial como se describe en la presente descripción.
Como ejemplo no limitante, la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción pueden usarse para medir la expresión génica intracelular, por ejemplo, visualizar transcritos en células o tejidos vivos. Las células vivas que expresan una secuencia de ARNm diana pueden sembrarse directamente en la cámara de perfusión (o la placa de múltiples pocillos) y cultivarse cuando la densidad celular alcanza una confluencia apropiada. Como se muestra en las Figuras 13A-13C y la Figura 14, dos sondas de oligo marcadas con fluorescencia (sonda de oligo A y sonda de oligo B) que se dirigen a secuencias vecinas del ARNm diana pueden añadirse a la cámara de perfusión (o la placa de múltiples pocillos) para internalizarse en las células vivas. La sonda de oligo A puede marcarse con una CFP como un fluoróforo donante y la sonda de oligo B puede marcarse con VFP (o Venus) como un fluoróforo aceptor. El FRET puede producirse cuando los espectros de emisión del fluoróforo donante se solapan con los espectros de excitación del fluoróforo aceptor. El FRET puede detectarse cuando la distancia de los fluoróforos donante y aceptor es menor que 10 nm y ambos fluoróforos se orientan correctamente. Específicamente, la CFP de la sonda de oligo A puede excitarse a 405 nm y emitirse a 477 nm. Cuando la VFP la sonda de oligo B está a una distancia menor que 10 nm a CFP, la emisión de 477 nm puede excitar aún más a VFP para que emita a 528 nm. La Figura 15 muestra un resultado de registro ilustrativo de la emisión a 477 nm y 528 nm cuando las células se excitan a 405 nm durante un período de tiempo. Cuando se expresa el ARNm diana, las dos sondas de oligo pueden hibridarse con las secuencias vecinas del ARNm diana que permite que se produzca FRET, lo que se indica como una disminución de la señal de emisión 477 con un aumento simultáneo de la señal de emisión 528. Cuando el ARNm diana se degrada, las sondas de oligo de difusión libre tendrían una tasa reducida de ocurrencia de FRET, que se indica como un aumento de la señal de emisión de 477 nm con una disminución simultánea de la señal de emisión de 528 nm. Además, como se muestra en la Figura 16, los fármacos que interfieren con la expresión del ARNm diana también pueden desencadenar la respuesta de la señal de emisión de 477 nm y 528 nm durante el tratamiento con fármaco. Inmediatamente después del registro, las células vivas pueden lavarse y perfundirse (o añadirse mediante pipeteado) con fijadores (por ejemplo, paraformaldehído al 2 %). Alternativamente, pueden obtenerse instantáneas de las células vivas después de los tratamientos con fármacos al perfundir (o añadir) los fijadores en diferentes puntos de tiempo con controles adecuados (por ejemplo, sin controles de tratamiento). Tras la fijación, la cubierta y la junta se desensamblan. La muestra celular puede someterse a continuación a un flujo de trabajo de análisis espacial como se describe en la presente descripción.
Ejemplo 4.Tamizaje de fármacos mediante el uso de la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos
Como ejemplo no limitante, la cámara de perfusión o la placa de múltiples pocillos descrita en la presente descripción pueden usarse para el tamizaje de fármacos. Como se muestra en la Figura 19, pueden recolectarse células de la piel o sangre de pacientes humanos que tienen una enfermedad específica para generar células madre pluripotentes inducidas por pacientes específicos (células iPS). Las células iPS pueden cultivarse en una placa para imitar las células afectadas por la enfermedad. Alternativamente, las células iPS pueden estimularse para diferenciarse en una muestra de organoide, que puede usarse como un modelo de enfermedad. La muestra de organoide puede diseccionarse y transferirse a la cámara de perfusión o a la placa de múltiples pocillos como se describe en la presente descripción. Posteriormente, los compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos) pueden diluirse y usarse para tratar la muestra de organoide en cada cámara (o pocillo) con controles adecuados. Las actividades celulares y/o las expresiones génicas intracelulares pueden detectarse (por ejemplo, registrarse) en respuesta al tratamiento con compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos). La muestra de organoide puede someterse a continuación a un flujo de trabajo de análisis espacial como se describe en la presente descripción. En base a los cambios de las actividades celulares detectadas y/o las expresiones génicas intracelulares, junto con los resultados del análisis espacial, los fármacos específicos de la enfermedad pueden determinarse y usarse para tratar la enfermedad específica en los pacientes humanos.
Ejemplo 5. Cultivo de tejidos en matrices espaciales
Se evaluó la viabilidad del cultivo celular en matrices espaciales, de acuerdo con el Protocolo de optimización de tejidos de Visio. Específicamente, las células de carcinoma pulmonar epitelial humano A549 (ATCC® CCL-185™) se cultivaron en un matraz T75 mediante el uso de medios F-12K (ATC<c>® 30-2004) complementados con suero fetal bovino al 10 % (FBS; ATCC® 30-2020). Las células se recolectaron cuando la confluencia alcanzó el 80-90 %. Específicamente, las células se lavaron 1 x con solución salina tamponada con fosfato (PBS; sin Mg2+, sin Ca2+), y se disociaron en 3 ml de tripsina al 0,25 % (p/v) complementada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,53 mM durante 5 minutos a 37 °C. Después de la disociación, se añadieron 3 ml de medio completo calentado (F-12K, FBS al 10 %) y las células se mezclaron suavemente mediante pipeteado. Las células se transfirieron a un tubo Falcon de 15 ml, seguido de centrifugación a 300 g durante 15 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el sedimento celular se resuspendió con 1 ml de medio completo. El número total de células se contó mediante el uso de un contador de células automatizado Countess™ II (Thermo Fisher Scientific) después de la tinción con colorante azul tripán al 0,04 %. Después de la determinación de la concentración celular, las células se diluyeron a 20000 células por 200 pl, y se añadieron 200 pl de la suspensión celular diluida a cada pocilio de un casete ensamblado. El casete ensamblado incluía un portaobjetos de matriz espacial que se ensambló en un casete deslizante a través de una junta extraíble (los detalles pueden encontrarse en la Guía del usuario de kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020), que está disponible en el sitio web de documentación de soporte de l0x Genomics). El casete ensamblado se colocó en un recipiente secundario, y las células se cultivaron hasta que la confluencia alcanzó el 80-90 %. El medio de cultivo se aspiró, y las células se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 %. Las células fijas se tiñeron y se obtuvieron imágenes. El análisis se realizó de acuerdo con el protocolo de optimización de tejidos de Visium. En particular, las imágenes de huella de ADNc se obtuvieron después de la eliminación de tejido, con los contornos celulares que representan el ARNm recogido de las células A549.
Las Figuras 20A-20C, muestran la imagen de la célula fusionada y la imagen de la huella de ADNc. La imagen de la huella de ADNc se superpuso y se alineó con la imagen de la célula A549 teñida en el portaobjetos de matriz. En general, la huella de ADNc siguió la forma y morfología de las células individuales. Sin embargo, también se observó una ubicación errónea del transcrito (o difusión del transcrito), lo que dio lugar a un halo visible de transcritos que rodean las células individuales. Se contempla que la adición de agentes, tales como agentes de apiñamiento, minimizaría los transcritos que se difunden de las células.
Se evaluó la viabilidad del cultivo celular en matrices espaciales, de acuerdo con el Protocolo de expresión génica de Visio. Las células se trataron con fármacos de molécula pequeña (es decir, osimertinib o linsitinib) antes de la cosecha. Específicamente, las células A549 se prepararon y se añadieron a cada pocillo de un casete ensamblado como se describió anteriormente. El casete ensamblado incluía un portaobjetos de matriz espacial que se ensambló en un casete deslizante a través de una junta extraíble (los detalles pueden encontrarse en la Guía del usuario de kits de reactivos de expresión de genes espaciales de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020), que está disponible en el sitio web de documentación de soporte de l0x Genomics). El casete ensamblado se colocó en un recipiente secundario, y las células se cultivaron hasta que la confluencia alcanzó el 80-90 % (aproximadamente 3 días). Aproximadamente 24 horas antes de la cosecha, las células se dejaron sin tratar (como control); se trataron con osimertinib; se trataron con linsitinib; o se trataron con osimertinib y linsitinib. Después de la cosecha, se aspiraron los medios de cultivo, y las células se fijaron en PF A al 4 %. Se obtuvieron imágenes de las células fijas mediante microscopía de campo claro, y el análisis de expresión génica espacial se realizó de acuerdo con el Protocolo de expresión génica de Visium, que incluyó etapas de preparación de bibliotecas, secuenciación y análisis de datos. Después del tratamiento y el procesamiento, se obtuvieron datos experimentales de una réplica de cultivos sin tratar, una réplica de cultivos tratados con linsitinib y dos réplicas de cultivos tratados con osimertinib.
Como se muestra en la Figura 21A, las células A549 eran viables y proliferaban en la parte superior del portaobjetos de matriz espacial. Las imágenes celulares se tomaron capturando la autofluorescencia emitida por las células, y las células viables parecían morfológicamente normales. También se observó crecimiento en o que rodeaba los fiduciales impresos. La Figura 21B indica que las regiones de mayor densidad celular coincidían con los recuentos relativos de UMI más altos.
Los recuentos de UMI espaciales y los recuentos de detección génica se determinaron en cultivos sin tratar y tratados con fármacos. Como se muestra en las Figuras 22A-22D, la captura del transcrito se detectó como se indica por el UMI espacial y los gráficos génicos, lo que indica que el cultivo de células en la parte superior del portaobjetos de matriz espacial no afectó a la calidad de los datos del análisis espacial. Sin embargo, se contempla que uno o ambos del patrón de crecimiento celular no uniforme y el desprendimiento celular durante el procesamiento pueden haber dado como resultado áreas de bajo UMI y recuentos de genes.
También se compararon los resultados del análisis espacial de los cultivos sin tratar y tratados con fármaco. Las Figuras 23A-23E mostraron que las métricas de secuenciación derivadas de cada una de las áreas de captura cultivadas mostraron resultados comparables. Debido a que se usaron dos réplicas de células tratadas con osimertinib en el análisis, se contempló que las áreas tratadas con osimertinib tendrían una mayor variación de la saturación de secuenciación, la mediana de genes por células, la mediana de recuentos por célula y la mediana de UMI por célula en comparación con las áreas sin tratar o las áreas tratadas con linsitinib (Figuras 23A-23D). Además, las dos réplicas de células tratadas con osimertinib también tuvieron en cuenta la variación por formación de conglomerados observada dentro del gráfico de UMAP (Figura 23E). Sin embargo, se detectaron distintos patrones de formación de conglomerados entre los cultivos sin tratar, tratados con osimertinib y tratados con linsitinib.
Además, se determinó un análisis diferencial sobre la expresión génica en base a los cultivos sin tratar y tratados con fármaco y los resultados se muestran en las Figuras 24A-24B. Los resultados mostraron que se expresaron diferencialmente múltiples genes (por ejemplo, ya sea regulados positivamente o regulados negativamente) después del tratamiento de Osimertinib o Linsitinib a las células vivas. Por ejemplo, en comparación con las células tratadas con Linsitinib, las células tratadas con Osimertinib mostraron una mayor expresión de BMF, IGFBP1, CEMIP, PRRG3 y COL6A3; en comparación con las células sin tratar, las células tratadas con Linsitinib mostraron una mayor expresión de SLC6A12, PRSS35, RAB17, AKR1B1 e IGFL2-AS1 (Figura 24A). También se detectaron los genes superiores expresados diferencialmente. Por ejemplo, en comparación con las células tratadas con Linsitinib, los 5 genes principales con aumento del nivel de expresión en las células tratadas con osimertinib fueron PRRG3, CITED4, AHNAK2, NPDC1 e ITGA3; en comparación con las células sin tratar, los 5 genes principales con aumento del nivel de expresión en las células tratadas con linsitinib fueron PRSS35, AKR1B1, IGFL2-AS1, CCL2 y CRYAB (Figura 24B).
Además, se realizó un metaanálisis en las muestras mediante el uso del Cebador de conglomerados consenso de células únicas (SC3' o SC3P) (los detalles pueden encontrarse en los Kits Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent v3.1 (Índice doble) (por ejemplo, Rev B, con fecha de marzo de 2021), que está disponible en el sitio web de la documentación de soporte de 10x Genomics Support) o carteras de Visium, como se muestra en la Figura 25. Dentro de los resultados de conglomerado obtenidos por cada herramienta, se detectó la separación observable del patrón de conglomerado de los cultivos tratados con osimertinib de los cultivos sin tratar o tratados con linsitinib. Por lo tanto, la expresión génica diferencial inducida por el tratamiento con fármaco se demostró al tratar células vivas con diferentes fármacos y evaluar su efecto sobre la expresión génica mediante el uso de carteras de análisis de células individuales o espaciales.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra biológica, el método comprende:
(a) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra biológica, en donde la muestra biológica se ubica dentro de una cámara de perfusión de una pluralidad de cámaras de perfusión, en donde la cámara de perfusión comprende un sustrato y una junta;
(b) poner en contacto la muestra biológica con el sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito;
(c) extender la sonda de captura mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida;
(d) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y (e) determinar (i) toda la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de la misma, y (ii) toda o parte de la secuencia del analito, o un complemento de la misma, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la ubicación y/o la abundancia del analito en la muestra biológica;
en donde el método comprende además:
montar la junta sobre el sustrato,
en donde el sustrato comprende una pluralidad de regiones de sustrato, en donde una región de sustrato de la pluralidad de regiones de sustrato comprende la sonda de captura que comprende (i) el código de barras espacial y (ii) el dominio de captura que se une específicamente a la secuencia presente en el analito,
en donde la junta comprende (i) una pluralidad de aberturas correspondientes a la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente, (ii) una pluralidad de canales de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y (iii) una pluralidad de canales de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y
en donde la pluralidad de aberturas de la junta se alinean con la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato cuando la junta se monta sobre el sustrato; y montar una cubierta sobre la junta para definir una pluralidad de cámaras de perfusión,
en donde la cubierta incluye una entrada y una salida, la entrada se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada cuando la cubierta se monta sobre la junta, la salida se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de salida cuando la cubierta se monta sobre la junta, y
en donde la pluralidad de cámaras de perfusión se definen por (i) la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato, (ii) la pluralidad de aberturas de la junta que se monta sobre el sustrato, y (iii) la cubierta que se monta sobre la junta.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el montaje de la junta sobre el sustrato y el montaje de la cubierta sobre la junta para definir la pluralidad de cámaras de perfusión se producen antes del registro de la actividad celular o el registro de la expresión génica intracelular, y/o
en donde el método comprende además perfundir un compuesto de prueba a través de la cámara de perfusión antes de la etapa de registro o sustancialmente al mismo tiempo que la etapa de registro, preferentemente en donde el compuesto de prueba es un fármaco.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el sustrato es un cubreobjetos que comprende plástico, metal o vidrio; y/o
en donde la sonda de captura se une al sustrato a través de un grupo de enlace, opcionalmente en donde el grupo de enlace es un grupo amida; y/o
en donde el sustrato comprende un marcador fiducial.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además cultivar la muestra biológica en la cámara de perfusión antes de la etapa de registro.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la muestra biológica se cultiva en un medio de cultivo para mantener su viabilidad, en donde el medio de cultivo se reemplaza en un intervalo apropiado de forma manual o automática, y/o en donde la muestra biológica se cultiva de forma estática;
opcionalmente en donde el medio de cultivo se complementa con oxígeno y/o en donde el medio de cultivo comprende un reactivo de bloqueo o en donde la muestra biológica se trata con el reactivo de bloqueo.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la actividad celular comprende actividad proteica, actividad de fosforilación, actividad relacionada con el receptor acoplado a proteína G, actividad de canales iónicos, actividad de la unión ligando-receptor, actividad neuronal, síntesis de proteínas, expresión y ubicación de proteínas, actividad óptica transitoria, interacciones célula a célula, morfología celular o sus combinaciones; y/o
en donde la registro comprende registro óptico, opcionalmente en donde el registro óptico comprende poner en contacto la muestra biológica con un colorante químico, en donde el colorante químico es un colorante sensible a la tensión, un colorante sensible al pH, un colorante sensible a la temperatura, un colorante sensible a la luz, un colorante sensible al oxígeno o un colorante sensible a metales, preferentemente en donde el colorante sensible a metales es un colorante sensible al calcio, o
en donde el registro óptico comprende marcar la muestra biológica con un indicador, en donde el indicador es un indicador codificado genéticamente, en donde el indicador codificado genéticamente es un indicador de actividad neuronal codificado genéticamente, un indicador de tensión codificado genéticamente (GEVI) o un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI, o GCaMP), y opcionalmente
en donde el colorante químico o el indicador comprende además un fluoróforo; y/o
en donde el registro óptico se logra mediante hibridaciónin situo transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET); y/o
en donde el registro óptico comprende la hibridación de una pluralidad de sondas marcadas ópticamente con (a) una proteína, un lípido, un ácido nucleico o una de sus combinaciones asociados con la actividad celular; o (b) el ácido nucleico asociado con la expresión génica intracelular, opcionalmente en donde una sonda marcada ópticamente de la pluralidad es una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) marcada con un fluoróforo, preferentemente, en donde la sonda de PNA es de al menos 10 ácidos nucleicos, al menos 15 ácidos nucleicos, al menos 20 ácidos nucleicos, al menos 25 ácidos nucleicos, al menos 30 ácidos nucleicos o más; y/o en donde el registro óptico se realiza mediante el uso de microscopía fluorescente en lapso de tiempo.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde la muestra biológica es una muestra de tejido, en donde la muestra de tejido es una sección de tejido vivo, una muestra de organoide o una muestra de cultivo de esferoides; opcionalmente
en donde la muestra de organoide comprende organoides normales y/u organoides neoplásicos, y/o en donde la muestra de organoide comprende organoides intestinales, organoides hepáticos, organoides pulmonares y/o organoides neuronales; y/o
en donde la muestra de organoide se origina de un tejido afectado por la enfermedad, un tejido normal, una célula afectada por la enfermedad, una célula normal, una célula diferenciada y/o células madre,
opcionalmente en donde el tejido afectado por la enfermedad es un tejido canceroso,
opcionalmente en donde la célula afectada por la enfermedad es una célula cancerosa,
opcionalmente en donde la célula diferenciada es una célula somática,
opcionalmente en donde la célula madre se selecciona de una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida, o una célula madre somática.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la muestra biológica es una muestra de cultivo celular, opcionalmente en donde la muestra de cultivo celular es una muestra de cultivo celular primario que comprende células individuales que se aíslan de un tejido fresco.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el dominio de captura de la sonda de captura se bloquea mediante una sonda de bloqueo, preferentemente antes de la etapa de contacto.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la muestra biológica comprende una pluralidad de células vivas y las células vivas se tiñen con inmunofluorescencia antes de la etapa de registro; y/o en donde la muestra biológica se tiñe mediante el uso de un marcador detectable, en donde el marcador detectable es Can-Grunwald, Giemsa, hematoxilina y eosina (H&E), Jenner, Leishman, tricromo de Masson, Papanicolaou, Romanowsky, plata, Sudan, Wright, y/o ácido peryódico de Schiff (PAS); y/o
en donde se obtienen imágenes de la muestra biológica, opcionalmente en donde se obtienen imágenes de la muestra biológica mediante el uso de técnicas de obtención de imágenes de campo claro; y/o en donde la muestra biológica se permeabiliza con un agente de permeabilización seleccionado de un solvente orgánico, un agente de reticulación, un detergente y una enzima, o una de sus combinaciones, preferentemente después de la etapa de registro; y/o
en donde la muestra biológica se fija con etanol, metanol, acetona, formaldehído, paraformaldehído-Triton, glutaraldehído, o sus combinaciones, opcionalmente en donde el formaldehído es formaldehído al 2 %; preferentemente después de poner en contacto la muestra biológica con el sustrato, o después de cultivar la muestra biológica sobre el sustrato.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la etapa de extensión comprende extender la sonda de captura en el extremo 3'; y/o
en donde la etapa de extensión utiliza una transcriptasa inversa; y/o en donde la etapa de extensión utiliza nucleótidos marcados con fluorescencia.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la muestra biológica se elimina después de la etapa de amplificación; opcionalmente en donde la muestra biológica se elimina enzimáticamente después de la etapa de amplificación.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la etapa de amplificación comprende amplificar (i) toda o parte de la secuencia del analito unido al dominio de captura, o un complemento de la misma, y (ii) toda la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de la misma; opcionalmente en donde la etapa de amplificación comprende la amplificación en círculo rodante y/o
en donde la etapa de amplificación utiliza una ADN polimerasa, una pluralidad de cebadores y una pluralidad de nucleótidos.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la etapa de determinación comprende secuenciación; opcionalmente
en donde la etapa de determinación comprende la secuenciación de (i) toda la secuencia del código de barras espacial o el complemento de la misma, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, y/o
en donde la etapa de secuenciación de secuenciación comprende secuenciación in situ, métodos de secuenciación de Sanger, métodos de secuenciación de nueva generación y secuenciación de nanoporos.
15. Un método para determinar la ubicación y/o abundancia de un analito en una muestra de tejido o célula viva, el método comprende:
(a) proporcionar una pluralidad de cámaras de perfusión, en donde una cámara de perfusión de la pluralidad de cámaras de perfusión comprende un sustrato, una junta montada sobre el sustrato y una cubierta montada sobre la junta, en donde la muestra de tejido o célula viva se ubica dentro de la cámara de perfusión de la pluralidad de cámaras de perfusión, en donde
(1) el sustrato comprende una pluralidad de regiones de sustrato, en donde una región de sustrato de la pluralidad de regiones de sustrato comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito;
(2) la junta comprende (i) una pluralidad de aberturas correspondientes a la pluralidad de regiones de sustrato, respectivamente, (ii) una pluralidad de canales de entrada que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y (iii) una pluralidad de canales de salida que se conectan fluídicamente a la pluralidad de aberturas, respectivamente, y en donde la pluralidad de aberturas de la junta se alinean con la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato cuando la junta se monta sobre el sustrato;
(3) la cubierta comprende una entrada y una salida, la entrada se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de entrada cuando la cubierta se monta sobre la junta, la salida se conecta fluídicamente a la pluralidad de canales de salida cuando la cubierta se monta sobre la junta; y
(4) la pluralidad de cámaras de perfusión se definen por (i) la pluralidad de regiones de sustrato del sustrato, (ii) la pluralidad de aberturas de la junta que se monta sobre el sustrato, y (iii) la cubierta que se monta sobre la junta;
(b) perfundir uno o más compuestos de prueba a través de la cámara de perfusión;
(c) registrar una actividad celular y/o una expresión génica intracelular de un ácido nucleico de la muestra de tejido o célula viva,
(d) permeabilizar la muestra de tejido o célula viva de manera que el analito se une específicamente al dominio de captura de la sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura;
(e) extender la sonda de captura en el extremo 3' mediante el uso del analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla, lo que genera de esta manera una sonda de captura extendida;
(f) amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas; y
(g) secuenciar (i) toda la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de la misma, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito, o un complemento de la misma, y mediante el uso de las secuencias determinadas de (i) y (ii) determinar la ubicación y la ubicación y/o abundancia del analito en la muestra de tejido o célula viva.
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