SK284748B6

SK284748B6 - DNA sekvencia udeľujúca cytoplazmovú samčiu sterilitu, rekombinantný rastlinný mitochondriálny a jadrový genóm, mitochondria a cytoplazma obsahujúca mitochondriálny genóm

Info

Publication number: SK284748B6
Application number: SK222-93A
Authority: SK
Inventors: Sandrine Bonhomme; Fran�Oise Budar; Diminique Lancelin; Georges Pelletier
Original assignee: Institut National De La Recherche Agronomique
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 2005-11-03
Also published as: HU215494B; ATE396257T1; PL169783B1; PT99024A; ES2169720T3; CA2092097A1; DE69133597D1; AU652964B2; CA2393476A1; EP0549726B1; JP2001145497A; WO1992005251A1; CZ291186B6; DK0909815T3; DK0549726T3; RU2117704C1; FR2667078B1; PL169149B1; KR930702520A; SK22293A3

Abstract

Je opísaná DNA sekvencia Ogurovej sterility, ktorá je a) tvorená DNA sekvenciou vymedzenou nukleotidmi č. 928 a 2273 z obr. 1 alebo b) má aspoň 50 % homológiu so sekvenciou uvedenou v a) a ktorá ak je prítomná v mitochondriálnom alebo jadrovom genóme rastliny, udeľuje cytoplazmovú samčiu sterilitu tejto rastline. Tiež je opísaný rekombinantný rastlinný mitochondriálny a jadrový genóm, mitochondria a cytoplazma obsahujúca uvedený mitochondriálny genóm.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka biologického materiálu, ktorý má samčiu sterilitu, ktorá je užitočná pre vývoj hybridných odrôd druhov, ktoré sú dôležité z agronomického hľadiska.

Tento vynález sa obzvlášť týka rastlín, ktoré patria do čeľade Cruciferae, pri ktorých cytoplazma buniek obsahuje organely s nukleotidovými sekvenciami, ktoré udeľujú samčiu sterilitu a dobré vlastnosti.

Doterajší stav techniky

Vývoj hybridných odrôd sa môže uľahčiť alebo sa môže umožniť tým, že sa používa cytoplazmový samčí sterilný systém. Takéto hybridy sa získavajú skríženým oplodňovaním dvoch rodičovských populácií - jednej, ktorá vytvára úlohu samčiu a druhej samičej. Jedna prekážka, s ktorou sa stretáva, ak je žiaduce získať hybridné odrody rovnakej kvality sexuálnym skrížením samooplodňujúcich sa druhov, je schopnosť rastlín samoopelovať sa. Samčie sterilné systémy umožňujú, že sa získavajú samičie rastliny, ktoré nie sú schopné samooplodňovania a z ktorých je možné po opelení priamo zbierať semená, ktoré sú samotné hybridné bez toho, aby bolo potrebné vykonať prácne techniky, ako je napríklad kastrácia kvetov.

Medzi genetické determinanty samčej sterility patria tie determinanty, ktoré sú obsiahnuté v cytoplazme. Pri každej sexuálne produkovanej generácii sa prenášajú výhradne matkou. V každej generácii sú teda produkovaní potomkovia so 100 % samčou sterilitou so systémom cytoplazmovej samčej sterility (CM S). Tieto genetické determinanty sú obsiahnuté v genóme mitochondrií.

Vhodný cytoplazmový samčí sterilný systém pri Cruciferae je definovaný nasledujúcimi vlastnosťami:

1. Samčia sterilita musí byť úplná, to znamená, že nesmie dochádzať k žiadnej produkcii peľu bez ohľadu na stav kultúry a bez ohľadu na líniu, ktorú je žiaduce použiť ako samičieho predka. Ak nejde o tento prípad, semená, ktoré sa pozbierajú z týchto samičích rastlín, budú sčasti odvodené od samooplodnenia a nebudú teda hybridného typu Fl.

2. Produkcia týchto semien sa musí prevádzať výhodne prírodnými peľovými vektormi, to znamená v tomto prípade týmito druhmi: Hymenoptera, Diptera a vetrom. Peľ musí byť prenášaný z peľujúcich rastlín na samčie sterilné (samičie) rastliny. V skutočnosti môže tento transport na vzdialenosť pri Cruciferae uskutočniť len hmyz.

Samčie rastliny musia byť teda pre hmyz, ktorý prichádza a zbiera na nich nektár, dostatočne atraktívne. Morfológia kvetov musí nútiť hmyz, aby prevádzal túto úlohu cez vršok kvetu, takže hruď hmyzu prichádza do kontaktu s bliznou. V praxi je tomu tak, že základ korunných lupienkou musí vytvoriť akýsi druh trubičky okolo základu piestika.

3. Morfológia samičích orgánov (piestikov) musí byť identická s morfológiou plodnej rastliny, ide zvlášť o jeden jediný piestik na kvet a priamočiarosť tvaru. Samčie sterility vedú v skutočnosti často tiež k feminizácii prašníkov, ktoré sú transformované do pseudopiestikov a dokonca vedú k transformácii nektariny na úplné kvety. Takto vytvorený piestik alebo piestiky sú niekedy tiež deformované. Všetky tieto odchýlky neumožňujú dobrú tvorbu semien. Tento stav je možné považovať za ekvivalent istého stupňa samčej sterility.

4. Pri príprave hybridných odrôd Fl pri druhoch, pri ktorých sa zbierajú semená, ako je napríklad repka alebo hor čica, je podstatné, že samčí predok hybridu úplne neguje účinok samčej sterilnej cytoplazmy, takže hybridná rastlina sa ľahko opeľuje.

Pri Cruciferae bol prvý prípad samčej sterilnej cytoplazmy alebo CMS opísaný Ogurom (1968) pri reďkovke. Raphanus sativus Bannerot (1974, 1977) preniesol Ogurovu cytoplazmu na Brassicae, čím získal rastliny, ktoré majú cytoplazmovú samčiu sterilitu. Rovnaké rastliny nemajú uspokojivé agronomické vlastnosti (chloróza pri znížených teplotách, slabá samičia plodnosť), čo viedlo k slabším výťažkom, ktoré boli dôvodom toho, že tieto rastliny neboli vhodné na komerčné použitie.

Aby bolo možné vyhnúť sa tejto chloróze pri Cruciferae, mali by sa spojiť jadrové a chloroplastové genómyn toho istého rodu do rovnakej bunky. Tak rastliny Brassica, ktoré majú jeden z chloroplastových genómov Brassicae, už nemajú žiadnu chlorózu. Ak majú celý Ogurov mitochondriálny genóm, majú úplnú cytoplazmovú samčiu sterilitu, ale kvety majú však odlišnú morfológiu, čo spôsobuje, že nie je možné, aby boli opelené prírodnými vektormi.

Navyše pri druhoch, pri ktorých je záujem o semená, je možné obnoviť samičiu plodnosť hybridných odrôd, čo je možné uskutočniť jadrovými génmi známymi ako reštauračné gény.

Je ťažké obnoviť samčiu plodnosť rastliny, ktorá obsahuje celý Ogurov mitochondriálny genóm, pretože je nutné, aby súčasne došlo k pôsobeniu niekoľkých reštauračných génov.

Pôvodcovia predloženého systému sa snažili získať vhodný samčí sterilný systém tak, že sa odstránia gény, ktoré sú zodpovedné za nežiaduce vlastnosti Ogurovej cytoplazmy, pričom sa zachováva samčia sterilita, ktorá je účinná a ľahko obnoviteľná.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa teda týka DNA sekvencie Ogurovej sterility, ktorá je

a) tvorená DNA sekvenciou vymedzenou nukleotidmi č. 928 a 2273 z obr. 1, alebo

b) má aspoň 50 % homológiu so sekvenciou uvedenou v a), a ktorá, ak je prítomná v mitochondriálnom alebo jadrovom genóme rastliny, udeľuje cytoplazmovú samčiu sterilitu tejto rastline.

Podľa predloženého vynálezu DNA sekvencia je tvorená sekvenciou vymedzenou nukleotidmi č. 928 a č. 1569 z obr. 1, alebo ktorá má aspoň 50 % homológiu s touto sekvenciou, a ktorá je transkribovaná na RNA v mitochondriách rastlín so samčou sterilitou.

Tiež je predmetom vynálezu rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm, ktorý obsahuje DNA sekvenciu Ogurovej sterility pozostávajúcu

a) z DNA sekvencie vymedzenej nukleotidmi č. 928 a č. 1 569 z obr. 1, alebo

b) zo sekvencie, ktorá má aspoň 50 % homológiu so sekvenciou uvedenou v a).

a ktorá, ak je prítomná v cytoplazme rastliny, udeľuje cytoplazmovú samčiu sterilitu tejto rastline, s vylúčením celého mitochondriálneho Ogurovho genómu.

Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa vynálezu obsahuje DNA sekvenciu Ogurovej sterility tvorenú sekvenciou vymedzenou nukleotidmi č. 928 a č. 1569 z obr. 1, alebo sekvenciou, ktorá má aspoň 50 % homológiu s uvedenou sekvenciou.

Uvedený rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondirálny genóm neobsahuje celý alebo časť jedného a/alebo druhého z dvoch fragmentov Ogurovho genómu,

- ktoré sú tvorené jedným z dvoch génov pre formylmetionínovú transférovú RNA použitého na iniciáciu translácie,

- ktoré sú tvorené coxl génom kódujúcim podjednotku č. 1 cytochrómovej oxidázy, alebo v ktorých sú tieto fragmenty inaktívne.

Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa vynálezu je zbavený časti sekvencie, ktorá je tvorená fragmentom 10,7 kb po štiepení pôsobením BglI a fragmentom 11 kb po štiepení pôsobením Nrul, pričom tieto fragmenty sú odhalené hybridizáciou so sondou coxl.

Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm je zbavený časti sekvencie, ktorá poskytuje fragment 15 kb po štiepení pôsobením Nrul, fragment 5,1 po štiepení pôsobením Sali a fragment 18,5 po štiepení s BglI, a ktorý je odhalený hybridizáciou so sondou zodpovedajúcou sekvencií tvorenej bázami 389 a 1 199 sekvencie z obr. 1.

Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa vynálezu ďalej obsahuje sekvenciu, ktorá poskytuje fragment 2,5 kb po štiepení pôsobením Ncol, fragment 6,8 po štiepení Nrul a fragment so 4,4 kb po štiepení pôsobením Sali.

Jadrový genóm podľa vynálezu obsahuje okrem DNA sekvencie opísanej, presekvenciu umožňujúcu zavedenie produktu translácie tejto sekvencie do mitochondrii.

Vo výhodnom uskutočnení genóm podľa vynálezu je mitochondriálnym genómom.

Predložený vynález sa tiež týka mitochondrie, ktorá obsahuje genóm opísaný.

Tiež je opísaná cytoplazma, ktorá obsahuje mitochondriálny genóm opísaný a chloroplasty toho istého druhu ako je jadrový genóm alebo iného druhu, ale ktoré sú zlúčiteľné s týmto jadrovým genómom.

Prehľad obrázkov na výkresoch

V nasledujúcej časti bude vynález opísaný pomocou nasledujúcich obrázkov:

Obrázok 1 opisuje sekvenciu nukleotidov Ogurovho fragmentu mitochondriálnej DNA reďkovky obsahujúceho CMS.

Obrázok 2 predstavuje reštrikčnú mapu fragmentu mitochondriálnej DNA opísaného na obr. 1.

Obrázok 3 predstavuje elektroforézu mitochondriálnej DNA po rozštiepení pôsobením BglI (3a) a Nrul (3b). Odkryté pásy zodpovedajú hybridizácii sondou Coxl (Hiesel a kol. 1987).

Obrázok 4 predstavuje elektroforézu mitochondriálnej DNA po štiepení pôsobením Sali. Odkryté pasy zodpovedajú hybridizácii sondou viazanou na nukleotidy č. 389 a 1199 sekvencie opísanej na obrázku 1.

Obrázok 5 ukazuje plody produkované rastlinami kapusty, ktoré nesú rôzne cytoplazmové genómy.

Obrázok 6 ukazuje elektroforézu mitochondriálnej RNA. Odkryté pásy zodpovedajú hybridizácii sondou EcoRI-BamHl fragmentu vrátane časti sekvencie označenej ako ORF B.

DNA sekvencia Ogurovej sterility je definovaná vo vzťahu k sekvencií naviazanej na čísla 1 a 2 428 na obrázku

1. Je obsiahnutá v transkribovanej sekvencií, ktorej konce 3' a 5' sú spojené na obrázku 2 čiarkovanou čiarou a ktorá je pozorovateľná len pri samčích sterilných rastlinách ORF B zodpovedá otvorenej čítacej oblasti. Toto označenie bolo zavedené na základe pozorovania homológie na sekvencií opísanej Brennickom Sekvencia, ktorá súhlasí s jedným z dvoch formylmetionínových transférových RNA génov, je na obrázku 2 vyznačená tieňované.

DNA sekvencia naviazaná na nukleotidy označené 928 a 2273 na obrázku 1 znázorňuje transkripciu, ktorá môže byť zviditeľnená molekulárnou hybridizáciou (1.4) ako je znázornené na obrázku 6. Na tomto obrázku 6 každá jamka znázorňuje plodnú rastlinu (F) alebo samčiu sterilnú rastlinu (S). Len samčia sterilná rastlina syntetizuje transkript s veľkosťou približne 1400 nukleotidov. Tento transkript začína v polohe 928 (±10 nukleotidov) tejto sekvencie na obrázku 1 a končí v polohe 2 273 (±5 nukleotidov). (Iniciácia transkripcie a terminácia transkripcie môže nastávať v rôznych polohách rastlinných mitochondrii).

Tento vynález sa výhodne týka cytoplazmy obsahujúcej DNA sekvencie, ktorá ma aspoň 50 % homológiu so sekvenciou viazanou na nukleotidy 928 a 2 273 z obrázka 1, ktoré udeľujú CMS charakter, alebo cytoplazmy obsahujúcej DNA sekvenciu s aspoň 50 % homológiou so sekvenciou viazanou na nukleotidy 928 a 1 569 z obrázka 1, a transkribovanú na RNA udeľujúcu CMS charakter a ktorá:

- obsahuje chloroplasty rovnakého druhu ako jadrový genóm alebo iných druhov, ale takých, aby boli zlúčiteľné s týmto jadrovým genómom,

- neobsahuje celý alebo časť jedného alebo druhého (alebo oboch) fragmentov (fragmentu) uvedeného Ogurovho mitochondriálneho genómu:

• nesúci jeden z dvoch formylmetionínových transférových RNA génov použitých pre iniciáciu translácie, • nesúci Coxl gen, ktorý kóduje pod jednotku č. 1 cytochromoxidasy.

Neprítomnosť týchto fragmentov, na ktoré je odkazované ako na „nežiaduce sekvencie“, je nutné, aby sa získali mitochondriálne genómy majúce samčiu sterilitu dobrej kvality, ktoré sa vyznačujú s definovanými štyrmi vlastnosťami.

Podľa iného aspektu sa tento vynález týka rekombinantného rastlinného jadrového alebo mitochondriálneho genómu vyznačujúceho sa tým, že obsahuje Ogurovú sterilnú DNA sekvenciu:

a) ktorá je nesená DNA sekvenciou naviazanou na nukleotidy 928 a 2 273 sekvencie na obrázku 1 alebo

b) ktorá má aspoň 50 % homológie so sekvenciou uvedenou pod ad a) a udeľuje rastline, ak je prítomná cytoplazma tejto rastliny, cytoplazmovú samčiu sterilitu.

Predmetom tohto vynálezu je rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm, vyznačujúci sa tým, že obsahuje Ogurovú sterilnú DNA sekvenciu, ktorá

c) je nesená sekvenciou naviazanou na nukleotidy 928 a 1569 na obrázku 1 alebo

d) má aspoň 50 % homológii so sekvenciou uvedenou pod ad c) a udeľuje, ak je prítomná cytoplazma rastliny a ak je transkribovaná na RNA, tejto uvedenej rastline cytoplazmovú samčiu sterilitu.

Jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa tohto vynálezu je možné charakterizovať tým, že uvedený rekombinantný mitochondriálny genóm je zbavený všetkých alebo časti Ogurových genómových fragmentov:

nesúcich jeden zo dvoch fromylmethioninových transfemých RNA génov použitých pre iniciáciu translácie, nesúcich Coxl gen, ktorý kóduje pod jednotku č. 1 cytochromoxidasy, alebo v nich sú uvedené fragmenty neaktívne.

Podrobnejšie môže byť rekombinantný mitochondriálny genóm podľa tohto vynálezu charakterizovaný:

1. Tým, že je zbavený celého alebo časti fragmentu s približne 10 700 pármi nukleotidov po štiepení pôsobením BglI alebo fragmentov s približne 11 000 pármi nukleotidov po štiepení pôsobením Nrul, pričom tieto fragmenty nesú Coxl gen.

To je zvlášť demonštrované na obrázku 3 molekulárnej hybridizácie sondou nesúcou Coxl sekvenciou.

2. Tým, že je zbavený celého alebo časti fragmentu s 5100 pármi nukleotidov po štiepení pôsobení Sali alebo fragmentu s približne 15 000 pármi nukleotidov po štiepení pôsobením Nrul a/alebo fragmentu s približne 18 500 pármi nukleotidov po štiepení pôsobením BglI, pričom tieto fragmenty nesú jeden z dvoch formilmethioninových transférnych RNA génov.

To je demonštrované na obrázku 4 molekulárnou hybridizáciou sondou naviazanou na nukleotidy č.389 a 1199 sekvenciou opísanou na obrázku 1.

Genotypy na obrázkoch 3 a 4, ktoré sú označené číslami, zodpovedajú rastlinám, ktoré majú vhodný cytoplazmový samčí ste Genotypy

B.n.

OGU.

9,17,21,24,27c

B.o ý systém. Chloroplasty B. napus B. napus R. sativus/OGU/ B. oleracea B. oleracea

Mitochondrie

B. napus

B. napus/Ogura

B. sativus /OGU/

R. oleracea/Ogura

B. oleracea

Navyše pre existenciu CMS charakteru v dobrej kvalite je potrebná prítomnosť DNA sekvencie, ktorá môže byť charakterizovaná, DNA/DNA hybridizáciami pri štiepení. Tento vynález sa teda týka DNA sekvencie, ktorú je možno definovať a ktorú je možno charakterizovať tým, že obsahuje sekvenciu, ktorá poskytuje fragment s 2500 pármi nukleotidov po štiepení pôsobením Nrul a fragment s 4400 pármi nukleotidov po štiepení pôsobením Sali.

Táto sekvencia môže byť tiež identifikovaná hybridizáciami na celkovú RNA samčích sterilných rastlín. Je uvedený prepis (transkript) približne 1400 párov nukleotidov. Tento transkript nie je prítomný pri rastlinách, ktoré sa vracali do plodnosti.

Definícia „nežiaducich“ nukleotidových sekvencií a nukleotidových sekvencií „podstatných“ pre Ogurovú sterilitu podľa tohto vynálezu umožňuje, aby technikami DNA hybridizácie, ktoré sú dobre známe odborníkom, bol vybraný rastlinný materiál nesúci chloroplasty, ktoré sú zlúčiteľné jadrovým genómom a nesúci mitochondrie dobrej kvality, bez toho, aby sa čakalo na kvety a plody. K dispozícií užívateľom je teda vysoko účinný nástroj na výber rastlín, ktoré nesú samčiu sterilnú cytoplazmu s dobrými agronomickými vlastnosťami.

Podľa iného aspektu sa tento vynález týka mitochondrie, vyznačujúcej sa tým, že obsahuje sekvencie nukleotidov zodpovedajúcich DNA majúcich aspoň 50 % homológie so sekvenciou viazanou na nukleotidy č. 928 a 2 273 na obrázku 1 a kódujúcu ogurovú cytoplazmovú samčiu sterilitu alebo tiež mitochondrie obsahuje DNA sekvenciu, ktorá je nesená sekvenciou viazanou nukleotidmi 928 a 1569 na obrázku 1 alebo majúci 50 % homológie s touto sekvenciou a ktorá je transkribovaná na RNA v mitochondriách samčích sterilných rastlín. Táto DNA môže mať navyše uvedené vlastnosti, zvlášť neprítomnosť nežiaducich sekvencií.

Tento vynález sa tiež týka Cruciferae cytoplazmy, vyznačujúcej sa tým, že obsahuje „Ogurovú sterilnú“ DNA sekvenciu, táto cytoplazma ďalej obsahuje chloroplasty z rovnakých druhov alebo z rôznych druhov, ale také, ktoré sú zlučiteľné s jadrovým genómom.

Ogurová sterilná sekvencia sa vyznačuje tým, že:

a) je nesená DNA sekvenciou s 2428 pármi nukleotidov uvedených na obrázku 1,

b) je naviazaná na nukleotidy 928 a 2273 na obrázku 1, odpovedá transkriptu označenému čiarkovanou čiarou na obrázku 2 a je vizualizovaná molekulárnou hybridizáciou (1.4) na obrázku 6,

c) má aspoň 50 % homológie so sekvenciou uvedenou pod ad b) a udeľuje rastline, ak je prítomná v mitochondriálnom genóme tejto rastliny, cytoplazmovú samčiu sterilitu, alebo

d) je nesená sekvenciou naviazanou na nukleotidy 928 a 1569 na obrázku 1 a je transkribovaná na BNA v mitochondriách sterilných rastlín alebo

e) má aspoň 50 % homológie so sekvenciou uvedenou pod ad d) a je transkribovaná na RNA v mitochondriách sterilných rastlín.

Tento vynález sa tiež týka rastlín čeľade Cruciferae, vyznačujúca sa tým, že obsahuje chloroplasty a jadro rovnakého druhu alebo druhov zlúčitcľných a mitochondrie nesúci génom, ktorý udeľuje CMS charakter ako je uvedené.

Podrobnejšie sa tento vynález týka tiež rastliny, ktorá patrí k druhu Brassica, vyznačujúca sa tým, že obsahuje chloroplasty a jadro Brassica a mitochondrie nesúce génom, ktorý udeľuje uvedený CMS charakter.

Mitochondriový génom musí niesť tiež početné gény druhu Brassica, o ktoré ide. Toho sa dosiahne rekombináciou medzi genómom Ogura a genómom Brassica.

Tento vynález sa zvlášť týka rastliny patriacej k druhu Brassica napus, vyznačujúca sa tým, že obsahuje jadro Brassica chloroplasty a samčie sterilné mitochondrie, ktoré nesú DNA podľa tohto vynálezu ako je uvedené. Tieto mitochondrie môžu niesť tiež väčšinu mitochondriálnych génov Brassica napus (188, AStp9, Atp6, CoxII, ndhl, cob/. Brassica napus zodpovedá repke alebo turínu a pod..

Tento vynález sa týka rastliny druhu Brassica oleracea, vyznačujúca sa tým, že obsahuje jadro Brassica a že cytoplazma obsahuje Brassica chloroplasty a mitochondrie nesúce DNA sekvencie, ktorá kóduje CMS charakter ako je uvedené.

Brassica oleracea zahŕňa rôzne typy kapusty, zrelej kapusty, karelábu, karfiolu, kŕmnu kapustu.

Tento vynález sa tiež týka rastlín druhu Brassica campestris, vyznačujúcej sa tým, že obsahuje jadro Brassica a tým, že cytoplazma obsahuje Brassica chloroplasty, ktoré sú zlučiteľné s genómom jadra a mitochondriami obsahujúcimi DNA sekvenciu, ktorá kóduje CMS charakter ako je uvedené.

Brassica campestris zodpovedá repke, turíne a čínskej, pekingskej a japonskej kapuste.

Tento vynález sa podobne týka rastlín, ktoré sú vybrané zo skupiny skladajúcej sa z B.juricea, B. migra, B. hirta a B. carinata, vyznačujúcich sa tým, že obsahujú Brassica jadro a tým že cytoplazma obsahuje Brassica chloroplasty, ktoré sú zlučiteľné s jadrovým génom a mitochondriami obsahujúcimi DNA sekvenciu, ktorá kóduje CMS charakter ako je uvedené.

Podľa iného aspektu tohto vynálezu je predmetom tohto vynálezu rastlina patriaca k rodu Brassica, ktorého jadrový genóm obsahuje definovanú Ogurovú sterilnú sekvenciu a tiež prvky, ktoré ovplyvňujú jej expresiu a transport transplačného produktu do mitochondrie. Táto rastlina môže patriť k jednému z nasledujúcich druhov: B. napus, B. oleracea, B. campestis, B. nigra, B. Juncea, B. hirta a B. carinata.

Prítomnosť „Ogurovej sterilnej sekvencie“ je nutná a postačujúca na vyvolanie úplnej neprítomnosti peľu v neprítomnosti reštauračných génov („restorer genes“). Opelenie týchto rastlín sa uskutočňuje normálne ako dôsledok dobrej produkcie nektáru.

Morfológia samičích orgánov je normálna a vytvorené plody (šešule) obsahujú normálny počet semien. Obrázok 5 ukazuje morfológiu, ktorá bola pozorovaná u normálnej kontrolnej rastliny /z/, rastliny inou morfológiou, ktorá nesie celý Ogurový génom /z/6// a Brassica oleracea chloroplasty, rastliny kapusty nesúce Brassica napus chloroplasty a samčie sterilné mitochondrie s Brassica napus génmi IzJAJI a rastliny nesúce Brassica oleracea chloroplasty a rekombinantné mitochondrie už neobsahujúce nežiaduce sekvencie /z/9Z a z /17//. Tieto rastliny majú nasledujúce vlastnosti:

Tabuľka 1

Produktivita línie z (hlávkovej kapusty) s rôznymi cytoplazmami cytoplazma genotypy poebi«ran4 eemenA chloroplasty mitochondri·

B. oleracea B. oleracea /z/ /plodná kontrola/ g/raetlina

53,1

B. napus

6. oleracea

B. oleracea

Ogura /«C/

Ogura/napus

Ogur*

Ogura

Ogurazoleracea /zA/ /x6/ /zO/ /z9 lebo zl7/

22,7

9,3

Genotyp:	Chloroplasty:	Mitochondrie:
z	B. oleracea	B. oleracea
z /A/	B.napus	B. napus/Ogura
z /6/	B. oleracea	Ogura
z/9/	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
z/17/	B. oleracea	B. oleracea/Ogura

Tabuľka 2

Produktivita línie Darmor (ozimná repka) s rôznymi cytoplazmami * výnos * samčie plodné a samčie sterilné /Fu/ ozimná repka Darmor

Genotypy z /A/ a z /6/ nemajú vhodný cytoplazmový samčí sterilný systém.

Takéto rastliny sa môžu získavať napríklad technikami napojovania protoplastov alebo všetkými inými technikami, ktoré vedú k dobrej rekombinácii medzi mitochondriovým genómom druhov, o ktoré ide, a ogurovým mitochondriovým genómom. V takýchto rastlinách je plodnosť obnovená reštauračným („restorer“) génom, na ktorý sa odkazuje ako na Rfl, ktorý pochádza z reďkovky, ktorá nie je prípadom rastlín, ktoré nesú celý nevhodný mitochondriový génom. Takéto rastliny sa môžu získavať tiež prirodzenou alebo umelou sexuálnou reprodukciou.

Rastliny, ktoré nesú mitochondriový genóm podľa tohto vynálezu, sa môžu získavať tiež prenosom génov do mitochondrie.

Vo všetkých prípadoch nesú tieto rastliny vhodný CMS systém, menovite:

- úplnú samčiu sterilitu,

- morfológiu, ktorá umožňuje dobré opelenie a dobrú produkciu semien ako je to uvedené v tabuľke 1 a tabuľke 2.

Tento vynález sa teda týka tiež spôsobu prípravy hybridných rastlín, vyznačujúcich sa tým, že rastlina, ktorá nesie vhodný CMS charakter, ktorý obsahuje Ogurovú sterilnú sekvenciu vo svojom mitochondriovom alebo jadrovom genóme, sa skríži s normálnou rastlinou v prípade jedlých alebo kŕmnych plodín alebo s rastlinou poskytujúcou gén reštaurujúci plodnosť, Rfl, v prípade, že sa majú zbierať semená. Tento vynález sa tiež týka hybridných rastlín, ktoré sa získavajú podľa tohto spôsobu.

Všeobecne povedané, najlepšie agronomické vlastnosti sa získajú so samčími sterilnými rastlinami, ktoré nesú chloroplasty rovnakého druhu ako je jadro a s mitochondriami, ktoré nesú vhodný samčí sterilný systém.

Tabuľka 1 ukazuje produktivitu línie kapusty s rôznymi cytoplazmami (vhodné sú genotypy Z9 a Z17). Tabuľka 2 ukazuje produktivitu línie repky s rôznymi cytoplazmami (vhodné sú genotypy Fu 27,Fu 58 a Fu 85).

výnos

DARHOR/ chloroplaty mitochondrie

DARMOR

Fu 27

Fu 58

Fu 77

Fu 118

1OO / 35 q/

118

120

114

103

B. napus

B. napuB

B. napus

B. campeetris

B. napus

B. napue

B. napus/Ogura

B. napue/Ogura

Ogura

B. hapua/Ogura

B. napus/Ogurj

BIENVENU 108

JET NEUF 09

Zlo2ky výnosu /Clermont-Ferrand/

NSq Víl

DARMOR 7183

BIENVENU 7334

JET NEUF 7977

DARMOR:

Fu 27

Fu 58 q NSdPSq NSd VŕlSd TDM Hl

YLD HT €7

9,9 70028

4,31 1077

0,256

31,6

120

11,2 8184.

0.269

30.7

109

9292

8617

8389

67291

0,262

33,3

115

11.6 106188

4,08

1337

O, 293

42,2

11,7

11,0

99947

92428

3.65

4,11

1229

0. 27

36,n

31

1243

0,276

32

Nsq: počet šešúľ na m²

WlSq: hmotnosť jednej šešule (mg) NSdPSq: počet semien na šešuli NSd: počet semien na m²

WlSd: hmotnosť jedného semena (mg) TMD celkový suchý materiál (g/m²) Hl: žatevný index (%) YLD: výnos (q/ha) HT: výška (cm) * Tieto rastliny plodili deformované plody (šešule)

Predmetom tohto vynálezu je tiež sonda, ktorá obsahuje sekvenciu aspoň desiatich blokov, výhodne 15 blokov, sekvencie naviazanej na nukleotidy označené 928 a 1559 z obrázka 1. Táto sonda môže byť označená napríklad rádioaktívnym nukleotidom alebo akýmkoľvek iným prostriedkom, ako je napríklad fluorescencia. Táto sonda sa môže používať na demonštrovanie samčej sterility. Zvlášť môže byť používaná pri selekcii klonov.

Niektoré vlastnosti a výhody tohto vynálezu budú jasnejšie ukázané v nasledujúcich príkladoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Demonštrovanie DNA sekvencie, ktorá je zodpovedná za Ogurovú cytoplazmatickú samčiu sterilitu.

1. Rastlina

Pojem „Cybrid“ označuje formy, ktoré sa získajú napojením izolovaných protoplastov s nasledujúcou generáciou celej rastliny. Tento spôsob umožňuje, aby cytoplazmová informácia pochádzajúca z oboch rodičov bola v bunke zmiešaná. Cybrid č. 13 bol získaný z B20 rastlín generovaných napojením protoplastov medzi Ogura-cms, B. napus cybridom odolným na triazin (progen. cybridu 77 je opísaný v práci Pelletiera a kol.: 1993 a Chetrita a kol. 1985) na triazin citlivú a plodnú odrodu pôvodu Brutor. Test odolnosti na triazin (Ducret a Gaguez, 1978) uskutočnený na vzorke listov každého regeneranta umožňoval stanoviť typ chloroplastu (na triazin rezistentný s chloroplastmi pochádzajúcimi z predka 77 a na triazin citlivé chloroplasty pochádzajúce z línie Brutor). Tieto rastliny boli kultivované. Bol pozorovaný stupeň kvetu. Ako cybridy sa vyberú tie rastliny, ktoré majú nerodičovské kombinácie (buď citlivý) samčí sterilný alebo rezistentný (samčí plodný). Cybrid č. 13 bol typu citlivý/samčí sterilný. Cybrid č. 1 bol typu rezistentný/samči plodný.

2.Izolácia nukleovej kyseliny

Z listov, ktoré pochádzajú z rastlín starých štyri týždne sa izoluje celková DNA podľa spôsobu, ktorý opísal Dellaporta (1983). Mitochondriová DNA bola extrahovaná z listov rastlín starých osem týždňov postupom podľa Vedela a Mathieu (1982) s nasledujúcimi variantmi:

Mitochondrie neboli pred lýzou čistené na sacharózovom gradiendu, lýza bola prevádzaná v 4 % sarkosylu s 0,5mg/ml proteinázy k (Boehringer Mannheim GmbH) v 50mM Tris o pH 8 s 20mM kyseliny ethylendiaminotetraoctovej (EDTA). Po vyzrážaní sa mitochondriová kyselina DNA vyčistí odstereďovanim v gradientu ethidiumbromid/chlorid cesný /spôsob 1 podľa Vedela a Mathieu, 1982 v poallomemej skúmavke na odsteďovanie.

Celková DNA bola izolovaná z listov kvetných pupenov podľa spôsobu, ktorý opísal Longermann a spol. (1987).

Mitochondriová DNA bola extrahovaná z rastlín karfiolu starých 8 týždňov podľa spôsobu opísaného Stemem a Newtonem (1986).

3. Reštrikčná analýza mitochondriovej DNA a elektroforéza na agarosovom gélu

Reštrikčná analýza mitochondriovej DNA a elektroforéza na agarosovom géli sa prevádza podľa postupu, ktorý opísal Pelletier a spol. (1983). Celková alebo mitochondriová ENA bola nanesená na elektroforézové gély obsahujúce formaldehyd, ako je to opísané Sambrookem a spol. (1989).

4. Hybridizácia

Prenos DNA alebo RNA na nylonové filtre (Hybond - N,Amersham) sa prevádza kapilárnou absorpciou s 6x SSC alebo lOx SSPE podľa pokynov výrobcu. Predhybridizácia a hybridizácia sa prevádza podľa Amershama s použitím sond označených označeným systémom multiprimerovej DNA (Amertham) po vyčistení na kolónach s Sephadexem G-50 (Sambrook a spol., 1989).

5. Klonovanie mitochondriovej DNA

Skonštruujú sa dve genómové banky samčích sterilných (13-7) a reventantných (13-6) cybridových línií vo vektore fagilambda EMBL3 kultivovanom na reštriktívnom (nepermisívnom) E, coli kmeni NM 1539 (Frischauf a spol. 1983). Bolo získané približne 2,5 x 10⁴ klonov na mikrogram mitochondriovej DNA.

Banky mitochondriovej DNA boli analyzované a vyseté, aby bolo možné izolovať plaky. Tie sa potom prenesú na nylonové filtre, ako je to opísané v práci Sambrooka a spol. (1989). Hybridizačná sonda použitá na testovanie dvoch bánk mitochondriovej DNA bola pripravená nasledujúcim spôsobom: fragment mitochondriovej DNA špecifický pre cms sa eluuje Gene clean TM postupom (BIO 101 INC.) zo štiepneho produktu mitochondriovej DNA naneseného preparatívny agarosový gél. Eluovaná DNA sa potom označí (labeluje) ako to bolo opísané.

Extraxie lambda DNA, subklonovanie fragmentu Ncol s 2500 pármi nukleotidov do miesta Ncol plasmidu pTrc99A (Amann a spol.,1988) a extrakcia plasmidovej DNA sa prevádza podľa protokolu Sambrooka a spol., 1989. Rekombinantné plazmidy sa zavedú do E. coli kmene NM522 (Gough aMurray, 1983).

6. Genetická štúdia cybridu 13 ajeho potomstva

V prvej generácii potomkov získaných opelením cybridu 13 Brutorem, skladajúci sa z 13 rastlín, 5 rastlín bolo úplne samčích sterilných (vrátane rastlín 13-5 a 13-7), jedna bola samčia plodná (č. 13-6) a 7 bolo skoro úplne sterilných s niekoľkými samčími plodnými kvetmi.

Plodná rastlina 13-6 sa samoopelí a skríži sa s Butorom. V oboch prípadoch sa získajú len plodné rastliny (43, respektíve 42).

Pri krížení medzi samčou sterilnou rastlinou č. 13-7 a Brutorom je 24 potomkov úplne sterilných a 6 nesie niekoľko plodných kvetov, čo je podobný výsledok ako ten, ktorý bol získaný s cybridom samotným. Rastlina 13-2 bola skrížená s reštauračnou („restorer“) líniou RF, ktorá je heterozygotná pre špecifické reštauračné gény („restores genes“) pre Ogurovú samčiu sterilitu (Chétrit a spol., 1985). Potomstvo z tohto skríženia sa skladá z 53 nasávacich sterilných rastlín, 37 samčích plodných rastlín a 9 rastlín, ktoré sú takmer úplne sterilné, aj keď nesú niekoľko plodných kvetov. Tieto výsledky ukazujú na to, že samčie sterilné rastliny cybridnej čeľade 13 obsahujú Ogura-cms determinant, podobne ako iné skôr študované cybridy s jednoduchším reštauračným profilom (Chétrit a spol., 1985).

V tomto stupni štúdia môže dôjsť ku dvom možnostiam: buď cybrid 13 obsahuje zmes „samčí plodný“ a „samčí sterilný“ mitochondriové genómy a to umožňuje vybrať ďalej čistenie pre oba fenotypy, alebo cybrid 13 obsahuje rekombinantný mitochondriový génom nestálej štruktúry, ktorý sa mení späť na stabilnejšiu „plodnú“ konfiguráciu a potom by bolo nemožné zachovať homogénny samčí sterilný fenotyp v nasledujúcich generáciách.

Samčie sterilné rastliny získané z potomstva samčej sterilnej rastliny č. 13-7 boli získané tak odrezkami ako sexuálnym skrížením s Butorom. Po rôznych počtoch generácií (jedna až päť) pri oboch metódach všetky čeľade poskytujú plodné rastliny. Oproti tomu úplne plodné rastliny získané týmto spôsobom nikdy neposkytujú opäť sterilné rastliny.

Vo svetle týchto výsledkov je možno uvažovať o tom, že správnym bude druhé navrhnuté vysvetlenie, to znamená, že cybrid 13 nesie nestabilný mitochondriový génom, ktorý stráca determinantu Ogura-cms počas procesu, ktorý vedie k „plodnej“ konfigurácii, bez možnosti návratu ku sterilnému fenotypu.

7. Porovnanie medzi mitochondriovými DNA samčích sterilných a plodných potomkov. Izolácia fragmentu špecifického pre samčiu sterilnú rastlinu

Mitochondriová DNA sa extrahuje z listov samčieho sterilného 13-7 progenu a z plodného potomstva (progen 13-6 alebo 13 - 7). Rozštiepi sa pôsobením niekoľkých reštrikčných enzýmov, aby bolo možné vyrovnať ich reštrikčné profily. Mitochondriové genómy týchto dvoch typov sú veľmi podobné, preto nie je možné pozorovať žiadny rozdiel medzi reštrikčným profilom samčej sterilnej mitochondrie a plodných revertantov použitím rôznych enzýmov. Ale v reštrikčnom profile mitochondriovej DNA samčích sterilných rastlín, ktoré boli rozštiepené pôsobením Nrul, bol delegovaný reštrikčný fragment so 6800 pármi nukleotidov. Tento fragment nebol nikdy pozorovaný pri súhlasných profiloch plodných relevantov.

Tento fragment /na ktorý je odkazované ako na N6.8/ bol eluovaný z aragosového gélu, označený (labelovaný) a použitý ako sonda na Nrul reštrikčné profily mitochondriovej DNA: pri každom samčom sterilnom potomstve cybridu 13 bol pozorovaný veľký signál s 6800 pármi nukleotidov, zatiaľ čo žiadny signál tejto veľkosti sa nehybridizoval so sondou v genóme mitochondrie plodných revertantov. A navyše, sonda N6.8 sa hybridizuje fragmentom s 6800 pármi nukleotidov v Ogurovom mitochondriovom DNA rozštiepenom pôsobením Nrul, ale nie v Brassica napus cv Brutor, čo ukazuje na Ogura pôvod tohto fragmentu.

Lambda banka, ktorá obsahuje mitochondriové DNA extrakty pochádzajúce zo samčích sterilných rastlín (13 - 7),bola testovaná eluovaným značeným fragmentom. Z ôsmich hybridizujúcich klonov boli izolované dve rekombinantné fágy obsahujúce celý N6.8 fragment a priľahlé sekvencie. Bola získaná podrobná reštrikčná mapa tejto oblasti. Hybridizácia reštrikčných profilov mitochondriovej DNA pochádzajúci z plodného a sterilného potomstva hybridu 13 s N6.8 ako sondy umožňuje, že oblasť špecifická pre samčí sterilný genotyp je obmedzený na Ncol fragment s 2500 pármi nukleotidov.

Ncol fragment s 2500 pármi nukleotidov sa označí a použije sa ako sonda na mitochondriovú DNA pochádzajúcu zo 13 - 7 a 13 - 6 potomstva rozštiepenej pôsobením Ncol. Vedľa signálu s 2500 pármi nukleotidov, ktorý je špecifický pre samčí sterilný profil, hybridizuje sa niekoľko Ncol fragmentov tak v plodných revertantovaných, ako i samčích sterilných profiloch. Týmito fragmentmi sú fragmenty s 2200, 10000 a 14000 pármi nukleotidov. Ncol fragment s 2700 pármi nukleotidov sa silne hybriduzuje v mitochondriovom genómu plodného potomstva, ale nie mitochondriovom genóme sterilného potomstva. Analýza tohto hybridizačného profilu vedie k záveru, že Ncol fragment s 2500 pármi nukleotidov, aj keď špecifický pre samčiu sterilnú mitochondriovú DNA, obsahuje sekvencie, ktoré sa opakujú inde v mitochondriovom genóme (na fragmentoch s 2200, 10000 a 14000 pármi nukleotidov po štiepení Ncol). Tieto opakované sekvencie sú prítomné tiež mitochondriovej DNA plodných relevantov vedľa špecifického fragmentu s 2700 pármi nukleotidov.

Celková RNA sa extrahuje z listov alebo pupeňov potomstva hybridov 13 alebo zo samčích sterilných alebo plodných hybridov (pochádzajúcich z iných spojovacích pokusov) a Brutovovej línie. Prevedie sa Nothemovo blotovanie a bloty sa hybridizujú so sondou zodpovedajúcou insertu lambda klonu, ktorý obsahuje N6.8 opísaný v príklade 3. Hlavný transkript s 1400 pármi nukleotidov sa de deguje vo všetkých samčích sterilných cybridoch vrátane cybridu 13-7, zatiaľ čo žiadny transkript s touto veľkosťou nebol pozorovaný v Brutorovej línii alebo vo dvoch plodných cybridoch (rozdiel od 13) navyše, plodné rastliny nesú transkript s 1100 pármi nukleotidov, ktorý sa hybridizuje so sondou, ktorá nie je prítomná, alebo je prítomná vo veľmi nízkej hladine pri všetkých samčích sterilných hybridoch, ktoré boli testované. Niekoľko transkriptov všeobecných pre všetky vzorky sa hybridizujú slabo so sondou kvôli značnej veľkosti značeného insertu. Tým bolo potvrdené, že mitochondriové transkripty sa môžu detegovať vo vzorcoch celkovej RNA hybridizáciou rovnakého Northenovho blotu s DNA fragmentom, ktorý obsahuje sekvenciu génu atpa.

Rovnaký špecifický transkript s 1400 pármi nukleotidov bol nájdený v Ogurovom mitochondriovom RNA extrahovanom z karfiolu, s použitím Ncol fragmentu s 2500 pármi nukleotidov ako sondy. Presné hranice tohto transkriptu boli stanovené pomocou subklonov Ncol fragmenta s 2500 pármi nukleotidov ako sondy.

8. Štúdia cybridu 1 a jeho potomstva

Cybrid 1 bol samčí plodný. V jeho potomstve rastlina 1.12 bola plodná a rastlina 1,18 bola sterilná. Rastlina 1.12 poskytla vo svojom potomstve sterilné rastliny (S₃) a plodné rastliny (RF₃). Rastlina 1.10 poskytla sterilné rastliny (S₃) a plodnú vetvu (RF2)· Rastliny S₂ a S₃ sú reštaurované rovnakým jadrovým génom, ktorý obsahuje peľovú plodnosť ako sterilný cybrid 13.

Pri hybridizácii s označeným Ncol fragmentom s 2500 pármi nukleotidov neposkytuje mitochondriová DNA z rastlín S₂ a S₃ žiadny signál 2500 pármi nukleotidov pri štiepení pôsobením Ncol ani žiadny signál 6800 pármi nukleotidov pri štiepení pôsobením Nrul.

Podobne hybridizácia celkovej RNA (Northemovo biotovanie) so sondou zodpovedajúcou ORFB sekvencie neposkytuje signál i s 1400 pármi nukleotidov, ako tomu dochádza pri sterilnom cybride 13. Oproti tomu sonda zodpovedajúca sekvencii, ktorá je naviazaná na nukleotidy 928 a 1569 na obrázku 1 poskytuje signál pri Northemovom blotovaniu pri približne 1300 pároch nukleotidov. Tento signál nie je prítomný pri RNA z rastlín RF], RF₂, RF₃ alebo Brutor. Podobne je možné túto T sekvenciu (928 až 1569) použiť ako sondu pri bodkovanom blotovaní celkovej RNA. V tomto prípade poskytujú signál len samčie sterilné rastliny, a to každá z nich.

Tieto výsledky ukazujú, že rastliny S₂ a S₃, aj keď ide o samčie sterilné rastliny, nezachovávajú sekvenciu nukleotidov uvedenú na obrázku 1 vo svojej pôvodnej konformácii a ďalej, že v tejto sekvencii časť naviazaná na nukleotidy 928 a 1569 je tou časťou, ktorá nesie špecifickú determinantu „Ogurovej sterility“, čo spôsobuje, že rastliny sú samčími sterilnými rastlinami, ak je táto sekvencia transkribovaná.

Táto sekvencia nemá žiadnu podstatnú homológiu so sekvenciami, ktoré sú prítomné v databankách.

Príklad 2

Demonštrácia nežiaducich sekvencii v Ogurovom mitochondriovom genóme.

Pri druhoch Brassica napus bola napojením protoplastov medzi repkou, ktorá nesie Ogurovú cytoplazmu, a normálnou repkou získaná zbierka cybridov. Prvý typ repky je samčí sterilný, deficitný na chlorofyl za nízkej teploty, zatiaľ čo druhý typ repky je normálny zelený a plodný. Cybridy boli rozdelené na tie, ktoré boli z regenerovaných rast lín a na tie, ktoré boli zo samčích sterilných adaptovanou normálnou zeleňou.

Rovnakým spôsobom sa získa zbierka cybridov a druhov Brassica oleracea napojením protoplastov medzi kapustou nesúcou Ogurovú cytoplazmu a normálnou kapustou. Tieto cybridy boli samčie sterilné normálnou zeleňou adoptovanou z regenerovaných rastlín.

Tieto cybridy boli skrížené rôznymi odrodami v prvom prípade repky a v druhom prípade kapusty. Kríženie bolo opakované v každej generácii s rovnakými odrodami, takže sa získa definovaný genotyp blízky opakujúcej sa odrode.

Tieto rôzne odrody, konvertovane cytoplazmami rôznych cybridov, boli podrobené agronomickým testom, ktorými sa merala produkcia semien, ktorá závisí od niekoľkých faktorov: dostatočnej produkcie nektáru tak, aby sa uskutočnilo opelenie hmyzom, a normálnej morfológie kvetov, aby toto opelenie bolo účinné a plody sa normálne vyvíjali.

Zbierka cybridov by sa teda mohla rozdeliť na dve skupiny:

skupinu cybridov, ktoré nesú samčiu sterilitu a ktoré sú vhodné na komerčnú produkciu semien a skupinu cybridov, ktoré nenesú všetky vlastnosti priaznivé pre dobrú komerčnú produkciu semien.

Napríklad cybridy repky č. 27, 58 a 85 a cybridy kapusty č. 9, 17, 21, 24 a 27c patrí do prvej skupiny.

Napríklad cybridy repky č. 23s, 77 a 118 a cybridy kapusty č. 1, 6 a 14 patri do druhej skupiny.

Celková DNA týchto cybridov sa podrobí enzymatickému štiepeniu pôsobením Sali, Ncol,NruI, BglI, Pstl a Kpnl. Získavané Southemové bloty boli hybridizované s rôznymi mitochondriovými sondami Atpa, Cob, Coxl, Atp6, 265 a 185 a s dvomi fragmentmi Ogura genómu, s fragmentom s 2500 pármi nukleotidov odvodených od štiepenia pôsobením Ncol a fragmentom s 19400 pármi nukleotidov odvodených od štiepenia pôsobením Nrul.

Tieto dve skupiny cybridov sa líšia v tom, že: a/ č. 23s, 77 a lis pri repke a 1, 16a 11 pri kapuste nesú vlastnosť Ogura genómu, ktorá obklopuje coxl gén, rozpoznateľný BglI fragmentom s 10700 pármi nukleotidov a Nrul fragmentom s 11000 pármi nukleotidov, a oblasť Ogura genómu, ktorá obklopuje jeden formilmetioninových transférových RNA génov, ktorý je rozpoznateľný Sali fragmentom s 5100 pármi nukleotidov a Nrul fragmentom s 15000 pármi nukleotidov, b/ č. 27, 58 a 85 pri repke a 9, 17, 21,24 a 27c pri kapuste nenesú zodpovedajúcu oblasť, ktoré boli nahradené, ako výsledok rekombinácie medzi genómom dvoch rodičov, ktoré boli spojené analogickými oblasťami mitochondriového genómu repky v č. 27, 58 a 85 a kapusta v č. 9, 17, 21, 24 a 27c.

Z tohto je možné odvodiť, že tieto dve oblasti Ogurovho genómu sú nežiaduce, ak je žiaduce mať samčí sterilný systém, ktorý by bol vhodný na komerčnú produkciu semien.

Príklad 3

Tento príklad ilustruje hodnotu poznania frekvencie „Ogurovej samčej sterility“ a nežiaducich sekvencií pre možnosť bezprostredného rozlíšenia získaných cybridov bez toho, aby bolo treba čakať niekoľko rokov na opätovné kríženie a na agronomické testy.

Protoplasty Brassica napus, ktoré nesú Ogurovú cytoplazmu, sa spoja s protoplastmi druhu Brassica, o ktoré ide. Kolónie odvodené od tohto napojenia sa kultivujú in vitro a nechajú sa regenerovať na médiu, ktoré podporuje tvorenie pupeňov (pozri Pelletier a spol., 1983).

Opísanou technikou je možné z jedného gramu čerstvého materiálu, buď kalusu, alebo fragmentu regenerovanej rastlinky izolovať celkovú DNA. Po štiepení pôsobením Sali hybridizácie Southemovho typu so sondou naviazanou na nukleotidy Č. 389a 1199 (pozri obrázok 1) by mala dať signál len s veľkosťou 4400 párov nukleotidov (nemala by poskytnúť signál 5100 párov nukleotidov). Podobne by sa po štiepení pôsobením Nrul a hybridizácii so sondou nesúcou Coxl gén mal získať signál pre veľkosť inú než 11000 párov nukleotidov.

Tieto hybridizácie umožňujú predpovedať, že získaná rastlina bude skutočne samčou sterilnou rastlinou a že bude vhodná na komerčnú produkciu semien.

Príklad 4

Tento príklad je variantom príkladu 3. Ja založený na myšlienke previezť sexuálne kríženie medzi dvoma rodičmi za špeciálnych podmienok alebo patričnými genotypmi miesto spojenia protoplastov. Výsledkom je to, že na rozdiel od známych procesov oplodňovania rastlín sa zmiešajú cytoplazmy oosféry a trubičiek peľu alebo samčie gamety. Keby bola takáto metóda opísaná, bolo by možné rovnakým spôsobom previezť roztriedenie mladých rastlín odvodených z týchto umelých oplodnení použitím rovnakých sond a rovnakých kritérií ako v príklade 3.

Príklad 5

Tento príklad ilustruje hodnotu znalosti sekvencie Ogurovej sterility pri typu genetickej manipulácie, ktorá už bola opísaná pri kvasinkách (Johnston a spol., 1988).

Začína sa s normálnou rastlinou Brassica. Meristémy alebo také bunky in vitro sa bombardujú mikročasticami obalenými DNA, ktorá nesie sekvenciu Ogurovej sterility. Takto získané rastliny v potomstve spracovaných meristémov alebo regnerovaných rastliniek budú cytoplazmové samčie sterilné rastliny, ak DNA bola schopná vstúpiť do mitochondrie a integrovať sa do genómu týchto organelií. Tento postup sa vyhýba problémom, ktoré sú tvorené nežiaducimi sekvenciami, ak sú v tomto postupe zahrnuté Ogurové redkvičkové chloroplasty alebo sekvencie takto definovaného Ogurovho mitochondriového genómu.

Príklad 6

Tento príklad ilustruje hodnotu znalosti sekvencie „Ogurovej sterility“ pri konštrukcii jadrovej namiesto cytoplazmovej samčej sterility potvrdzujúcej Mendelovskú dedičnosť spôsobom genetického inžinierstva.

Začína sa mitochnondriovou DNA sekvenciou naviazanou na nukleotidy 928 a 1569. Skonštruuje sa chimémy gén. Ten sa transkribuje, po genetickej transformácii buniek Brassica alebo buniek iného rodu, do jadra buniek získaných transformovaných rastlín. Ak chimémy gén obsahuje presekvenciu, ktorá umožňuje, aby jej proteínový translačný produkt bol importovaný do mitochondrie, budú tieto transformanty samčie sterilné. Tento charakter sa stane dominantnou Mendelovskou vlastnosťou.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA sekvencia Ogurovej sterility, ktorá je

a) tvorená DNA sekvenciou vymedzenou nukleotidmi č. 928 a 2273 z obr. 1, alebo

b) má aspoň 50 % homológiu so sekvenciou uvedenou v a), a ktorá, ak je prítomná v mitochondriálnom alebo jadrovom genóme rastliny, udeľuje cytoplazmovú samčiu sterilitu tejto rastline.
2. DNA sekvencia podľa nároku 1, ktorá je tvorená sekvenciou vymedzenou nukleotidmi č. 928 a č. 1569 z obr. 1, alebo ktorá má aspoň 50 % homológiu s touto sekvenciou, a ktorá je transkribovaná na RNA v mitochondriách rastlín so samčou sterilitou.
3. Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm, ktorý obsahuje DNA sekvenciu Ogurovej sterility pozostávajúcu

a) z DNA sekvencie vymedzenej nukleotidmi č. 928 a č. 1 569 z obr. 1, alebo

b) zo sekvencie, ktorá má aspoň 50 % homológiu so sekvenciou uvedenou v a), a ktorá, ak je prítomná v cytoplazme rastliny, udeľuje cytoplazmovú samčiu sterilitu tejto rastline, s vylúčením celého mitochondriálneho Ogurovho genómu.
4. Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa nároku 3, ktorý obsahuje DNA sekvenciu Ogurovej sterility tvorenú sekvenciou vymedzenou nukleotidmi č. 928 a č. 1569 z obr. 1, alebo sekvenciou, ktorá má aspoň 50 % homológiu s uvedenou sekvenciou.
5. Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochonriálny genóm podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 a 4, ktorý neobsahuje celý alebo časť jedného a/alebo druhého z dvoch fragmentov Ogurovho genómu,

- ktoré sú tvorené jedným z dvoch génov pre formylmetionínovú transférovú RNA použitého na iniciáciu translácie,

- ktoré sú tvorené coxl génom kódujúcim podjednotku č. 1 cytochrómovej oxidázy, alebo v ktorých sú tieto fragmenty inaktívne.
6. Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 5, ktorý jc zbavený časti sekvencie, ktorá je tvorená fragmentom 10,7 kb po štiepení pôsobením BglI a fragmentom 11 kb po štiepení pôsobením Nrul, pričom tieto fragmenty sú odhalené hybridizáciou so sondou coxl.
7. Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 6, ktorý je zbavený časti sekvencie, ktorá poskytuje fragment 15 kb po štiepení pôsobením Nrul, fragment 5.1 po štiepení pôsobením Sali a fragment 18.5 po štiepení s BglI, a ktorý je odhalený hybridizáciou so sondou zodpovedajúcou sekvencii tvorenej bázami 389 a M 99 sekvencie z obr. 1.
8. Rekombinantný rastlinný jadrový alebo mitochondriálny genóm podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 7, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá poskytuje fragment 2,5 kb po štiepení pôsobením Ncol, fragment 6,8 po štiepení Nrul a fragment so 4,4 kb po štiepení pôsobením Sali.
9. Jadrový genóm, ktorý obsahuje okrem DNA sekvencie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, presekvenciu umožňujúcu zavedenie produktu translácie tejto sekvencie do mitochondrií.
10. Genóm podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 8, ktorý je mitochondriálnym genómom.
11. Mitochondria, ktorá obsahuje genóm podľa nároku 10.
12. Cytoplazma, ktorá obsahuje mitochondriálny genóm podľa nároku 10 a chloroplasty toho istého druhu ako je jadrový genóm alebo iného druhu, ale ktoré sú zlučiteľné s týmto jadrovým genómom.