PL169149B1

PL169149B1 - Method of obtaining planets exhibiting cytoplasmic male sterility

Info

Publication number: PL169149B1
Application number: PL91309865A
Authority: PL
Inventors: Sandrine Bonhomme; Francoise Budar; Dominique Lancelin; Georges Pelletier
Original assignee: Agronomique Inst Nat Rech
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 1996-06-28
Also published as: EP0909815B1; ES2307308T3; FR2667078B1; HU9300801D0; AU652964B2; IE20020681A1; RU2117704C1; IE913320A1; ATE396257T1; KR930702520A; CA2092097C; SK284748B6; JPH06501613A; DE69132878T2; ATE211170T1; JP2001145497A; PT99024A; PL168666B1; HU215494B; FR2667078A1

Abstract

Sposób otrzymywania roslin wykazujacych ceche cytoplazmicznej sterylnosci meskiej, znamienny tym, ze prowadzi sie fuzje protoplastu zawierajacego w genomie jadrowym lub mitochondrialnym sekwencje DNA sterylnosci Ogury, która zawiera a) sekwencje ograniczona nukleotydami o numerach 928 i 1569 z fig. 1 lub b) sekwencje wykazujaca co najmniej 50% homologii z sekwencja wymieniona w punkcie a), i gdy jest obecna w cytoplazmie rosliny, nadaje wymienionej roslinie cytoplazmiczna sterylnosc meska z wyjatkiem calego genomu mitochond- rialnego Ogury, z protoplastem nie zawierajacym tej sekwencji. P L 169149 B 1 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania roślin wykazujących cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej. Materiał biologiczny, posiadający cechę sterylności męskiej przydatny jest do opracowywania odmian hybrydowych gatunków mających znaczenie w agronomii.

W szczególności sposób według wynalazku dotyczy otrzymywania roślin należących do rodziny krzyżowych, których cytoplazma w komórkach zawiera organella mające sekwencje nukleotydowe, powodujące sterylność męską i korzystne cechy agronomiczne.

Układ cytoplazmicznej sterylności męskiej pozwala na opracowanie nowych odmian hybrydowych, posiadających korzystne cechy agronomiczne. Hybrydy otrzymuje się przez krzyżowe zapłodnienie pomiędzy dwiema populacjami form rodzicielskich, z których jedna odgrywa rolę męską, zaś druga - żeńską. Jednym z wymogów spotykanych przy otrzymywaniu odmian hybrydowych o jednolitej jakości przez krzyżowanie płciowe wykonywane na gatunkach autogamicznych jest zdolność rośliny do samozapylania się. Układy sterylności męskiej pozwalają na otrzymanie roślin żeńskich niezdolnych do samozapładniania, z których po zapyleniu można - bez uciekania się do żmudnych technik, takich jak kastrowanie kwiatów - bezpośrednio zbierać nasiona, które wszystkie są hybrydami.

Pośród genetycznych determinant sterylności męskiej są takie, których nośnikiem jest cytoplazma. W każdym pokoleniu płciowym są one przekazywane wyłącznie przez formę żeńską. Otrzymuje się zatem 100% form męskosterylnych w każdym pokoleniu wraz z układem cytoplazmicznej sterylności męskiej (CMS). Te determinanty genetyczne przenosi genom mitochondrialny.

System cytoplazmicznej sterylności męskiej właściwy dla rodziny krzyżowych jest określony przez poniższe cechy:

1) sterylność męska winna być całkowita, tzn. jakiekolwiek są warunki hodowli i jakakolwiek jest linia, którą chcemy wykorzystać jako formę rodzicielską żeńską, nie powinna występować tam produkcja pyłku. W przeciwnym razie nasiona zebrane z tych roślin żeńskich pochodziłyby częściowo z samozapłodnienia, a zatem nie byłyby typem hybrydy FI.

2) Wytwarzanie tych roślin należy wykonać przy wykorzystaniu naturalnych wektorów pyłka, tzn. w przypadku tych gatunków: błonkoskrzydłych, dwuskrzydłych oraz wiatru. Pyłek powinien być przeniesiony z roślin zapylających na rośliny męskosterylne (żeńskie). W praktyce, jedynie owady mogą zapewnić przeniesienie pyłku na odległość.

Rośliny żeńskie winny zatem być wystarczająco przyciągające dla owadów przylatujących w poszukiwaniu nektaru. Morfologia kwiatów powinna zmusić owada do tego poszukiwania poprzez wierzchołek kwiatu, który umożliwia zasadniczo kontakt z przetchlinką. W praktyce następuje to w ten sposób, że podstawa kielicha powinna utworzyć rodzaj rurki wokół podstawy słupka.

3) Morfologia organów żeńskich (słupek) powinna być identyczna jak w przypadku rośliny płodnej. W szczególności powinien występować pojedynczy słupek w kwiecie i mieć postać prostoliniową. W istocie zdarza się często, że sterylne formy męskie wyrażają się także poprzez

169 149 feminizację pylników, które zmieniają się w pseudosłupki, a nawet przez przekształcenie nektarów w pełnych kwiatach. Zdarza się także, że tam, gdzie zdeformowane są słupki, dotyczy to także produktów. Wszystkie te odchylenia nie pozwalają na prawidłową produkcję nasion i w tym przypadku można mówić o pewnej sterylności żeńskiej.

4) Do wytwarzania odmian hybrydowych FI u gatunków, gdzie zbiera się nasiona, takich jak rzepa lub gorczyce, warunkiem niezbędnym jest, aby forma rodzicielska męska hybrydy całkowicie zlikwidowała efekt sterylnej cytoplazmy męskiej tak, by rośliny hybrydowe mogły być łatwo zapylone.

W przypadku rodziny krzyżowych pierwszy przypadek męskiej cytoplazmy sterylnej, gdzie CMS został opisany przez Ogurę (1968), dotyczył rzodkwi, Raphanus sativus. Bannerot (1974, 1977) przeniósł cytoplazmę Ogury na rodzaj Brassicae, otrzymując w ten sposób rośliny wykazujące cytoplazmiczną sterylność męską. Rośliny te nie miały zadowalających cech agronomicznych (chloroza w czasie obniżenia temperatury, zła płodność żeńska) i ich zła wydajność czyniła je nieodpowiednimi do wykorzystania handlowego.

Dla uniknięcia chlorozy u roślin z rodziny krzyżowych użyteczne jest połączenie w tej samej komórce genomów jądrowych oraz chloroplastowych tego samego rodzaju. Stąd też rośliny rodzaju Brassicae posiadające jeden z genomów chloroplastycznych nie wykazują już chlorozy. W przypadku, gdy posiadają całość genomu mitochondrialnego- Ogury, charakteryzują się pełną cytoplazmiczną sterylnością męską, lecz równocześnie morfologia kwiatów będzie wykazywać odchylenia, co sprawi, że ich zapylenie przez wektory naturalne będzie niemożliwe. Poza tym w przypadku gatunków, których nasiona mają znaczenie, użyteczne jest przywrócenie płodności męskiej odmian hybrydowych za pomocą genów jądrowych, zwanych restauratorami.

Przywrócenie płodności męskiej w -przypadku roślin posiadających całość genomu mitochondrialnego Ogury jest rzeczą trudną, ponieważ należałoby równocześnie wprowadzić do działania szereg genów-restauratorów.

Celem wynalazku było opracowanie sposobu otrzymywania roślin wykazujących cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej przez zastosowanie odpowiedniego układu sterylności męskiej przez eliminację genów odpowiedzialnych za cechy niepożądane w cytopiazmie Ogury, utrzymując efekytwną i łatwą do przywrócenia sterylność męską.

Sposób otrzymywania roślin wykazujących cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej według wynalazku polega na tym, że prowadzi się fuzję protoplastu zawierającego w genomie jądrowym lub mitochondrialnym sekwencję DNA sterylności Ogury, która zawiera a) sekwencję ograniczoną nukleotydanii 'o numerach 928 i 1569 z fig. 1 lub b) sekwencję wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją wymienioną w punkcie a), i gdy jest obecna w cytopiazmie rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską z wyjątkiem całego genomu mitochondralnego Ogury, z protoplastem nie zawierającym tej sekwencji.

Sekwencja DNA, którą nazywa się „sterylnością Ogury“ ma następujące wyróżniające ją cechy:

a) nośnikiem jej jest sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1 lub

b) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie

a) i w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym bądź jądrowym rośliny zapewnia u wspomnianej rośliny cytoplazmiczną sterylność męską.

W szczególności sekwencja DNA „sterylności Ogury“ stosowana w sposobie według wynalazku wykazuje ponadto dwie następujące cechy:

c) nośnikiem jej jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 lub

d) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie c), a także charakteryzuje się tym, że jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych.

Wynalazek zilustrowano na rysunkach, na których: fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA mitochondrialnego z rzodkwi Ogury, noszącą cechę CMS,' fig. 2 - mapę restrykcyjną fragmentu DNA mitochondralnego opisanego w fig. 1, fig. 3 - elektroforezę DNA mitochondrialnego po trawieniu przez Bgll (3a) i Nrul (3b). Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą CoxI. (Hiesel et al, 1987), fig. 4 - elektroforezę DNA mitochondrialnego po trawieniu przez SA II. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą ograniczoną przez

169 149 nukleotydy 389 i 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1, fig. 5 - owoce wytworzone przez kapusty posiadające różne genomy cytoplazmiczne, fig. 6 - elektroforezę RNA mitochondrialnego. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą, fragment EcoRI-BAM HI, włączającej część sckwcucji nazywanej orf B.

Sekwencja DNA „sterylności Ogury jest określona przez odniesienie do sekwencji ograniczonej numerami 1 i 2428 na fig. 1. Nośnikiem jej jest transkrybowana sekwencja, której skrajne punkty 3' i 5' są na fig. 2 połączone linią kropkowaną i którą obserwuje się wyłącznie u roślin męskosterylnych. ORFB odpowiada obszarowi rozpoczętego odczytu. Określenie to nadano wskutek zaobserwowanej homologii z sekwencją opisaną przez Brennicka. Na fig. 2 przedstawiono obszarem zakreskowanym sekwencję odpowiadającą jednemu z dwóch genów RNA, przenoszącego formylometioninę.

Sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy oznaczone numerami 928 oraz 2273 na fig. 1 odpowiada transkryptowi, który może być uwidoczniony przez hybrydyzację molekularną (14), jak przedstawiono na fig. 6. Na fig. 6 każda „studnia odpowiada roślinie płodnej (F) bądź męskosterylnej (S). Jedynie rośliny męskosterylne syntetyzują transkrypt około 1400 zasad. Ten transkrypt rozpoczyna się w pozycji 928 (10 zasad) z fig. 1 i kończy się w pozycji 2273 (5) (rozpoczęcie oraz zatrzymanie transkrypcji może się dokonać w różnych położeniach w mitochondriach roślinnych).

Jak wykazały badania, cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 2273 z fig. 1, zapewniającą cechę CMS lub cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 1569 z fig. 1 i transkrybowaną na RNA, nadającą cechę CMS, ma szereg charakterystycznych cech:

— obejmuje ona chloroplasty tego samego rodzaju co genom jądrowy bądź innego rodzaju lecz zgodne z tym genomem jądrowym, — nie obejmuje całości ani też części jednego bądź drugiego (bądź obydwu) fragmentu genomu mitochondrialnego Ogury, który:

— jest nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji, — jest nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej.

Nieobecność tych fragmentów zwanych „sekwencjami niepożądanymi jest niezbędna do otrzymania genomów mitochondrialnych o dobrej jakościowo sterylności męskiej, zgodnej z 4 cechami wymienionymi poprzednio.

Odpowiednio do wyżej przedsta wionych cech cytoplazmy, zrekombinowany genom roślinny jądrowy bądź mitochondrialny obejmuje sekwencje DNA „sterylności Ogury, które posiadają następującą charakterystykę tej sekwencji DNA:

a) jest przenoszona przez sekwencję DNA zawartą pomiędzy nukleotydami 928 oraz 2273 sekwencji przedstawionej na fig. 1 bądź

b) wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie a), i - w przypadku jej obecności w cytopiazmie rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską.

W szczególnym przypadku zrekombinowany genom roślinny jądrowy lub mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku obejmuje sekwencję DNA „sterylności Ogury,

c) która jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną nukleotydymi o numerach 928 oraz 1569 na fig. 1 lub

d) która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie c) i która - w przypadku obecności w cytopiazmie rośliny i transkrypcji na RNA - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską. Genom jądrowy lub mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku można scharakteryzować przez to, że wspomniany genom zrekombinowany pozbawiony jest całości lub części fragmentów genomu Ogury:

— będącego nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji, — będącego nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej, bądź w którym wspomniane fragmenty są nieaktywne.

169 149 5

Dokładniej, zrekombinowany genom jądrowy lub mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

1) jest pozbawiony całości lub części fragmentu około 10,7 kb po trawieniu przez Bgll lub fragmentu około 11 kb po trawieniu przez Nrul, nośników genu CoxI.

Jest do uwidocznione w szczególności na fig. 3 przez hybrydyzację molekularną z sondą, która jest nośnikiem sekwencji CoxI.

2) jest pozbawiony całości lub części fragmentu 5,1 kb po trawieniu przez Sal I lub fragmentu o około 15 kb po trawieniu przez NruI lub fragmentu o około 18,5 kp po trawieniu przez Bgll, nośników jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę.

Uwidoczniono to w szczególności na fig. 4, przez hybrydyzację molekularną z sondą ograniczoną przez nukleotydy o numerach 389 oraz 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1. Na fig. 3 oraz 4 genotypy oznaczone cyframi odpowiadają roślinom, w których występuje odpowiedni układ cytoplazmicznej sterylności męskiej.

GENOTYPY	CHLOROPLASTY	MITOCHONDRIA
B. n.	B. napus	B.napus
27	B. napus	B. napus/Ogura
OGU	R. sativus (OGU)	R. sativus (OGU)
9, 17,21,24, 27c	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
B. o.	B. oleracea	B. oleracea

Ponadto istnienie dobrej jakościowo cechy CMS wymaga obecności sekwencji DNA, którą można oznaczać przez hybrydyzację DNA/DNA na produktach trawienia. Taka właśnie sekwencja DNA, która może być łatwo określona powinna zawierać sekwencję, która po trawieniu przez NcoI daje fragment o 2,5 kb, po trawieniu przez NurI daje fragment o 6,8 kb, zaś po trawieniu przez SalI daje fragment o 4,4 kb. Taką sekwencję można również oznaczyć przez hybrydyzację całkowitego RNA roślin męskosterylnych. Udowodniono istnienie transkryptu o około 1400 parach zasad. Jest on nieobecny u roślin powracających do płodności.

Określenie „niepożądanych oraz „niezbędnych z punktu widzenia „sterylności Ogury“ sekwencji nukleotydowych pozwala na wyselekcjonowanie - za pomocą technik hybrydyzacji DNA znanych specjalistom - materiału roślinnego o dobrej jakości, który jest nośnikiem chloroplastów zgodnych z genomem jądrowym oraz nośnikiem mitochondriów, bez konieczności oczekiwania na roślinę dojrzałą i pojawienie się kwiatów i owoców. Jest to zatem narzędzie bardzo skuteczne dla wyselekcjonowania roślin posiadających męskosterylną cytoplazmę, o korzystnych cechach agronomicznych. A zatem, tak wyselekcjonowany materiał roślinny zawiera mitochondrium mające sekwencję nukleotydową odpowiadającą DNA i wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną zasadami o numerach 928 i 2273 na fig. 1 oraz kodującą cytoplazmiczną męską „sterylność Ogury - bądź też mitochondrium zawierające sekwencję DNA, której nośnikiem jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1, bądź wykazująca 50% homologii z tą sekwencją i która jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych. Wspomniane DNA może poza tym wykazywać cechy określone powyżej, w szczególności nieobecność sekwencji niepożądanych.

Ponadto, analogicznie cytoplazma rodziny roślin krzyżowych zawiera sekwencję DNA „sterylności Ogury obecną w genomie mitochondrialnym; cytoplazma ta zawiera poza tym chloroplasty tego samego rodzaju lub też innego rodzaju, lecz zgodnie z genomem jądrowym.

Sekwencja „sterylności Ogury charakteryzuje się tym, że:

a) jest przenoszona przez sekwencję DNA złożoną z 2428 par zasad, przedstawioną na fig. 1,

b) jest ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1 i odpowiada transkryptowi wskazanemu przez linie kropkowane na fig. 2 i uwiodcznionemu przez hybrydyzację molekularną (14) na fig. 6,

c) wykazuje co najmniej 50% homologii z wymienioną sekwencją wspomnianą w punkcie b) i w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, lub

169 149

d) jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 i transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych, lub

e) wykazuje co najmniej 50% homologii z sekwencją opisaną w punkcie d) i jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych.

Sposób według wynalazku umożliwia również otrzymanie roślin z rodziny krzyżowych, które zawierają chloroplasty i jądro tego samego rodzaju lub zgodne oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określona powyżej.

Dokładniej, sposobem według wynalazku można otrzymać rośliny należące do rodzaju Brassica, zawierające chloroplasty i jądro Brassica oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określono powyżej.

Ten genom mitochondrialny winien również być nośnikiem pewnej liczby genów rozpatrywanego gatunku Brassica. Uzyskuje się to przez rekombinację między genomem Ogury i genomem Brassica.

Podobnie, sposobem według wynalazku otrzymuje się rośliny należące do gatunku Brassica napus, zawierające jądro Brassica i cytoplazmę, mieszczącą w sobie chloroplasty Brassica oraz mitochondria męskosterylne, będące nośnikiem DNA. Mitochondria te mogą również być nośnikiem większości genów mitochondrialnych Brassica napus (186, Atp9, Atp6, CoxII, ndh1, cob). Brassica napus odpowiada rzepakowi, bądź roślinom Canola i Rutabaga.

Analogicznie, sposobem według wynalazku otrzymuje się rośliny gatunku Brassica oleracea, zawierające jądro Brassica oraz cytoplazmę, zawierającą w sobie chloroplasty Brassica i mitochondria zawierające sekwencję DNA, kodującą cechę CMS, taką jak określono poprzednio. Brassica oleracea obejmuje różne typy kapusty: kapusty głowiaste, kapustę brukselską, kalarepy, brokuły, kapusty pastewne i kalafiory. Rośliny gatunku Brassica campestris zawierają jądro Brassica i cytoplazmę mieszczącą w sobie chloroplasty Brassica zgodnie z genomem jądrowym oraz mitochondria zawierające sekwencję DNA kodującą cechę CMS, taką jak określono. Brassica campestris odpowiada rzepakowi, brukwi, kapuście chińskiej, pekińskiej i japońskiej.

Analogicznie, sposobem według wynalazku można otrzymać rośliny z grupy obejmującej: B. juncea, B. nigra, B. hirta, B. carinata, zawierające jądro Brassica i cytoplazmę, mieszczącą w sobie chloroplasty Brassica zgodne z genomem jądrowym oraz mitochondria zawierające sekwencję DNA kodujące cechę CMS, taką jak określono.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się również rośliny należące do rodzaju Brassica, zawierające genom jądrowy o sekwencji „sterylności Ogury“, taki jak określono powyżej, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium. Rośliny te mogą w szczególności należeć do jednego z następujących gatunków: B. napus, B. oleracea, B. campestris, B. nigra, B. juncea, B. hirta i B. carinata.

Obecność „sekwencji sterylności Ogury“ jest konieczna i wystarczająca dla indukowania całkowitej nieobecności pyłku przy nieobecności genów-restauratorów. Zapylenie tych roślin jest zapewnione normalnie dzięki prawidłowej produkcji nektaru.

Morfologia organów żeńskich jest normalna i dojrzałe owoce (łuszczyny) zawierają prawidłową liczbę nasion. Fig. 5 ilustruje morfologię zaobserwowaną u rośliny normalnej - świadka (z), rośliny o morfologii odchylającej się od normy, posiadającej cały genom Ogury [z (6)] i chloroplasty Brassica oleracea, kapusty, będącej nośnikiem chloroplastów Brassica napus i mitochondriów męskosterylnych, posiadających geny Brassica oleracea i zrekombinowanych mitochondriów, nie zawierających już niepożądanych sekwencji [z (9) i z (17)]. Rośliny te mają następujące cechy:

GENOTYPY CHLOROPLASTY MITOCHONDRIA

z	B. oleracea	B. oleracea
z (A)	B. napus	B. napus/Ogura
z (6)	B. oleracea	Ogura
z (9)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
z (17)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura

169 149 7

Genotypy z(A) i z(6) nie wykazują odpowiedniego układu cytoplazmicznej sterylności męskiej.

Takie rośliny otrzymuje się za pomocą techniki fuzji protoplastów. U takich roślin płodność jest restaurowana przez pojedynczy gen-restaurator, zwany Rf1, pochodzący z rzodkwi, co nie zachodzi w przypadku roślin, które są nośnikiem całości nieodpowiedniego genomu mitochondrialnego.

Rośliny te mają właściwy układ CMS, a mianowicie:

— całkowitą sterylność męską, — morfologię pozwalającą na prawidłowe zapylenie i prawidłową produkcję nasion, jak to zilustrowano w tabeli 1 oraz tabeli 2.

Uogólniając, najlepsze cechy agronomiczne otrzymuje się dla roślin męskosterylnych posiadających chloroplasty tego samego gatunku co jądro i mitochondria wykazujące odpowiedni układ sterylności męskiej.

Tabela 1 przedstawia wydajność linii kapusty ma różnych cytoplazmach, (odpowiednie są genotypy z9 lub z17). Tabela 2 przedstawia wydajność linii rzepaku na różnych cytoplazmach (odpowiednie są genotypy Fu 27, Fu 58 i Fu 85).

Sporządzono także sondę obejmującą sekwencję co najmniej 10 zasad, korzystnie zaś 15 zasad, z sekwencji zawartej między nukleotydami o numerach 928 i 1569 na fig. 1; wspomnianą sondę można oznaczyć na przykład w środowisku radioaktywnej zasady oraz każdym innym środkiem (na przykład przez fluorescencję). Sondę tę można wykorzystać dla wykrycia sterylności męskiej, a także w szczególności przy selekcji klonów.

Cechy i korzyści wynikające ze sposobu według wynalazku zilustrowano w następujących przykładach.

Tabela 1.

Wydajność linii Z (kapusta do kwaszenia) przy różnych cytoplazmach

Cytoplazma	Genotypy	Zbiór nasion
Chloroplasty	Mitochondria		gram/roślina
B. oleracca	B. Oleracea	(z)	53,1
B. napus	Ogura	(zC)	0
B. napus	Ogura/napus	^(zA)	22,7
B. oleracea	Ogura	(z6)	9,3
Ogura	Ogura	(zO)	20,1
B. oleracea	Ogura/oleracea	lub zl7)	91,8

Tabela 2.

Wydajność linii DARMOR (rzepak zimowy) przy różnych cytoplazmach Wydajność Rzepak zimowy DARMOR: męski płodny i męskosterylny

	Wydajność (% DARMOR)	Chloroplasty	Mitochondria
DARMOR	100 (35 g)	B. napus	B. napus
Fu 27	118	B. napus	B. napus/ogura
Fu 58	120	B. napus	B. napus/ogura
Fu 77	96	B. campestris	Ogura
Fu 85	114	B. napus	B. napus/ogura
Fu 118	103	B. napus	B. napus/ogura
BIENVENU	108
JET NEUF	89

169 149 cd. tabeli 2

Składniki wydajności (Clermont-Ferrand)

	NS	PIS	NGPS	NG	PIG	MST	HI	RDT	HT
DARMOR	7183	81,9	9,9	70028	4,31	1077	0,256	31,6	120
BIENVENU	7334	80,7	11,2	81841	3,88	1064	0,269	30,7	109
JET NEUF	7977	87,7	8,6	67291	4,98	1176	0,262	33,3	115
Fu 27 DARMOR	9292	82,8	11,6	106188	4,09	1337	0,293	42,2	122
Fu 58 DARMOR	8617	76,5	11,7	99947	3,65	1228	0,270	36,0	131
Fu 118DARMOR*	8389	84,6	11,0	92428	4,11	1243	0,276	38,1	132

NS: liczba łuszczyn/m² - PIS: ciężar łuszczyny (mg) - NGPS: liczba nasion na łuszczynę NG: liczba nasion/m² - PIG: ciężar nasiona (mg) - MST: substancja sucha ogółem (g/cm)

HI: wskaźnik zbiorów (%) - RDT: wydajność (q/ha) - HT· wysokość (cm) 'Rośliny te wykazują często zdeformowane owoce (łuszczyny)

Przykład I. Wykrycie sekwencji DNA odpowiedzialnej za cytoplazmiczną sterylność męską Ogury.

1. Roślina.

Przez „cybrydę“ określa się formy otrzymane przez fuzję izolowanych protoplastów, po której następuje regeneracja całej rośliny. Taki sposób otrzymywania pozwala na połączenie w komórce informacji cytoplazmicznych pochodzących od obydwu form rodzicielskich. Cybrydę nr 13 otrzymano pośród 820 roślin regenerowanych przez fuzję protoplastów między cybrydą B. napus odporną na triazynę, cms Ogury (potomstwo cybrydy 77 opisanej w Pelletier et al., 1983 oraz Chetrit et al., 1985) oraz odmianą pochodzącą od Brutor, wrażliwą na triazynę oraz płodną. Próba odporności na triazynę (Ducruet i Gasquez, 1978) wykonana na próbce liścia każdego regeneranta pozwoliła na ustalenie typu chloroplastu (chloroplasty odporne na triazynę pochodzące od formy rodzicielskiej 77 lub chloroplasty wrażliwe na triazynę pochodzące z linii Brutor). Wyhodowano rośliny i obserwowano stadium kwitnienia. Rośliny będące kombinacjami nierodzicielskimi (bądź czułe/męskosterylne bądź odporne/męskie płodne) wyselekcjonowano jako cybrydy. Cybryda nr 13 była typu wrażliwa/męskosterylna. Cybryda nr 1 była typu odporna/męska płodna.

2. Wyodrębnienie kwasów nukleinowych.

Całkowity DNA wyodrębniono przy użyciu liści pochodzących z czterotygodniowych roślin według metody opisanej przez Dellaporta (1983). DNA mitochondrialny wyekstrahowano z liści ośmiotygodniowych roślin, tak jak opisali to Vedel i Mathieu, 1982, z następującymi wariantami:

Mitochondria nie zostały oczyszczone w gradiencie sacharozy po lizie. Lizę wykonano w sarcosylu 4% z proteinazą K 0,5 mg/ml (Boehringer Manheim GmbH), w Tris pH 8, 50 mM, EDTA 20 mM. Po wytrąceniu, DNA mitochondrialny oczyszczono przez odwirowanie w gradiencie bromku etydyny - chlorku cezu (metoda 1 - Vedel i Mathieu 1982) w probówkach do odwirowania w poliallomerze.

Całkowite RNA wyodrębniono przy użyciu liści lub pączków kwiatowych według pracy Logemanna et al., 1987.

RNA mitochondrialne wyekstrahowano z ośmiotygodniowych kalafiorów według techniki Sterna i Newtona, 1986.

3. Analizy przez restrykcję DNA mitochondrialnego oraz elektroforezę w żelu agarozowym.

Analizy wykonano tak, jak opisali Pelletier et al., 1983. Całkowite lub mitochondrialne RNA umieszczono na żelach elektroforetycznych, zawierających formaldehyd, tak jak opisali Sambrook et al., 1989.

4. Hybrydyzacja.

Przeniesienie DNA bądź RNA na filtry nylonowe (Hybond -N, Amersham) wykonano przez absorpcję kapilarną przy użyciu, odpowiednio, 6 X SSC bądź 10 X SSPE według instrukcji producenta. Prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono według Amershama, wykorzystując sondy znaczone przez wieloinicjujący układ znaczenia DNA (Amersham) po oczyszczeniu na kolumnach Sephadex G50 (Sambrook et al., 1989).

5. Klonowanie DNA mitochondrialnego.

Dwa banki genomowe linii cybrydy męskosterylnej (13-7) oraz rewertanta (13 - 6) utworzono w wektorze fagu lambda EMBL3 i hodowano na szczepie restryktywnym E. coli Nm539 (Frischauf et al., 1983). Otrzymano około 2,5 X 104 klonów na mg DNA mitochondrialnego.

169 149

Banki DNA mitochondrialnego mianowano i rozwinięto w celu wyodrębnienia warstewek, które przeniesiono na filtry nylonowe, tak jak opisali Sambrook et al., 1989. Sondę hybrydyzacyjną wykorzystywaną do skriningowania dwóch banków DNA mitochondrialnego przygotowano następująco: fragment DNA mitochondrialnego, specyficzny dla CMS, wymyto, wykorzystując procedurę Gene cleanTM (BIO 101 INC.), przy użyciu produktu trawienia DNA mitochondrialnego, umieszczonego na preparatywnym żelu agarozowym. Wymyty DNA następnie znaczono tak jak wyżej.

Ekstrakcja DNA Lambda, podklonowanie fragmentu Ncol 2,5 w miejscu Ncol pTrc99A (Amann et al., 1988) oraz ekstrakcje DNA plazmidowego wykonano według protokołów Sambrooka et al., 1988. Plazmidy rekombinujące wprowadzono na szczep E. coli NM522 (Gough i Murray, 1983).

6. Badanie genetyczne cybrydy 13 i jej potomstwa.

W pierwszym pokoleniu potomstwa otrzymanego przez zapylenie cybrydy 13 przez Brutor, złożonym z 13 roślin, pięć jest całkowicie męskosterylnych (włączając w to rośliny 13-2 i 13-7), jedna męska płodna (numer 13-6) i siedem praktycznie całkowicie sterylnych z kilkoma kwiatami męskimi płodnymi.

Roślina płodna 13-6 została samozapylona oraz skrzyżowana z Brutorem. W dwóch przypadkach otrzymuje się wyłącznie rośliny płodne (odpowiednio 43 i 42).

W przypadku krzyżowania rośliny męskosterylnej numer 13-7 oraz Brutora 24 potomków jest całkowicie sterylnych, zaś 6 ma kilka kwiatów płodnych; jest to wynik podobny do otrzymanego przy użyciu samej cybrydy. Roślinę 13-2 skrzyżowano z linią restauracyjną RF, która jest heterozygotą dla specyficznych genów-restauratorów męskiej „sterylności Ogury“ (Chetrit et al., 1985). Potomstwo tej krzyżówki składa się z 53 roślin męskosterylnych, 37 roślin męskich płodnych oraz 9 roślin praktycznie całkowicie sterylnych, jednakże zawierających kilka kwiatów płodnych. Wyniki te sugerują, że rośliny męskosterylne z rodziny cybrydy 13 zawierają determinantę CMS Ogury, podobnie jak inne cybrydy badane poprzednio o prostszym profilu restauracji (Chetrit et al., 1985).

W tym stadium badań można było wziąć pod uwagę dwie możliwości: albo cybryda 13 zawiera mieszaninę genomów mitochondrialnych męskich płodnych .oraz męskosterylnych i można je bardziej wyselekcjonować w celu oczyszczenia dwóch fenotypów lub też cybryda 13 zawiera zrekombinowany genom mitochondrialny o niestabilnej strukturze, który wraca do bardziej stabilnej .konfiguracji „plodnej“ i będzie niemożliwe utrzymanie jednorodnego fenotypu męskosterylnego' w następnych pokoleniach.

Sterylne rośliny męskie, otrzymane przy użyciu potomstwa sterylnej rośliny męskiej numer 13-7 uzyskano równocześnie przez rozsadę i przez krzyżowanie płciowe z Brutorem. Po zmiennej liczbie pokoleń (1 - 5), za pomocą obydwu metod, wszystkie rodziny dały rośliny płodne. Inaczej jest w przypadku otrzymanych w ten sposób roślin całkowicie płodnych, które nie dają nigdy ponownie roślin sterylnych.

W świetle tych wyników można wziąć pod uwagę, że drugie wyjaśnienie zaproponowane powyżej, czyli że cybryda 13 zawiera niestabilny genom mitochondrialny, który traci determinantę CMS Ogury podczas procesu prowadzącego do konfiguracji „płodnej“, bez możliwości powrotu do fenotypu sterylnego jest wyjaśnieniem poprawnym.

7. Porównanie mitochondrialnego DNA w przypadku roślin męskosterylnych oraz płodnych rewertantów. Wyodrębnienie specyficznego fragmentu roślin męskosterylnych.

DNA mitochondrialny wyekstrahowano z liści męskosterylnego potomstwa 13-7 oraz płodnych rewertantów (potomstwo 13-6 lub 13-7) i trawiono licznymi enzymami restrykcyjnymi, w celu porównania jego profilu restrykcyjnego. Genomy mitochondrialne dwóch typów są bardzo podobne, gdyż nie można zaobserwować żadnej różnicy między profilami restrykcyjnymi mitochondriów męskosterylnych i płodnych rewertantów, uzyskanymi przy użyciu rozmaitych enzymów. Jednak fragment restrykcyjny o 6,8 kb wykryto w profilu restrykcyjnym DNA mitochondrialnego roślin męskosterylnych trawionych przy użyciu NruI, zaś nigdy nie zaobserwowano w profilach odpowiednich płodnych rewertantów.

Fragment (zwany N 6,8) wymyto z żelu agarozowego, znaczono i wykorzystano jako sondę na profilach restrykcyjnych DNA mitochondrialnego otrzymanych przy użyciu NruI: ważny sygnał

169 149 przy 6,8 kb zaobserwowano u całego męskosterylnego potomstwa cybrydy 13, podczas gdy żaden fragment tej wielkości nic uległ hybrydyzacji z sondą w genomach mitochondrialnych płodnych rewertantów. Poza tym, sonda N 6,8 hybrydyzuje z fragmentem o 6,8 kb w mitochondrialnym DNA Ogury, trawionym przy użyciu NruI; sonda nie hybrydyzuje natomiast z fragmentem pochodzącym od B. napus cv Brutor wskazując, że fragment ten jest pochodzenia Ogury.

Bank lambda, zawierający ekstrakty DNA mitochondrialnego pochodzącego od roślin męskosterylnych (13-7) sprawdzono ze znaczonym wymytym fragmentem i spośród 8 klonów hybrydyzujących, wyodrębniono 2 fagi rekombinujące, zawierające cały fragment N 6,8 oraz sekwencje sąsiadujące. Otrzymano szczegółową mapę restrykcyjną tego obszaru. Hybrydyzacja profilu restrykcyjnego DNA mitochondrialnego, pochodzącego od potomków płodnych i sterylnych cybrydy 13 z N 6,8 w charakterze sondy, pozwoliła ograniczyć obszar specyficzny genotypu męskosterylnego do fragmentu NcoI i 2,5 kb.

Fragment NcoI o 2,5 kb znaczono i wykorzystano jako sondę w stosunku do DNA mitochondrialnego, pochodzącego od potomków 13-7 i 13-6 trawionego przy pomocy NcoI. Oprócz sygnału, przy 2,5 kb specyficznego dla profilu męskosterylnego, liczne fragmenty NcoI hybrydyzują równocześnie w profilach płodnych rewertantów oraz profilach męskosterylnych; fragmenty te są przy 2,2,10 i 14 kb. Fragment NcoI o 2,7 kb silnie hybrydyzuje w genomie mitochondrialnym płodnych potomków, natomiast nie hybdyryzuje w przypadku potomków sterylnych. Analiza tego profilu hybrydyzacji prowadzi do wniosku, że fragment NcoI o 2,5 kb, chociaż specyficzny dla męskosterylnego DNA mitochondrialnego, zawiera sekwencje, które powtarzają się gdzie indziej w genomie mitochondrialnym (we fragmentach o 2,2,10 i 14 kb po wytrawieniu przy użyciu NcoI) i te powtarzające się sekwencje są również obecne w DNA mitochondrialnym płodnych rewertantów poza specyficznym fragmentem o 2,7 kb.

Całkowite RNA wyesktrahowano z liści lub z zalążków potomków cybrydy 13 lub z męskosterylnych lub płodnych cybryd (pochodzących z innych doświadczeń polegających na fuzji) i linii Brutor. Nothern blots (przemieszczenia typu Northern) wykonano i hybrydyzowano z sondą odpowiadającą wstawce (insertowi) klonu lambda zawierającego N 6,8 opisanego w przykładzie 3. Wykryto główny transkrypt o 1,4 kb u wszystkich cybryd męskosterylnych, także w przypadku cybrydy 13-7, podczas gdy nie zaobserwowano żadnego transkryptu tej wielkości w linii Brutor ani też w przypadku dwóch cybryd płodnych (różnych od cybrydy 13). Ponadto rośliny płodne wykazują transkrypt o 1,1 kb hybrydyzujący z sondą, nieobecny lub obecny na bardzo niskim poziomie, we wszystkich badanych cybrydach męskosterylnych. Liczne transkrypty wspólne dla wszystkich próbek hybrydyzują słabo z sondą, z powodu znacznej wielkości znaczonej wstawki (insertu). Sprawdzono, że transkrypty mitochondrialne w próbkach całkowitego RNA można wykryć przez hybrydyzację samego Northern blot (przemieszczenia typu Northern) z fragmentem DNA zawierającym sekwencję genu atpa.

Ten sam specyficzny transkrypt o 1,4 kb znaleziono w mitochondrialnych RNA Ogury wyekstrahowanych z kalafiorów, przy użyciu jako sondy fragmentu NcoI 2,5. Dokładne granice tego transkryptu wyznaczono przy wykorzystaniu w charakterze sondy podklonów fragmentu NcoI 2,5.

8. Badanie cybrydy 1 i jej potomstwa.

Cybryda 1 była płodną formą męską. Spośród jej potomstwa roślina 1.12 była płodna, zaś roślina 1.18 - sterylna. Roślina 1.12 dała jako potomstwo rośliny sterylne (S3) i rośliny płodne (RF3). Roślina 1.18 dała rośliny sterylne (S2) oraz gałąź płodną (RF2). Rośliny S2 i S3 restauruje się tym samym jądrowym genem restaurującym płodność pyłkową co w przypadku cybrydy 13.

DNA mitoc-hondrialny roślin S2 i S3, znaczony przez hybrydyzację z fragmentem NcoI o 2,5 kb, nie daje sygnału przy 2,5 kb po trawieniu przez NcoI, ani też sygnału przy 6,8 kb po trawieniu przez NruI.

Podobnie, hybrydyzacja całkowitego RNA (Northern) z sondą odpowiadającą sekwencji ORFB nie daje sygnału przy 1,4 kb, jak w przypadku sterylnej cybrydy 13. Natomiast sonda odpowiadająca sekwencji między nukleotydami 928 i 1569 z fig. 1 daje sygnał z Northern przy około 1,3 kb. Sygnał ten jest nieobecny w przypadku RNA roślin RF1, RF2, RF3 lub Brutor. Podobnie możliwe jest wykorzystanie tej samej sekwencji (928-1569) jako sondy, przy przesunięciu punktowym (dot biot) całkowitych RNA i w tym przypadku wszystkie rośliny męskosterylne dają sygnał.

169 149

Powyższe wyniki wskazują, że rośliny S2 i S3, mimo że męskosterylne, nie zachowały sekwencji nukleotydowej, opisanej na fig. 1, w swojej oryginalnej konformacji i pokazują, że część tej sekwencji zawarta między nukleotydami 928 i 1569 jest nośnikiem specyficznej determinanty „sterylności Ogury; czyni , ona rośliny męskosterylnymi, gdy ta sekwencja ulegnie transkrypcji.

Sekwencja ta nie, ma znaczącej homologii z sekwencjami obecnymi w bankach danych.

Przykład II. Wykrycie sekwencji niepożądanych w genomie mitochondrialnym Ogury.

Zbiór cybryd otrzymano w ramach gatunku B. napus przez fuzję protoplastów rzepaku, będącego nośnikiem cytoplazmy Ogury i rzepaku normalnego. Pierwszy z nich jest męskosterylny i ma deficyt chlorofilu w niskiej temperaturze, drugi zaś jest normalnie zielony i płodny. Cybrydy wyselekcjonowano spośród roślin regenerowanych i zachowano te, które były męskosterylne i prawidłowo zielone.

W identyczny sposób otrzymano zbiór cybryd w ramach gatunku B oleracea przez fuzję protoplastów kapusty będącej nośnikiem cytoplazmy Ogury i kapusty normalnej. Spośród roślin regenerowanych zachowano te cybrydy, które były męskosterylne i normalnie zielone.

Cybrydy te skrzyżowano z różnymi odmianami - odpowiednio - rzepaku bądź kapusty. Krzyżówki te powtarzano w każdym pokoleniu z tymi samymi odmianami tak, by otrzymać określony genotyp bliski genotypu takiego, jak w przypadku odmiany wstecznej.

Wspomniane wyżej różne odmiany przekształcone w ten sposób na cytoplazmach różnych cybryd poddano próbom agronomicznym, w celu zmierzenia produkcji nasion; zależy ona od szeregu czynników: produkcji nektaru wystarczającej dla zapewnienia zapylania przez owady, prawidłowej morfologii kwiatowej, tak by zapylenie było skuteczne i by owoce się prawidłowo rozwijały.

Zbiór cybryd mógł być zatem podzielony na dwie partie:

— partię cybryd wykazującą sterylność męską odpowiednią dla handlowej produkcji nasion — partię cybryd nie wykazującą wszystkich cech korzystnych dla prawidłowej produkcji handlowej nasion.

Do pierwszej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 27,58,85 oraz cybrydy kapusty nr 9,17, 21,24, 27c.

Do drugiej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 23c, 77,118 oraz cybrydy kapusty nr 1,6 i 14.

Całkowite DNA tych cybryd poddano trawieniu przez enzymy: SalI, NcoI, NruI, BgilI, PstI, KpnI. Otrzymane Southern blots (przeniesienia typu Southern) hybrydyzowano z różnymi sondami mitochondrialnymi Atpa, Cob, CoxI, Atp6,26S, 18S i dwoma fragmentami genomu Ogury: o 2,5 kb otrzymanym po trawieniu przez NcoI i o 19,4 kb otrzymanym po trawieniu przez NurI.

Dwie partie cybryd różnią się następująco:

a) nr. nr. 23S,77,11S-w przypadku rzepaku-oraz 16,11 -wprzypadku kapusty - posiadają obszar genomu Ogury, który otacza gen coxI rozpoznawalny przez fragmenty BglI o 10,7 kb lub NruI o 11 kb oraz obszar genomu Ogury, który otacza jeden z genów RNA, przenoszącego formylometioninę, rozpoznawalny przez fragmenty SalI o 5,1 kb i NruI o 15 kb.

b) nr. nr. 27,58,85 - w przypadku rzepaku-oraz 9,17,2124 i 27c-w przypadku kapusty-nie posiadają obszarów odpowiadających, które zostały zmienione - na skutek rekombinacji między genomami dwóch form rodzicielskich, które uległy fuzji - przez analogiczne obszary genomu mitochondrialnego rzepaku w przypadku nr. nr. 27,58,85 oraz kapusty w przypadku nr. nr. 9,17, 21, 24 i 27c.

Na tej podstawie wnioskuje się, że dwa rozpatrywane obszary genomu Ogury są niepożądane, jeśli chce się uzyskać układ sterylności męskiej odpowiedni dla handlowej produkcji nasion.

Przykład III. Przykład ten ilustruje znaczenie znajomości sekwencji męskiej „sterylności Ogury oraz sekwencji niepożądanych dla wykonania bezpośredniego wyselekcjonowanych otrzymanych cybryd bez konieczności wieloletniego krzyżowania wstecznego oraz testów agronomicznych.

Łączy się protoplasty rośliny z rodzaju Brassica, będące nośnikiem cytoplazmy Ogury z protoplastami rozpatrywanego rodzaju Brassica. Uzyskane w wyniku fuzji kolonie hoduje się in vitro i powoduje regenerację w środowisku, które sprzyja tworzeniu pączków (zob. Pelletier et al., 1983).

169 149

Przy użyciu 1 g świeżego materiału, co dotyczyłoby zasklepki lub fragmentu regenerowanego zarodka roślinnego, możliwe jest, przy użyciu technik opisanych poprzednio, wyodrębnienie całkowitego DNA. Po trawieniu przez Sali, hybrydyzacja typu Southern z sondą zawartą między nukleotydami nr 389 i 1199 (zob. fig. 1) powinna dać sygnał jedynie dla 4,4 kb (nie powinna dać sygnału przy 5,1 kb). Podobnie po trawieniu przez Nrul i hybrydyzacji z sondą zawierającą gen CoxI powinno się otrzymać sygnał dla wielkości różnej od 11 kb.

Wspomniane hybrydyzacje pozwalają przewidzieć, że dysponuje się rośliną, która będzie męskosterylna i która będzie się nadawać do handlowej produkcji nasion.

LITERATURA

Amman E, Ochs B,' Abel K-J (1988) Gene 69:301-315

Bannerot H, Boulidard L, Cauderon Y, Tempe J (1974) Proc

Eucarpia Meeting Cruciferae 25:52-54

Bannerot H, Boulidard L, Chupeau Y (1977) Eucarpia

Cruciferae Newsl: 2-16

Chetrit P, Mathieu C, Vedel F, Pelletier G, Primard C (1985)

Theor Appl Genet 69:361-366

Dellaporta SL, Wodd J, Hicks JB (1983) Plant Mol Biol Rep 1:19-21

Ducruet JM i Gasquez J (1978) Chemosphere 8:691-696

Frishauf AM, Lehrach H, Poutska A, Murray N (1983) J Mol Biol 170:827-842

Gough J i Murray N (1983) J Mol Biol 166:1-19

Hiesel R, Shobel W, Schuster W, Brennicke A (1987) EMBO J 6:29-34

Johnston SA, Anziano PQ, Shark K, Sanford JC, Butów RA (1988) Science 240:1538-1541

Logemann J, Schell J, Wilmitzer L, (1987) Analytical Biochem 163:16-20

Ogyra H (1968) Mem Fac Agric Kagoshima Univ 6:39-78

Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P. Remy R, Roussele P, Renard M (1983) Mol Gen Genet 191:244-250

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

Stern DB i Newton KJ (1986) Methods Enzymol 118:488-496

Vedel F i Mathieu C (1982) Anal Biochem 127:1-8

FIG.1

-- F

MBS	rt	n
asn	M	X	bB	T	uS
Saa	m	m	os	a	4p
IAB	β	n	Ir	q	Hi
ΙΣΣ	I	I	II	X	II

/

ACGTATATAAGAAGATTTTCATTCCAGTTGGAAAGCAATCGAGAAAACGCCGCCCAAATA

541 --------*---------*---------^---------—♦----------------—* 600

TGCATATATTCTTCTAAAAGTAAGGTCAACCTTTCGTTAGCTCTTTTGCGGCGGGTTTAT

A

£SM	C	HB	B
lseP	V	?	is	NT	M	MBsM
Ia©ra	i	1	np	rft	1	sssas
ΙΑΣ1	J	®	£M	lii	y	paAr
ΣΣΣΣ	I	Σ	ΙΣ	ΙΣ	I	ΣΣΣΣ
U				/		//

CGCTTCGCCACGTGTAGCCCTGTATGGACTCGCGAAGCAGGTCTCCGGTCGGTGTCCAAG

601 ---------♦------—♦---------*-------—*-----——---«—4» g$0

GCGAAGCGGTGCACATCGGGACATACCTGAGCGCTTCGTCC&GAGGCCAGCCACAGGTTC

S a MBS u O H fisnE ρ n ©aab

A η 1 IASw

ΙΣ X ΣΣΣΣ /

ATTTGATCTAACTATTGAGTGAGGACTACTTACCGATTGATAGAATAATACGTATATAAG

661

TAAACTAGATTGATAACTGACTCCTG&TGAATGGCTAACTATCTTATTATGCATATATTC

720

Γ S

Cft	M	a		T	H	H
Avu	fe	u 0	T	SM	Ha	i
1x4	o	3 p	a	pa	ho	n
uJM	Σ	A n	<?	£«	ai	£
ΣΣΣ	Σ	X Σ	Σ	ΣΣ	ΣΣ	I

//

AA£UUbe£?@C7TTGT@G&STGA?CT??CTCGAAATGAA?T&&8?A&GSCt2CTATGTTGAG 721 7 00

TTCTTCGACG&AACACCTCACTAGAAAGASCTTSACyTA&TTC&TTCCOCGATACAAGYC

Z

A	0		C		c	B
T 1	r	MSM	V	K	o	SA
£ w	d	np®	X	«9	5	IV
i W	Σ	1@®	J	O	7	Je
X Σ	Σ	ΣΣΧ	X	X	Σ	ΣΧ

ATTCTGAACC&&ASCACTAfiTTG&O8¥CTG<AAi0CCT?ATSA@£&GA&GTAATA&ATA<CCT

TA^GACTTGGTT?CGTGATCAACTCCAGACTTCG©AAS&STCGTeTTGA?TATTTATGGA

N a

B 1	H	7	C
aDNSa	□	X	sPM	Av	X
ajct I	d	n	pil	li	Σ
JaoyX	e	ί	Eey	uJ	-
ςςςιι	ta	I	ΙΣΧ	ΣΣ	2
///				/

CCA7GGACAA7AA7CT7AG7CGGAGTCAAA7TCC7TACC777CCACCCAAAGC7GAACAT

1---------*-------------------*---------’»-------------------¢. gQ

GG7ACC7G77A77AGAA7CAGCC7CAG777AAGGAA7GGAAAGG7GGG777CGAC77G7A

	S BB Na	Β	£	B P	N 1
S	M	A	asOlu	A	sT	c	u	a
P	n	i	mc pa 3	1	ca	o	1	X
i	1	w	ΗΥηΧΑ	w		B	0	X
I	X	Σ	XXIVX	X	ΣΣ	X	ta	Σ
			/ //		/

A7CCGCACAGA7A7TCCAT77777T7A77GAGGA7CCA7TT7CGAACTGAAC7AC7CA7G

SI----------4»--·—------------->— ------*---------·*—·-----120

7AGGCG7G7C7A7AAGG7AAAAAAAATAAC7CC7AGG7AAAAGCT7GACTTGATGAGTAC c

h F

	B	1	C C	n	w
D	s	M	Ml	BAvMNAvS	M	u	1
d	P	»	sl	bliahlif	n	4	a
e	c	0	®I	vuJ««uJ®	1	K	I
Σ	Σ	X	ΣΣ	ΣΣΣΣΣΣΣΣ /// U	X	X	V

C77AGGCAAAACAAGCAAGGGAGTTGTTAATAAGGAGCTAGCTACAGTGCTGCGGAGGGT

121 ----------------------------—----——«, ijjQ

GAATCCG7T77GT7CG77CCCTCAACAATTAT7CC7CGATCGATGTCACGACGCC7CCCA

S F

t	NC S	n	C
y	M	lvMNc	u	Aw	B
s	3	aiscr	4	li	b
j	®	IJpiF	H	uJ	V
I	X	νχχχχ	X	IX	X
/		/		/

7CCGTGCT7ATTAAGGAGCCGGGCAGCTACGCAACAC77CCT7GCAACTCATACC7AC7A

181--------—*------· *—'— -----♦---------*-----------*---------* 240

AGGCACGAA7AA77CC7CGGCCCG7CGA7GCG77G7GAAGGAACGTTGAGTA7GGA7GAT

FIG.1

F

FIG .1			Cn		ε	MSS
B	M	AvuBF	M	c	RasnRS
b	3	li4ss	n	o	ssaasp
	V	e	uJHmu	1	N	alABal
	X	9	ΣΧΧΣΧ	X	X	ΙΙΧΙΧΧ
			U			/ /

acaaactgtttactcttttttaagagttagctgcattcctgcgggaggtacgtacgcaat

241----------------------------------------------------„.,-----.-* 3QQ

7G777GACAAATGAGAAAAAATTCTCAATCGACGTAAGGACGCCCTCCATGCATGCGTTA

M w

o

I £

c o

P

X a

p

IM

2aB

8@b

6Xv

XXX /

M w

o

I s

P

M

X

N a

X

I

X

CAAAGCAGCAGGGCACGTTCGCAACACCTGCTTCAACTYCATGCACATTAjGCAACAAGAT

301---.-—-.-«.♦---------♦•-------«-φ-------.—3go

GTTTCGTCGTCCCGTGCAAGCGTTGTGGACGAAGTTGAAGTACGTGTAATCGTTGTTCTA

	F F			ε
	CnBfi C			CBS
m a	AvusuPAv8	S	S	ose
n b	Ii4p4®lif	b	f	Ras
1 v	uJHCHtuJ©	V	a	XJF
X X	ΧΧΧΧΧΧΧΧΣ	X	X	XXX
	// II

TGGGTAGYTGATTGYTGGGAfiGATAfiCTGCASCTCCCiACGGG&GTGAACTACAGTTCCA

351 ---------------------------------*--------------------φ 420

ACCCATCAACTAACJykCCCTCCTATCGACGTCGACGGAT®XCTCACTTGA?GTCAAGGT

B

P	S	H	c
1S	Ba	Ca	i	c				M
2f	su	V©	sł®S		F	HT	£	b
81	P>	IX	lns	i	a	hh	a	o
S&	Cg	JX	Olp	J	u	aa	s	V Λ
ΧΣ	XX	XX	XXX	X	X	XX	X	X

III /

G<^3SaOCACA^A*©^CCAATACCG<^?GTGASGCGCG?AGCGGGAAGAGA?GTATGG

CCCCCTCGTGTCGTTCCCCGTTAT^CCGACACTCCGCGCATCGCCCTTCTCTACATACC s

c	©a	S
Aw	M	A	su	B	sFS	M
11	s	1	®3	P	aoc	n
uJ	®	ω	BA	n	Jky	1
XX	X	1	XX	X	ΙΧΧ	X
/					//

TAAGCKbATAGCTCTTTAACCATTTGTAATGGAATGGGATCTTGATCCTCCTTGGAATAA?

AT?CCCTA?CGACAAATTGGTAAACA?TACC??ACCCTACA^C?AGGAGGAACC??Ar?A

481

540

841

961

1021

1081

FIG.1

F a

u

I

T s

P ε

i

C S V 3 i P J H X X

N a

I

GGGGGAAGAAGCGGGGTAGAGGAATTGGTCAACTCATCAGGCTCATGACCTGAAGATTAC —————————4—— — » — — — — 4-—— — — — — — — — 4-----=- = = 4.———— ———— —4.

SCCCC7TC7TCGCCCCATCTCC77AACCAGTTGAG7AG7CCGAG7AC7GGAC77C7AA7G

901

M C			S
b 0 F S	F		2	T
0 5 i p	a		a	a
X 7 n i	U		N	q
X XXX	X		X	X
AGG77CAAA7CCTG7CCCCGCACCG7AG77TCA7TC7GCATCAC7C7CCC7G7CG7TA7C
TCCAAGTTTAGGACAGGGGCGTGGCATCAAAGTAAGACGTAGTGAGAGGGACAGCAA7AG
	Η X	M TE
G	GCa m	aBse	M
d	Edv@M§	©cpo	b S
i	aiilcl	X©45	0 P
I	@XJXrX	If57	X i
I	IIIIII	ΙΙΧΣ	X X
	/ III

960

GACA7CGCAAGG77777GAAACGGCCGAAACGGGAAG7GACAA7ACCGC7T77C77CAGC -===_=--=<.==——=== = = 4·=- ==——=-»-4·-—

C7G7AGCGT7CCAAAAAC777GCCGGC77TGCCC7TCAC7G77A7GGCGAAAAGAAGTCG

900

1020

B 7

ST 3 ta p

Bq E

IX X /

A7A7AAATGCAAT6AT7ACCT77T7CGAAAAA77G7CCAC77T77G7CA7AATCTCACTC

-=-===_==>-======—=4.--=—-—--=^=====--==4>-========^=======.-« 1080

TA7A77TACGT7AC7AA7GGAAAAAGC7TTT7AACAGG7GAAAAACAG7A77AGAGTGAG

c	S H aCa
Av	uv®
li	9iX
uJ	6JI
XX	XXX
/	/

CTACTGAA7G7AAAGT7AGTGTAATAAGT77C7T7C77T7AGC7T7TT7AC7AA7GGCCC

1140

GA7GACT7ACA7T?CAA7CACAT7A77CAAAGAAAGAAAA7CGAAAAAA7GA77ACCGGG

1201

1261

1321

1381

N S

		BO	1	a	ε
vDE	Av	sr	a	u	03ΜΧ
ids	li	md	a.	3	ppao
Jep	uJ	Al	r	A	n3@a
XII	II	* T	I		Σ Σ Σ Σ
/	/				/ /

ATATTTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACGATCTA

TATAAACCGATTCGACCAAAAGATTGTTGGTTGTAACAAATGCTTGGTACTCTGCTAGAT

T a

T	qT	C	T
M	s	N	IS	vM	s
3	P	d	xp	ia	P
β	£	e	-E	J®	E
I	I	I	21	II	I

GAGAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATA

----------------------------------------♦----------------------- 1260

CTCTTCAATTTTTAAGGTATACTTAAAGTCATACCCACCGATCCACAGTTTTAATGTTAT

Μ T £3 B

R	β	P	H	3	M	M
3	I	4	P	m	s	n
a	I	5	h	A	©	i
I	I	I	I	I	X	T X

AAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAA

--------1320

TTTAGTTTACATGGATTGCTACTTCACTGCTTTTTrCAGAGTGGATAGTAATTTCCCCTT

M	M	H		M
n	n	n	n	n
1	1	1	1	1
X	X	I	X	X

ATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAA ——φ 1380 TATcrccccTTrcTccTTmTTTCTCCCCTTTCCCcTTTATCTCcccTTTCTCCTrrTT

T

Μ Μ M 3 η η n p

111 E

X I Σ X

AAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATTGACCG —------- >-----------------------+ 14 40

TTTCYCCCCTTTCCCCYTTATCTCCCCTTTCTCCTTTTTTTTCTCCACCTTTTAACTGGC

FIG.1

1619149 * . FIG.1 q . —: Ma : fp

- eE i ::

/

AGAAAATAATGCTTTGTGAACCCAATTGCTTTGACAAAAATAAAGAAAGAAGCAAAATCT

1441---------*-------------------*---------*---------------------* 1500

TCTTTTATTACGAAACACTTGGGTTAACGAAACTGTTTTTATTTCTTTCTTCGTTYTAGA

S N

T SB a Μ 1 s E gsDu b a X p a ltp3 o Z _c

E r ΙΥηΑ X X ra

X X XXIX I XX i /

CATTCAATTTGAAATAGAAGAGATCTCTATGCCCCCTGTTCTTGGTTTTCTCCCATGCTT

1501---------*---------^T---------77--------*-------------------«- 1560

GTAAGTTAAACTTTATCTTCTCTAGAGATAĆGGGGGACAAGAACCAAAAGAGGGTACGAA

1561

H n

c

I

X

M bS of

I®

XX

M n

X

C v

i

J

X

TTGTTGGTCAACAACCAACCACAACTTTCTATAGTTCTTCACTACTCCTAGAGGCTTGAC

------=__<.------=^.===---=—♦·«·------+.

AACAACCAGTTGTTGGTTGGTGTTGAAAGATATCAAGAAGTGATGAGGATCTCCGAACTG

1620

N

c	H		?	1
AvH	iT	G	s«3	a
lin	nf	3	pss	X
uJl	fi	U	E©@	r
ΙΣΣ	XX	X	XXX	T
U			/

GGAGTGAAGCTGTCTGGAGGGAATCATTTTGTTGAAATCAATTAATCTAATCATGCCTCA

1621 -----------+.==_==_===+.=—,=„„„—¢=========^ 1680

CCTCACTTCGACAGACCTCCCTTAGTAAAACAACTTTAGTTAATTAGATTAGTACGGAGT

BM sn ri

XX /

T s

P

E

X

M b

o

X

T

P

E

I

Ά b

o

X

ACTGGATAAATTCACTTATTTTTCACAATTCTTCTGGTTATGCCTTTTCTTCTTTACTTT 1681 *——«.=«.=========<.

TGACCTATTTAAGTGAATAAAAAGTGTTAAGAAGACCAATACGGAAAAGAAGAAATGAAA

1740

FIG.1

S c

	£	o	Z	T
N	RS	u	D	p	Ac	s
d	SC	3	P	1	lo	P
e	aa	A	Π	5	,«a	£
I	IX	X	X	I	XX	X

/

CTATATTTTCATATGCAATGATGGAGATGGAGTACTTGGGATCAGCAGAATTCTAAAACT

1741---------*---------*------------------------*---------* 1800

GATATAAAAGTATACGTTACTACCTCTACCTCATGAACCCTAGTCGTCTTAAGATTTTGA

E

C

S o S

ND	3 S	£	B	CM	AOMra	B
Ir	F SMNC	c	b	yb	vllpu	S
ad	o ascr	0	V	L©	aOauS	c
IX	k JpiF	P	X	TX	Χ9ΣΜ6	X
VI	X ΣΧΣΧ	X	I	XX	ΙΐνΧΣ	X
	///				/ //

ACGGAACCAACTGCTTTCACACCGGGGGAAGACCATCCAGAGCAAGGACCCCAACASTTT

1801 ---->—-------—*—-------*-------------------------*---------+ 1860

TGCCTTGGTTGACGAAAGTGTGGCCCCCTTCTGGTAGGTCTCGTTCCTGGGGTTGTCAAA

S

SB a	M	B
gsDu	b	B	M	s
ltp3	o	s	a	t
IYnA	X	r	©	B
XXIX	X	X	X	X
/ /

GGAAGATCTCTTGAGAAAAGGTTTTAGCACTGGTGTATCCTATATGTATGCTAGTTrATT

1861---------*---------*--------------—------------+ 1920

CCTTCTAGAGAACTCTTTTCCAAAATCGTGACCACATAGGATATACATACGATCAAATAA

	s	H Ca	H i	s a
T	c	V©	SAn?	M	u
a		ii	acca	n	3
q	f	JX	lcXq	1	A
X	X	XX	ΙΧΧΧ	X	X
/		/	/

CGAAGTATCCCAATGGTGTAAGGCCGTCGACTTATTGGGAAAAAGGAGGAAAATCACTTT

1921--------·<“-------·»·---------*---------*---------------« 1980

GCTTCATAGGGTTAeCACATTCCGGCAGCTGAATAACCCTTTTTCCTCCTTriAGTGAAA

C

D M v8 p n is η 1 Ji

X X XX

GATCTCTTGTTTCGGAGAAATAAGTGGCTCACGAGGAATGGAAAGAAACATATTATATAA 1981 -===-==--=4-====-=-==-4=========4-=-===--==^-==-=-==-===-=^-==-==--=--^- 2040

CTAGAGAACAAAGCCTCTTTATTCACCGAGTGCTCCTTACCKTCTITGTATAATATATT

FIG.1 u 0 A

3 ρ 1 c A n a

I IX X s

P ε

i

TATATCGAAGTCCTCYCGTTCAAATACTGGAAGGTGGATCACYYGTAGGAATYGTAGGAA

2241 —-----------------*---------*---------*--------------------ATATAGCTTCAGGAGAGGAAGTTTATGACCTYCCACCYAGTGAACATCCTYAACATCCTT

2100

N		N H
1		1 BC a	H
a	XR	BaBsvH®SM	iT	S
V X	CS	alaaialtw	nf	2
I	ras	®XlJJ®Xyo	fi	a
X	XX	ΙΣΣΧΧΧΧΧΣ	IX	I

////

TGACATAATGCTAATCCAYGTTGYACAYGGCCAAGGAAGCAYAAAAYGAYTCTYYCATYC

21C1---------*----------*---------*--------=4——-----4---------+ 2160

ACTGTAYTACGATTAGGTACAACATGTACCGGTTCCTTCGYATTTYACTAAGAAAGTAAG

R

ε		2	B
C	M	4r	MY 3
o	n	/a	nh p
N	1	3u	la C
I	X	XX	XX X
		/	/

TATAGATACCYCTGGTAGGTAAAGCACYCTACYGTGCTYYAYYGAAAGY7CCCA7CGCGG

2161--------------------*---------*---------o------------------- 2220

ATATCTATGGAGACCAYCC&TYTCGTG&G&TGAGACGAAAYAACYTYCAAGGGYAGCGCC

P c

X

Y h

&

X

Y a

«?

H n

X

M y

x g

CM

Sp

IX

GGGCG&GG&Y&CYYGCCYYCGCGGYYCGACTYYCYYTYCAGGCTYGACTCAYY&TYYYCC

2221 -—=«=—>—4-“ —»——--4.= ====- = 4-.—======4======—-4—-—-—-♦

CCOXTCCYAYGAM»Ga^GCCXCAAGCYGAAAGAAAM9YCCGAACYG^GYAAYAAAA£M®

2280 s P

Aa	S C81M	H	C
vu	M	2Ava2g3	0	iY	V
a9	n	alinSis	d	nf	i
X6	1	NuJX6AC	@	fi
IX	X	ΧΧΧΧΧΧΧ	X	XX	X
/		/ ut

GGYCCTCYCACAGeCCYTYAGAGCYCrTYAYGAYGCCCAeYGAGYAAGAYYCG^GGCTY 2281 —4-==———4——=—>—=-4—4===———4 2340

CCAGGAGAGYGYGGGGAAAYCYCGAGAAATACYACG^TGACYCATYCYAAGCCCCCGAA

FIG.1

Ν

s		5	C		3 35	ENM	3		M
	H	s	Av	F	aDpaST	slb	sT	ε	a	EM
ser	h	P	li	&	asSeph	pao	ma	a	©	an
pif	a	c	uJ	u	Jallia	3ΣΙ	Aq	r	I	rl
III	T	X	ΣΣ	▼ Λ	ΙΣΣΣΣΙ	XVI	:i	X	I	* *
//			/		/ //	/				/

CCCGGCGCAGAAGCTCAT?CTGAACCGCGGGAACCX?CGTCTCT?CGACACAAACGTTT?

2341 φ---------φ---------*---------*---------*---------φ 24CC

GGGCCGCGTCTTCGAGTAAGACTTGGCGCCCTTGGAAGCAGAGAAGCTGTGTTTGCAAAA

C Μ BBS Ν a ν Μ b A sasDlHu i η ο 1 aatpap3

J 1 Σ w BHYnlhA

I Σ I I ΧΧΧΧνίΣ / / /

ATGAAGAGGCTGATGGTGATGAGGATCC

2401 —-------*----------------- 2428

TACTTCTCCGACTACCACTACTCCTAGG

Enzymy przecinające

AccX	ΑίΙΣΣΣ	Alul	AlwX	AlwNl	As@I	AvaX	AvaXI
Bali	BamHI	BanXX	BbvX	BbvII	Bcefl	Bglll	BpulOI
Bsal	BsaAI	BsaBI	Bs&JI	Bsil	Bsal	BsaAI	8spl28Sl
BspCI	BspHI	BspMI	Bsrl	BstBI	BstSI	BstYl	CfrlOl
CviJX	Dd®X	DpnX	DrdXX	Dsal	Ea©I	Bari	Eco57l
EcoBl	EcoDX	ECONX	EcoO109X	EcoPl	BcoPISl	EcoRI	EcoRII
ECOR124/31 Espl	Esp3l Faul Finl Fnu4HI Foki Gdi:
Gsul	Hael	Ha© XX	Haelll	HgiAI	Hhal	HincII	HxnfX
HphI	MaeX	Ma© XX	ΜΛβΙΧΧ	MboII	Mcrl	Miel	Mlyl
Mmel	Mnll	MS@X	MSpl	Mwol	NCiX	NCOI	Ndel
Nhel	NlaXXI	NlaXV	NruI	NspBII	Piel	Pall	PpuMI
PstI	RsaX	SaeXX	SalX	Sau961	Sau3AX	Scal	ScrFI
SfaNX	Siei	SnaBX	Spoi	Spił	Spił	Sstl	Styl
StyLTI	StySJX	TaqX	TaqXX-ł	Taqll-2	Tfil	Thal	Tsp45l
TspEX	Tthłllll	XbaX	Scal	Xaalll	XanX
Enzymy nie przecinające
Aatll	ΑίΙΧΧ	Agel	Ahall	Apal	ApaLl	ΑνεΙΙ	Bani
Bcgl	Bell	BglX	BspCI	BspMIl	BssHII	BstEII	Bau36X
CfrAI	Ciał	Dra!	Dralll	Ordl	EciI	Eco47XXX	EcoAI
EcoDXXX	EcoEZ	EcoKX	EcoR124X	EcoRV	Fs@I	Fspl	HgaX
HgiEII	HindXXX 1	Kin£XXI	Hpal	KpnI	Mlul	Na®X	Nar!
NotI	Nsil	Nspl	PflMX	PshAI	PvuX	PvuIX	RleAI
Rsrll	SfiX	SgrAI	SaaX	Snął	Sphl	SspX	Stul
StySBI	StySPI	StySQI	Tthllll	UballOSl	UballOSl	Shol

CN

Ο

Ll

_Q

CL

Ο

2428

169 149

•· ·· * .‘Ι’·;'. .·. - · -ο*:*-;'· ·.··' ·· * · ? * ί.* ..’***’*'' * · .* ·, ·.. ·» · » '·* ·-·*. ' ' .. ' · *? ' . »·. ♦•ί*’ ’ .· f' ' ·ί*·. .Λ * ·/*' . '·',·«».· “*.·** '- . » ·

\1·Α

Γ

Ι“—ι ~ζ.

.ο m

ο οΣ| fO

I—ί ~αη cO

Ο

-»

Λ'

’-* ·τ:·.,·

·*;♦

ί

F

FIG. 5

^D^a«,e„_tWWawjctwtj ^Cena 4,00 ₂| ' ^Nakiad 90 egz.

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób otrzymywania roślin wykazujących cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej, znamienny tym, że prowadzi się fuzję protoplastu zawierającego w genomie jądrowym lub mitochondrialnym sekwencję DNA sterylności Ogury, która zawiera a) sekwencję ograniczoną nukleotydami o numerach 928 i 1569 z fig. 1 lub b) sekwencję wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją wymienioną w punkcie a), i gdy jest obecna w cytoplazmie rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską z wyjątkiem całego genomu mitochondrialnego Ogury, z protoplastem nie zawierającym tej sekwencji.