PL169783B1 - Sposób wytwarzania sekwencji DNA "sterylnosci Ogury" PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania sekwencji DNA "sterylnosci Ogury", znamienny tym, ze z pelnego genomu mitochondrialnego, wykazujacego ceche cytoplazmicznej meskiej "ste- rylnosci Ogury" izoluje sie sekwencje DNA, nadajaca ceche cytoplazmicznej sterylnosci meskiej, gdy wystepuje w mitochondrialnym lub jadrowym genomie rosliny i a) jest przeno- szona przez sekwencje DNA ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1, lub b) wy- kazuje co najmniej 50% homologii ze wspomniana sekwencja wymieniona w punkcie a). PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania sekwencji DNA ^^^1^ιelr^lności Ogury/. Stwierdzono, że materiał biologiczny, posiadający cechę steryłności męskiej przydatny jest do opracowywania odmian hybrydowych gatunków mających znaczenie w agronomii.

Stwierdzono, że rośliny należące do rodziny krzyżowych, których cytoplazma w komórkach zawiera organella mające sekwencje nukleotydowe, powodujące sterylność męską i korzystne cechy agronomiczne, przydatne do opracowania odmian hybrydowych.

Hybrydy otrzymuje się przez krzyżowe zapłodnienie pomiędzy dwiema populacjami form rodzicielskich, z których jedna odgrywa rolę męską, zaś druga - żeńską. Jednym z wymogów spotykanych przy otrzymywaniu odmian hybrydowych o jednolitej jakości przez krzyżow/anie płciowe wykonane na gatunkach autogamicznych jest zdolność rośliny do samozapylania się. Układy steryłności męskiej pozwalają na otrzymanie roślin żeńskich niezdolnych do samozapładniania, z których po zapyleniu można - bez uciekania się do żmudnych technik, takich jak kastrowanie kwiatów - bezpośrednio zbierać nasiona, które wszystkie są hybrydami.

Pośród genetycznych determinant steryłności męskiej są takie, których nośnikiem jest cytoplazma. W każdym pokoleniu płciowym są one przekazywane wyłącznie przez formę żeńską Otrzymuje się zatem 100% form męskosterylnych w każdym pokoleniu wraz z układem cytopłazmicznej steryłności męskiej (CMS). Te determinanty genetyczne przenosi genom mitochondrialny.

System cytoplazmicznej steryłności męskiej właściwy dła rodziny krzyżowych jest określany przez poniższe cechy:

1) Sterylność męska winna być całkowita, tzn. jakiekolwiek są warunki hodowli i jakakolwiek jest łinia, którą chcemy wykorzystać jako formę rodzicielską żeńską, nie powinna występować tam produkcja pyłku. W przeciwnym razie nasiona zebrane z tych roślin żeńskich pochodziłyby częściowo z samozapłodnienia, a zatem nie byłyby typem hybrydy FI.

2) Wytwarzanie tych roślin należy wykonać przy wykorzystaniu naturalnych wektorów pyłka, tzn. w przypadku tych gatunków: błonkoskrzydłych, dwuskrzydłych oraz wiatru. Pyłek powinien być przeniesiony z roślin zapylających na rośliny męskosteryłne (żeńskie). W praktyce, jedynie owady mogą zapewnić przeniesienie pyłku na odłegłość.

Rośłiny żeńskie winny zatem być wystarczająco przyciągające dła owadów przyłatujących w poszukiwaniu nektaru Morfołogia kwiatów powinna zmusić owada do tego poszukiwania poprzez wierzchołek kwiatu, który umożłiwia zasadniczo kontakt z przetchłinką. W praktyce następuje to w ten sposób, że podstawa kiełicha powinna utworzyć rodzaj rurki wokół podstawy słupka

169 783

3) Morfologia organów żeńskich (słupek) powinna być identyczna jak w przypadku rośliny płodnej. W szczególności powinien występować pojedynczy słupek w kwiecie i mieć on postać prostoliniową. W istocie zdarza się często, że sterylne formy męskie wyrażają się także poprzez feminizację pylników, które zmieniają się w pseudosłupki, a nawet przez przekształcenie nektarów w pełnych kwiatach. Zdarza się także, że tam, gdzie zdeformowane są słupki, dotyczy to także produktów. Wszystkie te odchylenia nie pozwalają na prawidłową produkcję nasion i w tym przypadku można mówić o pewnej sterylności żeńskiej.

4) Do wytwarzania odmian hybrydowych FI u gatunków, gdzie zbiera się nasiona, takich jak rzepa lub gorczyce, warunkiem niezbędnym jest, aby forma rodzicielska męska hybrydy całkowicie zlikwidowała efekt sterylnej cytoplazmy męskiej tak, by rośliny hybrydowe mogły być łatwo zapylone.

W przypadku rodziny krzyżowych pierwszy przypadek męskiej cytoplazmy sterylnej, gdzie CMS został opisany przez Ogurę (1968), dotyczył rzodkwi, Raphanus sativus. Bannerot (1974, 1977) przeniósł cytoplazmę Ogury na rodzaj Brassicae, otrzymując w ten sposób rośliny wykazujące cytoplazmiczną sterylność męską. Rośliny te nie miały zadowalających cech agronomicznych (chloroza w czasie obniżenia temperatury, zła płodność żeńska) i ich zła wydajność czyniła je nieodpowiednimi do wykorzystania handlowego.

Dla uniknięcia chlorozy u roślin z rodziny krzyżowych użyteczne jest połączenie w tej samej komórce genomów jądrowych oraz chloroplastowych tego samego rodzaju. Stąd też rośliny rodzaju Brassicae posiadające jeden z genomów chloroplastycznych nie wykazują już chlorozy. W przypadku, gdy posiadają całość genomu mitochondrialnego Ogury, charakteryzują się pełną cytoplazmiczną sterylnością męską, lecz równocześnie morfologia kwiatów będzie wykazywać odchylenia, co sprawi, że ich zapylenie przez wektory naturalne będzie niemożliwe.

Poza tym w przypadku gatunków, których nasiona mają znaczenie, użyteczne jest przywrócenie płodności męskiej odmian hybrydowych za pomocą genów jądrowych, zwanych restauratorami.

Przywrócenie płodności męskiej w przypadku roślin posiadających całość genomu mitochondrialnego Ogury jest rzeczą trudną, ponieważ należałoby równocześnie wprowadzić do działania szereg genów-restauratorów.

Celem wynalazku było otrzymanie układu sterylności męskiej przez eliminację genów odpowiedzialnych za cechy niepożądane w cytoplazmie Ogury, utrzymując efektywną i łatwą do przywrócenia sterylność męską.

Sposób wytwarzania sekwencji DNA sterylności Ogury według wynalazku polega na tym, że z pełnego genomu mitochondnalnego, wykazującego cechę cytoplazmicznej męskiej steryyności Ogury izoluje się sekwencję DNA, nadającą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej, gdy występuje w mitochondrialnym lub jądrowym genomie rośliny i

a) nośnikiem jej jest sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1, lub

b) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie a) i w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym bądź jądrowym rośliny zapewnia u wspomnianej rośliny cytoplazmiczną sterylność męską.

W szczególności sekwencja DNA sterłmości Ogury wytwarzana sposobem według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

c) nośnikiem jej jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 lub

d) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienoną w punkcie c) oraz tym, że jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych.

Do wytwarzania sekwencji DNA sterylności Ogury w sposobie według wynalazku stosuje się zrekombinowany genom roślinny jądrowy lub mitochondrialny, charakteryzujący się tym, że obejmuje sekwencję DNA sterylności Ogury a) która jest przenoszona przez sekwencję DNA zawartą pomiędzy nukleotydami 928 oraz 2273 sekwencji przedstawionej na fig. 1, bądź b) która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną

169 783 w punkcie a) i która - w przypadku jej obecności w cytoplazmie rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylnością męską.

Wynalazek zilustrowano na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA mitochondrialnego z rzodkwi Ogury, noszącą cechę CMS, fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu DNA mitochondrialnego opisanego w fig. 1, fig. 3 przedstawia elektroforezę DnA mitochondrialnego po trawieniu przez Bgll (3a) i Nrul (3b). Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą CoxI (Hiesel et al. 1987), fig. 4 przedstawia elektroforezę dNa mitochondrialnego po trawieniu przez SA1I. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą ograniczoną przez nukleotydy 389 i 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1, fig. 5 przedstawia owoce wytworzone przez kapusty noszące różne genomy cytoplazmiczne, fig. 6 przedstawia elektroforezę RNA mitochondrialnego. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą, fragment EcoRI-BAM HI, włączającej część sekwencji nazywanej ORF B.

Sekwencja DNA steiylności Ogury jest określona przez odniesienie do sekwencji ograniczonej numerami 1 i 2428 na fig. 1. Nośnikiem jej jest transkrybowana sekwencja, której skraje punkty 3' i 5' są na fig. 2 połączone linią kropkowaną i którą obserwuje się wyłącznie u roślin męskoste^rylnych. ORF B odpowiada obszarowi rozpoczętego odczytu. Określenie to nadano wskutek zaobserwowanej homologii z sekwencją opisaną przez Brennicka. Na fig. 2 przedstawiono obszarem zakreskowanym sekwencję odpowiadającą jednemu z dwóch genów RNA, przenoszącego formylometioninę.

Sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy oznaczone numerami 928 oraz 2273 na fig. 1 odpowiada transkryptowi, który może być uwidoczniony przez hybrydyzację molekularną (1, 4), jak przedstawiono na fig. 6. Na fig. 6 każda studnia odpowiada roślinie płodnej (F) bądź męskosterylnej (S). Jedynie rośliny męskosterylne syntetyzują transkrypt około 1400 zasad. Ten transkrypt rozpoczyna się w pozycji 928 (10 zasad) z fig. 1 i kończy się w pozycji 2273 (5) (rozpoczęcie oraz zatrzymanie transkrypcji może się dokonać w różnych położeniach w mitochondriach roślinnych).

Jak wykazały badania, cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 2273 z fig. 1, zapewniającą cechę CMS lub cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 1569 z fig. 1 i transkiybowaną na RNA, nadającą cechę CMS, ma szereg charakterystycznych cech i obejmuje ona:

- chloroplasty tego samego rodzaju co genom jądrowy bądź innego rodzaju lecz zgodne z tym genomem jądrowym,

- nie obejmuje całości ani też części jednego bądź drugiego (bądź obydwu) fragmentu genomu mitochondrialnego Ogury, który:

-jest nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji,

-jest nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej.

Nieobecność tych fragmentów zwanych sekwencjami niepożądanymi jest niezbędna do otrzymania genomów mitochondrialnych o dobrej jakościowo sterylności męskiej, zgodnej z 4 cechami wymienionymi poprzednio.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się zrekombinowany genom roślinny jądrowy bądź mitochondrialny obejmujący sekwencję DNA ^i^i^in^]^:^ości Ogury c) która jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną nukleotydami o numerach 928 oraz 1569 z fig. 1 lub d) która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie c) i która - w przypadku obecności w cytoplazmie rośliny i transkrypcji na RNA nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylnością męską. Genom jądrowy lub mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku można scharakteryzować przez to, że wspomniany genom zrekombinowany pozbawiony jest całości lub części fragmentów genomu Ogury.

- będącego nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji,

- będącego nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej, bądź w którym wspomniane fragmenty są nieaktywne.

169 783

Ujmując rozpatrywane zagadnienie dokładniej: zrekombinowany genom jądrowy bądź mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku może być pozbawiony całości lub części fragmentu około 10,7 kb po trawieniu przez Bgll lub fragmentu około 11 kb po trawieniu przez NruI, nośników genu CoxI.

Jest to uwidocznione w szczególności na fig. 3 przez hybrydyzację molekularną z sondą, która jest nośnikiem sekwencji CoxI, lub jest pozbawiony całości lub części fragmentu 5, kb po trawieniu przez SalI lub fragmentu około o 15 kb po trawieniu przez NruI lub fragmentu o około 18,5 kb po trawieniu przez BglI, nośników jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę.

Uwidoczniono to w szczególności na fig. 4, przez hybrydyzację molekularną z sondą ograniczoną przez nukleotydy o numerach 389 oraz 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1. Na fig. 3 oraz 4 genotypy oznaczone cyframi odpowiadają roślinom, w których występuje odpowiedni układ cytoplazmicznej sterylności męskiej.

GENOTYPY	CHLOROPLASTY	MITOCHONDRIA
B. n.	B. napus	B. napus
27	B. napus	B. napus/Ogura
OGU	B. sativus (OGU)	B. sativus (OGU)
9, 17, 21, 24, 27c	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
B. o.	B. oleracea	B. oleracea

Ponadto istnienie dobrej jakościowo cechy CMS wymaga obecności sekwencji DNA, którą można oznaczać przez hybrydyzację DNA/DNA na produktach trawienia. Zatem niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania sekwencji DNA, która mogła być określona i charakteryzuje się tym, ze zawiera sekwencję, która po trawieniu przez NcoI daje fragment o 2,5 kb, po trawieniu przez NruI daje fragment o 6,8 kb, zaś po trawieniu przez SalI daje fragment o 4,4 kb.

Tę sekwencję można również oznaczyć przez hybrydyzację całkowitego RNA roślin męskosterylnych. Udowodniono istnienie transkryptu o około 1400 parach zasad. Jest on nieobecny u roślin powracających do płodności.

Określenie niepożądanych oraz niezbędnych z punktu widzenia sterylności Ogury sekwencji nukleotydowych, otrzymywanych sposobem według wynalazku pozwala na wyselekcjonowanie - za pomocą technik hybrydyzacji DNA znanych specjalistom - materiału roślinnego o dobrej jakości, która jest nośnikiem chloroplastów zgodnych z genomem jądrowym oraz nośnikiem mitochondriów, bez konieczności oczekiwania na roślinę dojrzałą i pojawienie się kwiatów i owoców Jest to zatem narzędzie bardzo skuteczne dla wyselekcjonowania roślin posiadających męskosterylną cytoplazmę, o korzystnych cechach agronomicznych.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się mitochondrium charakteryzujące się tym, że zawiera ono sekwencję nukleotydową odpowiadającą DNA i wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną zasadami o numerach 928 i 2273 na fig. 1 oraz kodującą cytoplazmiczną męską sterylność Ogury - bądź też mitochondrium zawierającego sekwencję DNA, której nośnikiem jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1, bądź wykazująca 50% homologii z tą sekwencją i która jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych. Wspomniane DNA może poza tym wykazywać cechy określone powyżej, w szczególności nieobecność sekwencji niepożądanych.

Analogiczne cechy ma również cytoplazma rodziny roślin krzyżowych, charakteryzująca się tym, ze zawiera sekwencję DNA sterylności Ogury' obecną w genomie mitochondrialnym, cytoplazma ta zawiera poza tym chloroplasty tego samego rodzaju lub też innego rodzaju, lecz zgodnie z genomem jądrowym.

169 783

Sekwencja sterylności Ogury charakteryzuje się tym, że:

a) jest przenoszona przez sekwencję DNA złożoną z 2428 para zasad, przedstawioną na fig· 1,

b) jest ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1 i odpowiada transkryptowi wskazanemu przez linie kropkowane na fig. 2 i uwidocznionemu przez hybrydyzację molekularną (1, 4) na fig. 6,

c) wykazuje co najmniej 50% homologii z wymienioną sekwencją wspomnianą w punkcie b) i - w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylnością męską, lub

d) jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 i transkiybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych lub

e) wykazuje co najmniej 50% homologii z sekwencją opisaną w punkcie d) i jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych.

Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie roślin z rodziny krzyżowych, zawierających chloroplasty i jądro tego samego rodzaju lub zgodne oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, takąjak określona powyżej.

Można także otrzymać rośliny należące do rodzaju Brassica, zawierające chloroplasty i jądro Brassica oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, takąjak określona powyżej.

Ten genom mitochondrialny winien również być nośnikiem pewnej liczby genów rozpatrywanego gatunku Brassica. Uzyskuje się to przez rekombinację między genomem Ogury i genomem Brassica.

W szczególności można otrzymać rośliny należące do gatunku Brassica napus, zawierające jądro Brassica i cytoplazmę mieszczącą w sobie chloroplasty Brassica oraz mitochondria męskosterylne, będące nośnikiem DNA, otrzymanego sposobem według wynalazku. Mitochondria te mogą również być nośnikiem większości genów mitochondrialnych Brassica napus (186, Atp9, Atp6, CoxII, ndhl, cob). Brassica napus odpowiada rzepakowi, bądź roślinom Canola i Rutabaga.

Analogicznie, rośliny gatunku Brassica oleracea, zawierają jądro Brassica oraz cytoplazmę, mieszczącą w sobie chloroplasty Brassica i mitochondria zawierające sekwencję DNA, kodującą cechę CMS Brassica oleracea obejmuje różne kapusty: kapusty głowiaste, kapustę brukselską, kalarepy, brokuły, kapusty pastewne i kalafiory.

Ponadto sekwencja DNA otrzymana sposobem według wynalazku pozwala na otrzymanie roślin gatunku Brassica campestris zawierającej jądro Brassica i cytoplazmę, mieszczącą w sobie chloroplasty Brassica zgodnie z genomem jądrowym oraz mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA kodującą cechę CMS, takąjak określono Brassica compestris odpowiada rzepakowi, brukwi, kapuście chińskiej, pekińskiej i japońskiej.

Analogicznie, sekwencje otrzymywane sposobem według wynalazku pozwalają na otrzymanie roślin w grupie zawierającej: B. juncea, B. nigra, B. hirta, B. carinata, zawierających jądro Brassica i cytoplazmę, mieszczącą w sobie chloroplasty Brassica zgodnie z genomem jądrowym oraz mitochondria zawierające sekwencję DNA kodującą cechę CMS, tOkąjak określono.

Można także otrzymać roślinę należącą do rodzaju Brassica, której genom jądrowy zawiera sekwencję steiylności Ogury”, taką jak określono powyżej, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium. Roślina ta może w szczególności należeć do jednego z następujących gatunków: B. napus, B. oleracea, B. campestris, B. nigra, B. juncea, B. hirta i B. carinata.

Obecność sekwencji sterylności Ogury jest konieczna i wystarczająca dla indukowania całkowitej nieobecności pyłku przy nieobecności genów-restauratorów. Zapylenie tych roślin jest zapewnione normalnie dzięki prawidłowej produkcji nektaru.

Morfologia organów żeńskich jest normalna i dojrzałe owoce (łuszczyny) zawierają prawidłową liczbę nasion Fig. 5 ilustruje morfologię zaobserwowaną u rośliny normalnej świadka (z), rośliny o morfologii odchylającej się od normy, posiadającej cały genom Ogury [z

169 783 (6)] i chloroplasty Brassica oleracea, kapusty, będącej nośnikiem chloroplastów Brassica napus i mitochondriów męskosterylnych, posiadających geny Brassica napus [z (A)] oraz roślin będących nośnikami chloroplastów Brassica oleracea i zrekombinowanych mitochondriów, nie zawierających już niepożądanych sekwencji [z (9) i z (17)]. Rośliny te mają następujące cechy.

GENOTYPY	CHLOROPLASTY	MITOCHONDRIA
z	B. oleracea	B. oleracea
z (A)	B. napus	B. napus/Ogura
z (6)	B. oleracea	Ogura
z (9)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
z (17)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura

Genotypy z (A) i z (6) nie wykazują odpowiedniego układu cytoplazmicznej sterylności męskiej.

Takie rośliny można otrzymać na przykład za pomocą techniki fuzji protoplastów lub przy użyciu wszystkich innych technik, które zapewniają prawidłową rekombinację między genomem mitochondrialnym rozpatrywanego gatunku a genomem mitochondrialnym Ogury. U takich roślin płodność jest restaurowana przez pojedynczy gen-restaurator, zwany Rfl, pochodzący z rzodkwi, co nie zachodzi w przypadku roślin, które są nośnikiem całości nieodpowiedniego genomu mitochondrialnego.

Takie rośliny można również otrzymać przez naturalną lub sztuczną reprodukcję płciową.

Rośliny posiadające genom mitochondnalny można również otrzymać przez transfer genu do mitochondrium.

We wszystkich przypadkach rośliny te posiadają właściwy układ CMS, a mianowicie:

- całkowitą sterylność męską,

- morfologię pozwalającą na prawidłowe zapylenie i prawidłową produkcję nasion, jak to zilustrowano w tabeli 1 oraz tabeli 2.

Wytworzenie sekwencji DNA sterylności męskiej Ogury' sposobem według wynalazku pozwala na otrzymanie roślin hybrydowych. Metoda otrzymywania takich roślin polega na tym, ze krzyżuje się roślinę wykazującą odpowiednią cechę CMS, obejmującą sekwencję sterylności Ogury w swoim genomie mitochondrialnym lub jądrowym z rośliną normalną - gdy dotyczy to hodowli warzywnej lub pastewnej - lub z rośliną wnoszącą gen-restaurator płodności RF1 - gdy dotyczy to zbierania nasion. Metoda ta obejmuje także wytwarzanie roślin hybrydowych.

Uogólniając, najjepsze cechy agronomiczne otrzymuje się dla roślin męskosterylnych posiadających chloroplasty tego samego gatunku co jądro i mitochondria wykazujące odpowiedni układ sterylności męskiej.

Tabela 1 przedstawia wydajność linii kapusty na różnych cytoplazmach, (odpowiednie są genotypy z 9 lub z 17). Tabela 2 przedstawia wydajność linii rzepaku na różnych cytoplazmach, (odpowiednie są genotypy Fu 27, Fu 58 i Fu 85).

Dla wykrycia sterylności męskiej, a także do selekcji klonów stosuje się wytworzoną w tym celu sondę obejmującą sekwencję co najmniej 10 zasad, korzystnie zaś 15 zasad, z sekwencji zawartej między nukleotydami o numerach 928 i 1569 na fig 1; wspomnianą sondę można oznaczyć na przykład w środowisku radioaktywnej zasady oraz każdym innym środkiem (na przykład przez fluorescencję).

Cechy i korzyści wynalazku zostaną lepiej uwidocznione przez następujące przykłady.

169 783

TABELA 1: Wydajność linii Z (kapusta do kwaszenia) przy różnych cytoplazmach

169 783

TABELA 2: Wydajność linii DARMOR (rzepak zimowy) przy różnych cytoplazmach t>1 a

rH >1

U

Φ +>

n o

Λ!

n

Φe o

e '0 -rl '0] N O fi Λ! •m u) rt ft Ό Φ

N

Pi

169 783

Ό <d

M

U dl fe l

+J

TABELA 2: (dokończenie) dl

H

U •rl

O '01 o

•n nl *d •r|

Λ •H id rM

W

Em SB	i 120 109 115	122 131 132
Em §	31.6 30.7 33,3	42,2 36,0 38,1
HI	0,256 0,269 0,262	0,293 0,270 0,276
MST	1077 1064 1176	1337 1228 1243
O H CM	4,31 3,88 4,98	4,09 3) 65 4,11
i— NG	70028 81841 67291	106188 99947 92428
NGPS	Ol OJ IX) Ol rM CO rM	11) 6 11,7 11,0
PIS	81,9 80.7 87.7	82,8 76.5 84.6
NS	7183 7334 7977	9292 8617 8389
	DLRMOR BIENVENU JEi NEUF	Fo 2i DLRMOR Fi 5i DLRMOR Fo 11i DARMIOA *

dl· >1

N

O

N

0)

O rM

n) o

•rl

0) <d <d

Λ

N

O rl m

CM o

£ o>

g >1

N

O

N rM

M id •N dl· •r|

U o»

d) rM '0

O id

O id •ri

U id +>

$

O>

id s

o •rl id

M id •N dl· rl

O ω u

H H

Cm cm i i

CM g

>1

N

O

N rM id

Λ

N

O •rl rM

CM

O •rl

0} id 43 N O •rl i^-1 '0 '01 o

O £

Em «

id θ’ '□ '01 o

m id •d £

dP

S

Ό

M

O •rl

N

A!

•rl 'N id

A!

* ω o h

55 « >1 >1

N

O

N rM

d)

U

O s

O

d) id *

o o

ΨΙ dl •d

N o

+>

dl·

N □

(tf* m

N id dl +>

•rl rM '01

O *

169 783

Przykład I. Wykrycie sekwencji DNA odpowiedzialnej za cytopłazmiczną sterylnością męską Ogury.

1. Roślina.

Przez cybrydę określa się formy otrzymane przez fuzję izolowanych protoplastów, po której następuje regeneracja całej rośliny. Taki sposób otrzymywania pozwala na połączenie w komórce informacji cytoplazmicznych pochodzących od obydwu form rodzicielskich. Cybrydę nr 13 otrzymano pośród 820 roślin regenerowanych przez fuzję protoplastów między cybrydą B. napus odporną na triazynę, cms Ogury (potomstwo cybrydy 77 opisanej w Pelletier et al., 1983 oraz Chetrit et al., 1985) oraz odmianą pochodzącą od Brutor, wrażliwą na triazynę oraz płodną. Próba odporności na triazynę (Ducruet i Gasąuez, 1978) wykonana na próbie liścia każdego regeneranta pozwoliła na ustalenie typu chloroplastu (chloroplasty odporne na triazynę pochodzące od formy rodzicielskiej 77 lub chloroplasty wrażliwe na triazynę pochodzące z linii Brutor). Wyhodowano rośliny i obserwowano stadium kwitnienia. Rośliny będące kombinacjami nierodzicielskimi (bądź czułe /męskosterylne bądź odporne/ męskie płodne) wyselekcjonowano jako cybrydy. Cybryda nr 13 była typu wrażliwa/męskosterylna. Cybryda nr 1 była typu odporna/męska płodna.

2. Wyodrębnienie kwasów nukleinowych.

Całkowity DNA wyodrębniono przy użyciu liści pochodzących z czterotygodniowych roślin według metody opisanej przez Dellaporta (1983). DNA mitochondrialny wyekstrahowano z liści ośmiotygodniowych roślin, tak jak opisali to Vedel i Mathieu, 1982, z następującymi wariantami:

mitochondria nie zostały oczyszczone w gradiencie sacharozy po lizie i lizę wykonano w sarcosylu 4% z proteinazą K 0,5 mg/ml (Boehringer Manheim GmbH), w Tris pH 8, 50 mM, EDTA 20 mM. Po wytrąceniu, DNA mitochondrialny oczyszczono przez odwirowanie w gradiencie bromku etydyny - chlorku cezu (metoda 1 - Vedel i Mathieu 1982) w probówkach do odwirowania w poliallomerze.

Całkowite RNA wyodrębniono przy użyciu liści lub pączków kwiatowych według pracy Logemanna et al., 1987.

RNA mitochondrialne wyekstrahowano z ośmiotygodniowych kalafiorów według techniki Sterna i Newtona, 1986.

3. Analizy przez restrykcję DNA mitochondrialnego oraz elektroforezę w żelu agarozowym.

Analizy wykonano tak, jak opisali Pelletier et al., 1983. Całkowite lub mitochondrialne RNA umieszczono na żelach elektroforetycznych, zawierających formaldehyd, tak jak opisali Sambrook et al., 1989.

Hybrydyzacja.

Przeniesienie DNA bądź RNA na filtry nylonowe (Hybond -N, Amersham) wykonano przez absorpcję kapilarną przy użyciu, odpowiednio, 6 x SSC bądź 10 x SSPE według instrukcji producenta. Prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono według Amershama, wykorzystując sondy znaczone przez wieloinicjujący układ znaczenia DNA (Amersham) po oczyszczeniu na kolumnach Sephadex G50 (Sambrook et al., 1989).

5. Klonowanie DNA mitochondrialnego.

Dwa banki genomowe linii cybrydy męskosterylnej (13-7) oraz rewertanta (13-6) utworzono w wektorze fagu lambda EMbL3 i hodowano na szczepie restryktywnym E. coli Nm539 (Erischauf et al., 1983). Otrzymano około 2,5 x 104 klonów na mg DNA mitochondrialnego.

Banki DNA mitochondrialnego mianowano i rozwinięto w celu wyodrębnienia warstewek, które przeniesiono na filtry nylonowe, tak jak opisali Sambrook et al., 1989. Sondę hybrydyzacyjną wykorzystywaną do skrrningowania dwóch banków DNA mitochondrialnego przygotowano następująco: fragment DNA mitochondrialnego, specyficzny dla CMS, wymyto, wykorzystując procedurę Gene clean TM (BIO 101 INC.), przy użyciu produktu trawienia DNA mitochondrialnego, umieszczonego na preparatywnym żelu agarozowym. Wymyty DNA następnie znaczono tak jak opisano wyżej

169 783

Ekstrakcja DNA Lambda, podklonowanie fragmentu NcoI 2,5 w miejscu NcoI pTrc99A (Amann et al., 1988) oraz ekstrakcje DNA plazmidowego wykonano według protokołów Sambrooka et al., 1988. Plazmidy rekombinujące wprowadzono na szczep E. coli NM522 (Gough i Murray, 1983).

6. Badanie genetyczne cybrydy 13 i jej potomstwa.

W pierwszym pokoleniu potomstwa otrzymanego przez zapylenie cybrydy 13 przez Brutor, złożonym z 13 roślin, pięć jest całkowicie męskosterylnych (włączając w to rośliny 13-2 i 13-7), jedna męska płodna (numer 13-6) i siedem praktycznie całkowicie sterylnych z kilkoma kwiatami męskimi płodnymi.

Roślina płodna 13-6 została samozapylona oraz, skrzyżowana z Brutorem. W dwóch przypadkach otrzymuje się wyłącznie rośliny płodne (odpowiednio 43 i 42).

W przypadku krzyżowania rośliny męskosterylnej numer 13-7 oraz Brutora 24 potomków jest całkowicie sterylnych, zaś 6 ma kilka kwiatów płodnych; jest to wynik podobny do otrzymanego przy użyciu samej cybrydy. Roślinę 13-2 skrzyżowano z linią restauracyjną RF, która jest heterozygotą dla specyficznych genów-restauratorów męskiej sterylności Ogury (Chetrit et al., 1985). Potomstwo tej krzyżówki składa się z 53 roślin męskosterylnych, 37 roślin męskich płodnych oraz 9 roślin praktycznie całkowicie sterylnych, jednakże zawierających kilka kwiatów płodnych. Wyniki te sugerują, że rośliny męskosterylne z rodziny cybrydy 13 zawierają determinantę CMS Ogury, podobnie jak inne cybrydy badane poprzednio o prostszym profilu restauracji (Chetrit et al., 1985).

W tym stadium badań można było wziąć pod uwagę dwie możliwości: albo cybryda 13 zawiera mieszaninę genomów mitochondrialnych męskich płodnych oraz męskosterylnych i można je bardziej wyselekcjonować w celu oczyszczenia dwóch fenotypów lub też cybryda 13 zawiera zrekombinowany genom mitochondrialny o niestabilnej strukturze, który wraca do bardziej stabilnej konfiguracji płodnej i będzie niemożliwe utrzymanie jednorodnego fenotypu męskosterylnego w następnych pokoleniach.

Sterylne rośliny męskie, otrzymane przy użyciu potomstwa sterylnej rośliny męskiej numer 13-7 uzyskano równocześnie przez rozsadę i przez krzyżowanie płciowe z Brutorem. Po zmiennej liczbie pokoleń (1-5), za pomocą obydwu metod, wszystkie rodziny dały rośliny płodne, inaczej jest w przypadku otrzymanych w ten sposób roślin całkowicie płodnych, które nie dają nigdy ponownie roślin sterylnych.

W świetle tych wyników można wziąć pod uwagę, że drugie wyjaśnienie zaproponowane powyżej, czyli ze cybryda 13 zawiera niestabilny genom mitochondrialny, który traci determinantę CMS Ogury podczas procesu prowadzącego do konfiguracji płodnej, bez możliwości powrotu do fenotypu sterylnego jest wyjaśnieniem poprawnym.

7. Porównanie mitochondrialnego DNA w przypadku roślin męskosterylnych oraz płodnych rewertantów. Wyodrębnienie specyficznego fragmentu roślin męskosterylnych.

DNA mitochondrialny wyekstrahowano z liści męskosterylnego potomstwa 13-7 oraz płodnych rewertantów (potomstwo 13-6 lub 13-7) i trawiono licznymi enzymami restrykcyjnymi, w celu porównania jego profilu restrykcyjnego. Genomy mitochondrialne dwóch typów są bardzo podobne, gdyż nie można zaobserwować żadnej różnicy między profilami restrykcyjnymi mitochondriów męskosterylnych i płodnych rewertantów, uzyskanymi przy użyciu rozmaitych enzymów. Jednak fragment restrykcyjny o 6,8 kb wykryto w profilu restrykcyjnym DNA mitochondrialnego roślin męskosterylnych trawionych przy użyciu NruI, zaś nigdy nie zaobserwowano w profilach odpowiednich płodnych rewertantów.

Fragment (zwany N 6,8) wymyto z żelu agarozowego, znaczono i wykorzystano jako sondę na profilach restrykcyjnych DNA mitochondrialnego otrzymanych przy użyciu NruI: ważny sygnał przy 6,8 kb zaobserwowano u całego męskosterylnego potomstwa cybrydy 13, podczas gdy żaden fragment tej wielkości nie uległ hybrydyzacji z sondą w genomach mitochondrialnych płodnych rewertantów Poza tym, sonda N6,8 hybrydyzuje z fragmentem o 6,8 kb w mitochondrialnym DNA Ogury, trawionym przy użyciu NruI, sonda nie hybrydyzuje natomiast z fragmentem pochodzącym od B napus cv Brutor wskazując, że fragment ten jest pochodzenia Ogury.

169 783

Bank lambda, zawierający ekstrakty DNA mitochondnalnego pochodzącego od roślin męskosterylnych (13-7) sprawdzono ze znaczonym wymytym fragmentem i spośród 8 klonów hybrydyzujących, wyodrębniono 2 fagi rekombinujące, zawierające cały fragment N6,8 oraz sekwencje sąsiadujące. Otrzymano szczegółową mapę restrykcyjną tego obszaru. Hybrydyzacja profilu restrykcyjnego DNA mitochondnalnego, pochodzącego od potomków płodnych i sterylnych cybrydy 13 z N6,8 w charakterze sondy, pozwoliła ograniczyć obszar specyficzny genu męskosterylnego do fragmentu Ncol o 2,5 kb.

Fragment Ncol o 2,5 kb znaczono i wykorzystano jako sondę w stosunku do DNA mitochondrialnego, pochodzącego od potomków 13-7 i 13-6 trawionego przy pomocy Ncol. Oprócz sygnału, przy 2,5 kb specyficznego dla profilu męskosterylnego, liczne fragmenty Ncol hybrydyzują równocześnie w profilach płodnych rewertantów oraz profilach męskosterylnych, fragmenty te są przy 2,2, 10 i 14 kb. Fragment Ncol o 2,7 kb silnie hybrydyzuje w genomie mitochondrialnym płodnych potomków, natomiast nie hybrydyzuje w przypadku potomków sterylnych. Analiza tego profilu hybrydyzacji prowadzi do wniosku, że fragment Ncol o 2,5 kb, chociaż specyficzny dla męskosterylnego DNA mitochondnalnego, zawiera sekwencje, które powtarzają się gdzie indziej w genomie mitochondrialnym (we fragmetach o 2,2, 10 i 14 kb po wytrawieniu przy użyciu Ncol) i te powtarzające się sekwencje są również obecne w DNA mitochondrialnym płodnych rewertantów poza specyficznym fragmentem o 2,7 kb.

Całkowite RNA wyekstrahowano z liści lub z zalążków potomków cybrydy 13 lub z męskosterylnych lub płodnych cybryd (pochodzących z innych doświadczeń polegających na fuzji) i linii Brutor. Northern blots (przemieszczenia typu Northern) wykonano i hybrydyzowano z sondą odowiadającą wstawce (insertowi) klonu lambda zawierającego N6,8 opisanego w przykładzie III. Wykryto główny transkrypt o 1,4 kb u wszystkich cybryd męskosterylnych, także w przypadku cybrydy 13-7, podczas gdy nie zaobserwowano żadnego transkryptu tej wielkości w linii Brutor ani tez w przypadku dwóch cybryd płodnych (różnych od cybrydy 13). Ponadto rośliny płodne wykazują transkrypt o 1,1 kb hybrydyzujący z sondą, nieobecny lub obecny na bardzo niskim poziomie, we wszystkich badanych cybrydach męskosterylnych. Liczne transkrypty wspólne dla wszystkich próbek hybrydyzują słabo z sondą, z powodu znacznej wielkości znaczonej wstawki (insertu). Sprawdzono, że transkrypty mitochondrialne w próbkach całkowitego RNA można wykryć przez hybrydyzację samego Northern biot (przemieszczenia typu Northern) z fragmentem DNA zawierającym sekwencję genu atpa

Ten sam specyficzny transkrypt o 1,4 kb znaleziono w mitochondrialnych RNA Ogury wyekstrahowanych z kalafiorów, przy użyciu jako sondy fragmentu NcoI 2,5. Dokładne granice tego transkryptu wyznaczono przy wykorzystaniu w charakterze sondy podklonów fragmentu NcoI 2,5.

8. Badanie cybrydy 1 i jej potomstwa.

Cybryda 1 była płodną formą męską. Spośród jej potomstwa roślina 1.12 była płodna, zaś roślina 1 18 - sterylna. Roślina 1 12 dała jako potomstwo rośliny sterylne (S3) i rośliny płodne (RF3) Roślina 1.18 dała rośliny sterylne (S2) oraz gałąź płodną (RF2). Rośliny S2 i S3 restauruje się tym samym jądrowym genem restaurującym płodność pyłkową co w przypadku cybrydy 13.

DNA mitochondrialny roślin S2 i S3, znaczony przez hybrydyzację z fragmentem NcoI o 2,5 kb, nie daje sygnału przy 2,5 kb po trawieniu przez NcoI, ani tez sygnału przy 6,8 kb po trawieniu przez NruI.

Podobnie, hybrydyzacja całkowitego RNA (Northern) z sondą odpowiadającą sekwencji ORFB nie daje sygnału przy 1,4 kb, jak w przypadku sterylnej cybrydy 13. Natomiast sonda odpowiadająca sekwencji między nuldeotydami 928 i 1569 z fig. 1 daje sygnał w Northern przy około 1,3 kb. Sygnał ten jest nieobecny w przypadku RNA roślin RF1, RF2, RF3 lub Brutor. Podobnie możliwe jest wykorzystanie tej samej sekwencji (928-1569) jako sondy, przy przesunięciu punktowym (dot biot) całkowitych RNA i w tym przypadku wszystkie rośliny męskosterylne dają sygnał.

Powyższe wyniki wskazują, ze rośliny S2 i S3, mimo że męskosterylne, nie zachowały sekwencji nukleotydowej, opisanej na fig. 1, w swojej oryginalnej konformacji i pokazują, ze

169 783 część tej sekwencji zawarta między nukleotydami 928 i 1569 jest nośnikiem specyficznej determinanty sterylności Ogury; czyni ona rośliny męskostery^lnymi, gdy ta sekwencja ulegnie transkrypcji.

Sekwencja ta nie ma znaczącej homologii z sekwencjami obecnymi w bankach danych.

Przykład II. Wykrycie sekwencji niepożądanych w genomie mitochondrialnym Ogury.

Zbiór cybryd otrzymano w ramach gatunku B. napus przez fuzję protoplastów rzepaku, będącego nośnikiem cytoplazmy Ogury i rzepaku normalnego. Pierwszy z nich jest męskosterylny i ma deficyt chlorofilu w niskiej temperaturze, drugi zaś normalnie zielony i płodny. Cybrydy wyselekcjonowano spośród roślin regenerowanych i zachowano te, które były męskosteiylne i normalnie zielone.

Cybrydy te skrzyżowano z różnymi odmianami - odpowiednio - rzepaku bądź kapusty. Krzyżówki te powtarzano w każdym pokoleniu z tymi samymi odmianami tak, aby otrzymać określony genotyp bliski genotypu takiego, jak w przypadku odmiany wstecznej.

Wspomniane wyżej różne odmiany przekształcone w ten sposób na cytoplazmach różnych cybryd poddano próbom agronomicznym, w celu zmierzenia produkcji nasion; zależy ona od szeregu czynników: produkcji nektaru wystarczającej dla zapewnienia zapylania przez owady, prawidłowej morfologii kwiatowej, tak aby zapylenie było skuteczne i by owoce się prawidłowo rozwijały.

Zbiór cybryd mógł być zatem podzielony na dwie partie:

- partię cybryd wykazującą sterylność męską odpowiednią dla handlowej produkcji nasion,

- partię cybryd nie wykazującą wszystkich cech korzystnych dla prawidłowej produkcji handlowej nasion.

Do pierwszej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 27, 58, 85 oraz cybrydy kapusty nr 9, 17, 21, 24 i 27c.

Do drugiej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr23s, 77, 118 oraz cybrydy kapusty nr 1, 6 i 14.

Całkowite DNA tych cybryd poddano trawieniu przez enzymy: Sali, Ncol, Nrul, BglI, Pstl, KpnI. Otrzymane Southern blots (przeniesienia typu Southern) hybrydyzowano z różnymi sondami mitochondrialnymi Atpa, Cob, CoxI, Atp6, 26S, 18S i dwoma fragmentami genomu Ogury: o 2,5 kb otrzymanym po trawieniu przez NcoI i o 19,4 kb otrzymanym po trawieniu przez NruI.

Dwie partie cybryd różnią się następująco:

a) nr nr 23 S, 77, 11S - w przypadku rzepaku - oraz 1, 6, 11 - w przypadku kapusty - posiadają obszar genomu Ogury, który otacza gen coxI rozpoznawalny przez fragmenty BglI o 10,7 kb lub NruI o 11 kb oraz obszar genomu Ogury, który otacza jeden z genów RNA, przenoszącego formylometioninę, rozpoznawalny przez fragmenty SalI o 5,1 kb i NruI o 15 kb.

b) nr nr 27, 58, 85 - w przypadku rzepaku - oraz 9, 17, 21, 24 i 27c - w przypadku kapusty nie posiadają obszarów odpowiadających, które zostały zmienione - na skutek rekombinacji między genomami dwóch form rodzicielskich, które uległy fuzji - przez analogiczne obszary genomu mitochondrialnego rzepaku w przypadku nr nr 27, 58, 85 oraz kapusty w przypadku nr nr 9, 17, 21, 24 i 27c.

Na tej podstawie wnioskuje się, ze dwa rozpatrywane obszary genomu Ogury są niepożądane, jeśli chce się uzyskać układ sterylności męskiej odpowiedni dla handlowej produkcji nasion

Przykład III Przykład ten ilustruje znaczenie znajomości sekwencji męskiej sterylności Ogury oraz sekwencji niepożądanych dla wykonania bezpośredniego wyselekcjonowania otrzymanych cybryd bez konieczności wieloletniego krzyżowania wstecznego oraz testów agronomicznych.

Łączy się protoplasty rośliny z rodzaju Brassica, będące nośnikiem cytoplazmy Ogury z protoplastami rozpatrywanego rodzaju Brassica Uzyskane w wyniku fuzji kolonie hoduje się in vitro i powoduje regenerację w środowisku, które sprzyja tworzeniu pączków (zob. Pelletier et al., 1983).

169 783

Przy użyciu 1 g świeżego materiału, co dotyczyłoby zasklepki lub fragmentu regenerowanego zarodka roślinnego, możliwe jest, przy użyciu technik opisanych poprzednio, wyodrębnienie całkowitego DNA. Po trawieniu przez Sali, hybrydyzacja typu Southern z sondą zawartą między nukleotydami nr 389 i 1199 (zob. fig. 1) powinna dać sygnał jedynie dla 4,4 kb (nie powinna dać sygnału przy 5,1 kb). Podobnie po trawieniu przez NruI i hybrydyzacji z sondą zawierającą gen CoXI powinno się otrzymać sygnał dla wielkości różnej od 11 kb.

Wspomniane hybrydyzacje pozwalają przewidzieć, że dysponuje się rośliną, która będzie męskosterylna i która będzie się nadawać do handlowej produkcji nasion.

Przykład IV. Przykład ten jest wariantem przykładu III z tym, że w miejsce wykonania fuzji protoplastów wykonuje się krzyżowanie płciowe między dwoma formami rodzicielskimi w warunkach szczególnych ze szczególnymi genotypami takiego rodzaju, który w przeciwieństwie do procesów znanych z zapładniania u roślin - jest połączeniem (wynikiem skrzyżowania) cytoplazm oosfery i łagiewk pyłkowej lub gamety męskiej. Jeśli te sposoby byłyby opisane, można by w ten sam sposób wykonać wczesną selekcję młodych roślin uzyskanych z tych sztucznych zapłodnień, przy wykorzystaniu tych samych sond i tych samych kryteriów jak w przykładzie III.

Przykład V. Przykład ten ilustruje korzyść wynikającą z znajomości sekwencji sterylności Ogury, przy manipulacji genetycznej typu już opisanego dla przypadku drożdży (Johston et al., 1988).

Przy użyciu normalnej rośliny Brassica bombarduje się merystemy bądź też komórki in vitro mikrocząsteczkami pokrytymi DNA, które jest nośnikiem sekwencji steipyności Ogury. Rośliny otrzymane przez potomstwo merystem poddanych obróbce lub regenerowanych zarodków roślinnych będą cytoplazmicznie męskosterylne, jeśli DNA mógł przeniknąć do mitochondriów i zintegrować się z genomem tych organelli. Uniknie się zatem problemów wywołanych przez sekwencje niepożądane, co dotyczyłoby chloroplastów rzodkwi Ogury lub sekwencji określonych w ten sposób w genomie mitochondrialnym Ogury.

Przykład VI. Przykład ten ilustruje korzyść wynikającą z znajomości sekwencji ^^^l^^^^ności Ogury, przy konstruowaniu metodami inżynierii genetycznej jądrowej sterylności męskiej w dziedziczeniu mendlowskim, a nie cytoplazmicznym.

Przy użyciu sekwencji DNA mitochondrialnego ograniczonego przez nukleotydy 928 i 1569 można skonstruować gen chimeryczny, który po transformacji genetycznej komórek Brassica lub innego rodzaju, będzie transkrybowany do jądra komórek otrzymanych transformowanych roślin. Jeśli gen chimeryczny zawiera presekwencje, która umożliwia wprowadzenie do mitochondrium swojego produktu translacji w białko, transformanty te będą męskosterylne i cecha ta będzie funkcjonować jako dominująca cecha mendlowska.

LITERATURA

Amman E, Ochs B, Abel K-J (1988) Gene 69:301-315

Bannerot H, Boulidard L, Cauderon Y, Tempe J (1974) Proc Eucarpia Meeting Cruciferae 25:52-54

Bannerot H, Boulidard L, Chupeau Y (1977) Eucarpia Cruciferae Newsl: 2-16

Chetrit P, Mathieu C, Vedel F, Pelletier G, Primard C (1985) Theor Appl Genet 69:361-366

Dellaporta SL, Wodd J, Hicks JB (1983) Plant Mol Biol Rep 1:19-21

Ducruet JM i Gasquez J (1978) Chemosphere 8:691-696

Frishauf AM, Lehrach H, Poutska A, Murray N (1983) J Mol Biol 170: 827-842

Gough J i Murray N (1983) J Mol Biol 166: 1-19

Hiesel R, Shobel W, Schuster W, Brennicke A (1987) EMBO J 6:29-34

Johnston SA, Anziano PQ. Shark K, Sanford JC, Butów RA (1988) Science 240.1538-1541 Logemann J, Schell J, Wilmitzer L, (1987) Analytical Biochem 163:16-20 Ogyra H (1968) Mem Fac Agric Kagoshima Univ 6:39-78

169 783

Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P, Rćmy R, Roussele P, Renard M (1983) Mol Gen Genet 191:224-250

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

Stern DB i Newton KJ (1986) Methods Enzymol 118:488-496

Vedel F i Mathieu C (1982) Anal Biochem 127:1-8

169 783

Ν

BI Η Τ C

sDNSa	D	• L	sPM	Av	X
aaccl	d	n	pil	li	I
Jaoyl	β	f	Eey	uJ	-
XXIII	I	I	III	II	2
///				/

CCATGGACAATAATCTTAGTCGGAGTCAAATTCCTTACCTTTCCACCCAAAGCTGAACAT

60 GGTACCTGTTATTAGAATCAGCCTCAGTTTAAGGAATGGAAAGGTGGGTTTCGACTTGTA

S BN

	BB Na	B	E	P	1
S	M	A	asDlu	A	s?	c	u	a
P	n	1	mtpa3	1	ca	0	1	I
i	1	w	HYnIA	w	Bq	a	0	I
X	X	X	XXXVI	I	II	I	T X	I
			/ //		/

ATCCGCACAGATATTCCATTTTTTTTATTGAGGATCCATTTTCGAACTGAACTACTCATG 61 --------------♦---------*-----------------*—-------♦ 120

TAGGCGTGTCTATAAGGTAAAAAAAATAACTCCTAGGTAAAAGCTTGACTTGATGAGTAC

T c

h F

	B		1	c c		n	N
0	S	M	Ml	BAvMNAvS	M	u	1
d	P	w	Sl	bliahlif	n	4	a
β	c	O	• I	vuJa»uJ·	1	H	r 4
I	I	I	XI	ΣΙΣΙΙΣΙΣ /// //	I	I	V

CTTAGGCAAAACAAGCAAGGGAGTTGTTAATAAGGAGCTAGCTACAGTGCTGCGGAGGGT

121---------*---------♦-------------------*---------*---------* 180

GAATCCGTTTTGTTCGTTCCCTCAACAATTATTCCTCGATCGATGTCACGACGCCTCCCA

S F

c	NC S	n	c
y	M	lvMNc	u	Av	B
s	3	aiscc	4	li	b
j	β	IJpiF	H	uJ	V
I	I	VIIII	I	XI	I
/		/		/

TCCGTGCTTATTAAGGAGCCGGGCAGCTACGCAACACTTCCTTGCAACTCATACCTACTA

181-------—*---------*---------♦---------♦---------*---------* 2 40

AGGCACGAATAATTCCTCGGCCCGTCGATGCGTTGTGAAGGAACGTTGAGTATGGATGAT

F1G.1

300

F1G.1

169 783

F

B	M	Cn	ε c	MBS RasnRS
AvuBF	M
b	3	li4aa	n	o	3«aasp
V	e	uJHmu	1	N	alABal
1	X	ΙΙΙΣΧ //	X	I	ΙΙΙΣΧΧ / /

ACAAACTGTTTACTCTTTłTTAAGAGTTAGCTGCATTCCTGCGGGAGGTACGTACGCAAT 2 41 * ~ · ~~ *——-»· ——·—***

TGTITGACAAATGAGAAAAAATTCTCAATCGACGTAAGGACGCCCTCCATGCATGCGTTA

M w

O

I ε

c o

p

I

B

P

IM

2aB

8eb

6Iv

ΣΙΙ /

M w

O

I

B

P

M

I

N a

X

I

I

CAAAGCAGCAGGGCACGTTCGCAACACCTGCrrCAACTTCATGCACATTAGCAACAAGAT

301---------·*>----------*---------*--------“♦--------------—---+ 360

GTTTCGTCGTCCCGTGCAAGCGTTGTGGACGAAGTTGAAGTACGTGTAATCGTTGTTCTA

	r f			ε
	Cn*n C			CBS
Μ B	AvusuPAvS	B	s	03C
n b	Ii4p4alif	b	f	Ras
1 v	uJHCHtuJ·	V	β	IJT
I X	ΧΙΙΙΙΧΙΙΣ	I	I	XII
	// U

TGGCTAGTTGATTGTTGGGAGGATAGCTCCAGCTCCCrACOGGAGTGAACTACAGTTCCA

61---------*--------*---------*--------------------------♦ 420

ACCCATCAACTAACAACCCTCCTATCGACGTCGAGGGATGCCCTCACTTGATGTCAAGGT

S

P	S	H	c
1H	Ba	Ca	f	c				M
2<	3U		rł®5	V	F	HT	£	b
8i	Ρ»	ii	Ina	i	a	hh	a	o
6A	C<	JI	Olp	J	u	aa	r	I
ΣΧ	IX	XI	XXX	X	X	XI	X	X

GGOGGAGCACftOCAAGOGCCAATACCGGCTCTGAGGCGCGT&GCGGGAAGAGATGTATGG 421-------------—*-------------------♦---------*---------♦

480

S

c	Ba	B
Aw	M	A	su	D	3FS	M
li	s	1	a3	P	aot	n
uJ	a	w	BA	n	Jky	1
II	X	I	XI	X	ΙΧΧ	I
/					u

TAAGGGATAGCTGTTTAACCATTTGTAATGGAATGGGATGTTGATCCTCCTTGGAATAAT

ATTCCXTATCCACAAATTGGTAAACATTACCTTACCCTACAACTACGACGAACCTTATTA

481

540

169 783

FIG.1

- _F

MBS	M	n
asn	M	X	bB	T	uS
eaa	m	re	03	a	4p
IAB	«	n	Ir	q	Hi
III	I	I	II	I	II

/

ACGTATATAAGAAGATTTTCATTCCAGTTGGAAAGCAATCGAGAAAACGCCGCCCAAATA

541-----------------— —*”*------*---------*----------♦ 600

TGCATATATTCTTCTAAAAGTAAGGTCAACCTTTCGTTAGCTCTTTTGCGGCGGGTTTAT

A
£BM	c		HB			B
isaP	V	P	ia	NT	K	MB 5«
Iaem	i	1	np	rh	1	ssste
ΣΑΣΙ	J	e	£M	u&	y	paAr
ΙΙΙΧ	I	I	II	II	I	ΙΣΣΣ
//				/		//

CGCTTCGCCACGTGTAGCCCTGTATGGACTCGCGAAGCAGGTCTCCGGTCGGTGTCCAAG

501---------------------------------------—ggQ

GCGAAGCGGTGCACATCGGGACATACCTGAGCGCTTCGTCCAGAGOCCAGCCACAGGTTC

S £ MBS u 0 M asnS p n ea&b

A η 1 ΣΑΒν

II I IIII /

661

ATTTGATCTAACTATTGAGTGAGGACTACTTACCGATTGATAGAATKATACGTATATAAG

----720

TAAACTAGATTGATAACTCACTCCTGATGAATGGCTAACTATCTTATTATGCATATATTC r $

Cn	M	a		T	M	H
Avu	b	u 0	T	SM	Ha	i
1x4	o	3 P	a	P«	h·	n
uJH	I	A n	q	c«	al	£
III	I	I I	I	II	XI	I
//

AAflAAeCTOCTTroTGGAGTGATCTTTCTCGAAATGAATTJUtóTAAGGCGCTATCTTCAfi

721 —-^;--------♦------—-------♦----—---♦—--... ♦ 7 80

TTCTTCG&CGAAACACCTCACTACAAAGAGCTTTACYTAATTCATPCCOCGATACAAGTC

C

	A	0	c	c	B
T	1	r	KSS8	V	H	0	SA
£	w	d	np«	i	w	5	ar
i	N	I	1·«	J	o	7	Ja
I	I	I	III	I	I	I	II

ATTCTGAACCJUtó«CfeeTAGTTG&S0TCTGAaSCCT?ATOftGCAaAA<r?AAfAAATACCT

781 —------—-----------♦ 5 40

TAAfiACTTGGTTTCGTGATCAACTCCAG&CTTCOG&ATACTCGTCTTCATTATTTATGGA

169 783

FIG.1

F a

u

I

M n

I

T

P £

I

H i

n c

I

I

C B v 3 k

- P J H I I

N a

I

CGGGGAAGAAGCGGGGTAGAGGAATTGGTCAACTCATCAGGCTCATGACCTGAAGATTKC

341 ---------*---------*---------*-------------------*---------* 900

GCCCCTTCTTCGCCCCATCTCCTTAACCAGTTGAGTAGTCCGACTACTGGACTTCTAATG

M b

o

I

I £

C

O

I

F i

n

I s

P x

I

F a

u

Σ

S c

a

N

I

T a

q i

AGGTTCAAATCCTGTCCCCGCACCGTAGTTTCATTCTGCATCACTCTCCCTGTCGTTATC

901-------—*-------------------*---------*---------*---------* 960

TCCAAGTTTAGGACAGGGGCGTGGCATCAAAGTAAGACGTAGTGACAGGGACAGCAATAG

961

Η X H TE

G GCa m aBsc M d Cdv«Ha acpo b S i aiilcl Σ·45 o p

I elJIrl If57 I i

I ΣΣΣΣΣΣ ΙΣΣΣ Σ Σ / ///

GACATCGCAAGGTTTTTGAAACGGCCGAAACGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTCAGC

CTGTAGCGTTCCAAAAACTTTGCCGGCTTTGCCCTTCACTGTTATGGCGAAAAGAAGTCG

1020

B sT ta

ΣΣ /

T

P

E

ATATAAATGCAATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACrmTGTCATKATCTCACTC

1021---------*---------*---------*---------*---------*---------- 1080

TATATTTACGTTACTAATGGAAAAAGCTTTrTAACAGGTGAAAAACAGTATTAGAGTGAG

C

Av li uJ

ΣΣ /

S H aCa uv«

9il

6J1

ΣΣΣ /

CTACTGAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTrrAGCrrrTrrACTAATGGCCC

1081-------------------♦---------♦---------*-------------------- 1140

GATGACTTACATTTCAATCACATTATTCAAAGAAAGAAAATCGAAAAAATGATTACCGGG

169 783

			N	s
c		BO	1	a	E
vDE	Av	sr	a	u	DsKX
ids	lx	md	I	3	ppao
Jep	uJ	Al	I	A	n3ea
III	II	II	I	I	ΙΣΙΙ
/	/				/ /

ATATTTGGC7AAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTG7TTACGAACCATGAGACGATCTA

1Ł41---------------——* --------------——* ——* 1200

TATAAACCGATTCGACCAAAAGATTGTTGGTTGTAACAAATGCTTGGTACTCTGCTAGAT

T a

	T			C	T
M	3	N	is	vM	3
3	P	d	*P	ia	P
e	E	0	-E	J®	E
I	I	I	21	IZ	I

GAGAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATA

1201----------*—~----—-------♦-------—*--------------------♦ 1260

CTCTTCAATTTTTAAGGTATACTTAAAGTCATACCCACCGATCCACAGTTTTAATGTTAT

Μ T

	a s		B
R	e p	H	3	M	M
3	I 4	P	m	3	n
a	I 5	h	A	a	1
I	I I	I	I	I	I

AAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAA

61---------*---------*---------*---------*----------*---------♦ 1320

TTTAGTTTACATGGATTGCTACTTCACTGCTTTTTTCAGAGTGGATAGTAATTTCCCCTT

M	M	M	M	M
n	n	n	n	n
1	1	1	1	1
I	I	I	Z	I

ATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAA

1321---------*---------*---------*---------*---------*---------- 1380 tatctccccyttctcctyttttttctcccctttcccctttatctcccctttctccttttt

T
M	M	M	3
n	n	n	P
1	1	1	E
Z	I	Z	Z
a a AJLanArtfiJiAJLaAJLajLn&fiGTGcajLaATTnarrr:

TTTCTCCCCTTTCCCCTTTATCTCCCCTTTCTCCTTTTTTTTCTCCACCTTTTAACTGGC

169 783

FIG.1

Τ a

q i

I l

T

M3 fp eE

II /

AGAAAATAATGCTTTGTGAACCCAATTGCTTTGACAAAAATAAAGAAAGAAGCAAAATCT

1441 -----------------------------*----------------- — *---------* 1500

TCTTTTATTACGAAACACTTGGGTTAACGAAACTGTTTTTATTTCTTTCTTCGTTTTAGA .501

S N

T BB a Μ 1 s E gsOu b a X p a ltp3 o I c

E r ΙΥηΑ I I m

I I IIII I I I / /

CATTCAATTTGAAATAGAAGAGATCTCTATGCCCCCTGTTCTTGGTTTTCTCCCATGCTT

GTAAGTTAAACTTTATCTTCTCTAGAGATACGGGGGACAAGAACCAAAAGAGGGTACGAA

1560

H i

n c

I

I

M bS of

Ie

II

M n

I

M a

I

C v

i

J

I

TTGTTGGTCAACAACCAACCACAACTTTCTATAGTTCTTCACTACICCTAGAGGCTTGAC

1561 — ------+---------+-------—*---------*---------♦---------» 1620

AACAACCAGTTGTTGGTTGGTGTTGAAAGATATCAAGAAGTGATGAGGATCTCCGAACTG

c	H	T	1
AvM	iT	G	SAM	a
lin	nf	3	p3S	I
uJl	fi	U	Ee®	T X
III	II	I	III	I
//			/

GGAGTGAAGCTGTCTGGAGGGAATCATTTTGTTGAAATCAATTAATCTAATCATGCCTCA 1621 ——————-+-------—-* 1630

CCTCACTTCGACAGACCTCCCTTAGTAAAACAACTTTAGTTAATTAGATTAGTACGGAGT

T

BM 3

3Π p rl E II I o p o

I E I

II I /

ACTGGATAAATTCACTTATTTTTCACAATTCTTCTGGTTATGCCTTTTCTTCTTTACTTT

1681-------------------*---------*---------*---------♦—--------*

TGACCTATTTAAGTGAATAAAAAGTGTTAAGAAGACCAATACGGAAAAGAAGAAATGAAA

1740

169 783

FIG.1

S c

	a	0	E	T
N	RS	u	0	P	Ac	s
d	SC	3	P	1	lo	P
•	aa	A	n	5	wR	z
I	II	I	I	I	II	I

/

CTATATTTTCATATGCAATGATGGAGATGGAGTACTTGGGATCAGCAGAATTCTAAAACT

1741-----------------------------*----------♦—------------------ 1800

GATATAAAAGTATACGTTACTACCTCTACCTCATGAACCCTAGTCGTCTTAAGATTTTGA

S o S

NO	B S	E	B	tM	AONPa	B
Ir	F aMNc	c	b	yb	vllpu	S
ad	o ascr	o	V	Lo	aflau9	t
II	k JpiF	P	I	TI	19 IMS	X
vi	I IIII	I	I	II	IXVII	I
	///				/ U

ACGGAACCAACTGCTTTCACACCGGGGGAAGACCATCCAGAGCAAGGACCCCAACAGTTT

1801 --------♦—-----♦---------♦—-------♦---------*---------* 18 60

TGCCTTGGTTGACGAAAGTGTGGCCCCCTTCTGGTAGGTCTCGTTCCTGGGGTTGTCAAA

1861

S

BB a Μ B gaOu b B Ma ltp3 o a a t

ΙΥηΑ I r · B

IIII I X II / /

GGAAGATCTCTTGAGAAAAGGTTTTAGCACTGGTGTATCCTATATGTATGCTAGTTTATT

CCTTCTAGAGAACTCTTTTCCAAAATCGTGACCACATAGGATATACATACGATCAAATAA

1920

	B	H Ca	K i	s a
T	C	ve	SAnT	M	u
a	Q	ii	acca	n	3
q	i	JI	lclq	1	A
I	I	II	IIII	I	I
/		/	/

CGAAGTATCCCAATGGTGTAAGGCCGTCGACTTATTGGGAAAAAGGAGGAAAATCACTTT

1921---·*—----+---------*---------♦---------*—-------- 1980

GCTTCATAGGGTTACCACATTCCGGCAGCTGAATAACCCmTTCCTCCTTTTAGTGAAA

C

O M VB p n ia η 1 Ji

X I II

GATCTCYYGYYTCGGAGAAATAAGTGGCTCACGAGGAATGGAAAGAAACATATTATATAA

1981 -=----°---o-—« -—o-— --<►---------------— ♦----------- 2040

CTASAGAACAAAGCCYCYTTAYTCACCGAGTGCTCCTTACCTTTCTYTGTATAATATATT

FIG.l

169 783

M n

X s

r

I a

u D 3 P A n I X

A w

I

T

P ε

i

TATATCGAAGTCCTCTCCTTCAAATACTGGAAGGTGGATCACTTGTAGGAATTGTAGGAA

2341-------------------*-------------------*---------*---------* 2100

ATATAGCTTCAGGAGAGGAAGTTTATGACCTTCCACCTAGTGAACATCCTTAACATCCTT

N		N H
1		1 BC a	H
a	XR	EaBsvHaSM	iT	s
I	CS	alaaialtw	nf	f
I	ma	allJJelyo	fi	0
I	II	ΙΙΙΙΣΙΙΙΧ	II	X

////

TGACATAATGCTAATCCATGTTGTACATGGCCAAGGAAGCATAAAATGATTCTTTCATTC

21C1---------*---------*---------+---------*---------*---------* 2160

ACTGTATTACGATTAGGTACAACATGTACCGGTTCCTTCGTATTTTACTAAGAAAGTAAG ε

c o

R

ε		2	B
c	M	4F	MT 3
0	n	/a	nh p
N	1	3u	la C
I	I	II	II I
		/	/

TATAGATACCTCTGGTAGGTAAAGCACTCTACTGTCCTTTATTGAAAGTTCCCATCGCGG

2161 ---------*---------*---------*---------♦---------*---------* 2220

ATATCTATGGAGACCATCCATTTCGTGAGATGACACGAAATAACTTTCAAGGCTAGCGCC

B CHE s T T P v i M Cft pha lin los

C a q ® J f y Dp

I I X III XIX

GGGCGAGGATACTTOCCTTCGCGGTTCGACTTTCTTTTCAGGCTTGACTCATTATTTTCC

2221 -----*---------♦--------—*---------*---------*---------* 2280

CCCGCTCCTATGAACGGAAGCGCCAAGCTGAAAGAAAASTCCGAACTG&GTAATAAAAKS

S P

Aa	s cbih	K	C
vu	M	fAva2gS	D	iT	V
a9	n	alinSis	d	nf	i
16	1	NuJIiAt	β	fi
II	I	ΙΧΧΙΙΙΧ	I	II	X
/		/ ///

GGTCCTCTCACACCCCTTTKGAGCTCTTTATGATGCCCACTGAGTAAGATTCGGGGGCT?

CCAGGAGAGTGTGGCWAAATCTCGAGAAATACTACGGGTGACTCATTCTAAGCCCCCGAA

2340

2281

169 783

FIG.l

s		B	c		B aS	ENM	B	M
MNC	H	3	Av	F	aDpaST	alb	sT E	a	EM
ser	h	P	li	a	asBcph	pao	ma a	•	an
piF	a	c	uJ	u	Jallia	3ΧΧ	Aq c	I	cl
III	I	I	IX	T	ΣΧΧΙΧΧ	XVI	XI I	I	II
//			/		/ U	/			/

CCCGGCGCAGAAGCTCATTCTGAACCGCGGGAACCTTCGTCTCTTCGACACAAACGTTTT

2341 __------2 400 gggccgcgtcttcgagtaagacttggcgcccttggaagcagagaagctgtgtttgcaaaa s

C	M	BBB N a
V	M	b	A	sasOlHu
i	n	o	1	aatpapS
J	i	X	w	BHYnlhA
I	X	I	X	χχχχνχχ

/ / /

ATGAAGAGGCTGATGGTGATGAGGATCC

2401 ---------*---------*-------- ²⁴²⁸

TACTTCTCCGACTACCACTACTCCTAGG

Enzymy przecinające

AccI	AfIIII	Alul	AlwI	AlwNI	λ3·Χ	AvaX	AvaXX
Bali	BanHI	Banll	Bbvl	BbvII	Bcef I	Bglll	BpulOI
Baal	BsaAI	BsaBI	BsaJI	Bsil	Baal	BsmAI	Bspl2B6I
BspCI	BspHI	BspMI	Bsrl	BstBI	BstXI	BstYI	CfrlOI
CviJI	Ddel	DpnI	Drdll	Osa!	EaeZ	Earl	Eco57l
EcoBI	EcoDI	EcoNI	EcoO109X	EeoPI	EcoPISI	EcoRI	EcoRII
lcoR.124/31 Espl	Eap3I Faul FinI Fnu4HX Foki Gdi
Gaul	Kael	Haall	Haelll	HgiAI	Hhal	HincII	Hinf I
Hphl	Mae!	Mae IX	Haelll	MboII	Mcrl	Miał	Mlyl
Mmsl	Mnll	Mael	MSpI	Mwol	NciI	Neol	Ndel
Nhel	Nlalll	NlaIV	Nrul	NspBII	Ρ1·Χ	Pmll	PpuMI
PStl	Rsal	Sacll	Sali	Sau9«I	Sau3AX	Scal	SccFI
SfaNI	Siei	SnaBI	Spal	Spił	Spił	Sstl	Styl
StyLTI	StySJI	Taql	TaqII-l	TaqXI-2	Tfil	Thal	Tsp4SI
TspEI	Tthlllll	Xbal	Xcml	XaaXXX	Xmnl
Enzymy nie przecinające
Aatll	Aflll	Agel	Aha II	Apal	ApaLI	AvrII	Bani
Bcgl	Bell	Bgll	BspGI	BspMIX	BssHII	BstEII	Bau36I
CfrAI	Ciał	Dral	Dralll	Drdl	Ccii	ECO47XXI	EcoAI
EcoDXXX	EcoEZ	EcoKI	EC0R124I	EcoRV	Fsel	Fspl	Hgal
HgiEII	Hindlll	Hinflll	Hpal	KpnI	Mlul	Nael	Naci
Notl	Nsil	Napl	PflMI	PshAI	ΡνυΙ	PvuII	RlaAI
R3rXI	Sfil	SgrAI	Smal	Snął	SphI	Sap!	Stul
StySBX	StySPI	StySQI	Tthllll	UballOSI	UballOSI	Xhol

169 783

2428-«

169 783

β.κ

4?

S.p

O i— x>

~Z-

r*t o

169 783 £Q Of V

C

H-

Sal I FIG.4

169 783

FIC. 5

169 783

<r

Departamentu^,^·

Cena 4.00 ⁹⁰ ega-

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania sekwencji DNA steiyyności Ogury/, znamienny tym, że z pełnego genomu mitochondrialnego, wykazującego cechę cytopłazmicznej męskiej steryłności Ogury izoluje się sekwencję DNA, nadającą cechę cytoplazmicznej steryłności męskiej, gdy występuje w mitochondriałnym lub jądrowym genomie rośliny i a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1, lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie a).
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izoluje się sekwencję przenoszoną przez sekwencję ograniczoną przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1, lub wykazującą co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją, oraz transkrybowaną na RNA w mitochondriach roślin męskosteryłnych.