PL168666B1

PL168666B1 - Sposób otrzymywania roslin hybrydowych PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL168666B1
Application number: PL91298509A
Authority: PL
Inventors: Sandrine Bonhomme; Francoise Budar; Dominique Lancelin; Georges Pelletier
Original assignee: Agronomique Inst Nat Rech
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 1996-03-29
Also published as: EP0909815B1; ES2307308T3; FR2667078B1; HU9300801D0; AU652964B2; IE20020681A1; RU2117704C1; IE913320A1; ATE396257T1; KR930702520A; PL169149B1; CA2092097C; SK284748B6; JPH06501613A; DE69132878T2; ATE211170T1; JP2001145497A; PT99024A; HU215494B; FR2667078A1

Abstract

1. Sposób otrzymywania roslin hybrydowych, znamienny tym, ze krzyzuje sie rosline wykazujaca ceche cytoplazmicznej sterylnosci meskiej i zawierajaca sekwencje DNA steryl- nosci Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencje DNA ograniczona przez nukleotydy o numerach 926 i 1569, na fig. 1, lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyzej wymieniona sekwencja, wspomniana w punkcie a) i gdy wystepuje w genomie mitochon- drialnym lub jadrowym rosliny, nadaje wymienionej roslinie cytoplazmiczna sterylnosc meska, z roslina tego samego gatunku, majaca ewentualnie gen restaurator plodnosci Rfl. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Praodmiatom wynalaaku joit ipaiód atraymywania raślin hydrydawych. Matoriał dialagicany, paiiadający cochę itorylnaści męikioj praydatny joit da apracawywania admian hydrydowych gatunków mających anacaonio w agranamii.

Sacaogelnio aaś jaka matoriał dialagicany praydatna joit raślina nalokąca da radainy kraykawych, któroj cytaplaama w kamerkach aawiora arganolla paiiadająco iokwoncjo nukloatydowo, pawadująco itorylnaść męiką i karayitno cochy agranamicano.

Opracawanic admian hydrydawych makna ułatwić dądź umakliwić praca wykarayitanio układu cytaplazmicznej itorylnaści męikioj. Hydrydy atraymujo iię praoa krzykawo aapładnionio pamięday dwioma papulacjami farm radaiciolikich, z których jodna adrywa ralę męiką, aaś druga - końiką. Jodnym a wymagów ipatykanych pray atraymywaniu admian hydrydawych a jodnalitoj jakaści praoa kraykawanio płciawo wykanywano na gatunkach autagamicanych joit adalnaść raśliny da iamaaapylania iię. Układy itorylnaści męikioj paawalają na atraymanio raślin końikich nioadalnych da lamazapładniani2, a których pa aapyloniu makna - 1oz uciokania iię da kmudnych tochnik, takich jak kaitrawanio kwiatów - dozpaśrodnia adiorać naiiana, któro wiayitkio ią hydrydami.

Paśród gonotycanych dotorminant itorylnaści męikioj ią takio, których naśnikiom joit cytaplaama. W każdym pakaloniu płciawym ią ano przokazywano wyłącanio praoa farmę końiką. Otr^ymujo iię aatom 100% farm męikaitorylnych w kakdym pakaloniu wraa a układom cytaplazmicznoj itorylnaści męikioj (CMS). To dotorminanty gonotycano praonaii gonam mitochandrialny.

Syitom cytaplazmicanej itorylnaści męikioj właściwy dla radainy kraykawych joit akroślany praoa panikiao cochy:

1) itorylnaść męika winna dyć całkawita, tan. jakiokalwiok ią warunki hadawli jakakalwiok joit linia, którą chcomy wykarayitać jaka farmę radaicioliką końiką, nio pawinna wyitępawać tam pradukcja pyłku. W praociwnym raaio naiiana aodrano z tych raślin końikich pachadaiłydy caęściawa a lamazapładnionia, a aatom nio dyłydy typom hydrydy Fl.

2) Wytwaraanio tych raślin naloky wykanać pray wykarayitaniu naturalnych woktarów pyłka, tan. w praypadku tych gatunków: dłankaikraydłych, dwuikraydłych araa wiatru. Pyłok powinion hyć praonioiiany a raślin aapylających na raśliny męikaitorylno (końikio). W praktyco, jodynio awady magą aapownić przoniolionio pyłku na adlogłaść.

Raśliny końikio winny aatom dyć wyltarczająco prayciągająco dla awadów przylatujących w palzukiuaniu noktaru. Marfalagia kwiatów pawinna amuiić awada da toga paiaukiwania papraoa wiorachałok kwiatu, który umakliwia aasadnicza kantakt a praotchlinką. W praktyco naitępujo ta w ton ipaiód, ko paditawa kiolicha pawinna utwareyć radzaj rurki wakół paditawy iłupka.

3) Marfalagia arganów końikich (iłupok) pawinna dyć idontycanajak w praypadku raśliny pładnoj. W laczogelnaści pawinion wyitępawać pajodyncay iłupok w kwiocio i mioć an paitać praitaliniawą. W iitacio adaraa iię caęita, ko itorylno farmy męikio wyrakają iię takko papraoa fominizację pylników, któro amioniają iię w pioudaiłupki, a nawot praoa praokiatałconio noktarów w połnych kwiatach. Zdaraa iię takko, ko tam, gdaio adofarmawano ią iłupki, datycay ta takko produktów. Wiayitkio to adchylonia nio paawalają na prawidławą pradukcję nnian i w tym praypadku makna mówić o pownoj itorylnaści końikioj.

4) Da wytwaraania admian hydrydawych Fl u gatunków, gdaio adiora iię naiiana, takich jak raopa lud garcayco, warunkiom nioadędnym joit, ady farma rodziciollka męika hyhrydy całkowicio alikwidawał ofokt itorylnoj cytaplaamy męikioj tak, ady rośliny hydrydawo mogły dyć łatwa aapylano.

168 666

W przypadku rodziny krzyżowych pierwszy przypadek męskiej cytoplazmy sterylnej, gdzie CMS został opisany przez Ogurę (1968), dotyczył rzodkwi, Raphanus sativus. Bannerot (1974, 1977) przeniósł cytoplazmę Ogury na rodzaj Brassicae, otrzymując w ten sposób rośliny wykazujące cytoplazmiczną sterylność męską. Rośliny te nie posiadały zadowalających cech agronomicznych (chloroza w czasie obniżenia temperatury, zła płodność żeńska) i ich zła wydajność czyniła je nieodpowiednimi do wykorzystania handlowego.

Dla uniknięcia chlorozy u roślin z rodziny krzyżowych użyteczne jest połączenie w tej samej komórce genomów jądrowych oraz chloroplastowych tego samego rodzaju. Stąd też rośliny rodzaju Brassicea posiadające jeden z genomów chloroplastycznych nie wykazują już chlorozy. W przypadku, gdy posiadają całość genomu mitochondrialnego Ogury, charakteryzują się pełną cytoplazmiczną sterylnością męską, lecz równocześnie morfologia kwiatów będzie wykazywać odchylenia, co sprawi, że ich zapylenie przez wektory naturalne będzie niemożliwe.

Poza tym w przypadku gatunków, których nasiona mają znaczenie, użyteczne jest przywrócenie płodności męskiej odmian hybrydowych za pomocą genów jądrowych, zwanych restauratorami.

Przywrócenie płodności męskiej w przypadku roślin posiadających całość genomu mitochondrialnego Ogury jest rzeczą trudną, ponieważ należałoby równocześnie wprowadzić do działania szerego genów-restauratorów.

Celem wynalazku było opracowanie sposobu otrzymywania roślin hybrydowych z odpowiednim układem sterylności męskiej przy wyeliminowaniu genów odpowiedzialnych za cechy niepożądane w cytoplazmie Ogury i utrzymując efektywną i łatwą do przywrócenia sterylność męską.

Sposób otrzymywania roślin hybrydowych według wynalazku polega na tym, że krzyżuje się roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej i zawierającą sekwencję DNA sterylności Ogury, która jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569, jak przedstawiono na fig. 1, lub wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją, i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl. Korzystnie w sposobie według wynalazku krzyżuje się roślinę należącą do gatunku Brassica, zawierającą chloroplasty rodzaju Brassica zgodne z genomem jądrowym wymienionej rośliny i mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA sterylności Ogury, która jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569 na fig. 1 lub wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją i, gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl.

Korzystnie także w sposobie według wynalazku genom jądrowy zawiera presekwencję umożliwiającą wprowadzenie do mitochondriów produktu translacji wymienionej sekwencji, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium.

Jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej w sposobie według wynalazku stosuje się roślinę z gatunku Brassica napus lub Brassica oleracea, lub Brassica campestris, lub Brassica juncea, lub Brassica nigra, lub Brassica hirta, lub Brassica carinata.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę otrzymaną przez fuzję protoplastów lub roślinę otrzymaną przez reprodukcję płciową lub też przez transfer genu do mitochondriów.

Określenie sterylność Ogury oznacza sekwencję DNA wykazującą następujące właściwości:

a) nośnikiem jej jest sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 jak przedstawiono na fig. 1 lub

b) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie a) i w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym bądź jądrowym rośliny zapewnia u wspomnianej rośliny cytoplazmiczną sterylność męską.

168 666

W szczególnych przypadkach zaś sekwencjaDNA sterylności Ogury posiada dodatkowe właściwości, takie jak to, że c) nośnikiem jej jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 jak przedstawiono na fig. 1 lub d) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie c) oraz że jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych.

Wynalazek zilustrowano na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA mitochondrialnego z rzodkwi Ogury, noszącą cechę CMS; fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu DNA mitochondrialnego opisanego w fig. 1; fig. 3 przedstawia elektroforezę DnA mitochondrialnego po trawieniu przez BglI (3a) i NruI (3b). Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą CoxI. (Hiesel et al. 1987); fig. 4 przedstawia elektroforezę mitochondrialnego DNA po trawieniu przez SA1I. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą ograniczoną przez nukleotydy 389 i 1199 sekwencji opisanej na fig. 1; fig. 5 przestawia owoce wytworzone przez kapusty noszące różne genomy cytoplazmiczne; fig. 6 przedstawia elektroforezę RNA mitochondrialnego. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą, fragment EcoRI-BAM HI, włączającej część sekwencji nazywanej ORF B.

Sekwencja DNA sterylność Ogury jest określona przez odniesienie do sekwencji ograniczonej numerami 1 i 2428 na fig. 1. Nośnikiem jej jest transkrybowana sekwencja, której skrajne punkty 3' i 5' są na fig. 2 połączone linią kropkowaną i którą obserwuje się wyłącznie u roślin męskosterylnych. ORF B odpowiada obszarowi rozpoczętego odczytu. Określenie to nadano wskutek zaobserwowanej homologii z sekwencją opisaną przez Brennicka. Na fig. 2 przedstawiono obszarem zakreskowanym sekwencję odpowiadającą jednemu z dwóch genów RNA, przenoszącego formylometioninę.

Sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy oznaczone numerami 928 oraz 2273 na fig. 1 odpowiada transkryptowi, który może być uwidoczniony przez hybrydyzację molekularną (1,4), jak przedstawiono na fig. 6. Na fig. 6 każda studnia odpowiada roślinie płodnej (F)bądź męskosterylnej (S). Jedynie rośliny męskosterylne syntetyzują transkrypt około 1400 zasad. Ten transkrypt rozpoczyna się w pozycji 928 (10 zasad) z fig. 1 i kończy się w pozycji 2273 (5) (rozpoczęcie oraz zatrzymanie transkrypcji może się dokonać w różnych położeniach w mitochondriach roślinnych).

Cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 2273 z fig. 1, zapewniającą cechę CMS lub cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 1569 z fig. 1 i transkrybowaną na RNA, nadającą cechę CMS obejmuje:

- chloroplasty tego samego rodzaju co genom jądrowy bądź innego rodzaju lecz zgodne z tym genomem jądrowym,

- nie obejmuje całości ani też części jednego bądź drugiego (bądź obydwu) fragmentu genomu mitochondrialnego Ogury który:

- jest nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji, lub

-jest nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej.

Nieobecność tych fragmentów zwanych sekwencjami niepożądanymi jest niezbędna do otrzymania genomów mitochondrialnych o dobrej jakościowo sterylności męskiej, zgodnej z 4 cechami wymienionymi poprzednio.

Zrekombinowany genom roślinny jądrowy bądź mitochondrialny charakteryzuje się tym, że obejmuje sekwencję DNA sterylności Ogury która jest przenoszona przez sekwencję DNA zawartą pomiędzy nukleotydami 928 oraz 2273 sekwencji przedstawionej na fig. 1. bądź która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją która w przypadku jej obecności w cytoplazmie rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską.

W szczególnym przypadku zrekombinowany genom roślinny jądrowy lub mitochondrialny obejmuje sekwencję DNA sterylności Ogury, która jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną nukleotydami o numerach 928 oraz 1569 na fig. 1 lub która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją oraz która - w przypadku obecności w cytoplazmie rośliny i transkrypcji na RNA - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską.

168 666

Genom jądrowy lub mitochondrialny można scharakteryzować przez to, że wspomniany genom zrekombinowany pozbawiony jest całości lub części fragmentów genomu Ogury, będącego nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji i będącego nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej, bądź też w którym wspomniane fragmenty są nieaktywne.

Dokładniej, zrekombinowany genom jądrowy lub mitochondrialny może być pozbawiony całości lub części fragmentu około 10,7 kb po trawieniu przez BgII fragmentu około 11 kb po trawieniu przez NruI, nośników genu CoxI.

Jest to uwidocznione w szczególności na fig. 3 przez hybrydyzację molekularną z sondą, która jest nośnikiem sekwencji CoxI.

Może być on również pozbawiony całości lub części fragmentu 5,1 kb po trawieniu przez SalI lub fragmentu około 15 kb po trawieniu przez NruI fragmentu o około 18,5 kb po trawieniu przez BgII, nośników jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę. Uwidoczniono to w szczególności na fig. 4, przez hybrydyzację molekularną z sondą ograniczoną przez nukleotydy o numerach 389 oraz 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1.

Na fig. 3 oraz 4 genotypy oznaczone cyframi odpowiadają roślinom, w których występuje odpowiedni układ cytoplazmicznej sterylności męskiej.

GENOTYPY	CHLOROPLASTY	MITOCHONDRIA
B.n.	B. napus	B. napus
27	B. napus	B. napus/Ogura
OGU	R. sativus (OGU)	R. sativus (OGU)
9,17,21,24,27c	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
B.o.	B. oleracea	B. oleracea

Ponadto istnienie dobrej jakościowo cechy CMS wymaga obecności sekwencji DNA, którą można oznaczać przez hybrydyzację DNA/DNA na produktach trawienia. Zatem sekwencja DNA, która mogła być określona charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję, która po trawieniu przez NcoI daje fragment o 2,5 kb, po trawieniu przez NruI daje fragment o 6,8 kb, zaś po trawieniu przez SalI daje fragment 0 4,4 kb.

Sekwencję tę można również oznaczyć przez hybrydyzację całkowitego RNA roślina męskosterylnych. Uwidoczniono istnienie transkryptu o około 1400 parach zasad. Jest on nieobecny u roślin powracających do płodności.

Określenie niepożądanych oraz niezbędnych z punktu widzenia sterylności Ogury za pomocą technik hybrydyzacji DNA znanych specjalistom - materiału roślinnego o dobrej jakości, która jest nośnikiem chloroplastów zgodnych z genomem jądrowym oraz nośnikiem mitochondriów, bez konieczności oczekiwania na roślinę dojrzałą i pojawienie się kwiatów i owoców. Jest to zatem narzędzie bardzo skuteczne dla wyselekcjonowania roślin posiadających męskosterylną cytoplazmę, o korzystnych cechach agronomicznych.

Jak wynika z przeprowadzonych badań mitochondrium w roślinach wykazujących cechę CMS zawiera sekwencję nukleotydową odpowiadającą DNA i wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną zasadami o numerach 928 i 2273 na fig. 1 oraz kodującą cytoplazmiczną męską sterylność Ogury.

Ponadto w materiale roślinnym wykazującym tę cechę mitochondrium zawiera sekwencję DNA, której nośnikiem jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1, bądź wykazująca 50% homologii z tą sekwencją i która jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych. Wspomniane DNA może poza tym wykazywać cechy określone powyżej, w szczególności nieobecność sekwencji niepożądanych.

168 666

Cytoplazma rodziny roślin krzyżowych, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję DNA sterylność Ogury obecną w genomie mitochondrialnym; cytoplazma ta zawiera poza tym chloroplasty tego samego rodzaju lub też innego rodzaju, lecz zgodnie z genomem jądrowym.

Sekwencja sterylność Ogury charakteryzuje się tym, że:

a) jest przenoszona przez sekwencję DNA złożoną z 2428 par zasad, jak przedstawiono na fig. 1,

b) jest ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1 i odpowiada transkryptowi wskazanemu przez linie kropkowane na fig. 2 i uwidocznionemu przez hybrydyzację molekularną (14) na fig. 6,

c) wykazuje co najmniej 50% homologii z wymienioną sekwencją wspomnianą w punkcie b) i - w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, lub

d) jest przenoszona przez sekwencję ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 i transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych, lub

e) wykazuje co najmniej 50% homologii z sekwencją opisaną w punkeie d) i jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych.

A zatem, w sposobie według wynalazku stosuje się rośliny z rodziny krzżżowych, zawierające chloroplasty i jądro tego samego rodzaju lub zgodne, oraz mloc^nd^a będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określona powyżej.

Dokładniej, stosowane w sposobie według wynalazku rośliny należące do rodzaju Brassica, zawierają chloroplasty i jądro Brassica oraz mitoyhondkia będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określono powyżej.

Ten genom mitochondrialuy winien również być nośnikiem pewnej liczby genów rozpatrywanego gatunku Brassica. Uzyskuje się 'to przez rekombinację między genomem Ogury i genomem Brassica.

W szczególnym przypadku stosuje się rośliny należące do gatunku Brassica napus, zawierające jądro Brassica i, których cytoplazma mieści w sobie chloroplasty Brassica oraz mitochondria męskosterylne będące nośnikiem DNA.

Mitochondria te mogą również być nośnikiem większości genów mitochondrialnych Brassica napus (186, Atp9, Atp6, CoxII, ndh1, cob). Brassica napus odpowiada rzepakowi, bądź roślinom Canola i Rutabaga.

W wyniku rekombinacji można również otrzymać rośliny gatunku Brassica oleracea, charakteryzujące się tym, że zawierają jądro Brassica oraz tym, że cytoplazma mieści w sobie chloroplasty Brassica i mitochondria zawierające sekwencję DNA, kodującą cechę CMS. Brassica oleracea obejmuje różne typy kapusty: kapusty głowiaste, kapustę brukselską, kalarepy, brokuły, kapusty pastewne i kalafiory.

Analogicznie, w sposobie według wynalazku można również stosować rośliny gatunku Brassica campestris zawierające jądro Brassica i których cytoplazma mieści w sobie chloroplasty Brassica zgodne z genomem jądrowym oraz mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA kodującą cechę CMS, taką jak określono. Brassica campestris odpowiada rzepakowi, brukwi, kapuście chińskiej, pekińskiej i japońskiej.

Podobnie jak opisano powyżej można stosować rośliny wybrane z grupy zawierającej: B. juncea, B. nigra, B. hirta, B. carinata, zawierające jądro Brassica i których cytoplazma, mieści w sobie chloroplasty Brassica zgodne z genomem jądrowym oraz mitochondria zawierające sekwencję DNA kodującą cechę CMS, takąjak określono. Korzystnie stosuje się roślinę należącą do rodzaju Brassica, której genom jądrowy zawiera sekwencję sterylność Ogury, taką jak określono powyżej, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium. Roślina ta może w szczególności należeć do jednego z następujących gatunków: B. napus, B. oleracea, B. campestris, B. nigra, B. juncea, B. hirta i B. carinata.

Obecność sekwencji sterylności Ogury jest konieczna i wystarczająca dla indukowania całkowitej nieobecności pyłku przy nieobecności genów-restauratorów. Zapylenie tych roślin jest zapewnione normalnie dzięki prawidłowej produkcji nektaru.

168 666

Morfologia organów żeńskich jest normalna i dojrzałe owoce (łuszczyny) zawierają prawidłową liczbę nasion. Figura 5 ilustruje morfologię zaobserwowaną u rośliny normalnej świadka (z), rośliny o morfologii odchylającej się od normy, posiadającej cały genom Ogury [z(6)] i chloroplasty Brassica oleracea, kapusty, będącej nośnikiem chloroplastów Brassica napus i mitochondriów męskosterylnych, posiadających geny Brassica oleracea i zrekombinowanych mitochondriów, nie zawierających już niepożądanych sekwencji [z(9) i z(17)]. Rośliny te mają następujące cechy:

GENOTYPY	CHLOROPLASTY	MITOCHONDRIA
z	B. oleracea	B. oleracea
z (A)	B. napus	B. napus/Ogura
2 (6)	B. oleracea	Ogura
z(9)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
z(17)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura

Genotypy z(A) i z(6) nie wykazują odpowiedniego układu cytoplazmicznej sterylności męskiej.

Takie rośliny otrzymuje się przy użyciu technik, które zapewniają prawidłową rekombinację między genomem mitochondrialnym rozpatrywanego gatunku a genomem mitochondrialnym Ogury. U takich roślin płodność jest restaurowana przez pojedynczy gen-restaurator, zwany Rfl, pochodzący z rzodkwi, co nie zachodzi w przypadku roślin, które są nośnikiem całości nieodpowiedniego genomu mitochondrialnego.

Takie rośliny można również otrzymać przez naturalną lub sztuczną reprodukcję płciową.

Rośliny mające genom mitochondrialny można również otrzymać przez transfer genu do mitochondrium.

We wszystkich przypadkach rośliny te mają właściwy układ CMS, a mianowicie:

- całkowitą sterylność męską,

- morfologię pozwalającą na prawidłowe zapylenie i prawidłową produkcję nasion, jak to zilustrowano w tabeli 1 oraz tabeli 2.

Uogólniając, najlepsze cechy agronomiczne otrzymuje się dla roślin męskosterylnych posiadających chloroplasty tego samego gatunku co jądro i mitochondria wykazujące odpowiedni układ sterylności męskiej.

Tabela 1 przedstawia wydajność linii kapusty na różnych cytoplazmach, (odpowiednie są genotypy z9 lub zl7). Tabela 2 przedstawia wydajność linii rzepaku na różnych cytoplazmach (odpowiednie są genotypy Fu 27, Fu 58 i Fu 85).

Wynalazek ilustrują bliżej następujące przykłady.

Przykład I. Wykrycie sekwencji DNA odpowiedzialnej za cytoplazmiczną sterylność męską Ogury

1. Roślina

Przez cybrydę określa się formy otrzymane przez fuzję izolowanych protoplastów, po której następuje regeneracja całej rośliny. Taki sposób otrzymywania pozwala na połączenie w komórce informacji cytoplazmicznych pochodzących od obydwu form rodzicielskich. Cybrydę nr 13 otrzymano pośród 820 roślin regenerowanych przez fuzję protoplastów między cybrydą B. napus odporną na triazynę, cms Ogury (potomstwo cybrydy 77 opisanej w Pelletier et al., 1983 oraz Chetrit et al., 1985) oraz odmianę pochodzącą od Brutor, wrażliwą na triazynę oraz płodną. Próba odporności na triazynę (Ducruet i Gasąuez, 1978) wykonana na próbę liścia każdego regeneranta pozwoliła na ustalenie typu chloroplastu (chloroplasty odporne na triazynę pochodzące od formy rodzicielskiej 77 lub chloroplasty wrażliwe na triazynę pochodzące z linii Butor). Wyhodowano rośliny i obserwowano stadium kwitnienia. Rośliny będące kombinacjami nierodzicielskimi (bądź czułe /męskosterylne bądź odporne/ męskie płodne) wyselekcjonowano

168 666 χ

υ

Λ

Ε s

je cu ο

U

X o

c •N

Ό u

f?

§ * N

U t/3

X >

H o •o

Λ

CU

C3

J4

Ό 'co

O ,3 ‘c?

•Ό >>

168 666 x

o

C3

N

CC

Έ.

o o

X u

>» c

•N

X

Ui

CN

C3 ω

X rt

H £

O ε

’n

CC

Ct

0) ro >s

C

Έ υ

O

V3

O

E >>

c

Ό

O

	ura ura ura ura
rt i	0000 0000
«Η 1	0 o o o
C, 1	w w
3 1	03 03 03 03 03
c i	3 3 3 3 3
O l	0,0.3. 0.0.
£ '	rf tti (ϋ rt rf
U 1	cccc.cc
0 1	3
P 1	• · · 00 · ·
•Η 1	mmeoffl»
£ i
1	03
l	Ή
>, 1	0
P 1	4->
Q 1	03
rt i	03 03 03 Φ 03 03
\|	3 0 3 0.3 3
0.1	0.0.0.5 0.0.
O 1	(fl Λ nJ flJ flJ flJ
0 1	cccucc
O 1
1
£ i	mncocnmiD
ϋ I 1
I 1 Ά i
0 1
£ i	0*
CS l
< 1	c
a i	rn
X 1
1	ΟΦΟί^ηφΟ
Ό 1	O-ftJCb-OOffl
« 1	·« wM »*
0 t
C i
*> 1
d 1
3 i
N i
> « 1
	3L
	»3
	OSt-oc-mfflHH OfUiOt·-® —>85 £ -SB CS WE-¹ <33333_H OŁŁi-ŁŁCDD

168 666 rt fc o

tu

Ł>

N

O 'C o

o

X

Γ4

4>

U

Ł>

X rt o

MO

O c

'rt¹

X >>

£ s

c

X rt cc

HT 1	oo·® CUO —	cu —cu turom
E-¹	<ot*ro	cuo —
O	* * *	* < «*
a	— Om	aj®®
	romro	<rroro
	®O>CU	mo®
	m®®	Oit-t-
k-4	OJ OJ cu	cu cu cu
X	«, > «.	X «» *
	ooo	ooo
E->	t-·* ®	t-®m
m	t-®t-	mcu·*
£	oo-	maj aj

	— ΦΦ	o-®-
u	m® o	o®-
w	* * *	* * *
0-	ΜΤΓΟ'Ο'	<fm<r
	Φ--	®>®
o	cu^o*	tO^Ul
2	ΟΦ®	—
	O-t-	® OOJ
	t-Φ®	OOiOi
		—
	O>CU®	®t-o
m	* * *	* *
cu	Ol — ®	w-4 ** ^4
ω	—	^4 ^4
2
n	cnt-t-	® m®
Ł-<	* * *	> * *
Cu	— OC~	aj®·»
	® ΦΦ	®t~-®
		ajt-o,
n	omt*	Ol-®
2	— no·	aj®m
		Ol®®
		*
		K
		καο ΟΟΧ EEK KK<
	OŁ	<<Q
	20	OO
	KWEłI	Φ
	O>2	t~® —
	E2 KHE-i	cum —
	<i-i Ed	2 P P
	om	ŁŁ-Eł

ν' Sb rt rt X X N K

168 666 jako cybrydy. Cybryda nr 13 była typu wrażllwa/męskosterylna. Cybryda 1 była typu odporna/męska płodna.

2. Wyodrębnlenle kwasów nuklelnowycC

Całkowlty DNA wyodrębnlono przy użycśu llścl pochodzących z czterotygodnlowycC roślln według metody oplsanej przez Dellaporta (1983). DNA mśtocCondrlalny wyekstrahowano z llścl ośmlotygodnlowycC roślln tak jak oplsall to Vedel l Mathleu, 1982, z następującyml warlantaml:

mltochondrla nle zostały oczyszczone w gradlencle sacharozy po llzle l llzę wykonano w sarcosylu 4% z protelnazą K 0,5 mg/ml (Boehrlnger Manhelm GmbH), w Trls pH 8, 50 mM, EDTA 20 mM. Po wytrącenlu, DNA mltochondrlalny oczyszczono przez odwlrowanle w gradlencle bromku etydyny - chlorku cezu (metoda 1- Vedel l Mathleu 1982) w probówkach do odwlrowanla w polśallomerze.

Całkowlte RNA wyodrębnlono przy użyclu llścl lub pączków kwlatowych według pracy Logemanna et al., 1987.

RNA mltochondrlalne wyekstrahowano z ośmlotygodnlowych kalafiorów według technlkl Sterna l Newtona, 1986.

3. Anallzy przez restrykcję DNA mltochondrialnego oraz elektroforezę w żelu agarozowym

Anallzy wykonano tak jak oplsall Pelletler et al., 1983. Całkowlte lub mltochondrlalne RNA umleszczono na żelach elektroforetycznych zawlerających formaldehyd tak, jak to oplsall Sambrook et al., 1989.

4. Hybrydyzacja

Przenleslenle DNA bądź RNA na flltry nylonowe (Hybond-N, Amersham) wykonano przez absorpcję kapślarną przy użyclu, odpowlednlo, 6xSSC bądź 10xSSPE według lnstrukcjl producenta. PreCybtydyrację l hybrydyzację przeprowadzono według Amershama wykorzystując sondy znaczone przez wlelolnlcjujący układ znaczenla DNA (Amersham) po oczyszczenlu na kolumnach Sephadex 650 (Sambrook et al., 1989).

5. Klonowanle DNA mltochondrlalnego

Dwa bankl genomowe llnll cybrydy męskosterylnej (13 - 7) oraz rewertanta (13 - 6) utworzono w wektorze fagu lambda EMBL3 l hodowano na szczeple restryktywnym E.coll Nm539 (Frlschauf et al., 1983). Otrzymano około 2,5x104 klonów na mg DNA mltochondrlalnego.

Bankl DNA mltochondrialnego mlanowano l rozwlnlęto w celu wyodrębnlenla warstewek, które przenleslono na flltry nylonowe, tak jak oplsall Sambrook et al., 1989. Sondę hybrydacyjną wykorzystywaną do skrinowanśa dwóch banków DNA mltochondrlalnego przygotowano następująco: fragment DNA mltochondrlalnego specyficzny dla CMS wymyto wykorzystując procedurę Gene cleanTM (BIO 101 INC.) przy użyclu produktu trawśenla DNA mltochondrlalnego umleszczonego na preparatywnym żelu agarozowym. Wymyty DNA następnle znaczono tak jak to zostało opśsane.

Ekstrakcja DNA Lambda, podklonowanle fragmentu Ncool 2,5 w mlejscu Ncol pTrc99A (Amann et al., 1988) oraz ekstrakcje DNA plazmldowego wykonano według protokołów Sambrooka et al., 1988. Plazmśdu rekoblnujące wprowadzono na szczep E.coll NM522 (Gough l Murray, 1983).

6. Badanle genetyczne cybrydy 13 l jej potomstwa

W plerwszym pokolenśu potomstwa otrzymanego przez zapylenle cybrydy 13 przez Brutor, złożonym z 13 roślln pśęć jest całkowlcle męskosterylnych (włączając w to rośllny 13 -2 l 13 -7), jedna męska płodna (numer 13-6) l sledem praktycznle całkowlcle sterylnych z kllkoma kwśataml męsklml płodnyml.

Rośllna płodna 13-6 została samozapylona oraz skrzyżowana z Brutorem. W dwóch przypadkach otrzymuje slę wyłącznle rośllny płodne (odpowlednlo 43 l 42).

W przypadku krzyżowanśa rośllny męskosterylnej numer 13-7 oraz Brutora 24 potomków jest całkowlcle sterylnych, zaś 6 ma kllka płodnych; jest to wynlk podobny do otrzymanego przy użyclu samej cybrydy. Rośllnę 13-2 skrzyżowano z llnśą restaurującą RF, która jest heterozygotą

168 666 dla specyficznych genów-restauratorów męskiej sterylności Ogury (Chetrit et al., 1985). Potomstwo tej krzyżówki składa się z 53 roślin męskosterylnych, 37 roślin męskich płodnych oraz 9 roślin praktycznie całkowicie sterylnych, jednakże zawierających kilka kwiatów płodnych. Wyniki te sugerują, że rośliny męskosterylne z rodziny cybrydy 13 zawierają determinantę CMS Ogury, podobnie jak inne cybrydy badane poprzednio o prostszym profilu restauracji (Chetrit et al., 1985).

W tym stadium badań można było wziąć pod uwagę dwie możliwości: albo

- cybryda 13 zawiera mieszaninę genomów mitochondrialnych męskich płodnych oraz męskosterylnych i można je bardziej wyselekcjonować w celu oczyszczenia dwóch fenotypów lub też

- cybryda 13 zawiera zrekombinowany genom mitochondrialny o niestabilnej strukturze, który wraca do bardziej stabilnej konfiguracji płodnej i będzie niemożliwe utrzymanie jednorodnego fenotypu męskosterylnego w następnych pokoleniach.

Sterylne rośliny męskie, otrzymane przy użyciu potomstwa sterylnej rośliny męskiej numer 13-7, uzyskano równocześnie przez rozsadę i przez krzyżowanie płciowe z Brutorem. Po zmiennej liczbie pokoleń (1 - 5) za pomocą obydwu metod wszystkie rodziny dały rośliny płodne. Inaczej jest w przypadku otrzymanych w ten sposób roślin całkowicie płodnych, które nie dają nigdy ponownie roślin sterylnych.

W świetle tych wyników można wziąć pod uwagę, że drugie wyjaśnienie zaproponowane powyżej czyli, że cybryda 13 zawiera niestabilny genom mitochondrialny, który traci determinantę CMS Ogury podczas procesu prowadzącego do konfiguracji płodnej bez możliwości powrotu do fenotypu sterylnego jest wyjaśnieniem poprawnym.

7. Porównaóie miiechondrialnego DNA w przypadku rośli n męskosterylnech oraz płodnych rewertantów. Wyodrębnienie specyficznego fragmentu roślin męskoste^^^.

DNA mitochosdrialsy wyekstrahowano z liści męskosterylneNn potomstwa 13-7 oraz płodnych rewertantów (potomstwo 13-6 lub 13-7) i trawiono licznymi enzymami restrykcyjnymi w celu porównania jego profilu restrykcyjnego. Genomy mitochonOrialne dwóch typów są bardzo podobne, gdyż nie można zaobserwować żadnej różnicy między profilami restrykcyjnymi mitachosdriów męskost-erykTych i płodnych rewertantów uzyskanymi przy użyciu rozmaitych enzymów. Jednak fragment restrykcyjny o 6,8 kb wykryto w profilu restrykcyjnym DNA mitnchosOrialsego roślin męskosterylsydh trawionych przy użyciu NruI, zaś nigdy nie zaobserwowano w profilach odpowiednich płodnych rewertantów.

Fragment (zwany N6,8) wymyto z żelu agarnznwego, znaczono i wykorzystano jako sondę na profilach restrykcyjnych DNA mitochonOrialnego otrzymanych przy użyciu Nruł: ważny sygnał przy 6,8 kb zaobserwowano u całego męskosterylsego potomstwa cybrydy 13, podczas gdy żaden fragment tej wielkości nie uległ hybrydyzacji z sondą w genomach mitochandrialnych płodnych rewertantów. Poza tym, sonda N6,8 hydratyzuje z fragmentem o 6,8 kb w mitachandrialnym DNA Ogury trawionym przy użyciu NruI; sonda nie hybrydyzuje natomiast z fragmentem pochodzącym od B. Napus cv Brutor, wskazując że fragment ten jest pochodzenia Ogury.

Bank lambda zawierający ekstrakty DNA mitochondrialnega pochodzącego od roślin męskosterylnych (13-7) sprawdzono ze znaczonym wymytym fragmentem i spośród 8 klonów hybaydyżujących wyodrębniono 2 fagi rekombinując zawierające cały fragment N6,8 oraz sekwencje sąsiadujące. Otrzymano szczegółową mapę restrykcyjną tego obszaru. Hybrydyzacja profilu restrykcyjnego DNA mitochondrialnego, pochodzącego do potomków płodnych i sterylnych cybrydy 13 z N6,8 w charakterze sondy, pozwoliła ograniczyć obszar specyficzny genotypu męskasterylsega do fragmentu Ncol o 2,5 kb.

Fragment NcoI o 2,5 kb znaczono i wykorzystywano jako sondę w stosunku do DNA mitochondrialnego pochodzącego od potomków 13-7 i 13-6 trawionego przy pomocy NcoI. Oprócz sygnału przy 2,5 kb specyficznego dla profilu męskosterylnego, liczne fragmenty NcoI hybrydyzują równocześnie w profilach płodnych rewertantów oraz profilach męskosterylnych; fragmenty te są przy 2,2, 10 i 14 kb. Fragment NcoI o 2,7 kb silnie hybrydyzuje w genomie mitochondrialnym płodnych potomków natomiast nie hybryOyzuje w przypadku potomków sterylnych. Analiza tego profilu hybrydyzacji prowadzi do wniosku, że fragment NcoI o 2,5 kb, chociaż specyficzny dla męskosterylnego DNA mitocrondaialnego, zawiera sekwencje które

168 666 powtarzają się gdzie indziej w genomie mitochondrialnym (we fragmentach o 2,2, 10 i 14 kb po wytrawieniu przy użyciu Ncol) i te powtarzające się sekwencje są również obecne w DNA mitochondrialnym płodnych rewertantów poza specyficznym fragmentem o 2,7 kb.

Całkowite rNa wyekstahowano z liści lub z zalążków potomków cybrydy 13 lub z męskosterylnych lub płodnych cybryd (pochodzących z innych doświadczeń polegających na fuzji) i linii Brutor. Northern blots (przemieszczenia typu Northem) wykonano i hybrydyzowano z sondą odpowiadającą wstawce (insertowi) klonu lambda zawierającego N6,8 opisanego w przykładzie 3. Wykryto główny transkrypt o 1,4 kb u wszystkich cybryd męskosterylnych także w przypadku cybrydy 13-7 podczas gdy nie zaobserwowano żadnego transkryptu tej wielkości w linii Brutor ani też w przypadku dwóch cybryd płodnych (różnych od cybrydy 13). Ponadto rośliny płodne wykazują transkrypt o 1,1 kb hybrydyzujący z sondą, nieobecny lub obecny na bardzo niskim poziomie, we wszystkich badanych cybrydach męskosterylnych. Liczne transkrypty wspólne dla wszystkich próbek hybrydyzujących słabo z sondą z powodu znacznej wielkości znaczonej wstawki (insertu). Sprawdzono, że trankskrypty mitochondrialne w próbkach całkowitego RNA można wykryć przez hybrydyzację samego DNA zawierającym sekwencję genu atpa.

Ten sam specyficzny transktrypt o 1,4 kb znaleziono w mitochondrialnych RNA Ogury wyekstrahowanych z kalafiorów przy użyciu jako sondy fragmentu NcoI 2,5. Dokładne granice tego transkryptu wyznaczono przy wykorzystaniu w charakterze sondy podklonów fragmentu NcoI 2,5.

8. Badanie cybrydy 1 i jej potomstwa.

Cybryda 1 była płodną formą męską. Spośród jej potomstwa roślina 1,12 była płodna zaś roślina 1,18 - sterylna. Roślina 1,12 dała jako potomstwo rośliny sterylne (S3) i rośliny płodne (RF3). Roślina 1,18 dała rośliny sterylne (S2) oraz gałąź płodną (RF2). Rośliny S2 i S3 restauruje się tym samym jądrowym genem restaurującym płodność pyłkową co w przypadku sterylnej cybrydy 13.

DNA mitochondrialny roślin S2 i S3, znaczony przez hybrydyzację z fragmentem NcoI o 2,5 kb, nie daje sygnału przy 2,5 kb po trawieniu przez NcoI, ani też sygnału przy 6,8 kb po trawieniu przez Nful.

Podobnie hybrydyzacja całkowitego RNA (Northem) z sondą odpowiadającą sekwencji ORFB nie daje sygnału przy 1,4 kb, jak w przypadku sterylnej cybrydy 13. Natomiast sonda odpowiadająca sekwencji między nukleotydami 928 i 1569 z fig. 1, daje sygnał w Northem przy około 1,3 kb. Sygnał ten jest nieobecny w przypadku RNA roślin RF1, RF2, RF3 lub Brutor. Podobnie możliwejest wykorzystywanie tej sekwencji (928 -1569) jako sondy przy przesunięciu punktowym (dot biot) całkowitych RNA i w tym przypadku wszystkie rośliny męskosterylne dają sygnał.

Powyższe wyniki wskazują, że rośliny S2 i S3, mimo że męskosterylne, nie zachowały sekwencji nukleotydowej, opisanej na fig. 1, w swojej oryginalnej konformacji i pokazują, że część tej sekwencji zawarta między nukleotydami 928 i 1569 jest nośnikiem specyficznej determinanty sterylności Ogury; czyni ona rośliny męskosterylnymi, gdy ta sekwencja ulegnie transkrypcji.

Sekwencja ta nie ma znaczącej homologii z sekwencjami obecnymi w bankach danych.

Przykład II: Wykrycie sekwencji niepożądanych w genomie mitochondrialnym Ogury

Zbiór cybryd otrzymano w ramach gatunku B. napus przez fuzję protoplazmów rzepaku będącego nośnikiem cytoplazmy Ogury i rzepaku normalnego. Pierwszy z nich jest męskosterylnych i ma deficyt chlorofilu w niskiej temperaturze, drugi zaś jest normalnie zielony i płodny. Cybrydy wyselekcjonowano spośród roślin regenerowanych i zachowano te które były męskosterylne i prawidłowo zielone.

W identyczny sposób otrzymano zbiór cybryd w ramach gatunku B. oleracea przez fuzję protoplastów kapusty będącej nośnikiem cytoplazmy Ogury i kapusty normalnej. Spośród roślin regenerowanych zachowano te cybrydy, które były męskosterylne i normalnie zielone.

Cybrydy te skrzyżowano z różnymi odmianami - odpowiednio - rzepaku bądź kapusty. Krzyżówki te powtarzano w każdym pokoleniu z tymi samymi odmianami tak, by otrzymać określony genotyp bliski genotypu takiego, jak w przypadku odmiany wstecznej.

168 666

Wspomniane wyżej różne odmiany przekształcone w ten sposób na cytoplazmach różnych cybryd poddano próbom agronomicznym w celu zmierzenia produkcji nasion; zależy ona od szeregu czynników: produkcji nektaru wystarczającej dla zapewnienia zapylenia przez owady, prawidłowej morfologii kwiatowej tak by zapylenie było skuteczne i by owoce się prawidłowo rozwijały.

Zbiór cybryd mógł być zatem podzielony na dwie partie:

- partię cybryd wykazującą sterylność męską odpowiednią dla handlowej produkcji nasion

- partię cybryd nie wykazującą wszystkich cech korzystnych dla prawidłowej produkcji handlowej nasion.

Do pierwszej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 27, 58, 85 oraz cybrydy kapusty nr 9, 17, 21, 24 i 27c.

Do drugiej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 23s, 77, 118 oraz cybrydy kapusty nr 1, 6 i 14.

Całkowite DNA tych cybryd poddano trawieniu przez enzymy: Sali, Ncol, Nrul, Bgll, Pstl, Kpnl. Otrzymane Southern blots (przeniesienią typu Southern) hybrydyzowano z różnymi sondami mitochondrialnymi Atpa, Cob, Coxi, Atp6, 26S, 18S, i dwoma fragmentami genomu Ogury: o 2,5 kb otrzymanym po trawieniu przez Ncol i o 19,4 kb otrzymanym po trawieniu przez Nrul.

Dwie partie cybryd różnią się następująco:

a) nr, nr, 23S, 77,11S - w przypadku rzepaku- oraz 1,6,11 -w przypadku kapusty- posiadają obszar genomu Ogury, który otacza gen coxl rozpoznawalny przez fragmenty Bgll o 10,7 kb lub Nrul o 11 kb oraz obszar genomu Ogury, który otacza jeden z genów RNA przenoszącego formylometioninę, rozpoznawalny przez fragmenty sali o 5,1 kb i Nrul o 15 kb.

b) nr, nr, 27,58, 85 -w przypadku rzepaku- oraz 9, 17,21, 24 i 27c -w przypadku kapustynie posiadają obszarów odpowiadających które zostały zamienione - na skutek rekombinacji między genomami dwóch form rodzicielskich, które uległy fuzji - przez analogiczne obszary genomu mitochondrialnego rzepaku w przypadku nr, nr, 27, 58, 85 oraz kapusty w przypadku nr, nr, 9, 17, 21, 24 i 27c.

Na tej podstawie wnioskuje się, że dwa rozpatrywane obszary genomu Ogury są niepożądane, jeśli chce się uzyskać układ sterylności męskiej odpowiedni dla handlowej produkcji nasion.

Przykład UL Niniejszy przykład ilustruje znaczenie znajomości sekwencji męskiej sterylność Ogury oraz sekwencji niepożądanych dla wykonania bezpośredniego wyselekcjonowania otrzymanych cybryd bez konieczności wieloletniego krzyżowanie wstecznego oraz testów agronomicznych.

Łączy się protoplasty rośliny z rodzaju Brassica będące nośnikiem cytoplazmy Ogury z protoplastami rozpatrywanego rodzaju Brassica. Uzyskane w wyniku fuzji kolonie hoduje się in vitro i powoduje regenerację w środowisku, które sprzyja tworzeniu pączków (zob. Pelletier et al., 1983).

Przy użyciu 1 g świeżego materiału, co dotyczyłoby zasklepki lub fragmentu regenerowanego zarodka roślinnego, możliwe jest przy użyciu technik opisanych poprzednio wyodrębnienie całkowitego DNA. Po trawieniu przez sali, hybrydyzacja typu Southern z sondą zawartą między nukleotydami nr 389 i 1199 (zob. fig. 1) powinna dać sygnał jedynie dla 4,4 kb (nie powinna dać sygnału przy 5,1 kb). Podobni po trawieniu rzez Nrul i hybrydyzacji z sondą zawierającą gen coxl powinno się otrzymać sygnał dla wielkości różnej od 11 kb.

Wspomniane hybrydyzacje pozwalają przewidzieć, że dysponuje się rośliną, która będzie męskosterylne i która będzie się nadawać do handlowej produkcji nasion.

Przykład lV. Niniejszy przykład jest wariantem przykładu 3, z tym że w miejsce wykonania fuzji protoplastów wykonuje się krzyżowanie płciowe między dwiema formami rodzicielskimi w warunkach szczególnych lub ze szczególnymi genotypami takiego rodzaju, który - w przeciwieństwie do procesów znanych z zapładniania u roślin - jest połączeniem (wynikiem skrzyżowania) cytoplazm oosfery i łagiewki pyłkowej lub gamety męskiej. Jeśli te sposoby byłyby opisane, można być w ten sam sposób wykonać wczesną selekcję młodych roślin

168 666 uayikanych a tych sztucznych aapładnioń pray wykarayitaniu tych iamych iand i tych iamych kryteriów jak w przykładzio 3.

Przykład V. Niniejlzy przykład iluitrujo korzyść wynikającą ao anajamaści iokwoncji itorylnaści Ogury pray manipulacji genotycanej typu juk apiianogo dla praypadku drożdży (Jahnitan ot al., 1988).

Pray ukyciu narmalnoj rośliny Braiiica domdardujo iię moryitomy dądź tok komórki in vitro mikrocaąitkami pokrytymi DNA, któro joit naśnikiom iokwoncji itorylności Ogury. Rośliny otrzymano praoa potamitwo moryitom poddanych odródco lud rogonorawanych aarodków roślinnych dędą cytoplazmicanio męikoitorylno, jośli DNA mógł praoniknąć da mitochondriów i zintogrować iię z gonomom tych organolli. Uniknio iię aatom pradlomów wywołanych praoa lekuoncjo niopokądano, co dotyczyłody chlaraplaitów rzodkwi Ogury lud iokwoncji okroślonych w ton spó-iód w gonomio mitochondrialnym Ogury.

Przykład Vl. Niniojszy przykład ilustrujo korzyść o znajomości iokwoncji storylności Ogury przy konstruowaniu motodami inkyniorii gonotycznoj jądrowoj storylności męikioj w dziodziczoniu mondlowskim a nio cytoplazmicznym.

Przy ukyciu iokwoncji DNA mitachondrialnoga ograniczanoga praoa nuklootydy 928 i 1569 mokna skonstruować gon chimorycany, który po transformacji gonotycznoj komórok Braiiica lud innoga rodzaju dędzio tranikrydowany do jądra kamórok otrzymanych transformowanych roślin. Jośli gon chimorycany aawiora proiokwoncję, która umakliwia wprowadzonio do mitachondrium swojogo praduktu translacji w diałka, traniformanty to dędą męikastorylno i cocha ta dędzio funkcjonować jaka dominująca cocha mondlawika.

LITERATURA

Amann, o, Ochs, Adol K-J (1988) Gono 69:301-315

Bannorot H, Boulidard L, Caudoron Y, Tompo J (1974) Prac

Eucarpia Mooting Cruciforao 25:52-54

Bannorot H, Boulidard L, Chupoau Y (1977) Eucarpia Cruciforao Nowil: 2-16 Chotrit P, Mathiou C, Vodol F, Pollotior G, Primard C (1985)

Thoor Appl Gonot 69:361-366

Dollaporta SL, Wood J, Hicki JB (1983) Plant Mol Biol Rop 1:19-21

Ducruot JM i Gazquoz J (1978) Chomosphoro 8:691-696

Friihaut AM, Lohrach H, Pauitka A, Murray N (1983) J Mol Biol 170:827-842

Gough J i Murray N (1983) J Mol Biol 166:1-19

Hiosol R, Shodol W, Schustor W, Bronnicko A (1987) EMBO J 6:29-34

Johnitan SA, Anziano PQ, Shark K, Sanford JC, Butów RA (1988) Scionco 240:1538-1541

Logomann J, Schdl J, Wilmitzor L (1987) Analytical Biochom 163:16-20

Ogura H (1968 Mom Fac Agric Kagoshima Univ 6:39-78

Pollotior G, Primard C, Vodol F, Chotrit P, Romy R, Rauisollo P, Ronard M (1983)

Mól Gon Gonot 191:244-250

Samdraok J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Malocular Cloning, Cóld Spring Hardor

Ladóratory, Cald Spring Hardar, Now York

Stem DB i Nowtan KJ (1986) Monthods Enzymol 118:488-496

Vodol F i Mathiou C (1982) Anal Biochom 127:1-8.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania roślin hybrydowych, znamienny tym, że krzyżuje się roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej i zawierającą sekwencję DNA sterylności Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 926 i 1569, na fig. 1, lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją, wspomnianą w punkcie a) i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krzyżuje się roślinę należącą do gatunku Brassica, zawierającą chloroplasty rodzaju Brassica zgodne z genomem jądrowym wymienionej rośliny i mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA sterylności Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569 na fig. 1 lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją wspomnianą w punkcie a), i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej i należącą do rodzaju Brassica, której genom jądrowy zawiera sekwencję DNA sterylności Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569 na fig. 1, lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencję wspomnianą w punkcie a), i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską i presekwencję, umożliwiającą wprowadzenie do mitochondriów produktu translacji wymienionej sekwencji, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica napus.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica oleracea.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica campestris.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica juncea.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica nigra.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica hirta.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica carinata.
11. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku B. napus, B. oleracea, B. campestris,

B. nigra, B. juncea, B. hirta lub B. carinata.
12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3 albo 11, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę otrzymaną przez fuzję protoplastów.
13. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3 albo 11, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę otrzymaną przez reprodukcję płciową.

168 666
14. Sposób według z<utrz. 1 albo 2, albo 3, albo 11, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cochę cytaplaamicanoj itorylnaści męskiej itaiujo iię raślinę atraymaną praoa transfer gonu da mitachandriów.