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WO2013037266A1 - 利拉鲁肽的固相合成方法 - Google Patents

利拉鲁肽的固相合成方法 Download PDF

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WO2013037266A1
WO2013037266A1 PCT/CN2012/080756 CN2012080756W WO2013037266A1 WO 2013037266 A1 WO2013037266 A1 WO 2013037266A1 CN 2012080756 W CN2012080756 W CN 2012080756W WO 2013037266 A1 WO2013037266 A1 WO 2013037266A1
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WO
WIPO (PCT)
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fmoc
resin
liraglutide
solid phase
gly
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/CN2012/080756
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English (en)
French (fr)
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潘俊锋
刘建
马亚平
袁建成
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Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hybio Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Priority to ES12831927.4T priority patent/ES2592634T3/es
Priority to DK12831927.4T priority patent/DK2757107T3/en
Priority to EP12831927.4A priority patent/EP2757107B1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to a method for synthesizing a polypeptide, in particular to a method for solid phase synthesis of liraglutide. Background technique
  • Liraglutide English name is liraglutide, and its peptide sequence is: H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln -Ala-Ala-Lys(N-Palmitoyl-L-y-glutamyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH.
  • Liraglutide developed by Danmano and Nord, is a receptor agonist of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), which acts as a subcutaneous preparation to reduce blood sugar.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • Novo Nordisk's liraglutide is mainly prepared by biological methods such as genetic engineering, which is difficult in technology and high in production cost, and is not conducive to large-scale production of liraglutide.
  • a solid phase synthesis method of liraglutide comprising the following steps:
  • Fmoc-Gly-resin is obtained by coupling a resin solid phase carrier and N-terminal Fmoc-protected glycine (Fmoc-Gly-OH) in the presence of an activator system;
  • the amino acid having N-terminal Fmoc protection and side chain protection is sequentially coupled according to the liraglutide main chain peptide sequence by solid phase synthesis, wherein lysine adopts Fmoc-Lys(Alloc)-OH;
  • the resin solid phase carrier is a 2-CTC resin
  • the activator system is selected from DIEA, TMP or NMM
  • the Fmoc-Gly-resin is 0.15-0.28. Mm/g substitution of Fmoc-Gly-CTC resin.
  • the resin solid phase carrier adopts Wang Shuyue
  • the activator system is composed of DIC, HOBt and DMAP
  • the Fmoc-Gly-resin is 0.12-0.24 mmol/ g replacement of Fmoc-Gly-king resin.
  • step B) comprises the following steps:
  • tryptophan protects the side chain through the Boc protecting group; glutamic acid protects the side chain through the OtBu protecting group; lysine protects the side chain through the Alloc protecting group; glutamine
  • the side chain is protected by the Trt protecting group; the tyrosine is protected by the side chain of the tBu protecting group; the serine is protected by the Trt or tBu protecting group, and the serine has a different protecting group Trt or tBu to ensure the resin Coupling effect and final product yield; aspartic acid is protected by side chain by OtBu protecting group; threonine is protected by side chain by tBu protecting group; histidine is protected by side chain by Trt protecting group, Protection of the N-terminus by a Boc protecting group.
  • the coupling agent system comprises a condensing agent and a reaction solvent
  • the condensing agent is selected from the group consisting of DIC/HOBt, PyBOP/HOBt/DIEA or HATU/HOAt/DIEA
  • the reaction solvent is selected from DMF, DCM, NMP, DMSO or any combination between them.
  • the lysine side chain protecting group Alloc is removed by using 0.1 to 0.4 times the synthetic amount of Pd(PPh3)4 and 10 ⁇ 30 times of the synthetic amount of phenylsilane. Remove under solid conditions for 10 to 65 minutes.
  • the lysine side chain can be directly coupled to Palmitoyl-Glu-OtBu, or Fmoc-Glu-OtBu can be coupled first, and after Fmoc is removed, palmitoyl chloride is coupled.
  • the cleavage is carried out by removing the protecting group and the resin by a "cut peptide reaction" which is commonly used in the art to obtain a crude peptide of liraglutide.
  • the purification is reversed-phase high performance liquid chromatography, and the color column is a reverse phase C8 column, and the column temperature is 40 to 50 °C.
  • the beneficial effects of the invention are: providing a solid phase synthesis method for preparing liraglutide, operating the cartridge, the synthesis cycle is short, the cost is not high, and the generation of waste liquid is reduced.
  • the post-treatment is easy, the by-products are small, and the product yield is high, which is advantageous for large-scale production of liraglutide.
  • DRAWINGS Figure 1 is a flow chart showing the solid phase synthesis process of liraglutide of the present invention. detailed description
  • the invention discloses a solid phase synthesis method of liraglutide, and those skilled in the art can learn from the contents of the paper and appropriately improve the process parameters. It is to be understood that all such alternatives and modifications are obvious to those skilled in the art and are considered to be included in the present invention.
  • the method of the present invention has been described by the preferred embodiments, and it is obvious that those skilled in the art can change and adapt and combine the methods and applications described herein to implement and apply the present invention without departing from the scope of the present invention. Invention technology.
  • Example 2 was a synthesis of 0.28 mmol/g of Fmoc-Gly-CTC resin. Weigh 11.1 g of 2-CTC resin with a substitution of 0.9 mmol/g, add to the solid phase reaction column, wash twice with DMF, swell the resin with DMF for 30 minutes, and then dissolve 5.78 g of Fmoc-Gly-OH with DMF. After adding 6.94 mL of DIEA to the ice water bath, it was added to the above reaction column containing the resin. After reacting for 2 hours, it was blocked by adding 8 mL of anhydrous decyl alcohol for 1 hour.
  • Example 3 The synthesis of Fmoc-Gly-King resin with a JL of 0.24 mmol/g.
  • reaction solvent is a mixture of DMSO and DMF in a volume ratio of 1:4;
  • Fmoc-Ala-OH is a PyBOP/HOBt/DIEA system, and the reaction solvent is DCM;
  • Fmoc-Gln(Trt)-OH is a PyBOP/HOBt/DIEA system, and the reaction solvent is a mixture of DMSO and NMP in a volume ratio of 1:4; Fmoc-Ser(Trt)-OH and Fmoc-Ser(tBu)-OH are used.
  • the reaction solvent is NMP, and the different protecting groups Trt and tBu of serine are used to ensure the coupling effect of the resin and the final product yield.
  • the linear liraglutide CTC resin was washed 3 times with DMF and washed 5 times with DCM for subsequent synthesis.
  • Example 6 Preparation of a linear liraglutide resin. 12.5 g of Fmoc-Gly-King resin with a substitution of 0.12 mmol/g was weighed, added to the reactor, washed twice with DMF, and swelled with Fmoc-Gly-Wang resin for 30 minutes with DMF, and then removed with 20% DBLK.
  • Fmoc-Ile-OH adopts PyBOP/HOBt/DIEA system, and the reaction solvent is a mixture of DMSO and DMF with a volume ratio of 1:4; Fmoc-Ala-OH adopts
  • reaction solvent is DCM; Fmoc-Gln(Trt)-OH is adopted
  • reaction solvent is a mixture of DMSO and NMP in a volume ratio of 1:4; Fmoc-Ser(Trt)-OH and Fmoc-Ser(tBu)-OH are in HATU/HOAt/TMP system, reaction solvent For NMP, serine uses different protecting groups Trt and tBu to ensure the coupling effect of the resin and the final product yield. The resin was washed 3 times with DMF and 5 times with DCM for the next step.
  • Example 7 Synthesis of N a -Palmotiyl-Glu-OtBu.
  • H-Glu-OtBu (20.3 g, lOO mmol)
  • a three-necked flask containing 200 mL of dichloromethane, cool to 5 ° C in an ice water bath, and add 5.7 mL (50 mmol) of triethylamine, 20 Slowly drip after a minute
  • Add palmitoyl chloride 32.88 g (120 mmol) add dropwise in 30 minutes, naturally warm to room temperature after the addition, and then react for 2 hours. TLC monitoring, the reaction of the raw materials is complete, and the reaction solution is saturated with NaHCO.
  • Method 1 Weigh Palmemayl-Glu-OtBu 2.18 g, PyBOP 3.9 g, HOBt 1.22 g, dissolve with 25 mL of NMP, add 2.7 mL of DIEA for 3 minutes in an ice water bath, and add to the reaction column for 2 hours. The end point of the reaction was judged by the ninhydrin method. After the reaction, the mixture was condensed with decyl alcohol, and the resin was dried under vacuum overnight. Weighed to obtain 20.1 g of liraglutide resin (resin weight gain rate 94.7%).
  • Method 2 Weigh Fmoc-Glu-OtBu 3.18 g, PyBOP 3.9 g, HOBt 1.22 g, dissolve with 25 mL of dichlorosilane, add 2.7 mL of DIEA for 3 minutes in an ice water bath, and add to the reaction column for 2 hours. The end of the reaction was judged by the triketone method. At the end of the reaction, Fmoc was removed, DMF was washed 6 times, 1.22 g of palmitoyl chloride and 2.1 mL of DIEA were added, and the reaction was carried out at room temperature for 2 hours, and the end point of the reaction was judged by the ninhydrin method.
  • Example 10 Large-scale preparation of liraglutide resin.
  • Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc- Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu( Coupling of OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(Trt)-OH.
  • Liraglutide King 4 was washed 3 times with DMF and washed 5 times with DCM.
  • Example 11 Preparation of Liraglutide Crude Peptide.
  • the phage solution was treated with Waters 2545 RP-HPLC system, the column was 50 ⁇ 250 mm reverse phase C8 column, 0.1% hydrochloric acid/acetonitrile mobile phase was transferred to salt, the peak of interest was collected, concentrated by rotary evaporation, and lyophilized to obtain liraglutide salt.
  • the acid salt was 6.75 g, the HPLC purity was 99.1%, the purification yield was 52.7%, and the total yield was 15.32%.
  • Example 13 Preparation of Lirarupeptide Sperm Peptide Acetate.
  • the phage solution was treated with Waters 2545 RP-HPLC system, the color column was 50 ⁇ 250 mm reverse phase C8 column, 0.2% acetic acid/acetonitrile mobile phase was transferred to salt, and the peak of interest was collected, concentrated by rotary evaporation, and lyophilized to obtain liraglutide vinegar.
  • the acid salt was 6.83 g
  • the HPLC purity was 99.23%
  • the purification yield was 54.7%
  • the total yield was 15.68%.
  • the phage solution was treated with Waters 2545 RP-HPLC system, the column was 50 ⁇ 250 mm reverse phase C8 column, 0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile mobile phase was transferred to salt, and the peak of interest was collected, concentrated by rotary evaporation, and lyophilized to obtain liraglutide.
  • the acetate sperm peptide was 6.88 g, the HPLC purity was 99.17%, the purification yield was 55.2%, and the total yield was 15.87%.

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Abstract

提供了一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：A）在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和N端Fmoc保护的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）偶联得到Fmoc-Gly-树脂；B）通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用FmOC-LyS(Alloc)-OH；C）脱除赖氨酸侧链保护基Alloc；D）通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Palmitoyl-Glu-Offiu；E)裂解，脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；F)纯化，冻干，得到利拉鲁肽。

Description

利拉鲁肽的固相合成方法
本申请要求于 2011年 9月 14日提交中国专利局、 申请号为
201110271342.3、 发明名称为"利拉鲁肽的固相合成方法"的中国专利申请的优 先权， 其全部内容通过引用结合在本申请中。 技术领域
本发明涉及多肽的合成方法， 尤其涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。 背景技术
利拉鲁肽， 英文名称为 liraglutide, 其肽序为： H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-£-(N-a-Palmitoyl-L -y-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。 利拉鲁肽由丹 麦诺和诺德公司研制， 是胰高血糖素样肽 -1 ( G LP-1 )的受体激动剂， 作为一 种皮下注射制剂， 能起到良好的降低血糖作用。
诺和诺德的利拉鲁肽主要是通过基因工程等生物学方法进行制备，技术难 度大， 生产成本高， 不利于利拉鲁肽的大规模生产。 US6268343B1和
US6458924B2报道了利拉鲁肽的固液合成法， 中间体 GLP-l(7-37)-OH 均需要 反相 HPLC纯化，再在液相条件下与 Na-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，并且由 于 GLP-l(7-37)-OH N端未保护以及侧链保护基全部脱除， 会导致产生许多杂 质， 难以纯化， 操作繁瑣。 利拉鲁肽的现有合成方法存在操作繁瑣， 需两步纯 化， 合成周期长， 废液多， 不利于环保， 需花费大量乙腈， 成本高昂以及不利 于大规模生产的缺点。 发明内容 为解决现有技术中存在的问题， 本发明提供一种利拉鲁肽的固相合成方 法。
一种利拉鲁肽的固相合成方法， 包括如下步骤：
在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 N端 Fmoc保护的甘氨酸 ( Fmoc-Gly-OH )偶联得到 Fmoc-Gly-树脂；
通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且 侧链保护的氨基酸， 其中赖氨酸采用 Fmoc-Lys(Alloc)-OH;
脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc;
通过固相合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Glu-OtBu;
裂解， 脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；
纯化， 冻干， 得到利拉鲁肽。
采用上述技术方案， 通过固相合成法进行利拉鲁肽的制备， 操作筒单， 合 成周期短， 成本不高， 减少了废液的产生， 副产物少， 产品收率高， 利于利拉 鲁肽的大规模生产。
作为本发明的进一步改进，所述步骤 A )中，所述树脂固相载体采用 2-CTC 树脂， 所述活化剂系统选自 DIEA、 TMP或 NMM, 所述 Fmoc-Gly-树脂为 0.15-0.28 mmol/g替代度的 Fmoc-Gly-CTC树脂。
作为本发明的进一步改进， 所述步骤 A )中， 所述树脂固相载体采用王树 月旨， 所述活化剂系统由 DIC、 HOBt和 DMAP组成， 所述 Fmoc-Gly-树脂为 0.12-0.24 mmol/g替代度的 Fmoc-Gly-王树脂。
作为本发明的进一步改进， 所述步骤 B ) 包括如下步骤：
B1 )采用 DBLK使所述 Fmoc-Gly-树脂脱除 Fmoc保护基， 得到 H-Gly- 树脂， 所述 DBLK由体积比为 1： 4的哌啶和 DMF组成；
B2 )在偶联剂系统的存在下， H-Gly-树脂和 Fmoc保护且侧链保护的精氨 酸偶联得到 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂； B3 )重复步骤 Bl、 B2, 按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联。 在进行氨基酸的偶联时， 色氨酸通过 Boc保护基进行侧链的保护；谷氨酸 通过 OtBu保护基进行侧链的保护；赖氨酸通过 Alloc保护基进行侧链的保护； 谷氨酰胺通过 Trt保护基进行侧链的保护； 酪氨酸通过 tBu保护基进行侧链的 保护； 丝氨酸通过 Trt或 tBu保护基进行侧链的保护， 丝氨酸采用不同的保护 基 Trt或 tBu是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率； 天冬氨酸通过 OtBu保护基进行侧链的保护； 苏氨酸通过 tBu保护基进行侧链的保护； 组氨 酸通过 Trt保护基进行侧链的保护， 通过 Boc保护基进行 N端的保护。
作为本发明的进一步改进， 所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂， 所述 缩合剂选自 DIC/HOBt、 PyBOP/HOBt/DIEA或 HATU/HOAt/DIEA; 所述反应 溶剂选自 DMF、 DCM、 NMP、 DMSO或他们之间的任意组合。
作为本发明的进一步改进，所述步骤 C )中，脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc 采用 0.1~0.4倍合成规模用量的 Pd(PPh3)4和 10~30倍合成规模用量的苯基硅 烷在固相条件下脱除 10~65 分钟。
所述步骤 D ) 中， 在赖氨酸侧链可以直接偶联 Palmitoyl-Glu-OtBu, 也可 以先偶联 Fmoc-Glu-OtBu, 脱除 Fmoc后， 再偶联棕榈酰氯。
所述步骤 E ) 中， 裂解， 通过本领域常用的"切肽反应"脱除保护基和树脂 得到利拉鲁肽粗肽。
作为本发明的进一步改进， 所述步骤 F ) 中， 纯化为反相高效液相色谱纯 化， 色语柱为反相 C8柱， 柱温为 40~50°C。
与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 提供了一种固相合成法进行利拉 鲁肽的制备方法， 操作筒单， 合成周期短， 成本不高， 减少了废液的产生， 后 处理容易， 副产物少， 产品收率高， 利于利拉鲁肽的大规模生产。 附图说明 图 1为本发明利拉鲁肽的固相合成工艺流程图。 具体实施方式
本发明公开了一种利拉鲁肽的固相合成方法，本领域技术人员可以借鉴本 文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的 方法已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实 施例对本发明作进一步的详细说明。 王树脂和 CTC树脂购自天津南开和成有限公司， 各种保护氨基酸购自吉 尔生化有限公司。 说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中：
MM ^药甲氧羰基
0-苯并 唑- ^^—四甲基脲鎩六氟 ϋ酸盐
■SATO ο-σ-偶氮苯并三氮唑 -1-氧) - ; H用基脲鐡六氟磷酸盐
(^并三唑 ί-氧)三吡咯烷子基磷鐡六氟磷酸盐
BIG 二异丙基碳二亚胺
:H雜: §基苯丼三唑
興 At 1¾基-? 氮苯并三唑
DIEA. 二异丙基乙胺
TMP 三甲基吡啶
P t 2 6::?-五甲基二氢苯并呋喃 -5 酰基
Bt: Ξ苯甲基
■tB¾ 叔丁基
B 二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
2—三苯甲基氯树脂
■TFA
Alloc 烯丙氧羰基
M -甲基吡咯鲩酮
MSO 二甲基亚砜
Palniitoyi 粽榈酰基
E0T 乙二硫醇
四三苯基膦钯
苯硅鲩
实施例一替 ^JL为 0.15 mmol/g的 F moc-Gly-CTC树脂的合成。
称取替代度为 0.5 mmol/g的 2-CTC树脂 20 g,加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 4.3 g Fmoc-Gly-OH用 DMF溶解， 冰水 浴下加入 4.78 mL DIEA活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中，反应 2小时后， 加入 8 mL无水曱醇封闭 1小时。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 用无水曱醇封闭 30分钟， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 0.15 mmol/g„
实施例二替^^为 0.28 mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC树脂的合成。 称取替代度为 0.9 mmol/g的 2-CTC树脂 11.1 g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟后，取 5.78 g Fmoc-Gly-OH用 DMF溶解， 冰水浴下加入 6.94 mL DIEA活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2小 时后， 加入 8 mL无水曱醇封闭 1小时。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 用无水曱 醇封闭 30分钟， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 0.15 mmol/g。 实施例三替^ JL为 0.24 mmol/g 的 Fmoc-Gly-王树脂的合成。
称取替代度为 0.75 mmol/g的王树脂 13.1 g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 4.3 g Fmoc-Gly-OH、 3.78 g HOBt用 DMF溶解，冰水浴下加入 2.84 mL DIC活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 5分钟后加入 268 mg DMAP, 反应 2小时后， DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 用 100 mL醋酸酐 /吡啶封闭过夜， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度 为 0.24 mmol/g。 实施例四 替>½为 0.12 mmol/g 的 Fmoc-Gly-王树脂的合成。
称取替代度为 1.1 mmol/g的王树脂 9.2 g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗 涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 2.9 g Fmoc-Gly-OH、 1.78 g HOBt用 DMF 溶解， 冰水浴下加入 1.65 mL DIC活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 5分 钟后加入 137 mg DMAP, 反应 2小时后， DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 用 80 mL 醋酸酐 /吡啶封闭过夜， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Gly-王树脂， 检测替代度为 0.12 mmol/g。 实施例五 直链利拉鲁肽 CTC树脂的制备。
称取替代度为 0.15 mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC树脂 10 g, 加入固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-CTC树脂 30分钟后， 用 20 % DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次， 用茚三酮法检测树脂颜色， 树 脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 #3.89 g Fmoc- Arg ( Pbf ) -OH ( 6.0 mmol ), 0.97 g HOBt ( 7.2 mmol ), 0.91 g DIC ( 7.2 mmol )溶于体积比为 1 :1的 DCM和 DMF 混合溶液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2小时。 以茚三酮法检测判断反应终 点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需 再偶联反应 1小时， 此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终 点。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照利拉鲁肽主 链肽序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、
Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Lys(Alloc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(Trt)-OH 、 Fmoc-Ser(Trt)-OH 、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ala-OH和 Boc-His(Trt ) -OH的偶联。 其中 Fmoc-Ile-OH 采用
PyBOP/HOBt/DIEA体系， 反应溶剂为体积比为 1 :4的 DMSO与 DMF混合液； Fmoc-Ala-OH采用 PyBOP/HOBt/DIEA体系， 反应溶剂为 DCM;
Fmoc-Gln(Trt)-OH采用 PyBOP/HOBt/DIEA体系， 反应溶剂为体积比为 1 :4的 DMSO与 NMP混合液； Fmoc-Ser(Trt)-OH和 Fmoc-Ser(tBu)-OH采用
HATU/HOAt/TMP体系， 反应溶剂为 NMP , 丝氨酸采用不同的保护基 Trt和 tBu 是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率。将直链利拉鲁肽 CTC树脂用 DMF洗涤 3次， DCM洗 5次， 用于后续合成反应。 实施例六 直链利拉鲁肽王树脂的制备。 称取替代度为 0.12 mmol/g 的 Fmoc-Gly-王树脂 12.5 g, 加入反应器中， 用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-王树脂 30分钟后，用 20 % DBLK脱除 Fmoc 保护， 然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次， 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有 颜色， 表示 Fmoc已脱除。 将3.89 8 1110。-入 （？ -011(6.011111101) , 0.97 g HOBt(7.2mmol), 0.91 g DIC(7.2mmol)溶于体积比为 1： 1的 DCM和 DMF混合溶 液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2小时， 以茚三酮法检测判断反应终点。 重 复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH , Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Lys(Alloc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(Trt)-OH 、 Fmoc-Ser(Trt)-OH 、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ala-OH和 Boc-His(Trt ) -OH的偶联。 其中 Fmoc-Ile-OH采用 PyBOP/HOBt/DIEA体系， 反 应溶剂为体积比为 1 :4的 DMSO与 DMF混合液； Fmoc-Ala-OH采用
PyBOP/HOBt/DIEA体系， 反应溶剂为 DCM; Fmoc-Gln(Trt)-OH采用
PyBOP/HOBt/DIEA体系， 反应溶剂为体积比为 1 :4的 DMSO与 NMP混合液； Fmoc-Ser(Trt)-OH和 Fmoc-Ser(tBu)-OH采用 HATU/HOAt/TMP体系， 反应溶剂 为 NMP, 丝氨酸采用不同的保护基 Trt和 tBu是为了保证树脂的偶联效果以及最 终的产品收率。 将树脂用 DMF洗涤 3次， DCM洗 5次， 用于下步反应。 实施例七 Na-Palmotiyl-Glu-OtBu的合成。
称取 H-Glu-OtBu ( 20.3 g, lOO mmol ) , 加入到盛有 200 mL二氯曱烷的三 口瓶中， 冰水浴冷却到 5°C , 加入 5.7 mL ( 50 mmol )三乙胺， 20分钟后慢慢滴 加棕榈酰氯 32.88 g ( 120 mmol ) , 在 30分钟内滴加完毕， 滴加完毕后自然升温 到室温， 再反应 2小时， 薄层色谱（TLC )监测， 原料反应完全， 反应溶液依 次用饱和 NaHCO3100 mL萃取 2次， 去离子水 100 mL萃取 2次， 饱和食盐水 100 mL萃取 3次， 弃去水相， 有机相用无水硫酸钠干燥 30分钟， 用旋转蒸发仪旋掉 DCM, 得到油状物， 油状物加入 200 mL乙酸乙酯 /石油醚混合液， 冰箱中放置 2小时，析出白色固体，该白色固体用同样的方法重结晶 1次，过滤，真空干燥， 得到白色固体 38.74 g, 收率 87.72%。 实施例八利拉鲁肽 CTC树脂的合成。
取实施例五中得到的直链利拉鲁肽 CTC树脂，加入 30 mL二氯曱烷，再加 入 2.21 mL苯基硅烷， 反应 3分钟， 再加入 467 mg Pd(PPh3)4, 室温反应 45分钟， 抽掉反应液， 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。
称取 Fmoc-Glu-OtBu 3.18 g, PyBOP 3.9 g, HOBt 1.22 g, 用 25 mL 二氯曱 烷溶解， 冰水浴下加入 2.7 mL DIEA活化 3分钟， 加入反应柱反应 2小时， 以茚 三酮法检测判断反应终点。 反应结束， 脱除 Fmoc, DMF洗涤 6次， 加入棕榈酰 氯 1.22 g和 DIEA 2.1 mL, 室温反应 2小时， 以茚三酮法检测判断反应终点。 反 应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜。 称重得到利拉鲁肽 CTC树脂 16.5 g (树脂增重率 81.1%)。 实施例九利拉鲁肽王树脂的合成。
取实施例六中得到的直链利拉鲁肽王树脂， 加入 30 mL二氯曱烷， 再加 入 2.21 mL苯基硅烷， 反应 3分钟， 再加入 467 mg Pd(PPh3)4, 室温反应 45分钟， 抽掉反应液， 茚三酮检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。
方法 1 : 称取 Palmitoyl-Glu-OtBu 2.18 g, PyBOP 3.9 g, HOBt 1.22 g, 用 25 mL NMP溶解， 冰水浴下加入 2.7 mL DIEA活化 3分钟， 加入反应柱反应 2小时， 以茚三酮法检测判断反应终点。 反应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜。 称重得到利拉鲁肽王树脂 20.1 g (树脂增重率 94.7%)。
方法 2: 称取 Fmoc-Glu-OtBu 3.18 g, PyBOP 3.9 g, HOBt 1.22 g, 用 25 mL 二氯曱烷溶解，冰水浴下加入 2.7 mL DIEA活化 3分钟，加入反应柱反应 2小时， 以茚三酮法检测判断反应终点。 反应结束， 脱除 Fmoc, DMF洗涤 6次， 加入棕 榈酰氯 1.22 g和 DIEA 2.1 mL, 室温反应 2小时， 以茚三酮法检测判断反应终点。 反应结束后用曱醇收缩，树脂真空干燥过夜。称重得到利拉鲁肽树脂 19.8 g (树 脂增重率 91.1%)。 实施例十 利拉鲁肽王树脂的规模化制备。
参照实施例六，称取替代度为 0.12 mmol/g 的 Fmoc-Gly-王树脂 833.3 g,加 入反应器中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-王树脂 30分钟后， 用 20 % DBLK ^Fmoc保护， 后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。 将 259.2 g Fmoc- Arg ( Pbf) -OH(400 mmol), 64.8 g HOBt(480 mmol), 60.5 g DIC(480 mmol)溶于体 积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2小时， 以 茚三酮法检测判断反应终点。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联 的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、
Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Lys(Alloc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(Trt)-OH 、 Fmoc-Ser(Trt)-OH 、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Boc-His(Trt ) -OH的偶联。 将利拉鲁肽 王 4对脂用 DMF洗涤 3次， DCM洗 5次。 往上述得到的直链利拉鲁肽王树脂加入 6500 mL二氯曱烷， 再加入 147.3 mL苯基硅烷， 反应 3分钟， 再加入 31.3 g Pd(PPh3)4 , 室温反应 45分钟， 抽掉反 应液， 茚三酮检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 称取
Palmitoyl-Glu-OtBu 145.3 g, PyBOP 260 g, HOBt 81.0 g, 用 4.5 L NMP溶解， 冰水浴下加入 174.3 mL DIEA活化 3分钟， 加入反应柱反应 2小时， 以茚三酮法 检测判断反应终点。 反应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜。 称重得到利 拉鲁肽树脂 1335.5 g (树脂增重率 94.1%)。 实施例十一 利拉鲁肽粗肽的制备。
称取 130 g全保护的利拉鲁肽 CTC树脂或利拉鲁肽王树脂， 加入到 2 L 反应釜中， 按 TFA: 苯曱硫醚： 苯曱醚： EDT=90:5:3:2的体积比配制裂解试 剂 1.3 L, 将裂解试剂倒入利拉鲁肽 CTC树脂或利拉鲁肽王树脂中， 室温反应 2.5小时。反应结束， 过滤树脂， 收集滤液。 用少量 TFA洗涤树脂， 合并滤液， 将滤液加入到 11L无水乙醚中沉淀， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空干燥， 得 到利拉鲁肽粗肽 42.72 g, 粗肽收率 80·5%。 MALDI-TOF: (Μ+Η)+=3752·1。 实施例十二 利拉鲁肽精肽盐酸盐的制备。
称取 42.7 g 利拉鲁肽粗肽用 25%乙腈 +25%DMSO+50%水的混合溶剂 1000 mL溶解后， 采用 Waters 2545 RP-HPLC系统， 波长 214 nm, 色谱柱为 50x250 mm反相 C8柱， 柱温为 45°C , 常规 0.1 %TFA/乙腈流动相纯化， 收集 目的峰愤分，得到纯度大于 98.5%精肽。将精肽溶液采用 Waters 2545 RP-HPLC 系统， 色谱柱为 50x250 mm反相 C8柱， 0.1%盐酸 /乙腈流动相转盐， 收集目 的峰愤分， 旋转蒸发浓缩， 冻干得到利拉鲁肽盐酸盐精肽 6.75 g, HPLC纯度 99.1%, 纯化收率 52.7%, 总收率 15.32%。 实施例十三 利拉鲁肽精肽醋酸盐的制备。
称取 42.7 g 利拉鲁肽粗肽用 25%乙腈 +25%DMSO+50%水的混合溶剂 1000 mL溶解后，采用 Waters 2545 RP-HPLC系统，波长 214 nm,色谱柱为 50x250 mm 反相 C8柱， 柱温为 45 °C , 常规 0.1 %TFA/乙腈流动相纯化， 收集目的峰愤分， 得到纯度大于 98.5%精肽。 将精肽溶液采用 Waters 2545RP-HPLC系统， 色语柱 为 50x250 mm反相 C8柱， 0.2%醋酸 /乙腈流动相转盐， 收集目的峰愤分， 旋蒸 浓缩， 冻干得到利拉鲁肽醋酸盐精肽 6.83 g, HPLC纯度 99.23%, 纯化收率 54.7%, 总收率 15.68%。
实施例十四 利拉鲁肽精肽三氟醋酸盐的制备。
称取 42.7 g 利拉鲁肽粗肽用 25%乙腈 +25%DMSO+50%水的混合溶剂 1000 mL溶解后， 采用 Waters 2545 RP-HPLC系统， 波长 214 nm, 色谱柱为 50x250 mm反相 C8柱， 柱温为 45°C , 常规 0.1 %TFA/乙腈流动相纯化， 收集 目的峰愤分，得到纯度大于 98.5%精肽。将精肽溶液采用 Waters 2545 RP-HPLC 系统， 色谱柱为 50x250 mm反相 C8柱， 0.1%三氟醋 乙腈流动相转盐， 收 集目的峰愤分， 旋蒸浓缩， 冻干得到利拉鲁肽醋酸盐精肽 6.88 g, HPLC纯度 99.17%, 纯化收率 55.2%, 总收率 15.87%。 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不 能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干筒单推演或替 换， 都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种利拉鲁肽的固相合成方法， 其特征在于： 包括如下步骤：
A ) 在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 N端 Fmoc保护的甘氨 酸（ Fmoc-Gly-OH )偶联得到 Fmoc-Gly-树脂；
B ) 通过固相合成法， 按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc 保护且侧链保护的氨基酸， 其中赖氨酸采用 Fmoc-Lys(Alloc)-OH;
C ) 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc;
D )通过固相合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Glu-OtBu;
E ) 裂解， 脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；
F ) 纯化， 冻干， 得到利拉鲁肽。
2. 根据权利要求 1所述的利拉鲁肽的固相合成方法， 其特征在于： 所述 步骤 A )中，所述树脂固相载体采用 2-CTC树脂，所述活化剂系统选自 DIEA、 TMP或 NMM, 所述 Fmoc-Gly-树脂为 0.15~0.28 mmol/g替代度的
Fmoc-Gly-CTC树脂。
3. 根据权利要求 1所述的利拉鲁肽的固相合成方法， 其特征在于： 所述 步骤 A ) 中， 所述树脂固相载体采用王树脂， 所述活化剂系统由 DIC、 HOBt 和 DMAP组成， 所述 Fmoc-Gly-树脂为 0.12~0.24 mmol/g替代度的 Fmoc-Gly- 王树脂。
4. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的利拉鲁肽的固相合成方法， 其特 征在于： 所述步骤 B ) 包括如下步骤：
B1 )采用 DBLK使所述 Fmoc-Gly-树脂脱除 Fmoc保护基， 得到 H-Gly- 树脂， 所述 DBLK由体积比为 1： 4的哌啶和 DMF组成；
B2 )在偶联剂系统的存在下， H-Gly-树脂和 Fmoc保护且侧链保护的精氨 酸偶联得到 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂； B3 )重复步骤 Bl、 B2, 按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联。
5. 根据权利要求 4所述的利拉鲁肽的固相合成方法， 其特征在于： 所述 偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂， 所述缩合剂选自 DIC/HOBt、
PyBOP/HOBt/DIEA或 HATU/HOAt/DIEA; 所述反应溶剂选自 DMF、 DCM、 NMP、 DMSO或他们之间的任意组合。
6. 根据权利要求 1所述的利拉鲁肽的固相合成方法， 其特征在于： 所述 步骤 C ) 中， 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc采用 0.1~0.4倍合成规模用量的
Pd(PPh3)4和 10~30倍合成规模用量的苯基硅烷在固相条件下脱除 10~65 分钟。
7. 根据权利要求 1所述的利拉鲁肽的固相合成方法， 其特征在于： 所述 步骤 F ) 中， 纯化为反相高效液相色谱纯化， 色语柱为反相 C8柱， 柱温为
40~50°C。
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