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ES2592634T3 - Método para la síntesis en fase sólida de liraglutida - Google Patents

Método para la síntesis en fase sólida de liraglutida Download PDF

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ES2592634T3
ES2592634T3 ES12831927.4T ES12831927T ES2592634T3 ES 2592634 T3 ES2592634 T3 ES 2592634T3 ES 12831927 T ES12831927 T ES 12831927T ES 2592634 T3 ES2592634 T3 ES 2592634T3
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ES
Spain
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fmoc
resin
liraglutide
solid phase
gly
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ES12831927.4T
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English (en)
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Junfeng Pan
Jian Liu
Yaping MA
Jiancheng YUAN
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Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hybio Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

Un método para la síntesis en fase sólida de liraglutida, que se caracteriza por que el método comprende las siguientes etapas: A) en presencia de un sistema de agente activador, se obtiene Fmoc-Gly-resina mediante acoplamiento de glicina protegida con Fmoc N-terminal (Fmoc-Gly-OH) a un soporte de resina en fase sólida; B) mediante síntesis en fase sólida, los aminoácidos con protección Fmoc N-terminal y protección en las cadenas laterales se acoplan secuencialmente sobre la secuencia del esqueleto peptídico de la liraglutida, donde se emplea Fmoc-Lys(Alloc)-OH para la lisina; C) el grupo protector Alloc para la cadena lateral de lisina se elimina; D) mediante síntesis en fase sólida, se acopla palmitoil-Glu-OtBu a la cadena lateral de la lisina; E) se obtiene liraglutida bruta mediante escisión y eliminación de los grupos protectores y la resina; F) se obtiene finalmente liraglutida mediante purificación y liofilización.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la síntesis en fase sólida de liraglutida
5 [0001] La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud china N.° 201110271342.3, presentada el 14 de septiembre de 2011 ante la Oficina de Patentes de China, titulada "Método para la síntesis en fase sólida de liraglutida", que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.
Campo de la invención
10
[0002] La presente invención se refiere a un método para la síntesis de polipéptidos y, en particular, a un método para la síntesis en fase sólida de liraglutida.
Antecedentes de la invención
15
[0003] La liraglutida tiene la secuencia siguiente: H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-£-(N-a-Palmitoil-L-Y-glutamil))-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH. La liraglutida, desarrollada por Novo Nordisk, Dinamarca, es un agonista del receptor del péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP- 1), que tiene un efecto hipoglucémico favorable en forma de formulación para inyección subcutánea.
20
[0004] La liraglutida de Novo Nordisk se prepara principalmente mediante métodos biológicos, tales como la ingeniería genética, etc. Tales métodos, sin embargo, no son adecuados para una producción de liraglutida a gran escala, debido a sus técnicas complejas y elevado coste. La síntesis en fase sólida-líquida de liraglutida se ha descrito en los documentos US6268343B1 y US6458924B2, en los que se requiere HPLC en fase inversa para la
25 purificación del intermedio GLP-1(7-37)-OH, seguida de una reacción con Na-alcanoil-Glu(ONSu)-OtBu en fase líquida. En tal proceso, el N-terminal del GLP-1(7-37)-OH no está protegido y todos los grupos protectores para las cadenas laterales se han eliminado, llevando a la generación de una gran cantidad de impurezas, dificultades en la purificación y complicadas etapas operativas. Los métodos de síntesis de liraglutida en la técnica anterior presentan desventajas tales como un proceso operativo complicado que requiere dos etapas de purificación, largos ciclos de 30 síntesis, una gran cantidad de líquido residual que no es respetuoso con el medio ambiente, una gran cantidad de acetonitrilo requerida, altos costes y la no idoneidad para la producción a gran escala.
Sumario de la invención
35 [0005] Se proporciona en la presente invención un método para la síntesis en fase sólida de liraglutida, a fin de resolver problemas existentes en la técnica anterior.
[0006] Un método para la síntesis en fase sólida de liraglutida, que comprende las siguientes etapas:
40 [0007] en presencia de un sistema de agente activador, se obtiene Fmoc-Gly-resina mediante acoplamiento de glicina protegida con Fmoc en el N-terminal (Fmoc-Gly-OH) a un soporte de resina en fase sólida;
[0008] mediante síntesis en fase sólida, los aminoácidos con protección Fmoc en el N-terminal y protección en las cadenas laterales se acoplan secuencialmente basándose en la secuencia peptídica de la cadena principal de la
45 liraglutida, en la que se emplea Fmoc-Lys(Alloc)-OH para la lisina;
[0009] el grupo protector Alloc para la cadena lateral de lisina se elimina;
[0010] mediante síntesis en fase sólida, se acopla palmitoil-Glu-OtBu a la cadena lateral de la lisina;
50
[0011] se obtiene liraglutida bruta mediante escisión y eliminación de los grupos protectores y la resina;
[0012] la liraglutida se obtiene finalmente mediante purificación y liofilización.
55 [0013] Mediante la anterior solución técnica, la preparación de liraglutida mediante síntesis en fase sólida tiene ventajas tales como etapas operativas sencillas, un ciclo de síntesis corto, bajos costes, menos líquidos residuales producidos, menos subproductos, un alto rendimiento e idoneidad para la producción a gran escala de la liraglutida.
[0014] Para mejorar adicionalmente la presente invención, en dicha etapa A), se emplea resina de 2-CTC como 60 soporte de resina en fase sólida, y el sistema de agente activador se selecciona entre el grupo que consiste en
DIEA, TMP o NMM, y dicha Fmoc-Gly-resina es la Fmoc-Gly-resina de CTC con un grado de sustitución en el intervalo de 0,15 a 0,28 mmol/g.
[0015] Para mejorar adicionalmente la presente invención, en dicha etapa A), se emplea resina de Wang como 65 soporte de resina en fase sólida, y el sistema de agente activador consiste en DIC, HOBt y DMAP, y dicha Fmoc-
2
Gly-resina es la Fmoc-Gly-resina de Wang con un grado de sustitución en el intervalo de 0,12 a 0,24 mmol/g.
[0016] Para mejorar adicionalmente la presente invención, dicha etapa B) comprende las siguientes etapas:
5 [0017] B1) se obtiene H-Gly-resina eliminando el grupo protector Fmoc de la Fmoc-Gly-resina usando un DBLK (desbloqueante), consistiendo dicho DBLK en piperidina y DMF en una relación en volumen de 1:4;
[0018] B2) en presencia de un sistema de agente de acoplamiento, se obtiene la Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-resina mediante acoplamiento a la H-Gly-resina de la arginina protegida con Fmoc y con la cadena lateral protegida;
10
[0019] B3) repitiendo las etapas B1 y B2, se acoplan los aminoácidos secuencialmente basándose en la secuencia peptídica de la cadena principal de la liraglutida.
[0020] Cuando los aminoácidos está acoplados, la protección de la cadena lateral para el triptófano se consigue 15 mediante un grupo protector Boc; la protección de la cadena lateral para el ácido glutámico se consigue mediante un
grupo protector OtBu; la protección de la cadena lateral para la Usina se consigue mediante un grupo protector Alloc; la protección de la cadena lateral para la glutamina se consigue mediante un grupo protector Trt; la protección de la cadena lateral para la tirosina se consigue mediante un grupo protector tBu; la protección de la cadena lateral para la serlna se consigue mediante un grupo protector Trt o tBu. Con el fin de asegurar la eficacia del acoplamiento a la 20 resina y el rendimiento del producto final, para la serina se emplean diferentes grupos protectores que incluyen Trt o tBu. La protección de la cadena lateral para el aspartato se consigue mediante un grupo protector OtBu. La protección de la cadena lateral para la treonina se consigue mediante un grupo protector tBu. Para la histidina, la cadena lateral se protege mediante un grupo protector Trt, y el N-term¡nal se protege mediante un grupo protector Boc.
25
[0021] Para mejorar adlclonalmente la presente invención, dicho sistema de agente de acoplamiento comprende un agente de condensación y un disolvente de reacción, y dicho agente de condensación se selecciona entre el grupo que consiste en DIC/HOBt, PyBOP/HOBt/DIEA o HATU/HOAt/DIEA; y dicho disolvente de reacción se selecciona entre el grupo que consiste en DMF, DCM, NMP, DMSO, o cualquier combinación de los mismos.
30
[0022] Para mejorar adlclonalmente la presente invención, en dicha etapa c), el grupo protector Alloc para la cadena lateral de la lisina se elimina usando 0,1-0,4 veces la cantidad de la escala de síntesis de Pd(PPh3)4 y 10-30 veces la cantidad de la escala de síntesis de fenil sllano en condiciones de fase sólida durante 10-65 min.
35 [0023] En dicha etapa D), la cadena lateral de la lisina se puede acoplar directamente al palmitoil-Glu-OtBu, de modo alternativo se puede acoplar al Fmoc-Glu-OtBu inicialmente, seguido de la eliminación del Fmoc y acoplamiento posterior al cloruro de palmitoilo.
[0024] En dicha etapa E), "la reacción de escisión del péptido", usada generalmente en la técnica, se efectúa para 40 retirar los grupos protectores y la resina, obteniendo de este modo liraglutida bruta.
[0025] Para mejorar adicionalmente la presente invención, en dicha etapa F), la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa usando una columna C8 de fase inversa con una temperatura de columna en el intervalo de 40 a 50 °C.
45
[0026] En comparación con la técnica anterior, el beneficio de la presente invención es la provisión de un método de síntesis en fase sólida para la preparación de liraglutida, que tiene ventajas tales como etapas operativas sencillas, un ciclo de síntesis corto, bajos costes, menos líquidos residuales producidos, un procesado posterior fácil, menos subproductos, un alto rendimiento e idoneidad para la producción a gran escala de la liraglutida.
50
Breve descripción de las figuras
[0027] La Fig. 1 es un diagrama de flujo del proceso de síntesis en fase sólida de la liraglutida de acuerdo con la presente invención.
55
Descripción de las realizaciones específicas
[0028] Se divulga un método para la síntesis en fase sólida de liraglutida mediante la presente invención, que puede ser implementado por los expertos en la materia modificando apropiadamente los parámetros del proceso con
60 referencia a lo contenido en el presente documento. Más en particular, cabe señalar que todas las sustituciones y modificaciones similares son evidentes para los expertos en la materia, todas las cuales se contempla que estén incluidos en la presente invención. El método de la presente invención se describirá mediante ejemplos preferentes, y es evidente que los expertos en la materia pueden efectuar modificaciones o cambios apropiados y la combinación de los mismos sobre el método y la aplicación descritos en el presente documento, sin alejarse del contenido, el 65 espíritu y el alcance de la invención, a fin de conseguir y aplicar las técnicas descritas en la presente invención.
[0029] La presente invención se ilustrará adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos específicos, a fin de hacer que las soluciones técnicas de la presente invención sean mejor comprendidas por los expertos en la materia.
5 [0030] Tanto la resina de Wang como la resina de CTC se han adquirido a Tianjin Nankai Hecheng Science & Technology Co., Ltd, y diversos aminoácidos protegidos se han adquirido a GL Biochem Company. Las abreviaturas usadas en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones se enumeran en la tabla siguiente:
Fmoc
9-fluorenilmetiloxicarbonilo
HBTU
Hexafluorofosfato de 0-benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametiluronio
HATU
Hexafluorofosfato de 0-(7-aza-benzotziazol-1-oxi)N,N,N’,N’-tetrametiluronio
PyBOP
Hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-oxi)-tripirrolidinofosfonio
DIC
Diisopropilcarbodiimida
HOBt
1-hidroxibenzotriazol
HOAt
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
DIEA
N,N-diisopropiletilamina
TMP
2,4,6-trimetilpiridina
Pbf
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
Trt
Tritilo
tBU
Tere-butilo
DMF
N,N-dimetil formamida
DCM
Diclorometano
2-CTC
Resina de 2-clorotritilo
TFA
Acido trifluoroacético
Alloc
Aliloxicarbonilo
NMP
N-metil pirrolidona
DMSO
Dimetil sulfóxido
Palmitoil
Palmitoilo
EDT
Etanoditiol
Pd(PPh3)4
Tetraquis(trifenilfosfina)paladio
PhSiH3
Fenil silano
10 Ejemplo 1. Síntesis de Fmoc-Gly-Resina de CTC con un grado de sustitución de 0,15 mmol/g.
[0031] Se pesaron 20 g de resina de 2-CTC con un grado de sustitución de 0,5 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción en fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Después se disolvieron en DMF 4,3 g de Fmoc-Gly-OH y este se activó añadiendo 4,78 mi de DIEA en un
15 baño de hielo y agua antes de cargarlo en la columna de reacción mencionada anteriormente rellena de resina. Tras hacerlo reaccionar durante 2 h, se añadieron 8 mi de metanol absoluto para el bloqueo durante 1 h. La resina se lavó 3 veces con DMF y con DCM, y se bloqueó durante 30 min con metanol absoluto. Después de la contracción de la resina por el metanol, el metanol se extrajo hasta sequedad para obtener Fmoc-Gly-resina de CTC con un grado de sustitución detectado de 0,15 mmol/g.
20
Ejemplo 2. Síntesis de Fmoc-Gly-Resina de CTC con un grado de sustitución de 0,28 mmol/g.
[0032] Se pesaron 11,1 g de resina de 2-CTC con un grado de sustitución de 0,9 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción en fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF
25 durante 30 min. Después se disolvieron en DMF 5,78 g de Fmoc-Gly-OH y este se activó añadiendo 6,94 mi de DIEA en un baño de hielo y agua antes de cargarlo en la columna de reacción mencionada anteriormente cargada con resina. Tras hacerlo reaccionar durante 2 h, se añadieron 8 mi de metanol absoluto para el bloqueo durante 1 h. La resina se lavó con DMF y con DCM 3 veces respectivamente, y se bloqueó durante 30 min con metanol absoluto. Después de la contracción de la resina por el metanol, el metanol se extrajo hasta sequedad para obtener Fmoc-Gly- 30 resina de CTC con un grado de sustitución detectado de 0,15 mmol/g.
Ejemplo 3. Síntesis de Fmoc-Gly-Resina de Wang con un grado de sustitución de 0,24 mmol/g.
[0033] Se pesaron 13,1 g de resina de Wang con un grado de sustitución de 0,75 mmol/g y se añadieron a la 35 columna de reacción en fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF
durante 30 min. Después se disolvieron en DMF 4,3 g de Fmoc-Gly-OH y 3,78 g de HOBt y se activaron añadiendo 2,84 mi de DIC en un baño de hielo y agua antes de cargarlos en la columna de reacción mencionada anteriormente cargada con resina. Al cabo de 5 min, se añadieron 268 mg de DMAP y se hicieron reaccionar durante 2 h. Seguidamente, la resina se lavó con DMF y DCM 3 veces respectivamente, y se bloqueó con 100 mi de anhídrido 40 acético/piridina durante la noche. Después de la contracción de la resina por el metanol, el metanol se extrajo hasta sequedad para obtener Fmoc-Gly-resina de Wang con un grado de sustitución detectado de 0,24 mmol/g.
4
Ejemplo 4. Síntesis de Fmoc-Gly-Resina de Wang con un grado de sustitución de 0,12 mmol/g.
[0034] Se pesaron 9,2 g de resina de Wang con un grado de sustitución de 1,1 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción en fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante
5 30 min. Después se disolvieron en DMF 2,9 g de Fmoc-Gly-OH y 1,78 g de HOBty se activaron añadiendo 1,65 mi de DIC en un baño de hielo y agua antes de cargarlos en la columna de reacción mencionada anteriormente cargada con resina. Al cabo de 5 min, se añadieron 137 mg de DMAP y se hicieron reaccionar durante 2 h. Seguidamente, la resina se lavó con DMF y DCM 3 veces respectivamente, y se bloqueó con 80 mi de anhídrido acético/piridina durante la noche. Después de la contracción de la resina por el metanol, el metanol se extrajo hasta 10 sequedad para obtener Fmoc-Gly-resina de Wang con un grado de sustitución detectado de 0,12 mmol/g.
Ejemplo 5. Preparación de resina de CTC con liraglutida lineal
[0035] Se pesaron 10 g de resina de Fmoc-Gly-resina de CTC con un grado de sustitución de 0,15 mmol/g y se 15 añadieron a la columna de reacción en fase sólida. Posteriormente, la resina Fmoc-Gly-resina de CTC se lavó dos
veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. La protección con Fmoc se retiró con un 20 % de DBLK, y la resina se lavó después 4 veces con DMF y dos veces con DCM. La resina se ensayó mediante la prueba de la ninhidrina, en la que se indicaba la eliminación del Fmoc por el aspecto de color de la resina. Se disolvieron 3,89 g de Fmoc-Arg(Pbf)-OH (6,0 mmol), 0,97 g de FIOBt (7,2 mmol), 0,91 g de DIC (7,2 mmol) en una solución mixta de 20 DCM y DMF en una relación en volumen de 1:1, se cargaron en la columna de reacción en fase sólida y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina, en la que una resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras que la coloración de la resina indicaba una reacción incompleta, para la cual fue necesaria 1 h más. Tales criterios se aplicaron para la determinación del punto final mediante la prueba de la ninhidrina en adelante en el presente documento. La anterior 25 etapa de desprotección del Fmoc y la correspondiente etapa de acoplamiento de aminoácido se repitieron y, basándose en la secuencia peptídica de la cadena principal de la liraglutida, se acoplaron secuencialmente Fmoc- Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OFI, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc- Phe-OFI, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, 30 Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH y Boc-His(Trt)-OH. En el proceso de reacción, se empleó el sistema PyBOP/HOBt/DIEA para Fmoc-lle-OH, y el disolvente de reacción fue la solución mixta de DMSO y DMF en una relación en volumen de 1:4; se empleó el sistema PyBOP/HOBt/DIEA para Fmoc-Ala-OH, y el disolvente de reacción fue DCM; se empleó el sistema PyBOP/HOBt/DIEA para Fmoc-Gln(Trt)-OH, y el disolvente de reacción fue la 35 solución mixta de DMSO y NMP en una relación en volumen de 1:4; se empleó el sistema HATU/HOAt/TMP para Fmoc-Ser(Trt)-OH y Fmoc-Ser(tBu)-OH, y el disolvente de reacción fue NMP; a fin de asegurar la eficacia del acoplamiento a la resina y el rendimiento del producto final, para la serina se emplearon diferentes grupos protectores que incluyen Trt y tBu. La resina de CTC con liraglutida lineal se lavó 3 veces con DMF y 5 veces con DCM para la reacción de síntesis posterior.
40
Ejemplo 6. Preparación de resina de Wang con liraglutida lineal
[0036] Se pesaron 12,5 g de resina de Fmoc-Gly-resina de Wang con un grado de sustitución de 0,12 mmol/g y se añadieron al reactor. Posteriormente, la resina Fmoc-Gly-resina de Wang se lavó dos veces usando DMF, y se
45 hinchó en DMF durante 30 min. La protección con Fmoc se retiró con un 20 % de DBLK, y la resina se lavó después 4 veces con DMF y dos veces con DCM. La resina se ensayó mediante la prueba de la ninhidrina, en la que se indicaba la eliminación del Fmoc por el aspecto de color de la resina. Se disolvieron 3,89 g de Fmoc-Arg(Pbf)-OH (6,0 mmol), 0,97 g de HOBt (7,2 mmol), 0,91 g de DIC (7,2 mmol) en una solución mixta de DCM y DMF en una relación en volumen de 1:1, se cargaron en la columna de reacción en fase sólida y se hicieron reaccionar a 50 temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. La anterior etapa de desprotección del Fmoc y la correspondiente etapa de acoplamiento de aminoácido se repitieron y, basándose en la secuencia peptídica de la cadena principal de la liraglutida, se acoplaron secuencialmente Fmoc- Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, 55 Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH y Boc-His(Trt)-OH. En el proceso de reacción, se empleó el sistema PyBOP/HOBt/DIEA para Fmoc-lle-OH, y el disolvente de reacción fue una solución mixta de DMSO y DMF en una relación en volumen de 1:4; se empleó el sistema PyBOP/HOBt/DIEA para Fmoc-Ala-OH, y el disolvente de reacción 60 fue DCM; se empleó el sistema PyBOP/HOBt/DIEA para Fmoc-Gln(Trt)-OH, y el disolvente de reacción fue una solución mixta de DMSO y NMP en una relación en volumen de 1:4; se empleó el sistema HATU/HOAt/TMP para Fmoc-Ser(Trt)-OH y Fmoc-Ser(tBu)-OH, y el disolvente de reacción fue NMP. A fin de asegurar la eficacia del acoplamiento a la resina y el rendimiento del producto final, para la serina se emplearon diferentes grupos protectores que incluyen Trt y tBu. La resina se lavó 3 veces con DMF y 5 veces con DCM para la próxima reacción. 65
Ejemplo 7. Síntesis de Na"Palmitoil-Glu-OtBu.
[0037] Se pesó H-Glu-OtBu (20,3 g, 100 mmol) y se añadió a un matraz de tres bocas que contenía 200 mi de diclorometano. La mezcla se enfrió hasta 5 °C en un baño de hielo y agua, y después se añadieron 5,7 mi (50 mmol)
5 de trietilamina. Al cabo de 20 min, se añadieron gota a gota 32,88 g (120 mmol) de cloruro de palmitoilo lentamente durante un periodo de 30 min. Una vez finalizada la adición, el sistema se dejó calentar naturalmente hasta temperatura ambiente y se hizo reaccionar durante 2 h más. La reacción completa de las materias primas se controló mediante cromatografía de capa fina (TLC). La solución de reacción se extrajo secuencialmente con 100 mi de NaHCOs saturado dos veces, 100 mi de agua desionizada dos veces, y 100 mi de solución salina saturada 3 10 veces, y después se descartó la fase acuosa. La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro durante 30 min. El DCM se eliminó en un evaporador rotatorio para obtener un producto oleoso. Se añadieron 200 mi de solución mixta de acetato de etilo/éter de petróleo al producto oleoso y se colocó en un congelador durante 2 h. Posteriormente apareció un sólido blanco. El sólido blanco se recristalizó una vez del mismo modo. Tras la filtración y el secado al vacío, se obtuvieron 38,74 g de sólido blanco con un rendimiento del 87,72 %.
15
Ejemplo 8. Sintesis de resina de CTC con liraglutida.
[0038] A la resina de CTC con liraglutida lineal obtenida en el Ejemplo 5, se añadieron 30 mi de diclorometano, seguido de 2,21 mi de fenil silano. Tras llevar a cabo la reacción durante 3 min, se añadieron 467 mg de Pd(PPh3)4,
20 y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 45 min. La solución de reacción se succionó y se descartó, y la aparición de color en la resina se detectó mediante la prueba de la ninhidrina. La aparición de color indicaba la eliminación del Fmoc.
[0039] Se pesaron 3,18 g de Fmoc-Glu-OtBu, 3,9 g de PyBOP, 1,22 g de HOBt y se disolvieron en 25 mi de 25 diclorometano. El sistema se activó en un baño de hielo y agua durante 3 min añadiendo 2,7 mi de DIEA y se cargó
en la columna de reacción para una reacción de 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. Una vez finalizada la reacción, el Fmoc se retiró, y la resina se lavó con DMF 6 veces. Posteriormente, se añadieron 1,22 g de cloruro de palmitoilo y 2,1 mi de DIEA, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. 30 Una vez finalizada la reacción, la resina se contrajo con metanol y se secó al vacío durante la noche. Tras pesarla, se obtuvieron 16,5 g de resina de CTC con liraglutida (la tasa de aumento de peso fue del 81,1 %).
Ejemplo 9. Síntesis de resina de Wang con liraglutida.
35 [0040] A la resina de Wang con liraglutida lineal obtenida en el Ejemplo 6, se añadieron 30 mi de diclorometano, seguido de 2,21 mi de fenil silano. Tras hacerlos reaccionar durante 3 min, se añadieron 467 mg de Pd(PPh3)4, y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 45 min. La solución de reacción se succionó y se descartó, y la aparición de color en la resina se detectó mediante la prueba de la ninhidrina. La aparición de color indicaba la eliminación del Fmoc.
40
[0041] Método 1: Se pesaron 2,18 g de Palmitoil-Glu-OtBu, 3,9 g de PyBOP, 1,22 g de HOBt y se disolvieron en 25 mi de NMP. El sistema se activó en un baño de hielo y agua durante 3 min añadiendo 2,7 mi de DIEA y se cargó en la columna de reacción para una reacción de 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. Una vez finalizada la reacción, la resina se contrajo con metanol y se secó al vacío durante la
45 noche. Tras pesarla, se obtuvieron 20,1 g de resina de Wang con liraglutida (la tasa de aumento de peso fue del 94,7 %).
[0042] Método 2: Se pesaron 3,18 g de Fmoc-Glu-OtBu, 3,9 g de PyBOP, 1,22 g de HOBt y se disolvieron en 25 mi de diclorometano. El sistema se activó en un baño de hielo y agua durante 3 min añadiendo 2,7 mi de DIEA y se
50 cargó en la columna de reacción para una reacción de 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. Una vez finalizada la reacción, el Fmoc se retiró, y la resina se lavó con DMF 6 veces. Posteriormente, se añadieron 1,22 g de cloruro de palmitoilo y 2,1 mi de DIEA, y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. Una vez finalizada la reacción, la resina se contrajo con metanol y se secó al vacío durante la noche. Tras pesarla, 55 se obtuvieron 19,8 g de resina con liraglutida (la tasa de aumento de peso fue del 91,1 %).
Ejemplo 10. Preparación a gran escala de resina de Wang con liraglutida.
[0043] Con referencia al Ejemplo 6, se pesaron 833,3 g de resina de Fmoc-Gly-resina de Wang con un grado de 60 sustitución de 0,12 mmol/g y se añadieron al reactor. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se
hinchó en DMF durante 30 min. La protección con Fmoc se retiró con un 20 % de DBLK, y la resina se lavó después 4 veces con DMF y dos veces con DCM. Se disolvieron 259,2 g de Fmoc-Arg(Pbf)-OH (400 mmol), 64,8 g de HOBt (480 mmol), 60,5 g de DIC (480 mmol) en una solución mixta de DCM y DMF en una relación en volumen de 1:1, se cargaron en la columna de reacción en fase sólida y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 h. El 65 punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. La anterior etapa de desprotección del
Fmoc y la correspondiente etapa de acoplamiento de aminoácido se repitieron y, basándose en la secuencia peptídica de la cadena principal de la liraglutida, se acoplaron secuencialmente Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)- OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 5 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH y Boc-His(Trt)-OH. La resina de Wang con liraglutida se lavó 3 veces con DMF y 5 veces con DCM.
[0044] Se añadieron 6500 mi de diclorometano a la resina de Wang con liraglutida lineal obtenida anteriormente, 10 seguido de 147,3 mi de fenil silano. Después de llevar cabo la reacción durante 3 min, se añadieron 31,3 g de
Pd(PPh3)4. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 45 min. La solución de reacción se succionó y se descartó, y la aparición de color en la resina se detectó mediante la prueba de la ninhidrina. La aparición de color indicaba la eliminación del Fmoc. Se pesaron 145,3 g de Palmitoil-Glu-OtBu, 260 g de PyBOP, 81,0 g de HOBt y se disolvieron en 4,5 I de NMP. El sistema se activó en un baño de hielo y agua durante 3 min añadiendo 174,3 mi 15 de DIEA y se cargó en la columna de reacción para una reacción de 2 horas. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de la ninhidrina. Una vez finalizada la reacción, la resina se contrajo con metanol y se secó al vacío durante la noche. Tras pesarla, se obtuvieron 1335,5 g de resina con liraglutida (la tasa de aumento de peso fue del 94,1 %).
20 Ejemplo 11. Preparación de liraglutida bruta.
[0045] Se pesaron 130 g de resina de CTC con liraglutida o resina de Wang con liraglutida completamente protegida y se añadieron a un reactor de 2 I. Se formularon 1,3 I de reactivo de escisión en una relación en volumen de TFA : tioanisol: anisol: EDT = 90 : 5 : 3 : 2. El reactivo de escisión se vertió en la resina de CTC con liraglutida o la resina
25 de Wang con liraglutida, y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2,5 h. Una vez finalizada la reacción, la resina se filtró y el filtrado se recogió. La resina se lavó con una pequeña cantidad de TFA. Los filtrados se combinaron y se añadieron a 11 I de éter etílico anhidro. Tras la precipitación y centrifugación, el gránulo se lavó con éter etílico anhidro y se secó a vacío para dar 42,72 g de liraglutida bruta con un rendimiento del 80,5 %. MALDI-TOF: (M+H)+ = 3752,1.
30
Ejemplo 12. Preparación de clorhidrato de liraglutida purificado.
[0046] Se pesaron 42,7 g de liraglutida bruta y se disolvieron en 1000 mi de un disolvente mixto de 25% de acetonitrilo + 25 % de DMSO + 50 % de agua. La liraglutida bruta se purificó mediante un sistema de RP-HPLC
35 Waters 2545 equipado con una columna C8 de fase inversa de 50 x 250 mm a una temperatura de columna de 45 °C usando una rutina de un 0,1 % de TFA/acetonithlo como fase móvil a una longitud de onda de detección de 214 nm. La fracción de interés se recogió para dar el péptido purificado con una pureza superior al 98,5%. En el sistema de RP-HPLC Waters 2545 equipado con una columna C8 de fase inversa de 50 x 250 mm, la solución del péptido purificado se convirtió en sal usando un 0,1 % de ácido clorhídrico/acetonitrilo como fase móvil. La fracción 40 de interés se recogió y se concentró mediante evaporación rotatoria. Tras la liofilización, se obtuvieron 6,75 g de clorhidrato de liraglutida purificado con una pureza HPLC del 99,1 %, un rendimiento de purificación del 52,7 % y un rendimiento global del 15,32 %.
Ejemplo 13. Preparación de acetato de liraglutida purificado.
45
[0047] Se pesaron 42,7 g de liraglutida bruta y se disolvieron en 1000 mi de un disolvente mixto de 25% de acetonitrilo + 25 % de DMSO + 50 % de agua. La liraglutida bruta se purificó mediante un sistema de RP-HPLC Waters 2545 equipado con una columna C8 de fase inversa de 50 x 250 mm a una temperatura de columna de 45 °C usando una rutina de un 0,1 % de TFA/acetonitrilo como fase móvil a una longitud de onda de detección de
50 214 nm. La fracción de interés se recogió para dar el péptido purificado con una pureza superior al 98,5%. En el sistema de RP-HPLC Waters 2545 equipado con una columna C8 de fase inversa de 50 x 250 mm, la solución del péptido purificado se convirtió en sal usando un 0,2 % de ácido acético/acetonitrilo como fase móvil. La fracción de interés se recogió y se concentró mediante evaporación rotatoria. Tras la liofilización, se obtuvieron 6,83 g de acetato de liraglutida purificado con una pureza HPLC del 99,23 %, un rendimiento de purificación del 54,7 % y un 55 rendimiento global del 15,68 %.
Ejemplo 14. Preparación de trifluoroacetato de liraglutida purificado.
[0048] Se pesaron 42,7 g de liraglutida bruta y se disolvieron en 1000 mi de un disolvente mixto de 25% de 60 acetonitrilo + 25 % de DMSO + 50 % de agua. La liraglutida bruta se purificó mediante un sistema de RP-HPLC
Waters 2545 equipado con una columna C8 de fase inversa de 50 x 250 mm a una temperatura de columna de 45 °C usando una rutina de un 0,1 % de TFA/acetonitrilo como fase móvil a una longitud de onda de detección de 214 nm. La fracción de interés se recogió para dar el péptido purificado con una pureza superior al 98,5%. En el sistema de RP-HPLC Waters 2545 equipado con una columna C8 de fase inversa de 50 x 250 mm, la solución del 65 péptido purificado se convirtió en sal usando un 0,1 % de ácido trifluoroacético/acetonitrilo como fase móvil. La
fracción de interés se recogió y se concentró mediante evaporación rotatoria. Tras la liofilización, se obtuvieron 6,88 g de acetato de liraglutida purificado con una pureza HPLC del 99,17%, un rendimiento de purificación del 55,2 % y un rendimiento global del 15,87 %.
5 [0049] El contenido anterior es una descripción detallada de la presente invención con referencia a las realizaciones especificas preferentes, y no se debe considerar que la práctica específica de la presente invención se limita a tal descripción. Para el experto en la materia, se pueden hacer alguna deducción simple y sustituciones sin alejarse del concepto de la presente invención, y se debe considerar que están incluidas en el alcance de protección de la presente invención.
10

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para la síntesis en fase sólida de llraglutida, que se caracteriza por que el método comprende las siguientes etapas:
    5
    A) en presencia de un sistema de agente activador, se obtiene Fmoc-Gly-resina mediante acoplamiento de glicina protegida con Fmoc N-terminal (Fmoc-Gly-OFI) a un soporte de resina en fase sólida;
    B) mediante síntesis en fase sólida, los aminoácidos con protección Fmoc N-terminal y protección en las cadenas laterales se acoplan secuencialmente sobre la secuencia del esqueleto peptídico de la liraglutida, donde se
    10 emplea Fmoc-Lys(Alloc)-OFI para la lisina;
    C) el grupo protector Alloc para la cadena lateral de lisina se elimina;
    D) mediante síntesis en fase sólida, se acopla palmitoil-Glu-OtBu a la cadena lateral de la lisina;
    E) se obtiene liraglutida bruta mediante escisión y eliminación de los grupos protectores y la resina;
    F) se obtiene finalmente liraglutida mediante purificación y liofilización.
    15
  2. 2. El método para la síntesis en fase sólida de liraglutida de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que en dicha etapa A), se emplea resina de 2-CTC como soporte de resina en fase sólida, y el sistema de agente activador se selecciona entre el grupo que consiste en DIEA, TMP o NMM, y dicha Fmoc-Gly-resina es la Fmoc-Gly- resina de CTC con un grado de sustitución en el intervalo de 0,15 a 0,28 mmol/g.
    20
  3. 3. El método para la síntesis en fase sólida de liraglutida de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que en dicha etapa A), se emplea resina de Wang como soporte de resina en fase sólida, y el sistema de agente activador consiste en DIC, FIOBt y DMAP, y dicha Fmoc-Gly-resina es la Fmoc-Gly-resina de Wang con un grado de sustitución en el intervalo de 0,12 a 0,24 mmol/g.
    25
  4. 4. El método para la síntesis en fase sólida de liraglutida de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se caracteriza por que dicha etapa B) comprende las siguientes etapas:
    B1) se obtiene FI-Gly-resina eliminando el grupo protector Fmoc de la Fmoc-Gly-resina usando un DBLK, 30 consistiendo dicho DBLK en piperidina y DMF en una relación en volumen de 1:4;
    B2) en presencia de un sistema de agente de acoplamiento, se obtiene la Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-resina mediante acoplamiento a la FI-Gly-resina de la arginina protegida con Fmoc y con la cadena lateral protegida;
    B3) repitiendo las etapas B1 y B2, se acoplan los aminoácidos secuencialmente basándose en la secuencia peptídica de la cadena principal de la liraglutida.
    35
  5. 5. El método para la síntesis en fase sólida de liraglutida de acuerdo con la reivindicación 4, que se caracteriza por que dicho sistema de agente de acoplamiento comprende un agente de condensación y un disolvente de reacción, y dicho agente de condensación se selecciona entre el grupo que consiste en DIC/HOBt, PyBOP/HOBt/DIEA o HATU/HOAt/DIEA; y dicho disolvente de reacción se selecciona entre el grupo que consiste en DMF, DCM, NMP,
    40 DMSO o cualquier combinación de los mismos.
  6. 6. El método para la síntesis en fase sólida de liraglutida de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que, en dicha etapa c), el grupo protector Alloc para la cadena lateral de la lisina se elimina usando 0,1-0,4 veces la cantidad de la escala de síntesis de Pd(PPh3)4 y 10-30 veces la cantidad de la escala de síntesis de fenil silano en
    45 condiciones de fase sólida durante 10-65 min.
  7. 7. El método para la síntesis en fase sólida de liraglutida de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que, en dicha etapa F), la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa usando una columna C8 de fase inversa con una temperatura de columna en el intervalo de 40 a 50 °C.
    50
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