ES2687795T3 - Método para preparar exenatida - Google Patents
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Abstract
Un método para la preparación de exenatida, que se caracteriza por comprender las siguientes etapas: Etapa 1: se obtiene serina-resina mediante un primer acoplamiento entre serina y la resina; Etapa 2: se obtiene péptido-resina de SEQ ID NO: 1 mediante un segundo acoplamiento de dicha serinaresina secuencialmente con aminoácidos; Etapa 3: se obtiene péptido-resina de SEQ ID NO. 2 mediante un tercer acoplamiento entre la histidina que contiene el grupo protector o una sal de la misma con dicho péptido-resina de SEQ ID NO. 1, y la exenatida por último se obtiene después de corte y purificación; en donde la histidina que contiene grupo protector o una sal de la misma en la etapa 3 tiene la estructura como se muestra en la fórmula IV: Boc-His(Boc)-OH.DCHA Fórmula IV, en donde la etapa 3 comprende obtener exenatida-resina en un solvente en presencia de un agente de acoplamiento y una base orgánica, en donde el agente de acoplamiento es HATU y HOAt.
Description
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DESCRIPCION
Método para preparar exenatida Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de síntesis de polipéptidos, y en particular, a un método para la preparación de exenatida.
Antecedentes de la invención
La diabetes es una serie de síndromes de trastornos del metabolismo de azúcar, proteína, lípido, agua, electrolito y similares, debido a hipoinsulinismo, resistencia a insulina y similares, que resulta de la acción de varios factores patogénicos en el cuerpo, incluyendo factores hereditarios, trastorno inmunitario, infección microbiológica y las toxinas de la misma, toxinas de radicales libres y factores psíquicos etc. Clínicamente, la diabetes se caracteriza principalmente por hiperglucemia, en la que pueden aparecer manifestaciones tal como diuresis, polidipsia, polifagia y demacración (es decir, “tres aumentos y una reducción” en síntomas) etc., en casos típicos. Una vez la diabetes (azúcar en sangre) no está bien controlada, se pueden producir complicaciones, que producen insuficiencia y lesiones incurables en el riñón, ojo y pie.
La diabetes se puede dividir en diabetes de tipo I, diabetes de tipo II, diabetes gestacional y otros tipos especiales de diabetes. La diabetes de tipo II representa aproximadamente el 95% de todos los pacientes diabéticos. La diabetes de tipo I es un tipo de enfermedad autoinmunitaria, que resulta del ataque en el cuerpo por el sistema inmunitario mismo. Las células beta pancreáticas del paciente diabético, que secretan la insulina, son atacadas y destruidas por su propio sistema inmunitario, lo que produce insuficiente insulina secretada por el páncreas. La diabetes de tipo I se produce principalmente en adolescentes, que dependerán de insulina exógena suplementada para mantener sus vidas, debido a la falta de insulina secretada. La diabetes de tipo II muestra heredabilidad más fuerte y factores medioambientales, y tiene heterogeneidad significativa. Actualmente, se cree que la patogénesis de la diabetes es una combinación de resistencia a insulina (principalmente manifestada como hiperinsulinemia y baja utilización de glucosa) e hipoinsulinismo, y como resultado las manifestaciones de diabetes no son siempre las mismas, en las que en algunos casos la resistencia a insulina domina acompañada con hipoinsulinismo, mientras que en otros casos el hipoinsulinismo domina acompañado con o sin resistencia a insulina.
La exenatida, como se muestra en la fórmula I, tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, que es el primer análogo de incretina desarrollado por Eli Lilly and Company (EE UU) junto con Amylin Company. La exenatida es un polipéptido sintético compuesto de 39 aminoácidos, que tiene efectos similares como una incretina endógena tal como glicetina-1 (GLP-1), incluyendo fomentar la secreción de insulina dependiente de glucosa, restablecer la secreción de insulina de primera fase, inhibir la secreción de glucagón, ralentizar la evacuación de los contenidos gástricos, y mejorar la función de las células beta pancreáticas. En 2004, la exenatida ha sido aprobada para su comercialización por la FDA bajo en nombre comercial Byetta. Es una formulación de inyección subcutánea administrada dos veces al día.
La solicitud ha sido aprobada por la Agencia de Alimentos y Fármacos de los EE UU (FDA) el 27 de enero, 2012 para la comercialización de la formulación de liberación controlada (una vez a la semana) de inyección de exenatida. El control del azúcar en sangre se puede mejorar usando tal formulación para pacientes adultos de diabetes de tipo II en base a la dieta y ejercicio. Este es el primer fármaco terapéutico para diabetes de tipo II administrado semanalmente.
Este péptido se sintetizó por métodos de acoplamiento secuencial en fase sólida única como se describe en los documentos US6924264, US7157555, US6902744, CN101538324A, EP1773870A2 y CN101357938A.
Usando una resina amina como el soporte, se obtuvo exenatida por acoplamiento secuencial y corte final. Sin embargo, puesto que el aminoácido en el N-terminal es His, se pueden crear impurezas racémicas de His, que es difícil de eliminar por purificación, usando el material de acoplamiento rutinario Fmoc-His(Trt)-OH y los métodos de acoplamiento en la síntesis en fase sólida de Fmoc.
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Compendio de la invención
En tal base, se proporciona un método para la preparación de exenatida en la presente invención. En este método, el rendimiento y pureza de exenatida se mejoran adoptando histidina que contiene un grupo protector o una sal de la misma y método de síntesis en fragmento, basado en la inhibición de la producción de D-His-exenatida.
Para alcanzar el objeto anterior de la presente invención, la presente invención proporciona las siguientes soluciones técnicas:
Se proporciona un método para la preparación de exenatida en la presente invención, que comprende las siguientes etapas:
Etapa 1: se obtiene serina-resina mediante un primer acoplamiento entre serina y la resina;
Etapa 2: se obtiene péptido-resina de SEQ ID NO. 1 mediante un segundo acoplamiento de dicha serina-resina secuencialmente con aminoácidos;
Etapa 3: se obtiene exenatida-resina mediante un tercer acoplamiento entre la histidina que contiene el grupo protector o una sal de la misma con dicho péptido-resina de SEQ ID NO. 1, y por último la exenatida se obtiene después de corte y purificación.
La histidina que contiene el grupo protector o una sal de la misma en la etapa 3 tiene la estructura como se muestra en la fórmula IV
Boc-His(Boc)-OH.DCHA Fórmula IV.
Preferiblemente, el tercer acoplamiento es acoplamiento preactivado o acoplamiento in situ.
Se obtiene exenatida-resina en un solvente en presencia de un agente de acoplamiento y una base orgánica a través del tercer acoplamiento entre la histidina que contiene el grupo protector o una sal de la misma con dicho péptido-resina de SEQ ID NO. 1, y por último la exenatida se obtiene después de corte y purificación.
El agente de acoplamiento es HATU y HOAt.
Preferiblemente, la base orgánica es DIPEA o TMP.
Preferiblemente, el solvente es uno de NMP, DMF y DCM, o una mezcla de dos o más de los mismos. Preferiblemente, el agente de corte es una mezcla de TFA, PhSMe, EDT, TIS, agua y fenol.
Preferiblemente, la proporción en volumen de TFA, PhSMe, EDT, TIS, agua y fenol en el agente de corte es 80-85:2- 5:2-5:2-5:0-3:0-2.
Preferiblemente, la temperatura de reacción del tercer acoplamiento está en el intervalo de 0 a 30°C.
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Preferiblemente, en particular en la etapa 2, se obtiene el péptido-resina de SEQ ID NO. 1 en un solvente en presencia de un agente de acoplamiento y una base orgánica a través del segundo acoplamiento de dicha serina- resina secuencialmente con aminoácidos.
Preferiblemente, el agente de acoplamiento es HATU y HOAt.
Preferiblemente, la base orgánica es DIPEA o TMP.
Preferiblemente, el solvente es uno de NMP, DMF y DCM, o una mezcla de dos o más de los mismos.
Preferiblemente, en particular en la etapa 2, se obtiene el péptido-resina de SEQ ID NO. 1 a través del segundo acoplamiento de dicha serina-resina secuencialmente con Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala- OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc- Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(pBf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)- OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu- OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly- OH, Fmoc- Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH.
Preferiblemente, la temperatura de reacción del segundo acoplamiento está en el intervalo de 0 a 30°C. Preferiblemente, el agente de acoplamiento para el primer acoplamiento es HOBt.
Preferiblemente, la temperatura de reacción del primer acoplamiento está en el intervalo de 0 a 30°C. Preferiblemente, la resina en la etapa 1 es resina Rink Amida-MBHA.
Se proporciona un método para la preparación de exenatida en la presente invención. En este método, la exenatida se sintetiza adoptando histidina que contiene un grupo protector o una sal de misma usando una síntesis in situ o un método de preactivación. En particular, se obtiene serina-resina mediante un primer acoplamiento entre serina y la resina; posteriormente, se obtiene el péptido-resina de SEQ ID NO. 1 mediante un segundo acoplamiento de dicha serina-resina secuencialmente con aminoácidos; y después se obtiene exenatida-resina mediante un tercer acoplamiento entre la histidina que contiene el grupo protector o una sal de la misma con dicho péptido-resina de SEQ ID NO. 1, y la exenatida purificada se obtiene por último después de corte y purificación. Basado en la inhibición de la producción de D-His-exenatida, el rendimiento y pureza de exenatida se mejoran mediante el método de preparación de exenatida proporcionado en el presente documento.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es el cromatograma de HPLC del péptido purificado preparado en grupo control del ejemplo 34.
La figura 2 es el cromatograma de HPLC del péptido purificado preparado en grupo de prueba del ejemplo 34. Descripción detallada de la invención
- Abreviatura
- Forma completa
- DCHA
- Diciclohexilamina
- CHA
- Ciclohexilamina
- Bum
- t-butoximetilo
- mmt
- 4-metoxitritilo
- mtt
- metiltritilo
- Trt
- tritilo
- HOAt
- 1-hidroxi-7-azobenzotriazol
- Fmoc
- 9-fluorofenilmetiloxicarbonilo
- DIPCDI
- Diisopropilcarbodiimida
- HOBt
- 1-hidroxibenzotriazol
- HATU
- hexafluorofosfato de 2-(7-azo-benzotriazol)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
- HBTU
- hexafluorofosfato de benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio
- DIPEA
- N,N-diisopropiletilamina
- DMF
- N,N-dimetilformamida
- DCM
- diclorometano
- NMP
- N-metilpirrolidona
- TMP
- 2,4,6-trimetilpiridina
- TFA
- ácido trifluoroacético
- PhSMe
- tioanisol
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TIS triisopropilsilano
EDT etanoditiol
Fenol fenol
SCX-HPLC cromatografía de intercambio catiónico fuerte
Ejemplo 1: Síntesis de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink amida-MBHA con grado de sustitución de 0,1 mmol/g
Se pesaron 100 g de resina Rink amida-MBHA y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida seguido por lavado con DMF dos veces. Después de que se hinchara la resina en DMF durante 30 minutos, la protección Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó con DMF 6 veces. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 4,60 g de Fmoc-Ser(tBu)-OH (12 mmol) y 1,95 g de HOBt (14,4 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 2,25 ml de DIC (14,4 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. La resina se lavó con DMF 3 veces, y la solución de bloqueo (piridina/anhídrido acético = 1:1) se añadió para bloquear durante 2 h. La resina se lavó con cada uno de dMf y DCM 4 veces, se encogió en metanol y el metanol se eliminó a sequedad por succión, se obtuvo Fmoc-Ser(tBu)- resina Rink Amida-MBHA. Se determinó el grado de sustitución como 0,098 mmol/g.
Ejemplo 2: Síntesis de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink amida-MBHA con grado de sustitución de 0,2 mmol/g
Se pesaron 100 g de resina Rink amida-MBHA y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida seguido por lavado con DMF dos veces. Después de que se hinchara la resina en DMF durante 30 minutos, la protección Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó con DMF 6 veces. La resina se ensayo mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 9,20 g de Fmoc-Ser(tBu)-OH (24 mmol) y 3,89 g de HOBt (28,8 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 4,50 ml de DIC (28,8 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. La resina se lavó con DMF 3 veces, y la solución de bloqueo (piridina/anhídrido acético = 1:1) se añadió para bloquear durante 2 h. La resina se lavó con cada uno de dMf y DCM 4 veces, se encogió en metanol y el metanol se eliminó a sequedad por succión, se obtuvo Fmoc-Ser(tBu)- resina Rink Amida-MBHA. Se determinó el grado de sustitución como 0,192 mmol/g.
Ejemplo 3: Síntesis de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink amida-MBHA con grado de sustitución de 0,3 mmol/g
Se pesaron 100 g de resina Rink amida-MBHA y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida seguido por lavado con DMF dos veces. Después de que se hinchara la resina en DMF durante 30 minutos, la protección Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó con DMF 6 veces. La resina se ensayo mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 13,8 g de Fmoc-Ser(tBu)-OH (36 mmol) y 5,84 g de HOBt (43,2 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 6,75 ml de DIC (43,2 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. La resina se lavó con DMF 3 veces, y la solución de bloqueo (piridina/anhídrido acético = 1:1) se añadió para bloquear durante 2 h. La resina se lavó con cada uno de dMf y DCM 4 veces, se encogió en metanol y el metanol se eliminó a sequedad por succión, se obtuvo Fmoc-Ser(tBu)- resina Rink Amida-MBHA. Se determinó el grado de sustitución como 0,302 mmol/g.
Ejemplo 4: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 78,1 g de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink Amida-MBHA con un grado de sustitución de 0,192 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó después 6 veces usando DMF. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 20,24 de Fmoc-Pro-OH (60 mmol) y 9,73 de HOBt (72 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 11,26 ml de DIC (72 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una reacción de una hora adicional. Tales criterios se aplicaron a la determinación del punto final mediante la prueba de ninhidrina de aquí en adelante. El acoplamiento del fragmento 2-39 se logró secuencialmente del C- terminal al N-terminal según la secuencia del esqueleto de exenatida repitiendo la etapa anterior de eliminar la protección de Fmoc y la etapa de acoplamiento con el correspondiente aminoácido añadido. Después de que se terminara la reacción, la resina se encogió en metanol y se secó al vacío durante la noche, dando 160,3 g de exenatida (2-39)-resina Rink amida-MBHA por peso.
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Ejemplo 5: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 153,1 g de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink Amida-MBHA con un grado de sustitución de 0,098 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó después 6 veces usando DMF. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 20,24 de Fmoc-Pro-OH (60 mmol) y 9,73 de HOBt (72 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 11,26 ml de DIC (72 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió otra reacción de 1 h. Tales criterios se aplicaron a la determinación del punto final mediante la prueba de ninhidrina de aquí en adelante. El acoplamiento del fragmento 2-39 se logró secuencialmente del C-terminal al N- terminal según la secuencia del esqueleto de exenatida repitiendo la etapa anterior de eliminar la protección de Fmoc y la etapa de acoplamiento con el correspondiente aminoácido añadido. Después de que se terminara la reacción, la resina se encogió en metanol y se secó al vacío durante la noche, dando 233,9 g de exenatida (2-39)- resina Rink amida-MBHA por peso.
Ejemplo 6: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 49,7 g de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink Amida-MBHA con un grado de sustitución de 0,302 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó después 6 veces usando DMF. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 20,24 de Fmoc-Pro-OH (60 mmol) y 9,73 de HOBt (72 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 11,26 ml de DIC (72 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió otra reacción de 1 h. Tales criterios se aplicaron a la determinación del punto final mediante la prueba de ninhidrina de aquí en adelante. El acoplamiento del fragmento 2-39 se logró secuencialmente del C-terminal al N- terminal según la secuencia del esqueleto de exenatida repitiendo la etapa anterior de eliminar la protección de Fmoc y la etapa de acoplamiento con el correspondiente aminoácido añadido. Después de que se terminara la reacción, la resina se encogió en metanol y se secó al vacío durante la noche, dando 131,3 de exenatida (2-39)- resina Rink amida-MBHA por peso.
Ejemplo 7: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 4 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 8: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
20.86 ml de DIPEA (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 9: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
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Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 6 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de DCM. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 10: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 4 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de DMF/DCM (1:1). Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 11: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 6 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 25°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 12: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de DCM. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 25°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 13: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 6 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de DMF/DCM (1:1). Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 25°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 14: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP/DCM (1:1). Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 25°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción
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completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 15: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 4 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 30°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento. Tales criterios se aplicaron a la determinación del punto final mediante la prueba de ninhidrina de aquí en adelante.
Ejemplo 16: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de DCM. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 30°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 17: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 4 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de DMF. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 30°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 18: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 6 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de DMF/DMF (1:1). Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 30°C durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 19: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento con preactivación usando Boc-His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 6 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
32.22 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina y se disolvieron en 500 ml de DMF. Después de activación durante 5 min añadiendo 15,86 ml de TMP (120 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución mezcla se añadió a la columna de reacción y la reacción se realizó a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 20: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Fmoc- His(Boc)-OH.DCHA y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
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Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 4 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 34,56 g de Fmoc-His(Boc)-OH.DCHA (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó
mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora
adicional de reacción de acoplamiento. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK, y la resina se lavó
después con DMF 6 veces. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina.
Ejemplo 21: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Fmoc- His(Bum)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 27,81 g de Fmoc-His(Bum)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó
mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora
adicional de reacción de acoplamiento. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK, y la resina se lavó
después con DMF 6 veces. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina.
Ejemplo 22: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Fmoc- His(mmt)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 38,98 g de Fmoc-His(mmt)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota
15.86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó
mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora
adicional de reacción de acoplamiento. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK, y la resina se lavó
después con DMF 6 veces. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina.
Ejemplo 23: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Fmoc- His(mtt)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 4 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 38,02 g de Fmoc-His(mtt)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK, y la resina se lavó después con DMF 6 veces. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina.
Ejemplo 24: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Trt)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 6 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron
29.86 g de Boc-His(Trt)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
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Ejemplo 25: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(Bum)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 4 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 20,49 g de Boc-His(Bum)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 26: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(mmt)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 31,66 g de Boc-His(mmt)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 27: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Boc- His(mtt)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 6 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 30,70 g de Boc-His(mtt)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 28: Síntesis de péptido-resina de SEQ ID NO. 2 por el método de acoplamiento in situ usando Trt- His(Trt)-OH y el péptido-resina de SEQ ID NO. 1
Se pesaron 15 mmol del péptido-resina de SEQ ID NO. 1 preparado en el ejemplo 5 y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. La resina se lavó dos veces con DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. Se añadieron 38,39 g de Trt-His(Trt)-OH (60 mmol), 22,81 g de HATU (60 mmol), 9,80 g de HOAt (72 mmol) a la resina seguido por la adición de 500 ml de solución de NMP. Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 15,86 ml de TMP (120 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento.
Ejemplo 29: Corte de exenatida-resina
Se colocaron 100 g de péptido-resina obtenido en cualquiera de los ejemplos 7-28 en un reactor de corte. Posteriormente, el agente de corte TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O:fenol = 80:5:5:5:3:2 (v/v) se añadió en una proporción de 10 ml/g de resina y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Los reactivos se filtraron a través de un embudo con filtro sinterizado y el filtrado se recogió. La resina se lavó mediante una pequeña cantidad de TFA 3 veces y los filtrados se combinaron. El filtrado se precipitó añadiendo éter etílico absoluto enfriado en hielo (en una cantidad de 100 ml/g de resina). El precipitado se centrifugó después, y el precipitado se lavó con éter etílico anhidro 3 veces y se secó al vacío para obtener un polvo blanco, es decir, exenatida cruda.
Ejemplo 30: Corte de exenatida-resina
Se colocaron 100 g de péptido-resina obtenido en cualquiera de los ejemplos 7-28 en un reactor de corte. Posteriormente, el agente de corte TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O:fenol = 85:4:4:4:2:1 (v/v) se añadió en una proporción de 10 ml/g de resina y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Los reactivos se filtraron a través de un embudo con filtro sinterizado y el filtrado se recogió. La resina se lavó mediante una pequeña cantidad de TFA 3 veces y los filtrados se combinaron. El filtrado se precipitó añadiendo éter etílico absoluto enfriado en hielo (en una cantidad de
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100 ml/g de resina). El precipitado se centrifugó después, y el precipitado se lavó con éter etílico anhidro 3 veces y se secó al vacío para obtener un polvo blanco, es decir, exenatida cruda.
Ejemplo 31: Corte de exenatida-resina
Se colocaron 100 g de péptido-resina obtenido en cualquiera de los ejemplos 7-28 en un reactor de corte. Posteriormente, el agente de corte TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O:fenol = 81,5:5:5:5:2,5:1 (v/v) se añadió en una proporción de 10 ml/g de resina y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Los reactivos se filtraron a través de un embudo con filtro sinterizado y el filtrado se recogió. La resina se lavó mediante una pequeña cantidad de TFA 3 veces y los filtrados se combinaron. El filtrado se precipitó añadiendo éter etílico absoluto enfriado en hielo (en una cantidad de 100 ml/g de resina). El precipitado se centrifugó después, y el precipitado se lavó con éter etílico anhidro 3 veces y se secó al vacío para obtener un polvo blanco, es decir, exenatida cruda.
Ejemplo 32: Preparación de acetato de exenatida purificado
Se pesaron 20,0 g de exenatida cruda obtenida en cualquiera de los ejemplos 29-31 y se disolvieron en 2000 ml de agua. La solución se purificó por un sistema Waters 2545 RP-HPLC equipado con columna C18 de 50*250 mm de fase inversa usando solución de TFA al 0,2%/acetonitrilo convencional como fase móvil. El eluyente se detectó a una longitud de onda de 230 nm y se recogieron fracciones del pico diana, para obtener péptido purificado con una pureza mayor del 98,5%. En el sistema Waters 2545 RP-HPLC equipado con columna C18 de 50*250 mm de fase inversa, la solución de péptido purificado se convirtió en su sal usando solución de ácido acético al 0,2%/acetonitrilo como fase móvil. Las fracciones de pico diana se recogieron y concentraron por evaporación rotatoria. Después de liofilizar, se obtuvieron 4,2 g de acetato de exenatida purificado con una pureza por HPLC del 98,5%. El contenido de D-His-exenatida en la exenatida refinada era menor del 0,5%, detectada por el método de SCX-HPLC.
Ejemplo 33: Preparación a gran escala de acetato de exenatida purificado
Se pesaron 1000 g de resina Rink amida-MBHA y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida y se lavó con DMF dos veces. Después de haber hinchado la resina en DMF durante 30 min, la protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó con DMF 6 veces. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 92,0 g de Fmoc- Ser(tBu)-OH (240 mmol) y 38,9 g de HOBt (288 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 45 ml de DIC (288 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción se realizó a temperatura ambiente durante 2 h. La resina se lavó con DMF 3 veces, la solución de bloqueo (piridina/anhídrido acético = 1:1) se añadió para bloquear durante 2 h. La resina se lavó con cada uno de dMf y DCM 4 veces, se encogió en metanol y el metanol se eliminó a sequedad por succión, se obtuvo Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink amida- MBHA. Se determinó que el grado de sustitución era 0,189 mmol/g.
Se pesaron 1005,3 g de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink Amida-MBHA con un grado de sustitución de 0,189 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó después 6 veces usando DMF. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 256,42 de Fmoc-Pro-OH (760 mmol) y 123,21 g de HOBt (912 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 142,57 ml de DIC (912 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción. Tales criterios se aplicaron a la determinación del punto final mediante la prueba de ninhidrina de aquí en adelante. El acoplamiento del fragmento 2-39 se logró secuencialmente del C-terminal al N-terminal según la secuencia del esqueleto de exenatida repitiendo la etapa anterior de eliminar la protección de Fmoc y la etapa de acoplamiento con los correspondientes aminoácidos añadidos. Se añadieron 408,12 g de Boc-His(Boc)-OH.DCHA (760 mmol), 288,95 g de HATU (760 mmol), 124,12 g de HOAt (912 mmol) a la resina seguido por la adición de 5000 ml de solución de NMP/DCM (1:1). Después de agitar durante 5 min, se añadieron gota a gota 200,9 ml de TMP (1520 mmol), y la reacción se realizó a 0°C durante 3 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción de acoplamiento. Después de que se terminara la reacción, la resina se encogió en metanol y se secó al vacío durante la noche, dando 2029,6 g de péptido-resina de SEQ ID NO. 1 por peso.
Se colocaron 2029,6 g de péptido-resina de SEQ ID NO. 1 en un reactor de corte. Posteriormente, el agente de corte TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O:fenol = 81,5:5:5:5:2,5:1 (v/v) se añadió en una proporción de 10 ml/g de resina y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Los reactivos se filtraron a través de un embudo con filtro sinterizado y el filtrado se recogió. La resina se lavó mediante una pequeña cantidad de TFA 3 veces y los filtrados se combinaron.
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El filtrado se precipitó añadiendo éter etílico absoluto enfriado en hielo (en una cantidad de 100 ml/g de resina). El precipitado se centrifugó después, y el precipitado se lavó con éter etílico anhidro 3 veces y se secó al vacío para obtener 836,97 g de polvo blanco, es decir, exenatida cruda, con un rendimiento en peso del 105,2% y una pureza del péptido crudo del 55,9%.
Después de que la exenatida cruda se convirtiera a la sal a través de purificación, se obtuvieron por último 173,68 g exenatida purificada con una pureza por HPLC del 98,9%, en donde el contenido de D-His-exenatida era del 0,19%, determinado por SCX-HPLC.
Ejemplo 34
Grupo control:
Se pesaron 10 g de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink Amida-MBHA con un grado de sustitución de 0,15 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó después 6 veces usando DMF. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 2,02 de Fmoc-Pro-OH (6 mmol) y 0,97 g de HOBt (7,2 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 1,13 ml de DIC (7,2 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina incolora y transparente indicaba una reacción completa; mientras el color desarrollado en la resina indicaba una reacción incompleta, para lo que se requirió una hora adicional de reacción. Tales criterios se aplicaron a la determinación del punto final mediante la prueba de ninhidrina de aquí en adelante. El acoplamiento del resto de los aminoácidos se logró secuencialmente del C-terminal al N-terminal según la secuencia del esqueleto de exenatida repitiendo la etapa anterior de eliminar la protección de Fmoc y la etapa de acoplamiento con el correspondiente aminoácido añadido, en donde el aminoácido en la posición 1 en el N-terminal era Fmoc-His(Trt)-OH. Después de que se terminara la reacción, la resina se encogió en metanol y se secó al vacío durante la noche, dando 19,3 g de exenatida-resina por peso.
El péptido-resina resultante se añadió a 193 ml de agente de corte TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O:fenol = 85:4:4:4:2:1 (v/v), y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Los reactivos se filtraron a través de un embudo con filtro sinterizado y el filtrado se recogió. La resina se lavó mediante una pequeña cantidad de TFA 3 veces y los filtrados se combinaron. El filtrado se precipitó añadiendo éter etílico absoluto enfriado en hielo (en una cantidad de 100 ml/g de resina). El precipitado se centrifugó después, y el precipitado se lavó con éter etílico anhidro 3 veces y se secó al vacío para dar un sólido en polvo blanco, es decir, exenatida cruda.
La exenatida cruda obtenida se convirtió en su sal mediante purificación usando RP-HPLC, lo que produjo 1,75 g de acetato de exenatida con una pureza por HPLC del 94,3%.
Basado en la detección usando SCX-HPLC, el cromatograma líquido se mostró en la figura 1, en donde RT21.523 indicaba D-His-exenatida con un contenido el 2,73%.
Grupo de prueba:
Se pesaron 1000 g de resina Rink amida-MBHA y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida seguido por lavado con DMF dos veces. Después de haber hinchado la resina en DMF durante 30 min, la protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó con DMF 6 veces. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 92,0 g de Fmoc- Ser(tBu)-OH (240 mmol) y 38,9 g de HOBt (288 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 45 ml de DIC (288 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción se realizó a temperatura ambiente durante 2 h. La resina se lavó con DMF 3 veces, la solución de bloqueo (piridina/anhídrido acético = 1:1) se añadió para bloquear durante 2 h. La resina se lavó con cada uno de dMf y DCM 4 veces, se encogió en metanol y el metanol se eliminó a sequedad por succión, se obtuvo Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink amida- MBHA. Se determinó que el grado de sustitución era 0,193 mmol/g.
Se pesaron 984,5 g (190 mmol) de Fmoc-Ser(tBu)-resina Rink Amida-MBHA con un grado de sustitución de 0,193 mmol/g y se añadieron a la columna de reacción de fase sólida. Posteriormente, la resina se lavó dos veces usando DMF, y se hinchó en DMF durante 30 min. La protección de Fmoc se eliminó mediante DBLK y la resina se lavó después 6 veces usando DMF. La resina se ensayó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la eliminación de Fmoc estaba indicada por el color desarrollado en la resina. Se pesaron 256,42 de Fmoc-Pro-OH (760 mmol) y 123,21 g de HOBt (912 mmol) y se disolvieron en una solución mezcla de DCM y DMF en una proporción en volumen de 1:1. Después de activación durante 3 min añadiendo 142,57 ml de DIC (912 mmol) en un baño de agua y hielo, la solución se añadió a la columna de reacción de fase sólida y la reacción de realizó a temperatura ambiente durante 2 h. El punto final de la reacción se determinó mediante la prueba de ninhidrina, en la que la resina
Claims (5)
- REIVINDICACIONES1. Un método para la preparación de exenatida, que se caracteriza por comprender las siguientes etapas:Etapa 1: se obtiene serina-resina mediante un primer acoplamiento entre serina y la resina;Etapa 2: se obtiene péptido-resina de SEQ ID NO: 1 mediante un segundo acoplamiento de dicha serina- resina secuencialmente con aminoácidos;Etapa 3: se obtiene péptido-resina de SEQ ID NO. 2 mediante un tercer acoplamiento entre la histidina que 10 contiene el grupo protector o una sal de la misma con dicho péptido-resina de SEQ ID NO. 1, y la exenatidapor último se obtiene después de corte y purificación;15en donde la histidina que contiene grupo protector o una sal de la misma en la etapa 3 tiene la estructura como se muestra en la fórmula IV:Boc-His(Boc)-OH.DCHA Fórmula IV,en donde la etapa 3 comprende obtener exenatida-resina en un solvente en presencia de un agente de 20 acoplamiento y una base orgánica, en donde el agente de acoplamiento es HATU y HOAt.
- 2. El método de preparación según la reivindicación 1, que se caracteriza en que el tercer acoplamiento es acoplamiento con preactivación o acoplamiento in situ.25 3. El método de preparación según la reivindicación 1, que se caracteriza en que la base orgánica es DIPEA oTMP.
- 4. 30
- 5.El método de preparación según la reivindicación 1, que se caracteriza en que el solvente es uno de NMP, DMF y DCM, o una mezcla de dos o más de los mismos.El método de preparación según la reivindicación 1, que se caracteriza en que el agente de corte es una mezcla de TFA, PhSMe, EDT, TIS, agua y fenol.
- 6. El método de preparación según la reivindicación 5, que se caracteriza en que la proporción en volumen de 35 TFA, PhSMe, EDT, TIS, agua y fenol en el agente de corte es 80-85:2-5:2-5:2-5:0-3:0-2.
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