TW200932268A - Binding molecules to the human OX40 receptor - Google Patents

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200932268 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明揭示内容係關於抗體，且尤其係關於與0X40受 體結合之抗體。 本申請案主張於2007年12月14日申請、案號為61/ ; 〇13947之美國臨時申請案之權利，該案之全文以引用的方 . 式併入本文中。 合作研究協議 © 本文之揭露内容與申請專利範圍是在Pfizer Inc.與

Medarex Inc.之間產生所主張發明的日期之時或之前生效 之合作研究協議範圍内所採取的行動之結果。 【先前技術】 增強抗腫瘤T細胞功能代表在癌症治療態樣有效力且新 穎之方法。與產生有效抗腫瘤T細胞反應有關之重要構成 要素包括增強CD4 +輔助T細胞活性來促進抗腫瘤細胞溶解 性T細胞之產生以及為記憶T細胞與效應T細胞提供存活信 _ 號。已經指出的用於介導此等反應之主要受體為0X40受 體。Sugamura，K. Ishii，N.，Weinberg, Α·等人於 Nature - Rev· Imm. 4: 420-431 (2004)發表之”效應T-細胞協同刺激 分子0X40之治療標乾（Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule 0X40)” ；以及 Hori，T.於 Intn. J. Hematology. 83: 17-22 (2006)所發表之"0X40於發 病中之角色及疾病之控制（Roles of 0X40 in the pathogenesis and control of diseases)” ° 136851.doc 200932268 0X40受體（OX40R)(亦稱為 CD134、TNFRSF4、ACT-4、 ACT35及TXGP1L)係TNF受體超家族中之一員。發現 OX40R會在活化之CD4+ T細胞上表現。且已經證實在腫瘤 内（腫瘸浸潤淋巴細胞）及在癌症病人之引流淋巴結中有高 數量之OX40R+ T細胞（1997 Vetto, J.T.等人，"腫瘤浸潤淋 巴細胞與帶有黑色素瘤及頭頸部癌症病人之引流淋巴結上 T細胞活化標記OX-40之存在（Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph nodes cells from patients with melanoma and head and neck cancers)" > Am. J. Surg. 174 : 258-265 ; Weinberg，A.D.等人，"活體内OX-40受體嚅合促 進抗腫瘤免疫（Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity)，J. Immunol. 164 : 2160-69 (2000) ; Petty, J.K.，等人，”人類大腸直腸癌存活與T-細胞 協同刺激分子OX40(CD 134)表現關聯（Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134)" * Am. J. Surg. 183 : 512-518 (2002))。在小鼠之腫瘤模型中顯示出，在 腫瘤引發期間，相較於經對照處理之小鼠，活體内OX40R 之嚅合顯著地延緩腫瘤出現並且防止腫瘤出現（Weinberg等 人，2000年）。因此，已經仔細考量經由使用OX40R結合 劑藉由嚅合OX40R來增進哺乳動物對抗原之免疫反應（WO 99/42585，Weinburg等人，2000年）° 【發明内容】 136851.doc 200932268 本發明揭示内容提供與人類OX40R結合之經分離結合分 子，其包括OX40R抗體、OX40R抗體之抗原結合片段、及 OX40R抗體之衍生物。在一些實施例中，結合分子以 1χ10_7 Μ或更少之KD與人類OX40R結合且對人類OX40R具 有促效活性。在另外一些實施例中，結合分子係以100 nM 或更少之KD與人類OX40R特異性結合之人類單株抗體。 本發明揭示内容還提供一種包括一或多種結合分子及醫 藥學上可接受之載劑的組合物。在一些實施例中，結合分 子係人類單株OX40R抗體或其抗原結合片段。組合物還可 包括其他藥劑，例如化學治療劑、免疫治療劑、及賀爾蒙 治療劑。 本發明揭示内容進一步提供使用結合分子之治療及診斷 方法。在一些實施例中，本發明揭示内容提供一種治療或 預防哺乳動物癌症的方法，其包括將治療有效量之結合分 子或包括結合分子之組合物投予哺乳動物。在一些其他實 施例中，本發明揭露内容提供一種提高哺乳動物免疫反應 之方法，其包括將治療有效量之結合分子或包括結合分子 之組合物投予哺乳動物。在一些特定實施例中，該等方法 中所使用之結合分子係一種人類單株OX40R抗體或其抗原 結合片段。 本發明揭露内容進一步提供編碼結合分子之胺基酸序列 之核酸分子、包括此等核酸之載體、包括載體之宿主細 胞、及製備該等結合分子之方法。 本發明揭示内容還提供其他態樣，此等態樣將顯而易見 136851.doc 200932268 於包括申請專利範圍之整個揭露内容中》 【實施方式】 定義 術語"促效劑"係指本文中所定義之結合分子，其與 OX40R結合時（1)刺激或活化〇X40R，（2)增強、增加、促 進、誘導或延長OX40R之活性、功能或存在，或者（3)増 強、增加、促進或誘導〇X4〇R之表現》 術語"抗體"係指一般由兩對相同多肽鏈構成之免疫球蛋 白分子，每對多肽鏈具有一條"輕"(L)鏈與一條"重” 鍵。人類輕鍵分為κ及λ輕鍵。重鍵分為μ、δ、γ、a或ε， 並分別定義抗體之同型為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在 輕鏈及重鏈中’可變區域及恆定區域係藉由一個大約丨2個 或更多胺基酸之"J"區域而連接，重鏈中亦包括一個大約3 個或更多胺基酸的"D"區域。每個重鏈由一個重鏈可變區 域（在此縮寫為HCVR或VH)及一個重鏈恆定區域組成。重 鏈怪定區域由三個結構域CH1、CH2及CH3組成。每個輕鏈 由一個輕鏈可變區域（在此縮寫為LCVR或VL)及一個輕鏈 怪定區域組成。輕鏈恆定區域由一個結構域CL組成。抗體 之怪定區域可介導該免疫球蛋白與宿主組織或因子之結 合’包括各種免疫系統之細胞（如效應細胞）及典型補體系 統之第一組分（Clq)。Vh&Vl區域可再細分為具有高度可 變性、稱為互補決定區域（CDR)之區域，其中散布有較為 保守之、稱為構架區域（FR)的區域。每個vH及Vl區域由三 個CDRS及四個FRs組成，以下列順序自胺基端排列至羧基 136851.doc •10· 200932268 端：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。每個 重/輕鏈對（VH& VL)之可變區域分別形成抗體結合位點。 每個區域或結構域之胺基酸排列係依據具有免疫學重要性 的蛋白質 Kabat 序列（Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)(National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1987 and 1991))或 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia 等人（1989) Nature 342:87 8-883。術語"抗體"包含作為一個抗體多聚體（抗體 之多聚形式）之部分的抗體，如二聚體、三聚體或單體抗 體之更高階多聚體。亦包含連接於或附著於，或者另外物 理上或功能上相關於一個非抗體部分的抗體◎而且，術語 π抗體"不受任何產生抗體的特定方法之限制。舉例而言， 其尤其包括重組抗體、單株抗體及多株抗體。

術語"抗體衍生物"或抗體之"衍生物"係指可以與該抗體 所結合之相同抗原（如OX40R)結合的分子，且包含與額外 分子實體連接之抗體的胺基酸序列》在抗體衍生物中所包 含之抗體之胺基酸序列可為全長抗體，或可為全長抗體之 任一部分或多個部分。額外分子實體可為一個化學或生物 分子。額外分子實體之實例包括化學基團、胺基酸、肽、 蛋白質（如酶、抗體）以及化合物。額外分子實體可能會具 有任何用途’如用作偵測劑、標記、標誌、藥劑或治療 劑。抗體之胺基酸序列可藉由化學偶合、基因融合、非共 價締合或其他方式附著或連接於該額外實體。術語"抗體 衍生物"亦包含嵌合抗體、人類化抗體及來源於對〇X4〇R 136851.doc -11- 200932268 抗體胺基酸序列進行修飾之分子，例如保守性胺基酸取 代、添加及插入。 術語抗體之"抗原結合片段”係指全長抗體之一或多個部 分，其保留與該抗體所結合之相同抗原（如：〇X4〇R)結合 的能力。術語"抗原結合片段"亦包含抗體之部分，其為藉 由該抗體部分與一或多個額外分子實體共價或非共價締合 而形成之較大分子部分。額外分子實體之實例包括胺基 酸、肽或蛋白質，例如可用以生成四聚seFV分子的抗生蛋 白鏈菌素（streptavidin)核心區域（Kipriyan〇v 等人，（1995)

Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、半耽胺酸 (cysteine)殘基、標誌肽或用於生成二價及生物素標記 (biotinylated) scFv分子之C端多組胺酸標籤（Kipriyan〇v等 人 ’（1994) Mol. Imnumol. 31:1047-1058)。 術語"結合分子"包含各自如本文中所定義之抗體， (2)抗體之抗原結合片段，及抗體之衍生物。 術語"與OX40R結合”係指本文所定義之結合分子與 OX40R在細胞外檢定，例如BIAcore檢定中結合。结合音 指1χ10_6 Μ或更小之結合親和力（kd)。 術s吾”嵌合抗體"係指包含來源於兩種或多種不同抗體之 胺基酸序列之抗體。該兩種或多種不同之抗體可能來自相 同物種’或來自兩種及兩種以上不同物種。 術語"保守性胺基酸取代"係指胺基酸殘基被另一胺基酸 殘基取代，其中兩個胺基酸殘基之侧鏈R基團具有類似之 化學性質（例如電荷或疏水性）。側鏈具有類似化學性質之 I36851.doc -12- 200932268 胺基酸基團實例包括1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺 酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺 酸；3)含有醯胺之侧鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側 鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、 精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7) 含有硫之側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。保守性胺基酸取代 基團可為，例如，纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸_酪 胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麵胺酸-天冬胺酸 以及天冬醯胺-齡醮胺酸。 術語"抗原決定基（epitope)”係指抗原可以特異性與抗 體、或T細胞受體結合，或與分子相互作用之部分^ ”抗原 決疋基在此項技術中亦稱作"抗原決定子（antigenic determinant)"。抗原決定基一般由分子之化學活性表面群 組組成，如胺基酸或碳水化合物或糖類側鏈，且通常具有 特異性3維結構特性以及特異性電荷特性。抗原決定基可 為''線性"或”構形”抗原決定基。一旦確定抗原上所希望之 抗原決定基，就能例如使用以下所述之技術產生相對於該 抗原決定基之抗體。抗體之產生及表徵亦說明有關所希望 之抗原決定基之資訊。自此等資訊中，可以競爭性地篩選 與相同抗原決定基結合之抗體。達成此舉之一個方式係進 行交又競爭研究，以尋找彼此競爭性結合之抗體，亦即競 爭結合至該抗原之抗體。PCT公開案第WO 03/48731號描 述一種基於抗體之父叉競乎而用以"重新分級（binning)"抗 體之面通量方法。 136851.doc -13- 200932268 術語"生殖系（germline)"係指抗體基因及基因片段之核 苷酸序列，藉由經由生殖細胞自親代傳至後代。生殖系序 列與編碼成熟B細胞中抗體之核苷酸序列不同，其在B細 胞成熟的過程中會因重組及高度突變事件而被改變。 術語"宿主細胞”係指已將表現載體引入其中之細胞。術 語不僅包含特定之受試細胞，亦包含該細胞的子代。因為 特定修飾可能會因為突變或環境影響而發生在後代，所以 此等後代不一定與親代細胞相同，但仍然包括在術語"宿 主細胞，'之範圍内。術語”人類抗體”係指僅由人類免疫球 蛋白序列之胺基酸所組成的抗體》若人類抗體在小鼠體 内、小鼠細胞内或來源於小鼠細胞之融合瘤内產生，則可 能會包含鼠科碳水化合物鏈》人類抗體可由此項技術中已 知的多種方式製備而成。 術語"人類化抗體"係指一種包含來源於人類抗體序列之 胺基酸殘基之嵌合抗體。當該抗體之構架區域與恆定區域 包含來源於人類抗體序列之胺基酸殘基時，人類化抗體可 能會包含非人類動物抗體之一些或所有CDRs。 術έ吾哺乳動物”係指哺乳綱（Mammalia class)之任何動物 物種’哺乳動物之實例包括：人類；諸如大鼠、小鼠、猴 及天竺鼠之實驗動物；諸如貓、狗、兔、牛、羊、山羊、 馬及豬之家畜；以及諸如獅、虎、象及其類似物之獵捕野 生動物。 術語”經分離核酸"係指基因體、CDNA或合成來源之核 酸分子或其組合，其與其他存在於核酸天然來源中之核酸 136851.doc -14· 200932268 分子分離。舉例而言，就基因體DNA而言，術語"經分離” 包括與基因體DNA與其天然締合之染色體分離的核酸分 子。較佳地，”經分離”核酸在生物體基因體DNA中不含天 然側接該核酸之序列（亦即位於所關注核酸5'端及3'端之序 列），其中該核酸係來源於該生物體。 術語"經分離抗體”或"經分離結合分子”係指如下之抗體 或結合分子：（1)並未與在其自然狀態中伴隨之天然締合組 分締合；（2)不含其他來自相同物種之蛋白質；（3)藉由來 自不同物種之細胞表現；或（4)在自然界不發生。經分離抗 體之實例包括利用OX40R親和性純化之OX40R抗體，在活 體外由融合瘤或其他細胞株產生之OX40R抗體，及來自轉 殖動物之人類OX40R抗體。 術語”KD"係指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常 數，且用以描述配位體（如抗體）與蛋白質（如OX40R)之間 的結合親和力。平衡解離常數越小，配位體結合越緊密， 或者配位體與蛋白質間之親和力越高。KD可藉由表面電漿 共振分析法（surface plasmon resonance)量測，例如使用 BIACOREtm系統。本文實例部分敘述一種利用BIACOREtm 系統之檢定程序（BIAcore檢定）。 術語”解離速率”或”kd”係指特定抗體-抗原相互作用之解 離速率常數。解離速率常數可藉由表面電漿共振分析法量 測，例如使用BIACORETM*統。 術語"OX40R抗體"係指如本文中所定義，能夠與人類 OX40R結合之抗體。 136851.doc 200932268 術語”0X40受體"及"OX40R"在本申請案中可交替地使 用，且包括人類OX40R以及其變異體、同功異型物及同源 物種。因此，本文中揭露之人類結合分子，在某些情形亦 與來自非人類物種之OX40R結合。在其他情形下，該等結 合分子對於人類OX40R具有完全特異性，且不會顯現物種 交又反應或其他類型之交叉反應。 術語”與人類OX40R特異性結合”係關於結合分子（如抗 體）與其結合搭配物（如抗原）之相互作用，意謂與CD40、 CD137或CD271結合之結合分子之KD如利用活體外檢定確 定時，比與人類OX40R結合的KD大100倍。 術語”載體”係指能夠在宿主細胞中轉運另一個核酸分子 之核酸分子。載體之實例包括質體、病毒載體、裸露之 DNA或RNA表現載體、黏質體或嗜菌體載體。某些載體可 在其中引入該等載體之宿主細胞中自主複製（例如：具有 細菌複製起點之細菌載體及游離基因型哺乳動物細胞載體 (episomal mammalian vectors))。某些載體在引入宿主細胞 時，可整合於宿主細胞之基因體中，因而與宿主細胞基因 體一起複製（例如：非游離基因型哺乳動物細胞載體）。某 些載體可以引導該等載體與其可操作連接之基因之表現， 因此被稱為"表現載體π。 本文中所使用之20種習知胺基酸及其縮寫係按照習知用 法，參考Immunology-A Synthesis (第 2版，E.S. Golub及 D.R. Gren 編，Sinauer Associates, Sunderland, ΜΑ (1991))。 136851.doc -16- 200932268 與人類OX40R結合之結合分子 本發明揭示内容提供與人類OX40R結合之經分離結合分 子，包括OX40R抗體、OX40R抗體之抗原結合片段及 OX40R抗體之衍生物。該等結合分子特徵在於以下功能特 性中之至少一種：（a)以1 X 10_6 Μ或更小之KD值與人類 OX40R結合；（b)對人類OX40R具有促效活性；（c)在高達 ， 500 nM濃度下不與CD40受體結合；（d)在高達500 nM濃度 下不與CD137受體結合；（e)在高達500 nM濃度下不與 ❿ CD271受體結合；（f)可藉由經分離人類T細胞增強IL-2之 產生；（g)可增強免疫反應；（h)可抑制腫瘤細胞生長；以 及⑴對癌症具有治療效果。在某些實施例中，該結合分子 以1χ1(Τ7 Μ或更小、1χ10_8 Μ或更小或5χ1χ10_9 Μ或更小 之KD值與人類OX40R結合。 人類OX40R抗體 在特定第一態樣中，本發明揭示内容提供一種與人類 OX40R結合之人類抗體。在一些實施例中，該人類抗體為 以100 nM或更低，較佳為10 nM或更低之KD值特異性與人 類OX40R結合之單株抗體，且對於人類OX40R具有促效活 ; 性。該等人類抗體之一個實例係人類單株抗體11D4。抗體 , 11D4之重鏈之胺基酸序列及重鏈可變區域（VH)之胺基酸序 列分別顯示於SEQ ID NOs : 9及7中。抗體11D4之輕鏈之 胺基酸序列及輕鏈可變區域（VL)之胺基酸序列分別顯示於 SEQ ID NOs : 10及8中。11D4抗體之同型對於重鏈為IgG2 且對於輕鏈為κ。11D4抗體之同種異型（allotype)對於重鏈 136851.doc -17- 200932268 為G2(n-)且對於輕鏈為Km3。成熟之重鏈及輕鏈胺基酸序 列來自表現構築體中DNA序列的概念性轉譯。抗體11〇4不 含重鏈或輕鏈中之構架突變，但在重鏈CDR2中含有一個 突變。 本發明中另一個示範性抗體係人類單株抗體18D8。抗體 1 8D8之VH及VL區域之胺基酸序列分別顯示於SEQ m N〇S : 19及20中。重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別顯示於 SEQ ID NOs : 21 及 22 中。 ® 已知11D4及18D8與OX40R結合，且其各自之Vh及％序 列可以與其他OX4〇r抗體"混合與匹配"，以產生其他抗 體。該等"混合與匹配"抗體與OX40R之結合可利用此項技 術已知之結合檢定加以測試，包括實例中描述之檢定。在 某種情形下，當VH及VL區域被混合與匹配時，特定vH/VL 配對之VH序列被結構類似之VH序列置換。同樣地，在另 一種情形下，特定VH/VL配對之VL序列被結構類似之VL序 0 列置換。 由此可知，在某些實施例中，本發明提供一種經分離 OX40R抗體，其包含：（1)抗體11D4或18D8之重鏈可變區 ： 域；（2)包含SEQ ID NOs : 7或19之胺基酸序列之重鏈可變 - 區域；或者（3)包含由核酸序列SEQ ID NOs : 11或23所編 碼之胺基酸序列的重鏈可變區域。在一些其他實施例中， 本發明提供一種經分離〇X40R抗體’其包含：（1)抗體 11D4或18D8之輕鏈可變區域；（2)包含SEQ ID N0s : 8或 20之胺基酸序列之輕鍵可變區域；或者（3)包含由核酸序列 136851.doc .18- 200932268 SEQ ID NOs : 12或24所編碼之胺基酸序列的輕鏈可變區 域。

在另一態樣中，本發明提供包含11D4或11D8重鏈可變 區域（VH)之CDR1、CDR2及CDR3 ’以及11D4或11D8輕鏈 之CDR1、CDR2 及 CDR3的抗體。11D4 之 VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3區域之胺基酸序列分別顯示於SEQ ID ；- NOs:l、2及 3 中。抗體 11D4之 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3區域之胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NOs : 4、5及6 ® 中。抗體18D8之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之胺基酸 序列分別顯示於SEQ ID NOs: 13、14及15中。抗體18D8的 VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之胺基酸序列分別顯示於 SEQ ID NOs : 16、17及18中。CDR區域係利用Kabat系統 (Kabat, Ε· A.，等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 描述。 已知11D4及18D8與人類OX40R結合，且其抗原結合特 異性主要由CDR1、CDR2及CDR3區域提供，VH CDR1、 ： CDR2及CDR3序列及VL CDR1、CDR2及CDR3序列可被"混 合與匹配"，以產生其他OX40R抗體。舉例而言，雖然每 個抗體一般含有VH CDR1、CDR2及CDR3與VL CDR1、 CDR2及CDR3，然來自不同OX40R抗體之CDRs可被混合與 匹配。該等”混合與匹配”抗體與〇X4〇R之結合可利用上述 結合檢定與實例中所述之結合檢定加以測試（如： 136851.doc -19- 200932268 ELISAs、Biacore分析）。在某種情形下，當VH CDR序列被 混合與匹配時，來自特定Vh序列之CDR1、CDR2及/或 CDR3序列被結構類似之CDR序列置換。同樣地，當Vl CDR序列被混合與匹配時，來自特定VL序列之CDR 1、 CDR2及/或CDR3序列一般被結構類似之CDR序列置換。對 於一般熟悉此項技術者顯而易見，以與本文中揭露之CDR 序列結構類似的序列取代一或多個VH及/或VL CDR區域序 列，可產生新穎VH及VL序列。 因此，在某些實施例中，本發明提供（1)一種經分離單 株抗體，其包含至少一種選自抗體11D4或18D8之VH CDR1、VH CDR2或VH CDR3之CDR。在某些其他實施例 中，本發明提供一種經分離單株抗體，其包含至少一種選 自抗體 11D4 或 18D8 之 VL CDR1、VL CDR2 或 VL CDR3 之 CDR。在另外一些實施例中，本發明提供一種經分離單株 抗體，其包含至少一種選自以下之CDR :包含SEQ ID NOs : 1或13之胺基酸序列的VH CDR1、或與SEQ ID NOs: 1或13之差異在於1、2、3或4個保守性胺基酸取代 的序列；包含SEQ ID NOs : 2或14之胺基酸序列的Vh CDR2、或與SEQ ID NOs : 2或14之差異在於1、2、3或4個 保守性胺基酸取代的序列；以及包含SEQ ID NOs : 3或15 之胺基酸序列的VH CDR3、或與SEQ ID NOs : 3或15之差 異在於1、2、3或4個保守性胺基酸取代的序列。

在另外一些其他實施例中，本發明提供一種經分離單株 抗體，其包含至少一種選自以下之CDR :包含SEq ID 136851.doc -20- 200932268 NOs : 4或16之胺基酸序列的VL CDRl、或與SEQ ID NOs : 4或16之差異在於1、2、3或4個保守性胺基酸取代 的序列；包含SEQ ID NOs : 5或17之胺基酸序列的VL CDR2、或與SEQ ID NOs : 5或17之差異在於1、2、3或4個 保守性胺基酸取代的序列；及包含SEQ ID NOs : 6或18之 胺基酸序列的Vl CDR3、或與SEQ ID NOs : 6或18之差異 在於1、2、3或4個保守性胺基酸取代的序列。 在某些情況下，OX40R抗體重鏈之C端離胺酸被切除 (Harris R. J.，J. of Chromotography, 705: 129-134 (1995))。OX40R抗體重鏈及/或輕鏈視情況包括信號序 列。 OX40R抗體之類別（如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)及子 類（如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)可藉由任何合適之方法確 定。一般來說’抗體之類別及子類可利用對於抗體之類別 與子類具有特異性的抗體來確定。該等抗體為市售的《類 別及子類可藉由ELISA、或西方墨點法以及其他技術確 定。另外，類別及子類可藉由將抗體重鏈及/或輕鏈恆定 區域之全部或一部分定序、將其胺基酸序列與不同類別及 子類免疫球蛋白之已知胺基酸序列比較、及確定該等抗體 之類別及子類而確定。該等OX40R抗體可為igG、IgM、 IgE、IgA或IgD分子。舉例而言’ 〇x4〇r抗體可為IgG1、 IgG2、IgG3或IgG4子類之IgG抗體。因此，本發明一態樣 提供一種將OX40R抗體之類別或子類轉換為另一種類別或 子類的方法。在某些情況下，編碼Vl*Vh不包括編碼Cl 136851.doc -21 200932268 或CH之序列之核酸分子係利用此項技術中熟知的方法分 離。然後該核酸分子經操作連接於編碼所希望免疫球蛋白 類別或子類之CL或CH的核酸序列。上述操作可利用包含如 上所述CL或CH鏈之載體或核酸分子來達成。舉例而言’原 本為IgM之OX40R抗體可類別轉換（class switch)為180抗 ： 體。而且類別轉換亦可用以將IgG子類轉換為另外一種’ 如：自IgGl轉換為IgG2。另一種產生包含所希望同型之抗 體的方法，包含分離編碼〇乂40尺抗體重鏈之核酸與編碼 ® 0X4 OR抗體輕鍵之核酸；分離編碼vh區域之序列；將該 VH序列與編碼所需同塑之重鏈恆定區域的序列接合；在細 胞中表現該輕鏈基因與該重鏈構築體；以及收集具有所需 同型之OX40R抗體。 抗原結合片段 在另一態樣中，如上所述，本發明提供任何人類〇X40R 抗體之抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段選 自：（1) OX40R抗體之輕鏈；⑺OX40R抗體之重鍵’（3) ❹ OX40R抗體輕鏈中之可變區域；（4) OX40R抗體重鍵中之 可變區域；（5) OX40R抗體之一或多個CDRs(二、三’四、 ： 五或六個CDRs);或（6) OX40R抗體輕鏈中之三個CDRs& 重鏈中之三個CDRs。在某些特定實施例中，本發明提供 一種抗體11D4或18D8之抗原結合片段。在某些其他特定 之實施例中，OX40R抗體之抗原結合片段包括：（丨）Fab片 段，由Vl、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；（ii) F(ab，）2片段，包含兩個Fab片段之二價片段，其中兩個Fab 136851.doc •22- 200932268 片段在鉸鏈區域由雙硫橋鍵連接；（iii)由VH及CH1結構域 組成之Fd片段；（iv)由抗體單臂VL及VH結構域組成之Fv片 段；（v)由VH結構域組成之dAb片段（Ward等人，（1989) Nature 341:544-546); (vi)經分離之 CDR;以及（vii)單鏈抗 體（scFv)，其為包含與抗體VH區域連接之抗體VL區域之 多肽（Bird 等人，（1988) Science 242:423-426 及 Huston 等 人，（1988) Proc, Natl· Acad. Sci· USA 85:5879-5883)。抗 原結合片段亦可包含兩個或多個來自相同重鏈或相同輕 鏈、或者不同鏈之較短片斷。抗原結合片段，如Fab及 F(ab’）2片段，可利用習知技術自全抗體製備，例如分別以 木瓜酶（papain)或胃蛋白酶（pepsin)分解全抗體。亦可利用 如本文所述之重組DNA技術獲得。 抗艘衍生物 在其他一些態樣中，本發明提供如上所述任何〇X4〇R抗 體之衍生物〇 在一特定態樣中，抗體衍生物來源於11D4或18D8抗體 胺基酸序列之修飾。抗體鏈之任何區域之胺基酸序列可被 修飾，如構架區域、CDR區域或恆定區域。該修飾可藉由 此項技術中已知的標準技術引入，如定點突變（site_ directed mutagenesis)及隨機PCR介導之突變（^⑽如爪 PCR-mediated mutagenesis)，而且可包含天然以及非天然 胺基酸。 修飾之類型包括OX40R抗體之一或多個胺基酸的取代、 插入、缺失或其組合。在一些實施例中，抗體衍生物包括 136851.doc •23- 200932268 1、2、3或4個位於重鏈CDRs之胺基酸取代，及/或位於輕 鏈CDRs之一個胺基酸取代。在一些實施例中，〇X4〇R抗 體之衍生物包含關於人類基因生殖系胺基酸序列之一或多 個胺基酸取代。在一特定實施例中，生殖系之一或多個取 代位於重鏈之CDR2區域。在另一特定實施例中，關於生 殖系之胺基酸取代位於一或多個與關於抗體11D4或18D8 生殖系取代相同的位置。在另一實施例中，胺基酸取代將 抗體中一或多個半胱胺酸改變為另一殘基，例如，但不限 於’丙胺酸或絲胺酸。半胱胺酸可為典型（canonical)或非 典型（non-canonical)半胱胺酸。該取代可於抗體之可變結 構域之CDR或構架區域或恆定區域產生。胺基酸取代之另 一種類型為消除天冬醯胺-甘胺酸對，其會藉由改變一個 或兩個殘基形成可能之去酿胺位點（deamidation site)。在 其他實施例中，胺基酸取代為保守性胺基酸取代。在一實 施例中’抗體衍生物關於11D4或18D8胺基酸序列在重鏈 CDR區域中’具有丨、2、3或4個保守性胺基酸取代。 OX40R抗體修飾之另一種類型係抗體初始糖基化樣式之 改變。術語"改變"係指缺失可見於抗體中之一或多個碳水 化合物部分’及/或添加一或多個不存在於抗體中之糖基 化位點。抗體之糖基化一般為N_連接。連接係指碳水化 合物部分附著於天冬醯胺殘基之側鏈。添加糖基化位點至 該抗體可便利地藉由改變胺基酸序列而實現，使得其包含 一或多個上述三肽序列（N-連接糖基化位置）。 修飾之又一種類型涉及存在於抗體上之任何碳水化合物 136851.doc -24 - 200932268 部分之移除，其可藉由化學或酶方法而實現。化學去糖灵 化需要將抗體暴露於諸如三氟甲磺酸或等價化合物之化人 物。本文理會造成除連接糖（N-乙醯葡糖胺或队乙酿半乳 醣胺）以外多數或全部糖類之切除，同時留下完整抗體。 化學去糖基化敘述於Sojahr，Η. T.與Bahl，Ο. P.之心化 r Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57以及Edge, A. S.等人之 - Anal. Biochem. 1 18 (1981) 131-137 中。抗體上碳水化合物 部分之酶切除，可藉由使用如Thotakura，N, R·及Bahl，〇 ® Ρ•於 Meth· Enzymol. 138 (1987) 350-359 所敘述之各種不同 内切及外切葡萄糖苷酶（glyCosidase)而完成。 其他修飾之實例包括乙醢化、醯化、醯胺化、交聯、環 化、雙硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、半胱胺酸 形成、甲醯化、羥基化、碘化、甲基化、肉菫蔻酸化 (myristoylation)、氧化、聚乙二醇化、蛋白質分解處理、 破酸化、異戊二稀化（prenylation)及硫化。 _ 又另一態樣中’提供一種包含本文中所述〇X4〇R抗體或 其抗原結合片段、與額外分子實體連接之抗體衍生物。額 外分子實體之實例包括藥劑、肽或蛋白質、偵測劑或標 記β可連接至OX40R抗體之藥劑之特定實例包括細胞毒性 劑或其他癌症治療劑，以及放射性同位素。可連接至 OX40R抗體之肽或蛋白質之特定實例包括抗體，其可為相 同OX40R抗體或不同之抗體。可連接至〇X4〇R抗體之偵測 劑或標記之特定實例包括螢光化合物，如螢光素 (fluorescein)、螢光異硫氰酸鹽（FITC)、若丹明（rh〇damine)、 136851.doc -25· 200932268 5-二甲胺-1-萘項醯氣（5-dimethylamine-l-naphtthalenesulfonyl chloride)、藻紅蛋白（phycoerythrin)及鑭系磷光體（ianthanide phosphors)，（2)酶’如辣根過氧化酶（horseradish peroxidase)、β-半乳糖苷酶（p-galactosidase)、螢光酶 (luciferase)、鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase)及葡萄糖氧 化酶（glucose oxidase) ; (3)生物素；（4)由第二報導基因（如 白胺酸拉鏈（leucine zipper)對序列、二次抗體結合位置、 金屬結合結構域及抗原決定基標籤）辨識之預定多肽抗原 決定部位。在特定實施例中，抗體衍生物為〇X4〇R抗體多 聚體，其為OX40R抗體之多聚形式，例如抗體二聚體、三 聚體或單體抗體之更高階多聚體。抗體多聚體内之個別單 體可相同或不同，亦即其可為雜聚或均聚抗體多聚體。多 聚體内之個別單體可具有相同或不同之結合特異性。抗體 之多聚反應可經由抗體之自然聚集而完成。舉例而言，一 定百分比之經純化抗體製劑（如經純化IgGl分子）自發形成 含有抗體均二聚體及其他更高階抗體多聚體之蛋白質聚集 體。或者，抗體均二聚體可經由此項技術中已知之化學連 接技術而形成，例如藉由利用異質雙功能交聯劑。合適之 交聯劑包括異質雙功能、具有以合適間隔基（如間_馬來醯 亞胺基苯曱醯基-N-經基破ίό酿亞胺g旨（m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基 甲基）環己烷-1·羧酸酯以及N-琥珀醯亞胺基S-乙醯硫代乙 酸酯（N-succinimidyl S-acethylthio-acetate))分開之兩個可 區別的反應基團’或同質雙功能（如辛二酸二琥珀醯亞胺 136851.doc -26- 200932268 酯）之交聯劑。該等連接劑可售自Pierce Chemical Company，Rockford，IL。亦可藉由此項技術熟知之重組 DNA技術使抗體多聚合》 在又一態樣中，抗體衍生物為嵌合抗體，其包含上述人 類OX40R抗體之胺基酸序列。在一實例中，來自人類 OX40R抗體之一或多個cDRs與來自非人類動物（如小鼠或 大鼠）抗體之CDRs組合。在另一施例中，嵌合抗體之所有 CDRs均來自人類〇X4〇R抗體。在另一實例中，來自一個 以上人類OX40R抗體之CDRs在嵌合抗體中組合。而且， 嵌合抗體可包含來自一個人類OX40R抗體之構架區域以及 來自一或多個不同人類抗體之一或多個CDRs。嵌合抗體 可利用此項技術中熟知的習知方法產生》在某些特定實施 例中’該嵌合抗體包含來自一個抗體之重鏈可變區域或輕 鏈可變區域之1個、2個或3個CDRs，該抗體選自抗體11〇4 或 18D8。 本發明提供之其他抗體衍生物之實例包括單鏈抗體、雙 功能抗體（diabodies)、功能域抗體（domain antibodies)、奈 米抗體（nanobodies)及迷你抗體（unibodies)。"單鏈抗體” (scFv)由單一多肽鍵組成，該單一多肽鏈包含與結構域 連接之VL結構域’其中vL結構域與vH結構域配對以形成 單價分子。單鏈抗體可根據此項技術熟知之方法製備（例 如’參見Bird 等人（1988)Science 242:423-426 以及 Huston 等 人（1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。"二聚 抗體"由兩個鍵組成，每個鍵在同一個多肽鏈上包含連接 136851.doc •27- 200932268 於輕鏈可變區域之重鏈可變區域，該兩個多肽鏈以短肽連 接子連接，其中在同一條鏈上之兩個區域不會互相配對， 但會與另一條鏈上之互補結構域配對以形成雙特異性分 子。製備二聚抗體之方法在此項技術中已知（例如，參見 Holliger P.等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-； 6448及 Poljak R_ J.等人（1994)Structure 2:1121-1123)。功能 域抗體（dAbs)係抗體之功能性小結合單元，對應於抗體重 鏈或輕鏈之可變區域。功能域抗體可充分表現於細菌、酵 ® 母及哺乳動物細胞系統中。功能域抗體之進一步細節及其 產生方法在此項技術中已知（例如，參見美國專利第 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245^,； 歐洲專利 0368684 及 0616640 ; WO 05/035572、WO 04/101790、W0 04/081026、W0 04/058821、WO 04/003019及W0 03/002609)。奈米抗體來源於抗體之重 鏈。奈米抗體一般包含一個單一可變區域及兩個恆定區域 (CH2及CH3)，並保留初始抗體之抗原結合能力。奈米抗 藝 體可藉由此項技術已知之方法製備（例如，參見美國專利 第 6,765,087 號、第美國專利 6,838,254 號、W0 06/ ： 079372)。迷你抗體由IgG4抗體之一個輕鏈及一個重鏈組 ；. 成。迷你抗體可藉由移除IgG4抗體之鉸鏈區域而製成。迷 你抗體之進一步細節及其製備方法可見於WO 2007/059782 中〇 產生結合分子的方法 本文所揭露的結合分子可以此項技術所熟知的技術來產 136851.doc -28 - 200932268 生包括s知單株抗體#《去，例如柯勒及麥爾斯坦（K〇hier and Milstein)的標準體細胞雜交技術（价丨㈣256: 495，（1975)) ’以及例如8淋巴球的病毒或致癌基因轉化等 其他技術。 非人類動物的免疫 本發明揭露内容亦提供一種產生〇X4〇R抗體或其抗原結 合片段之方法，其包含利用〇父4〇11抗原使包含人類免疫球 蛋基因座（loci)之非人類動物免疫，及自該經免疫動物或 自來源於該經免疫動物之細胞中分離該抗體。 適合之非人類動物之實例包括基因轉殖或染色體轉殖動 物，例如 HuMAb Mouse®、KM Mouse®、"TC 小鼠"及 Xenomouse 。HuMAb Mouse®(Medarex，Inc.)包含人類免 疫球蛋白基因微基因座（miniloci)，其編碼未重排之人類重 鏈（μ及γ)與κ輕鏈免疫球蛋白序列，以及使内生性0與κ鏈 基因座去活化之標靶突變（參見例如Lonberg等人（1994) Nature 368·· 856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠^^^或议 表現，而對免疫起反應，引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因 進行類別轉換（class-switching)以及體細胞突變以產生高親 和力人類IgGK單株抗體（參見例如Harding，F.及Lonberg，N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546)。HuMAb

Mouse®之準備及使用，以及由該小鼠所帶有之基因體修飾 為此項技術所熟知（參見例如Fishwild，D.等人（1996) Nature Biotechnology 14: 845-851)。KM 1111〇6"1'1^帶有人類 重鏈轉殖基因以及人類輕鏈轉殖染色體，且其詳細描述於 136851.doc • 29· 200932268 WO 02/43478 中。XenomouseTM(Abgenix，Inc·)包含大片段 之人類免疫球蛋白基因座，並無法產生小鼠抗體。此動物 模型為此項技術所熟知（參見例如美國專利第5,939,598、 6,075，181、6，114,598、6，150,584 及 6，162,963 號）。"TC 小 鼠"亦為基因工程化小鼠，其帶有人類重鏈轉殖染色體以 及人類輕鏈轉殖染色體。該小鼠描述於Tomizuka等人 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727 中。 用來使動物產生免疫之OX40R抗原可為經分離及/或經 純化OX40R，且較佳為人類OX40R。在一實施例中， OX40R抗原係人類OX40R之片段，較佳為OX40R之細胞外 功能域（extracellular domain)。在另一實施例中，OX40R 抗原係包含至少一個人類OX40R之抗原決定基（epitope)之 片段。在另一實施例中，OX40R抗原係在其細胞表面上表 現OX40R之細胞，更具體來說，係在其細胞表面上過度表 現OX40R之細胞。該動物之免疫可藉由任何此項技術所知 之適合方法來完成（參見例如Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990)。用來使非人類動物，例如小鼠、大鼠、綿羊、山 羊、豬、牛及馬，產生免疫之方法為此項技術所熟知（參 見例如 Harlow and Lane (1990)、美.國專利第 5,994,619 號）。實例1提供一種用來使HuMab小鼠產生免疫之方法。 在以OX40R抗原使動物產生免疫之後，可由該動物獲得 抗體及/或產生抗體之細胞。在一實施例中，自該動物取 得血清，並可由該血清中獲得免疫球蛋白部分，或可自該 136851.doc • 30· 200932268 血清中純化出OX40R抗體。 該OX40R抗體亦可利用產生抗體之不死化細胞 (antibody-producing immortalized cell)來產生，該產生抗 體之不死化細胞係自該經免疫動物中所分離出之細胞製備 出。在免疫過後，自該動物收集淋巴結及/或脾臟B細胞並 ； 以適當手段將之不死化。將細胞不死化之方法包括（但不 . 侷限於）以致癌基因將其轉染、以致癌基因病毒將其感染 及將其於選用給不死化細胞之條件下培養、給予其致癌性 ® 或致突變性之化合物、將其與不死化細胞融合，例如骨髓 癌細胞、以及將腫瘤抑制基因去活化（參見例如Harlow及 Lane,上文）。在一特定實施例中，把自經免疫動物所收 集到之脾臟B細胞與不死化骨髓癌細胞融合以形成產生抗 體之不死化融合瘤（hybridoma)。該等骨髓癌細胞較佳不會 分泌免疫球蛋白多肽（一種非分泌型細胞株）。不死化融合 瘤係利用OX40R抗原（例如該OX40R、其一部分、或表現 該OX40R之細胞）來進行篩選。最初之篩選可例如利用酶 連接免疫分析法（ELISA)或放射性免疫分析法來進行。 ELISA篩選之實例描述於WO 00/37504中。 ： 產生OX40R抗體之細胞，例如融合瘤，經選擇、選殖並 , 進一步篩選以具有所欲之特性，包括如下進一步所述之茁 ' 狀生長、高抗體產量及所欲之抗體特性。融合瘤可於同基 因型（syngeneic)動物中於活體内擴增，在缺之免疫系統之 動物，例如裸鼠（nude mice)中擴增，或在活體外細胞培養 物中擴增。 136851.doc 31 · 200932268

因此，提供製造會產生人類單株OX40R抗體或其抗原結 口片&之細胞的方法，該方法包含：（a)以〇X4〇R抗原使非 人類基因轉殖動物產生兔疫；（b)讓該動物對該〇X4〇R抗原 發動免疫反應；（C)自該動物分離出產生抗體之細胞；及 (d)使該產生抗體之細胞不死化^在一實施例中，該方法更 包含（e)建立該不死化產生抗體之細胞之個別單株族群；及 ⑴篩選產生所欲之OX40R抗體的不死化產生抗體之細胞。 核酸、載體、宿主細胞及產生OX40R抗體之重組方法 本揭露内谷之另一態樣提供一種編碼結合分子之胺基酸 序列的經分離核酸分子，該等結合分子與人類〇X4〇R結 合。由該核酸分子所編碼之該胺基酸序列可為完整抗體之 任何部分，例如CDR、包含一、二或三個CDRs之序列、 或重鏈或輕鏈之可變區域’或可為全長重鏈或輕鏈。在一 些實施例中，該核酸分子編碼胺基酸序列，該胺基酸序列 包含⑴抗體11D4或18D8之CDR3區域，尤其為重鏈CDR3 區域；（2)抗體11D4或18D8之重鏈可變區域或輕鏈可變區 域，或（3)抗體11D4或18D8之重鏈或輕鏈。在其他實施例 中’該核酸分子編碼一多肽，該多肽包含選自由SEQ ID NOs : 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、 16、17、18、19、20、21及22組成之群的胺基酸序列。在 其他實施例中，該核酸分子選自由SEQ ID NOS : 1丨、12、 23及24組成之群β 本揭露内容所提供之核酸分子可自任何產生〇X4〇R抗體 之來源中獲得。可藉由標準技術而自產生〇X4〇R抗體之細 136851.doc •32· 200932268 胞中分離出mRNA，利用PCR及文庫（library)構築技術來選 殖及/或擴增mRNA，並利用標準方法來篩選，以獲得編碼 OX40R抗體之胺基酸序列的核酸分子。該mRNA可用以生 成cDNA，以用來進行抗體基因之聚合酶鏈反應（PCR)或 cDNA選殖。在一實施例中，自如上所述表現OX40R抗體 / 之融合瘤獲得該核酸分子，較佳係具有表現人類免疫球蛋 - 白基因之非人類基因轉殖動物細胞作為其所融合搭配物之 融合瘤。在另一實施例中，該融合瘤源自非人類、非基因 ® 轉殖動物。 編碼OX40R抗體重鏈之核酸分子可藉由將編碼該重鏈可 變區域之核酸分子與編碼重鏈恆定區域之核酸分子融合而 構築。同樣地，編碼OX40R抗體輕鏈之核酸分子可藉由將 編碼該輕缝可變區域之核酸分子與編碼輕鍵丨亙定區域之核 酸分子融合而構築。編碼該VH及VL鏈之核酸分子可藉由 將其插入表現載體中而轉換為全長抗體基因，該表現載體 已分別編碼重鏈恆定及輕鏈恆定區域，使得該VH片段可 ❹ 操作連接至該载體中之該重鏈恆定區域（CH)片段，而該 VL片段可操作連接至該載體中之該輕鏈恆定區域（CL)片 ： 段。或者，利用標準分子生物技術，藉由將編碼VH鏈之 , 核酸分子連接（例如接合）至編碼CH鏈之核酸分子，而將編 碼該VH或VL鏈之核酸分子轉換為全長抗體基因。同樣可 利用編碼VL及VH鏈之核酸分子而達成。人類重鏈及輕鏈 十亙定區域基因之序列為此項技術中所知。參見例如Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest， 136851.doc -33- 200932268 第5版，NIH Pbul. No. 91-3242，1991。編碼全長重鏈及/或 輕鏈之核酸分子接著可自該等核酸分子引入其中之細胞中 表現出來且可將OX40R抗體分離。 如下所述，該等核酸分子可用來重組地表現大量之 OX40R抗體。該等核酸分子亦可以用來製造本揭露内容所 / 提供之其他結合分子，例如本文其他處所描述的嵌合抗 -‘ 體、單鏈抗體、免疫黏附素、雙功能抗體、突變抗體以及 抗體衍生物。在一實施例中，核酸分子用來作為特異性抗 ® 體序列之探針或PCR引子。例如，核酸分子探針可在診斷 方法中使用，或核酸分子PCR引子可用來擴增DNA之區 域，尤其係用來分離用以製造OX40R抗體之可變區域的核 酸序列之DNA。 一旦獲得編碼OX40R抗體之VL及VH片段之DNA分子， 則此等DNA分子可進一步藉由重組DNA技術來操作，例如 用以將該等可變區域基因轉為全長抗體鏈基因、轉為Fab 片段基因或轉為scFv基因。在此等操作中，編碼Vl或VH DNA分子可操作連接至編碼另一多肽之另一 DNA分子，例 如抗體恆定區域或指疊連接子（flexible linker)。本上下文 ： 中所使用之此術語”可操作連接"，意指兩個DNA分子連接 , 使得由此兩個DNA分子所編碼之胺基酸序列保持同框（in- frame)。 所分離出之編碼VH區域之DNA分子可藉由將編碼VH之 DNA分子可操作連接至編碼重鏈恆定區域（CHI、CH2及 CH3)之另一 DN A分子而轉為全長重鍵。該人類重鍵恆定區 136851.doc -34- 200932268 域基因之序列係此項技術中已知（參見例如Kabat，E. A.等 人（1991 )Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5版，U.S. Department of Health and Human Services， NIH Publication No. 91-3242)，而包含此等區域之DNA片 段可藉由標準PCR擴增而獲得。該重鏈恆定區域可為 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM 或 IgD 怪定區 域，但最佳係IgGl或IgG2恆定區域。IgGl恆定區域序列可 為任何已知出現於不同個體之間的各種對偶基因或同種異 〇 型（allotype)，例如 Gm(l)、Gm(2)、Gm(3)以及 Gm(17)。此 等同種異型代表IgGl恆定區域中自然發生之胺基酸取代。 對於Fab片段重鏈基因，該編碼VH之DNA可操作連接至僅 編碼重鏈CH1恆定區域之另一 DNA分子。該CH1重鏈恆定 區域可源自任何重鍵基因。 藉由將所分離出之編碼VL區域之DNA分子可操作連接至 編碼輕鏈恆定區域CL之另一DNA分子，可將該編碼VL之 DNA分子轉為全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人類輕 〇 鏈恆定區域基因之序列為此項技術中已知（參見例如Kabat, E. A.等人（1991)Sequences of Proteins of Immunological ： Interest,第 5 版，U.S. Department of Health and Human

Services，NIH Publication No· 91-3242)，且藉由標準PCR 擴增可獲得包含此等區域之DNA片段。該輕鏈恆定區域可 為κ或λ恆定區域。該κ恆定區域可為任何已知出現於不同 個體之間的各種對偶基因，例如Inv(l)、Ιην(2)及Ιην(3)。 該λ恆定區域可源自該三個λ基因中之任一個。 136851.doc -35- 200932268 為產生scFv基因’將編碼Vh-及Vl-之DNA片段可操作連 接至編碼摺疊連接子之另一片段，例如編碼胺基酸序列 (GlycSer)3 ’使得VH及VL序列可表現為連續之單鏈蛋白 質’其中由該摺疊連接子連接vL及vH區域（參見例如Bird 等人（1998) Science 242: 423-426 ; Huston等人（i998)Proc Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 ; McCafferty 等人（1990) Nature 348: 5 52-5 54)。若只使用單一 yH及，則該單鍵抗 體為一價’若使用兩個VH及VL，則該單鏈抗體為二價，若 使用多於兩個VH及VL，則該單鏈抗體為多價。可產生特異 性地結合至OX40R及另一分子的雙特異性或多價抗體。 在另一態樣中，本揭露内容提供了一種載體，其包含上 文所述之核酸分子。該核酸分子可編碼輕鏈或重鏈之一部 分（例如CDR或可變區域）、全長輕鏈或重鏈、包含一部分 或全長之重鏈或輕鏈的多肽、或抗體衍生物或抗原結合片 段之胺基酸序列。將編碼部分或全長結合分子之Dna分子 插入表現載體中以表現結合分子，使得該DNA分子可操作 連接至轉錄及轉譯控制序列。在本上下文中，此術語”可 操作連接"意欲指DNA分子接合至一載體中得該載體中之 轉錄及轉譯控制序列發揮想要的其調節該DNa分子的轉錄 及轉譯之功能。選擇該表現載體及表現控制序列以與所用 的表現宿主細胞相容。表現載體包含例如質體（plasmid)、 反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒（AAV)、植物病毒，例 如花椰菜花葉病毒、菸草花葉病毒、黏質體（c〇smid)、 YACs以及EBV源游離基因組（epis〇me：^可將編碼輕鏈胺 136851.doc • 36 - 200932268 基酸序列之DNA分子以及編碼重鏈胺基酸序列之dna分子 插入不同的載體或相同載體中。該DNA分子係藉由任何適 合的方法來插入該表現載體中（例如於該抗體基因片段及 載體上互補限制位點接合，或若沒有限制位點時則以平端 接合）。 一種適合之表現載體之實例係一個編碼功能完整人類Ch 或匕免疫球蛋白序列之載體，其經基因工程化具有適當之 限制位點’使得任何vH*vL序列可被插入及表現。該表現 載體亦可編碼幫助自宿主細胞分泌抗體鏈之蛋白質序列之 信號肽。編碼抗體鏈之胺基酸序列之DNA可被選殖至該載 體中’使得該信號肽同框連接至該抗體鏈胺基酸序列之胺 基末端。該信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異種 (heterologous)信號肽（亦即，來自於非免疫球蛋白之信號 肽）。 除了編碼0X4 0R抗體胺基酸序列之核酸序列（抗體鏈基 因）外’表現載體帶有控制該抗體鏈基因於宿主細胞中表 現之調控序列。該表現載體之設計，包括調控序列之選 擇’可視諸如待轉化之宿主細胞之選擇 '所欲蛋白質之表 現量等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之調控序列 包含引導哺乳動物細胞中高蛋白質表現量之病毒元件，例 如源自反轉錄病毒LTRs之啟動子（promoter)及/或增強子 (enhancer)、巨細胞病毒（Cmv)(例如CMV啟動子/增強 子）、猴病毒4〇(SV40)(例如SV4〇啟動子/增強子）、腺病毒 (例如腺病毒主要晚期啟動子（AdMLP))、多瘤病毒 136851.doc -37- 200932268 (polyoma)及強哺乳動物啟動子，如天然（native)免疫球蛋 白及肌動蛋白啟動子^對於進一步關於病毒調控元件及其 序列的描述，參見例如美國專利第5，168,〇62、4,51〇,245及 4,968,615 號）。 除了抗體鍵核酸序列及調控序列之外，重組表現載體可 帶有其他序列，例如於宿主細胞中調控載體複製之序列以 及可選擇之標志（marker)基因。該可選擇標志基因幫助選 擇出已引入載體之宿主細胞（參見例如美國專利第 4,399,216、4,634,665及5，179,017號）。可選擇標志基因包 含二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於在dhfr宿主細胞中進 行甲胺喋呤（methotrexate)選擇/擴增）、新黴素磷酸轉移酶 (neomycin phosphotransferase)基因（用於 G418 選擇）及楚胺 酸合成酶基因。該表現載體之設計，包括調控序列之選 擇’可視諸如待要轉化之宿主細胞之選擇、所欲蛋白質之 表現量等眾多因素來定。編碼結合分子之核酸分子及包含 此等核酸分子之載體可用於轉化適合宿主細胞，從而重組 產生結合分子。適合之宿主細胞以一或多個帶有編碼結合 分子胺基酸序列之核酸分子之表現載體來進行轉化，使得 胺基酸序列於該宿主細胞中表現，且一般，將之分泌至培 養該宿主細胞之培養基中’並可自該培養基中回收該胺基 酸序列。宿主細胞之轉化可藉由任何此項技術中已知的方 法來進行，例如美國專利第4,399,216、4,912,〇4〇、 4,740,461及4,959,455號中所揭露之内容。 宿主細胞可為哺乳動物、昆蟲、植物、細菌或酵母細 136851.doc • 38 * 200932268

胞。適合作為宿主細胞之哺乳動物細胞株之實例包括中國 倉鼠卵巢（CHO)細胞、NSO細胞、SP2細胞、HEK-293T細 胞，NIH-3T3細胞、海拉（HeLa)細胞、幼倉鼠腎（BHK)細 胞、非洲綠猴腎細胞（COS)、人類肝細胞癌細胞（例如Hep G2)、A549細胞及許多其他細胞株。昆蟲細胞株之實例包 括Sf9或Sf21細胞；植物宿主細胞之實例包括終草 (Nicotiana)、阿拉伯芥（Arabidopsis)、浮萍、玉米、小 麥、馬鈴薯等；細菌宿主細胞包括大腸桿菌（Ε· coli)及鏈 黴菌（Streptomyees)物種。酵母宿主細胞之實例包括裂殖 性酵母菌（Schizosaccharomyees pombe)、釀酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)及嗜曱酵酵母菌（Pichia pastoris)。 由不同細胞株或基因轉殖動物所表現之結合分子之胺基 酸序列可能會具有不同之醣化作用。然而，所有由本文所 提供之核酸分子所編碼之結合分子或包含本文所提供之胺 基酸序列之結合分子係本發明之一部分，而不管該等結合 分子之醣化如何。 在另一態樣中，本揭露内容提供一種利用噬菌體呈現 (phage display)來製造〇X4〇R抗體或其抗原結合片段之方 法。該方法包含⑷在嗤菌體上合成人類抗體文庫；⑻以 。OX40R或其片段绵選該文庫：⑷分離出結合至〇X4〇r或 八^之巫菌體；及⑷自該嗔菌體獲得該抗體。-種用 來裝備抗體文庫之示範方法包含如下步驟：⑷以〇_&或 、原Ρ刀使包含人類免疫球蛋白基因座之非人類動物免 136851.doc -39- 200932268 疫，以產生免疫反應；（b)自經免疫之動物提取產生抗體之 細胞；（c)自經提取之細胞中分離出編碼OX40R抗體重鏈及 輕鏈之RNA ; (d)反轉錄該RNA以製造出cDNA ; (e)擴增該 cDNA ;及（f)將該cDNA插入噬菌體呈現載體中’使抗體表 現於該噬菌體上。重組人類OX40R抗體或其抗原結合片段 / 可藉由篩選重組組合抗體文庫而分離出。該文庫可為scFv 噬菌體呈現文庫，其利用由自B細胞分離出之nxRNA所製 備出之人類VL及VH cDNA所產生。製備及篩選該等文庫之 © 方法為此項技術中已知。產生噬菌體呈現文庫之套組為市 售得之（例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01 ;及Stratagene SurfZAPTM噬菌體呈現套組，目錄 號240612)〇 在一個情形中，為了分離並製造出具有所欲特性之人類 OX40R抗體，首先將如本文所述之人類OX40R抗體用來選 擇具有相似於OX40R結合活性的人類重鏈及輕鏈序列，其 利用此項技術已知之方法，例如，WO 93/0621 3中所描述 ❹ 之抗原決定基印記（epitope imprinting)法進行。此方法中 所使用之抗體文庫可為scFv文庫，其以W0 92/01047、 '； McCafferty 等人Nature 348: 552-554 (1990)及 Griffiths等人 EMBO J. 12:725-734 (1993)中所描述之方法製備及篩選。 該scFv文庫可利用人類CCR2作為抗原進行篩選。 一旦選擇初始人類VL及VH區域，即執行"混合與匹配"實 驗，其中不同對之初始所選擇之VL及VH片段經篩選用以 OX40R結合以選擇VL/VH對組合。此外，為了進一步提高 136851.doc • 40· 200932268 抗體之品質，該VL/VH對之VL及Vh片段可在Vh及/或VL之 CDR3區域中以類似於活體内體細胞突變過程之過程而被 隨機地突變，該活體内體細胞突變過程造成在自然免疫反 應期間時抗體親和力之成熟。這種活體外親和力成熟可藉

由使用分別互補於VH CDR3或VL CDR3之PCR引子擴增VH 及Vl功能域而完成，其引子在一些特定位置與四種核苷酸 驗基之隨機混合物”攙合（spike)"，使得所得PCR產物編碼 其中隨機突變已被引入至該VH及/或VL CDR3區域之VH及 VL片段。此等隨機突變之％及％片段可經重新篩選以與 0X4 0R結合。 在自重組免疫球蛋白呈現文庫篩選及分離OX40R抗體或 抗原結合部分之後，編碼所選擇之結合分子之核酸可自該 呈現包（display package)(例如自該噬菌體基因體）中回收， 並藉由重組DNA技術再選殖（subclone)至其他表現載體 中。必要時’可進一步操作該核酸以產生其他如下所述之 抗體形式。如上所述’為表現藉由篩選組合文庫而分離出 之重組人類抗體，將編碼該抗體之DNA選殖入重組表現載 體中’並引入哺乳動物宿主細胞中。 醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供一種例如醫藥組合物之組合 物，其包含本發明所提供的結合分子中之一種或組合，且 視情況包含醫藥學上可接受之载劑。該等組合物可以此項 技術所知之習知方法來製備。 在某些實施例中，組合物包含OX4〇R抗體或其抗原結合 136851.doc 200932268 片段°在-特定實施例中，該組合物包含抗體ud4或抗體 刪，或任一上述抗體的抗原結合片段。在其他實施例 中’組合物包含抗體11D4或抗體18D8之衍生物。 術語”醫藥學上可接受載劑"意指任何適用於調配以傳遞 結合分子之非活性物質。載劑可為抗黏劑、黏合劑、膜 崩解劑、填充劑或稀釋劑、防腐劑(例如抗氧化劑、 抗菌劑或抗真菌劑）、甜味劑、延遲吸收劑、潤濕劑、乳

化劑、緩衝劑及其類似物。適當之醫藥學上可接受载劑的 實例包含水、酒精、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二 醇及其類似物）、右旋糖、植物油（例如撖欖油）、鹽水、緩 衝劑、緩衝鹽水及例如糖、多元醇、山梨糖醇及氣化納之 等張劑。 、醫藥學上可接受載劑可為任何適當之形式，例如液體、 半固體以及固體劑型。液體劑型之實例包含溶液（例如可 注射及可輸注溶液）、微乳液、微脂粒、分散液或懸浮 液固體劑型之實例包含鍵劑、丸劑、膠囊、微勝囊及散 劑。適用於傳遞結合分子之組合物的特定形 < 為例如溶 液、懸浮液或分散液之無菌㈣以用於注射或輸注。可藉 由將所需篁之抗體併人適當載劑中，接著以微過滤方式殺 菌來製備無菌溶液。通常，分散液係藉由將抗體併入包含 ，本分散介質及其他載劑之無菌媒劑中而製備。關於用於 製備無菌液體之無菌粉末，其製備方法包含將先前之活性 成刀加上任何額外想要之成分的無菌過濾溶液真空乾燥及 冷凍乾燥（凍乾法）以產生活性成分加上任何額外想要之成 136851.doc •42- 200932268 分的粉末。組合物之各種劑型可以此項技術中所知的習知 技術來製備。

包含在組合物中之結合分子之相對量會視很多因素而改 變’例如視所使用之特定結合分子及載劑、劑型及所要求 的釋放與藥效特性而改變。單一劑型之結合分子的量通常 為產生治療效果的量，但亦可為較少量。此量之範圍相對 於該劑型之總量通常會介於大約〇 〇丨％至大約99%、介於 大約0.1%至大約7〇%或介於大約1%至大約3〇%範圍内。 除了該結合分子，亦可將一或多種額外治療劑包含在該 組合物中。額外治療劑之實例描述如下。包含在該組合物 中之額外治療劑之適當量可易於由熟悉此項技術者選擇， 且會視很多因素而改變，例如視所使用之特定藥劑及載 劑劑型及所要求之釋放與藥效特性而改變。以單一劑塑 所包含的額外治療劑之量通常為該藥劑產生治療效果之 量，但亦可為較少量。 結合分子及醫藥組合物之使用 結合分子及醫藥組合物（包含本發明所提供之結合分子） 係用於治療、診斷《他㈣，例如提高免疫反應、治療 癌症、增進其他癌症治療之功效或增進疫苗功效，且其、结 子亦具有多種用途，例如用作藥劑或診斷劑。因此， 在另一態樣中，本發明揭露内交 句路門谷棱供使用結合分子或醫藥 組合物之方法。 在特定態樣中，提供用以提高 土 . ^ 托网哺礼動物免疫反應之方 法，，、包含投予治療有效量之本 發月揭露内容所提供之、结: 136851.doc •43- 200932268 合分子至該哺乳動物。在一些實施例中，該結合分子係 OX40R抗體或其抗原結合片段，且該哺乳動物為人類。在 另一實施例中，該結合分子係抗體11D4或抗體1 8D8，或 任何上述抗體之抗原結合片段。術語”增進免疫反應”或其 合乎文法之變化意指刺激、引發、增加、改善或加強哺乳 動物免疫系統之任何反應》所述免疫反應可為細胞反應 (亦即細胞介導之，例如細胞毒性T淋巴球介導之反應）或 體液反應（亦即抗體介導之反應），且可為一次或二次免疫 反應。提高免疫反應之實例包含增加之CD4+輔助T細胞活 性及產生細胞溶解性T細胞❶提高免疫反應可藉由使用熟 悉此項技術者所知之若干活體外（in vitro)或活體内（in vivo)量測法來評估’所述量測法包含（但不限於）細胞毒性 τ淋巴球檢定、釋放細胞激素（cytokine)(例如IL_2之產 生）、腫瘤之退化、帶有腫瘤之動物之存活率、抗體產 生、免疫細胞增殖率、細胞表面標誌之表現及細胞毒性。 一般，當相較於未經治療哺乳動物或未使用所申請之方法 治療之動物的免疫反應，所揭露的方法會提高哺乳動物之 免疫反應。在一實施例中，該方法提高細胞免疫反應，特 別係細胞毒性T細胞反應。在另一實施例中，細胞免疫反 應係T辅助細胞反應。在另—實施例中，免疫反應係細胞 激素之產生’特別係IL-2之產生。 在另-特定態樣，本發明之揭露内容提供治療哺乳動物 癌症之方法，纟包含投予治療有效量之本發明揭露内容所 提供的結合分子至該哺乳動物。術語"治療癌症"或"癌症 136851.doc •44· 200932268 ❹

之冶療意指在診斷出有癌症之哺乳動物體内產生令人滿 意或有益效果。該令人滿意或有益效果可包含癌細胞進一 步生長或擴散之抑制、癌細胞之死亡、癌症再發之抑制、 與該癌症相關之疼痛降低或改善動物存活率。癌症再發之 抑制關乎先前經放射線、化療、手術或其他技術治療之癌 症位點及周圍組織。該效果可為主觀或客觀的。例如，若 該動物係人類，則人可能會注意到改善之體力或活力或降 低之疼痛，以作為改善之主觀徵兆或治療反應。或者，基 於身體檢查、實驗參數、腫瘤標誌或χ光線攝影之發現， £»床醫師可能會注意到腫瘤大小或腫瘤負荷之縮減。臨床 醫師可能會觀察對治療的反應之一些實驗徵象包含測試正 規化，例如，白血球細胞計數、紅血球細胞計數、血小板 計數、紅血球沈降速率及各種酶量。或者，臨床醫師可能 會觀察到可偵測到腫瘤標誌減少。或者， 評估客觀改善，例如超音波、核磁共振測試及正 測試。在某些實施例中’該結合分子係本發明所提供之 OX40R抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，該结合 分子係抗體讓或聊，或上述兩抗體中任抗體之= 結合片段。在另-實施例中，哺乳動物為人類。 在另-態樣中，本發明揭露内容提供—種預防哺乳動物 癌症之方法，纟包含投予治療有效量之本發明揭露内容所 提供之結合分子至該哺乳動物。術語”預防癌症"或”癌症 之預防"意指延遲、抑制或預防哺乳動物癌症之發作，其 中癌症或腫瘤之發作並未被證實，但是癌症之傾向已被識 136851.doc -45- 200932268 別，無論藉由例如基因篩選抑或其他方式。術語亦包含治 療具有癌前期症狀之哺乳動物，以停止該癌前期症狀向惡 性腫瘤之進展或導致該癌前期症狀退化。癌前期症狀之實 例包含增生、發育障礙及化生。在某些實施例中，結合分 子係本發明所提供之OX40R抗體或其片段。在另一實施例 中，結合分子係抗體1104或1808，或上述兩抗體中任抗 體之抗原結合片段。在另一實施例中，該哺乳動物為人 類。 各種癌症，無論惡性或良性且無論原發或繼發，可藉由 本發揭露所提供之方法治療或預防。此類癌症之實例包含 肺癌，例如支氣管癌（例如鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細 胞癌及腺癌）、肺泡細胞癌、支氣管之腺瘤、肺軟骨瘤型 錯構瘤（非癌性）以及肉瘤（癌性）；心臟癌，例如黏液瘤、 纖維瘤及橫紋肌瘤；骨癌，例如骨軟骨瘤、軟骨瘤、軟骨 母細胞瘤、軟骨黏液性纖維瘸、骨樣骨瘤、巨大細胞瘤、 軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維 組織細胞瘤、依汶氏瘤（伊汶氏肉瘤）及骨網狀細胞肉瘤； 腦癌，例如神經膠質瘤（如多形性膠質母細胞瘤）、退行性 星狀細胞瘤、星細胞瘤、寡樹突膠質瘤、神經管胚細胞 瘤脊索瘤、許旺氏細胞瘤（Schwannoma)、室管膜瘤、腦 脊膜瘤、垂體腺瘤、松果體瘤、骨瘤、血管母細胞瘤、顱 因e瘤、脊索瘤、胚芽瘤、畸胎瘤、皮樣囊腫及血管瘤； 消化系統癌症，例如平滑肌瘤、表皮樣癌、腺癌、平滑肌 肉瘤、胃腺癌、腸脂瘤、腸神經纖維瘤、腸纖維瘤、大腸 136851.doc -46- 200932268 息肉及大腸直腸癌；肝癌，例如肝細胞腺瘤、血管瘤、肝 細胞癌、纖維板層樣癌、膽管癌、肝原細胞瘤及企管肉 瘤；腎癌，例如腎腺癌、腎細胞癌、腎上腺瘤及腎盂之移 行細胞瘤；膀胱癌；血液癌，例如急性淋巴（淋巴母細胞） 白血病、急性骨髓性（骨髓細胞性、骨髓性、骨髓母細胞 性、骨髓單核細胞性）白血病、慢性淋巴白血病（例如

Sezary症候群及毛細胞型白血病）、慢性骨髓細胞（脊髓 性、骨髓性、粒細胞性）白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍 > 奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、蕈狀肉芽腫及骨髓增生性 疾病（包含例如真性紅血球增多症、骨髓纖維變性、血小 板增多症及慢性骨髓細胞性白血病之骨髓增生性疾病）； 皮膚癌’例如基底細胞癌、鱗狀上皮細胞癌、黑色素瘤、 卡波西氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma)以及柏哲德氏症（Paget，s disease);頭頸癌症；眼睛相關癌症，例如視網膜母細胞 瘤及眼内黑癌；男性生瘦系統癌症，例如良性前列腺增 生、如列腺癌以及睪丸癌（例如精原細胞瘤、畸胎瘤、胚 胎細胞瘤及絨毛膜癌）；乳癌；女性生殖系統癌症，例如 子呂癌（例如子宮内膜癌）、子宮頸癌（子宮頸瘤）、卵巢癌 (印巢瘤）、外陰癌、陰道癌、輸卵管癌及水泡樣胎塊；甲 狀腺癌（包含乳突性、濾泡性、未分化或髓質性癌）；親鉻 細胞瘤（腎上腺）；副曱狀腺之非癌性腫瘤；胰癌；以及血 癌’例如白血病、骨髓癌、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金 氏淋巴瘤。 在特定治療方法中，該等結合分子可單獨投藥作為單一 136851.doc •47· 200932268 治療，或結合一或多種額外治療劑或療法而投藥。因此， 在另一態樣中，本發明之揭露内容提供一種組合療法，其 包含本發明提供之結合分子與一或多種額外療法或治療 劑。術語”額外療法"意指沒有使用本發明所提供之結合分 子作為治療劑之療法。術語，，額外治療劑"意指除了本發明 所提供之結合分子以外之任何治療劑。在某些實施例中， 該結合分子係抗體11D4或抗體18D8，或上述兩抗體中任 抗體之抗原結合片段。在一特定實施例中，本發明之揭露 内容提供一種組合療法以治療哺乳動物癌症，其包含投予 治療有效量之本發明揭露内容所提供的結合分子與一或多 種額外之治療劑至該哺乳動物。在另一實施例中，該哺乳 動物為人類。 可將廣泛多種癌症治療劑與結合分子結合使用。一般熟 悉此項技術者將會瞭解可用來與本發明所提供之方法及结 合分子結合使用之其他現存癌症療法及其發展，且不限於 本文所提出的彼等療法形式。可用於組合療法以治療癌症 之額外治療劑的種類的實例包含（1)化學治療劑，（2)免疫 治療劑，及（3)荷爾蒙治療劑。 術語”化學治療劑”意指可導致癌細胞死亡或干擾癌細胞 生長、分裂、修復及/或功能之化學或生物物質。化學治 療劑之實例包含揭露於WO 2006/088639、WO 2006/ 129163及US 20060153808中之化學治療劑，該等專利之揭 露内容以引用之方式併入本文中。特定化學治療劑之實例 包含：（1)烷基化劑，例如苯丁酸氮芥（LEUKERAN)、間環 136851.doc •48· 200932268 磷醯胺（CYTOXAN)、異環磷醯胺（IFEX)、鹽酸氮芥 (MUSTARGEN)、。塞替派（thiotepa)(THIOPLEX)、鏈佐菌素 (ZANOSAR)、卡氮芥（BICNU、GLIADEL WAFER)、羅莫 司丁（lomustine)(CEENU)及達卡巴仁（dacarbazine)(DTIC-• DOME) ; (2)生物鹼或植物長春花屬生物鹼類，包含細胞 ； 毒性抗生素，例如小紅莓（doxorubicin)(ADRIAMYCIN)、

泛艾黴素（epirubicin)(ELLENCE、PHARMORUBICIN)、柔 紅黴素（daunorubicin)(CERUBIDINE、DAUNOXOME)、奈 © 莫柔比星（nemorubicin)、泛達黴素（idaiubicm)(IDAMYCIN PFS 、ZAVEDOS)、小藍莓（mitoxantrone)(DHAD、 NOVANTRONE)、可美淨（dactinomycin)(放線菌素 D、 COSMEGEN)、普卡黴素（plicamycin)(MITHRACIN)、絲裂 黴素（mitomycin)(MUTAMYCIN)及博來黴素（bleomycin) (BLENOXANE)、酒石酸長春瑞濱（vinorelbine tartrate) (NAVELBINE))、長春花驗（vinblastine)(VELBAN)、長春 新驗（vincristine)(ONCOVIN)及長春花驗酿胺（vindesine) (ELDISINE) ; (3)抗代謝劑，例如截瘤達（capecitabine) (XELODA)、阿糖胞苷（cytarabine)(CYTOSAR-U)、氟達拉 '； 濱（fludarabine)(FLUDARA)、吉西他濱（gemcitabine) 、 (GEMZAR)、羥基脲（hydroxyurea)(HYDRA)、氨甲喋呤 (methotrexate)(FOLEX、MEXATE、TREXALL)、奈拉濱 (nelarabine)(ARRANON)、三曱.曲沙（trimetrexate) (NEUTREXIN)及愛寧達（pemetrexed)(ALIMTA) ; (4)嘧啶 拮抗劑，例如5-氟尿嘧啶（5-FU)、截瘤達（XELODA)、雷 136851.doc -49· 200932268 替曲塞（raltitrexed)(TOMUDEX)、替加氟-尿嘲咬（tegafur-uracil)(UFTORAL)及吉西他濱（GEMZAR) ; (5)紫杉酵類， 例如歐洲紫杉醇（TAXOTERE)、太平洋紫杉醇（TAXOL); (6)鉑藥物，例如順鉑（PLATINOL)以及卡鉑（PARAPLATIN) 以及草酸翻（oxaliplatin)(ELOXATIN) ; (7)拓樸異構酶抑制 ； 劑，例如愛萊諾迪肯（irinotcan)(CAMPTOSAR)、拓撲替康 (HYCAMTIN)、滅必治（etoposide)(ETOPOPHOS 、 VEPESSID、TOPOSAR)及替尼泊甙（VUMON) ; (8)鬼臼素 © (鬼臼毒素衍生物），例如滅必治（ETOPOPHOS、VEPESSID、 TOPOSAR) ； (9)葉酸衍生物，例如亞葉酸（leucovorin) (WELLCOVORIN) ; (10)亞硝基脲，例如卡氮芥（BiCNU)、 洛莫司汀（〇mustine)(CeeNU) ; (11)絡胺酸激酶受體之抑制 劑，包含上皮細胞生長因子受體（EGFR)、血管内皮生長因 子（VEGF)、胰島素受體、類胰島素生長因子受體（IGFR)、 肝細胞生長因子受體（HGFR)及血小板源生長因子受體 (PDGFR)，例如艾瑞莎（gefitinib)(IRESSA)、得舒緩 (erlotinib)(TARCEVA)、硼替左米（Bortezomib) (VELCADE)、 甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate) (GLEEVEC)、 -: genefitinib、拉帕提尼（lapatinib)、索拉非尼（sorafenib)、 .. 沙利竇邁（thalidomide)、纾癌特（sunitinib) (SUTENT)、阿 西替尼（axitinib)、莫須瘤（rituximab)、群司珠單抗 (trastuzumab)(HERCEPTIN)、爾必得舒（cetuximab) (ERBITUX)、貝伐珠單抗（bevacizumab)(AVASTIN)及蘭尼 單抗（ranibizumab)(LUCENTIS)、lym-l(ONCOLYM)、揭露 136851.doc -50- 200932268 於WO 2002/053596中之類胰島素生長因子1受體之抗體 (IGF-1R) ; (12)血管生成抑制劑，例如癌思停（bevacizumab) (AVASTIN)、蘇拉明（suramin)(GERMANIN)、血管抑素、 SU5416、沙利竇邁及基質金屬蛋白酶抑制劑（例如圖巴馬 司他（batimastat)及馬立馬司他（marimastat))及揭露於WO ； 2002055106申之血管生成抑制劑；以及（13)蛋白酶體抑制 ； 劑，例如棚替左米（bortezomib)(VELCADE)。 術語"免疫治療劑"係指可提高哺乳動物免疫反應之化學 © 或生物物質。免疫治療劑之實例包含：卡介苗（bacillus

Calmette-Guerin，BCG);細胞激素，例如干擾素；疫苗， 例如MyVax個人化免疫療法、Onyvax-P、Oncophage、 GRNVAC1、Favld、Provenge、GVAX、Lovaxin C；、 BiovaxID、GMXX及NeuVax ;以及抗體，例如阿來組單抗 (alemtuzumab)(Campath)、貝伐珠單抗（bevacizumab) (AVASTIN)、爾必得舒（cetuximab)(ERBITUX)、吉妥單抗 (gemtuzumab ozogamicin)(MYLOTARG)、替伊莫單抗（ibritumomab ❿ tiuxetan)(ZEVALIN)、帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX)、莫 須瘤（rituximab)(RITUXAN，MABTHERA)、群司珠單抗 '： (trastuzumab)(HERCEPTIN)、托西莫單抗（tositumomab) 、 (BEXXAR)、群梅利珠單抗（tremelimumab)、CAT-3888 及 揭露於WO 2003/040170中之CD40受體之促效劑抗體。 術語"荷爾蒙治療劑"，係指抑制或消除荷爾蒙之產生， 或抑制或對抗荷爾蒙對癌細胞生長及/或存活之作用的化 學或生物物質。適用於本文方法之藥劑的實例包括彼等揭 136851.doc •51 · 200932268 露於US 20070117809中之藥劑。特殊之荷爾蒙治療劑的實 例包含··他莫西芬（tamoxifen)(NOLVADEX)、托瑞米芬 (toremifene)(Fareston)、法洛德（fulvestrant)(FASLODEX)、 阿那曲0坐（anastrozole)(ARIMIDEX)、依西美坦（exemestane) (AROMASIN)、來曲嗤（letrozole)(FEMARA)、醋酸甲地孕 ； 酮（megestrol acetate)(MEGACE)、戈舍瑞林（goserelin) (ZOLADEX)及柳培林（leuprolide)(LUPRON)。本揭露内容 之結合分子亦可與非藥物荷爾蒙治療結合使用，例如：（1) © 移除全部或一部份與荷爾蒙產生有關之器官或腺體之手術 方法，例如卵巢、睪丸、腎上腺及腦垂體；及（2)放射線治 療，病患之器官或腺體受足量之放射線照射，以抑制或消 除目標荷爾蒙的產生。 治療癌症之組合療法亦包括由本揭露内容所提供之結合 分子與移除腫瘤之手術相結合。可於手術之前、期間或之 後，提供此結合分子給該哺乳動物。 治療癌症的組合療法亦包括由本揭露内容所提供之結合 分子與放射線療法相結合，例如電離（電磁）放射線療法（例 如X光或γ射線）及粒子束放射線療法（例如高線性能量輻 ϊ 射）。放射源可位於哺乳動物之外部或内部。可於放射線 , 治療之前、期間或之後，投予此結合分子給該哺乳動物。 所述結合分子及組合物之投藥 本發明所提供的結合分子及組合物可經由任何適當之經 腸或非經腸之投藥路徑而被投予。投藥之術語”經腸路徑 (enteral route)”係指經由腸胃道之任何部分來投藥。腸道 136851.doc -52· 200932268 路徑的實例包含：口服、經黏膜、口腔及直腸路徑，或胃 内路徑。"非經腸路徑（parenteral r〇ute),，之投藥則係指不為 經腸路徑之投藥路徑。非經腸投藥路徑之實例包括：靜脈 内、肌肉内、皮内、腹膜内、腫瘤内、膀胱内、動脈内、 鞘内、囊内、眼内、心臟内、經氣管、關節内、囊下、蛛 網膜下、脊椎内、硬膜外及胸骨内、皮下或局部投藥。本 案所揭露之抗體與組成物可使用任何適當之方法來投藥， 例如經口攝取、鼻胃管、胃造口管、注射、輸注、植入式 輸注幫浦及滲透性幫浦。投藥之適當路徑與方法，可視多 個因素而定，例如所使用之特異性抗體、所需之吸收速 率、所使用之特定調配物或劑型、被治療之疾病之類型或 嚴重程度、特定作用部位、及病患之症狀，並且可以很容 易地由熟悉此項技術者加以選擇。 結合分子的"治療上有效量"係指有效達成所需治療有效 目的之量。舉例而言’於提高免疫反應之上下文中，"治 療上有效a："就是任何能有效刺激、引起、增加、改善咬 增強哺乳動物免疫系統之任何反應的量。於治療癌症之上 下文中，"治療上有效量"就是任何足以產生被治療之哺乳 動物所希望或有益之效果的量，例如抑制癌細胞之進一步 生長或擴散、癌細胞之死亡、抑制癌症復發、降低與癌症 有關之疼痛或改善哺乳動物之存活。在預防癌症之方法 中 ';σ療上有效量為任何能有效延遲、抑制或預防投予 該結合分子之哺乳動物癌症發作的量。結合分子之治療上 有效量的範圍通常為每公斤哺乳動物體重約〇 〇〇1至約5〇〇 136851.doc -53- 200932268

mg ’而更常見為約0.05至約loo mg。舉例而言，該量可為 每公斤哺乳動物體重約0.3 mg、1 mg、3 mg、5 mg、1Q mg、50 mg或100 mg。在某些實施例中，〇X4〇R抗體之 治療上有效量在每公斤哺乳動物體重約〇丨至3〇 mg之範圍 内。投藥之精確劑量含量可易於由熟悉此項技術者加以判 疋’並且將視多個因素’例如被治療之疾病類型或嚴重程 度、所使用之特定結合分子、投藥路徑、投藥時間、治療 持續時間、所使用之特定其他療法、被治療之病患之年 β 齡、性別、體重、症狀、一般健康狀況及先前病史，以及 醫學領域中所熟知之其他因素。 結合分子或組合物通常會於多種時機被使用。單一劑量 之間隔例如可為每週、每月、每三個月或每年。示範性治 療方案之投藥需每週一次、每兩週一次、每三週一次、每 四週一次、每月一次、每三個月一次或每三至六個月一 次。OX40R抗體之典型劑量方案包括經由靜脈内投藥1 mg/kg 0 (體重）或3 mg/kg(體重），其使用下列給藥方案之一：⑴每 四週給六劑量，然後每三個月；（ii)每三週；（iii)每三週， 給3 mg/kg(體重）一次後接著給1 mg/kg(體重）。 :實例 Y 實例1 : OX40R抗體之製備 依據本揭露内容之示範性抗體係如下製備、選擇及測 定： 以OX04R抗原免疫及選擇產生OX04R單株抗醴之小鼠： 人類OX40R之完全人類抗體之製備係使用人類Ig基因轉 136851.doc -54· 200932268 殖小鼠品系HC〇7、HCol2、HCol7與HCo 27，以及人類染 色體轉殖/基因轉殖品系，KM(Medarex，Inc.)。此等品系都 表現與自人類所分離出之抗體無明顯區別之完全人類抗 體。 & 在5亥基因轉殖之品系中，内生性小鼠κ輕鏈基因以及内 ’ 生性小鼠重鏈基因均分別如Chen等人（1993) EMB〇 j : 12:821-830及WO 01/09187之實例1中所述被同型結合地阻 斷。此外，他們帶有如Fishwild等人（1996) Nature β Biotechnology 14:845-851中所述之人類κ輕鏈轉殖基因， KCo5。相反地，該基因轉殖品系之間關於人類重鏈基因 有區別。如美國專利第5,545,806、5,625,825及5,545,80號 7中所述，HCo7品系帶有HCo7人類重鏈轉殖基因；如|〇 01/09187之實例2所示，HCol2品系帶有HCol2人類重鏈轉 殖基因；如Deshpande等人US 2005/0191293A1之實例8中 所述，HCol7品系帶有HCol7人類重鏈轉殖基因；如於 2008年8月8日申請之PCT/US2008/072640之實例5中所述， HCo27品系帶有HCo27人類重鏈轉殖基因。如Ishida等人 (2002)，Cloning and Stem Cells，4: 91-102 中所述，KM品系 ·: 帶有人類微染色體。

HuMab小鼠之一般免疫方案在Lonberg等人（1994) Nature 368 (6474): 856-859 ; Fishwild 等人（1996) Nature

Biotechnology 14: 845-851 ;及 PCT publication WO .98/ 24884中有描述。 HCo7、HCol2、HCol7、HCo27及 KM品系之HuMab小鼠 136851.doc -55- 200932268 於6-16週齡時開始以15-25 0§之經純化人類重組〇又4〇尺-18 蛋白進行免疫’且轉染鼠科pre_B細胞，300-19(Reth，Μ. G.等人 ’ Nature 312 29: 418-42，1984; Alt，F.等人，Cell 27: 381-390，1981) ’以於Ribi佐劑中表現人類〇X40R。經 純化人類重組〇X40R-Ig蛋白係人類〇X4〇r之細胞外功能域 ： (胺基酸卜220)與人類IgGl之恆定區域融合之構築體。以3- ； 28天之間隔’經由腹膜内注射、皮下注射或注射至腳墊 (footpad)進行投予’最高至總計1〇次之免疫作用。免疫反 © 應如下所述地以ELISA及FACS篩選進行監控。 選擇產生〇乂0411抗髏之HuMab小鼠： 為了選擇產生結合至OX04R之抗體之HuMab小鼠，自經 免疫之小鼠中獲得血液，並以ELISA來分析對於經純化人 類OX04R重組蛋白之特異性結合，並以FACS來分析對於 表現全長人類OX04R之細胞株之結合，而非結合至不表現 OX04R之對照組細胞株。

Fishwild 等人於（1996)，Nature Biotechnology 14: 845-_ 851中描述ELISA結合檢定法。簡言之，將含有1 pg/ml之 純化重組OX40R-Ig之PBS溶液以50微升/孔之量塗佈於微 -； 滴定盤，並於4°C培養隔夜。接著使用溶於PBS/Tween 、 （0.05%)中之5%雞血清，以200微升/孔之量將此等孔進行 阻斷。把來自經OX40R免疫之小鼠之稀釋血漿加入每個孔 中，並於環境溫度下培養一小時。以PBS/Tween清洗此等 微滴定盤，接著以結合有辣根過氧化酶（HRP)之山羊抗人 類IgG Fc多株抗體於室温中培養一小時。在清洗過後，利 136851.doc -56- 200932268 用 ABTS受質（Moss Inc.，product #: ABTS-1000 mg/ml)來顯 示該等盤，並於OD405下以分光光度計進行分析。 FACS檢定係以習知程序來執行。簡言之，表現OX40R 之300-19細胞以1:20稀釋之來自經免疫小鼠之血清進行培 ’ 養。將細胞清洗且以FITC標記之抗人類IgG抗體來偵測特 異性抗體結合。在FACS流式細胞儀（Becton Dickinson，San ： J〇se，CA)上進行流式細胞分析。 將顯示出最高力價（titer)之OX40R抗體之小鼠用來進行 © 融合。如下所述進行融合，而將融合瘤上清液（supernatant) 以ELISA及FACS來測定抗OX40R之活性。 生成產生OX40R人類單株抗體之融合瘤 將以上選擇之小鼠於處死並移除脾臟及/或淋巴結之前3 天由靜脈内方式進行OX40R-Ig之加強免疫，然後之前2天 再一次進行加強免疫。 根據標準流程或製造商所建議之流程，使用電融合⑺-fusion, Cyto Pulse™ technology, Cyto Pulse™ Sciences, Inc.，Glen Burnie，MD)來將由經免疫之HuMab或KM小鼠分 離出之脾臟細胞及/或淋巴結淋巴細胞與SP2/0非分泌性小 ； 鼠骨髓瘤細胞（ATCC，CRL-1581)融合。簡言之，製備來自 、 經免疫小鼠之脾臟細胞及/或淋巴結淋巴細胞之單一細胞 ' 懸浮物，並接著將其與相同數量之SP2/0非分泌性小鼠骨 髓瘤細胞結合；接著執行電融合。 該等細胞接著以2 X 1 04個細胞/孔之量塗於平底微滴定 盤，並於選擇性之培養基中培養10-14天，該選擇性之培 136851.doc -57- 200932268 養基包含 10%胎牛血清、10% P388D1(ATCC，CRL-TIB-63) 條件培養基、3-5% (IGEN) DMEM(Mediatech，Herndon, VA，目錄號CRL 10013，具有高含量葡萄糖、L-麩胺酸及 丙酮酸鈉）、7 mM HEPES、0.05 5 mM 2-巯基乙醇、〇.1 IU/mL盤尼西林-0.1 mg/mL鏈黴素及lx HAT (Sigma，目錄 / 號 CRL -P-7185)。 ； 在1-2週後，將細胞培養在以HT置換HAT之培養基中。 在細胞塗佈後近乎10-14天，篩選個別孔中之上清液其係 © 否存在人類γ、κ抗體。判定為人類γ、κ陽性（positive)之上 清液接著以ELISA及FACS進行人類OX40R單株IgG抗體之 篩選（使用上述流程）。將分泌抗體之融合瘤轉移至24孔之 盤中，進行再次篩選且，若確認為人類OX40R單株IgG抗 體陽性，則以極限稀釋法（limiting dilution)進行至少2次之 次選殖（subclone)。將穩定之次純系接著以活體外之方式 培養，以於組織培養基中產生小量抗體用以進一步表徵。 實例2 :生物學/藥理學實例 Α.活體外研究程序 舆OX40R之細胞外功能域結合：人類〇X40R-Ig融合蛋 ·； 白以 pH 9.4之 BupHTM破酸鹽緩衝液（Pierce，Rockford，IL) ^ 稀釋，以100微升/孔（0.25 pg/ml)之量塗覆於96孔之

Maxisorb盤（Nunc，Roskilde，Denmark)中，並於4°C 中培養 隔夜。以包含 0·05% Tween 20(Sigma，St Louis，MO)且稀釋 於PBS(Sigma, St Louis, MO)之清洗緩衝液清洗板3次，並 以 0.5%溶於PBS之BSA (Sigma，St Louis，MO)以 300 μΐ/孔 136851.doc -58 - 200932268 之量於室溫中進行一個小時之阻斷。接下來，清洗該等盤 並以不同濃度（1〇〇微升/孔）之稀釋於阻斷緩衝液中之抗人 類OX40R反應抗體培養並於室溫中培養一小時。接著再清 洗該等盤，以溶於阻斷緩衝液、濃度為25 ng/ml且標記有 辣根過氧化酶（HRP)之抗人類κ鏈抗體（Bethyl Laboratories， Montgomery, TX)於室溫中培養一小時。最後，清洗該等 分析盤並加入100微升/孔之1-Step Turbo-TMB受質（Pierce, Rockford，IL)，並置於室溫30分鐘。藉由加入等體積之2 Μ H2 S〇4來終止反應，並於Molecular Devices Spectra Max 340(Molecular Devices, Sunnyvale，CA)上以 450 nm讀取吸 光值。 FACS為基礎之結合至細胞表面OX40R:利用OX40R表 現細胞株（見如下）或活化之初級周邊血液單核細胞（見如 下）來評估對人類及獼狼（cynomolgus)OX40受體之結合。 收集細胞並於室溫下使用清洗緩衝液清洗細胞（5 xlO5個/ 管）。該清洗緩衝液由PBS、2%之熱去活性胎牛血清 (Hyclone，Logan, UT)及0.02%之疊氮化鈉（sodium azide) (Sigma，St. Louis，MO)組成。接著，將100 μΐ不同濃度之 抗體加入細胞中（起始以30 pg/ml之濃度進行3倍滴定法）， 該等細胞係以包含 0.005 mg/ml之 cytocholasin B(Sigma, St. Louis，MO)之清洗緩衝液稀釋。於室溫中溫和地晃動該等 細胞三小時。接著清洗該等細胞兩次，並將細胞以0.5 毫升/管重新懸浮於冷清洗緩衝液中，收集10,000個結果並 使用 Becton Dickinson FACSCalibur 及 CellQuest 軟體（San 136851.doc -59- 200932268

Jose，CA)進行分析。

Biacore分析法：生物感應器生物特異性相互作用分析 儀（Biosensor biospecific interaction analysis instrumen) (BIAcore 2000)使用表面電漿共振以量測分子於cM5感測 晶片上之相互作用。由分子與感測晶片之葡聚糖側之相互 •： 作用所引起的兩個介質-玻璃及羧甲基化葡聚糖 ·· (carboxymethylated dextran)-之間折射係數的改變係如製 造商之應用手冊中所詳細描述加以量測並以隨意之反射係 〇 數單位（RU)之變化報導。

於CM5感測晶片上之羧甲基化葡聚糖表面因〇2 M N_乙 基-Ν'-(二曱胺基丙基）碳化二亞胺介導之〇 〇5 μ N-羥基_號 拍酿亞胺之衍生化而被活化7分鐘。以5 μΙ/min之速率將濃 度為500 pg/ml、溶於1〇 mM醋酸鈉、pH 4.5之抗生蛋白鍵 菌素（Sigma S-4762)注射到三個表面上（流動細胞-2，3及 4)，並以接近2500RU，s使其共價固定（Covalentiy immobilized)於流動細胞表面。在固定期間，將35 μΐ之1〇 mM醋酸鈉緩衝液注射於流動細胞·丨上以替代抗原，進而 形成活化之空白表面以量測非特異性結合。在所有四種流 '： 動細胞上未反應之N-羥基琥珀醯亞胺酯之去活化係使用pH 、 8.5、1 Μ之乙醇胺鹽酸鹽（ethanolamine hydrochloride)來進 行。在固定之後’以5次再生注射5 μ1、50 mM之氫氧化 鈉’直到得到穩定之基線，來清潔掉流動細胞之任何未反 應或結合不佳之材料。 生物素化（Biotinylated)之 CD134-muIg(Ancell 513-030) 136851.doc •60· 200932268 以10 pg/rnl之濃度、5 μΐ/min之速率手動注射於流動細胞-2、3及4上以得到3種表面密度：Fc-2 = 150RU、Fc-3=375RU及Fc-4=5 80RU。製備出不同密度之表面以監控締 合階段期間之質量運輸受限結合以及解離期間之重新結合 ' 的可能性，必須避免受到表面密度影響之兩種人工製品。 ；- 一系列OX40R抗體之稀釋液於電泳缓衝液（running buffer)(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% polysorbate 20 (v/v))中在 666 nM至 66 pM濃度範圍 © 内以半對數（half logs)之方式製備。將流速設為5 μΐ/min， 且將25 μ 1之每個濃度點樣本注射於感測晶片上，在每個 濃度抗體之注射之間具有5 μΐ、50 mM之氫氧化鈉之再生 注射。解離時間為5分鐘。以BIAevaluation 3.0 global fit 軟體分析數據（每個濃度點分開分析）。 抗原決定基表徵：將表現對應於0X40 1-235胺基酸序列 (細胞外及穿膜結構域）以及CD40 216-278胺基酸序列（細胞 内結構域）之重組人類〇又40-0040融合構築體的300-19細 胞用以進行抗體抗原決定基分析。表現OX40-CD40之細胞 株生長於RPMI培養基（Gibco，Grand Island, NY)中，其添 ·; 加有 10%胎牛血清（Hyclone, Logan, UT)、10 mM hepes、 ^ 1%盤尼西林-鍵徵素（penicillin-streptomycin)、2 mM L-楚 醯胺酸（L-glutamine)、0.1 mM非必需胺基酸以及0.05 mM 2-疏基乙醇（Gibco，Grand Island, NY)。以3 ml冰冷之清洗 緩衝液（PBS，2% FBS及0.02%疊氮化鈉）清洗300-19.hCD13 4.2細胞（5xl05個/管）。吸出細胞上清液，並將含 136851.doc -61 - 200932268

有300 pg/ml初始未結合之0X40反應抗體之100 μΐ清洗缓 衝液加至細胞沈澱物中，混合並於4°C下培養30分鐘。接 著，在試管中加入螢光標記之二級抗體，混合並於4°C下 再培養30分鐘。與0X40反應之螢光標記抗體包括10 μΐ以 藻紅蛋白（phycoerythrin，ΡΕ)標記之 Ber Act 35 (Caltag /- Laboratories，Burlingame, CA.)、PE-標記之 L106 (BD ; Pharmingen，San Jose, CA)或與 Alexa Fluor 647 結合之 OX40R抗體。OX40R抗體係利用Alex Fluor 647蛋白標記 ® 套組如製造商（Molecular Probes，Eugene，OR)所述標記榮 光物。進行螢光染色後，隨後以清洗緩衝液清洗細胞三 次，重新懸浮於冰冷之清洗緩衝液中，且收集10,000個結 果以 Becton Dickinson FACSCalibur 及 CellQuest軟體（San Jose，CA)進行分析。當一級抗體阻擋80%以上之二級螢光 物標記抗體之染色時，視為抗體與相同抗原決定基結合。 抗體0X40配位體-OX40R抑制檢定：測試抗體阻斷300-19人類0X40配位體（L)表現細胞與經0X40人類IgG 1融合蛋 ❹ 白塗佈之培養盤結合的能力。300-19-OX40L細胞株生長於 RPMI培養基（Gibco，GrandIsland,NY)中，其添加有 10%胎 ·： 牛血清（Hyclone，Logan，UT)、10 mM HEPES、1%盤尼西 .· 林-鏈徵素（penicillin-streptomycin)、2 mM L-麵醯胺酸⑺- glutamine)、0.1 mM非必需胺基酸、0·05 mM 2-酼基乙醇 及 0.5 mg/ml 遺傳徽素（Geneticin)(Gibco，Grand Island, NY)。0X40人類IgGl融合蛋白含有細胞外0X40蛋白質之 前220個胺基酸。該融合蛋白質在塗佈緩衝液（BupH，碳酸 136851.doc -62- 200932268 鹽-碳酸氫鹽緩衝液，Pierce，Rockford, IL)中以1 00微升/孔 (5 pg/ml)之濃度塗佈於Nunc Maxisorb培養盤（Nunc, Roskilde，Denmark)上，並於4°C下培養隔夜。接著，在紙 巾上吸乾培養盤，以200微升/孔之阻斷緩衝液（稀釋於PBS 中之5%淡奶）阻斷並於室溫下培養2小時。以PBS清洗培養 ； 盤，接著將以PBS稀釋之各種抗體稀釋液（50微升/孔）加入 ： 檢定培養盤，並在室溫下培養30分鐘。接著，在PBS中之 細胞以50微升/孔之量在6x 105個/孔濃度下加入含有抗體之 © 孔中，並在5% C02潮濕腔室中在37°C下再培養置60分鐘。 以PBS溫和地清洗培養盤兩次，以去除非黏附細胞，且藉 由在每個孔中加入200微升20 pg/ml二乙酸螢光素 (Fluorescein Diacetate)(Sigma，St. Louis，MO)PBS溶液來量 測孔中之細胞活性。將培養盤在5% C02潮濕腔室中於37°C 下培養90分鐘，利用分光光度計在490時（Spectra Max 340, Molecular Devices，Sunnyvale, CA)讀取數值。 OX40R抗體選擇性檢定（ELISA):以100 μΐ人類TNFa受 體家族成員融合蛋白塗佈Maxisorb 96孔盤（Nunc，Roskilde, Denmark)，該融合蛋白以0.25 pg/ml稀釋於pH 9.4之 BupHTM碳酸鹽緩衝液（Pierce, Rockford，IL)中，將其在4°C , 下培養隔夜。受到測試之選擇性受體融合蛋白包括CD40-Ig (Alexis Biochemicals, San Diego, CA) ' CD137-Ig (R&D Systems, Minneapolis, MN)及 CD271-Ig(Alexis Biochemicals, San Diego，CA)。同時亦包括作為每個檢定之正對照之 OX40-Ig融合蛋白（内部構築體，Bioexpress, 97/2117)。隨 136851.doc -63- 200932268 後以 PBS 中稀釋之含有 0.05% Tween 20(Sigma，St Louis， MO)之清洗緩衝液將培養盤清洗三次，並在室溫下以300 微升 0,5% BSA(Sigma，St Louis, MO)之 PBS(Sigma，St Louis，MO)溶液阻斷一小時。接著清洗培養盤並將各種濃 . 度之抗-人類0X40反應抗體以100微升/孔加入培養盤中， ； 並於室溫下培養一小時。將培養盤徹底地清洗三次，且在 ： 室溫下以25 ng/ml辣根過氧化酶標記之抗-人類κ鏈抗體 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)偵測 0X40抗體結合 © 歷時一小時。隨後在將培養盤清洗三次，然後在室溫下加 入 100微升/孔之卜Step Turbo-TMB 受質（Pierce, Rockford, IL)歷時30分鐘。藉由加入等體積之2 Μ硫酸使反應終止。 在波長 450 nm 於 Molecular Devices Spectra Max 340(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上讀取吸光值。 物種交又反應：表現OX40R之細胞株：300-19細胞株表 現重組人類OX40-CD40融合構築體或整個獮猴OX40R蛋白 質，該重組人類OX40-CD40融合構築體對應於OX40R(細 〇 胞外與穿膜結構域）之1-235以及CD40(細胞内結構域）之 216-278 。 人類T淋巴球之製備：如製造商之敘述，將人類全血收 集至肝素化針筒（Baxter; Deerfield，IL)中，並隨後立刻移 入 Sigma Accuspin tube(Sigma，St. Louis, MO)中，以分離 周邊血液單核細胞（PBMC) » PBMC以DPBS清洗兩次，且 如製造商（R & D Systems，Minneapolis，MN)所述利用 T細 胞純化管柱分離T淋巴球。簡言之，將PBMC重新懸浮於2 136851.doc -64 · 200932268 ml之管柱緩衝液中，並裝入經預洗之T細胞分離管柱中。 PBMC在室溫下培養10分鐘，以管枉緩衝液溶離Τ細胞，清 洗一次並以2xl06/ml重新懸浮於TCM中，該TCM由添加有 10%胎牛血清（Hyclone，Logan, UT)之RPMI 1640 (Sigma, St Louis，MO)及 2 mM L-麵醯胺酸（L-glutamine)、10 mM Hepes、100 U/ml盤尼西林（penicillin)以及 50 ug/ml鏈徵素 (streptomycin)(Gibco，Grand Island, NY.)組成。將含有 1 ug/ml抗-人類 CD28抗體（純系 37407，R & D Systems， Minneapolis, MN)之2 ml體積的T細胞加入預先塗以抗-人 類 CD3抗體純系 UCTH1(R & D Systems，Minneapolis, ΜΝ) 之24孔盤之孔中，該抗-人類CD3抗體以5 pg/ml溶於PBS 中。在以流式細胞儀測試人類0X40交叉反應之前，將T細 胞培養物刺激3天。 獮猴PBMC之製備：利用肝素化真空採血管（BD; Franklin Lakes，NJ)獲得獮猴全血，並以1:4稀釋於PBS 中。混合稀釋後之全血並取出15 ml小心地鋪在等體積之 Histopaque 1077(Sigma, St Louis, MO)上。以 100〇xg在室 溫下將管離心45分鐘，收集單核PBMC界面，以PBS清洗 一次並以ACK溶解緩衝液（Biosource, Rockville，MD)在室 溫下重新懸浮2分鐘以去除任何RBC。PBS清洗後，計數 PBMC並以組織培養基（TCM)重新調整為ΙχΙΟ6個/ml。TCM 由下列成份所組成：添加有10%胎牛血·清（Hyclone，Logan， UT)之 RPMI 1640(Sigma，St Louis，MO)及 2 mM L-麵醯胺 酸、10 mM Hepes、100 U/ml盤尼西林、購買自Gibco 136851.doc -65- 200932268 (Grand Island，NY)之50 ug/ml鏈徽素。接著，將含有抗-人 類 CD28 交叉反應抗體（純系 CD28.2，BD Biosciences, San Diego，CA)之 2 ml 之 PBMC 製劑加入 24 孔盤（Costar， Corning，NY)之孔中，該培養盤事先以抗-猴CD3抗體（純系 FN1 8, Biosource，Camarillo, CA)塗佈，該抗-猴 CD3抗體以 ； 10 pg/ml溶於PBS中。PBMC培養物在利用流式細胞儀測試 : 人類0X40交又反應之前刺激4天。 兔子PBMC之製備：以肝素化真空採血管（BD; Franklin © Lakes，NJ)收集兔子全血並立刻以1:3稀釋於HBSS(Gibco,

Grand Island，NY)中。混合後，取5 ml稀釋後之血液小心 地鋪在等體積之 Lympholyte-Rabbit(Cedarlane Laboratories， Westbury，NY)上，並在25°C下離心30分鐘。收集PBMC界 面，以PBS清洗兩次並於含有10 ng/ml PHA(Remel, Lenexa, KS)之TCM中將其以2xl06個/ml之濃度重新懸浮。 將細胞培養24至48小時。 狗PBMC之製備：以肝素化真空採血管（BD; Franklin φ

Lakes, NJ)收集狗全血。接著，將血液與等體積之溫暖 HBSS(Gibco，Grand Island，NY)混合。取4 ml稀釋後之血 液，在15 ml錐形離心管中小心地鋪在3 ml之Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories，Westbury, NY)上。將離心管在 80〇xg下離心20分鐘並收集PBMC界面，以HBSS清洗兩次 並於TCM中將其以2xl06個/ml之濃度懸浮。將PBMC細胞 以2毫升/孔加入24孔盤之孔中，並以2 pg/ml ConA(Sigma, St. Louis, MO)刺激細胞48小時。 136851.doc -66 - 200932268 鼠科及大鼠PBMC之製備：以肝素化針筒收集大鼠全血 並以1··3稀釋於暖HBSS中。接著，取5 ml稀釋後之血液小 心地舖在等體積之 Lympholyte-Rat(Cedarlane Laboratories, Westbury，NY)上。將管在1500 RPM下離心20分鐘。收集 PBMC界面，清洗兩次並將細胞沈澱物以TCM重新調濃度 ； 為2xl06個/ml。將2 ml之細胞加入24孔盤之每個孔中，並 : 在流式細胞儀染色前以10 ng/ml PHA(Remel，Lenexa，KS) 刺激24-48小時。 © 用於物種交又反應之流式細胞儀染色：將經刺激之小 鼠、大鼠、兔子、狗及獼猴之PBMC與表現獼猴0X40受體 之3 00-19細胞株用於測試人類0X40抗體物種交叉反應。將 表現人類0X40之活化T淋巴球與轉殖〇χ4〇之300-19細胞用 作正對照。細胞（5.0 X 105個/管）以冰冷之清洗緩衝液 (PBS，2% FBS及0.02%之疊氮化鈉）清洗一次，且在每個 離心管中加入與Alexa Fluor 647結合之1〇〇微升/管對照或5 ug/ml 0X40反應性抗體。如製造商（Molecular Probes， Eugene，OR)所述，抗體係利用Alex Fluor 647蛋白質標記 套組標記。將細胞與螢光物標記抗體在黑暗中於冰上培養 30分鐘，清洗三次且重新懸浮於0.5 mi清洗煖衝液中以供 分析。利用 Becton Dickinson FACSCalibur與 CellQuest軟體 ' (San Jose, CA)進行抗體染色之量測與分析。 螢光素酶活性檢定：製備含有0X40細胞外結構域及 CD40細胞内結構域之293T細胞，該細胞内活性區域與含 有螢光素酶之NfkB報導基因融合。收集細胞，清洗並懸浮 136851.doc -67- 200932268 於不含酚紅之完全培養基（含有10%胎牛血清、HEPES緩衝 液、非必需胺基酸及L-麩醯胺酸之DMEM)中，密度為 0·5χ106個細胞/毫升。取80 ul之細胞塗於96孔盤 (PerkinElmer, parts number 6005680)之每個檢定孑L 中。 單獨或在交聯抗體Fab'山羊抗-人類IgG(Jackson ; ImmunoResearch，West Grove, PA)存在時，於每個孔中加 ： 入測試抗體。將培養盤在37°C下培養隔夜。在次日加入 100 ul之榮光素酶（Promega，Bright-glo luciferassay system， ❹ 目錄號E2620)，並利用閃爍計數器（TopCount，Packard- NXT)量測螢光素酶活性量。 人類 aCD3 IL-2檢定•·以肝素化（Baxter; Deerfield, IL)針 筒收集人類全血，將其鋪在Accuspin管（Sigma; St. Louis, MO)上，在2000 rpm下離心1 5分鐘。收集白企球層細胞 (buffy coat) ’ 以 PBS(Sigma; St· Louis，MO)清洗，並以水 溶解紅血球。利用富集人類CD3+之管柱（R&D; Minneapolis，MN)將T細胞分開，計數細胞並以RPMI培養 基（Gibco; Grand Island，NY)調整為 lxl06/ml，該 RPMI 培養 基包含：10% 胎牛血清（Hyclone; Logan，UT)、10 mM ·; hepes、1 % 盤尼西林-鏈黴素（penicillin-streptomycin)、2 mM L-麩醯胺酸及0.1 mM非必需胺基酸（均購自Gibco)。同 時，人類抗-CD3s純系 #UCHT1(R&D systems，Minneapolis， MN)以 2·5 pg/ml 溶於 PBS中，置入24 孔盤（Costar; Coring, NY)中並在37°C下培養2小時。以PBS將培養盤清洗三次， 並在各孔中加入以下成分：lx 106/孔T細胞、連續稀釋之 136851.doc -68- 200932268 0X40抗體（或IgG2 KLH對照）及F(ab')2山羊抗人類IgG Fey 以進行交聯（加入2.5 ug/mL) »在48及72小時取出上清液， 並以ELISA(R&D)評估IL-2含量。 獮猴aCD3 11^_2檢定：以肝素化管（BD; Franklin Lakes, ’ NJ)收集獼猴全血，以1:4稀釋於PBS中，並將其鋪在 ,: Histopaque 1 077(Sigma; St. Louis，MO)上，在 2200 rpm下 ； 離心45分鐘。收集白血球層細胞，以PBS清洗，並以水溶 解紅血球。將細胞密度調整至1 X 106/ml，並加入24孔盤 © 中，該等24孔盤係以不同濃度之猴抗-CD3，純系FN-1 8 (Biosource; Camarillo, CA)在37°C下預塗佈2小時。將連續 稀釋之0X40抗體（或IgG2 KLH對照）以及2.5 ug/mL F(ab')2 山羊抗人類IgG FcY加入孔中。在24及48小時收集上清 液，並以ELISA(Biosource，Camarillo，CA)評估 IL-2 含量。 同種異艟抗原引發之T細胞檢定：將新鮮分離之人類T 細胞（見上）與經絲裂黴素c處理之同種異體腫瘤細胞（Raji) 一起培養3-4天。隨後收集、清洗T細胞’且在以11D4刺激 之前，在新鮮培養基中保持一天。24小時後以ELISA(R&D systems，Minneapolis，MN)評估 IL-2之含量。 B.活艘内研究程序 使用移植人類T細胞與樹突狀細胞之小鼠的SCID-beige 人類腫瘤模型：SCID-beige 小鼠（Taconic # CBSBG-MM)在 來到後利用前先適應5-7天。使用以下之腫瘤細胞株： RAJI (ATCC # CCL-86)、BT-474 (ATCC # HTB-20)、PC-3 (ATCC # -1435)以及 LoVo (ATCC # CCL-229)。 136851.doc -69- 200932268 如下自人類血液中製備經純化之τ淋巴細胞（τ細胞）與來 源於單核細胞之樹突狀細胞：使用Sigma Accuspin Tubes # A7054離心管自肝素化之血液中收集人類單核細胞。將細 胞收集’置於T75長頸瓶中，並在37。〇下於5% c〇2條件下 之潮濕培養箱中培養3小時。收集非黏附細胞並保存（見 下）°含有黏附細胞之長頸瓶以20 ml含有10%胎牛血清之 RPMI完全培養基培養’該培養基補充有1〇 ng/mi IL_4 (R&D)及 100 ng/ml GM-CSF(R&D)。將培養物在 37°C 下在 5°/〇 C〇2之條件下的潮濕培養箱中培養6_7天。隨後，利用 傾析及以RPMI完全培養基沖洗長頸瓶數次，收集來源於 非黏附單核細胞之樹突狀細胞。 依照製造商之指示使用T細胞富集管柱（R&D)經由高親 和性負選擇而使用初始之非黏附單核細胞來將T細胞純 化。將經純化T細胞以1 〇7/ml低溫保存於回收細胞培養基 中並儲存於液氮中直至使用。以0.2 mL/小鼠，將腫瘤細胞 (1 xlO7)與來自相同供體之T細胞（1x106)及來源於單核細胞 之樹突狀細胞（5 X 105)經皮下注射《腫瘤生長係以游標尺隨 時間監測》 C.抗體11D4之結果 (1)活艎外研究： 抗體11D4在活體外研究中之某些特性概括於表3中。 抗體11D4以高親和性與OX40R結合。 以下實驗利用包含OX40R細胞外結構域之IgGl融合蛋白 顯示於全細胞（OX40R+轉染細胞與活化原發性T細胞）。在 136851.doc -70· 200932268 利用IgGl融合蛋白之實例中’ 11Ε>4與〇X4〇R細胞外結構域 以0.5+/-0.18 Mg/mL(3.5 ηΜ)之EC5〇結合。此結合在表現 0乂4011全長細胞外結構域之3〇〇_；19前-；3細胞（卩代-8〇6118)上 得以確遇（未在母體3〇〇-19細胞上觀察到結合）。與〇X4〇R 轉染細胞結合之ECs。為0·2+/_0.16 gg/mL(1 7 nM)。為了確 認結合係在原發性T細胞上觀察到，周邊血液T細胞自多個 :人類供體中分離，並以抗（：1)3及抗CD28刺激兩天，以提高 OX40R之表現。關於此等τ細胞之飽和結合數據顯示11D4 ® 以0.6+/_1.0 Mg/mL(4.0 nM，N=17 位供體）之 EC5〇結合。此等 數據說明11D4與OX40R迫切結合。 為了進一步表徵此種結合，收集數據以評估丨1D4在 OX40R細胞外結構域上相互作用之區域，且亦判定受體是 否在結合後内在化。與OX40R IgGl融合蛋白之競爭性結 合數據顯示，11D4競爭結合表現〇Χ40配位體之細胞，提 供11D4在受體之配位體結合區域相互作用之證據。另外， p WFACS分析評估時，11D4不與兩種市售OX40R抗體，

BerAct35及Ll〇6交互競爭結合τ細胞。利用非競爭偵測抗 體之FACS分析顯示，在將原發性、活化τ細胞與11D4預先 培養30分鐘後，OX40R沒有内在化。利用OX40R細胞外結 '： 構域蛋白作為固定配位體由Biacore分析所確定之結合親和 性顯示11D4結合之平衡解離常數（KD)為0.48 nM。此等分 析亦預測11D4之解離速率常數（kd)將為5.72 E-05 Ι/s。因 此’ 11D4以高親和性與〇X4〇R之配位體結合區域結合，具 有慢之解離速率常數，且在結合後不會内在化受體。 136851.doc 200932268 抗體11D4選擇性與OX40R結合 11D4對於OX40R之選擇性係利用與包含相關受體之各別 細胞外結構域之IgGl融合蛋白構築體相關之數據相對 TNFR超家族之其他成員來評估。此等受體包括CD40受 體、4-1BB受體（CD13 7)以及神經生長因子受體（CD271)。 ； 在所有情形中，關於此等受體之濃度高達100 pg/mL(700 ： nM)時，沒有觀察到明顯之結合。與OX40R融合蛋白 (EC5〇=0.5 ug/ml)觀察到之結合比較時，此等數據說明 © 11D4比測試之其他相關家族成員對於OX40R有大於100倍 之選擇性。（參見圖la及lb) 抗體11D4之功能活性 11D4之功能活性在OX40R+轉染細胞及原發性T細胞中 顯示。在此等檢定中，當添加至含有或不含二級抗體 (F(ab’）2山羊抗人類IgG Fey)之細胞中時，11D4表現促效活 性。 在第一組實驗中，利用轉染OX40R細胞外及穿膜結構域 之293細胞評估11D4之促效活性，該OX40R細胞外及穿膜 結構域以NFkB螢光素酶報告基因與CD40之細胞内結構域 ： 融合。在這個檢定中，11D4藉由OX40R以平均0.33 , Mg/mL(2.2 nM, N=4)之EC5〇增強信號。以11D4誘導螢光素 酶之代表性濃度-反應曲線顯示於圖2中。在F(ab’）2二級抗 體不存在時，螢光素酶活性之強度隨著EC5〇降低4倍。 抗原特異性T細胞之產生可作為11D4促效活性之另一個 證據。新鮮分離之人類_T細胞與經絲裂黴素c(mitomycin c) 136851.doc -72- 200932268 處理之同種異體腫瘤細胞（Raji)一起培養34天。之後收集 、、田胞進行清洗，並在以11D4刺激之前，在新鮮培養基 中保持一天。FACS分析顯示，即使在保持後，此等細胞 中仍有高OX40R表現量。11D4誘導此等細胞產生高含量 IL_2，有些情況下超過100 ng/mL(圖3)。這種反應在兩個 刀開實例中之平均EC50為0.008+/-0.006 pg/mL。在11D4不 存在時’此等細胞僅分泌最少含量之IL-2。 11D4亦在以抗_CD3刺激之原發性人類τ細胞中增強IL_2 之產生。雖然由於單獨以抗CD-3誘導IL-2，這個檢定之信

雜比在某些檢定中很低，但在添加F(ab,)2山羊抗人類lgQ

Fey時，i1D4增強IL_2產生。在抗cd_3f存在時，在新鮮 分離之T細胞中上，觀察不到11D4之活性。IL_2被11D4增 加之量值’視供體與由抗_CD3產生IL_2之數量而定，範圍 係單獨利用抗-0〇3之2.3至57倍。圖4顯示11〇4對於以2.5

Mg/mL抗-CD3刺激由原發性人類τ細胞產生IL-2之作用（使 用1:3稀釋比例之8點濃度曲線）β自使用8點濃度反應曲線 之數據所計算出之平均ECw為〇.〇42+/-〇·〇ι叫/„^(參見表 4) 〇 11D4對於產生IL-2之功能活性亦利用猴細胞進行檢定， 該等細胞以抗-CD3與11D4(連同F(ab')2:級抗體）刺激。結 果表示於圖5及表5。此等數據顯示11D4之EC5〇在猴與人類 細胞中類似（〇,〇22 vs 0.042 pg/mL(人類細胞）），但上述單 獨以抗-CD3所誘導IL-2之量值在利用獮猴T細胞誘導時明 顯較少（大約35倍，人類細胞（N=21) IL-2為5762+Λ4748 136851.doc -73· 200932268 pg/mL vs 獮猴細胞（N=9)IL-2為 261+/-294 pg/mL)。 物種交又反應 評估11D4與來自多個物種T細胞之結合能力。自小鼠、 大鼠、兔子、狗及猴中分離T細胞，並以抗_CD3加抗-CD28或有絲分裂原活化τ細胞。如FACS分析所顯示，沒有 觀察到與小鼠、大鼠、兔子或狗細胞之結合。缺乏與小鼠 OX40R結合之情形’亦可利用含有鼠科〇X4〇R細胞外結構 域之市售融合蛋白以ELIS A加以確認。相反，如由FACS之 飽和結合檢定所確定，11D4卻與獮猴T細胞結合。利用不 同猴所獲得之EC5〇值之範圍顯示於圖6中。為了比較，利 用人類細胞所獲得之ECm值範圍顯示於圖7中。雖然可 變，但ECm值之範圍在猴與人類細胞之間類似（猴平均值 0.354 pg/mL vs人類細胞平均值 〇 566 Mg/mL)。 (2)活艘内研究： 對於11D4缺乏與鼠科〇X4〇R交又反應之情形，需要利用 嚴重混合型免疫不全（SCID)beige小鼠開發異源基因 (xenogenic)腫瘤模型。SCID_beige小鼠缺乏鼠科t&b淋巴 細胞與ΝΚ細胞，而使其成為人類免疫細胞移植與人類腫 瘤生長之理想接受纟。呈現不β腫瘤類型 < 四種腫瘤細胞 株在這個活體内模型中加以測試。沒有任何一種腫瘤細胞 株表現OX40R。在所有情況下，腫瘤細胞（1><1〇7)都與來自 同-供體之T細胞(lxl〇6)及來源於單核細胞之樹突狀細胞 (5xl05)經皮下注射。如表6所示，在此等模型中以腹膜内 (IP)注射之方式所投予之11D4能抑制腫瘤生長達到98%。 136851.doc •74- 200932268 由於11D4容易投予且在周邊血液中快速散布，因此選擇腹 膜内注射内途徑投予。 11D4在SCID-beige小鼠中對抗B細胞淋巴瘤之功效： 給SCID-beige小鼠皮下同時注射Burkitt，s B細胞淋巴 瘤，Raji ’與人類T細胞及來源於單核細胞之樹突狀細 胞。在注射腫瘤時，小鼠接受11D4或同型對照抗體（igG2 抗-KLH)之一次腹膜内注射。如圖8所示，11D4在測試動 物中降低腫瘤生長之速率。每隻個別動物（N= 1〇)在激發 (challenge)後第21天之腫瘤大小顯示於圖9中，說明1〇 mg/kg之劑量在腫瘤生長時顯示64%之抑制作用。T細胞與 樹突狀細胞不存在時，則未觀察到活性。 11D4在前列腺腫瘤棋型中之功效： 給SCID-beige小鼠皮下同時注射前列腺腺癌pc-3與人類 T細胞及來源於單核細胞之樹突狀細胞。在注射腫瘤時， 小鼠接受11D4或同型對照抗體（IgG2抗-KLH)之一次腹膜内 注射。結果如圖10所示，其顯示11D4處理對於腫瘤生長產 生劑量相關性抑制作用。此研究中每隻個別動物（N==1〇)在 激發後第2 7天之腫瘤大小顯示於圖11中，當投予動物一次 1.0 mg/kg之11D4注射時顯示70%之腫瘤生長抑制作用， 而在10 mg/kg之劑量時顯示90%之抑制作用。此等動物中 在第27天所確定之1 lD4ir漿含量在劑量1 .〇 mg/kg時為6.2 pg/mL 〇 11D4在大腸癌腫瘤模型中之功效： 給SCID-beige小鼠皮下注射大腸直腸癌l〇v〇與人類τ淋 136851.doc 75· 200932268 巴細胞及來源於自體單核細胞之樹突狀細胞。在注射腫瘤 時，小鼠接受11D4或對照抗體（IgG;^^_KLH)之一次腹膜内 注射。結果如圖12所示，其顯示11〇4在此等動物中劑量相 關性降低腫瘤生長。此研究中每隻個別動物（N=1 〇)在激發 後第27天之腫瘤大小顯示於圖13中，顯示一次丨〇 mg/kg 之劑量對於腫瘤生長有64%之抑制作用，而在丨〇 〇 mg/kg 之劑量時對於腫瘤生長有87%之抑制作用。 11D4在乳癌模型中之功效： 給SCID-beige小鼠皮下注射乳癌bT474與人類T淋巴細胞 及來源於自體單核細胞之樹突狀細胞。在注射腫瘤時及3 〇 天後再次，小鼠接受11D4或對照抗體（Ig〇2抗-KLH)之兩次 腹膜内（IP)注射。結果顯示於圖14中，其顯示11D4在此等 動物中降低Μ瘤生長。此研究中每隻個別動物（N=1〇)在激 發後第85天之腫瘤大小顯示於圖1.5中，其顯示1 〇.〇 mg/kg 之劑量對於腫瘤生長有98%之抑制作用，而在i mg/kg之劑 量時有85%之抑制作用。 D.抗體18D8之結果 (1) 活體外研究： 抗體18D8在活體外研究中之結果概括於表7中。 抗體18D8對於抗-CD3所誘導之由來自不同供體之原發 性人類T細胞產生誘導IL-2的作用亦顯示於表8中。 (2) 活體内研究： 18D8在SCID-beige小鼠模型中對抗B細胞淋巴瘤之功效 給SCID-beige小鼠皮下注射Burkitt’s B細胞淋巴瘤， 136851.doc -76- 200932268

Raj i，與人類T淋巴細胞及來源於自體單核細胞之樹突狀 細胞。在注射踵瘤時，.小鼠接受1 8D8或同型對照抗體 (IgG2抗-KLH)之一次腹膜内注射。此研究中每組使用十隻 動物。表9呈現兩次研究之結果。結果顯示，18D8在劑量 為1.0 mg/kg及10 mg/kg時產生明顯之抗腫瘤功效。τ細胞 與樹突狀細胞不存在時未觀察到活性，表示此抗腫瘤效果 係免疫介導的。 18D8在SCID-beige小氣模型中對抗前列腺踵瘤之功效 給SCID-beige小鼠皮下注射前列腺癌pc-3與人類T細胞 及來源於自體單核細胞之樹突狀細胞。在注射腫瘤時，小 鼠接受18D8或同型對照抗體（igG2抗-KLH)之一次腹膜内 注射。該研究中每組使用十隻動物。結果顯示於表9中。 結果顯示18D8處理在劑量為〇.1 mg/kg、1.〇 mg/kg以及1〇 mg/kg時，分別對於腫瘤生長產生42%、9〇%及88%之抑制 作用。 寄存資訊 申请人已將含有編碼抗體UD4重鏈之質體的大腸桿菌 DHa5培養物以及含有編碼抗體11 輕鏈之質體的大腸桿 菌DHa5培養物，於2007年7月1〇日寄存於維吉尼亞州，馬 那薩斯大學大道10801之美國菌種保存中心（American巧… Culture collections « ATCC » 10801 University Boulevard, Manassas，VA) ’分別分配為寄存編號pTA_8524及 8525。$專利程序及依據其之規定起見（布達佩斯條約）， 此等寄存物係遵照布達佩斯條約關於微生物寄存國際認證 136851.doc -77· 200932268 之條秋來產生。此等寄存物將不受atcc寄存處之限制而 、寺0年之期間、《在最近一次請求後維持5年或維持在 專利，有效期間’三者取其較長者，而且在此期間若該寄 、°行則被替換。根據其專利法，寄存材料之有效性並不 被解釋為可違反在任何國家權力機構所准予之權利而實施 該專利。

本說明書中所有引用之參考文獻，包括但不限於，所有 明文公開案、專利、專利申請案、書籍、期刊係藉由引 用的方式完全併入本說明書中。在本文中對於參考文獻之 討論僅為了概括其作者所持之觀點，且任何參考文獻不允 許構成先前技術。 雖然為了理解明確性之目的，前述發明已藉由示範與舉 例之方式在一些細節加以描述，在本文教示下對一般熟悉 此項技術者而言顯而易見的是’因此在不脫離附加之申請 專利範圍之精神或範圍的情況下’可對本發明進行某些改 變及修飾。 136851.doc -78- 200932268 表1. 11D4及18D8抗體之序列辨識符號 序列編號 抗體 序列 1 11D4 VHCDR1胺基酸 2 11D4 VH CDR2胺基酸 3 11D4 VH CDR3胺基酸 4 11D4 VLCDR1胺基酸 5 11D4 VL CDR2胺基酸 6 11D4 CDR3胺基酸 7 11 D4 VH胺基酸 8 11D4 W胺基酸 9 11D4 重鏈胺基酸 10 11D4 輕鏈胺基酸 11 11D4 VH核酸 12 11D4 核酸 13 18D8 VHCDR1胺基酸 14 18D8 VH CDR2胺基酸 15 18D8 VH CDR3胺基酸 16 18D8 VlCDRI胺基酸 17 18D8 CDR2胺基酸 18 18D8 CDR3胺基酸 19 18D8 VH胺基酸 20 18D8 胺基酸 21 18D8 重鏈胺基酸 22 18D8 輕鏈胺基酸 23 18D8 Vh核酸 24 18D8 乂1^核酸 136851.doc -79- 200932268 表2A. 11D4抗體之胺基酸序列

描述 序列 (可變區域在上，恆定區域在下，下劃線為CDR區域） 重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVROAP GKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTTSRDNAKNSTYT OMNST ；RDF.D TAVYYCARESGWYLFDYWGOGTLVTVSS fgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtl tnisrtpevtcvwdvshedpevgfnwyvdgvevhnaktkpreegfnstfrwsvltwhqdwlngkeyk ckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenny Icttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk 輕鏈 DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPEK APKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCOOYNSYPPTFGGGTKVIKrtvaaDSvfifbDsdeelksetaswcllnnfv preakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglss pvtksfhrgec

136851.doc •80- 200932268 表2B. 18D8抗體之胺基酸序列

描述 序列 〔可變區域在上，恆定區域在下，下劃線為CDR區域） 重鏈 RVOT.VFSGrTGT.VOPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVROAPG KGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNS LRAEDTALYYCAKDOSTADYYFYYGMDVWGOGTTVTVSSastk gpsviplapcsr stsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlgssglyslsswtvpssnfgtqtytcn vdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvsh edpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrwsvltwhgdwlngkeykckvsnkglpa piektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgiypsdiavewesngqpennykttp pmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk 輕鏈 EIVVTOSPATLSLSPGERATLSCRASOSVSSYLAWYOOKPGOAP RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLRPEDFAVYYCOORSNWPTFGOGTKVEIKrtvaaDsvfifpDS deqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadye khkvyacevthqglsspvt ksfnrgec 136851.doc -81 - 200932268 表3. 11D4抗體某些活體外特性之概括 參數 活性 pg/ml (nM) 對於OX40R之親和性：（Biacore) KD 解離速率(kd) 0.07 0.48 5.7E-051 與OX40R之結合： 融合蛋白細胞外結構域 飽和結合(EC50): 以CD3/CD28刺激之T細胞(N=l 7) OX40R+ 300-19細胞(N=5) 0.5 +/- 0.18 3.50 0.6 +/- 1.00 4.00 0.2 +/-0.16 1.70 OX40R+轉染細胞之活體外刺激 (螢光素酶)(EC5D;N=4) 0.33 +/- 0.22 2.20 增強T細胞活性： -經CD3誘導之IL-2產生(N=12) -由經抗原引發之細胞刺激IL-2產生(N=2) 0.042+/- 0.01 0.30 0.008+/- 0.006 0.04 選擇性(結合） (CD40、CD137、CD271) >100 pg/mL >700.00

數值以平均值+/-—個標準誤差表示 136851.doc 82- 200932268 表4.11D4抗體對於由原發性人類T細胞產生抗-CD3誘導之 IL-2的作用

EC50 (μR/mL) 最大IL-2 (pg/mL) ECmax 〇g/mL) 刺激指數 供體 0.008 4831 0.05 3.8 1 0.011 5450 0.05 2.6 2 0.014 6571 0.5 2.3 3 0.014 7271 0.05 5,9 4 0.011 6313 0.05 9.1 5 ND ND ND 7.0 6 0.010 1006 0.05 4.8 7 ND ND NfD 5.9 8 ND ND ND 25.4 9 ND ND NO 57.0 10 ND ND ND 8.3 11 ND ND ND 5.1 12 ND m ND 2.7 13 ND ND ND 4.6 14 0.014 4687 0.05 6.0 15 0.014 3012 0.05 35.2 16 ND ND ND 21.4 17 0.029 2796 0.125 3.8 18 0.052 1718 0,125 5.5 19 0.020 14190 0.56 16.8 20 0.068 1611 1.67 7.9 21 最大IL-2 :對於單獨之抗-CD3，以11D4在ECmax產生IL-2 之量 ECmax :對於單獨之抗-CD3，產生最大IL-2量之11D4濃度 刺激指數：以11D4所產生之最大量IL-2與單獨使用抗-CD3 產生IL-2之量的比率 ND=未確定 136851.doc -83 - 200932268 最後四位供體（18-21)之數值來自1:3或1:4稀釋比例、以八 點構成之劑量反應曲線；所有其他數值表示對數稀釋曲 線。1:3 及 1:4 濃度曲線之 EC5〇 為 0.042+/-0.01 ug/mL， N=4。 表5. 11D4抗體對於由獮猴T細胞產生抗-CD3誘導之IL-2的 作用 EC50 (pg/mL) 最大IL-2 誘導之 (pg/mL) ECmax (pg/mL) 刺激指數 供體 0.007 376 0.05 3_5x 32750 0.002 116 0.05 2_2x 2325 ND ND ND 2.Ox 32405 0.007 167 0.05 34.4 32081 0.011 978 0.005 5.6x 32842 ND m ND 6.3x 2325 0.008 40 0.021 2.7x 33081 0.031 168 0.062 5.Ox 33080 0.028 128 0.062 3.8x 33062

最大IL-2 :對於單獨之抗-CD3，以11D4在ECmax產生IL-2 之量 ECmax :對於單獨之抗-CD3，產生最大IL-2量之11D4濃度 刺激指數：以11D4所產生之最大量IL-2與單獨使用抗-CD3 產生之量的比率 ND=未確定 表6中最後三位供體（33081、33080及33062)之數值來自 1:3稀釋比例、以八點構成之劑量反應曲線。所有其他數 值表示對數稀釋曲線。得自利用1:3稀釋比例之濃度曲線 之 EC50為 0.022+/-0.01 ; N=3。 136851.doc -84- 200932268 表6.在移植人類T細胞與樹突狀細胞之sCID-beige小鼠中， 抗體11D4對於人類腫瘤生長之抑制作用 腫瘤類型 11D4給予時間 研究持續 時間 10 mg/kg 1.0 mg/kg 0.1 mg/kg 0.01 mg/kg Raji:B細胞淋巴瘤 第1天 21天 64% 42% 27% ad Raji:B細胞淋巴瘤 第1天 21天 nd 75% 42% 8% Lovo :大腸癌 第1天 25天 76% 44% 20% nd Lovo :大腸癌 第1天 25天 87% 64% 15% nd PC3 :前列腺 第1天 27天 90% 77% 45% ad PC3 :前列腺 第1天 27天 90% 70% 50% nd BT474 :乳房 第1天及第30天 85天 98% 85% 46% nd ❹ 數值=在研究終止時所確定之對腫瘤生長之抑制百分比 未確定 表7·抗體1 8D8活體外研究之結果 參數 活性 μβ/ml (nM) 對於OX40R之親和性(Biacore): KD 0.49 3.38 解離速率(kd) 2.9E-04 1/s 與OX40R之結合(EC50): -融合蛋白質細胞外結構域 -飽和結合： 0.034+/-0.01 0.23 以CD3/CD28刺激之T細胞(N=4) 1.06+/-0.51 7.30 OX40R+ 300-19細胞(^=2) 0.24+/-0.09 1.66 增強T細胞活性(EC50): -經CD3誘導之IL-2產生(N=4) 0.049+/-0.06 0.33 -由經抗原引發之細胞刺激IL-2產生(N=l) 0.014+/-0 0.10 選擇性 (與CD40、CD137、CD271 結合）： >100 μβ/mL >700.00

以pg/ml表示之活性數值代表平均值+/-—個標準誤差。 136851.doc •85- 200932268 表8.抗體18D8對於由原發性人類τ細胞產生抗_CD3誘導 之IL-2之作用

ECso 最大IL-2 (pg/mL) ECmax 刺激指數 供體 (pg/mL) (pg/rnL) 0.013 1120 0.05 13.7 LC 0.024 4334 0.5 5.1 ΓΗ 0.024 2280 0.5 5.4 ΚΟ 0.135 1356 •~ _ 0.5 2.4 RN 最大IL-2 :對於單獨之抗_CD3，以產生il-2 ECmax :對於單獨之抗-CD3 ’產生最大IL-2量之18D8濃度 刺激指數：以18D8所產生之最大量匕-2與單獨使用抗-CD3 產生之IL-2之量的比率。 數值表示對數稀釋曲線。 表9.在SCID-beige小鼠中，抗體18ϋ8對於人類腫瘤生長 之抑制作用 腫瘤類型 18D8給手—時間 研究持續 18D8 之劑量(mg/kg) 時間 10 1.0 0.1 0.01 Raji: B細胞淋巴瘤 第1天〜— 23天 73% 73% 11% nd Raji: B細胞淋巴瘤 第1天 ' 24天 54% 59% nd nd PC3 :前列腺 第1天 24天 88% 90% 42% nd 數值=在研究終止時所確定之對腫瘤生長之抑制百分比 nd=未確定 【圖式簡單說明】 圖la與圖lb係顯示與OX40R特異性結合之抗體11D4之 136851.doc -86 - 200932268 ryi · 園， 圖2係顯示交聯抗體11D4對OX40R刺激之螢光素酶活性 之作用的圖； 圖3係顯示抗體！ i D 4對同種異體抗原引發之τ細胞產生 IL-2之作用的圖； 圖4係顯示抗體11D4對由原發性Τ細胞產生之抗CD3誘導 之IL-2之作用的圖； 圖5係顯示抗體11D4對由獮猴原發性T細胞產生抗cD3誘 & 導之IL-2之作用的圖； 圖6顯示使用來自以抗-CD3及抗-CD28所刺激之14個供 体之獮猴PBMC之抗體11D4的飽和結合曲線； 圖7 ”’、頁不使用來自以抗_ C d 3及抗-C D 2 8所刺激之1 7個供 體之人類PBMC之抗體11D4的飽和結合曲線； 圖8為顯示抗體11D4對SCId小鼠中之B細胞淋巴瘤Raji 生長之作用的圖； _ 圖9為顯示在腫瘤注射21天後，抗體UD4對b細胞淋巴 瘤Raji生長之作用的圖； 圖1〇為顯示單一注射抗體11D4對SCID小鼠前列腺腫瘤 : PC-3生長之作用的圖； :圖11為顯示在腫瘤注射27天後，抗體11D4對SCID小鼠 前列腺腫瘤PC-3生長之作用的圖； 圖12為顯示抗體11D4對SCID小鼠直腸癌LOVO生長之作 用的圖式； 圖13為顯示在腫瘤注射25天後，抗體11D4對SCID小鼠 136851.doc -87 - 200932268 直腸癌LOVO生長之作用的圖； 圖14為顯示抗體11D4對SCID小鼠乳房腫瘤BT474生長之 作用的圖；及 圖15為顯示抗體11D4對SCID小鼠乳房腫瘤BT474生長之 作用的圖。

136851.doc -88- 200932268 序列表 <110> 1.美商美達瑞克斯公司 2.美商輝瑞大藥廠 <120>人類0X40受體之結合分子 <130> PC33601 <140> 097148544 <141> 2008-12-12 <150> 61/013,947 <151> 2007-12-14 <160> 24 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213>人類 <400> 1 Ser Tyr ser Met Asn 1 5 <210> 2 <2U> 17 <212> PRT <213>人類 <400> 2 Tyr lie Ser Ser Ser Ser Ser Thr lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val * 5 10 15 1 Gly <210> 3 <2U> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 3 Glu ser Gl) 1 <210> 4 <21X> XI <212> PRT <213> 人類 <400> 4

Arg Ala Ser Gin Gly lie Str Ser Trp ueu Ala 1 5 10 <210> <211> <212> 57 p

RT 136851-序列表.doc 200932268 <213> 人類 <400> 5

Ala Ala Ser ser Leu Gin ser <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213>人類 <400> 6

Gin Gin Tyr Asn ser Tyr Pro Pro Thr <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213>人類 ❹ <400> 7

Glu val Gin Leu val Glu str Gly Gly 6ly Leu val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser cly Phe Thr Phe ser ser Tyr 20 25 30 ser Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45

Ser Tyr lie ser Ser Ser ser Ser Thr lie Asp Tyr Ala Asp ser val 50 5Ϊ 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu val Thr val ser Ser 115 <210> δ <211> 107 <212> PRT <213>人類 2- 13685卜序列表.doc 200932268 <400> 8 asp lie Gin Met Thr Gin ser Pro ser ser Leu Ser Ala ser val Gly 1 ^ 5 10 15

Asp Arg val Thr i7e Thr cys Arg Ala ser Gin Gly lie ser ser Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Glu Lys Ala Pro Lys ser Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu G>n Ser ely Val pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 ser Gly ser Gly Thr Asp Pbe Thr Leu Thr lie Ser ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Gly Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr pro Pro

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vaT Glu lie Lys 100 105 <210> 9 <211> 444 <212> PRT <213>人類 <400> 9

Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr phe ser ser Tyr 20 25 30 ❹ ser Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu clu Trp val 35 40 45 ser Tyr rle ser Ser ser ser ser Thr lie Asp Ala Asp Ser val

Lys Gly Arg phe Thr lie Sir Arg Asp Asn Ala Lys Asn ser Leu Tyr 65 70 75 s〇

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp elu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 85

IV

Ala Arg Glu ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 l〇5 U〇 136851 -序列表 200932268

Leu val Thr val ser Ser Αΐ·β Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro 115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg ser Thr ser Glu ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr val ser Trp Asn 145 150 155 160 ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gin ser ser Gly Leu Tyr ser Le：u Ser Ser Val Val Thr val Pro Ser ser 180 185 190

Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr cys Asn Val Asp His Lys Pro ser 195 200 205 ❿

Asn Thr Lys val Asp Lys Ttr val Glu Arg Lys cys cys val Glu cys 210 235 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 pro Pro Lys pro L^s Asp Tlr Leu Met lie ser Arg Thr· Pro Glu val 250 255

Thr cys val val val Asp v<l ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe 260 265 270

Asn Trp Tyr val Asp Gly Vfl Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro 275 280 285 ❹

Arq Glu Glu Gin Phe Asn s«：r Thr Phe Arg Val val Ser val Leu Thr 290 2<<5 300 val val His Gin Asp Trp letu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val 305 310 315 320 ser Asn Lys Gly Leu Pro a'a Pro lie Glu Lys Thr lie ser lvs Thr ho 335

Lvs Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu pro ser Arg 1 340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn G'n val Ser Leu Thr Cys Ιβυ Val Lys Gly 136851-序列表.doc -4- 200932268 355 360 365

Phe Tyr Pro ser Asp lie A>a val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 370 375 380

Glu Asn Asn Tyr lvs Thr Ttr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly ser 385 B90 395 400

Phe Phe Leu Tyr ser Lys u.u Thr Val Asp Lys Ser A「g Trp Gin Gin 405 410 415

Gly Asn val Phe Ser cys ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430

Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly tys 435 440

❹ <210> 10 <211> 214 <212> PRT <U3>人類 <400> 10

Asp lie Gin Met Thr Gin 5€r Pro Ser ser Leu ser Ala Ser val Gly 15 10 15

Asp Arg val Thr lie Thr Cvs Arg Ala ser Gin Gly lie Ser ser Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala pro Lys ser Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala ser Ser Leu Gin ser Gly Val Pro ser Arg Phe Ser Gly 50 5f 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Pbe Thr leu Thr lie ser ser Leu Gin Pro 65 7〇 75 80

Clu Asp Phe Ala Thr Tyr T>r cys Gin Gin Tyr Asn sen Tyr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu tys ser Gly 115 120 125

Thr Ala S«r Val Val cys l^u Leu Asn Asn Phe Tyr pro Arg Glu Ala 136851-序列表.doc 200932268 130 135 140

Lys val Gin Trp Lys val Λ,ρ Asn Ala Leu Gin Ser G!y ash Ser ?ln

Glu Ser Val Thr Clu Gin A5p Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His l^s val Tyr

Ala Cys Glu val Thr His Gfn Gly leu 5er Ser Pro val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu cys 210

<210> 11 <211> 354 <212> DNA <213>人類 <400> 11 gaggtgcagc tggtggagtc tggoggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catagactac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attattgtgc gagagaaagc ggct卯tacc tctttgacta ctggiggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213>人類 <400> 12 gacatccaga tgacccagtc tccr^tcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca gagaaagccc ctaagtccct gatrtatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tggciacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a <210> 13 <211> 5 136851-序列表.doc 6- 200932268 <l±d> PRT <213>人類 <400> 13

Asp Tyr Ala Met His <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213>人類 <4〇0> 14

Gly He ser Trp Asn ser Gly ser lie Gly Tyr Ala Asp ser val 15 10 15

Gly <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> 人類 <400> 15

1 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> 人類 <400> 16

Asp Gin Ser Thr Ala Asp T>r Tyr phe Tyr Ty「 Gly Met Asp val ^ 5 10 15

Arg Ala ser Gin Ser val Ser ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213>人類 <400> 17

Asp Ala Ser Asn Arg Ala tIt <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213>人類 <400> 18 136851-序列表.doc 200932268 cm cm Arg Ser fn Trp P〇> Thr <210> 19 <211> 124 <212> PRT <213>人類 <400> 19

Glu Val Gin leu Val Glu ser cly Gly Gly

Leu val Gin Pro gy Arg

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ata A7a 5|r Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg GTn Aja Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val ser Cly He ser Trp Asn ser Gly Ser He Gly T^r Ala Asp ser val

Lys Gly Arg phe Ttir lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tvr 65 70 75 $6

Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr cvs 85 90 95

Ala Lys Asp Gin ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr ely Met asd 100 l〇5 110 K val rnp Glyolncly Thr rPr val Thr val ser Ser ❹ <210> 20 <211> 106 <212> PRT <213>人類 <400> 20

Glu lie Val val Thr Gin s«r Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser pro Gly 1 5 l〇 15

Glu Arg Ala Thr Leu ser c^s Arg Ala ser Gin ser val ser ser Tyr 20 25 3〇

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin i^s Pro Gly Gin Ala p「〇 Arg uu Leu lie 35 ' 40 45 136851-序列表.doc 200932268

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Al« Thr Gly lie pro Ala Arg Phe ser Gly 50 55 6〇 ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu Glu Pro 65 70 75 8〇

Glu Asp Phe Ala val Tyr T>r cys Gin Gin Arg ser Asn Trp Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys VcT Glu lie Lys 100 105 <210> 21 <211> 450 <212> PRT <213>人類 <400> 21

Clu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Arg 1 S 10 15 ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp val A「g Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu T「p val 35 40 45

Ser Gly lie ser Trp Asn Ser Gly Ser lie Gly 5i T^r Ala Asp Ser val

Lys Gly Arg Phe Thr lie s,r Arg Asp Asn Ala Lys ASn Ser Leu T^r

Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr T^r Cys 85 90 ❹

Ala Lys Asp Gin ser Thr a'a Asp Tyr Tyr Phe TVr Tyr Cly Met Asp 100 105 no val Trp Gly Girt Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 QTy Pro ser val Phe Pro lru Ala Pro Cys ser Arg ser Thr Ser Glu

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Crs Leu val Lys Asp Tyr phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 9 - 136851 -序列表.doc 200932268 val Thr val ser Trp ash ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr 165 170 175

Phe Pro Ala val Leu Gin ser ser Gly leu Tyr Ser Leu Ser ser val 180 185 190 val Thr val Pro ser ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr cys Asn 195 200 205 val Asg His Lys Pro ser Ain Thr Lys Val Asp L^s Thr Val Glu Arg

Lys Cys cys val Glu cys pro pro cys pro Ala Pro pro val Ala Gly 225 2B0 235 240

Pro ser val Phe Leu Phe pro pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys Val val val Asp val Ser His Glu 260 265 270

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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Ar 290

Clu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg 300

Val Val Ser val leu Thr νεί val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys cys Lys Val Set Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glw 325 330 335

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Thr Leu Pro pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val ser Leu 355 360 365

Thr cy. Leu val Lys cly Phe Tyr Pro ser Asp lie Ala val Glu Trp

Glu Ser Asn Gly Gin Pro G'u Asn Asn Tyr tys Thr Thr pro Pro Met 385 390 395 400

Leu Asp ser Asp Gly ser phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp 405 410 415 136851-序列表.doc -10 200932268

Lys ser Arg Gin Gin G>y Asn Val Phe Ser cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser P「〇 435 440 445

Gly Lys 450 <210> 22 <211> 213 <212> PRT <213>人類 <400> 22

Glu lie Val Val Thr Cln ser pro Ala Thr Leu ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu ser cy-s Arg Ala Ser Gin Ser Val ser ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin l>s Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

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Phe Gly Gin Gly Thr Lys V<1 Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110

Ser val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys ser Gly Thr 115 120 125

Ala Ser val val cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr pro Arg Glu Ala lys 130 1:5 140 val Gin Trp Lys val Asp Afn Ala Leu Gin ser Gly Asn ser Gin Glu 145 150 155 160

Ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp ser Thr Tyr ser Leu ser ser 165 170 175 136851-序列表.d〇c -11 - 200932268

Thr Leu Thr Leu ser Lys AM Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr Ala 180 185 190 cys <31 u val Thr His Gin GTy Leu Ser ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys <210> 23 <2X1> 372 <212> DNA <21J>人類 <400> 23

gaagtgcagc tggtggagtc tgg&ggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct ccagggaagg gcctggaatg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat ctgcaaatga acagtctgag agcigaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatcag agtacagctg attactactt ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca <210> 24 <211> 318 <212> DNA <213>人類 <400> 24 gaaattgtgg tgacacagtc tccegccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagrgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tggoiacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct gaagattttg cagtttatta ctgt.cagcag cgtagcaact ggccgacgtt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaa 136851-序列表.doc 12-

Claims (1)

1. 200932268 十、申請專利範圍： 1. 一種經分離結合分子，該經分離結合分子與抗體競爭結 合人類OX40R，該結合分子包括： (a) 重鏈可變區域，其包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序 ' 列；及 ； (b)輕鏈可變區域，其包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序 - 列。 2. —種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： 〇 (a)重鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列； (b) 重鏈CDR2，其包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列；及 (c) 重鏈CDR3，其包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。 3 . —種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： (a) 輕鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列； (b) 輕鏈CDR2，其包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列；及 (c) 輕鏈CDR3，其包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。 4. 一種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： ❹ (a)重鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列； (b) 重鏈CDR2，其包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列； (c) 重鏈CDR3，其包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列； (d) 輕鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列； ' (e)輕鏈CDR2，其包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列；及 (f)輕鏈CDR3，其包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。 5. —種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： (a)重鏈可變區域，其包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序 136851.doc 200932268 列；及 (b)輕鏈可變區域，其包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序 列。 6. —種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： ’ (a)重鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； ： (b)重鏈CDR2，其包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列；及 . (c)重鏈CDR3，其包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。 7. —種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： © (a)輕鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列； (b) 輕鏈CDR2，其包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及 (c) 輕鏈CDR3，其包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。 8. —種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： (a) 重鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； (b) 重鏈CDR2，其包括SEQ ID NO·· 14之胺基酸序列； (c) 重鏈CDR3，其包括SEQ ID NO·· 15之胺基酸序列； (d) 輕鏈CDR1，其包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列； (e) 輕鏈CDR2，其包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及 (f) 輕鏈CDR3，其包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。 9. 一種與人類OX40R結合之經分離結合分子，其包括： (a) 重鏈可變區域，其包括SEQ ID NO: 19之胺基酸序 列；及 (b) 輕鏈可變區域，其包括SEQ ID NO: 20之胺基酸序 列。 10·如請求項1至9中任一項之經分離結合分子，該結合分 136851.doc 200932268 子： (a) 以ΙχΙΟ·6 Μ或更少之KD與人類OX40R結合；且 (b) 具有對人類OX40R之促效活性。 11.如請求項1至9中任一項之結合分子，該結合分子為人類 - 抗體。 ； 1 2.如請求項1至9中任一項之結合分子，該結合分子為嵌合 抗體或人類化抗體。 13. 如請求項11之抗體，其中該抗體以100 nM或更少之KD與 〇 人類OX40R結合。 14. 一種與人類OX40R結合之經分離人類單株抗體，其包括 包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之重 鍵。 15. —種與人類OX40R結合之經分離人類單株抗體，其包括 包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之輕 鏈。 16. —種與人類OX40R結合之經分離人類單株抗體，其包括 零 包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之輕鏈。 ·. 17· —種與人類OX40R結合之經分離人類單株抗體，其包括 包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID ' NO: 22之胺基酸序列之輕鏈。 18. —種組合物，其包括如請求項1至17中任一項之結合分 子及選擇性地包括醫藥學上可接受之載劑。 1 9. 一種治療有其需要之哺乳動物癌症之方法，該方法包括 136851.doc 200932268 將治療有效量之如請求項 予該哺乳動物。 至17中任一項之結合分子投 乳癌、前列腺 ，該方法包括 之結合分子投 20. 如請求項19之方法，其中該癌症選自由 癌、大腸直腸癌、肺癌或血癌組成之群。 21. -種預防有纟需要之哺乳動物癌症之方法 將治療有效量之如請求項丨至丨7中任一項 予該哺乳動物。 22. —種提尚哺乳動物之免疫反應之方、本 疋仗汉愿之方法，該方法包括將治 療有效量之如請求们至17中任一項之結合分子投予該 哺乳動物。 其中δ亥結合分子為人 23·如請求項19至22中任一項之方法 類抗體。 24’如請求項23之方法’其中該結合分子為如請求項⑽” 之人類抗體。

   25. —種經分離核酸分子，其包括編碼如請求項i至17中任 一項之結合分子之核苷酸序列。 26. 如請求項25之核酸分子’其包括選自SEq m N〇: ^、 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 23 或 SEQ ID NO:24 之核芽 酸序列。 27. —種載體，其包括如請求項25或26之核酸分子。 28·如請求項27之載體，其進一步包括操作性連接至該核酸 分子之表現控制序列。 29. —種宿主細胞，其包括如請求項27或28之載體。 3 0. —種抑制腫瘤細胞生長之方法，其包括將該等腫瘤細胞 136851.doc 200932268 與如請求項1至17中任一項之結合分子接觸或與包括如 請求項1至1 7中任一項之結合分子之組合物接觸，其中 該結合分子係以有效量抑制該等腫瘤細胞之生長。

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