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KR102584675B1 - GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도 - Google Patents

GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR102584675B1
KR102584675B1 KR1020207036929A KR20207036929A KR102584675B1 KR 102584675 B1 KR102584675 B1 KR 102584675B1 KR 1020207036929 A KR1020207036929 A KR 1020207036929A KR 20207036929 A KR20207036929 A KR 20207036929A KR 102584675 B1 KR102584675 B1 KR 102584675B1
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Abstract

본 발명은 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 새로운 항체, 및 암의 치료에서 이의 용도를 제공한다. 본 발명은 상기 항체를 포함하는 새로운 이중특이적 항체, 및 암의 치료에서 이의 용도를 추가로 제공한다.

Description

GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도
서열목록
본원은 EFS-웹을 통해 전자 출원되었고, 전자 제출된 .txt 포맷의 서열목록을 포함한다. 상기 .txt 파일은 2019년 5월 14일에 생성되었고 738 KB 크기를 갖는 "PC72377-PRV2_Sequence_Listing_ST25_05142019.txt"란 제목의 서열목록을 포함한다. .txt 파일에 포함된 서열목록은 본원의 일부이며 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 GUCY2c(구아닐릴 사이클라제 C) 및/또는 CD3(분화 클러스터 3)에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 CD3 및 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체(예를 들어 CD3 및 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 관련된 분자, 예를 들어 상기 항체 또는 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산, 조성물 및 관련된 방법, 예를 들어 상기 항체 및 이중특이적 항체를 생산하고 정제하는 방법, 및 진단 및 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.
암은 매년 7백만건 초과의 사망을 차지하는 전세계 주요 사망 원인이다. 암 사망률은 거의 보편적으로 원발성 종양이 먼 부위로 확산되어 전이를 형성하고 궁극적으로 사망에 이르게 하는 것과 관련이 있다. 이는 특히 식도, 위, 결장 및 직장의 선암을 포함하는 위장관암에 해당한다. 대장암(CRC)은 미국에서 네번째로 많이 진단된 암이며 암 사망의 두번째 주요 원인이다(문헌[SSiegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin., 66:7-30, 2016]). 전세계적으로, 대장암은 매년 120만건의 신규 사례 및 60만건의 사망의 원인이다(문헌[Brenner H, Kloor M, Pox CP. Colorectal cancer. Lancet, 383:1490-502, 2014]).
구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2c)(STAR, ST 수용체, GUC2C, GUCY2C, GC-C 및 GCC로도 공지됨)는 장액의 유지, 전해질 항상성 및 세포 증식에서 작용하는 막경유 세포 표면 수용체이다(문헌[Carrithers et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 3018-3020, 2003]; [Mann et al., Biochem Biophys Res Commun 239: 463-466, 1997]; [Pitari et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 2695-2699, 2003)]; GenBank 기탁번호 NM.sub.-004963 및 GenPept 기탁번호 NP-004954). 이러한 작용은 구아닐린(문헌[Wiegand et al. FEBS Lett. 311:150-154, 1992]) 및 우로구아닐린(문헌[Hamra et al. Proc Natl Acad Sci USA 9(22):10464-10468, 1993])의 결합을 통해 중재된다. 또한, GUCY2c는 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli) 및 기타 전염성 미생물에 의해 생산된 펩티드인 열-안정한 장독소(ST)에 대한 수용체이다(문헌[Rao, M. C. Ciba Found. Symp. 112:74-93, 1985]; [Knoop F. C. and Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 28:67-72, 1992]). GUCY2c에 대한 ST의 결합은 신호 케스케이드를 활성화시키고, 이는 장 질환, 예를 들어 설사를 야기한다.
GUCY2c는 대장암, 췌장암, 위암, 간암 및 식도암을 포함하는 암에 수반되는 단백질로서 특성규명되었다(문헌[Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39:171-181, 1996]; [Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005]; [Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661, 1994]; [Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995]).
세포 표면 단백질로서, GUCY2c는 수용체 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 리간드에 대한 치료 표적으로서 작용할 수 있다. GUCY2c는 소장, 대장 및 직장의 점막에 막을 형성하는 상피 세포의 정점에 발현된다(문헌[Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181, 1996]). GUCY2c 발현은 장 상피 세포의 신생물 변형시 유지되되, 발현은 모든 원발성 및 전이성 대장 종양에서 존재하였다(문헌[Carrithers et al., 1996]; [Buc et al.]; [Carrithers et al., 1994]). 또한, GUCY2c 발현은 바레트 식도, 식도암 및 위암으로 진단된 식도 세포에서 검출되었다.
전이된 대장암 세포를 특이적으로 표적화하고 이에 특이적으로 결합할 수 있는 분자 및/또는 조성물이 필요하다. 대장암을 앓는 것으로 의심받는 개체, 특히 대장암 세포의 전이로 고통받는 것으로 의심받는 개체를 치료하는 개선된 방법이 필요하다.
종양 세포 사멸을 매개하도록 T 세포를 모집할 수 있는 이중특이적 항체를 생산하는 다양한 전략이 개발되었다. 이러한 이중특이적 항체는 종양 세포와 인간 면역계의 효과기 세포(NK 세포, T 세포, 단핵구, 대식 세포 또는 과립구) 사이에 가교를 형성하여 종양 세포의 특이적 사멸을 가능하게 할 수 있다. 이러한 이중특이적 항체가 치료 적용례, 예를 들어 종양 치료를 위한 치료 개념에 유리한 것으로 입증되었지만, 매우 강하고 특이적인 방식으로 GUCY2c 양성 종양 세포를 표적화할 수 있는 이중특이적 항체가 필요하다. 이러한 분자는 GI 암의 경우 치료제로서, 암의 치료에서, 및 세포 상의 GUCY2c의 검출에서 유용할 수 있다.
본 발명은 이중특이적 항체를 포함하는 항체를 제공하되, 여기서 상기 항체는 GUCY2c에 특이적으로 결합한다. 또한, 본 발명은 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2c)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하되, 여기서 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 또는 73에 나타낸 중쇄 가변(VH) 서열의 VH 상보 결정 영역 1(VH CDR1), VH 상보 결정 영역 2(VH CDR2) 및 VH 상보 결정 영역 3(VH CDR3)을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및/또는 (b) 서열번호 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 또는 175에 나타낸 경쇄 가변(VL) 서열의 VL 상보 결정 영역 1(VL CDR1), VL 상보 결정 영역 2(VL CDR2) 및 VL 상보 결정 영역 3(VL CDR3)을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역.
한 실시양태에서, 본 발명은 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하되, 여기서 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) (i) 서열번호 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 또는 261의 서열을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열번호 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 또는 267의 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열번호 14, 22, 29, 36 또는 44의 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 (b) (i) 서열번호 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 또는 167의 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열번호 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 또는 168의 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열번호 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 또는 169의 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역.
한 실시양태에서, 본 발명은 항체를 제공하되, 여기서 (a) VH 영역은 (i) 서열번호 74의 서열을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열번호 75의 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열번호 29의 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고/하거나; (b) VL 영역은 (i) 서열번호 148의 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열번호 149의 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열번호 142의 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 항체를 제공하되, 여기서 (a) VH 영역은 서열번호 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 또는 73을 포함하고/하거나; (b) VL 영역은 서열번호 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 또는 175를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 항체를 제공하되, 여기서 VH 영역은 서열번호 73의 서열을 포함하고; VL 영역은 서열번호 147의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 항체를 제공하되, 여기서 VH 영역은 서열번호 73의 서열, 또는 VH 영역 내에 존재하지 않는 잔기에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고/하거나; VL 영역은 서열번호 147의 서열, 또는 VL 영역 내에 존재하지 않는 아미노산에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 GUCY2c에 결합하는 항체를 제공한다: 서열 RASESV-XL1.30-XL1.30a-YG-XL1.30d-SLLQ를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VL CDR1; 서열번호 149의 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VL CDR2; 서열번호 142의 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VL CDR3; 서열 GFTFS-XH1.31-XH1.32-WMH를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VH CDR1; 서열 EIK-XH2.52A-XH2.53-XH2.54-XH2.55-XH2.56-XH2.57-NVHEKFKD를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VH CDR2; 및 서열 T-XH3.96-XH3.97-XH3.98-XH3.99-XH3.100-G-XH3.100B-WF-XH3.100E-XH3.101-V를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VH CDR3(여기서 XL1.30, XL1.30a, XL1.30d, XH1.31, XH1.32, XH2.52A, XH2.53, XH2.54, XH2.55, XH2.56, XH2.57, XH3.96, XH3.97, XH3.98, XH3.99, XH3.100, XH3.100B, XH3.100E 및 XH3.101 각각은 독립적으로 표 42A 및 42B의 4열 및 5열에 따른 아미노산 잔기이다).
한 양상에서, XL1.30은 D, N 또는 S이고; XL1.30a는 Y, W 또는 I이고; XL1.30d는 T, S 또는 H이고; XH1.31은 S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G 또는 V이고; XH1.32는 Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V 또는 S이고; XH2.52A는 P, T 또는 V이고; XH2.53은 S, A, L 또는 R이고; XH2.54는 N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T 또는 I이고; XH2.55는 E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D 또는 Q이고; XH2.56은 L, W, Y, F, V, I, N 또는 H이고; XH2.57은 T, M, S, L, N, Q 또는 V이고; XH3.96은 I, F 또는 K이고; XH3.97은 T, V, L, I, M, F, Y 또는 A이고; XH3.98은 T, N, R, G, L 또는 I이고; XH3.99는 T, K, L, W, A, S, M, P, N 또는 R이고; XH3.100은 E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L 또는 M이고; XH3.100B는 Y 또는 H이고; XH3.100E는 F 또는 L이고; XH3.101은 D, Y, E 또는 S이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 항체를 제공하되, 여기서 상기 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 쇄 Fv(scFv) 단편, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv) 단편, 단일 도메인 항체(dAb) 단편, 단클론 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 이종이량체성 다이아바디, 이중특이적 이종이량체성 IgG, 다클론 항체, 표지된 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 VH 골격 또는 인간화된 VH 골격, 및 인간 VL 골격 또는 인간화된 VL 골격을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 골격은 서열번호 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하고/하거나; VL 골격은 서열번호 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 또는 155의 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 GUCY2c 세포외 도메인 상의 에피토프에 결합하는 단리된 인간 단클론 항체를 제공하되, 여기서 상기 에피토프는 서열번호 406의 아미노산 잔기 R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 또는 I86으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 양상에서, 에피토프는 서열번호 406의 아미노산 잔기 R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 또는 I86으로부터 선택된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 양상에서, 에피토프는 서열번호 406의 아미노산 잔기 R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 또는 I86을 포함한다. 추가적 양상에서, 에피토프는 서열번호 406에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 추가적 양상에서, 에피토프는 기능적 에피토프이다.
또 다른 양상에서, 단리된 인간 항체 및 GUCY2c 에피토프 아미노산 접촉부는 결정학에 의해 결정시 3.8 Å 이하이다. 본원에 사용된 "3.8 Å 이하"는 접촉부가 3.8 Å보다 짧거나 3.8 Å과 같음 의미한다.
한 양상에서, 본 발명의 항체는 이중특이적 항체이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공하되, 여기서 상기 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c 항체의 VL(GUCY2c VL) 및 CD3 항체의 VH(CD3 VH)를 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 항체의 VL(CD3 VL) 및 GUCY2c 항체의 VH(GUCY2c VH)를 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되; GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
또 다른 실시양태에서, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VL 및 GUCY2c VH를 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VL 및 CD3 VH를 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되; GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
또 다른 실시양태에서, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되; GUCY2c VH 및 GUCY2c VL은 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VH 및 CD3 VL은 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
추가적 실시양태에서, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되, GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
전술된 것 각각의 일부 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인 각각의 아미노산 서열은 이종이량체화를 유도하고/하거나 이중특이적 항체를 안정화시키도록 변형된다.
일부 이러한 실시양태에서, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하되, 여기서 (a) 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 놉(knob)을 형성하고; (b) 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 홀(hole)을 형성한다.
또 다른 이러한 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 돌연변이 Y349C 및/또는 T366W를 포함하고; 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 돌연변이 S354C, T366S, L368A, 및/또는 Y407V를 포함한다(EU 인덱스에 따른 넘버링).
전술된 것 각각의 특정 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인은 서열번호 188의 서열을 포함하고; 제2 이종이량체-촉진 도메인은 서열번호 189의 서열을 포함한다.
추가적 실시양태에서, GUCY2c VL 및 CD3 VH는 글리신-세린 링커에 의해 연결되고; CD3 VL 및 GUCY2c VH는 글리신-세린 링커에 의해 연결된다. 일부 이러한 실시양태에서, 글리신-세린 링커는 서열번호 190의 서열을 포함하는 링커 1이다. 다른 실시양태에서, 글리신-세린 링커는 서열번호 191의 서열을 포함하는 링커 2이다.
전술된 것 각각의 추가적 실시양태에서, 도메인 1은 제1 이종이량체-촉진 도메인에 시스테인 링커를 통해 공유 결합되고; 도메인 2는 제2 이종이량체-촉진 도메인에 시스테인 링커를 통해 공유 결합되되; 시스테인 링커는 5개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 시스테인 링커는 서열번호 192의 서열을 포함하는 링커 3이다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 제2 폴리펩티드 쇄에 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다. 일부 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 다이설파이드 결합은 제1 폴리펩티드 쇄의 링커 3과 제2 폴리펩티드 쇄의 링커 3 사이에 형성된다. 또 다른 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 다이설파이드 결합은 제1 이종이량체-촉진 도메인과 제2 이종이량체-촉진 도메인 사이에 형성된다. 구체적 실시양태에서, 다이설파이드 결합 각각은 2개의 시스테인 잔기를 연결시킴으로써 형성된다.
임의의 전술된 것의 추가적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 또는 261의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR1; (b) 서열번호 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 또는 267의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR2; (c) 서열번호 14, 22, 29, 36 또는 44의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR3; (d) 서열번호 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 또는 167의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR1; (e) 서열번호 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 또는 168의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR2; 및 (f) 서열번호 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 또는 169의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR3.
특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 74 또는 259의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR1; (b) 서열번호 75 또는 267의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR2; (c) 서열번호 29의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR3; (d) 서열번호 148의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR1; (e) 서열번호 149의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR2; 및 (f) 서열번호 142의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR3.
구체적 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 73의 서열을 포함하는 GUCY2c VH 영역; 및 (b) 서열번호 147에 나타낸 서열을 포함하는 GUCY2c VL 영역.
추가적 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: (a) 서열번호 2, 268 또는 277의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR1; (b) 서열번호 3, 10, 269 또는 270의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR2; (c) 서열번호 4의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR3; (d) 서열번호 77, 85, 91, 278, 279 또는 280의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR1; (e) 서열번호 78 또는 281을 포함하는 CD3 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 79의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR3.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: (a) 서열번호 2 또는 268의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR1; (b) 서열번호 10 또는 270의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR2; (c) 서열번호 4의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR3; (d) 서열번호 91의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR1; (e) 서열번호 78의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 79의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR3.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: (a) 서열번호 1, 9 또는 273의 서열을 포함하는 CD3 VH 영역; 및 (b) 서열번호 76, 84, 90, 274, 275 또는 276의 서열을 포함하는 CD3 VL 영역. 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 9의 서열을 포함하는 CD3 VH 영역; 및 (b) 서열번호 90의 서열을 포함하는 CD3 VL 영역.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: 서열 RASESV-XL1.30-XL1.30a-YG-XL1.30d-SLLQ를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VL CDR1; 서열번호 149의 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VL CDR2; 서열번호 142의 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VL CDR3; 서열 GFTFS-XH1.31-XH1.32-WMH를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VH CDR1; 서열 EIK-XH2.52A-XH2.53-XH2.54-XH2.55-XH2.56-XH2.57-NVHEKFKD를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VH CDR2; 및 서열 T-XH3.96-XH3.97-XH3.98-XH3.99-XH3.100-G-XH3.100B-WF-XH3.100E-XH3.101-V를 갖는 아미노산을 포함하는 GUCY2c VH CDR3(여기서 XL1.30, XL1.30a, XL1.30d, XH1.31, XH1.32, XH2.52A, XH2.53, XH2.54, XH2.55, XH2.56, XH2.57, XH3.96, XH3.97, XH3.98, XH3.99, XH3.100, XH3.100B, XH3.100E 및 XH3.101 각각은 독립적으로 표 42A 및 42B의 4열 및 5열에 따른 아미노산 잔기이다).
한 양상에서, XL1.30은 D, N 또는 S이고; XL1.30a는 Y, W 또는 I이고; XL1.30d는 T, S 또는 H이고; XH1.31은 S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G 또는 V이고; XH1.32는 Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V 또는 S이고; XH2.52A는 P, T 또는 V이고; XH2.53은 S, A, L 또는 R이고; XH2.54는 N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T 또는 I이고; XH2.55는 E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D 또는 Q이고; XH2.56은 L, W, Y, F, V, I, N 또는 H이고; XH2.57은 T, M, S, L, N, Q 또는 V이고; XH3.96은 I, F 또는 K이고; XH3.97은 T, V, L, I, M, F, Y 또는 A이고; XH3.98은 T, N, R, G, L 또는 I이고; XH3.99는 T, K, L, W, A, S, M, P, N 또는 R이고; XH3.100은 E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L 또는 M이고; XH3.100B는 Y 또는 H이고; XH3.100E는 F 또는 L이고; XH3.101은 D, Y, E 또는 S이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 GUCY2c 세포외 도메인 상의 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체를 제공하되, 상기 에피토프는 서열번호 406의 아미노산 잔기 R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 또는 I86으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 양상에서, 에피토프는 서열번호 406의 아미노산 잔기 R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 또는 I86으로부터 선택된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 양상에서, 에피토프는 서열번호 406의 아미노산 잔기 R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 또는 I86을 포함한다. 추가적 양상에서, 에피토프는 서열번호 406에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 추가적 양상에서, 에피토프는 기능적 에피토프이다.
또 다른 양상에서, 단리된 인간 항체 및 GUCY2c 에피토프 아미노산 접촉부는 결정학에 의해 결정시 3.8 Å 이하이다.
한 양상에서, 본 발명은, GUCY2c에 특이적으로 결합하고 본원에 개시된 이중특이적 항체와 결합에 대해 경쟁하는 이중특이적 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공하되, 여기서 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 GUCY2c 항체의 VL(GUCY2c VL)(서열번호 147) - 링커 1(서열번호 190) - CD3 항체의 VH(CD3 VH)(서열번호 9) - 링커 3(서열번호 192) - 제1 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 188)을 순서대로 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 CD3 항체의 VL(CD3 VL)(서열번호 90) - 링커 2 (서열번호 191) - GUCY2c 항체의 VH(GUCY2c VH)(서열번호 73) - 링커 3(서열번호 192) - 제2 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 189)을 순서대로 포함하고; GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; 제1 폴리펩티드 쇄의 링커 3 및 제2 폴리펩티드 쇄의 링커 3는 2개의 다이설파이드 결합에 의해 서로에 대해 공유 결합되고; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고; 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 놉을 형성하고, 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 홀을 형성하고; 하나 이상의 다이설파이드 결합은 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인과 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인 사이에 형성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 VH 골격 또는 인간화된 VH 골격, 및 인간 VL 골격 또는 인간화된 VL 골격을 추가로 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일부 이러한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간화된 항체이다. 구체적 실시양태에서, VH 골격은 서열번호 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하고/하거나; VL 골격은 서열번호 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 또는 155의 서열을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하되, 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고; 제1 폴리펩티드 쇄는 ATCC 기탁번호 PTA-124944의 발현 벡터에 의해 생산되고; 제2 폴리펩티드 쇄는 ATCC 기탁번호 PTA-124943의 발현 벡터에 의해 생산된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는, (a) 인간 GUCY2c의 세포외 도메인에 결합하고/하거나; (b) 30분 내지 100일의 연장된 혈청 및 종양 반감기를 나타내고/내거나; (c) 증가된 GUCY2c 발현 수준 또는 증가된 수용체 밀도 수준의 존재 하에 0.0001 내지 100 nM의 낮은 EC50 값을 나타낸다.
본 발명은 치료 효과량의 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료가 필요한 환자에서 GUCY2c 관련된 장애를 치료하는 방법을 제공하되, 이는 상기 환자에게 본 발명의 GUCY2c 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료가 필요한 환자에서 GUCY2c 관련된 장애를 치료하는 방법을 제공하되, 이는 상기 환자에게 본 발명의 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애가 필요한 환자에서 GUCY2c 관련된 장애를 치료하는 방법을 제공하되, 이는 상기 환자에게 본원에 개시된 GUCY2c 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, GUCY2c 관련된 장애는 암이다. 구체적 실시양태에서, 암은 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암이다.
본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료가 필요한 환자에서 GUCY2c 관련된 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공하되, 이는 상기 환자에게 본원에 개시된 이중특이적 항체, 또는 본원에 개시된 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 세포용해성 T 세포 반응이 활성화된다.
한 양상에서, 본 발명은 치료에서 사용하기 위한 본원에 개시된 항체, 이중특이적 항체 또는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 치료에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 GUCY2c 관련된 장애의 치료이다. 구체적 실시양태에서, GUCY2c 관련된 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암이다. 구체적 실시양태에서, 치료는 세포용해성 T 세포 반응을 활성화시킨다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 재조합에 의해 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체를 생산한다. 구체적 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포주, 포유동물 세포주, 곤충 세포주 및 효모 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포주는 CHO 세포주이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이중특이적 항체는 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하여 생산된다.
한 양상에서, 본 발명은, 본원에 개시된 GUCY2c 항체 또는 이중특이적 항체의 생산을 야기하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 이중특이적 항체를 배양 상청액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 GUCY2c 항체 또는 이중특이적 항체의 생산 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료용 약제의 제조에서 본원에 개시된 GUCY2c 항체, 이중특이적 항체, 약학 조성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체 및 치료제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체 및 지사제를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 양상에서, 지사제는 비제한적으로 비스무트 서브갈레이트, 락토바실러스 아시도필러스, 사카로미세스 불라르디, 로페라미드/시메티콘, 아트로핀/다이페녹시레이트, 아트로핀/다이페녹신, 사카로미세스 불라르디 라이오, 락토바실러스 아시도필러스, 로페라미드, 비스무트 서브살리실리에트, 락토바실러스 아시도필러스/락토바실러스 불가리서스, 락토바실러스 람노서스, 애타펄자이트, 크로펠레머, 플루오로퀴놀론, 항생제 또는 옥트레오티드를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료용 약제의 제조에서 본원에 개시된 GUCY2c 이중특이적 항체 및 지사제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
다른 실시양태는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다. 본 발명의 양상 또는 실시양태가 Markush 군 또는 군 분류의 다른 대안의 관점에서 기재되는 경우, 본 발명은 전체로 나열된 전체 군뿐만 아니라 군의 각 구성원, 주요 군의 가능한 모든 하위 군, 및 군 구성원 중 하나 이상이 부재하는 주요 군을 포함한다. 또한, 본 발명은 청구된 발명에서 하나 이상의 임의의 군 구성원의 명시적 배제를 고려한다.
도 1a, 1b, 1c 및 1d는, "놉-인-홀(knob-in-hole)" 회합을 통해 회합하기에 최적화된 Fc 쇄를 포함하는 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인을 갖는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 4개의 대안적 개략도를 도시한다.
도 2는, 유세포 분석법 기반 분석을 사용한, T84 종양 세포에 대한 (2a) GUCY2C-0247 및 (2b) GUCY2C-1608 이중특이적 항체의 결합을 도시한다.
도 3은 나이브(naive) 인간 T 세포에 대한 (3a) GUCY2C-0247 및 (3b) GUCY2C-1608 이중특이적 항체의 결합을 결정하는 유세포 분석법 기반 분석을 도시한다.
도 4a는, 나이브 인간 T 세포를 모집하여 T84 종양 세포에서 세포 사멸을 유도하는 GUCY2C-1608 및 GUCY2C-0247을 도시한다. 도 4b는 GUCY2c 발현 종양 세포주(LS1034)에서 관찰된 GUCY2C-1608 매개된 세포독성 T 세포 활성을 도시한다. 도 4c는 GUCY2c 발현 종양 세포주(LS174T)에서 관찰된 GUCY2C-1608 매개된 세포독성 T 세포 활성을 도시한다. 도 4d는 활성 없음이 GUCY2c-음성 세포주에서 GUCY2C-1608 사용시 관찰됨을 도시한다.
도 5a 내지 5f는 GUCY2c 발현 T84 세포에 대한 나이브 인간 T 세포의 GUCY2C-1608 매개된 모집시 유도된 시토카인 방출의 시험관내 분석을 도시한다. 루미넥스(Luminex) 기반 분석은 인간 IFN-감마(도 5a), IL10(도 5b), IL2(도 5c), IL4(도 5d), IL6(도 5e) 및 TNF-알파(도 5f)의 상향조절을 나타냈다.
도 6은 입양 전달 모델에서 T84 대장 암종 세포주 이종이식 종양에서 GUCY2C-0247에 의한 투여량 의존적 종양 성장 억제를 도시한다.
도 7은 입양 전달 모델에서 HT55 대장 암종 세포주 이종이식 종양에서 GUCY2C-0247에 의한 투여량 의존적 종양 성장 억제를 도시한다.
도 8은 입양 전달 모델에서 HT55 대장 암종 세포주 이종이식 종양에서 GUCY2C-1608에 의한 투여량 의존적 종양 성장 억제를 도시한다.
도 9는 입양 전달 모델에서 대장암 LS1034 세포주 이종이식 종양에서 GUCY2c 이중특이적 항체, GUCY2C-0247 및 GUCY2C-1608에 의한 투여량 의존적 종양 성장 억제를 도시한다.
도 10은 입양 전달 모델에서 대장암 LS1034 세포주 이종이식 종양에서 GUCY2c 이중특이적 항체, GUCY2C-0074, GUCY2C-0098 및 GUCY2C-0105에 의한 종양 성장 억제를 도시한다.
도 11은 입양 전달 모델에서 PDX-CRX-11201 대장 암종 환자 유래된 이종이식 종양에서 GUCY2C-0098에 의한 투여량 의존적 종양 성장 억제를 도시한다.
도 12는 입양 전달 모델에서 PDX-CRX-11201 대장 암종 환자 유래된 이종이식 종양에서 GUCY2C-1608에 의한 투여량 의존적 종양 성장 억제를 도시한다.
도 13은 입양 전달 모델에서 PDX-CRX-11201 대장 암종 환자 유래된 이종이식 종양에서 GUCY2C-0240에 의한 종양 성장 억제를 도시한다.
도 14는 입양 전달 모델에서 PDX-CRX-12213 대장 암종 환자 유래된 이종이식 종양에서 GUCY2C-0098 종양 성장 억제에 의한 종양 성장 억제를 도시한다.
도 15는 입양 전달 모델에서 PDX-CRX-24225 대장 암종 환자 유래된 이종이식 종양에서 GUCY2C-0247에 의한 종양 성장 억제를 도시한다.
도 16은 T84 세포에서 GUCY2c-CD3 이중특이적 항체의 cGMP 유도 및 무효화 능력의 특징을 도시한다.
도 17은 정제 후에 GUCY2C-1608의 LC/MS 분석을 도시한다.
도 18은 항-CD3 변이체를 갖는 항-GUCY2C 이중특이적 항체의 T 세포 매개된 세포독성을 도시한다. 상이한 CD3 변이체를 갖는 항-GUCY2c 이중특이적 항체는 T84 종양 세포에서 세포 사멸을 유도하는 나이브 인간 T 세포를 모집한다.
도 19는 GUCY2c ECD 펩티드 경쟁 DELFIA ELISA를 도시한다.
도 20은 항체 MS20을 사용한 경쟁 DELFIA ELISA를 도시한다.
도 21은 결정학을 통한 GUCY2c 펩티드 및 GUCY2C-1608 scFv 펩티드의 결합 접점(interface)의 세부사항을 도시한다.
도 22는 GUCY2c CD3 이중특이적 항체 상의 2개의 항원 결합 부위의 결정 구조를 도시하며, 이는 이들이 약 70 Å만큼 떨어져 있고 직접 서로 마주보고 분자의 반대편 상에 위치됨을 나타낸다.
도 23은 항-VEGF 및 악시티닙(axitinib)을 사용한 병용 연구의 결과를 도시하며, 이는 GUCY2c CD3 이중특이적 항체와의 병용으로 사용시 부가적(additive) 종양 성장 억제를 나타냈다.
도 24는 항-PD1을 사용한 병용 연구의 결과를 도시하며, 이는 GUCY2c CD3 이중특이적 항체와 병용으로 사용시 부가적 종양 성장 억제를 나타냈다.
도 25는 항-PD-L1을 사용한 병용 연구의 결과를 도시하며, 이는 GUCY2c CD3 이중특이적 항체와 병용으로 사용시 부가적 종양 성장 억제를 나타냈다.
본원에 개시된 발명은 GUCY2c(예를 들어 인간 GUCY2c, 마우스 GUCY2c, 래트 GUCY2c, 시노몰구스 GUCY2c)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 또한, 본원에 개시된 발명은 CD3(예를 들어 인간 CD3) 및 종양 항원(예를 들어 GUCY2c)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 이들 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체의 생산 방법 및 사용 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2, CD3 또는 이중특이적 항체)를 사용하여 개체에서 GUCY2c 발현과 관련된 질환, 예컨대 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일반적 기술
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 기술에 속하는 분자생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 충분히 설명되어 있다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 명료성을 위해 및/또는 편리한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에서 이러한 정의의 포함은 당분야에서 일반적으로 이해되는 것에 대한 실질적인 차이를 반드시 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명은 하기 정의 및 실시예를 사용하여 참고로 상세히 기재될 것이다. 본원에 언급된 모든 특허 및 공개문헌(이러한 특허 및 공개문헌 내에 개시된 모든 서열을 포함함)은 명시적으로 참고로 포함된다.
정의
일반적으로, 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법, 및 기타 과학 용어 및 전문 용어는 본 발명의 관련된 분야의 숙련가에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기 실시양태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본원에 사용된 단수 용어는, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 이의 상응하는 복수 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 수치 범위는 상기 범위를 한정하는 수를 포함한다.
용어 "약", "대략" 등은, 수치 값의 목록 또는 범위에 선행하는 경우, 상기 목록 또는 범위의 각각의 개별적인 값 바로 앞에 상기 용어가 선행하는 것과 같이 독립적으로 상기 목록 또는 범위의 각각의 개별적인 값을 지칭한다. 상기 용어는 값이 이를 지칭하는 값에 정확히 일치하거나 이와 가깝거나 유사함을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약 또는 대략 특정한 값은 상기 값의 99%, 95% 또는 90%의 값을 나타낼 수 있다. 예로서, 용어 "약 100"은 99 및 101, 및 사이의 모든 값(예를 들어 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5 등)을 포함한다. 또 다른 예로서, 온도가 70℃인 경우, "약" 또는 "대략" 70℃는 69℃, 66℃ 또는 63℃와 대등할 수 있다. 이는 단지 예임이 이해되어야 한다.
본원에 사용된 "3.8 Å 이하"는, 접촉부가 결정학에 의해 결정시 3.8 Å보다 작거나 그와 같음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 핵산은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 방향으로 기록된다; 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카복시 방향으로 기록된다. 실무자는 기술 정의 및 용어에 대해 문헌[Sambrook et al., 1 989, and Ausubel FM et al., 1993]을 참조한다. 본 발명이 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않고 다양할 수 있음이 이해되어야 한다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이, 바람직하게는 비교적 짧은(예를 들어 10 내지 100개의 아미노산)의 아미노산 쇄를 지칭한다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고/있거나, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/있거나 비아미노산이 개재될 수 있다. 또한, 상기 용어는 자연적으로 또는 개재, 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어 비천연 아미노산 등을 포함함) 및 당분야에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드가 상기 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드가 단일 쇄로서 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있음이 이해된다. 바람직하게는, 포유동물 폴리펩티드(포유동물 유기체로터 본래 유래된 폴리펩티드), 보다 바람직하게는 직접 배지 내로 분비된 것이 사용된다.
"항체"는, 면역 글로불린 분자의 가변 영역에 위치된 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역 글로불린 분자이다. 본원에 사용된 상기 용어는 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이중-특이적 항체, 이작용성 항체, 삼중특이적 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 이종이량체성 다이아바디, 이중특이적 이종이량체성 IgG, 표지된 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 및 이의 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(ScFv) 및 도메인 항체(예를 들어 샤크 및 카멜리드 항체), 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 배열의 면역 글로불린 분자를 포함한다. 항체는 임의의 클래스의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 서브클래스)을 포함하고, 항체는 임의의 특정 클래스일 필요는 없다. 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역 글로불린은 상이한 클래스에 배정될 수 있다. 면역 글로불린의 5개의 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이 중 여럿은 서브클래스(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 면역 글로불린의 상이한 클래스에 해당하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 상이한 클래스의 면역 글로불린의 서브유닛 구조 및 3-차원 배열은 주지되어 있다. 또한, 본 발명은 "항체 유사체", 기타 비-항체 분자 단백질-기반 스캐폴드, 예를 들어 CDR을 사용하여 특이적 항원 결합을 제공할 수 있는 융합 단백질 및/또는 면역 접합체를 포함한다. 본 발명의 항체는 비제한적으로 마우스, 인간, 낙타, 라마, 어류, 상어, 염소, 토끼, 닭 및 소를 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 다이설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역 글로불린 분자, 및 이의 다량체(예를 들어 IgM)를 추가로 포함한다. 중쇄 각각은 중쇄 가변 영역(본원에서 HC VR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합으로서 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. CH1 및 CH2 도메인은 힌지 영역에 의해 연결된다. 경쇄 각각은 경쇄 가변 영역(본원에서 LC VR 또는 VL로 지칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 골격 영역(FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역 사이에 배치된 상보 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 나뉠 수 있다. VH 및 VL 각각은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 다양한 실시양태에서, CD3 항체의 FR(또는 이의 항원 결합부)은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 이상의 CDR의 나란한 분석을 기반으로 정의될 수 있다. 각각의 쇄의 CDR은 FR에 의해 근접하게 함께 고정되고, 나머지 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 단편", "항체 단편" 또는 "항원 결합부"는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어 항체의 "항원 결합 단편" 내에 속하는 결합 단편의 예는 하기를 포함한다: (i) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 또는 전장 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH/VL 쌍, 예컨대 VH 도메인 및/또는 VL 도메인; (ii) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (iii) 본질적으로 Fab 및 힌지 영역의 일부인 Fab' 단편(예를 들어 문헌[Fundamental Immunology, Paul ed., 3.sup.rd ed.1993]); (iv), 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (v) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 ; (vi) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (vii) VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄인 단일 쇄 Fv 단편(scFv)(예를 들어 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879- 5883]); (viii) VH-VL 쌍을 안정화시키도록 조작된 분자간 다이설파이드 결합을 갖는 Fv인 다이설파이드 안정화된 Fv 단편(dsFv); (ix) 중쇄의 가변 도메인으로 구성되고 경쇄를 갖지 않는 단일 가변 도메인 항체(sdAb 또는 dAb) 단편(예를 들어 문헌[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (x) 상보 결정 영역(CDR); 및 임의의 이의 유도체.
본원에 사용된 항체의 "항원 결합 단편"은 하나 이상의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 골격 서열에 인접하거나 그와 함께 프레임을 이루는 하나 이상의 CDR을 포함할 것이다. 본원에 사용된 "항체의 항원 결합 단편"은, (예를 들어 다이설파이드 결합에 의해) 서로 및/또는 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 영역과 비공유 회합된 하기에 열거된 임의의 가변 영역 및 불변 도메인 배열의 동종이량체 또는 이종이량체(또는 기타 다량체)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체성일 수 있거나 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 배열은 하기를 포함한다: VH-CH1; VH-CH2; VH-CH3; VH-CH1-CH2; VH-CH1-CH2-CH3; VH-CH2-CH3; VH-VL-CL, VH-VL-CH1, VH-VL-CH2; VH-CL; VL-CH1; VL-CH2; VL-CH3; VL-CH1-CH2; VL-CH1-CH2-CH3; VL-CH2-CH3; 및 VL-CL. 가변 영역 및 불변 도메인은 직접 서로 연결될 수 있거나 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 2개(예를 들어 5개, 10개, 15개, 20개, 40개, 60개 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 이는 단일 폴리펩티드 분자에서 인접 가변 영역 및/또는 불변 도메인 사이의 가요성 또는 반가요성 연결을 야기한다.
본원에 사용된 "결합 도메인"은 해당 분자(예를 들어 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 억제제)에 대해 선택적으로 결합하는 것을 담당하는 폴리펩티드(예를 들어 항체)의 임의의 영역을 포함한다. 예시적 결합 도메인은 항체 가변 영역, 수용체 결합 도메인, 리간드 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "인간 수용체 골격"은, 하기에 정의되는 바와 같이 인간 면역 글로불린 골격 또는 인간 공통 골격으로부터 유래된 경쇄 가변(VL) 골격 또는 중쇄 가변(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역 글로불린 골격 또는 인간 공통 골격으로부터 "유래된" 인간 수용체 골격은 이의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 인간 수용체 골격은 VL 인간 면역 글로불린 골격 서열 또는 인간 공통 골격 서열과 서열에 있어서 동일하다.
본원에 사용된 "친화도 성숙된" 항체는 변형을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 (CDR 및 FR을 포함하는) 하나 이상의 가변 영역에서 하나 이상의 변형을 갖는 항체를 지칭하고, 여기서 상기 변형은 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 야기한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 도메인", "Fc 쇄" 또는 유사 용어는 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. IgG의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인인 CH2 및 CH3을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 일반적으로 EU 인덱스의 넘버링 체계에 따라 아미노산 231에서 아미노산 340으로 또는 카바트(Kabat)의 넘버링 체계에 따라 아미노산 244에서 아미노산 360으로 연장된다. 인간 IgG Fc 영역의 CH3 도메인은 일반적으로 EU 인덱스 넘버링 체계에 따라 아미노산 341에서 아미노산 447로 또는 카바트 넘버링 체계에 따라 아미노산 361에서 아미노산 478로 연장된다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인("Cγ 2" 도메인으로도 지칭됨)은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 특별하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 온전한 천연 IgG의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. Fc 영역은 천연 또는 변이체 Fc 서열을 포함할 수 있다. 면역 글로불린 중쇄의 Fc 서열의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 서열은 일반적으로 위치 Cys226 주위 또는 Pro230 주위의 아미노산 잔기에서 Fc 서열의 카복시 말단으로 늘어진 것으로 한정된다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 체계에 따른다.
특정 실시양태에서, Fc 쇄는 파파인 절단 부위 및 단부의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하고 항체의 C-말단에서 끝난다. 따라서, 완전 Fc 쇄는 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 힌지(예를 들어 상부, 중부 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 또는 이의 변이체, 일부 또는 단편. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 완전 Fc 쇄(즉 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 CH3 도메인 또는 이의 일부로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 힌지 도메인(또는 이의 일부) 및 CH3 도메인(또는 이의 일부)으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 CH2 도메인(또는 이의 일부) 및 CH3 도메인으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 힌지 도메인(또는 이의 일부) 및 CH2 도메인(또는 이의 일부)으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 CH2 도메인의 적어도 일부(예를 들어 CH2 도메인의 전체 또는 부분)가 없다. 본원에서 Fc 쇄는 일반적으로 면역 글로불린 중쇄의 Fc 쇄의 전체 또는 부분을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이는 비제한적으로 전체 CHI, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 도메인, 및 단지 예를 들어 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 이러한 펩티드의 단편을 포함한다. Fc 쇄는 임의의 종의 면역 글로불린 및/또는 임의의 아형(비제한적으로 인간 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체를 포함함)으로부터 유래될 수 있다. Fc 도메인은 천연 Fc 및 Fc 변이체 분자를 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc와 같이, 용어 Fc 쇄는 전체 항체로부터 소화되든지 다른 수단에 의해 생산되는지에 관계 없이 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 쇄는 다이설파이드에 의해 함께 고정된 중쇄 둘 모두의 카복시 말단 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 쇄는 CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진다.
당분야에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것(감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체(이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적 스플라이싱된 형태를 포함함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제성 수용체")를 포함하고, 이는 주로 이의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991]; [Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995]에 리뷰되어 있다. 또한, "FcR"은 모계 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체(FcRn)를 포함한다(문헌[Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976]; 및 [Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994]).
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "야생형 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "야생형" 인간 IgG Fc는 인간 집단 내에서 자연 발생하는 아미노산의 서열을 의미한다. 물론, Fc 서열이 개체 사이에 약간 다를 수 있지만, 하나 이상의 변경이 야생형 서열에서 발생할 수 있고 이는 그럼에도 불구하고 본 발명의 범위 내에 속한다. 예를 들어, Fc 영역은 본 발명과 관련되지 않는 추가적 변경, 예컨대 글리코실화 부위의 돌연변이, 비천연 아미노산의 포함 또는 "놉-인-홀" 돌연변이를 함유할 수 있다.
"변이체 Fc 영역" 또는 "변이체 Fc 쇄"는 하나 이상의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 효과기 기능을 유지한다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 쇄는, 천연 서열 Fc 쇄와 비교하거나 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 천연 서열 Fc 쇄에 또는 모 폴리펩티드의 Fc 쇄에 갖는다. 본원의 변이체 Fc 쇄는 바람직하게는 천연 서열 Fc 쇄 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 쇄에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 가장 바람직하게는, 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
본원에 사용된 용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 쇄(천연 서열 Fc 쇄 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 쇄)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소타입에 따라 다를 수 있다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC); 식세포 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 쇄가 결합 도메인(예를 들어 항체 가변 영역)과 조합되는 것을 요구하며 이러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위해 당분야에 공지된 다양한 분석에 의해 평가될 수 있다. 효과기 기능의 예시적 측정은 Fcγ3 및/또는 C1q 결합을 통해서 수행된다.
항체의 효과기 기능은 Fc 쇄의 서열에 의해 결정되며; 상기 쇄는 또한 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 (일반적으로 이의 N-말단에서) 야생형 힌지 서열의 부분 또는 전체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 기능적 또는 야생형 힌지 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 "힌지 영역", "힌지 서열" 및 이의 변형은 예를 들어 문헌[Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, Elsevier Science Ltd., NY (4th ed., 1999)]; [Bloom et al., Protein Science, 6:407-415, 1997]; 및 [Humphreys et al., J. Immunol. Methods, 209:193-202, 1997]에 예시된 당분야에 공지된 의미를 포함한다.
본원에 사용된 "면역 글로불린-유사 힌지 영역", "면역 글로불린-유사 힌지 서열" 또는 이의 변형은 면역 글로불린-유사 또는 항체-유사 분자(예를 들어 면역 어드헤신)의 힌지 영역 및 힌지 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 글로불린-유사 힌지 영역은 임의의 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형으로부터, 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 기원하거나 유래될 수 있다(이의 키메라 형태, 예를 들어 키메라 IgG1/2 힌지 영역을 포함함).
일부 실시양태에서, 힌지 영역은 EU 인덱스 넘버링 체계에 따라 아미노산 216에서 아미노산 230으로 또는 카바트 넘버링 체계에 따라 아미노산 226에서 아미노산 243으로 연장된 인간 IgG1 아형으로부터 기원할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 186)일 수 있다. 당업자는 IgG 분자의 다양한 도메인에 상응하는 정확한 아미노산의 이해가 다를 수 있다. 따라서, 상기에 개괄된 도메인의 N-말단 또는 C-말단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 심지어 10개의 아미노산만큼 연장되거나 단축될 수 있다.
일부 실시양태에서, 힌지 영역은 하나 이상의 아미노산에 의해 돌연변이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 절단될 수 있거나 전체 힌지 영역의 단지 일부를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 힌지 영역의 마지막 5개의 아미노산만을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된", "융합된", "융합", "공유 결합된", "공유 커플링된" 및 "유전적으로 융합된"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 임의의 수단에 의해 2개의 요소 또는 성분을 함께 합하는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "공유 결합된"은, 명시된 모이어티가 서로 직접적으로 공유 결합되거나 사이에 오는 모이어티, 예컨대 연결 펩티드 또는 모이어티를 통해 서로 간접적으로 공유 결합됨을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 모이어티는 공유적으로 융합된다. 공유 연결기의 한 유형은 펩티드 결합이다. 화학 접합 방법(예를 들어 이종 이작용성 가교제를 사용함)이 당분야에 공지되어 있다. 또한, 융합된 모이어티는 유전적으로 융합될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유전적으로 융합된", "유전적으로 연결된" 또는 "유전자 융합된"은 단백질, 폴리펩티드 또는 단편을 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현에 의한 개별적 펩티드 주쇄를 통한 2개 이상의 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편의 공직선성 공유 연결 또는 부착을 지칭한다. 이러한 유전자 융합은 단일의 인접한 유전자 서열의 발현을 야기한다. 바람직한 유전자 융합은 인프레임이고, 즉 2개 이상의 개방형 해독 프레임(ORF)이 원래 ORF의 정확한 해독 프레임을 유지하는 방식으로 융합되어 계속 이어지는 보다 긴 ORF를 형성한다. 따라서, 생산된 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 단백질 분절을 함유하는 단일 폴리펩티드이다(상기 분절은 일반적으로 자연에서 그렇게 연결되지 않는다). 이러한 경우에, 단일 폴리펩티드는 처리 동안 절단되어 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이량체성 분자가 생산된다.
본원에 사용된 용어 "변형"은 폴리펩티드 서열의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실, 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티의 변경, 또는 단백질, 예를 들어 항체의 기능의 변형을 지칭한다. 예를 들어, 변형은 항체의 변경된 기능, 또는 단백질에 부착된 변경된 탄수화물 구조일 수 있다. 본원에 사용된 "아미노산 변형"은 항체에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이(치환), 삽입(부가) 또는 결실을 지칭한다. 용어 "아미노산 돌연변이"는 또 다른 상이한 아미노산 잔기에 의한 하나 이상의 기존 아미노산 잔기의 치환(예를 들어 아미노산 잔기의 대체)을 나타낸다. 용어 "아미노산 결실"은 아미노산 서열의 사전 결정된 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 나타낸다. 예를 들어, 돌연변이 L234A는 항체 Fc-영역의 위치 234의 아미노산 잔기 리신이 아미노산 잔기 알라닌으로 치환됨을 나타낸다(알라닌에 의한 리신의 치환)(EU 인덱스에 따른 넘버링 넘버링 체계). "자연 발생 아미노산 잔기"는 알라닌(3-문자 코드: Ala, 1-문자 코드: A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라긴(Asn, N), 아스파르트산(Asp, D), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gin, Q), 글루탐산(Glu, E), 글리신(Gly, G), 히스티딘(His, H), 이소류신(He, I), 류신(Leu, L), 리신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y) 및 발린(Val, V)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타낸다.
본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 본원에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 제거하지 않거나 실질적으로 변경하지 않고 야생형 서열의 결합제, 예를 들어 항체로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면에, "필수" 아미노산 잔기는 이러한 변화를 야기한다. 항체에서, 필수 아미노산 잔기는 특이성 결정 잔기(SDR)일 수 있다.
용어 "제제"는 생물학적 거대 분자, 생물학적 물질로부터 생산한 추출물, 생물학적 거대 분자의 혼합물, 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 및/또는 화학적 화합물 및 생물학적 거대 분자의 혼합물을 나타내도록 본원에서 사용된다. 용어 "치료제"는 생물학적 활성을 갖는 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 "단클론 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별적 항체가 부수적인 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 지향성이어서 고도로 특이적이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 지향성인 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 각각은 항원 상의 단일 결정기에 지향성이다. 수식어 "단클론"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득한 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]에 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 생산될 수 있거나, 예컨대 US 4,816,567에 기재된 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 예를 들어 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990]에 기재된 기술을 사용하여 생산한 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 항체는 "인간화된 항체"일 수 있다. 본원에 사용된 "인간화된" 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 키메라 면역 글로불린, 면역 글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원 결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 기타 포유동물) 항체의 형태를 지칭한다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 "이입(import)" 가변 도메인으로부터 가져온 "이입" 잔기로 흔히 지칭된다. 이입 잔기, 서열 또는 항체는 본원에 논의된 바와 같이 목적하는 친화도 및/또는 특이성, 또는 기타 바람직한 항체 생물학적 활성을 갖는다.
바람직하게는, 인간화된 항체는, 수용자의 상보 결정 영역(CDR)의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역 글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역 글로불린의 Fv 골격 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 이입된 CDR 또는 골격 서열 모두에서 발견되지 않으나 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화시키도록 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 영역을 포함하되, 여기서 모든 또는 실실적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역 글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역 글로불린 공통 서열의 것이다. 또한, 인간화된 항체는 전형적으로 인간 면역 글로불린의 것인 면역 글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부를 최적으로 포함할 것이다. WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 쇄를 갖는 항체가 바람직하다. 인간화된 항체의 다른 형태는 원래 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR(CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 또는 CDR H3)(원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR로부터 "유래된" 하나 이상의 CDR로도 지칭됨)을 갖는다. 본원에 사용된 "인간화된"은 탈면역화된 항체를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 및/또는 당업자에게 공지되거나 본원에 개시된 임의의 인간 항체 생산 기술을 사용하여 생산된 항체를 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어 CDR, 특히 CDR3에 인간 생식계열 면역 글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체의 이러한 정의는 하나 이상의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 하나 이상의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 이의 예는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되되, 여기서 상기 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다(문헌[Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996]; [Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991]). 또한, 인간 항체는, 인간 면역 글로불린 유전자좌가 내인성 유전자좌를 대신하여 유전자 이식에 의해 도입된 동물, 예를 들어 내인성 면역 글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스의 면역화에 의해 생산될 수 있다. 이러한 접근법은 US 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 지향성인 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 생산될 수 있다(이러한 B 림프구는 개체로부터 또는 cDNA의 단일 세포 클로닝으로부터 회복될 수 있거나, 시험관내 면역화될 수 있다). 예를 들어, 문헌[Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, 1991]; 및 US 5,750,373을 참조한다.
본 발명의 인간 항체는 힌지 이종 성분과 회합된 2개 이상의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린 분자는 이량체가 쇄간 중쇄 다이설파이드 결합에 의해 함께 고정된 약 150 내지 160 kDa의 안정한 4개의 쇄 구축물을 포함한다. 대안적으로, 이량체는 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 연결되지 않고, 공유 커플링된 경쇄 및 중쇄로 구성되도록 형성된 약 75 내지 80 kDa의 분자(하프-항체(half-antibody))이다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 생산되고 발현되고 생성되고 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기에 추가로 기재됨), 재조합 결합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체(하기에 추가로 기재됨), 인간 면역 글로불린 유전자에 대해 유전자 이식된 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어 문헌[Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295] 참조), 또는 다른 DNA 서열에 인간 면역 글로불린 유전자 서열을 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 기타 방법에 의해 생산되거나 발현되거나 생성되거나 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 동물 유전자 이식이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이 유발)되고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열이다.
본 발명의 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 해당하는 서열과 동일하거나 그에 상응하고, 상기 쇄의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체, 및 이러한 항체의 단편의 해당하는 서열과 동일하거나 이에 상응하는, "키메라" 항체일 수 있되, 이는 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다(US 4,816,567; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851 -6855, 1984]). 본원의 해당 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들어 구대륙 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 영역 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화된 항체를 포함한다.
"일가 항체"는 분자 당 하나의 항원 결합 부위(예를 들어 IgG 또는 Fab)를 포함한다. 일부 경우에, 일가 항체는 하나 초과의 항원 결합 부위를 가질 수 있으나, 상기 결합 부위는 상이한 항원으로부터의 것이다.
"단일특이적 항체"는, 2개의 결합 부위가 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는, 분자 당 2개의 동일한 항원 결합 부위(예를 들어 IgG)를 포함하는 항체 또는 항체 제제를 지칭한다. 따라서, 이는 하나의 항원 분자에 대한 결합에 대해 서로 경쟁한다. 상기 용어는 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"을 포함한다. 자연에서 발견되는 대부분의 항체는 단일특이적이다. 일부 경우에, 단일특이적 항체는 또한 일가 항체(예를 들어 Fab)일 수 있다.
"이가 항체"는 분자 당 2개의 항원 결합 부위(예를 들어 IgG)를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 이가 항체는 이중특이적일 수 있다.
본원에 사용된 "이중특이적 항체", "이중-특이적 항체", "이작용성 항체", "이종다량체", "이종다량체성 복합체", "이중특이적 이종이량체성 다이아바디" 또는 "이종다량체성 폴리펩티드"는 적어도 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 분자이되, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기만큼 상기 제1 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 바람직하게는, 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 리간드, 항원 또는 결합 부위에 대한 결합 특이성을 갖는다. 따라서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체의 2개의 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적, 예를 들어 종양 표적 상에 존재하는 2개의 상이한 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 "표적 항원", "표적 세포 항원", "종양 항원" 또는 "종양 특이적 항원"은 표적 세포, 예를 들어 종양 내 세포, 예컨대 암 세포 또는 종양 스트로마의 세포의 표면 상에 제시된 항원 결정기를 지칭한다.
용어 "돌연변이 부하", "돌연변이성 부하", "돌연변이 부담" 및 "돌연변이성 부담"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 종양 돌연변이 부하는, 종양 게놈의 암호화 영역 당 돌연변이의 총 수로서 정의되는, 종양 게놈 내의 돌연변이의 수의 표시이다. 단지 몇 개의 내지 수천개의 돌연변이 범위의 종양 유형 내에서 돌연변이 부담의 대규모 변동성이 존재한다(문헌[Alexandrov LB et al., Nature 2013;500(7463):415-421]; [Lawrence MS et al., Nature 2013;499:214-218]; [Vogelstein B et al., Science, 2013;339:1546-1558]).
본원에 사용된 "이중특이적 항체"의 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄는 적어도 하나의 항체 VL 및 하나의 항체 VH 영역, 또는 이의 단편을 포함하되, 여기서 항체 결합 도메인 모두는 단일 폴리펩티드 쇄 내에 포함되고, 각각의 폴리펩티드 쇄의 VL 및 VH 영역은 상이한 항체로부터의 것이다.
이중특이적 항체, 이중-특이적 항체, 이작용성 항체, 이종다량체, 이종다량체성 복합체, 이중특이적 이종이량체성 다이아바디 또는 이종다량체성 폴리펩티드는 제1 및 제2 폴리펩티드에 더하여 다른 폴리펩티드가 존재하는 고차 삼차 구조를 형성할 수 있다. 이종다량체의 폴리펩티드는 비-펩티드성 공유 결합(예를 들어 다이설파이드 결합) 및/또는 비공유 상호작용(예를 들어 수소결합, 이온결합, 반데르발스힘 및/또는 소수성 상호작용)에 의해 서로 상호작용할 수 있다.
이중특이적 항체, 이중-특이적 항체, 이작용성 항체, 이종다량체, 이종다량체성 복합체, 이중특이적 이종이량체성 다이아바디 또는 이종다량체성 폴리펩티드는, 쇄내가 아닌 V 영역의 쇄간 쌍 이룸이 달성되어 이가 단편(즉 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편)을 초래하도록 VH 영역과 VL 영역 사이에 sFv 단편을 짧은 링커(예를 들어 약 3 내지 10개의 잔기)에 의해 구축시킴으로써 생산될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)으로부터 유래될 수 있다. 다이아바디는 예를 들어 EP404,097; WO93/11161; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993]에 보다 충분히 기재되어 있다. 이중특이적 항체는 2개의 항체의 VH 및 VL 영역이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는 2개의 "크로스오버" sFv 단편의 이종이량체이다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 자연 환경의 하나 이상의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 하나 이상의 성분으로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체는 본 발명의 목적을 위해 "단리된 항체"이다. 또한, 단리된 항체는 재조합 세포 내 동일반응계 항체를 포함한다. 단리된 항체는 하나 이상의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 특정 실시양태에 따라, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 미함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된" 또는 "연결되다"는 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 직접 펩티드 결합 연결, 또는 제1 및 제2 아미노산 서열에 및 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이에 펩티드 결합된 제3 아미노산 서열을 포함하는 연결을 지칭한다. 예를 들어, 링커 펩티드는 하나의 아미노산 서열의 C-말단 단부 및 나머지 아미노산 서열의 N-말단 단부에 결합된다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 길이가 2개 이상의 아미노산인 아미노산 서열을 지칭한다. 링커는 중성의 극성 또는 비극성 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커는 예를 들어 2 내지 100개의 아미노산의 길이, 예컨대 2 내지 50개의 아미노산의 길이, 예를 들어 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 링커는 자동 절단, 또는 효소 또는 화학물질에 의한 절단에 의해 "절단성"일 수 있다. 절단되는 아미노산 서열, 효소 및 화학물질의 절단 부위는 당분야에 주지되어 있고 또한 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "다이설파이드 결합" 또는 "시스테인-시스테인 다이설파이드 결합"은, 시스테인의 황 원자가 산화되어 다이설파이드 결합을 형성하는, 2개의 시스테인 사이의 공유 상호작용을 지칭한다. 수소 결합에 대한 1 내지 2 kcal/mol과 비교하여, 다이설파이드 결합의 평균 결합 에너지는 약 60 kcal/mol이다. 본 발명에 있어서, 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인은 단일 쇄 항체의 골격 영역 내에 존재하고 항체의 형태를 안정화시키는 역할을 한다. 시스테인 잔기는 예를 들어 부위 지향된 돌연변이 유발에 의해 도입되어 분자 내에 안정화 다이설파이드 결합이 생성될 수 있다.
"놉-인-홀 명칭"은 "돌기 및 공동" 명칭과 유사하고, 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"돌기" 또는 "놉"은, 제1 폴리펩티드의 접점으로부터 돌출되고, 따라서 이종이량체를 안정화시키고 그에 따라 동종이량체 형성보다 이종이량체 형성을 장려하기 위해 인접 접점(즉 제2 폴리펩티드의 접점)에서 상보적 공동에 위치가능한, 하나 이상의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 돌기는 원래 접점에 존재할 수 있거나 (예를 들어 접점을 암호화하는 핵산 변경함으로써) 합성에 의해 도입될 수 있다. 일반적으로, 제1 폴리펩티드의 접점을 암호화하는 핵산은 돌기를 암호화하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제1 폴리펩티드의 접점에서 하나 이상의 원래 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산은, 원래 아미노산 잔기보다 큰 측쇄 부피를 갖는 하나 이상의 이입 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체된다. 대체되는 원래 잔기의 수의 상한은 제1 폴리펩티드의 접점의 잔기의 총 수이다. 돌기의 형성을 위한 특정 이입 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로부터 선택된다.
돌기 또는 놉은 각각 제1 폴리펩티드의 접점 및 제2 폴리펩티드 상의 돌기 및 공동의 공간적 위치를 의미하는 공동 또는 홀에 "위치가능"하고, 돌기 및 공동의 크기는 돌기가 접점에서 제1 및 제2 폴리펩티드의 통상적 회합을 유의미하게 섭동시키지 않고 공동에 위치할 수 있도록 하는 것이다. 돌기, 예컨대 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)은 전형적으로 접점의 축으로부터 수직으로 연장되지 않기 때문에, 돌기와 상응하는 공동의 정렬은 예컨대 X-선 결정학 또는 핵자기공명(NMR)에 수득한 3-차원 구조를 기반으로 한 돌기/공동 쌍의 모델링에 의존적이다. 이는 당분야에 널리 인정되는 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
"공동" 또는 "홀"은, 제2 폴리펩티드의 접점으로부터 우묵한 곳을 형성하고 따라서 인접 제1 폴리펩티드의 접점 상의 상응하는 돌기를 수용하는 하나 이상의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 공동은 원래 접점에 존재할 수 있거나, (예를 들어 접점을 암호화하는 핵산을 변경함으로써) 합성에 의해 도입될 수 있다. 일반적으로, 제2 폴리펩티드의 접점을 암호화하는 핵산은 공동을 암호화하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 접점의 하나 이상의 원래 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산이 원래 아미노산 잔기보다 작은 측쇄 부피를 갖는 하나 이상의 "이입" 아미노산 잔기를 암호화하는 DNA로 대체된다. 대체되는 원래 잔기의 수의 상한은 제2 폴리펩티드의 접점의 잔기의 총 수이다. 공동의 형성을 위한 특정 이입 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "접점", "접점 잔기", "접점 아미노산", "접촉 잔기" 또는 "접촉 아미노산"은 전형적으로 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 접촉에 수반될 수 있는 도메인에 존재하는 임의의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"원래 아미노산" 잔기는, 원래 잔기보다 작거나 큰 측쇄 부피를 가질 수 있는 "이입 아미노산" 잔기로 대체되는 것이다. 이입 아미노산 잔기는 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산 잔기일 수 있되, 바람직하게는 전자이다. "자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화되는 잔기이다. "비-자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암화화되지 않는 잔기이되, 이는 폴리펩티드 쇄의 인접 아미노산 잔기에 공유 결합할 수 있다. 비-자연 발생 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 기타 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌[Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기재된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 원래 아미노산 잔기의 대체를 수반할 수 있으나, 하나 초과의 원래 잔기가 대체될 수 있다. 일반적으로, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 접점의 전체 잔기보다 많지 않은 잔기는 대체되는 원래 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 일부)이 제2 항체 또는 이의 항원 결합부의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 제1 항체와 이의 동족 에피토프의 결합의 결과가, 제2 항체의 부재 하에 제1 항체의 결합과 비교하여, 제2 항체의 존재 하에 눈에 띄게 감소되는 것을 의미한다. 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에 눈에 띄게 감소되는 대안은 그런 경우도 있으나 꼭 그럴 필요는 없다. 즉 제1 항체는 제1 항체의 이의 각각의 에피토프에 대한 결합을 억제하는 제2 항체의 부재 하에 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일하거나 더 크거나 더 적은 정도로 다른 항체의 이의 동족 에피토프 또는 리간드에 대한 결합을 눈에 띄게 억제하는 경우, 항체는 이의 각각의 에피토프의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"한다고 일컬어진다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 둘 모두가 본 발명에 포함된다. 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 메커니즘과 관계 없이(예를 들어 입체 장애, 형태 변화, 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부에 대한 결합), 숙련가는 본원에 제공된 교시를 기반으로, 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포함되고 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있음을 이해한다.
본원에 사용된 "항체 의존적 세포 매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포(예컨대 천연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식 세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개된 반응을 지칭한다. 해당 분자의 ADCC 활성은 US 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 해당 분자의 ADCC 활성은 예컨대 문헌[Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656, 1998]에 개시된 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다.
본원에 사용된 "보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합화된 분자(예를 들어 항체)로의 보체 시스템(C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예컨대 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163, 1996]에 기술된 CDC 분석이 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 특이적으로 결합하다", "면역 특이적으로 인식하다", "특이적으로 결합하다", "특이적으로 인식하다" 및 유사한 용어는, 분자, 예를 들어 결합 도메인이 항원(예를 들어 에피토프 또는 면역 복합체)에 특이적으로 결합하나 또 다른 분자에는 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 당분야에 공지된 분석, 예를 들어 면역 분석, BIACORE(상표) 또는 기타 분석에 의해 결정시 낮은 친화도에 의해 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 다른 단백질과 교차-반응하지 않는다.
적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액 중에서 사전 세척하고; 50℃ 내지 65℃에서, 5 X SSC에서 밤새 하이브리드화시키고; 이어서 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 세척 동안 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어, 0.015 M 나트륨 클로라이드/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 50℃에서 사용하거나, (2) 하이브리드화 동안 변성제, 예컨대 폼아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 나트륨 포스페이트 완충제를 함유하는 50%(v/v) 폼아미드(pH 6.5)를 750 mM 나트륨 클로라이드, 75 mM 나트륨 시트레이트와 함께 42℃에서 사용하거나, (3) 42℃에서 0.2x SSC(나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트) 중에서 세척하면서 50% 폼아미드, 5x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 피로나트륨 포스페이트, 5x 덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 μg/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 42℃에서, 및 50% 폼아미드를 55℃에서 사용하고, 이어서, 55℃에서 0.1x SSC 함유 EDTA로 이루어진 고-엄격성 세척을 사용하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알 것이다.
결합 단백질, 결합 도메인, CDR 또는 항체(본원에서 광범위하게 정의됨)는 카바트 정의, 초티아(Chothia) 정의, 카바트 및 초티아 둘 모두의 축적물의 정의, AbM 정의, 콘택트(contact) 정의, 노쓰(North) 정의 및/또는 형태 정의, 또는 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. (hypervariable regions)]; [Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989 (structural loop structures)]을 참조한다. CDR을 구성하는 특정 항체의 아미노산 잔기의 확인은 당분야에 주지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. CDR의 AbM 정의는 카바트와 초티아 사이의 절충물이고, 옥스포드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Accelrys(등록상표))를 사용한다. CDR의 "콘택트" 정의는 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996]에 제시된 바와 같이 관찰된 항원 접촉부를 기반으로 한다. CDR의 "형태" 정의는 항원 결합에 대해 엔탈피 기여하는 잔기를 기반으로 한다(예를 들어 문헌[Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2008] 참조). 노쓰는 다양한 바람직한 세트의 CDR 정의를 사용하여 기본 CDR 형태를 확인하였다(문헌[North et al., J. Mol. Biol. 406: 228-256, 2011]). 본원에서 CDR의 "형태 정의"로서 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대해 엔탈피 기여하는 잔기로서 확인될 수 있다(문헌[Makabe et al., J Biol. Chem. 283:1156-1166, 2008]). 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나에 엄격히 따르지 않으나, 특정 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 결과를 고려하여 단축되거나 연장될 수 있으나 카바트 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 CDR은 당분야에 공지된 임의의 접근법(접근법의 조합을 포함함)에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 임의의 이들 접근법에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다. 하나 초과의 CDR을 함유하는 임의의 제시된 실시양태의 경우, CDR(또는 항체의 다른 잔기)은 카바트, 초티아, 확장된 정의(카바트 및 초티아), 노쓰, 확장된 정의, AbM, 콘택트, 및/또는 형태 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
가변 도메인의 잔기는 항체의 편집물의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 사용되는 넘버링 체계인 카바트에 따라 넘버링된다. 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]을 참조한다. 이러한 넘버링 체계를 사용하여, 실제 선형인 아미노산 서열은 가변 영역의 FR 또는 CDR의 단축 또는 내부로의 삽입에 해당하는 소수의 또는 부가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물(카바트에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예를 들어 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열에 대한 항체의 서열의 동종관계의 영역에서 정렬에 의해 제시된 항체에 대해 결정될 수 있다. 카바트 넘버링의 부과에 대한 다양한 알고리즘이 이용가능하다. Abysis의 버전 2.3.3 발매물(www.abysis.org)에서 사용되는 알고리즘은 가변 영역 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR2 및 VH CDR3에 카바트 넘버링을 부과하는 데 사용되었다. AbM 정의는 VH CDR1에 대해 사용되었다. 또한, 항체의 특정한 아미노산 잔기 위치는 카바트에 따라 넘버링될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "파지 디스플레이 라이브러리"는 박테리오파지의 집단을 지칭하며, 이들 각각은 표면 단백질에 인프레임으로 재조합으로 융합된 외래 cDNA를 함유한다. 파지는 이의 표면 상에 cDNA에 의해 암호화되는 외래 단백질을 전시한다. 박테리아 숙주(전형적으로 에스케리키아 콜라이)에서 복제 후에, 해당 외래 cDNA를 함유하는 파지는 파지 표면 상의 외래 단백질의 발현에 의해 선택된다.
용어 "에피토프"는, 파라토프(paratope)로 공지된 항체의 항원 결합 영역 중 하나 이상에서 항체에 의해 인식될 수 있고/있거나 접촉부를 생성할 수 있고/있거나 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 흔히 화학적 활성 표면으로 분류된 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 이루어지고, 특정 3-차원 구조적 특징 및 특정 전하 특징을 갖는다. 본원에 사용된 에피토프는 형태 에피토프 또는 선형 에피토프일 수 있다. 형태 에피토프는 선형 폴리펩티드 쇄의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 쇄에서 인접 아미노산 잔기에 의해 생산된 것이다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 항원 상의 사카라이드, 포스포릴 기 또는 설폰일 기의 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 당분야에 주지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 통상적인 면역 분석에 의해 결정되는 항체가 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 부분으로서 정의된다. "비선형 에피토프" 또는 "형태 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질 내에 비연속적 폴리펩티드(또는 아미노산)를 포함한다. 항원 상의 목적하는 에피토프가 결정된 후에, 예를 들어 본원에 기재된 기술을 사용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생산하는 것이 가능하다.
항체와 단백질 또는 펩티드의 상호작용과 관련하여 사용될 때 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합함"은 단백질 상에 특정 구조물(즉 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존적인 상호작용을 지칭한다; 달리 말하면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특이적 단백질 구조를 인식하고 그에 결합한다. 예를 들어, 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리된 표지되지 않은 A)를 함유하는 단백질의 존재는 항체에 결합한 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
특정 실시양태에서 "특이적으로 결합하다"는 예를 들어 약 0.1 nM 이하, 보다 통상적으로 약 1 μM 미만의 KD에 의해 항체가 단백질에 결합함을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합하다"는 때때로 적어도 약 0.1 μM 이하, 다른 때에는 적어도 약 0.01 μM 이하, 다른 때에는 적어도 약 1 nM 이하의 KD에 의해 항체가 표적에 결합함을 의미한다. 상이한 종에서 동종 단백질 사이의 서열 동일성으로 인해, 특이적 결합은 하나 초과의 종의 단백질(예를 들어 인간 GUCY2c 및 마우스 GUCY2c)을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상이한 단백질의 폴리펩티드 서열의 특정 영역 내에서 동종 관계로 인해, 특이적 결합은 하나 초과의 단백질을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 모이어티가 제2 표적에 특이적으로 결합하지 않거나 특이적으로 결합할 수 있음이 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합"은 배타적 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (이를 포함할 수 있으나) 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 따라서, 항체는 일부 실시양태에서, 하나 초과의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다중 표적은 항체 상의 동일한 항원 결합 부위에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체는, 특정 예에서, 2개의 동일한 항원 결합 부위를 포함할 수 있되, 이들 각각은 2개 이상의 단백질 상의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정한 대안적 실시양태에서, 항체는 다중특이적일 수 있고 특이성이 상이한 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 이중특이적 항체는 하나의 단백질 상의 에피토프(예를 들어 인간 CD3)를 인식하는 하나의 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 제2 단백질 상의 상이한 에피토프를 인식하는 제2의 상이한 항원 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 반드시 그럴 필요는 없으나 일반적으로, 결합의 언급은 특이적 결합을 의미한다.
항원에 특이적으로 결합하는 항체는 당분야에 공지된 분석, 예를 들어 면역 분석, BIACORE(상표) 또는 기타 분석에 의해 결정시 낮은 친화도로 인해 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 단백질과 교차-반응하지 않는다.
항체와 단백질 또는 펩티드의 상호작용과 관련하여 사용될 때 용어 "비-특이적 결합" 또는 "백그라운드 결합"은 특정 구조의 존재에 의존적이지 않은 상호작용을 지칭한다(즉 항체는 특정 구조, 예컨대 에피토프보다는 일반적으로 단백질에 결합한다).
본원에 사용된 용어 "kon" 또는 "ka"는 항원에 대한 항체의 결합의 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 속도 상수(kon/ka 및 koff/kd) 및 평형 해리 상수는 전체 항체(즉 이가) 및 단량체성 GUCY2c 단백질을 사용하여 측정된다.
본원에 사용된 용어 "koff" 또는 "kd"는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리의 속도 상수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예를 들어 항체)와 이의 결합 파트너(예를 들어 항원) 사이의 전체 비공유 상호작용의 합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 표현될 수 있다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 표현될 수 있다. 예를 들어, Kd는 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM 또는 보다 강할 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하는 당분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저 친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 용이하게 해리되는 경향을 가지는 반면에, 고 친화도 항체는 일반적으로 항원에 빠르게 결합하고 결합된 상태를 보다 길게 유지하는 경향을 갖는다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특히, 용어 "결합 친화도"는 특정 항원-항체 상호작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. KD는 "결합 속도(kon)"에 대한 "해리 속도(koff)"의 비이다. 따라서, KD는 koff/kon과 같고, 몰 농도(M)로서 표현된다. 따라서, KD가 작을수록 결합의 친화도가 강하다. 따라서, 1 μM의 KD는 1 nM의 KD와 비교하여 약한 결합 친화도를 나타낸다. 항체의 KD 값은 당분야에 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 하나의 방법은 전형적으로 바이오센서 시스템, 예컨대 BIACORE(상표) 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용함에 의한 것이다. BIACORE(상표) 동력학 분석은 표면 상에 고정화된 분자(예를 들어 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자)를 갖는 칩으로부터 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 항체의 KD를 결정하는 또 다른 방법은, 전형적으로 OCTET(등록상표) 기술(Octet QKe 시스템(포르테바이오(ForteBio))을 사용하는 바이오-레이어(Bio-Layer) 간섭법을 사용함에 의한 것이다.
본 발명의 이중특이적 항체, 예컨대 항체, 이의 단편 또는 유도체와 관련하여 "생물학적으로 활성인", "생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 명시된 경우를 제외하고 생물학적 분자에 결합하는 능력을 갖는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드 서열"은 DNA 분자(예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어 mRNA), DNA 및 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 이러한 유사체는 예를 들어 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생산될 수 있고 이는 비제한적으로 이노신 또는 트라이틸화된 염기를 포함한다. 또한, 이러한 유사체는 유리한 특성, 예를 들어 뉴클레아제 내성 또는 증가된 세포막을 가로지르는 능력을 분자에게 제공하는 변형된 주쇄를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 단일 가닥 및 이중 가닥 부분 모두를 함유할 수 있고, 삼중 가닥 부분을 함유할 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 항체 및 항체의 결합 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정된다.
본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함할 수 있다: 단지 변이체에 대한 암호화 서열, 변이체에 대한 암호화 서열 및 추가적 암호화 서열, 예컨대 기능적 폴리펩티드, 또는 신호 또는 분비 서열 또는 전구-단백질 서열; 항체에 대한 암호화 서열 및 비-암호화 서열, 예컨대 인트론, 또는 항체에 대한 암호화 서열의 비-암호화 서열 5' 및/또는 3'. 용어 "항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 변이체에 대한 추가적 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 추가적 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특이적 숙주 세포/발현 시스템에 대해 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열이 목적하는 단백질의 아미노산 서열로부터 용이하게 수득될 수 있음이 당분야에 공지되어 있다(GENEART(등록상표) AG(독일 레젠스부르크 소재) 참조).
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 추가적인 보존적 또는 비필수 아미노산 치환을 가질 수 있고, 이는 폴리펩티드 기능에 대해 실질적인 영향을 미치지 않는다. 특정 치환이 관용되는지 여부, 즉 목적하는 생물학적 특성, 예컨대 결합 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는지 여부는 문헌[Bowie, JU et al. Science 247: 1306-1310,1990] 또는 [Padlan et al. FASEB J. 9: 133-139, 1995]에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 원래 환경(예를 들어 자연 발생한 경우 자연 환경)으로부터 제거된 물질을 지칭한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계에서 공존하는 물질 중 일부 또는 전부로부터 분리된 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 세포 또는 배양된 세포를 포함하는 조성물, 예를 들어 혼합물, 용액 또는 현탁액의 일부일 수 있고, 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "레플리콘(replicon)"은 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 복제의 자율적 단위체로서 행동하는 임의의 유전 요소, 예컨대 플라스미드, 염색체 또는 바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 기재된 성분이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록하는 관계에 있는 상황을 지칭한다. 예를 들어, 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 제어 서열은, 암호화 서열의 발현이 적합하거나 제어 서열과 양립할 수 있는 조건 하에 달성되는 방식으로 결장된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이고 해독 단계에 존재함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 관례에 따라 사용된다.
본원에 사용된 "벡터"는, 숙주 세포에서 하나 이상의 해당 유전자 또는 서열을 전달할 수 있고, 바람직하게는 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 비제한적으로 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 프로듀서 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "발현 제어 서열" 또는 "제어 서열"은 이것이 결찰된 암호화 서열의 발현을 수행하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 상이하다. 예를 들어, 원핵 생물에서, 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 종결자, 및 일부 경우에, 인핸서를 포함한다. 따라서, 용어 "제어 서열"은 발현을 위해 존재가 필요한 최소한 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 존재가 유리한 추가적 성분, 예를 들어 리더 서열을 포함할 수 있다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별적 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연 돌연변이, 우발적 돌연변이 또는 의도적 돌연변이로 인해 (형태 또는 게놈 DNA 상보성에 있어서) 원래 모 세포와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
본원에 사용된 "포유동물 세포"는 인간, 래트, 마우스, 기니피그, 침팬지 또는 마카크를 포함하는 포유동물로부터 유래된 세포를 포함한다. 세포를 생체내 또는 시험관내 배양할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정제된 생성물"은 생성물이 일반적으로 결합된 세포 구성성분으로부터 및/또는 해당 샘플에 존재할 수 있는 다른 유형의 세포로부터 단리된 생성물의 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(즉 오염 물질이 없음), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "암" 또는 "암성"은, 비정상적인 제어되지 않는 세포 성장으로부터 야기되는, 제어되지 않는 세포 성장, 신생물 또는 종양을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 질환을 지칭하거나 기술한다. 일부 양상에서, 암은 국부화된 전이 없는 악성 원발성 종양을 지칭한다. 다른 양상에서, 암은 이웃하는 신체 구조를 침입하거나 파괴하고 동떨어진 부위에 퍼지는 악성 종양을 지칭한다. 일부 양상에서, 암은 특이적 암 항원과 연관된다. 암의 예는 비제한적으로 구강 및 인두, 소화계(예를 들어 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장) 또는 내분비계의 암을 포함한다. 특정 실시양태에서, 소화계의 암은 식도암, 위암, 소장암, 결장암, 직장암, 항문암, 간암, 담낭암, 맹장암, 담관암 및 췌장암이다.
본원에 사용된 용어 "식도암"은, 식도 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 질환으로서 식도암을 정의하는 일반적으로 인정되는 의학적 정의를 포함하는 것으로 의도된다. 식도암의 예는 선암, 편평 상피 세포 암종, 융모막 암종, 림프종, 육종 및 소세포 암을 포함한다.
"위장"(GI) 암은 소화계에 영향을 미치는 암의 군을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "위암"은 위 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 질환으로서 위암을 정의하는 일반적으로 인정되는 의학적 정의를 포함하는 것으로 의도된다. 특히, 위암은 악성 세포가 위의 내벽에서 형성되는 질병이다. 위암은 위의 임의의 부분에서 발생할 수 있고 위 전체에 및 다른 기관, 특히 식도, 폐 및 간으로 퍼질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대장암" 또는 "장암"은 소장 아래의 위장관(즉 맹장, 상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장 및 구불 결장, 및 직장을 포함하는 대장(결장))의 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 질환으로서 대장암을 정의하는 인정되는 의학적 정의를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에 사용된 용어 "대장암"은 십이지장 및 소장(공장 및 회장)의 세포의 암을 특징으로 하는 의학적 질환을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 대장암의 정의는 통상적인 의학적 정의보다 광범위하나 십이지장 및 소장의 세포가 또한 GUCY2c를 함유하기 때문에 그와 같이 제공된다.
본원에 사용된 용어 "악성 세포" 또는 "악성 종양"은, 침습성이고/이거나 전이를 겪을 수 있는 종양 또는 종양 세포, 즉 암성 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료함" 또는 "치료"는 유익하거나 목적하는 임상적 결과를 수득하는 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 치료는 GUCY2c 항체 분자(예를 들어 GUCY2c 단클론 항체, 또는 GUCY2c 이중특이적 또는 다중특이적 항체)를 개체, 예를 들어 환자에게 투여하는 것으로 정의된다. 이러한 투여는 예를 들어 개체에 대한 직접 투여 또는 개체에게 반환되는 개체로부터의 단리된 조직 또는 세포에 대한 적용일 수 있다. GUCY2c 항체 분자는 단독으로 또는 하나 이상의 제제와 병용으로 투여될 수 있다. 치료는 장애, 장애의 증상 또는 장애에 대한 소인, 예를 들어 암을 치유하거나 낫게 하거나 완화시키거나 덜어주거나 변경하거나 고치거나 개선하거나 경감시키거나 영향을 미치는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 하기 중 임의의 하나 이상의 것에 유용하다: (a) 개체에서 GUCY2c를 발현하는 악성 세포와 연관된 질환(예를 들어 위장 관련된 암, 예컨대 대장암(CRC))의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선함; (b) GUCY2c를 발현하는 악성 종양을 갖는 개체에서 종양 성장 또는 진행 억제; (c) GUCY2c를 발현하는 하나 이상의 악성 세포를 갖는 개체에서 GUCY2c를 발현하는 암(악성) 세포의 전이 억제; (d) GUCY2c를 발현하는 종양의 퇴행(예를 들어 장기 퇴행) 유도; (e) GUCY2c를 발현하는 악성 세포에서 세포독성 활성의 행사; (f) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체의 무진행 생존의 증가; (g) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체의 전체 생존 증가; (h) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체에서 추가적 화학치료제 또는 세포독성제의 사용 감소; (i) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체에서 종양 부담 감소; 또는 (j) 확인되지 않은 인자와 GUCY2c의 상호작용의 차단. 이론에 얽매이지 않고, 치료는 시험관내 또는 생체내 세포의 억제, 절제 또는 사멸을 야기하거나, 장애, 예를 들어 본원에 기재된 장애, 예컨대 암을 매개하는 변종 세포를 포함하는 세포의 능력의 감소시키는 것으로 생각된다.
본원에 사용된 "지사제"는 설사를 중단시키거나 감속시키는 의약을 의미한다. 락토스, 알코올, 고 삼투압 제품의 중단과 함께 유체 투여를 포함할 수 있는 보조적 조치에 더하여, 이들 지사제가 GUCY2c 이중특이적 항체와 공통-투여되거나 병용될 수 있다. 지사제는 비제한적으로 비스무트 서브갈레이트, 락토바실러스 아시도필러스, 사카로미세스 불라르디, 로페라미드/시메티콘, 아트로핀/다이페녹시레이트, 아트로핀/다이페녹신, 사카로미세스 불라르디 라이오, 락토바실러스 아시도필러스, 로페라미드, 비스무트 서브살리실리에트, 락토바실러스 아시도필러스/락토바실러스 불가리서스, 락토바실러스 람노서스, 애타펄자이트, 크로펠레머, 플루오로퀴놀론, 항생제 또는 옥트레오티드를 포함한다. 문헌[Bensen et al. Recommended Guidelines for the Treatment of Cancer Treatment-Induced Diarrhea. Journal of Clinical Oncology 14: 2918-2926, 2004]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "개체"는 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하는 임의의 동물(예를 들어 포유동물)을 포함하는 것으로 의도되고, 이는 특정 치료의 수용자일 수 있다. 예를 들어, 개체는 암을 앓는 환자(예를 들어 인간 환자 또는 수의학 환자)일 수 있다. 전형적으로, 용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 인간 개체와 관련하여 상호교환적으로 사용된다.
용어 본 발명의 "비-인간 동물"은 달리 기재되지 않는 한 모든 비-인간 척추동물, 예를 들어 비-인간 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 말, 닭, 양서류 파충류, 마우스, 래트, 토끼 또는 염소 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은, 인간을 포함하는 동물에서 사용하기 위해, 연방 정부 또는 주 정부의 규제기관에 의해 승인되거나(승인될 수 있거나) US 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 제품 또는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 보조제" 또는 "허용되는 약학적 담체"는, 본원의 하나 이상의 항체와 함께 개체에게 투여될 수 있고 상기 항체의 활성을 파괴하지 않는 부형제, 담체 또는 보조제를 지칭한다. 부형제, 담체 또는 보조제는 치료 효과를 전달하기에 충분한 투여량의 항체와 함께 투여될 때 비독성이어야 한다.
본원에 사용된 용어 "개선함"은 본 발명의 항체 분자를 투여하지 않은 것과 비교하여 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선을 의미한다. 또한, "개선함"은 증상의 지속기간의 단축 또는 축소를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방함" 및 "예방"은 예방제 또는 치료제의 투여의 결과로서 개체에서 장애의 하나 이상의 증상의 재발 또는 발병의 예방을 지칭한다.
본원에 사용된 "효과량", "치료 효과량", "치료에 충분한 양" 또는 "효과 투여량"은 단일 또는 다중 투여량 투여를 개체에게 투여시, 이러한 치료의 부재 하에 예상되는 것 이상으로, 질병, 장애 또는 부작용의 예방, 치유, 개선, 치료 또는 관리, 또는 질병 또는 장애의 발달 속도의 감소, 또는 본원에 기재된 장애를 갖는 개체의 상태의 치유, 완화, 경감 또는 개선의 연장에 있어서 효과적이거나 충분한 치료제의 임의의 양을 지칭한다. 또한, 상기 용어는 그 범위 내에 일반적 생리학적 기능을 향상시키는 데 효과적인 양을 포함한다. 효과량은 하나 이상의 치료제의 투여에 있어서 고려될 수 있고, 단일 제제는 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과를 달성하거나 달성할 수 있는 경우 효과량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 종양 또는 암의 "성장을 억제함"은 이의 성장 및/또는 전이의 감속, 방해, 저지 또는 중단을 지칭하고 반드시 종양 성장의 완전한 제거를 나타내는 것은 아니다.
효능은 제시된 강도의 효과를 생성하는 데 필요한 양으로 표현되는 치료제의 활성의 척도이다. 고 효능 제제는, 저 농도에서 보다 적은 반응을 야기하는 저 효능의 제제와 비교하여 저 농도에서 보다 큰 반응을 야기한다. 효능은 친화도 및 효력의 함수이다. 효력은 표적 리간드에 대한 결합시 생물학적 반응을 생성하는 치료제의 능력 및 상기 반응의 정량적 규모를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "반최고치 효과 농도(EC50)"는 명시된 노출 시간 후에 기저값과 최대값 사이 중간의 반응을 야기하는 치료제의 농도를 지칭한다. 치료제는 억제 또는 자극을 야기할 수 있다. EC50 값 효능의 척도로서 통상적으로 사용되고 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 "병용 요법" 또는 "병용으로" 투여는 하나 초과의 예방제 및/또는 치료제의 사용을 지칭한다. 용어 "병용 요법" 또는 "병용으로" 사용은 예방제 및/또는 치료제를 장애를 앓는 개체에게 투여하는 순서를 제한하지 않는다. 달리 말하면, 병용 요법은 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 치료제에 의해 처리함으로써 수행될 수 있다. "순차적 투여"의 경우, 제1의 투여되는 제제는 제2 제제가 투여되거나 개체에서 활성화될 때 개체에 대한 일부 생리학적 효과를 행사할 수 있다.
예방제 및/또는 치료제의 투여와 관련하여 본원에 사용된 용어 "동시적 투여"는 별개의 제제가 개체 내에 동시에 존재하도록 하는 제제의 투여를 지칭한다. 동시적 투여는 단일 조성물, 또는 동시에 또는 비슷한 시기에 투여되는 개별적 조성물로 제형화된 분자에 의해 수행될 수 있다. 순차적 투여는 필요에 따라 임의의 순서로 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "GUCY2c"는 포유동물 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2c), 바람직하게는 인간 GUCY2c 단백질을 지칭한다. 용어 "GUCY2c"는 용어 "GUCY2C"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 인간 GUCY2c의 뉴클레오티드 서열은 GenBank 기탁번호 NM.sub.-004963에 개시되어 있고, 이는 본원에 참고로 포함된다. 인간 GUCY2c의 아미노산 서열은 GenBank 기탁번호 NP.sub.-004954에 개시되어 있고, 이는 본원에 참고로 포함된다.
전형적으로, 자연 발생 대립형질 변이체는 GenBank 기탁번호 NP.sub.-004954에 기재된 단백질에 대해 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. GUCY2c 단백질은 막경유 세포 표면 수용체 단백질로서 특성규명되었고, 장액의 유지, 전해질 항상성 및 세포 증식에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
본원에 사용된 "GUCY2c에 결합하는 항체", "GUCY2c를 인식하는 항체", "항-GUCY2c 항체", "항-GUCY2c 항체 분자" 또는 "GUCY2c 항체"는 항체의 하나 이상의 결합 도메인(본원에 정의됨)을 항-GUCY2c 항체의 하나 이상의 결합 도메인(본원에 정의됨)과 조합하는 분자를 포함한다. 본 발명의 GUCY2c 항체 분자는 GUCY2c, 예를 들어 인간 GUCY2c, 마우스 GUCY2c, 래트 GUCY2c, 시노몰구스 GUCY2c와 상호작용하거나 이를 인식하고, 예를 들어 이에 결합하는(예를 들어 특이적으로 결합하는), 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
용어 "분화 클러스터 3" 또는 "CD3"는 다량체성 단백질 복합체(T3 복합체로서 공지됨)를 지칭하고, 4개의 별개의 폴리펩티드 쇄인 엡실론(ε), 감마(γ), 델타(δ) 및 제타(ζ)로 구성되며, 이는 이량체의 3개의 쌍(εγ, εδ, ζζ)으로서 조합되고 기능한다. CD3 복합체는 T 세포 수용체(TCR)와 비공유 결합되는 T 세포 공-수용체로서 작용하고(문헌[Smith-Garvin et al. 2009]), T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. CD3 단백질 복합체는 T 세포 계통의 본질적인 의미를 규정하는 특징이고, 따라서 CD3 항체는 T 세포 마커로서 효과적으로 사용될 수 있다(문헌[Chetty and Gatter, Journal of Pathology, Vol 172, 4, 303-301 (1994)). CD3 항체가 내인성 림포카인 생산의 활성화를 통해 세포독성 T 세포의 생산을 유도하고 종양 표적을 선택적으로 사멸시킬 수 있음이 공지되어 있다(문헌[Yun et al., Cancer Research, 49:4770-4774, 1989]).
보다 구체적으로, T 세포는 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 TCR 복합체를 발현한다(문헌[Smith-Garvin　et　al., Annula Review of Immunology,　27: 1, 591-619 (2009)]). 항원은 면역 반응을 자극할 수 있는 종양 세포 및 바이러스 감염된 세포에 의해 발현되는 펩티드이다. 세포내 발현되는 항원은 주조직 적합성 클래스 I(MHC 클래스 I) 분자에 결합하고, T 세포에 노출되는 표면으로 이동한다. 항원과의 복합체에서 MHC 클래스 I에 대한 TCR의 결합 친화도가 충분한 경우, 면역 시냅스의 형성이 시작된다. 면역 시냅스를 통한 신호 전달은 εδ, εγ 및 ζζ 이량체를 형성하는 CD3 공-수용체를 통해 매개된다. 이들 이량체는 TCR과 회합되고 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. 이러한 신호 전달 캐스케이드는 항원을 발현하는 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 세포독성은 T 세포에서 표적 세포로의 그랜자임 B 및 퍼포린의 방출 및 이동에 의해 매개된다.
본원에 사용된 "CD3에 결합하는 항체", "CD3을 인식하는 항체", "항-CD3 항체", "CD3 항체 분자" 또는 "CD3 항체"는 단일 CD3 서브유닛(예를 들어 엡실론, 델타, 감마 또는 제타)을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 2개의 CD3 서브유닛의 이량체성 복합체(예를 들어 감마/엡실론, 델타/엡실론 및 제타/제타 CD3 이량체)를 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 인간 CD3 엡실론은 GenBank 기탁번호 NM_000733에 나타나 있다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 가용성 CD3 및/또는 세포 표면 발현된 CD3에 결합할 수 있다. 가용성 CD3은 천연 CD3 단백질, 및 막경유 도메인이 없거나 세포막과 회합하지 않는 재조합 CD3 단백질 변이체, 예컨대 단량체성 및 이량체성 CD3 구축물을 포함한다.
CD3 지향성 항체는 T 림프구에서 활성화 신호를 생성할 수 있다. 비제한적으로 CD28, CD134, CD137 및 CD27을 포함하는 다른 T 세포 활성화 리간드가 또한 사용될 수 있다.
CD3 이중특이적 항체는 MHC-펩티드/TCR 결합의 필요성을 피하고, 대신 세포 표면 항원을 발현하는 표적 세포에 T 세포를 모집한다. 이중특이적 항체의 하나의 아암은 종양 결합된 세포 표면 항원에 결합하고, 나머지 아암은 T 세포 상의 TCR 복합체의 일부인 CD3 단백질에 결합한다. 이중특이적 항체를 통한 T 세포 상의 CD3 및 종양 세포 상의 표적 항원의 공-결합은 세포독성 반응을 야기한다. 따라서, 이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 이중특이적 항체가, T 세포가 항원과의 복합체에서 TCR과 MHC 클래스 I의 상호작용에 대한 필요성을 피하도록 하는 것을 허용하고, 대신 T 세포 상에 발현되는 CD3(예컨대 CD3 엡실론) 및 종양 상에 발현되는 GUCY2c의 직접적인 공-결합을 통해 표적 세포로 T 세포를 지향시키는 것으로 생각된다.
본원에 사용된 용어 "CD3-GUCY2c 이중특이적 항체"는 목적하는 분자를 발현하는 종양 세포로 표적화함으로써 개체의 T 세포가 암 세포를 사멸시키도록 사용하도록 설계된 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 목적하는 분자는 인간 GUCY2c이다. 일부 실시양태에서, CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 2개의 Fv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 GUCY2c 지향성 제1 Fv 도메인 및 CD3 지향성 제2 Fv 도메인을 포함한다. Fv 도메인은 scFv 도메인일 수 있다.
본원에 사용된 "제1 폴리펩티드"는 제2 폴리펩티드와 회합할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 접점에서 만난다. 접점에 더하여, 제1 폴리펩티드는 하나 이상의 추가적 도메인, 예컨대 "결합 도메인"(예를 들어 항체 가변 도메인, 수용체 결합 도메인, 리간드 결합 도메인 또는 효소 도메인) 또는 항체 불변 도메인(또는 이의 일부)(CH2, CH1 및 CL 도메인을 포함함)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 제1 폴리펩티드는 항체로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함할 것이다. 이러한 도메인은 편리하게 불변 도메인, 예컨대 항체의 CH3 도메인이고, 제1 폴리펩티드의 접점을 형성할 수 있다. 예시적 제1 폴리펩티드는 항체 중쇄 폴리펩티드, 항체 불변 도메인을 이종 폴리펩티드의 결합 도메인과 조합하는 키메라, 수용체 폴리펩티드, 리간드 폴리펩티드 및 항체 가변 도메인 폴리펩티드(예를 들어 이중특이적 항체)를 포함한다.
접점에 더하여, 제2 폴리펩티드는 추가적 도메인, 예컨대 "결합 도메인"(예를 들어 항체 가변 도메인, 수용체 결합 도메인, 리간드 결합 도메인 또는 효소 도메인) 또는 항체 불변 도메인(또는 이의 일부)(CH2, CH1 및 CL 도메인을 포함함)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 제2 폴리펩티드는 항체로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함할 것이다. 이러한 도메인은 편리하게 불변 영역, 예컨대 항체의 CH3 도메인이고 제2 폴리펩티드의 접점을 형성할 수 있다. 예시적 제2 폴리펩티드는 항체 중쇄 폴리펩티드, 이종 폴리펩티드의 결합 도메인과 조합하는 키메라, 및 항체 가변 도메인 폴리펩티드(예를 들어 이중특이적 항체)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "복합체" 또는 "복합체화된"은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘(예를 들어 반데르발스, 소수성, 친수성 힘)을 통해 서로 상호작용하는 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 한 실시양태에서, 복합체는 이종다량체이다. 본원에 사용된 용어 "단백질 복합체" 또는 "폴리펩티드 복합체"가 단백질 복합체에서 단백질에 접합된 비-단백질 독립체(예를 들어 비제한적으로 화학 분자, 예컨대 독소 또는 검출 시약을 포함함)를 갖는 복합체를 포함하는 것이 이해되어야 한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 재료 및 방법이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 재료 및 방법이 기재된다.
재료 및 방법
단클론 항체의 생산을 위한 종래의 하이브리도마 방법, 항체(키메라 항체, 예를 들어 인간화된 항체를 포함함)의 생산을 위한 재조합 기술, 유전자 이식 동물에서의 항체 생산, 및 "완전 인간" 항체의 생산을 위해 최근 기재된 파지 디스플레이 기술을 포함하는 다양한 항체 생산 기술이 기재되어 있다. 이들 기술을 하기에 간략히 기재된다.
해당 항원에 대한 다클론 항체는 일반적으로 항원 및 보조제의 다수의 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 생산될 수 있다. 항원(또는 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편)은 이작용성 제제 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통해 접합) 또는 N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통함)를 사용하여 면역화시킬 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합될 수 있다. 동물은 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화되고, 몇 주 후에 동물은 다수의 부위에 피하 주사에 의해 부스팅된다. 7 내지 14일 후에 동물을 채혈하고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 동물은 역가 안정기까지 부스팅된다. 바람직하게는, 동물은, 동일하나 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된 항원의 접합체에 의해 부스팅된다. 또한, 접합체는 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물에서 생산될 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반을 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
단클론 항체는 처음 문헌[Kohler & Milstein, Nature 256:495, 1975]에 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(US 4,816,567(Cabilly et al.))에 의해 생산될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물은 전술된 바와 같이 면역화되어 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 생산한다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986]). 이렇게 생산된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하고 성장시킨다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장할 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는 통상적 면역 글로불린 정제 절차, 예컨대 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
항체, 항체의 항원 결합 단편 또는 임의의 항체 구축물의 발현은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 에스케리키아 콜라이 세포에서 수행될 수 있고, 분비된 항체가 상기 세포(세포 배양 상청액, 컨디셔닝된 세포 배양 상청액, 세포 용해물 또는 정제된 벌크)로부터 회수되고 채취된다. 일반적인 항체 생산 방법은 당분야에 주지되어 있고 예를 들어 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999]; [Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1986]; [Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16:151-160, 2000]; [Werner, R.G., Drug Res. 48:870-880, 1998]에 기재되어 있다. 구체적 실시양태에서, 세포 배양물은 포유동물 세포 배양물, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 배양물이다.
다양한 실시양태에서, 단리되거나 회수된 항체는 당분야에 공지된 통상적 크로마토그래피 방법을 사용하여 추가적 정제 단계를 거칠 수 있다. 특히, 정제 방법은 비제한적으로 친화도 크로마토그래피(예를 들어 단백질 A 친화도 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및/또는 투석을 포함하는 것으로 생각된다. 이 중 바람직한 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피를 사용하는 것이다. 친화도 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔히 아가로스이나, 다른 매트릭스도 사용가능하다.
다른 항체 정제 기술, 예컨대 이온 교환 컬럼 분류, 에탄올 침전, 역상 고압 크로마토그래피, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(상표) 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 크로마토그래피(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE를 사용하는 전기영동, 및 암모늄 설페이트 침전이 또한 당분야에 공지되어 있다. 상기 목록의 정제 방법은 단지 예시일 뿐이며, 제한적인 열거를 의도하지 않는다.
대안적으로, 내인성 면역 글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자 이식 동물(예를 들어 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(J.sub.H)의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 야기함이 기재되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식계열 면역 글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 공격에 인간 항체의 생산을 야기할 것이다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255;1993] 및 [Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원에 대한 고 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성의 유지하면서 인간화될 수 있다. 비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당분야에 주지되어 있다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 상응하는 인간 항체 서열로 치환함으로써 윈터(Winter) 및 동료의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있다(문헌[Jones et al., Nature 321:522-525, 1986]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988]). 따라서, 이러한 인간화된 항체는 실질적으로 덜 온전한 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체(Cabilly, supra)이다. 실제는, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기, 및 아마도 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 항체를 항원에 대한 고 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화시키는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화된 서열의 3-차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 생성물의 분석 공정에 의해 인간화된 항체를 생산한다. 3-차원 면역 글로불린 모델은 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보자 면역 글로불린 서열의 개연성 있는 3-차원 형태 구조를 보여주고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 사용가능하다. 이들 디스플레이의 검토는 후보자 면역 글로불린 서열의 기능에서 잔기의 예상되는 역할의 분석, 즉 후보자 면역 글로불린이 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 FR 잔기가 공통 및 이입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 추가적 세부사항에 대해 WO 92/22653(공개일: 1992년 12월 23일)을 참조한다.
또한, 본 발명의 항체는 당분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 특정 양상에서, 이러한 파지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어 인간 또는 뮤린)로부터 발현된, 항원 결합 도메인, 예컨대 Fab 및 Fv 또는 다이설파이드 결합된 안정화된 Fv를 디스플레이하는 데 사용될 수 있다. 해당 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포착된 항원을 사용하여 선택되거나 확인될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 사상 파지이다. 항원 결합 도메인은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합에 의해 융합된 단백질로서 발현된다. 본 발명의 면역 글로불린 또는 이의 단편을 생산하는 데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkmann et al. "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995]에 개시된 것을 포함한다.
다수의 IgG 이소타입 및 이의 도메인의 기능적 특징은 당분야에 주지되어 있다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 아미노산 서열은 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 특이적 IgG 이소타입으로부터의 2개의 도메인의 선택 및/또는 조합은 FcγR에 대한 친화도를 포함하는 모 이소타입의 임의의 공지된 파라미터를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIB에 대한 제한된 결합을 나타내거나 나타내지 않는 IgG 이소타입(예를 들어 IgG2 또는 IgG4)으로부터의 영역 또는 도메인의 사용은, 이중특이적 항체가 활성화 수용체에 대한 결합을 최대화하고 억제성 수용체에 대한 결합을 최소화하도록 조작되는 것이 목적되는 특정 용도를 가질 수 있다. 유사하게, C1q 또는 FcγRIIIA에 우선적으로 결합하는 것으로 공지된 IgG 이소타입(예를 들어 IgG3)으로부터의 Fc 쇄 또는 도메인의 사용은, 효과기 기능 활성, 예를 들어 보체 활성화 또는 ADCC가 최대화되도록 이중특이적 항체를 조작하도록 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 증진시키는 것으로 당분야에 공지된 Fc 아미노산 변형과 조합될 수 있다. 유사한 방식으로, Fc 쇄의 효과기 기능을 최소화하거나 제거하도록 IgG 이소타입의 Fc 쇄 또는 도메인이 돌연변이될 수 있다.
발견 과정 동안에, 항체의 생산 및 특성규명은 바람직한 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 항원에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체를 찾는 경쟁 및 교차-경쟁을 수행하는 것이다. 하나의 방법은 항체가 결합하는 에피토프를 확인하는 것 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]의 챕터 11에 기재된 바와 같은, 항체-항원 복합체의 결정 구조 해석, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석 및 합성 펩티드-기반 분석을 포함하는 단백질 상의 에피토프의 위치의 맵핑 및 특성규명을 위한 많은 방법이 당분야에 공지되어 있다. 추가적 예에서, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급처, 예를 들어 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems, Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands)로부터 상업적으로 입수가능하다. 추가적 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이 유발, 도메인 교환 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여 에피토프 결합에 필요하고/하거나 충분하고/하거나 필연적인 잔기를 확인할 수 있다. 항원 결합 도메인 상호작용의 결합 친화도 및 해리 속도는 경쟁 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 분석의 하나의 예는 표지된 항원의 항온처리, 및 표지된 항원에 결합된 분자의 검출을 포함하는 방사선 면역 분석이다. 항원에 대한 본 발명의 분자의 친화도는 및 결합 해리 속도는 스캐차드(Scatchard) 분석에 의한 포화 데이터로부터 결정될 수 있다.
항원에 대한 본 발명의 항체의 친화도 및 결합 특성은, 비제한적으로 효소 결합된 면역 흡착 분석(ELISA), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석, 바이오-레이어 간섭 측정 또는 면역 침전 분석을 포함하는, 항원 결합 도메인에 대해 당분야에 공지된 시험관내 분석(생화학 또는 면역학 기반 분석)을 사용하여 초기에 결정될 수 있다. 본 발명의 분자는 시험관내 기반 분석의 것과 비교하여 생체내 모델(예컨대 본원에 기재되고 개시된 것)에서 유사한 결합 특성을 가질 수 있다. 그러나, 본 발명은, 시험관내 기반 분석에서 목적하는 표현형을 나타내지 않으나 생체내 목적하는 표현형을 나타내는 본 발명의 분자를 배제한다.
임의적 이중특이적 항체 포맷은 예를 들어 US 2007/0004909, 2009/0060910 및 2010/0174053에 기재된 이중-친화도 재표적화(DART(등록상표)) 단백질로도 공지된 공유 결합된 이중특이적 이종이량체성 다이아바디를 기반으로 하는 Fv-유래된 전략이다.
본 발명의 분자(즉 결합 도메인)를 암호화하는 핵산 서열을 수득한 후에, 분자의 생산을 위한 벡터가 당분야에 주지된 방법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체) 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 당분야에 공지된 자연적으로 결합되거나 이종기원인 프로모터 영역을 포함하는 항체 암호화 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터의 진핵 프로모터 시스템일 수 있으나, 원핵 숙주에 대한 제어 서열이 또한 사용될 수 있다. 벡터가 적절한 숙주 세포주 내로 혼입된 후에, 숙주 세포는 뉴클레오티드 서열을 발현시키기에 적합하고, 필요에 따라 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 번식한다. 진핵 세포주는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 또는 인간 배아 신장 세포주를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA는, 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 리고뉴클레오티드프로브를 사용함으로써) 단리되고 서열 결정될 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 단리된 후에, DNA는 발현 벡터 내로 위치될 수 있고, 이어서 이는 달리 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 시미안 COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주 세에서 단클론 항체의 합성물을 수득한다. 또한, DNA는 예를 들어 동종 뮤린 서열을 대신하여 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열을 치환함으로써 변형될 수 있다(문헌[Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]). 이러한 방식으로, 본원의 항-항원 단클론 항체의 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 생산한다.
세포 표면 단백질로서, GUCY2c는 수용체 결합 단백질에 대한 치료 표적, 예컨대 항체 또는 리간드로서 작용할 수 있다. 정상 장 조직에서, GUCY2c는 루미날 환경과 혈관 구획 사이에 장벽을 형성하는 상피 세포 밀착 접합부의 정점부에 발현된다(문헌[Almenoff et al., Mol Microbiol 8: 865-873, 1993]; 및 [Guarino et al., Dig Dis Sci 32: 1017-1026, 1987]). 이와 같이, GUCY2c 결합 단백질 치료제의 전신 정맥내 투여는, 위장계의 신생 세포(악성 또는 전이성 결장암 세포, 장외 또는 전이성 결장 종양, 식도 종양 또는 위 종양, 또는 위식도 접합부의 선암을 포함함)에 접근할 수 있으면서, 정상 세포에 존재하는 장 GUCY2c 수용체에 대해 최소의 영향을 갖는다. 또한, GUCY2c는 리간드 결합시 수용체 매개된 세포내 섭취를 통해 내재화한다(문헌[Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005]; [Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995]).
GUCY2c의 조직 특이적 발현 및 암, 예를 들어 위장 기원의 암(예를 들어 결장암, 위암 또는 식도암)과의 회합은 이러한 질병을 위한 진단용 마커로서 GUCY2c의 용도를 허용하도록 개발될 수 있다(문헌[Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39:171-181, 1996]; [Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005]).
본 발명은, GUCY2c(예를 들어 인간 GUCY2c(예를 들어 기탁번호 NP_004954.2의 유도체인 서열번호 224))에 결합하고 하기 중 임의의 하나 이상의 것에 있어서 유용한 항체를 제공한다: (a) 개체에서 GUCY2c를 발현하는 악성 세포와 관련된 질환(예를 들어 위장 관련된 암, 예컨대 대장암(CRC))의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선함; (b) GUCY2c를 발현하는 악성 종양을 갖는 개체에서 종양 성장 또는 진행의 억제; (c) GUCY2c를 발현하는 하나 이상의 악성 세포를 갖는 개체에서 GUCY2c를 발현하는 암(악성) 세포의 전이의 억제; (d) GUCY2c를 발현하는 종양의 퇴행 유도(예를 들어 장기 퇴행); (e) GUCY2c를 발현하는 악성 세포에서 세포독성 활성의 행사; (f) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체의 무진행 생존의 증가; (g) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체에서 전체 생존의 증가; (h) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체에서 추가적 화학치료제 또는 세포독성제의 사용의 감소; (i) GUCY2c 관련된 장애를 갖는 개체에서 종양 부담의 감소; 또는 (j) 아직 확인되지 않은 기타 인자와 GUCY2c의 상호작용의 차단.
한 양상에서, (a) 서열번호 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 또는 73에 나타낸 VH 서열의 VH 상보 결정 영역 1(VH CDR1), VH 상보 결정 영역 2(VH CDR2) 및 VH 상보 결정 영역 3(VH CDR3)을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및/또는 (b) 서열번호 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 또는 175에 나타낸 VL 서열의 VL 상보 결정 영역 1(VL CDR1), VL 상보 결정 영역 2(VL CDR2) 및 VL 상보 결정 영역 3(VL CDR3)을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 항체가 제공된다.
또 다른 양상에서, 표 1에 나열된 부분적 중쇄 서열 중 임의의 하나 및/또는 부분적 경쇄 서열 중 임의의 하나를 갖는 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 VH 영역 및/또는 VL 영역을 포함하는 항체를 제공하되, (a) VH 영역은 서열번호 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 또는 73을 포함하고/하거나; (b) VL 영역은 서열번호 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 또는 175를 포함한다.
[표 1]
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표 1에서, 밑줄 친 서열은 카바트에 따른 CDR 서열이고, 굵은 글씨는 초티아에 따른 것이다. AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용되었다.
또한, 본 발명은 GUCY2c에 대한 항체의 CDR 분획을 제공한다. CDR 접촉 영역은 항원에 대한 특이성을 항체에게 제공하는 항체의 영역이다. 일반적으로, CDR 접촉 영역은 특이적 항원에 결합하는 항체에 대한 적절한 루프 구조물을 유지하기 위해 제한된 CDR 및 버니어(Vernier) 대역에서의 잔기 위치를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007]을 참조한다. CDR 영역의 결정은 당분야의 기술에 속한다. Abysis의 버전 2.3.3 발매물(www.abysis.org)에서 시행되는 알고리즘은 VH CDR1을 제외한 가변 영역 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR2 및 VH CDR3에 카바트 넘버링을 부과하는 데 사용되었다. AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용되었다.
한 양상에서, 표 2에 나열된 VH CDR 서열 중 임의의 하나 및/또는 VL CDR 서열 중 임의의 하나를 갖는 항체가 제공된다. 한 양상에서, 본 발명은 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2c)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하되, 항체는 하기를 포함한다: (a) (i) 서열번호 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 또는 261을 포함하는 VH 상보 결정 영역 1(VH CDR1); (ii) 서열번호 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 또는 267을 포함하는 VH 상보 결정 영역 2(VH CDR2); 및 (iii) 서열번호 14, 22, 29, 36 또는 44를 포함하는 VH 상보 결정 영역 3(VH CDR3)을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및/또는 (b) (i) 서열번호 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 또는 167을 포함하는 VL 상보 결정 영역 1(VL CDR1); (ii) 서열번호 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 또는 168을 포함하는 VL 상보 결정 영역 2(VL CDR2); 및 (iii) 서열번호 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 또는 169를 포함하는 VH 상보 결정 영역 3(VL CDR3)을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 (a) VH 영역이 (i) 서열번호 74 또는 259의 서열을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열번호 75 또는 267의 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열번호 29의 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고/하거나; (b) VL 영역이 (i) 서열번호 148의 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열번호 149의 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열번호 142의 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 항체를 제공한다.
[표 2]
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Figure 112020139468681-pct00007
Figure 112020139468681-pct00008
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한 양상에서, 표 3에 나열된 부분적 경쇄 서열 중 임의의 하나 및/또는 부분적 중쇄 서열 중 임의의 하나를 갖는 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되되, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 1, 9 또는 273에 나타낸 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열번호 76, 84, 90, 274, 275 또는 276에 나타낸 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역.
[표 3]
Figure 112020139468681-pct00013
Figure 112020139468681-pct00014
표 3에서, 밑줄 친 서열은 카바트에 따른 CDR 서열이고, 굵은 글씨는 초티아에 따른 것이다. AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용되었다.
표 4는 본원에 제공된 CD3 항체에 대한 CDR 서열의 예를 제공한다.
[표 4]
Figure 112020139468681-pct00015
Figure 112020139468681-pct00016
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한 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하되, (a) GUCY2c VL CDR1은 서열번호 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 또는 167의 서열을 포함하고; GUCY2c VL CDR2는 서열번호 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 또는 168의 서열을 포함하고; GUCY2c VL CDR3은 서열번호 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 또는 169의 서열을 포함하고; (b) CD3 VH CDR1은 서열번호 2, 268 또는 277의 서열을 포함하고; CD3 VH CDR2는 서열번호 3, 10, 269 또는 270의 서열을 포함하고; CD3 VH CDR3은 서열번호 4의 서열을 포함하고; (c) CD3 VL CDR1은 서열번호 77, 85, 91, 278, 279 또는 280의 서열을 포함하고; CD3 VL CDR2는 서열번호 78 또는 281의 서열을 포함하고; CD3 VL CDR3은 서열번호 79의 서열을 포함하고; (d) GUCY2c VH CDR1은 서열번호 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 또는 261의 서열을 포함하고; GUCY2c VH CDR2는 서열번호 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 또는 267의 서열을 포함하고; GUCY2c VH CDR3은 서열번호 14, 22, 29, 36 또는 44의 서열을 포함한다.
일부 이러한 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하되, (a) GUCY2c VH CDR1은 서열번호 74 또는 259의 서열을 포함하고; (b) GUCY2c VH CDR2는 서열번호 75 또는 267의 서열을 포함하고; (c) GUCY2c VH CDR3은 서열번호 29의 서열을 포함하고; (d) GUCY2c VL CDR1은 서열번호 148의 서열을 포함하고; (e) GUCY2c VL CDR2는 서열번호 149의 서열을 포함하고; (f) GUCY2c VL CDR3은 서열번호 142의 서열을 포함한다.
전술된 것 각각의 추가적 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하되, (a) CD3 VH CDR1은 서열번호 2, 268 또는 277의 서열을 포함하고; (b) CD3 VH CDR2는 서열번호 10 또는 270의 서열을 포함하고; (c) CD3 VH CDR3은 서열번호 4의 서열을 포함하고; (d) CD3 VL CDR1은 서열번호 91, 278, 279 또는 280의 서열을 포함하고; (e) CD3 VL CDR2는 서열번호 78 또는 281의 서열을 포함하고; (f) CD3 VL CDR3은 서열번호 79의 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 본원 및 표 5, 표 37A 및 표 37B에 기재된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다: CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C-0212, GUCY2C-0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C-1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C-0486, GUCY2C-1640, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679 또는 GUCY2C-1680.
본원에 상세히 나타낸 서열은 GUCY2c 항체, CD3 항체 및 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 설명한다. 일부 실시양태에서, 이들 항체는 이들의 클론 ID(예를 들어 GUCY2C-0098)로 지칭된다. 이들 클론 ID는 성숙 항체(예를 들어 IgG 또는 CD3 이중특이적 항체)를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 또한, 클론 ID는 항체에서 발견되는 고유한 VH 또는 VL 영역을 지칭할 수 있다. CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 나타내는 클론 ID의 경우(예를 들어 GUCY2C-0098), 성숙 단백질에 혼입된 고유한 항-CD3 항체 영역(예를 들어 VL 및/또는 VH 영역)이 존재할 수 있다. 표 5는 항체의 포맷 및 성숙 단백질에 존재하는 항-CD3 영역(존재하는 경우)을 나타낸다. 표 37A 및 37B는 이들 성숙 GUCY2c 항체, 항-CD3 IgG 및 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 성분 서열을 추가로 나타낸다.
[표 5]
Figure 112020139468681-pct00018
Figure 112020139468681-pct00020
본원에 제공된 특정 CD3 항체는 하나 초과의 명칭으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, CD3-0001은 2B5v1 또는 h2B5v1로 지칭될 수 있고; CD3-0004는 2B4 또는 h2B4로 지칭될 수 있고; CD3-0006은 2B5v6 또는 h2B5v6으로 지칭될 수 있다.
본원에 제공된 특정 CD3 항체는 비제한적으로 CD3-0006(2B5v6 또는 h2B5v6으로도 지칭됨)의 변이체를 포함한다. 예를 들어, CD3-0006의 변이체는 비제한적으로 2B5-1038, 2B5-1039 및 2B5-1040을 포함한다.
GUCY2c(예컨대 인간 GUCY2c(예를 들어 서열번호 224, 230 또는 232)) 또는 CD3(서열번호 242)에 대한 본원에 기재된 항체의 결합 친화도(KD)는 약 0.001 내지 약 6500 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 4500 nM, 4000 nM, 3500 nM, 3000 nM, 2500 nM, 2000 nM, 1500 nM, 1000 nM, 750 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5.5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 0.002 nM 또는 0.001 nM이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 5000 nM, 4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 500 nM, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.01 nM 또는 그 이하의 nM이다. 특정 실시양태에서, 항체는 약 80 내지 약 200 pM, 바람직하게는 약 100 내지 약 150 pM의 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, GUCY2c 및/또는 CD3에 결합하고 본원에 기재된 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다: CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C-0212, GUCY2C-0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C-1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C-0486, GUCY2C-1640, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679 및 GUCY2C-1680(표 5).
한 양상에서, 표 6에 나열된 골격 영역 서열 중 임의의 하나를 갖는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 VH 골격 또는 인간화된 VH 골격, 및 인간 VL 골격 또는 인간화된 VL 골격을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 항체를 제공한다. 일부 이러한 실시양태에서, VH 골격은 서열번호 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하고/하거나; VL 골격은 서열번호 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 또는 155의 서열을 포함한다.
[표 6]
Figure 112020139468681-pct00021
Figure 112020139468681-pct00022
Figure 112020139468681-pct00023
Figure 112020139468681-pct00024
한 실시양태에서, 본 발명은 항체를 제공하되, VH 영역은 서열번호 73의 서열, 또는 CDR 영역 내에 속하지 않는 잔기에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고/하거나; VL 영역은 서열번호 147의 서열, 또는 CDR 영역 내에 속하지 않는 아미노산에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공하되, 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 216 및 220 중 하나 이상에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 216 및 220 중 하나 이상에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 아미노산 서열번호 216의 서열을 포함하고; 제2 폴리펩티드 쇄는 아미노산 서열번호 220의 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, GUCY2c의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하되, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 216의 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 220의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄는 접점을 통해 제1 폴리펩티드 쇄와 회합할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다.
하나의 이러한 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하되, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c 항체의 VL(GUCY2c VL) 및 CD3 항체의 VH(CD3 VH)를 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 항-CD3 항체의 VL(CD3 VL) 및 GUCY2c 항체의 VH(GUCY2c VH)를 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되; GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
또 다른 이러한 실시양태에서, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VL 및 GUCY2c VH를 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VL 및 CD3 VH를 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되; GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
또 다른 이러한 실시양태에서, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 2, 및 (ii) a 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되; GUCY2c VH 및 GUCY2c VL은 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VH 및 CD3 VL은 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
추가적 실시양태에서, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하되, GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 한 양상에서, 폴리뉴클레오티드는 표 1 내지 7 및 38에 나열된 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, CDR 영역, 골격 영역, 놉 및 홀 Fc 쇄, 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 항체 CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C-0212, GUCY2C-0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C-1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C-0486, GUCY2C-1640, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679 또는 GUCY2C-1680을 암호화하는 서열을 포함한다.
해당 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포의 벡터에 보존되고, 숙주 세포는 미래 사용을 위해 확장되고 동결될 수 있다. 벡터(발현 벡터를 포함함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열번호 76, 84, 90, 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 274, 275 또는 276에 나타낸 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산; 및/또는 서열번호 1, 9, 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, 73 또는 273에 나타낸 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 73 및 147; 69 및 147; 60 및 138; 48 및 125; 또는 26 및 106으로부터 선택된 임의의 서열 쌍에 나타낸 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 CDR H3(VH CDR3) 및/또는 CDR L3(VL CDR3)을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 융합 단백질은 하나 이상의 항체 및 다른 천연 분자에서 이것이 부착되지 않은 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역의 이종 서열 또는 동종 서열을 함유한다. 예시적 이종 서열은 비제한적으로 태그, 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함한다. 태그는 당분야에 주지되어 있다. 융합 폴리펩티드 당분야에 공지된 방법, 예를 들어 합성으로 또는 재조합으로 생산될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성을 포함하는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 생산될 수 있지만, 본원에 기재된 재조합 방법을 사용하여 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생산함으로써 생산될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 scFv를 포함한다. 단일 쇄 가변 영역 단편은 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 짧은 연결 펩티드를 사용하여 연결함으로써 생산된다(문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988]). 연결 펩티드의 예는 GGGGSGGGGSGGGGSG(서열번호 193)이고, 이는 하나의 가변 영역의 카복시 말단과 나머지 가변 영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5 nm를 가교시킨다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되어 왔다(문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988]). 링커는 짧고 가요성의 폴리펩티드이어야 하고 바람직하게는 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성되어야 한다. 링커는 추가적 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합으로 또는 합성으로 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산의 경우, 자동화된 합성 기기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산의 경우, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드를 적합한 숙주 세포(진핵, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포, 또는 원핵, 예컨대 에스케리키아 콜라이) 내로 도입할 수 있다. 해당 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 통상적 조작, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 결찰에 의해 생산될 수 있다. 생산된 scFv는 당분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.
또한, 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 다이아바디 또는 미니바디가 포함된다. 다이아바디는 중쇄 가변(VH) 및 경쇄 가변(VL) 영역이 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되나 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍 이룸을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하고 2개의 항원 결합 부위를 형성하는, 이가의 이중특이적 항체이다(예를 들어 문헌[Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448, 1993]; [Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994] 참조). 미니바디는 면역 글로불린 분자의 힌지 영역 및 CH3 도메인에 융합된 천연 항체의 VL 및 VH 영역을 포함한다. 예를 들어, US 5,837,821을 참조한다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물(예컨대 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 임의의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 서열번호 246(GUCY2C-1608 제1 폴리펩티드 쇄를 암호화함) 및 서열번호 247(GUCY2C-1608 제2 폴리펩티드 쇄를 암호화함)에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 조성물의 발현 벡터 및 투여가 본원에 추가로 기재된다.
또한, 임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥(코팅 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 성숙 및 미성숙 mRNA, 예컨대 전구 mRNA(pre-mRNA) 또는 이형핵 mRNA(hnRNA) 및 성숙 mRNA를 포함한다. 추가적 암호화 또는 비-암호화 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드 천연 서열(즉 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 면역 반응성 분자와 비교하여 암호화된 폴리펩티드의 면역 반응성이 약화되지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 암호화된 폴리펩티드의 면역 반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 70% 동일성, 보다 바람직하게는, 적어도 약 80% 동일성, 보다 더 바람직하게는, 적어도 약 90% 동일성, 가장 바람직하게는, 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 2개의 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기에 기재된 바와 같이 최대한 상응하게 정렬되었을 때 동일한 경우에 "동일"하다고 언급된다. 전형적으로, 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하고, 서열 유사성의 국지적 영역을 확인 및 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 약 20개 이상의 인접 위치, 통상적으로는 30 내지 약 75개, 또는 40 내지 약 50개의 인접 위치의 분절을 지칭하고, 이때 서열은 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후 인접 위치의 동일한 수의 기준 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 레이저진 스위트(Lasergene suite)의 생물정보학 소프트웨어의 메그얼라인(Megalign) 프로그램(디엔에이스타 인코포레이티드(DNASTAR, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨 소재))을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, "서열 동일성의 백분율"은 20개 이상의 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 이때 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 통상적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 기준 서열 내의 위치의 총 수(즉 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 부가적으로 또는 대안적으로 천연 유전자, 또는 이의 일부 또는 보체에 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 암호화하는 자연 발생 DNA 서열(또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 하이브리드화될 수 있다.
유전자 암호의 축중성의 결과로서 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것이 당업자에게 인지될 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용도에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 본 발명의 범주 내에 포함된다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술(예컨대 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 식별될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드의 생산 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 획득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당분야에 주지되어 있고, 본원에 상세하게 기재될 필요가 없다. 당업자는 본원에 제공된 서열 및 시판 중인 DNA 합성 기기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 생산하는 경우에, 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 목적하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 삽입시킬 수 있고, 이어서 벡터를 복제 및 증폭에 적합한 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해서 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내 이입, 형질감염, F-정합 또는 전기천공에 의해서 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입시킴으로써 세포가 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 비-통합 벡터(예컨대 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 숙주 세포 게놈 내에 통합될 수 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당분야에 주지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다(예를 들어 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조).
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 가능하게 한다. PCR 기술은 당분야에 주지되어 있고, US 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202뿐만 아니라 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여, 이를 적합한 숙주 세포 내에 삽입시킴으로써 획득할 수 있다. 세포가 복제되고, DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 당분야에서 시판 중인 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가질 것이고/이거나 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예를 들어 pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 다수의 기타 클로닝 벡터는 상업적 판매원, 예컨대 바이오래드(BioRad), 스트레이트진(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이것은 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피좀으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능해야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 비제한적으로 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소(예컨대 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현(즉 번역)을 위해서, 통상적으로 하나 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보좀 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 필요하다.
해당 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 사용한 형질주입; 미세발사체 충격(microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염(예를 들어 벡터가 감염원, 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 비롯한 다수의 적절한 수단 중 임의의 것에 의해서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다.
이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포는 해당 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 단리할 목적으로 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한적인 예는 비제한적으로 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함한다(또한, WO 87/04462 참조). 적합한 비-포유류 숙주 세포는 원핵생물(예컨대 에스케리키아 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)) 및 효모(예컨대 사카로마이세스 세레비자에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 cDNA를 상응하는 내인성 항체 또는 단백질 GUCY2c보다 약 5-배, 더욱 바람직하게는, 10-배, 더욱 더 바람직하게는, 20-배 더 큰 수준으로 발현하거나, GUCY2c 도메인(예를 들어 도메인 1 내지 4)은 면역 분석 또는 FACS에 의해 초래된다. 해당 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 확인될 수 있다.
한 양상에서, GUCY2c 항체 분자는 예를 들어 직접 결합 또는 경쟁 결합 분석에 의해 측정시 피코몰 내지 마이크로몰 친화도 범위, 바람직하게는 피코몰 내지 낮은 나노몰 범위의 GUCY2c에 대한 친화도를 가질 것이다.
이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 사용하여 생산될 수 있다. 이중특이적 항체의 생산 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986] 참조). 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기반으로 하되, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(문헌[Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983]).
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 전장 인간 항체를 포함하되, 여기서 이종이량체 단백질의 항체 가변 영역은 인간 면역 효과기 세포 상에 위치한 효과기 항원(예를 들어 CD3 항원)에 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 효과기 세포의 활성을 모집할 수 있고, 이종이량체 단백질의 제2 항체 가변 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 단백질은 면역학적 비활성 Fc 쇄를 포함한다.
인간 면역 효과기 세포는 당분야에 공지된 임의의 다양한 면역 효과기 세포일 수 있다. 예를 들어, 면역 효과기 세포는 비제한적으로 T 세포(예를 들어 세포독성 T 세포), B 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 인간 림프구양 세포 계통의 구성원일 수 있다. 또한, 면역 효과기 세포는 예를 들어 비제한적으로 단핵구, 호중성 과립구 및 수지상 세포를 포함하는 인간 골수양 계통의 구성원일 수 있다. 이러한 면역 효과기 세포는 효과기 항원의 결합에 의해 활성화시에 표적 세포에 대한 세포독성 또는 세포사멸 효과, 또는 다른 목적하는 효과를 가질 수 있다.
효과기 항원은 인간 면역 효과기 세포 상에 발현되는 항원(예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드)이다. 이종이량체 단백질(예를 들어 이종이량체 항체 또는 이중특이적 항체)에 결합할 수 있는 효과기 항원의 예는 비제한적으로 인간 CD3(또는 CD3(분화 클러스터) 복합체), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 및 CD89를 포함한다.
표적 세포는 인간에 대해 천연 또는 외래인 세포일 수 있다. 천연 표적 세포에서, 세포는 악성 세포로 형질전환되거나 병리학적으로 변형될 수 있다(예를 들어 바이러스, 플라스모듐 또는 박테리아에 의해 감염된 천연 표적 세포). 외래 표적 세포에서, 세포는 침해 병원체, 예컨대 박테리아, 플라스모듐 또는 바이러스이다.
표적 항원은 병적 상태(예를 들어 염증성 질병, 증식성 질병(예를 들어 암), 면역계 장애, 신경 질병, 신경퇴행성 질병, 자가면역 질병, 감염성 질병(예를 들어 바이러스 감염 또는 기생충 감염), 알레르기 반응, 이식편-대-숙주 질병 또는 숙주-대-이식편 질병)에서 표적 세포 상에 발현된다. 표적 항원은 효과기 항원이 아니다. 표적 항원의 예는 비제한적으로 GUCY2c, BCMA, EpCAM(상피 세포 부착 분자), CCR5(케모카인 수용체 유형 5), CD19, HER(인간 상피 성장 인자 수용체)-2/neu, HER-3, HER-4, EGFR(상피 성장 인자 수용체), PSMA, CEA, MUC-1(무친), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, CIhCG, 루이스-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오시드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, Globo H, 퓨코실 GM1, 폴리 SA, GD2, 카보안하이드라제 IX(MN/CA IX), CD44v6, Shh(소닉 헤지호그), Wue-1, 형질 세포 항원, (막 결합된) IgE, MCSP(흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메소텔린, A33 항원, PSCA(전립선 줄기 세포 항원), Ly-6; 데스모글레인 4, E-카데린 네오에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체, CD25, CA19-9 마커, CA-125 마커 및 MIS(뮐러 억제 물질) 수용체 유형 II, sTn(시알릴화된 Tn 항원; 태그-72), FAP(섬유아 세포 활성화 항원), 엔도시알린, EGFRvIII, LG, SAS 및 CD63을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하되, (a) GUCY2c VL의 GUCY2c VL CDR1, GUCY2c VL CDR2 및 GUCY2c VL CDR3은 서열번호 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 또는 175에 나타낸 서열을 포함하고/하거나; (b) CD3 VH의 CD3 VH CDR1, CD3 VH CDR2 및 CD3 VH CDR3은 서열번호 1, 9 또는 273에 나타낸 서열을 포함하고/하거나; (c) CD3 VL의 CD3 VL CDR1, CD3 VL CDR2 및 CD3 VL CDR3은 서열번호 76, 84, 90, or 274, 275 또는 276에 나타낸 서열을 포함하고/하거나; (d) GUCY2c VH의 GUCY2c VH CDR1, GUCY2c VH CDR2 및 GUCY2c VH CDR3은 서열번호 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 또는 73에 나타낸 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하되, (a) GUCY2c VH 영역은 서열번호 73의 서열을 포함하고; (b) GUCY2c VL 영역은 서열번호 147의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은은 이중특이적 항체를 제공하되, (a) GUCY2c VL CDR1은 서열번호 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 또는 167의 서열을 포함하고; GUCY2c VL CDR2는 서열번호 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 또는 168의 서열을 포함하고; GUCY2c VL CDR3은 서열번호 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 또는 169의 서열을 포함하고; (b) CD3 VH CDR1은 서열번호 2, 268 또는 277의 서열을 포함하고; CD3 VH CDR2는 서열번호 3, 10, 269 또는 270의 서열을 포함하고; CD3 VH CDR3은 서열번호 4의 서열을 포함하고; (c) CD3 VL CDR1은 서열번호 77, 85, 91, 278, 279 또는 280의 서열을 포함하고; CD3 VL CDR2는 서열번호 78 또는 281의 서열을 포함하고; CD3 VL CDR3은 서열번호 79의 서열을 포함하고; (d) GUCY2c VH CDR1은 서열번호 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 또는 261의 서열을 포함하고; GUCY2c VH CDR2는 서열번호 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 또는 267의 서열을 포함하고; GUCY2c VH CDR3은 서열번호 14, 22, 29, 36 또는 44의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 항체 단편(예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종 접합 항체, 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질(예를 들어 도메인 항체), 인간화된 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열(항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유 결합에 의해 변형된 항체를 포함함)이다. 항체는 뮤린, 래트, 인간 또는 임의의 다른 기원의 것일 수 있다(키메라 또는 인간화된 항체를 포함함).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 GUCY2c 또는 CD3 항체는 단클론 항체이다. 예를 들어, GUCY2c 또는 CD3 항체는 인간화된 단클론 항체 또는 키메라 단클론 항체이다.
본 발명은 Fc 쇄 또는 도메인을 포함하는 이중특이적 항체, 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 쇄 또는 이의 일부는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 쇄의 하나 이상의 불변 도메인(예를 들어 CH2 또는 CH3 도메인)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 쇄 또는 이의 일부를 포함하는 분자를 포함하되, Fc 쇄 또는 이의 일부는 비슷한 야생형 Fc 쇄 또는 이의 일부와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함한다. 변이체 Fc 영역은 당분야에 주지되어 있고, 당분야에 주지된 임의의 결합 활성 또는 효과기 기능 분석, 예를 들어 ELISA, SPR 분석 또는 ADCC에서 분석된 바와 같이 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체의 표현형을 변경하는 데 주로 사용된다. 이러한 변이체 Fc 쇄 또는 이의 일부는 Fc 쇄 또는 이의 일부를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체가 나타내는 혈장 반감기 및 안정성을 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 당분야에 공지된 임의의 Fc 변이체의 용도를 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 Fc 쇄, 및 그에 따른 본 발명의 이중특이적 항체 분자의 친화도 및 결합력을 감소시키기 위한 하나 이상의 변형이 Fc 쇄의 아미노산에 발생한다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 변이체 Fc 쇄 또는 이의 일부를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하되, 변이체 Fc 쇄는 변이체 Fc 영역이 단지 하나의 FcγR(여기서 FcγR은 FcγRIIIA이다)에 결합하는 야생형 Fc 쇄와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 변이체 Fc 쇄 또는 이의 일부를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하되, 변이체 Fc 쇄는 변이체 Fc 영역이 단지 하나의 FcγR(여기서 FcγR은 FcγRIIA이다)에 결합하는 야생형 Fc 쇄와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 변이체 Fc 쇄 또는 이의 일부를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하되, 변이체 Fc 쇄는 변이체 Fc 쇄가 단지 하나의 FcγR(여기서 FcγR은 FcγRIIB이다)에 결합하는 야생형 Fc 쇄와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 변이체 Fc 쇄를 포함하는 분자를 포함하되, 변이체는, 당업자에게 공지되거나 본원에 기재된 방법을 사용하여 측정시 Fc 쇄를 포함하지 않거나 야생형 Fc 쇄를 포함하는 분자와 비교하여 감소된 ADCC 활성(또는 기타 효과기 기능) 및/또는 FcγRIIB(CD32B)에 대한 증가된 결합을 부여하거나 매개한다.
또한, 본 발명은 2개 이상의 IgG 이소타입의 도메인 또는 영역을 포함하는 Fc 영역의 용도를 포함한다. 당분야에 공지된 바와 같이, Fc 영역의 아미노산 변형은 Fc 매개된 효과기 기능 및/또는 결합 활성에 깊게 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 기능적 특징에 있어서 이들 변경은 선택된 IgG 이소타입에 있어서 구현될 때 추가로 개선되고/되거나 조작될 수 있다. 유사하게, 이소타입 Fc의 본래 특징은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 조작될 수 있다. 다수의 IgG 이소타입(즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)은 이의 힌지 및/또는 Fc 영역의 아미노산 서열의 차이로 인한, 혈청 반감기, 보체 결합, FcγR 결합 친화도 및 효과기 기능 활성(예를 들어 ADCC, CDC)를 포함하는, 상이한 물리적 및 기능적 특징을 나타낸다.
한 실시양태에서, 아미노산 변형 및 IgG Fc 영역은 목적하는 특징을 갖는 이중특이적 항체를 조작하기 위해 이의 각각의 개별적 결합 및/또는 효과기 기능 활성을 기반으로 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 변형 및 IgG 힌지/Fc 영역은 IgG1에 있어서 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 바와 같이 결합 및/또는 효과기 기능 활성에 대해 개별적으로 분석되었다. 한 실시양태에서, 아미노산 변형 및 IgG 힌지/Fc 영역은 이중특이적 항체 또는 기타 Fc-함유 분자(예를 들어 면역 글로불린)에 있어서 유사한 기능, 예를 들어 감소된 ADCC 활성(또는 기타 효과기 기능) 및/또는 FcγRIIB에 대한 증가된 결합을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 당분야에 공지된 아미노산 변형의 조합을 포함하는 변이체 Fc 영역 및 선택된 IgG 영역을 포함하되, 이는 새로운 특성을 나타내고, 상기 특성은 변형 및/또는 영역이 본원에 기재된 바와 같이 독립적으로 분석될 때 검출되지 않는다.
일부 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함하되, CH2 도메인 및/또는 CH3 각각의 아미노산 서열은 야생형 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고 놉 또는 홀을 형성한다.
일부 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하되, CH2 도메인 각각 및/또는 CH3 도메인 각각의 아미노산 서열은 이종이량체화를 유도하고/하거나 이중특이적 항체를 안정화시키도록 변형된다.
일부 이러한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 상의 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 폴리펩티드 쇄 상의 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함한다. 종합해보면, 제1 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 이종이량체화를 유도하고/하거나 (예를 들어 상보적 이종이량체-촉진 도메인 상의 놉 및 홀의 상호작용에 의해) 이중특이적 항체를 안정화시키고/시키거나 이중특이적 항체를 안정화시키는 작용을 한다.
일부 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 둘 다 놉이거나 둘 다 홀이지 않고/않거나; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 IgG 면역 글로불린 Fc 영역을 형성한다.
일부 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인은 놉(돌기) 또는 홀(공동)을 포함하도록 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 쇄를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하되, (a) 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 놉을 형성하고; (b) 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 홀을 형성한다. 또 다른 이러한 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 돌연변이 Y349C 및/또는 T366W를 포함하여 놉을 형성하고; 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및/또는 Y407V를 포함하여 홀을 형성한다(EU 인덱스에 따른 넘버링). 일부 구체적 실시양태에서, 돌연변이는 감소된 효과기 기능을 야기한다.
일부 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인은, 제2 이종이량체-촉진 도메인이 홀(공동)을 포함하도록 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 경우, 서열번호 188의 서열을 포함하는 놉(돌기)을 포함하도록 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인은, 제2 이종이량체-촉진 도메인이 놉(돌기)을 포함하도록 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 경우, 홀(공동)을 포함할 수 있다. 전술된 것 각각의 특정 실시양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인은 서열번호 188의 서열을 포함하여 놉을 형성하고; 제2 이종이량체-촉진 도메인은 서열번호 189의 서열을 포함하여 홀을 형성한다. 표 7은 본원에 기재된 다양한 GUCY2c 및 CD3 항체를 갖는 GUCY2c 이중특이적 항체의 놉 및 홀 Fc 쇄, 및 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열을 제공한다(서열번호 196, 197, 199, 200, 202, 203, 205, 206, 210, 211, 216, 217, 219, 220, 248, 249, 282, 283, 284, 285, 286 및 287).
[표 7]
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Figure 112020139468681-pct00027
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GUCY2c 또는 CD3에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 하나의 방법은 항체의 일작용성 Fab 단편의 결합 친화도를 측정함에 의한 것이다. 일작용성 Fab 단편을 수득하기 위해, 항체(예를 들어 IgG)를 파파인에 의해 절단하거나 재조합에 의해 발현시킬 수 있다. 항체의 GUCY2c Fab 단편의 친화도는, HBS-EP 러닝 완충제(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20)를 사용하여 사전-고정화된 스트렙타비딘 센서 칩(SA) 또는 항-마우스 Fc 또는 항-인간 Fc를 갖춘 표면 플라즈몬 공명(BIACORE(상표) 3000(상표) 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템, BIACORE(상표), INC(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재))에 의해 결정될 수 있다. 비오티닐화된 또는 Fc 융합 인간 GUCY2c를 HBS-EP 완충제 내로 0.5 μg/mL 미만의 농도로 희석하고 가변성의 접촉 시간을 사용하여 개별적인 칩 채널을 가로질러 주입하여 2개의 범위의 항원 밀도, 즉 상세한 동력학 연구를 위해 50 내지 200 반응 단위(RU) 또는 스크리닝 분석을 위해 800 내지 1,000 RU를 달성할 수 있다. 재생 연구는, 200회 이상의 주입 동안 칩 상의 GUCY2c의 활성을 유지하면서, 25% v/v 에탄올 중의 25 mM NaOH가 결합된 Fab를 효과적으로 제거하는 것을 나타냈다. 전형적으로, 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물(0.1 내지 10x 추측 KD의 이어지는 농도)을 1분 동안 100 μL/분으로 주입하고, 2시간 이하의 해리 시간이 허용된다. Fab 단백질의 농도는, 공지되지 않은 농도의 Fab(아미노산 분석에 의해 결정됨)를 기준물로 사용하는 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정된다. 동적 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, BIAevaluation 프로그램을 사용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(문헌[Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., Methods Enzymology 6. 99-110, 1994])에 포괄적으로 데이터를 적합시킴으로서 동시에 수득된다. 평형 해리 상수(KD) 값은 koff/kon으로서 계산된다. 이러한 프로토콜은 인간 GUCY2c, 또 다른 포유동물의 GUCY2c(예컨대 마우스 GUCY2c, 래트 GUCY2c 또는 영장류 GUCY2c), 및 다양한 형태의 GUCY2c(예를 들어 글리코실화된 GUCY2c)를 포함하는 임의의 GUCY2c에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 데 사용하기에 적합하다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 25℃에서 측정되나, 37℃에서 측정될 수도 있다.
본원에 기재된 항체는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 하이브리도마 세포주의 생산을 위하여, 숙주 동물의 면역화의 경로 및 계획은 일반적으로, 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 항체 자극 및 생산을 위해 확립되고 통상적인 기술에 의해 유지된다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반적인 기술은 당업에게 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.
인간을 비롯한 임의의 포유동물 개체 또는 이로부터의 항체 생산 세포가 인간을 비롯한 포유동물 및 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로서의 역할을 하도록 조작될 수 있음이 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물은 본원에 기술된 바를 비롯한 소정량의 면역원으로 복강내, 근육내, 경구, 피하, 발바닥내 및/또는 피내 접종된다.
하이브리도마는 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 문헌[Kohler, B. and Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975]의 일반적인 체세포 하이브리드화 기술을 사용하여 생산될 수 있거나, 문헌[Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982]에 의해 변형된다. 이용가능한 골수종 세포주, 예컨대 비제한적으로 X63-Ag8.653 및 솔크 인스티튜트, 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터의 세포주가 하이브리드화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 기술은 골수종 세포 및 림프구 세포를 융합원, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 또는 당업자에게 주지된 전기적인 수단에 의해 융합함을 포함한다. 융합 후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 선택적인 성장 배지, 예컨대 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지에서 성장시켜 하이브리드화되지 않은 모 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은, 본원에 기술된 임의의 배지의 임의의 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는 데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 다른 대안(EBV 불멸화된 B 세포)은 본 발명의 단클론 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 하이브리도마는 필요에 따라 확장되고 서브클로닝되고, 상청액은 통상적인 면역 분석 과정(예컨대 방사선 면역 분석, 효소 면역 분석 또는 형광 면역 분석)에 의해 항-면역원 활성에 대해 분석되었다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 GUCY2c 또는 CD3에 특이적인 단클론 항체 또는 이의 일부를 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포괄한다.
이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내 성장될 수 있다. 단클론 항체는 필요에 따라 통상적인 면역 글로불린 정제 절차, 예컨대 암모늄 설페이트 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 존재하는 경우, 원치 않는 활성은, 예를 들어 고체 상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 상에서 침전을 실행하고, 목적하는 항체를 면역원으로부터 용리하거나 방출시킴으로써 제거될 수 있다. 이작용성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR(이때, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화시킬 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는, 인간 GUCY2c 또는 CD3, 단편으로 숙주 동물을 면역화시킨다.
필요에 따라, 해당 항체(단클론 또는 다클론)가 서열 결정될 수 있고, 이어서 폴리뉴클레오티드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 해당 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포의 벡터에서 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포가 확장되고 미래 사용을 위해 동결될 수 있다. 세포 배양물에서 재조합 단클론 항체의 생산은 당분야에 공지된 수단에 의한 B 세포로부터의 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행될 수 있다(예컨대 문헌[Tiller et al., J. Immunol. Methods, 329, 112, 2008]; US 7,314,622 참조).
대안에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 인간화시키거나 친화도 또는 항체의 기타 특징을 개선하도록 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 인간 임상 시험 및 치료에서 사용되는 경우 면역 반응을 피하기 위해 보다 인간 불편 영역과 비슷하도록 조작될 수 있다. GUCY2c 또는 CD3에 대한 보다 큰 친화도 및 GUCY2c의 보다 큰 효력을 수득하도록 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
단클론 항체를 인간화시키는 4개의 일반적 단계가 있다. (1) 뉴클레오티드, 및 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 예측된 아미노산 서열의 결정, (2) 인간화된 항체의 설계, 즉 인간화 처리 동안 사용할 항체 골격 영역의 결정, (3) 실제 인간화 방법론/기술, 및 (4) 인간화된 항체의 형질감염 및 발현. 예를 들어, US 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 및 6,180,370을 참조한다.
설치류 또는 변형된 설치류 V 영역, 및 인간 불변 영역에 융합된 이의 회합된 CDR을 갖는 키메라 항체를 포함하는, 비-인간 면역 글로불린으로부터 유래된 항원 결합 부위를 많은 인간화된 항체 분자가 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Winter et al. Nature 349:293-299, 1991], [Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224, 1989], [Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538, 1987] 및 [Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583, 1987]을 참조한다. 다른 참조문헌은 적절한 인간 항체 불변 영역과 융합 전에 인간 지지성 골격 영역(FR) 내로 이식된 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, 문헌[Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988], [Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536, 1988] 및 [Jones et al. Nature 321:522-525, 1986]을 참조한다. 또 다른 참조문헌은 재조합으로 조작된 설치류 골격 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, EP 0519596을 참조한다. 이러한 "인간화된" 분자는, 인간 수용자에서 이들 모이어티의 치료적 적용의 지속기간 및 효과를 제한하는 설치류 항-인간 항체 분자에 대한 원치 않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계된다. 예를 들어, 항체 불변 영역은 면역학적 비활성이도록 조작될 수 있다(예를 들어 보체 용해를 촉발하지 않음). 예를 들어, PCT/GB99/01441; UK 9809951.8을 참조한다. 사용될 수 있는 항체의 다른 인간화 방법은 문헌[Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, 1991], US 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; 및 6,350,861; 및 WO 01/27160에 개시되어 있다.
또한, 상기에 논의된 인간화된 항체와 관련된 원칙은 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서 사용하기 위한 맞춤 항체에 적용된다. 또한, 본원에 기재된 항체의 인간화의 하나 이상의 양상, 예를 들어 CDR 그래프팅, 골격 돌연변이 및 CDR 돌연변이는 조합될 수 있다.
하나의 변형에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 면역 글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용함으로써 수득될 수 있다. 또한, 보다 바람직하거나(예를 들어 완전 인간 항체) 또는 보다 강한 면역 반응을 생성하도록 설계된 유전자 이식 동물이 인간화된 항체 또는 인간 항체의 생산에 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 Xenomouse(상표)(앱제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc., 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재)), 및 HuMAb-Mouse(등록상표) 및 TC Mouse(상표)(메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc., 미국 뉴저지주 프린스턴 소재))이다.
대안에서, 항체는 재조합으로 생산될 수 있고 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 또 다른 대안에서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합으로 생산될 수 있다. 예를 들어, US 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌[Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994]을 참조한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술(문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990])을 사용하여 면역화되지 않은 공여자로부터 면역 글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 부수적 코트 단백질 유전자 내로 인프레임 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 사상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기반으로 한 선택이 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 야기한다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다; 리뷰를 위해 예를 들어 문헌[Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993]을 참조한다. V-유전자 분절의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]은, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원(자가-항원을 포함함)에 대한 항체는 문헌[Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993]에 기재된 기술에 따라 본질적으로 단리될 수 있다. 자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 빠른 속도로 돌연변이를 축적한다(체세포 과돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 보다 높은 친화도를 부여할 것이고, 고 친화도 표면 면역 글로불린을 나타내는 B 세포는 후속 항원 공격 동안 우선적으로 복제되고 분화된다. 이러한 자연적 과정은 "쇄 셔플링"으로 공지된 기술을 사용하여 모방될 수 있다(문헌[Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992]). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득한 "일차" 인간 항체의 친화도는 순차적으로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 면역화되지 않은 공여자로부터 수득한 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체(래퍼토리)의 래퍼토리로 대체함으로써 개선될 수 있다. 이러한 기술은 pM 내지 nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 가능하게 한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리("가장 큰 라이브러리"로도 공지됨) 생산 전략은 문헌[Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993]에 기재되어 있다. 또한, 유전자 셔플링은 설치류 항체로부터 인간 항체를 파생시키는 데 사용될 수 있되, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인(imprinting)"으로도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득한 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자를 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체하여 설치류-인간 키메라를 생산한다. 항원에 대한 선택은 기능적 항원 결합 부위를 회복할 수 있는 인간 가변 영역의 단리를 야기하고, 즉 에피토프가 파트너 선택을 좌우한다(각인시킨다). 남아 있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 상기 처리가 반복될 때, 인간 항체가 수득된다(WO 93/06213 참조). CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 종래의 인간화와 달리, 이러한 기술은 설치류 기원의 골격 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전 인간 항체를 제공한다.
항체는, 먼저 항체 및 항체 생산 세포를 숙주 동물로부터 단리하여 유전자 서열을 수득하고, 상기 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포(예를 들어 CHO 세포)에서 재조합으로 항체를 발현함으로써 재조합에 의해 생산될 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 식물(예를 들어 타바코) 또는 유전자 이식 밀크(milk)에서 항체 서열을 발현하는 것이다. 식물 또는 밀크에서 재조합으로 항체를 발현시키는 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001]; [Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995]; 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999]을 참조한다. 항체의 유도체, 예를 들어 인간화된 것, 단일 쇄 등의 생산 방법이 당분야에 공지되어 있다.
또한, 면역 분석 및 유세포 분석 분류 기술, 예컨대 형광 활성화된 세포 분류(FACS)가 GUCY2c, CD3 또는 해당 항원에 특이적인 항체를 단리하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항체는 많은 다양한 고상 지지체 또는 담체에 결합될 수 있다. 이러한 지지체는 활성 및/또는 비활성일 수 있다. 주지된 지지체는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철석을 포함한다. 지지체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성이거나 불용성일 수 있다. 당업자는 결합 항체에 대한 다른 적합한 지지체를 알거나, 통상적인 실험을 사용하여 이를 알아낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 지지체는 심근을 표적화하는 모이어티를 포함한다.
단클론 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열 결정된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 단리된 후에, DNA는 발현 벡터(예컨대 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내에 놓일 수 있고, 이어서 달리 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이 세포, 시미안 COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체의 합성물을 수득할 수 있다. 예를 들어, WO 87/04462를 참조한다. 또한, DNA는 예를 들어 동종 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 암호화 서열을 치환함으로써(문헌[Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]) 또는 비-면역 글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 면역 글로불린 암호화 서열 전부 또는 일부를 공유 결합함으로써 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원의 단클론 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 생산한다.
본원에 기재된 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체는 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 발현 수준의 감소가 검출되고/되거나 측정되는 당분야에 공지된 방법에 의해 확인되거나 특성규명된다. 일부 실시양태에서, GUCY2c 항체는 후보자 제제를 GUCY2c와 함께 배양하고 결합 및/또는 수반되는 GUCY2c 발현 수준의 감소를 모니터링함으로써 확인된다. 결합 분석은 정제된 GUCY2c 폴리펩티드, 또는 GUCY2c 폴리펩티드를 자연 발현하거나 형질감염되어 발현하는 세포를 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 결합 분석은 경쟁 결합 분석으로서, 여기서 GUCY2c 결합에 대해 공지된 GUCY2c 항체와 경쟁하는 후보자 항체의 능력이 평가된다. 분석은 ELISA 포맷을 포함하는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
초기 확인 후에, 후보자 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체의 활성을, 목적되는 생물학적 활성을 시험하도록 공지된 생물학적 분석에 의해 추가로 확인하고 개선할 수 있다. 대안적으로, 생물학적 분석을 사용하여 후보자를 직접 스크리닝할 수 있다. 항체를 확인하고 특성규명하는 방법 중 일부는 실시예에 상세히 기재되어 있다.
GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체는 당분야에 주지된 방법을 사용하여 특성규명될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 이것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것 또는 에피토프 맵핑이다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]의 챕터 11에 기재된 바와 같은, 항체-항원 복합체의 결정 구조 해석, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석 및 합성 펩티드-기반 분석을 포함하는 단백질 상의 에피토프의 위치의 맵핑 및 특성규명을 위한 많은 방법이 당분야에 공지되어 있다. 추가적 예에서, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급처, 예를 들어 펩스캔 시스템즈(Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프(즉 아미노산의 단일 스트레치에 함유됨), 또는 형태 에피토프(반드시 단일 스트레치에 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3-차원 상호작용에 의해 형성됨)일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어 적어도 4 내지 6개의 아미노산의 길이)의 펩티드는 단리되거나 합성될 수 있고(예를 들어 재조합에 의해), GUCY2c, CD3 또는 항원 항체를 사용하는 결합 분석에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체가 결합하는 에피토프는, GUCY2c, CD3 또는 항원 서열으로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하고 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 분석에 따라, GUCY2c, CD3 또는 다른 항원을 암호화하는 개방형 해독틀은 무작위로 또는 특이적 유전자 구축물에 의해 단편화되고, GUCY2c, CD3 또는 다른 항원의 발현된 단편과 시험할 항체의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은 예를 들어 PCR에 의해 생산된 후에, 시험관내 방사성 아미노산의 존재 하에 단백질로 전사되고 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 단편에 대한 항체의 결합이 면역 침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 또한, 특정 에피토프가 파지 입자(파지 라이브러리)의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 큰 라이브러리를 사용함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 정의된 라이브러리가 단순 결합 분석에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가적 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이 유발, 도메인 교환 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이 수행되어 에피토프 결합에 요구되고/되거나 충분하고/하거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, 도메인 교환 실험은, GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 단백질의 다양한 단편이 또 다른 종(예를 들어 마우스)의 GUCY2c의 서열, 또는 밀접하게 관련되나 항원과 관련하여 별개인 단백질(예를 들어 Trop-1)로 대체된 돌연변이체 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원을 사용함으로써 수행될 수 있다. 돌연변이체 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체를 특성규명하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법은, GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체가 동일한 다른 항체와 동일한 에피토프에 각각 결합하는 지를 결정하는, 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체, 즉 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 상의 다양한 단편을 사용한 경쟁 분석이다. 경쟁 분석은 당업자에게 주지되어 있다.
발현 벡터는 GUCY2c, CD3 또는 다른 항원 항체의 직접 발현에 사용될 수 있다. 당업자는 생체내 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위한 발현 벡터의 투여에 친숙하다. 예를 들어, US 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471을 참조한다. 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여(주사를 포함함), 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 삽입된 투여 및 국소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경줄기 또는 신경절에 또는 관상동맥, 심방, 심실 또는 심막 내로 직접 투여된다.
또한, 발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화된 전달이 사용될 수 있다. 수용체 매개된 DNA 전달 기술은 예를 들어 문헌[Findeis et al., Trends Biotechnol., 11:202, 1993]; [Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 263:621, 1988]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 269:542, 1994]; [Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990]; 및 [Wu et al., J. Biol. Chem., 266:338, 1991]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 치료 포로토콜로 국부 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg 범위의 DNA로 투여된다. 또한, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg DNA의 농도 범위가 유전자 치료 포로토콜 동안 사용될 수 있다. 치료용 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비-바이러스 기원의 것일 수 있다(일반적으로, 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy,1:51, 1994]; [Kimura, Human Gene Therapy, 5:845, 1994]; [Connelly, Human Gene Therapy, 1:185, 1995]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics, 6:148, 1994] 참조). 이러한 암호화 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 암호화 서열의 발현은 구성적일 수 있거나 조절될 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 목적하는 세포에서 발현을 위한 바이러스-기반 벡터는 당분야에 주지되어 있다. 예시적 바이러스-기반 비히클은 비제한적으로 재조합 레트로바이러스(예를 들어, WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; US 5,219,740 및 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0 345 242 참조), 알파 바이러스-기반 벡터(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 삼림 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)를 포함한다. 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992]에 기재된 바와 같이 죽은 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
또한, 단독의 죽은 아데노 바이러스에 연결되거나 연결되지 않은 다중 양이온성 축합된 DNA(예를 들어, 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992] 참조); 리간드-연결된 DNA(예를 들어, 문헌[Wu, J. Biol. Chem., 264:16985, 1989] 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포(예를 들어, US 5,814,482; WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 세포막에 의한 핵 전하 중화 또는 융합을 포함하는 비-바이러스 전달 비히클 및 방법이 사용될 수 있다. 또한, 네이키드 DNA가 사용될 수 있다. 예시적 네이키드 DNA 도입 방법은 WO 90/11092 및 US 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 US 5,422,120; WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기재되어 있다. 추가적 접근법이 문헌[Philip, Mol. Cell Biol., 14:2411, 1994] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581, 1994]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같거나 방법에 의해 생산되고 본원에 기재된 특징을 갖는 본 발명의 항체를 포함하는, 약학 조성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 본원에 사용된 약학 조성물은 GUCY2c에 결합하는 하나 이상의 항체, CD3 및 GUCY2c 종양 항원에 결합하는 하나 이상의 이중특이적 항체, 및/또는 하나 이상의 이들 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 당분야에 주지된 완충제를 포함하는 적합한 부형제, 예컨대 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 임의의 이들 항체의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당분야에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질 분해 또는 기타 분해에 의해, 전술된 재조합 방법에 의해(즉 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50개 이하의 아미노산의 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 통상적으로 생산된다. 화학적 합성 방법은 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 항체는 고상 방법을 사용하는 자동화된 폴리펩티드 합성 기기에 의해 생산될 수 있다. 또한, US 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415를 참조한다.
2개의 공유 결합된 항체를 포함하는 이종 접합 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 항체는 원치 않는 세포에 면역계 세포를 표적화시키는 데(US 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해(WO 91/00360 및 WO 92/200373; 및 EP 03089) 사용되어 왔다. 이종 접합 항체는 임의의 통상적인 가교 방법에 의해 생산될 수 있다. 적합한 가교제 및 기술은 당분야에 주지되어 있고 US 4,676,980에 기재되어 있다.
또한, 키메라 또는 하이브리드 항체 가교제의 수반을 포함하는 공지된 합성 단백질 화학 방법을 사용하여 시험관내 생산될 수 있다. 예를 들어, 면역 독소가 다이설파이드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에터 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약은 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
재조합 인간화된 항체에서, Fcγ 부분은 Fcγ 수용체와 보체 및 면역계의 상호작용을 피하도록 변형될 수 있다. 이러한 항체의 생산 기술은 WO 99/58572에 기재되어 있다. 예를 들어, 불변 영역은, 항체가 인간 임상 시험 및 치료에서 사용되는 경우 면역 반응을 피하도록 인간 불변 영역과 보다 유사하게 조작될 수 있다. 예를 들어, US 5,997,867 및 5,866,692를 참조한다.
본원에 개시된 GUCY2c 항체 및 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는, 항체가 유래된 상응하는 생식계열 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 골격 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을 예를 들어 공개 항체 서열 데이터베이스로부터 입수가능한 생식계열 서열과 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 임의의 아미노산 서열로부터 유래된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하되, 하나 이상의 골격 및/또는 CDR 영역내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기로, 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기로, 또는 상응하는 생식계열 잔기의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 종합적으로 "생식계열 돌연변이"로 본원에서 지칭된다). 당업자는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로부터 출발하여 하나 이상의 별개의 생식계열 돌연변이 또는 이의 조합을 포함하는 많은 항체 및 항원 결합 단편을 용이하게 생산할 수 있다. 특정 실시양태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 모든 골격 및/또는 CDR 잔기는, 항체가 유래된 원래 생식계열 서열에서 발견되는 잔기로 복귀 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, 특정 잔기만이, 예를 들어 FR1의 처음 8개의 아미노산 내에 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에 발견되는 돌연변이된 잔기만이, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에 발견되는 돌연변이된 잔기만이 원래 생식계열 서열로 복귀 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, 골격 및/또는 CDR 잔기 중 하나 이상은 상이한 생식계열 서열(즉 항체가 원래 유래된 생식계열 서열과 상이한 생식계열 서열)의 상응하는 잔기로 돌연변이된다.
또한, 본 발명의 항체는 골격 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 예를 들어 여기서 특정 별개의 잔기가 특정 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 반면에, 원래 생식계열 서열과 상이한 특정 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 수득된 후에, 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원 결합 단편은 하나 이상의 목적하는 특성, 예컨대 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 증진된 길항성 또는 작용성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 시험될 수 있다. 이러한 일반적 방법에 의해 수득한 항체 및 항원 결합 단편은 본 발명 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HC VR, LC VR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 GUCY2c 항체 및 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 HC VR, LC VR, 및/또는 CDR 아미노산 서열과 비교하여 예를 들어 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HC VR, LC VR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 GUCY2c 항체 및 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함한다.
따라서, 본 발명은 이의 특성에 유의미하게 영향을 미치지 않는 기능적 등가 항체, 및 증진되거나 감소된 활성 및/또는 친화도를 갖는 변이체를 포함하는, 본 발명의 변형의 항체 및 폴리펩티드에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열은 GUCY2c 및/또는 CD3에 대한 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 수득하도록 돌연변이될 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당분야에서 통상적인 실행이며 본원에 상세히 기재될 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 하나 이상의 결실, 또는 기능적 활성을 유의미하게 유해하게 변화시키지 않거나 리간드에 대한 폴리펩티드의 친화도를 성숙(증진)시키는 아미노산의 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기로부터 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합, 및 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환에서 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
치환 변이체는 항체 분자에서 제거된 하나 이상의 아미노산 잔기 및 그 위치에 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 유발의 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하나, FR 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 제목 하에 표 8에 나타나 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 야기하는 경우, 표 8에서 "예시적 치환"으로 표시되거나 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기재되는 보다 실질적 변화가 도입되고 생성물이 스크리닝될 수 있다.
[표 8]
Figure 112020139468681-pct00031
항체의 생물학적 특성의 실질적 변형은, (a) 치환의 영역에서 폴리펩티드 주쇄의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선 형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지함에 대한 효과에 있어서 유의미하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 아미노산 잔기는 공통 측쇄 특성을 기반으로 군으로 나뉜다:
(1) 비극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하 없는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성(음으로 하전됨): Asp, Glu;
(4) 염기성(양으로 하전됨): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환함으로써 비-보존적 치환이 수행된다.
또한, 항체의 적절한 형태를 유지하는 데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화성 안정성을 개선하고 일탈적인 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로, 시스테인 결합이 항체에 부가되어 이의 안정성을, 특히 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우에 개선할 수 있다.
아미노산 변형은, 하나 이상의 아미노산을 변화시키거나 변형함으로부터 영역, 예컨대 가변 영역의 완전한 재설계에까지 이를 수 있다. 가변 영역의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 5개보다 많지 않은 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에 수행된다. 다른 실시양태에서, 1 내지 3개보다 많지 않은 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, CDR 도메인은 VH CDR3 및/또는 VL CDR3이다.
또한, 변형은 글리코실화된 폴리펩티드 및 비글리코실화된 폴리펩티드, 다른 번역-후 변형(예컨대 다양한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 포스포릴화)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 이의 불변 영역의 보존된 위치에서 글리코실화된다(문헌[Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997]; [Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32, 1997]). 면역 글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능(문헌[Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996]; [Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180, 1990]) 및 당단백질의 부분 사이의 분자간 상호작용(이는 당단백질이 형태 및 제시된 3-차원 표면에 영향을 미칠 수 있다)(문헌[Jefferis and Lund, supra]; [Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996])에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 올라고사카라이드는 특이적 인식 구조를 기반으로 제시된 당단백질을 특정 분자에 표적화시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 항체의 글리코실화가 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)가 테트라사이클린-조절 발현된(글리코실트랜스퍼라제가 촉매작용하는 이등분성 GlcNAc의 형성) CHO 세포는 ADCC 활성을 개선하는 것으로 보고되었다(문헌[Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180, 1999]).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 부착에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 트라이펩티드 서열의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 형성한다. O-연결된 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있으나, 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다.
항체에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성되어, 이는 하나 이상의 전술된 트라이펩티드 서열을 함유한다(N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한, 변경은 원래 항체의 서열에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 이에 의한 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
또한, 항체의 글리코실화 패턴은 근본적인 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수 있다. 글리코실화는 항체를 발현하는 데 사용된 숙주 세포에 크게 의존적이다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용되는 세포 유형이 드물게 천연 세포이기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴의 변형이 예상될 수 있다(예를 들어 문헌[Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997] 참조).
숙주 세포의 선택에 더하여, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 모드, 배지 제형, 배양물 밀도, 산소처리, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올라고사카라이드 생산에 수반되는 특정 효소의 도입 또는 과발현을 포함하는 다양한 방법이 특정 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경하는 데 제안되었다(US 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H(Endo H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 사용하여 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드를 처리하는 데 결함이 있도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이들 기술 및 유사한 기술은 당분야에 주지되어 있다.
변형의 다른 방법은 비제한적으로 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하는 당분야에 공지된 커플링 기술의 사용을 포함한다. 변형은 예를 들어 면역 분석용 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 당분야에 확립된 절차를 사용하여 생산되고, 당분야에 공지된 표준 분석(이 중 일부는 하기 및 실시예에 기재됨)을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 인간 Fc 감마 수용체에 대한 증가된 친화도를 갖거나; 면역학적으로 비활성이거나 부분적으로 비활성이고, 예를 들어 보체 매개된 용해를 촉발하지 않거나, 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나, 대식 세포를 활성화시키지 않거나; (변형되지 않은 항체와 비교하여) 보체 매개된 용해의 촉발, 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)의 자극, 또는 소교 세포의 활성화 중 임의의 하나 이상의 것에서 감소된 활성을 갖는 불변 영역을 포함한다. 불변 영역의 상이한 변형은 효과기 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌[Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999]; PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 플랭킹 잔기를 돌연변이시킴으로써 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 A, Q, K 또는 H로 돌연변이될 수 있다. 문헌[Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 불변 영역은 효소에 의해(예컨대 효소 PNGase에 의한 탄수화물 제거) 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서 발현에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다.
다른 항체 변형은 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 항체를 포함할 수 있다. 이들 항체는, 표적 분자에 지향성인 결합 도메인에 더하여, 인간 면역 글로불린 중쇄의 불변 영역의 전체 또는 부분에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖는 효과기 도메인을 포함한다. 이들 항체는 상당한 보체 의존성 용해 또는 표적의 세포 매개된 파괴를 촉발하지 않고 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효과기 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이는 전형적으로 2개 이상의 인간 면역 글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기반으로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 염증 및 종래 항체 요법의 다른 부작용을 피하기 위해 장기 항체 요법에서 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명은 친화도 성숙된 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화도 성숙된 항체는 당분야에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다(문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992]; [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994]; [Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995]; [Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004, 1995]; [Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995] ; [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992]; 및 WO 04/058184).
하기 방법은 항체의 친화도의 조정 및 CDR의 특성규명에 사용될 수 있다. 항체의 CDR의 특성규명 및/또는 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도의 변경(예컨대 개선)의 하나의 방법은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발"로 지칭된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발은 하기와 같이 작용한다. CDR의 하나 이상의 아미노산 위치는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 2개 이상의(예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개) 아미노산으로 대체된다. 이는, 각각 2개 이상의 구성원의 복잡성을 갖는(2개 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우), 클론의 작은 라이브러리(일부 실시양태에서, 분석된 모든 아미노산 위치에서 하나)를 생성한다. 일반적으로, 또한, 라이브러리는 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각각의 라이브러리의 소수의 클론, 예를 들어 약 20 내지 80개의 클론(라이브러리의 복잡성에 따라)은, 표적 폴리펩티드(또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝되고, 증가되거나 동일하거나 감소된 결합을 갖거나 결합을 갖지 않는 후보자가 확인된다. 결합 친화도의 결정 방법은 당분야에 주지되어 있다. 결합 친화도는 약 2-배 이상의 결합 친화도의 차이를 검출하는 BIACORE(상표) 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 결정될 수 있다. BIACORE(상표)는 출발 항체가 비교적 높은 친화도, 예를 들어 약 10 nM 이하의 KD에 의해 결합한 경우 특히 유용하다. BIACORE(상표) 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 스크리닝이 본원 실시예에 기재되어 있다.
결합 친화도는 키넥사 바이오센서(Kinexa Biocensor), 섬광 근접 분석, ELISA, ORIGEN 면역 분석(IGEN), 형광 소광, 형광 전이 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 결합 친화도는 적합한 생물학적 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
일부 실시양태에서, CDR의 모든 아미노산 위치는 당분야에 공지된 돌연변이 유발 방법(이 중 일부는 본원에 기재됨)을 사용하여 20개의 천연 아미노산 모두에 의해 대체된다(일부 실시양태에서, 하나씩). 이는 (20개의 아미노산 모두가 모든 위치에서 치환되는 경우) 각각 20개의 구성원의 복잡성을 갖는 클론의 작은 라이브러리(일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대하 하나)를 생성한다.
일부 실시양태에서, 스크리닝할 라이브러리는 동일한 CDR 또는 2개 이상의 CDR에 존재할 수 있는 2개 이상의 위치에서 치환을 포함한다. 따라서, 라이브러리는 하나의 CDR에서 2개 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR에서 2개 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 3, 4 또는 5개 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있되, 상기 위치는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견된다. 치환은 저 중복성 코돈을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Balint et al., Gene 137(1):109-18, 1993]의 표 2를 참조한다.
결합이 개선된 후보자는 서열 결정되어 개선된 친화도("개선된" 치환으로도 지칭됨)를 야기하는 CDR 치환 돌연변이체를 확인할 수 있다. 또한, 결합하는 후보자는 서열 결정되어 결합을 유지하는 CDR 치환을 확인할 수 있다.
여러 회의 스크리닝이 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합이 개선된 후보자(각각 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함함)는 또한 각각의 개선된 CDR 위치에서(즉 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타내는 CDR의 아미노산 위치) 적어도 원래 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리의 설계를 위해 유용하다. 이러한 라이브러리의 생산, 및 스크리닝 또는 선별은 하기에 추가로 논의된다.
또한, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발은, 개선된 결합, 동일한 결합 또는 감소된 결합을 갖거나 결합을 갖지 않는 클론의 빈도가 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각각의 아미노산 위치의 중요성과 관련한 정보를 제공하는 한, CDR을 특성규명하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 20개 아미노산 모두로 변할 때 CDR의 위치가 결합을 유지하는 경우, 상기 위치는 항원 결합에 필요할 것 같지 않은 위치로서 확인된다. 역으로, 단지 적은 비율의 치환으로 CDR의 위치가 결합을 유지하는 경우, 상기 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발 방법은 많은 다양한 아미노산(20개의 아미노산 모두를 포함함)으로 변할 수 있는 CDR의 위치, 및 변하지 않거나 단지 약간의 아미노산으로 변할 수 있는 CDR의 위치에 관한 정보를 생성한다.
개선된 친화도를 갖는 후보자는 개선된 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리에서 해당 위치에서 원래 아미노산과 조합될 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선별 방법을 사용하여 목적되거나 허용되는 라이브러리의 복잡성에 따라 해당 위치에서 추가적 치환을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 인접 아미노산 위치는 적어도 2개 이상의 아미노산으로 무작위화될 수 있다. 인접 아미노산의 무작위화는 돌연변이체 CDR에서 추가적 형태적 유연성을 가능하게 하고, 이는 차례로 많은 수의 개선하는 돌연변이의 도입을 허용하거나 가능하게 할 수 있다. 또한, 라이브러리는 제1회의 스크리닝에서 개선된 친화도를 나타내지 않는 위치에서 치환을 포함할 수 있다.
제2 라이브러리는, BIACORE(상표) 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하는 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보좀 디스플레이를 포함하는 선별에 대해 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용하는 선별을 포함하는, 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 개선되고/되거나 변경된 결합 친화도를 갖는 라이브러리 구성원에 대해 스크리닝되고 선별된다.
본 발명은 또한 고체 지지체(예컨대 비오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 가능하게 하는 제제에 접합된(예를 들어 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 간단히, 이들 방법이 본원에 기재된 임의의 GUCY2c 항체 실시양태에 적용된다는 이해 하에 일반적으로 항체에 대한 참조가 이루어진다. 접합은 일반적으로 본원에 기재된 성분을 연결하는 것을 지칭한다. 연결(일반적으로 적어도 투여를 위해 근접 회합으로 이들 성분을 고정시킴)은 많은 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 제제와 항체 사이의 직접 반응이, 각각 서로 반응할 수 있는 치환기를 갖는 경우, 가능하다. 예를 들어, 제제 및 항체 중 하나의 친핵성 기, 예컨대 아미노 또는 설프하이드릴 기는 나머지 하나의 카본일-함유 기, 예컨대 안하이드라이드 또는 산 할라이드, 또는 양호한 이탈기(예를 들어 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제1 단계로서, 제1 및 제2 폴리펩티드(및 이중특이적 항체를 형성하는 임의의 추가적 폴리펩티드)가 선택된다. 일반적으로, 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은, 본원에 정의된 놉 또는 홀, 또는 둘 모두를 암호화하도록 변경될 수 있도록, 단리되어야 한다. 그러나, 돌연변이는 합성 수단을 사용하여, 예를 들어 펩티드 합성 기기를 사용함으로써 도입될 수 있다. 또한, 치환된 잔기가 비-자연 발생 잔기인 경우, 상기 문헌[Noren et al.]의 방법이 이러한 치환을 갖는 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용가능하다. 또한, 이중특이적 항체의 부분은 적합하게 세포 배양으로 재조합으로 생산되고, 분자의 나머지 부분은 전술된 기술에 의해 생산된다.
항체 단리 및 이중특이적 항체 생산 기술은 하기와 같다. 그러나, 이중특이적 항체가 당분야에 공지된 기술을 사용하여 다른 폴리펩티드로부터 생산되거나 이를 혼입시키는 것이 이해된다. 예를 들어, 해당 폴리펩티드(예를 들어 리간드, 수용체 또는 효소)를 암호화하는 핵산은, 폴리펩티드 mRNA를 갖고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 생각되는 조직으로부터 생산된 cDNA 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 라이브러리는 해당 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질을 확인하도록 설계된 프로브(예컨대 항체 또는 약 20 내지 80개의 염기의 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝된다. 선택된 프로브를 사용하는 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]의 챕터 10 내지 12에 기재된 표준 절차를 사용하여 수행될 수 있다.
전술된 바와 같이, 이중특이적 항체는, 각각 적어도 하나의 항체 VL 영역 및 하나의 항체 VH 영역 또는 이의 단편을 포함하는 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 복합체를 지칭하되, 여기서 각각의 폴리펩티드 쇄의 VL 및 VH 영역은 상이한 항체로부터 기원한 것이다. 구체적 양상에서, 이중특이적 항체는 VL 및 VH 영역 모두를 함유하는 폴리펩티드 쇄의 이량체 또는 사량체를 포함한다. 다량체성 단백질을 포함하는 개별적 폴리펩티드 쇄는 쇄간 다이설파이드 결합에 의해 다량체의 하나 이상의 다른 펩티드에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 동시에 T 세포(CD3) 및 종양 세포(GUCY2c)를 표적화하고 GUCY2c를 발현하는 종양 세포에 대한 T 세포 세포독성을 성공적으로 유도하거나 활성화시킨다.
이중특이적 항체의 각각의 폴리펩티드 쇄는 링커에 의해 공유 결합될 수 있는(여기서 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 글리신-세린 링커이고) VL 영역 및 VH 영역을 포함하여, 항체 결합 도메인이 자기-조립으로부터 제한 받는다. 특정 실시양태에서, 글리신-세린 링커는 서열번호 190의 서열을 포함하는 링커 1이다. 또한, 각각의 폴리펩티드 쇄는, 이종이량체화 및/또는 다수의 폴리펩티드 쇄의 안정화를 촉진하고 상이한 폴리펩티드 쇄의 동종이량체화의 가능성을 감소시키는 이종이량체화 도메인을 포함한다. 이종이량체화 도메인은 폴리펩티드 쇄의 N-말단, 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 이종이량체화 도메인은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 시스테인 링커(링커 2)를 포함할 수 있다. 2개의 폴리펩티드 쇄의 상호작용은 2개의 VL/VH 쌍 이룸을 생성하여 2개의 에피토프 결합 도메인, 즉 이가 분자를 생성할 수 있다. VH 또는 VL 영역은 폴리펩티드 쇄 내의 임의의 위치로 제한되지 않으며(즉 아미노 말단 또는 카복시 말단으로 제한되지 않음), 상기 영역은 서로에 대한 상대적인 위치로도 제한되지 않고, 즉 VL 영역은 VH 영역에 대한 N-말단일 수 있고, 그 역도 마찬가지이다. 유일한 제한은 상보적 폴리펩티드 쇄가 기능적 이중특이적 항체의 생산을 위해 이용가능하다는 것이다. VL 및 VH 영역이 상이한 항원에 특이적인 항체로부터 유래되는 경우, 기능적 이중특이적 항체의 생산은 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄의 상호작용을 필요로 한다(즉 이종이량체의 생산). 대조적으로, 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄가 상호작용하지 않는 경우(예를 들어 재조합 발현 시스템에서), 즉 하나는 VLA 및 VHB(A는 제1 에피토프이고, B는 제2 에피토프임)를 포함하고, 나머지 하나가 VLB 및 VHA를 포함하는 경우, 2개의 상이한 결합 부위는 하기를 생성한다: VLA-VHA 및 VLB-VHB. 모든 이중특이적 항체 폴리펩티드 쇄 쌍에서, 2개의 쇄의 정렬 불량 또는 결합 불량(예를 들어 VL-VL 또는 VH-VH 영역의 상호작용)은 가능한 일이다. 그러나, 기능적 이중특이적 항체의 정제는 당분야에 공지되거나 본원에 예시된 임의의 친화도, 예를 들어 친화도 크로마토그래피를 사용하여 적절하게 이량체화된 결합 부위의 면역 특이성을 기반으로 용이하게 수행된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체의 폴리펩티드 쇄는 다양한 링커 및 펩티드를 포함할 수 있다. 링커 및 펩티드는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, GUCY2c VL 및 CD3 VH는 링커 1 또는 링커 2에 의해 연결되고; CD3 VL 및 GUCY2c VH는 링커 1 또는 링커 2에 의해 연결된다. 일부 이러한 실시양태에서, 링커 1은 서열번호 190의 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커 2는 서열번호 191의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 도메인 1은 시스테인 링커를 통해 제1 이종이량체-촉진 도메인에 공유 결합되고, 도메인 2는 시스테인 링커를 통해 제2 이종이량체-촉진 도메인에 공유 결합된다. 시스테인 링커 각각은 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하여 분자내 다이설파이드 결합을 허용한다. 전술된 것 각각의 추가적 실시양태에서, 시스테인 링커는 5개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 시스테인 링커는 서열번호 192의 서열을 포함하는 링커 3이다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된다. 일부 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 다이설파이드 결합은 제1 폴리펩티드 쇄의 링커 3과 제2 폴리펩티드 쇄의 링커 3 사이에 형성된다. 또 다른 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 다이설파이드 결합은 제1 이종이량체-촉진 도메인과 제2 이종이량체-촉진 도메인 사이에 형성된다. 구체적 실시양태에서, 각각의 다이설파이드 결합은 2개의 시스테인 잔기를 연결함으로서 형성된다.
본 발명의 이중특이적 항체는 2개의 개별적이고 별개의 에피토프에 동시에 결합할수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 에피토프 결합 부위는 면역 효과기 세포 상에 발현된, 예를 들어 T 림프구 상에 발현된 CD3 결정기에 대해 특이적이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 효과기 세포 결정기에 결합하고 효과기 세포를 또한 활성화시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 (a) 인간 GUCY2c의 세포외 도메인에 결합하고/하거나; (b) 30분 내지 100일의 연장된 혈청 및 종양 반감기를 나타내고/내거나; 및/또는 (c) 증가된 GUCY2c 발현 수준 또는 증가된 수용체 밀도 수준의 존재 하에 0.0001 내지 100 nM의 EC50 값을 나타낸다.
한 실시양태에서, 에피토프 결합 도메인은 유방암, 난소암, 갑상선암, 전립선암, 자궁암, 폐암(비제한적으로 비-소세포 폐암 및 소세포 폐암을 포함함), 방광암, 자궁내막암, 두경부암, 고환암 및 교아종과 연관된 GUCY2c 종양 연관된 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암이다. 구체적 실시양태에서, 치료는 세포용해성 T 세포 반응을 활성화시킨다.
본 발명의 이중특이적 항체는 일반적으로 면역 글로불린 또는 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 결합 도메인을 유도하는 항체는 조류 및 포유류(예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 뮤린, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭)을 포함하는 임의의 동물 기원의 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 단클론 항체 또는 인간화된 단클론 항체이다.
본 발명의 이중특이적 항체는 다양한 방법으로 특성규명될 수 있다. 특히, 본 발명의 분자는 항원에 면역 특이적으로 결합하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 이어서, 항원에 면역 특이적으로 결합하는 것으로 확인되는 분자는 항원에 대한 이의 특이성에 대해 분석될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 드노보(de novo) 단백질 합성 및 결합 단백질을 암호화하는 핵산의 재조합 발현을 포함하는 당분야에 주지된 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 목적되는 핵산 서열은 재조합 방법(예를 들어 목적하는 폴리뉴클레오티드의 이전에 생산된 변이체의 PCR 돌연변이 유발)에 의해 또는 고상 DNA 합성에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 재조합 발현 방법이 사용된다. 한 양상에서, 본 발명은 CD3 VH 및/또는 VL을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다; 또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c VH 및/또는 VL을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 유전자 코드의 축퇴로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 면역 글로불린 아미노산 서열을 암호화하고, 본 발명은 본원에 기재된 결합 단백질을 암호화하는 모든 핵산을 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 표적 항원 및 CD3에 결합하는 2개의 scFv 도메인을 포함할 수 있고, 이는 IgG의 Fc 도메인에 융합된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 GUCY2c 및 CD3 엡실론에 결합하는 2개의 scFv 도메인을 포함하고, 이는 IgG1의 Fc 도메인에 융합된다. 특히, 도 1a, 1b, 1c 및 1d는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 4개의 대안적 그림을 나타낸다. 이중특이적 항체는 제1 이종이량체-촉진 및 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함한다. 각각의 제1 이종이량체-촉진 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 면역 글로불린 Fc 영역의 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있되, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인은 놉(돌기) 또는 홀(공동)을 포함하도록 변경되었다. 이중특이적 항체의 Fc 부분에 대한 변형은 하기에 기재된다.
본 발명의 한 양상에서, 도s 1a, 1b, 1c 및 1d에 나타낸 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에 추가로 기재된 이중특이적 항체를 제공하되, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c 항체의 VL(GUCY2c VL) 및 CD3 항체의 VH(CD3 VH)를 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 항체의 VL(CD3 VL) 및 GUCY2c 항체의 VH(GUCY2c VH)를 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 이중특이적 항체를 제공하되, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VL 및 GUCY2c VH를 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VL 및 CD3 VH를 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 이중특이적 항체를 제공하되, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 1, 및 (ii) a 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 이중특이적 항체를 제공하되, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 1, 및 (ii) 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 2, 및 (ii) 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함한다.
전술된 일부 실시양태에서, GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성한다.
임의의 전술된 것의 추가적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 또는 261의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR1; (b) 서열번호 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 또는 267의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR2; (c) 서열번호 14, 22, 29, 36 또는 44의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR3; (d) 서열번호 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 또는 167의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR1; (e) 서열번호 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 또는 168의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR2; 및 (f) 서열번호 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 또는 169의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR3.
특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 74의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR1; (b) 서열번호 75의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR2; (c) 서열번호 29의 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR3; (d) 서열번호 148의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR1; (e) 서열번호 149의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR2; 및 (f) 서열번호 142의 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR3.
구체적 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 73의 서열을 포함하는 GUCY2c VH 영역; 및 (b) 서열번호 147에 나타낸 서열을 포함하는 GUCY2c VL 영역.
추가적 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: (a) 서열번호 2의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR1; (b) 서열번호 3 또는 10의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR2; (c) 서열번호 4의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR3; (d) 서열번호 77, 85 또는 91의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR1; (e) 서열번호 78의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 79의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR3.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: (a) 서열번호 2의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR1; (b) 서열번호 10의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR2; (c) 서열번호 4의 서열을 포함하는 CD3 VH CDR3; (d) 서열번호 91의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR1; (e) 서열번호 78의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 79의 서열을 포함하는 CD3 VL CDR3.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: (a) 서열번호 1, 9 또는 273의 서열을 포함하는 CD3 VH 영역; 및 (b) 서열번호 76, 84, 90, 274, 275 또는 276의 서열을 포함하는 CD3 VL 영역. 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 (a) 서열번호 9의 서열을 포함하는 CD3 VH 영역; 및 (b) 서열번호 90의 서열을 포함하는 CD3 VL 영역.
본 발명의 또 다른 양상에서, 링커 3은 서열 GCPPCP(서열번호 192)를 갖는 절단된 인간 IgG1 하부 힌지 영역, 및 하부 힌지 영역에 선행하는 하나 이상의 글리신 잔기를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인은 서열번호 188, 196, 199, 202, 205, 210, 216, 248, 282, 284 또는 286의 서열을 포함하는 놉 Fc 쇄(돌기) 또는 서열번호 189, 197, 200, 203, 206, 211, 217, 220, 249, 283, 285 또는 287의 서열을 포함하는 홀 Fc 쇄(공동)를 포함하도록 변경된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 제2 이종이량체-촉진 도메인은 서열번호 188, 196, 199, 202, 205, 210, 216, 248, 282, 284 또는 286의 서열을 포함하는 놉 Fc 쇄(돌기)(이러한 제1 이종이량체 영역이 홀 Fc 쇄(공동)를 포함하는 경우), 또는 서열번호 189, 197, 200, 203, 206, 211, 217, 220, 249, 283, 285 또는 287의 서열을 포함하는 홀 Fc 쇄(공동)(이러한 제1 이종이량체 영역이 놉 Fc 쇄(돌기)를 포함하는 경우)를 포함하도록 변경된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 쇄를 포함할 수 있다(표 7).
표 9는 본원에 기재된 다양한 GUCY2c 및 CD3 항체를 갖는 이중특이적 항체의 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄의 핵산 서열을 제공한다. 서열번호 246 및 247은 본원에 사용된 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
[표 9]
Figure 112020139468681-pct00032
인간 IgG1 CH2-CH3의 효과기 삭제 돌연변이
인간 IgG1의 Fc 쇄를 표준 프라이머-유도된 PCR 돌연변이 유발을 사용하여 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A(서열번호 187, EU 인덱스에 따른 넘버링)를 도입하도록 변형하여 FcγRIII에 대한 결합으로 인해 효과기 기능을 삭제하여 효과기 기능 삭제 표현형을 제공한다(문헌[Canfield et al., J. Exp. Med (1991) 173: 1483-1491]; [Shields et al., J. Biol. Chem. (2001) 276:6591-604]).
인간 IgG1 CH2-CH3의 놉-인-홀 돌연변이
놉-인-홀은 이종이량체화를 위해 항체 중쇄 동종이량체를 조작하기 위해 당분야에 공지된 효과적인 설계 전략이다. 이러한 접근법에서, '놉' 변이체는 IgG1의 Fc 쇄의 하나의 쇄에서 작은 아미노산을 보다 큰 것으로 대체함으로써(예를 들어 Y349C 및 T366W)(EU 인덱스에 따른 넘버링) 수득된다. '놉'은 큰 잔기를 보다 작은 것으로 대체함으로써(예를 들어 S354C, T366S, L368A 및 Y407V)(EU 인덱스에 따른 넘버링) Fc 쇄의 상보적 쇄의 CH3 도메인에서 '홀' 내로 삽입되도록 설계된다.
일부 실시양태에서, 표 10에 제공된 바와 같이, 상보적 돌연변이가 도입되어 생성된 Fc 쇄의 이종이량체화를 유도하여, 각각의 Fc 쇄는 돌연변이의 하나의 세트, 즉 Fc 쇄의 놉(또는 돌기)에서 Y349C 및 T366W(서열번호 188), 또는 Fc 쇄의 홀(또는 공동)에서 S354C, T366S, L368A 및 Y407V(서열번호 189)에서를 가질 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 내로 공-형질감염될 때, 서열번호 246 및 247의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA는 하나의 홀(또는 공동) Fc 쇄에 회합된 하나의 놉(또는 돌기) Fc 쇄를 갖는 이중특이적 항체인 Fc 도메인을 생산한다.
[표 10]
Figure 112020139468681-pct00034
본 발명의 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 열적 안정성 연구에서 응집, 및 인간 CD3 및 GUCY2c 둘 모두를 표적화하는 강한 이중특이적 항체-Fc 융합에 대해 안정하다. 놉-인-홀 Fc 도메인은 CHO 세포에서 개선된 발현 및 개선된 정제를 가능하게 하여 목적하는 이종이량체의 고순도를 야기한다. Fc 도메인 내에서 조작된 돌연변이는 FcγR 결합을 제거하여 잠재적으로 ADCC 매개된 T 세포 고갈을 피한다. 또한, 이중특이적 항체로의 Fc 도메인의 혼입은 시차주사 열량법(DSC)에 의해 나타난 바와 같이 분자의 안정성을 증진시킨다.
이중특이적 항체는 본 발명의 또 다른 폴리펩티드 쇄 상의 대응 시스테인 잔기와 상호작용하여 쇄간 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하도록 조작될 수 있다. 쇄간 다이설파이드 결합은 이중특이적 항체를 안정화시키는 작용을 하여 재조합 시스템에서 발현 및 회복을 개선하여 안정하고 일관된 제형을 야기할 뿐만 아니라 생체내 단리되고/되거나 정제된 생성물의 안정성을 개선할 수 있다. 시스테인 잔기는 단일 아미노산으로서 또는 보다 큰 아미노산 서열의 부분, 예를 들어 힌지 영역으로서 폴리펩티드 쇄의 임의의 일부에 도입될 수 있다. 구체적 양상에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 폴리펩티드 쇄의 C-말단에서 발생하도록 조작된다.
한 양상에서, 본 발명은 GUCY2c에 특이적으로 결합하고 본원에 개시된 이중특이적 항체와 결합에 대해 경쟁하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일부 이러한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 GUCY2c의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
한 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공하되, 여기서 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로으로 순서대로 항-GUCY2c 항체의 VL(GUCY2c VL)(서열번호 147) - 링커 1(서열번호 190) - 항-CD3 항체의 VH(CD3 VH)(서열번호 9) - 링커 3(서열번호 192) - 제1 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 188)을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 순서대로 항-CD3 항체의 VL(CD3 VL)(서열번호 90) - 링커 2(서열번호 191) - 항-GUCY2c 항체의 VH(GUCY2c VH)(서열번호 73) - 링커 3(서열번호 192) - 제2 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 189)을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공하되, 여기서 이중특이적 항체 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, (a) 제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 순서대로 항-GUCY2c 항체의VL(GUCY2c VL)(서열번호 147) - 링커 1(서열번호 190) - 항-CD3 항체의 VH(CD3 VH)(서열번호 9) - 링커 3(서열번호 192) - 제1 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 188)을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 순서대로 항-CD3 항체의 VL(CD3 VL)(서열번호 90) - 링커 2(서열번호 191) - 항-GUCY2c 항체의 VH(GUCY2c VH)(서열번호 73) - 링커 3(서열번호 192) - 제2 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 189)을 포함하고; GUCY2c VL 및 GUCY2c VH는 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH는 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; 제1 폴리펩티드 쇄의 링커 3 및 제2 폴리펩티드 쇄의 링커 3은 2개의 다이설파이드 결합에 의해 서로 공유 결합되고; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고; 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 놉을 형성하고, 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인은 홀을 형성하고; 하나 이상의 다이설파이드 결합은 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인과 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인 사이에 형성된다.
일부 이러한 실시양태에서, 본 발명은 GUCY2c의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 VH 골격 또는 인간화된 VH 골격, 및 인간 VL 골격 또는 인간화된 VL 골격을 추가로 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일부 이러한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간화된 항체이다. 구체적 실시양태에서, VH 골격은 서열번호 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하고/하거나; VL 골격은 서열번호 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 또는 155의 서열을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하되, 이중특이적 항체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고; 제1 폴리펩티드 쇄는 ATCC 기탁번호 PTA-124944의 발현 벡터에 의해 생산되고; 제2 폴리펩티드 쇄는 ATCC 기탁번호 PTA-124943의 발현 벡터에 의해 생산된다.
한 양상에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 제공하되, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 216의 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 220의 서열을 포함한다.
일부 이러한 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하되, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 서로 공유 결합된다.
본 발명은 치료 효과량의 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 개체에서 암의 치료, 예방 또는 관리를 위한 방법 및 조성물을 포함하며, 이는 상기 개체에게 본 발명에 따라 조작된 치료 효과량의 항체 또는 이중특이적 항체를 투여함을 포함하며, 상기 분자는 암 항원에 추가로 결합한다. 본 발명의 분자는 특히 원발성 종양의 성장 및/또는 퇴행 및 암 세포의 전이의 예방, 억제 또는 감소에 유용할 수 있다. 특정 작용 메커니즘에 제한되지 않고, 본 발명의 분자는 효과기 기능을 매개할 수 있고, 이는 종양 클리어런스, 종양 감소 또는 이들의 조합을 야기할 수 있다.
본 발명의 항체(예를 들어 GUCY2c 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적)는 비제한적으로 치료적 치료 방법 및 진단적 치료 방법을 포함하는 다양한 적용례에 유용하다.
한 양상에서, 본 발명은 개체에서 GUCY2c 발현과 관련된 질환의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체에서 GUCY2c 발현과 관련된 질환의 치료 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 본원에 기재된 GUCY2c 항체 또는 GUCY2c 이중특이적 항체를 포함하는 효과량의 조성물(예를 들어 약학 조성물)을 투여함을 포함한다. GUCY2c 발현과 관련된 질환은 비제한적으로 비정상적 GUCY2c 발현, 변경되거나 비정상적인 GUCY2c 발현, GUCY2c를 발현하는 악성 세포, 및 증식성 장애(예를 들어 암)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 이중특이적 항체를 T 세포 상의 GUCY2c 항원 및 CD3 항원을 면역 특이적으로 인식하도록 조작함에 의한, GUCY2c 항원에 의해 특성규명되는 암의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 조작된 이중특이적 항체는 항-CD3 유도된 활성화된 살해 T 세포에 의해 세포독성 활성을 갖기 때문에 암의 예방 또는 치료에 유용하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료가 필요한 환자에서 GUCY2c 관련된 장애의 치료 방법을 제공하되, 이는 상기 환자에게 본원에 개시된 GUCY2c 항체를 투여함을 포함한다. 또한, 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료가 필요한 환자에서 GUCY2c 관련된 장애의 치료 방법을 제공하되, 이는 상기 환자에게 본 발명의 이중특이적 항체를 투여함을 포함한다.
본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 치료가 필요한 환자에서 GUCY2c 관련된 장애의 치료 방법을 추가로 제공하되, 이는 상기 환자에게 본원에 개시된 GUCY2c 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, GUCY2c 관련된 장애는 암이다. 구체적 실시양태에서, 암은 유방암, 난소암, 갑상선암, 전립선암, 자궁암, 폐암(비제한적으로 비-소세포 폐암 및 소세포 폐암을 포함함), 방광암, 자궁내막암, 두경부암, 고환암 또는 교아종이다. 특정 실시양태에서, 암은 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암이다. 구체적 실시양태에서, 치료는 세포용해성 T 세포 반응을 활성화시킨다.
한 양상에서, 본 발명은 치료에서 사용하기 위한 본원에 개시된 항체, 이중특이적 항체 또는 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 본원에 정의된 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 치료에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 GUCY2c 관련된 장애의 치료이다. 구체적 실시양태에서, GUCY2c 관련된 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암, 난소암, 갑상선암, 전립선암, 자궁암, 폐암(비제한적으로 비-소세포 폐암 및 소세포 폐암을 포함함), 방광암, 자궁내막암, 두경부암, 고환암 및 교아종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 암은 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암이다. 구체적 실시양태에서, 치료는 세포용해성 T 세포 반응을 활성화시킨다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 벡터에 의해 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 일부 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 항체 또는 이중특이적 항체를 재조합으로 생산한다. 구체적 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포주, 포유동물 세포주, 곤충 세포주 및 효모 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포주는 CHO 세포주이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이중특이적 항체는 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하여 생산된다.
한 양상에서, 암의 치료가 필요한 개체에서 암의 치료 방법이 제공되되, 이는 a) 본원에 기재된 이중특이적 항체를 제공함, 및 b) 상기 이중특이적 항체를 상기 환자에게 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 항원을 발현하는 악성 세포와 관련된 질환의 치료가 필요한 개체에서 종양 항원을 발현하는 악성 세포와 관련된 질환의 치료 방법이 제공되되, 이는 a) 본원에 기재된 항체를 제공함, 및 b) 본원에 기재된 항체를 포함하는 약학 조성물의 효과량을 이를 필요로 하는 상기 개체에게 투여함을 포함한다. 치료할 암의 예는 비제한적으로 식도암, 위암, 소장암, 결장암, 직장암, 항문암, 간암, 담낭암, 맹장암, 담관암 ?? 췌장암을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 상기에 열거된 원발성 및 전이성 암을 치료하고 이미지화시키고 검출하고 이에 대해 백신 접종시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, GUCY2c를 발현하는 악성 세포를 갖는 개체에서 종양 성장 또는 진행의 억제 방법이 제공되되, 이는 이를 필요로 하는 상기 개체에게 본원에 기재된 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함하는 조성물의 효과량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함한다. 다른 실시양태에서, 개체에서 GUCY2c를 발현하는 전이 세포를 억제하는 방법이 제공되되, 이는 본원에 기재된 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함하는 조성물의 효과량을 이를 필요로 하는 상기 개체에게 투여함을 포함한다. 다른 실시양태에서, 개체에서 악성 세포의 종양 퇴행의 유도 방법이 제공되되, 이는 본원에 기재된 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함하는 조성물의 효과량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함한다.
구체적 양상에서, 본 발명의 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 부재 하에 암 세포의 성장과 비교하여, 암 세포의 성장을 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20% 또는 적어도 10%만큼 억제하거나 감소시킨다.
구체적 양상에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 부재와 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%만큼 세포를 사멸시키거나 암 세포의 성장을 억제하거나 감소시킨다.
한 실시양태에서, 개체에서 자가면역 장애의 치료 방법이 제공되되, 이는 본원에 기재된 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함하는 조성물의 표과량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함한다.
본원에 사용된 자가면역 장애는 비제한적으로 염증성 장 질환, 전신 홍반성 루푸스, 당뇨병(유형 I), 셀리악병, 무글로불린혈증, 자가면역 장 질환, 자가면역 간염, 크론병, 위장 유천포창, 다발성근염, 횡단성 척수염, 궤양성 대장염 및 맥관염을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 발현과 관련된 질환(예를 들어 암)의 치료를 필요로 하는 개체에서 GUCY2c 발현와 관련된 질환(예를 들어 암)의 치료를 위한, 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 포함하는 조성물(예를 들어 약학 조성물)의 효과량을 제공한다. 한 실시양태에서, GUCY2c를 발현하는 악성 세포를 갖는 개체에서 종양 성장 또는 진행의 억제를 위한 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 포함하는 조성물(예를 들어 약학 조성물)의 효과량이 제공된다. 일부 실시양태에서, 개체에서 GUCY2c를 발현하는 악성 세포의 전이의 억제를 위한 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 포함하는 조성물(예를 들어 약학 조성물)의 효과량이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 포함하는 조성물(예를 들어 약학 조성물)의 효과량이 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 발현과 관련된 질환(예를 들어 암)의 치료가 필요한 개체에서 GUCY2c 발현과 관련된 질환(예를 들어 암)의 치료에서 사용하기 위한 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c)를 제공한다. 일부 실시양태에서, GUCY2c를 발현하는 악성 세포를 갖는 개체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하기 위한 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)가 제공된다. 일부 실시양태에서, GUCY2c를 발현하는 악성 세포의 전이의 억제가 필요한 개체에서 GUCY2c를 발현하는 악성 세포의 전이의 억제하기 위한 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)가 제공된다. 일부 실시양태에서, GUCY2c를 발현하는 악성 세포를 갖는 개체에서 종양 퇴행을 유도하기 위한 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)가 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 발현과 관련된 질환(예를 들어 암)의 치료용 약제의 제조에서 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행의 억제용 약제의 제조에서 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, GUCY2c를 발현하는 악성 세포의 전이의 억제용 약제의 제조에서 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 종양 퇴행의 유도용 약제의 제조에서 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 용도가 제공된다.
또 다른 양상에서, GUCY2c 발현과 관련된 질환의 검출, 진단 및/또는 모니터링 방법이 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)는 검출가능한 모이어티, 예컨대 이미지화제 및 효소-기질 표지에 의해 표지될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항체는 생체내 진단 분석, 예컨대 생체내 이미지화(예를 들어 PET 또는 SPECT), 또는 염색 시약에 사용될 수 있다.
따라서, T 세포를 종양-특이적 항원으로 지향시키는 것에 더하여, 본 발명의 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 다른 진단제 또는 치료제를 표면 상의 종양을 발현하는 세포로 전달하는 데 사용된다. 따라서, 이중특이적 항체는 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어 링커를 통해 약물에 부착되어, 이는 종양을 갖는 세포에 직접 전달될 것이다. 치료제는 비제한적으로 핵산, 단백질, 펩티드, 아미노산 또는 유도체, 당단백질, 방사성 동위원소, 지질, 탄수화물 또는 재조합 바이러스를 포함한다. 핵산 진단제 또는 치료제는 비제한적으로 안티센스 핵산, 싱글 또는 듀플렉스 DNA와 공유성 가교결합을 위해 유도된 올리고뉴클레오티드, 및 트라이플렉스 형성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 이중특이적 항체에 연결된 진단제 또는 치료제는, 바람직하게는 순환계에 대한 직접 노출로부터 보호된, 치료제, 예컨대 약물, 핵산(예를 들어 안티센스 핵산), 또는 또 다른 치료제를 함유하는 캡슐화 시스템, 예컨대 리포좀 또는 미셀일 수 있다. 항체에 부착된 리포좀의 생산 수단은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, US 4,957,735; 및 문헌[Connor, et al., Pharm. Ther. 28:341-365 (1985)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체를 또 다른 형태의 요법에 의해 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적 형태의 요법은 비제한적으로 화학 요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법 및/또는 추가적 면역 요법을 포함하는 추가적 항암 요법이다.
본 발명은 비제한적으로 현재 표준의 실험적 화학 요법, 생물학적 요법, 면역 요법, 방사선 요법 또는 수술을 포함하는, 암의 치료 또는 예방을 위해 당업자에게 공지된 기타 요법과 병용으로 본 발명의 분자를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 본 발명의 분자는 치료 또는 예방 효과량의 하나 이상의 제제, 치료 항체, 또는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 당업자에게 공지된 기타 제제와 병용으로 투여될 수 있다.
따라서, 암의 치료 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 효과량의 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 화학 치료제와 병용으로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 병용 치료는 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 적합한 화학 치료제는 비제한적으로 하나 이상의 추가적 제제, 예컨대 베바시주맙(bevacizumab), 세툭시맙(cetuximb), 시롤리무스(sirolimus), 파니투무맙(panitumumab), 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈(capecitabine), 티보자닙(tivozanib), 이리노테칸(irinotecan), 옥사플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin), 트라이플루리딘(trifluridine), 티피라실(tipiracil), 류코보리(leucovori), 젬시타빈(gemcitabine) 및/또는 에를로티닙 하이드로클로라이드(erlotinib hydrochloride)를 포함한다.
본원에 제공된 투여량 및 투여 빈도는 용어 "치료적으로 효과적인 및 예방적으로 효과적인"에 포함된다. 투여량 및 빈도는 투여된 특정 치료제 또는 예방제, 암의 중증도 및 유형, 투여의 경로, 및 환자의 연령, 체중, 반응 및 과거 병력에 따라 각각의 환자에 특이적인 인자에 따라 변할 수 있다. 적합한 섭생법은 상기 인자를 고려함으로써 및 예를 들어 문헌[Physician's Desk Reference (56th ed., 2002)]에 보고되고 권고되는 투여량에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는 선택된 투여 모드, 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제, 예컨대 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 담체 등에 적절하도록 제형화된 투여용 약학 조성물의 형태일 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18th ed., 1995]은 당업자에게 일반적으로 공지된 바와 같은 제형화 기술의 개요서를 제공한다.
이들 약학 조성물은 일반적으로 암을 치료하도록 의도된 목적을 달성하는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는, 비제한적으로 식도 경유, 종양내, 결장 경유, 피부 경유, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 모드를 지칭하는, 본원에 정의된 바와 같이 비경구적일 수 있다. 본 발명에 따른 분자(예를 들어 GUCY2c 항체, CD3-GUCY2c 이중특이적 항체, 약학 조성물)의 투여 및 투약 방법은 치료할 질병의 유형 또는 적절하게는 이의 단계, 조절할 항원, 공존하는 치료의 종류, 존재하는 경우 치료의 빈도, 목적되는 효과의 성질, 및 환자의 체중, 연령, 건강, 식단 및 성별에 좌우된다. 따라서, 실제로 사용되는 투여량 섭생법은 크게 변할 수 있고, 따라서 본원에 제시된 투여량 섭생법으로부터 벗어날 수 있다.
본 발명의 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 다양한 제형이 투여에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)는 순수하게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체) 및 약학적으로 허용되는 부형제는 다양한 제형으로 존재할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 당분야에 공지되어 있고, 약리학적으로 효과적인 물질의 투여를 가능하게 하는 비교적으로 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 농도를 제공할 수 있거나 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 비제한적으로 안정화제, 습윤제 및 유화제, 삼투압 조절용 염, 캡슐화제, 완충제, 피부 침투 증진제를 포함한다. 장관외 및 비-장관외 약물 전달을 위한 부형제 및 제형이 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005]에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 이들 제제는 주사(예를 들어 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등)에 의한 투여를 위해 제형화된다. 따라서, 이들 제제는 약학적으로 허용되는 비히클, 예컨대 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정 투여량 섭생법, 즉 투여량, 시기 및 반복은 특정 개체 및 상기 개체의 병력에 좌우될 것이다.
본원에 기재된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)는 주사(예를 들어 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등)를 포함하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 또한, 항체, 예를 들어 단클론 항체 또는 이중특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같이 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 투여를 위해, 투여량은 치료 받을 숙주 및 특정 투여 모드에 좌우된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 투여량 범위는 약 0.001 내지 약 20,000 μg/kg 체중일 것이다. 용어 "체중"은 환자가 치료 받는 중일 때 적용가능하다. 단리된 세포를 치료할 때, 본원에 사용된 "체중"은 "전체 세포 체중"을 지칭한다. 용어 "전체 체중"은 사용되어 단리된 세포 및 환자 치료 모두에 대해 적용될 수 있다. 모든 농도 및 치료 수준은 본원에서 "체중" 또는 간단히 "kg"으로 표현되고, 또한 "전체 세포 체중" 및 "전체 체중"을 포함하는 것으로 간주된다. 그러나, 당업자는 다양한 투여량 범위, 예를 들어 0.01 내지 20,000 μg/kg 체중, 0.02 내지 15,000 μg/kg 체중, 0.03 내지 10,000 μg/kg 체중, 0.04 내지 5,000 μg/kg 체중, 0.05 내지 2,500 μg/kg 체중, 0.06 내지 1,000 μg/kg 체중, 0.07 내지 500 μg/kg 체중, 0.08 내지 400 μg/kg 체중, 0.09 내지 200 μg/kg 체중 또는 0.1 내지 100 μg/kg 체중의 사용을 알 것이다. 또한, 당업자는 예를 들어 0.0001 μg/kg, 0.0002 μg/kg, 0.0003 μg/kg, 0.0004 μg/kg, 0.005 μg/kg, 0.0007 μg/kg, 0.001 μg/kg, 0.1 μg/kg, 1.0 μg/kg, 1.5 μg/kg, 2.0 μg/kg, 5.0 μg/kg, 10.0 μg/kg, 15.0 μg/kg, 30.0 μg/kg, 50 μg/kg, 75 μg/kg, 80 μg/kg, 90 μg/kg, 100 μg/kg, 120 μg/kg, 140 μg/kg, 150 μg/kg, 160 μg/kg, 180 μg/kg, 200 μg/kg, 225 μg/kg, 250 μg/kg, 275 μg/kg, 300 μg/kg, 325 μg/kg, 350 μg/kg, 375 μg/kg, 400 μg/kg, 450 μg/kg, 500 μg/kg, 550 μg/kg, 600 μg/kg, 700 μg/kg, 750 μg/kg, 800 μg/kg, 900 μg/kg, 1 μg/kg, 5 μg/kg, 10 μg/kg, 12 μg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg 및/또는 30 mg/kg의 다양한 상이한 투여량 수준이 사용될 것임을 알 것이다. 모든 이들 투여량은 예시적인 것이고, 이들 점 사이의 임의의 투여량이 또한 본 발명에 사용될 것으로 예상된다. 임의의 상기 투여량 범위 또는 투여량 수준이 본 발명의 항체에 대해 사용될 수 있다. 며칠 이상의 반복된 투여를 위해, 상태에 따라, 목적되는 증상의 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어, 예를 들어 종양 성장/진행 또는 암 세포의 전이를 억제하거나 지연할 때까지 치료가 지속된다.
또한, 다른 투여량 섭생법이, 당업자가 달성하기를 바라는 약동학적 쇠퇴의 패턴에 따라 유용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 초기 시동 투여량으로 투여된 후에, 보다 높은 투여량 및/또는 연속되고 실질적으로 일정한 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 1주일에 1 내지 4회의 투여가 고려된다. 다른 실시양태에서, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회의 투여가 고려된다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 섭생법(항체, 예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함함)은 시간에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 적절한 투여량은 사용된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체) 또는 이의 조성물, 치료할 증상의 유형 및 중증도, 제제가 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 병력 및 제제에 대한 반응, 투여된 제제에 대한 환자의 클리어런스 비, 및 담당의의 재량에 좌우될 것이다. 전형적으로 임상의는 투여량이 목적하는 결과를 달성할 때까지 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 투여할 것이다. 투여량 및/또는 빈도는 치료 과정 동안 변할 수 있다. 경험적 고찰, 예컨대 반감기는 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체는 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격 받는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다. 투여의 빈도는 치료의 과정 동안 결정되고 조정될 수 있고, 일반적으로, 증상의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연, 예를 들어 종양 성장 억제 또는 지연 등을 기반으로 하나 반드시 그럴 필요는 없다. 대안적으로, 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 지속적인 서방형 제제가 적절할 수 있다. 서방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 투여량은 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 1회 이상의 투여를 제공 받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 증분 투여량을 제공 받는다. 효력을 평가하기 위해, 질병의 지표에 따를 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 투여는 종양 성장 억제, 종양 퇴행, 종양 크기 감소, 종양 세포 수 감소, 종양 성장 지연, 압스코팔(abscopal) 효과, 종양 전이 억제, 시간에 따른 전이성 병변 감소, 화학 치료제 또는 세포독성제의 사용 감소, 종양 부담 감소, 무진행 생존 증가, 전체 생존 증가, 완전한 반응, 부분적 및 안정적 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과를 야기한다.
본 발명의 방법에 따른 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 투여는 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인 것인지 예방적인 것인지 여부, 및 당업자에게 공지된 기타 인자에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 투여는 사전 선택된 시간 동안 본질적으로 연속적일 수 있거나 일련의 간격을 둔 투여량으로 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 초과의 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)가 존재할 수 있다. 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 이상의 상이한 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이는(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체) 서로 악영향을 주지 않는 상보적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 항체 중 하나 이상이 사용될 수 있다: GUCY2c 또는 CD3 상의 하나의 에피토프에 지향성인 제1 GUCY2c 또는 CD3 항체, 및 GUCY2c 또는 CD3 상의 상이한 에피토프에 지향성인 제2 GUCY2c 또는 CD3 항체.
본 발명에 따라 사용된 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 치료 제형은 목적하는 순도를 갖는 단백질을 임의적 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005])와 함께 혼합함으로써 저장을 위해 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 유기산; 염, 예컨대 염화 나트륨; 산화 방지제, 예컨대 아스코르브산, 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 상대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN, 상표), 플루로닉스(상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 함유하는 리포좀은 당분야에 공지된 방법(예컨대 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 US 4,485,045 및 4,544,545에 기재됨)에 의해 생산된다. 증진된 순환 시간을 갖는 리포좀은 US 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생산될 수 있다. 리포좀은 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포좀이 생산된다.
또한, 활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스를 계면 중합함으로써 제조된 마이크로 캡슐, 또는 젤라틴-마이크로 캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로 캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로 스피어, 마이크로 유화액, 나노 입자 및 나노 캡슐) 또는 마이크로 유화액에 포집될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005]에 개시되어 있다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로 캡슐이다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(US 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT, 상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로 스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 멸균 상태여야 한다. 이는 용이하게 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성된다. 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 위치한다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 흡입제에 의한 투여를 위한 단위 투여량 형태, 예컨대 정제, 환약, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액 또는 좌제일 수 있다.
고체 조성물, 예컨대 정제의 제조를 위해, 주된 활성 성분을 약학 담체, 예를 들어 통상적인 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 솔비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 다이칼슘 포스페이트 또는 검, 및 기타 약학 희석제, 예를 들어 물과 혼합하여 본 발명의 화합물의 균일 혼합물을 함유하는 고체 제형화전 조성물 또는 이의 비독성의 약학적으로 허용되는 염을 형성한다. 이들 제형화전 조성물이 균일한 것으로 언급되는 경우, 이는 활성 성분이 조성물에 걸쳐 고르게 분포되어 조성물이 동등하게 효과적인 단위 투여량 형태, 예컨대 정제, 환약 및 캡슐로 용이하게 세분화될 수 있음을 의미한다. 이어서, 고체 제형화전 조성물은 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명이 활성 성분을 함유하는 상기에 기재된 유형의 단위 투여량 형태로 세분된다. 본 발명의 조성물의 정제 또는 환약은 코팅되거나 혼합되어 지연된 작용의 유리점을 제공하는 투여량 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환약은 내부 투여량 및 외부 투여량 성분을 포함할 수 있고, 후자는 전자 위의 인벨로프의 형태이다. 상기 2개의 성분은 위에서의 분해에 저항하고 내부 성분이 온전하게 십이지장에 전달되도록 하거나 방출이 지연되도록 하는 역할을 하는 장용성 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용성 층 또는 코팅에 사용될 수 있되, 이러한 물질은 많은 중합체성 산, 및 중합체성 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 이러한 물질의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면 활성제는 특히 비이온성 제제, 예컨대 폴리옥시에틸렌솔비탄(예를 들어 Tween(상표) 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 솔비탄(예를 들어 스판(Span, 상표) 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면 활성제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5%의 표면 활성제를 포함할 수 있고 이는 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요에 따라 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 약학적으로 허용되는 비히클이 첨가될 수 있음이 이해될 수 있다.
적합한 유화액은 상업적으로 입수가능한 지방 유화액, 예컨대 인트라리비드(Intralipid, 상표), 리포신(Liposyn, 상표), 인포누트롤(Infonutrol, 상표), 리포푸딘(Lipofundin, 상표) 및 리피피산(Lipiphysan, 상표)을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전 혼합된 유화액 조성물에 용해될 수 있거나, 대안적으로 오일(예를 들어 대두 오일, 홍화 오일, 면실 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일), 및 인지질(예를 들어 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합시 형성된 유화액에 용해될 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가되어 유화액의 긴장성을 조정할 수 있음이 이해된다. 적합한 유화액은 전형적으로 20% 이하, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 유화액은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 가질 수 있다.
유화액 조성물은 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 인트라리피드(상표) 또는 이의 성분(대두 오일, 게란 인지질, 글리세롤 및 물)과 함께 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 흡입제를 위한 조성물은 약학적으로 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 이의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기에 제시된 적합한 약학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 코 호흡성 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 멸균된 약학적으로 허용되는 용매 중의 조성물은 기체의 사용에 의해 연무될 수 있다. 연무된 용액은 연무 장치로부터 직접 흡입될 수 있거나, 연무 장치는 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐적 정압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 코로 투여될 수 있다.
본 발명의 범위 내의 조성물은 항체(GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)가 암의 치료를 위해 목적되는 의료적 효과를 달성하는 데 효과적인 양으로 존재한다. 개별적 필요는 환자마다 다를 수 있으나, 모든 성분의 효과량의 최적 범위의 결정은 통상의 지식의 임상의의 능력 내에 있다.
또한, 이러한 조성물, 및 제형화 방법의 예는 상기 섹션 및 하기에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체 매개된 용해 또는 ADCC를 촉발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 원치 않거나 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체 매개된 용해 또는 ADCC를 촉발하지 않는 불변 영역을 포함한다.
조성물이 하나 초과의 항체(예를 들어 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체), 예컨대 GUCY2c 또는 CD3 및 GUCY2c의 상이한 에피토프를 인식하는 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 혼합물을 포함할 수 있음이 이해된다. 다른 예시적 조성물은 상이한 종의 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 동일한 에피토프를 인식하거나 GUCY2c(예를 들어 인간 GUCY2cA) 또는 CD3 및 GUCY2c(인간 CD3 및 GUCY2c)의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 초과의 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 하나 이상의 추가적 치료제의 투여와 병용으로 투여될 수 있다. 이는 비제한적으로 생물 치료제 및/또는 화학 치료제(예컨대 비제한적으로 백신), CAR-T 세포-기반 요법, 방사선 요법, 시토카인 요법, CD3 이중특이적 항체, 다른 면역 억제성 경로의 억제제, 혈관신생의 억제제, T 세포 활성화제, 대사성 경로의 억제제, mTOR 억제제, 아데노신 경로의 억제제, 티로신 키나제 억제제(비제한적으로 인라이타(Inlyta)를 포함함), ALK 억제제 및 수니티닙, BRAF 억제제, 후생유전 변형제, IDO1 억제제, JAK 억제제, STAT 억제제, 사이클린 의존적 키나제 억제제, 생물 치료제(비제한적으로 VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, 기타 성장 인자 수용체, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB, TIGIT 및 ICOS에 대한 항체), 면역원제(예를 들어 약화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포, 예컨대 종양 유래된 항원 또는 핵산에 의해 펄스화된 수지상 세포, 면역 자극성 시토카인(예를 들어 IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극성 시토카인(예컨대 비제한적으로 GM-CSF)을 암호화하는 유전자에 의해 형질감염된 세포)의 투여를 포함한다.
생물 치료제의 예는 치료 항체, 면역 조절제 및 치료 면역 세포를 포함한다.
치료 항체는 다양한 항원에 대한 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 치료 항체는 종양 연관된 항원에 지향성일 수 있어, 항원에 대한 항체의 결합은 항원을 발현하는 세포의 사멸을 촉진한다. 다른 예에서, 치료 항체는 면역 세포 상의 항원(예를 들어 PD-1)에 지향성일 수 있어, 항원을 발현하는 세포의 활성의 하향 조절을 방지한다(이로써 항원을 발현하는 세포의 활성을 촉진한다). 일부 경우에, 치료 항체는 다수의 상이한 메커니즘을 통해 작용할 수 있다(예를 들어 이는 i) 항원을 발현하는 세포의 사멸을 촉진하고, ii) 항원이 항원을 발현하는 세포에 접촉한 면역 세포의 활성의 하향조절하는 것을 일으키는 것을 방지할 수 있다).
치료 항체는 예를 들어 하기에 열거된 항원에 지향성일 수 있다. 일부 항원의 경우, 항원에 지향성인 예시적 항체가 또한 하기에 포함된다(항원 다음 괄호 안에). 또한, 하기 항원은 본원에서 "표적 항원" 등으로 지칭될 수 있다. 본원에서 치료 항체에 대한 표적 항원은 예를 들어 하기를 포함한다: 4-1BB(예를 들어 우토밀루맙(utomilumab)); 5T4; A33; 알파-폴레이트 수용체 1(예를 들어 미르베툭시맙 소라브탄신(mirvetuximab soravtansine)); Alk-1; BCMA[예를 들어 PF-06863135(US 9,969,809 참조)]; BTN1A1(예를 들어 WO 2018/222689 참조); CA-125(예를 들어 아바고보맙(abagovomab)); 카보안하이드라제 IX; CCR2; CCR4(예를 들어 모가물리주맙(mogamulizumab)); CCR5(예를 들어 레론리맙(leronlimab)); CCR8; CD3[예를 들어 블리나투모맙(blinatumomab)(CD3/CD19 이중특이적), PF-06671008(CD3/P-카데린 이중특이적), PF-06863135(CD3/BCMA 이중특이적), CD19(예를 들어 블리나투모맙, MOR208); CD20(예를 들어 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 리툭시맙(rituximab), 우블리툭시맙(ublituximab)); CD22(이노투주맙 오조가미신(inotuzumab ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox)); CD25; CD28; CD30(예를 들어 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)); CD33(예를 들어 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin)); CD38(예를 들어 다라투무맙(daratumumab), 이사툭시맙(isatuximab)), CD40; CD-40L; CD44v6; CD47; CD52(예를 들어 알렘투주맙(alemtuzumab)); CD63; CD79(예를 들어 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin)); CD80; CD123; CD276/B7-H3(예를 들어 옴부르타맙(omburtamab)); CDH17; CEA; ClhCG; CTLA-4(예를 들어 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab)), CXCR4; 데스모글레인 4; DLL3(예를 들어 로발피투주맙 테시린(rovalpituzumab tesirine)); DLL4; E-카데린; EDA; EDB; EFNA4; EGFR(예를 들어 세툭시맙, 데파툭시주맙 마포도틴(depatuxizumab mafodotin), 네시투무맙(necitumumab), 파니투무맙); EGFRvIII; 엔도시알린; EpCAM(예를 들어 오포르투주맙 모나톡스(oportuzumab monatox)); FAP; 태아 아세틸콜린 수용체; FLT3(예를 들어 WO 2018/220584 참조); GD2(예를 들어 디누툭시맙(dinutuximab), 3F8); GD3; GITR; GloboH; GM1; GM2; GUCY2C(예를 들어 PF-07062119); HER2/neu[예를 들어 마르게툭시맙(margetuximab), 페르투주맙(pertuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab); 아도-투라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine), 트라스투주맙 듀오카르마진(trastuzumab duocarmazine), PF-06804103(US 8,828,401 참조)]; HER3; HER4; ICOS; IL-10; ITG-AvB6; LAG-3(예를 들어 렐라틀리맙(relatlimab)); 루이스-Y; LG; Ly-6; M-CSF[예를 들어 PD-0360324(US 7,326,414 참조)]; MCSP; 메소텔린; MUC1; MUC2; MUC3; MUC4; MUC5AC; MUC5B; MUC7; MUC16; 노치(Notch)1; 노치3; 넥틴(Nectin)-4(예를 들어 엔포르투맙 베도틴(enfortumab vedotin)); OX40[예를 들어 PF-04518600(US 7,960,515 참조)]; P-카데린[예를 들어 PF-06671008(WO 2016/001810 참조)]; PCDHB2; PD-1[예를 들어 BCD-100, 캄렐리주맙(camrelizumab), 세미플리맙(cemiplimab), 제놀림주맙(genolimzumab)(CBT-501), MEDI0680, 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), RN888(WO 2016/092419 참조), 신틸리맙(sintilimab), 스파르탈리주맙(spartalizumab), STI-A1110, 티슬렐리주맙(tislelizumab), TSR-042]; PD-L1(예를 들어 아테졸리주맙(atezolizumab), 두르발루맙(durvalumab), BMS-936559(MDX-1105) 또는 LY3300054); PDGFRA(예를 들어 올라라투맙(olaratumab)); 형질 세포 항원; PolySA; PSCA; PSMA; PTK7[예를 들어 PF-06647020(US 9,409,995 참조)]; Ror1; SAS; SCRx6; SLAMF7(예를 들어 엘로투주맙(elotuzumab)); SHH; SIRPa(예를 들어 ED9, Effi-DEM); STEAP; TGF-베타; TIGIT; TIM-3; TMPRSS3; TNF-알파 전구체; TROP-2(예를 들어 사티투주맙 고비테칸(sacituzumab govitecan)); TSPAN8; VEGF(예를 들어 베바시주맙, 브롤루시주맙(brolucizumab)); VEGFR1(예를 들어 라니비주맙(ranibizumab)); VEGFR2(예를 들어 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab)); Wue-1.
치료 항체는 임의의 적합한 포맷을 가질 수 있다. 예를 들어, 치료 항체는 본원에 기재된 임의의 포맷을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 항체는 네이키드 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 항체는 약물/제제에 연결될 수 있다("항체-약물 접합체"(ADC)로도 공지됨). 일부 실시양태에서, 특정 항원에 대한 치료 항체는 다중특이적 항체(예를 들어 이중특이적 항체) 내로 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원에 지향성인 항체는 약물/제제에 접합될 수 있다. 또한, 연결된 항체-약물 분자는 "항체-약물 접합체"(ADC)로 지칭된다. 약물/제제는 항체에 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 가장 통상적으로, 독성 약물이 항체에 연결되어, 각각의 항원에 대한 ADC의 결합이 항원을 발현하는 세포의 사멸을 촉진한다. 예를 들어, 독성 약물에 연결된 ADC는 종양 연관된 항원을 발현하는 종양 세포의 사멸을 촉진하기 위해 종양 연관된 항원을 표적화는 데 특히 유용하다. 다른 실시양태에서, 항체에 연결될 수 있는 제제는 예를 들어 면역 조절제(예를 들어 ADC 부근에서 면역 세포의 활성을 조절함), 이미지화제(예를 들어 개체 또는 개체의 생물학적 샘플에서 ADC의 이미지화를 가능하게 함), 또는 항체 혈청 반감기 또는 생물활성을 증가시키는 제제일 수 있다.
세포독성제 또는 기타 치료제를 항체에 접합시키는 방법은 다양한 공개 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 발생시킬 접합 반응을 위해, 항체에서 리신 측쇄 아민을 통해, 또는 쇄간 다이설파이드 결합을 환원시킴으로써 활성화된 시스테인 설프하이드릴 기를 통해 화학 변형이 있을 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005] 및 [Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004]을 참조한다. 정의된 화학양론을 갖는 특이적 약물 접합체에 대한 항체의 특이적 부위에서 조작된 반응성 시스테인 잔기가 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008]을 참조한다. 트랜스글루타미나제 및 아민(예를 들어 반응성 아민을 포함하거나 이에 부착된 세포독성제)의 존재 하에 폴리펩티드 조작에 의해 반응성이 된(즉 아실 공여자로서 공유 결합을 형성하는 능력) 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 내인성 글루타민을 사용한 접합이 또한 WO 2012/059882 및 WO2015/015448에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, ADC는 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 WO 2016/166629에 제공된 ADC의 임의의 특성 및 특징을 가질 수 있다.
ADC 포맷으로 항체에 연결될 수 있는 약물/제제는 예를 들어 세포독성제, 면역 조절제, 이미지화제, 치료 단백질, 바이오 중합체 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
ADC에 혼입될 수 있는 예시적 세포독성제는 안트라사이클린(anthracycline), 아우리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), 콤브레타스타틴(combretastatin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 피롤로벤조다이아제핀 이량체, 인돌리노-벤조다이아제핀 이량체, 엔다이인, 젤다나마이신(geldanamycin), 메이탄신(maytansine), 푸로마이신(puromycin), 탁산(taxane), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 캄프토테신(camptothecin), 투불리신(tubulysin), 헤미아스털린(hemiasterlin), 스플리세오스타틴(spliceostatin), 플라디에놀리드(pladienolide), 및 이의 입체 이성질체, 등배체, 유사체 또는 유도체를 포함한다.
ADC에 혼입될 수 있는 예시적 면역 조절제는 간사이클로버(gancyclovier), 에타네르셉트(etanercept), 타크롤리무스(tacrolimus), 시롤리무스, 보클로스포린(voclosporin), 사이클로스포린(cyclosporine), 라파마이신(rapamycin), 사이클포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀게이트 모페틸(mycophenolgate mofetil), 메토트렉세이트(methotrextrate), 글루코코르티코이드 및 이의 유사체, 시토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림포톡신, 종양 괴사 인자(TNF), 조혈 인자, 인터류킨(예를 들어 인터류킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 및 IL-21), 콜로니 자극 인자(예를 들어 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 과립구 대식 세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)), 인터페론(예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마), "S 1 인자"로 지정된 줄기 세포 성장 인자, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴 또는 이들의 조합을 포함한다.
ADC에 포함될 수 있는 예시적 이미지화제는 플루오레세인, 로다민, 란타나이드 인 및 이의 유도체, 또는 킬레이터에 결합된 방사성 동위원소를 포함한다. 형광단의 예는 비제한적으로 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(예를 들어 5-FITC), 플루오레세인 아미다이트(FAM)(예를 들어 5-FAM), 에오신, 카복시플루오레세인, 에리트로신, Alexa Fluor.RTM.(예를 들어 Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 또는 750), 카복시테트라메틸로다민(TAMRA)(예를 들어 5,-TAMRA), 테트라메틸로다민(TMR) 및 설포로다민(SR)(예를 들어 SR101)을 포함한다. 킬레이터의 예는 비제한적으로 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA), 1,4,7-트라이아자사이클로노난-1,4,7-트라이아세트산(NOTA), 1,4,7-트라이아자사이클로노난, 1-글루타르산-4,7-아세트산(데페록사민(deferoxamine)), 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA) 및 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산)(BAPTA)을 포함한다.
ADC에 포함될 수 있는 예시적 치료 단백질은 독소, 호르몬, 효소 및 성장 인자를 포함한다.
ADC에 혼입될 수 있는 예시적 생체 적합성 중합체는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체, 및 쌍성이온-함유 생체 적합성 중합체(예를 들어 포스포릴콜린-함유 중합체)를 포함한다.
ADC에 혼입될 수 있는 예시적 생체 적합성 중합체는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항원에 지향성인 항체는 이중특이적 항체 분자 내로 혼입될 수 있다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다.
면역 조절제는 개체에서 면역 반응을 자극할 수 있는 다양한 분자 유형, 예컨대 패턴 인식 수용체(PRR) 작용제, 면역 자극성 시토카인 및 암 백신을 포함한다.
패턴 인식 수용체(PRR)는 면역계의 세포에 의해 발현되고 병원체 및/또는 세포 손상 또는 사멸과 관련된 다양한 분자를 인식하는 수용체이다. PRR은 선천적 면역 반응 및 후천적 면역 반응 둘 모두에 수반된다. PRR 작용제는 개체에서 면역 반응을 자극하는 데 사용될 수 있다. Toll-유사 수용체(TLR), RIG-I-유사 수용체(RLR), 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인(NOD)-유사 수용체(NLR), C-형 렉틴 수용체(CLR), 및 인터페론 유전자(STING) 단백질의 자극 물질을 포함하는 PRR 분자의 다수의 클래스가 존재한다.
용어 "TLR" 및 "Toll-유사 수용체"는 임의의 Toll-유사 수용체를 지칭한다. Toll-유사 수용체는 면역 반응을 활성화시키는 데 관여하는 수용체이다. TLR은 예를 들어 미생물에서 발현되는 병원체 연관된 분자 패턴(PAMP), 뿐만 아니라 죽은 세포 또는 죽어가는 세포로부터 방출되는 내인성 손상 연관된 분자 패턴(DAMP)를 인식한다.
TLR을 활성화시키는(이로써 면역 반응을 활성화시키는) 분자는 본원에서 "TLR 작용제"로 지칭된다. TLR 작용제는 예를 들어 소분자(예를 들어, 약 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 분자), 및 대분자(예를 들어 올리고뉴클레오티드 및 단백질)를 포함할 수 있다. 일부 TLR 작용제는 단일 유형의 TLR(예를 들어 TLR3 또는 TLR9)에 대해 특이적인 반면에, 일부 TLR 작용제는 2개 이상의 유형의 TLR(예를 들어 TLR7 및 TLR8 둘 모두)을 활성화시킨다.
본원에 제공된 예시적 TLR 작용제는 TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 및 TLR9의 작용제를 포함한다.
예시적 소분자 TLR 작용제는 예를 들어 US 4,689,338; 4,929,624; 5,266,575; 5,268,376; 5,346,905; 5,352,784; 5,389,640; 5,446,153; 5,482,936; 5,756,747; 6,110,929; 6,194,425; 6,331,539; 6,376,669; 6,451,810; 6,525,064; 6,541,485; 6,545,016; 6,545,017; 6,573,273; 6,656,938; 6,660,735; 6,660,747; 6,664,260; 6,664,264; 6,664,265; 6,667,312; 6,670,372; 6,677,347; 6,677,348; 6,677,349; 6,683,088; 6,756,382; 6,797,718; 6,818,650; 및 7,7091,214; US 2004/0091491, 2004/0176367 및 2006/0100229; 및 WO 2005/18551, WO 2005/18556, WO 2005/20999, WO 2005/032484, WO 2005/048933, WO 2005/048945, WO 2005/051317, WO 2005/051324, WO 2005/066169, WO 2005/066170, WO 2005/066172, WO 2005/076783, WO 2005/079195, WO 2005/094531, WO 2005/123079, WO 2005/123080, WO 2006/009826, WO 2006/009832, WO 2006/026760, WO 2006/028451, WO 2006/028545, WO 2006/028962, WO 2006/029115, WO 2006/038923, WO 2006/065280, WO 2006/074003, WO 2006/083440, WO 2006/086449, WO 2006/091394, WO 2006/086633, WO 2006/086634, WO 2006/091567, WO 2006/091568, WO 2006/091647, WO 2006/093514 및 WO 2006/098852에 개시된 것을 포함한다.
소분자 TLR 작용제의 추가적 예는 특정 푸린 유도체(예컨대 US 6,376,501 및 6,028,076에 기재된 것), 특정 이미다조퀴놀린 아미드 유도체(예컨대 US 6,069,149에 기재된 것), 특정 이미다조피리딘 유도체(예컨대 US 6,518,265에 기재된 것), 특정 벤즈이미다졸 유도체(예컨대 US 6,387,938에 기재된 것), 5원 질소-함유 헤테로환형 고리에 융합된 4-아미노피리미딘의 특정 유도체(예컨대 US 6,376,501; 6,028,076 및 6,329,381; 및 WO 02/08905에 기재된 아데닌 유도체), 특정 3-베타-D-리보퓨라노실티아졸로 [4,5-d]피리미딘 유도체(예컨대 US 2003/0199461에 기재된 것), 및 특정 소분자 면역 강화제 화합물(예컨대 US 2005/0136065에 기재된 것)을 포함한다.
예시적 대분자 TLR 작용제는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 TLR 작용제 올리고뉴클레오티드 서열은 시토신-구아닌 다이뉴클레오티드(CpG)를 함유하고 예를 들어, US 6,194,388; 6,207,646; 6,239,116; 6,339,068; 및 6,406,705에 기재되어 있다. 일부 CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 합성 면역 조절 구조적 모티프(예컨대 US 6,426,334 및 6,476,000에 기재된 것)를 포함할 수 있다. 다른 TLR 작용제 뉴클레오티드 서열은 CpG 서열이 결핍되어 있고 예를 들어 WO 00/75304에 기재되어 있다. 또 다른 TLR 작용제 뉴클레오티드 서열은 구아노신- 및 우리딘-풍부 단일 가닥 RNA(ssRNA)(예컨대 문헌[Heil et ah, Science, vol. 303, pp. 1526-1529, Mar. 5, 2004]에 기재된 것)을 포함한다.
다른 TLR 작용제는 생물학적 분자, 예컨대 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP)를 포함하고 예를 들어 US 6,113,918; 6,303,347; 6,525,028; 및 6,649,172에 기재되어 있다.
또한, TLR 작용제는 불활성화된 병원체 또는 이의 단편을 포함하며, 이는 다수의 상이한 유형의 TLR 수용체를 활성화시킬 수 있다. 예시적 병원체 유래된 TLR 작용제는 BCG, 미코박테리움 오부엔스(mycobacterium obuense) 추출물, Talimogene laherparepvec(T-Vec)(HSV-1로부터 유래됨) 및 Pexa-Vec(백신 바이러스로부터 유래됨)를 포함한다.
일부 실시양태에서, TLR 작용제는 TLR에 특이적으로 결합하는 작용제 항체일 수 있다.
다양한 TLR 및 TLR 작용제의 간단한 설명이 하기에 제공된다. 특정 TLR에 대한 하기 TLR 작용제의 목록은 제시된 TLR 작용제가 반드시 해당 TLR만을 활성화시키는 것을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다(예를 들어 특정 분자는 다수의 유형의 TLR 또는 심지어 다수의 클래스의 PRR을 활성화시킬 수 있다). 예를 들어, 예시적 TLR4 작용제로서 하기에 제공된 일부 분자는 또한 TLR5 작용제일 수 있다.
용어 "TLR1" 및 "toll-유사 수용체 1"은 임의의 형태 TLR1 수용체, 및 TLR1의 활성의 적어도 부분을 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR1과 관련하여, TLR1은 천연 서열 TLR1, 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR1을 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR1은 유니프롯(UniProt) 엔트리번호 Q15399 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR1 작용제"는 TLR1에 결합시, (1) TLR1을 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR1의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유발하거나 연장시키거나, (3) TLR1의 발현을 증진하고 증가시키고 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR1 작용제는 예를 들어 TLR1에 결합하는 박테리아 리포단백질 및 이의 유도체를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR1 작용제의 예는 예를 들어 박테리아 리포단백질 및 이의 유도체, 예컨대 SPM-105(오토클레이브 처리된 마이코박테리아로부터 유래됨), OM-174(지질 A 유도체), OmpS1(살모넬라 타이피(Salmonella typhi)로부터의 포린), OspA(보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi)로부터 유래), MALP-2(마이코플라즈마 대식 세포-활성화 리포펩티드-2kD), STF(가용성 결핵 인자), CU-T12-9, 디프로보심(Diprovocim) 및 세포벽 성분으로부터 유래된 리포펩티드, 예컨대 PAM2CSK4, PAM3CSK4 및 PAM3Cys이다.
TLR1은 TLR2와 이종이량체를 형성할 수 있고, 따라서 많은 TLR1 작용제는 또한 TLR2 작용제이다.
용어 "TLR2" 및 "toll-유사 수용체 2"는 임의의 형태의 TLR2 수용체, 및 TLR2의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR2와 관련하여, TLR2는 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR2를 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR2는 유니프롯 엔트리번호 O60603 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR2 작용제"는, TLR2에 결합시, (1) TLR2를 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR2의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR2의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR2 작용제는 예를 들어 TLR2에 결합하는 박테리아 리포단백질 및 이의 유도체를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR2 작용제의 예는 예를 들어박테리아 리포단백질(예를 들어 다이아실화된 리포단백질) 및 이의 유도체, 예컨대 SPM-105(오토클레이브 처리된 마이코박테리아로부터 유래됨), OM-174(지질 A 유도체), OmpS1(살모넬라 타이피로부터의 포린), OspA(보렐리아 버그도르페리로부터 유래됨), MALP-2(마이코플라즈마 대식 세포-활성화 리포펩티드-2kD), STF(가용성 결핵 인자), CU-T12-9, 디프로보심, 암플리반트(Amplivant), 및 세포벽 성분으로부터 유래된 리포펩티드, 예컨대 PAM2CSK4, PAM3CSK4 및 PAM3Cys이다.
TLR2는 TLR1 또는 TLR6과 이종이량체를 형성할 수 있고, 따라서 많은 TLR2 작용제가 또한 TLR1 또는 TLR6 작용제이다.
용어 "TLR3" 및 "toll-유사 수용체 3"은 임의의 형태의 TLR3 수용체, 및 TLR3의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR3과 관련하여, TLR3은 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR3을 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR3은 유니프롯 엔트리번호 O15455 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR3 작용제"는, TLR3에 결합시, (1) TLR3을 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR3의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR3의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR3 작용제는 예를 들어 TLR3에 결합하는 핵산 리간드를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR3 작용제의 예는 TLR3 리간드, 예컨대 합성 dsRNA, 폴리이노신산-폴리시티딜산["폴리(I:C)"](예를 들어 인보젠(InvivoGen)으로부터 고분자량(HMW) 및 저분자량(LMW) 제제로 입수가능), 폴리아데닐산-폴리우리딜산["폴리(A:U)"](예를 들어 인보젠으로부터 입수가능), 폴리CLC(문헌[Levy et al., Journal of Infectious Diseases, vol. 132, no. 4, pp. 434-439, 1975] 참조), 암플리젠(Ampligen)(문헌[Jasani et al., Vaccine, vol. 27, no. 25-26, pp. 3401-3404, 2009] 참조), 힐토놀(Hiltonol), 린타톨리모드(Rintatolimod) 및 RGC100(문헌[Naumann et al., Clinical and Developmental Immunology, vol. 2013, article ID 283649] 참조)이다.
용어 "TLR4" 및 "toll-유사 수용체 4"는 임의의 형태의 TLR4 수용체, 및 TLR4의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR4와 관련하여, TLR4는 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR4를 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR4는 유니프롯 엔트리번호 O00206 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR4 작용제"는, TLR4에 결합시, (1) TLR4를 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR4의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR4의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR4 작용제는 예를 들어 TLR4에 결합하는 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS) 및 이의 유도체를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR4 작용제의 예는 예를 들어 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS) 및 이의 유도체, 예컨대 B:0111(시그마(Sigma)), 모노포스포릴 지질 A(MPLA), 3DMPL(3-O-탈아실화된 MPL), GLA-AQ, G100, AS15, ASO2, GSK1572932A(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline, UK, 영국 소재))이다.
용어 "TLR5" 및 "toll-유사 수용체 5"는 임의의 형태의 TLR5 수용체, 및 TLR5의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR5와 관련하여, TLR5는 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR5를 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR5는 유니프롯 엔트리번호 O60602 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR5 작용제"는 TLR5에 결합시, (1) TLR5를 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR5의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR5의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR5 작용제는 예를 들어 TLR5에 결합하는 박테리아 플라젤린 및 이의 유도체를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR5 작용제의 예는 예를 들어 바실러스 서브틸리스로부터 정제된 박테리아 플라젤린, 슈도도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 정제된 플라젤린, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터 정제된 플라젤린, 및 재조합 플라젤린(모두 인보젠으로부터 입수가능), 엔톨리모드(CBLB502; 약리학적으로 최적화된 플라젤린 유도체)이다.
용어 "TLR6" 및 "toll-유사 수용체 6"은 임의의 형태의 TLR6 수용체, 및 TLR6의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR6과 관련하여, TLR6은 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR6을 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR6은 유니프롯 엔트리번호 Q9Y2C9 하에 제공된다.
본원에 제공된 "TLR6 작용제"는, TLR6에 결합시, (1) TLR6을 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR6의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR6의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR6 작용제는 예를 들어 TLR6에 결합하는 박테리아 리포펩티드 및 이의 유도체를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR6 작용제의 예는 예를 들어 TLR2 및 TLR6이 이종이량체를 형성할 수 있기 때문에, 상기에 제공된 많은 TLR2 작용제를 포함한다. TLR6은 또한 TLR4와 이종이량체를 형성할 수 있고, TLR6 작용제는 상기에 제공된 다양한 TLR4 작용제를 포함한다.
용어 "TLR7" 및 "toll-유사 수용체 7"은 임의의 형태의 TLR7 수용체, 및 TLR7의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR7과 관련하여, TLR7은 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR7을 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR7은 유니프롯 엔트리번호 Q9NYK1 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR7 작용제"는, TLR7에 결합시, (1) TLR7을 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR7의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR7의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR7 작용제는 예를 들어 TLR7에 결합하는 핵산 리간드를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR7 작용제의 예는 재조합 단일 가닥("ss")RNA, 이미다조퀴놀린 화합물, 예컨대 이미퀴모드(imiquimod)(R837), 가르디퀴모드(gardiquimod) 및 레지퀴모드(resiquimod)(R848); 록소리빈(Loxoribine)(7-알릴-7,8-다이하이드로-8-옥소-구아노신) 및 관련된 화합물; 7-티아-8-옥소구아노신, 7-데아자구아노신 및 관련된 구아노신 유사체; ANA975(아나다이즈 파마슈티컬즈(Anadys Pharmaceuticals)) 및 관련된 화합물; SM-360320(수미모토(Sumimoto)); 3M-01, 3M-03, 3M-852 및 3M-S-34240(쓰리엠 파마슈티컬즈(3M Pharmaceuticals)); GSK2245035(글락소스미스클라인; 8-옥소아데닌 분자), AZD8848(아스트라제네카(AstraZeneca); 8-옥소아데닌 분자), MEDI9197(메디뮨(Medimmune); 과거에 3M-052), ssRNA40 및 아데노신 유사체, 예컨대 UC-1V150(문헌[Jin et al., Bioorganic Medicinal Chem Lett (2006) 16:4559-4563], 화합물 4)이다. 많은 TLR7 작용제는 또한 TLR8 작용제이다.
용어 "TLR8" 및 "toll-유사 수용체 8"은 임의의 형태의 TLR8 수용체, 및 TLR8의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR8과 관련하여, TLR8은 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR8을 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR8은 유니프롯 엔트리번호 Q9NR97 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR8 작용제"는 TLR8에 결합시, (1) TLR8을 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR8의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR8의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR8 작용제는 예를 들어 TLR8에 결합하는 핵산 리간드를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR8 작용제의 예는 재조합 단일 가닥 ssRNA, 이미퀴모드(R837), 가르디퀴모드, 레지퀴모드(R848), 3M-01, 3M-03, 3M-852 및 3M-S-34240(쓰리엠 파마슈티컬즈); GSK2245035(글락소스미스클라인; 8-옥소아데닌 분자), AZD8848(아스트라제네카; 8- 옥소아데닌 분자), MEDI9197(메디뮨; 과거에 3M-052), 폴리-G10, 모톨리모드 및 상기에 제공된 다양한 TLR7 작용제이다(전술된 바와 같이, 많은 TLR7 작용제가 또한 TLR8 작용제이다).
용어 "TLR9" 및 "toll-유사 수용체 9"는 임의의 형태의 TLR9 수용체, 및 TLR9의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 TLR9와 관련하여, TLR9는 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 TLR9를 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR9는 유니프롯 엔트리번호 Q9NR96 하에 제공된다.
본원에 사용된 "TLR9 작용제"는, TLR9에 결합시, (1) TLR9를 자극하거나 활성화시키거나, (2) TLR9의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) TLR9의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR9 작용제는 예를 들어 TLR9에 결합하는 핵산 리간드를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 TLR9 작용제의 예는 메틸화되지 않은 CpG-함유 DNA, 면역 자극성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 예컨대 CpG-함유 ODN, 예컨대 CpG24555, CpG10103, CpG7909(PF-3512676/아가톨리모드(agatolimod)), CpG1018, AZD1419, ODN2216, MGN1703, SD-101, 1018ISS 및 CMP-001이다. TLR9 작용제는 또한 뉴클레오티드 서열 함유 합성 시토신-포스페이트-2'-데옥시-7-데아자구아노신 다이뉴클레오티드(CpR)(하이브리돈 인코포레이티드(Hybridon, Inc.)), dSLIM-30L1 및 면역 글로불린-DNA 복합체를 포함한다. 예시적 TLR9 작용제는 WO 2003/015711, WO 2004/016805, WO 2009/022215, PCT/US95/01570, PCT/US97/19791, 및 US 8,552,165, 6,194,388 및 6,239,116(이들 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
RLR은 예를 들어 dsRNA를 검출하는 다양한 세포액 PRR을 포함한다. RLR의 예는 예를 들어 레티노산-유도 유전자 I(RIG-I), 흑색종 분화 연관된 유전자 5(MDA-5), 및 LGP2(Laboratory of Genetics and Physiology 2)를 포함한다.
본원에 사용된 "RLR 작용제"는, RLR에 결합시, (1) RLR을 자극하거나 활성화시키거나, (2) RLR의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) RLR의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 RLR 작용제는 예를 들어 RLR에 결합하는 핵산 및 이의 유도체, 및 RLR에 특이적으로 결합하는 작용성 단클론 항체(mAb)를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 RLR 작용제의 예는 예를 들어 캡핑되지 않은 5' 트라이포스페이트를 갖는 짧은 이중 가닥 RNA(RIG-I 작용제); 폴리 I:C(MDA-5 작용제) 및 BO-112(MDA-A 작용제)이다.
NLR은 예를 들어 손상 연관된 분자 패턴(DAMP) 분자를 검출하는 다양한 PRR을 포함한다. NLR은 서브패밀리 NLRA-A, NLRB-B, NLRC-C 및 NLRP-P를 포함한다. NLR의 예는 예를 들어 NOD1, NOD2, NAIP, NLRC4 및 NLRP3을 포함한다.
본원에 사용된 "NLR 작용제"는, NLR에 결합시, (1) NLR을 자극하거나 활성화시키거나, (2) NLR의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) NLR의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 NLR 작용제는 예를 들어 NLR에 결합하는 DAMP 및 이의 유도체, 및 NLR에 특이적으로 결합하는 작용성 단클론 항체(mAb)를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 NLR 작용제의 예는 예를 들어 리포좀성 무라밀 트라이펩티드/미파무르티드(mifamurtide)(NOD2 작용제)이다.
CLR은 예를 들어 탄수화물 및 당단백질을 검출하는 다양한 PRR을 포함한다. CLR은 막경유 CLR 및 분비된 CLR 둘 모두를 포함한다. CLR의 예는 예를 들어 DEC-205/CD205, 대식 세포 만노스 수용체(MMR), 덱틴(Dectin)-1, 덱틴-2, 밍클(mincle), DC-SIGN, DNGR-1 및 만노스 결합 렉틴(MBL)을 포함한다.
본원에 사용된 "CLR 작용제"는, CLR에 결합시, (1) CLR을 자극하거나 활성화시키거나, (2) CLR의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) CLR의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 CLR 작용제는 예를 들어 CLR에 결합하는 탄수화물 및 이의 유도체, 및 CLR에 특이적으로 결합하는 작용상 단클론 항체(mAb)를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 CLR 작용제의 예는 예를 들어 MD-분획(그릴폴라 프론도자(Grifola frondosa)로부터의 정제된 가용성 베타-글리칸 추출물) 및 임프라임(imprime) PGG(효모로부터 유래된 베타 1,3/1,6-글루칸 PAMP)이다.
STING 단백질은 유형 1 인터페론 신호 전달에서 세포액 DNA 센서 및 어댑터 단백질 모두로서 작용한다. 용어 "STING" 및 "인터페론 유전자의 자극제"는 임의의 형태의 STING 단백질, 및 STING 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 동형 및 종 동족체를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예컨대 구체적으로 인간 STING와 관련하여, STING는 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 원숭이 및 마우스의 천연 서열 STING를 포함한다. 하나의 예시적 인간 TLR9는 유니프롯 엔트리번호 Q86WV6 하에 제공된다. 또한, STING는 TMEM173으로 공지되어 있다.
본원에 사용된 "STING 작용제"는, TLR9에 결합시, (1) STING를 자극하거나 활성화시키거나, (2) STING의 활성, 기능 또는 존재를 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하거나 연장시키거나, (3) STING의 발현을 증진시키거나 증가시키거나 촉진하거나 유도하는 임의의 분자를 의미한다. 임의의 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 STING 작용제는 예를 들어 STING에 결합하는 핵산 리간드를 포함한다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 STING 작용제의 예는 다양한 면역 자극성 핵산, 예컨대 합성 이중 가닥 DNA, 사이클릭 다이-GMP, 사이클릭-GMP-AMP(cGAMP), 합성 사이클릭 다이뉴클레오티드(CDN), 예컨대 MK-1454 및 ADU-S100(MIW815), 및 소분자, 예컨대 P0-424이다.
다른 PRR은 예를 들어 IFN-조절 인자의 DNA 의존적 활성제(DAI) 및 AIM2(Absent in Melanoma 2)를 포함한다.
면역 자극성 시토카인은 면역 반응을 자극하는 다양한 신호 전달 단백질, 예컨대 인터페론, 인터류킨 및 조혈 성장 인자를 포함한다.
예시적 면역 자극성 시토카인은 GM-CSF, G-CSF, IFN-알파, IFN-감마; IL-2(예를 들어 데닐류킨 디피톡스(denileukin difitox)), IL-6, IL-7, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 TNF-알파를 포함한다.
면역 자극성 시토카인은 임의의 적합한 포맷을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 자극성 시토카인은 야생형 시토카인의 재조합 버전일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 자극성 시토카인은 상응하는 야생형 시토카인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 뮤테인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 자극성 시토카인은 시토카인 및 하나 이상의 다른 기능성 단백질을 함유하는 키메라 단백질(예를 들어 항체) 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 자극성 시토카인은 약물/제제(예를 들어 가능한 ADC 성분으로서 본원에 기재된 임의의 약물/제제)에 공유 결합될 수 있다.
암 백신은 종양 연관된 항원을 함유하는(또는 개체에서 종양 연관된 항원을 생산하는 데 사용될 수 있는) 다양한 조성물을 포함하고, 따라서 개체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있고, 이는 종양 연관된 항원을 함유하는 종양 세포에 지향된다.
암 백신에 포함될 수 있는 예시적 물질은 약화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포, 예컨대 종양 유래된 항원 또는 종양 연관된 항원을 암호화하는 핵산에 의해 펄스화된 수지상 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 환자 자신의 암 세포에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 환자 자신의 암 세포로부터 유래되지 않은 생물학적 물질에 의해 생산될 수 있다.
암 백신은 예를 들어 시풀류셀(sipuleucel)-T 및 탈리모겐 라헤르파렙벡(talimogene laherparepvec)(T-VEC)을 포함한다.
면역 세포 요법은 환자를 암 세포를 표적화할 수 있는 면역 세포에 의해 치료하는 것을 수반한다. 면역 세포 요법은 예를 들어 종양-침윤성 림프구(TIL) 및 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)를 포함한다.
화학 치료제의 예는 하기를 포함한다: 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa) 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이미드 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포라미드, 트라이에틸렌티오포스포라미드 및 트라이메틸올로멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone)); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브라이오스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); CC-1065(이의 아조젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체를 포함함); 크립토피신(cryptophycin)(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴(dolastatin); 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI를 포함함); 엘류테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사르코딕타인(sarcodictyin); 스폰지스타틴(spongistatin); 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 콜로소프파미드(cholophosphamide), 에스트라무틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프리드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드; 니트로수레아(nitrosurea), 예컨대 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine); 항생제, 예컨대 엔다이인 항생제(예를 들어 칼리케아미신(calicheamicin), 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 phiI1(예를 들어 문헌[Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네미신(dynemicin)(다이네미신 A를 포함함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트(clodronate); 에스페라미신(esperamicin); 및 네오카르지노스타닌(neocarzinostatin) 발색단 및 관련된 색소 단백질 엔다이인 항생제 크로모모포어(chromomophore)), 아클라시노마이신(aclacinomysin), 액티노마이신(actinomycin), 아우트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카미노마이신(caminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(doxorubicin)(모폴리노-독소루비신, 시나노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 페길화된 리포좀성 독소루비신, 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 푸로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트(methotrexate) 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 푸린 유사체, 예컨대 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토푸린, 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈(ancitabine), 아자시타빈(azacytidine), 6-아자우리딘, 카르모푸르(carmofur), 사이타라빈(cytarabine), 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘(doxifluridine), 엔코시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine); 안드로겐, 예컨대 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론(dromostanolone) 프로피오네이트, 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스톨락톤(testolactone); 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane); 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글락톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐루라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트렉세이트(edatrexate); 데포파민(defofamine); 데모콜신(demecolcine); 다이아지쿠온(diaziquone); 엘포르미틴(elformithine); 엘리프티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에포틸론(epothilone); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 메이탄시노이드(maytansinoid), 예컨대 메이탄신(maytansine) 및 안사미토신(ansamitocin); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 로족산트론(losoxantrone); 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진(procarbazine); 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조푸란(sizofuran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트라이아지쿠온(triaziquone); 2, 2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(trichothecene)(특히 T-2 톡신, 베라쿠린(verracurin) A, 로리딘(roridin) A 및 안귀딘(anguidine)); 우레탄; 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미톨락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside)("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드(taxoid), 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀; 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴(carboplatin); 빈블라스틴(vinblastine); 백금; 에토포시드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 노반트론; 테니포시드(teniposide); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린; 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 임의의 전술된 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체. 또한 하기가 포함된다: 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), 예를 들어 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 및 토레미펜(toremifene)(파레스톤(Fareston)); 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤(megestrol) 아세테이트, 엑세메스탄(exemestane), 포르메스탄(formestane), 파드로졸(fadrozole), 보로졸(vorozole), 레트로졸(letrozole) 및 아나스토로졸(anastrozole); 및 항안드로겐제, 예컨대 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 류프롤리드(leuprolide) 및 고세렐린(goserelin); KRAS 억제제; MCT4 억제제; MAT2a 억제제; 티로신 키나제 억제제, 예컨대 수니티닙, 악시티닙; alk/c-Met/ROS 억제제, 예컨대 크리조티닙(crizotinib), 로를라티닙(lorlatinib); mTOR 억제제, 예컨대 템시롤리무스, 게다톨리십(gedatolisib); src/abl 억제제, 예컨대 보수티닙(bosutinib); 사이클린 의존적 키나제(CDK) 억제제, 예컨대 팔보시클립(palbociclib), PF-06873600; erb 억제제, 예컨대 다코미티닙(dacomitinib); PARP 억제제, 예컨대 탈라조파립(talazoparib); SMO 억제제, 예컨대 글라스데깁(glasdegib), PF-5274857; EGFR T790M 억제제, 예컨대 PF-06747775; EZH2 억제제, 예컨대 PF-06821497; PRMT5 억제제, 예컨대 PF-06939999; TGFRβr1 억제제, 예컨대 PF-06952229; 전술된 것 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체. 구체적 실시양태에서, 이러한 추가적 치료제는 베바시주맙, 세툭시맙, 시롤리무스, 파니투무맙, 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈, 티보자닙, 이리노테칸, 옥사플라틴, 시스플라틴, 트라이플루리딘, 티피라실, 류코보린(leucovorin), 젬시타빈, 레고라피닙(regorafinib) 또는 에를로티닙 하이드로클로라이드이다.
일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는, 면역 체크포인트 조절제 또는 공자극제를 표적화하는 하나 이상의 다른 치료제, 예컨대 비제한적으로 CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC(PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA(PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM(SLAMF1, CD150), SLAMF2(CD48), SLAMF3(CD229), SLAMF4(2B4, CD244), SLAMF5(CD84), SLAMF6(NTB-A), SLAMCF7(CS1), SLAMF8(BLAME), SLAMF9(CD2F), CD28, CEACAM1(CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, CD39-CD73-아데노신 경로(A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CXCR4, CCR4, CCR8, CCR5, CSF-1을 표적화하는 제제, 또는 선천적 면역 반응 조절제와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 예를 들어 항-CTLA-4 길항제 항체, 예컨대 이필리무맙; 항-LAG-3 길항제 항체, 예컨대 BMS-986016 및 IMP701; 항-TIM-3 길항제 항체; 항-B7-H3 길항제 항체, 예컨대 MGA271; 항-VISTA 길항제 항체; 항-TIGIT 길항제 항체; 항체; 항-CD80 항체; 항-CD86 항체; 항-B7-H4 길항제 항체; 항-ICOS 작용제 항체; 항-CD28 작용제 항체; 선천적 면역 반응 조절제(예를 들어 TLRs, KIR, NKG2A) 및 IDO 억제제와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 OX40 작용제, 예컨대 항-OX-40 작용제 항체와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 GITR 작용제, 예컨대 항-GITR 작용제 항체, 예컨대 비제한적으로 TRX518과 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 IDO 억제제와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 시토카인 치료제, 예컨대 비제한적으로 IL-15, CSF-1, MCSF-1 등과 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 하나 이상의 다른 치료 항체, 예컨대 비제한적으로 CD19, CD22, CD40, CD52 또는 CCR4를 표적화하는 항체와 함께 사용된다.
특정 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체 조성물은 하나 이상의 추가적 제제 예컨대 베바시주맙, 세툭시맙, 시롤리무스, 파니투무맙, 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈, 티보자닙, 이리노테칸, 옥사플라틴, 시스플라틴, 트라이플루리딘, 티피라실, 류코보리, 젬시타빈 및 에를로티닙 하이드로클로라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체 요법은 다른 제제 치료와 공동-투여될 수 있거나, 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 제제 치료에 선행하거나 후행할 수 있다. 다른 제제 및/또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 개별적으로 투여되는 실시양태에서, 일반적으로 각각의 전달 사이에 상당한 기간이 만료되지 않았음을 보장하여 상기 제제 및 본 발명의 조성물이 여전히 개체에 유리하게 조합된 효과를 행사할 수 있다. 이러한 경우에, 서로에 대해 약 12 내지 24시간 이내에, 보다 바람직하게는, 서로에 대해 약 6 내지 12시간 이내에 두 양식을 투여할 수 있는 것이 고려된다. 일부 경우에, 투여 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직 할 수 있지만, 각각 투여 사이에 며칠(2, 3, 4, 5, 6 또는 7)내지 몇 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과한다.
일부 실시양태에서, GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체 조성물은 수술, 방사선 요법, 화학 요법, 표적화된 요법, 면역 요법, 호르몬 요법, 혈관신생 억제 및 완화 치료로 이루어진 군으로부터 선택된 종래의 요법을 추가로 포함하는 치료 섭생법과 병용된다.
본 발명에 사용된 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover])를 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 해당 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 산화 방지제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 상대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN(상표), PLURONICS(상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 추가로 본원에 기재된다.
한 양상에서, 본 발명 본원에 개시된 항-GUCY2c 항체 또는 이중특이적 항체의 생산 방법을 제공하되, 이는 본원에 개시된 항-GUCY2c 항체 또는 이중특이적 항체의 생산을 야기하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 항체 또는 이중특이적 항체를 정제하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 GUCY2c 관련된 장애의 검출용, 진단용 및/또는 치료용 약제의 제조에서, 본원에 개시된 항-GUCY2c 항체, 이중특이적 항체, 약학 조성물, 폴리뉴클레오티드, 상청액, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 추가적 양상은 본원 상기에 개시된 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체, 및 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 지시서를 포함하는 키트이다. 일반적으로, 이들 지시서는 상기에 기재된 치료적 치료를 위한 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 투여의 설명을 포함한다. 이들 키트는 본원에 개시된 임의의 약학 조성물을 포함한다. 약학 조성물 및 기타 시약은 임의의 통상적인 형태, 예컨대 용액 또는 분말 형태로 키트에 존재할 수 있다.
또 다른 양상에서, 키트는 하나 이상의 용기에 암의 치료에서 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 다른 예방제 또는 치료제는 화학 치료제이다. 다른 양상에서, 예방제 또는 치료제는 생물 치료제 또는 호르몬 치료제이다.
본 발명의 약학 조성물, 예방제 또는 치료제의 여러 양상은 바람직하게는 시험관내 세포 배양 시스템에서, 및 동물 모델 유기체, 예컨대 설치류 동물 모델 시스템에서 인간에서 사용하기 전에 목적하는 치료적 활성에 대해 시험된다.
본 발명의 예방적 및/또는 치료적 프로토콜의 독성 및 효력은 예를 들어 LD50(집단의 50%에 대해 치명적인 투여량) 및 ED50(집단의 50%에 대해 치료적으로 효과적인 투여량)을 결정하기 표준 약학 절차에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 투여량 비가 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 예방제 및/또는 치료제가 바람직하다.
또한, 당업자에게 공지된 임의의 분석이 사용되어 암의 치료 또는 예방에 대해 본원에 개시된 요법 또는 병용 요법의 예방적 및/또는 치료적 유용성을 평가할 수 있다.
본원에 기재된 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 사용에 관한 지시서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 투여량, 벌크 패키지(예를 들어 다회-투여량 패키지) 또는 소단위 투여량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 지시서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지시서이지만, 기계-판독가능한 지시서(예를 들어 자성 또는 광학 저장 디스크 상에 존재하는 지시서)가 또한 허용가능하다.
본 발명의 키트는 적합한 포장재 내에 존재한다. 약학 학조성물을 개체에게 투여하기 위해 각각의 약학 조성물 및 기타 포함된 시약, 예를 들어 완충제, 평형된 염 용액 등에 대해 적합한 포장재는 비제한적으로 바이알, 앰프, 튜브, 병, 자르(jar), 가요성 포장재(예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 포장재가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 GUCY2c 항체 또는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체이다. 용기는 추가로 제2 약학 활성제를 포함할 수 있다.
일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 이와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다.
생물 기탁
본 발명의 대표적인 물질은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209 머내서스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2018년 2월 13일자로 기탁되었다. ATCC 기탁번호 PTA-124943을 갖는 벡터 GUCY2C-1608 쇄 A(VH-홀 서열번호 220)는 이중특이적 항체 GUCY2C-1608의 VH-홀 쇄를 암호화하는 DNA 삽입물(서열번호 247)을 포함하고, ATCC 기탁번호 PTA-124944를 갖는 벡터 GUCY2C-1608 쇄 B(VL-놉 서열번호 216)는 이중특이적 항체 GUCY2C-1608의 VL-놉 쇄를 암호화하는 DNA 삽입물(서열번호 246)을 포함한다.
기탁은 특허 절차의 목적에 대한 미생물 기탁의 국제 승인 및 이러한 조약(부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존가능한 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 이는 화이자 인코포레이티드(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 이것은 관련 미국 특허의 등록시에 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시에(어느 것이든 더 빠른 시기), 공공에 대한 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 이에 따른 미국 특허청장의 규칙(886 OG 638에 대한 특정한 언급이 있는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라서 미국 특허청장에 의해서 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용가능성을 보장한다.
본원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에서 배양되는 경우 사멸하거나 손실 또는 파괴되는 경우에, 그 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 이용가능성은 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로 해석되지 않아야 한다.
본 발명을 수행하기 위한 구체적 양상의 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되고, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
실시예 1: 마우스 GUCY2c 항체의 면역화 및 하이브리도마 생산
재조합 인간 GUCY2c 단백질 면역원 또는 표면 상에 인간 GUCY2c(서열번호 224)를 과발현하는 세포를 하이브리도마의 생산을 위해 Balb/c 마우스 내로 주사하였다. 8주령 암컷 Balb/c 마우스를, 가용성 huGUCY2c-mIgG2a 단백질 또는 인간 GUCY2c(서열번호 224/225)를 발현하는 300.19 세포주에 의해 면역화시켰다. huGUCY2c 재조합 단백질에 의해 면역화된 마우스의 경우, 동물에게 RIMMS 프로토콜에 따라 투여하였다(문헌[Kilpatrick, et al. Hybridoma. 1997. 16:381-389]). 간략히, 마우스를 6회 재조합 인간 GUCY2c-마우스 IgG2a Fc-융합 단백질(서열번호 230)에 의해 2주 동안 피하 주사를 통해 면역화시켰다. 사용된 보조제는 완전 및 불완전 프로이드 보조제였다. 세포-기반 면역화의 경우, Balb/c 마우스를 인간 GUCY2c를 과발현하는 5x106개의 300.19 세포로 1개월 동안 1주일에 2회 보조제 없이 i.p. 주사를 통해 면역화시켰다. 마우스 GUCY2c 항체 역가를 결정하기 위해, 시험 혈액을 면역화된 동물로부터 수집하고, GUCY2c 특이적 역가를 재조합 인간 GUCY2c mIgG2a-Fc(서열번호 230) 및 시노몰구스 GUCY2c-mIgG2a-Fc(서열번호 234)에 대해 효소 결합된 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 시험하였다. 최고 GUCY2c 역가를 갖는 동물을 하이브리도마 생산을 위해 선택하였다. 가용성 재조합 단백질 면역화된 마우스의 경우 LN 림프구 및 비장 세포를 융합에 사용한 반면에, 300.19/hGUCY2c에 의해 면역화된 마우스의 경우 단지 비장 세포만 융합을 위해 사용하였다. 하이브리도마 생산을 위해, 비장 세포 및/또는 림프절 림프구를 PEG를 사용하여 P3X 골수종에 의해 1:1 비로 융합하였다. 융합된 세포를 HAT의 존재 하에 7일 동안 선택하였고, 이후 하이브리도마를 스크리닝 전에 HT-함유 배지에서 보관하였다. 항-huGUCY2c 특이적 하이브리도마를 확인하기 위해, 하이브리도마 상청액을 IgG 항-huGUCY2c 반응성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 잠재적 항-GUCY2c 하이브리도마를 통합하고 GUCY2c를 발현하는 형질감염된 300.19 세포주 및 일차 종양 세포주 상의 세포 표면 인간 및 시노 GUCY2c에 대한 반응성에 대해 분석하였다. 간략히, 다양한 GUCY2c 단백질(서열번호 224, 226 및 228)을 발현하는 300.19 세포주를 제1일에 4 x 104 세포/웰로 멸균 96-웰 조직 배양 플레이트(벡튼 디킨슨(Becton Dickinson))에 시딩하고, 37℃/5% CO2에서 1 내지 2일 동안 컨플루언트 단층이 관찰될 때까지 배양하였다. 세포를 4회 PBS + Ca2+ 및 Mg2+로 세척하고 1시간 동안 실온에서 3% 밀크/1% BSA/PBS + Ca2+ 및 Mg2+에 의해 차단하였다. 연속 희석된(차단 완충제에 1:3) 샘플을 플레이트에 도포하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한 후에, PBS + Ca2+ 및 Mg2+로 세척하였다. 이어서, 차단 완충제에 희석된(1:4,000) HRP-접합된 이차 항체인 염소 항-마우스 IgG Fc(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 적용하고, 세포와 함께 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS + Ca2+ 및 Mg2+로 세척한 후에, TMB 기질 용액을 사용하여 10분 동안 성장시킨 후에, 0.18 M H2SO4에 의해 반응을 정지시켰다. O.D. 450 nM에서의 흡광도를 측정하고, 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 및 그래프패드-프리즘(Graphpad-Prism) 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하고 분석하였다. 인간 및 시노몰구스 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 하이브리도마를 확인하였다.
실시예 2: 유세포 분석 및 면역 조직화학 분석에서 항-GUCY2c 하이브리도마 항체의 결합
항-GUCY2c 하이브리도마 항체를, T84 및 HT55 종양 세포 상의 인간 GUCY2c에 대한 세포 표면 결합에 대해 유세포 분석에 의해 스크리닝하였다. HT29 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 세포 해리 완충제(시그마)에 의해 해리시키고 얼음 상에서 PBS+3% BSA에 의해 차단하였다. 세포를 얼음 상에서 일차 항체에 의해 1시간 동안 염색시킨 후에, 찬 PBS로 세척하였다. 10 μg/mL의 이차 항체(PE-접합된 항-마우스 이차 항체, 잭슨 이뮤노리서치)를 얼음 상에 1시간 동안 첨가하였다. 세포를 찬 PBS로 다시 세척하고 PBS에 재현탁하고 생사 판별을 위해 DAPI로 염색시키고 GUCY2c 결합에 대해 BD LSRII Fortessa 상에서 분석하였다. 여러 클론을 GUCY2c 발현 세포주(T84 및 HT55)에 대한 특이적 결합, 및 GUCY2c-음성 세포(HT29)에 대한 결합 없음을 나타내는 것으로 확인하였다.
GUCY2c에 대해 면역화된 BALB/c 마우스로부터의 하이브리도마를 포말린 고정된 파라핀 내장된 세포 펠릿에서 면역 반응성에 대해 시험하였다. 이러한 스크린을 위해 생산한 세포 펠릿은 300.19 모 세포, 마우스, 시노몰구스 마카크 또는 인간 GUCY2c를 과발현하는 300.19 세포, 고 내인성 수준의 GUCY2c를 발현하는 하나의 인간 대장암 세포주(T84) 및 GUCY2c 발현에 대해 음성인 하나의 인간 대장암 세포주(HT29)로 이루어졌다. 세포주를 24시간 동안 10% 중성의 완충된 포말린(써모 사이언티픽)에서 고정하고 300 x g에서 4분 동안 원심분리하여 펠릿화시켰다. 포말린을 제거하고, 세포 펠릿을 사전 가온된 50℃ 히스토겔(Histogel)(써모 사이언티픽)을 사용하여 부드럽게 재현탁하였다. 히스토겔에 내장된 세포 펠릿을 4℃에서 1 내지 2시간 동안 냉각한 후에, 밤새 VIP 자동화된 조직 처리기(티슈-텍(Tissue-Tek))에서 처리하였다. 처리된 세포 펠릿을 파라핀에 내장하였다. 세포 마이크로어레이의 5개의 마이크론 절편을 절단하고 수욕으로 옮기고 Superfrost Excell 현미경 슬라이드(피셔(Fisher)) 상에 두었다. 슬라이드를 밤새 건조하였다. 조직 절편의 탈파라핀화 및 재수화 후에, 열 유도된 에피토프 회수를 Borg Decloaker 완충제 pH 9.5(바이오 메디컬(Biocare Medical)) 또는 pH 6.0 시트레이트 완충제(써모 사이언티픽)에서 리트리버(Retriever) 2100 프레서 쿠커(pressure cooker)(일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈(Electron Microscopy Sciences))에서 수행한 후에, 실온(RT)으로 냉각하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 퍼옥시데이즈드(Peroxidazed) 1(바이오 메디컬)에 의해 10분 동안 불활성화시켰다. 비-특이적 단백질 상호작용을 10분 동안 백그라운드 퍼니셔(Background Punisher)(바이오 메디컬)에 의해 차단하였다. 각각의 하이브리도마를 희석 없이 1시간 동안 열 유도된 에피토프 회수 조건 하에 배양하였다. 절편을 TBS에서 헹구고, 하이브리도마 결합을 엔비전(Envision)+ 마우스 HRP(DAKO)를 사용하여 30분 동안 검출하였다. 슬라이드를 TBS에서 헹구고, 면역 반응성을 베타조이드(Betazoid) DAB 색원체 키트(바이오 메디컬)를 사용하여 5분 동안 발달시킨 후에, 증류수에서 헹궜다. 면역 염색된 절편을 간략히 CAT 헤마톡실린(바이오 메디컬)에 의해 대비염색시키고 수돗물에서 세척하고 분류된 알코올에서 탈수시키고 자일렌에서 세정하고 퍼마운트(Permount) 마운팅 배지(피셔케미컬즈(FisherChemicals))에 의해 커버슬립핑하였다. 수의학 병리학자가 슬라이드를 면역 반응성에 대해 평가하였다. 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 GUCY2c에 대한 면역 반응성을 갖는 클론을 본 스크린에서 확인하였다.
유세포 분석 및 면역 조직화학(IHC)에 의한항-GUCY2c 하이브리도마 항체의 결과가 표 11에 나타나 있다.
[표 11]
Figure 112020139468681-pct00035
실시예 3: 세포주 상의 GUCY2c 발현 수준의 정량화
세포주의 GUCY2c 수용체 밀도를 1:1 비로 피코에리트린(써모 사이언티픽)에 접합된 GUCY2C-9H3 클론을 사용하여 측정하였다. 1x105개의 세포를 10 μg/mL의 PE 표지된 항-GUCY2c mAb를 사용하여 포화 결합에 대해 염색시켰다. 세포를 FACS 완충제 및 DAPI에서 세척하고 재현탁히고 FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 획득하였다. QuantiBRITE PE 표지된 비드(BD)를 동일한 획득 PE 전압 세팅에서 사용하여 PE 기하 평균 형광 강도를 기반으로 세포 당 PE 표지된 항체의 수(ABC)를 계산하였다. 인간 종양 세포주의 GUCY2c 수용체 밀도를 표 12에 나타냈다. 세포주 및 GUCY2c에 대한 수용체 밀도를 본 분석에서 특성규명하였고, 이는 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 기능적 활성을 평가하기 위해 후속 분석(예를 들어 세포독성 분석) 사용되었다.
[표 12]
Figure 112020139468681-pct00036
실시예 4: 항-GUCY2c 하이브리도마 항체의 클로닝 및 서열 결정
확인된 세포 표면 결합 활성을 갖는 하이브리도마 상청액을 마우스 IgG1 포맷으로 서브클로닝하였다. RNA를 추출하고, 발현된 항체의 가변(V) 영역 DNA 서열을 하기에 기재된 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 클로닝을 통해 수득하였다.
1-5x106개의 서브클로닝된 하이브리도마 세포를 QIAGEN RNAeasy 미니 키트를 사용하여 전체 RNA 단리를 위해 균질화시켰다. 이어서, 제1 가닥 cDNA를 SuperScript III RT 키트(인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 생산하였다. 이어서, 항-GUCY2c IgG의 가변 영역에 대한 이중 가닥 cDNA를 생산하고 하기에 기재된 바와 같이 마우스 IgG 중쇄(IgG1, IgG2a, IgG2b) 및 경쇄(카파 또는 람다) 불변 영역으로부터의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 순환 조건은 하기와 같았다: 95℃에서 1분 동안 1회의 주기; 95℃에서 1분 동안, 63℃에서 1분 동안 및 72℃에서 1분 동안 25회의 주기. 생산된 RT-PCR 생성물을 TOPO-Blunt 클로닝 벡터(인비트로젠) 내로 클로닝하고 서열 결정하였다.
가변 도메인의 잔기를 항체의 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에서 사용되는 넘버링 체계인 카바트에 따라 넘버링하였다(문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]). 이러한 넘버링 체계를 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR 내로의 삽입 또는 이의 단축에 해당하는 부가적이거나 보다 적은 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물(카바트에 따라 잔기 52a) 및 중쇄 골격(FR) 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예를 들어 카바트에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 항체의 서열의 상동 관계의 영역에서의 정렬에 의해 제시된 항체에 대해 결정될 수 있다. 카바트 넘버링 배치에 대한 다양한 알고리즘이 이용가능하다. Abysis의 버전 2.3.3 발매물(www.abysis.org)에서 시행되는 알고리즘은 가변 영역 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR2 및 VH CDR3에 카바트 넘버링을 부과하기 위해 본원에서 사용되었다. AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용되었다. FR 잔기는 CDR 잔기 이외의 항체 가변 도메인 잔기이다. VH 또는 VL 도메인 골격은 하기 구조로 CDR 사이에 배치된 4개의 골격 하위영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다.
마우스 V 영역 및 변형된 인간 IgG 불변(hIgG1) 영역을 갖는 키메라 T 세포 이중특이적 단백질을 하기와 같이 생산하였다: 모 마우스 TOPO 벡터로부터의 V 영역 cDNA를, 각각 시스테인 링커(링커 3), 예컨대 GCPPCP(서열번호 192)를 갖는 제1 및 제2 이종이량체-촉진 도메인, 및 "놉" Fc 쇄(서열번호 188) 또는 "홀" Fc 쇄(서열번호 189)를 포함하는 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 이러한 경우, 마우스 항-GUCY2c 가변 중쇄(VH) 영역(서열번호 11, 19, 26, 33 및 41)는 링커GGGSGGGG(서열번호 190)에 의해 분리되는 인간 항-CD3 가변 경쇄(VL) 영역(서열번호 84)과 인프레임 융합되고, "홀" Fc 쇄(서열번호 189)에 연결되는 또다른 링커 GCPPCP(서열번호 192)가 뒤따른다. 마우스 항-GUCY2c VL 영역(서열번호 92, 100, 104, 106, 112 및 119)은 링커 GGGSGGGG(서열번호 190), 인간 항-CD3 VH 영역(서열번호 1), 이어서 링커 GCPPCP(서열번호 192) 및 "놉" Fc 쇄(서열번호 188)와 인프레임 융합된다. 단편을, 등온 어셈블리(ITA) 클로닝을 위한 도착지 벡터와 상동 관계를 공유하는 15 내지 25개의 뉴클레오티드 돌출부를 혼입하는 프라이머를 사용하여 표준 PCR에 의해 증폭시켰다. 단편을 주입 ITA 클로닝 키트(클론테크(Clontech))를 사용하여 선형화된 벡터 내로 재결합시켰다.
이어서, 결찰물을 적절한 에스케리키아 콜라이 DH5α(라이프 테크놀로지스) 내로 형질전환시키고 밤새 37℃에서 100 μg/mL 카르베니실린을 함유하는 아가로스 플레이트 상에서 성장시켰다. 콜로니를 계수하고 고르고 밤새 YT-브로쓰 + 100 μg/mL 카르베니실린에서 밤새 성장시키고, DNA를 표준 방법을 사용하여 단리하였다. 이어서, 모든 DNA 구축물을, 통상적 서열 결정 방법을 사용하여 포유동물 세포 발현 전에 둘 모두의 가닥에 대해 서열 결정하였다.
실시예 5: 키메라 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 발현 및 정제
상보적 구축물 쌍(12.5 μg의 각각의 쇄)을, ExpiFectamine(상표) 293 형질감염 키트(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 1x106 세포/mL HEK 293 세포를 함유하는 25 mL 로그 단계 배양물 내로 공-형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에, ExpiFectamine 형질감염 인핸서를 첨가하고, 세포를 채취 전에 추가적 4 내지 5일 동안 성장시켰다. 이어서, 폐배양물을 수집하고 원심분리하여 세포 데브리를 제거한 후에, 20 μm 필터에 통과시켰다.
이어서, CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 함유하는 정화 컨디셔닝된 배지를 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 샘플을, 액체 핸들러(테칸(Tecan))를 사용하여 MabSelect SuRe(상표) 단백질 A 수지(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))로 사전-팩킹된 0.45 mL 마이크로 컬럼(레플리젠(Repligen))에 적재하였다. 결합된 단백질을 PBS(pH 7.2)로 세척한 후에, 20 mM 시트르산, 150 mM 염화 나트륨(pH 3.5)으로 용리하고 2 M tris(pH 8.0)로 중화시켰다. 이어서, 샘플을 제조사의 방법에 따라 G25 Sephadex 드립 컬럼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 PBS(pH 7.2) 내로 탈염시켰다. 정제된 단백질을 제조사 프로토콜에 따라 Aglient 1200 HPLC 상에서 Mab HTP 컬럼(토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))을 사용하는 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 순도에 대해 분석하였다. 농도를 분광광도계(트리니안(Trinean))를 사용하여 OD280 nm에서 측정함으로써 결정하였다.
실시예 6: 재조합 단백질 결합 분석
단백질을 재조합 인간, 시노 및 마우스 단백질에 대한 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 정제된 인간, 시노몰구스, 뮤린 GUCY2c ECD 또는 인간 CD3 엡실론-델타 단백질을 Nunc-Maxisorb 384-웰 ELISA 플레이트 상에 1 μg/mL로 20 μL에서 PBS-CMF(칼슘 및 마그네슘 미함유)에서 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 3회 PBS + 0.05% TWEEN20으로 세척하고 PBS + 3% 밀크로 1시간 동안 RT에서 진탕하면서 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 연속 희석된 샘플을 첨가하고 1시간 동안 RT에서 진탕하면서 배양하였다. 플레이트를 이전과 같이 3회 세척하고, 이차 항체를 첨가한 후에(염소 항-hu IgG Fc-HRP - 서던 바이오테크(Southern Biotech) L2047-05, 1:5000; 염소 항-마우스 IgG Fc-HRP - 써모 사이언티픽, 1:4,000 희석됨; 또는 마우스 항-펜타-HIS-HRP, Qiagen, 1:1000), 1시간 동안 RT에서 진탕하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 신호를 TMB를 사용하여 발달시키고, 반응을 H2SO4에 의해 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 엔비전 플레이트 리더(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 판독하였다. 또한, 대안적 검출 방법을 TMB/H2SO4 대신에 주기적으로 사용하였다. 첨가 및 세척 후에, DELFIA 분석 완충제(퍼킨 엘머 1244-330)에 1:1000 희석된 20 μL/웰의 항-인간 IgG 유로퓸 접합체(퍼킨 엘머 EU-N1)를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 3회 1x DELFIA 세척 용액(퍼킨 엘머 1244-114)으로 세척하고, 20 μL/웰의 증진 용액(퍼킨 엘머 1244-105)을 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 이어서, 시간 분해 형광을 320 및 615 nm에서 엔비전(등록상표) 플레이트 리더(엔비전(등록상표) 멀티라벨 플레이트 리더, 퍼킨 엘머)를 제조사의 방법에 따라 사용하여 측정하였다.
GUCY2c 및 CD3 둘 모두에 대한 이중특이적 결합을 시험하기 위해, 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 인간 CD3 엡실론-델타(서열번호 242)를 Nunc-Maxisorb 384-웰 ELISA 플레이트 상에 1 μg/mL으로 20 μL에서 PBS-CMF(칼슘 및 마그네슘 미함유)에서 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 3x PBS + 0.05% TWEEN20으로 세척하고 PBS + 3% 밀크 1시간 동안 RT에서 진탕하면서 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 연속 희석된 샘플을 첨가하고 1시간 동안 RT에서 진탕하면서 배양하였다. 플레이트를 이전과 같이 3회 세척하고, 정제된 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 GUCY2c ECD-마우스 IgG2a Fc 융합 단백질을 플레이트에 1 μg/mL로 첨가하고 RT에서 1시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 플레이트를 이전과 같이 3회 세척하고, 이차 항체를 첨가한 후에(염소 항-마우스 IgG Fc-HRP - 써모 사이언티픽, 1:4,000 희석됨), 1시간 동안 RT에서 진탕하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 신호를 TMB를 사용하여 발달시키고, 반응을 H2SO4에 의해 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 엔비전(등록상표) 플레이트 리더(퍼킨 엘머) 상에서 판독하였다. 또한, 대안적 검출 방법을 TMB/H2SO4 대신에 주기적으로 사용하였다. 정제된 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 GUCY2c ECD-마우스 IgG2a Fc 융합 단백질의 첨가 및 세척 후에, DELFIA 분석 완충제(퍼킨 엘머 1244-330)에 1:1000 희석된 20 μL/웰의 항-mu-IgG 유로퓸 접합체(퍼킨 엘머 EU-N1)를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 3x DELFIA 세척 완충제로 세척하고 30분 동안 20 μL의 증진 용액(퍼킨 엘머 1244-105)과 함께 배양하였다. 이어서, 시간 분해 형광을 3240 및 615 nm에서 엔비전(등록상표) 플레이트 리더(퍼킨 엘머)를 제조사의 방법에 따라 사용하여 측정하였다. 키메라 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 재조합 인간 GUCY2c 및 인간 CD3 엡실론에 대한 결합 활성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 상위 6개의 히트는 저 nM 또는 서브 nM의 이중 결합 활성을 나타냈다(표 13).
[표 13]
Figure 112020139468681-pct00037
실시예 7: 이중특이적 항체 매개된 T 세포 활성
인간 PBMC를 건강한 공여자 혈액으로부터 Histopaque-177(시그마)을 사용하여 단리하였다. 나이브 T 세포를 PBMC로부터 T 세포 강화 키트(스템 셀 테크놀로지스)를 사용하여 단리하였다(T 세포의 음성 선택). 루시페라제 발현 구축물에 의해 형질감염된 GUCY2c 발현 T84 인간 종양 세포를 R10 배지(RPMI, 10% FBS, 1% Penn/Strep, 3 mL 45% 글루코스)에 재현탁하였다. 또한, T 세포를 R10 배지에 재현탁하고 T84 세포에 10:1 또는 5:1의 효과기 대 표적 비(E:T 비)로 첨가하였다. 세포를 GUCY2c 이중특이적 항체 또는 음성 대조군 CD3 이중특이적 항체의 연속 희석물로 처리하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에, 루시페라제 신호를 빅터(Victor)(퍼킨 엘머)를 사용하여 네올라이트(neolite) 시약(퍼킨 엘머)을 사용하여 측정하였다. EC50 값을 4-파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하여 그래프패드 프리즘에서 계산하였다. 표적 음성 HCT116 또는 HT29 세포는 임의의 GUCY2c 이중특이적 항체 매개된 세포독성을 나타내지 않았다. 키메라 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체(E:T 비 = 10:1)를 사용한 세포 사멸 분석의 결과를 표 14에 나타냈다. 모든 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 GUCY2c 양성 세포의 특이적이고 강한 T 세포 의존적 세포 사멸을 나타냈다.
[표 14]
Figure 112020139468681-pct00038
인간화된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체(E:T 비 = 5:1)를 사용한 세포 사멸 분석의 결과를 표 15에 나타냈다. 모든 이중특이적 항체는 GUCY2c 양성 세포에서 T 세포 의존적 세포독성을 나타냈다.
[표 15]
Figure 112020139468681-pct00039
실시예 8: Octet에 의한 에피토프 비닝
이중특이적 단백질 GUCY2C-0074, -0077, -0104, -0105 및 -0098을 OctetRED 384(포르테바이오(ForteBio))를 사용한 탠덤 비닝 분석을 사용하여 인간 GUCY2c(서열번호 224)에 대한 경쟁 및 비경쟁 결합에 대해 평가하였다. Octet 분석을 실온에서 수행하였다. 비오티닐화된 인간 GUCY2c를 10 μg/mL로 칼슘 및 마그네슘 미함유 포스페이트 완충된 염수(PBS)에 희석하고 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(18-5020, 포르테바이오) 상에 제조사의 지시서에 따라 포착하였다. 이중특이적 단백질을 300 nM로 PBS에 희석하였다. GUCY2c 코팅된 바이오센서를 제1 이중특이적 단백질 내로 300초 동안 담근 후에, 제2 이중특이적 단백질 내로 300초 동안 담갔다. 각각의 이중특이적 항체를 이러한 쌍별 조합 방식으로 시험하였다. 인간 GUCY2c 상의 동일한 결합 영역에 대해 경쟁하는 이중특이적 항체를 단일 빈으로 나누었다. 키메라 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 Octet에 의한 에피토프 비닝은 항-GUCY2c 결합 도메인에 의해 인식되는 고유한 에피토프 군을 나타냈다(표 16). + 기호는 경쟁성 에피토프를 나타내고; +/- 기호는 부분적으로 중첩하는 에피토프를 나타내고; - 기호는 비경쟁성 에피토프를 나타내고; NT는 비교 분석을 시험하지 않았음을 나타낸다.
[표 16]
Figure 112020139468681-pct00040
실시예 9: 마우스 GUCY2c 항체 결합 도메인의 인간화
마우스 GUCY2c 가변 영역의 인간화를 CDR-그래프트 전략을 사용하여 수행하였다. 인간 수용체 골격 VH3-7(서열번호 176)(중쇄의 경우) 및 VK1-39(서열번호 180)(경쇄의 경우), 및 항-GUCY2c 상보 결정 영역(CDR) 공여자 서열을 함유하는 상보적 DNA(cDNA)를 인간 IgG1-3m 불변 영역 또는 경쇄의 경우 인간 카파를 함유하는 벡터에서 합성하였다. 중쇄 벡터는 CH1 영역(서열번호 185), 힌지 영역(서열번호 186), 및 효과기 기능 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 CH2-CH3 영역(서열번호 187; EU 인덱스에 따른 넘버링)을 포함하였다. 경쇄 벡터는 카파 CL 도메인(서열번호 184)을 포함하였다. VH 및 VL 영역 둘 모두의 골격 영역에서 마우스 서열로의 복귀 돌연변이가 도입되고 결합 활성의 완전한 회복에 대해 평가하였다. 인간 수용체 골격, 모 마우스 클론 및 완전히 활성인 인간화된 변이체의 VH 및 VL 영역의 배열을 클론 GUCY2C-0098에 대해 하기 표 17A, 17B, 18A 및 18B에 나타냈다.
VH 및 VL 영역 둘 모두의 골격 영역에서 마우스 서열로의 복귀 돌연변이를 도입하고 결합 활성의 완전한 회복에 대해 평가하였다. 인간 수용체 골격, 모 모 마우스 클론 및 완전히 활성인 인간화된 변이체 GUCY2C-0241의 VH 및 VL 영역의 배열을 클론 GUCY2C-0098에 대해 하기 표 17A 및 17B에 나타냈다.
[표 17A]
Figure 112020139468681-pct00041
[표 17B]
Figure 112020139468681-pct00042
인간 수용체 골격, 모 마우스 클론 및 완전히 인간화된 변이체의 VL 영역의 배열을 클론 GUCY2C-0098에 대해 표 18A 및 18B에 나타냈다. 카바트 넘버링을 기반으로 한 CDR에 밑줄을 쳤다. 굵은 글씨는 완전히 인간화된 클론에 존재하는 원래 비-인간 생식계열 아미노산을 나타낸다.
[표 18A]
Figure 112020139468681-pct00043
[표 18B]
Figure 112020139468681-pct00044
표 19는 인간화된 항-GUCY2c 결합 도메인이 인간 IgG1로서 ELISA에 의해 측정시 재조합 GUCY2c 단백질에 대한 유지된 결합을 나타냄을 보여준다.
[표 19]
Figure 112020139468681-pct00045
표 20은 인간화된 GUCY2c 결합 도메인이 CD3 이중특이적 항체로서 동시에 재조합 인간 GUCY2c 및 인간 CD3 단백질에 대한 유지된 결합을 나타냄을 보여준다. GUCY2C-0240은 GUCY2C-0166 IgG의 인간화된 CD3 이중특이적 항체 버전이다. GUCY2C-0247 및 GUCY2C-0250은 상이한 항-CD3 가변 영역을 갖는 GUCY2C-0241의 인간화된 CD3 이중특이적 항체이다.
[표 20]
Figure 112020139468681-pct00046
실시예 10: 파지 디스플레이를 사용한 GUCY2C 결합 도메인의 추가적 인간화 및 최적화
특정 실시양태에서, 치환은, 인간 아미노산 함량을 증가시키고 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위한 CDR 잔기가 상응하는 인간 생식계열 잔기로 대체된 인간 생식계열 치환이다. 예를 들어, 인간 생식계열 VH3-7 골격 및 예시적 항체 GUCY2C-0241이 사용되는 경우, GUCY2C-0241 항체(서열번호 27) 및 인간 생식계열 VH3-7의 VH CDR1의 정렬은 하기 표 21과 같다(카바트 넘버링 체계 및 VH CDR1의 AbM 정의 사용):
[표 21]
Figure 112020139468681-pct00047
위치 26, 28, 29, 31, 32, 33 및 34에서, 인간 생식계열 잔기 및 상응하는 GUCY2C-0241 잔기는 동일하고, 생식계열 치환은 가능하지 않다. 위치 27, 30 및 35에서(밑줄 친 굵은 글씨), 인간 생식계열 잔기 및 상응하는 GUCY2C-0241 잔기는 상이하다. 이들 위치에서 GUCY2C-0241의 잔기는 인간 잔기 함량을 추가로 증가시키기 위해 상응하는 인간 생식계열 VH3-7 잔기로 대체될 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 생식계열 VH 골격 서열을 포함하는 VH 골격을 포함할 수 있다. VH 골격 서열은 인간 VH3 생식계열, VH1 생식계열, VH5 생식계열 또는 VH4 생식계열로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직한 인간 생식계열 중쇄 골격은 VH1, VH3 또는 VH5 생식계열로부터 유래된 골격이다. 예를 들어, 하기 생식계열로부터 유래된 VH 골격이 사용될 수 있다: IGHV3-23, IGHV3-7 또는 IGHV1-69(생식계열 명칭은 IMGT 생식계열 정의를 기반으로 한다). 바람직한 인간 생식계열 경쇄 골격은 Vκ 또는 Vλ 생식계열로부터 유래된 골격이다. 예를 들어, 하기 생식계열로부터 유래된 VL 골격이 사용될 수 있다: IGKV1-39 또는 IGKV3-20(생식계열 명칭은 IMGT 생식계열 정의를 기반으로 한다). 대안적으로 또는 부가적으로, 골격 서열은 인간 생식계열 공통 골격 서열, 예컨대 인간 Vλ1 공통 서열, Vκ1 공통 서열, Vκ2 공통 서열, Vκ3 공통 서열, VH3 생식계열 공통 서열, VH1 생식계열 공통 서열, VH5 생식계열 공통 서열 또는 VH4 생식계열 공통 서열의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 골격의 서열은 다양한 공개 데이터베이스, 예컨대 V-base, IMGT, NCBI 또는 Abysis로부터 입수가능하다.
항체 또는 항원 결합 단편은 인간 생식계열 VL 골격 서열을 포함하는 VL 골격을 포함할 수 있다. VL 골격은, 유래된 생식계열과 기능적 및 구조적 유사성을 계속 유지하면서, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, VL 골격은 인간 생식계열 VL 골격 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 생식계열 VL 골격 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 VL 골격을 포함한다.
인간 생식계열 VL 골격은 DPK9(IMGT 명칭: IGKV1-39)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK12(IMGT 명칭: IGKV2D-29)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK18(IMGT 명칭: IGKV2-30)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK24(IMGT 명칭: IGKV4-1)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 HK102_V1(IMGT 명칭: IGKV1-5)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK1(IMGT 명칭: IGKV1-33)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK8(IMGT 명칭: IGKV1-9)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK3(IMGT 명칭: IGKV1-6)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK21(IMGT 명칭: IGKV3-15)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 Vg_38K(IMGT 명칭: IGKV3-11)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK22(IMGT 명칭: IGKV3-20)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPK15(IMGT 명칭: IGKV2-28)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPL16(IMGT 명칭: IGLV3-19)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 DPL8(IMGT 명칭: IGLV1-40)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 V1-22(IMGT 명칭: IGLV6-57)의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 인간 Vλ 공통 서열의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 인간 Vλ1 공통 서열의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 인간 Vλ3 공통 서열의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 인간 Vκ 공통 서열의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 인간 Vκ1 공통 서열의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 인간 Vκ2 공통 서열의 골격일 수 있다. 인간 생식계열 VL 골격은 인간 Vκ3 공통 서열의 골격일 수 있다.
증가된 이원 치환에 의한 GUCY2c 항체의 파라토프 결정
중요한 CDR 잔기의 결정 방법이 기재되어 있고, 이에 의해 기능적 항체 변이체가 CDR-H3을 제외하고 각각의 CDR 위치에서 인간 생식계열 잔기 또는 상응하는 설치류 잔기를 함유하는 라이브러리로부터 선택된다(문헌[Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359]). 파지 scFv 라이브러리를 구축하였고, 여기서 인간 생식계열(VH3-7/VK1-39)과 상이한 GUCY2C-0241의 VH CDR3을 제외한 모든 CDR 위치는 무작위화되어 약 50%의 클론이 마우스 GUCY2C-0241 아미노산을 암호화하고 약 50%가 인간 생식계열 아미노산을 해당 위치에서 암호화한다(표 17A, 17B, 18A 및 18B). 라이브러리를 생산하고 하기에 기재된 바와 같이 인간 GUCY2c(서열번호 232)의 선택을 3 내지 4 라운드 수행하였다. GUCY2c에 대한 결합을 유지하는 클론을 회수하고 이의 서열을 결정하였다.
본 실험으로부터, 인간 서열이 약 20% 미만의 결합 클론에서 관찰되는 위치는 본질적 마우스 잔기로서 정의되었다. 마우스 잔기는 우선적으로 25개의 위치(중쇄 잔기 H35, E50, P52a, S53, N54, G55, L56, T57, N58, I60, E61, K62, F63 및 N65; 경쇄 잔기 E27, V29, D30, L32, M33, Q34, N53, E55, T91, R92 및 K93, 카바트 넘버링 체계에 따르고, AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용되었고; 초티아 넘버링 체계가 VL CDR1에 대해 사용되었다)에서 유지되었고, 이는 인간 생식계열 잔기에 의한 이들 잔기의 대체가 강하게 기피됨을 시사한다. 마우스 및 인간 잔기는 중쇄 잔기 27(F/Y) 및 30(S/T) 및 경쇄 잔기 54(L/V) 및 94(A/V)(카바트 넘버링 체계에 따르고; AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용됨)에서 유사한 빈도(20% 초과의 인간 함량으로서 정의됨)를 갖는 것으로 나타났고, 이는 이들 위치에서 마우스 서열이 중요하지 않음을 시사한다.
또한, 이전에 마우스 아미노산으로의 복귀 돌연변이(중쇄 위치 I48 및 G49, 카바트 넘버링 체계에 따름)를 필요로 하는 골격(FW) 잔기가 증가된 이원 치환 전략에 포함되었다. 파지 선택 및 스크리닝 후에, 중쇄 골격 위치 48에 대한 인간 아미노산 서열이 약 10% 관찰되었고, 이는 복귀 돌연변이가 바람직함을 시사한다. 중쇄 위치 49는 마우스 아미노산 잔기를 100% 함유하였고, 이는 이러한 복귀 돌연변이가 필수적임을 시사한다. 증가된 이원 치환 후에 CDR 또는 FW 위치에서 마우스 또는 인간 아미노산 서열의 빈도를 표 22에 나타냈다. 표 22는 증가된 이원 치환에 의해 시험한 GUCY2C-0098 CDR 위치에서 인간 아미노산의 혼입의 빈도를 나타낸다(카바트 넘버링 체계를 사용하고, AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용되고; 초티아 넘버링 체계가 VL CDR1에 대해 사용됨).
[표 22]
Figure 112020139468681-pct00048
Figure 112020139468681-pct00049
항-GUCY2c 결합 도메인의 추가적 최적화
개선된 안정성을 갖는 항-GUCY2c의 변이체를 하기 절차에 의해 단리하였다. 인간화된 클론 GUCY2C-0241의 VH 및 VL 영역(서열번호 60 및 137)을 단일 쇄 가변 단편(scFv)으로서 C-말단 His6 및 c-myc 태그를 함유하는 파지 발현 벡터(Blue Heron)에서 합성하였다. 무작위 돌연변이를 이전에 US 9,884,921에 기재된 방법을 사용하여 NNK 소프트 무작위화에 의해 VH 및 VL CDR 도메인 내로 도입하였다. 하나의 CDR 잔기를 하나씩 선택적으로 돌연변이시키도록 설계된 올리고를 벤더(IDT)에서 합성한 후에, 이전에 기재된 방법을 사용하여 핵산 템플레이트에 변화를 도입하는 데 사용하였다(문헌[Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359]). 잠재적 NG 아스파라긴 탈아미드화 부위를 제거하는 번역후 변형의 잠재적 부위(중쇄 G55E)를 제거하도록 설계된 돌연변이(문헌[Chelius et al., Anal. Chem. 77(18):6004-6011, 2005])를 또한 올리고 설계에 혼입하였다. 돌연변이된 클론을 고르고 서열 결정하여 돌연변이 빈도를 평가하였다. 이어서, GUCY2C-0241의 돌연변이된 VH 및 VL CDR 변이체(서열번호 60 및 137)를 함유하는 이들 파지 발현 벡터를 파지 디스플레이를 위해 작은 서브라이브러리 내로 모았다.
재조합 인간, 시노몰구스 및 뮤린 GUCY2c 단백질을 선택 및 후속 스크리닝 단계 동안 사용하였다(서열번호 230, 232, 234, 236, 238 및 240). 비오티닐화된 단백질이 관여한 선택을 위해, 전술된 파지 풀의 분액 및 자성 스트렙타비딘 비드(다이아나비즈(Dynabeads) M-280 스트렙타비딘)를 개별적으로 3% 밀크/PBS에서 1시간 동안 실온, 60℃ 또는 65℃에서 회전 혼합기(20 rpm)에서 차단하였다. 상이한 온도에서 배양한 후에, 차단된 파지 풀을 4000 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브에 옮기고 6% 차단 완충제와 혼합하였다. 차단된 파지를 과몰 농도의 선택 해제 시약(즉 표적을 함유하지 않는 스트렙타비딘 비드, 이중 가닥 sDNA, 인슐린 및/또는 막 추출 시약)과 함께 배양하고 실온에서 1시간 동안 회전 진탕기(20 rpm) 상에서 배양하고 차단된 스트렙타비딘-자성 비드와 혼합하고 추가적 1시간 동안 배양하였다. 선택 해제된 라이브러리를 비드를 자성 분기리를 사용하여 펠릿화하여 수집하였다. 킹피셔(Kingfisher) 자성 정제 기기(써모피셔(ThermoFisher, 미국 뉴저지주 스프링필드 소재))를 사용하여, 비오티닐화된 선택 항원(표 23에 나타낸 바와 같이 다양한 농도)을 선택 해제된 파지 라이브러리와 함께 96-딥 웰 플레이트에서 1시간 동안 실온에서 주기적 혼합과 함께 배양하였다. 비드를 킹피셔 기기 상에서 자성 분리기를 사용하여 분리하고 4회 PBS/0.1% Tween20으로 및 3회 PBS로 개별적 96-딥 웰 플레이트에서 세척하였다. 결합된 파지를 100 mM 트라이에틸아민(TEA)과 함께 8분 동안 새로운 96-웰 플레이트에서 배양한 후에 자성 비드로부터 분리하여 평가하였다. 용리된 파지를 2 M Tris-HCl(pH 7.5)로 중화시켰다. 항-GUCY2c 결합 도메인 최적화를 위한 파지 선택 조건의 예를 표 23에 나타냈다. 또한, 표 23은 파지 디스플레이를 위해 사용된 선택 조건을 나타낸다. Dslxn은 사용된 선택 해제 조건을 의미한다. SA = 스트렙타비딘; D = DNA; I = 인슐린; M = 막 추출 단백질. Therm은 표적과의 배양 전에 수행된 열적 배양을 나타낸다.
[표 23]
Figure 112020139468681-pct00050
용리된 파지를, 중간 로그 단계(약 0.5의 OD600에 해당)로 성장시킨 10 mL의 에스케리키아 콜라이 ER2738 배양물을 감염시키는 데 사용하였다. 박테리아를 파지에 의해 1시간 동안 37℃에서 150 rpm에서의 진탕과 함께 감염시키고 원심분리 단계 후에 농축하고 2% 글루코스 및 100 μg/mL 암피실린를 함유하는 2X YT 한천 생물학적 분석 플레이트(2X YTAG) 상에 플레이팅하였다. 인풋 또는 아웃풋 파지로 감염된 에스케리키아 콜라이 배양물의 다양한 희석물을 또한 2X YTAG 한천 상에 플레이팅하여 파지 역가를 결정하였다. 밤새 30℃에서 성장시킨 후에, 10 mL의 2X YTAG 배지를 각각의 생물학적 분석 플레이트에 첨가하고, 세포를, 박테리아 론(lawn)을 스크랩핑함으로써 재현탁하였다. 글리세롤을 상기 세포 현탁액에 첨가하여 17%의 최종 농도를 수득하고 추가적 사용 전까지 -80℃에서 분액으로 저장하였다. 다음 라운드의 선택을 위해 파지를 구조(rescue)하기 위해, 100 μL의 상기 세포 현탁액을 사용하여 20 mL 2X YTAG 배지를 접종시키고, 이를 37℃에서(300 rpm) 0.3 내지 0.5의 OD600까지 성장시켰다. 이어서, 세포를 3.3 μL의 MK13K07 헬퍼 파지에 의해 중복 감염시키고 37℃에서(150 rpm) 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 원심분리하고, 펠릿을 카나마이신(kanamycin)/비-글루코스 함유 배지(50 μg/mL 카나마이신 및 100 μg/mL 암피실린을 갖는 2X YT)에 재현탁하였다. 이러한 배양물을 밤새 30℃에서(300 rpm) 성장시켰다. 파지를 원심분리 후에 상청액에서 채취하고 전술된 바와 같이 다음 라운드의 선택에서 사용하기 위해 준비시켰다.
ELISA에서 사용하기 위한 미가공 주변세포질 물질의 생산
ScFv를 사용된 성장 조건에 따라 파지 입자의 표면 상에 또는 박테리아 주변세포질 공간의 용액에서 발현시켰다. 주변세포질 내로 scFv의 방출을 유도하기 위해, 0.1% 글루코스/100 μg/mL 암피실린을 갖는 2X YT 배지를 함유하는 96-딥 웰 플레이트를 QPix 콜로니 피커(picker)(몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 해동된 글리세롤 스톡(웰 당 하나의 클론)으로부터 접촉시키고 37℃에서(999 rpm) 약 4시간 동안 성장시켰다. 배양물을 0.02 mM의 최종 농도의 IPTG에 의해 유도하고 밤새 30℃에서(999 rpm) 성장시켰다. 박테리아 주변세포질의 내용물(periprep)을 삼투압 충격에 의해 방출시켰다. 간략히, 플레이트를 원심분리하고, 펠릿을 150 μL의 TES 주변세포질 완충제(50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% 수크로스, pH7.4)에 재현탁한 후에, 150 μL의 1:5 TES:물을 첨가하고 얼음 상에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 20분 동안 4000 RPM에서 원심분리하고, scFv-함유 상청액을 채취하였다.
경쟁 ELISA
ELISA 플레이트(NUNC-Maxisorb 460372)를 PBS 완충제 중의 1 μg/mL의 해당 항원으로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 코팅 용액을 폐기한 후에, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 웰 당 70 μL PBS-3% BSA에 의해 차단하였다. 차단 용액을 폐기하고, periprep 또는 정제된 단백질로서 미공지된 샘플(사전 결정된 희석물, 전형적으로 1:5) 및 순수한 모 항체의 혼합물인 20 μL의 일차 항체를 목적하는 농도(전형적으로 EC50 내지 EC80)로 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 실온에서 느린 진탕과 함께 배양하였다. 플레이트를 5회 100 μL/웰의 세척 완충제(퍼킨 엘머 1244-114)로 세척하고 Delfia 분석 완충제(퍼킨 엘머 1244-111)에 스트렙타비딘-Eu 또는 항-인간 IgG의 경우 1:1000 희석되거나 항-마우스 IgG의 경우 1:500 희석된 20 μL의 이차 유로퓸 접합체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 5회 이전과 같이 세척하고 30분 동안 20 μL의 증진 용액(퍼킨 엘머 1244-105)과 함께 배양하였다. 이어서, 시간 분해 형광을 320 및 615 nm에서 엔비전(등록상표) 플레이트 리더(엔비전(등록상표) 멀티라벨 플레이트 리더, 퍼킨 엘머)를 제조사의 방법에 따라 사용하여 측정하였다.
scFv-Fc, IgG 및 이중특이적 항체로의 ScFv 전환
목적되는 거동을 나타내는 ScFv를 scFv-Fc로 서브클로닝하기 위해 선택하였고, 여기서 인간 IgG1의 Fc 도메인은 scFv의 3' 단부에 부착되었다. 간략히, 단편을 5' 증폭의 경우 프라이머 BssHII 및 3' 증폭의 경우 BclI를 사용하여 표준 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 단편을 상응하는 제한 효소를 제조사의 설명서에 따라 사용하여(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 절단하였다. 항-GUCY2c scFv-Fc 앰플리콘을 겔 정제하고(Qiagen 겔 정제 키트) 인간 IgG1 Fc 도메인을 함유하는 화이자 전매 사전-절단된 포유동물 발현 벡터로 결찰시켰다. ScFv-Fc 구축물을 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시키고 이전과 같이 서열 결정하였다. 이어서, 서열 확인된 발현 벡터를 전술된 바와 같이 HEK 293 세포에서 일시적 포유동물 발현을 위해 사용하였다. 샘플을 단백질 A 친화도 포착을 사용하여 정제한 후에, 전술된 바와 같이 PBS로 완충제 교환을 수행하였다. 이어서, 정제된 샘플을 재조합 GUCY2c 단백질 결합 활성 및 안정성에 대해 스크리닝하였다. scFv-Fc 서열의 예는 GUCY2C-0405(서열번호 213)이다. 이러한 포맷은 글리신-세린 링커(서열번호 193)인 링커 4에 의해 연결된 VH-VL 배향의 scFv로 이루어진다. VH-VL은 2개의 링커 서열(링커 5(서열번호 194) 및 링커 6(서열번호 195))을 사용하여 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인(서열번호 187)에 연결된다.
또한, 최적화된 scFv를 전술된 바와 같이 인간 IgG1 및 T 세포 이중특이적 포맷으로 서브클로닝하였다. 가변 영역 유전자 특이적 프라이머를 이전과 같이 ITA 클로닝을 위해 설계하였다.
실시예 11: 최적화된 GUCY2c 항체의 표면 플라즈몬 공명
최적화된 GUCY2c 항체를 BIACORE(상표) 8K 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결합에 대해 평가하였다. CM5 센서 칩를 사용하여, 항-인간 Fc(GE BR-1008-39)를 먼저 제조사의 프로토콜에 따라 코팅하였다. 인간 항-GUCY2c IgG를 30초 동안 0.5 μg/mL에서 10 μL/분으로 행크 완충된 염수(HBS) -EP+(pH=7.4)에서 칩 위에서 움직이게 하였다. 다음으로, 450 nM, 150 nM 및 50 nM의 농도의 인간 GUCY2c 단백질(서열번호 224)을 54초 동안 50 μL/분으로 칩 위를 움직이게 하여 결합시킨 후에, 300초 동안 해리시켰다. 칩을 3X 3M MgCl2를 사용하여 30초 동안 각각의 움직임 사이에 재생시켰다. BIACORE(상표)에서, 인간 IgG1 포맷의 최적화된 항-GUCY2c 결합 도메인의 인간 GUCY2c 재조합 단백질에 대한 결합 친화도(nM KD)를 표 24에 나타냈다. 여러 최적화된 GUCY2c 결합 도메인, 예컨대 GUCY2C-0486(서열번호 214 및 215)은 최적화되지 않은 모 결합 도메인(GUCY2C-0241)과 비교하여 개선된 결합 친화도를 나타낸다.
[표 24]
Figure 112020139468681-pct00051
실시예 12: 열 자극 결합 분석
최적화된 변이체의 개선된 열적 안정성을 평가하기 위해, 최적화된 파지 클론의 주변세포질 표본(상기에 기재됨) 또는 정제된 단백질을 PCR 블록에서 고온에서 열 자극에 따라 결합 활성에 대해 평가하였다. 그라이너 바이오-원(Greiner bio-one) 384-웰 백색 ELISA 플레이트(781074)를 코팅 완충제(25 mM Na2CO3, 75 mM NaHCO3 pH 9.6)에서 1 μg/mL의 표적 단백질에 의해 O/N 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 3회 PBS + 0.05% TWEEN20으로 세척한 후에, 1시간 동안 RT에서 차단 완충제(PBS + 3% 밀크)와 함께 진탕하면서 차단하였다. 개별적으로, 주변세포질 표본 또는 정제된 단백질의 희석 플레이트를 실온에서 차단 완충제에 1:10의 주변세포질 표본 또는 1 μg/mL(EC80)의 재조합 단백질 결합으로 제조하고, 100 μL를 96-웰 PCR 플레이트에 옮겼다. 이어서, 100 μL 희석된 샘플을 함유하는 PCR 플레이트를 목적하는 온도(일반적으로 55℃ 내지 75℃)에서 30분 동안 가열하였다. 플레이트를 15분 동안 실온에서 냉각한 후에, 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 차단된 ELISA 플레이트를 비우고, 20 μL의 열 자극된 단백질 상청액을 웰마다 첨가하고, 1시간 동안 RT에서 진탕하면서 배양하였다. 플레이트를 3회 이전과 같이 세척하고, DELFIA 분석 완충제(퍼킨 엘머 1244-330)에 1:1000 희석된 20 μL의 항-6xHIS-유로퓸 시약(퍼킨 엘머 EU-N1) 또는 항-인간 IgG-유로퓸 접합체 시약 단백질(퍼킨 엘머 EU-N1)을 웰 마다 첨가하고 RT에서 1시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 플레이트를 3회 1x DELFIA 세척 용액(퍼킨 엘머 1244-114)으로 세척하고, 20 μL의 증진 용액(퍼킨 엘머 1244-105)을 각각의 웰에 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 엔비전 플레이트 리더 상에서 시간 분해 형광에 대해 먼저 OD320에서, 이어서 OD615에서 제조사의 방법에 따라 판독하였다. 50%의 활성이 유지되는 온도를 T50으로 기록하였다. scFv-Fc로서 안정성 최적화된 GUCY2c 결합 도메인에 대한 열적 결합 분석은, 최적화되지 않은 모 클론 GUCY2C-0241과 비교하여(본원에서 scFv-Fc 포맷의 GUCY2C-0295) 고온에서 배양 후에 개선된 열적 안정성을 나타냈다(표 25A 및 25B).
표 25A 및 25B는 증가하는 온도에서 최적화된 GUCY2c 결합 도메인(scFv-Fc 단백질로서)에 대한 시간 분해 형광(TRF)을 나타낸다. T50 값은 클론이 50% 결합 활성을 보유하는 온도를 나타낸다.
[표 25A]
Figure 112020139468681-pct00052
[표 25B]
Figure 112020139468681-pct00053
개선된 열적 안정성을 나타내는GUCY2c 항체 클론에 대한 아미노산 서열을 모 클론 GUCY2C-0241(VH 서열번호 60 및 VL 서열번호 137)에 대해 비교하였다. 개선된 안정성을 야기하는 VH CDR의 아미노산 함량의 변화를 표 26A에 나타냈다. 위치 59, 60, 61 및 62에서의 변화가 안정성에 대해 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났고, 이는 안정성의 가장 큰 변화와 관련된다(카바트 넘버링 체계에 따르고, AbM 정의가 VH CDR1에 대해 사용됨).
[표 26A]
Figure 112020139468681-pct00054
개선된 안정성을 야기하는 VL CDR의 아미노산 함량의 변화를 표 26B에 나타냈다(초티아의 넘버링 체계가 VL CDR1에 대해 사용되었고, 카바트의 넘버링 체계가 VL CDR2 및 CDR3에 대해 사용되었다). VL CDR2의 위치 53, 54 및 55 및 VL CDR3의 위치 93 및 94에서의 변화가 안정성에 대해 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났고, 이는 안정성의 가장 큰 변화와 관련된다.
[표 26B]
Figure 112020139468681-pct00055
실시예 13: 최적화된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 재조합 단백질 결합
최적화된 항-GUCY2c 결합 도메인을 이중특이적 포맷에서 인간 GUCY2c(서열번호 224) 및 인간 CD3(서열번호 242)에 대한 동시적 재조합 단백질 결합에 대해 실온 및 60℃에서 이전에 기재된 DELFIA 방법을 사용하여 평가하였다. 또한, 최적화된 이중특이적 항체를 인간 GUCY2c(서열번호 232) 및 시노몰구스 GUCY2c(서열번호 236)에 대한 직접 결합에 대해 실온 및 60℃에서 이전에 기재된 DELFIA 방법을 사용하여 평가하였다. 인간 GUCY2c 및 인간 CD3에 대한 최적화된 GUCY2c 이중특이적 항체의 이중 결합을 표 27에 나타냈다. 최적화된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체, 예컨대 GUCY2C-1478은 실온 및 60℃ 둘 모두에서 강한 결합을 나타냈다.
[표 27]
Figure 112020139468681-pct00056
시노몰구스 GUCY2c에 대한 최적화된 GUCY2c 이중특이적 항체의 직접 결합의 결과를 표 28에 나타냈다. 최적화된 CD3-GUCY2C 이중특이적 항체, 예컨대 GUCY2C-1478은 실온에서 인간 및 시노 GUCY2c 둘 도무에 대한 강한 결합을 나타내면서, 60℃에서 배양 후에 결합 신호의 약간의 손실을 나타냈다.
[표 28]
Figure 112020139468681-pct00057
실시예 14: 유세포 분석법에 의한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 세포 결합
최적화된 CD3 이중특이적 항체를, 신선한 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)로부터 정제된 T84 세포 상의 GUCY2c 및 나이브 인간 T 세포 상의 인간 CD3에 대한 세포 표면 결합에 대해 이전에 기재된 바와 같은 유세포 분석 방법을 사용하여 적정하였다. 인간화되고 최적화된 GUCY2c 클론 GUCY2C-0247 및 GUCY2C-1608은 인간 GUCY2c를 발현하는 T84 세포에 대해 저/서브 nM 미만의 결합 친화도를 나타냈다(도 2A 및 2B). 또한, 인간화되고 최적화된 GUCY2c 이중특이적 항체를 유세포 분석법에 의해 CD3 세포 표면에 대해 평가하였고(도 3A 및 3B), 나이브 인간 T 세포에 대한 저/서브 nM 결합 친화도를 나타냈다.
실시예 15: GUCY2c 이중특이적 항체의 면역원성 리스크-경감(de-risking)
일부 치료 단백질을 환자에게 투여할 때, 원치 않는 면역 반응, 예컨대 항-약물 항체(ADA)의 생산이 약물 효력에 영향을 미치고 환자 안전성 문제를 일으켰다(문헌[Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015]). ADA를 치료 단백질의 약리학적 활성을 억제하는지에 따라 2개의 군으로 분류하였다: 중성화 ADA(NAb) 또는 비-중성화 ADA(비-NAb)(문헌[Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015]). NAb 및 비-Nab가 감소된 약물 효력에 기여할 수 있는 2개의 가능한 메커니즘이 존재한다. 먼저, Nab는 표적 분자에 대한 치료 단백질의 결합을 직접 차단하고, 따라서 이의 치료 효력을 감소시킨다(문헌[Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015]). 두번째로, NAb 및 비-Nab는 증가된 클리어런스에 기여하여 TPP의 약동학(PK)에 영향을 미치고, 따라서 약물 효력을 절충시킬 수 있다(문헌[Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015]). 치료 단백질에 대한 면역원성은 T 세포 의존적 및 T 세포 독립적 경로 둘 모두로 생성될 수 있다. T 세포 의존적 경로에서, T 세포는 항원 제시 세포의 주조직 적합성 복합 클래스 II 분자(MHC II)에 의해 제시되는 치료 단백질 유래된 항원성 펩티드의 인식을 통해 활성화된다. 이어서, 활성화된 T 세포는 B 세포를 자극하여 치료 단백질 특이적 ADA를 생산한다(문헌[Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015]). T 세포 의존적 반응을 통해 발생한 면역원성에 대한 가능성을 최소화하기 위해, 본원에 기재된 인실리코(in silico) 방법을 사용하여 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체 서열의 항원 가능성을 감소시키기 위해 노력했다.
서열을 잠재적 T 세포 에피토프를 확인하기 위한 2개의 프로토콜(하기에 상세히 기재됨)을 사용하여 분석하였다. 프로토콜에 대해 본원에 기재된 규칙에 의해 표시된 임의의 서열은 에피토프로서 간주되었다. 본원은 아미노산 9-mer의 수준에서 주로 서열을 시험한다.
방법 1: 서열을 ISPRI 소프트웨어 패키지의 EpiMatrix 분석을 위해 제출하였다(ISPRI v 1.8.0, EpiVax Inc., Providence, RI (2017); Schafer JRA, Jesdale BM, George JA, Kouttab NM, De Groot AS. Prediction of well-conserved HIV-1 ligands using a matrix-based algorithm, EpiMatrix. Vaccine 16(19), 1880-84, 1998). 처리하지 않은 결과는 8개의 상이한 HLA 유형에 대한 각각의 9-mer 아미노산 단편의 결합 가능성의 순위를 제공한다. 따라서, 각각의 9-mer에 대한 8개의 예측("관찰")이 존재한다. 9-mer을 서열의 각각의 개별적 선형 넘버링 위치에서 출발하여 생산하였다(따라서, 동일한 서열에서 1회 초과의 9-mer이 발생하는 것이 가능하다). 임의의 4회의 관찰이 9-mer이 바인더의 상위 5%에 속하는 것을 나타내는 경우(4개 이상의 HLA 유형에 대해 바인더의 상위 5%에 속할 것으로 예상됨을 의미), 9-mer이 예측된 에피토프("에피토프")로서 간주된다. 대안적으로, 8개의 예측 중 임의의 하나가 9-mer이 바인더의 상위 1%에 속하는 것을 나타내는 경우, 9-mer은 또한 예측된 에피토프로 간주된다.
방법 2: 서열을 MHC-II 결합 일치 방법을 사용하여 분석을 위해 제출하였다(Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. Peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 11:568, 2010; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothe B, Sette A, Peters B. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4),e1000048, 2008 in IEDB (Vita R, Overton JA, Greenbaum JA, Ponomarenko J, Clark JD, Cantrell JR, Wheeler DK, Gabbard JL, Hix D, Sette A, Peters B. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. Jan 28 (43), D405-12, 2015; IEDB MHC-II Binding Predictions, http://www.iedb.org).
소프트웨어의 출력은 결과를 15-mer로 정렬한다. 15-mer 및 HLA 유형의 각각의 조합에 대해 일치 점수 및 백분위수 순위가 제공된다. 그러나, 각각의 15-mer의 일치가 유래된 개별적 점수는 15-mer에서 발견된 특정 9-mer의 순위이다: 일치에 대해 사용된 각각의 방법은 15-mer 내의 9-mer에 대한 백분위수 순위를 보고하고, 전체 15-mer에 대한 값으로서 취해진 일치는 중앙 값을 갖는 9-mer에 대한 예측이다. (a) 15-mer에 대한 일치 대표로 선택되고 (b) 고려 중인 HLA 유형에 대한 바인더의 상위 10%에 속하는 백분위수 순위를 갖고, 기준 (a) 및 (b)가 동일한 9-mer에 대해 3개 이상의 별개의 HLA 유형에 대해 발생하는 경우(즉 3개의 관찰), 9-mer을 에피토프로 분류한다. 고려된 HLA 유형은 DRB1*01, 1*03, 1*04, 1*07, 1*08, 1*11, 1*13 및 1*15였고, 이는 표준 ISPRI/EpiMatrix 리포트에서 동일한 HLA 유형이다. 따라서, 방법의 기본 출력은 15-mer의 순위이고, 방법 1과의 비교의 용이성을 위해 예측된 9-mer 에피토프의 목록을 수득하기 위한 데이터를 재해석한다.
각각의 에피토프를 생식계열 또는 비-생식계열 에피토프로 분류한다. 항체에서, 각각의 에피토프를 항체 내 이의 위치(CDR 또는 비-CDR)를 기반으로 분류한다. IMGT(www.imgt.org)로부터 입수한 인간 V 도메인의 서열을 필터링하여 위유전자 또는 개방형 해독틀(ORF)로 주석이 달린 생식계열을 제거한다. 남아 있는 서열에서 발견되는 임의의 예측된 9-mer 에피토프는 생식계열 에피토프로 간주되었다. J 또는 C 영역에서 발견되는 에피토프(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 또는 이들 영역 사이의 접합부는 또한 생식계열 에피토프로서 분류되었다. 그렇지 않으면, 에피토프는 비-생식계열 에피토프로 분류되었다. CDR 정의는 카바트의 넘버링 체계를 기반으로 하고(문헌[Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991]), 여기서 CDR은 하기 잔기를 포함하는 것으로 정의된다: VH CDR1(삽입, 예컨대 H35A를 포함하나 H36까지는 포함하지 않는 H26-H35), VH CDR2(H50-H65 일체 포함), VH CDR3(H95-H102 일체 포함) VL CDR1(L24-L34 일체 포함), VL CDR2(L54-L56 일체 포함), VL CDR (L89-L97 일체 포함). 예측된 9-mer 에피토프는 이의 아미노산 중 하나가 CDR 영역의 일부인 경우 CDR 에피토프이다. VH CDR1에 대해 선택된 출발 위치(H26)가 카바트 주석을 사용하는 다른 문헌과 상이함을 참고한다.
각각의 쇄의 경우, 또는 항체 VH 및 VL 도메인의 쌍의 경우, 전체 점수는 하기와 같이 구성요소 9-mer 각각을 합함으로써 계산될 수 있다. 9-mer이 에피토프인지 여부에 관계 없이, 9-mer 및 HLA 유형의 모든 개별적인 조합("관찰")을 시험하였다. 특정 관찰이 펩티드가 제시된 HLA 유형에 대해 바인더의 상위 5%에 속하는 것을 나타내는 경우, 이러한 관찰에 대한 EpiMatrix Z-점수가 전체 단백질 서열과 관련된 전체 누계에 더해진다. 또한, 시험된 관찰의 총 수가 기록된다. 유일한 예외는, ISPRI에 의해 "T-레지토프(regitope)"로서 확인된 9-mer에 대한 모든 관찰이 0의 EpiMatrix 점수를 갖는 것으로 가정된다는 것이다. 누계에서, 0.05 * 2.2248의 기저 점수를 각각의 관찰(T- 레지토프를 포함함)로부터 감한다. 최종 점수는 하기와 같이 계산된다:
T-reg 조정된 점수 = (누계) * 1000 / (관찰의 수)
낮은 점수는 낮은 예측된 면역원성 가능성을 나타낸다.
점수는 ISPRI/EpiMatrix로부터의 예측만을 포함하고, IEDB로부터의 정보는 포함하지 않는다. 따라서, ISPRI에 의한 것이 아닌 IEDB에 의해 예측된 임의의 강한 HLA 바인더는 점수에 기여하지 않는다. 이론상, 서열은 많은 IEDB-예측된 HLA 바인더를 함유할 수 있고, EpiMatrix가 또한 동일한 서열을 예상되는 결합제인 것으로 예측하지 않는 경우 유리한 T-reg 조정된 점수를 갖는다.
최적화되지 않은 및 최적화된 GUCY2c VH 및 VL 영역을 생식계열에 대해 정렬한다. 굵은 글씨의 잔기는 상기 인실리코 방법을 사용하여 결정시 T 세포 에피토프 핫 스팟을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 치환은, 인간 아미노산 함량을 증가시키고 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 CDR 잔기가 상응하는 인간 생식계열 잔기로 대체된 인간 생식계열 치환이다(이전에 기재됨). 다른 실시양태에서, 치환은, 항체의 면역원성의 가능성을 감소시키고 항체의 결합 특성을 방해하지 않는 또 다른 아미노산이다.
예를 들어, 인간 생식계열 VH3-7 골격이 예시적 항체 GUCY2C-0241과 함께 사용되는 경우, GUCY2C-0241의 VH CDR2(서열번호 28) 및 인간 생식계열 VH3-7(서열번호 178)의 정렬은 하기 표 29와 같다(카바트 넘버링 체계를 사용함):
[표 29]
Figure 112020139468681-pct00058
위치 51, 52, 59 및 64에서, 인간 생식계열 잔기 및 상응하는 GUCY2C-0241 잔기는 동일하고, 생식계열 치환은 가능하지 않다. 위치 50, 52A, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 63 및 65에서(굵은 글씨), 인간 생식계열 잔기 및 상응하는 GUCY2C-0241 잔기는 상이하다. 인실리코 T 세포 에피토프 평가가 GUCY2C-0241 서열에 대해 수행되는 경우, 잠재적 펩티드 서열이 확인된다(밑줄). 이어서, 이는 비-인간 생식계열 함량에 대해 추가로 분석되고, 10 초과의 T 세포 에피토프 점수를 갖고 비-인간 생식계열인 잔기를 돌연변이 유발을 위해 표적화한다(상기에 굵은 글씨 및 밑줄로 나타냄). 소프트 무작위화 돌연변이 유발을 사용하여(US 9,884,921에 이전에 기재된 방법), 이들 잔기를 돌연변이시키고 유지된 결합 활성 및 유지된 안정성에 대해 시험하였다.
실시예 16: 최적화된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 T 세포 매개된 세포 사멸 활성
최적화된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체를 이전에 기재된 바와 같이 종양 세포의 T 세포 매개된 세포독성에 대해 평가하였다. 최적화된 GUCY2c 이중특이적 항체는 T84 종양 세포의 개선된 T 세포 효율적 T 세포 매개된 사멸을 나타냈다. 인간화된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체(E:T 비 = 5:1)를 사용한 세포 사멸 분석의 결과를 표 30 및 도 4a 내지 4d에 나타냈다.
[표 30]
Figure 112020139468681-pct00059
실시예 17: 시차주사 열량법(DSC) 분석
단백질을 포스페이트 완충된 염수(PBS) 용액에 400 μL의 부피에서 0.6 mg/mL로 희석하였다. PBS를 기준 세포에서 완충제 블랭크로서 사용하였다. PBS는 하기를 함유하였다: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 및 1.47 mM KH2PO4, pH 7.2. 샘플을 오토샘플러(맬번 인스트루먼츠 리미티드(Malvern Instruments Ltd, 영국 맬번 소재))를 사용하여 MicroCal VP-Capillary DSC의 샘플 트레이 내로 분배하였다. 샘플을 5분 동안 10℃에서 평형시킨 후에, 100℃/시간의 속도로 110℃까지 스캐닝하였다. 16초의 여과 시간을 선택하였다. 처리되지 않은 데이터를 기선 보정하고, 단백질 농도를 정규화하였다. Origin 소프트웨어 7.0(오리진랩 코포레이션(OriginLab Corporation, 미국 매사추세츠주 노샘프턴 소재))을 사용하여 적절한 수의 전환과 함께 데이터를 MN2-State 모델에 적합시켰다. scFv-Fc 포맷의 최적화된 항-GUCY2c 결합 도메인의 시차주사 열량법의 결과를 표 31에 나타냈다. 최적화된 클론은 최적화되지 않은 모 클론 GUCY2C-0247(본원에서 scFv-Fc 포맷의 GUCY2C-0295)과 비교하여 개선된 언폴딩 온도(Tm1)를 나타냈다.
[표 31]
Figure 112020139468681-pct00060
실시예 18: CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석
인간 GUCY2c(서열번호 224), 시노 GUCY2c(서열번호 236) 및 뮤린 GUCY2C(서열번호 240)에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 친화도를 BIACORE(상표) T200 기기(지이 헬쓰케어)를 25℃ 및 37℃에서 10 Hz의 수집 속도로 사용하여 결정하였다. 인간 GUCY2c, 시노 GUCY2c 및 마우스 GUCY2c를 아민 커플링 키트(BR100050, 지이 헬쓰케어)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 CM5 센서 칩(BR100530, 지이 헬쓰케어) 표면의 3개의 상이한 유세포에 직접 고정화시켰다. 인간, 시노 및 뮤린 GUCY2c의 최종 고정화 수준은 각각 142 RU(공명 유닛), 61 RU 및 201 RU였다. 유세포 1을 기준 유세포로서 사용하였다. 450 내지 5.56 nM 범위의 농도의 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 3-배 연속 희석물을 센서 표면에 52초 동안 50 μL/분의 유속으로 주입하였다. 해리를 400초 동안 모니터링하고, 표면을 10 mM 글리신(pH 2.1)에 의해 재생시켰다. 러닝 및 샘플 완충제는 10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P-20(HBS-EP+)이었다. 데이터를 이중 참조하였다. 결합 친화도 및 속도 상수를 생성된 센서그램 데이터를 BIACORE(상표) T200 평가 소프트웨어 버전 3.0(지이 헬쓰케어)에서 1:1 랭뮤어 모델에 적합시켜 결정하였다. 인간 CD3(서열번호 242) 및 시노 CD3(서열번호 244)에 대한 GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 친화도를 BIACORE(상표) T200 기기(지이 헬쓰케어)를 25℃ 및 37℃에서 10 Hz의 수집 속도로 사용하여 결정하였다. 인간 CD3 및 시노 CD3을 CM5 센서 칩(BR100050, 지이 헬쓰케어) 표면의 3개의 상이한 유세포에 His 포착 키트(28995056, 지이 헬쓰케어)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 포착하였다. 인간 CD3(서열번호 242)의 포착 수준은 유세포 2 및 3 상에 각각 8 RU 및 16 RU였고, 10 RU의 시노 CD3이 유세포 4 상에 포착되었다. 유세포 1을 기준으로서 사용하였다. 100 내지 3.7 nM 범위의 농도의 GUCy2c 이중특이적 단백질의 3-배 연속 희석물을 센서 표면에 55초 동안 50 μL/분의 유속으로 주입하였다. 해리를 300초 동안 모니터링하고, 표면을 10 mM 글리신(pH 1.5)에 의해 재생시켰다. 러닝 및 샘플 완충제는 10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P-20(HBS-EP+)이었다. 데이터를 이중 참조하였다. 결합 친화도 및 속도 상수를 생성된 센서그램 데이터를 BIACORE(상표) T200 평가 소프트웨어 버전 3.0(지이 헬쓰케어)에서 1:1 랭뮤어 모델에 적합시켜 결정하였다. 분석 방향 및 온도를 포함하는 상이한 조건 하에 인간, 시노 및 마우스 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 BIACORE(상표) 결합 분석의 결과를 표 32A 내지 32J에 나타냈다. 인간화되고 최적화된 GUCY2C 결합 도메인은 이중특이적 항체로서 GUCY2C 및 CD3에 대한 결합을 유지하거나 개선하였음을 나타냈다. 일부 고온(37℃)의 경우에, 결합 친화도의 감소가 관찰되었다.
표 32A는 인간 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-인간 IgG 포착이었다.
[표 32A]
Figure 112020139468681-pct00061
표 32B는 인간 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 직접 고정화였다.
[표 32B]
Figure 112020139468681-pct00062
표 32C는 인간 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 37℃에서 직접 고정화였다.
[표 32C]
Figure 112020139468681-pct00063
표 32D는 시노 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-인간 IgG 포착이었다.
[표 32D]
Figure 112020139468681-pct00064
표 32E는 시노 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 직접 고정화였다.
[표 32E]
Figure 112020139468681-pct00065
표 32F는 시노 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 37℃에서 직접 고정화였다.
[표 32F]
Figure 112020139468681-pct00066
표 32H는 뮤린 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-인간 IgG 포착이었다.
[표 32H]
Figure 112020139468681-pct00067
표 32I는 뮤린 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 직접 고정화였다.
[표 32I]
Figure 112020139468681-pct00068
표 32J는 뮤린 GUCY2c에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 37℃에서 직접 고정화였다.
[표 32J]
Figure 112020139468681-pct00069
표 33A 내지 33F 분석 방향 및 온도를 포함하는 상이한 조건 하에 인간 및 시노 CD3에 대한CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 BIACORE(상표) 결합 분석을 나타낸다.
표 33A는 인간 CD3 단백질에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-인간 IgG 포착이었다.
[표 33A]
Figure 112020139468681-pct00070
표 33B는 인간 CD3에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-His였다.
[표 33B]
Figure 112020139468681-pct00071
표 33C는 인간 CD3에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-His였다.
[표 33C]
Figure 112020139468681-pct00072
표 33D는 시노 CD3에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-His였다.
[표 33D]
Figure 112020139468681-pct00073
표 33E는 시노 CD3에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-His였다.
[표 33E]
Figure 112020139468681-pct00074
표 33F는 시노 CD3에 대한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. 사용된 포착 방법은 25℃에서 항-His였다.
[표 33F]
Figure 112020139468681-pct00075
실시예 19: CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 시험관내 시토카인 방출 측정
T84 세포를 T 세포(5:1의 E:T 비) 및 GUCY2C-1608로 상이한 투여량으로 처리하였다. 상청액을 상이한 시점(24시간, 48시간, 96시간)에서 수집하고 멀티플렉스 루미넥스 어세이를 제조사의 가이드라인에 따라 사용하여 분석하고 루미넥스 200 상에서 xPONENT 소프트웨어를 사용하여 판독하였다. 측정한 시토카인은 인간 IFN-감마, IL10, IL2, IL4, IL6, TNF-알파였다. 도 5a 내지 5f는 GUCY2C-1608에 대한 시토카인 방출 프로필을 나타낸다. 이들 시토카인은 T 세포의 존재 하에 T84 세포의 GUCY2C-1608 처리에 의해 상향조절되고, 이는 GUCY2c 발현 세포에서 T-세포 매개된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체 활성의 메커니즘을 뒷받침한다.
실시예 20: CD3-GUCY2c 이중특이적 항체 매개된 활성의 생체내 평가
인간 PBMC를 배지(X-VIVO 15(Lonza), 5% 인간 혈청 알부민(Gemini #100-318), 1% Penn/Strep, 0.01 mM 2-머캅토에탄올) 내로 약 5x106 세포/mL로 해동하였다. 세포를 스핀 다운시키고 Robosep 완충제(스템 셀 테크놀로지스)에 5x107 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. T 세포를 EasySep 인간 T 세포 강화 키트(스템 셀 테크놀로지스)를 사용하여 단리하였다. T 세포를 인간 T 세포 활성화/확장 키트(밀테나이(Miltenyi))를 사용하여 활성화시키고 확장시켰다. 제2일에, T 세포를 G-Rex 세포 배양 장치로 확장을 위해 옮기고, IL-2(스템 셀 테크놀로지스)를 배지에 첨가하고 2일 후에 보충하였다. T 세포를 활성화/확장 1주일 후에 채취하였다. 채취시, 비드를 자석에 의해 제거하고, 세포를 생체내 접종을 위해 DPBS에 1x107 세포/mL로 재현탁하였다.
이종이식 연구를 위해, NSG 마우스에게 대장 종양 세포주(T84, H55, LS1034) 또는 환자 유래된 이종이식편(PDX-CRX-11201, PDX-CRX-12213, PDX-CRX-24225) 단편을 피하로 옆구리에 접종하였다.
종양 측정치를 디지털 버니어 캘리퍼를 사용하여 수집하고, 부피를 변형된 타원 식 ½ × 길이 × 너비2을 사용하여 계산하였다. 마우스를 무작위화시키고 150 내지 200 mm3의 종양 크기로 준비하였다. 초기 투여량의 GUCY2c 이중특이적 항체, 음성 대조군 이중특이적 항체 또는 비히클을 동물에게 제0일에 투여하고, 2x106개의 배양된 T-세포를 다음날에 접종하였다. 마우스에게 0.2 mL의 볼루스 주사를 매주 최대 5회 투여하였고, 모든 화합물 및 T-세포 투여를 각각의 동물의 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 수행하였다. 이식편 대 숙주 반응의 신호에 대한 연속된 모니터링과 함께 종양 측정치를 1주일에 2회 수집하였다(도 6 내지 15). 모든 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체는 세포주 이종이식 및 환자 유래된 이종이식 모델 둘 모두에서 투여량 의존적 T-세포 매개된 항종양 활성을 나타냈다.
실시예 21: 잠재적 GUCY2c 경로 조절 활성에 대해 GUCY2c-CD3 이중특이적 항체를 특성규명하기 위한 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 분석
GUCY2c 경로 자극에 대한 반응으로 T84 세포에 의한 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 생산을 시험하기 위해, 2 x106 T84 세포를 24 웰 플레이트에 밤새 플레이팅하였다. 세포를 50 mM HEPES를 함유하는 DMEM으로 세척하고 50 mM HEPES 및 1 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX)을 함유하는 DMEM으로 15분 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 GUCY2C-1608 또는 음성 대조군 이중특이적 항체로 0.1 내지 99 μM 범위의 농도에서 처리하였다. 양성 대조군으로서, GUCY2c 작용제, 장독소 STp(BACHEM)를 45분 동안 첨가하였다(0.02 내지 51 μM). 미립자를 원심분리에 의해 제거하고, 200 μL의 상청액을, cGMP 파라미터 분석 키트(알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 제조사의 가이드라인에 따라 사용하여 cGMP 생산에 대해 분석하기 위해 사용하였다. GUCY2C-1608의 잠재적 무효화 활성을 평가하기 위해, 0.2 μM의 STp를 동일한 범위의 GUCY2C-1608 또는 음성 대조군 이중특이적 항체에 상기에 기재된 바와 같이 45분 동안 첨가하고, 상청액을 cGMP 수준에 대해 유사하게 분석하였다.
GUCY2c 경로 활성을 cGMP 생산을 측정함으로써 T84 세포에서 평가하였다. GUCY2c 경로 작용제 박테리아 장독소 STp가 투여량 의존적 방식으로 cGMP를 증가시킨 반면에, cGMP 생산은 증가하는 농도의 GUCY2C-1608의 첨가에 의해 증진되지 않았다. 또한, GUCY2C-1608은 0.2 μM STp에 의해 유도된 cGMP 생산에 영향을 미치지 않았다(도 16). 이러한 결과는, GUCY2C-1608이 GUCY2c 경로 작용제가 아니며 리간드의 존재 하에 GUCY2c 경로 기능을 무효화시키지 않음을 시사한다.
실시예 22: DNA 및 인슐린 다중특이성 ELISA
표적 이외에 분자에 대한 항체의 비특이적 결합은 생체내 신속한 클리어런스의 메커니즘으로 제안되었다(문헌[Hotzel et al., 2010, MAbs 4(6):753-760]). 이러한 다반응성의 비-표적 결합의 증거는, 막 표본(문헌[Xu et al., Protein Eng. Des. Select. 26(10):663-70, 2013]), 배큘로 바이러스 입자(문헌[Hotzel et al., mAbs 4, 753-760, (2012)), 또는 음성-하전된 기질, 예컨대 DNA, 인슐린 및 헤파린(문헌[Tiller et al., J. Immunol. Methods 329(1-2):112-124, 2008])에 대한 결합의 측정을 통해 수득될 수 있다. DNA 및 인슐린에 대한 ELISA는 루푸스 환자의 저 친화도 자기 항체의 검출을 위해 본래 개발된 저 엄격성 프로토콜을 사용하였다(문헌[Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008]; US 7,314,622).
384-웰 ELISA 플레이트(Nunc Maxisorp)를 밤새 4℃에서 PBS(pH 7.5) 중의 DNA(10 μg/mL) 및 인슐린(5 μg/mL)으로 코팅하였다. 문헌[Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008] 및 US 7,314,622에 기재된 분석으로부터 변경된 ELISA를 퍼킨엘머 야누스 액체 핸들링 로보트 상에서 수행하였다. 웰을 물로 세척하고 50 μL의 다반응성 ELISA 완충제(PEB; 0.5% Tween-20 및 1 mM EDTA 함유 PBS)로 1시간 동안 실온에서 차단하고 3회 물로 헹궜다. 25 μL에 연속 희석된 mAb를 웰에 4중 실험으로 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 3회 물로 세척하고 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 25 μL의 10 ng/mL 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)(잭슨 이뮤노리서치)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 배양하고 3회 80 μL의 물로 세척하고 25 μL의 TMB 기질(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))을 각각의 웰에 첨가하였다. 반응을 6분 50초 후에 25 μL의 0.18 M 오쏘-인산을 각각의 웰에 첨가함으로써 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다. DNA- 및 인슐린-결합 점수를 10 μg/mL에서 항체의 ELISA 신호 대 완충제 함유 웰의 신호의 비로서 계산하였다. 표 34는 DNA 및 인슐린 결합 ELISA를 사용한 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체의 다중특이성 분석을 나타낸다. 최적화된 이중특이적 항체는 비-특이적 결합에 대해 낮은 가능성을 나타낸다.
[표 34]
Figure 112020139468681-pct00076
실시예 23: 친화도 포착 자기-상호작용 나노 입자 분광학(AC-SINS)
항체 및 항체-유사 단백질은 특히 증가된 농도에서 자신과의 상호작용에 대한 가능성을 갖는다. 이러한 자기-상호작용은 약물 개발 동안 제형과 관련된 점도 문제 및 클리어런스의 증가된 위험을 야기할 수 있다(문헌[Avery et al., mAbs, 2018, Vol. 0, N0. 0, 1-12]). 친화도 포착 자기-상호작용 나노 입자 분광학 분석은 자기-상호작용을 측정하고, 고 점도, 및 불량한 약동학적 특성에 대한 가능성을 예측하는 것을 보조하는 데 사용된다.
AC-SINS 분석은 퍼킨-엘머 야누스 액체 핸들링 로보트 상에서 384-웰 포맷으로 표준화된다. 20 nm 금 나노 입자(테드 펠라 인코포레이티드(Ted Pella, Inc.) #15705)를, 20 mM 아세트산 나트륨(pH 4.3)으로 완충제 교환되고 0.4 mg/mL으로 희석된, 80% 염소 항-인간 Fc(잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈 인코포레이티드 # 109-005-098) 및 20% 비특이적 염소 다클론 항체(잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈 인코포레이티드 # 005-000-003)의 혼합물로 코팅하였다. 실온에서 1시간의 배양 후에, 금 나노 입자 상의 비점유된 부위를 티올화된 폴리에틸렌 글리콜(2 kD)로 차단하였다. 이어서, 코팅된 나노 입자를 시린지 필터를 사용하여 10-배 농축하고, 10 μL를 PBS(pH 7.2)에서 100 μL의 mAb에 0.05 mg/mL에서 첨가하였다. 코팅된 나노 입자를 해당 항체와 함께 2시간 동안 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 배양한 후에, 384-웰 폴리스티렌 플레이트에 옮기고, 테칸 M1000 분광광도계 상에서 판독하였다. 흡광도를 450 내지 650에서 2 nm 증분으로 판독하고, 마이크로소프트 엑셀 매크로를 사용하여 최대 흡광도를 확인하고 데이터를 평활하고 데이터를 이차 다항식을 사용하여 적합하였다. 평균 블랭크(PBS 완충제 단독)의 평활된 최대 흡광도를 항체 샘플의 평활된 최대 흡광도로부터 감하여 항체 AC-SINS 점수를 결정하였다. 표 35는 최적화된 CD3-GUCY2c 이중특이적 항체에 대한 AC-SINS 비-특이성 분석이 자기-상호작용 및 비-특이성에 대한 낮은 가능성을 나타냄을 보여준다.
[표 35]
Figure 112020139468681-pct00077
실시예 24: GUCY2c-1608 이중특이적 항체의 안정한 세포주 생산, 발현 및 정제
GUCY2C-1608 이중특이적 항체를 암호화하기 위한 2개의 쇄를 이중 프로모터, 및 CHO 세포 게놈 내로의 단일 부위 통합(SSI)(문헌[Zhang, L. et al. Biotechnology Progress., 31: 1645-1656, 2015)을 위한 재조합 부위를 함유하는 포유동물 발현 벡터 pRY19-GA-Q 내로 클로닝하였다. SSI는, 고 안정성 유전자 발현에 대해 공지된 염색체 위치에서 재조합 효소-기반 카세트 교환을 사용하여 해당 유전자의 삽입을 의존한다. GUCY2C-1608-홀 및 GUCY2C-1608-놉 구축물을 각각 카세트 1 및 2에서 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 생산된 GUCY2C-1608 플라스미드를 해당 유전자를 함유하는 pRY19 벡터를 사용하여 전기천공을 통해 CHO-K1 SV 10E9 세포 내로 형질감염시킨 후에, 히그로마이신(hygromycin)-B 및 간시클로비르(ganciclovir)를 사용한 양성 및 음성 선택압이 수행되었다. 이러한 CHO 풀은 3주의 회복 단계를 거쳤다. 관찰된 생존능이 90%를 초과할 때, 세포 은행을 미래 작업을 위해 생산하였다. 생산된 CHO 풀을 CD-CHO 배지(써모피셔 사이언티픽(미국 매사추세츠주 월탐 소재))에서 12-일 유가식 플랫폼 발현 처리를 거치도록 했다. 12-일 처리의 말에, 세포를 3000 x g에서 10분 동안 원심분리한 후에, 0.2 μm PES 병 뚜껑 필터(코닝(Corning, 미국 뉴욕주 오넌타 소재))를 사용하여 컨디셔닝된 배지를 멸균 여과하였다. 또한, 안정한 CHO 풀을 10 L 조절된 록킹 생물 반응기(피네스(Finesse, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재))에 맞게 확장하였다. CHO 풀을, 배양물 생존능을 유지하기 위해 화학적으로 정의된 공급물을 포함하는 화이자 전매 배지에서 12-일 유가식으로 성장시켰다. 완료되었을 때, 배양물을, 20" 5 μm Pall Profile II, 이어서 10" 0.2 μm Pall Supor(팔 코포레이션(Pall Corporation, 미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재))로 이루어진 필터 트레인을 사용하여 심층 여과하였다. 역가를 단백질-A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 평가하였다. 이어서, 단백질 정제를 단백질 A 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 당분야에 공지된 기술을 사용하여 수행하였다. 안정하게 형질감염된 CHO 세포 풀로부터의 GUCY2C-1608에 대한 단백질 발현 역가를 표 36에 타나냈다. GUCY2C-1608 클론 풀에 대한 발현 역가는 0.48 내지 0.84 g/L의 발현 수준을 나타냈다.
[표 36]
Figure 112020139468681-pct00078
실시예 25: GUCY2C-1608 이중특이적 항체의 질량 분광계 분석
LC/MS 분석을 수행하여 바르게 쌍을 이룬 GUCY2C-1608 정제된 이중특이적 항체의 생산을 확인하였다. 이중특이적 분자의 분자량은 이의 고유한 아미노산 서열에 의해 정의되고, 정확한 분자량 결정은 바르게 쌍을 이룬 GUCY2c 이중특이적 분자의 존재에 대한 증거를 제공한다. 간략히, CD3-GUCY2c 이중특이적 샘플을, Bruker maXis II Q-ToF 질량 분광계와 연결된 Waters Acquity H-클래스 HPLC 상에서 LC/MS 분석에 의해 분석하였다. 분석물을 SMT SAM C2 컬럼(2.1 mm X 100 mm, 80℃에서 유지)에 적재하고 완충제 B(80% 1-프로판올, 20% 아세토니트릴, 및 0.05% 트라이플루오로아세트산) 및 완충제 C(100% 아세토니트릴 및 0.05% 트라이플루오로아세트산)의 삼원 구배를 300 μL/분의 유속으로 사용하여 용리하였다(5분 19% B 및 4% C로 증감, 20분 22% B 및 16% C로 증감, 10분 0% B 및 98% C로 증감). 질량 분광계 검출을 모세관 전압을 3.5 kV로 설정하여 양성 모드로 수행하였다. 데이터 분석을 Compass 데이터분석 v4.2의 MaxEnt 1 디콘볼루션에 의해 수행하였다. 도 17은 최종 정제된 GUCY2C-1608 이중특이적 항체의 예측된 분자량에서의 고 순도를 나타낸다.
실시예 26: 서열
표 37A 및 37B은 본원에 논의된 서열번호의 항체 또는 항체 단편의 요약을 제공한다. 표 37A는 VH CDR1 서열에 대해 ABM 넘버링 체계를 사용한다. 표 37A는 VH CDR2를 포함하는 모든 다른 서열에 대해 카바트 넘버링 체계를 사용한다.
[표 37A]
Figure 112020139468681-pct00079
[표 37B]
Figure 112020139468681-pct00080
표 38은 본원에 언급된 서열을 제공한다.
[표 38]
Figure 112020139468681-pct00081
Figure 112020139468681-pct00082
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본 발명의 항체 서열은 Abysis AbM을 사용하여 넘버링된다. Abysis AbM 넘버링 체계는 카바트 넘버링을 부여하고 CDR H1을 제외하고 카바트 규칙에 따라 각각의 CDR의 시작부 및 단부를 결정한다. CDR H1은 AbM 정의에 따라 결정된다.
실시예 27: 3개의 항-CD3 변이체가 GUCY2C-CD3 이중특이적 항체에서 개선된 친화도 및 세포독성을 나타낸다.
2B5v6으로부터 유래된 3개의 항-CD3 변이체 2B5-1038(서열번호 273 및 274), 2B5-1039(서열번호 273 및 275) 및 2B5-1040(서열번호 273 및 276)을, 본원 상기에 기재된 표준 클로닝, 발현 및 정제 기술을 사용하여 도 1에 나타낸 배열 중 하나의 항종양 GUCY2c 항체 서열과 쌍을 이룬 이중특이적 다이아바디-Fc 분자로 재포맷화시켰다. 표 39에 나타낸 생산된 이중특이적 항체를 T-세포 재표적화 분석을 사용하여 시험관내 세포 독성, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 사용하여 결합 친화도, 및 AC-SINS에 의해 비특이성에 대해 시험하였다. 면역원성 위험을 잠재적 T-세포 에피토프의 인실리코 예측을 위한 Epivax 툴에 의해 평가하였다. 온전한 질량 분광법 데이터는 모든 이중특이적 항체가 바르게 쌍을 이룬 100% 이종이량체임을 시사한다. 표 39는 3개의 이중특이적 항체 모두가 (1) 항-CD3 2B5v6과 쌍을 이룬 대조군 이중특이적 GUCY2C-1608과 비교하여 시험관내 세포독성에서 약 2-배 더 강하고(도 18); (2) SPR에 의해 측정시, 세포독성 활성에 부합하는 재조합 인간 CD3에 대한 결합 친화도를 갖고; (3) 대조군에 비해 개선된 면역원성 점수를 갖고; (4) AC-SIN 점수가 대조군 이중특이적 GUCY2C-1608과 동일하게 유지됨을 나타낸다.
[표 39]
Figure 112020139468681-pct00146
실시예 28: 항-GUCY2c 항체 결합 도메인의 친화도 성숙
GUCY2c에 대한 항-GUCY2c 항체 결합 도메인의 친화도를 증가시키기 위해, 파지 디스플레이 접근법을 사용하였다. 4개의 파지 디스플레이 라이브러리를 전술된 방법을 사용하여 설계하고 생산하였다. 라이브러리를, 돌연변이를 항-GUCY2C-1608(서열번호 221)의 CDR H1, H2 및 H3 및 CDR L1 내로 도입하여 생산하였다. 파지 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 구조하고 표 40에 개괄된 경쟁적 선택 전략을 사용하여 선택하였다. 라운드 1에서, 파지를 비오티닐화된 인간 GUCY2c(5 nM; 서열번호 232)와 복합화된 스트렙타비딘 비드와 함께 배양하였다. 3회 세척 후에, 100배 초과의 비오티닐화되지 않은 항원(500 nM)을 반응 생성물에 첨가하고, 혼합물을 밤새 4℃에서 회전시켰다. 비드를 다음날에 세척하여 비드로부터 해리된 파지를 제거하고, 남아 있는 결합된 파지를 TEA를 사용하여 용리하였다. 라운드 2에서, 선택을 임의의 경쟁 없이 0.5 nM 항원에 대해 상기와 같이 반복하였다. 콜로니를 고르고, 주변세포질 표본을 이전에 기재된 바와 같이 생산하였다. 클론을 전술된 경쟁 ELISA를 사용하여 개선된 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 모 물질과 비교하여 개선된 결합을 나타내는 클론을 추가적 분석을 위해 선택하였다. 스크리닝 후에, DNA 서열 결정을 전술된 바와 같이 상위 클론에 대해 수행하여 개선된 GUCY2c 결합 활성에 기여하는 돌연변이를 확인하였다.
초기 친화도 성숙 라이브러리 선택 후에, 상위 히트로부터의 CDR 영역을 새로운 라이브러리로 합하고, 추가적 파지 디스플레이 선택을 표 41에 개괄된 바와 같이 수행하였다. 라운드 1 선택을, 0.5 nM 비오티닐화된 항원을 사용한 것을 제외하고, 초기 친화도 라이브러리 선택에 대해 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 라이브러리에 대하여, 선택 전에 파지가 65℃ 배양되거나 배양되지 않는 2개의 라운드 2 선택 브랜치가 존재하였다. 파지 선택 후에, 콜로니를 고르고, 주변세포질 표본을 이전에 기재된 바와 같이 생산하였다. 클론을 전술된 경쟁 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 스크리닝 후에, DNA 서열 결정을 상위 클론에 대해 수행하여 개선된 GUCY2c 결합 활성에 기여하는 돌연변이를 확인하였다. 표 40 및 41은 친화도 성숙 라이브러리에 대해 사용된 파지 디스플레이 선택 전략을 나타낸다(C = 라이브러리; R = 라운드; Dslxn = 선택 해제 조건; Therm = 열적 조건; SA = 스트렙타비딘; D = DNA; I = 인슐린; M = 막 추출물).
[표 40]
Figure 112020139468681-pct00147
[표 41]
Figure 112020139468681-pct00148
periprep 경쟁 ELISA에 의해 측정시 개선된 친화도를 나타내는 GUCY2c 항체 클론의 아미노산 서열을 모 클론 GUCY2C-1608(VH 서열번호 73 및 VL 서열번호 147)에 대해 비교하였다. 개선된 안정성을 야기하는 VH CDR의 아미노산 함량 변화를 표 42A에 나타냈다. 위치 54, 55, 56, 97 및 99의 변화는 친화도에 가장 크게 영향을 미치는 것으로 나타났고, 이는 시간 분해 형광의 최대 변화와 관련된다(카바트 넘버링 체계에 따르고, AbM 정의를 VH CDR1에 대해 사용함).
[표 42A]
Figure 112020139468681-pct00149
periprep 경쟁 ELISA에 의해 측정시 개선된 친화도를 야기하는 VL CDR의 아미노산 함량 변화를 표 42B에 나타냈다(초티아의 넘버링 체계를 VL CDR1에 대해 사용하였음). VL CDR1의 위치 30, 30a 및 30d의 변화는 친화도에 대해 가장 크게 영향을 비치는 것으로 나타났고, 이는 시간 분해 형광의 최대 변화와 관련된다.
[표 42B]
Figure 112020139468681-pct00150
주변세포질 표본으로서 scFv 포맷에서 스크리닝 후에, 상위 클론으로부터의 VH 및 VL 서열을 완전 인간 IgG1/카파 포맷으로 클로닝하였다. VH 및 VL 유전자를 파지 벡터로부터 PCR 증폭시키고 전술된 분자생물학 기술을 사용하여 인간 IgGI 및 인간 카파 벡터 내로 서브클로닝하였다. 이어서, 이들 상위 친화도 성숙된 클론의 인간 IgG1 버전을 전술된 방법을 사용하여 일시적으로 발현시키고 정제하였다. 이어서, 정제된 단백질을 인간 GUCY2c 재조합 단백질(서열번호 232)에 대해 이전과 같이 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석하였다. 표 43은 IgG 형태의 모 GUCY2C-1608(GUCY2c-1640; 서열번호 214 및 223)과 비교한 친화도 성숙된 클론에 대한 결합 속도(ka), 해리 속도(kd) 및 평형 상수(KD)를 나타낸다. 여러 변이체는 모 항체와 비교하여 3.4-배 개선된 친화도를 나타낸다. 표 44는 이들 GUCY2C-1608의 친화도 성숙된 버전에 대한 완전 VH 및 VL 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 43]
Figure 112020139468681-pct00151
[표 44]
Figure 112020139468681-pct00152
Figure 112020139468681-pct00153
실시예 29: GUCY2C 세포외 도메인의 펩티드 맵핑에 의한 에피토프 결정
펩티드 맵핑을 수행하여 GUCY2c 세포외 도메인(ECD) 상의 에피토프를 결정하고, 여기서 선두 GUCY2c 항체가 결합한다. 이러한 접근법에서, 15 aa 오버랩을 갖는 20-mer 펩티드를, 아미노산 1 내지 440으로 이루어진 GUCY2c의 막경유 도메인으로 전체 세포외 도메인으로 덮도록 생산하였다(표 45). 펩티드를 합성하고 동결건조된 포맷으로 어레이로서 제공하였다(뉴 잉글랜드 펩티드(미국 매사추세츠주 가드너 소재)). 어레이를 아세토니트릴에 의해 100 μg/mL으로 재구성한 후에, 나트륨 카보네이트/바이카보네이트 완충제에 의해 20 μg/mL로 추가로 희석하였다. 이어서, 정제된 항체 또는 GUCY2c-CD3 이중특이적 항체를, 희석된 펩티드를 표적 항원으로서 사용하여, 이전에 논의된 Delfia ELISA 방법을 사용하여 상이한 펩티드에 대한 결합에 대해 Delfia ELISA에 의해 시험하였다. GUCY2C-1608은 시간 분해된 형광(TRF)에 의해 측정시 펩티드 19 및 20(서열번호 334 및 335)에 대한 강한 결합을 나타냈다. 모든 펩티드에 대한 GUCY2C-1608의 TRF 결합 데이터를 표 45에 나타냈다. 서열 NSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRM(서열번호 405)은 이들 펩티드에 의해 걸쳐 이어진다. 펩티드간 중첩 영역은 RSSTCEGLDLLRKIS(서열번호 406)이고, 이는 영역 내 에피토프를 나타낸다.
[표 45]
Figure 112020139468681-pct00154
Figure 112020139468681-pct00155
Figure 112020139468681-pct00156
Figure 112020139468681-pct00157
이어서, GUCY2c 펩티드 19(서열번호 334)를 전술된 방법을 사용하여 경쟁 DELFIA ELISA에서 완전 세포외 도메인과 경쟁시키켰고, 완전 세포외 도메인과 효과적으로 경쟁하는 것으로 나타났다(도 19). 이는 펩티드 19(서열번호 334)가 GUCY2C-1608이 완전 GUCY2c 세포외 도메인 상에 결합하는 특이적 에피토프를 함유함을 시사한다.
GUCY2C-1608은 항체 MS20과 다른 GUCY2c ECD 에피토프에 결합한다.
또한, GUCY2c 세포외 도메인에 대한 GUCY2C-1608 결합을 공지된 항-GUCY2c 항체와 비교하였다. US 2013/315923에 개시된 항체 MS20은 보고된 에피토프를 갖지 않았다. 이러한 항체를 GUCY2C-1608과 비교하기 위해, 경쟁 Delfia ELISA를 전술된 Delfia 경쟁 ELISA의 변형된 방법을 사용하여 수행하였다. 여기서, 인간 GUCY2c 단백질(서열번호 232)을 이전과 같이 플레이트 상에 코팅하였다. GUCY2C-1640(GUCY2C-1608의 IgG 버전; 서열번호 214 및 223) 또는 MS20 항체를 20 μg/mL에서 출발하여 연속 희석한 후에, 250 ng/mL(개별적으로 결정된 EC50 값)의 GUCY2C-0098의 토끼 키메라 IgG 버전(서열번호 440 및 441, 이는 토끼 불변 도메인에 융합된 서열번호 26 및 106으로 이루어짐)과 조합하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 1:1000 희석된 이차 항-토끼 유로퓸 항체(퍼킨 엘머)의 검출을 위해 첨가하였다. TRF 신호를 이전과 같이 검출하였다. TRF 신호의 감소는 GUCY2C-0098의 토끼 키메라 버전이 인간 GUCY2c에 대한 결합으로부터 대체되기 때문에 경쟁적 결합을 시사한다. 예상되는 바와 같이, GUCY2C-1640은 GUCY2C-0098의 토끼 키메라 버전을 대체하는 반면에, MS20은 그렇지 않다(도 20). 따라서, GUCY2C-1608은 MS20 항체와 상이한 GUCY2c ECD 에피토프에 결합한다.
실시예 30: GUCY2c-1608은 항체 5F9와 상이한 GUCY2c ECD 에피토프에 결합한다.
US 2011/0110936에 기재된 항체는 본원 하기에 기재되는 펩티드 19(서열번호 334)와 상이한 GUCY2c ECD 상의 에피토프 서열에 결합하는 것으로 보고되었다.
인간, 래트 및 닭 GUCY2c(각각 CID1814, 1815 및 1818), 점 돌연변이체 CID1941 내지 1950, "패치" 돌연변이체 CID1868 내지 1873(패치 돌연변이체는 닭 GUCY2c에서 동일한 위치로부터 아미노산 잔기에 의해 대체된 2 내지 5개의 인간 GUCY2c 아미노산 잔기로 이루어진다) 또는 인간-닭 GUCY2c 키메라 CID1874 내지 1881(닭 GUCY2c 잔기에 의해 대체된 5개 초과의 인간 GUCY2c 아미노산) 또는 확인용 역 키메라 CID1939 및 1940(인간 GUCY2c 잔기에 의해 치환된 5개 초과의 닭 GUCY2c 아미노산) 또는 음성 대조군 CID1431(효모 표면 상에 발현된 다른 구축물과 동일한 에피토프 태그를 갖는 음성 대조군 구축물)을 발현하는 3x10e6 세포를 96-웰 플레이트에 웰 마다 첨가하였다. 세포를 항-V5(Abcam 27671) 항체, 일가 또는 이가 항-GUCY2c 항체, 항체 GUCY2C-1608 또는 항체 5F9 항체(US 2011/0110936에 기재된 밀레니엄 항체)와 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 이어서, 세포를 3회 PBS + 0.5% BSA 완충제로 세척하였다. 이어서, 세포를 PE-접합된 항-마우스 IgG 또는 PE-접합된 항-인간 IgG 또는 PE-접합된 항-HA 항체(밀테나이 바이오텍 130-092-257)와 함께 30분 동안 4℃에서 어두운 곳에서 배양하였다. 세포를 3회 PBS+ 0.5% BSA 완충제로 세척한 후에, 유세포 분석계 상에서 분석하였다.
세포에 대한 항-GUCY2c 항체 결합의 MFI(중간 형광 강도)를 항-tag 항체의 MFI에 의해 측정된 세포 표면 상의 발현에 대해 정규화하였다. 모든 세포는 발현 정규화를 위해 세포 표면 상에 V5 및 HA를 발현하였다. 표 46은 각각의 GUCY2c 구축물에 대한 항-GUCY2c 항체의 정규화된 상대적 결합을 나타낸다. 항-GUCY2c Ab에 결합하지 않는 키메라(CID1939 및 CID1940 제외), 점 돌연변이체 및 패치 돌연변이체는 이들 구축물에서 변한 GUCY2c 잔기가 항체에 대한 결합에 중요하다는 것을 시사한다. 역 키메라 CID1939 및 CID1940에 대한, 항체 5F9가 아닌 GUCY2C-1608의 결합의 회복은 항체 GUCY2C-1608이 GUCY2c(서열번호 224) 상의 잔기 68 내지 87에 결합하는 것을 확인시켜주고, 항체 5F9의 결합 부위가 항체 GUCY2C-1608의 것과 중첩되지 않음을 나타낸다.
[표 46]
Figure 112020139468681-pct00158
Figure 112020139468681-pct00159
실시예 31: 항-GUCY2C-1608 scFv + GUCY2c-펩티드 복합체의 결정화 및 구조 결정
결정화 시험을 위해, GUCY2C-1608 scFv(서열번호 409)와 GUCY2c- ECD 펩티드 번호 19 68NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS87(서열번호 334) 사이의 복합체를 1:1.2 몰비로 생산하고 TBS(pH 7.5) 함유 단백질 용액에서 8.8 mg/mL로 농축하였다. 결정을 현적(hanging-drop) 증기 확산법에 의해 20% PEG 3350, 200 mM 리튬 설페이트, bis-tris(pH 5.5)를 함유하는 조건으로부터 수득하였다. 막대형 결정은 단사정계 공간군 P212121에 부합하는 대칭을 가졌다(여기서 셀 파라미터 a=70.68 Å; b=80.57 Å; c= 90.7 Å; GUCY2C-1608 scFv-펩티드 복합체의 2개의 카피는 결정학적 비대칭 유닛으로 존재). 결정을 20% 에틸렌 글리콜을 함유하는 저장 용액을 사용하여 냉동 방지하였고, 액체 질소에서 플래쉬 냉동하였다. 1.6 Å 분해능에 대한 데이터 세트를 아르곤 국립 연구소(APS)에서 IMCA beamLine 17-ID에서 단일 동결된 결정으로부터 수집하였다. 데이터를 autoPROC를 사용하여 처리하고 확장시켰고, 최종 데이터 세트는 71.4% 완료되었다.
항-GUCY2c CD3 이중특이적 구조물로부터 수득한 단일 쇄 Fv 단편에서 출발하여 PHASER을 사용한 분자 대체에 의해 구조를 해석하였다(도 22). GUCY2C-1608 scFv의 2개의 카피에 대해 조사함으로써 해석을 수득하였다. 모델로서 GUCY2C-1608 scFv의 2개의 카피를 사용하여 계산하여 생성된 전자 밀도 맵은, 각각 GUCY2C-1608 scFv의 상응하는 카피에 결합하는 2개의 펩티드에 대한 과중한 전자 밀도를 분명하게 나타냈다.
COOT를 사용한 여러 반복된 라운드의 수동 조정 및 모델 리빌딩, 및 autoBUSTER을 사용한 결정학적 보정으로 GUCY2C-1608 scFv + 펩티드의 최종 모델을 산출하였고, 여기서 결정학적 Rwork는 19.7%이고, Rfree는 21.7%이다(여기서 Rwork= ||Fobs| - |Fcalc|| / |Fobs|; Rfree는 Rwork와 동일하나, 보정 처리가 생략된 반영물의 무작위로 선택된 5%에 대해 계산된다).
A. GUCY2C-1608 scFv -펩티드 구조의 설명
17-잔기 길이의 GUCY2c-펩티드는 GUCY2C-1608 scFv의 CDR-영역에 대한 결합시 대부분 α-나선 형태를 채택한다(도 21). α-나선은 펩티드의 N-말단에 대해 다이설파이드 SS-결합-제한된다. 상호작용 하에 숨겨진 전체 결합 접점 영역은 약 1,320 Å2이고, 이는 놀랍게도 단지 17개의 아미노산 잔기 길이의 단편에 대해 크다. 결합 접점은 대게 일부 특정 극성 접촉부에 대해 이의 중심에서 대게 소수성이고, 이의 주변부에서 수소 결합한다(도 21).
GUCY2C-1608 scFv에 대해 3.8 Å 이하인 결합 에피토프 접촉부는 펩티드 서열에서 밑줄 친 잔기에 의해 정의되고(68NS GDCRSSTCEGLDLLRKI S87), 표 47에 나열하였다. 결합 접점에 대해 75% 초과의 표면적이 기여하는 아미노산을 굵은 글씨로 강조하였다. GUCY2C-1608 scFv의 결합 파라토프는 5개의 CDR-영역에 의해 정의된다: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1 및 CDR-L3. 3.8 Å 이하의 접촉부에 수반되는 GUCY2C-1608 scFv(파라토프) 및 GUCY2c-펩티드(에피토프)의 아미노산을 표 48에 나열하였다.
[표 47]
Figure 112020139468681-pct00160
[표 48]
Figure 112020139468681-pct00161
B. 항-GUCY2c CD3 이중특이적 항체의 결정화 및 구조 결정
결정화 시험을 위해, 변경된 버전의 GUCY2C-1608을 정제를 보조하기 위해 각각의 VL-VH 서브유닛 쇄의 C-말단에 His6 태그 또는 FLAG 태그를 갖도록 생산하였다. 결정학을 위한 GUCY2c CD3 이중특이적 항체를 서열 GUCY2C-1637 VH(서열번호 407) 및 GUCY2C-1637 VL(서열번호 408)을 사용하여 생산하였다. 구축물을 전술된 바와 같이 FreeStyle(상표) 293 HEK 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 컨디셔닝된 배지의 채취 후에, TBS에 사전 평형시킨 2.5 mL의 Ni-NTA 수지를 1시간 동안 4℃에서 오비탈 혼합기 상에서 단백질에 배취-결합시켰다. 이어서, 수지를 수집하고 Applied Biosystems 컬럼(라이프 테크놀로지스(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재))에 두었다. 수지를 먼저 먼저 기선까지 완충제 A(50 mM 인산 나트륨, 300 mM 염화 나트륨 pH 8.0), 이어서 20 mM 이미다졸로 보충된 5 CV의 완충제 A로 세척하고, 및 마지막으로 완충제 A + 250 mM 이미다졸로 용리하였다. 최고 순도를 갖는 분획을 모으고 2시간 동안 4℃에서 10 kD MWCO를 갖춘 30 mL 카세트를 사용하여 PBS 내로 투석하였다. 이어서, 투석된 단백질을 항-FLAG 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 40 mL의 항-FLAG M2 수지(시그마(미국 미주리주 세인트 루이스 소재))를 TBS에 사전 평형시키고 밤새 4℃에서 1.4 L의 컨디셔닝된 배지에서 배취-결합시켰다. 이어서, 수지를 수집하고 항-FLAG M2 크로마토그래피를 위한 컬럼 내로 팩킹하고 기선까지 TBS(20 CV)로 세척하고 먼저 0.1 M FLAG 펩티드 완충제로 용리하고 마지막으로 0.1 M 글리신(pH 3.0)으로 용리하였다. 용리된 단백질을 즉시 10% 1.0 M Tris(pH 8.0)에 의해 중화시켰다. 이어서, 최고 순도를 갖는 분획을 모으고 Superdex200 컬럼(지이 헬쓰케어(미국 뉴저지주 피스카터웨이 소재))을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하고 TBS에 저장하였다.
결정화 시험을 위해, 정제된 His/FLAG 버전의 GUCY2C-1608을 TBS(pH 7.5)를 함유하는 단백질 용액 중에서 12 mg/mL로 농축하였다. 결정을 1 M 말론산 나트륨(pH 6), 2% 에틸렌 이민 중합체를 함유하는 조건으로부터 현적 증기 확산법에 의해 수득하였다. 결정은 육각형 공간군 P3221에 부합하는 대칭을 가졌다(여기서 셀 파라미터 a=b=119.55 Å, c=121.85 Å; 다이아바디의 하나의 카피는 결정학적 비대칭 유닛으로 존재). 결정을 2.8 M 말론산 나트륨(pH 6)을 함유하는 저장 용액을 사용하여 냉동 방지하였고, 액체 질소에서 플래쉬 냉동하였다. 2.03 Å 분해능에 대한 데이터 세트를 아르곤 국립 연구소(APS)에서 IMCA beamLine 17-ID에서 단일 동결된 결정으로부터 수집하였다. 데이터를 autoPROC를 사용하여 처리하고 확장시켰고, 최종 데이터 세트는 49.3% 완료되었다.
Brookhaven PDB 엔트리 1moe로부터 수득한 단일 쇄 Fv 단편 모델에서 출발하여 PHASER을 사용한 분자 대체에 의해 구조를 해석하였다. 개별적으로 다이아바디 분자의 4개의 서브유닛 각각에 대해 조사함으로써 해석을 수득하였다. COOT를 사용한 여러 반복된 라운드의 수동 조정 및 모델 리빌딩, 및 autoBUSTER을 사용한 결정학적 보정으로 다이아바디의 최종 모델을 산출하였고, 여기서 결정학적 Rwork는 19.1%이고, Rfree는 20.8%이다(여기서 Rwork= ||Fobs| - |Fcalc|| / |Fobs|; Rfree는 Rwork와 동일하나, 보정 처리가 생략된 반영물의 무작위로 선택된 5%에 대해 계산된다).
C. 항-GUCY2C-CD3 다이아바디 구조의 설명
GUCY2c CD3 이중특이적 항체 상의 2개의 항원 결합 부위는 약 70 Å만큼 떨어져 있고, 분자의 반대면에, 서로에 대해 바로 건너편에 위치된다(도 22). 항-CD3 CDR 및 항-GUCY2c CDR 영역 둘 모두는 서브유닛 접점으로부터 멀리 위치된다.
실시예 32: GUCY2c CD3 이중특이적 항체의 항-VEGF-A mAb 및 악시티닙과의 병용의 생체내 평가
인간 PBMC를 배지(X-VIVO 15(Lonza), 5% 인간 혈청 알부민(Gemini #100-318), 1% Penn/Strep, 0.01 mM 2-머캅토에탄올) 내로 약 5x106 세포/mL로 해동하였다. 세포를 스핀 다운시키고 Robosep 완충제(스템 셀 테크놀로지스)에 5x107 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. T 세포를 EasySep 인간 T 세포 강화 키트(스템 셀 테크놀로지스)를 사용하여 단리하였다. T 세포를 인간 T 세포 활성화/확장 키트(밀테나이)를 사용하여 활성화시키고 확장시켰다. 제2일에, T 세포를 G-Rex 세포 배양 장치로 확장을 위해 옮기고, IL-2(스템 셀 테크놀로지스)를 배지에 첨가하고 2일 후에 보충하였다. T 세포를 활성화/확장 1주일 후에 채취하였다. 채취시, 비드를 자석에 의해 제거하고, 세포를 생체내 접종을 위해 1x107 세포/mL로 DPBS에 재현탁하였다.
NSG 마우스에게 대장암 환자로부터 유래된 이종이식 PDX-CRX-11201 단편을 피하로 옆구리에 접종하였다. 종양 측정치를 디지털 버니어 캘리퍼를 사용하여 수집하고, 부피를 변형된 타원 식 ½ × 길이 × 너비2을 사용하여 계산하였다. 마우스를 무작위화시키고 150 내지 200 mm3의 종양 크기로 준비하였다. 초기 투여량의 GUCY2c 이중특이적 항체(GUCY2C-1608), 음성 대조군 이중특이적 항체 또는 비히클을 동물에게 제0일에 투여하고, 2x106개의 배양된 T-세포를 다음날에 접종하였다. 마우스에게 0.2 mL 볼루스 주사를 매주 최대 3회 투여하였고, 모든 화합물 및 T-세포 투여를 각각의 동물의 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 수행하였다. 조합 제제 투여를 제0일에 출발하였다. 항-VEGF mAb(G6-31)를 최대 4회 3일마다 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 악시티닙을 매일 2회 최대 14일 동안 경구 섭식을 통해 투여하였다. 이식편 대 숙주 반응의 신호에 대한 연속된 모니터링과 함께 종양 측정치를 1주일에 2회 수집하였다.
0.05 mg/kg으로 투여한 GUCY2c CD3 이중특이적 항체는 PDX-11201 입양 전달 모델에서 부분적 항종양 반응을 가졌다. 항-VEGF mAb 및 악시티닙이 또한 단독으로 각각 5 mg/kg 및 15 mg/kg으로 투여시 상기 모델에서 부분적 항종양 반응을 가졌다. GUCY2c CD3 이중특이적 항체와 항-VEGF mAb 또는 악시티닙의 병용은 부가적 항종양 반응을 야기하여 완전 종양 억제를 나타냈다.
GUCY2C-1608은 PDX-CRX-11201 대장 암종 환자 유래된 이종이식 모델에서 항-VEGF mAb 및 악시티닙과의 병용에서 증진된 종양 성장 억제, 및 입양 T 세포 전달을 나타낸다.
실시예 33: GUCY2c CD3 이중특이적 항체의 항-PD1과의 병용의 생체내 평가
인간 PBMC를 배지(X-VIVO 15(Lonza), 5% 인간 혈청 알부민(Gemini #100-318), 1% Penn/Strep, 0.01 mM 2-머캅토에탄올) 내로 약 5x106 세포/mL로 해동하였다. 세포를 스핀 다운시키고 Robosep 완충제(스템 셀 테크놀로지스)에 5x107 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. T 세포를 EasySep 인간 T 세포 강화 키트(스템 셀 테크놀로지스)를 사용하여 단리하였다. T 세포를 인간 T 세포 활성화/확장 키트(밀테나이)를 사용하여 활성화시키고 확장시켰다. 제2일에, T 세포를 G-Rex 세포 배양 장치로 확장을 위해 옮기고, IL-2(스템 셀 테크놀로지스)를 배지에 첨가하고 2일 후에 보충하였다. T 세포를 활성화/확장 1주일 후에 채취하였다. 채취시, 비드를 자석에 의해 제거하고, 세포를 생체내 접종을 위해 1x107 세포/mL로 DPBS에 재현탁하였다.
NSG 마우스에게 대장암 세포주 LS1034 세포를 피하로 옆구리에 접종하였다. 종양 측정치를 디지털 버니어 캘리퍼를 사용하여 수집하고, 부피를 변형된 타원 식 ½ × 길이 × 너비2을 사용하여 계산하였다. 마우스를 무작위화시키고 150 내지 200 mm3의 종양 크기로 준비하였다. 초기 투여량의 0.03 mg/kg의 GUCY2c 이중특이적 항체(GUCY2C-1608), 0.1 mg/kg의 음성 대조군 이중특이적 항체, 5 mg/kg의 항-PD1 항체(펨브롤리주맙 생물학적 유사 D265A hIgG1a Fc 효과기 기능 돌연변이체), 또는 비히클을 동물에게 제0일에 투여하고, 2x106개의 배양된 T-세포를 다음날에 접종하였다. 마우스에게 0.2 mL 볼루스 주사를 매주 최대 3회 투여하였고, 모든 화합물 및 T-세포 투여를 각각의 동물의 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 수행하였다. 이식편 대 숙주 반응의 신호에 대한 연속된 모니터링과 함께 종양 측정치를 1주일에 2회 수집하였다.
0.03 mg/kg으로 투여된 GUCY2c CD3 이중특이적 항체는 LS1034 입양 전달 모델에서 부분적 항종양 반응을 가졌다. 항-PD-1 항체는 10 mg/kg으로 투여시 상기 모델에서 항종양 반응을 갖지 않았다. GUCY2c CD3 이중특이적 항체와 항-PD-1 항체의 병용은 부가적 항종양 반응을 야기하였다(도 24).
GUCY2C-1608은 LS1034 대장 암종 세포주 유래된 이종이식 모델에서 항-PD1 mAb와의 병용에서 증진된 종양 성장 억제, 및 입양 T 세포 전달을 나타낸다.
실시예 34: GUCY2c CD3 이중특이적 항체의 항-PDL1과의 병용의 생체내 평가
인간 PBMC를 배지(X-VIVO 15(Lonza), 5% 인간 혈청 알부민(Gemini #100-318), 1% Penn/Strep, 0.01 mM 2-머캅토에탄올) 내로 약 5x106 세포/mL로 해동하였다. 세포를 스핀 다운시키고 Robosep 완충제(스템 셀 테크놀로지스)에 5x107 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. T 세포를 EasySep 인간 T 세포 강화 키트(스템 셀 테크놀로지스)를 사용하여 단리하였다. T 세포를 인간 T 세포 활성화/확장 키트(밀테나이)를 사용하여 활성화시키고 확장시켰다. 제2일에, T 세포를 G-Rex 세포 배양 장치로 확장을 위해 옮기고, IL-2(스템 셀 테크놀로지스)를 배지에 첨가하고 2일 후에 보충하였다. T 세포를 활성화/확장 1주일 후에 채취하였다. 채취시, 비드를 자석에 의해 제거하고, 세포를 생체내 접종을 위해 1x107 세포/mL로 DPBS에 재현탁하였다.
NSG 마우스에게 대장암 세포주 LS1034 세포를 피하로 옆구리에 접종하였다. 종양 측정치를 디지털 버니어 캘리퍼를 사용하여 수집하고, 부피를 변형된 타원 식 ½ × 길이 × 너비2을 사용하여 계산하였다. 마우스를 무작위화시키고 150 내지 200 mm3의 종양 크기로 준비하였다. 초기 투여량의 0.03 mg/kg의 GUCY2c 이중특이적 항체(GUCY2C-1608), 0.1 mg/kg의 음성 대조군 이중특이적 항체 또는 비히클을 동물에게 제0일에 투여하고, 2x106개의 배양된 T-세포를 다음날에 접종하였다. 마우스에게 0.2 mL 볼루스 주사를 매주 최대 3회 투여하였고, 모든 화합물 및 T-세포 투여를 각각의 동물의 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 수행하였다. 항-PDL1을 제0일에 출발하여 3일마다 최대 6회 정맥내로 투여하였다. 이식편 대 숙주 반응의 신호에 대한 연속된 모니터링과 함께 종양 측정치를 1주일에 2회 수집하였다.
0.03 mg/kg으로 투여된 GUCY2c CD3 이중특이적 항체는 LS1034 입양 전달 모델에서 부분적 항종양 반응을 가졌다. 항-PD-L1은 10 mg/kg으로 투여시 상기 모델에서 항종양 반응을 갖지 않았다. GUCY2c CD3 이중특이적 항체와 항-PD-L1의 병용은 부가적 항종양 반응을 야기하였다(도 25).
GUCY2C-1608은 LS1034 대장 암종 세포주 유래된 이종이식 모델에서 항-PD-L1 mAb와 병용으로 증진된 종양 성장 억제, 및 입양 T 세포 전달을 나타낸다.
실시예 35: 진행성 위장 종양을 갖는 환자에서 GUCY2c-1608 이중특이적 항체의 안전성, 내약성, 약동학, 약력학 및 항종양 활성을 평가하기 위한 제1상 투여량 단계적 증가 및 확대 연구
본 실시예는 GUCY2c-1608 이중특이적 항체의 제1상, 오픈-라벨(open-label), 멀티-센터(multi-center), 다중-투여량, 안전성, PK 및 PD 연구를 제시한다. 본 연구는 2개의 파트, 즉 단일 제제로서 투여량 단계적 확대 및 병용에서 투여량 조사 결과(항-PD-1 또는 항-VEGF)(각각 파트 1A 및 1B) 후에 투여량 확대(파트 2)로 이루어진다. 대장, 위 및 식도 선암을 포함하는 진행성/전이성 위장 종양을 갖는 환자의 연속하는 코호트(임상적 이점을 갖는 것으로 공지된 섭생법에 대한 후보자가 아님)에게 연구의 파트 1A에서 단계적으로 증가되는 투여량의 GUCY2c-1608 이중특이적 항체를 제공한다. 파트 1B에서, 병용(항-PD-1 또는 항-VEGF)된 GUCY2c-1608 이중특이적 항체의 투여량 조사 결과 평가를 진행성/전이성 대장, 위 및 식도 선암을 갖는 환자에서 수행한다. 파트 2(투여량 확대 단계)는, 파트 1(투여량 단계적 증가 단계)에서 선택된 최적 제2상 투여량(RP2D)을 이전에 대장 선암을 치료 받았던 환자에서 단일요법으로 또는 병용으로(항-PD-1 또는 항-VEGF) 평가한다. 이러한 환자에서 쌍을 이룬 종양 생검을 필요로 하는 바이오마커 코호트는 최대 내량(MTD)에 접근할 때 또는 RP2D/MTD일 때 파트 1A 및 1B에서 및 파트 2의 투여량 확대 아암의 서브세트에서 발생할 수 있다.
단계적으로 증가되는 투여량의 GUCY2c-1608을 매주 피하(SC) 주사로 21-일 주기로 투여한다. 제안된 출발 SC 투여량은 0.6 μg/kg이다.
단일요법으로서 GUCY2c-1608 RP2D/MTD를 결정하자마자, 파트 1B 투여량 코호트는 병용에서(항-PD-1 또는 항-VEGF) 이러한 투여량 수준의 안전성, 내약성 및 예비 항종양 활성 탐구를 개시한다. 투여량 확대 단계(파트 2)는 진행성/전이성 대장 선암 환자에서 단일요법으로서 및 제제(항-PD-1 또는 항-VEGF)와 병용시 GUCY2c-1608의 RP2D를 평가한다.
또한, 새로운 투여량 수준에 등록된 각각의 초기 환자(즉 초기 독성 제한 투여량(DLT) 평가에 기여한 환자)에게 투여된 제1 투여량 사이에 최소 72-시간 간격이 존재한다. 모든 환자를 파트 1의 제1주기 제1일(C1D1)의 제1 SC 투여량 후에 적어도 48시간 이상 동안 입원 환자로서 관찰하였다.
연구자 및 의료 모니터가 개별적 이익/위험 평가를 기반으로 질병 진행 이후의 치료에 동의하지 않는 한, 질병 진행, 환자 거부 또는 허용되지 않는 독성(어느 것이든 가장 빠른 것)이 발생할 때까지, GUCY2c-1608을 사용한 치료를 계속한다.
IV 투여량 투여를 사용한 대안적 투여 섭생법
SC 투여 받은 투여량 단계적 증가 코호트로부터 생성된 입수가능한 임상 데이터(안전성/내약성, PK, PD 등)를 기반으로, 정맥내(IV) 투여를 평가할 수 있다.
보다 높은 수준의 투여량의 후속 투여를 가능하게 하는 시동 투여량의 평가를 본 연구에서 시작할 수 있다.
투여량 단계적 증가 기준
투여 코호트에 대하여, 초기 투여량 수준을 표 49에 나타냈다; 중간 투여량을 임상 결과를 기반으로 평가할 수 있다. SC 투여 코호트에 대하여, 초기 투여량 단계적 증가 수준 동안, 최대 투여량은 최대 250%로 증가하나, DLT의 관찰 후에 100% 이하로 조정된다.
[표 49]
Figure 112020139468681-pct00162
투여량 단계적 증가는 당업자게 의해 결정되는 바와 같이 중단 기준을 만족할 때 중단된다.
본 연구의 파트 1A의 목적은 SC 투여량 섭생법에 대한 MTD를 결정하는 것이나, 투여 섭생법이 IV로 전환되는 경우, MTD는 IV 투여량 투여에 대해 결정된다. IV에 대해 투여량 프라임의 도입이 필요한 경우, MTD는 IV에 대해 시동 투여량 섭생법을 사용하여 결정된다.
파트 1B의 목적은 제제(항-PD-1 또는 항-VEGF)와 병용된 GUCY2c-1608의 MTD를 결정하는 것이다.
RP2D는 제1상 연구를 기반으로 추가적 연구를 위해 선택되는 투여량이다.
환자 선택
투여량 단계적 증가의 경우(파트 1A 및 1B): 표준 요법에 내성이 있거나 표준 요법을 사용할 수 없는, 진행성/전이성 대장, 위 또는 식도 선암의 조직학적 또는 세포학적 진단.
투여량 확대의 경우(파트 2): 표준 요법에 내성이 있거나 표준 요법을 사용할 수 없는, 이전에 방사선 조사되지 않은, RECIST 버전 1.1에 정의된 바와 같이 하나 이상의 측정가능한 병변을 갖는, 이전에 치료 받은 대장 선암의 조직학적 또는 세포학적 진단.
시토카인 방출 증후군 관리
시토카인 방출 증후군(CRS) 관리 및 수정된 CRS 등급제는 문헌[D.W.Lee, et al: Current Concepts in the Diagnosis and Management of Cytokine Release Syndrome. Blood 124 (2014) 188-195]으로부터 조정되었다.
항-IL6 투여: 1시간 동안 4 mg/kg이 고려되고 24 내지 48시간 내에 임상적 개선이 없는 경우 및 제2 투여량의 투여가 고려된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원 및 간행물의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
등가물
본 발명은 구체적 실시양태를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 실시양태 및 변형이 본 발명의 진정한 근원 및 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 본 발명의 대상은 본원에 개시된 다양한 요소, 특징, 기능 및/또는 특성의 조합 및 하위조합을 포함하는 모든 다른 실시양태 및 변형을 포함한다. 하기 청구범위는 특히 새롭고 뻔하지 않은 것으로 간주되는 특정 조합 및 하위조합을 주목한다. 특징, 기능, 요소 및/또는 특성의 다른 조합 및 하위조합으로 구현된 발명은 본원에서, 본원을 우선권 주장하는 출원에서 또는 관련된 출원에서 청구될 수있다. 상이한 발명에 관한 것이든 동일한 발명에 관한 것이든 상관 없이, 및 원래의 청구항과 비교하여 범위가 넓거나 좁거나 동일하거나 다른 것인지에 상관 없이, 이러한 청구항은 또한 본원의 발명의 대상에 포함되는 것으로 간주된다.
ATCC PTA-124943 20180214 ATCC PTA-124944 20180214
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. <120> ANTIBODIES SPECIFIC FOR GUCY2C AND USES THEREOF <130> PC72377 <140> PCT/IB2019/054187 <141> 2019-05-21 <150> US 62/675,617 <151> 2018-05-23 <150> US 62/848,519 <151> 2019-05-15 <160> 445 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide 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tatgaaaaat gtccttgttc tgacgctgtc tcctgggaat 840 tcccttctaa atagctcttt ctccaggaat ctatcaccaa caaaacgaga ctttgctctt 900 gcctatttga atggaatcct gctctttgga catatgctga agatatttct tgaaaatgga 960 gaaaatatta ccacccccaa atttgctcat gctttcagga atctcacttt tgaagggtat 1020 gacggtccag tgaccttgga tgactggggg gatgttgaca gtaccatggt gcttctgtat 1080 acctctgtgg acaccaagaa atacaaggtt cttttgacct atgataccca cgtaaataag 1140 acctatcctg tggatatgag ccccacattc acttggaaga actctaaact tcctaatgat 1200 attacaggcc ggggccctca gatcctgatg attgcagtct tcaccctcac tggagctgtg 1260 gtgctgctcc tgctcgtcgc tctcctgatg ctcagaaaat atagaaaaga ttatgaactt 1320 cgtcagaaaa aatggtccca cattcctcct gaaaatatct ttcctctgga gaccaatgag 1380 accaatcatg ttagcctcaa gatcgatgat gacaaaagac gagatacaat ccagagacta 1440 cgacagtgca aatacgacaa aaagcgagtg attctcaaag atctcaagca caatgatggt 1500 aatttcactg aaaaacagaa gatagaattg aacaagttgc ttcagattga ctattacaac 1560 ctgaccaagt tctacggcac agtgaaactt gataccatga tcttcggggt gatagaatac 1620 tgtgagagag gatccctccg 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tgacatctat aagagttttg accacattgt tgatcatcat 2520 gatgtctaca aggtggaaac catcggtgat gcgtacatgg tggctagtgg tttgcctaag 2580 agaaatggca atcggcatgc aatagacatt gccaagatgg ccttggaaat cctcagcttc 2640 atggggacct ttgagctgga gcatcttcct ggcctcccaa tatggattcg cattggagtt 2700 cactctggtc cctgtgctgc tggagttgtg ggaatcaaga tgcctcgtta ttgtctattt 2760 ggagatacgg tcaacacagc ctctaggatg gaatccactg gcctcccttt gagaattcac 2820 gtgagtggct ccaccatagc catcctgaag agaactgagt gccagttcct ttatgaagtg 2880 agaggagaaa catacttaaa gggaagagga aatgagacta cctactggct gactgggatg 2940 aaggaccaga aattcaacct gccaacccct cctactgtgg agaatcaaca gcgtttgcaa 3000 gcagaatttt cagacatgat tgccaactct ttacagaaaa gacaggcagc agggataaga 3060 agccaaaaac ccagacgggt agccagctat aaaaaaggca ctctggaata cttgcagctg 3120 aataccacag acaaggagag cacctatttt acgcgtacgc ggccgctcga gcagaaactc 3180 atctcagaag aggatctggc agcaaatgat atcctggatt acaaggatga cgacgataag 3240 <210> 226 <211> 1080 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 226 Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His 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actctaaact tcctaatgat 1260 attacaggcc ggggccctca gggaggcgga ggttccgaga atttatactt ccagggcgga 1320 ggcggttccg gcggcggagg aagcgagccc cgcggaccga caatcaagcc ctgtcctcca 1380 tgcaaatgcc cagcacctaa cctcgagggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 1440 atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg 1500 agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 1560 gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 1620 cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggctttcg catgcgccgt caacaacaaa 1680 gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca 1740 caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa gagatgacta agaaacaggt cactctgacc 1800 tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa 1860 acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 1920 tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca 1980 gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt 2040 ggcgggccac ccgactacaa ggacgacgat gacaaa 2076 <210> 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ctttgaggac 780 aatgtcacag cccctgacta tatgaaaaat gtccttgttc tgacgctgtc tcctgggaat 840 tcccttctaa atagctcttt ctccaggaat ctatcaccaa caaaacgaga ctttgctctt 900 gcctatttga atggaatcct gctctttgga catatgctga agatatttct tgaaaatgga 960 gaaaatatta ccacccccaa atttgctcat gctttcagga atctcacttt tgaagggtat 1020 gacggtccag tgaccttgga tgactggggg gatgttgaca gtaccatggt gcttctgtat 1080 acctctgtgg acaccaagaa atacaaggtt cttttgacct atgataccca cgtaaataag 1140 acctatcctg tggatatgag ccccacattc acttggaaga actctaaact tcctaatgat 1200 attacaggcc ggggccctca gggaggcgga ggttccgaga atttatactt ccag 1254 <210> 234 <211> 672 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 234 Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val 1 5 10 15 Leu Met Met Asp Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Glu Asn Val Glu 20 25 30 Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn 35 40 45 Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Ser Phe Met Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu 65 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ttgcagagcc cctggaaaac gtggaagatg cggtgaatga ggggctggaa 120 atagtgagag gacgtctgca aaacgctggc ctaaatgtga ctgtgaatgc ttctttcatg 180 tattcggatg gtctgattca taactccggc gactgccgga gcagcacctg tgaaggcctt 240 gacctactca ggaaaatttc aaatgcaaaa cggatgggct gtgtcctcat ggggccctca 300 tgtacatact ccaccttcca gatgtacctt gacacagaat tgagctaccc catgatctca 360 gctggaagtt ttggattgtc atgtgactat aaagaaacct taaccaggct gatgtctcca 420 gctagaaagt tgacatactt cttggttaac ttttggaaaa ccaatgatct acccttcaaa 480 acttattcct ggagcacttc gtatgtttac aagaatggta cggagtccga ggactgtttc 540 tggtacctta acgctctgga ggccagtgtt tcctatttct cccacgaact cagttttaag 600 ttggtgttaa gacaagataa ggagtttcag gatatcttaa tggaccacaa caggaaaagc 660 aatgtgattg ttatgtgtgg tgatccagag ttcctctaca agttgaaggg tgaccgagca 720 gtggctgaag acattgtcat tattctagtg gatcttttca atgaccagta ctttgaggac 780 aatgtcacag cccctgacta tatgaaaaat gtccttgttc tgacgcagtc tcctgggaat 840 tccctcctaa atagctcttt ctccaggaat ctatccccaa caaaacgaga ctttgctctt 900 gcctatttga atggaatcct gctctttgga catatgctaa agacatttct tgaaaatgga 960 gaaaatatta ccacccccaa atttgctcat gctttcagga atctcacttt tgaagggtat 1020 gacggtccag tgaccttgga tgactggggg gatgtggaca gtaccatggt gcttctgtat 1080 acgtctgtgg acaccaagaa atacaaggtt cttttgacct atgataccca cgtaaatcag 1140 accaaccctg tggatatgag ccccacattc acttggaaga actctaaact tcctaatgat 1200 attacagacc ggggccctca gggaggcgga ggttccgaga atttatactt ccagggcgga 1260 ggcggttccg gcggcggagg aagcgagccc cgcggaccga caatcaagcc ctgtcctcca 1320 tgcaaatgcc cagcacctaa cctcgagggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 1380 atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg 1440 agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 1500 gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 1560 cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggctttcg catgcgccgt caacaacaaa 1620 gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca 1680 caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa gagatgacta agaaacaggt cactctgacc 1740 tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa 1800 acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 1860 tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca 1920 gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt 1980 ggcgggccac ccgactacaa ggacgacgat gacaaa 2016 <210> 236 <211> 418 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 236 Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val 1 5 10 15 Leu Met Met Asp Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Glu Asn Val Glu 20 25 30 Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn 35 40 45 Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Ser Phe Met Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Lys Arg Met Gly Cys Val Leu 85 90 95 Met Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr 100 105 110 Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys 115 120 125 Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg 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ggggccctca gatcctgatg attgcagtct tcaccctcac cggagctgtg 1260 gtgctgctcc tgcttgtcgc tctcctgatg ctcagaaaat ataaaaaaga ttatgaactt 1320 cgtcagaaaa aatggtccca cattcctcct gaaaatatct ttcctctgga gaccaatgag 1380 accaatcacg ttagcctgaa gatcgatgat gacaaaagac gagatacaat ccagagacta 1440 cgacagtgca aatacgacaa aaagcgagtg attctcaaag atctcaagca caatgatggt 1500 aatttcactg aaaaacagaa gatagaattg aacaagttgc ttcagattga ctattacaac 1560 ctgaccaagt tctatggcac cgtgaaactt gataccatga tcttcggggt gatagaatac 1620 tgtgagagag gatccctccg ggaagtttta aatgacacaa tttcctaccc tgatggcaca 1680 ttcatggatt gggagtttaa gatctctgtc ctgtatgaca ttgctaaggg aatgtcatat 1740 ctgcactcca gtaagacaga agtccatggt cgtctgaaat ctaccaactg cgtagtggac 1800 agtagaatgg tggtgaagat cactgatttt ggctgcaatt ccattttacc tccaaaaaaa 1860 gacctgtgga cagctccaga gcacctccgc caagccaacg tctctcagaa aggagatgtg 1920 tacagctacg ggatcatcgc acaggagatc atcctgcgga aagaaacctt ctacacttcg 1980 agctgtcgag accggaacga gaagattttc agagtggaaa attccaatgg aatgaaaccc 2040 ttccgtccag atttattctt ggaaacggca gaggaaaaag agctagaagt gtacctactt 2100 gtaaaaagct gttgggaaga agatccagaa aagagaccag atttcaaaaa aattgagact 2160 acacttgcca agatatttgg actttttcat gaccaaaaaa atgaaagcta tatggatacc 2220 ttgatccgac gtctacagct atattctcga aacctggaac atctggtaga ggaaaggaca 2280 cagctataca aggcagagag ggacagggct gacagactta actttatgtt gcttccaagg 2340 ctagtggtaa agtctctgaa ggagaaaggc tttgtagagc cggaactata tgaggaagtt 2400 acaatctact tcagtgacat tgtaggtttc actactatct gcaaatacag cacccccatg 2460 gaagtggtgg acatgcttaa tgacatctat aagagttttg accacattgt tgatcatcat 2520 gatgtctaca aggtggaaac cattggtgat gcctacatgg tggctagtgg tttgcctaag 2580 agaaatggca atcggcatgc aatagacatt gccaagatgg ccttggaaat cctcagcttc 2640 atggggacct ttgagctgga gcatcttcct ggcctcccaa tatggattcg cattggcgtt 2700 cactctggtc cctgcgctgc tggagttgtg ggaatcaaga tgcctcgtta ttgtctattt 2760 ggagatacag tcaacacagc ctctaggatg gaatccactg gcctcccttt gaggattcat 2820 gtgagtggct ccaccatagc cattctgaag agaactgagt gccagttcct gtatgaagtg 2880 agaggagaaa 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ttacgacctt 300 ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336 <210> 289 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 289 gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggcggt ttggttcagc ccggtggatc actgcgactc 60 agttgcgcag ctagcggctt caccttttct gattactaca tgacatgggt acgacaggcg 120 ccaggcaagg gtttggaatg ggtagcattc atacgcaatc aggcacgcgg gtacacttca 180 gaccacaatc cctcagtaaa aggaagattt accatctcaa gagacaatgc caaaaattca 240 ctctacctgc aaatgaactc acttcgcgcc gaggataccg ccgtgtatta ctgtgccaga 300 gacagaccat cttattacgt gctggactat tggggacagg gcactacagt caccgtcagc 360 tct 363 <210> 290 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 290 gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgca caagctcaga gtcactgttt aatgtccgca gcggcaaaaa ctatcttgcg 120 tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtgaccga 180 gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240 atctcctccc 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Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 145 150 155 160 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 180 185 190 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 195 200 205 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 443 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 443 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 115 120 125 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met 130 135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 210 215 220 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 245 250 255 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 290 295 300 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 340 345 350 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 355 360 365 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp 405 410 415 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 420 425 430 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 444 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 444 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg 85 90 95 Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 445 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 445 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly 450

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  19. 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로서,
    상기 제1 폴리펩티드 쇄 및 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 함께 하기를 포함하는, 이중특이적 항체:
    (i) 서열번호 74 또는 259의 아미노산 서열을 포함하는 GUCY2c 중쇄 가변 영역(VH) 상보 결정 영역(CDR) 1; (ii) 서열번호 75 또는 267의 아미노산 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR2; 및 (iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 GUCY2c VH CDR3을 포함하는 GUCY2c 항체의 VH 영역(GUCY2c VH);
    (i) 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 GUCY2c 경쇄 가변 영역(VL) CDR1; (ii) 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR2; 및 (iii) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 GUCY2c VL CDR3을 포함하는 GUCY2c 항체의 VL 영역(GUCY2c VL);
    (i) 서열번호 2 또는 268의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 VH CDR1; (ii) 서열번호 10 또는 270의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 VH CDR2; 및 (iii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 VH CDR3을 포함하는 CD3 항체의 VH 영역(CD3 VH); 및
    (i) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 VL CDR1; (ii) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 VL CDR2; 및 (iii) 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 VL CDR3을 포함하는 CD3 항체의 VL 영역(CD3 VL).
  20. 제19항에 있어서,
    a. 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. GUCY2c 항체의 VL 영역(GUCY2c VL) 및 CD3 항체의 VH 영역(CD3 VH)을 포함하는 도메인 1, 및
    ii. 제1 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    b. 제2 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. CD3 항체의 VL 영역(CD3 VL) 및 GUCY2c 항체의 VH 영역(GUCY2c VH)을 포함하는 도메인 2, 및
    ii. 제2 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    GUCY2c VL 및 GUCY2c VH가 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH가 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하는, 이중특이적 항체.
  21. 제19항에 있어서,
    a. 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. CD3 VL 및 GUCY2c VH를 포함하는 도메인 1, 및
    ii. 제1 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    b. 제2 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. GUCY2c VL 및 CD3 VH를 포함하는 도메인 2, 및
    ii. 제2 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    GUCY2c VL 및 GUCY2c VH가 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH가 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하는, 이중특이적 항체.
  22. 제19항에 있어서,
    a. 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 1, 및
    ii. 제1 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    b. 제2 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 2, 및
    ii. 제2 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    GUCY2c VL 및 GUCY2c VH가 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH가 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하는, 이중특이적 항체.
  23. 제19항에 있어서,
    a. 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. CD3 VH 및 GUCY2c VL을 포함하는 도메인 1, 및
    ii. 제1 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    b. 제2 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. GUCY2c VH 및 CD3 VL을 포함하는 도메인 2, 및
    ii. 제2 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하고;
    GUCY2c VL 및 GUCY2c VH가 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH가 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하는, 이중특이적 항체.
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  25. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인이 둘 다 놉이 아니거나 둘 다 홀이 아니거나; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인이 IgG 면역 글로불린 Fc 영역을 형성하는, 이중특이적 항체.
  26. 제25항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각이 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함하고, 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인이 돌연변이 Y349C, 돌연변이 T366W, 또는 돌연변이 Y349C 및 T366W 둘다를 포함하여 놉을 형성하고; 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하여 홀을 형성하는(EU 인덱스에 따른 넘버링), 이중특이적 항체.
  27. 제26항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각이 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함하고, 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH2 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH2 도메인 각각이 L234A, L235A 및 G237A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는(EU 인덱스에 따른 넘버링), 이중특이적 항체.
  28. 제27항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인이 서열번호 188의 서열을 포함하여 놉을 형성하고; 제2 이종이량체-촉진 도메인이 서열번호 189의 서열을 포함하여 홀을 형성하는, 이중특이적 항체.
  29. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    GUCY2c VL 및 CD3 VH가 글리신-세린 링커에 의해 연결되고; CD3 VL 및 GUCY2c VH가 글리신-세린 링커에 의해 연결되는, 이중특이적 항체.
  30. 제29항에 있어서,
    글리신-세린 링커가 서열번호 190의 서열을 포함하는 링커 1인, 이중특이적 항체.
  31. 제29항에 있어서,
    글리신-세린 링커가 서열번호 191의 서열을 포함하는 링커 2인, 이중특이적 항체.
  32. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    도메인 1이 제1 이종이량체-촉진 도메인에 시스테인 링커를 통해 공유 결합되고; 도메인 2가 제2 이종이량체-촉진 도메인에 시스테인 링커를 통해 공유 결합되고; 시스테인 링커가 5개 이상의 아미노산을 포함하는, 이중특이적 항체.
  33. 제32항에 있어서,
    시스테인 링커가 서열번호 192의 서열을 포함하는 링커 3인, 이중특이적 항체.
  34. 제19항에 있어서,
    제1 폴리펩티드 쇄가 제2 폴리펩티드 쇄에 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합되는, 이중특이적 항체.
  35. 제34항에 있어서,
    하나 이상의 다이설파이드 결합이 제1 폴리펩티드 쇄의 링커 3과 제2 폴리펩티드 쇄의 링커 3 사이에 형성되는, 이중특이적 항체.
  36. 제34항에 있어서,
    하나 이상의 다이설파이드 결합이 제1 이종이량체-촉진 도메인과 제2 이종이량체-촉진 도메인 사이에 형성되는, 이중특이적 항체.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서,
    다이설파이드 결합 각각이 2개의 시스테인 잔기를 연결함으로써 형성되는, 이중특이적 항체.
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  43. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. GUCY2c VH 영역이 서열번호 73의 서열을 포함하고;
    b. GUCY2c VL 영역이 서열번호 147의 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
  44. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. CD3 VH 영역이 서열번호 9의 서열을 포함하고;
    b. CD3 VL 영역이 서열번호 90의 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
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  54. 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로서,
    a. 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로 GUCY2c 항체의 VL(GUCY2c VL)(서열번호 147) - 링커 1(서열번호 190) - CD3 항체의 VH(CD3 VH)(서열번호 9) - 링커 3(서열번호 192) - 제1 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 188)을 순서대로 포함하고;
    b. 제2 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로 CD3 항체의 VL(CD3 VL)(서열번호 90) - 링커 2 (서열번호 191) - GUCY2c 항체의 VH(GUCY2c VH)(서열번호 73) - 링커 3(서열번호 192) - 제2 이종이량체-촉진 도메인(서열번호 189)을 순서대로 포함하는, 이중특이적 항체.
  55. 제54항에 있어서,
    GUCY2c VL 및 GUCY2c VH가 GUCY2c에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; CD3 VL 및 CD3 VH가 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 형성하고; 제1 폴리펩티드 쇄의 링커 3 및 제2 폴리펩티드 쇄의 링커 3이 2개의 다이설파이드 결합에 의해 서로 공유 결합되고; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인 각각이 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고; 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인이 놉을 형성하고, 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인이 홀을 형성하고; 하나 이상의 다이설파이드 결합이 제1 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인과 제2 이종이량체-촉진 도메인의 CH3 도메인 사이에 형성되는, 이중특이적 항체.
  56. 제19항 또는 제54항에 있어서,
    인간 VH 골격 또는 인간화된 VH 골격, 및 인간 VL 골격 또는 인간화된 VL 골격을 추가로 포함하는, 이중특이적 항체.
  57. 제19항 또는 제54항에 있어서,
    인간화된 항체인, 이중특이적 항체.
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  59. 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로서,
    제1 폴리펩티드 쇄가 ATCC 기탁번호 PTA-124944의 발현 벡터에 의해 생산되고; 제2 폴리펩티드 쇄가 ATCC 기탁번호 PTA-124943의 발현 벡터에 의해 생산되는, 이중특이적 항체.
  60. 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, GUCY2c 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체로서,
    제1 폴리펩티드 쇄가 서열번호 216의 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄가 서열번호 220의 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
  61. 제19항, 제54항, 제59항 및 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 폴리펩티드 쇄가 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 서로 공유 결합되는, 이중특이적 항체.
  62. 삭제
  63. 치료 효과량의 제19항, 제54항, 제59항 및 제60항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
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  74. 제19항, 제54항, 제59항 및 제60항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  75. 제74항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  76. 제75항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  77. 제76항에 있어서,
    이중특이적 항체를 재조합에 의해 생산하는, 숙주 세포.
  78. 제76항에 있어서,
    박테리아 세포주, 포유동물 세포주, 곤충 세포주 및 효모 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된, 숙주 세포.
  79. 제78항에 있어서,
    포유동물 세포주가 CHO 세포주인, 숙주 세포.
  80. 제76항의 숙주 세포를 이중특이적 항체의 생산을 야기하는 조건 하에 배양하는 단계, 및 배양 상청액으로부터 상기 이중특이적 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 이중특이적 항체의 생산 방법.
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  83. 제63항에 있어서,
    암이 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암인, 약학 조성물.
  84. 제83항에 있어서,
    치료가 세포용해성 T 세포 반응을 활성화시키는, 약학 조성물.
  85. 삭제
  86. 제19항, 제54항, 제59항 및 제60항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 및 제2 치료제를 포함하는 암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  87. 삭제
  88. 제19항, 제54항, 제59항 및 제60항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 및 지사제를 포함하는 암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 제86항에 있어서,
    암이 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암인, 조성물.
  92. 제88항에 있어서,
    암이 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭, 맹장, 담관 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택된 소화계의 암인, 조성물.
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