BRPI0820875B1 - Molécula de ligação isolada, anticorpo monoclonal humano, composição, molécula de ácido nucleico, vetor e célula hospedeira - Google Patents

Abstract

moléculas de ligação ao receptor de ox40 humano a presente invenção proporciona moléculas de ligação isoladas que se ligam ao ox4or huma-no, moléculas de ácido nucléico que codificam uma seqüência de aminoácidos das moléculas de ligação, vetores compreendendo as moléculas de ácido nucléico, células hospedeiras contendo os vetores, métodos de produção das moléculas de ligação, composições farmacêuticas conten-do as moléculas de ligação e métodos de emprego das molécuias de ligação ou composições.

Description

[0001] Este Pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos no61/013947, depositado em 14 de dezembro de 2007, ora incorporado a título de referência em sua totalidade.

ACORDO DE PESQUISA CONJUNTA

[0002] A apresentação e reivindicações presentes foram realizadas como resultado das atividades feitas dentro do escopo de um acordo de pesquisa conjunta no dia ou antes da data da invenção reivindicada ser realizada entre Pfizer Inc. e Medarex, Inc.

ANTECEDENTES

[0003] A presente descrição refere-se a anticorpos e, particularmente a anticorpos que se ligam ao receptor OX40.

[0004] A intensificação da função de célula T antitumoral representa uma tentativa poderosa e nova para o tratamento do câncer. Componentes decisivos envolvidos com a geração de uma resposta de célula T antitumoral eficaz inclui a intensificação da atividade de célula T auxiliar CD4+ para promoção de geração de células T citolíticas antitumorais e proporcionar sinais de sobrevivência para células T de memória e efetoras. Um receptor chave que demonstrou mediar essas respostas é o receptor de OX40. Saugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. T herapeutic targetin of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40, Nature Rev. Imm. 4: 42-431 (2004); Hori, T. Papéis of OX40 na patogenêse e controle de doenças. Intsn. J. Hematology 83: 17-22 (2006).

[0005] O receptor de OX40 (OX40R) também conhecido como Cd134, TNFRSF4, ACT-4, ACT35, e TXGP1L) é um membro da superfamília do receptor de TNF. O OX40R é tido por ser expressado em células T CD4+. Grandes números de células TOX40R+ foram demonstrados em tumores (linfócitos infiltrantes de tumor) e na drenagem de nódulos linfáticos de pacientes com câncer (Vetto, J.T. et al., 1997. A presença do marcador da ativação de célula TOX-40 em linfócitos infiltrantes de tumor e drenagem de células de nodos linfáticos de pacientes com melanoma e cânceres de pescoço e cabeça. Am. J. Surg 174: 258-265; Weinberg, A.D. et al., Engagement of, A. D. et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J. Immunol. 164: 2160-69 (2000); Petty, J.K., et al. Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD 134). Am. J. Surg. 183: 512-518 (2002)). Demonstrou-se em modelos de tumor em camundongos, que, o compromisso do OX40R in vivo durante iniciação do tumor retardou e preveniu, significativamente, a aparição de tumores, quando comparado com camundongos de controle tratados (Weinberg et al., 2000). Portanto, foi cogitado intensificar a resposta imune de um mamífero para um antígeno pelo compromiso de OX40R mediante uso de um agente de ligação a OX40R (WO 99/42585; Weinberg et al., 2000).

SUMÁRIO

[0006] A presente descrição proporciona moléculas de ligação isoladas, que se ligam ao OX40R humano, incluindo anticorpos OX40R, fragmentos de ligação ao antígeno dos anticorpos OX40R, e os derivados dos anticorpos OX40R. Em algumas modalidades, a molécula de ligação liga-se ao OX40R humano com um KD de 1 x 107M ou menor, tendo atividade agonista do OX40R humano. Em algumas outras modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo monoclonal humano que se liga especificamente ao OX40R humano com um KD de 100 nM ou menos.

[0007] A presente descrição também propicia uma processo compreendendo uma ou mais moléculas de ligação e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo monoclonal OX40R humano ou um seu fragmento de ligação ao antígeno. A composição pode compreender ainda, agentes farmacêuticos adicionais, tais como agentes quimioterapêuticos, imunoterapêuticos, e agentes terapêuticos hormonais.

[0008] A presente invenção propicia ainda métodos de diagnóstico e terapêutico usando as moléculas de ligação. Em algumas modalidades, a descrição propicia um método de tratamento ou prevenção do câncer em um mamífero, compreendendo a administração ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ou uma composição compreendendo uma molécula de ligação. Em outras modalidades, a apresentação proporciona um método de incrementar uma resposta imune em um mamífero, compreendendo a administração ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ou uma composição compreendendo uma molécula de ligação. Em modalidades particulares, a molécula de ligação usada nos métodos trata-se de um anticorpo OX40R monoclonal humano ou um seu fragmento de ligação ao antígeno.

[0009] A presente apresentação proporciona ainda, moléculas de ácido nucleico que codificam uma sequência de aminoácido de uma molécula de ligação, vetores compreendendo esses ácidos nucleicos, células hospedeiras compreendendo os vetores, e métodos de preparar as moléculas de ligação.

[00010] A apresentação também propicia outros aspectos, os quais tornar-se-ão evidentes a partir da completa descrição, incluindo as reivindicações.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS

[00011] As Figuras 1a e 1b são gráficos mostrando que, o anticorpo 11d4 liga-se especificamente ao OX40R;

[00012] A figura 2 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo reticulado 11D4 na atividade de luciferase estimulada por OX40R;

[00013] A figura 3 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 na produção de IL-2 por células T iniciadas com alo-antígeno;

[00014] A figura 4 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 na produção de Il-2 induzida por anti-CD3 por células T primárias;

[00015] A figura 5 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D2 na produção de IL-2 induzida por anti-CD3 por células T primárias de cynomolgus

[00016] A Figura 6 mostra as curvas de ligação de saturação com anticorpo 11D4 usando PBMC's de cynomolgus de 14 doadores estimulados com anti-CD3 e anti-CD-28;

[00017] A figura 7 mostra as curvas de ligação de saturação com o anticorpo 11D4 usando PBMC's de humano de 17 doadores estimulados com anti-CD3 e anti-Cd28;

[00018] A figura 8 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de linfoma Raji de célula B em camundongos SCID;

[00019] A figura 9 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de linfoma de célula B Raji, 21 dias após injeção de tumor;

[00020] A figura 10 é um gráfico mostrando os efeitos de uma única injeção do anticorpo 11D4 no crescimento de tumor PC-3 de próstata em camundongos SCID;

[00021] A figura 11 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de tumor PC-3 de próstata em camundongos SCID, 27 dias após injeção do tumor;

[00022] A figura 12 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de carcinoma de colón LOVO em camundongos SCID;

[00023] A figura 13 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de carcinoma de cólon LOVO em camundongos SCID 25 dias pós-injeção de tumor;

[00024] A figura 14 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de tumor de mama BT474 em camundongos SCID; e

[00025] A figura 14 é um gráfico mostrando o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de tumor de mama BT474 em camundongos SCID.

DESCRIÇÃO DETALHADA DEFINIÇÕES

[00026] O termo "agonista" refere-se a uma molécula de ligação conforme aqui indicado, que, com a ligação ao OX40R, 1) estimula ou ativa o OX40R, 2) intensifica, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de OX40R, ou 3) intensifica, aumenta, promove ou induz a expressão de OX40R.

[00027] O termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina tipicamente composta de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve"(L) e uma cadeia "pesada" (H). Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias kappa e lambda. Cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou epsilon e indicam o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constante são ligadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 3 ou mais aminoácidos. Cada cadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviado como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada, A região constante de cadeia pesada é composta de três domínios CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta de um domínio, CL. As regiões constantes de anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema complementar clássico. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas de regiões de quadro genético (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro RFs dispostas de terminal amino para terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. AS regiões variáveis de cada par de cadeia pesada/leve (VH e VL, respectivamente, forma o sítio de ligação ao anticorpo. A atribuição dos aminoácidos para cada região ou domínio está de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk (1987) J. MoI. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883. O termo "anticorpo" abrange um anticorpo que é parte de um multímero do anticorpo (uma forma multimérica de anticorpos), como dímeros, trimeros, ou multímeros de ordem superior de anticorpos monoméricos. Ele abrange ainda um anticorpo que está ligado ou unido ou de outro modo, fisicamente ou funcionalmente associado com uma fração que não de anticorpo. Além disso, o termo "anticorpo"não está limitado por qualquer método particular de produção do anticorpo. Por exemplo, inclui inter alia, anticorpos recombinantes, anticorpos monoclonais, e anticorpos policlonais.

[00028] O termo "derivado de anticorpo" ou "derivado" de um anticorpo refere-se a uma molécula capaz de ligar-se ao mesmo antígeno (por exemplo, OX40R) que o anticorpo se liga e compreende uma sequência de aminoácidos do anticorpo ligada a uma entidade molecular adicional. A sequência de aminoácido do anticorpo contida no derivado de anticorpo pode ser o anticorpo de comprimento total ou pode ser qualquer parte ou partes de um anticorpo de comprimento total. A entidade molecular adicional pode ser uma molécula química ou biológica. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem grupos químicos, aminoácidos, peptídeos, proteínas (como enzimas, anticorpos), e compostos químicos. A entidade molecular adicional pode ter qualquer utilidade, tal como para emprego do agente de detecção, rótulo, marcador, agente farmacêutico ou terapêutico. A sequência de aminoácido de um anticorpo pode ser ligada à entidade adicional por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de um outro modo. O termo "derivado de anticorpo"também abrange anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, e moléculas derivadas de modificações das sequências de aminoácido de um anticorpo OX40R, tal como conservação de substituições, adições e inserções de aminoácido.

[00029] O termo "fragmento de ligação ao antígeno"de um anticorpo refere-se a uma ou mais partes de um anticorpo de comprimento total que retém a capacidade de ligação ao mesmo antígeno (por exemplo, OX40R) ao qual o anticorpo se liga. O termo "fragmento de ligação ao antígeno" também abrange a parte de um anticorpo que faz parte de uma molécula maior formada pela associação covalente ou não covalente da parte do anticorpo com uma ou mais entidades moleculares adicionais. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem aminoácidos, peptídeos ou proteínas, como a região de núcleo de estreptavidina, que pode ser empregada para produzir uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al., 1995), Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), um resíduo de cistina, um peptídeo marcador, ou um marcador de poli-histidina C-terminal, que pode ser empregado para fazer moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov et al., (1994), Mol. Immunol. 31:1047-1058).

[00030] O termo "molécula de ligação"abrange (1) anticorpo, (2) fragmento de ligação ao antígeno ou a um anticorpo e (3) derivado de um anticorpo, cada qual como aqui indicado.

[00031] O termo " liga-se a OX40R" ou "ligação a OX40R" refere-se à ligação de uma molécula de ligação conforme aqui empregado, ao OX40R em um ensaio in vitro, como um ensaio BIAcore. Ligação significa uma afinidade de ligação (KD) de 1 x 10-6M ou menor.

[00032] O termo "anticorpo quimérico"refere-se a um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácido derivada de dois ou mais diferentes anticorpos. Os dois ou mais diferentes anticorpos podem ser da mesma espécie ou de duas ou mais espécies diferentes.

[00033] O termo "substituição de aminoácido conservadora" refere- se a uma substituição de um resíduo de aminoácido por um outro resíduo de aminoácido, em que os grupos R da cadeia lateral dos dois resíduos de aminoácido têm propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) Exemplos de grupos de aminoácido que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; 2) cadeias laterais alifática-hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina.

[00034] Grupos de substituição de aminoácidos conservadores são, por exemplo, valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina.

[00035] O termo "epitopo" refere-se à parte de um antígeno que é capaz de ligação específica a um anticorpo, ou receptor de célula T, ou diferentemente, de interação com uma molécula. "Epitopo"também é conhecido na técnica como "determinante antigênico". Um epitopo, consiste, em geral de grupamento superficiais quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou carboidratos ou cadeias laterais de açúcar, e, geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específica. Um epitopo pode ser "linear" ou "conformacional". Uma vez um desejado epitopo de um antígeno seja determinado, anticorpos daquele epitopo podem ser gerados, por exemplo, usando as técnicas aqui descritas. A geração e caracterização de anticorpos também pode explicar informação acerca de epitopos desejáveis. Desta informação, é possível então selecionar competitivamente os anticorpos para ligação ao mesmo epitopo. Uma abordagem para se conseguir isto, é realizar testes de competição cruzada com o fito de encontrar anticorpos que se ligam competitivamente uns aos outros, ou seja, os anticorpos competem para ligação ao antígeno. Um processo de alta produção para "ligação"de anticorpos com base em sua competição cruzada está descrito na Publicação PCT n° WO 03/48731.

[00036] O termo "linha germinativa" refere-se a sequências de nucleotídeo dos genes do anticorpo e segmentos genéticos à medida que passaram de pais para a descendência via células germinativas. A sequência da linha germinativa distingue-se das sequências de nucleotídeo codificando anticorpos, em células B maduras que foram alteradas por eventos de recombinação e hipermutação durante o curso da maturação de célula B.

[00037] O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão. O termo abrange não apenas a célula individual particular, mas também a progênie dessa célula. Devido a ocorrência de determinadas modificações nas gerações seguintes, devido a, tanto influencias de mutação ou ambientais, essa progênie pode não ser idêntica à célula de origem, porem ainda estará inclusa no escopo do termo "célula hospedeira". O termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo consistindo de sequências de aminoácido ou de sequência de imunoglobulina humana apenas. Um anticorpo humano pode conter cadeias de carboidrato de murídeo caso produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo, ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Anticorpos humanos podem ser preparados de vários modos conhecidos na técnica.

[00038] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico contendo resíduos de aminoácido derivados de sequências de anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode conter algumas ou todas as CDRs de um anticorpo de animal não humano, enquanto as regiões do quadro genético e regiões constantes do anticorpo contém resíduos de aminoácido derivados de sequências de anticorpo humano

[00039] O termo "mamífero"refere-se a qualquer espécie animal da classe Mammalia. Exemplos de mamífero incluem: humanos, animais de laboratório, tais como ratos, camundongos, símios e porquinhos da índia, animais domésticos, como gatos, cães, coelhos, gado, ovelha, cabras, cavalos e porcos; e animais selvagens cativos, como leões, tigres, elefantes, e outros.

[00040] O termo "ácido nucleico isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico de cDNA genômico, ou de origem sintética, ou uma combinação destes, separado de outras moléculas de ácido nucleico presentes na fonte natural do ácido nucleico. Por exemplo, com relação ao DNA genômico, o termo "isolado" inclui moléculas de ácido nucleico separadas do cromossomo com o qual o DNA genômico está naturalmente associado. Preferivelmente, um ácido nucleico "isolado"está isento de sequências que, flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (ou seja, sequências localizadas na extremidade 5' e 3' do ácido nucleico de interesse) no DNA genômico do organismo do qual é derivado o ácido nucleico.

[00041] O termo "anticorpo isolado" ou "molécula de ligação isolada" refere-se a um anticorpo ou a uma molécula de ligação que: 1) não está associado com componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo; (2) é isento de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expressado por uma célula de espécies diferentes, ou (4) não ocorre na natureza. Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo OX40R que foi purificado por afinidade usando OX40R, um anticorpo OX40R que foi gerado por hibridomas ou outra linhagem celular in vitro e um anticorpo OX40R humano derivado de um animal transgênico.

[00042] O termo "KD" refere-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação particular anticorpo-antígeno empregado para descrever a afinidade de ligação entre um ligante (como um anticorpo) e uma proteína (como OX40R). Quanto menor for a constante de dissociação de equilíbrio, mais forte será a ligação ao ligante, ou maior a afinidade entre o ligante e a proteína. Um KD pode ser medido por ressonância de plasmon superficial, por exemplo, usando o sistema BIACORE™. Um procedimento de ensaio usando o sistema BIACORE™ (ensaio BIAcore) está descrito no parágrafo Exemplos desta apresentação.

[00043] O termo " coeficiente de desvio"ou "kd" refere-se a constante de coeficiente de dissociação de uma interação particular de anticorpo-antígeno. Uma constante de taxa de dissociação pode ser medida por ressonância de plasmon superficial, por exemplo, usando o BIACORE™.

[00044] O termo "anticorpo OX40R" refere-se a um anticorpo, conforme aqui empregado, capaz de ligação ao OX40R humano.

[00045] O termo "receptor OX40" e OX40R"são empregados permutavelmente no presente pedido de patente incluindo o OX40R humano, bem como suas variantes, isoformas, e espécies homólogas. Portanto, molécula de ligação humanas aqui apresentadas podem em alguns casos ligar-se também ao OX40R de espécies diferentes de humanos. Em outros casos, as moléculas de ligação podem ser completamente específicas para o OX40R humano, e podem não apresentar espécies ou outros tipos de reatividade cruzada.

[00046] O termo " liga-se especificamente ao OX40R humano" em referência à interação de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, com seu par de ligação, por exemplo, um antígeno, significa que o KD de uma molécula de ligação para ligação ao Cd40, CD137 ou Cd271 é mais do que 100 vezes o KD para sua ligação ao OX40R humano, conforme determinado em um ensaio in vitro.

[00047] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar uma outra molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem plasmídeos, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, vetores cosmídeos ou fagemídeos. Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos, com uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissomais). Alguns vetores podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira pela introdução à célula hospedeira, e daí serem replicados junto com o genoma hospedeiro (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais). Alguns vetores são capazes de direcionar a expressão genética para a qual eles são ligados operativamente, podendo por isso ser referidos como "vetores de expressão".

[00048] Conforme aqui empregado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991)).

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO QUE SE LIGAM A OX40R HUMANO

[00049] A presente apresentação proporciona moléculas de ligação isoladas que se ligam ao OX40R humano, incluindo anticorpos OX40R, fragmento de ligação ao antígeno dos anticorpos OX40R, e os derivados dos anticorpos OX40R. As moléculas de ligação são caracterizada por pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: a) ligam-se ao OX40R humano com um KD de 1 x 1 0-6 M ou menos; b) têm atividade agonista para o OX40R humano ; c) não se ligam ao receptor de CD40 a concentração até 500 nM; d) não se ligam ao receptor de Cd137 a concentrações de até 500 nM; e) não se ligam ao receptor de CD271 a concentrações de até 500 nM; f) são capazes de intensificar a produção de IL-2 por células T humanas isoladas; b) são capazes de intensificar a resposta imune; h) são capazes de inibir o crescimento de células de tumor; e (i) têm efeito terapêutico em um câncer. Em algumas modalidades,a molécula de ligação liga-se ao OX40R humano com um KD de 1 x 10-7 M ou menos ou 1 x 10-8 ou menos, ou 5 x 1 x 10-9 M ou menos.

Anticorpos OX40R humanos

[00050] Em alguns primeiros aspectos, a presente descrição propicia um anticorpo humano que se liga ao OX40R humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao OX40R humano com um KD de 100 nm ou menos, preferivelmente 10 nM ou menos, e possui atividade agonista junto ao OX40R humano. Um exemplo desses anticorpo humanos é o anticorpo monoclonal humano 11D4. Um exemplo desses anticorpos humanos é o anticorpo monoclonal humano 11D4. A sequência de aminoácido de cadeia pesada e secai da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo. 11Da são mostradas na SEQ ID NOs: 9 e 7, respectivamente. A sequência de aminoácido de cadeia leve e a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo 11K4 são mostradas em SEQ ID NOs: 10 e 8, respectivamente. Os isotipos do anticorpo 11D4 são IgG2 para a cadeia pesada e Kappa para a cadeia leve. Os alótipos do anticorpo 11De são G2(n-) para a cadeia pesada e Km3 para a cadeia leve. As sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve maduras são derivadas de tradução conceitual de sequências de DNA nos construtores de expressão. O anticorpo 11D4 não contém mutações do quadro genético na cadeia pesada ou leve, porém contém uma mutação na cadeia pesada CDR2.

[00051] Um outro anticorpo ilustrativo da apresentação é o anticorpo monoclonal humano 18D8. A sequência de aminoácido da região VH e região VL do anticorpo 18 D8 está mostrada na SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente. A sequência de aminoácido de cadeia pesada e cadeia leve está mostrada nas SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente.

[00052] Isto exposto, 11D 4 e 18D8 ligam-se ao OX40R, as sequências VH e VL= de cada um deles pode ser "misturada e combinada" com outros anticorpos OX40R para criar anticorpos adicionais. A ligação desses anticorpos "misturados e combinados" ao OX40R pode ser testada usando os ensaios de ligação conhecidos da técnica, incluindo um ensaio descrito no s Exemplos. Em um caso particular, quando as regiões VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência VH de um dado pareamento VH e VL é substituída com uma sequência VH de estrutura semelhante. Do mesmo modo, em um outro caso, uma sequência VL de um dado pareamento é substituída com uma sequência VL de estrutura semelhante.

[00053] Portanto, em algumas modalidades,a apresentação obtém um anticorpo OX40R isolado compreendendo: 1) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 11D4 ou 18D8, 2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 7 ou 19, ou 3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de ácido nucleico das SEQ ID NOs: 11 ou 23. Em outras modalidades, a apresentação propicia um anticorpo OX40R isolado compreendendo: 1) uma região variável de cadeia leve do anticorpo 11D4 ou 18D8, 2) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 8 ou 20, ou 3) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de ácido nucleico das SEQ ID NOs: 12 ou 24.

[00054] Em outro aspecto, a apresentação obtém anticorpos compreendendo as CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de 11D4 ou 11 D8. A sequência de aminoácido de VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 de 11D4 está mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 respectivamente. A sequência de aminoácido de VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 do anticorpo 11D4 está mostrada nas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente. A sequência de aminoácido de VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3, do anticorpo 18D8 está mostrada nas SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente. A sequência de aminoácido de VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3, do anticorpo 18D8 está mostrada nas SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente. AS regiões CDR são esboçadas usando o sistema (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

[00055] Do exposto que 11D4 e 18D8 ligam-se a OX40R humano, e que a especificidade para ligação ao antígeno é dada principalmente por regiões CDR1, CDR2 e CDR3, as sequência CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e CDR1, CDR2 e CDR3 de VL podem ser "misturadas e combinadas" para criar anticorpos OX40R adicionais. Por exemplo, CDR3 de diferentes anticorpos OX40R podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo conterá tipicamente, uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VL. A ligação desses anticorpos "misturados e combinados" ao OX40R pode ser submetida a teste usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, análise Biacore ELISA). Em um caso, quando as sequências CDR VH são misturadas e combinadas as sequências CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma dada sequência VH são substituídas com uma sequência CDR de estrutura semelhante. Similarmente, quando as sequências CDR VL são misturadas e combinadas a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma dada sequência VL é substituída, tipicamente com uma(s) sequência(s) CDR de estrutura semelhante. Será prontamente evidente aos de prática comum na técnica, que as novas sequências VH e VL podem ser criadas substituindo-se uma ou mais sequências da região CDR de VH e/ou VL com sequências estruturalmente semelhante das sequência CDR aqui apresentadas.

[00057] Portanto, em algumas modalidades,a apresentação obtém 1) um anticorpo monoclonal isolado compreendendo pelo menos uma CDR selecionada de VH CDR1, VH CDR2 ou VH CDR3 do anticorpo 11D4 ou 18D8. Em outras modalidades, a descrição propicia um anticorpo monoclonal isolado compreendendo pelo menos uma CDR selecionada de VL CDR1, VL CDR2 ou VL CDR3 do anticorpo 11D4 ou 18D8. Em algumas modalidades adicionais, a apresentação propicia um anticorpo monoclonal isolado compreendendo pelo menos uma CDR selecionada de uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 1 ou 13, ou uma sequência diferente das SEQ ID NOs: 1 ou 3, em 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservadoras; uma CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 2 ou 14 ou uma sequência diferente das SEQ ID NOs: 2 ou 14, em 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservadoras e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 3 ou 15 ou uma sequência diferentes das SEQ ID NOs: 3 ou 15, em 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido conservadores.

[00058] Em ainda algumas outras modalidades, a apresentação propicia um anticorpo monoclonal isolado compreendendo pelo menos uma CDR selecionada de: uma CDR1 V L compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 4 ou 16 ou uma sequência diferente das SEQ ID NOs: 4 ou 16, em 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservadoras; uma CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 5 ou 17 ou uma sequência diferente das SEQ ID NOs: 5 ou 17 em 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido conservadoras e uma CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 6 ou 18 ou uma sequência diferente das SEQ ID NOs: 6 ou 18 em 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido conservadoras.

[00059] Em alguns casos, lisina C-terminal de cadeia pesada de um anticorpo OX40R é clivado (Harris R. J., J. of Chromatography, 705: 129-134 (1995)). As cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos OX40R podem incluir, opcionalmente, uma sequência de sinal.

[00060] A classe (por exemplo, IgG, IgM, IgE, IgA, ou IgD) e subclasses (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4) dos anticorpos OX40R pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Geralmente, a classe e subclasse de um anticorpo pode ser determinada usando anticorpos que, são específicos para uma dada classe e subclasse do anticorpo. Tais anticorpos são comercialmente disponíveis. A classe e subclasse pode ser determinada por ELISA, ou Western Blot, bem como por outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse pode ser determinada por sequenciamento de todos ou uma parte dos domínios constantes dessas cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos comparando-se suas sequências de aminoácido com as sequências de aminoácido conhecidas de varias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando-se a classe e subclasse dos anticorpos. Os anticorpos OX40R podem ser uma molécula de IgG, uma IgM, uma IgE, uma IgA, ou uma IgD. Em outras modalidades, os anticorpos OX40R podem ser uma IgG e é uma subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Assim em um outro aspecto da apresentação, é proporcionado um método para converter a classe ou sub-classe de um anticorpo OX40R em uma outra classe ou subclasse. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico codificando uma VL ou VH que não inclui sequências codificando CL ou CH é isolada usando métodos do conhecimento da técnica. A molécula de ácido nucleico então é operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico codificando uma CL ou CH de uma desejada classe ou subclasse de imunoglobulina. Isto pode ser conseguido usando-se um vetor ou molécula de ácido nucleico compreendendo uma cadeia CL ou CH conforme descrito acima. Por exemplo, um anticorpo OX40R que foi originalmente IgM pode ser trocado de classe para uma IgG. Além disso, a classe que troca pode ser usada para converter uma subclasse IgG em uma outra, por exemplo, de IgG1 para IgG2. Um outro método para produzir um anticorpo compreendendo um desejado isotipo, compreende as etapas de isolar um ácido nucleico codificando uma cadeia pesada de um anticorpo OX40R e um ácido nucleico codificando uma cadeia leve de um anticorpo OX40R, isolar a sequência codificando a região VH, ligar a sequência VH a uma sequência codificando um domínio constante de cadeia pesada do desejado isotipo, expressar o gene de cadeia leve e o construtor de cadeia pesada em uma célula e coletar o anticorpo OX40R com o desejado isotipo.

Fragmentos de ligação ao Antígeno

[00061] Em um outro aspecto, a presente descrição propicia fragmentos de ligação ao antígeno de quaisquer anticorpos OX40R humanos, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado de: 1) uma cadeia leve de um anticorpo OX40R ; 2) uma cadeia pesada de um anticorpo OX40R; 3) uma região variável de cadeia leve de um anticorpo OX40R; 4) uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo OX40R ; 5) uma ou mais CDRs (duas, três, quatro cinco u seis CDRs) de um anticorpo OX40R; ou 6 ) três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada de um anticorpo OX40R. Em algumas modalidades particulares, a patente propicia um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo 11D4 ou 18D8. Em algumas outras modalidades particulares, os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo OX40R inclui: i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo de domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente composto de dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região articulada; (iii) um fragmento Fd significa um fragmento de anticorpo consistindo dos domínios VH e CH1, (iv) um fragmento Fv consiste dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)0 consiste de um domínio VH. (vi) uma CDR isolada, e (vii) anticorpo de cadeia simples (scFv), que se trata de um polipeptídeo compreendendo uma região VL de um anticorpo ligado a uma região VH de um anticorpo . Bird et al., (1988) Science 242:23-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-588 3. Um fragmento de ligação ao antígeno também pode compreender dois ou mais fragmentos mais curtos, ou da mesma cadeia pesada ou mesma cadeia leve ou de diferentes cadeias. Fragmentos de ligação ao antígeno tais como fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser preparados de anticorpos completos usando técnicas convencionais tais como digestão de papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos totais. Eles também podem ser obtidos usando-se técnicas de DNA recombinante como aqui descrito.

Derivados de Anticorpo

[00062] Em outros aspectos ainda a presente invenção propicia derivados de quaisquer anticorpos OX40R aqui descritos.

[00063] Em um aspecto particular, o derivado de anticorpo é derivado de modificações das sequências de aminoácido de 11D4 ou 18D8. Sequências de aminoácido de quaisquer regiões de cadeias de anticorpo podem ser modificadas como regiões do quadro genético regiões CDR ou regiões constantes. As modificações podem ser introduzidas por técnicas padrão conhecidas na técnica tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR aleatória, compreendendo aminoácidos naturais bem como os não naturais.

[00064] Tipos de modificações incluem substituições, inserções deleções ou combinações destes, de um ou mais aminoácidos de um anticorpo OX40R. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido nas CDRs de cadeia pesada e/ou uma substituição de aminoácido nas cDRs de cadeia leve. Em algumas modalidades, um derivado de um anticorpo OX40R compreende uma ou mais substituições de aminoácido em relação à sequência de aminoácido de linha germinativa do gene humano. Em uma modalidade particular, u ma ou mais substituições da linhagem germinativa está na região CDR2 de cadeia pesada. Em outra modalidade particular, as substituições de aminoácido em relação à linha germinativa estão em uma ou mais das posições iguais como substituições relativas à linha germinativa em anticorpos 11D4 ou 18D8. Em outras modalidades, a substituição de aminoácido deve alterar uma ou ais cisteínas em um anticorpo em um outro resíduo, como sem limitação, alanina ou serina. A cisteína pode ser uma cisteína canônica ou não canônica . A substituição pode ser feita em uma região CDR ou do quadro genético de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. U outro tipo de substituições de aminoácido consiste em eliminar pares asparagina-glicina que formam sítios de desamidação potenciais, alterando um ou ambos os resíduos. Em outras modalidades ainda, a substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido conservadora. Numa modalidade,o derivado de anticorpo possui 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido conservadoras ns regiões CDr de cadeia pesada em relação às sequências de aminoácido de 11D4 ou 18D8.

[00065] Um outro tipo de modificação de um anticorpo OX40R é a alteração do padrão de glicosilação original do anticorpo. O termo "alteração"refere-se à deleção de uma ou mais frações carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação dos anticorpos, é tipicamente ligada a N. "Ligada a N" refere-se à ligação da fração carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. A adição dos sítios de glicosilação ao anticorpo é realizada, convenientemente, alterando-se a sequência de aminoácido de modo que ela contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo supracitadas, (para sítios de glicosilação N-ligados).

[00066] Ainda um outro tipo de modificação envolve a remoção de quaisquer frações carboidrato presentes no anticorpo, que pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer exposição do anticorpo a um composto, tal como ácido trifluormetanosulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria de todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o anticorpo intato. A desglicosilaçao química está descrita por Sojahr, H. T., e Bahl, O. P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 and by Edge, A. S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. A clivagem enzimática das frações carboidrato nos anticorpos pode ser adquirida mediante uso de uma série de endo- e exo-glicosidades conforme descrito por Thotakura, N. R., e Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

[00067] Exemplos de outras modificações incluem acetilação, acilação, amidação, reticulação, ciclização, formação de ponte dissulfeto, desmetilação, formação de reticulação covalente, formação de cistina, formilação, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilaçao, oxidação, peguilaçao, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação e sulfatação.

[00068] Em um aspecto ulterior, é obtido um derivado de anticorpo compreendendo um anticorpo OX40R ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito no presente, ligado a uma entidade molecular adicional. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem agentes farmacêuticos, peptídeos ou proteínas e agente de detecção ou rótulos. Exemplos específicos de agentes farmacêuticos que podem ser ligados a um anticorpo OX40R incluem agentes citotóxicos ou outros agentes terapêuticos de câncer, e isótopos radioativos. Exemplos específicos de peptídeos ou proteína que podem ser ligados a um anticorpo OX40R incluem anticorpos que podem ser o mesmo anticorpo OX40R ou um anticorpo diferente. Exemplos específicos de agentes de detecção ou rótulos que podem ser ligados a um anticorpo OX40R incluem 1) compostos fluorescentes, como fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5- dimetilamina-1-naftalenosulfonila, ficoetritrina, e fósforos lantanídeos; 2) enzimas como peroxidase de rábano de cavalo, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina e glicose oxidase; 3) biotina, 4) um predeterminado epitopo de polipeptídeo reconhecido por um gene repórter secundário, tal como sequências de par zíper leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, e marcadores de epitopo. Numa modalidade particular, o derivado de anticorpo é um multímero do anticorpo OX40R, que é uma forma multimérica de um anticorpo OX40R, como dímeros, trimeros ou multímeros de ordem superior de anticorpo, de anticorpos monoméricos. Monômeros individuais dentro de um multímero de anticorpo podem ser idênticos ou diferentes, ou seja, eles podem ser multímeros de anticorpo heteroméricos ou homoméricos. Anticorpos individuais dentro de um multímero podem ter especificidades de ligação iguais ou diferentes. A multimerização de anticorpos pode ser realizada através da agregação natural de anticorpos. Por exemplo, alguma percentagem de preparações de anticorpo purificado (por exemplo, moléculas IgG1 purificadas) formam agregados de proteína contendo homodímeros de anticorpo e outros multímeros de anticorpo de ordem superior. Alternativamente, homodímeros de anticorpo podem ser formados através de técnicas de ligação química conhecidas na técnica, tal como por emprego de agentes de reticulação hetero- bifuncionais . Reticuladores adequados incluem os que são hetero- bifuncionais, tendo dois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (tal como éster m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida, 4- (maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato de succinimidila e S-acetiltio-acetato de N-succinimidila ou homo- bifuncional(como suberato de dissuccinimidila). Esses ligantes estão comercialmente disponíveis de Pierce Chemical Company Rockford, II. Anticorpos também podem ser preparados para multimerizar através de técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica.

[00069] Em um outro aspecto ainda, o derivado de anticorpo é um anticorpo quimérico compreendendo uma sequência de aminoácido de um anticorpo OX40R humano descrito acima. Em um exemplo, uma ou mais CDRs de um anticorpo OX40R humano é combinada com CDRs de um anticorpo de um animal que não um ser humano, como camundongo ou rato. Num outro exemplo, todas as CDRs do anticorpo quimérico são derivadas de anticorpos OX40R humanos. Num outro exemplo as CDRs de mais de um anticorpo OX40R humano são combinadas em um anticorpo quimérico. Além disso, um anticorpo quimérico pode compreende as regiões d o quadro genético derivadas de um anticorpo OX40R humano e uma ou mais cDRs de um ou mais diferentes anticorpos humanos. Anticorpos quiméricos podem ser gerados usando-se métodos convencionais do conhecimento da técnica. Em algumas modalidades particulares, o anticorpo quimérico compreende uma, duas ou três CDRS da região variável de cadeia pesada ou da região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado dentre anticorpo 11D4 ou 18D8.

[00070] Exemplos de outros derivados de anticorpo proporcionados pela presente invenção incluem anticorpos de cadeia simples, diacorpos, anticorpos dominantes, nanocorpos, e unicorpos. Um "anticorpo de cadeia simples" (scFv) consiste de uma única cadeia polipeptídica composta por um domínio VL ligado a um domínio VH em que o domínio VL e o domínio VH são emparelhados para formar uma molécula monovalente. Anticorpo de cadeia simples pode ser preparado de acordo com métodos conhecidos na técnica. (ver por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Um "diacorpo" consiste de duas cadeias, cada qual compreendendo uma região variável de cadeia pesada ligada a uma região variável de cadeia leve na mesma cadeia polipeptídica ligada por um ligante peptídico curto, em que as duas regiões na mesma cadeia não formam par entre si, porém com domínios complementares na outra cadeia para formar uma molécula biespe- cífica. Métodos de preparação de diacorpos são do conhecimento da técnica. Ver por exemplo, Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, and Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2:11211123). Anticorpos de domínio (dAbs) são unidades de ligação funcionais pequenas de anticorpos correspondendo às regiões variáveis de cadeias, ou pesada ou leve de anticorpos. Anticorpos de domínio são bem expressados em bactérias, levedura e sistemas celulares de mamífero. Mais detalhes de anticorpos de domínio e métodos de produção dos mesmos, são do conhecimento da técnica. (ver, por exemplo, U.S. Patente Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; Patentes européias 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 e WO03/002609. Nanocorpos são derivados de cadeias pesadas de um anticorpo. Um nanocorpo compreende, tipicamente, um único domínio variável e dois domínios constantes (CH2 e CH3) e retém a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo original. Nanocorpos podem ser preparados por métodos conhecidos da técnica. (ver por exemplo, Patente U.S. No. 6,765,087, Patente U.S. No. 6,838,254, WO 06/079372). Unicorpos consistem de uma cadeia leve e uma cadeia pesada de um anticorpo IgG4. Unicorpos podem ser produzidos pela remoção da região de articulação de anticorpos IgG4. Mais detalhes de unicorpos e métodos de prepará-los podem ser encontrados em WO2007/059782.

MÉTODOS DE PRODUÇÃO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO

[00071] Moléculas de ligação conforme aqui apresentado, podem ser produzidas por técnicas conhecidas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein (Nature 256:495, (1975), bem como outras técnicas como transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

Imunização de Animais Não Humanos

[00072] A apresentação também propicia um método para produção de anticorpos OX40R ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreendendo imunizar um animal não humano compreendendo locais de imunoglobulina humana com um antígeno de OX40R, e isolar o anticorpo do animal imunizado ou de células derivadas do animal imunizado.

[00073] Exemplos de animais não humanos adequados incluem um animal transgênico ou transcromossômico, como HuMAb Mouse®, KM Mouse®, "camundongos TC" e Xenomouse™. O HuMAb Mouse® (Medarex Inc.) contém miniloci de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia pesada ( μ e y) e cadeia leve K, juntamente com mutações, que inativam os loci de cadeia μ e K endógenas (ver por exemplo, Lonberg, et al., (1994), Nature 368:856-859). Portanto, os camundongos apresentam expressão reduzida de IgM ou k de camundongo, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanas passam por troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGk humanos (Ver por exemplo, Harding, F. e Lonberg N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546) Preparações e uso de HuMAb Mouse®, e modificações genômicas feitas por esses camundongos, está em reconhecido na técnica (Ver, por exemplo, Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851). O camundongo KM™ porta um transgene de cadeia pesada humana e um transcromossoma de cadeia leve humana e estão descritos em detalhe em Wo 02/43478. O Xenomouse™ Abgenix, Inc.) contem grandes fragmentos de loci de imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpo de camundongo. Este modelo animal é do conhecimento da técnica. (ver por exemplo, U.S. Patente Nos.: 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584; e 6,162,963). "Camundongos TC"também são camundongos engenheirados portando, tanto um transcromossoma de cadeia pesada humana e um transcromossoma de cadeia leve humana. Esses camundongos estão descritos em Tomizuka et al., (200)) Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:722-727.

[00074] O antígeno OX40R para emprego na imunização do animal pode ser isolado e/ou OX40R purificado e é preferivelmente um OX40R humano. Numa modalidade, o antígeno OX40R é um fragmento do OX40R humano, preferivelmente o domínio extracelular do OX40R. Numa outra modalidade, o antígeno OX40R é um fragmento compreendendo pelo menos um epitopo do OX40R humano. Numa outra modalidade, o antígeno OX40R é uma célula expressando OX40R em sua superfície celular, mais particularmente uma célula que superexpressa o OX40R em sua superfície celular. A imunização dos animais pode ser feita por qualquer método do conhecimento da técnica. Ver, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1 990). Métodos particulares para imunização de animais não humanos como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, cago e cavalos são do conhecimento da técnica (ver, por exemplo, Harlow and Lane (1990); U.S. Pat. No. 5,994,619). O Exemplo 1 fornece um método de imunização de camundongos HuMab.

[00075] Após a imunização do animal com um antígeno OX40R, os anticorpos e/ou células produtoras de anticorpo podem ser obtidos do animal. Numa modalidade, o soro é obtido do animal e uma fração de imunoglobulina pode ser obtida do soro, ou os anticorpos OX40R podem ser purificados do soro.

[00076] Os anticorpos OX40R também podem ser produzidos, usando células imortalizadas produtoras de anticorpo preparadas de células isoladas do animal imunizado. Após a imunização, o linfonodo e/ou células B do baço são coletadas do animal e imortalizadas por métodos adequados. Métodos de imortalização de células incluem, sem limitação, a transfecção com oncogenes, infectando-as com um vírus oncogênico e cultivando-as sob condições que selecionam para células imortalizadas, submetendo-as aos compostos carcinogênicos ou de mutação, fundindo-as com u ma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma e inativando um gene supressor de tumor (Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra). Numa modalidade particular, as células B do baço coletadas do animal imunizado são fundidas a células de mieloma imortalizadas para formar hibridomas imortaliza dos produtores de anticorpo. As células de mieloma, preferivelmente não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linha de célula não secretora). Hibridomas imortalizados são selecionados usando o antígeno OX40 (por exemplo, o OX40R, ou uma parte dele ou uma célula expressando o OX40R). A seleção inicial pode ser realizada usando um imunoensaio de ligação a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio. Um exemplo de teste de seleção ELISA está descrito em WO 00/37504.

[00077] As células produtoras do anticorpo OX40R por exemplo, hibridomas são selecionadas e clonadas, e ainda selecionadas com critério, para características desejáveis incluindo, crescimento robusto, alta produção de anticorpo, e desejáveis características do anticorpo, conforme descrito a seguir. Hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singeneicos, em animais que carecem de um sistema imune, por exemplo, camundongos escalvados, ou em cultura celular in vitro .

[00078] Portanto, são obtidos métodos para produzir uma célula produtora de um anticorpo OX40R monoclonal humano, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo: (a) imunizar um animal transgênico não humano com um antígeno de OX40R; b) deixar o animal construir uma resposta imune para o antígeno de OX40R; c) isolar as células produtoras de anticorpo do animal; e d) imortalizar as células produtoras de anticorpo. Numa modalidade, o método compreende adicionalmente (e) criar populações monoclonais individuais das células produtoras de anticorpo imortaliza das que produzem um anticorpo OX40R desejado.

VETORES DE ÁCIDOS NUCLEICOS, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, E MÉTODOS RECOMBINANTES DE PRODUÇÃO DOS ANTICORPOS OX40R

[00079] Um outro aspecto da apresentação propicia uma molécula de ácido nucleico isolada codificando uma sequência de aminoácido de uma molécula de ligação que liga o OX40R humano. A sequência de aminoácido codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser qualquer parte de um anticorpo intato, tal como uma CDR, uma sequência compreendendo uma, duas ou três CDRs ou uma região variável de uma cadeia pesada ou cadeia leve ou pode ser uma cadeia pesada de comprimento total ou cadela leve. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido compreendendo 1) uma região CDR3, particularmente, uma região CDR3 de cadeia pesada dos anticorpos 11D4 ou 18D8; 2) uma região variável de uma região de cadeia pesada ou região variável de uma cadeia leve dos anticorpos 11D4 ou 18D8; ou 3) uma cadeia pesada ou uma cadeia leve dos anticorpos 11D4 ou 18D8. Em outras modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22. Em outras modalidades ainda, a molécula de ácido nucleico é selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 11, 12, 23, e 24.

[00080] As moléculas de ácido nucleico obtidas pela invenção podem ser obtidas de qualquer fonte que produza um anticorpo OX40R. mRNA e células produtoras de anticorpo OX40R podem ser isolados por técnicas padrão, clonados e/ou amplificados usando PCR e técnicas de construção de biblioteca, sendo submetido a teste usando protocolos padrão para obter moléculas de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácido de um anticorpo OX40R. O mRNA pode ser usado para produzir cDNA para uso na reação em cadeia da polimerase (PCR) ou clonagem do cDNA dos genes do anticorpo. Numa modalidade, a molécula de ácido nucleico é obtida de um hibridoma que expressa um anticorpo OX40R, conforme descrito acima, preferivelmente um hibridoma que possui como um de seus pares de fusão, uma célula de animal transgênico não humano que expressa genes de imunoglobulina humana. Numa outra modalidade, o hibridoma é derivado de um animal não humano, não transgênico.

[00081] Uma molécula de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de um anticorpo OX40R pode ser construída por fusão de uma molécula de ácido nucleico codificando a região variável de cadeia pesada com uma molécula de ácido nucleico codificando uma região constante de uma cadeia pesada. Similarmente, uma molécula de ácido nucleico codificando a cadeia leve de um anticorpo OX40R pode ser construída por fusão de uma molécula de ácido nucleico codificando a região variável de cadeia leve com uma molécula de ácido nucleico codificando uma região constante de uma cadeia leve. As moléculas de ácido nucleico codificando as cadeias VH e VL podem ser convertidas em genes de anticorpo de comprimento total por inserção das mesmas nos vetores de expressão, que já codifica regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente, de modo que, o segmento VH é operativamente ligado a região constante de cadeia pesada segmento(s) (CH) dentro do vetor e o segmento VL é operativamente ligado ao segmento (CL) da região constante de cadeia leve dentro do vetor. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico codificando as cadeias VH ou VL são convertidas em genes do anticorpo de comprimento total por ligação, por exemplo ligando a molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia VH a uma molécula de ácido nucleico codificando uma cadeia CH usando técnicas biológicas moleculares padrão. O mesmo pode ser conseguido usando-se moléculas de ácido nucleico codificando cadeias Vl e CL. As sequências de genes da região constante de cadeia pesada e leve humana são conhecidas na técnica. Ver em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. As molécula de ácido nucleico codificando as cadeias de comprimento total pesada e/ou leve podem então, ser expressada de uma célula para a qual elas foram introduzidas sendo o anticorpo OX40R isolado.

[00082] As moléculas de ácido nucleico podem ser empregadas para expressar de modo recombinante grandes quantidades dos anticorpos OX40R conforme descrito a seguir. As moléculas de ácido nucleico também podem ser usada para produzir outras moléculas de ligação obtidas pela presente descrição, tal como anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos que sofreram mutação, e derivados de anticorpo, conforme descrito algures no presente. Numa modalidade, uma molécula de ácido nucleico é usada como sonda genética ou iniciador da PCR para sequências específicas do anticorpo. Por exemplo uma sonda de molécula de ácido nucleico pode ser usada em métodos de diagnostico ou um iniciador da PCR de molécula de ácido nucleico pode ser empregado para amplificar regiões de DNA que poderia ser usado, inter alia, para isolar sequências de ácido nucleico para uso na produção de regiões variáveis dos anticorpos OX40R .

[00083] Uma vez que as moléculas de DNA codificando os segmentos VH e VL de um anticorpo OX40R sejam obtidas, essas moléculas de DNA podem ser mais manipuladas ainda para técnicas de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia do anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab, ou em um gene scFv. Nessas manipulações, uma molécula de DNA codificando um VL ou VH é operativamente ligada a uma outra molécula de DNA codificando um outro polipeptídeo, tal como uma região constante do anticorpo ou um ligante flexível. O ermo "operativamente ligado" conforme aqui empregado,significa que, as duas moléculas de dNA são unidas de modo que as sequências de aminoácido codificada pelas duas moléculas de DNA permanecem no quadro.

[00084] A molécula de DNA isolada codificando a região VH pode ser convertida em um gene de cadeia pesada de comprimento total ro ligação operativa da molécula de DNA codificando Vh em uma outra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada (CH 1, CH2 e CH3). As sequências dos genes da região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos por amplificação da PCR padrão A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, porem mais preferivelmente, é uma região constante IgGl ou IgG2 . A sequência de região constante IgG1 pode ser quaisquer dos vários alelos ou alótipos conhecidos por ocorrerem entre diferentes indivíduos tais como Gm(I), Gm(2), Gm(3), e Gm(17). Esses alótipos representam substituições de aminoácido de ocorrência natural nas regiões constantes de IgG1. Para um gene de cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA codificando VH pode ser operativamente ligado a uma outra molécula de DNA codificando apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.

[00085] A região constante de cadeia pesada CH1 pode ser derivada de quaisquer dos genes de cadeia pesada.

[00086] A molécula de dNA isolada codificando a região VL pode ser convertida em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de cadeia leve Fab) por ligação operativa da molécula de DNA codificando VL a uma outra molécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve CL.. As sequências dos genes da região constante de cadeia leve humana são conhecidas na técnica (ver por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos abrangendo essas regiões podem ser obtidos por amplificação da PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda. A região constante kappa pode ser quaisquer dos alelos conhecidos por ocorrerem dentre diferentes indivíduos tais como Inv(l), Inv(2), e Inv(3). A região constante lambda pode ser derivada de quaisquer dos três genes lambda.

[00087] Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificando V H e VL são operativamente ligados a um outro fragmento codificando um ligante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácido (Gly4 - Ser)3 de modo que, as sequências VH e VL podem ser expressadas como uma proteína de cadeia simples adjacente, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexivel (ver, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554). O anticorpo de cadeia simples pode ser monovalente, caso apenas uma v H e VL sejam usadas. Anticorpos biespecíficos ou polivalentes podem ser gerados, que se ligam especificamente ao OX40R e a uma outra molécula.

[00088] Num outro aspecto, a presente invenção propicia um vetor, compreendendo uma molécula de ácido nucleico aqui descrita. A molécula de ácido nucleico pode codificar uma parte de uma cadeia leve ou cadeia pesada (tal como uma CDR ou uma região variável) de uma cadeia leve ou pesada de comprimento total, polipeptídeo compreendendo uma parte ou o comprimento total de um cadeia pesada ou leve, ou uma sequência de aminoácido de um derivado de anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno. A fim de expressar uma molécula de ligação, uma molécula de DNA codificando molécula de ligação de comprimento parcial ou total é inserida ao vetor de expressão al que a molécula de DNA é operativamente ligada às sequências de controle transcricionais e traducionais. Neste contexto, o termo “operativamente ligado” pretende significar que, a molécula de DNA é ligada ao vetor, de modo que, as sequências de controle transcripcionais e traducionais dentro do vetor, prestam-se à função de regular a transcrição e traduçao da molécula de DNA. O vetor de expressão e sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. Vetores de expressão incluem por exemplo, plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados (AAV) vírus de plantas como vírus do mosaico da couve-flor, vírus do mosaico do tabaco, cosmídeos, YACs, e epissomas derivados de EBV. As moléculas de DNA são inseridas ao vetor de expressão por quaisquer métodos adequados (por exemplo, por ligação de sítios de restrição complementares no fragmento do gene do anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega, caso nenhum sitio de restrição esteja presente).

[00089] Um exemplo de um vetor de expressão adequado é o que codifica uma sequência de imunoglobulina humana funcionalmente completa CH CL, com sítios de restrição apropriados, de modo que qualquer sequência VH ou VL pode ser inserida e expressada. O vetor de expressão também pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da sequência de aminoácido da cadeia do anticorpo pode ser clonado num vetor de modo que o peptídeo sinal é ligado no quadro ao terminal amino da sequência de aminoácido da cadeia do anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (ou seja, um peptídeo sinal de uma proteína que não imunoglobulina.

[00090] Além da sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácido de um anticorpo OX40R (genes da cadeia de anticorpo), os vetores de expressão carregam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O planejamento do vetor de expressão, incluindo a seleção as sequências reguladoras pode depender desses fatores como a escolha da célula hospedeira para transformação do nível de expressão da proteína desejada e assim por diante. Sequências reguladoras para expressão de célula hospedeira de mamífero, incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão protéica em células de mamífero, tal como promotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovirus (CMV) como o promotor/intensificador de CMV), vírus de símio 40 (SV40) (como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores robustos de mamífero, tais como imunoglobulina nativa e promotores de actina. Para mais descrição de elementos reguladores virais, e suas sequências, ver por exemplo, Patentes U.S. 5.168.062, 4.510.245 e 4.968.615.

[00091] Além das sequências de ácido nucleico do anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes podem portar sequências adicionais como as sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção das células hospedeiras para as quais o vetor foi introduzido (U.S. Patente Nos. 4,399,216, 4,634,665 e 5,179,017). Genes marcadores selecionáveis incluem o diidrofolato redutase (DHFR) para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato), o gene neomicina fosfotransferase (para seleção de G418), e o gene glutamato sintetase. O desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção das sequências reguladoras, pode depender de uma série de fatores, como da escolha da célula hospedeira para transformação, do nível de expressão da proteína desejada, etc. Moléculas de ácido nucleico codificando moléculas de ligação e vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucleico podem ser usadas para transformação de uma célula hospedeira adequada para produção recombinante de uma molécula Del ligação. Uma célula hospedeira é transformada com um ou mais vetores de expressão portando moléculas de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácido de uma molécula de ligação de modo que a sequência de aminoácido posa ser recuperada. A transformação das células hospedeiras pode ser feita por qualquer método do conhecimento da técnica tal como a apresentada na Patente U,S. 4.399.216. 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455.

[00092] A célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero, de inseto, de planta, bacteriana, ou levedura. Exemplos de linhagens de célula de mamífero, como células hospedeiras incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), xll NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de rim de hamster jovem (BHK) células de rim de macaco verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (COS) (por exemplo, HepG2), células A549 e uma série de outras linhagens de célula. Exemplos de linhas de célula de inseto incluem Sf9 ou células Sf21. Exemplos de células hospedeiras de planta incluem Nicotiana, Arabidopsis, Nadabau, milho, trigo, batata e outros. Células hospedeiras bacterianas incluem Schizosaccha- romyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.

[00093] Sequências de aminoácido de uma molécula de ligação expressadas por diferentes linhas de célula ou em animais transgênicos pode ter diferentes sítios de glicosilação. Contudo, todas as moléculas de ligação codificadas pelas moléculas de ácido nucleico aqui providas ou compreendendo as sequências de aminoácido aqui obtidas constituem parte da presente invenção, independentemente da glicosilação das moléculas de ligação.

[00094] Numa outro aspecto, a presente descrição propicia um método para produzir um anticorpo OX40R ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, usando quadro de fago. O método compreende a) sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos no fago, b) selecionar criteriosamente a biblioteca com o OX40 ou uma parte do mesmo, e d) obter o anticorpo a partir do fago. Um método exemplar para preparar a biblioteca de anticorpos compreende a etapa de: a) imunizar um animal não humano compreendendo loci de imunoglobulina humana com OX40 ou uma parte antigênica deste para criar uma resposta imune; b) extrair células produtoras de anticorpo do animal imunizado; c) isolar RNA codificando cadeias pesada e leve dos anticorpos OX40R das células extraídas; d) transcrever de modo reverso o RNA para produzir cDNA; e) amplificar o cDNA; e f) inserir o cDNA ao vetor do quadro de fago de modo que os anticorpos sejam expressos no fago. Anticorpos OX40R humanos recombinantes ou fragmentos de ligação ao antígeno destes podem ser isolados por seleção de uma biblioteca de anticorpo combinatória recombinante. A biblioteca pode ser uma biblioteca de apresentação de fago scFv, gerada pelo uso de cDNAs de VL e VH humanos preparada de mRNA isolado de células B. Métodos para preparar e selecionar essas bibliotecas são do conhecimento da técnica. Kits para geração das bibliotecas de quadro de fago estão comercialmente disponíveis (ver. por exemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalogo no. 27-9400-01; e o kit de quadro de fago Stratagene SurfZAP™, catalogo no. 240612).

[00095] Em um caso, para se isolar e produzir anticorpos OX40R humanos com as desejadas características, um anticorpo OX40R humano conforme aqui descrito, é primeiro usado para seleção de sequências das cadeias pesada e leve humanas com atividade de ligação similar para OX40r usando métodos do conhecimento da técnica assim como os métodos de impressão de epitopo descritos em WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpo usadas neste método pode ser as bibliotecas scFv preparadas e selecionadas conforme descrito em WO 92/01047, McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990); and Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). As bibliotecas de anticorpo scFv podem ser selecionadas usando CCR2 como o antígeno.

[00096] Uma vez selecionadas as regiões VH e VL humanas, são realizados experimentos de “mistura e combinação”, em que diferentes pares dos segmentos VH e VL inicialmente selecionados são examinados para ligação a OX40R para seleção de combinações do par VH e VL. Adicionalmente, para melhorar mais ainda a qualidade do anticorpo, os segmentos VH e VL dos pares VH/ VL podem ser aleatoriamente mudados dentro da região CDR3 de VH e/ou VL em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivoresponsável pela maturação de afinidade dos anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação por afinidade in vitro pode ser realizada ampliando-se os domínios VH e VL usando iniciadores da PCR complementares a CDR3 VH ou CDR3 VL respectivamente, cujos iniciadores foram rejeitados com uma mistura aleatória de quatro bases de nucleotídeo em determinadas posições tal que os produtos da PCR resultantes codificam segmentos VH e VL para os quais mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões de VH e VL CDR3. Essas segmentos VH e VL mutacionados podem ser reexaminados para ligação a OX40R.]

[00097] A seguir ao exame e isolamento doe um anticorpo OX40R ou parte de ligação ao antígeno de uma biblioteca de quadro de imunoglobulina recombinante, ácidos nucleicos codificando a moléculas de ligação selecionada, podem ser recuperados do pacote do quadro(por exemplo, do genoma do fago) e sub clonado em outros vetores de expressão por técnicas de DNA recombinante. Caso desejado, o ácido nucleico pode ainda ser manipulado para criar outras formas de anticorpo, como descrito a seguir. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado por seleção de uma biblioteca combinatória, o DNA codificando o anticorpo é clonado ao vetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras de mamífero conforme descrito supra.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00098] Em um segundo aspecto, a presente invenção propicia uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo uma ou uma combinação de moléculas de ligação proporcionadas pela presente invenção e, opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições podem ser preparadas por métodos convencionais conhecidos da técnica.

[00099] Em algumas modalidades, a composição compreende um anticorpo OX40R ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. Numa modalidade particular, a composição compreende anticorpo 11D4 ou anticorpo 18D8, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste anticorpo. Em ainda outras modalidades, a composição compreende um derivado do anticorpo 11D4 ou anticorpo 18D8.

[000100] O termo “veiculo farmaceuticamente aceitável” refere-se a qualquer substância inativa adequada para emprego em uma formulação para distribuição de uma moléculas de ligação. Um veiculo pode ser um antiaderente, aglutinante, revestimento, desintegrante, carga ou diluente, conservante (como um agente antioxidante, antibacteriano, ou antifúngico), adoçante, agente retardante de absorção, agente umectante, agente emulsificante, tampão e similar. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, etanol polióis (como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e outros), dextrose, óleos vegetais (como óleo de oliva) salina, tampão, solução salina tamponada e agentes isotônicos como açucares, poliálcoois, sorbitol e cloreto de sódio.

[000101] As composições podem estar em quaisquer formas adequadas, como líquida, semi-sólida e forma de dosagem sólida. Exemplos de formas de dosagem líquida incluem solução (por exemplo, soluções injetáveis e para infusão), microemulsão, lipossomas, dispersão ou suspensão. Exemplos de formas de dosagem sólida incluem comprimido, pílula, cápsula, microcápsula, e pó. Uma forma particular da composição adequada para fornecer uma molécula de ligação é um liquido estéril como uma solução, suspensão ou dispersão, para injeção ou infusão. Soluções estéreis podem ser preparadas por incorporação do anticorpo na quantidade necessária, em um veiculo apropriado, seguido por microfiltração de esterilização. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do anticorpo ao veiculo estéril contendo um meio de dispersão básico e outros veículos. No caso de pós estéreis para preparação de líquido estéril, os métodos de preparação incluem secagem a vácuo e liofilização produzindo um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução filtrada previamente esterilizada do mesmo. As várias formas de dosagem das composições podem ser preparadas por técnicas convencionais conhecidas.

[000102] A quantidade relativa de uma molécula de ligação incluída na composição irá variar, dependendo de uma série de fatores, tais como moléculas de ligação especifica e veículos usados, forma de dosagem e características de liberação desejadas e farmacodinâmicas. A quantidade de uma moléculas de ligação em uma única forma de dosagem irá geralmente estar na quantidade que produza um efeito terapêutico, porém também pode ser uma quantidade menor. Geralmente, esta quantidade irá variar desde cerca de 0,01% a cerca de 99%, de cerca de 0,1% a cerca de 70%, ou de cerca de 1% a cerca de 30% relativo ao peso total da forma de dosagem. Além das moléculas de ligação, um ou mais agentes terapêuticos podem ser incluídos na composição. Exemplos de agentes terapêuticos adicionais estão descritos a seguir. A quantidade adequada dos agentes terapêuticos adicionais para inclusão na composição podem ser prontamente selecionados por um versado na técnica, com a variação dependendo de uma série de fatores, tais como do agente particular e veículos usados, da forma de dosagem e da liberação desejada e características farmacodinâmicas. A quantidade do agente terapêutico adicional incluso em uma única forma de dosagem irá em geral ser a quantidade dos agentes que produzirão um efeito terapêutico, porém pode ser uma quantidade menor também.

USO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[000103] As moléculas de ligação e composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de ligação proporcionada pela presente invenção são úteis para diagnóstico terapêutico ou outros fins, tais como intensificação de uma resposta imune, tratamento do câncer, intensificação da eficácia de outra terapia de câncer, ou intensificação de eficácia de vacinas, tendo uma série de utilidades, tais como para uso como medicamentos ou agentes de diagnostico. Sendo assim, em um outro aspecto, a presente invenção propicia métodos de uso das moléculas de ligação ou composições farmacêuticas.

[000104] Em um aspecto particular, os métodos são proporcionados para intensificar a resposta imune em um mamífero, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação proporcionada pela descrição. Em algumas modalidades, a molécula de ligação trata-se de um anticorpo OX40R ou um seu fragmento de ligação ao antígeno sendo o mamífero um humano. Em uma outra modalidade, a molécula de ligação é o anticorpo 11D4 ou anticorpo 18D8, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um destes anticorpos. O termo “intensificar a resposta imune” ou suas variações gramaticais, significa estimular, forçar, aumentar, melhorar, qualquer resposta de um sistema imune do mamífero. A resposta imune pode ser uma resposta celular (ou seja, mediada por célula, tal como mediada por linfócito T citotóxico) ou uma resposta humoral (ou seja, resposta mediada pelo anticorpo), e pode ser uma resposta imune secundária ou primária. Exemplos de intensificação da resposta imune incluem atividade de célula T auxiliar CD4+ e geração de células T citolíticas. A intensificação da resposta imune pode ser avaliada usando-se uma serie de medições in vitro ou in vivo conhecidas dos versados na técnica, incluindo sem limitação, a ensaios de linfócito T citotóxicos, liberação de citocinas (por exemplo, produção de IL-2), regressão de tumores, sobrevivência de animais com tumor, produção de anticorpo, proliferação de célula imune, expressão de marcadores superficiais celulares, e citotoxicidade. Tipicamente, os métodos da descrição intensificam a resposta imune por um mamífero, quando comparado com a resposta imune por um mamífero não tratado ou o animal não tratado usando os métodos reivindicados. Numa modalidade o método intensifica uma resposta celular imune, particularmente uma resposta de célula T citotóxica. Numa outra modalidade, a resposta imune celular é uma resposta de célula auxiliar T. Em ainda uma outra modalidade, a resposta imune é uma produção de citocina, particularmente produção de IL-2.

[000105] Num aspecto particular, a presente invenção propicia um método de tratamento do câncer em um mamífero, compreendendo a administração ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação proporcionada pela presente invenção. O termo “tratamento do câncer” ou tratando o câncer” refere-se ao fato de ocasionar um efeito benéfico ou desejável em um mamifero diagnosticado com um câncer. O efeito benéfico ou desejável pode incluir inibição de mais crescimento ou disseminação de células cancerosas, morte de células cancerosas, inibição de recorrência de câncer, redução da dor associada com o câncer, ou melhorar a sobrevivência do animal. A inibição da recorrência de câncer abrange sitios de câncer e tecido circundante que foram previamente tratados por radiação, quimioterapia, cirurgia, ou outras técnicas. O efeito pode ser ou subjetivo ou objetivo. Por exemplo, caso o animal seja um humano, o humano, pode observar um melhor vigor ou vitalidade ou dor reduzida como sintomas subjetivos de melhora ou resposta à terapia. Alternativamente, o clinico pode sentir uma redução no tamanho do tumor ou carga tumoral com base no exame físico, parâmetros de laboratório, marcadores de tumor ou exames radiográficos. Alguns sinais de laboratório que os clínicos podem observar para resposta ao tratamento incluem normalização dos testes, tais como contagem de célula da série branca, contagem de célula da série vermelha, contagem de plaquetas, sedimentação de eritrócito e vários níveis enzimáticos. Adicionalmente o clinico pode observar um redução em um marcador de tumor detectável. Alternativamente, outros testes podem ser empregados para se avaliar a melhora objetiva tal como sonogramas, ressonância magnética nuclear, e teste de emissão de positrons. Em algumas modalidades, a molécula de ligação trata-se de um anticorpo OX40R ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, proporcionado pela invenção. Numa outra modalidade, a molécula de ligação é um anticorpo 11D4 ou 18D8, ou um fragmento de ligação ao antígeno de qualquer anticorpo. Em outras modalidades, o mamífero é um humano.

[000106] Num outro aspecto particular, a presente invenção propicia um método de prevenção do câncer em um mamífero, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação proporcionada pela apresentação. O termo “prevenção do câncer” refere-se a retardar, inibir, ou prevenir o inicio de um câncer em um mamífero, em que o inicio da oncogênese ou tumorigênese não é evidenciado, porém uma predisposição para o câncer é identificada, seja este determinado por seleção genética, por exemplo, ou de outro modo. O termo ainda abrange tratamento de um mamifero com condições pré-malignas, para interromper o progresso da condição pré-maligna ou ocasionar a regressão das condições de malignidade. Exemplos de condições pré-malignas incluem hiperplasia, displasia e metaplasia. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo OX40R ou um fragmento deste, proporcionados pela invenção. Numa outra modalidade, a molécula de ligação trata-se do anticorpo 11D4 ou 18D8. ou um fragmento de ligação ao antígeno de quaisquer anticorpos. Numa outra modalidade, o mamífero é um humano.

[000107] Uma série de cânceres, sejam estes malignos ou benignos, ou primários ou secundários, podem ser tratados ou evitados com um método proporcionado pela invenção. Exemplos desses cânceres, incluem cânceres de pulmão, tais como carcinoma broncogênico (por exemplo, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula pequena, carcinoma de célula grande, e adenocarcinoma), carcinoma de célula alveolar, adenoma bronquial, hematoma condromatoso (não canceroso) e sarcoma (canceroso), câncer de coração como mixoma, fibromas e rabdomiomas, cânceres ósseos, como osteocondromas, condromas, condroblastomas, fibromas condromixóides, osteomas osteóides, tumores de célula gigante, condrosarcoma, mieloma múltiplo, osteosarcoma, fibrosarcomas, histiocitomas fibrosos malignos, tumor de Ewing (sarcoma de Ewing) e sarcoma de célula do retículo, câncer cerebral, como gliomas (por exemplo, glioblastoma multiforme) astrocitomas anaplásticos, astrocitomas, oligodendrogliomas, meduloblastomas, cordoma, Schwannomas, ependinomas, meningiomas, adenoma pituitário, pinealoma, osteomas, hemangioblastomas, craniofarin- giomas, cordomas, germinomas, teratomas, cistos dermatológicos e angiomas, cânceres do sistema digestivo tais como leiomioma, carcinoma epidermóide, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, adenocarcinomas do estomago, lipomas intestinais, neurofibromas intestinais, fibromas intestinais, pólipos no intestino grosso, e cânceres colorretais, cânceres de fígado, como adenomas hepatocelulares, hemangioma, carcinoma hepatocelular, carcinoma fibrolamelar, colangiocarcinoma, hepatoblastoma e angiosarcoma, cânceres de rim, como adenocarcinoma de rim, carcinoma de célula renal, hipernefroma e carcinoma de célula passageira da pélvis renal, cânceres de bexiga, cânceres hematológicos como leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), leucemia mielóide (mielocítica, mielogenosa, mieloblástica, mielomonocítica), leucemia linfocítica crônica (por exemplo, síndrome de Sezarh e leucemia de cédula capilar), leucemia mielocítica crônica (mielóide, mielogenosa, granulocítica), linfoma de Hodgkin, linfoma de não- Hodgkin, linfoma de célula B, fungóides de micose, e distúrbios mieloproliferativos (incluindo distúrbios mieloproliferativos tais como policitemia Vera, mielofibrose, trombocitemia, e leucemia mielocítica crônica), cânceres de pele como carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, melanoma, sarcoma de Kaposi e doença de Paget, cânceres de cabeça e pescoço, cânceres relacionados ao olho, como retinoblastoma e melanocarcinoma intraocular, cânceres do sistema reprodutivo masculino, tais como hiperplasia da próstata benigna, câncer de próstata e cânceres testiculares (por exemplo seminoma, teratoma, carcinoma embrionário, e coriocarcinoma), câncer de mama, cânceres do sistema reprodutor feminino como câncer de útero (carcinoma endometrial), câncer cervical (carcinoma cervical), câncer do ovário (carcinoma ovariano), carcinoma vulvar, carcinoma vaginal, câncer das trompas de falópio e hidatidiforme mole, câncer da tireóide (incluindo papilar, folicular, anaplástico, ou medular). feocromocitomas (glândula adrenal ), crescimentos não cancerosos das glândulas paratireóides, cânceres pancreáticos e cânceres hematológicos como leucemias, mielomas, linfomas que não-Hodgkin e linfomas de Hodgkin.

[000108] Na pratica dos métodos terapêuticos, as moléculas de ligação podem ser administradas sozinhas como monoterapia ou administradas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos ou terapias adicionais. Portanto, num outro aspecto, a presente invenção obtém uma terapia combinada, que compreende uma molécula de ligação proporcionada pela apresentação, em combinação com uma ou mais terapias adicionais ou agentes terapêuticos. O termo “terapia adicional” refere-se a uma terapia que não emprega uma molécula de ligação propiciada pela invenção como um agente terapêutico. O termo "agente terapêutico adicional” refere-se a qualquer agente terapêutico diferente de uma molécula de ligação propiciada pela apresentação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é o anticorpo 11D4 ou 18D8, ou um fragmento de ligação ao antígeno de quaisquer anticorpos. Num aspecto particular, a presente invenção propicia uma terapia combinada para tratar o câncer em um animal, compreendendo a administração ao mamífero, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação propiciada pela presente invenção em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Numa outra modalidade o mamífero é um humano.

[000109] Uma ampla série de agentes terapêuticos de câncer podem ser empregados em combinação com uma molécula de ligação. O perito na técnica reconhecerá a presença e desenvolvimento de outras terapias de câncer podendo ser empregada em combinação com os métodos e moléculas de ligação da presente invenção, que não estarão restritas a essas formas de terapia aqui descritas. Exemplos de categorias de agentes terapêuticos adicionais que podem ser usados em combinação de terapia para tratamento do câncer incluem (1) agentes quimioterapêuticos (2) agentes imunoterapêuticos e (3) agentes terapêuticos hormonais.

[000110] O termo “agente quimioterapêutico” refere-se a uma substância química ou biológica que pode ocasionar morte das células cancerosas, ou interferir com o desenvolvimento, divisão, reparo, e/ou função das células de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem os apresentados em WO 2006/088639, WO 2006/129163, e US 20060153808, cujas revelações estão ora incorporadas por referência. Exemplos dos agentes quimioterapêuticos incluem: (1) agentes de alquilação tais como clorambucil (LEUKERAN), mciclofosfamida (CYTOXAN), ifosfamida (IFEX), cloridrato de mecloretamina (MUSTARGEN), tiotepa (THIOPLEX), estreptozotocin (ZANOSAR), carmustina (BICNU, GLIADEL WAFER), lomustina (CEENU), e dacarbazina (DTIC-DOME); (2)alcalóides ou alcalóides de vinca vegetal, incluindo antibióticos citotóxicos, tais como doxorubicina (ADRYAMICIN), epirubicina (ELLENCE, PHARMORUBICIN), daunorubicina (CERUBIDINE, DAUNOXOME), nemorubicina, idarubicina (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS), mitoxantrona (DHAD, N0VANTR0NE). dactinomicina (actinomicina D, COSMEGEN), plicamicina (MITHRACIN), mitomicina (MUTAMYCIN), e bleomicina (BLENOXANE), tartarato de vinorelbina (NAVELBINE)), vinblastina (VELBAN), vincristina (ONCOVIN), e vindesina (ELDISINE); (3) antimetabólitos, tais como capecitabina (XELODA), citarabina (CYTOSAR-U), fludarabina (FLUDARA), gemcitabina (GEMZAR), hidroxiuréia (HYDRA), metotrexato (FOLEX, MEXATE, TREXALL), nelarabina (ARRANON), trimetrexato (NEUTREXIN), e pemetrexed (ALIMTA); (4) antagonistas de pirimidina, tais como 5-flúor-uracil (5-FU); capecitabina (XELODA), raltitrexed (TOMUDEX), tegafur-uracil (UFTORAL), e gemcitabina (GEMZAR); (5) taxanos, tais como docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel (TAXOL); (6) fármacos de platina, tais como cisplatina (PLATINOL) e carboplatina (PARAPLATIN), e oxaliplatina (ELOXATIN); (7) inibidores de topoisomerase, tais como irinotecan CAMPTOSAR), topotecan (HYCAMTIN), etoposideo (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR), e teniposideo (VUMON); (8) epipodofillotoxinas (derivados de podofilotoxina), tais como etoposídeo (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR); (9) derivados de ácido fólico, tais como leucovorina (WELLCOVORIN); (10) nitrosouréias, tais como carmustina (BiCNU), lomustina (CeeNU); (11) inibidores do receptor de tirosina quinase, incluindo receptor do fator do crescimento epidérmico (EGFR), fator do crescimento endotelial vascular (VEGF), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar a insulina (IGFR), receptor do fator de crescimento de hepatócito (HGFR), e receptor do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR), como gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), bortezomib (VELCADE), mesilato de imatinib (GLEEVEC), genefitinib, lapatinib, sorafenib, talidomida, sunitinib (SUTENT), axitinib, rituximab, trastuzumab (HERCEPTIN), cetuximab (ERBITUX), bevacizumab (AVASTIN), e ranibizumab (LUCENTIS), lym-1 (ONCOLYM), anticorpos para o receptor do fator-1 de crescimento similar a insulina (IGF-IR) que estão apresentados em WO2002/053596); (12) inibidores da angiogênese, tais como bevacizumab (AVASTIN ), suramin (GERMANIN), angiostatin, SU5416, talidomida, e inibidores da matriz de metaloproteinase ( tais como batimastat e marimastat), e aqueles apresentados em WO2002055106; e (13) inibidores de proteassoma, tais como bortezomib (VELCADE).

[000111] O termo “agentes imunoterapêuticos” refere-se a uma substância química ou biológica que intensifica uma resposta imune de um mamífero. Exemplos de agentes imunoterapêuticos incluem: bacilo de Calmette-Guerin (BCG); citocinas, como interferons; vacinas como imunoterapia personalizada MyVax, Onyvax- P, Oncofago, GRNVACl, Favld, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX, e NeuVax; e anticorpos tais como alemtuzumab (CAMPATH), bevacizumab (AVASTIN), cetuximab (ERBITUX), gemtuzunab ozogamicin (MYLOTARG), ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN), panitumumab (VECTIBIX), rituximab (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumab (HERCEPTIN), tositumomab (BEXXAR), tremelimumab, CAT-3888, e anticorpos agonistas para o receptor de CD40, apresentados em WO2003/040170.

[000112] O termo “agente terapêutico hormonal” refere-se a uma substância química ou biológica que impede ou elimina a produção de um hormônio ou inibe ou neutraliza o efeito de um hormônio no crescimento e/ou sobrevivência de células cancerosas. Exemplos desses agentes adequados para os métodos presentes incluem os apresentados em US200701 17809. Exemplos de agentes terapêuticos hormonais particulares, incluem, tamoxifen (NOLVADEX), toremifeno (Fareston), fulvestrant (FASLODEX), anastrozol (ARIMIDEX), exemestano (AROMASIN), letrozol (FEMARA), acetato de megestrol (MEGACE), goserelin (ZOLADEX), e leuprolida (LUPRON). As moléculas de ligação desta apresentação também podem ser usadas em combinação com terapias hormonais não farmacológicas tais como 1) métodos cirúrgicos que removem toda ou parte dos órgãos ou glândulas que participam da produção do hormônio, tal como os ovários, os testículos, a glândula adrenal e a glândula pituitária, e 2) tratamento de radiação, em que os órgãos ou glândulas dos pacientes são submetidos à radiação numa quantidade suficiente para impedir ou eliminar a produção do hormônio alvejado.

[000113] A terapia combinada para tratamento do câncer também abrange a combinação de uma molécula de ligação proporcionada pela descrição com cirurgia para remoção do tumor. A molécula de ligação pode ser administrada ao mamifero antes, durante ou após a cirurgia.

[000114] A terapia combinada para tratamento do câncer também abrange combinação de uma molécula de ligação proporcionada pela invenção com terapia de radiação, como radioterapia de ionização (eletromagnética) (por exemplo, raios-X ou raios gama) e terapia de radiação de feixe de partículas (por exemplo, radiação de alta energia linear). A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao mamífero. A molécula de ligação pode ser administrada ao mamifero, antes, durante, ou após a terapia de radiação.

ADMINISTRAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO E COMPOSIÇÕES

[000115] As moléculas de ligação e composições proporcionadas pela presente invenção podem ser administradas via qualquer via entérica ou parenteral adequada de administração. O termo “via entérica” de administração refere-se à administração via qualquer parte do trato gastrintestinal. Exemplos de vias entéricas incluem via oral, mucosal, bucal, e retal ou intragástrica. “Via parenteral” de administração refere- se a um via de administração diferente da via entérica. Exemplos de vias parenterais de administração incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitonial, intratumoral, intravesicular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, trans-traqueal, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, epidural e intra- externa, subcutânea ou administração tópica. Os anticorpos e composições da invenção podem ser administrados usando qualquer método adequado, tal como ingestão oral, tubo nasogástrico, tubo gastrotômico, injeção, infusão, bomba de infusão implantável,e bomba osmótica. A via adequada e método de administração pode variar, dependendo de uma serie de fatores tais como o anticorpo especifico que está sendo usado, a velocidade de absorção desejada, da formulação especifica ou forma de dosagem usada, tipo ou gravidade do distúrbio em tratamento, do sitio específico de ação, e condições do paciente, podendo ser prontamente selecionado por uma pessoa de prática na técnica.

[000116] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” de uma molécula de ligação refere-se a uma quantidade que seja eficaz para um determinado propósito terapêutico. Por exemplo, no contexto de incrementar uma resposta imune, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é qualquer quantidade que seja eficaz em estimular, suscitar, aumentar, melhorar, qualquer resposta em um sistema imune de mamífero. No contexto do tratamento de câncer, uma “quantidade terapeuticamente eficaz ” é qualquer quantidade que seja suficiente para ocasionar qualquer efeito benéfico ou desejável no mamífero em tratamento, tal como inibição de maior desenvolvimento ou disseminação das células cancerosas, morte das células cancerosas, inibição ou recorrência do câncer, redução da dor associada com o câncer, ou sobrevivência melhorada do mamífero. Num método de prevenção de câncer, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é qualquer quantidade que seja eficaz em retardar, inibir, ou prevenir o início de um câncer no mamífero, para o qual a molécula de ligação é administrada. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação normalmente varia de cerca de 0,001 a cerca de 500 mg/kg, e normalmente de cerca de 0,05 a cerca de 100 mg;kg do peso corpóreo do mamífero. Por exemplo, a quantidade pode ser cerca de 0,3 mg/kg, 1mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg ou 100 mg/kg do peso corpóreo do mamífero. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo OX40R fica na faixa de cerca de 0,1 - 30 mg/kg do peso corpóreo do mamífero. O nível de dosagem exata para administração pode ser prontamente determinado pelo versado na técnica, dependendo de uma serie de fatores, tais como do tipo e da gravidade do distúrbio em tratamento, da molécula de ligação particular empregada, da via de administração, do tempo de administração, da duração do tratamento, da terapia adicional particular empregada, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico precedente do paciente em tratamento, e fatores que tais, do conhecimento da técnica.

[000117] Uma molécula de ligação ou composição é normalmente administrada em múltiplas ocasiões. Intervalos entre doses únicas podem ser por exemplo, semanais, mensais, a cada três meses ou anualmente. Um regime de tratamento exemplar emprega a administração uma vez por semana, a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses, ou uma vez a cada três a seis meses. Regimes de dosagem típicos para um anticorpo OX40R incluem 1 mg/kg de peso corpóreo ou 3 mg/kg de peso corpóreo via administração intravenosa usado um dos seguintes programas de dosagem: i) cada quatro semanas para seis dosagens, então a cada três meses ii) cada três semanas; iii) 3 mg/kg de peso corpóreo uma vez, seguido por 1 mg/kg de peso corpóreo a cada três semanas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: 'PREPARAÇÃO DOS ANTICORPOS OX40R

[000118] Anticorpos ilustrativos de acordo com a invenção foram preparados, selecionados e testados como a seguir:

Imunização com o Antígeno de OX40R e Seleção de Camundongos Produtores de Anticorpos Monoclonais OX40R

[000119] Anticorpos monoclonais humanos totais para OX40R humano foram preparados usando linhagens de camundongo transgênicas Ig humana HCo7, HCo12, HCo17 e Hco27, bem como a linhagem transcromossomal/transgênica humana KM (Medarex. Inc), Todas essa linhagens expressam anticorpos humanos totais que não se distinguem de anticorpos isolados de humanos.

[000120] Nas linhagens transgênicas tanto o gene de cadeia leve kappa de camundongo endógeno e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foram rompidos, sendo homozigotos, conforme descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:821-830 e no Exemplo 1 de WO 01/09187, respectivamente. Além disso, eles portam um transgene de cadeia leve kappa humana KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotecnology 14:845-851. Em contraste, as linhagens transgênicas distinguem-se com relação a seus genes de cadeia pesada humana. como descrito nas Patentes Nos.: 5,545,806, 5,625,825, e 5,545,807; a linhagem HCol2 porta o transgene de cadeia pesada humana HCo 12 como descrito no Exemplo 2 de WO 01/09187; a linhagem Hcol7 porta o transgene de cadeia pesada humana HCo17 como descrito no Exemplo 8 de Deshpande et al., US 2005/0191293A1; a linhagem Hco27 porta o transgene de cadeia pesada humana Hco27 como descrito no Exemplo 5 de PCT/US2008/072640, depositado em 08 de agosto de 2008. A linhagem KM porta um mini-cromossomo humano,como descrito em Ishida et al., (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102.

[000121] Esquemas de imunização geral para camundongos HuMab estão descritos em Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação PCT WO 98/24884.

[000122] Camundongos HuMab das linhagens HCo7, HCo12, Hcol7, Hco27 e KM foram imunizados começando em 6 a 16 semanas de idade com 15 a 25μg de proteína OX40R-Ig recombinante humana e linha de célula pré-B de murídeo, 300-19 (Reth, M. G. et al, Nature 312 29: 41842, 1984; Alt, F. et al., Cell 27: 381-390, 1981), transfectado para expressar OX40R em adjuvante Ribi. A proteína OX40R-Ig recombinante humana purificada é m construtor do domínio extracelular (aminoácidos 1 a 220) do anticorpo OX40R humano fundido à região constante de IgG1 humano. A administração foi feita via injeção intraperitoneal, subcutânea ou à pata a 3-28 dias de intervalo, até perfazer um total de 10 imunizações. A resposta imune foi monitorada via ensaio ELISA e FACS como descrito a seguir.

Seleção de Camundongos HuMab Produtores de Anticorpos OX40R

[000123] Para selecionar camundongos HuMab produtores de anticorpos que se ligam a OX40R, o sangue do camundongo imunizado foi obtido e analisado por ELISA para ligação especifica à proteína recombinante OX40R humana purificada e por FACS, para ligação a uma linhagem de célula expressando OX40R humano de comprimento total e não a uma linha de célula de controle que não expressa OX40R.

[000124] O ensaio de ligação a ELISA foi como descrito por Fishwild et al., (1996), Nature Biotechnology 14:845-851. Resumidamente, placas de microtítulo foram revestidas usando 50 μl/poço de uma solução de OX40R-Ig recombinante purificado contendo 1 μg/ml em PBS, sendo incubado durante a noite a 4°C. Os poços foram então bloqueados usando 2000 μl;poço de soro de frango a 5% em PBS/Tweem (0,05%) As diluições do plasma de camundongos imunizados com OX40R foram adicionadas para cada poço sendo incubados por 1 hora a temperatura ambiente . A placas foram lavada com PBS/Tweem sendo incubadas com um anticorpo policlonal IgGFc anti humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano de cavalo (HRP) por 1 hora a temperatura ambiente. Após lavar, as placas foram reveladas com substrato ABTS (Moss Inc., produto n°: ABTS-1000 mg/ml) e analisadas por espectrofotometria a uma OD 405.

[000125] Realizou-se ensaio FACS de acordo com procedimentos convencionais. Em resumo, as células 300-19 expressando OX40R foram incubadas com soro de camundongos imunizados diluído a 1:20. As células foram lavadas detectando-se a ligação especifica para o anticorpo com IgG Ab anti-humano rotulado com FITC. Análises de citometria de fluxo foram realizadas em um instrumento citométrico de fluxo FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA).

[000126] Os camundongos que desenvolveram os maiores títulos de anticorpos OX40R foram usados para fusões. As fusões foram realizadas como descrito abaixo e os sobrenadantes do hibridoma foram testados para atividade anti-OX40R por ELISA e por FACS.

Geração de Hibridomas que produzem Anticorpos Monoclonais Humanos para OX40R

[000127] Os camundongos selecionados supra foram reforçados intravenosamente com OX40R-Ig em 3 dias e novamente em 2 dias antes de serem sacrificados tendo o baços removidos e/ou linfonodos.

[000128] Os esplenócitos e/ou linfócitos do linfonodo isolados de camundongos HuMab ou KM foram fundidos a células de mielona de camundongo não secretores de SP2/0 (ATCC, CRL - 1581) usando eletrofusão (E-fusão Cyto Pulse™ Tecnology, Cyto Pulse™ Sciences, Inc., Glen Burnie, MD) de acordo com protocolos padrão ou recomendados pelo fabricante. Em resumo suspensões de célula simples de esplenócitos e;ou linfócitos de linfonodo dos camundongos imunizados foram preparadas e combinadas com igual quantidade de células de mieloma de camundongo não secretores de SP2/0, sendo então realizada a E-fusão.

[000129] As células foram então colocadas em placas a 2 x 104 células por poço em placas de microtítulo de fundo chato e incubadas por 10 a 14 dias em meio seletivo contendo soro bovino fetal a 10%, P388D1 a 10% (ATCC, CRL-TIB-63) meio condicionado 3-5% (IGEN) em DMEM (Mediatech, Herndon, VA, Cat. No. CRL 10013, com alta glicose, L- glutamina e piruvato de sódio), 7 niM HEPES, 0,055 mM 2- mercaptoetanol, 0.1 IU/mL penicilina - 0,1 mg/mL de estreptomicina, e 1 x HAT (Sigma, Cat. No. CRL -P-7185).

[000130] Após 1 a 2 semanas as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído por HT. Aproximadamente 10 a 14 dias depois da deposição em placas, os sobrenadantes dos poços individuais foram selecionados quanto à presença de anticorpos gama, kappa humanos. O sobrenadantes com marca positiva para gama, kapa humano foram então selecionados por ELISA e FACS usando o protocolo descrito acima) para anticorpos IgG monoclonais OX40R humanos. Os hibridomas secretores do anticorpo foram transferidos para placas de 24 poços, novamente examinados e, caso confirmados positivos para anticorpos monoclonais IgG OX40R humanos, eram sub clonados pelo menos duas vezes por diluição limitada. Os subclones estiáveis foram então cultivados in vitro para gerar pequenas proporções de anticorpo em meio de cultura de tecido para mais caracterização.

EXEMPLO 2 - EXEMPLOS BIOLÓGICOS/FARMACOLÓGICOS A. Procedimentos de Teste in vitro

[000131] Ligação ao Domínio Extracelular do OX40R:Uma proteína de fusão OX40-Ig humano foi diluída em tampão de carbonato BupH™ (Pierce, Rockford, IL) sendo revestida em placas Maxisorb de 96 poços (Nun c, Roskilde, Denmark) a 100 μl/poço (0,25 μg/ml) e incubadas durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem contendo 0,05% de Tweem 20 (Sigma St. Louis, MO) diluídas em PBS (Sigma, St. Louis, MO) e bloqueadas com 300 μl/poço de 0,5% SA (Sigma,St. Louis, MO) em PBs durante 1 hora a temperatura ambiente. A seguir, as placas foram lavadas e incubadas com anticorpos reativos OX40 anti-humanos diluídas em tampão de bloqueio a concentrações variadas (100 μl/poço) sendo incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram então lavada e incubada por uma hora a temperatura ambiente. com um anticorpo de cadeia kapa anti-humano. rotulado com peroxidase de rábano de cavalo (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a 25 mg/mL em tampão de bloqueio. Finalmente, as placas de ensaio foram lavadas adicionando- se 100 μl;poço de substrato Turbo-TMB de um vez (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A reação foi interrompida por adição de igual volume de ácido sulfúrico 2M, sendo lida absorbância a 450 nm em um Molecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ligação com base em FACS à OX40R de Superfície Celular :

[000132] Linhas de célula expressando OX40R (ver abaixo) ou células mononucleares de sangue periférico primário ativadas foram usadas para se avaliar a ligação em, receptores OX40 tanto de humano como de cynomolgus. As células foram coletadas e lavadas (5 x 10/tubo) usando-se tampão de lavagem a temperatura ambiente. O tampão de lavagem consistiu de PBS, soro bovino fetal inativado pelo calor a 2% (Hyclone, Logan, UT) e 0.02% azida de sódio (Sigma, St. Louis, MO). A seguir, 100 μl de concentrações variadas do anticorpo foram adicionadas para as células (iniciando a 30 ug/ml e usando uma titulação de 3 vezes) diluída com tampão de lavagem contendo 0,005 mg/ml de citocolasina B (Sigma, St; Louis, MO). As células foram gentilmente osciladas a temperatura ambiente por 3 horas. A seguir, as células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 0,5 ml/tubo com tampão de lavagem frio e 10.000 eventos foram coletados e analisados usando um software Becton Dickinson FACSCalibur e CellQuest (San Jose, CA).

[000133] Ensaio Biacore: O instrumento de analise de interação bioespecifica Biosensor (BIAcore 2000) utiliza ressonância de plásmon para medir a interação molecular em um chip do sensor CM5. Alterações nos índices refrativos entre dois meios, vidros, e dextrana carboximetilada ocasionadas pela interação de moléculas ao lado da dextrana do chip do sensor, são medidas e descritas como alterações em unidades de refletância arbitraria (RU) como descrito detalhadamente pelas notas de aplicação do fabricante.

[000134] As superfícies de dextrana carboximetiladas em um chip do sensor CM5 foram ativadas por derivatização com N-hidroxisuccinimida 0,05 M mediada por N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida 0,2 M por 7 minutos. Estreptavidina (Sigma S-4762) a uma concentração de 500 μg/ml em acetato de Na 10 mM, pH 4,5 foi injetado em três superfícies (Flow Cell -2, 3 e 4) a uma velocidade de 5 μl/minutos e imobilizada covalentemente às superfícies de célula de fluxo com aproximadamente 2500 RU's. 35 μl de tampão de acetato de Na a 10 mM foi injetado sobre Flow Cell 1 durante a imobilização no lugar do antígeno para fazer uma superfície neutra ativada e medir a ligação não especifica. A desativação de ésteres de N-hidroxisuccinimida não reagidos em todas as quatro células Flow foi feita usando-se cloridrato de etanolamina 1M, pH 8,5 Seguinte à imobilização, as células de fluxo são lavadas de qualquer material ligado não reagido com 5 injeções de regeneração de 5 μl de NaOH 50 mM até ser conseguida uma linha de referência estável.

[000135] CD134-muIg biotinilado (Ancell 513-030) a uma concentração de 10 μg/ml a uma velocidade de fluxo de 5 μl;min. foi injetado manualmente sobre as células Flow 2, 3 e 4 para conseguir 3 densidades de superfície: Fc-2=150RU, Fc-3=375RU e Fc-4=580RU. As diferentes superfícies de densidade foram preparadas para monitorar a possibilidade de ligação limitada pelo transporte de massa durante a fase de associação e religaçâo durante a dissociação, ambos artifícios que são influenciados pela densidade superficial que devem ser evitados.

[000136] Uma diluição em serie dos anticorpos OX40R foram preparadas numa faixa de concentração de 666 nM a 66 pM por meio logs em tampão de serviço (0,01M HEPES, pH 7,4; NaCl a 0,15M, EDTA 3 mM, polisorbato 20 a 0,005% (v/v). A velocidade de fluxo foi ajustada em 5 μl/min. e 25 μl de cada amostra no ponto de concentração foi injetado sobre o chip do sensor com uma injeção de regeneração de 5 μl de NaOh 50 mM entre cada concentração do anticorpo injetado. O tempo de dissociação foi de 5 minutos. Os dados foram analisados usando-se software equipado com avaliação BIA 3.0 global (análise separada de cada ponto de concentração ).

Caracterização do Epitopo

[000137] 300-19 células expressando um construtor de fusão OX40- CD40 humano recombinante correspondendo a 1-235 sequência de aminoácido de OX40 (domínio extracelular e transmembrana) e 216278 sequência de aminoácido de CD40 (domínio intracelular) foi usado para analise do epitopo do anticorpo. A linha de célula expressando OX40-CD40 foi cultivada em meio RPMI (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Hiclone, Logan UT), Hepes a 10 mM, penicilina-estreptomicina a 1% 2 mM L-glutamina, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM e 2-mercaptoetanol a 0,05 mM ((Gibco, Grand Island, NY) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Hyclone, Logan, UT), 10 mM de Hepes, penicilina-estreptomicina a 1%, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol (Gibco, Grand Island, NY). Células 300- 19.hCD 134.2 (5xl05/tubo) foram lavadas uma vez em 3 ml de tampão de lavagem frio (PBS a 2% FBS e azida de sódio a 0,02%. O sobrenadante de célula foi aspirado e 100 μL de tampão de lavagem contendo 300 μg/ml de anticorpo reativo OX40 não conjugado primário foi adicionado para o precipitado de célula, misturado e incubado por 30 minutos a 4°C. A seguir, um anticorpo secundário rotulado com fluoróforo foi adicionado ao tubo, misturado e incubado por mais 30 minutos a 4°C. Os anticorpos rotulados com fluoróforo reativo OX40 incluíam ou 10 μl de Ber rotulado com ficoeritrina (PE) Lei 35 (Laboratories Caltag, Burlingame, CA), PE-rotulado L106 (BD Pharfmingen, San Jose, CA) ou anticorpo OX40R conjugado com Alexa Flúor 647. O anticorpo OX40R foi rotulado com fluoróforo usando o kit de rotulação de proteína Alex Flúor647 conforme descrito pelo fabricante (Molecular Probes, Eugenes, OR). Após o manchamento, as células foram então lavadas 3 X com tampão de lavagem, ressuspensas em tampão de lavagem frio, sendo coletados 10.000 eventos e analisados usando um software de Becton Dickinson FACSCalibur e CellQuest (San Jose, CA). Os anticorpos foram degradados como ligação ao mesmo epitopo, quando o anticorpo primário bloqueou o manchamento do anticorpo secundário rotulado com fluoróforo em mais de 80%.

Ensaio de Inibição de OX40R ao Ligante do Anticorpo OX40

[000138] Os anticorpos foram testados quanto á sua capacidade em bloquear a ligação das 300-19 células expressando o ligante (L) OX40 humano em placas revestidas com proteína de fusão IgG1 OX40 humana. A linha de célula 300-19-OX40L foi cultivada em meio RPMI (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com soro bovino fetal a 10%, (Hyclone, Logan, UT), 10 mM HEPES, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L- glutamina, 0,1 mM de aminoácidos não-essenciais, 0,05 mM de 2- mercaptoetanol e 0,5 mg/ml Geneticin (Gibco, Grand Island, NY). A proteína de fusão IgG1 OX-40 humana consiste dos primeiros 220 aminoácidos da proteína OX40 extracelular. A proteína de fusão foi revestida em placas Nunc Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) em 100 μ/poço (5 μg;ml) em tampão de revestimento (BupH, tampo de carbonato- bicarbonato, Pierce Rockford, IL) e incubadas durante a noite a 4°C. A seguir, as placas foram manchadas em um papel-toalha para remover o fluido, bloqueadas com 200 μl/po^o com tampão de bloqueio (Carnation MIlk a 5% diluído em PBS) e incubadas a temperatura ambiente por duas horas. As placas foram lavadas com PBS e varias diluições do anticorpo diluídas em PB S foram então adicionadas para placa de ensaio e incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos. A seguir 50 μl/poço de células em PBS a 6 x 105/poço foram adicionadas aos poços contendo o anticorpo sendo incubadas por mais 60 minutos a 37°C em uma câmara umedecida de CO2 a 5%. As placas foram lavadas suavemente 2 vezes com PBS para remover as células que não aderiram e foi medida a atividade celular nos poços adicionando-se 200 μl de uma solução de PBS 20 ug/ml de diacetato de fluoresceina (Sigma St. Louis MO) para cada poço. As placas foram incubadas a 37°C em uma câmara umedecida com CO2 a 5% por 90 minutos e lidas usando um espectrofotômetro a 490 (Spectra Max 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ensaio de Seletividade para Anticorpo OX40R (ELISA)

[000139] Placas de 96 poços Maxisorb (Nunc,Roskilde, Denmark) foram revestidas com 100 μl de proteínas de fusão membros da família do receptor TNFα humano a 0,25 μg/ml diluídas em Tampão de carbonato BupH™, pH 9,4 (Pierce, Rockford, IL) sendo incubadas durante a noite a 4°C. As proteínas de fusão do receptor de seletividade testado incluíram CD40-Ig (Alexis Biochemicals, San Diego, CA), CD 137-Ig (R&D Systems, Minneapolis, MN) e CD271-Ig (Alexis Biochemicals, San Diego, CA). Também incluída como controle positivo com cada ensaio estava a proteína de fusão OX40-Ig (construtor doméstico, Bioexpress, 97/2117). As placas foram então lavadas três vezes com tampão de lavagem contendo 0,05% de Tween 20 (Sigma, St. Louis MO) diluída em PBS e bloqueadas com 300 μl de BSA a 0,5% (Sigma, St Louis, MO) em PBS (Sigma St. Luis, MO) por 1 hora a temperatura ambiente. A seguir as placas foram lavadas adicionando- se 100μl/poço de anticorpos OX40 reativos anti-humanos para as placas em concentrações variadas e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram cuidadosamente lavadas três vezes, detectando-se a ligação ao anticorpo OX40R com um anticorpo de cadeia kapa anti-humano rotulado com peroxidase de rábano de cavalo (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a 25 ng/ml por 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram então lavadas três vezes, seguido por adição de 100μl/poço de substrato Turbo-TMB em uma etapa (Pierce, Rockford, IL) por 30 minutos a temperatura ambiente. A reação foi interrompida por adição de igual volume de H2SO4 2M. Foi lida a absorbância a 450 nm em um Molecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Espécies de Reatividade Cruzada: Linhagens celulares Expressando OX40R:

[000140] A linha de célula 300-19 expressando, ou um construtor da fusão OX40-CD40 humano recombinante, correspondendo a 1-235 de OX40R (domínio extracelular e de transmembrana) e 216-278 de CD40 (domínio intracelular) ou a proteína total OX40R de cynomolgus.

Preparação de Linfócitos T Humanos:

[000141] Sangue humano total foi coletado em seringas heparinizadas (Baxter; Deerfiled, IL) e a seguir imediatamente transferido para tubos Accuspin (Sigma)(Sigma, /st. Louis, MO) para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) conforme descrito pelo fabricante. As células PBMC foram lavadas duas vezes com DPBS e os linfócitos T foram isolados usando uma coluna de purificação de célula T como descrito pelo fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN). Em resumo, PBMCs foram ressuspensas em 2 ml de tampão de coluna e introduzidas a uma coluna isolada de célula T pré-lavada. PBMCs foram incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente e as células T purificadas com tampão de coluna lavadas uma vez e ressuspensas TCM a 2 x 106/ml consistindo de RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Hyclone, Logan, UT) e L- glutamina (2 mM), Hepes (10 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (50 ug/ml) (Gibco, Grand Island, NY.). Um volume de 2 ml de células T contendo um anticorpo CD28 anti-humano a 1 ug/ml (clone 37407, R & D Systems, Minneapolis, MN) foi adicionado aos poços de um placa de 24 poços pré-revestida com um clone de anticorpo anti-humano CD3 UCTHl (R & D Systems, Minneapolis, MN ) a 5 μg/ml em PBS. As culturas de célula T foram estimuladas por 3 dias antes de serem testadas para reatividade cruzada com OX-40 humano por citometria de fluxo.

Preparação de PBMCs de Cynomolgus:

[000142] Sangue total de cynomolgus foi obtido usando tubos vacutainer® (BD; Franklin Lakes, NJ) sendo diluído 1:4 em PBS. O sangue total diluído foi misturado e 15 ml deste foi cuidadosamente feito em camadas sobre um volume idêntico de Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO). Os tubos foram centrifugados a 1000 x g por 45 minutos a temperatura ambiente e a interface de PBMC mononuclear foi coletada, lavada uma vez em PBS e ressuspensa por 2 minutos a temperatura ambiente com tampão de lise ACK (Biosource, Rockville, MD) para remover qualquer RBCs. Após uma lavagem com PBS, as PBMCs foram contadas e reajustadas a 1 x 106 ml em meio de cultura de tecido (TCM). TCM consistiu de RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com soro bovino fetal a 10% Hyclone, Logan, UT) e L- glutamina (2 mM), Hepes (10 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (50 ug/ml) adquiridos da Gibco (Grand Island, NY). A seguir, 2 ml da preparação de PBMC contendo um anticorpo de reação cruzada CD28 (clone CD28.2, BD Biosciences, San Diego, CA) foi adicionado aos poços de uma placa de 24 poços (Costar, Corning, NY) pré-revestida com um anticorpo CD3 de anti-macaco(clone FNl 8, Biosource, Camarillo, CA) a 10 μg/ml em PBS. culturas de PBMC foram estimuladas por 4 dias antes de serem analisadas para reatividade cruzada de OX40 humano por citometria de fluxo.

Preparação de PMCs de Coelho:

[000143] Sangue total de coelho foi retirado para tubos Vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) sendo imediatamente diluído 1:3 com HBSS quente (Gibco, Grand Island, NY). Após misturar, 5 ml do sangue diluído foi cuidadosamente depositado sobre um igual volume de Lympholyte-Rabbit (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) e centrifugado por 30 minutos a 25°C. A interface de PBMC foi coletada, lavada duas vezes com PBS e ressuspensa a 2x106/ml em TCM contendo PHA at 10 ng/ml (Remel, Lenexa, KS). As células foram cultivadas por 24-48 horas.

Preparação de PBMCs de Caninos

[000144] Sangue total de canino foi coletado usando tubos vacutainer heparinizados (BD); Franklin Lakes, NJ). A seguir o sangue foi misturado com igual volume de HBSS quente(Gibco, Grand Island, NY). Quatro ml do sangue diluído foi lentamente depositado em 3 ml de Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) em tubos cônicos de 15 ml. Os tubos foram centrifugados por 20 minutos a 800 x g coletando-se a interface do PBMC, lavando-se com HBSS sendo ressuspensa em TCM a 2 x 106/ml. O PBMCs foi adicionado para poços de uma placa de 24 poços (2 ml/poço) sendo as células estimuladas com 2 μg/ml de ConA (Sigma, St. Louis, MO) por 48 horas.

Preparação de PBMCs de murídeo e rato:

[000145] Sangue total de rato coleado em seringas heparinizadas foi diluído 1:3 em HBSS quente. A seguir 5 ml foi cuidadosamente depositado sobre igual volume de Lympholyte-Rat (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY). Os tubos foram centrifugados por 20 minutos a 1500 RPM. A interface dos PBMCs foi coletada, lavada duas vezes e o precipitado reajustado a 2x10 /ml em TCM. Dois ml de células foi adicionado para cada poço de uma placa de 24 poços sendo estimulados por 24-48 horas com PHA (Remel, Lenexa, KS) a 10 ng/ml antes do manchamento com citometria de fluxo.

Manchamento de Citometria de Fluxo para Espécies de reatividade cruzada

[000146] PBMCs de mouse, rato, coelho, cão e cynomolgus estimulados e a linha de célula 300-19 expressando o receptor de OX40 de cynomolgus foi usada para testeem espécies de reatividade cruzada do anticorpo OX40 humano. OX40 humano, expressando linfócitos T ativados e OX40 células 300-19 transduzidas de OX40 foram usadas como controles positivos. Células (5,0x105/tubo) foram lavadas uma vez em tampão de lavagem frio (PBS, FBS 2% e 0,02% azida de sódio) e 100 μ/tubo de controle conjugado Alexa Fluor 647 ou anticorpos reativos OX40 a 5 ug/ml foram adicionados para cada tubo. Os anticorpos foram rotulados usando um kit de rotulação de proteína Alex Fluor 647, conforme descrito pelo fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). As células foram incubadas no escuro com anticorpos fluoróforos em gelo por 30 minutos, lavadas 3 X e ressuspensas em 0,5 ml de tampão de lavagem para análise. O manchamento de anticorpo foi medido e analisado usando-se um Becton Dickinson FACSCalibur e software CellQuest (San Jose, CA).

Ensaio da Atividade Luciferase:

[000147] foram preparadas células 293T contendo o domínio extracelular de 0X40 e o domínio intracelular de CD40 fundidas a um reportes NfkB contendo luciferase. As células foram coletadas, lavadas e ressuspensas em meio completo isento de fenol vermelho (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, tampão HEPES aminoácidos não essenciais e L-glutamina) a uma densidade de 0,5 x 106células/ml. 80 ul de células foram depositados em cada poço de ensaio de uma placa de 96 poços (PerkinElmer, número de partes 6005680). Os anticorpos de teste foram adicionados para cada poço separados ou na presença de um IgG anti-humano de cabra Fab' de anticorpo de ligação cruzada (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). A placa foi incubada durante a noite a 37°C. 100 ul of luciferase (Promega, Bright-glo sistema luciferassay, Cat. n° E2620) foi adicionado no dia seguinte e a proporção de atividade luciferase medida usando-se um contador de cintilação (TopCount, Packard -NXT).

Ensaio IL-2 de αCD3 Humano

[000148] Sangue humano total foi coletado em seringas heparinizadas (Baxter; Deerfield, IL), depositado sobre tubos Accuspin (Sigma; St. Louis, MO) e centrifugados por 15 minutos at 2000 rpm. A camada leucocitária foi coletada, lavada com PBS (Sigma, St. Louis, MO), e as células da série vermelhalisadas com água. Células T foram separadas por colunas enriquecidas com CD3+ humano (R&D; Minneapolis, MN), contadas e ajustadas a 1x106/ml em meio RPMI (Gibco; Grand Island, NY) contendo: 10% de soro bovino fetal (Hyclone; Logan, UT), 10 mM hepes, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e 0,1 mM de aminoácidos não essenciais (todos de Gibco). Concomitantemente, anti-CD3ε humano, clone n° UCHT1 (R&D systems, Minneapolis, MN) foi colocado a 2,5 μgs/ml em PBS para placas de 24 poços (Costar; Corning, NY) e incubadas por 2 horas a 37°C. As placas foram lavadas 3x com PBS e a seguir adicionadas para os poços: Células T a 1 x 106/poço, diluições seriais de anticorpos OX40 (ou controle IgG2 KLH) e IgG anti-humano de cabra F(ab')2 parra ligação cruzada (adicionado a 2,5 ug/mL). Os sobrenadantes foram retirados em 48 e 72 horas, sendo os níveis de IL-2 avaliados por ELISA (R&D).

Ensaio IL-2 de aCD3 de Cynomolgus:

[000149] Sangue total de macaco Cynomolgus foi coleado em frascos heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ), diluído a 1:4 em PBS, depositado sobre Histopaque 1077 (Sigma, St Louis, MO) e centrifugado por 45 minutos a 2200 rpm. A camada leucocitária foi coletada, lavada com PBS, sendo as células da série vermelha lisadas com água. As células foram ajustadas a 1 x 106 e adicionadas parra placas de 24 poços que tinham sido pré-revestidos por 2 horas com concentrações variadas de anti-CD3 de macaco, clone FN-18 (Biosource; Camarillo, CA) at 37°C. Diluições seriais de anticorpo OX40 (ou controle IgG2 KLH, bem como Fcy de IgG anti-humano de cabra a 2.5 ug/mL foram adicionados para os poços. Os sobrenadantes foram coletadas 24 e 48 horas sendo os níveis de IL-2 avaliados por ELISA (Biosource, Camarillo, CA ).

Ensaio de Células T Iniciadas com aloantígeno

[000150] Células T humanas recentemente isoladas (ver acima) foram incubadas com células de tumor alogenéico tratadas com mitomicina (Raji) por 3-4 dias. As células T foram colhidas, lavadas e deixadas em repouso por 1 dia em meio fresco antes da estimulação com 11D4. O nível de IL-2 foi avaliado 24 horas depois por ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN).

Procedimentos de teste In vivo Modelos de Tumor Humano de SCID-bege Usando Camundongos Enxertados com Células T humanas e Células Dendríticas

[000151] CamundongosSCID-bege (Taconic n° CB SBG-MM) foram aclimatados por 5-7 dias após a chegada, e antes do uso. Foram usadas as seguintes linhas de célula de tumor: RAJI, ATCC n°CCL-86; BT-474, ATCC n°HTB-20; PC-3, ATCCn°-1435; e LoVo, ATCCn° CCL-229.

[000152] Linfócitos T purificados (células T) e células dendríticas derivadas de monócito foram preparadas de sangue humano como a seguir: células mononucleares humanas foram coletadas de sangue heparinizado usando Tubos Sigma Accuspin n° A7054. As células foram coletadas, colocadas em um frasco T75 e incubadas por 3 horas a 37°C em uma incubadora umidificada sob 5% de CO2. as células não aderentes foram coletadas e guardadas (ver a seguir). O frasco contendo as células aderentes foi incubado com 20 ml de meio RPMI completo (contendo 10% de soro bovino fetal) suplementado com IL-4 (R&D) a 10 ng/ml e GM-CSF (R&D) a 100 ng/ml. A cultura foi a seguir incubada por 6-7 dias a 37°C em uma incubadora umidificada sob 5% de CO2. As células dendríticas derivadas de monócito não aderente foram então coletadas por decantação e enxágüe do frasco varias vezes com meio RPMI completo.

[000153] As células mononucleares não aderentes foram usadas na purificação das células T via seleção negativa de alta afinidade usando colunas enriquecidas com célula T (R&D) de acordo com as instruções do fabricante. Células T purificadas são conservadas por congelamento em Meio de Cultura de Recuperação de Célula a 107 /ml e armazenadas em Nitrogênio liquido até o uso. Células de tumor cells (1 x 107) foram injetadas subcutaneamente (SC) com célula T (1 x 106) e células dendríticas derivadas de monócito (5 x 105 ) do mesmo doador, a 0,2 ml/camudongo. O crescimento do tumor foi monitorado com o tempo com auxílio de calibradores.

C. Resultados párea Anticorpo 11D4 1) testes In vitro:

[000154] Algumas propriedades do anticorpo 11D4 de testes in vitro estão resumidos na Tabela 3. Anticorpo 11D4 liga-se a OX40R com grande afinidade.

[000155] Demonstrou-se isto pelo uso de uma proteína de fusão IgG1 contendo o domínio extracelular de OX40R e em células totais (células transfectadas com OX40R+ e células T primárias ativadas). Nos exemplos, usando a proteína de fusão IgG1, 11D4 ligado ao domínio extracelular de OX40R com um EC50 de 0,5 +/- 0,18 μg/ml (3,5 nM) Esta ligação foi confirmada em células pré-B 300-19 expressando o domínio extracelular de comprimento total de OX40R (nenhuma ligação foi observada em células 300-19 paternas) O EC50 para ligação a células transfectadas OX40R foi 0,2 +/- 0,16 μg/mL (1,7 nM). De modo a confirmar que a ligação foi observada em células T primárias, células T de sangue periférico foram isoladas de múltiplos doadores humanos e estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 por 2 dias para suprarregular a expressão do OX40R. Dados de ligação de saturação dessas células T indicaram que, 11D4 liga-se com um EC50 de 0,6 +/-1,0 μg/mL (4,0 nM, N - 17 doadores). Esses dados demonstram que, 11D4 liga-se estreitamente ao OX40R.

[000156] De modo a caracterizar mais ainda esta ligação, coletaram- se dados para se avaliar a região n domínio extracelular de OX40R onde 11D4 interage e também determina se o receptor foi internalizado seguinte a ligação. Dados de ligação competitivos para proteína de fusão IgGl de OX40R indicaram que, 11D4 compete para ligação com células expressando o ligante OX40 expressando células, oferecendo evidência de que, 11D4 interage na região de ligação do ligante ao receptor. Além disso, 11D4 não compete cruzado com dois anticorpos OX40R comercialmente disponíveis, BerAct35 e L106, para ligação a células T conforme avaliado por análise FACS. A análise FACS usando anticorpos de detecção não competitivos indicou que, o OX40R não era internalizado seguinte a pré-incubação de células T primárias, ativadas com 11D4 durante 30 minutos. Sua afinidade de ligação determinada por análise Biacore usando a proteína de fusão do domínio extracelular de OX40R como o ligante imobilizado, indicou que, a constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 11D4 para ligação foi de 0,48 nM. Essas analises também estimaram que, a constante (kd) de 11D4 é 5,72 E-05 1/s. Portanto, 11D4 liga-se com alta afinidade, para a região de ligação do ligante de OX40R, possui uma constante de dissociação lenta e não internaliza o receptor seguinte á ligação.

Anticorpo 11D4 liga-se seletivamente ao OX40R

[000157] A seletividade de 11D4 para OX40r foi avaliada contra outros membros da superfamília de TNFR usando os dados relacionados com construtores da proteína de fusão IgG1 contendo o respectivo domínio extracelular do receptor relacionado. Esses receptores incluíam o receptor CD40, receptor 4-1BB (CD137) e o receptor do fator de crescimento neuronal (CD271). Em todo caso, nenhuma ligação significativa foi observada a concentrações de até 100 μg;mL (700 nM) nesses receptores. Quando se compara à ligação observada com a proteína de fusão OX40R (EC50 = 0,5 μg/ml) esses dados demonstram que, 11D4 é > 100 vezes seletivo para o OX40R versus outros membros da família relacionados que foram testados (Ver as figuras 1a e 1b).

Atividade Funcional do Anticorpo 11D4:

[000158] A atividade funcional de 11D4 foi demonstrada em ambas as células transfectadas OX40R+ e em células T primárias. Nesses ensaios, 11D4 demonstrou atividade agonista quando adicionado a células com ou sem um anticorpo secundário Fçy de IgG anti-humano de cabra F(ab')2.

[000159] No primeiro lote de experimentos, 11D4 foi avaliado para atividade agonista usando 293 células transfectadas com o domínio extracelular e transmembranado OX40R fundido ao domínio intracelular de CD40 com um reporte luciferase NFkB. Neste ensaio, 11D4 intensificou a sinalização através de OX40R com uma média EC50 de 0,33μg/mL (2,2 nM, N= 4). Um curva de concentração-resposta representativa para indução de luciferase por 11D4 está mostrada na Figura 2. Na ausência do anticorpo secundário F(ab')2, a amplitude da atividade luciferase foi reduzida 4 vezes juntamente com EC50.

[000160] Como uma evidência posterior para a atividade agonista de 11D4, foram geradas células T específicas para antígeno. Células T humanas isoladas recentemente, foram incubadas com células de tumor alogenéico tratado com mitomicina c (Raji) por 3 a 4 dias. AS células T foram então colhidas, lavadas e deixadas em repouso por 1 dia em meio fresco antes da estimulação com 11D4. A análise FACS indicou um alto nível de expressão OX40R nessas células mesmo após o repouso. 11D4 indicou altos níveis de IL-2 por essas células, em alguns casos, excedeu 100 ng/mL. (Figura 3). A média EC50 para esta resposta de 2 exemplos separados foi 0,008 +/- 0,006 μg/mL. Na ausência de 11D4 apenas níveis mínimos de IL-2 foram secretados por essas células.

[000161] 11D4 também incrementa a produção de IL-2 por células T humanas primárias estimuladas por anti-CD3. Embora o sinal para relação de ruído neste ensaio fosse baixo em alguns ensaios, devido à indução de IL-2 por anti-CD-3 sozinho, 11D4 incrementou a produção de IL-2 quando adicionado com Fcy de IgG anti-humano de cabra F(ab')2. Nenhuma atividade foi observada para 11D4 em células T recentemente isoladas na ausência de anti-CD3. A amplitude do aumento de IL-2 por 11D4 variou de 2,3 a 57 vezes versus anti-CD3 sozinho, dependendo do doador e da quantidade de IL-2 gerado por anti-CD3. O efeito de 11D4 na produção de IL-2 por células T humanas primárias estimuladas com 2,5 μg/mL de anti-CD3 está representada na Figura 4 (usando uma curva de concentração de 8 pontos com diluições 1:3). A média EC50 calculada dos dados que usaram curvas de resposta de concentração de 8 pontos foi de 0,042 +/- 0,01 μg/mL (ver a Tabela 4).

[000162] A atividade funcional de 11D4 na produção de IL-2 também foi avaliada usando-se células de macaco estimuladas com anti-CD3 e 11D4 (juntamente com anticorpo secundário F(ab')2). Os resultados estão representados na figura 5 e Tabela 5. esses dados indicaram que, o EC50 para 11D4 era semelhante entre células de macaco e de humano (0,022 versus 0,042 μg/mL para células humanas), ms a amplitude de IL- 2 induzida acima daquela de anti-CD3 sozinho foi menos significativa usando células T de Cynomolgus (aproximadamente 35 vezes, 5762 +/4748 pg/mL IL-2 para células humanas (N = 21) vs 261 +/- 294 pg/mL IL- 2 para células de macaco (N = 9).

Espécies de Reatividade Cruzada

[000163] 11D4 foi avaliado quanto à sua capacidade em ligar-se a células T de múltiplas espécies. células T foram isoladas de camundongo, rato, coelho, cão, e macaco e foram ativadas com ou anti- CD3 mais anti-CD28 ou mitógeno. Não se observou nenhuma ligação a células de camundongo, rato, coelho ou cão, conforme indicado por analise FACS. A falta de ligação a OX40R de camundongo também foi confirmada por ELISA usando uma proteína de fusão comercialmente disponível contendo o domínio extracelular de OX40R de murídeo. Em contraste, 11D4 liga-s a células T de macaco Cynomolgus conforme determinado em um ensaio de ligação de saturação por FACS. A faixa de valores EC50 obtida usando diferentes macacos está mostrada na Figura 6. Para comparação, a faixa de valores EC50 obtida usando células humanas está mostrada na Figura 7. Embora variável a faixa de valores EC50 foi semelhante entre células de macaco e de humano (valores médios são 0,354 μg;mL, para macacão versus 0,566 μg para células de humano).

2) testes In vivo

[000164] A falta de reatividade cruzada de 11D4 com OX40R de murídeo exigiu o desenvolvimento de um modelo de tumor xenogênico usando camundongo bege SCID. camundongos bege SCID carecem de linfócitos T e B de murídeo e células NK tornando-os receptores ideais para enxertia de células imune humanas e crescimento de tumores humanos. Quatro linhas de célula tumorais representando tipos diversos de tumor foram testados neste modelo de teste in vivo. Nenhuma das linhagens de tumor expressou OX40R. Em todos os casos, as células de tumor (1 x 107) foram injetadas subcutaneamente (SC) com células T (1 x 106) e células dendríticas derivadas de monócito (5 x 105) do mesmo doador . 11D4 administrado por injeção intraperitoneal inibiu o crescimento do tumor em até 98% nesses modelos conforme resumido na Tabela 6. A via IP de administração foi escolhida para 11D4 devido a sua facilidade de administração e rápida disseminação ao sangue periférico.

Eficácia de 11D4 contra um Linfoma de Celula B em Camundongos bege SCID

[000165] Injetou-se a camundongos bege SCID (SC) com o linfoma de célula B de Burkitt, Raji, juntamente com células T humanas e células dendríticas derivadas de monócito. O s camundongos receberam uma injeção única i.p de, ou 11D4 ou um anticorpo de isotipo de controle (IgG2 anti-KLHG) por ocasião da injeção de tumor. Como se vê na Figura 8, 11D4 diminuiu a velocidade do crescimento do tumor em animais tratados. O tamanho do tumor em cada animal individual (N = 10) no dia 21 após desafio está mostrado na Figura 9. ilustrando 64% de inibição o crescimento tumoral por um nível de dose de 10 mg/kg. Nenhuma atividade foi vista na ausência de células T e células dendríticas.

Eficácia de 11D4 em um Modelo de Tumor de Próstata

[000166] Injetou-se (SC) a camundongos bege SCID o adenocarcinoma PC-3 de próstata junto com células T humanas e células dendríticas derivadas de monócito. Os camundongos receberam uma única injeção IP de, ou 11D4 ou um anticorpo de controle do isotipo (IgG2 anti-KLH) por ocasião da injeção do tumor. Os resultados que estão representados na Figura 10, mostram que, o tratamento com 11D4 resultou em uma inibição dose-dependente do crescimento do tumor. O tamanho do tumor em cada animal individual (N = 10) deste teste no dia 27 após o desafio está dado na Figura 11, ilustrando uma inibição de 70% no crescimento do tumor quando aos animais administrou-se uma única injeção de 1,0 mg/kg de 11D4 e 90% de inibição a uma dose de 10 mg/kg. Os níveis de plasma de 11D4 determinados no dia 27 nesses animais foram 6,2 μg/ml a um nível de dosagem de 1,0 mg/kg.

Eficácia de 11D4 em um Modelo de Tumor de Carcinoma de Cólon

[000167] Injetou-se a camundongos SCID bege (SC) com o adenocarcinoma colorretal LoVo, juntamente com linfócitos T humanos e células dendriticas derivadas de monócito autólogo. Os camundongos receberam uma injeção IP única de, ou 11D4 ou um anticorpo de controle (IgG2 anti-KLHB) por ocasião da injeção de tumor. Os resultados representados na Figura 12, mostram que 11D4 diminuiu o crescimento do tumor numa dose-dependente nesses animais. O tamanho do tumor em cada individuo (n= 10) deste teste no dia 27 após desafio está mostrado na Figura 13, ilustrando uma inibição de 64% em um crescimento de tumor usando uma única dose de 1,0 mg;kg e uma inibição de 87% do crescimento do tumor a um nível de dose de 10,0 mg/kg.

Eficácia de 11D4 em um Modelo de Tumor de Carcinoma mamário

[000168] Camundongos bege SCID foram injetados SC com o carcinoma mamário BT474 junto com linfócitos T humanos e células dendríticas derivadas de monócito autólogo. Os camundongos receberam duas injeções (IP) de, ou 11D4 ou um anticorpo de controle (IgG2 anti-KLH) por ocasião da injeção do tumor e novamente 30 dias depois. Os resultados representados na Figura 14, mostram que, 11D4 diminuiu o crescimento tumoral nesses animais. O tamanho do tumor em cada indivíduo animal (N= 10) deste teste no dia 85 após desafio está dado na Figura 15, ilustrando uma inibição de 98% em um crescimento de tumor a um nível de dose de 10,0 mg;kg e 85% de inibição a uma dose de 1 mg/kg.

D. Resultados para Anticorpo 18D8 1) Testes In vitro

[000169] Os resultados dos testes in vitro para o anticorpo 18D8 estão resumidos na Tabela 7.

[000170] O efeito do anticorpo 18D8 na produção de IL-2 induzida por anti-CD3 por células T primárias humans de diferentes doadores também está dado na Tabela 8

2) Testes In vivo Eficácia de 18D8 contra Linfoma de Célula B em um Modelo de Camundongo bege SCID

[000171] Injetou-se a camundongos bege SCID (SC) linfoma de célula B de Burkitt junto com linfócitos T humanos e células dendríticas derivadas de monócito. Os camundongos receberam uma única injeção IP de, ou 18Du ou um anticorpo de controle de isotipo (IgG2 anti-KLH) por ocasião da injeção de tumor. Dez animais por grupo foram usados em cada teste. Os resultados de dois testes estão representados na Tabela 9. O resultado mostra que, 18D8 produziu eficácia anti-tumor significativa na doses de 1,0 mg/kg e 10 mg/kg. Não se observou nenhuma atividade na ausência de células T e células dendríticas, sugerindo que, este efeito anti-tumor pode ser imunologicamente mediado.

Eficácia de 18D8 contra Tumor de Próstata em um Modelo de Camundongo bege SCID

[000172] Camundongos bege SCID foram injetados s.c com o adenocarcinoma de próstata P-3 juntamente com células T humanas e células dendríticas derivadas de monócito autólogo. Os camundongos receberam uma única injeção IP de, ou 18D8 ou um anticorpo de controle do isotipo (IgG2 anti-KLH) por ocasião da injeção de tumor. Dez animais por grupo foram usados nesta tese. Os resultados apresentam-se na Tabela 9. Os resultados mostram que, o tratamento com 18D8 resultou em uma inibição de 42%, 90%, e 88% do crescimento tumoral nas doses de 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente.

INFORMAÇÃO DO DEPÓSITO

[000173] Os depositantes depositaram uma cultura de E. coli DHa5 contendo plasmídeo codificando a cadeia pesada do anticorpo 11D4 e uma cultura de E. coli DHa5 contendo plasmídeo codificando a cadeia leve do anticorpo 11D4 nas coleções de American Type Culture (ATCC). 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 em 10 de julho de 2007, que foram atribuídas com os números de depósito PTA-8524 e PTA-8525, respectivamente. Esses depósitos foram feitos sob a disposição do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Finalidade de Procedimento de Patente e os Regulamentos competentes (Tratado de Budapeste). Esses depósitos serão mantidos sem restrição no depósito da ATCC durante um período de 30 anos, ou 5 anos após o pedido mais recente, ou pela vida eficaz da patente, independente do tempo, sendo substituído caso os depósitos tornem-se inviáveis durante esse período. A disponibilidade dos materiais depositados não devem ser construídos como uma licença para prática da invenção, em contravenção dos direitos garantidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com as leis de patente.

[000174] Todas as referências citadas neste relatório descritivo, incluindo, sem limitação, todos os documentos, publicações, patentes, pedidos de patente, livros, artigos periódicos estão ora incorporados por referência em sua totalidade. A descrição das referencias ora citadas, destina-se simplesmente, a resumir as assertivas feitas por seus autores, não se admitindo que qualquer referência venha a se constituir em técnica precedente.

[000175] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe, à guisa de ilustração e exemplos com finalidade de melhor entendimento, ficará prontamente evidente aos versados na pratica, à luz dos ensinamentos presentes, que, algumas alterações e modificações podem ser feitas à invenção sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações apensas. TABELA 1. Identificadores de Sequência para anticorpos 11D4 e 18D8

Tabela 2A. Sequências de aminoácido para Anticorpo 11D4

Tabela 2B - Sequência de aminoácido para Anticorpo 18D8

(variable region in upper case, constant region in lower case, CDRs underlined = região variável em letras capitais, região constante em letras minúsculas, CDRs sublinhadas) TABELA 3 - Resumo de Algumas Propriedades do Anticorpo 11D4 in vitro

IL-2 Max = Proporção de IL-2 produzida com 11D4 na ECmax em apenas Anti-CD3 ECmax = Cód de 11D4 que produz o nível máximo de Il-2 sobre anti-CD3 apenas Índice de estimulação: Coeficiente do nível Maximo de IL-2 produzido com 11D4 versus a proporção de IL-2 produzida com apenas anti-CD3 ND = não determinado Valores para os quatro últimos doadores (18-21) são da curva de dose-resposta feita em 8 pontos diluições 1:3 ou 1:4; todos os outros valores representam curvas de log de diluição. O EC50 das curvas de concentração 1:3 e 1:4 foi de 0,042 +/- 0,01 μg/mL, N = 4. TABELA 5 = Efeito do Anticorpo 11D4 em IL-2 Induzido por anti-CD3 Produção por Células T de Cynomolgus

Max Il-2 = Proporção de Il-2 produzido com 11D4 a ECmax sobre apenas anti-CD3 ECmax: concentração de 11D4 produzindo o nível máximo de Il-2 sobre apenas anti-CD3 Índice de Estimulação = proporção do IL-2 máximo produzido com 11D4 sobre a proporção produzida com apenas anti-CD3 ND = não determinado

[000176] Os valores para os três últimos doadores (33081, 33080 e 33062) na Tabela 6 são da curva dose-resposta feia em 8 pontos em diluições 1:3. Todos os outros valores representam curvas de log de diluição. O EC50 derivado das curvas usando diluições 1:3 foi de 0,022 +/- 0,01 N = 3. TABELA 6: Inibição do Crescimento de Tumor Humano por Anticorpo 11D4 em Camundongos bege SCID Enxertados com células T Humanas e Células Dendríticas

TABELA 7. Resultados de testes in vitro com Anticorpo 18D8

Valores para atividade expressada em μg/ml representam a média +/- um SD TABELA 8 : Efeito do Anticorpo 18D8 na Produção de IL-2 Induzida por anti-CD3 por Células T Humanas Primárias

IL-2 Max : Proporção de IL-2 produzido com 18D8 em ECmax sobre anti-CD3 apenas ECmax: Concentração de 18D8 produzindo o nível Maximo de Il-2 sobre anti-CD3 apenas

[000177] Os valores representam curvas de log de diluição. TABELA 9; Inibição do Crescimento de Tumor Humano pelo Anticorpo 18D8 em Camundongos SCID-bege

Valores: % de inibição do crescimento de tumor determinado ao término do teste nd = não determinado

Claims (22)

1. Molécula de ligação isolada que compete para ligação a QX40R com um anticorpo, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 7; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 8.

2. Molécula de ligação isolada de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 1; b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 2; e c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 3.

3. Molécula de ligação isolada de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4; b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 5; e c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 6.

4. Molécula de ligação isolada que se lia ao QX40R humano, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 1; b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 2; c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 3; d) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 4; e) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 5; e f) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 6.

5. Molécula de ligação isolada que se liga ao 0X40R humano, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 7; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 8.

6. Molécula de ligação isolada de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 13; b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 14; e c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 15.

7. Molécula de ligação isolada de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 16; b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 17; e c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N0: 18.

8. Molécula de ligação isolada que se liga ao QX40R humano, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 13; b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 14; c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 15; d) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 16; e) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 17; e f) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 18.

9. Molécula de ligação isolada que se liga ao QX40R humano, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 19; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 20.

10. Molécula de ligação isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que: a) liga-se ao QX40R humano com uma KD de 1 x 10-6 M ou menos e b) possui atividade agonista para o anticorpo QX40R humano.

11. Molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que é um anticorpo humano.

12. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que é um anticorpo quimérico ou humanizado.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, CARAC-TERIZADO pelo fato de que ligar-se ao QX40R humano com uma Kode 100 nM ou menor.

14. Anticorpo monoclonal humano isolado que se liga ao QX40R humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NQ: 9 ou SEQ ID NQ: 21.

15. Anticorpo monoclonal humano isolado que se liga ao QX40R humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NQ: 10 ou SEQ ID NQ: 22.

16. Anticorpo monoclonal humano isolado que se liga ao QX40R humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NQ: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 10.

17. Anticorpo monoclonal humano isolado que se liga ao QX40R humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 21 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 22.

18. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que com-preende uma molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

19. Molécula de ácido nucleico CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada das SEQ ID NQs: 11, 12, ou 24.

20. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 19.

21. Vetor, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERI-ZADO pelo fato de que compreende ainda, uma sequência de controle de expressão ligada operativamente à molécula de ácido nucleico.

22. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que a célula hospedeira é uma célula de bactéria ou de levedo.

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