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TWI788307B - 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞 - Google Patents

用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞 Download PDF

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TWI788307B
TWI788307B TW106137461A TW106137461A TWI788307B TW I788307 B TWI788307 B TW I788307B TW 106137461 A TW106137461 A TW 106137461A TW 106137461 A TW106137461 A TW 106137461A TW I788307 B TWI788307 B TW I788307B
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aapc
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TW106137461A
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Inventor
安南 維爾拉帕斯朗
艾許瓦亞 格庫達斯
布萊恩 拉比諾維
麥可 洛茲
Original Assignee
美商艾歐凡斯生物治療公司
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Publication date
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Abstract

於一些實施態樣中，本發明揭示關於經分離之人造抗原呈現細胞(aAPC)之組成物和方法，該組成物和方法包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，諸如MOLM-14或EM-3髓樣細胞，其中該髓樣細胞內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，且其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL及/或OX40L之核酸並轉導該髓樣細胞以表現CD86和4-1BBL及/或OX40L蛋白。於一些實施態樣中，本發明亦揭示以aAPC擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法及使用經aAPC擴增後之TIL治療癌症的方法。

Description

用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
本發明揭示用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞(aAPC)。
使用過繼性自體轉移腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)治療巨大的難治性癌症為對預後不良之患者的有力治療方式的代表。Gattinoni,et al.,Nat.Rev.Immunol. 2006, 6,383-393。成功的免疫療法需要大量TIL，為了將其商業化則需要穩固且可靠之過程。由於細胞擴增之技術、邏輯和調節問題，實現該過程一直是個挑戰。基於IL-2來擴增TIL，再接著進行“快速擴增過程”(REP)的方法因為其速度和效率的關係已經成為擴增TIL之較佳方法。Dudley,et al.,Science 2002, 298,850-54；Dudley,et al.,J.Clin.Oncol. 2005, 23,2346-57；Dudley,et al.,J. Clin.Oncol. 2008, 26,5233-39；Riddell,et al.,Science 1992, 257,238-41；Dudley,et al.,J.Immunother. 2003, 26,332-42。然而，雖然REP可導致TIL在14天內擴增1,000倍，但其需要大量過量(例如200倍)之作為餵養細胞的經放射照射之同種異體外周血單核細胞(PBMC)(其經常來自多個供體)，及抗CD3抗體(OKT-3)和高劑量之IL-2。Dudley,et al.,J.Immunother. 2003, 26,332-42。儘管PBMC具有高性能，但其仍有許多缺點，包括需要大量之同種異體PBMC、需要藉由白血球分離術從多個健康供體取得PBMC、冷凍保存後所造成之PBMC存活力的供體間變異性及容易變化之TIL擴增結果、未檢測到之病毒性病原體引起下游患者感染的風險及用於確認各個別供體細胞產物之無菌性和品質(包括病毒污染物測試)和測試擴增性質的廣泛且昂貴之實驗室測試。
不幸的是，與PBMC相比較，研發之用於擴增TIL的aAPC苦於性能較差，包括該輸入之TIL的表型性質改變及擴增性能差和/或擴增結果的高變異性。由於可適合作為aAPC之可能細胞的數量大及鑑定合適之候選細胞的不可預測性，迄今為止，用於多株TIL之aAPC的研發僅著重於已完善建立之K562細胞株。Butler and Hirano,Immunol.Rev. 2014, 257,191-209。例如，在前REP培養物中(但不在REP培養物中)測試經修飾以表現4-1BBL(CD137L)之K562細胞以測定從腫瘤分解物增加擴增TIL，但是PBMC仍需要與K562細胞聯合使用以達成擴增TIL。 Friedman,et al.,J.Immunother. 2011 ,34,651-661。測試其他經修飾以表現CD64、CD86和4-1BBL之工程化K562細胞且達成之TIL擴增的最佳情況與PBMC相當，很可能較PBMC差，且亦苦於該多株TIL表型偏向較不利之CD8+/CD4+ T細胞比。Ye,et al.,J.Translat.Med. 2011, 9,131。最近，經修飾以表現CD86、4-1BBL(CD137L)、高親和力Fc受體(CD64)及與膜結合之IL-15的K562細胞亦顯示出與PBMC餵養細胞相較下，繁殖之TIL(後REP)數量相等，但具有與膜結合之IL-15的額外複雜性。Forget,et al.,J.Immunother. 2014, 37,448-60。其他研發之系統缺乏關鍵之共刺激分子、導致不利之T細胞表型偏斜或需要額外之介白素(諸如IL-21)。Butler and Hirano,Immunol.Rev. 2014,257,191-209。總體而言，經K562修飾之aAPC尚未顯示出能以可接受之變異性持續擴增TIL，同時亦在其他測量中表現優於PBMC，包括總擴增細胞數。除了K562細胞之外的替代aAPC已成功用於其他細胞擴增方法中，但並未取得與PBMC相同之性能以獨特的多株細胞亞群來構成TIL。Maus,et al.,Nat.Biotechnol. 2002, 20,143-148；Suhoski,et al.,Mol.Ther. 2007, 15,981-988。
MOLM-14人白血病細胞株係從具有復發之急性單核細胞白血病之患者的外周血建立，且初始表型特徵指明至少存有下列標記物：CD4、CD9、CD11a、CD13、CD14、CD15、CD32、CD33、CD64、CD65、CD87、CD92、CD93、CD116、CD118和CD155。Matsuo, et al.,Leukemia 1997,11,1469-77。MOLM-14之另外的表型特徵發現高含量之HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L、CD58及低含量之CD86。MOLM-14細胞和密切相關之MOLM-13細胞先前未曾被報導為用於擴增用於腫瘤免疫療法應用之細胞的有用aAPC。
EM-3人細胞株係從患有費城染色體陽性CML之患者的骨髓建立。Konopka,et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 1985,82,1810-4。EM-3細胞和密切相關之EM-2細胞先前未曾被報導為用於擴增用於腫瘤免疫療法應用之細胞的有用aAPC。EM-3細胞之表型特徵指明至少存有下列標記物：CD13、CD15和CD33。
本發明出人意料地發現以另外之共刺激分子(包括CD86(B7-2)、4-1BBL(CD137L)和OX40L(CD134L))轉導之工程化骨髓譜系細胞，包括MOLM-13、MOLM-14、EM-3和EM-2細胞可優異且高效率地大量擴增TIL並具有最小之可變性、降低之成本、且不依賴人血液樣品作為PBMC來源，並具有利用可有效地從主細胞庫產生之aAPC的優點。CD86和4-1BBL為提供共刺激信號來激活T細胞的共刺激分子。以另外之共刺激分子轉導的MOLM-14、MOLM-13、EM-3及/或EM-2細胞可用於，例如擴增用於癌症免疫療法和其他療法之TIL。
於一實施態樣中，本發明提供人造抗原呈現 細胞(aAPC)，該aAPC包含以一或多種載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，該CD86蛋白和4-1BBL蛋白各自為人類蛋白質。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該aAPC可刺激並擴增與該aAPC接觸之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
顯而易見的是，於本發明之某些實施態樣中，該編碼CD86之核酸分子與該編碼4-1BBL之核酸分子可包含在不同的病毒載體中或包含在相同之病毒載體中。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該aAPC在包含濃度約3000IU/mL之IL-2和濃度約30ng/mL之OKT-3抗體的細胞培養基中在7天之期間擴增TIL群至少50倍。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該 一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該aAPC可刺激並擴增與該aAPC接觸之T細胞。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該髓樣細胞內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該髓樣細胞基本上缺乏與膜結合之IL-15。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該髓樣細胞為MOLM-14細胞。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4- 1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該髓樣細胞為MOLM-13細胞。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該髓樣細胞為EM-3細胞。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該髓樣細胞為EM-2細胞。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，其中該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之胺基酸序列，該4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之胺基酸序列。
於一實施態樣中，本發明提供aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白及4- 1BBL蛋白，其中該編碼CD86之核酸分子包含如SEQ ID NO：16所示之核酸序列且該編碼4-1BBL之核酸分子包含如SEQ ID NO：19所示之核酸序列。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法，該方法包含令TIL群與包含經一或多種病毒載體轉導之髓樣細胞的aAPC接觸之步驟，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子和編碼4-1BBL之核酸分子，其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該TIL群被擴增。於一實施態樣中，該方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體 包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該細胞培養基進一步包含初始濃度約3000IU/mL之IL-2及初始濃度約30ng/mL之OKT-3抗體。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該APC群在7天之期間擴增細胞培養基中之TIL群至少50倍。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體 包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞為MOLM-14細胞。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸 分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞為MOLM-13細胞。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞為EM-3細胞。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中 該髓樣細胞為EM-2細胞。
於一實施態樣中，前述方法是為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之胺基酸序列，且該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之胺基酸序列。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中 該編碼CD86之核酸包含如SEQ ID NO：16所示之核酸序列，且編碼4-1BBL之核酸包含如SEQ ID NO：19所示之核酸序列。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該TIL群對該aAPC群之比例係介於1：200至1：400之間。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟： (a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸分子及編碼4-1BBL之核酸分子，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，及(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該TIL群對該aAPC群之比例為約1：300。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法，該方法包含令TIL群與髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)接觸，其中該髓樣aAPC包含至少二種共刺激配體，該至少二種共刺激配體與至少二種在該TIL上之共刺激分子特異性結合，其中該共刺激分子與該共刺激配體結合可誘導該TIL增殖，從而特異性擴增TIL，且其中該至少二種共刺激配體包含CD86和4-1BBL。於一實施態樣中，前述方法為玻管內或活體外方法。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中從快速擴增開始7天該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群； 其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，且其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL為第二TIL群且可從包含下列步驟之方法取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該TIL係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；且其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，且其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和 CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，且其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第二TIL群且可藉由包含下列步驟之過程取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，且其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性 淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，且其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第二TIL群且可藉由包含下列步驟之過程取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群 之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；且其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，且其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該快速擴增進行之期間不超過14天。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第二TIL群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍，其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該快速擴增進行之期間不超過14天。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白， 且其中該細胞培養基進一步包含初始濃度約3000IU/mL之IL-2和初始濃度約30ng/mL之OKT-3抗體。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第二TIL群且可藉由包含下列步驟之過程取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；且其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該細胞培養基進一步包含初始濃度約3000IU/mL之IL-2和初始濃度約30ng/mL之OKT-3抗體。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群； 其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，該TIL群為第二TIL群且可藉由包含下列步驟之過程取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；且其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之 數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該第二TIL群對該aAPC群之比例係介於1：200至1：400之間。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第二TIL群且可藉由包含下列步驟之過程取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；且其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該第二TIL群對該aAPC群之比例係介於1：200至1：400之間。於某些實施態樣中，該第二TIL群對該aAPC群之比例為約1：300。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： (a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，且其中該第二TIL群對該aAPC群之比例為約1：300。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群；其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白， 其中該癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌、腎癌和腎細胞癌。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第二TIL群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該TIL係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該快速擴增開始7天後，該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及其中該髓樣aAPC內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中該髓樣aAPC經轉導以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌、腎癌和腎細胞癌。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群； (b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群， 其中該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第三TIL 群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(b)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3。
於一實施態樣中，該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。於一實施態樣中，該髓樣細胞包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-13細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-13細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。於某些實施態樣中，該髓樣細胞包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。於某些實施態樣中，該髓樣細胞包含經一或多種病毒載體轉導之EM-2細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼 CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-2細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)以非清髓性淋巴細胞清除攝生法治療該患者，其中該非清髓性淋巴細胞清除攝生法包含投予劑量為60mg/m2/天之環磷醯胺達二天且隨後投予劑量為25mg/m2/天之氟達拉濱達5天之步驟；(e)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群；及(f)以高劑量IL-2攝生法治療該患者，其中該高劑量IL-2攝生法包含600,000或720,000IU/kg之阿地介白素，該劑量係每8小時以15分鐘大量靜脈內輸注形式投予直至產生耐受性； 其中該髓系aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)以非清髓性淋巴細胞清除攝生法治療該患者，其中該非清髓性淋巴細胞清除攝生法包含投予劑量為60mg/m2/天之環磷醯胺達二天且隨後投予劑量為25mg/m2/天之氟達拉濱達5天之步驟；(e)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群；及(f)以高劑量IL-2攝生法治療該患者，其中該高劑量IL-2攝生法包含600,000或720,000IU/kg之阿地介 白素，該劑量係每8小時以15分鐘大量靜脈內輸注形式投予直至產生耐受性；其中該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，且其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第三TIL群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；及(b)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；進一步其中該TIL群係用於與非清髓性淋巴細胞清除攝生法一起投予患者，其中該非清髓性淋巴細胞清除攝生法包含投予劑量為60mg/m2/天之環磷醯胺達二天且隨後投予劑量為25mg/m2/天之氟達拉濱達5天且進一步其中該TIL群係用於與高劑量IL-2攝生法一起投予，其中該高劑 量IL-2攝生法包含600,000或720,000IU/kg之阿地介白素，該阿地介白素劑量係每8小時以15分鐘大量靜脈內輸注形式投予直至產生耐受性。於某些實施態樣中，該TIL群係在進行高劑量IL-2攝生法之前投予且隨後進行非清髓性淋巴細胞清除攝生法。
於某些實施態樣中，該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-13細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-13細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。於某些實施態樣中，該髓樣aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
於一實施態樣中，該TIL群係用於治療選自由下列所組成之群組的癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌、腎癌和腎細胞癌。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群； (b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中在該第二細胞培養基中IL-2的初始存在濃度為約3000IU/mL且OKT-3抗體之初始存在濃度為約30ng/mL。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第三TIL群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；及(b)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；其中在該第二細胞培養基中IL-2的初始存 在濃度為約3000IU/mL且OKT-3抗體之初始存在濃度為約30ng/mL。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中該快速擴增進行之期間不超過14天。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第三TIL群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第 一細胞培養基包含IL-2；及(b)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(髓樣aAPC)群快速擴增第二TIL群以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；其中該快速擴增進行之期間不超過14天。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中該初次擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步 驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；及(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中該快速擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第三TIL群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；及(b)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增 開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；其中該初始擴增及/或快速擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中在該快速擴增中，該第二TIL群對該aAPC群之比例係介於1：80至1：400之間。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群； (b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中在該快速擴增中，該第二TIL群對該aAPC群之比例為約1：300。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL群為第三TIL群且可藉由包含下列步驟之方法取得：(a)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第一TIL群係/已從患者切除的腫瘤取得，且其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(b)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且 其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3，且其中在該快速擴增中，該第二TIL群對該aAPC群之比例係介於1：80至1：400之間。
於一實施態樣中，在該快速擴增中，該第二TIL群對該aAPC群之比例為約1：300。
於一實施態樣中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌、腎癌和腎細胞癌。
於一實施態樣中，本發明提供用於特異性誘 導表現已知之共刺激分子的腫瘤浸潤性淋巴細胞增殖之套組，該套組包含有效量之aAPC，其中該aAPC包含使用慢病毒載體(LV)轉導之MOLM-14細胞或EM-3細胞，其中該LV包含編碼至少一種共刺激配體之核酸，該共刺激配體特異性結合該已知之共刺激分子，其中該已知之共刺激分子與該共刺激配體結合會刺激並擴增該T細胞，該套組進一步包含施用器和使用該套組之說明資料。
於一實施態樣中，本發明提供用於評估腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)提供多個表現內源性CD16 Fc受體之小鼠肥大細胞瘤P815細胞，其中該P815細胞係經基於增強型綠色螢光蛋白(GFP)和螢火蟲螢光素酶的慢病毒載體轉導；(b)將該多個P815細胞和TIL在有和無OKT-3之存在下共同培養以分別評估T細胞受體(TCR)激活作用(特異性滅殺)或經淋巴因子激活之滅殺作用(LAK，非特異性滅殺)；(c)培育4小時；(d)添加螢光素並培育5分鐘；(e)使用光度計讀取生物發光強度；和(f)計算細胞毒性和存活百分比率。
在結合閱讀附圖時將更容易理解前文之概述及下文中本發明之詳細描述。
第1圖說明使用經放射照射之同種異體PBMC餵養細胞快速擴增TIL之結果。將各TIL株(M1015T和M1016T)(1.3×105個細胞)與46種不同的經放射照射之餵養細胞(1.3×107個細胞)、IL-2(3000IU/mL)和OKT-3(30ng/mL)在T25培養瓶中共同培養7天。第7天計算TIL之擴增倍數值。該圖形顯示2種TIL株在以46種不同之餵養細胞之測試批次進行的個別刺激實驗中三擴增倍數並突顯使用PBMC餵養細胞之擴增結果的變異性。
第2圖說明該pLV430G人4-1BBL載體之載體圖。
第3圖說明該pLV430G人4-1BBL載體之4-1BBL PCRP(聚合酶鏈反應產物)部分的圖形。
第4圖說明該pLV430G人CD86載體之載體圖。
第5圖說明該pLV430G人CD86載體之CD86PCRP部分的圖形。
第6圖說明該pDONR221人CD86供體載體之載體圖。
第7圖說明該pDONR221人4-1BBL供體載體之載體圖。
第8圖說明該pLV430G空載體之載體圖。
第9圖說明該pDONR221空載體之載體圖。
第10圖說明該用於產生慢病毒之psPAX2輔助質粒之載體圖。
第11圖說明該用於產生慢病毒之pCIGO-VSV.G輔助質粒之載體圖。
第12圖說明在慢病毒轉染前(“未經轉染的”)和轉染後(“經轉染的”)在MOLM-14細胞上進行之流式細胞術實驗的結果，確認CD137和CD86在工程化MOLM-14細胞上之表現。
第13圖說明使用經放射照射之親本未經修飾之MOLM-14細胞(“親本MOLM-14”)、工程化MOLM-14細胞(CD86/4-1BBL，“工程化MOLM-14”)或用於TIL批次M1032-T2之PBMC餵養細胞(“餵養細胞”)快速擴增TIL之結果。將TIL與PBMC餵養細胞或親本或工程化MOLM-14細胞以1：100之比例，在OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)之存在下共同培養。在第6和11天計算細胞數並將細胞分裂培養。每一個點分別代表在第0、6、11和14天測定之細胞數。使用對數尺度。
第14圖說明如第13圖所示之結果，使用線性尺度描述。
第15圖說明TIL批次M1033-T6之結果，其他參數如第13圖中所示，使用對數尺度。
第16圖說明如第14圖所示之結果，使用線性尺度描述。
第17圖說明使用表現CD86和4-1BBL之工程 化MOLM-14細胞(“TIL+工程化MOLM-14(CD86/41BB)+OKT3”)或經放射照射之PBMC餵養細胞(“TIL+餵養細胞+OKT3”)快速擴增TIL之結果。將TIL與PBMC餵養細胞或工程化MOLM-14細胞以1：100之比例加上OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共同培養。在第6天和11天計算細胞數並將細胞分裂培養。每一個點分別代表在第14天測定之細胞數。
第18圖說明其中將TIL(2×104)與親本MOLM-14(“MOLM14”)細胞、經轉導以表現CD86和4-1BBL之MOLM-14細胞(“aMOLM14”)或PBMC餵養細胞(“PBMC+”)以不同比例(1：10、1：30和1：100，分別以“10”、“30”和“100”表示)在24孔G-Rex盤之各具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)的孔中共同培養之實驗結果。對照組僅使用OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)(“PBMC-”)。每一種條件係以一式三份培養。在第4和7天以新鮮培養基和IL-2餵養培養物。第7天計算存活之細胞數。此處呈現之長條圖顯示出在第11天計算之存活細胞數的平均值加標準差(SD)。藉由學生“t”檢驗計算p值。
第19圖說明將TIL與不同比例(1：30、1：100和1：300，分別以“30”、“100”和“300”表示)之PBMC餵養細胞(“PBMC”)、親本MOLM-14細胞(“MOLM14”)或經轉導以表現CD86和4-1BBL之MOLM-14細胞(“aMOLM14”)在各具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)之單一24孔G-Rex盤中共同培養的實驗結果。在第11天計算存活之細胞數並 繪圖。其他條件如第18圖中所示。
第20圖說明將TIL與不同比例(1：50、1：100和1：200，分別以“50”、“100”和“200”表示)之PBMC餵養細胞(“PBMC”)、親本MOLM-14細胞(“MOLM14”)或經轉導以表現CD86和4-1BBL之MOLM-14細胞(“aMOLM14”)在各具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)之單一24孔G-Rex盤中共同培養的實驗結果。在第14天計算細胞數。其他條件如第18圖中所示。
第21圖說明將TIL與不同比例(1：100、1：200、1：400和1：800，分別以“100”、“200”、“400”和“800”表示)之PBMC餵養細胞(“PBMC”)、親本MOLM-14細胞(“MOLM14”)或經轉導以表現CD86和4-1BBL之MOLM-14細胞(“aMOLM14”)在各具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)之單一24孔G-Rex盤中共同培養的實驗結果。在第14天計算細胞數。其他條件如第18圖中所示。
第22圖說明旭日圖可視化，其顯示以PBMC餵養細胞擴增之活T細胞受體(TCR)α/β、CD4、CD8、CD27、CD28和CD57 TIL的精細分佈。
第23圖說明旭日圖可視化，其顯示以aMOLM14 aAPC擴增之活TCR α/β、CD4、CD8、CD27、CD28和CD57 TIL的精細分佈。
第24圖描述流式細胞術等高線圖，其顯示在活，TCR α/β+、CD4+或CD8+ TIL上門控之記憶亞群(CD45RA+/-、CCR7+/-)。
第25圖使用SPADE樹說明在CD3+細胞上門控之T細胞亞群，REP後CD4+和CD8+ TIL(以aMOLM14 aAPC擴增)之表型特徵。該顏色梯度與LAG-3、TIM3、PD1和CD137之平均螢光強度(MFI)成比例。
第26圖使用SPADE樹說明在CD3+細胞上門控之T細胞亞群，REP後CD4+和CD8+ TIL(以aMOLM14 aAPC擴增)之表型特徵。該顏色梯度與MFI CD69、CD154、KLRG1和TIGIT成比例。
第27圖說明在粒線體壓力試驗期間測量之以餵養細胞或aMOLM14擴增後的TIL之耗氧率(OCR)。每個數據點代表以一式三份測量之平均值±平均值之標準差(SEM)。
第28圖說明在粒線體壓力試驗期間測量之以餵養細胞或aMOLM14擴增後的TIL之細胞外酸化率(ECAR)。每個數據點代表以一式三份測量之平均值±平均值之標準差(SEM)。
第29圖說明目的載體pLV4301G之載體圖。
第30圖說明供體載體1，pMK 7c12抗mFC scFv CoOP ECORV SacII L1R5之載體圖。
第31圖說明供體載體2，pMK hCD8a支架TN L5 L2之載體圖。
第32圖說明用於產生慢病毒之最終載體，pLV4301G 7C12的scFv mIgG hCD8 flag之載體圖。
第33圖說明目的載體pLV4301G之載體圖。
第34圖說明供體載體1，pMK 8B3抗mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5之載體圖。
第35圖說明供體載體2，pMK hCD8a支架TN L5 L2之載體圖。
第36圖說明用於生產慢病毒，pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 flag之載體圖。
第37圖說明在慢病毒轉染前(“未經轉染的”)和轉染後(“經轉染的”)在EM-3細胞上之流式細胞術實驗的結果，確認CD137和CD86在工程化EM-3細胞上之表現。
第38圖說明其中將TIL與比例為1：100之aEM3(7C12或8B3)，加上OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共同培養之實驗結果。在第11及14天計算細胞數。
第39圖說明其中將TIL與比例為1：100之aEM3(7C12或8B3)，加上OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共同培養的實驗結果。在第11及14天計算細胞數。
第40圖說明其中將TIL與比例為1：100之aEM3或PBMC餵養細胞，加上IL-2(3000IU/mL)，在有或無OKT-3(30ng/mL)之存在下共同培養的實驗結果。玻條形圖顯示在第11天測定之細胞數。
第41圖說明以EM-3 aAPC，在不同之TIL：aAPC比例下擴增TIL之結果。
第42圖說明以EM-3 aAPC擴增TIL之結果。將TIL(2×104)與5種不同之PBMC餵養細胞批次或aEM3(一式三份)以1：100之比例，並加上IL-2(3000IU/mL)在G- Rex 24孔盤中共同培養。在第14天計算活細胞數。圖形顯示在第14天計算之活細胞數(平均值)，置信區間95%。
第43圖說明以EM-3 aAPC和MOLM-14 aAPC擴增TIL之結果。將TIL(2×104)與5種不同之PBMC餵養細胞批次或aMOLM-14(一式三份)或aEM3(亦為一式三份)加IL-2(3000IU/mL)以1：100之比例，並加上IL-2(3000IU/mL)在G-Rex 24孔盤中共同培養。圖形顯示在第14天計算之活細胞數(平均值)，置信區間95%。
第44圖說明旭日圖可視化，其顯示以aEM3 aAPC或PBMC餵養細胞(TIL批次M1054)擴增之活TCR α/β、CD4+和CD8+ TIL的精細分佈。
第45圖說明旭日圖可視化，其顯示以aEM3 aAPC或PBMC餵養細胞(TIL批次M1055)擴增之活TCR α/β、CD4+和CD8+ TIL的精細分佈。
第46圖說明使用CD3+細胞，以aEM3 aAPC或PBMC餵養細胞擴增之TIL的CD4+和CD8+SPADE樹。該顏色梯度與LAG-3、TIM-3、PD-1和CD137之MFI成比例。
第47圖說明使用CD3+細胞，以aEM3 aAPC或PBMC餵養細胞擴增之TIL之CD4+和CD8+SPADE樹。該顏色梯度與CD69、CD154、KLRG1和TIGIT之MFI成比例。
第48圖說明藉由Seahorse XF Mito壓力試驗測量之備用耗氧能力的概要。
第49圖說明藉由Seahorse XF Mito壓力試驗測量之糖酵解保留率的概要。
第50圖說明使用MitoTracker染料將針對PBMC或aEM3擴增之活TIL的粒線體染色，該MitoTracker染料將活細胞中之粒線體染色且其積累係取決於膜電位。以L/D Aqua將針對PBMC或aEM3擴增之TIL染色之後，再以MitoTracker紅色染料染色。顯示之數據為在存活群體上被門控之MitoTracker陽性(MFI)細胞。
第51圖說明與該以PBMC餵養細胞擴增之TIL和使用aMOLM14 aAPC擴增之TIL相比較，P815 BRLA之細胞毒性效力和功能活性的結果。
第52圖說明與該以PBMC餵養細胞擴增之TIL和使用aEM3 aAPC擴增之TIL相比較，P815 BRLA之細胞毒性效力和功能活性的結果。
第53圖說明與未經刺激(“US”)之TIL相比較下以經塗覆抗CD3/CD28/4-1BB之微珠刺激一整夜(“S”)後二批TIL釋出之IFN-γ，比較以PBMC餵養細胞擴增之TIL和使用aMOLM14 aAPC擴增之TIL。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，ns=不顯著。
第54圖說明與未經刺激(“US”)之TIL相比較下以經塗覆抗CD3/CD28/4-1BB之微珠刺激一整夜(“S”)後三批TIL釋出之IFN-γ，比較以PBMC餵養細胞擴增之TIL和使用aEM3 aAPC擴增之TIL。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，ns=不顯著。
第55圖說明與未經刺激(“US”)之TIL相比較下以經塗覆抗CD3/CD28/4-1BB之微珠刺激一整夜(“S”)後 二批TIL釋出之粒酶B，比較以PBMC餵養細胞擴增之TIL和使用aMOLM14 aAPC擴增之TIL。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，ns=不顯著。
第56圖說明與未經刺激(“US”)之TIL相比較下以經塗覆抗CD3/CD28/4-1BB之微珠刺激一整夜(“S”)後三批TIL釋出之粒酶B，比較以PBMC餵養細胞擴增之TIL和使用aEM3 aAPC擴增之TIL。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，ns=不顯著。
第57圖說TIL擴增和治療過程。本發明之aAPC可用於REP前階段(圖形之上半部)或REP階段(圖形之下半部)且當在各細胞培養物中添加IL-2時，可添加本發明之aAPC。步驟1係指在10個G-Rex 10培養瓶中加入4個腫瘤片段。在步驟2中，取得約40×106個TIL或更多。在步驟3中，將細胞分裂培養在36個G-Rex 100培養瓶中以進行REP。在步驟4中，藉由離心收獲TIL。在約43天之總處理時間後，在步驟5中取得新鮮之TIL產物，TIL可在該時點被輸注入患者體內。
第58圖說明用於以aAPC擴增之TIL的治療方案。在開始時進行手術(及腫瘤切除術)，而淋巴細胞清除化療法係指如本文他處描述之以化療進行的非清髓性淋巴細胞清除。
第59圖說明生物發光重定向之細胞溶解分析(BRLA)結果，其顯示當TIL批次M1033T-1以個別之效應子：靶的比與P815選殖株G6共同培養(具有和不具有抗 CD3)時之細胞毒性百分比。
第60圖說明酶聯免疫吸附分析(ELISA)數據，其顯示針對不同之效應子對靶細胞比所釋出之IFN-γ量。
第61圖說明在抗CD3之存在下，將TIL批次M1033T-1與P815選殖株G6以1：1之效應子對靶細胞比共同培養4小時和24小時，由TIL批次M1033T-1所表現之LAMP1(%)。
第62圖說明用於TIL批次M1030之BRLA結果。藉由BRLA測得之細胞毒性(測量值以LU50/1×106 TIL表示)為26±16。
第63圖說明TIL批次M1030之標準鉻釋出分析。藉由鉻釋出分析所測得之細胞毒性(測量值以LU50/1×106 TIL表示)為22。
第64圖說明TIL批次M1053之BRLA結果，其顯示藉由BRLA測量之TIL的細胞溶解單位為70±17。
第65圖說明TIL批次M1053之標準鉻釋出分析結果，亦顯示藉由鉻分析測量之TIL的細胞溶解單位為14±5。將此結果與第64圖比較顯示出BRLA和鉻釋出分析之性能彼此相當。
第66圖說明TIL之IFN-γ釋出和細胞毒性潛力之間的線性關係。
第67圖說明IFN-γ之ELISpot結果。
第68圖說明TIL批次M1053酶促釋出IFN-γ。
第69圖說明TIL批次M1030酶促釋出IFN-γ。
第70圖說明ELISpot數據，其顯示由M1053T和M1030T釋出之粒酶B。該數據確認藉由BRLA證明之TIL的效力。
第71圖說明TIL批次M1053酶促釋出粒酶B。
第72圖說明TIL批次M1030酶促釋出粒酶B。
第73圖說明ELISpot數據，其顯示M1053T和M1030T所釋出之TNF-α。該數據確認由BRLA證明之TIL的效力。
第74圖說明TIL批次M1053酶促釋出TNF-α。
第75圖說明TIL批次M1030酶促釋出TNF-α。
第76圖說明當使aEM3細胞之細胞群脫離FBS進入hAB血清培養基時，該等細胞群(C712(A)和8B5(B))中之變化。
第77圖說明將aEM3細胞群懸浮於各種冷凍培養基中時細胞群在凍融恢復週期間之變化。
第78圖說明在八天之時間過程中，aEM3細胞在透氣細胞培養瓶中之生長。
第79圖說明用於測定aEM3細胞之純度之流式面板分析。
第80圖說明用於測定aEM3細胞之純度的流式面板分析的結果。
第81圖說明藉由OKT3刺激之aEM3餵養細胞和PBMC餵養細胞之細胞因子表現之間的差異。
第82圖說明與CM1相比較，以無血清培養基(即，CTS Optmizer)可有利地擴增TIL(REP前)以提供增加之細胞數。
第83和84圖說明與CM1相比較，以無血清培養基(即，CTS Optmizer)可有利地擴增TIL(REP前)以在第11天(REP前)(第83圖)和第22天(REP前和REP後)(第84圖)提供增加之細胞數。
第85圖說明aAPC細胞(即，aEM3細胞)可生長並使用無血清培養基。具體地說，CTS Optmizer和Prime-TCDM被發現與cDMEM(10% hSerum)相比較，可有效地生長aEM3。顯示之數據為五個獨立實驗之平均值±SD。p值係藉由學生t檢驗計算。* P<0.05。
第86和87圖說明二個實驗之結果，其證明在冷凍保存後第3天來自TIL-R3細胞株之aEM3細胞快速恢復。第86圖說明實驗1之總細胞計數而第87圖說明實驗2之總細胞計數。
第88圖說明來自TIL-R3細胞株之aEM3細胞在冷凍保存後的生長情況，其中該細胞經平皿接種並生長9天。解凍後每三天測量細胞計數。
第89圖說明來自TIL-R3細胞株之aEM3細胞在冷凍保存後的生長情況，其中該細胞經平皿接種在GREX 10培養瓶中並生長8天。解凍後每四天測量細胞計數。
第90圖說明pLenti-C-Myc-DDK人OX40L載體 之載體圖。
第91圖說明在以aEM3細胞株和PBMC餵養細胞進行之REP中擴增之TIL的流式細胞術分析結果，其顯示與aEM3培養之TIL促進CD8+ TIL偏態。
第92圖說明從實驗取得之活細胞的數目，該實驗中，TIL係在REP中以aEM3細胞株和PBMC餵養細胞擴增。
第93圖說明從實驗取得之CD3+細胞之數目，該實驗中，TIL係在REP中以aEM3細胞株和PBMC餵養細胞擴增。
第94圖說明從實驗取得之CD3-細胞之數目，該實驗中，TIL係在REP中以aEM3細胞株和PBMC餵養細胞擴增。
第95圖說明使用qPCR法分析端粒長度之結果。
第96圖說明本發明之aAPC之實施態樣的示意圖。
第97圖說明本發明之aAPC之實施態樣的示意圖。
第98圖說明本發明之aAPC之實施態樣的示意圖。
序列表之簡要說明
SEQ ID NO：1為莫羅單抗(muromonab)之重鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO：2為莫羅單抗之輕鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO：3為重組人IL-2之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4為阿地介白素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5為重組人IL-7之胺基酸序列。
SEQ ID NO：6為重組人IL-15之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7為重組IL-21之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8為人CD86之胺基酸序列。
SEQ ID NO：9為人4-1BBL(CD137L)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：10為人OX40L(CD134L)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：11為人CD28之胺基酸序列。
SEQ ID NO：12為人CTLA-4之胺基酸序列。
SEQ ID NO：13為人4-1BB(CD137)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：14為人OX40(CD134)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：15為pLV430G 4-1BBL空載體之核苷酸序列。
SEQ ID NO：16為人pLV430G 4-1BBL載體之4-1BBL CoOP部分之核苷酸序列。
SEQ ID NO：17為4-1BBL PCRP之核苷酸序列。
SEQ ID NO：18為pLV430G hCD86空載體之核苷酸序列。
SEQ ID NO：19為pLV430G人hCD86載體之hCD86 CoOP部分之核苷酸序列。
SEQ ID NO：20為pLV430G人hCD86載體之hCD86 CoOP B1 B2 PCRP部分之核苷酸序列。
SEQ ID NO：21為pDONR221 hCD86載體之核苷酸序列。
SEQ ID NO：22為pDONR221 4-1BBL載體之核苷酸序列。
SEQ ID NO：23為pLV430G載體之核苷酸序列。
SEQ ID NO：24為pDONR221載體之核苷酸序列。
SEQ ID NO：25為用於生產慢病毒之psPAX2輔助質粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26為用於生產慢病毒之pCIGO-VSV.G輔助質粒之核苷酸序列。
SEQ ID NO：27為mFc-7C12 scFv選殖株之胺基酸序列。
SEQ ID NO：28為mFc-8B3 scFv選殖株之胺基酸序列。
SEQ ID NO：29為mFc-7C12 scFv之核苷酸序列。
SEQ ID NO：30為mFc-8B3 scFv之核苷酸序列。
SEQ ID NO：31為目的載體pLV4301G之核苷酸序列。
SEQ ID NO：32為供體載體1，pMK 7c12抗mFc scFv CoOp ECORV SacII L1R5之核苷酸序列。
SEQ ID NO：33為供體載體2，pMK hCD8a支架TN L5 L2之核苷酸序列。
SEQ ID NO：34為用於生產慢病毒之最終載體，pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 flag之核苷酸序列。
SEQ ID NO：35為目的載體，pLV4301G之核苷酸序列。
SEQ ID NO：36為供體載體1，pMK 8B3抗mFc scFv CoOp ECORV SacII L1R5之核苷酸序列。
SEQ ID NO：37為供體載體2，pMK hCD8a支架TN L5 L2之核苷酸序列。
SEQ ID NO：38為用於生產慢病毒之最終載體，pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8flag之核苷酸序列。
SEQ ID NO：39為用於生產慢病毒之pLenti- C-Myc-DDK OX40L載體之核苷酸序列。
SEQ ID NO：40為用於定量性聚合酶鏈反應測量端粒長度之Tel-1b引物之核苷酸序列。
SEQ ID NO：41為用於定量性聚合酶鏈反應測量端粒長度之Tel-2b引物之核苷酸序列。
SEQ ID NO：42為用於定量性聚合酶鏈反應測量端粒長度之Tel-1b引物之核苷酸序列。
SEQ ID NO：43為用於定量性聚合酶鏈反應測量端粒長度之Tel-1b引物之核苷酸序列。
發明之詳細描述
除非另有定義，本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明所屬技藝之技術熟習人士所通常理解者相同的含義。本文所提及之所有專利案和出版物全文以引用方式併入本文。
定義
本文所使用之術語“共同投予(co-administration、co-administering)”、“組合投予(administered in combination with、administering in combination with)”、“同時”和“並行”包含投予人個體二或更多種活性製藥成分，從而使二種活性製藥成分及/或彼等之代謝物同時存在於人個體中。共同投予包括在個別之組成物中同時投予、在個別之組成物中在不同時間投予、在其中存有 二或更多種活性製藥成分之組成物中投予。在個別之組成物中同時投予及在其中存有二種藥劑之組成物中投予亦包含在本發明之方法中。
術語“活體內”係指事件發生在個體之體內。
術語“玻管內”係指事件發生在個體身體外。玻管內分析包含其中使用活細胞或死細胞，且亦可包含其中未使用完整細胞之無細胞分析。
術語“活體外”係指涉及在已從個體身體移出之細胞、組織及/或器官上治療或實施程序的事件。適當地，該細胞、組織及/或器官可在手術或治療方法中返回個體體內。
術語“抗原”係指誘導免疫反應之物質。於一些實施態樣中，抗原為能與抗體或T細胞受體(TCR)(若由主要組織相容性複合體(MHC)分子呈現)結合之分子。本文所使用之術語“抗原”亦包含T細胞抗原決定部位。抗原還能被免疫系統識別。於一些實施態樣中，抗原能誘導體液免疫反應或導致B淋巴細胞及/或T淋巴細胞激活之細胞免疫反應。在某些情況下，這可能需要抗原含有或連接Th細胞抗原決定部位。抗原亦可具有一或多個抗原決定部位(例如B-和T-抗原決定部位)。於一些實施態樣中，較佳地，抗原與其對應抗體或TCR反應(通常以高度特異性和選擇性方式反應)，而不與多種其他抗體或可能被其他抗原誘導之TCR反應。
術語“有效量”或“治療有效量”係指本文所描 述之化合物或化合物之組合足以實現預期之應用(包括，但不限於疾病治療)的量。治療有效量可根據預期之應用(玻管內或體內)，或接受治療之人個體和疾病狀況(例如個體之體重、年齡和性別)、該疾病狀況之嚴重程度、投予方式，等(可由本技藝之一般技術人輕易地測定)變化。該術語亦適用於將在靶細胞中誘導特定反應(例如減少血小板黏附及/或細胞移行)之劑量。該特定劑量將根據所選擇之特定化合物、欲遵循之給藥方案、該化合物是否與其他化合物一起投予、投予時點、欲投予該化合物劑量之組織及其中攜帶該化合物之物理輸送系統而變化。
如本文所使用之術語“治療效果”包含在人個體中之治療益處及/或預防益處。預防效果包括延遲或排除疾病或病症之出現、延遲或排除疾病或病症之症狀發作、減緩、停止或逆轉疾病或病症之進展、或彼等之任何組合。
“醫藥上可接受之載體”或“醫藥上可接受之賦形劑”意圖包括任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑及惰性成分。該等醫藥上可接受之載體或醫藥上可接受之賦形劑於活性製藥成分之用途為本技藝所周知。除了與該活性製藥成分不相容者外，任何傳統之醫藥上可接受之載體或醫藥上可接受之賦形劑均可考慮用於本發明之治療組成物中。其他活性製藥物成分(諸如其他藥物)亦可被納入所描述之組成物和方法中。
術語“快速擴增”係指抗原特異性TIL之數目在一週之期間內增加至少約3倍(或4-、5-、6-、7-、8-、或9-倍)，更佳地，在一週之期間內增加至少約10倍(或20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、或90倍)，或最佳地，在一週之期間內增加至少約100倍。本文中描述許多快速擴增之方案。
本文中“腫瘤浸潤性淋巴細胞”或“TIL”意指最初以已離開個體之血流並遷移入腫瘤的白血球形式取得之細胞群。TIL包括，但不限於CD8+細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1和Th17細胞CD4+T細胞、天然殺手細胞、樹突狀細胞和M1巨噬細胞。TIL包括初代和次代TIL。“初代TIL”係指那些依本文之概述從患者組織樣品取得者(本文中有時稱為“新鮮收穫的”或“第一TIL群”)，而“次代TIL”為已依本文中之討論擴增或增殖的任何TIL細胞群，包括，但不限於塊狀TIL和擴增之TIL(依適當情況為“REP TIL”、或“後REP-TIL”、或“第二TIL群”、或“第三TIL群”)。
一般而言，TIL可使用細胞表面標記物以生物化學方式定義，或藉由其浸潤腫瘤和使治療生效之能力從功能上定義。一般而言，TIL可藉由表現下列生物標記物之一或多者來分類：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外，另外，TIL可藉由其被重新引入患者時浸潤實體瘤之能力從功能上定義。
本文中，“經冷凍保存之TIL”係指被處理並 儲存在約-150℃至-60℃之範圍內的TIL。用於冷凍保存之一般方法亦描述於本文他處，包括描述於實施例中。為了清楚起見，“經冷凍保存之TIL”可與可作為初代TIL之來源的經冷凍保存之組織樣品區分。
本文中“經解凍冷凍保存之TIL”意指先前被冷凍保存，然後再經處理以回復至室溫或更高之溫度(包括，但不限於細胞培養溫度或其中可將TIL投予患者之溫度)的TIL群。
本文中“細胞群”(包括TIL)意指共享共同特徵的許多細胞。
術語“中央記憶T細胞”係指一種T細胞亞群，其在人體中為CD45R0+且組成性表現CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)。中央記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。用於中央記憶T細胞之轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中央記憶T細胞主要分泌IL-2和CD40L作為TCR觸發後之效應分子。中央記憶T細胞在血液中之CD4區室中占絕大多數，且在人體中按比例富集在淋巴結和扁桃腺中。
術語“效應記憶T細胞”係指一種人或哺乳動物T細胞亞群(像中央記憶T細胞)，其為CD45R0+，但已損失組成性表現CCR7(CCR7lo)且為異質性或為低CD62L表現(CD62Llo)。中央記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包括BLIMP1。在抗原刺激後，效應記憶T細胞迅速分泌 大量炎性細胞因子，包括干擾素γ、IL-4和IL-5。效應記憶T細胞在血液中之CD8區室中占絕大多數，且在人體中按比例富集在肺、肝和腸。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量穿孔素。
在二或更多個核酸或多肽之背景下，術語“序列同一性”、“同一性百分比”和“序列同一性百分比”係指當將二或更多個序列或子序列進行比較且最大對應地對齊(若必要時，引入缺口)時，在不考慮將任何保守性胺基酸取代當作序列同一性之一部分的情況下，該二或更多個序列或子序列彼此相同或具有具體指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基。同一性百分比可使用序列比較軟體或算法或藉由目視觀察來測量。可使用本技藝中已知之各種算法和軟體來比對胺基酸或核苷酸序列。用於測定序列同一性百分比之合適程式包括，例如可從美國政府之國家生物技術信息中心BLAST網站取得之BLAST程序組。二個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP算法進行。BLASTN係用於比較核酸序列，而BLASTP係用於比較胺基酸序列。可從DNASTAR取得之ALIGN、ALIGN-2(Genentech公司，加州南舊金山)或MegAlign為其他可用來比對序列之可公開取得的軟體程式。本技藝之技術熟習人士可藉由特定之比對軟體決定用於最大比對之合適參數。於某些實施例中係使用該比對軟體之預設參數。
術語“保守性胺基酸取代”係指不會廢止抗體與抗原結合或蛋白質與其配體結合之胺基酸序列修飾。保 守性胺基酸取代包括藉由一種類別之胺基酸取代同一類別之胺基酸，其中胺基酸之類別係藉由共通之胺基酸側鏈物化性質和在自然界中發現之同源蛋白中的高取代頻率(例如藉由標準Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣測定者)定義。已分類六種一般類別之胺基酸側鏈且包括：第I類(Cys)；第II類(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；第III類(Asn、Asp、Gln、Glu)；第IV類(His、Arg、Lys)；第V類(Ile、Leu、Val、Met)；和第VI類(Phe、Tyr、Trp)。例如，以Asp取代另一第III類殘基，諸如Asn、Gln或Glu為保守性取代。因此，在4-1BBL或CD86蛋白中之預測的非必需胺基酸殘基較佳為被來自相同類別之另一種胺基酸殘基取代。用於鑑定不會排除抗原或配體結合之胺基酸保守性取代的方法為本技藝所周知(參見，例如Brummell,et al.,Biochemistry 1993,32,1180-1187；Kobayashi,et al.,Protein Eng.1999,12,879-884(1999)；及Burks,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94,412-417)。
術語“逆轉錄病毒”係指在其複製週期中利用逆轉錄酶之RNA病毒，其中逆轉錄病毒基因組RNA係藉由逆轉錄酶轉化成雙股DNA。該雙股DNA形式被整合入該被感染之細胞(“原病毒”)的染色體中。該原病毒係作為RNA聚合酶II之模板並指導該編碼產生新病毒顆粒所需之結構蛋白及酶之RNA分子表現。在原病毒的每一端為稱為“長終端重複序列”或“LTR”之結構。該LTR包含許多調節信號，包括病毒基因組複製和整合所需之轉錄控制元件、多 腺苷酸化信號和序列。包含在逆轉錄病毒科內的幾個屬包括西斯泰納病毒A(Cisternavirus A)、腫瘤病毒A(Oncovirus A)、腫瘤病毒B(Oncovirus B)、腫瘤病毒C(Oncovirus C)、腫瘤病毒D(Oncovirus D)、慢病毒(Lentivirus)、γ逆轉錄病毒(Gammaretrovirus)和泡沫病毒(Spumavirus)。一些逆轉錄病毒為致癌性(即，致腫瘤的)，而其他則不是。該腫瘤病毒在易感物種中誘導肉瘤、白血病、淋巴瘤和乳腺癌。逆轉錄病毒感染多種物種並可同時以水平方向和垂直方向傳遞。因為它們被整合入宿主之DNA中，它們能夠將宿主之DNA序列從細胞傳遞到細胞。示例性γ逆轉錄病毒載體包括那些源自兼嗜性(amphotropic)Moloney鼠白血病病毒(MLV-A)者，其使用細胞表面磷酸轉運子受體以進入然後永久地整合入增殖細胞染色體中。該兼嗜性MLV載體系統已被完善建立且為受歡迎之用於遞送基因之工具(參見，例如Gordon and Anderson,Curr.Op.Biotechnol.,1994, 5,611-616及Miller,et al.,Meth.Enzymol.,1993, 217,581-599，其揭示內容以引用方式併入本文)。
術語“慢病毒”係指一種病毒屬，包括HIV(人類免疫缺陷病毒；包括HIV第1型和HIV第2型)、維斯那-梅迪(visna maedi)病毒(其在綿羊中導致腦炎(維斯那)或肺炎(梅迪))、山羊關節-腦炎病毒(其在山羊中導致免疫缺陷、關節炎和腦病變)；馬傳染性貧血病毒(其在馬中導致自體免疫性溶血性貧血和腦病變)；貓免疫缺陷病毒(FIV)(其 在貓中導致免疫缺陷)；牛免疫缺陷病毒(BIV)(其在牛中導致淋巴結病變、淋巴細胞增多及可能之中樞神經系統感染)；和猴免疫缺陷病毒(SIV)(其在近似人類之靈長類動物中導致免疫缺陷和腦病變)。由這些病毒引起之疾病特徵為潛伏期很長且病程延長。一般情況下，病毒潛伏感染單核細胞和巨噬細胞，它們再從單核細胞和巨噬細胞散佈到其他細胞。HIV、FIV和SIV亦可輕易感染T淋巴細胞(即，T細胞)。
術語“抗CD3抗體”係指抗體或其變體，例如單株抗體且包括針對在成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體之人、人化、嵌合型或鼠抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗(muromonab)。抗CD3抗體亦包括UHCT1選殖株，亦稱T3和CD3ε。其他抗CD3抗體包括，例如奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)和維西珠單抗(visilizumab)。
術語“OKT-3”(在此亦稱為“OKT3”)係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體之單株抗體或其變體，包括人、人化、嵌合型或鼠抗體且包括市售形式，諸如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3純質，Miltenyi生物技術有限公司，德國Bergisch Gladbach)和莫羅單抗或彼等之變體、保守性胺基酸取代物、糖型或生物模擬藥物。莫羅單抗之重鏈和輕鏈的胺基酸序列列於表1中(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。能夠產生OKT-3之雜交瘤存放於美國典型培養物存放中心且指派之ATCC登錄編號為 CRL 8001。能夠產生OKT-3之雜交瘤亦存放在歐洲認證之細胞培養物收集處(ECACC)且分派之目錄編號為86022706。
Figure 106137461-A0202-12-0065-258
術語“IL-2”(本文中亦稱為“IL2”)係指稱為介白素-2之T細胞生長因子，且包括所有形式之IL-2，包括人類和哺乳動物形式、彼等之保守性胺基酸取代物、糖型、生物模擬藥和變體。IL-2描述於，例如Nelson,J.Immunol. 2004, 172,3983-88 and Malek,Annu.Rev.Immunol. 2008, 26,453-79(其揭示內容以引用方併入本文)中。適合用於本發明之重組人IL-2的胺基酸序列列於表2中(SEQ ID NO：3)。例如，術語IL-2包含IL-2之人，重組形式，諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可從多個供應商購得，每一單次使用小瓶中包含22000000IU)及由CellGenix公司(美國新罕布夏州樸玆茅斯)(CELLGRO GMP)、或ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(美國紐澤西州East Brunswick)(目錄編號CYT-209-b)銷售之重組形式之IL-2，和來自其他供應商之其他同等商品。阿地介白素(des-丙胺醯基-1，絲胺酸-125人IL-2)為非糖基化之人類重組形 式之IL-2，其分子量為約15kDa。適合用於本發明中之阿地介白素的胺基酸序列列於表2(SEQ ID NO：4)中。術語IL-2亦包含如本文所描述IL-2之聚乙二醇化形式，包括聚乙二醇化之IL2前藥NKTR-214(其可從美國加州南舊金山Nektar治療公司取得)。適合用於本發明中之NKTR-214和聚乙二醇化之IL-2描述於美國專利申請案US 2014/0328791 A1和國際專利申請刊物WO 2012/065086 A1號中(其揭示內容在此以引用方式併入本文)。適合用於本發明中之軛合的IL-2之可替代形式描述於美國專利案第4,766,106、5,206,344、5,089,261和4902,502號中，其揭示內容以引用方式併入本文。適合用於本發明中之IL-2的配製劑描述於美國專利案第6,706,289號(其揭示內容以引用方式併入本文)中。
術語“IL-7”(本文中亦稱為“IL7”)係指稱為介白素-7之糖基化的組織來源之細胞因子，其可從基質和上皮細胞，及樹突細胞取得。Fry and Mackall,Blood 2002, 99,3892-904。IL-7可刺激T細胞發展。IL-7與IL-7受體結合，IL-7受體係由IL-7受體α和共通γ鏈受體所組成之異二聚體，其在一系列對胸腺內之T細胞發育及在周邊血液內存活重要之信號內。適合用於本發明中之重組人IL-7可從多個供應商購得，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(美國紐澤西州East Brunswick)(目錄編號CYT-254)和ThermoFisher Scientific公司(美國麻州Waltham)(人IL-7重組蛋白，目錄編號Gibco PHC0071)。適合用於本發明中之 重組人IL-7的胺基酸序列列於表2中(SEQ ID NO：5)。
術語“IL-15”(本文中亦稱為“IL15”)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子，且包括所有形式之IL-15，包括人類和哺乳動物形式、彼等之保守性胺基酸取代物、糖型、生物模擬藥和變體。IL-15描述於，例如Fehniger and Caligiuri,Blood 2001, 97,14-32，其揭示內容以引用方併入本文。IL-15與IL-2分享β和γ信號傳導受體亞基。重組人IL-15為含有114個胺基酸(及N-端甲硫胺酸)之單一，非糖基化多肽鏈，分子量為12.8kDa。重組人IL-15可從多個供應商購得，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(美國紐澤西州East Brunswick)(目錄編號CYT-230-b)和ThermoFisher Scientific公司(美國麻州Waltham)(人IL-15重組蛋白，目錄編號34-8159-82)。適合用於本發明之重組人IL-15的胺基酸序列列於表2(SEQ ID NO：6)中。
術語“IL-21”(本文中亦稱為“IL21”)係指稱為介白素-21之多效細胞因子蛋白，包括所有形式之IL-21，包括人類和哺乳動物形式、彼等之保守性胺基酸取代物、糖型、生物模擬藥和變體。IL-2描述於，例如Spolski and Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc. 2014, 13,379-95中，其揭示內容以引用方併入本文。IL-21主要由天然殺手T細胞和經激活之人CD4+ T細胞製造。重組人IL-21為含有132個胺基酸之單一、非糖基化多肽鏈，分子質量為15.4kDa。重組人IL-21可從多個供應商購得，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(美國紐澤西州East Brunswick)(目錄 編號CYT-408-b)和ThermoFisher Scientific公司(美國麻州Waltham)(人IL-21重組蛋白，目錄編號14-8219-80)。適合用於本發明之重組人IL-21的胺基酸序列列於表2中(SEQ ID NO：7)。
Figure 106137461-A0202-12-0068-259
如本文所使用之術語“髓樣細胞”係指骨髓譜系或由其衍生之細胞。骨髓譜系包括許多形態、表型和功能上不同的細胞類型，包括粒細胞之不同子集(中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜鹼性粒細胞)、單核細胞、巨噬細胞、紅血球、巨核細胞和肥大細胞。於某些實施態樣中，該髓樣細胞係源自骨髓譜系之細胞株的細胞。
“MOLM-14”係指一種人白血病細胞株，其係從具有復發之急性單核細胞白血病患者之外周血建立且初始表型特徵指明至少有下列標記物存在：CD4、CD9、CD11a、CD13、CD14、CD15、CD32、CD33、CD64、CD65、CD87、CD92、CD93、CD116、CD118和CD155。Matsuo,et al.,Leukemia 1997,11,1469-77。MOLM-14之 另外的表型特徵被發現具有較高含量之HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L、CD58和較低含量之CD86。MOLM-14細胞株存放於DSMZ，登錄編號為ACC777。該密切相關之MOLM-13細胞株存放於DSMZ，登錄編號為ACC554。如本文所使用之術語“MOLM-14細胞”係指MOLM-14細胞及/或源自該存放之MOLM-14親本細胞株的細胞。如本文所使用之術語“MOLM-13細胞”係指MOLM-13細胞及/或源自該存放之MOLM-13親本細胞株的細胞。
“EM-3”係指從患有費城染色體陽性CML之患者的骨髓建立之人細胞株。Konopka,et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 1985,82,1810-4。EM-3細胞之表型表徵指明至少存有下列標記物：CD13、CD15和CD33。EM-3細胞株存放於DSMZ，登錄編號為ACC134，而該密切相關之EM-2細胞株係存放於DSMZ，登錄編號為ACC135。如本文所使用者，術語“EM-3細胞”係指EM-3細胞及/或源自該存放之EM-3親本細胞株的細胞。
如本文使用者，術語“CD86蛋白質”可指包含如SEQ ID NO：8中所列之胺基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO：8中所描述之胺基酸序列具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之胺基酸序列的蛋白質。
如本文使用者，術語“4-1BBL”或“CD137L”可指包含如SEQ ID NO：9中所列之胺基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO：9中所描述之胺基酸序列具有至少 90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之胺基酸序列的蛋白質。
如本文使用者，術語“OX40L”或“CD137L”可指包含如SEQ ID NO：10中所列之胺基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO：10中所描述之胺基酸序列具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之胺基酸序列的蛋白質。
術語“生物模擬藥”係指生物產品，包括與經美國授權之參考生物產品高度類似的單株抗體或融合蛋白，該生物產品和參考產品雖然在臨床之無活性組分中有微小差別，但在安全性、純度和產品之效力方面，該生物產品和參考產品之間並無臨床上有意義之差異。此外，類似之生物藥品或“生物仿製”藥品為類似於已被歐洲藥品管理局授權使用之另一生物藥品的生物藥品。其他國家和地區之監管機構所使用之術語“生物模擬藥”亦同義。生物產品或生物藥品為由生物來源製成或源自生物來源(諸如細菌或酵母)的藥物。其可由相當小之分子(諸如人胰島素或紅血球生成素)或複雜的分子(諸如單株抗體)所組成。例如，若該參考IL-2蛋白為阿地介白素(PROLEUKIN)，經藥物監管部門核准之參考阿地介白素的蛋白質為類似於阿地介白素之“生物模擬藥”或阿地介白素之“生物模擬藥”。在歐洲，類似之生物藥品或“生物模擬藥”為類似於另一已被歐洲藥品管理局(EMA)授權使用之生物藥品的生物藥品。在歐洲，用於類似之生物應用的相關法律依據為法規 (EC)726/2004號之第6條和修訂版之指令2001/83/EC，第10條(4)，因此在歐洲，生物模擬藥可在法規(EC)726/2004號第6條和指令2001/83/EC，第10條(4)下被授權、被核准用於授權或用於授權之應用主題。在歐洲，已被授權之原始生物醫藥產品可稱為“參考醫藥產品”。類似之生物醫藥產品的CHMP指南(CHMP Guideline on Similar Biological Medicinal Products)中概述一些對被認為是生物模擬藥之產品的要求。此外，產品之具體指導方針(包括關於單株抗體生物模擬藥之指導原則)係由EMA根據產品的不同來提供並公佈在其網站上。如本文所描述之生物類似物可在品質特徵、生物活性、作用機制、藥物安全性略圖及/或功效方面類似於該參考醫藥產品。此外，該生物模擬藥可用於或旨在用於治療與該參考醫藥產品相同之病況。因此，如本文所描述之生物模擬藥可被認為具有與參考藥物產品相似或高度相似之品質特性。或者，或此外，如本文所描述之生物模擬藥可被認為具有與參考藥物產品相似或高度相似之生物活性。或者，或此外，如本文所描述之生物模擬藥可被認為具有與參考之藥物產品相似或高度相似之藥物安全性略圖。或者，或此外，如本文所描述之生物模擬藥可被認為具有與參考之藥物產品相似或高度相似之功效。如本文所描述者，在歐洲，生物模擬藥可被比作已被EMA授權通過之參考藥物產品。然而，在某些研究中，該生物模擬藥可被比作已在歐洲經濟區外被授權之生物醫藥產品(非歐洲經濟區授權之“比較品”)。該等研究包括， 例如某些臨床和活體內非臨床研究。如本文所使用者，術語“生物模擬藥”亦關於已被比作或可被比作經非EEA授權之生物醫藥產品。某些生物模擬藥為蛋白質，諸如抗體、抗體片段(例如抗原結合部分)和融合蛋白。蛋白質生物模擬藥可具有在胺基酸結構中稍作修飾(包括，例如缺失、添加及/或取代胺基酸)，而不顯著影響多肽功能之胺基酸序列。該生物模擬藥可包含與其參考醫藥產品之胺基酸序列具有97%或更高(例如97%、98%、99%或100%)之序列同一性的胺基酸序列。該生物模擬藥可包含一或多個轉譯後修飾，例如，但不限於與該參考藥物產品之轉譯後修飾不同的糖基化、氧化、脫醯胺化及/或截短，惟該差異不會導致該藥物產品之安全性及/或功效變化。該生物模擬藥與該參考藥物產品可具有相同或不同之糖基化模式。特別地，但非獨有地，該生物模擬藥可具有不同之糖基化模式，若該差異解決或旨在解決與該參考醫藥產品相關之安全性問題。此外，該生物模擬藥與該參考藥物產品之差異可在於，例如其強度、製藥形式、配製劑、賦形劑及/或呈現，惟該藥物產品之安全性和有效性不受到損害。與該參考醫藥產品相比較，該生物模擬藥可在，例如藥代動力學(PK)及/或藥效學(PD)變化形廓上有所差異，而仍被視為與該被授權之參考醫藥產品足夠相似或被認為適合被授權。在某些情況下，與該參考醫藥產品相比較，該生物模擬藥顯示出不同的結合特性，其中該不同的結合特性被監管局(諸如EMA)認為並非授權作為類似之生物產品的障 礙。術語“生物模擬藥”亦被其他國家和地區之監管機構作為同義詞。
如本文所使用者，術語“變體”包括，但不限於藉由在該參考蛋白質或抗體之胺基酸序列內或鄰近該胺基酸序列的特定位置處取代、缺失及/或添加一或多個胺基酸來包含與該參考蛋白質或抗體之胺基酸序列不同的胺基酸序列之蛋白質、抗體或融合蛋白。與該參考蛋白質或抗體之胺基酸序相比較，該變體可在其胺基酸序列中包含一或多個保守性取代。保守性取代可能涉及，例如取代類似地帶電或不帶電之胺基酸。該變體保留特異性結合該參考蛋白或抗體之抗原的能力。術語“變體”亦包括聚乙二醇化之抗體或蛋白質。
“聚乙二醇化”係指經修飾之抗體、或其片段、或蛋白質，該經修飾之抗體、或其片段、或蛋白質通常在其中一或多個PEG基團與該抗體、或其片段、或蛋白質連接之條件下，與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。聚乙二醇化可，例如增加抗體或蛋白質之生物(例如血清)半衰期。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所使用者，術語“聚乙二醇”旨在涵蓋任何已用來衍生其他蛋白質之PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。欲聚乙二醇化之抗體或蛋白質可為無糖基化抗體。用於聚乙二醇化之方法為本技藝所已知且可應用於本 文所描述之抗體和蛋白質，如歐洲專利案第EP 0154316和EP 0401384號中所描述者。
術語“約”和“近似”意指在數值之統計學上有意義的範圍內。該等範圍可在一個數量級內，較佳為在指定數值或範圍之50%以內，更佳為在20%以內，再更佳為在10%以內，甚至更佳為在5%以內。術語“約”或“近似”所包含之容許變化取決於所研究之特定系統，且可被本技藝之一般技術人士輕易地理解。此外，如本文所使用之術語“約”和“近似”意指尺寸、大小、配製、參數、形狀及其他量和特性不精確且不必精確，但可能依需要為近似及/或為較大或較小，反映容許偏差、轉換係數、四捨五入、測量誤差，等，及本技藝之技術熟習人士已知之其他因素。一般而言，無論是否明確地如此陳述，尺寸、大小、配製、參數、形狀或其他量或特性為“約”或“近似”。值得注意的是，具有非常不同之大小、形狀和尺寸的實施態可採用所描述之安排。
當以原始和修正形式用於所附之申請專利範圍時，轉折術語“包含”、“基本上由…組成”和“由……組成”係定義與被排除在申請專利範圍外之未被列舉的額外申請專利元件或步驟(若有任何時)有關的申請專利範圍。術語“包含”意圖為涵蓋的或為開放式的，且不排除任何額外、未列舉之元件、方法、步驟或材料。術語“由…組成”排除除了那些在申請專利範圍中具體指定者之外的任何元件、步驟或材料，且，於後種情況下，排除與該具體指定 之材料聯結的一般雜質。術語“基本上由……組成”將該申請專利之範圍限制在指定之元件、步驟或材料及那些本質上不會影響該申請專利之發明的基本和新穎特徵者。本文所描述之體現本發明的所有組成物、方法和套組可在替代之實施態樣中藉由轉折術語“包含”、“基本上由…組成”和“由…組成”中之任一者更具體地定義。
人造抗原呈現細胞
於一實施態樣中，本發明包括經分離之人造抗原呈現細胞(aAPC)，該經分離之人造抗原呈現細胞(aAPC)包含表現HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58之細胞且該細胞經修飾以表現一或多種共刺激分子。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現一或多種共刺激分子之MOLM-14細胞。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現一或多種共刺激分子之MOLM-13細胞。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含內源性表現HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58之MOLM-14細胞，其中該細胞係經修飾以表現CD86蛋白(其包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物)及4-1BBL蛋白(其包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物)，且其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86和4-1BBL。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-13細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-13細胞表現CD86和4-1BBL。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，且4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該4-1BBL包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該 aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之胺基酸序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之胺基酸序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之胺基酸序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之胺基酸序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞 之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之胺基酸序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之胺基酸序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，且該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該4-1BBL包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基 酸取代物，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸 序列具有大於96%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼OX40L之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86和OX40L。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-13細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼OX40L之核 酸，且其中該MOLM-13細胞表現CD86和OX40L。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和OX40L蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，且OX40L蛋白包含如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和OX40L蛋白之MOLM-13細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該OX40L包含如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-13細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之 MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白 之MOLM-14細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該MOLM-14細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於任一前述實施態樣中，可理解的是包含MOLM-14或MOLM-13細胞之aAPC可經修飾以同時表現OX40L和4-1BBL。
人CD86、人4-1BBL(CD137L)和人OX40L(CD134L)之序列列於表3中。
Figure 106137461-A0202-12-0083-260
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與包含如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物之第二蛋白結合，該第三蛋白與包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物之第四蛋白結合。 於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與包含如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物的第二蛋白結合，該第三蛋白與包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物的第四蛋白結合。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結 合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13 細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經 修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白 包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第 二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-14細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有 大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之MOLM-13細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
與人CD86結合之配體(CD28和CTLA-4)、與人4-1BBL結結合之配體(4-1BB)及與人OX40L結合之配體(OX40)的序列列於表4中。
Figure 106137461-A0202-12-0091-261
於一實施態樣中，本發明包括經分離之人造抗原呈現細胞(aAPC)，該經分離之人造抗原呈現細胞(aAPC)包含表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58之細胞且該細胞經修飾以表現一或多種共刺激分子，其中該aAPC係 源自EM-3親本細胞株。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包括經修飾以表現一或多種共刺激分子之EM-3細胞。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包括經修飾以表現一或多種共刺激分子之EM-2細胞。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58之EM-3細胞，其中該細胞經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，且其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86和4-1BBL。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列且該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實 施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白 係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細 胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋 白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含EM-3細胞，該EM-3細胞經修飾以表現單鏈片段可變(scFv)結合結構域(諸如本文所描述之選殖株7C12和8B3)，該單鏈片段可變(scFv)結合結構域與提供額外之增殖信號的單株抗體(諸如OKT-3)之Fc結構域結合。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實 施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白 係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細 胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋 白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現單鏈片段可變(scFv)結合結構域(諸如本文所描述之選殖株7C12和8B3)之EM-2細胞，該單鏈片段可變(scFv)結合結構域與提供額外之增殖信號的單株抗體(諸如OKT-3)之Fc結構域結合。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含如第96圖中描繪之經修飾的EM-3或EM-2細胞。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含如第97圖中描繪之經修飾的EM-3或EM-2細胞。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含如第98圖中描繪之經修飾的EM-3或EM-2細胞。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58之EM-3細胞，其中該細胞係經修飾以表現CD86蛋白和OX40L蛋白，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該OX40L蛋白包含如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，且其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之EM-3細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼OX40L蛋白之核酸，且其中該EM-3細胞表現CD86和OX40L蛋白。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和OX40L蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，且該OX40L蛋白包含如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列 具有大於99%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列且該OX40L蛋白 包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-3細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-3細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有 大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO： 12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-3細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現單鏈片段可變(scFv)結合結構域(諸如本文所描述之選殖株7C12和8B3)之EM-3細胞，該單鏈片段可變(scFv)結合結構域與提供額外之增殖信號的單株抗體(諸如OKT-3)之Fc結構域結合。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和OX40L蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，該OX40L蛋白包含如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列 具有大於99%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列且該OX40L蛋白 包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及OX40L蛋白之EM-2細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列且該OX40L蛋白包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，其中該CD86蛋白和OX40L蛋白係表現在該EM-2細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列和彼等之保守性胺基酸取代物。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有 大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO： 12所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之EM-2細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現單鏈片段可變(scFv)結合結構域(諸如本文所描述之選殖株7C12和8B3)之EM-2細胞，該單鏈片段可變(scFv)結合結構域與提供額外之增殖信號的單株抗體(諸如OKT-3)之Fc結構域結合。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含如第96圖中描繪之經修飾的EM-3或EM-2細胞。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含如第97圖中描繪之經修飾的EM-3或EM-2細胞。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含如第98圖中描繪之經修飾的EM-3或EM-2細胞。
可理解的是，於任一前述實施態樣中，包含EM-3或EM-2細胞之aAPC可經修飾以同時表現OX40L和4-1BBL。
於一實施態樣中，本發明包括經分離之人造 抗原呈現細胞(aAPC)，該經分離之人造抗原呈現細胞(aAPC)包含表現CD58且經修飾以表現一或多種共刺激分子之細胞，其中該aAPC係源自K562譜系親本細胞株。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現一或多種共刺激分子之K562譜系細胞。於一實施態樣中，該K562譜系親本細胞株係在登錄編號ATCC CCL-243存放，且亦存放在歐洲認證之細胞培養物收集處(ECACC 89121407)。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含表現CD58之K562譜系細胞，其中該細胞經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，且其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之K562譜系細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該K562譜系細胞表現CD86和4-1BBL。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白之K562譜系細胞，該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸 序列，該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之K562譜系細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之K562譜系細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之K562譜系細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之K562譜 系細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之K562譜系細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現CD86蛋白及4-1BBL蛋白之K562譜系細胞，該CD86蛋白包含與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列且該4-1BBL蛋白包含與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，其中該CD86蛋白和4-1BBL蛋白係表現在K562譜系細胞之表面上。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之K562譜系細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列和彼之保守性胺基酸取代物，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列和彼 等之保守性胺基酸取代物。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之K562譜系細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於99%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之K562譜系細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於98%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之K562譜系細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於97%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之K562譜系細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序 列具有大於96%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於96%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之K562譜系細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於95%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現第一蛋白和第三蛋白之K562譜系細胞，該第一蛋白與第二蛋白結合，該第二蛋白包含與如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列，該第三蛋白與第四蛋白結合，該第四蛋白包含與如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列具有大於90%同一性之序列。於一實施態樣中，本發明包括製備任一前述實施態樣之aAPC之方法。
於一實施態樣中，本發明包括aAPC，該aAPC包含經修飾以表現單鏈片段可變(scFv)結合結構域(諸如本文所描述之選殖株7C12和8B3)之K562譜系細胞，該單鏈片段可變(scFv)結合結構域與提供額外之增殖信號的單株抗體(諸如OKT-3)之Fc結構域結合。
製備人造抗原呈現細胞之方法
於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括穩定併入用於產生CD86和4-1BBL之基因之步驟。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括逆轉錄病毒轉導之步驟。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括慢病毒轉導之步驟。慢病毒轉導系統為本技藝所已知且描述於，例如Levine,et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci. 2006, 103,17372-77；Zufferey,et al.,Nat.Biotechnol. 1997, 15,871-75；Dull,et al.,J.Virology 1998, 72,8463-71，和美國專利案第6,627,442號(各篇之揭示內容以引用方式併入本文)。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括γ逆轉錄病毒轉導之步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統為本技藝中已知且描述於，例如Cepko and Pear,Cur.Prot.Mol.Biol. 1996,9.9.1-9.9.16(其揭示內容以引用方式併入本文)中。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括由轉位子介導之基因轉移之步驟。由轉位子介導之基因轉移系統為本技藝所已知且包括其中該轉位酶係以DNA表現載體或可表現之RNA或蛋白質之形式提供，從而使該轉位酶不會在轉基因細胞中長期表現之系統(例如以mRNA形式提供之轉位酶，例如包含帽和多聚A尾之mRNA)。合適之由轉位子介導之基因轉移系統(包括鮭魚型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)，諸如SB10、SB11和SB100x和具有增加之酶活性的工程化酶)描述於，例如Hackett,et al.,Mol.Therapy 2010, 18,674-83和美國專利案第6,489,458號(各篇之揭示內容以引用方式併入本文)中。
於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括穩定併入用於暫時產生CD86和4-1BBL之基因的步驟。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括電穿孔之步驟。電穿孔方法為本技藝所已知且描述於，例如Tsong,Biophys.J. 1991, 60,297-306和美國專利申請刊物第2014/0227237 A1號(各篇之揭示內容以引用方式併入本文)中。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括磷酸鈣轉染之步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面塗層及內吞作用)為本技藝所已知且描述於Graham and van der Eb,Virology 1973, 52,456-467；Wigler,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. 1979, 76,1373-1376；和Chen and Okayarea,Mol.Cell.Biol. 1987, 7,2745-2752；及美國專利案第5,593,875號(各篇之揭示內容以引用方式併入本文)中。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括脂質體轉染之步驟。脂質體轉染方法(諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(DOTMA)和二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)的1：1(w/w)脂質體製劑之方法)為本技藝所已知且描述於Rose,et al.,Biotechniques 1991, 10,520-525和Felgner,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987, 84,7413-7417，及美國專利案編號5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484；和7,687,070(各篇之揭示內容以引用方式併入本文)中。於一實施態樣中，製備aAPC之方法包括使用美國專利案第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994；和7,189,705號中所描 述之方法的轉染步驟；各篇之揭示內容以引用方式併入本文。
於一實施態樣中，首先使用Gateway選殖方法(購自ThermoFisher公司)轉導該aAPC以製備用於慢病毒轉導之載體，隨後使用該載體和一或多個相關之輔助質粒轉導慢病毒(亦描述於本文他處)。在Gateway選殖方法中，選定基因(如CD86)，然後提供引物並藉由經attB標籤之引物對的協助使用PCR技術擴增。然後，利用BP反應將PCR片段與包括attP位點之供體載體(pDONR，諸如pDONR221)組合，以提供入門選殖株。介於attB位和attP位點之間的整合反應將PCR片段與供體載體組合。所產生之入門選殖株含有鄰接attL位點之所欲基因。然後，利用LR反應將入門選殖株與目的載體組合以產生表現載體。在LR反應中，採用重組反應，以利用attL和attR位點及選殖酶將該入門選殖株與目的載體(諸如pLV430G)連接。該attL位點已在入門選殖株中找到，而目的載體包括該attR位點。進行LR反應以將所欲序列轉移入同步反應中之一或多個目的載體。
於一些實施態樣中，本文所描述之aAPC可生長並保持在以血清為底質之培養基及/或無血清培養基中。根據示例性方法，aAPC可以每孔約1×106個細胞之密度培養在24孔盤中3至5天。然後，可將細胞分離出及/或藉由離心洗滌並重新懸浮於培養基中或冷凍保存在合適之冷凍保存培養基(例如，CryoStor 10(BioLife Solutions) 中，並儲存在-80℃冷凍庫中。
於一些實施態樣中，本文所描述之aAPC可在以血清為底質之培養基之存在下生長。於一些實施態樣中，本文所描述之aAPC可在以血清為底質之培養基的存在下生長，該以血清為底質之培養基為含有人類血清(hSerum)之培養基(例如具有10%hSerum之cDMEM)。於一些實施態樣中，該在以血清為底質之培養基的存在下生長之aAPC可選自由下列所組成之群組：aMOLM-13細胞，aMOLM-14細胞及aEM3細胞。
於一些實施態樣中，本文所描述之aAPC可在無血清培養基之存在下生長。於一些實施態樣中，該無血清培養基可選自由下列所組成之群組：CTS Optmizer(ThermoFisher)、Xvivo-20(Lonza)、Prime T Cell CDM(Irvine)、XFSM(MesenCult)和類似物。於一些實施態樣中，該在無血清培養基之存在下生長的aAPC可選自由下列所組成之群組：aMOLM-13細胞，aMOLM-14細胞及aEM3細胞。
擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞和T細胞之方法
於一實施態樣中，本發明包括擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法，該方法包含令包含至少一個TIL之TIL群與本文所描述之aAPC群接觸，其中該aAPC包含至少一種與表現在該TIL細胞表面上之共刺激分子特異性結合之共刺激配體，其中該共刺激分子與該共刺激配體結合 誘導該TIL增殖，從而特異性擴增該TIL。
於一實施態樣中，本發明提供使用本發明之任一aAPC擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體之方法，該方法包含如Jin,et al.,J.Immunotherapy 2012, 35,283-292(其揭示內容以引用方式併入本文)中所描述之步驟。例如，可將該腫瘤置於酶培養基中並以機械方式分解約1分鐘。然後可將該混合物在37℃，5%CO2下培育30分鐘，然後再次以機械方式破碎約1分鐘。在37℃，5%CO2下培育30分鐘後，第三次以機械方式破壞腫瘤約1分鐘。若在第三次機械破壞後，仍存在大塊組織，可額外對該樣品施用1或2次機械分解，並在或不在37℃，5%CO2下額外培育30分鐘。在最終培育結束時，若該細胞懸浮液中含有大量紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll實施密度梯度分離以除去這些細胞。在24孔盤(Costar 24孔細胞培養簇，平底；康寧公司，紐約州康寧)中開始TIL培養，在每一個孔中之具有IL-2(6000IU/mL；Chiron公司，加州Emeryville)的2mL完全培養基(CM)中接種1×106個腫瘤分解細胞或一個大小約1至8mm3之腫瘤片段。CM包含具有GlutaMAX之RPMI 1640並輔以10%人AB血清、25mM HEPES和10mg/ml慶大黴素。培養可在具有40mL容積及10cm2透氣之矽底部的透氣培養瓶中(G-Rex 10；Wilson Wolf製造公司，New Brighton)開始，每個培養瓶可裝載在10-40mL之具有IL-2的CM中之10-40×106個活腫瘤分解細胞或5-30個腫瘤片段。G-Rex 10和24孔盤可置於加濕之培養箱中，在 37℃，5%CO2下培育並在培養開始後5天，移出一半的培養基，以新鮮之CM和IL-2替換且在第5天後，每2至3天更換一半的培養基。TIL之快速擴增方案(REP)可使用本發明之aAPC，依本文他處之描述利用T-175培養瓶和透氣袋或透氣G-Rex 10培養瓶進行。在T-175培養瓶中進行之REP方面，可將1×106個TIL懸浮在各個培養瓶中之150mL培養基中。可將該TIL與本發明之aAPC以本文中所描述之比例在CM和AIM-V培養基之1：1混合物(50/50培養基)中進行培養，該培養基中補充有3000IU/mL之IL-2和30ng/mL之抗CD3抗體(OKT-3)。該T-175培養瓶可在37℃，5%CO2下培育。在第5天使用具有3000IU/mL之IL-2的50/50培養基將一半之培養基更換掉。在第7天，可將來自2個T-175培養瓶之細胞在3L袋子中組合並將300mL之具有5%人AB血清和3000IU/mL之IL-2的AIM-V加入300mL之TIL懸浮液中。每天或每二天計算在各個袋子中之細胞數，且可添加新鮮培養基以將細胞計數保持在介於0.5和2.0×106細胞/mL之間。在具有500mL容積及100cm2之透氣矽底部的透氣培養瓶(如本文他處所描述之G-Rex 100；Wilson Wolf製造公司)中進行之REP方面，可將5×106或10×106個TIL與aAPC以本文所描述之比例(例如1：100)在400mL之50/50培養基(其中補充有3000IU/mL之IL-2和30ng/mL之抗CD3抗體(OKT-3))中培養。該G-Rex100培養瓶可在37℃下，5%CO2中培育。第5天，可移出250mL之上清液並置於離心瓶中在1500rpm(491g)離心10分鐘。以150mL之具有3000IU/mL 之IL-2的新鮮50/50培養基將所得之TIL沈澱小丸重新懸浮並再重新加入G-Rex 100培養瓶中。當在G-Rex 100培養瓶中連續擴增TIL時，在第7天將每個G-Rex 100中之TIL懸浮在存在於各個培養瓶中之300mL培養基中，將該細胞懸浮液分成三個100mL之等分試樣中並可將該等分試樣接種在3個G-Rex100培養瓶中。然後，可將約150mL之具有5%人AB血清和3000IU/mL之IL-2的AIM-V加入每個培養瓶中。然後，可將G-Rex100培養瓶在37℃下，5%CO2中培育並可在四天後，將150mL之具有3000IU/mL之IL-2的AIM-V加入每個G-Rex 100培養瓶中。之後，可藉由在培養的第14天收穫細胞來完成REP。
如本文所描述者，TIL可在無血清培養基之存在下有利地擴增。於一些實施態樣中，本文所描述之TIL擴增方法可包括使用無血清培養基，而非以血清為底質之培養基(例如完全培養基或CM1)。於一些實施態樣中，本文所描述之TIL擴增方法可使用無血清培養基中，而非以血清為底質之培養基。於一些實施態樣中，該無血清培養基可選自由下列所組成之群組：CTS Optmizer(ThermoFisher)、Xvivo-20(Lonza)、Prime T Cell CDM(Irvine)和類似物。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體 包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該細胞培養基進一步包含初始濃度為約3000IU/mL之IL-2及初始濃度為約30ng/mL之OKT-3抗體。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該APC群在7天之期間將在細胞培養基之TIL群擴 增至少50倍。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞內源性表現HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞為MOLM-14細胞。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體 包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞為MOLM-13細胞。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該髓樣細胞為EM-3細胞。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之序列或彼之保守性胺基酸取代物，且該4-1BBL蛋白包含 如SEQ ID NO：9所示之序列或彼之保守性胺基酸取代物。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該編碼CD86之核酸包含如SEQ ID NO：19所示之序列且該編碼4-1BBL蛋白之核酸包含如SEQ ID NO：16所示之序列。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟： (a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該TIL群對該aAPC群之比例係介於1：200至1：400之間。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含下列步驟：(a)以一或多種病毒載體轉導髓樣細胞以取得人造抗原呈現細胞(aAPC)群，其中該一或多種病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該髓樣細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和(b)令TIL群與該aAPC群在細胞培養基中接觸，其中該TIL群對該aAPC群之比例為約1：300。
於一實施態樣中，本發明提供擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法，該方法包含令TIL群與髓樣人造抗原呈現細胞(aAPC)接觸，其中該髓樣aAPC包含至少二種共刺激配體，該至少二種共刺激配體與至少二種在該TIL上之共刺激分子特異性結合，其中該共刺激分子與該共刺激配體結合誘導該TIL增殖，從而特異性擴增該TIL，且其中該至少二種共刺激配體包含CD86和4-1BBL。
於任一前述實施態樣中，除了4-1BBL外，該aAPC可進一步包含OX40L或可包含OX40L，而非4-1BBL。
於一實施態樣中，擴增或治療癌症之方法包括其中從患者腫瘤樣品取得TIL之步驟。患者腫瘤樣品可使用本技藝中已知之方法取得。例如，培養之TIL可來自酶促分解之腫瘤分解物和來自銳器剝離之腫瘤片段(大小約1至約8mm3)。該等腫瘤分解物可藉由先在酶促培養基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝液、2mM之麩胺酸鹽、10mcg/mL之慶大黴素、30單位/mL之DNA酶及1.0mg/mL之膠原蛋白酶)中培育，接著藉由，例如機械分離(例如使用組織分離器)來產生。腫瘤分解物可藉由下列步驟產生：將腫瘤置於酶促培養基中，並將該腫瘤以機械方式分解約1分鐘，隨後在37℃，5%CO2中培育30分鐘，接著在前述條件下重複機械分離和培育之循環，直到僅有小的組織片段存在。在此過程結束時，若該細胞懸浮液含有大量紅血球或死亡的細胞，可使用FICOLL支鏈型親水性多醣進行密度梯度分離以去除這些細胞。可使用本技藝已知之替代方法，例如那些描述於美國專利申請刊物第2012/0244133 A1號(其揭示內容以引用方式併入本文)中者。任一前述方法均可用於本文所描述之用於擴增TIL之方法或治療癌症之方法的任一實施態樣中。
於一實施態樣中，REP可使用本發明之 aAPC，藉由任何合適之方法在透氣容器中進行。例如，TIL可在介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)之存在下，利用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。該非特異性T細胞受體刺激物可包括，例如約30ng/mL之抗CD3抗體，例如OKT-3，一種單株抗CD3抗體(可從Ortho-McNeil公司，美國紐澤西州Raritan，或Miltenyi Biotech公司，美國加州Auburn購得)或UHCT-1(可從BioLegend公司，美國加州聖地牙哥購得)。TIL可藉由在玻管內進一步以該癌症之一或多種抗原(包括其抗原性部分，諸如抗原決定部位)刺激來快速擴增，該一或多種抗原可選擇地在T細胞生長因子(諸如300IU/mL之IL-2或IL-15)之存在下，可選擇地從載體表現，諸如人白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3μM MART-1：26-35(27L)或gp100：209-217(210M))。其他合適之抗原可包括，例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2、或其抗原性部分。TIL亦可藉由以該癌症之相同抗原，在表現HLA-A2之抗原呈現細胞上以脈衝方式再刺激來快速擴增。或者，該TIL可進一步以，例如經放射照射之自體淋巴細胞或經放射照射之HLA-A2+同種異體淋巴細胞和IL-2再刺激。
於一實施態樣中，該用於擴增TIL之方法可包括使用約5000mL至約25000mL之細胞培養基、約5000mL至約10000mL之細胞培養基、或約5800mL至約8700mL之細胞培養基。於一實施態樣中，該用於擴增TIL之方法可包括使用約1000mL至約2000mL之細胞培養基、約 2000mL至約3000mL之細胞培養基、約3000mL至約4000mL之細胞培養基、約4000mL至約5000mL之細胞培養基、約5000mL至約6000mL之細胞培養基、約6000mL至約7000mL之細胞培養基、約7000mL至約8000mL之細胞培養基、約8000mL至約9000mL之細胞培養基、約9000mL至約10000mL之細胞培養基、約10000mL至約15000mL之細胞培養基、約15000mL至約20000mL之細胞培養基、或約20000mL至約25000mL之細胞培養基。於一實施態樣中，擴增TIL之數目使用不超過一種類型之細胞培養基。任何合適之細胞培養基均可使用，例如AIM-V細胞培養基(L-麩胺醯胺、50μM硫酸鏈黴素和10μM硫酸慶大黴素)細胞培養基(Invitrogen，美國加州Carlsbad)。在這方面，本發明方法有利地減少培養基之量和擴增該TIL之數目所需之培養基類型的數目。於一實施態樣中，擴增該TIL之數目可包含以不高於每三或四天之頻率餵養細胞。在透氣容器中擴增細胞之數目可藉由減少為了擴增該細胞之數目所必要之餵養頻率來簡化擴增該細胞之數目所必要之程序。
於一實施態樣中，該快速擴增係使用透氣容器實施。該等實施態樣允許細胞群從約5×105個細胞/cm2擴增至介於10×106和30×106個細胞/cm2之間。於一實施態樣中，該擴增不需餵養即可發生。於一實施態樣中，該擴增不需餵養即可發生，只要該培養基停留在該透氣培養瓶之約10cm的高度。於一實施態樣中，這不需餵養但需添加 一或多種細胞因子。於一實施態樣中，該細胞因子可以大丸劑形式添加，而不需將細胞因子與培養基混合。該等容器、裝置和方法為本技藝所已知且已被用來擴增TIL，並包括那些描述於下列文獻中者：美國專利申請刊物第US 2014/0377739 A1號、國際專利申請刊物第WO 2014/210036 A1號、美國專利申請刊物第US 2013/0115617 A1號、國際刊物第WO 2013/188427 A1號、美國專利申請刊物第US 2011/0136228 A1號、美國專利案第8,809,050號、國際專利申請刊物第WO 2011/072088 A2號、美國專利申請刊物第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請刊物第US 2012/0244133 A1號、國際專利申請刊物第WO 2012/129201 A1號、美國專利申請刊物第US 2013/0102075 A1號、美國專利第8,956,860號、國際專利申請刊物第WO2013/173835 A1號和美國專利申請刊物第US 2015/0175966 A1號(其揭示內容以引用方式併入本文)。該等方法亦描述於Jin,et al.,J.Immunotherapy 2012,35,283-292(其揭示內容以引用方式併入本文)中。
於一實施態樣中，該透氣容器為G-Rex 10培養瓶(Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)。於一實施態樣中，該透氣容器包括10cm2透氣培養表面。於一實施態樣中，該透氣容器包括40mL細胞培養基容量。於一實施態樣中，該透氣容器在2次培養基交換後提供1至3億個TIL。
於一實施態樣中，該透氣容器為G-Rex 100 培養瓶(Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)。於一實施態樣中，該透氣容器包括100cm2透氣培養表面。於一實施態樣中，該透氣容器包括450mL細胞培養基容量。於一實施態樣中，該透氣容器在2次培養基交換後提供10至30億個TIL。
於一實施態樣中，該透氣容器為G-Rex 100培養瓶(Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)。於一實施態樣中，該透氣容器包括100cm2透氣培養表面。於一實施態樣中，該透氣容器包括1000mL細胞培養基容量。於一實施態樣中，該透氣容器不需培養基交換可提供10至30億個TIL。
於一實施態樣中，該透氣容器為G-Rex 100培養瓶(Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)。於一實施態樣中，該透氣容器包括100cm2透氣培養表面。於一實施態樣中，該透氣容器包括2000mL細胞培養基容量。於一實施態樣中，該透氣容器不需培養基交換可提供10至30億個TIL。
於一實施態樣中，該透氣容器為G-Rex 24孔盤(Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)。於一實施態樣中，該透氣容器包括具有孔之盤，其中每個孔包括2cm2透氣培養表面。於一實施態樣中，該透氣容器包括具有孔之盤，其中每個孔包括8mL細胞培養基容量。於一實施態樣中，該透氣容器在2次培養基交換後提供2000萬至6000萬個TIL。
於一實施態樣中，該透氣容器為G-Rex 6孔盤(Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)。於一實施態樣中，該透氣容器包括具有孔之盤，其中每個孔包括10cm2透氣培養表面。於一實施態樣中，該透氣容器包括具有孔之盤，其中每個孔包括40mL細胞培養基容量。於一實施態樣中，該透氣容器在2次培養基交換後提供10億至30億個TIL。
於一實施態樣中，在第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目之必要程序。於一實施態樣中，在第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME)。
於一實施態樣中，該方法之持續時間包括從哺乳動物取得腫瘤組織樣品；在含有細胞培養基之第一透氣容器中培養該腫瘤組織樣品；從該腫瘤組織樣品取得TIL；在其中含有細胞培養基之第二透氣容器中使用aAPC持續擴增該TIL之數目約14至約42天，例如約28天。
於一實施態樣中，該快速擴增係使用約1×109至約1×1011個aAPC。於一實施態樣中，該快速擴增係使用約1×109個aAPC。於一實施態樣中，該快速擴增係使用約1×1010個aAPC。於一實施態樣中，該快速擴增係使用約1×1011個aAPC。
於一實施態樣中，該TIL對aAPC之比例(TIL：aAPC)係選自由下列所組成之群組：1：5、1： 10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：85、1：90、1：95、1：100、1：105、1：110、1：115、1：120、1：125、1：130、1：135、1：140、1：145、1：150、1：155、1：160、1：165、1：170、1：175、1：180、1：185、1：190、1：195、1：200、1：225、1：250、1：275、1：300、1：350、1：400、1：450和1：500。於一較佳之實施態樣中，該TIL對aAPC之比例(TIL：aAPC)為約1：90。於一較佳之實施態樣中，該TIL對aAPC之比例(TIL：aAPC)為約1：95。於一較佳之實施態樣中，該TIL對aAPC之比例(TIL：aAPC)為約1：100。於一較佳之實施態樣中，該TIL對aAPC之比例(TIL：aAPC)為約1：105。於一較佳之實施態樣中，該TIL對aAPC之比例(TIL：aAPC)為約1：110。
於一實施態樣中，在快速擴增中，該TIL對aAPC之比例為約1：25、約1：50、約1：100、約1：125、約1：150、約1：175、約1：200、約1：225、約1：250、約1：275、約1：300、約1：325、約1：350、約1：375、約1：400、或約1：500。於一實施態樣中，在快速擴增中，該TIL對aAPC之比例介於約1：50至1：300之間。於一實施態樣中，在快速擴增中該TIL對aAPC之比例介於約1：100至1：200之間。
於一實施態樣中，該細胞培養基進一步包含IL-2。於一較佳之實施態樣中，該細胞培養基包含約3000 IU/mL之IL-2。於一實施態樣中，該細胞培養基包含約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL的、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL或約8000IU/mL之IL-2。於一實施態樣中，該細胞培養基包含介於1000和2000IU/mL之間、介於2000和3000IU/mL之間、介於3000和4000IU/mL之間之間、介於4000和5000IU/mL之間、介於5000和6000IU/mL之間、介於6000和7000IU/mL之間、介於7000和8000IU/mL之間、或8000IU/mL之IL-2。
於一實施態樣中，該細胞培養基包含OKT-3抗體。於一較佳之實施態樣中，該細胞培養基包含約30ng/mL之OKT-3抗體。於一實施態樣中，該細胞培養基包含約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL、及約1μg/mL之OKT-3抗體。於一實施態樣中，該細胞培養基包含介於0.1ng/mL至1ng/mL之間、介於1ng/mL至5ng/mL之間、介於5ng/mL至10ng/mL之間、介於10ng/mL至20ng/mL之間、介於20ng/mL至30ng/mL之間、介於30ng/mL至40ng/mL之間、介於40ng/mL至50 ng/mL之間、介於50ng/mL至100ng/mL之間的OKT-3抗體。
於一實施態樣中，TIL之快速擴增過程可使用如前述之T-175培養瓶和透氣袋(Tran,et al.,J.Immunother. 2008, 31,742-51；Dudley,et al.,J.Immunother. 2003, 26,332-42)或透氣培養皿(G-Rex培養瓶，購自Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)來實施。為了在T-175培養瓶中快速擴增TIL，可將懸浮在150mL之培養基中的1×106個TIL加入各T-175培養瓶中。該TIL可與aAPC以TIL：aAPC為1：100之比例一起培養，該細胞係在補充有3000IU(國際單位)/mL之IL-2和30ng/mL之抗CD3抗體(例如OKT-3)的培養基中培養且該培養基為CM和AIM-V培養基之1：1混合物。該T-175培養瓶可在37℃，5%CO2下培育。在第5天使用具有3000IU/mL之IL-2的50/50培養基交換一半的培養基。第7天可將來自二個T-175培養瓶之細胞組合在一個3升的袋子內並將300mL具有5%人AB血清和3000IU/mL之IL-2的AIM V加入該300mL之TIL懸浮液中。每天或每二天計算每個袋子內之細胞的數目並添加新鮮之培養基以將細胞計數保持在0.5至2.0×106個細胞/mL。
於一實施態樣中，為了在具有100cm透氣之矽底部之500mL容量的透氣培養瓶(G-Rex 100，購自Wilson Wolf製造公司，美國明尼蘇達州New Brighton)中進行快速TIL擴增，可將5×106或10×106個TIL與aAPC以 1：100之比例在400mL之補充有5%人AB血清、3000IU/mL之IL-2和30ng/mL之抗CD3抗體(例如OKT-3)的50/50培養基中培養。該G-Rex 100培養瓶可置於37℃，5%CO2中培育。在第5天，可移出250mL之上清液並置入離心瓶中，在1500rpm離心(每分鐘轉速；491×g)10分鐘。該TIL之沈澱小丸可重新懸浮於150mL之含有5%人AB血清、3000IU/mL之IL-2的新鮮培養基中，並添加返回原始之G-Rex 100培養瓶中。當將TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增時，在第7天可將每個G-Rex 100中之TIL懸浮在各培養瓶內之300mL培養基中並可將該細胞懸浮液劃分成3個100mL等分試樣以用於接種3個G-Rex 100培養瓶。然後，將150mL之具有5%人AB血清和3000IU/mL之IL-2的AIM-V加入各培養瓶中。該G-Rex 100培養瓶可在37℃，5%CO2下培育並在4天後在各G-Rex 100培養瓶中加入150mL之具有3000IU/mL之IL-2的AIM-V。在培養的第14天收穫該細胞。
於一實施態樣中，可依下述製備TIL。將2mm3之腫瘤片段培養在完全培養基(CM)中，該完全培養基(CM)係由補充有2mM麩胺醯胺(Mediatech公司，維吉尼亞州Manassas)、100U/mL青黴素(Invitrogen生命技術)、100μg/mL鏈黴素(Invitrogen生命技術)、5%經熱滅活之人AB血清(Valley生物醫學公司，維吉尼亞州Winchester)和600IU/mL之rhIL-2(Chiron公司，加州Emeryville)的AIM-V培養基(Invitrogen生命技術，加州Carlsbad)所組成。為 了酶促分解實體瘤，將腫瘤標本切入RPMI-1640中，清洗並在15-22℃，800rpm離心5分鐘，然後再懸浮於酶促分解緩衝液中(在含有0.2mg/mL膠原蛋白酶和30單位/ml之DNA酶的RPMI-1640中)，接著在室溫下旋轉過夜。從片段建立之TIL可在CM中生長3-4週並新鮮地擴增或冷凍保存在具有10%二甲基亞碸(DMSO)之經熱滅活的HAB血清中及儲存於-180℃直到研究時。以3×106個細胞/孔之密度將從收集之腹水取得之腫瘤相關淋巴細胞(TAL)接種在24孔盤內之CM中。約每隔一天使用低倍倒置顯微鏡檢查TIL之生長。
於一實施態樣中，TIL係在透氣容器中擴增。透氣容器已用於採用本技藝中已知之方法、組成物和設備，利用PBMC來擴增TIL(包括美國專利申請刊物第2005/0106717 A1號中所描述者，其揭示內容以引用方式併入本文)。於一實施態樣中，TIL係在透氣袋擴增。於一實施態樣中，TIL係在透氣袋中利用擴增TIL之細胞擴增系統(諸如旭日(Xuri)細胞擴增系統W25(GE Healthcare))擴增。於一實施態樣中，TIL係在透氣袋中利用細胞擴增系統(諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為旭日細胞擴增系統W5(GE Healthcare))擴增TIL。於一實施態樣中，該細胞擴增系統包括具有選自由下列所組成之群組的體積之透氣細胞袋：約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、 約9L、約10L、約11L、約12L、約13L、約14L、約15L、約16L、約17L、約18L、約19L、約20L、約25L、約30L。於一實施態樣中，該細胞擴增系統包括透氣細胞袋，該透氣細胞袋之體積範圍係選自由下列所組成之群組：介於50至150mL之間、介於150至250mL之間、介於250至350mL之間、介於350至450mL之間、介於450至550mL之間、介於550至650mL之間，介於650至750mL之間、介於750至850ML之間，介於850至950ML之間及介於950至1050mL之間。於一實施態樣中，該細胞擴增系統包括透氣細胞袋，該透氣細胞袋之體積範圍係選自由下列所組成之群組：介於1L至2L之間、介於2L至3L之間、介於3L至4L之間、介於4L至5L之間、介於5L至6L之間、介於6L至7L之間、介於7L至8L之間、介於8L至9L之間、介於9L至10L之間、介於10L至11L之間、介於11L至12L之間、介於12L至13L之間、介於13L至14L之間、介於14L至15L之間、介於15L至16L之間、介於16L至17L之間、介於17L至18L之間、介於18L至19L之間及介於19L至20L之間。於一實施態樣中，該細胞擴增系統包括透氣細胞袋，該透氣細胞袋之體積範圍係選自由下列所組成之群組：介於0.5L至5L之間、介於5L至10L之間、介於10L至15L之間、介於15L至20L之間、介於20L至25L之間及介於25L至30L之間。於一實施態樣中，該細胞擴增系統使用之搖動時間為約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小 時、約11小時、約12小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天及約28天。於一實施態樣中，該細胞擴增系統使用之搖動時間係介於30分鐘至1小時之間、介於1小時至12小時之間、介於12小時至1天之間、介於1天至7天之間、介於7天至14天之間、介於14天至21天之間及介於21天至28天之間。於一實施態樣中，該細胞擴增系統使用之搖動速率為約2次搖動/分鐘、約5次搖動/分鐘、約10次搖動/分鐘、約20次搖動/分鐘、約30次搖動/分鐘及約40次搖動/分鐘。於一實施態樣中，該細胞擴增系統使用之搖動速率係介於2次搖動/分鐘和5次搖動/分鐘之間、介於5次搖動/分鐘和10次搖動/分鐘之間、介於10次搖動/分鐘和20次搖動/分鐘之間、介於20次搖動/分鐘和30次搖動/分鐘之間及介於30次搖動/分鐘和40次搖動/分鐘之間。於一實施態樣中，該細胞擴增系統使用之搖動角度為約2°、約3°、約4°、約5°、約6°、約7°、約8°、約9°、約10°、約11°及約12°。於一實施態樣中，該細胞擴增系統使用之搖動角度係介於2°至3°之間、介於3°至4°之間、介於4°至5°之間、介於5°至6°之間、介於6°至7°之間、介於7°至8°之間、介於8°至9之間°、介於9°至10°之間、介於10°至11°之間及介於11°至12°之間。
於一實施態樣中，使用aAPC擴增TIL之方法 進一步包含其中選擇優良腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用本技藝已知之任何選擇方法。例如美國專利申請刊物第2016/0010058 A1號中所描述之方法(其揭示內容以引用方式併入本文)可用於選擇優良腫瘤反應性之TIL。
於一實施態樣中，本發明之aAPC可用於擴增T細胞。本發明所描述之用於擴增TIL之任一前述實施態樣亦可應用於擴增T細胞。於一實施態樣中，本發明之aAPC可用於擴增CD8+ T細胞。於一實施態樣中，本發明之aAPC可用於擴增CD4+ T細胞。於一實施態樣中，本發明之aAPC可用於擴增以嵌合抗原受體(CAR-T)轉導之T細胞。於一實施態樣中，本發明之aAPC可用於擴增包含經修飾之T細胞受體(TCR)的T細胞。該CAR-T細胞可被靶向針對任何合適之抗原，包括如本技藝中所描述之CD19，例如在美國專利案第7,070,995；7,446,190；8,399,645；8,916,381；及9,328,156號中所描述者(其揭示內容以引用方式併入本文)。該經修飾之TCR細胞可被靶向針對任何合適之抗原，包括如本技藝中所描述之NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原性部分，例如在美國專利案第8,367,804和7,569,664號中所描述者(其揭示內容以引用方式併入本文)。
治療癌症和其他疾病之方法
本文所描述之組成物和方法可用於治療疾病 之方法中。於一實施態樣中，彼等係用於治療過度增殖性疾病。彼等亦可用於治療如此處所描述及下列段落中之其他病症。本文所描述之TIL、其群體和組成物可用於治療疾病。於一實施態樣中，本文所描述之TIL、其群體和組成物係用於治療過度增殖性疾病。
於一些實施態樣中，該過度增殖性病症為癌症。於一些實施態樣中，該過度增殖性疾病為實體瘤癌症。於一些實施態樣中，該實體瘤癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌、腎癌和腎細胞癌、胰臟癌及膠質母細胞瘤。於一些實施態樣中，該過度增殖性病症為血液惡性腫瘤。於一些實施態樣中，該血液惡性腫瘤係選自由下列所組成之群組：慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴母細胞性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和套細胞淋巴瘤。
於一實施態樣中，本發明包括以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)使用人造抗原呈現細胞(aAPC)群在細胞培養基中快速擴增該第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；及(c)對癌症患者投予治療有效份之該第二TIL群。於一實施態樣中，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多個病 毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。於一實施態樣中，該快速擴增進行之期間不超過14天。
於一實施態樣中，本發明包括以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)使用第一人造抗原呈現細胞(aAPC)群在第一細胞培養基中初次擴增第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少10倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)使用第二aAPC群在第二細胞培養基中快速擴增第二TIL群以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群。於一實施態樣中，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。於一實施態樣中，該快速擴增進行之期間不超過14天。於一實施態樣中，該初始擴增係使用透氣容器實施。
於一實施態樣中，本發明包括以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟：(a)從患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中初次擴增第一TIL群以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少10倍，且其中 該第一細胞培養基包含IL-2；(c)使用人造抗原呈現細胞(aAPC)群在第二細胞培養基中快速擴增第二TIL群以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)對癌症患者投予治療有效份之該第三TIL群。於一實施態樣中，該aAPC包含經一或多種病毒載體轉導之MOLM-14細胞，其中該一或多個病毒載體包含編碼CD86之核酸和編碼4-1BBL之核酸，且其中該MOLM-14細胞表現CD86蛋白和4-1BBL蛋白。於一實施態樣中，該快速擴增進行之期間不超過14天。
於一實施態樣中，本發明包括以TIL群治療癌症之方法，其中該患者在輸注根據本發明之TIL之前預先以非清髓性化療治療。於一實施態樣中，該非清髓性化療為60mg/kg/天之環磷醯胺達二天(在輸注TIL前第27和26天)和25mg/m2/天之氟達拉濱達5天(在輸注TIL前第27至23天)。於一實施態樣中，在非清髓性化療和輸注根據本發明之TIL(第0天)後，患者接受每8小時靜脈內輸注720,000IU/kg之IL-2直至產生生理性耐受性。
本文所描述之化合物和化合物之組合於治療、預防及/或管理所指明之疾病或病症之效力可使用本技藝中已知之各種模型測試，該等模型提供治療人類疾病之指導方針。例如，用於測定對卵巢癌之治療效力的模型描述於，例如Mullany,et al.,Endocrinology 2012, 153,1585-92；和Fong,et al.,J.Ovarian Res. 2009, 2,12。用 於測定對胰臟癌之治療效力的模型描述於Herreros-Villanueva,et al.,World J.Gastroenterol. 2012, 18,1286-1294。用於測定對乳腺癌之治療效力的模型描述於，例如Fantozzi,Breast Cancer Res. 2006, 8,212。用於測定對黑色素瘤之治療效力的模型描述於，例如Damsky,et al.,Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23,853-859。用於測定對肺癌之治療效力的模型描述於，例如Meuwissen,et al.,Genes & Development,2005, 19,643-664。用於測定對肺癌之治療效力的模型描述於，例如Kim,Clin.Exp.Otorhinolaryngol. 2009, 2,55-60；和Sano,Head Neck Oncol. 2009, 1,32。
以化療進行非清髓性淋巴細胞清除
於一實施態樣中，本發明包括以TIL群治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前預先以非清髓性化療治療。於一實施態樣中，本發明提供可藉由本文所描述之方法取得之用於治療癌症之TIL群，其中該TIL群係用於治療預先以非清髓性化療治療之患者取得。於一實施態樣中，該非清髓性化療為60mg/kg/天之環磷醯胺共2天(在輸注TIL前第27和26天)和25mg/m2/天之氟達拉濱達5天(在輸注TIL前第27至23天)。於一實施態樣中，在非清髓性化療和輸注根據本發明之TIL(第0天)後，患者每8小時接受靜脈內輸注720,000IU/kg之IL-2(阿地介白素，可以PROLEUKIN之形式購得)直至產生生理耐受 性。
實驗結果指明在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前的淋巴細胞清除法藉由排除調節性T細胞和免疫系統(“細胞因子匯”)之競爭元素在增強治療功效中具關鍵作用。因此，本發明之一些實施態樣在引入本發明之經aAPC擴增之TIL之前對患者採用淋巴細胞清除步驟(有時亦稱為“免疫抑制調節”)。
一般而言，淋巴細胞清除係利用投予氟達拉濱或環磷醯胺(該活性形式被稱為馬磷醯胺(mafosfamide))及其組合來達成。該等方法描述於Gassner,et al.,Cancer Immunol.Immunother. 2011, 60,75-85、Muranski,et al.,Nat.Clin.Pract.Oncol., 2006, 3,668-681、Dudley,et al.,J.Clin.Oncol. 2008, 26,5233-5239及Dudley,et al.,J.Clin.Oncol. 2005, 23,2346-2357中，所有這些文獻之全部內容以引用方式併入本文。
於一些實施態樣中，氟達拉濱之投予濃度為0.5μg/mL-10μg/mL之氟達拉濱。於一些實施態樣中，氟達拉濱之投予濃度為1μg/mL之氟達拉濱。於一些實施態樣中，該氟達拉濱治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天、或更久。於一些實施態樣中，該氟達拉濱之投予劑量為10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天、或45mg/kg/天。於一些實施態樣中，該氟達拉濱治療係投予35mg/kg/天共2-7天。於一些實施態樣中，該氟達 拉濱治療係投予35mg/kg/天共4-5天。於一些實施態樣中，該氟達拉濱治療係投予25mg/kg/天共4-5天。
於一些實施態樣中，馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)係藉由投予環磷醯胺來達到0.5μg/mL-10μg/mL之濃度。於一些實施態樣中，馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)係藉由投予環磷醯胺來達到1μg/mL之濃度。於一些實施態樣中，該環磷醯胺治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天、或更久。於一些實施態樣中，該環磷醯胺之投予劑量為100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天、或300mg/m2/天。於一些實施態樣中，該環磷醯胺係經由靜脈內(i.v.)途徑投予。於一些實施態樣中，該環磷醯胺治療係投予35mg/kg/天，i.v.共2-7天。於一些實施態樣中，該環磷醯胺治療係投予250mg/m2/天，i.v.共4-5天。於一些實施態樣中，該環磷醯胺治療係投予250mg/m2/天，i.v.共4天。
於一些實施態樣中，淋巴細胞清除係藉由將氟達拉濱和環磷醯胺一起投予患者來進行。於一些實施態樣中，氟達拉濱之投予劑量為25mg/m2/天，i.v.且環磷醯胺之投予劑量為250mg/m2/天，i.v.超過4天。
於一實施態樣中，該淋巴細胞清除係藉由投予劑量為60mg/m2/天之環磷醯胺達二天且隨後投予劑量為25mg/m2/天之氟達拉濱達5天來進行。
醫藥組成物、劑量和給藥方案
於一實施態樣中，使用本發明之aAPC擴增之TIL係以醫藥組成物之形式投予患者。於一實施態樣中，該醫藥組成物為在無菌緩衝液中之TIL的懸浮液。使用本發明之aAPC擴增之TIL係藉由本技藝中已知之任何合適之途徑投予。較佳地，該TIL係以單次輸注之形式(諸如動脈內或靜脈內輸注)投予，較佳為持續約30至60分鐘。其他合適之投予途徑包括腹膜內、鞘內和淋巴內投予。
任何合適之TIL劑量均可投予。較佳地，投予約2.3×1010至約13.7×1010個TIL，平均為投予約7.8×1010個TIL，尤其是若該癌症為黑色素瘤。於一實施態樣中，投予約1.2×1010至約4.3×1010個TIL。
於一些實施態樣中，本發明之醫藥組成物中所提供之TIL的數目為約1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、 7×1013、8×1013和9×1013。於一實施態樣中，本發明之醫藥組成物中所提供之TIL的數目係在下列範圍內：1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012及5×1012至1×1013。
於一些實施態樣中，本發明之醫藥組成物中所提供之TIL的濃度低於，例如該醫藥組成物之100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
於一些實施態樣中，本發明之醫藥組成物中所提供之TIL的濃度高於，例如該醫藥組成物之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、 13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、1.25%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
於一些實施態樣中，本發明之醫藥組成物中所提供之TIL的濃度係在下列範圍內：該醫藥組成物之約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%、或約1%至約10% w/w、w/v或v/v。
於一些實施態樣中，本發明之醫藥組成物中 所提供之TIL的濃度係在下列範圍內：該醫藥組成物之約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v。
於一些實施態樣中，本發明之醫藥組成物中所提供之TIL的量等於或少於10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
於一些實施態樣中，本發明之醫藥組成物中所提供之TIL的量超過0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、 0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
本發明之實施態樣的醫藥組成物中所提供之TIL的有效劑量範圍很寬。確切之劑量將取決於該投予途徑、該化合物之投予形式、欲治療之個體的性別和年齡、欲治療之個體的體重及主治醫師之偏好和經驗。若適當時亦可使用臨床已建立之TIL劑量。使用本文之方法投予之醫藥組成物的量(諸如TIL劑量)將取決於該接受治療之人或哺乳動物、該疾病或病症之嚴重性、投予速率、該活性藥物成分之配置和處方醫師之判斷。
於一些實施態樣中，TIL可在單一劑量中投予。該等投予可藉由注射(例如靜脈內注射)進行。於一些實施態樣中，TIL可在數個劑量中投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次、或超過六次。給藥可為每月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。只要有必要可持續投予TIL。
於一些實施態樣中，TIL之有效劑量為約1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、 2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及9×1013。於一些實施態樣中，TIL之有效劑量係在下列範圍內：1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012及5×1012至1×1013。
於一些實施態樣中，TIL之有效劑量係在下列範圍內：約0.01mg/kg至約4.3mg/kg、約0.15mg/kg至約3.6mg/kg、約0.3mg/kg至約3.2mg/kg、約0.35mg/kg至約2.85mg/kg、約0.15mg/kg至約2.85mg/kg、約0.3mg至約2.15mg/kg、約0.45mg/kg至約1.7mg/kg、約0.15mg/kg至約1.3mg/kg、約0.3mg/kg至約1.15mg/kg、約0.45mg/kg至約1mg/kg、約0.55mg/kg至約0.85mg/kg、約0.65mg/kg至約0.8mg/kg、約0.7mg/kg至約0.75mg/kg、約0.7mg/kg至約2.15mg/kg、約0.85mg/kg至約2mg/kg、約1mg/kg至約1.85mg/kg、約1.15mg/kg至約1.7mg/kg、約1.3mg/kg至約1.6mg/kg、約1.35mg/kg至約1.5mg/kg、約 2.15mg/kg至約3.6mg/kg、約2.3mg/kg至約3.4mg/kg、約2.4mg/kg至約3.3mg/kg、約2.6mg/kg至約3.15mg/kg、約2.7mg/kg至約3mg/kg、約2.8mg/kg至約3mg/kg、或約2.85mg/kg至約2.95mg/kg。
於一些實施態樣中，TIL之有效劑量係在下列範圍內：約1mg至約500mg、約10mg至約300mg、約20mg至約250mg、約25mg至約200mg、約1mg至約50mg、約5mg至約45mg、約10mg至約40mg、約15mg至約35mg、約20mg至約30mg、約23mg至約28mg、約50mg至約150mg、約60mg至約140mg、約70mg至約130mg、約80mg至約120mg、約90mg至約110mg、或約95mg至約105mg、約98mg至約102mg、約150mg至約250mg、約160mg至約240mg、約170mg至約230mg、約180mg至約220mg、約190mg至約210mg、約195mg至約205mg、或約198至約207mg。
該TIL之有效量可藉由任何可接受之投予具有類似用途之藥劑的模式在單一劑量或數個劑量中投予，包括經由鼻內和經皮途徑、藉由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、胃腸道外、肌肉內、皮下、局部、藉由移植、或藉由吸入投予。
實施例
現在參考下列實施例說明本文所涵蓋之實施態樣。所提供之這些實施例僅用於說明目的且本文所涵蓋 之揭示內容絕不應被解釋受限於這些實施例，而應被解釋為涵蓋任何和所有變型，這些變型可由本文所提供之教示內容而變得顯明。
實施例1-使用PBMC餵養細胞擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞的變化性
使用PBMC餵養細胞擴增TIL的變化性可藉由比較在來自一個患者之相同TIL株上進行的多次TIL擴增之結果證明。第1圖說明使用經放射照射之同種異體PBMC餵養細胞(PBMC餵養細胞)快速擴增TIL之典型結果。將二個標記之TIL株M1015T和M1016T(1.3×105細胞)與46種不同之經放射照射之餵養細胞批次(1.3×107)、IL-2(3000IU/mL，重組人IL-2(例如阿地介白素藥物或等同物)，CellGenix公司，美國新罕布什州樸次茅斯)和OKT-3(30ng/mL，MACS GMP純CD3，Miltenyi Biotec公司，德國Bergisch Gladbach)在T25培養瓶中共同培養7天。在第7天計算TIL之擴增倍數值。該圖形顯示該二個TIL株在不同之刺激實驗中的擴增倍數值。在各TIL株方面，對46種不同之PBMC餵養細胞批次進行測試。各TIL株之結果的範圍超過100倍，突顯出使用PBMC餵養細胞擴增之結果的變化性。與PBMC餵養細胞相比較，本發明之aAPC可降低進行擴增時之變化性並提供其他優點，諸如下列實施例中所示者。
實施例2-選擇用於發展aAPC之髓樣細胞
在各種髓樣譜系細胞株上決定表型特徵，以鑑定用於進一步修飾成用於擴增TIL之aAPC的可能候選物。結果總結於表5中。該MOLM-14細胞株顯現出內源性表現CD64且被選定用於進一步發展。EM-3細胞株之選擇係基於對內源性表現ICOS-L的觀察(EM-2細胞株未被觀察到內源性表現ICOS-L，儘管係採自同一患者)。
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實施例3-MOLM-14人造抗原呈現細胞(aMOLM-14 aAPC)之製備方法
從萊布尼茨學院DSMZ-德意志微生物保藏中心(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)取得MOLM-14細胞。為了發展基於MOLM-14之aAPC，以共刺激分子CD86和4-1BBL(CD137L)將MOLM-14細胞工程化。將人 CD86(hCD86)和人4-1BBL(h4-1BBL)基因選殖入市售之PLV430G並使用慢病毒轉導方法與PDONR221載體(Invitrogen公司/Thermo Fisher科技公司，美國加州Carlsbad)共同轉染。依Katzen,Expert Opin.Drug Disc. 2007, 4,571-589中之描述使用高通量基因選殖法(gateway cloning method)將hCD86和hCD137L基因選殖在PLV430G和PDONR221載體上。使用293T細胞株(以大T抗原轉化之人胚胎腎細胞)來產生慢病毒，轉導入MOLM-14細胞中。使用與APC軛合之CD86和與PE軛合之CD137L分選(S3e細胞分選儀，Bio-Rad公司，美國加州Hercules)經轉染之細胞以分離並富集細胞。藉由流式細胞術檢查富集之細胞的純度。
用於選殖之載體和及其部分描繪於第2圖至第11圖，各載體之核苷酸序列列於表6中。該pLV430G人4-1BBL載體說明於第2圖中，該聚合酶鏈反應產物(PCRP)部分顯示於第3圖中。該pLV430G人CD86載體說明於第4圖中，該PCRP部分顯示於第5圖中。該pDONR221人CD86供體和人4-1BBL供體載體分別顯示於第6圖和第7圖中。用於高通量基因選殖法之空pLV430G目的載體和空pDONR221供體載體分別顯示於第8圖和第9圖中。第10圖和第11圖說明用於產生慢病毒之psPAX2和pCIGO-VSV.G輔助質粒之載體圖。
Figure 106137461-A0202-12-0157-6
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使用流式細胞術(Canto II流式細胞儀，Becton,Dickinson,and Co.，美國紐澤西州Franklin Lakes)確認工程化之MOLM-14 aAPC(本文中亦稱為aMOLM14 aAPC)上之CD86和4-1BBL的表現，結果顯示於第12圖中。將aMOLM-14 aAPC在100Gy下進行γ放射照射並冷凍之。
實施例4-使用MOLM-14人造抗原呈現細胞擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞
將工程化MOLM-14細胞在100Gy下進行γ放射照射，再將其與TIL共同培養。經由將TIL與經放射照射之工程化MOLM-14細胞以1：100之比例在含有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)之CM2培養基中培養14天以起始REP。在收穫REP時，測量TIL擴增率、激活和分化階段標記物之表型、代謝率、細胞毒性及重新快速擴增方案(re-REP)分析。
結果顯示於第13圖、第14圖、第15圖及第16圖中，其中比較二組患者TIL的二次擴增。以CD86/4-1BBL修飾之MOLM-14細胞(標記為“TIL+工程化MOLM-14+OKT3”)取得之結果與以PBMC餵養細胞(標記為“TIL+餵養細胞+OKT3”)取得之結果。
第17圖中比較第14天之結果，其中顯示來自另外二個患者TIL之結果。結果表明與同種異體餵養細胞相比較時，該經CD86和4-1BBL工程化之MOLM-14細胞在快速擴增方案中顯示出類似之TIL擴增。然而，與親本MOLM-14一起培養之TIL未擴增。
此外，當使用BRLA(其詳細描述於實施例9中)測量時，對MOLM-14擴增之TIL保持TIL表型並顯示出殺死P815細胞之潛力。簡單地說，將經螢光素-轉導之P815靶細胞和所欲之TIL在有和無抗CD3之存在下共同培養以測定TIL之腫瘤反應性是否係透過TCR激活(特異性滅殺)或為非特異性滅殺。培育4小時後，在孔中加入螢光素並培育5分鐘。培育後，使用光度計讀取生物發光強度。使用下式計算細胞毒性百分比和存活百分比：%存活=(實驗存活-最小)/(最大信號-最小信號)×100或%細胞毒性=100-(%存活)。
第18圖顯示以低比率之TIL對MOLM-14 aAPC比進行擴增的結果與以PBMC餵養細胞進行擴增之結果的比較。以不同之TIL對aAPC或PBMC之比例(分別為1：10、1：30和1：100，以“10”、“30”、和“100”表示)將TIL(2×104)與親本MOLM-14(“MOLM14”)細胞、經轉導以表現CD86和4-1BBL之MOLM-14細胞(“aMOLM14”)或PBMC餵養細胞(“PBMC+”)在各具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)的24孔G-Rex盤中一起培養。使用僅具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)(“PBMC-”)者作為對照組。每 一種條件均以一式三份培養。在第4及7天以新鮮培養基和IL-2餵養培養物。在第7天計算活細胞數。第18圖顯示出在第11天計算之存活細胞數的平均值加標準差(SD)，藉由學生t檢驗計算p-值。使用單獨之TIL、單獨之PBMC和單獨之aMOLM-14細胞進行另外之對照實驗，所有這些均導致不可檢測之細胞數目(數據未顯示)。該結果顯示出當與具有OKT-3和IL-2之PBMC餵養細胞相比較，具有OKT-3和IL-2之比例為1：100之TIL：aMOLM-14的培養物可產生類似之擴增(p=0.0598)。
第19圖顯示以高比率之TIL對MOLM-14 aAPC，而其他部分依上文中關於第18圖之描述進行擴增的結果與以PBMC餵養細胞進行擴增之結果的比較。在1：300之比例下，具有OKT-3和IL-2之CD86/4-1BBL修飾的MOLM-14 aAPC效力顯著優於具有OKT-3和IL-2之PBMC餵養細胞。第20圖和第21圖顯示在重複實驗中使用不同批次之TIL驗證這些結果。尤其是，如第21圖所示，比例為1：200之TIL：aMOLM-14顯示出與相同條件下之PBMC餵養細胞相比較，其TIL擴增增加。這些結果證實在擴增TIL數目時，aMOLM-14 aAPC出乎意料地優於PBMC，特別是當使用比例為1：200至1：300之TIL：aMOLM-14時。
在第22圖及第23圖中，藉由流式細胞術分析來比較以aMOLM-14或PBMC擴增之TIL，以確認TIL顯示出類似之表型且預期該TIL被重新輸入患者體內時具類似效能。簡單地說，首先以L/D Aqua將TIL染色以確定存活 力。接著以TCR α/β PE-Cy7、CD4 FITC、CD8 PB、CD56 APC、CD28PE、CD27 APC-C7和CD57-PerCP-Cy5.5將細胞表面染色。使用Canto II流式細胞儀(Becton,Dickinson,and Co.，美國紐澤西州Franklin Lakes)，根據前向光散射法(FSC)/側光散射法(SSC)藉由門控10,000至100,000個細胞來完成表型分析。藉由Cytobank軟體分析數據，以創建旭日圖和SPADE(密度標準化事件之生成樹級數分析(Spanning Tree Progression of Density Normalized Event))。門控之設置係基於螢光減一(FMO)對照組。當與PBMC餵養細胞相比較時，對aMOLM-14擴增之TIL增加CD8+ TIL。不受理論之束縛，此增加之CD8+ TIL百分比可能係由於存有4-1BBL工程化之MOLM14。CD28、CD57和CD27分化標記物之表現沒有差異。另外之流式細胞術數據顯示於第24圖中且描繪出流式細胞術等高線圖，此等高線圖顯示在活TCR α/β+、CD4+或CD8+ TIL上門控之記憶子集(CD45RA+/-，CCR7+/-)，其指出以PBMC餵養細胞取得之記憶子集係由aMOLM-14 aAPC複製。
使用CD3+細胞，以aMOLM-14 aAPC或PBMC餵養細胞擴增之TIL的CD4和CD8 SPADE樹顯示於第25圖和第26圖中。顏色梯度與LAG-3、TIL3、PD1和CD137或CD69、CD154、KLRG1和TIGIT之平均螢光強度(MFI)成比例。不受理論約束，結果顯示出對aMOLM14擴增的二個TIL批次經歷激活，但aMOLM-14 aAPC和PBMC 餵養細胞的MFI之間沒有差異，這表明aMOLM-14 aAPC有效地複製以PBMC餵養細胞取得之TIL表型結果。
亦分析針對aMOLM-14或PBMC擴增之TIL的代謝變化形廓。使用雙粒線體糖酵解壓力試驗測量以經放射照射之PBMC餵養細胞或aMOLM-14 aAPC擴增後之TIL的耗氧率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)。簡單地說，將細胞在分析培養基(XF分析培養基，Agilent Technologies，美國加州聖克拉拉)中洗滌，該分析培養基係輔以10mM葡萄糖、1mM丙酮酸鈉和2mM L-麩胺醯胺，pH 7.4，然後將1×105個活細胞平皿接種在塗覆黏合劑(Cell-TakTM，Corning)之XFp微量細胞培養盤上。旋轉微量細胞培養盤以使細胞黏附在盤上，然後在37℃，加濕之非CO2培養箱中平衡，再分析細胞代謝物。使用Seahorse XFp分析儀(Agilent Technologies，美國加州聖克拉拉)進行粒線體和糖酵解壓力測試實驗，在具體指定之時間間隔依序注射下列化合物以同時分析細胞之粒線體和糖酵解呼吸：1μM寡黴素；0.5μM FCCP；50mM 2-脫氧葡萄糖；和各為0.5μM之魚藤酮和抗黴素A。使用WAVE v2.3.0軟體(Agilent Technologies，美國加州聖克拉拉)和GraphPad Prism v6.07繪圖軟體分析結果並顯示於第27圖和第28圖中，其中之點代表以一式三份測量之平均值±SEM。以aMOLM-14 aAPC和PBMC餵養細胞生長的二種TIL顯示出類似之氧化磷酸化和糖酵解行為。該數據表明當與PBMC餵養細胞相比較，aMOLM-14不會改變TIL之代謝進程。
實施例5-EM-3人造抗原呈現細胞(aEM3 aAPC)之製備方法
從Creative Bioarray公司(Shirley，美國紐約)取得EM-3細胞。為了發展基於EM-3之人造APC，以CD86、4-1BBL和針對IgG Fc區之抗體(選殖株7C12或選殖株8B3)將EM-3細胞株工程化。將人CD86和人4-1BBL/CD137基因選殖入市售之PLV430G並使用慢病毒轉導法與PDONR221載體(Invitrogen)共同轉染。依Katzen,Expert Opin.Drug Disc. 2007, 4,571-589中之描述，使用高通量基因選殖法將hCD86和hCD137L基因選殖在PLV430G和PDONR221載體上。使用293T細胞株生產慢病毒並轉導入EM-3細胞株。使用與APC軛合之CD86和與PE軛合之CD137L分選(S3e細胞分選儀，BioRad公司，美國加州Hercule)經轉染之細胞以分離和富集該細胞。藉由流式細胞術檢查該富集之細胞的純度。針對小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b之Fc(Viva Biotech有限公司，美國伊利諾州芝加等)產生定名為7C12和8B3之單鏈Fv(scFv)抗體選殖株。這些scFv選殖株之胺基酸序列列於表7中(SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28)。對OKT-3篩選所產生之scFv選殖株之Fc結合效率，對含有作為共同報告子之eGFP的pLV4301G工程化處理以產生慢病毒。使用293T細胞株來包裝和產生慢病毒。使用慢病毒系統轉導工程化EM-3(CD86/CD137L)細胞並使用eGFP分選。藉由流式細胞術定期評估EM37C12CD86CD137L和EM38B3CD86CD137L各 個經轉導之分子的一貫表現。
Figure 106137461-A0202-12-0177-21
用於製備aEM3 aAPC之非限制性方案(其亦可適用於與aMOLM-14 aAPC一起使用)描述於下列段落中。
所欲質粒之分子選殖可依下述進行。為了產生DONR載體可使用下列混合物：鄰接B位點之PCR產物或目的載體(例如適於高通量之慢病毒載體)50-100μg；DONR載體(例如pDONR222)50-100μg；BR選殖酶II(Life Technologies)1μL；和TE緩衝液(1mM Tris、0.1mM EDTA，pH 8.0，適量，以使體積達到5μL)。在室溫下培育至少1小時。培育後，藉由熱休克方法或電穿孔進行細菌轉化。為了產生目的載體，可使用下列混合物：重組之pDONR載體(例如pDON222-基因X)50-100μg、目的載體(例如適於高通量之慢病毒載體)50-100μg、LR選殖酶II(Life Technologies)1μL和TE緩衝液(1mM Tris、0.1mM EDTA，pH 8.0，適量，以使體積達到5μL)。在室溫下培育至少1小時。培育後，藉由化學感受態轉化/熱休克法進行細菌轉化。
選殖之質粒的轉化和選擇可依下述進行。化學感受態轉化法可依下述進行。製備具有用於選擇之抗生素的營養瓊脂盤(LB-Lennox或YT)。確保可輕易取得室溫 之恢復培養基(由Lucigen提供，美國威斯康辛州Middleton)。視需要地，可將無菌培養管(例如17mm×100mm管(14mL管)，每個轉化反應一個管)在冰上冷卻。從-80℃冷凍庫中取出E.cloni細胞(Lucigen)並在濕冰上解凍完全(5-15分鐘)。視需要地，在冷卻之培養管中添加40μL之E.cloni細胞。在該40μL之細胞中添加1-4μL之DNA樣品。以手指輕打(不使用移液管上下混合，如此可能引入氣泡並使細胞加溫)。將該細胞/DNA混合物在冰上培育30分鐘。經由將該培養管置於42℃水浴中45秒來將細胞熱休克。將該1.7mL管或培養管返回冰上2分鐘。將350μL之室溫的恢復培養基加至該細胞或將960μL之室溫的恢復培養基加至培養管中的細胞。將說管放置在37℃，250rpm下之搖動培養箱中1小時。將100%之轉化混合物平皿接種在含有適當抗生素之LB-Lennox或YT瓊脂盤上。平皿接種之體積可能需要根據DNA進行優化。將該培養盤在37℃下培育過夜。轉化之選殖株可進一步在任何豐富培養基(例如LB或TB)中生長。
用於Miniprep之株落(Qiagen公司，美國加州Valencia)可依下述生長。將回收之DNA操作(例如LR反應)的轉化反應物平皿接種後，在形成株落後，在所需數目之具有被刺破蓋子的2mL Eppendorf微管中添加1mL所欲之TB/抗生素。使用ART LTS 20μL軟微量吸管尖端(VWR 89031-352)或10μL Denville尖端挑出所需之菌落數。將吸管尖端放置在具有被刺破之蓋子的2mL Eppendorf微管 中。切割該尖端以使其與管子相合，蓋上帽子並將管子置於搖動器上(具VWR牌15mL管子之紫色15mL管架。在225rpm/37℃搖動過夜(不超過16小時)。隔夜培育後，將各尖端置於來自Denville之ClavePak 96盤中的1mL管內，該管內具有無菌水(以在篩選和選擇質粒後保留該尖端以用於製造細菌原液)。根據Qiagen Mini prep套組方案(Qiagen公司，美國加州Valencia)進行Miniprep。一旦洗提出該質粒，進行限制性分解以選擇正確之選殖株。選擇質粒後，使用從相同質粒選殖株保留之尖端來生長具有該質粒之大腸桿菌(E.coli)，以製造細菌原液。
慢病毒生產可依下述實施。製備下列培養基組成物：500mL DMEM/F12(Sigma公司)；25mL經熱滅活之FBS(HI)(Hyclone)；10mM HEPES(Life Technologies)；1X Primocin(Invivogen)；1X Plasmocin(Invivogen)；和1X 2-巰基乙醇(Life Technologies)。收穫含有90%匯合之293T細胞的T75培養瓶(Thermo Fisher科技)。吸出培養基。加入10mL PBS，輕輕沖洗並吸除。添加2mL TrypLE Express(Life Technologies)並將其均勻地分佈在該細胞層上，在37℃下靜置3-5分鐘(細胞培養箱)。加入10mL培養基並藉由上下移液來分散細胞。若有多個培養瓶則將其合併。計算細胞數。若使用血細胞計數器來測定濃度，細胞/mL=(#計算之細胞×稀釋倍數×104)。為了分裂細胞以返回T75培養瓶中，決定該細胞達到充分匯合所需要之時間並據此稀釋。(細胞每16-18小時倍增成雙倍，因此3天=1/27 稀釋)。一般而言，可使用每天2.5之倍增因子，其中細胞匯合時為2×105個細胞/cm2。使體積達到25mL之培養基。為了接種該原液滴定液，分析每個孔需要在0.4mL培養基中包含5×104個細胞。將293T細胞在培養基中調整成2×104/mL。在24孔盤的每個孔中接種1mL。例如，週一接種之細胞可能在週二被感染，並在週五時在流式細胞儀上運行，而週四接種之細胞係在週五被感染，並在週一時在流式細胞儀上運行。為了接種以供用於包裝轉染，在轉染前一天，以6.8×106個細胞接種T75培養瓶或在轉染當天早晨以1.7×106個細胞接種T75培養瓶。(在轉染當天接種可減少轉染效率之變化)。以培養基使培養瓶之體積達到25mL。例如，在週一設立之培養瓶在週二被轉染，並在週四和週五收集病毒。在某些情況下(例如高滴定構建體)，可省略第二次收集。為了包裝慢病毒載體，每一T75培養瓶轉染需要2μg之Baculo p35質粒(可選擇的；僅在若包裝死亡基因時有必要)、2μg之VSV.G env質粒(例如pMD2.G或PCIGO VSV-G)；4.7μg之Gag/聚合酶質粒(例如psPAX2或pCMV-δR8.91)和2.3μg之上述的慢病毒載體。決定所有樣品所需之VSV和R8.2/9.1(+/-Baculo)質粒的量(若製備許多樣品則製造這些DNA的混合物)。各T75轉染需要90μL在2mL Opti-MEM培養基(Thermo Fisher科技)中之LipofectAmine 2000(Thermo Fisher科技)。製造含有足夠用於所有樣品之Opti-MEM和LipofectAmine 2000的混合物。輕輕混合並將其在室溫下靜置5分鐘，且標記為管A。在 每次轉染方面，在微管中之500μL室溫Opti-MEM培養基中添加包裝DNA和特定之慢病毒載體DNA並混合之，且標記為管B。將500μL來自管B之DNA加入管A中之2mL LipofectAmine 2000混合物中並輕輕混合，在室溫下培育20-30分鐘。從包裝培養瓶中吸出培養基。在5mL之Opti-MEM培養基中添加2.5mL之DNA/Lipofectamine複合物，並加入細胞中(不要在細胞上直接移液混合，因為293T細胞僅半黏附)。將盤分成幾個小組處理以避免乾燥。培育過夜並在第二天早晨更換培養基。更換培養基後24小時收集上清液。上清液可在轉染後48小時在單次收集中收穫，或在轉染後48和72小時在2次收集中收穫(在這種情況下，將收穫物合併)。若需要收集二次，在第一天藉由移液管收集上清液，並更換20mL之新鮮培養基。為了避免培養瓶乾燥，每次只操作5個培養瓶。將收集之上清液保持在4℃下直至第二天將其匯集。第二天再次將上清液冷卻並依適當情況匯集。將上清液在2000rpm下旋轉5分鐘以將任何沾染之293T細胞沉澱下。將收穫之上清液通過含有預先過濾片之0.45μm或0.8μm過濾器單位過濾。使用足夠大之過濾單位以使過濾速度相當快。儲存於4℃，直到準備濃縮。
病毒可使用PEG-it法(System Biosciences公司，Palo Alto,CA 94303)濃縮以供長期儲存在-80℃下。收集來自該轉染盤之上清液。將上清液中之細胞碎片旋轉沈澱下。亦可過濾上清液以完全除去任何包裝細胞。在上清液中添加等於上清液體積的四分之一的PEG-it溶液量。 將懸浮液在4℃下培育過夜。在4℃，3500rpm(1500g)下離心30分鐘。除去剩之上清液，並在4℃，3500rpm下離心5分鐘。除去剩餘之上清液。將病毒重新懸浮在所需量之磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中，並將等分試樣冷凍在-80℃。
使用慢病毒轉導細胞株可依下述實施。將欲轉導之細胞調整成：在24孔盤中，每孔1×106個懸浮細胞(每次轉導1個孔)，或在24孔盤中之黏附細胞為50%匯合(每次轉導1個孔)。在懸浮之細胞方面，將細胞濃度調整為1×107/mL，並在24孔盤的每個孔中接種100μL(每次轉導1個孔)。在黏附細胞方面，基於細胞/cm2接種以在轉導當天達到50%匯合(例如，在293T細胞方面，匯合=2×105/cm2)。每孔之轉導總體積應為約500μL，其中具有3-10μg/mL聚凝胺(Polybrene)(海美溴銨(Hexadimethrine bromide)，Sigma-Aldrich，美國密蘇里州聖路易斯)。添加之濃縮病毒的量將取決於所需之MOI(感染複數)。典型之MOI為10：1，但這可能根據細胞類型而變化。該轉染孔應含有100μL之標準培養基，該100μL之標準培養基中含有1×106個懸浮細胞或50%匯合細胞。在MOI為10：1方面(例如病毒活性為1×108IU/mL且目標為感染1×106細胞，則需要1×107個病毒粒子或100μL之病毒)。添加標準培養基以達到500μL。添加聚凝胺達3μg/mL(初代細胞)至10μg/mL(腫瘤細胞株)。在30℃，1800rpm下將盤旋轉1.5至2小時。使用組織培養箱，將盤在37℃/5%CO2培育5小時至隔夜。更換培養基。轉導72小時後，若取得足夠之細胞， 進行流式細胞術分析以測試轉導效率。
aAPC之分選可下述實施。將細胞在上述培養基中培養，直至細胞計數達到最少1000至2000萬個。每種條件取1×106個細胞並以用於該經轉導之蛋白質的抗體染色。洗滌該細胞並藉由流式細胞術分析，以測試轉導之穩定性。一旦已分析並確認所欲之蛋白質的表現，準備剩餘之細胞以用於分選。在S3分選機中藉由所欲標記物上之門控分選細胞。使用如上述之培養基培養該經分選之細胞。在冷凍小瓶之前，測試所欲之蛋白表現的穩定性。使用回收之細胞培養的冷凍培養基(Invitrogen)來製造該相同細胞之細胞庫。在每次轉導和分選程序之後可將細胞存入集合庫。
7C12和8B3 scFv選殖株之核苷酸序列信息(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30)及其慢病毒載體列於表8中。提供之用於產生pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 flag載體之序列為SED IQ NO：31至SEQ ID NO：34且描述於第29圖至第32圖中。提供之用於產生pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 flag載體之序列為SEQ ID NO：35至SEQ ID NO：38且描述於第33圖至第36圖中。
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Figure 106137461-A0202-12-0184-23
Figure 106137461-A0202-12-0185-24
Figure 106137461-A0202-12-0186-25
Figure 106137461-A0202-12-0187-26
Figure 106137461-A0202-12-0188-27
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用於本文所描述之實驗的工程化EM-3 aAPC(本文中亦稱為aEM3 aAPC)的製備方法中，CD86和4-1BBL之表現係使用流式細胞儀(Canto II流式細胞儀，Becton,Dickinson,and Co.，美國紐澤西州Franklin Lakes)確認，結果顯示於第37圖中。將aEM3 aAPC在100Gy下進行γ放射照射並冷凍之。
使用類似之慢病毒轉導方法，以共刺激性人OX-40L將如上述之經預先轉導以表現CD86，抗IgG Fc區之抗體，和4-1BBL(或可選擇地無4-1BBL)的aEM-3細胞進行基因工程處理。為了產生含有人OX-40L之慢病毒，使用PolyJet(Signagen實驗室，美國馬利蘭州Rockville)將pLenti-C-Myc-DDK OX40L(PS100064，Origene公司，SEQ ID NO：39，第90圖)載體與VSV-G外套質粒(pCIGO-VSV.G)共同轉染入Phoenix-GP(ATCC CRL-3215)細胞株中。60小時後收穫上清液並使用具有Ultracel-100膜之Amicon Ultra-15離心過濾裝置濃縮之。然後，以濃縮之慢病毒感染aEM-3細胞並進一步擴增5天。以與PE軛合之抗人OX40L、與Brilliant Violet 421軛合之抗人CD137L(若先前之aEM-3細胞包含4-1BBL)及與PE/Cy7軛合之抗人CD86將細胞染色，並基於GFP、OX40L、CD137L(當包含在內 時)和CD86之表現使用S3e細胞分選儀(Bio-Rad公司，美國加州Hercules)分選。使用流式細胞術進一步驗證分選之細胞的純度。藉由流式細胞術檢查經富集之細胞的純度。
實施例6-使用EM-3人造抗原呈現細胞擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞
進行實驗以測試EM-3 aAPC(aEM3)擴增TIL之能力。將TIL與aEM3(7C12或8B3)以1：100之比例共同培養，並添加OKT-3(30mg/mL)和IL-2(3000IU/mL)。第11天和第14天計算細胞之數目。二批TIL之結果繪製於第38圖和第39圖中。此外，將TIL與aEM3或PBMC餵養細胞以1：100之比例共同培養，並添加IL-2(3000IU/mL)，加上或不加上OKT-3(30mg/mL)。結果繪製於第40圖中，其中該條狀圖顯示出在第11天測定之細胞數。
第41圖說明在不同之TIL：aAPC比例下以EM-3 aAPC(aEM3)擴增TIL之結果。結果顯示出aEM3 aAPC之性能與PBMC相當，且在一些情況下比PBMC更好，特別是在1：200之比例下培養較長的時間(14天)。
第42圖說明與PBMC餵養細胞相比較，以EM-3 aAPC(aEM3)擴增之TIL之細胞計數的變異性低。將TIL(2×104)與5個不同之PBMC餵養細胞批次或aEM3(一式三份)在G-Rex 24孔盤中以1：100之比例共同培養並添加IL-2(3000IU/mL)。該圖形顯示出在第14天計算之存活細胞數(平均值)，置信區間95%。第43圖比較以EM-3 aAPC 和MOLM-14 aAPC擴增TIL之結果以說明將TIL(2×104)在G-Rex 24孔盤中以1：100之比例與5個不同之PBMC餵養細胞批次或aMOLM-14(一式三份)或aEM3(一式三份)共同培養並添加IL-2(3000IU/mL)時，aEM3和aMOLM-14二者之細胞計數的可變性。在第14天計算活細胞數，該圖形顯示出存活細胞數(平均值)，置信區間95%。aEM3和aMOLM-14之結果表明與現有技藝中之較佳的PBMC餵養細胞法相比較，使用該二種aAPC可取得較高之一致性。
採用對aEM3或PBMC餵養細胞擴增之TIL，使用4個不同的小組(分化小組1和2，T細胞激活小組1和2)進行流式細胞分析。簡單地說，先以L/D Aqua將TIL染色以測定存活力。接著以4個不同的小組將細胞表面染色：用於分化小組1的為TCR α/β PE-Cy7、CD4 FITC、CD8 PB、CD56 APC、CD28 PE、CD27 APC-Cy7和CD57-PerCP-Cy5.5；用於分化小組2的為CD45RA PE-Cy7、CD8a PerCP/Cy5、CCR7 PE、CD4 FITC、CD3 APC-Cy7、CD38 APC和HLA-DR PB；用於T細胞激活小組1的為CD137 PE-Cy7、CD8a PerCP-Cy5.5、Lag-3 PE、CD4 FITC、CD3 APC-Cy7、PD1 APC和Tim-3 BV421；或用於T細胞激活小組2的為CD69 PE-Cy7、CD8a PerCP/Cy5.5、TIGIT PE、CD4 FITC、CD3 APC-Cy7、KLRG1 ALEXA 647和CD154 BV421。使用Canto II流式細胞儀，根據FSC/SSC藉由門控10,000至100,000個細胞來完成表型分析。使用Cytobank軟體(Cytobank公司，美國加州聖克拉拉)分析數 據以創建旭日圖和SPADE(密度標準化事件之生成樹級數分析)繪圖。門控之設置係基於螢光減一(FMO)對照組。SPADE繪圖係以一組細胞產生，其特徵在於基於表面標記物之表現水準的相關節點之形式。CD4+和CD8+ TIL亞群係基於CD3+門控測定並產生樹狀圖。第44圖和第45圖中顯示可視化之旭日圖。第44圖顯示與針對PBMC餵養細胞擴增之相同TIL相比較，針對aEM3 aAPC擴增之TIL維持CD8+表型。第45圖顯示出來自不同患者之對aEM3 aAPC擴增的第二批TIL之結果，其中可見到與使用PBMC餵養細胞(25%)擴增相比較，CD8+細胞明顯增加(65.6%)。
以使用CD3+細胞之aEM3 aAPC或PBMC餵養細胞擴增之TIL的CD4和CD8 SPADE樹顯示在第46圖和第47圖中。顏色梯度與LAG3、TIL3、PD1和CD137或CD69、CD154、KLRG1和TIGIT之平均螢光強度(MFI)成正比。不受理論約束，結果顯示以aEM3 aAPC擴增之TIL經歷激活，但aEM3 aAPC和PBMC餵養細胞的MFI之間沒有差異，這表明aEM3 aAPC有效地複製以PBMC餵養細胞取得之TIL表型結果。
與PBMC餵養細胞相比較，亦評估以aEM3 aAPC擴增之TIL的備用耗氧能力(SRC)和糖酵解保留率，結果顯示於第48圖和第49圖中。海馬細胞外流量細胞粒線體壓力試驗(Seahorse XF Cell Mito Stress Test)使用靶向粒線體中之電子傳遞鏈的組分之呼吸調節劑藉由直接測量細胞之耗氧率(OCR)來測量粒線體功能。連續注射測試化合 物(寡黴素、FCCP及魚藤酮和抗黴素A之混合物，如下述)以分別測量ATP產量、最大呼吸和非粒線體呼吸。然後利用這些參數和基礎呼吸計算質子漏和備用耗氧能力。各調節劑靶向電子傳遞鏈之特定組分。寡黴素抑制ATP合成酶(複合物V)，而在注射寡黴素後之OCR降低與粒線體呼吸關聯，該粒線體呼吸與細胞ATP產生有關。羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)為一種解偶聯劑，其瓦解質子梯度並破壞粒線體膜電位。結果，通過電子傳遞鏈之電子流未受抑制且氧被複合物IV最大限度地消耗。然後，可使用受FCCP刺激之OCR來計算備用耗氧能力，其被定義為最大呼吸和基礎呼吸之間的差異。備用耗氧能力(SRC)為細胞對能源需求增加而作出反應之能力的度量。第三次注射的為魚藤酮(複合物I抑制劑)和抗黴素A(複合物III抑制劑)之混合物。該組合關閉粒線體呼吸，因而能夠計算由粒線體外之過程驅動的非粒線體呼吸。
第50圖說明對PBMC餵養細胞或aEM3 aAPC擴增之活TIL的粒線體染色。Mito Tracker染料將活細胞中之粒線體染色且其積累係取決於膜電位。以L/D Aqua將對PBMC餵養細胞或aEM3 aAPC擴增之TIL染色，接著以Mito Tracker red染色。數據顯示出Mito Tracker陽性(MFI)細胞在活細胞群上被門控。
實施例7-比較工程化MOLM-14(aMOLM14)和EM-3(aEM3)aAPC
使用用於細胞毒性效力之BRLA評估如先前實施例中所描述之以PBMC餵養細胞及aMOLM-14和aEM3 aAPC擴增之TIL的功能活性。P815 BRLA詳細描述於實施例9中。結果顯示於第51圖和第52圖中，並顯示出以aAPC擴增之TIL具有與以PBMC餵養細胞擴增者類似之功能特性(和預期之臨床效力)。
亦評估如上述之以PBMC餵養細胞及aMOLM-14和aEM3 aAPC擴增之TIL在以塗覆抗CD3/CD28/4-1BB之微珠刺激一整夜後所釋出之IFN-γ和所釋出之粒酶B。IFN-γ釋出結果顯示於第53圖和第54圖中，粒酶B釋出結果顯示於第55圖和第56圖中。相對於以PBMC餵養細胞擴增者，以aEM3 aAPC擴增之TIL被觀察到IFN-γ釋出和粒酶B釋出顯著且令人驚訝地增加，但以aMOLM-14 aAPC擴增之TIL則不。不受理論之束縛，這表明與aEM3 aAPC一起培養之TIL在體內作為癌症療法可能更具活性。所觀察到之其他差異大多並非統計上有意義的。
以aEM3和aMOLM-14 aAPC擴增TIL之結果總結於表9中。
Figure 106137461-A0202-12-0204-38
實施例8-用於aEM3和aMOLM-14 aAPC之主細胞庫的製備方法
aEM3和aMOLM-14 aAPC可生長在下列培養基組成物中以產生主細胞庫，該主細胞庫可在下列培養基中進一步生長以供應aAPC：500mL之Dulbecco氏改良之Eagle培養基DMEM/F12(Sigma-Aldrich公司，美國密蘇里州聖路易)、50mL之經熱滅活(HI)的胎牛血清(FBS)(Hyclone)；10mM之4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES緩衝液)(Life Technologies)；1X Primocin(Invivogen)；1X Plasmocin(Invivogen)和1X 2-巰基乙醇(Life Technologies)。
本文所描述之aAPC(包括aEM3和aMOLM-14 aAPC)亦可使用本技藝已知之任何用於生長細胞的適當方法從主細胞庫生長。於一實施態樣中，將aAPC解凍，然 後藉由將飽和之培養物分裂成2至3份在80-90% RPMI 1640+10-20% h.i.FBS(胎牛血清)的培養基中擴增，每2-3天以約0.5-1×106細胞/mL之密度將細胞接種在24孔盤中，在37℃和5% CO2下培育，並保持在約0.5-1.5×106細胞/mL。
其他可採用之利用本發明之某些實施態樣的aAPC來產生人類療法的步驟為本技藝所已知且包括細胞株表徵(HLA高解析分類)；細胞因子釋出測試；用於替代FBS來生長aAPC之人血清的試驗；測試冷凍培養基以冷凍aAPC；主細胞庫存(包括原料測試和穩定性測試)；放射照射標準化(包括照射劑量(1000、3000、5000、10000、15000rad)、新鮮對冷凍aAPC，及有/無TIL)；aAPC之穩定性；發展面板以評估aAPC之污染；發展分子生物學分析(qPCR、DNA測序)；測試來自不同腫瘤類型，包括黑色素瘤、子宮頸癌及頭頸癌之TIL的擴增(使用G-Rex 5M)；效力、純度和同一性測試；黴漿菌和無菌分析；微生物測試(USP/EP無菌性、生物負載和內毒素分析)；和外來病毒性病原測試。
實施例9-擴增TIL和以擴增之TIL治療癌症之方法
TIL可採用本文所描述之任何擴增方法，使用本發明之某些實施態樣的aAPC(諸如aEM3和aMOLM-14 aAPC)擴增。例如，用於擴增TIL之方法描繪於第57圖中。使用aAPC擴增TIL可進一步與本文所描述之治療患者 之癌症的任何方法組合。第58圖顯示一種用於擴增TIL並以擴增之TIL治療患者的方法，其中該擴增係利用aAPC(包括aEM3和aMOLM-14 aAPC)。
實施例10-P815生物發光重定向之細胞溶解分析
本實施例描述發展替代之靶細胞株以評估TIL在生物發光重定向之細胞溶解分析(BRLA)中的細胞溶解潛力。BRLA能夠評估在無自體腫瘤細胞之存在下由T細胞介導之滅殺。細胞溶解活性之評估可接合及不接合該T細胞受體，在1至4小時中，評估接合該T細胞受體之T細胞滅殺，而無所謂之淋巴因子激活之殺手活性(LAK)。
表現內源性CD16 Fc受體之小鼠肥大細胞瘤P815細胞可與抗CD3ε(OKT-3)結合，提供有效之TCR激活信號作為靶細胞株。以基於eGFP和螢火蟲螢光素酶之慢病毒載體轉導P815選殖株G6，使用BD FACSAria II分選並選殖。使用Intellicyt iQue篩選器分析以基於eGFP強度來選擇選殖株G6。將所欲之靶細胞和TIL+/- OKT-3共同培養以分別評估TCR激活(特異性滅殺)或非特異性(淋巴因子激活之滅殺，LAK)。培育4小時後，在孔中添加螢火蟲螢光素((4S)-2-(6-羥基-1,3-苯並噻唑-2-基)-4,5-二氫噻唑-4-羧酸，可從多個來源購得)並培育5分鐘。使用光度計讀取生物發光強度。使用下列公式計算細胞毒性和存活百分比：%存活率=(實驗存活-最小值)/(最大信號-最小信號)×100；%細胞毒性=100-(%存活)。藉由ELISA分析在共同培養之 TIL的培養基上清液中之釋出的干擾素γ，並在流式細胞儀上分折TIL上之LAMP1(CD107a，選殖株eBioH4A3)表現以評估TIL之細胞毒性效力。
結果顯示於第59圖至第75圖中。第59圖說明在個別之效應子：靶的比例下，藉由BRLA評估之與P815選殖株G6共同培養(有和無抗CD3)之TIL批次M1033T-1的毒性百分比。第60圖說明酶聯免疫吸附分析(ELISA)數據，該數據顯示針對不同比率之效應子對靶細胞的比例釋出的IFN-γ量。第61圖說明在抗CD3之存在下，TIL批次M1033T-1與P815選殖株G6以1：1之效應子對靶細胞的比例共同培養4小時和24小時後由TIL批次M1033T-1表現之LAMP1(%)。
依第62圖所示，使用第二批TIL證實該結果，第62圖顯示TIL批次M1030之BRLA。藉由BRLA測得之細胞毒性(以LU50/1×106TIL測量)為26±16。第63圖說明TIL批次M1030之標準鉻釋出分析的結果。藉由鉻釋出分析測得之細胞毒性(以LU50/1×106TIL測量)為22。
使用第三批TIL進一步證實結果。第64圖說明藉由BRLA測得之TIL批次M1053的結果，該結果顯示藉由BRLA測得之TIL的細胞溶解單位為70±17。第65圖說明TIL批次M1053之標準鉻釋出分析的結果，該結果顯示藉由鉻釋出分析測得之TIL的細胞溶解單位為14±5。比較二種分析結果顯示出BRLA結果與鉻釋出分析結果的性能相當。
第66圖說明TIL之IFN-γ釋出和細胞毒性潛力之間的線性關係。第67圖說明IFN-γ之ELISpot結果。第68圖說明TIL批次M1053之酶促IFN-γ釋出。第69圖說明TIL批次M1030之酶促IFN-γ釋出。第70圖說明顯示出由M1053T和M1030T釋出之粒酶B的ELISpot數據。第71圖說明TIL批次M1053之酶促粒酶B釋出。第72圖說明TIL批次M1030之酶促粒酶B釋出。第73圖說明ELISpot數據，其顯示出由M1053T和M1030T釋出之TNF-α。第74圖說明TIL批次M1053之酶促TNF-α釋出。第75圖說明TIL批次M1030之酶促TNF-α釋出。第66圖至第76圖中之數據確認這些批次之TIL的效力，此亦藉由BRLA顯示。
總之，BRLA不需要放射性核素且與傳統細胞毒性分析一樣有效和敏感。在個別時間點藉由流式細胞術評估TIL上之Lamp1表現證明相對於藉由BRLA所顯示之效力的細胞毒性T細胞脫粒作用。BRLA顯示出與標準鉻釋出分析類似至更佳之效力。BRLA亦能評估TIL細胞溶解活性之效力。BRLA與鉻釋出分析之比較顯示出BRLA的效率和可靠性。BRLA與TIL釋出IFNγ具有線性關係。藉由ELISpot進行之IFN-γ、TNFα和粒酶B釋出分析與藉由BRLA評估之TIL的細胞毒性效力一致。
實施例11-用於將EM3細胞從FBS脫離而轉換到hAB血清的過程
為了避免反應性，有些細胞株可能需要從一 種培養基脫離而轉換到另一種培養基。本實施例中，將EM3細胞從FBS脫離而轉換到hAB血清以避免反應性。如第76圖中所示，aEM3細胞成功脫離FBS而轉換到hAB血清。
實施例12-冷凍培養基配方優化
為了冷凍貯存依本文之描述所培養之EM3細胞，將冷凍培養基配製劑之方法優化。如第77圖中所示，使用三種冷凍培養基並計算它們對細胞數目之影響。所使用之細胞培養基包括CryStor 10(Biolife Solutions(CS10))(A)、hAB[90%]和DMSO[10%](B)及具有DMSO[10%]和cDMEM2[70%]之hAB[20%](C)。第77圖證明人AB血清(90%)和DMSO(10%)之配製劑使EM3細胞之數目在恢復3天後意外增加。
實施例13-GREX培養瓶中之aEM3細胞的生長
將aEM3細胞在透氣性細胞培養瓶(即，GREX培養瓶(Wilson Wolf製造公司))中培養並在8天之期間內觀察對細胞倍增時間之影響。如第78圖所示，GREX培養瓶提供aEM3細胞之快速生長。
實施例14-測定aEM3細胞純度之流式面板分析
為了測定根據本文所描述之方法培養的細胞之純度，使用流式面板分析來測定aEM3 aAPC之純度。該 等分析之結果描述於第79圖和第80圖中。如第80圖所示，分選aEM3細胞群之前，aEM3 7C12和aEM3 8B5細胞分別為53.5%和43.2% eGFP+。分選後，細胞群中aEM3 7C12和aEM3 8B5細胞之eGFP+分別提高為96.8%和96.3%(第80圖)。
實施例15-作為PBMC餵養細胞之替代的aEM3餵養細胞
如本文所描述者，aEM3細胞可作為PBMC餵養細胞之替代，導致TIL擴增過程和所產生之TIL二者之意料外的不同性質。為了比較在細胞因子表現中之差異，藉由OKT-3處理來刺激PBMC和aEM3細胞。如第81圖中所示，與PBMC相比較，aEM3細胞表現出相當不同之細胞因子表現變化形廓。令人驚訝地，本發明之aEM3細胞提供有效之TIL(如此處所示)，不會再現與以傳統PBMC擴增之TIL相同的細胞因子分泌性質。
實施例16-以完全培養基和無血清培養基擴增之TIL之間的比較
為了優化TIL擴增方案，依本文之描述進行幾個TIL擴增實驗，但使用無血清培養基，而不使用完全培養基(CM1)。
於一實驗中，將組織片段在具有CM1或各種無血清培養基加上300IU/mL之IL-2的單孔中培養。然後，在開始REP之前第11天計算細胞數目。所使用之各種 無血清培養基包括Prime CDM(Irvine)、CTS Optimizer (ThermoFisher)和Xvivo-20(Lonza)。如第82圖所示，與CM1相比較，以CTS擴增之TIL(PreREP)的細胞數增加。
此外，以具有6000IU/mL之IL-2的CM1或各種無血清培養基培養組織片段直到第11天。然後，在第11天使用PBMC餵養細胞、OKT-3和IL-2起始REP，並在第16天將培養物分裂培養。然後，在第22天結束時終止培養。所使用之各種無血清培養基包括Prime CDM(Irvine)、CTS Optimizer(ThermoFisher)和Xvivo-20(Lonza)。如第83圖和第84圖所示，當分別在第11天和第22天計算細胞數目時，與CM1相比較，以Prime CDM擴增TIL(PreREP)時增加細胞數目。
實施例17-與基於血清之培養基相比較之無血清培養基中之aAPC的生長
為了優化aAPC生長並維持無血清存在時之方案，使用各種無血清培養基培養aEM3細胞。
依本文之描述使用一般細胞培養方案將aEM3細胞以每孔1×106個細胞之密度在24孔盤中培養3天，但有一組細胞被提供基於血清之培養基(cDMEM(10%hSerum))，而其他組細胞被提供無血清培養基。用於該研究之無血清培養基包括CTS OpTmizer(ThermoFisher)、Xvivo 20(Lonza)、Prime-TCDM(Irvine)和XFSM(MesenCult)培養基。然後，在第3天計算細胞數 目。
如第85圖所示，CTS OpTmizer和Prime-TCDM無血清培養基所提供之細胞生長與基於血清之培養基(即，cDMEM(10% hSerum))相當。因此，與基於血清之培養基相比較，無血清培養基為用於生長和維持aAPC的有效替代物。
實施例18-aAPC之繁殖、維持和冷凍保存
本實施例中提供用於製備和保存aAPC之程序。具體地說，繁殖並冷凍保存從命名為TIL-Rs3之細胞株取得之細胞aEM3。
aEM3細胞之解凍和恢復可使用下列非限制性程序來達成。將經冷凍保存之aEM3細胞在預溫熱之培養基(37℃)中緩慢地升溫，該培養基係從CTS OpTmizer基礎培養基(Thermo Fisher)、CTS OpTmizer細胞補充劑(Thermo Fisher)、慶大黴素(Lonza)和Glutamax(Life Technologies)製得。然後，將懸浮之細胞在4℃，1500rpm下離心5分鐘。將所得之上清液丟棄，並將剩餘之aEM3細胞再懸浮於前述之培養基中，然後接種之(在6孔盤中，每孔包含5×106個細胞/10mL)。
aEM3細胞之繁殖可使用下列非限制性程序來實現。製備透氣性細胞培養瓶(即，GREX 10培養瓶(Wilson Wolf製造公司))中之前述培養基的等分試樣。藉由離心(即，在4℃，1500rpm下5分鐘)洗滌該經平皿接種 之aEM3細胞，將細胞再懸浮在培養基中，並以1-2×106細胞/mL之細胞密度加入GREX培養瓶中。以30mL之培養基稀釋該aEM3細胞懸浮液，然後將該GREX培養瓶在37℃，CO2下培育3-4天。3-4天後，從培養箱中取出該GREX培養瓶並放置在生物安全櫃(BSC)內。藉由移液管從GREX培養瓶小心地提取該培養之aEM3細胞並將所得之提取液離心以提供增加之aEM3細胞數，該aEM3細胞可以每一GREX 10培養瓶中10-20×106細胞之細胞密度重新懸浮。
aEM3細胞之替代冷凍保存可使用下列非限制性程序來達成。從培養箱中取出前述之含有aEM3細胞的GREX 10培養瓶並放置在BSC中。使用移液管將該培養之aEM3細胞小心地從GREX培養瓶中提取，將所得之提取物離心以提供增加之aEM3細胞數，該aEM3細胞可再懸浮於CryStor 10(Biolife Solutions)之體積中，以在冷凍管中提供10-100×106個細胞/小瓶之濃度。可將該aEM3細胞懸浮液放置在冷凍容器中並轉移至-80℃冷凍庫。
實施例19-證明aEM3細胞在冷凍保存後快速恢復
根據實施例18中所提出之程序，使用CS-10冷凍保存培養基將來自TIL-R3細胞株之aEM3細胞(1-2×106個細胞)冷凍保存。然後，將該等細胞之小瓶解凍並計算細胞數。計算冷凍前、解凍後和解凍後3天(即，解凍後恢復)之細胞數目。如第86圖和第87圖所示，在二個獨立之實驗中，總活細胞計數在解凍後迅速恢復。
將TIL-R3細胞(1×106個細胞)解凍(解凍後第3天)並以0.5×106/cm2之密度平皿接種在24孔盤的每個孔中。在第0天和第3天，計算活細胞之數目並記錄。在第一次傳代時(第6天)，將細胞以2×106個細胞/cm2或0.5×106個細胞/cm2之密度分裂培養。在第一次傳代結束時，計算細胞數目。所得之細胞計數顯示於第88圖中，其同時證明解凍後之恢復階段和生長階段。
此外，根據實施例18中所描述之程序，以2×106/cm2個細胞之密度將TIL-R3細胞(20×106個細胞)培養在GREX 10培養瓶中。在第4天和第8天，計算活細胞數目並記錄。第89圖顯示所得之細胞計數，其證明在冷凍保存後，當細胞之密度在第4至8天之間達到13.9×106個細胞時，細胞之生長階段達到高原期。
實施例20-與aEM3 aAPC一起培養之TIL的CD8偏態、擴增性能和CD3污染
將15個不同的PreREP TIL株(0.4×105個細胞)與aEM3 aAPC(如本文所描述者)或PBMC餵養細胞(10×106)、OKT3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共同培養並在第5天使用6孔Grex盤將培養物分裂培養。在第11天採取培養物之樣品並藉由流式細胞術分析。藉由公式(CD8%aEM3)/(CD8%PBMC)計算CD8+細胞之相對比率。第91圖中顯示之結果指出與aEM3細胞一起培養之TIL令人驚訝地促進CD8+偏態及改善之TIL產物。這些實驗之其他結 果顯示於第92圖、第93圖和第94圖中，其中該顯示與aEM3 aAPC一起培養之TIL的結果顯現出相較於與PBMC餵養細胞一起培養之TIL，該與aEM3 aAPC一起培養之TIL的擴增結果與其相當且非CD3+細胞污染較少。
實施例21-測量端粒長度
從REP前或REP後(用於CD3+之磁珠分選)之TIL分離出基因組DNA以用於qPCR(定量性聚合酶鏈反應)分析以測量端粒長度。實時qPCR法描述於Cawthon,Nucleic Acids Res. 2002,30(10),e47；及Yang,et al.,Leukemia,2013,27,897-906中。簡單地說，使用PCR熱循環儀(Bio-Rad實驗室公司)以96孔格式測定端粒重複序列副本數對單基因副本數(T/S)比。使用10ng之基因組DNA用於端粒或血紅蛋白(hgb)PCR反應，並使用下列引物：Tel-1b引物(CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT)(SEQ ID NO：40)；Tel-2b引物(GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT)(SEQ ID NO：41)；hgb1引物(GCT TCT GAC ACA ACT GTG TTC ACT AGC)(SEQ ID NO：42)；和hgb2引物(CAC CAA CTT CAT CCA TCA CGT CC)(SEQ ID NO：43)。
藉由端粒和血紅蛋白二種反應分析所有樣品，該分析係在相同之盤上進行，一式三份。除了該測試 樣品外，每個96孔盤含有從0.08ng至250ng之基因組DNA的5-點標準曲線，該基因組DNA係從1301個人T細胞白血病細胞株(可從Sigma和ATCC取得)分離出。藉由從中位數端粒Ct值減去中位數血紅蛋白閾循環(Ct)值來計算每個樣品之T/S比(-dCt)。藉由從每個未知樣品之T/S比減去10.0ng標準曲線點之T/S比來決定相對T/S比(-ddCt)。
結果顯示於第95圖中。顯示的每個數據點為相對T/S比之中位數測量值。結果指出與aEM3一起培養之TIL維持其端粒長度。
<110> 艾歐凡斯生物治療公司(Iovance Biotherapeutics,Inc.)
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Figure 106137461-A0202-12-0217-39
Figure 106137461-A0202-12-0218-40
Figure 106137461-A0202-12-0219-41
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<223> 莫羅單抗輕鏈
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Figure 106137461-A0202-12-0219-42
Figure 106137461-A0202-12-0220-43
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<223> 重組人IL-2
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Figure 106137461-A0202-12-0220-44
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<223> 阿地介白素(aldesleukin)
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Figure 106137461-A0202-12-0221-45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組人IL-7
<400> 5
Figure 106137461-A0202-12-0221-46
Figure 106137461-A0202-12-0222-47
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組人IL-15
<400> 6
Figure 106137461-A0202-12-0222-48
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-21
<400> 7
Figure 106137461-A0202-12-0223-49
<210> 8
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD86
<400> 8
Figure 106137461-A0202-12-0223-50
Figure 106137461-A0202-12-0224-51
Figure 106137461-A0202-12-0225-52
<210> 9
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BBL
<400> 9
Figure 106137461-A0202-12-0225-53
Figure 106137461-A0202-12-0226-54
<210> 10
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人OX40L
<400> 10
Figure 106137461-A0202-12-0226-55
Figure 106137461-A0202-12-0227-56
<210> 11
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28
<400> 11
Figure 106137461-A0202-12-0227-57
<210> 12
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CTLA-4
<400> 12
Figure 106137461-A0202-12-0228-58
<210> 13
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB
<400> 13
Figure 106137461-A0202-12-0229-59
Figure 106137461-A0202-12-0230-60
<210> 14
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人OX40
<400> 14
Figure 106137461-A0202-12-0230-61
Figure 106137461-A0202-12-0231-62
<210> 15
<211> 7569
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLV430G人4-1BBL載體
<400> 15
Figure 106137461-A0202-12-0231-63
Figure 106137461-A0202-12-0232-64
Figure 106137461-A0202-12-0233-65
Figure 106137461-A0202-12-0234-66
Figure 106137461-A0202-12-0235-67
<210> 16
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL CoOP
<400> 16
Figure 106137461-A0202-12-0235-68
<210> 17
<211> 832
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL PRCP
<400> 17
Figure 106137461-A0202-12-0235-69
Figure 106137461-A0202-12-0236-70
<210> 18
<211> 7776
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLV430G人CD86載體
<400> 18
Figure 106137461-A0202-12-0236-71
Figure 106137461-A0202-12-0237-72
Figure 106137461-A0202-12-0238-73
Figure 106137461-A0202-12-0239-74
Figure 106137461-A0202-12-0240-75
<210> 19
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD86 CoOP
<400> 19
Figure 106137461-A0202-12-0240-76
Figure 106137461-A0202-12-0241-77
<210> 20
<211> 1039
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD86 PCRP
<400> 20
Figure 106137461-A0202-12-0241-257
<210> 21
<211> 3526
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDONR221 CD86載體
<400> 21
Figure 106137461-A0202-12-0241-79
Figure 106137461-A0202-12-0242-80
Figure 106137461-A0202-12-0243-81
<210> 22
<211> 3319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDONR221 4-1BBL載體
<400> 22
Figure 106137461-A0202-12-0243-82
Figure 106137461-A0202-12-0244-84
Figure 106137461-A0202-12-0245-85
<210> 23
<211> 8449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLV430G載體
<400> 23
Figure 106137461-A0202-12-0245-86
Figure 106137461-A0202-12-0246-87
Figure 106137461-A0202-12-0247-88
Figure 106137461-A0202-12-0248-89
Figure 106137461-A0202-12-0249-90
<210> 24
<211> 4761
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDONR221載體
<400> 24
Figure 106137461-A0202-12-0249-91
Figure 106137461-A0202-12-0250-92
Figure 106137461-A0202-12-0251-93
Figure 106137461-A0202-12-0252-94
<210> 25
<211> 10703
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> psPAX2質粒
<400> 25
Figure 106137461-A0202-12-0252-95
Figure 106137461-A0202-12-0253-96
Figure 106137461-A0202-12-0254-97
Figure 106137461-A0202-12-0255-98
Figure 106137461-A0202-12-0256-99
Figure 106137461-A0202-12-0257-100
<210> 26
<211> 7298
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCIGO-VSV.G質粒
<400> 26
Figure 106137461-A0202-12-0258-102
Figure 106137461-A0202-12-0259-103
Figure 106137461-A0202-12-0260-104
Figure 106137461-A0202-12-0261-105
<210> 27
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mFC-7C12 scFv
<400> 27
Figure 106137461-A0202-12-0261-106
Figure 106137461-A0202-12-0262-107
<210> 28
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mFC-8B3 scFv
<400> 28
Figure 106137461-A0202-12-0262-108
Figure 106137461-A0202-12-0263-109
<210> 29
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mFC-7C12 scFv
<400> 29
Figure 106137461-A0202-12-0263-110
Figure 106137461-A0202-12-0264-111
<210> 30
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mFC-8B3 scFv
<400> 30
Figure 106137461-A0202-12-0264-112
<210> 31
<211> 9862
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目的載體pLV4301G
<400> 31
Figure 106137461-A0202-12-0265-113
Figure 106137461-A0202-12-0266-114
Figure 106137461-A0202-12-0267-115
Figure 106137461-A0202-12-0268-116
Figure 106137461-A0202-12-0269-117
<210> 32
<211> 3334
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 供體載體1,pMK 7c12抗mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5
<400> 32
Figure 106137461-A0202-12-0270-118
Figure 106137461-A0202-12-0271-119
<210> 33
<211> 2779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 供體載體2,pMK hCD8a支架TN L5 L2
<400> 33
Figure 106137461-A0202-12-0271-120
Figure 106137461-A0202-12-0272-121
Figure 106137461-A0202-12-0273-122
<210> 34
<211> 9338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於產生慢病毒之最終載體,pLV4301G 7C12 scFV mIgG hCD8 flag
<400> 34
Figure 106137461-A0202-12-0273-123
Figure 106137461-A0202-12-0274-124
Figure 106137461-A0202-12-0275-125
Figure 106137461-A0202-12-0276-126
Figure 106137461-A0202-12-0277-127
Figure 106137461-A0202-12-0278-128
<210> 35
<211> 9862
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目的載體,pLV4301G
<400> 35
Figure 106137461-A0202-12-0278-129
Figure 106137461-A0202-12-0279-130
Figure 106137461-A0202-12-0280-131
Figure 106137461-A0202-12-0281-132
Figure 106137461-A0202-12-0282-133
Figure 106137461-A0202-12-0283-134
<210> 36
<211> 3340
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 供體載體1,pMK 8B3抗mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5
<400> 36
Figure 106137461-A0202-12-0283-135
Figure 106137461-A0202-12-0284-136
<210> 37
<211> 2779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 供體載體2,pMK hCD8a支架TN L5 L2
<400> 37
Figure 106137461-A0202-12-0285-137
Figure 106137461-A0202-12-0286-138
<210> 38
<211> 9344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於產生慢病毒之最終載體,pLV4301G 8B3 scFV mIgG hCD8 flag
<400> 38
Figure 106137461-A0202-12-0286-140
Figure 106137461-A0202-12-0287-141
Figure 106137461-A0202-12-0288-142
Figure 106137461-A0202-12-0289-143
Figure 106137461-A0202-12-0290-144
Figure 106137461-A0202-12-0291-145
<210> 39
<211> 6924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLenti-C-Myc-DDK OX40L
<400> 39
Figure 106137461-A0202-12-0291-146
Figure 106137461-A0202-12-0292-147
Figure 106137461-A0202-12-0293-148
Figure 106137461-A0202-12-0294-149
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tel-1b引物
<400> 40
Figure 106137461-A0202-12-0295-256
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tel-2b引物
<400> 41
Figure 106137461-A0202-12-0295-151
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hgb1引物
<400> 42
Figure 106137461-A0202-12-0295-152
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hgb2引物
<400> 43
Figure 106137461-A0202-12-0295-153

Claims (27)

  1. 一種人造抗原呈現細胞(aAPC)，其包含K562髓樣細胞，其中該aAPC係經一或多種病毒載體穩定轉導，其中該一或多種病毒載體包含(i)編碼CD86之核酸；(ii)一或多種編碼一或多種共刺激分子之核酸，該一或多種共刺激分子係選自OX40L和4-1BBL；及(iii)編碼SEQ ID NO：27之核酸，其中該K562髓樣細胞表現該(i)、(ii)及(iii)之核酸的每一者編碼之蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項之aAPC，其中該aAPC可刺激並擴增與該aAPC接觸之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
  3. 如申請專利範圍第2項之aAPC，其中該aAPC在包含濃度約3000IU/mL之IL-2和濃度約30ng/mL之OKT-3抗體的細胞培養基中在7天之期間擴增TIL群至少50倍。
  4. 如申請專利範圍第1項之aAPC，其中該aAPC可刺激並擴增與該aAPC接觸之T細胞。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之aAPC，其中該CD86蛋白包含如SEQ ID NO：8所示之序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之aAPC，其中該編碼CD86之核酸包含SEQ ID NO：19。
  7. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之aAPC，其中該一或多種共刺激分子包含4-1BBL蛋白。
  8. 如申請專利範圍第7項之aAPC，其中該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列。
  9. 如申請專利範圍第7項之aAPC，其中該一或多種編碼4-1BBL蛋白之核酸包含SEQ ID NO：16。
  10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之aAPC，其中該一或多種共刺激分子包含OX40L蛋白。
  11. 如申請專利範圍第10項之aAPC，其中該OX40L蛋白包含如SEQ ID NO：10所示之序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列。
  12. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之aAPC，其中該aAPC已生長在不含血清之培養基。
  13. 一種擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方 法包含下列步驟：令TIL群與如申請專利範圍第1至12項中任一項之aAPC群在細胞培養基中接觸。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該細胞培養基進一步包含初始濃度約3000IU/mL之IL-2及初始濃度約30ng/mL之OKT-3抗體。
  15. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該aAPC群在7天之期間擴增細胞培養基中之該TIL群至少50倍。
  16. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法，其中該CD86蛋白包含SEQ ID NO：8或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列。
  17. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法，其中該編碼CD86之核酸包含SEQ ID NO：19。
  18. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法，其中該一或多種共刺激分子包含4-1BBL蛋白。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該4-1BBL蛋白包含如SEQ ID NO：9所示之序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列。
  20. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該一或多種編碼4-1BBL蛋白之核酸包含SEQ ID NO：16。
  21. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法，其中該一或多種共刺激分子包含OX40L蛋白。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該OX40L蛋白包含如SEQ ID NO：10所示之序列或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列。
  23. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法，其中該擴增係使用透氣容器實施。
  24. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法，其中該TIL群對該aAPC群之比例係介於1：200至1：400之間。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該TIL群對該aAPC群之比例為約1：300。
  26. 一種用於治療癌症之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群，其中該TIL係藉由包含下列步驟之方法可獲得者：(a)自患者切除的腫瘤取得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群之初次擴 增以取得第二TIL群，其中該第二TIL群之數目較該第一TIL群之數目多至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；及(c)在第二細胞培養基中使用K562髓樣人造抗原呈現細胞(K562髓樣aAPC)群進行該第二TIL群之快速擴增以取得第三TIL群，其中該第三TIL群之數目在該快速擴增開始7天後較該第二TIL群之數目多至少50倍，其中該第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；其中該aAPC係經一或多種病毒載體穩定轉導，其中該一或多種病毒載體包含(i)編碼CD86或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列之核酸；(ii)一或多種核酸，該一或多種核酸包含編碼一或多種胺基酸序列之序列，該一或多種胺基酸序列係選自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14；及(iii)編碼SEQ ID NO：27之核酸，其中該K562髓樣細胞表現該(i)、(ii)及(iii)之核酸的每一者編碼之蛋白；且其中治療有效份之該第三TIL群係供投予給癌症患者。
  27. 一種包含K562髓樣細胞之人造抗原呈現細胞(aAPC)，其中該aAPC係經一或多種病毒載體穩定轉導，其中該一或多種病毒載體包含(i)編碼CD86或彼之包含一或多個保守性胺基酸取代之序列之核酸；(ii)一或多種核 酸，該一或多種核酸包含編碼一或多種胺基酸序列之序列，該一或多種胺基酸序列係選自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14；及(iii)編碼SEQ ID NO：27之核酸，其中該K562髓樣細胞表現該(i)、(ii)及(iii)之核酸的每一者編碼之蛋白。
TW106137461A 2016-10-31 2017-10-30 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞 TWI788307B (zh)

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