TW202509219A

TW202509219A - 編碼細胞介素之慢病毒載體及其用於製備腫瘤浸潤性淋巴球之用途

Info

Publication number: TW202509219A
Application number: TW113126279A
Authority: TW
Inventors: 永良張; 帕斯誇伊娜馬四世; 內森吉伯特; 鶴群尹; 費德瑞克福格特; 尚恩荷爾; 提姆艾瑞克森; 阿爾瓦羅普利多
Original assignee: 美商艾歐凡斯生物治療公司
Priority date: 2023-07-13
Filing date: 2024-07-12
Publication date: 2025-03-01
Also published as: WO2025015318A9; WO2025015318A2; WO2025015318A3

Abstract

本文提供編碼細胞介素之核酸分子，諸如重組表現載體，及其製備經修飾之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之用途，其中經修飾之TIL包括與其細胞表面締合之一或多種免疫調節劑(例如，細胞介素)。與TIL締合之免疫調節劑提供局部免疫刺激作用，其可有利地增強患者受體中之TIL存活、增殖及/或抗腫瘤活性。因此，本文中所揭示之組合物及方法提供有效癌症療法。

Description

編碼細胞介素之慢病毒載體及其用於製備腫瘤浸潤性淋巴球之用途

本發明係關於編碼細胞介素之慢病毒載體及其用於製備腫瘤浸潤性淋巴球之用途。

TIL細胞療法已顯示出對實體腫瘤患者之臨床益處(Chesney等人, Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2022;10:e005755；2. Schoenfeld等人, SITC Annual Meeting 2021)。然而，免疫抑制性腫瘤微環境(TME)可能會消除TIL細胞療法之全部潛力(Granhøj等人, Expert Opin Biol Th. 2022;1-15)。促發炎細胞介素IL-12以其增加IFN-γ產生及促進1型免疫反應之能力而聞名，其可重塑TME，且具有增強抗腫瘤活性之潛力。

目前之TIL擴增過程在擴增之TIL產品中產生腫瘤特異性TIL (TS-TIL)及旁觀者TIL。TIL輸注產品中新抗原特異性純系之頻率及其在活體外擴增時動員之能力與TIL在黑色素瘤中之功效相關(Kristensen N.P.等人, J Clin. Invest. 2022;132:e150535；Chiffelle, J.等人, bioRxiv 2023；其內容以引用之方式整體併入本文中)。旁觀者T細胞可具有類似Treg之作用，自效應TS-TIL中竊取IL-2及穩態細胞介素。在REP期間，旁觀者TIL在營養物及氧氣方面亦勝過TS-TIL，從而減少其總數，因為：a)旁觀者TIL往往為更年輕且更健康(分化程度更低)之T細胞，因此具有更大增殖潛力；b) TIL生長視TIL之代謝狀態及表型狀態，亦即共刺激受體之表現而定。旁觀者TIL在授受性轉移後佔用寶貴的腫瘤空間，且造成到達腫瘤之「交通堵塞」。Allen等人, Science, 2022, 378, eaba1624。

因此，仍需要改良之TIL療法來治療癌症。本文揭示具有可誘導且膜結合之IL-12的經基因編輯之TIL，其顯示出優良之細胞毒性功能。本發明進一步提供一種改良之擴增方法，用於優先產生TS-TIL而非旁觀者TIL。

本揭示案之一些實施例提供一種核酸分子，其包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下。

本揭示案之一些實施例提供一種核酸分子，其包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下，且其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。

本揭示案之一些實施例提供一種核酸分子，其包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下，及編碼栓繫IL-15 (TeIL-15)之核苷酸序列，其中該TeIL-15處於EF1α啟動子之控制下。

本揭示案之一些實施例提供一種核酸分子，其包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下，及編碼栓繫IL-15 (TeIL-15)之核苷酸序列，其中該TeIL-15處於EF1α啟動子之控制下，且其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。

在一些實施例中，TeIL-12包含膜錨，及與人類IL-12 p35次單元融合之人類IL-12 p40次單元。在一些實施例中，人類IL-12 p35次單元具有SEQ ID NO:60之胺基酸序列且人類IL-12 p40次單元具有SEQ ID NO:61之胺基酸序列。在一些實施例中，TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼TeIL-12之核苷酸序列示於SEQ ID NO:162中。在一些實施例中，核酸分子進一步包含編碼選自由以下組成之群之細胞介素的核苷酸序列：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。在一些實施例中，細胞介素處於組成型啟動子之控制下。在一些實施例中，組成型啟動子係選自由以下組成之群：EF1α啟動子、CMV啟動子、CAG啟動子、MND啟動子及SSFV啟動子。在一些實施例中，細胞介素處於組成型啟動子之控制下。在一些實施例中，組成型啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，細胞介素為IL-15或其變異體。在一些實施例中，IL-15為人類IL-15。在一些實施例中，人類IL-15具有SEQ ID NO:64之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-15為栓繫IL-15 (TeIL-15)。在一些實施例中，TeIL-15包含膜錨，及人類IL-15。在一些實施例中，TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。在一些實施例中，細胞介素為IL-2或其變異體。在一些實施例中，IL-2為人類IL-2。在一些實施例中，人類IL-2具有SEQ ID NO:138之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2為栓繫IL-2 (TeIL-2)。在一些實施例中，TeIL-2具有SEQ ID NO:139之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸分子進一步包含編碼截短CD19 (tCD19)之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:148-150中所示之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子進一步包含編碼shRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，shRNA抑制免疫檢查點基因之表現。在一些實施例中，免疫檢查點基因係選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，shRNA為PD-1 shRNA。在一些實施例中，PD-1 shRNA包含SEQ ID NO:141-147中所示之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:151中所示之核酸序列。

本揭示案之一些實施例提供一種重組表現載體，其包含本文揭示之核酸分子。

本揭示案之一些實施例提供一種重組表現載體，其包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下。

本揭示案之一些實施例提供一種重組表現載體，其包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下，且其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。

本揭示案之一些實施例提供一種包含核酸分子之重組表現載體，該核酸分子包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下，及編碼栓繫IL-15 (TeIL-15)之核苷酸序列，其中該TeIL-15處於EF1α啟動子之控制下。

本揭示案之一些實施例提供一種包含核酸分子之重組表現載體，該核酸分子包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下，及編碼栓繫IL-15 (TeIL-15)之核苷酸序列，其中該TeIL-15處於EF1α啟動子之控制下，且其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。

本揭示案之一些實施例提供一種包含核酸分子之重組表現載體，該核酸分子包含SEQ ID NO:167之核苷酸序列。

在一些實施例中，載體為轉移載體。在一些實施例中，轉移載體來源於人類免疫缺乏病毒-1 (HIV-1)且為複製缺陷型的。在一些實施例中，轉移載體為pLenti-IRES-EGFP載體。

本揭示案之一些實施例提供一種慢病毒表現系統，其包含本文揭示之重組表現載體及一或多種輔助質體，該一或多種輔助質體編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，慢病毒表現系統包含編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之輔助質體。在一些實施例中，慢病毒表現系統包含編碼Env蛋白之輔助質體及編碼Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之輔助質體。在一些實施例中，慢病毒表現系統包含編碼Env蛋白、Gag蛋白及Pol蛋白之輔助質體及編碼Rev蛋白之輔助質體。在一些實施例中，慢病毒表現系統包含編碼Env蛋白及Rev蛋白之輔助質體及編碼Gag蛋白及Pol蛋白之輔助質體。在一些實施例中，Env蛋白係選自由以下組成之群：Ba-EVTR、VSV-G及RD114。在一些實施例中，Env蛋白包含Ba-EVTR蛋白。

本揭示案之一些實施例提供一種製造重組慢病毒粒子之方法，其包括：a)在細胞培養基中培養包裝細胞群體；b)使該包裝細胞群體與本文揭示之慢病毒表現系統接觸；及c)收穫該細胞培養基之上清液，其中該上清液包含重組慢病毒粒子。

本揭示案之一些實施例提供一種重組慢病毒RNA分子，其包含本文揭示之核酸分子。

本揭示案之一些實施例提供一種重組慢病毒前病毒DNA分子，其包含本文揭示之核酸分子。

本揭示案之一些實施例提供一種重組慢病毒粒子，其包含本文揭示之重組慢病毒RNA分子。在一些實施例中，重組慢病毒粒子藉由本文揭示之包裝細胞株產生。在一些實施例中，重組慢病毒粒子包含選自由以下組成之群的Env蛋白：Ba-EVTR、VSV-G及RD114。在一些實施例中，重組慢病毒粒子包含係Ba-EVTR之Env蛋白。在一些實施例中，重組慢病毒粒子進一步包含反轉錄酶。在一些實施例中，重組慢病毒粒子進一步包含封裝該重組慢病毒RNA分子之殼體。

本揭示案之一些實施例提供一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其包含本文揭示之重組慢病毒前病毒DNA。在一些實施例中，重組慢病毒前病毒DNA整合至經基因編輯之TIL之基因體中。

本揭示案之一些實施例提供一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其表現外源性栓繫IL-12 (TeIL-12)。

本揭示案之一些實施例提供一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其表現外源性栓繫IL-12 (TeIL-12)，其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。

本揭示案之一些實施例提供一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其表現外源性栓繫IL-12 (TeIL-12)及外源性栓繫IL-15 (TeIL-15)。

本揭示案之一些實施例提供一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其表現外源性栓繫IL-12 (TeIL-12)及外源性栓繫IL-15 (TeIL-15)，其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。

本揭示案之一些實施例提供一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其表現外源性栓繫IL-12 (TeIL-12)及外源性栓繫IL-15 (TeIL-15)，其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列，且其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。

在一些實施例中，TeIL-12包含膜錨，及與人類IL-12 p35次單元融合之人類IL-12 p40次單元。在一些實施例中，人類IL-12 p35次單元具有SEQ ID NO:60之胺基酸序列且人類IL-12 p40次單元具有SEQ ID NO:61之胺基酸序列。在一些實施例中，TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，經基因編輯之TIL進一步表現選自由以下組成之群的細胞介素：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF及其變異體。在一些實施例中，細胞介素為IL-15或其變異體。在一些實施例中，IL-15為人類IL-15。在一些實施例中，人類IL-15具有SEQ ID NO:64之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-15為栓繫IL-15 (TeIL-15)。在一些實施例中，TeIL-15包含膜錨，及人類IL-15。在一些實施例中，TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。

在一些實施例中，經基因編輯之TIL包含本文揭示之核酸分子。在一些實施例中，經基因編輯之TIL包含本文揭示之重組慢病毒粒子。在一些實施例中，經基因編輯之TIL包含本文揭示之重組慢病毒RNA分子。在一些實施例中，經基因編輯之TIL包含本文揭示之重組慢病毒前病毒DNA。在一些實施例中，重組慢病毒前病毒DNA整合至經基因編輯之TIL之基因體中。

本揭示案之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括在細胞培養基中培養該TIL群體，其中該細胞培養基包含IL-15、IL-21及L-精胺酸。

本揭示案之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括在細胞培養基中培養該TIL群體，其中該細胞培養基包含IL-15、IL-21、L-精胺酸及NAD+。

本揭示案之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體約3-14天進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體約7-14天進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含IL-15、IL-21及L-精胺酸。

本揭示案之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體約3-14天進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體約7-14天進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含IL-15、IL-21、L-精胺酸及NAD+。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含IL-15及IL-21；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含IL-15、IL-21及L-精胺酸；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體約7-14天進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含IL-15、IL-21、L-精胺酸及NAD+；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體；及c)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增以產生該經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)用重組慢病毒粒子轉導該TIL群體，該重組慢病毒粒子包括包含編碼TeIL-12之核苷酸的重組慢病毒RNA分子；及c)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增以產生該經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)用重組慢病毒粒子轉導該TIL群體，該重組慢病毒粒子包括包含編碼TeIL-12之核苷酸的重組慢病毒RNA分子及編碼TeIL-15之核苷酸；及c)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增以產生該經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體表現TeIL-12。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體表現TeIL-12，且其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體表現TeIL-12及TeIL-15，其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列，且其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。

在一些實施例中，方法進一步包括在用重組慢病毒粒子轉導TIL群體之前活化TIL群體1天或2天。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與選自由以下組成之群的細胞介素接觸：IL-2、IL-15、IL-21、IL-7及其組合。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與20 ng/mL IL-15接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與10 ng/mL IL-7接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。在一些實施例中，轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟包括離心。在一些實施例中，轉導步驟在Lentibooster存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。在一些實施例中，活化步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。在一些實施例中，方法進一步包括在轉導步驟之後使TIL群體靜置2天或3天。

在一些實施例中，TIL群體係自腫瘤消化物獲得。在一些實施例中，方法進一步包括引發步驟。在一些實施例中，引發步驟在第一擴增步驟之前進行。在一些實施例中，引發步驟在IFNγ存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟持續24-48小時。在一些實施例中，引發步驟持續約30小時。在一些實施例中，方法進一步包括富集步驟。在一些實施例中，富集步驟在引發步驟之後及第一擴增步驟之前進行。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+ T細胞。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+及CD39+ T細胞。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+及CD200+ T細胞。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+及OX40+ T細胞。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+、CD200+及CD39+ T細胞。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+、CD200+及OX40+ T細胞。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+、CD39+及OX40+ T細胞。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+、CD200+、CD39+及OX40+ T細胞。在一些實施例中，第一擴增在飼養細胞存在下進行。在一些實施例中，飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。在一些實施例中，第一擴增在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，第一擴增進行約3-11天之時段。在一些實施例中，第一擴增進行約9天之時段。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。在一些實施例中，L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。在一些實施例中，L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。在一些實施例中，第二細胞培養基包含NAD+增強劑。在一些實施例中，NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。在一些實施例中，第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。在一些實施例中，GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。在一些實施例中，第二擴增進行約7-11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約10天之時段。

在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含IL-2。在一些實施例中，IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基不含附加的IL-2。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含濃度為約1 ng/mL至約100 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基包含IL-2及IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基包含3000 IU/mL之IL-2及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及蛋白激酶B (AKT)抑制劑。在一些實施例中，AKT抑制劑係選自由以下組成之群：帕他色替(ipatasertib)、GSK690693、GSK2141795、GSK2110183、AZD5363、GDC-0068、AT7867、CCT128930、MK-2206、BAY 1125976、哌立福辛(Perifosine)、冬淩草甲素(Oridonin)、草質素(Herbacetin)、特黑內酯(Tehranolide)、異甘草素(Isoliquiritigenin)、黃芩素(Scutellarin)及和厚樸酚(Honokiol)。在一些實施例中，AKT抑制劑為AZD5363。在一些實施例中，AKT抑制劑濃度為約0.1 µM至約10 µM。在一些實施例中，AKT抑制劑濃度為約1 µM。在一些實施例中，第一擴增進行約11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約11天之時段。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)在IFNγ存在下引發包含TIL群體之腫瘤消化物；b)使該TIL群體富集CD137+ T細胞；c)藉由在第一細胞培養基中培養富集CD137+ T細胞之TIL群體進行第一擴增；d)用包含編碼TeIL-12之核酸序列的重組慢病毒粒子轉導富集CD137+ T細胞之TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體；及e)藉由在第二細胞培養基中培養經基因編輯之TIL群體進行第二擴增。

在一些實施例中，TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下。在一些實施例中，TeIL-12包含膜錨，及與人類IL-12 p35次單元融合之人類IL-12 p40次單元。在一些實施例中，人類IL-12 p35次單元具有SEQ ID NO:60之胺基酸序列且人類IL-12 p40次單元具有SEQ ID NO:61之胺基酸序列。在一些實施例中，TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼TeIL-12之核苷酸序列示於SEQ ID NO:162中。在一些實施例中，方法進一步包括在用重組慢病毒粒子轉導TIL群體之前活化TIL群體1天或2天。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。在一些實施例中，轉導步驟在10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度下進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。在一些實施例中，轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟包括離心。在一些實施例中，轉導步驟在Lentibooster存在下進行。在一些實施例中，方法進一步包括在轉導步驟之後使TIL群體靜置2天或3天。在一些實施例中，在引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟持續24-48小時。在一些實施例中，引發步驟持續約30小時。

在一些實施例中，TIL群體係自腫瘤消化物獲得。在一些實施例中，方法進一步包括引發步驟。在一些實施例中，引發步驟在第一擴增步驟之前進行。在一些實施例中，引發步驟在IFNγ存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟持續24-48小時。在一些實施例中，引發步驟持續約30小時。在一些實施例中，第一擴增在飼養細胞存在下進行。在一些實施例中，飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。在一些實施例中，第一擴增在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，第一擴增進行約3-11天之時段。在一些實施例中，第一擴增進行約9天之時段。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。在一些實施例中，L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。在一些實施例中，L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。在一些實施例中，第二細胞培養基包含NAD+增強劑。在一些實施例中，NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。在一些實施例中，第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。在一些實施例中，GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。在一些實施例中，第二擴增進行約7-11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約10天之時段。

本揭示案之一些實施例提供一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括：a)在IFNγ存在下引發包含TIL群體之腫瘤消化物；b)使TIL群體富集CD137+ T細胞；c)藉由在第一細胞培養基中培養富集CD137+ T細胞之TIL群體進行第一擴增；d)用包含編碼TeIL-12及TeIL-15之核酸序列的重組慢病毒粒子轉導富集CD137+ T細胞之TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體；及e)藉由在第二細胞培養基中培養經基因編輯之TIL群體進行第二擴增。

在一些實施例中，TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下。在一些實施例中，TeIL-15處於組成型啟動子之控制下。在一些實施例中，組成型啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，NFAT啟動子及組成型啟動子引入編碼序列之相同核酸中。在一些實施例中，TeIL-12包含膜錨，及與人類IL-12 p35次單元融合之人類IL-12 p40次單元。在一些實施例中，人類IL-12 p35次單元具有SEQ ID NO:60之胺基酸序列且人類IL-12 p40次單元具有SEQ ID NO:61之胺基酸序列。在一些實施例中，TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼TeIL-12之核苷酸序列示於SEQ ID NO:162中。在一些實施例中，TeIL-15包含SEQ ID NO:73中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，方法進一步包括在用重組慢病毒粒子轉導TIL群體之前活化TIL群體1天或2天。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。在一些實施例中，方法進一步包括在轉導步驟之後使TIL群體靜置2天或3天。在一些實施例中，在引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟持續24-48小時。在一些實施例中，引發步驟持續約30小時。

本揭示案之一些實施例提供一種治療性TIL群體，其由製造本文揭示之經基因編輯之TIL群體的方法產生。在一些實施例中，TIL群體之約15-60%表現TeIL-12。在一些實施例中，TIL群體超過30%表現TeIL-12。在一些實施例中，TIL群體超過50%表現TeIL-12。在一些實施例中，TIL群體之約15-60%表現TeIL-15。在一些實施例中，TIL群體超過30%表現TeIL-15。在一些實施例中，TIL群體超過50%表現TeIL-15。在一些實施例中，TIL群體之約15-60%表現TeIL-2。在一些實施例中，TIL群體超過30%表現TeIL-2。在一些實施例中，TIL群體超過50%表現TeIL-2。在一些實施例中，TIL群體超過30%具有減少之PD-1表現。在一些實施例中，TIL群體超過40%具有減少之PD-1表現。在一些實施例中，TIL群體超過60%具有減少之PD-1表現。

本揭示案之一些實施例提供一種醫藥組合物，其包含本文揭示之治療性TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括：a)自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體；b)藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增；c)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增；d)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導TIL群體以產生治療性經基因編輯之TIL群體；及e)向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。在一些實施例中，方法進一步包括在用重組慢病毒粒子轉導TIL群體之前活化TIL群體1天或2天。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與選自由以下組成之群的細胞介素接觸：IL-2、IL-15、IL-21、IL-7及其組合。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與20 ng/mL IL-15接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與10 ng/mL IL-7接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。在一些實施例中，轉導步驟在10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度下進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。在一些實施例中，轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟包括離心。在一些實施例中，轉導步驟在Lentibooster存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。在一些實施例中，活化步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。在一些實施例中，方法進一步包括在轉導步驟之後使TIL群體靜置2天或3天。

在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含IL-2。在一些實施例中，IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基不含附加的IL-2。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含濃度為約1 ng/mL至約100 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基包含IL-2及IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基包含3000 IU/mL之IL-2及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及蛋白激酶B (AKT)抑制劑。在一些實施例中，AKT抑制劑係選自由以下組成之群：帕他色替、GSK690693、GSK2141795、GSK2110183、AZD5363、GDC-0068、AT7867、CCT128930、MK-2206、BAY 1125976、哌立福辛、冬淩草甲素、草質素、特黑內酯、異甘草素、黃芩素及和厚樸酚。在一些實施例中，AKT抑制劑為AZD5363。在一些實施例中，AKT抑制劑濃度為約0.1 µM至約10 µM。在一些實施例中，AKT抑制劑濃度為約1 µM。在一些實施例中，第一擴增進行約11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約11天之時段。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療患者之步驟。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺(cyclophosphamide)持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱(fludarabine)持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。在一些實施例中，環磷醯胺與美司鈉(mesna)一起投與。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素(aldesleukin)或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。在一些實施例中，方法不包括用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，治療性TIL群體包含約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個TIL。

本揭示案之一些實施例提供一種包裝細胞株，其包含本文揭示之重組表現載體及一或多種重組DNA分子，該一或多種重組DNA分子中之各者編碼選自由以下組成之群的任一種蛋白質、任兩種蛋白質、任三種蛋白質或所有四種蛋白質：編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白，其限制條件為選自由Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白組成之群的任何蛋白質由該一或多種重組DNA分子之至少一種重組DNA分子編碼，其中該一或多種重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。在一些實施例中，一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子組成。在一些實施例中，第一重組DNA分子整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。在一些實施例中，一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子及第二重組DNA分子組成。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼選自由Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白組成之群的單一蛋白質。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Env蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Gag蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Pol蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Rev蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼選自由Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白組成之群的兩種蛋白質。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Env蛋白及Gag蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Env蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Env蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Gag蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Gag蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼Pol蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子及第二重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。在一些實施例中，一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子、第二重組DNA分子及第三重組DNA分子組成。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼第一蛋白質且第二重組DNA分子編碼第二蛋白質，其中該第一蛋白質及該第二蛋白質獨立地選自由Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白組成之群，其限制條件為該第一蛋白質及該第二蛋白質不相同。在一些實施例中，第一蛋白質為Env蛋白且第二蛋白質為該Gag蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Env蛋白且第二蛋白質為Pol蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Env蛋白且第二蛋白質為Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Gag蛋白且第二蛋白質為Pol蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Gag蛋白且第二蛋白質為Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Pol蛋白且第二蛋白質為Rev蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子編碼第一蛋白質且第二重組DNA分子編碼兩種蛋白質，其中第一蛋白質及兩種蛋白質中之各者獨立地選自由Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白組成之群，其限制條件為任何蛋白質與由第一蛋白質及兩種蛋白質組成之群中的任何其他蛋白質不相同。在一些實施例中，第一蛋白質為Env蛋白且兩種蛋白質為Gag蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Env蛋白且兩種蛋白質為Gag蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Env蛋白且兩種蛋白質為Pol蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Gag蛋白且兩種蛋白質為Env蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Gag蛋白且兩種蛋白質為Env蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Gag蛋白且兩種蛋白質為Pol蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Pol蛋白且兩種蛋白質為Env蛋白及Gag蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Pol蛋白且兩種蛋白質為Env蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Pol蛋白且兩種蛋白質為Gag蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Rev蛋白且兩種蛋白質為Env蛋白及Gag蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Rev蛋白且兩種蛋白質為Env蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，第一蛋白質為Rev蛋白且兩種蛋白質為Gag蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，第一重組DNA分子、第二重組DNA分子及第三重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。在一些實施例中，一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子、第二重組DNA分子、第三重組DNA分子及第四重組DNA分子組成。在一些實施例中，第一重組DNA分子、第二重組DNA分子、第三重組DNA分子及第四重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。在一些實施例中，Env蛋白包含Ba-EVTR蛋白。在一些實施例中，編碼TeIL-12之核酸分子整合至該包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白中之一或多者的重組DNA分子處於誘導型啟動子之控制下。在一些實施例中，包裝細胞株為293T細胞株。

本揭示案之一些實施例提供一種富集腫瘤反應性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之方法，其包括：a)在IFNγ存在下引發自腫瘤消化物獲得之TIL群體；b)使TIL群體富集CD137+ TIL；c)藉由在第一細胞培養基中培養富集CD137+ T細胞之TIL群體進行第一擴增；及d)藉由在第二細胞培養基中培養富集CD137+ TIL之TIL群體進行擴增以產生富集腫瘤反應性TIL之TIL群體。在一些實施例中，與使用參考擴增程序擴增之TIL相比，富集腫瘤反應性TIL之TIL群體包含增加百分比之腫瘤反應性TIL。

在一些實施例中，在引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟持續24-48小時。在一些實施例中，引發步驟持續約30小時。在一些實施例中，第一擴增在飼養細胞存在下進行。在一些實施例中，飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。在一些實施例中，第一擴增在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，第一擴增進行約3-11天之時段。在一些實施例中，第一擴增進行約9天之時段。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。在一些實施例中，L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。在一些實施例中，L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。在一些實施例中，第二細胞培養基包含NAD+增強劑。在一些實施例中，NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。在一些實施例中，第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。在一些實施例中，GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。在一些實施例中，第二擴增進行約7-11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約10天之時段。在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+ TIL包括使TIL群體與固定在珠粒上之抗CD137抗體接觸。在一些實施例中，方法進一步包括使TIL群體與抗CD39抗體接觸。在一些實施例中，方法進一步包括使TIL群體與抗CD200抗體接觸。在一些實施例中，方法進一步包括使TIL群體與抗OX40抗體接觸。

本揭示案之一些實施例提供一種富集腫瘤反應性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之方法，其包括：a)在IFNγ存在下引發自腫瘤消化物獲得之TIL群體；b)使TIL群體富集CD103+ TIL；c)藉由在第一細胞培養基中培養富集CD103+ T細胞之TIL群體進行第一擴增；及d)藉由在第二細胞培養基中培養富集CD103+ T細胞之TIL群體進行第二擴增以產生富集腫瘤反應性TIL之TIL群體。在一些實施例中，與使用參考擴增程序擴增之TIL相比，富集腫瘤反應性TIL之TIL群體包含增加百分比之腫瘤反應性TIL。

在一些實施例中，在引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在引發步驟期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，引發步驟持續24-48小時。在一些實施例中，引發步驟持續約24小時。在一些實施例中，選擇CD103+ TIL包括使用流式細胞分析技術分選第二TIL群體。在一些實施例中，步驟(b)包括選擇CD103+CD31- TIL。在一些實施例中，第一擴增在飼養細胞存在下進行。在一些實施例中，飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。在一些實施例中，第一擴增在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，在第一擴增期間IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，第一擴增進行約3-11天之時段。在一些實施例中，第一擴增進行約9天之時段。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。在一些實施例中，L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。在一些實施例中，L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。在一些實施例中，第二細胞培養基包含NAD+增強劑。在一些實施例中，NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。在一些實施例中，第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。在一些實施例中，GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。在一些實施例中，第二擴增進行約7-11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約10天之時段。本揭示案之一些實施例提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a. 自該患者切除腫瘤樣品； b. 消化該腫瘤樣品以獲得腫瘤消化物； c. 使用本文揭示之方法自該腫瘤消化物產生富集腫瘤反應性TIL之TIL群體；及 d. 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療患者之步驟。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。在一些實施例中，環磷醯胺與美司鈉一起投與。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。在一些實施例中，方法不包括用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，治療性TIL群體包含約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個TIL。

本揭示案之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；及 b) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15及L-精胺酸。

本揭示案之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；及 b) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15、L-精胺酸及NAD+。

在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。在一些實施例中，L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。在一些實施例中，第二細胞培養基包含NAD+增強劑。在一些實施例中，NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。在一些實施例中，NAD+增強劑為NAD+。在一些實施例中，NAD+以約50-75 µM之濃度存在。在一些實施例中，第一擴增進行約3-14天之時段。在一些實施例中，第一擴增進行約11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約7-14天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約11天之時段。

本揭示案之一些實施例提供一種治療性TIL群體，其藉由本文揭示之方法產生。

本揭示案之一些實施例提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a) 自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體； b) 藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增； c) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15及L-精胺酸；及 d) 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a) 自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體； b) 藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增； c) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15、L-精胺酸及NAD+；及 d) 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療患者之步驟。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。在一些實施例中，環磷醯胺與美司鈉一起投與。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。在一些實施例中，方法不包括用IL-2方案治療患者之步驟。

本揭示案之一些實施例提供一種將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之細胞培養基中培養該第二TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 收穫自步驟(c)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫之治療性TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (e) 將自步驟(d)收穫之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(d)至(e)之轉移在不打開該系統下進行，及 (f) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。

本揭示案之一些實施例提供一種將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、NAD+、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第二TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 收穫自步驟(c)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫之治療性TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (e) 將自步驟(d)收穫之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(d)至(e)之轉移在不打開該系統下進行，及 (f) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。

本揭示案之一些實施例提供一種製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至(f)之轉移在不打開該系統下進行，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。

本揭示案之一些實施例提供一種製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、NAD+、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至(f)之轉移在不打開該系統下進行，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。

本揭示案之一些實施例提供一種製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 加工自患者切除之腫瘤以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體； (c) 用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，且其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。

本揭示案之一些實施例提供一種製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 加工自患者切除之腫瘤以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體； (c) 用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、NAD+、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，且其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。

在一些實施例中，方法進一步包括在用重組慢病毒粒子轉導TIL群體之前活化TIL群體1天或2天。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。在一些實施例中，轉導步驟在10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度下進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。在一些實施例中，轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟包括離心。在一些實施例中，轉導步驟在Lentibooster存在下進行。在一些實施例中，方法進一步包括在轉導步驟之後使TIL群體靜置2天或3天。

本揭示案之一些實施例提供治療性經基因編輯之TIL群體，其由本文揭示之方法產生。

本揭示案之一些實施例提供一種醫藥組合物，其包含本文揭示之治療性經基因編輯之TIL群體。

本揭示案之一些實施例提供本文揭示之治療性TIL群體或本文揭示之治療性經基因編輯之TIL群體用於治療有需要之患者之癌症的用途，其包括向該患者投與該治療性TIL群體或該治療性經基因編輯之TIL群體。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2023年7月13日申請之美國臨時專利申請案第63/513,550號、2024年1月17日申請之美國臨時專利申請案第63/622,008號、2024年3月6日申請之美國臨時專利申請案第63/562,210號及2024年5月17日申請之美國臨時專利申請案第63/649,302號的優先權，該等臨時專利申請案以引用之方式整體併入本文中。 序列表

本申請案含有序列表，該序列表已以XML ST.26格式以電子方式提交且以引用之方式整體併入本文中。該XML複本創建於2024年7月10日，名稱為116983-5126-WO_Sequence_Listing，且大小為209,365個位元組。 I. 前言

利用TIL之授受性細胞療法為誘導各種癌症(包括白血病及黑色素瘤)中之腫瘤消退之有效方法。已發現使用包括免疫刺激性藥劑之佐劑可增強授受性細胞療法且將此類療法擴展至其他實體腫瘤。然而，諸如細胞介素(例如，介白素)之免疫調節劑之共同投藥可因所需高劑量而引起不合需要的毒性。因此，在正確的時間及位點提供此類佐劑對於避免此類不合需要的作用而言顯得至關重要。

本文中提供用於使用經修飾之TIL治療癌症之組合物及方法，其中經修飾之TIL包括與其細胞表面締合之一或多種免疫調節劑(例如，細胞介素)。與TIL締合之免疫調節劑提供局部免疫刺激作用，其可有利地增強患者受體中之TIL存活及/或抗腫瘤活性。因此，本文中所揭示之組合物及方法提供有效癌症療法。 II. 定義

除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的含義相同的含義。本文所提及之所有專利及公開案皆以全文引用的方式併入本文中。

如本文所用，術語「共同投與(co-administration/co-投與)」、「與……組合投與(administered in combination with/投與in combination with)」、「同時(simultaneous)」及「並行(concurrent)」涵蓋向個體投與兩種或更多種活性醫藥成分(在本發明之較佳實施例中，例如複數種TIL)，使得活性醫藥成分及/或其代謝物兩者同時存在於個體中。共同投與包含以分開的組合物同時投給予、以分開的組合物在不同時間投與或以其中存在兩種或更多種活性醫藥成分之組合物之形式投與。以分開的組合物同時投與及以其中存在兩種試劑之組合物之形式投與為較佳的。

術語「活體內」係指發生於個體體內之事件。

術語「活體外」係指發生於個體體外之事件。活體外分析法涵蓋採用活細胞或死細胞的基於細胞之分析法，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞之分析法。

術語「離體」係指涉及對已自個體身體移除的細胞、組織及/或器官進行治療或執行程序的事件。適當地，細胞、組織及/或器官可利用手術或治療方法返回至個體體內。

術語「快速擴增」意謂抗原特異性TIL之數目在一週時間內增加至少約3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更佳地在一週時間內增加至少約10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最佳在一週時間內增加至少約100倍。下文中揭示多種快速擴增方案。

本文中「腫瘤浸潤性淋巴球」或「TIL」意謂最初作為已離開個體血流且遷移至腫瘤中的白血球獲得之細胞群體。TIL包括(但不限於) CD8 ⁺細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4 ⁺T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代TIL及繼代TIL兩者。「初代TIL」係如本文所概述之自患者組織樣品獲得之TIL(有時稱為「新鮮收穫」)，且「繼代TIL」係任何如本文中所論述之經擴增或增殖的TIL細胞群體，包括(但不限於)主體TIL及經擴增之TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞群體可包含經基因修飾之TIL。

本文中之「細胞群體」(包含TIL)意指許多具有共同特質之細胞。通常，群體之數目在1×10 ⁶至1×10 ¹⁰之範圍內，其中不同的TIL群體包含不同數目。例如，初代TIL在IL-2的存在下的初始生長產生大約1×10 ⁸個細胞之主體TIL群體。一般進行REP擴增以提供1.5×10 ⁹至1.5×10 ¹⁰個細胞群體用於輸注。

本文中「冷凍保存之TIL」意謂在約-150℃至-60℃之範圍內處理且儲存TIL，無論係初代的、主體的或經擴增的(REP TIL)。用於冷凍保存之通用方法亦描述於本文別處，包含在實例中描述。為清楚起見，「冷凍保存之TIL」可與可用作初代TIL來源之冷凍組織樣品區分。

本文中「解凍之冷凍保存之TIL」意謂先前經冷凍保存且隨後處理以恢復至室溫或更高溫度(包含但不限於細胞培養溫度或可向患者投與TIL之溫度)的TIL群體。

TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標記物)或功能性(根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現以下生物標記物中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可藉由重新引入患者中後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。

術語「冷凍保存培養基(cryopreservation media/cryopreservation medium)」係指可用於冷凍保存細胞之任何培養基。此類培養基可包含包括7%至10% DMSO之培養基。例示性培養基包含CryoStor CS10、HypoThermosol以及其組合。術語「CS10」係指獲自幹細胞科技公司(Stemcell Technologies)或Biolife Solutions之冷凍保存培養基。CS10培養基可以商品名「CryoStor®CS10」來指代。CS10培養基為包括DMSO之無血清、無動物成分的培養基。

術語「中央記憶T細胞」係指在人類中為CD45R0+且組成性表現CCR7 (CCR7 ^hi)及CD62L (CD62 ^hi)之T細胞子集。中央記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發之後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞主要存在於血液的CD4隔室中，且在人類中按比例富集於淋巴結及扁桃體中。

術語「效應記憶T細胞」係指人類或哺乳動物T細胞之子集，如中央記憶T細胞，為CD45R0+，但已經失去對CCR7的組成性表現(CCR7 ^lo)並且對於CD62L表現而言為異質的或低的(CD62L ^lo)。中央記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包含BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激之後快速分泌高含量發炎性細胞介素，包括幹擾素-γ、IL4-及IL-5。效應記憶T細胞主要存在於血液的CD8隔室中，且在人類中按比例富集於肺、肝臟及腸道中。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。

術語「密閉系統」係指對外部環境密閉之系統。適用於細胞培養方法之任何密閉系統均可用於本發明之方法。密閉系統包括例如(但不限於)密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統中，該系統不對外部環境開放，直至TIL準備好向患者投與為止。

如本文所用，術語「片段化(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「片段化的(fragmented)」描述將腫瘤破壞之過程，包括機械片段化方法，諸如壓碎、切片、分割及粉碎腫瘤組織，以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構的方法。

術語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核之周邊血液細胞，包括淋巴球(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈遞細胞(PBMC為一種類型之抗原呈遞細胞)時，周邊血液單核細胞較佳係經照射之同種異體周邊血液單核細胞。

術語「抗CD3抗體」係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的抗體或其變異體，例如單株抗體，且包括人類、人類化、嵌合、鼠類或哺乳動物抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗(muromonab)。抗CD3抗體亦包括UHCT1純系，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包括例如奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizuma)及維西珠單抗(visilizumab)。

術語「OKT-3」(在本文中亦被稱為「OKT3」)係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的單株抗體或其生物類似物或變異體，包括人類、人類化、嵌合或鼠類抗體，且包括市售形式，諸如OKT-3(30 ng/mL，MACS GMP CD3純，Miltenyi Biotech公司, San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變異體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3之融合瘤寄存於美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)且所指派之ATCC寄存號為CRL 8001。能夠產生OKT-3之融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures；ECACC)且所指派之目錄號為86022706。

術語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2之T細胞生長因子，且包括所有形式之IL-2，包括人類及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變異體。IL-2係描述於例如Nelson的 J. Immunol. 2004, 172,3983-88及Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26,453-79，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之重組人類IL-2之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO:3)。舉例而言，術語IL-2涵蓋人類重組形式之IL-2，諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)以及由美國新罕布什爾州次茅斯的CellGenix公司(CELLGRO GMP)或美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(目錄號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他商業等效物。阿地介白素(去丙胺醯基-1，絲胺酸-125人類IL-2)為分子量大約15 kDa之非醣基化人類重組形式的IL-2。適用於本發明之阿地介白素之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO:4)。術語IL-2亦涵蓋如本文所描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥貝培阿地介白素(bempegaldesleukin) (NKTR-214，如同SEQ ID NO:4之聚乙二醇化人類重組IL-2，其中平均6個離胺酸殘基係經[(2,7-雙{[甲基聚(氧乙烯)]胺基甲醯基}-9H-茀-9-基)甲氧基]羰基取代的N ⁶)，其可購自Nektar Therapeutics (South San Francisco, CA, USA)，或可藉由此項技術中已知之方法製備，諸如國際專利申請公開案第WO 2018/132496 A1號之實例19中描述之方法或美國專利申請公開案第US 2019/0275133 A1號之實例1中描述之方法，該等公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之貝培阿地白介素(NKTR-214)及其他聚乙二醇化IL2分子描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案第WO 2012/065086 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的結合IL-2描述於美國專利第4,766,106號、第5,206,344號、第5,089,261號及第4,902,502號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物描述於美國專利第6,706,289號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，適合用於本發明之IL-2形式為可購自Synthorx公司之THOR-707。THOR-707及適用於本發明之另外替代形式之IL-2的製備及特性描述於美國專利申請公開案第US 2020/0181220 A1號及第US 2020/0330601 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為介白素2 (IL-2)結合物，其包含：分離及純化之IL-2多肽；及在選自以下之胺基酸位置結合至分離及純化之IL-2多肽的結合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107，其中胺基酸殘基之編號對應於SEQ ID NO:5。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自R38及K64。在一些實施例中，胺基酸位置選自E61、E62及E68。在一些實施例中，胺基酸位置在E62。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成離胺酸、半胱胺酸或組胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成半胱胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成離胺酸。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成非天然胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-離胺酸(PraK)、BCN-L-離胺酸、降冰片烯離胺酸、TCO-離胺酸、甲基四口井離胺酸、烯丙氧基羰基離胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、2-胺基-8-側氧基辛酸、對乙醯基-L-苯丙胺酸、對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)、對碘-L-苯丙胺酸、間乙醯基苯丙胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、對炔丙基氧基苯丙胺酸、對炔丙基-苯丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對溴苯基丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、O-烯丙基酪胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、膦醯基酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、2-胺基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-側氧基丙基)胺基)乙基)硒烷基)丙酸、2-胺基-3-(苯基硒烷基)丙酸或硒半胱胺酸。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，IL-2結合物與IL-2受體α (IL-2Rα)次單元之親和力降低。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，降低之親和力係與IL-2Rα之結合親和力降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或大於99%。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，降低之親和力係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更大。在一些實施例中，結合部分削弱或阻斷IL-2與IL-2Rα之結合。在一些實施例中，結合部分包含水溶性聚合物。在一些實施例中，另外的結合部分包含水溶性聚合物。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包含聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇) (PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯嗎啉)或其組合。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包含PEG。在一些實施例中，PEG為線性PEG或分支鏈PEG。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包含多醣。在一些實施例中，多醣包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基澱粉(HES)。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包含聚醣。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包含多元胺。在一些實施例中，結合部分包含蛋白質。在一些實施例中，另外的結合部分包含蛋白質。在一些實施例中，蛋白質各獨立地包含白蛋白、運鐵蛋白(transferrin)或運甲狀腺素蛋白(transthyretin)。在一些實施例中，蛋白質各獨立地包含Fc部分。在一些實施例中，蛋白質各獨立地包含IgG之Fc部分。在一些實施例中，結合部分包含多肽。在一些實施例中，另外的結合部分包含多肽。在一些實施例中，多肽各獨立地包含XTEN肽、富甘胺酸高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白質(GLK)聚合物。在一些實施例中，分離及純化之IL-2多肽藉由麩胺醯化修飾。在一些實施例中，結合部分直接結合至分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，結合部分經由連接子間接結合至分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，連接子包含同型雙官能連接子。在一些實施例中，同型雙官能連接子包含羅曼特氏試劑(Lomant's reagent)二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代雙(丙酸磺基琥珀醯亞胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸雙(磺基琥珀醯亞胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(磺基DST)、糖基雙(琥珀醯亞胺基丁二酸)伸乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、碳酸N,N'-二琥珀醯亞胺酯(DSC)、二亞胺代二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫代雙丙醯亞胺酸酯(DTBP)、1,4-二(3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB)(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二縮水甘油醚、己二酸二醯肼、碳醯肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基聯苯、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。在一些實施例中，連接子包含異型雙官能連接子。在一些實施例中，異型雙官能連接子包含3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺基-6-\-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(sIAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝苯酯(NPIA)、羰基反應性及硫氫基反應性交聯劑，諸如4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8(M ₂C ₂H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙醯基醯肼(PDPH)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮水楊酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-疊氮柳基醯胺基己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(對疊氮柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基丁二醯亞胺(ANB-Nos)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-疊氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-疊氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sADP)、4-(對疊氮苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸對硝苯酯(ρNPDP)、對硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙醯胺、對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)、4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)或對疊氮苯基乙二醛(APG)。在一些實施例中，連接子包含可裂解連接子，視情況包含二肽連接子。在一些實施例中，二肽連接子包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些實施例中，連接子包含不可裂解連接子。在一些實施例中，連接子包含順丁烯二醯亞胺基，視情況包含順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些實施例中，連接子進一步包含間隔子。在一些實施例中，間隔子包含對胺基苯甲基醇(PAB)、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或類似物。在一些實施例中，結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，另外的結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為本文所描述之任一種IL-2形式的片段。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係如美國專利申請公開案US 2020/0181220 A1號及美國專利申請公開案US 2020/0330601 A1號中所揭示般聚乙二醇化。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少80%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO:5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，IL-2多肽包含相對於SEQ ID NO:5之一個殘基的N端缺失。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式缺乏IL-2R α鏈接合，但保持與中間親和力IL-2R β-γ信號傳導複合物的正常結合。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少90%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO:5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO:5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)，其共價連接至包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少98%序列一致性之胺基酸序列；及參考SEQ ID NO:5中的胺基酸位置，對位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸之AzK取代。

在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為奈瓦紐金α ((Nemvaleukin alfa)) (亦稱為ALKS-4230 (SEQ ID NO:6)，其可購自Alkermes公司)。奈瓦紐金α亦被稱為人類介白素2片段(1-59)變異體(Cys ¹²⁵＞Ser ⁵¹)，其經由肽基連接子( ⁶⁰GG ⁶¹)融合至人類介白素2片段(62-132)，該片段經由肽基連接子( ¹³³GSGGGS ¹³⁸)融合至人類介白素2受體α鏈片段(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，經醣基化；人類介白素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys ¹²⁵(51) ＞Ser]-突變體(1-59)，其經由G ₂肽連接子(60-61)融合至人類介白素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)且經由GSG ₃S肽連接子(133-138)融合至人類介白素2受體α鏈(IL2R子單元α、IL2Rα、IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，糖型α。奈瓦紐金α之胺基酸序列提供於SEQ ID NO:6中。在一些實施例中，奈瓦紐金α呈現以下轉譯後修飾：在以下位置處之二硫橋鍵：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO:6中之編號)，及在以下位置處之醣基化位點：N187、N206、T212(使用SEQ ID NO:6中之編號)。奈瓦紐金α之製備及特性以及適用於本發明之IL-2的其他替代形式描述於美國專利申請公開案第US 2021/0038684 A1號及美國專利第10,183,979號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為與SEQ ID NO:6具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性之蛋白質。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式具有SEQ ID NO:6中所提供之胺基酸序列或其保守性胺基酸取代。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包含SEQ ID NO:7之胺基酸24-452之融合蛋白或其變異體、片段或衍生物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包含與SEQ ID NO:7之胺基酸24-452具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性之胺基酸序列之融合蛋白，或其變異體、片段或衍生物。適用於本發明之其他IL-2形式描述於美國專利第10,183,979號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。視情況，在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包含第一融合搭配物之融合蛋白，該第一融合搭配物藉由黏蛋白域多肽連接子連接至第二融合搭配物，其中該第一融合搭配物為IL-1Rα或與IL-1Rα具有至少98%胺基酸序列一致性且具有IL-Rα的受體拮抗劑活性的蛋白質，且其中第二融合搭配物包含全部或一部分包含Fc區的免疫球蛋白，其中黏蛋白域多肽連接子包含SEQ ID NO:8或與SEQ ID NO:8具有至少90%序列一致性的胺基酸序列，且其中與第一融合搭配物在不存在黏蛋白域多肽連接子的情況下與第二融合搭配物的融合相比，融合蛋白的半衰期有所改良。

在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式包括抗體細胞介素移植蛋白質，該抗體細胞介素移植蛋白質包含：重鏈可變區(V _H)，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V _L)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及移植至V _H或V _L之CDR中之IL-2分子或其片段，其中相對於調節性T細胞，該抗體細胞介素移植蛋白質優先擴增T效應細胞。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包含重鏈可變區(V _H)，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V _L)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V _H或V _L之CDR中，其中該IL-2分子為突變蛋白，並且其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括投與美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中所描述之抗體，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含：重鏈可變區(VH)，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及移植至V _H或V _L之CDR中之IL-2分子或其片段，其中該IL-2分子為突變蛋白，其中相對於調節性T細胞，該抗體細胞介素移植蛋白優先擴增T效應細胞，且其中該抗體進一步包含選自由以下組成之群之IgG類重鏈及IgG類輕鏈：包含SEQ ID NO:39之IgG類輕鏈及包含SEQ ID NO:38之IgG類重鏈；包含SEQ ID NO:37之IgG類輕鏈及包含SEQ ID NO:29之IgG類重鏈；包含SEQ ID NO:39之IgG類輕鏈及包含SEQ ID NO:29之IgG類重鏈；及包含SEQ ID NO:37之IgG類輕鏈及包含SEQ ID NO:38之IgG類重鏈。

在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V _H之HCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V _H之HCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V _H之HCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V _L之LCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V _L之LCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V _L之LCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。

IL-2分子之插入可在CDR之N端區處或附近，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含併入CDR中之IL-2分子，其中IL2序列不會將CDR序列框移。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包含併入CDR中之IL-2分子，其中IL-2序列置換CDR序列之全部或一部分。IL-2分子置換可在CDR之N端區處，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。IL-2分子置換可少至CDR序列或整個CDR序列之一或兩個胺基酸。

在一些實施例中，IL-2分子直接移植至無肽連接子之CDR中，其中在CDR序列與IL-2序列之間沒有另外的胺基酸。在一些實施例中，IL-2分子間接移植至具有肽連接子之CDR中，其中CDR序列與IL-2序列之間存在一或多個另外的胺基酸。

在一些實施例中，本文所描述之IL-2分子為IL-2突變蛋白。在一些情況下，IL-2突變蛋白包含R67A取代。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包含美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中表1中的胺基酸序列，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文。

在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含選自由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:25組成之群的HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含選自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:16組成之群的HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含選自由以下組成之群的HCDR1：選自由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:26組成之群的HCDR2。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含選自由SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:27組成之群的HCDR3。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含V _H區，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含重鏈，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含V _L區，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含輕鏈，其包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含V _H區，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列；及V _L區，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含重鏈區，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及輕鏈區，其包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含重鏈區，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及輕鏈區，其包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含重鏈區，其包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列；及輕鏈區，其包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包含重鏈區，其包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列；及輕鏈區，其包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包含美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其變異體、衍生物或片段，或其保守性胺基酸取代，或與其具有至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白之抗體組分包含帕利珠單抗之免疫球蛋白序列、構架序列或CDR序列。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白質的血清半衰期比野生型IL-2分子(諸如(但不限於)阿地介白素或類似分子)長。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白質具有如表3中所示之序列。

術語「IL-4」(在本文中亦稱「IL4」)係指被稱為介白素4之細胞介素，其由Th2 T細胞及嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞產生。IL-4調節初始輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke及Borish, Respir. Res. 2001, 2,66-70。在由IL-4活化後，Th2 T細胞隨後以正回饋迴路產生另外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增殖及II類MHC表現，且誘導來自B細胞之類別轉換至IgE及IgG1表現。適用於本發明之重組人類IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(East Brunswick, NJ, USA) (目錄號CYT-211)及ThermoFisher Scientific公司(Waltham, MA, USA.)(人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人類IL-4之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO:9)。

術語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的醣基化的組織衍生性細胞介素，其可獲自基質及上皮細胞以及樹突狀細胞。Fry及Mackall ， Blood 2002 ， 99 ， 3892-904 。 IL-7可以刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(一種由IL-7受體α及共同γ鏈受體組成之異二聚體)結合，其屬於對於T細胞在胸腺內之發育及在周邊內之存活而言重要之一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(East Brunswick, NJ, USA) (目錄號CYT-254)及ThermoFisher Scientific公司(Waltham, MA, USA) (人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人類IL-7之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO:10)。

術語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子，且包括所有形式之IL-2，包括人類及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變異體。IL-15描述於例如Fehniger及Caligiuri的Blood 2001, 97, 14-32中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ信號傳導受體子單元。重組人類IL-15為分子質量為12.8 kDa的含有114個胺基酸(及N端甲硫胺酸)的單一非醣基化多肽鏈。重組人類IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(East Brunswick, NJ, USA) (目錄號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific公司(Waltham, MA, USA) (人類IL-15重組蛋白，目錄號34-8159-82)。適用於本發明之重組人類IL-15之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO:11)。

術語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21之多效性細胞介素蛋白，且包括所有形式之IL-21，包括人類及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變異體。IL-21描述於例如Spolski及Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc 2014, 13,379-95，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-21主要藉由自然殺手T細胞及經活化之人類CD4 ⁺T細胞產生。重組人類IL-21為分子質量為15.4 kDa之含有132個胺基酸的單一非醣基化多肽鏈。重組人類IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司(East Brunswick, NJ, USA) (目錄號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific公司(Waltham, MA, USA) (人類IL-21重組蛋白，目錄號14-8219-80)。適用於本發明之重組人類IL-21之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO:12)。

當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，本發明組合物待投與的精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病狀的個別差異來確定。通常可說明本文所描述之包含腫瘤浸潤性淋巴球(例如繼代TIL或基因修飾之細胞毒性淋巴球)的醫藥組合物可以10 ⁴至10 ¹¹個細胞/公斤體重(例如，10 ⁵至10 ⁶、10 ⁵至10 ¹⁰、10 ⁵至10 ¹¹、10 ⁶至10 ¹⁰、10 ⁶至10 ¹¹、10 ⁷至10 ¹¹、10 ⁷至10 ¹⁰、10 ⁸至10 ¹¹、10 ⁸至10 ¹⁰、10 ⁹至10 ¹¹或10 ⁹至10 ¹⁰個細胞/公斤體重)的劑量投與，包括在彼等範圍內之所有整數值。TIL (在一些情況下，包括經基因修飾之細胞毒性淋巴球)組合物亦可以此等劑量多次投與。TIL (在一些情況下，包括經基因工程改造之TIL)可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術來投與(參見例如Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 1988 , 319, 1676)。特定患者之最佳劑量及治療方案可容易由所屬醫藥領域的技術人員藉由監測患者之疾病病徵且相應地調整治療來確定。

術語「血液惡性病(hematological malignancy /hematologic malignancy)」或有相關意義之術語係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括(但不限於)血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統之組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括(但不限於)急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤、急性單核球性白血病(aMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。術語「B細胞惡性血液病」係指影響B細胞之血液惡性病。

術語「液體腫瘤」係指性質上為流體的異常細胞團塊。液體腫瘤癌症包括(但不限於)白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤之TIL在本文中亦可稱為骨髓浸潤性淋巴球(MIL)。獲自液體腫瘤(包括在周邊血液中循環之液體腫瘤)之TIL在本文中亦可稱為PBL。術語MIL、TIL及PBL在本文中可互換使用且僅基於衍生細胞之組織類型而有所不同。

如本文所用，術語「微環境」可指作為整體之實體或血液腫瘤微環境或可指在微環境內之個別細胞子集。如本文所用，腫瘤微環境係指以下之複雜混合物：「促進贅生性轉化、支援腫瘤生長及侵襲、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移茁壯成長之生態棲位(niche)之細胞、可溶因子、信號傳導分子、細胞外基質及機械信號」，如Swartz等人, Cancer Res., 2012, 72, 2473中所描述。儘管腫瘤表現應由T細胞識別之抗原，但由於微環境之免疫抑制，免疫系統清除腫瘤的情況係罕見的。

在一些實施例中，本發明包括一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非清髓性化療預治療。在一些實施例中，可提供TIL群體，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非清髓性化療預治療。在一些實施例中，非清髓性化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d持續5天(在TIL輸注前第27至23天)。在一些實施例中，在根據本發明之非清髓性化療及TIL輸注之後(第0天)，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2的靜脈內輸注以達到生理耐受。

實驗發現表明，在授受性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，淋巴球耗減藉由消除調節性T細胞且競爭免疫系統之元件(「細胞介素庫」)在增強治療功效方面發揮關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之TIL之前在患者身上採用淋巴球耗減步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調節」)。

術語「有效量」或「治療有效量」係指如本文所描述之化合物或化合物組合之量，其足以實現所預期應用，包括(但不限於)疾病治療。治療有效量可視預期應用(活體外或活體內)或所治療之個體及疾病病狀(例如，個體之體重、年齡及性別)、疾病病狀之嚴重程度或投給、予方式而變化。該術語亦適用於將誘發標靶細胞中之特定反應(例如血小板黏附及/或細胞遷移減少)之劑量。特定劑量將視以下而變化：所選特定化合物、所依循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投與、投與時序、其所投與之組織及其中攜帶化合物之物理遞送系統。

術語「治療(treatment/treating/treat)」及其類似術語係指獲得所要的藥理學及/或生理學效應。該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，且/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物，尤其人類中之疾病之任何治療，且包括：(a)預防可能易患疾病但尚未診斷為患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制疾病，亦即，遏制其發展或進展；及(c)緩解疾病，亦即，引起疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦意欲涵蓋遞送試劑以便提供藥理學效應，即使在不存在疾病或病狀之情況下亦如此。舉例而言，「治療」涵蓋可在不存在疾病病狀之情況下(例如在疫苗之情況下)引發免疫反應或賦予免疫性的組合物之遞送。

當參考核酸或蛋白質之部分使用時，術語「異源」指示核酸或蛋白質包含兩個或更多個在自然界中發現彼此之間沒有相同關係的子序列。舉例而言，通常以重組方式產生核酸，其具有兩個或更多個來自無關基因的經佈置以製造新的功能性核酸序列的序列，例如來自一個來源之啟動子及來自另一來源之編碼區或來自不同來源之編碼區。類似地，異源蛋白指示蛋白質包含兩個或更多個在自然界中未發現彼此呈相同關係之子序列(例如融合蛋白)。

在兩個或更多個核酸或多肽之上下文中，術語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義詞，例如「99%一致」)係指兩個或更多個序列或子序列在進行比較及比對(需要時引入間隔)以達到最大對應性且不將任何保守性胺基酸取代視為序列一致性之部分時，該兩個或更多個序列或子序列係相同的或具有相同的特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查來量測。所屬領域中已知可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對的各種演算法及軟體。用以判定序列一致性百分比之適合的程式包括例如可購自美國政府的國家生物技術資訊中心(U.S. Government's National Center for Biotechnology Information) BLAST網站之BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign (可購自DNASTAR)係另外的可用於比對序列之可供大眾使用的軟體程式。熟悉此項技術者可以藉由特定的比對軟體來判定用於最大比對的適當參數。在某些實施例中，使用比對軟體的預設參數。

如本文所用，術語「變異體」涵蓋(但不限於)包含與參考抗體之胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白，不同之處在於在參考抗體之胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、缺失及/或添加。與參考抗體之胺基酸序列相比，變異體可以在其胺基酸序列中包含一或多個保守取代。保守取代可涉及例如類似帶電或不帶電胺基酸之取代。變異體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。術語變異體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。

本文中「腫瘤浸潤性淋巴球」或「TIL」意謂最初作為已離開個體血流且遷移至腫瘤中的白血球獲得之細胞群體。TIL包括(但不限於) CD8 ⁺細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4 ⁺T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代TIL及繼代TIL兩者。「初代TIL」係如本文中所概述之自患者組織樣品獲得之細胞(有時稱為「新鮮收穫」)，且「繼代TIL」係任何如本文中所論述之經擴增或增殖的TIL細胞群體，包括(但不限於)如本文中所論述之主體TIL及經擴增之TIL(「REP TIL」)以及「reREP TIL」)。reREP TIL可包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL (諸如圖8之步驟D中所描述的TIL，包括稱為reREP TIL之TIL)。

TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標記物)或功能性(根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現以下生物標記物中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45RA、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可藉由其重新引入患者中後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。TIL可進一步藉由效力表徵 - 例如若例如幹擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TIL可視為強效的。若例如幹擾素(IFN γ)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL、大於約300 pg/mL、大於約400 pg/mL、大於約500 pg/mL、大於約600 pg/mL、大於約700 pg/mL、大於約800 pg/mL、大於約900 pg/mL、大於約1000 pg/mL，則TIL可視為強效的。

術語「去氧核糖核苷酸」涵蓋天然的及合成的、未經修飾的及經修飾的去氧核糖核苷酸。修飾包括改變糖部分、鹼基部分及/或寡核苷酸中之去氧核糖核苷酸之間的連接。

術語「RNA」定義包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子。「核糖核苷酸」定義在b-D-呋喃核糖部分之2'位置具有羥基的核苷酸。術語RNA包括雙股RNA、單股RNA、經分離之RNA (諸如經部分純化之RNA、基本上純RNA、合成RNA、以重組方式產生之RNA)以及藉由一或多個核苷酸之添加、缺失、取代及/或改變而不同於天然存在之RNA的經改變之RNA。本文所描述之RNA分子中之核苷酸亦可包含非標準核苷酸，諸如非天然存在之核苷酸或化學合成之核苷酸或去氧核苷酸。此等經改變之RNA可稱為類似物或天然存在之RNA的類似物。

術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」意欲包括任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑，以及惰性成分。此類醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑用於活性醫藥成分之用途為此項技術中所熟知的。除非任何習知醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，否則涵蓋其在本發明之治療性組合物中之使用。諸如其他藥物之另外活性醫藥成分亦可併入所描述之組合物及方法中。

術語「約」或「大約」意指在值之統計學上有意義的範圍內。此範圍可在既定值或範圍之一數量級內，較佳地50%內，更佳地20%內，再更佳地10%內，且甚至更佳地5%內。由術語「約」或「大約」涵蓋之允許差異取決於研究下之特定系統，且可由所屬領域中具有通常知識者容易地理解。此外，如本文所用，術語「約」及「大約」意指尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他數量(quantity)及特徵並不精確且不需要精確，而是可以視需要為近似值及/或較大或較小的，反映出公差、轉換因子、四捨五入、量測誤差等，以及熟習此項技術者已知的其他因素。一般而言，無論是否如此明確說明，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」的。應注意，大小、形狀及尺寸非常不同之實施例可採用所描述之佈置。

當以原始及修改形式用於所附申請專利範圍中時，過渡術語「包含(comprising)」、「基本上由…組成(consisting essentially of)」及「由…組成(consisting of)」相對於哪些未敍述之另外的請求項要素或步驟(若存在)被排除在申請專利範圍之範疇之外來定義請求項範疇。術語「包含」意欲為包含性的或開放性的，且不排除任何另外的、未敍述之要素、方法、步驟或材料。術語「由…組成」不包含除申請專利範圍中指定之要素、步驟或材料以外的任何要素、步驟或材料，且在後一情況中排除與指定材料一般相關之雜質。術語「基本上由…組成」將請求項之範疇限於所指定要素、步驟或材料及實質上不影響所主張發明之基礎及新穎特徵的要素、步驟或材料。在替代實施例中，本文所描述之體現本發明之所有組合物、方法及套組可由任何過渡術語「包含」、「基本上由…組成」及「由…組成」更具體地定義。

術語「抗體(antibody)」及其複數形式「抗體(antibodies)」係指完整的免疫球蛋白及任何抗原結合片段(「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」亦係指包括藉由二硫鍵連接之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之醣蛋白，或其抗原結合部分。各重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為V _H)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個域(CH1、CH2及CH3)。各輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為V _L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個域C _L。抗體之V _H及V _L區可進一步細分成高變區，其稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)，且其可穿插有保守性更高之區域，稱為構架區(FR)。各V _H及V _L由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與一或多個抗原決定基相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等組織或因子包含免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。

術語「抗原」係指誘導免疫反應之物質。在一些實施例中，若藉由主要組織相容複合物(MHC)分子呈現，則抗原為能夠由抗體或TCR結合之分子。如本文所用，術語「抗原」亦涵蓋T細胞抗原決定基。抗原另外能夠被免疫系統識別。在一些實施例中，抗原能夠誘導引起B淋巴球及/或T淋巴球之活化的體液免疫反應或細胞免疫反應。在一些情況下，此可能需要抗原含有或連接至Th細胞抗原決定基。抗原亦可具有一或多個抗原決定基(例如B抗原決定基及T抗原決定基)。在一些實施例中，抗原較佳將通常以高特異性及選擇性方式與其對應抗體或TCR反應，且不與可由其他抗原誘導之多種其他抗體或TCR反應。

術語「單株抗體」、「mAb」、「單株抗體組合物」或其複數形式係指單一分子組合物的抗體分子之製劑。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。對某些受體具有特異性之單株抗體可使用以下技術中之知識及技術製得：向測試個體注射適合抗原，且接著分離表現具有所需序列或功能特徵之抗體的融合瘤。編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離及定序。融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。在分離後，可將DNA置放於表現載體中，接著轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中達成單株抗體之合成。抗體之重組產生將在下文更詳細地描述。

如本文所用，術語抗體(或簡言之，「抗體部分」或「片段」)之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指保留特異性結合於抗原之能力的抗體之一或多個片段。已證實抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內的結合片段的實例包括(i) Fab片段，由V _L、V _H、C _L及CH1域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段，一種二價片段，其包含鉸鏈區處藉由二硫橋鍵連接的兩個Fab片段；(iii)由V _H及CH1域組成的Fd片段；(iv)由抗體之單一臂之V _L及V _H域組成的Fv片段；(v)域抗體(dAb)片段(Ward等人, Nature, 1989, 341, 544-546)，其可由一個V _H或一個V _L域組成；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域(V _L及V _H)係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該合成連接子使得能夠將該兩個域製造成其中V _L與V _H區配對以形成單價分子之單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv))；參見例如Bird等人, Science 1988, 242, 423-426；及Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883)。此類scFv抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用來篩選片段。在一些實施例中，scFv蛋白域包含V _H部分及V _L部分。scFv分子在V _L域係scFv分子之N端部分之情況下表示為V _L-L-V _H，或在V _H域係scFv分子之N端部分之情況下表示為V _H-L-V _L。用於製備scFv分子及設計適合之肽連接子之方法描述於美國專利第4,704,692號；美國專利第4,946,778號；R. Raag及M. Whitlow，「Single Chain Fvs.」 FASEB, 第9卷:73-80 (1995)；及R. E. Bird及B. W. Walker，「Single Chain Antibody Variable Regions」, TIBTECH, 第9卷: 132-137 (1991)中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括滿足以下條件之抗體：具有其中構架區及CDR區皆衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。如本文所用，術語「人類抗體」不意欲包括其中衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上之抗體。

術語「人類單株抗體」係指具有可變區之呈現單一結合特異性之抗體，該等可變區中之構架及CDR區皆衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。在一些實施例中，人類單株抗體係由融合瘤產生，該融合瘤包括與永生化細胞融合的自轉殖基因非人類動物(例如，轉殖基因小鼠)獲得之B細胞，其具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因體。

如本文所用，術語「重組人類抗體」包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如(a)自對於人類免疫球蛋白基因而言為轉殖基因或轉染色體之動物(諸如小鼠)或由其製備之融合瘤(在下文進一步描述)分離的抗體；(b)自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞，例如自轉染瘤分離的抗體；(c)自重組、組合人類抗體庫分離的抗體；及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他手段製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有其中構架區及CDR區衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可經歷活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之V _H及V _L區之胺基酸序列為雖然衍生自人類生殖系V _H及V _L序列且與其相關，但在活體內可能並非天然存在於人類抗體生殖系譜系內之序列。

如本文所用，「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如IgM或IgG1)。

片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「與抗原特異性結合之抗體」互換使用。

術語「人類抗體衍生物」係指人類抗體之任何經修飾之形式，包括抗體與另一活性醫藥成分或抗體之結合物。術語「結合物」、「抗體-藥物結合物」、「ADC」或「免疫結合物」係指與另一治療部分結合之抗體或其片段，該治療部分可使用此項技術中可用之方法與本文所描述之抗體結合。

術語「人類化抗體(humanized antibody/ humanized antibodies)」及「人類化」意指其中衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上的抗體。可在人類構架序列中進行其他構架區修飾。非人類(例如鼠類)抗體之人類化形式為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區之殘基由來自具有所需特異性、親和力及能力之諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供體抗體)的15個高變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基由相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發現之殘基。進行此等修飾以進一步優化抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常，人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人, Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann等人, Nature 1988, 332, 323-329；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2,593-596。本文所描述之抗體亦可經修飾以使用已知提供效應功能及/或FcR結合之改良(例如降低)之任何Fc變異體。Fc變異體可包括例如以下所揭示之胺基酸取代中之任一者：國際專利申請公開案第WO 1988/07089 A1號、第WO 1996/14339 A1、第WO 1998/05787 A1、第WO 1998/23289 A1、第WO 1999/51642 A1、第WO 99/58572 A1、第WO 2000/09560 A2、第WO 2000/32767 A1、第WO 2000/42072 A2、第WO 2002/44215 A2、第WO 2002/060919 A2、第WO 2003/074569 A2、第WO 2004/016750 A2、第WO 2004/029207 A2、第WO 2004/035752 A2、第WO 2004/063351 A2、第WO 2004/074455 A2、第WO 2004/099249 A2、第WO 2005/040217 A2、第WO 2005/070963 A1、第WO 2005/077981 A2、第WO 2005/092925 A2、第WO 2005/123780 A2、第WO 2006/019447 A1、第WO 2006/047350 A2及第WO 2006/085967 A2；及美國專利第5,648,260號；第5,739,277號；第5,834,250號；第5,869,046號；第6,096,871號；第6,121,022號；第6,194,551號；第6,242,195號；第6,277,375號；第6,528,624號；第6,538,124號；第6,737,056號；第6,821,505號；第6,998,253號；及第7,083,784號；其揭示內容以引用之方式併入本文中。

術語「嵌合抗體」意指其中可變區序列衍生自一個物種且恆定區序列衍生自另一物種之抗體，諸如其中可變區序列衍生自小鼠抗體且恆定區序列衍生自人類抗體之抗體。

「雙功能抗體」為具有兩個抗原結合位點之小型抗體片段。片段包含重鏈可變域(V _H)，其連接至相同多肽鏈(V _H-V _L或V _L-V _H)中之輕鏈可變域(V _L)。藉由使用過短以使得同一鏈上之兩個域之間不能配對的連接子，迫使域與另一條鏈之互補域配對，且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更詳細地描述於例如歐洲專利第EP 404,097號，國際專利公開案第WO 93/11161號；及Bolliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6444-6448中。

術語「醣基化」係指抗體之經修飾之衍生物。去醣基化抗體未發生醣基化。醣基化可經改變以例如提高抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，其引起消除一或多個可變區構架醣基化位點，藉此消除該位點處之醣基化。去醣基化可增加抗體對抗原之親和力，如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中所描述。或者或另外，可產生醣基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基量降低之低岩藻醣基化抗體或等分GlcNac結構增加之抗體。已證明此類經改變之醣基化模式會提高抗體之能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變之醣基化機制之宿主細胞中表現抗體來實現。醣基化機制改變之細胞已在此項技術中描述且可用作表現本發明之重組抗體以產生醣基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，細胞株Ms704、Ms705及Ms709不具有岩藻糖基轉移酶基因、FUT8(α(1,6)岩藻糖基轉移酶)，使得表現於Ms704、Ms705及Ms709細胞株中之抗體在其碳水化合物上不具有岩藻糖。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8-/-細胞株係藉由使用兩種置換載體進行之所靶向之CHO/DG44細胞中之FUT8基因的斷裂而形成(參見例如美國專利公開案第2004/0110704號或Yamane-Ohnuki等人, Biotechnol. Bioeng., 2004, 87, 614-622)。作為另一實例，歐洲專利第EP 1,176,195號描述一種具有功能性破壞之FUT8基因之細胞株，該基因編碼岩藻糖基轉移酶，使得此類細胞株中表現之抗體藉由減少或消除α1,6鍵相關酶而呈現低岩藻醣基化，且亦描述如下細胞株：具有用於將岩藻糖添加至結合於抗體之Fc區之N-乙醯基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)。國際專利公開案WO 03/035835描述變異型CHO細胞株，即Lec 13細胞，其具有降低的將岩藻糖連接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力，亦引起表現於該宿主細胞中之抗體之低岩藻醣基化(亦參見Shields等人, J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733-26740。國際專利公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾型醣基轉移酶(例如，β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnTIII))之細胞株，使得表現於經工程改造之細胞株中之抗體呈現增加之二分GlcNac結構，從而提高抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人, Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶使抗體之岩藻糖殘基裂解。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體移除岩藻糖基殘基，如Tarentino等人, Biochem. 1975, 14,5516-5523中所描述。

「聚乙二醇化」係指經修飾之抗體或其片段，其通常與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG的反應性酯或醛衍生物在使一或多個PEG基團變得連接至抗體或抗體片段之條件下反應。例如，聚乙二醇化可增加抗體之生物學(例如血清)半衰期。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之PEG之任何形式，諸如單(C ₁-C ₁₀)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。待聚乙二醇化之抗體為去醣基化抗體。聚乙二醇化方法係此項技術中已知的且可應用於本發明之抗體，如例如歐洲專利第EP 0154316號及歐洲專利第EP 0401384號及美國專利第5,824,778號中所描述，其揭示內容各自以引用之方式併入本文中。

術語「生物類似物」意謂滿足以下條件之生物產品(包括單株抗體或蛋白質)：儘管存在臨床非活性組分之少量差異，但其與美國核凖之參考生物產品極類似，且生物產品與參考產品之間在產品之安全性、純度及效能方面不存在臨床上有意義的差異。此外，類似生物或「生物類似物」藥物為與已被歐洲藥物管理局(European Medicines Agency)授權使用之另一種生物藥物類似之生物藥物。術語「生物類似物」亦由其他國家及地區監管機構同義地使用。生物產品或生物藥物係由生物來源(諸如細菌或酵母)製得或衍生的藥物。其可由相對較小分子(諸如人類胰島素或紅血球生成素)或複雜分子(諸如單株抗體)組成。舉例而言，若參考IL-2蛋白為阿地介白素(PROLEUKIN)，則由藥物監管機構批准之參考阿地介白素的蛋白質係「與阿地介白素生物類似」或為「阿地介白素之生物類似物」。在歐洲，類似生物或「生物類似物」藥物為與已由歐洲藥物管理局(EMA)授權使用之另一種生物藥物類似之生物藥物。歐洲類似生物應用之相關法律依據係法規(EC)第726/2004號之第6條及指令2001/83/EC之第10(4)條，經修訂且因此在歐洲，生物類似物可根據法規(EC)第726/2004號之第6條及指令2001/83/EC之第10(4)條而授權、批准授權或作為授權申請的對象。經授權之原始生物藥物產品在歐洲可被稱為」參考藥品」。CHMP關於類似生物藥物產品之指南中概述了產品被視為生物類似物的一些要求。此外，產品特定指南，包括與單株抗體生物類似物相關的指南，由EMA以逐項產品之方式提供且發佈在其網站上。如本文所描述之生物類似物可在品質特徵、生物活性、作用機制、安全性概況及/或功效方面與參考藥品類似。另外，生物類似物可用於或意欲用於治療與參考藥品相同之病狀。因此，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考藥品類似或極類似之品質特徵。或者或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考藥品類似或極類似之生物活性。或者或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考藥品類似或極類似之安全性概況。或者或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考藥品類似或極類似之功效。如本文中所描述，在歐洲，已將生物類似物與由EMA授權之參考藥品相比較。然而，在一些情況下，在某些研究中，可將生物類似物與在歐洲經濟區(European Economic Area)以外獲得授權之生物藥品(非EEA授權之「比較物」)相比較。此類研究包括例如某些臨床及活體內非臨床研究。如本文所用，術語「生物類似物」亦係關於已與或可與非EEA授權之比較物相比較之生物藥品。某些生物類似物係蛋白質，諸如抗體、抗體片段(例如，抗原結合部分)及融合蛋白。蛋白質生物類似物可具有胺基酸序列，其在胺基酸結構中具有不顯著影響多肽之功能之少量修飾(包括例如胺基酸之缺失、添加及/或取代)。生物類似物可包含與其參考藥品之胺基酸序列具有97%或更高，例如97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。生物類似物可包含與參考藥品之轉譯後修飾不同的一或多個轉譯後修飾，例如(但不限於)醣基化、氧化、去醯胺及/或截短，其限制條件為該等差異不會引起藥品之安全性及/或功效之變化。生物類似物可具有與參考藥品相同或不同的醣基化模式。特定言之，但非排他性地，若該等差異解決或意欲解決與參考藥品相關之安全性問題，則生物類似物可具有不同醣基化模式。另外，生物類似物可在例如其強度、醫藥形式、調配物、賦形劑及/或呈現方式方面與參考藥品不同，限制條件為不損害藥品之安全性及功效。與參考藥品相比，生物類似物可包含例如藥物動力學(PK)及/或藥效動力學(PD)概況之差異，但仍視為與參考藥品充分類似，從而可被授權或視為適於授權。在某些情況下，生物類似物呈現與參考藥品相比不同之結合特徵，其中監管機構(諸如EMA)未將該等不同結合特徵視為類似生物產品獲得授權的障礙。術語「生物類似物」亦由其他國家及地區監管機構同義地使用。

術語「重組慢病毒RNA分子」係指可包含慢病毒基因體之至少一部分之單股RNA基因體，包括5'及3'長末端重複(LTR)序列。在一些實施例中，可修飾慢病毒基因體以抑制複製且限制致病性，同時保留功能。例如，可自重組慢病毒RNA分子包含之慢病毒基因體中移除 env基因、 gag基因、 pol基因及 rev基因。在一些實施例中，重組慢病毒RNA分子由如本揭示案其他地方所述之慢病毒載體或重組慢病毒粒子包含。

術語「慢病毒粒子」或「慢病毒病毒體」係指慢病毒，其為反轉錄病毒之子集。慢病毒可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞中，且將其整合至細胞基因體中，使經基因工程改造之慢病毒成為最有效之基因遞送工具之一。此等慢病毒含有用於控制轉殖基因或shRNA表現之啟動子，但不含毒力基因，因此可在實驗室中安全使用。

術語「重組慢病毒粒子」或「重組慢病毒病毒體」係指藉由基因重組技術產生之慢病毒粒子或慢病毒病毒體。重組慢病毒粒子或慢病毒病毒體可使用任何合適之方法產生，例如藉由用編碼病毒基因體之核酸轉導或轉染包裝細胞株，且隨後分離新包裝之病毒粒子。應理解，重組技術可在病毒載體本身產生之上游階段進行。例如，可使用重組技術產生質體，且接著可以更大規模產生質體，且最後可將質體引入細胞株中進行包裝以產生病毒載體。

術語「慢病毒載體」係指包含重組慢病毒RNA分子之重組慢病毒粒子，其含有慢病毒基因體之至少一部分，包括5'及3' LTR，以及編碼一或多種所關注之基因(GOI)之核苷酸序列。可修飾慢病毒基因體以抑制複製且限制致病性，同時保留功能。例如，可將 env基因、 gag基因、 pol基因及 rev基因自慢病毒基因體中移除且包括在輔助質體中。

術語「轉移載體」係指含有編碼重組慢病毒RNA分子之核苷酸序列之重組DNA質體，其含有慢病毒基因體之至少一部分，包括5'及3' LTR，以及編碼一或多種所關注之基因(GOI)之核苷酸序列，而一或多種「輔助質體」或「包膜質體」含有出現在慢病毒粒子表面上或對於慢病毒粒子功能而言不可或缺之蛋白質的基因。轉移載體可與輔助質體一起轉染至包裝細胞株中，以產生包含編碼一或多種GOI之核苷酸序列作為重組慢病毒RNA分子之一部分的慢病毒載體。

術語「Env」係指由慢病毒基因體中之 env基因編碼之慢病毒粒子表面的包膜醣蛋白。Env蛋白含有表面次單元及跨膜次單元。在一些實施例中，Env蛋白係選自由以下組成之群：狒狒反轉錄病毒包膜(Ba-EVTR)、水皰性口炎病毒-G蛋白(VSV-G)及RD114。

術語「Gag」係指由慢病毒基因體中之 gag基因編碼之結構蛋白。Gag蛋白作為獨立蛋白或與Pol蛋白(Gag-Pol)之融合蛋白生成。

術語「Pol」係指由慢病毒基因體中之 pol基因編碼之反轉錄酶及整合酶。Pol蛋白作為獨立蛋白或與Gag蛋白(Gag-Pol)之融合蛋白生成。

術語「Rev」係指由慢病毒基因體中之 rev基因編碼之蛋白質。Rev具有富含亮胺酸之核輸出信號(NES)，且經由與Rev反應元件(RRE)結合，介導部分剪接及未剪接之RNA之核至細胞質轉運，從而產生Gag、Gag-Pol、Env及輔助蛋白(Pollard及Malim, Annu. Rev. Microbiol., 1998, 52, 491532)。 III. 編碼細胞介素之核酸分子

本文提供包含編碼一或多種所關注之基因(GOI)之核苷酸序列的核酸分子，該等所關注之基因例如選自由以下組成之群的細胞介素：IL-12、IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。在一些實施例中，核酸分子包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼TeIL-12及栓繫IL-15 (TeIL-15)之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼TeIL-12及栓繫IL-2 (TeIL-2)之核苷酸序列。

在一些實施例中，編碼一或多種GOI，例如選自由以下組成之群的細胞介素的核苷酸序列由兩種或更多種核酸分子提供：IL-12、IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。舉例而言，本文提供一種核酸分子，其包含編碼IL-12或其變異體之核苷酸序列；及一種第二核酸分子，其包含編碼IL-15或其變異體之核苷酸序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸分子，其包含編碼IL-12或其變異體之核苷酸序列；及一種第二核酸分子，其包含編碼IL-2或其變異體之核苷酸序列。

在一些實施例中，細胞介素為栓繫細胞介素。舉例而言，細胞介素連接至允許將細胞介素栓繫至細胞表面之細胞膜錨部分。適合的細胞膜錨部分包括例如內源性細胞表面蛋白質之跨膜域及其片段。可使用之例示性跨膜域包括例如B7-1、B7-2及CD8a跨膜域及其片段。在一些實施例中，細胞膜錨部分進一步包括內源性細胞表面蛋白質之跨膜及細胞內域或其片段。在一些實施例中，細胞膜錨部分為B7-1、B7-2或CD8a跨膜-細胞內域或其片段。在某些實施例中，細胞膜錨部分為具有IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 40)之胺基酸序列之CD8a跨膜域。在某些實施例中，細胞膜錨部分為具有LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 41)之胺基酸序列之B7-1跨膜-細胞內域。

在某些實施例中，細胞膜錨部分為非肽細胞膜錨部分。在例示性實施例中，非肽細胞膜錨部分為糖磷脂醯肌醇(GPI)錨。GPI錨具有包括磷酸乙醇胺連接子、聚糖核心及磷脂尾區之結構。在一些實施例中，聚糖核心經一或多個側鏈修飾。在一些實施例中，聚糖核心經以下側鏈中之一或多者修飾：磷酸乙醇胺基團、甘露糖、半乳糖、唾液酸或其他糖。

膜錨定之細胞介素可包括允許膜錨定之細胞介素之組分(例如，細胞介素與細胞膜錨部分)之連接的連接子。適合的連接子包括長度為至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸殘基之連接子。在一些實施例中，連接子之長度為5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、45-50、50-60個胺基酸。適合的連接子包括(但不限於)：可裂解連接子、不可裂解連接子、肽連接子、可撓性連接子、剛性連接子、螺旋連接子或非螺旋連接子。在一些實施例中，連接子為肽連接子，其視情況包含Gly及Ser。在某些實施例中，肽連接子利用甘胺酸-絲胺酸聚合物，包括例如(GS)n (SEQ ID NO: 42)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 43)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 44)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 45)、(GGGGGS)n (SEQ ID NO: 46)及(GGGGGGS)n (SEQ ID NO: 47)，其中n為至少一之整數(且通常為3至10)。可與本發明之組合物及方法一起使用之其他連接子描述於美國專利公開案第US 2006/0074008號、第US 20050238649號及第US 2006/0024317號中，其各自以引用之方式整體併入本文中，尤其與連接子有關之相關部分。在一些實施例中，肽連接子為SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 48)。

在一些實施例中，連接子為可裂解連接子。在例示性實施例中，可裂解連接子允許將細胞介素釋放至腫瘤微環境中。可裂解連接子亦適用於其中兩個膜錨定之細胞介素在相同細胞中共表現之實施例。在例示性實施例中，連接子為自裂解2A肽。參見例如Liu等人, Sci. Rep. 7(1):2193 (2017)，其與2A肽有關之相關部分以引用之方式本文中。2A肽病毒性寡肽，其介導真核細胞轉譯期間之多肽之裂解。在一些實施例中，2A肽包括具有胺基酸序列GDVEXiNPGP(SEQ ID NO: 49)之C端，其中Xi為任何天然存在之胺基酸殘基。在某些實施例中，2A肽為豬捷申病毒-1 2A肽(GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP，SEQ ID NO: 50)。在一些實施例中，2A肽為馬鼻炎A病毒2A肽(GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO: 51)。在某些實施例中，2A肽為口蹄疫病毒2A肽：(GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP，SEQ ID NO: 52)。在一些實施例中，可裂解連接子包括弗林蛋白酶可裂解序列。例示性弗林蛋白酶可裂解序列描述於例如Duckert等人, Protein Engineering, Design & Selection 17(1):107-112 (2004)及美國專利第8,871,906號中，其各自以引用之方式併入本文中，尤其與弗林蛋白酶可裂解序列有關之相關部分。在一些實施例中，連接子包括2A肽及弗林蛋白酶可裂解序列。在例示性實施例中，弗林蛋白酶可裂解2A肽包括胺基酸序列RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 53)。

在一些實施例中，連接子為可降解連接子(例如，二硫鍵連接子)，使得連接子在生理條件下降解，藉此釋放細胞介素。在一些實施例中，細胞介素經由可降解連接子可逆地連接至官能基，使得連接子在生理條件下降解且釋放細胞介素。適合的可降解連接子包括(但不限於)：對生物培養基中存在之一或多種酶敏感之蛋白酶敏感性連接子，該一或多種酶諸如腫瘤微環境中之蛋白酶，諸如腫瘤微環境或發炎組織中存在之基質金屬蛋白酶(例如，基質金屬蛋白酶2(MMP2)或基質金屬蛋白酶9(MMP9))。

在其他實施例中，細胞介素為酶敏感性連接子。例示性可裂解連接子包括由一種以下酶識別之可裂解連接子：金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、纖維蛋白溶酶、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、凋亡蛋白酶-1、凋亡蛋白酶-2、凋亡蛋白酶-3、凋亡蛋白酶-4、凋亡蛋白酶-5、凋亡蛋白酶-6、凋亡蛋白酶-7、凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-9、凋亡蛋白酶-10、凋亡蛋白酶-11、凋亡蛋白酶-12、凋亡蛋白酶-13、凋亡蛋白酶-14及TACE。參見例如美國專利第8,541,203號及第8,580,244號，其全部內容及與可裂解連接子有關之相關部分各自以引用之方式併入本文中。

在某些實施例中，膜錨定之細胞介素包括信號肽，其促進細胞介素易位至細胞膜。可使用任何適合的促進細胞介素定位至細胞膜之信號肽。在一些實施例中，信號肽不幹擾細胞介素之生物活性。例示性信號肽序列包括(但不限於)：人類粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、受體信號序列、人類泌乳素信號序列及人類IgE信號序列。在某些實施例中，融合蛋白包括人類IgE信號序列。在例示性實施例中，人類IgE信號序列具有胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 54)。在一些實施例中，人類IgE信號序列包括胺基酸序列NIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP (SEQ ID NO: 55)。在一些實施例中，信號肽序列為具有胺基酸序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 56)之IL-2信號序列。

核酸分子可進一步包含與編碼一或多種細胞介素之核苷酸序列可操作地連接之天然或標準啟動子。在一些實施例中，編碼各細胞介素之核苷酸序列可操作地連接於相同啟動子。在一些實施例中，編碼各細胞介素之核苷酸序列可操作地連接於不同啟動子。較佳地，啟動子在T細胞中具有功能。啟動子之選擇，例如強啟動子、弱啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子及發育特異性啟動子，在技術人員之普通技術範圍內。類似地，核苷酸序列與啟動子之組合亦在技術人員之技術範圍內。啟動子可為非病毒啟動子或病毒啟動子，例如活化T細胞核因子(NFAT)啟動子、EF-1a啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、CAG啟動子、MND啟動子或SSFV啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子或在鼠幹細胞病毒之長末端重複序列中發現之啟動子。

如本文所用之「NFAT啟動子」意謂一或多個連接至由T細胞表現之任何基因之最小啟動子之NFAT反應元件。較佳地，由T細胞表現之基因之最小啟動子為最小人類IL-2啟動子。NFAT反應元件可包含例如NFATl、NFAT2、NFAT3及/或NFAT4反應元件。NFAT啟動子(或其功能部分或功能變異體)可包含任何數目的結合模體，例如至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個，或至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個或至多十二個結合模體。

在較佳實施例中，NFAT啟動子包含六個NFAT結合模體。參見例如美國專利第8,556,882號，其以全文引用的方式併入本文中且尤其與NFAT啟動子有關之相關部分。在一些實施例中，NFAT啟動子系統控制一或多種細胞介素之表現。在某些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL-12、IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。在一些實施例中，細胞介素為栓繫細胞介素。在一些實施例中，NFAT啟動子系統控制IL-12或其變異體之表現。在一些實施例中，NFAT啟動子系統控制IL-15或其變異體之表現。在一些實施例中，NFAT啟動子系統控制IL-18或其變異體之表現。在一些實施例中，NFAT啟動子系統控制TeIL-12之表現。在一些實施例中，NFAT啟動子系統控制TeIL-15之表現。在一些實施例中，NFAT啟動子系統控制TeIL-18之表現。

如本文所用，「介白素12」、「IL-12」及「IL12」均指一種介白素，其為由IL-12A及IL-12B基因編碼之異二聚體細胞介素(Genbank寄存編號：NM_000882 (IL-12A)及NM_002187 (IL-12B))。IL-12由一束四個α螺旋組成，且參與原生T細胞向TH1細胞之分化。其由兩個獨立之基因IL-12A (p35)及IL-12B (p40)編碼。蛋白質合成後形成活性異二聚體(稱為『p70』)及p40同二聚體。IL-12與IL-12受體結合，IL-12受體係由IL-12R-β1及IL-12R-β2形成之異二聚體受體。IL-12稱為T細胞刺激因子，可刺激T細胞之生長及功能。詳言之，IL-12可刺激T細胞及自然殺手(NK)細胞之干擾素γ (IFN-γ)及腫瘤壞死因子-α (TNF-α)產生，且減少IL-4介導之IFN-γ抑制。IL-12可進一步介導NK細胞及CD8+細胞毒性T淋巴球之細胞毒活性的增強。此外，IL-12亦可藉由增加干擾素γ之產生，進而增加趨化介素誘導蛋白10 (IP-10或CXCL10)之產生而具有抗血管生成活性。IP-10接著介導此抗血管生成作用。因此，不受任何特定操作理論之束縛，據信IL-12可增加本文提供之TIL組合物之存活力及/或抗腫瘤作用。

在一些實施例中，IL-12為全長IL-12、IL-12之片段或變異體。在一些實施例中，IL-12為人類IL-12或變異人類IL-12。在示例性實施例中，IL-12為生物活性人類IL-12變異體。在一些實施例中，與野生型IL-12相比，IL-12包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變。

在一些實施例中，IL-12包含IL-12 p35次單元或其變異體。在一些實施例中，IL-12 p35次單元為人類IL-12 p35次單元。在一些實施例中，IL-12 p35次單元具有SEQ ID NO:60之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-12包含IL-12 p40次單元或其變異體。在一些實施例中，IL-12 p40次單元具有SEQ ID NO:61之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-12為包含與IL-12 p40次單元附接之IL-12 p35次單元之單鏈IL-12多肽。此類IL-12單鏈多肽有利地保留野生型IL-12之一或多種生物活性。在一些實施例中，本文所述之單鏈IL-12多肽係根據下式：自N端至C端，(p40)-(L)-(p35)，其中「p40」為IL-12 p40次單元，「p35」為IL-12 p35次單元，且L為連接子。在其他實施例中，單鏈IL-12係根據下式：自N端至C端，(p35)-(L)-(p40)。任何合適之連接子可用於單鏈IL-12多肽，包括本文所述之彼等連接子。合適之連接子可包括例如具有胺基酸序列(GGGGS) _x之連接子，其中x為1-10之整數。其他合適之連接子包括例如胺基酸序列GGGGGGS。可與主題單鏈IL-12多肽一起使用之示例性單鏈IL-12連接子亦描述於Lieschke等人, Nature Biotechnology15: 35-40 (1997)，其以引用之方式整體併入本文中，且尤其是其關於IL-12多肽連接子之教導。在一示例性實施例中，單鏈IL-12多肽為單鏈人類IL-12多肽(亦即，其包括人類p35及p40 IL-12次單元)。

在示例性實施例中，本文揭示之核酸分子編碼TeIL-12，其包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列(胺基酸1-18：人類IgE信號序列肽；胺基酸529-553：肽連接子；胺基酸554-601：膜錨)，其中核酸可操作地連接於NFAT啟動子、EF-1a啟動子、CMV啟動子、CAG啟動子、MND啟動子或SSFV啟動子，如本文所描述。參見例如美國專利第8,556,882號，其以引用的方式整體併入本文中且尤其關於用於IL-12表現之NFAT啟動子的相關部分。

在一些實施例中，核酸分子進一步包含編碼選自由以下組成之群之細胞介素的核苷酸序列：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。在一些實施例中，細胞介素為栓繫細胞介素。在一些實施例中，細胞介素處於EF1a啟動子、CMV啟動子、CAG啟動子、MND啟動子或SSFV啟動子之控制下。

如本文所用，「介白素15」、「IL-15」及「IL15」皆係指結合於複合物且經由該複合物進行信號傳導之介白素，該複合物係由IL-15特異性受體α鏈(IL-15Rα)、IL-2/IL-15受體β鏈(CD122)及共用γ鏈(γ-C，CD132)構成(例如Genbank寄存編號：NM_00000585、NP_000576及NP_751915 (人類)；及NM_001254747及NP_001241676 (小鼠))。已證實IL-15刺激腫瘤內之T細胞增殖。IL-15亦能夠提高效應記憶體CD8+ T細胞之存活能力且對於NK細胞之發育係重要的。因此，不受任何特定操作理論約束，咸信與本文所描述之IL-15結合之經修飾之TIL呈現增強之存活及/或抗腫瘤作用。

IL-15在活體內具有小於40分鐘之短半衰期。對IL-15單體之修飾可改良其在治療癌症時之活體內藥物動力學。此等修飾通常集中於藉由IL-15受體之α子單元，即IL-15Rα來改良IL-15之反式呈現。此類修飾包括：1)IL-15與其可溶性受體a-子單元-Fc融合物之預先結合，以形成IL-15:IL-15Rα-Fc複合物(參見例如Rubinstein等人, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103:9166-71 (2006))；2)超促效劑IL-15-sIL-15Rα-壽司蛋白質(sushi protein)之表現(參見例如Bessard等人, Molecular cancer therapeutics 8: 2736-45 (2009))；及3)人類IL-15突變體IL-15N72D與IL-15Rα-Fc壽司-Fc融合物複合物之預先結合(參見例如Zhu等人, Journal of Immunology 183: 3598-6007 (2009))。

在一些實施例中，IL-15為栓繫IL-15 (TeIL-15)。在一些實施例中，TeIL-15包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列(胺基酸1-18：人類IgE信號序列肽；胺基酸132-157：肽連接子；胺基酸158-205：膜錨)。

在一些實施例中，IL-15為全長IL-15、IL-15之片段或變異體。在一些實施例中，IL-15為人類IL-15或變異型人類IL-15。在例示性實施例中，IL-15為生物學活性人類IL-15變異體。在一些實施例中，IL-15與野生型IL-15相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變。在某些實施例中，IL-15與野生型人類IL-15相比包括N72D突變。在一些實施例中，變異型IL-15呈現IL-15Rα結合活性。

在一些實施例中，IL-15包括IL-15及IL-15Rα之細胞外域。在某些實施例中，IL-15包括IL-15及與Fc域融合之IL-15Rα(IL-15Rα-Fc)。

在一些實施例中，細胞介素為超促效劑IL-15 (IL-15SA)，其包括人類IL-15與可溶性人類IL-15Rα之複合物。人類IL-15與可溶性人類IL-15Rα之組合形成IL-15 SA複合物，其具有比單獨的人類IL-15更高的生物活性。此項技術中已描述可溶性人類IL-15Rα以及細胞外域之截短型式(Wei等人, 2001 J of Immunol. 167: 277-282)。人類IL-15Rα之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 72中。在一些實施例中，IL-15SA包括人類IL-15與可溶性人類之複合物。IL-15Rα包含全部或一部分細胞外域且不具有跨膜或細胞質域。在一些實施例中，IL-15SA包括人類IL-15與可溶性人類IL-15Rα之複合物，該可溶性人類IL-15Rα包括完全細胞外域或細胞外域之保留IL-15結合活性之截短形式。

在一些實施例中，IL-15SA包括人類IL-15與可溶性人類IL-15Rα之複合物，該可溶性人類IL-15Rα包括細胞外域之保留IL-15結合活性之截短形式。在一些實施例中，可溶性人類IL-15Rα包括人類IL-15Rα之胺基酸1-60、1-61、1-62、1-63、1-64或1-65。在一些實施例中，可溶性人類IL-15Rα包括人類IL-15Rα之胺基酸1-80、1-81、1-82、1-83、1-84或1-85。在一些實施例中，可溶性人類IL-15Rα包括人類IL-15Rα之胺基酸1-180、1-181或1-182。

在一些實施例中，細胞介素為包含人類IL-15與可溶性人類IL-15Rα之複合物之IL-15SA，該可溶性人類IL-15Rα包含細胞外域之保留IL-15結合活性且包含壽司域之截短形式。在此項技術中，IL-15Rα之壽司域描述為長度係約60個胺基酸且包含4個半胱胺酸。(Wei等人, 2001)。可溶性人類IL-15Rα之保留IL-15活性且包含壽司域之截短形式適用於本發明之IL-15SA中。

在一些實施例中，細胞介素包括複合物，其包含以融合蛋白，諸如本文所描述之Fc融合物(例如，人類IgG1 Fc)形式表現之可溶性人類IL-15Rα及IL-15。在一些實施例中，IL-15SA包含二聚人類IL-15RαFc融合蛋白(例如，人類IgG1 Fc)與兩個人類IL-15分子之複合物。

在一些實施例中，細胞介素為IL-15SA細胞介素複合物，其包括包含SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68或SEQ ID NO: 69中所示之胺基酸序列之IL-15分子。在一些實施例中，IL-15SA細胞介素複合物包含可溶性IL-15Rα分子，其包含SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 70或SEQ ID NO: 71之序列。

在一些實施例中，細胞介素為IL-15SA細胞介素複合物，其包括二聚IL-15RαFc融合蛋白與兩個IL-15分子之複合物。在一些實施例中，IL-15-SA包含二聚IL-15RαSu (壽司域)/Fc (SEQ ID NO: 65)及兩個IL-15N72D (SEQ ID NO: 64)分子(亦稱為ALT-803)，如US20140134128中所描述，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO: 65)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 67)。在一些實施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO: 65)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 68)。在一些實施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO: 65)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 69)。

在一些實施例中，IL-15SA包括二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO: 65)及兩個具有選自SEQ ID NO: 64、67、68及69之胺基酸序列之IL-15分子。

在一些實施例中，IL-15SA包括可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 66)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 64)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 66)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 67)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 66)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 68)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 66)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 69)。

在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 70)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 64)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 70)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 67)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 70)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 68)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 70)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 69)。

在一些實施例中，IL-15SA包括可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 71)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 64)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 71)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 67)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 165)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 68)。在一些實施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO: 165)及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 69)。

在一些實施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc(SEQ ID NO: 65)分子及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 68)。在一些實施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc (SEQ ID NO: 65)分子及兩個IL-15分子(SEQ ID NO: 69)。

在一些實施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 66。

如本文所用，「介白素18」、「IL-18」、「IL18」、「IGIF」、「IL-1g」、「幹擾素-γ誘導因子」及「IL1F4」皆係指一種介白素，其為由IL-18基因編碼之雜二聚細胞介素(例如，Genbank寄存編號：NM_001243211、NM_001562及NM_001386420)。IL-18，在結構上與IL-1β類似，為細胞介素之IL-1超家族之成員。此細胞介素，其由許多人類淋巴及非淋巴細胞表現，在發炎過程中具有重要作用。IL-18與IL-12之組合可活化細胞毒性T細胞(CTL)以及自然殺手(NK)細胞以產生IFN-γ且因此，有助於腫瘤免疫性。因此，不受任何特定操作理論約束，鹹信IL-18可增強本文中所提供之TIL組合物之抗腫瘤作用。

在一些實施例中，IL-18為栓繫IL-18 (TeIL-18)。在一些實施例中，TeIL-18包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列(胺基酸1-18：人類IgE信號序列肽；胺基酸176-200：肽連接子；胺基酸201-248：膜錨)。在一些實施例中，TeIL-18包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列(胺基酸1-18：人類IgE信號序列肽；胺基酸175-199：肽連接子；胺基酸200-247：膜錨)。

在一些實施例中，IL-18為全長IL-18、IL-18之片段或變異體。在一些實施例中，IL-18為人類IL-18或變異型人類IL-18。在例示性實施例中，IL-18為生物學活性人類IL-18變異體。在一些實施例中，IL-18與野生型IL-18相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個突變(SEQ ID NO: 75)。在一些實施例中，生物活性變異體為抗誘餌IL-18變異體(「DR-IL18」或「DR-IL-18」)，即使存在抑制性分子諸如IL-18結合蛋白(IL-18BP)，其亦提供IL-18信號傳導活性。可包括於本文所描述之標的經修飾之TIL中的例示性IL-18變異體示於下表7中。WO 2022/094473中描述了可包括於標的經修飾之TIL中之其他IL-18變異體，該文獻以全文引用的方式併入並且特定關於與變異體DR-IL-18有關之揭示內容。

在一些實施例中，變異體IL-18包括選自C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D及C38S/C68N之穩定性突變對[相對於人類野生型IL-18 - SEQ ID NO: 75]。在一些實施例中，除了選自C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D及C38S/C68N之穩定化突變對[相對於人類野生型IL-18 - SEQ ID NO: 75]之外，變異體IL-18包括在胺基酸位置M51 (例如，M51E、M51R、M51K、M51T、M51D或M51N)、K53 (例如，K53G、K53S、K53T或K53R)、Q56 (例如，Q56G、Q56R、Q56L、Q56E、Q56A、Q56V或Q56K)、D110 (例如，D110S、D110N、D110G、D110K、D110H、D110Q或D110E)及N111 (例如，N111G、N111R、N111S、N111D、N111H或N111Y)之突變。在一些此類情況下，穩定化IL-18變異體多肽另外包括在胺基酸位置S105(例如，S105D、S105A、S105N、S105R、S105D或S105K)處之突變；並且在一些情況下，進一步包括在胺基酸位置P57(例如，P57A、P57L、P57G或P57K)及M60(例如，M60L、M60R、M60K或M60Q)處之突變。

如本文所用，「介白素21」、「IL-21」及「IL21」(例如，Genbank寄存編號：NM_001207006及NP_001193935(人類)；及NM_0001291041及NP_001277970 (小鼠))皆係指細胞介素之成員，其結合於IL-21受體且對免疫系統之細胞(包括自然殺手(NK)細胞及細胞毒性細胞)具有強效調節作用，且結合於可破壞病毒感染或癌性細胞之IL-21受體。因此，不受任何特定操作理論約束，鹹信IL-21可增加本文中所提供之TIL組合物之存活能力及/或抗腫瘤作用。

在一些實施例中，IL-21為栓繫IL-21。在一些實施例中，栓繫IL-21包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列(胺基酸1-18：人類IgE信號序列肽；胺基酸152-197：肽連接子；胺基酸198-245：膜錨)。

在一些實施例中，IL-21為人類IL-21 (SEQ ID NO: 136)。在一些實施例中，與經修飾之TIL結合之IL-21為全長IL-21、IL-21之片段或變異體。在一些實施例中，IL-21為人類IL-21或變異型人類IL-21。在例示性實施例中，IL-21為生物學活性人類IL-21變異體。在一些實施例中，IL-21與野生型IL-21相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變。

如本文所用，「介白素2」、「IL-2」、「IL2」及「TCGF」(例如Genbank寄存編號：NM_000586及NP_000577(人類))皆係指結合於IL-2受體之細胞介素之成員。IL-2增強活化誘導之細胞死亡(AICD)。當初始T細胞亦受抗原刺激時，IL-2亦促進T細胞分化成效應T細胞及記憶T細胞，由此幫助身體抵抗感染。IL-2與其他細胞介素一起刺激原生CD4+ T細胞分化成Th1及Th2淋巴球且阻止分化成Th17及濾泡Th淋巴球。IL-2亦增加自然殺手細胞及細胞毒性T細胞之細胞殺傷活性。因此，不受任何特定操作理論約束，鹹信IL-2可增加本文中所提供之TIL組合物之存活能力及/或抗腫瘤作用。

在一些實施例中，IL-2為栓繫IL-2。在一些實施例中，栓繫IL-2包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列(胺基酸1-20：人類IL-2信號肽；胺基酸154-178：肽連接子；胺基酸179-226：膜錨)。

在一些實施例中，IL-2為人類IL-2 (SEQ ID NO: 138)。在一些實施例中，與經修飾之TIL結合之IL-2為全長IL-2、IL-2之片段或變異體。在一些實施例中，IL-2為人類IL-2或變異型人類IL-2。在例示性實施例中，IL-2為生物學活性人類IL-2變異體。在一些實施例中，IL-2與野生型IL-2相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變。

在一些實施例中，本文提供之核酸分子進一步包含編碼截短CD-19 (tCD19)之核苷酸序列。

在一些實施例中，本文提供之核酸分子進一步包含編碼shRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，shRNA抑制免疫檢查點基因之表現。

可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。舉例而言，可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因可選自包含以下之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、Cish、CBL-B、TIGIT、TET2、TGFβ及PKA。BAFF (BR3)描述於Bloom等人, J. Immunother., 2018,印刷中。根據另一實例，可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因可選自包含以下之群：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。示例性PD-1 shRNA序列提供於下表中。

在本發明之一些實施例中，本文揭示之核酸分子進一步包含長末端重複(LTR)序列，例如5' LTR序列及3' LTR序列(圖28)。LTR序列對於病毒基因體整合至宿主細胞基因體以及病毒基因在宿主細胞中之表現至關重要。

在本發明之一個實施例中，本文揭示之核酸分子呈重組慢病毒RNA分子之形式。例如，重組慢病毒RNA分子可包含慢病毒基因體之至少一部分，包括5'及3' LTR。在一些實施例中，可修飾慢病毒基因體以抑制複製且限制致病性，同時保留功能。例如，可將 env基因、 gag基因、 pol基因及 rev基因自慢病毒基因體中移除且包括在輔助質體中。在一些實施例中，重組慢病毒RNA分子由如本揭示案其他地方所述之慢病毒載體或重組慢病毒粒子包含。

在本發明之另一實施例中，本文揭示之核酸分子呈重組慢病毒前病毒DNA分子形式。舉例而言，宿主細胞，例如如本文揭示之經基因編輯之TIL包含重組慢病毒前病毒DNA分子。在一些實施例中，重組慢病毒前病毒DNA分子整合至宿主細胞，例如如本文揭示之經基因編輯之TIL的基因體中。在一些實施例中，重組慢病毒前病毒DNA分子由如本揭示案其他地方所述之包裝細胞株包含。在一些實施例中，重組慢病毒前病毒DNA分子整合至包裝細胞株之基因體中。 IV. 重組表現載體、慢病毒表現系統、包裝細胞株

在本發明之一個實施例中，本文揭示之本發明之核酸分子攜帶在重組表現載體中。因此，本發明之一個實施例提供一種重組表現載體，其包含本文關於本發明之其他態樣所描述之任何本發明之核酸分子。

在一些實施例中，藉由兩種或更多種重組表現載體提供編碼一或多種GOI，例如選自由以下組成之群的細胞介素的核苷酸序列：IL-12、IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。舉例而言，本文提供一種重組表現載體，其包含編碼IL-12或其變異體之核苷酸序列；及第二重組表現載體，其包含編碼IL-15或其變異體之核苷酸序列。在一些實施例中，本文提供一種重組表現載體，其包含編碼IL-12或其變異體之核苷酸序列；及第二重組表現載體，其包含編碼IL-2或其變異體之核苷酸序列。

出於本文之目的，術語「重組表現載體」意謂一種經基因修飾之寡核苷酸或多核苷酸構築體，當該構築體包含編碼mRNA、蛋白質、多肽或肽之核苷酸序列且載體在足以使mRNA、蛋白質、多肽或肽在宿主細胞內表現之條件下與細胞接觸時，允許細胞表現mRNA、蛋白質、多肽或肽。本發明之載體整體上並非天然存在的。然而，載體部分可為天然存在的。重組表現載體可包含任何類型之核苷酸，包括但不限於DNA及RNA，其可為單鏈或雙鏈、合成或部分自天然來源獲得的，且其可含有天然、非天然或改變之核苷酸。重組表現載體可包含天然存在或非天然存在之核苷酸間鍵聯，或兩種類型之鍵聯。較佳地，非天然存在或改變之核苷酸或核苷酸間鍵聯不阻礙載體之轉錄或複製。載體可含有提供本發明核酸表現之調控核酸序列。

重組表現載體可為任何合適之重組表現載體。合適載體包括經設計用於增殖及擴增或用於表現或兩者之載體，諸如質體及病毒。例如，載體可選自pUC系列(Fermentas Life Sciences, Glen Bumie, MD)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, CA)、pET系列(Novagen, Madison, WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)及pEX系列(Clontech, Palo Alto, CA)。

亦可使用噬菌體載體，諸如λGT10、λGT11、λZap II (Stratagene)、λEMBL4及λNMI 149。可用於本發明之上下文的植物表現載體之實例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及pBIN19 (Clontech)。可用於本發明之上下文的動物表現載體之實例包括pEUK-Cl、pMAM及pMAMneo (Clontech)。

在一些實施例中，重組表現載體為病毒載體。合適之病毒載體包括但不限於慢病毒、反轉錄病毒、α病毒、疫苗、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及禽痘病毒載體，且較佳具有轉化T細胞之原生或工程改造能力。

重組表現載體可使用標準重組DNA技術來製備，該等技術描述於例如Green及Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第4版) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)中。可製備環狀或線性表現載體之構築體以含有在原核或真核宿主細胞中起作用之複製系統。複製系統可衍生自例如ColEl、2μ質粒、λ、SV40、牛乳頭狀瘤病毒及其類似物。

重組表現載體可包含調控序列，諸如轉錄及轉移起始密碼子及終止密碼子，該等調控序列對於欲引入載體之宿主類型(例如，細菌、真菌、植物或動物)為特異性的，視情況而定，且考慮載體係基於DNA亦或基於RNA。

重組表現載體可包括一或多種標記基因，其允許選擇經轉型或轉染之宿主。標記基因包括殺生物劑抗性，例如對抗生素、重金屬等之抗性、在營養缺陷型宿主中之互補以提供原養型及其類似物。用於重組表現載體之合適標記基因包括例如新黴素/G418抗性基因、潮黴素抗性基因、組胺醇抗性基因、四環素抗性基因及胺苄青黴素抗性基因。

重組表現載體可包含可操作地連接於核酸分子之天然或標準啟動子。較佳地，啟動子在T細胞中具有功能。啟動子之選擇，例如強啟動子、弱啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子及發育特異性啟動子，在技術人員之普通技術範圍內。類似地，核苷酸序列與啟動子之組合亦在技術人員之技術範圍內。啟動子可為非病毒啟動子或病毒啟動子，例如NFAT啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子或在鼠幹細胞病毒之長末端重複序列中發現之啟動子。

本文進一步提供一種慢病毒表現系統，其包括：包含本文揭示之核酸分子之轉移載體，其可轉錄至重組慢病毒RNA分子中以包裝成慢病毒粒子；以及編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之一或多種輔助載體或輔助質體。在一些實施例中，Env蛋白係選自由以下組成之群：Ba-EVTR、VSV-G及RD114。

在一些實施例中，重組慢病毒RNA分子可包含慢病毒基因體之至少一部分，包括5'及3' LTR。在一些實施例中，可修飾慢病毒基因體以抑制複製且限制致病性，同時保留功能。例如，可將 env基因、 gag基因、 pol基因及 rev基因自慢病毒基因體中移除且包括在輔助質體中。在一些實施例中，重組慢病毒RNA分子由如本揭示案其他地方所述之慢病毒載體或重組慢病毒粒子包含。

在一些實施例中，兩種輔助載體或輔助質體編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，三種輔助載體或輔助質體編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，四種輔助載體或輔助質體編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白。輔助載體或輔助質體之任何組合可用於編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白。舉例而言，在一些實施例中，一種輔助載體或輔助質體編碼Env蛋白、Gag蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，一種輔助載體或輔助質體編碼Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白。在一些實施例中，一種輔助載體或輔助質體編碼Gag蛋白及Pol蛋白。在一些實施例中，一種輔助載體或輔助質體編碼Env蛋白及Rev蛋白。

包裝細胞株可用於將核酸(例如編碼轉殖基因之RNA)包裝至慢病毒載體。因此，本文所述之系統及方法可包含例如慢病毒包裝細胞株，其包含至少一種適合於產生慢病毒載體之質體，例如視情況包含轉殖基因之慢病毒載體。可用於產生慢病毒載體之各種慢病毒組分為此項技術中已知的。參見例如Zufferey等人, 1997, Nat. Biotechnol. 15:871-875及Dull等人, 1998, J. Virol. 72(11): 8463 -8471。在慢病毒包裝系統中可提供包裝細胞適合產生慢病毒載體之不同功能，該慢病毒包裝系統包含一或多種核酸(例如質體)，例如至少一種、兩種、三種或四種質體，其中一種質體編碼反轉錄病毒包膜蛋白(Env質體)，一種質體編碼一或多種反轉錄病毒包裝蛋白，例如Gag及Pol蛋白(包裝質體或Gag-Pol質體)，一種質體編碼慢病毒Rev蛋白(Rev質體)及包含至少一種所關注之基因(GOI)表現卡匣(轉移載體)之一或多種質體。在一些實施例中，慢病毒包裝系統進一步包含至少一種、兩種、三種或四種質體，或本文所述之方法包括使用至少一種、兩種、三種或四種質體。在一些實施例中，慢病毒包裝系統進一步包含第五種質體，或本文所述之方法包括使用第五種質體。在某些實施例中，本文所述之方法包括將五種質體轉染至包裝細胞中，其中第五種質體不編碼慢病毒載體包裝系統之蛋白質。在一些實施例中，慢病毒包裝系統包含一或多種核酸(例如，質體)，例如五種質體，其中一種質體編碼表現載體，一種質體編碼Tat (例如，pcDNATat)，一種質體編碼Rev蛋白(例如pHCMV-Rev)，一種質體編碼gagpol (例如pHCMV-gagpol)，且一種質體編碼VSV-G (例如pVSVG)，例如如Rout-Pitt等人, J Biol. Methods 5(2): 1-9, 2018。在一些實施例中，質體可包含雙基因表現卡匣，例如雙順反子卡匣，例如編碼兩個所關注之轉殖基因之雙順反子構築體。在一些實施例中，第一所關注之轉殖基因編碼第一細胞介素，例如TeIL-12，且第二所關注之轉殖基因編碼第二細胞介素，例如IL-15。在一些實施例中，反轉錄病毒包裝蛋白源自慢病毒，例如慢病毒包裝蛋白，例如慢病毒gag及pol蛋白。

在一些實施例中，慢病毒gag蛋白為野生型慢病毒gag蛋白，且在其他實施例中，其相對於野生型序列具有一或多個序列修飾。在一些實施例中，慢病毒pol蛋白為野生型慢病毒pol蛋白，且在其他實施例中，其相對於野生型序列具有一或多個序列修飾。在一些實施例中，rev蛋白為野生型rev蛋白，且在其他實施例中，其相對於野生型序列具有一或多個序列修飾。在一些實施例中，慢病毒載體包裝系統可為假型慢病毒載體包裝系統，其包含經修飾之包膜蛋白，例如源自不同病毒之包膜蛋白或嵌合包膜蛋白，例如Env質體可編碼Ba-EVTR Env蛋白。

在一些實施例中，使用包含pMDLgpRRE、pRSV-Rev及pMD.G質體(Dull等人, 同上)之包裝系統，但使用卡那黴素抗性標記物，例如賦予對卡那黴素及新黴素兩者之抗性之標記物，例如新黴素磷酸轉移酶II代替胺苄青黴素基因產生慢病毒載體。

因此，本文進一步提供一種包裝細胞株，其包含本文揭示之重組表現載體，例如轉移載體，該重組表現載體包括包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)及視情況選自由以下組成之群的細胞介素之核苷酸序列的核酸分子：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。在一些實施例中，細胞介素為栓繫細胞介素。在一些實施例中，核酸分子包含編碼TeIL-12及栓繫IL-15 (TeIL-15)之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼TeIL-12及栓繫IL-18 (TeIL-18)之核苷酸序列。

在一些實施例中，核酸分子進一步包含編碼shRNA之核酸序列。在一些實施例中，shRNA抑制免疫檢查點基因之表現。在一些實施例中，shRNA抑制PD-1之表現。

可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。舉例而言，可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因可選自包含以下之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、Cish、CBL-B、TIGIT、TET2、TGFβ及PKA。BAFF (BR3)描述於Bloom等人, J. Immunother., 2018 ,印刷中。根據另一實例，可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因可選自包含以下之群：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。

在一些實施例中，包裝細胞株為人類細胞株。在一些實施例中，包裝細胞株為293T細胞株。

在一些實施例中，包裝細胞株為由描述於Xue等人, Cell & Gene Therapy Insights 2022; 8(2), 199-209 (內容以引用之方式整體併入)中之EuLV®系統(Shenzhen Eureka Biotechnology有限公司, Shenzhen, China)產生之穩定包裝細胞株。

此項技術中已知之任何合適之方案皆可用於開發穩定包裝細胞株。例如Broussau等人, Mol. Thera., 2008, 16:500-507描述一種誘導型包裝細胞株293SF-PacLV，用於在無血清培養物中產生慢病毒載體，其內容以引用之方式整體併入本文中。首先建立源自293SF細胞之細胞株，其表現cumate開關之阻遏物(CymR)及四環素(Tet)開關之反向反式活化子(rtTA2S-M2)。接下來產生穩定表現人類免疫缺陷病毒-1之Gag/Pol及Rev基因以及水皰性口炎病毒(VSV-G)之醣蛋白的純系。Rev及VSV-G之表現受到293SF-PacLV細胞株中cumate及Tet開關之緊密調控。使用兩種方法來產生包裝細胞株。在第一種方法(兩步驟)中，首先產生表現Gag/Pol及Rev基因之穩定純系且進行表徵，然後再產生表現VSV-G及額外Rev之純系。在第一種方法(一次性)中，所有LV組分(Gag/Pol、rev及VSV-G)透過單次轉染事件同時添加。

兩步驟法：產生源自293細胞純系(293SF)之細胞株，該細胞株適合懸浮生長及在表現CymR之無血清培養基中生長。用pMPGBFP/CMV5-CymR/tk-neo轉染293SF，且在新黴素存在下分離出抗性細胞池。接著藉由有限稀釋池來分離純系。將純系在無選擇壓力之情況下維持6週，以測試其穩定性。使用表現受CMV5-CuO啟動子調控之β-半乳糖苷酶(β-gal)的腺病毒載體(AdV)分析CymR功能。使用存在及不存在cumate時之最佳β-gal開/關比率來選擇產生最佳數量之CymR之純系。純系G顯示開/關比為14，被選為rtTA2 ^S-M2反式活化子之受體。用質體pUDHrtTA2 ^S-M2.hygro轉染293SF-CymR-G細胞。產生潮黴素抗性細胞池，且在不進行選擇之情況下藉由有限稀釋池來獲得純系。使用編碼由TR5及CuO啟動子調控之綠色螢光蛋白(GFP)之AdV來測試純系產生之CymR及rtTA2 ^S-M2之功能。選擇具有最佳開/關比之純系來開發包裝細胞株。

此係藉由用pMPG-RSV-Rev/CMV-Gag/ polRRE轉染來進行，pMPG-RSV-Rev/CMV-Gag/polRRE係一種質體，編碼人類免疫缺陷病毒-1之Rev、Gag及pol基因，以及對作為與GFP之融合蛋白之腐草黴素之抗性。在96孔盤中分離出抗腐草黴素純系。藉由用pCSII-CMV5-GFPq及VSV-G瞬時轉染來分析具有最佳GFP表現水準之純系之LV產生。以最佳純系獲得之力價比以編碼受勞斯肉瘤病毒(RSV)調控之Rev之質體(pRSV-Rev)轉染相同純系時所獲得的力價低10至55倍。接著藉由有限稀釋對兩個純系(#19及#64)進行次選殖，且藉由瞬時轉染分析LV產生。如同對親代純系所觀測到的，在存在額外Rev之情況下獲得之LV力價顯著更高。

因為先前之結果顯示293SF-Rev-Gag-Pol細胞產生之Rev數量並非最佳，所以最佳兩個亞純系(#19-17及#64-8)與編碼嘌呤黴素抗性(pPuro)、Rev (pkCMV5-CuO-Rev)及VSV-G (pTR5-CuO-VSVg-IRES-GFPq)之質體共轉染，以產生表現VSV-G及更多Rev之細胞株。VSV-G由cumate開關及Tet開關調控，而Rev僅由cumate開關調控。在Dox及cumate誘導後，首先藉由量測GFP (透過IRES-GFP)針對VSV-G表現來篩選嘌呤黴素抗性純系。接著用pCSII-CMV5-GFPq瞬時轉染分析LV之產生。最佳純系與pRSV-Rev之共轉染僅使LV力價增加兩倍至四倍，低於早期水準。三個最佳純系在無選擇壓力之情況下進行次選殖。如前所述，藉由瞬時轉染分析LV之產生。在添加Rev後，六個最佳亞純系之產生僅增加兩倍至三倍，從而指示Rev之量接近最佳。藉由量測純系#16-22誘導後GFP表現(來自穩定整合之VSV-G-IRES-GFPq卡匣)之增加來研究雙開關之功效。在cumate及Dox存在下，觀測到誘導因子超過2,500。兩種誘導劑存在下之GFP表現比單獨使用各誘導劑時高得多。在僅cumate存在之情況下，GFP表現水準增加4.5倍，此指示cumate開關使Tet開關之緊密度提高此倍數。

一次性方法：由於來自Gag基因之蛋白酶之有效表現需要Rev，據報導，Gag基因具有細胞毒性，因此即使相對少量之Rev亦可能對細胞有害。因此，產生在非常緊密調控下表現Rev之包裝細胞株。建構pTR5-CuO-Rev，其含有受Tet開關及cumate開關雙重調控之Rev編碼序列。293SF-CymR-rtTA2 ^S-M2細胞株與編碼Rev、Gag、Pol、VSV-G及嘌呤黴素抗性之質體共轉染。在嘌呤黴素存在下選擇穩定純系。藉由用轉移載體pCSII-CMV5-GFPq轉染，分析添加Dox及cumate後具有最高GFP誘導因子之純系的LV產生。接著將兩個最佳純系進行次選殖而不進行選擇及分析LV之產生。用pCSIICMV5-GFPq及pRSV-Rev轉染最佳亞純系不會增加產生之LV之量，此指示純系產生之Rev之量不受限制。

接著比較使用兩步驟(#16-22)及一次性(#29-6)方法時在最佳純系中獲得之LV產生水準。#16-22及#29-6之力價分別為8.6×10 ⁶及2.6×10 ⁷TU/ml。誘導後產生之p24量亦藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)進行評估。#16-22及#29-6所產生之p24量分別為39 ng/ml及571 ng/ml。#16-22之比活性(p24之TU/ng)為219,000，#29-6之比活性為45,000，該事實表明後一個純系產生更多有缺陷或空的病毒體。

簡而言之，將Ba-EVTR、gag/pol及rev穩定插入293T細胞中，以獲得包裝細胞群，且透過單株及力價篩選獲得最佳包裝細胞株。接著，包含本文揭示之核酸分子之轉移載體，亦即編碼GOI之轉移載體整合至最佳包裝細胞株中，該轉移載體例如為包括包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)及視情況選自由以下組成之群的細胞介素之核苷酸序列的核酸分子的轉移載體：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。在一些實施例中，細胞介素為栓繫細胞介素。在一些實施例中，核酸分子包含編碼TeIL-12及栓繫IL-15 (TeIL-15)之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼TeIL-12及栓繫IL-18 (TeIL-18)之核苷酸序列。

可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。舉例而言，可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因可選自包含以下之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、Cish、CBL-B、TIGIT、TET2、TGFβ及PKA。BAFF (BR3)描述於Bloom等人, J. Immunother., 2018,印刷中。根據另一實例，可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因可選自包含以下之群：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。

在一些實施例中，包裝細胞株包含編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之重組DNA。在一些實施例中，編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白中之一或多者的重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Env蛋白、Gag蛋白及Pol蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Env蛋白、Gag蛋白及Rev蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Env蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，Env蛋白係選自由以下組成之群：Ba-EVTR、VSV-G及RD114。在一些實施例中，Env蛋白為Ba-EVTR Env蛋白。在一些實施例中，編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Ba-EVTR Rev蛋白中之一或多者的重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Ba-EVTR Env蛋白、Gag蛋白及Pol蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Ba-EVTR Env蛋白、Gag蛋白及Rev蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，編碼Ba-EVTR Env蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。

在一些實施例中，編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之重組DNA整合至包裝細胞株之基因體中。在一些實施例中，本文揭示之核酸分子，例如重組慢病毒前病毒DNA分子，整合至包裝細胞株之基因體中。

在一些實施例中，藉由適於產生慢病毒載體之慢病毒包裝系統的轉染，例如瞬時或穩定轉染，向複數個宿主細胞提供用於產生慢病毒載體之不同功能，該等宿主細胞例如為哺乳動物細胞，例如HEK293細胞，例如Expi293F細胞(例如在無血清條件下懸浮生長之複數個Expi293F細胞)。在一些實施例中，至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%之宿主細胞，如HEK293細胞，例如Expi293F細胞經轉染。轉染或感染之方法係熟習此項技術者熟知的。在一些實施例中，每百萬個細胞提供至少0.3pg、至少0.4pg. 至少0.5pg、至少0.6pg. 至少0.7pg、至少0.8pg細胞、至少0.9pg或至少1.0 pg慢病毒包裝系統進行轉染。在一些實施例中，轉染試劑用於轉染宿主細胞，例如哺乳動物細胞，例如HEK293細胞，例如Expi293F細胞。在一些實施例中，使用轉染試劑。轉染試劑係此項技術中熟知的且可自商業供應商獲得。轉染試劑之實例包括但不限於Lipofectamine™ (Invitrogen)、Polifectamine、LentiTran (Origene)、PEIpro® (Polyplus)、FectoVIR® - AAV (Polyplus)及ProFection® (Promega)。 V. 重組慢病毒粒子及其製備方法

在一些實施例中，本揭示案提供製造重組慢病毒粒子之方法。可使用以下一般步驟。首先，在細胞培養基中培養包裝細胞群體。一旦獲得足夠數量之包裝細胞，即可將所需之核酸，諸如包含編碼本文揭示之細胞介素之核酸分子的慢病毒載體引入包裝細胞中。可引入包裝細胞中之額外核酸包括促進包裝之質體，例如編碼病毒gag、pol、env及rev之質體。接著包裝細胞開始產生重組慢病毒粒子。轉染後，可將諸如Benzonase之核酸酶添加至培養基中。

在一些實施例中，基因體中整合有VSV-G、gag/pol及rev之穩定包裝細胞株可用於生產重組慢病毒粒子。在一些實施例中，穩定包裝細胞株進一步包含慢病毒載體，該慢病毒載體包含整合至基因體中之編碼本文揭示之細胞介素之核酸分子。

此項技術中已知之任何合適方案可用於使用穩定包裝細胞株產生重組慢病毒粒子。例如，Broussau等人(同上)描述使用穩定包裝細胞株之慢病毒粒子產生，其內容以引用之方式整體併入本文中。

若可獲得合成包括病毒RNA之所有基本病毒功能之細胞株(生產者)，則無需準備大量質體，亦無需進行轉染程序。使用此類細胞株，僅藉由添加誘導劑(諸如Dox及cumate)即可啟動LV產生。評估包裝細胞產生穩定生產者之能力。純系#29-6及#16-22用條件性-SIN-LV轉導，該條件性-SIN-LV係藉由用轉移載體pLVR2-GFP23轉染包裝細胞而產生。藉由有限稀釋轉導細胞池來分離純系。用Dox誘導後具有最高GFP表現之純系被消耗。測試來自親代細胞#16-22 (16-22-22)及#29-6 (#29-6-14)之最佳純系在無血清懸浮培養中的產生。每天更換培養基，且藉由流式細胞分析技術測定感染性粒子之數量。

亦藉由ELISA分析產生之p24之量。兩個純系之行為非常相似，僅產生之LV之絕對數量不同，純系#29-6-14之絕對數量高出兩至三倍。產生之感染性粒子之數量每天均在增加，直至第4天達到最大值。接著逐漸降低。使用#29-6-14時，在第4天獲得最高力價(3.4×10 ⁷TU/ml)。細胞在不同時間點產生之p24數量遵循相同模式。在第1天，#16-22-22及#29-6-14之病毒製劑之比活性(p24之TU/ng)分別為54,000及166,000，且逐漸降低。在產生結束時(第6天或第7天)，比活性降低3至4倍，從而表明在稍後之時間點產生更多有缺陷之粒子。

評估源自包裝細胞#29-6之四個不同生產純系之相對穩定性。在無選擇壓力下，比較培養4週及18週後之LV產量。培養18週後，用此四個純系獲得之力價並未顯著下降。此等資料表明，使用本研究中描述之包裝細胞，可獲得長期穩定性足以滿足大規模生產過程之生產者。此外，藉由使用濃縮LV儲備感染293細胞來測試具有複製能力之慢病毒的存在。P24之ELISA分析未偵測到具有複製能力之慢病毒，且聚合酶鏈式反應(PCR)未偵測到VSV-G。

由於個別純系之次選殖及分析係一個耗時之過程，因此研究是否可使用細胞池來獲得高水平LV。對於本實驗，包裝細胞#29-6經條件性-SIN-LV轉導，該條件性SIN-LV藉由pTet07-CSII-CMVGFPq轉染包裝細胞而產生。接著在搖瓶中之無血清懸浮培養物中測試生產池之生產效率。每天更換培養基，且藉由流式細胞分析技術測定感染性粒子之數量。池之生產模式與兩個純系之生產模式非常相似，除了最高力價(1.9×10 ⁷TU/ml)在第3天而非第4天獲得，且有用生產之持續時間短一天。

不希望受理論束縛，在一些實施例中，細胞培養基係最終慢病毒製劑之污染核酸的來源，例如，培養基可能含有來自溶解之包裝細胞的包裝細胞DNA。因此，在細胞培養基中添加benzonase可降解污染核酸，進而改善重組慢病毒粒子之純化。

接下來，可自包裝細胞培養物中收穫重組慢病毒粒子，以開始重組慢病毒粒子之純化。在一些實施例中，收穫重組慢病毒粒子包括將上清液或細胞培養基與包裝細胞分離。在一些實施例中，包裝細胞在澄清之前不溶解。在一些實施例中，可溶解包裝細胞，且可使溶解物澄清。

天然存在之慢病毒係反轉錄病毒科之一類病毒，其特徵在於潛伏期長。慢病毒通常可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中。慢病毒之實例包括HIV (人類免疫缺陷病毒；包括HIV 1型及HIV 2型)，人類獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)之病原體；維斯納-梅迪病毒(visna-maedi) (導致綿羊腦炎(維斯納)或肺炎(梅迪))、山羊關節炎腦炎病毒(導致山羊免疫缺陷、關節炎及腦病變)；馬傳染性貧血病毒，其導致馬自體免疫性溶血性貧血及腦病變；貓免疫缺陷病毒(FIV)，其導致貓免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其導致牛淋巴結病、淋巴球增多，且可能導致中樞神經系統感染；及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其導致低於人類之靈長類動物免疫缺陷及腦病變。此等病毒引起之疾病具有潛伏期長及病程遷延之特徵。通常，病毒潛伏感染單核球及巨噬細胞，該等細胞傳播至其他細胞。HIV、FIV及SIV亦容易感染T淋巴球(亦即T細胞)。

本文進一步提供一種重組慢病毒粒子，其包含本文揭示之重組慢病毒RNA分子。在一些實施例中，重組慢病毒粒子藉由本文揭示之包裝細胞株產生。

在一些實施例中，重組慢病毒粒子包含本文揭示之重組慢病毒載體。在一些實施例中，重組慢病毒載體包含本文揭示之重組慢病毒RNA分子。在一些實施例中，重組慢病毒粒子進一步包含封裝重組RNA病毒基因體之殼體。在一些實施例中，重組慢病毒粒子進一步包含選自由以下組成之群的Env蛋白：Ba-EVTR、VSV-G及RD114。在一些實施例中，重組慢病毒粒子進一步包含反轉錄酶。

添加有關製造未經基因編輯之TIL之部分 VI. 製備經基因編輯之 TIL 之方法

在本發明之關於用於擴增TIL群體之方法的一些實施例中，該等方法包括一或多個基因編輯至少一部分TIL以增強其治療作用之步驟。如本文所用，「基因編輯(gene-editing/gene editing)」及「基因體編輯」係指一種基因修飾，其中在細胞之基因體中永久性修飾DNA，例如在細胞之基因體內插入、缺失、修飾或置換DNA。在一些實施例中，基因編輯引起DNA序列之表現之緘默(有時稱為基因剔除)或抑制/降低(有時稱為基因減弱)。在其他實施例中，基因編輯引起DNA序列之表現之增強(例如，藉由引起過度表現)。根據本發明之實施例，使用基因編輯技術增強治療性TIL群體之有效性。

在本發明之一些實施例中，本文提供一種製造經基因編輯之TIL群體之方法，其包括：a)藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；b)藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增；及c)在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體表現一或多種細胞介素，諸如IL-12、IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。

細胞表面標記物PD-1、CD39及CD103係識別腫瘤特異性T細胞之主要生物標記物，但此等TIL為終末分化的。最近活化之CD8+ T細胞上CD137 (4-1BB；TNFSR9)之上調已用於識別腫瘤抗原特異性T細胞(Draghi A.等人, Front Immunol 2021;12:705422，其內容以引用的方式整體併入本文中)，其為抗原特異性的且往往具有更適合/更年輕之表型(c-fos及c-jun表現)。CD137透過共刺激效應為抗原引發之T細胞提供增強之存活、增殖及效應功能以及代謝優勢。

因此，本發明提供一種方法，其富集腫瘤特異性CD8 TIL (保留TCR腫瘤反應性庫之廣度)，同時在同一過程中提供CD4 TIL。在一些實施例中，該方法包括引發腫瘤且使用CD137作為標記物來富集及擴增腫瘤特異性T細胞，無需了解表位特異性。參見例如圖48。 A. 獲得患者腫瘤樣品

一般而言，TIL最初獲自患者腫瘤樣品(「初代TIL」)且隨後擴增成更大的群體以用於如本文所描述之進一步操縱。

患者腫瘤樣品可使用此項技術中已知之方法獲得，通常經由手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品的其他手段獲得。在一些實施例中，使用多病灶取樣。在一些實施例中，手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品的其他手段包括多病灶取樣(亦即，自患者中之一或多個腫瘤位點及/或位置以及在相同位置或緊密相鄰的一或多個腫瘤處獲得樣品)。一般而言，腫瘤樣品可來自任何實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣品亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。實體腫瘤可為任何癌症類型，包括(但不限於)乳癌、胰臟癌、前列腺癌、大腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括(但不限於)鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮內膜癌、子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、卵巢癌、肉瘤、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。在一些實施例中，適用之TIL係獲自黑色素瘤。

一旦獲得，腫瘤樣品通常使用銳器分割片段化成1至約8 mm ³之間的小型片狀物，其中約2-3 mm ³為尤其適用的。在一些實施例中，使用酶促腫瘤消化物自此等片段培養TIL。此類腫瘤消化物可藉由在酶促培養基(例如羅斯威爾公園癌症研究所(RPMI) 1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，接著進行機械解離(例如使用組織解離器)來產生。腫瘤消化物可藉由以下產生：將腫瘤置放於酶促培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環，直至僅存在小組織片。在此過程結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用FICOLL分支鏈親水性多醣之密度梯度分離以移除此等細胞。可使用此項技術中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所描述之方法，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所描述之任何實施例中擴增TIL之方法或治療癌症之方法。 B. 腫瘤片段化及 / 或消化

如上文所指出，在一些實施例中，TIL係衍生自實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化且以全腫瘤進行酶消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂下在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂、旋轉下在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂、恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，整個腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。

在一些實施例中，在無菌緩衝液中用凍乾酶復原腫瘤。在一些實施例中，緩衝液為無菌HBSS。

在一些實施例中，酶混合物包含膠原蛋白酶。在一些實施例中，膠原蛋白酶為膠原蛋白酶IV。在一些實施例中，膠原蛋白酶之工作儲備液為100 mg/ml 10X工作儲備液。

在一些實施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些實施例中，DNA酶之工作儲備液為10,000 IU/ml 10X工作儲備液。

在一些實施例中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些實施例中，玻尿酸酶之工作儲備液為10 mg/ml 10X工作儲備液。

在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原蛋白酶、1000 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻尿酸酶。

在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原蛋白酶、500 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻尿酸酶。

在一些實施例中，酶混合物包含中性蛋白酶。在一些實施例中，中性蛋白酶之工作儲備液以175 DMC U/mL之濃度復原。

在一些實施例中，酶混合物包含中性蛋白酶、DNA酶及膠原蛋白酶。

在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原蛋白酶、1000 IU/ml DNA酶及0.31 DMC U/ml中性蛋白酶。在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原蛋白酶、500 IU/ml DNA酶及0.31 DMC U/ml中性蛋白酶。

一般而言，收穫之細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮收穫的」細胞群體。

在一些實施例中，片段化包括物理片段化，包括例如分割以及消化。在一些實施例中，片段化為物理片段化。在一些實施例中，片段化為分割。在一些實施例中，片段化係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一些實施例中，TIL最初可自獲自經基因編輯之前的患者之酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養。

在一些實施例中，當腫瘤為實體腫瘤時，在獲得腫瘤樣品之後，對腫瘤進行物理片段化。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，片段化在獲得腫瘤之後並且在不進行任何冷凍保存的情況下發生。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個片段或塊置於各容器中進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將30或40個片段或塊置於各容器中進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將40個片段或塊置於各容器中進行第一擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4個至約50個片段，其中各片段之體積為約27 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm ³至約1500 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。在一些實施例中，多個片段包含約至約100個片段。

在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm ³與10 mm ³之間。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm ³與8 mm ³之間。在一些實施例中，腫瘤片段為約1 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約2 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約3 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約4 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約5 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約6 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約7 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約8 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約9 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約10 mm ³。在一些實施例中，腫瘤為1至4 mm×1至4 mm×1至4 mm。在一些實施例中，腫瘤為1 mm×1 mm×1 mm。在一些實施例中，腫瘤為2 mm×2 mm×2 mm。在一些實施例中，腫瘤為3 mm×3 mm×3 mm。在一些實施例中，腫瘤為4 mm×4 mm×4 mm。

在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上出血性、壞死及/或脂肪組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上出血性組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上壞死組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上脂肪組織之量減至最小。

在一些實施例中，進行腫瘤片段化以便維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，在不使用解剖刀進行鋸切動作的情況下進行腫瘤片段化。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，藉由在酶促培養基(例如(但不限於) RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)來產生腫瘤消化物。在將腫瘤置於酶促培養基中之後，可以機械方式將腫瘤解離大約1分鐘。隨後可將溶液在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO ₂中再培育30分鐘之後，可將腫瘤第三次機械破壞大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後若大片組織仍存在，則施加1或2次另外機械解離至樣品，不論是否再在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用Ficoll之密度梯度分離以移除此等細胞。

在一些實施例中，將第一擴增步驟之前收穫的細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮收穫的」細胞群體。

在一些實施例中，細胞可視情況在樣品收穫之後冷凍且在進入下文進一步詳細描述之擴增之前冷凍儲存。

在一些實施例中，TIL係藉由解凍冷凍保存之腫瘤消化物來獲得，該冷凍保存之腫瘤消化物包含源於自個體切除之腫瘤之第一TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體係藉由將自個體獲得之腫瘤樣品加工成腫瘤消化物而由自個體切除之腫瘤獲得。在一些實施例中，腫瘤消化物或腫瘤片段包含第一TIL群體且由自個體切除之腫瘤獲得。

在一些實施例中，本文揭示之方法包括將腫瘤消化物或腫瘤片段添加至密閉系統中，其中腫瘤消化物或腫瘤片段包含第一TIL群體且由自個體切除之腫瘤獲得。在一些實施例中，本文揭示之方法包括藉由解凍冷凍保存之腫瘤消化物進行第一擴增，該冷凍保存之腫瘤消化物包含源於自個體切除之腫瘤之第一TIL群體。在一些實施例中，本文揭示之方法包括藉由將自患者獲得之腫瘤樣品加工成腫瘤消化物或多個腫瘤片段而由自患者切除之腫瘤獲得第一TIL群體。

在一些實施例中，可以透過若干次凍融循環或質譜程序自腫瘤消化物中進一步獲得腫瘤溶解物。

在一些實施例中，腫瘤片段及/或腫瘤消化物及/或腫瘤溶解物可視情況在進入引發步驟之前冷凍且冷凍儲存。

在一些實施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些實施例中，DNA酶之工作儲備液為10,000IU/mL 10X工作儲備液。

在一些實施例中，片段化包括物理片段化，包括例如分割以及消化。在一些實施例中，片段化為物理片段化。在一些實施例中，片段化為分割。在一些實施例中，片段化係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養。

在一些實施例中，TIL並非自腫瘤消化物獲得。在一些實施例中，實體腫瘤核心未片段化。

在一些實施例中，獲得第一TIL群體包括多病灶取樣方法。

腫瘤解離酶混合物可包括一或多種解離(消化)酶，諸如但不限於膠原蛋白酶(包括膠原蛋白酶之任何摻合物或類型)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶(hyaluronidase)、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、彈性蛋白酶(elastase)、木瓜酶(papain)、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶(pronase))、去氧核糖核酸酶I (DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白分解酶，及其任何組合。

在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶復原。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如漢克平衡鹽溶液(Hank’s balance salt solution，HBSS))中復原。

在一些情況下，膠原蛋白酶(諸如無動物源1型膠原蛋白酶)係在10 mL無菌HBSS或另一緩衝液中復原。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶2892 PZ U。在一些實施例中，膠原蛋白酶係在5 mL至15 mL緩衝液中復原。在一些實施例中，在復原後，膠原蛋白酶儲備液之範圍為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL，例如約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約350 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約300 PZ U/mL、約150 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL、約150 PZ U/mL、約200 PZ U/mL、約210 PZ U/mL、約220 PZ U/mL、約230 PZ U/mL、約240 PZ U/mL、約250 PZ U/mL、約260 PZ U/mL、約270 PZ U/mL、約280 PZ U/mL、約289.2 PZ U/mL、約300 PZ U/mL、約350 PZ U/mL或約400 PZ U/mL。

在一些實施例中，中性蛋白酶係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中復原。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶175 DMC U。在一些實施例中，在復原後，中性蛋白酶儲備液之範圍為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL，例如約100 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL-約350 DMC/mL、約100 DMC/mL-約300 DMC/mL、約150 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL、約110 DMC/mL、約120 DMC/mL、約130 DMC/mL、約140 DMC/mL、約150 DMC/mL、約160 DMC/mL、約170 DMC/mL、約175 DMC/mL、約180 DMC/mL、約190 DMC/mL、約200 DMC/mL、約250 DMC/mL、約300 DMC/mL、約350 DMC/mL或約400 DMC/mL。

在一些實施例中，DNA酶I係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中復原。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶4 KU。在一些實施例中，在復原後，DNA酶I儲備液之範圍為約1 KU/mL至10 KU/mL，例如約1 KU/mL、約2 KU/mL、約3 KU/mL、約4 KU/mL、約5 KU/mL、約6 KU/mL、約7 KU/mL、約8 KU/mL、約9 KU/mL或約10 KU/mL。

在一些實施例中，酶之儲備液可變化，因此檢驗凍乾儲備液之濃度且及相應地修改添加至消化混合液中之酶之最終量。

在一些實施例中，酶混合物包括約4.7 mL無菌HBSS中的約10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3 µL膠原蛋白酶(1.2 PZ/mL)及250 μl DNA酶I (200 U/mL)。 C. 引發

在一些實施例中，該方法包括引發步驟，其中在IFNγ存在下引發腫瘤消化物(參見圖48)。在一些實施例中，IFNγ以約10 ng/mL、約20 ng/mL、約30 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約300 ng/mL、約400 ng/mL、約500 ng/mL、約600 ng/mL、約700 ng/mL、約800 ng/mL、約900 ng/mL、約1,000 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，IFNγ以約100 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，IFNγ以約200 ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，IFNγ以約400 ng/mL之濃度存在。

在一些實施例中，引發步驟包含IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或更多者之組合。因此，可能之組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21、及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且尤其如其中所描述之T細胞。

在一些實施例中，引發步驟包含IL-2。在一些實施例中，IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，引發步驟不包含附加的IL-2。在一些實施例中，引發步驟包含濃度為約1 ng/mL至約100 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，引發步驟包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，引發步驟包含IL-2及IL-21。在一些實施例中，引發步驟包含3000 IU/mL之IL-2及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，引發步驟包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，引發步驟包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。

引發步驟可持續約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約18小時、約24小時、約30小時、約36小時、約48小時。在一些實施例中，引發步驟持續12小時。在一些實施例中，引發步驟持續24小時。在一些實施例中，引發步驟持續30小時。在一些實施例中，引發步驟持續36小時。在一些實施例中，引發步驟持續48小時。 D. 富集腫瘤反應性 TIL

本發明涵蓋用於富集及擴增具有CD137+表型之腫瘤反應性T細胞群體之方法。在一些實施例中，引發步驟後之TIL群體富集CD137+ TIL (參見圖48)。舉例而言，「CD137+」或「表現CD137」之細胞在本文中與CD137-或不表現可偵測水準之CD137之細胞形成對比。如本文所用，「CD137暗」細胞具有比CD137+細胞或「CD137亮」細胞更低之可偵測水準之CD137表現。在一個實施例中，腫瘤反應性T細胞對CD137及PD-1均呈現陽性。舉例而言，「CD137+PD-1+」或「表現CD137及PD-1」之細胞在本文中與CD137-PD-1+、CD137+PD-1-或不表現可偵測水準之CD137或PD-1之細胞形成對比。

本發明涵蓋使用用於分離CD137+細胞的簡單直接之基於抗體之純化系統來分離該等細胞之方法。然而，任何細胞分離方法皆可用於自生物樣品中分離本發明之細胞。例如，結合於CD137之抗體可結合於實體支撐物，諸如磁珠、Dynal珠、微珠、管柱、吸附管柱及吸附膜。將抗體結合於實體支撐物係此項技術中熟知的。或者，可自多種來源購買結合於實體支撐物(諸如磁珠)之抗體，例如Milteny Biotec (Auburn, CA)。

文獻表明，一些腫瘤反應性TIL存在於CD137+群體中。CD39更具選擇性，且由大多數假定之CD4腫瘤反應性(PD1+ICOS+)群體表現。大多數假定之腫瘤反應性CD4+CXCL13群體皆表現CD200。因此，在一些實施例中，富集步驟可進一步包括選擇表現CD200及/或CD39之TIL。此外，OX40為已知之CD4 T細胞活化標記物，在消化培養物中TCR刺激後24小時其可能會上調。因此，在一些實施例中，富集步驟可進一步包括選擇表現CD200、CD39及/或OX40之TIL。

藉由除抗CD137抗體之外亦包括抗CD200抗體、抗C39抗體及/或抗OX40抗體，腫瘤反應性TIL之產量將藉由本文揭示之方法增加，此仍然移除很大一部分旁觀者TIL。在一些實施例中，腫瘤反應性TIL可為CD200+細胞群體。在一些實施例中，腫瘤反應性TIL可為CD39+細胞群體。在一些實施例中，腫瘤反應性TIL可為OX40+細胞群體。

在一些實施例中，使TIL群體富集CD137+ TIL包括使TIL群體與固定在珠粒上之抗CD137抗體接觸。在一些實施例中，方法進一步包括使TIL群體與固定在珠粒上之抗CD39抗體接觸。在一些實施例中，方法進一步包括使TIL群體與固定在珠粒上之抗CD200抗體接觸。在一些實施例中，方法進一步包括使TIL群體與固定在珠粒上之抗OX40抗體接觸。

多種抗體可用於本發明。如熟習此項技術者將理解，任何能夠識別且結合於所關注之抗原(諸如CD137、CD200、CD39或OX40)之抗體皆可用於本發明。製造及使用此類抗體之方法係此項技術中熟知的。例如，可用於本發明之多株抗體係藉由根據此項技術中熟知之標準免疫學技術對兔進行免疫而產生。 E. 第一擴增

在一些實施例中，在包含飼養細胞第二細胞培養基中培養由富集步驟產生之腫瘤反應性TIL。在一些實施例中，飼養細胞為T細胞耗減之飼養細胞，諸如T細胞耗減之PBMC (參見圖48)。

在一些實施例中，將由富集步驟產生之腫瘤反應性TIL在有利於TIL生長但不利於腫瘤及其他細胞生長的條件下於含有IL-2之血清中培養。在一些實施例中，由富集步驟產生之腫瘤反應性TIL在2 mL孔中在包含具有6000 IU/mL IL-2之不活化人類AB血清之培養基中培育。在一些實施例中，將腫瘤反應性TIL培養數天之時段，通常3至14天。在一些實施例中，將腫瘤反應性TIL培養5至11天之時段。在一些實施例中，將腫瘤反應性TIL培養7至10天之時段。在一些實施例中，將腫瘤反應性TIL培養約9天之時段。

在TIL培養係在24孔盤中起始，例如，使用Costar 24孔細胞培養簇平底(Corning公司, Corning, NY)之實施例中，各孔可在具有IL-2 (6000 IU/mL；Chiron公司，Emeryville，CA)之2 mL完全培養基(CM)中用1×10 ⁶個腫瘤消化物細胞或一個腫瘤片段接種。

在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，第一擴增之CM由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在具有40 mL容量及10 cm ²透氣矽底之透氣瓶(例如，G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)中起始培養之實施例中，各瓶可裝載有含10-40×10 ⁶個活腫瘤消化物細胞或5-30個腫瘤片段之10-40 mL具有IL-2之CM。G-Rex10及24孔盤皆可在濕氣培育箱中在37℃、5% CO ₂下培育且在培養起始後5天，可移除一半培養基且更換為新鮮的CM及IL-2，且在第5天之後，可每2-3天更換一半培養基。

在一些實施例中，本文揭示之擴增過程中使用的培養基為無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，無血清或確定培養基用於防止及/或減少部分因含血清培養基之批次間變化所致之實驗變化。

在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括(但不限於) CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(Minimal Essential Medium，BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(Glasgow's Minimal Essential Medium，G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。

在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包括(但不限於)以下中之一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、Co ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。

在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該習知生長培養基包括(但不限於) CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。

在一些實施例中，以無血清或確定培養基之總體積計，無血清或確定培養基中之總血清替代物濃度(vol%)為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約10%。

在一些實施例中，無血清或確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，其在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，其在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度為約0.1 mM至約10 mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM或4 mM至約5 mM之麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度為約2 mM之麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。

在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度為約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度為約55 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含一或多種選自由以下組成之群的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自由以下組成之群的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、Co ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。

在一些實施例中，確定培養基中甘胺酸之濃度在約5-200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5-250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5-300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5-200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5-400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1-1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1-45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1-250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10-500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2-110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3-175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5-500 mg/L，硫胺素之濃度為約1-20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1-20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1-200 mg/L，鐵飽和運鐵蛋白之濃度為約1-50 mg/L，胰島素之濃度為約1-100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001-0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000至50,000 mg/L。

在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以下表11中之標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列舉之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表11中之標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列舉之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包含下表11中之標題「補充劑之較佳實施例」欄中列舉之類型及濃度的非微量部分成分。

在一些實施例中，確定培養基之滲透壓介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度為約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度為約100 μM)、2-巰基乙醇(最終濃度為約100 μM)。

在一些實施例中，Smith等人, Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™用作基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。

在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。

在製備腫瘤片段之後，所得細胞(亦即，片段)在含有IL-2之血清中，在相對於腫瘤及其他細胞有利於TIL生長之條件下培養。在一些實施例中，將腫瘤消化物在2 mL孔中，在包含不活化人類AB血清(或在一些情況下，如本文所概述，在存在APC細胞群體之情況下)及6000 IU/mL IL-2的培養基中培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，通常10至14天，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，第一擴增期間之生長培養基包含IL-2或其變異體。在一些實施例中，IL為重組人類IL-2 (rhIL-2)。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20-30×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備液具有4-8×10 ⁶IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有5-7×10 ⁶IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有6×10 ⁶IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含1000與2000 IU/mL之間、2000與3000 IU/mL之間、3000與4000 IU/mL之間、4000與5000 IU/mL之間、5000與6000 IU/mL之間、6000與7000 IU/mL之間、7000與8000 IU/mL之間、1000與5000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。

在一些實施例中，第一擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第一擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一擴增可進行14天。在一些實施例中，第一擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一擴增可進行11天。在一些實施例中，第一擴增可進行5天至7天。在一些實施例中，第一擴增可進行6天至7天。在一些實施例中，第一擴增可進行7天至12天。在一些實施例中，第一擴增可進行8天至12天。在一些實施例中，第一擴增可進行9天至12天。在一些實施例中，第一擴增可進行10天至12天。在一些實施例中，第一擴增可進行7天。在一些實施例中，第一擴增可進行9天。

在一些實施例中，在密閉系統生物反應器中進行第一擴增。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。

在一些實施例中，第一細胞培養基包含6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一細胞培養基包含3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一細胞培養基包含2000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一細胞培養基包含1000 IU/mL IL-2。 F. 活化

在一些實施例中，在第一擴增(預REP)步驟之後，藉由向培養基中添加抗CD3促效劑及抗CD28促效劑(例如TransAct)且培養約1至3天來活化TIL，其中TIL將用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。

在一些實施例中，活化第二TIL群體(自第一擴增或預REP步驟獲得)之步驟可進行大約、小於、大於1天、2天、3天或介於任何上述值之間的範圍的時段。例如，在一些實施例中，活化第二TIL群體之步驟進行約1天。在一些實施例中，活化第二TIL群體之步驟進行約2天。在一些實施例中，活化第二TIL群體之步驟進行約3天。

在一些實施例中，使用抗CD3促效劑及抗CD28促效劑，諸如TransAct進行活化第二TIL群體(自第一擴增或預REP步驟獲得)之步驟。在一些實施例中，活化第二TIL群體之步驟使用TransAct以1:10稀釋度、以1:17.5稀釋度、以1:20稀釋度、以1:25稀釋度、以1:30稀釋度、以1:40稀釋度、以1:50稀釋度、以1:60稀釋度、以1:70稀釋度、以1:80稀釋度、以1:90稀釋度或以1:100稀釋度進行。

在一些實施例中，活化第二TIL群體(自第一擴增或預REP步驟獲得)之步驟可藉由將抗CD3促效劑及抗CD28促效劑，諸如TransAct添加至第一細胞培養基進行。在一些實施例中，活化第二TIL群體之步驟可藉由用包含抗CD3促效劑及抗CD28促效劑，諸如TransAct之細胞培養基替換第一細胞培養基來進行。

在一些實施例中，方法可包括在用重組慢病毒粒子轉導TIL群體之前活化TIL群體1天、2天、3天或4天。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與選自由以下組成之群的細胞介素接觸：IL-2、IL-15、IL-21、IL-7及其組合。

在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與20 ng/mL IL-15接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與10 ng/mL IL-7接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct接觸。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。在一些實施例中，活化步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。 G. 慢病毒粒子產生

在一些實施例中，使用重組表現載體、編碼病毒gag、pol、env及rev之一或多種輔助質體及/或本文揭示之包裝細胞株產生重組慢病毒粒子。

可使用以下一般步驟。首先，在細胞培養基中培養包裝細胞群體。一旦獲得足夠數目之包裝細胞，所需核酸，諸如包含編碼本文揭示之細胞介素之核酸分子的轉移載體，可引入包裝細胞中。可引入包裝細胞中之額外核酸包括促進包裝之質體，例如編碼病毒gag、pol、env及rev之質體。接著包裝細胞開始產生重組慢病毒粒子。

在一些實施例中，將HEK 293T細胞重懸於病毒培養基(10% FBS、DMEM (高葡萄糖、麩醯胺酸)、丙酮酸鈉(1% w/v)、碳酸氫鈉(0.075%)或HEPES，無Pen/strep)中。

第二天，將Gag/Pol輔助質體、Rev輔助質體、BaEVTR或VSV-G輔助質體以及轉移載體以1 µg/μL濃度以1:1莫耳比混合。混合後，添加30 µL TransIT ^®-Lenti試劑(Mirus Bio)，且在每個HEK 293T培養皿1 mL Opti-MEM™培養基中室溫培育10分鐘。接著將HEK 293T細胞在37℃、5% CO ₂下培育2天。

自培養皿中取出培養物上清液，且將新鮮培養基添加至每個培養皿中，以200 g離心5分鐘以移除細胞碎片，且接著使用0.45 µM過濾器過濾。接著經由60,000 g超速離心2小時濃縮病毒上清液。超速離心後，移除上清液，且將病毒團塊重新溶解在Opti-MEM™培養基中。可重複病毒粒子收穫步驟以最佳化病毒產生。 H. 轉導

在一些實施例中，在活化步驟之後，TIL經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導。

在一些實施例中，轉導步驟以約10 ⁴-10 ⁶個細胞/毫升之TIL濃度進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10 ⁴個細胞/毫升之TIL濃度進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10 ⁶個細胞/毫升之TIL濃度進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。在一些實施例中，轉導步驟以約10之MOI進行。在一些實施例中，轉導步驟以約20之MOI進行。在一些實施例中，轉導步驟以約30之MOI進行。在一些實施例中，轉導步驟以約40之MOI進行。

在一些實施例中，藉由每孔添加250 uL，在塗佈Retronectin (在PBS中1:100稀釋)之非組織培養48孔盤中進行轉導步驟。接著將48孔盤包裹在石蠟膜中，且接著在4℃下培育隔夜。

自Retronectin塗佈之培養盤移除塗佈溶液且用250 uL 2% BSA部分V替換。將培養盤在室溫下培育30分鐘以進行阻斷。添加以下： a. 100 uL TIL懸浮液(1e5個細胞) b. 300 uL CM2 + IL-15 (20 ng/mL) + IL-7 (40 ng/mL) + Lentibooster 1:50 c. MOI範圍為10-40之慢病毒 d. 以不含建它黴素之CM2調節，每孔總體積600 uL

接著將培養盤在32℃、2000×g下離心45分鐘。

在一些實施例中，轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟包括離心。在一些實施例中，轉導步驟在Lentibooster存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟在Lentibooster存在下以1:50之比率進行。

在一些實施例中，轉導步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。

在一些實施例中，方法進一步包括在轉導步驟之後使TIL群體靜置1天、2天、3天或4天。 I. 第二擴增

在一些實施例中，TIL細胞群體之數目在初始主體加工、預REP擴增及基因修飾之後擴增，其中經擴增之TIL已經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在此項技術中通常稱為快速擴增過程(REP)之擴增過程。第二擴增通常使用包含多種組分(包括飼養細胞、細胞介素來源及抗CD3促效劑抗體)之培養基在透氣容器中完成。

在一些實施例中，TIL之第二擴增(其可包括有時稱為REP之擴增)可使用熟習此項技術者已知之任何TIL瓶或容器進行，其中經擴增之TIL已經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。在一些實施例中，第二擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二擴增可進行約7天至約12天。在一些實施例中，第二擴增可進行約7天至約10天。在一些實施例中，第二擴增可進行約7天至約9天。在一些實施例中，第二擴增可進行約8天至約9天。在一些實施例中，第二擴增可進行約9天。在一些實施例中，第二擴增可進行約10天。在一些實施例中，第二擴增可進行約11天。

在一些實施例中，第二擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包括例如稱為REP之擴增)進行。舉例而言，TIL可在介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激而快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包括例如抗CD3促效劑抗體，諸如約30 ng/ml OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil (Raritan, NJ)或Miltenyi Biotech (Auburn, CA))或UHCT-1 (可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種抗原(包括其抗原部分，諸如抗原決定基)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該等抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體表現，該載體諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1:26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他適合的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈遞細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經照射之自體淋巴球或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二擴增之部分發生。在一些實施例中，第二擴增在經照射之自體淋巴球或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下發生。

在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含1000與2000 IU/mL之間、2000與3000 IU/mL之間、3000與4000 IU/mL之間、4000與5000 IU/mL之間、5000與6000 IU/mL之間、6000與7000 IU/mL之間、7000與8000 IU/mL之間或8000 IU/mL的IL-2。

在一些實施例中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL或約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、1 ng/mL與5 ng/mL之間、5 ng/mL與10 ng/mL之間、10 ng/mL與20 ng/mL之間、20 ng/mL與30 ng/mL之間、30 ng/mL與40 ng/mL之間、40 ng/mL與50 ng/mL之間及50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。

在一些實施例中，抗原呈遞飼養細胞(APC)為PBMC。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL與PBMC及/或抗原呈遞細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL與PBMC之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL與PBMC之比率介於1比100與1比200之間。

在一些實施例中，REP及/或第二擴增係在燒瓶中進行，其中在150 ml培養基中混合主體TIL與100倍或200倍過量之不活化飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2。替換培養基(通常經由抽吸新鮮培養基來替換2/3培養基)直至細胞轉移至替代生長箱室。替代生長箱室包括G-REX瓶及透氣容器，如下文更充分論述。

在一些實施例中，如實例及圖式中所論述，第二擴增(其可包括稱為REP過程之過程)縮短為7至14天，其中藉由此類第二擴增進行擴增之TIL已經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。在一些實施例中，第二擴增縮短為9天。

在一些實施例中，REP及/或第二擴增可使用如先前描述的T-175瓶及透氣袋(Tran等人, J. Immunother. 2008, 31,742-51；Dudley等人, J. Immunother. 2003, 26,332-42)或透氣性培養器皿(G-Rex瓶)進行，其中藉由此類第二擴增進行擴增之TIL已經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。在一些實施例中，第二擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係在T-175瓶中進行，且可將懸浮於150 mL培養基中之約1×10 ⁶個TIL添加至各T-175瓶中。TIL可在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物中培養。T-175瓶可在37℃、5% CO ₂下培育，其中藉由此類第二擴增進行擴增之TIL已經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。可在第5天使用具有3000 IU/mL IL-2的50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，可將來自兩個T-175瓶之細胞在3 L袋中合併，且將300 mL AIM V與5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2添加至300 ml TIL懸浮液中。每天或每兩天對各袋中之細胞數目進行計數，且添加新鮮培養基以使細胞計數保持在0.5與2.0×10 ⁶個細胞/毫升之間。

在一些實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增)可在500 mL容量的具有100 cm透氣矽底之透氣瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing公司)中進行，5×10 ⁶或10×10 ⁶個TIL可與PBMC一起在400 mL補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養，其中藉由此類第二擴增進行擴增之TIL已經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。G-Rex 100瓶可在37℃、5% CO ₂下培育。在第5天，可移出250 mL上清液且置放於離心瓶中且以1500 rpm (491 × g)離心10分鐘。TIL離心塊可用150 mL具有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回初始G-Rex 100瓶中。當TIL在G-Rex 100瓶中連續擴增時，在第7天，各G-Rex 100中之TIL可懸浮於各瓶中存在之300 mL培養基中，且細胞懸浮液可分成可用於接種3個G-Rex 100瓶之3份100 mL等分試樣。隨後可將150 mL具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各瓶中。G-Rex 100瓶可在37℃、5% CO ₂下培育且在4天之後，可將具有3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V添加至各G-REX 100瓶中。可在培養之第14天收穫細胞。

在一些實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增)可在500 mL容量的具有100 cm透氣矽底之透氣瓶(G-REX-100，可購自Wilson Wolf Manufacturing公司, New Brighton, MN, USA)中進行，5×10 ⁶或10×10 ⁶個TIL可與PBMC一起在400 mL補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養。G-REX-100 (或G-REX100M)可在37℃、5% CO ₂下培育。在第5天，可移出250 mL上清液且置放於離心瓶中且以1500 rpm (491 × g)離心10分鐘。TIL離心塊可用150 mL具有5%人類AB血清、6000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回初始GREX-100瓶中。當TIL在GREX-100瓶中連續擴增時，在第10或11天，可將TIL移至更大瓶，諸如GREX-500 (或G-REX500M)。可在培養之第14天收穫細胞。可在培養之第15天收穫細胞。可在培養之第16天收穫細胞。在一些實施例中，替換培養基直至細胞轉移至替代生長箱室。在一些實施例中，藉由抽吸用過之培養基且用等體積之新鮮培養基替換來替換2/3之培養基。在一些實施例中，替代生長箱室包括GREX瓶及透氣容器，如下文更充分論述。在一些實施例中，該方法採用不同離心速度(400g、300g、200g持續5分鐘)及不同之重複次數。

在一些實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在燒瓶中進行，其中在150 ml培養基中混合主體TIL與100倍或200倍過量之不活化飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，替換培養基直至細胞轉移至替代生長箱室，其中藉由此類第二擴增進行擴增之TIL已經本文揭示之重組慢病毒粒子轉導以產生經基因編輯之TIL群體。在一些實施例中，藉由抽吸用過之培養基，接著輸註新鮮培養基來替換2/3之培養基。在一些實施例中，替代生長箱室包括G-REX瓶及透氣容器，如下文更充分論述。

在一些實施例中，第二擴增培養基(例如，有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈遞飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。

在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括(但不限於) CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。

在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包括(但不限於)以下中之一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、C _O ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。

在一些實施例中，無血清或確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，其在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)以及55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，其在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基(其以引用之方式併入本文中)適用於本發明中。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含一或多種選自由以下組成之群的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自由以下組成之群的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、C _O ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。

在一些實施例中，確定培養基中甘胺酸之濃度在約5-200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5-250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5-300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5-200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5-400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1-1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1-45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1-250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10-500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2-110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3-175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5-500 mg/L，硫胺素之濃度為約1-20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1-20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1-200 mg/L，鐵飽和運鐵蛋白之濃度為約1-50 mg/L，胰島素之濃度為約1-100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001-0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000-50,000 mg/L。

在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以下表12中之標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列舉之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表12中之標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列舉之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包含下表12中之標題「補充劑之較佳實施例」欄中列舉之類型及濃度的非微量部分成分。

在一些實施例中，Smith等人, Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™用作基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。

在一些實施例中，在密閉系統生物反應器中進行第二擴增。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。

在一些實施例中，方法之步驟在約22天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約8天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約9天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約10天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約11天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約12天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約13天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約14天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約15天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約16天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約17天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約18天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約19天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約20天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約21天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約22天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約23天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約24天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約25天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約26天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約27天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約28天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約29天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約30天之時段內完成。在一些實施例中，方法之步驟在約31天之時段內完成。

在一些實施例中，抗原呈遞細胞(APC)為PBMC。根據一些實施例，PBMC經照射。根據一些實施例，PBMC為同種異體的。根據一些實施例，PBMC經照射且為同種異體的。根據一些實施例，抗原呈遞細胞為人工抗原呈遞細胞。

在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以之間的初始濃度存在1500 IU/mL與6000 IU/mL於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2500 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以3000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以3500 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以4000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以4500 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以5000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以5500 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1000 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1500 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2000 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2500 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以3000 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以3500 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以4000 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以4500 IU/mL與5000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1000 IU/mL與4000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1500 IU/mL與4000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2000 IU/mL與4000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2500 IU/mL與4000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以3000 IU/mL與4000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以3500 IU/mL與4000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1000 IU/mL與3000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1500 IU/mL與3000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2000 IU/mL與3000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以2500 IU/mL與3000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1000 IU/mL與2000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，在第一擴增中IL-2以1500 IU/mL與2000 IU/mL之間的初始濃度存在於細胞培養基中。

在一些實施例中，第二擴增步驟，IL-2以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在且OKT-3抗體以約30 ng/mL之初始濃度存在。

在一些實施例中，第一擴增使用透氣容器進行。在一些實施例中，第二擴增使用透氣容器進行。

在一些實施例中，第一細胞培養基進一步包含選自由以下組成之群的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。在一些實施例中，第二細胞培養基及/或第三培養基進一步包含選自由以下組成之群的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。 1.飼養細胞及抗原呈遞細胞

在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序在REP TIL擴增期間及/或在第二擴增期間需要過量的飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係自健康血液供體之標準全血單位獲得的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。

一般而言，同種異體PBMC係經由照射或熱處理而不活化，且如實例中所描述用於REP程序，其提供用於評估經照射之同種異體PBMC之無複製能力的例示性方案。

在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在REP之第0天及/或第二擴增之第0天(亦即，第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目，則認為PBMC係無複製能力的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。

在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP之第0天及/或第二擴增之第0天(亦即第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係無複製能力的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。

在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP之第0天及/或第二擴增之第0天(亦即第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係無複製能力的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5-60 ng/mL OKT3抗體及1000-6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10-50 ng/mL OKT3抗體及2000-5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20-40 ng/mL OKT3抗體及2000-4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25-35 ng/mL OKT3抗體及2500-3500 IU/mL IL-2存在下培養。

在一些實施例中，抗原呈遞飼養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈遞飼養細胞為人工抗原呈遞飼養細胞。在一些實施例中，第二擴增中TIL與抗原呈遞飼養細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在第二擴增中TIL與抗原呈遞飼養細胞之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在第二擴增中TIL與抗原呈遞飼養細胞之比率介於1比100與1比200之間。

在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約2.5×10 ⁹個飼養細胞與約100×10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約2.5×10 ⁹個飼養細胞與約50×10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約2.5×10 ⁹個飼養細胞與約25×10 ⁶個TIL之比率。

在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序在第二擴增期間需要過量的飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係自健康血液供體之標準全血單位獲得的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈遞細胞(aAPC)代替PBMC。

在一些實施例中，在第二擴增中使用人工抗原呈遞細胞來替代PBMC或與PBMC組合使用。 2.細胞介素及其他添加劑

本文所描述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(尤其IL-2)之培養基，如此項技術中所已知。

或者，使用細胞介素之組合進行TIL之快速擴增及/或第二擴增係可能的，如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述，使用IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或更多者的組合。因此，可能組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21以及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且尤其如其中所描述之T細胞。

在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含IL-2。在一些實施例中，IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基不含附加的IL-2。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含濃度為約1 ng/mL至約100 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基或第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基包含IL-2及IL-21。在一些實施例中，第一細胞培養基包含3000 IU/mL之IL-2及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。在一些實施例中，第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及蛋白激酶B (AKT)抑制劑。在一些實施例中，AKT抑制劑係選自由以下組成之群：帕他色替、GSK690693、GSK2141795、GSK2110183、AZD5363、GDC-0068、AT7867、CCT128930、MK-2206、BAY 1125976、哌立福辛、冬淩草甲素、草質素、特黑內酯、異甘草素、黃芩素及和厚樸酚。

在一些實施例中，第一擴增進行約7-11天之時段。在一些實施例中，第二擴增進行約7-11天之時段。 3.T細胞代謝修飾劑

活體外擴增改變TIL細胞狀態，此與ACT功效相關(Chiffelle, J.等人, bioRxiv 2023，其內容以引用之方式整體併入本文中)。快速擴增之TIL具有生物能及生物合成之需求。增加諸如L-精胺酸及NAD+之必需輔因子之可用性可能支持主要生物質成分之合成。在活體外擴增過程中功能性地重振細胞可能會產生具有新效應特徵之TIL。

因此，本文提供T細胞代謝修飾劑，其增加必需輔因子L-精胺酸及NAD ⁺之可用性以支持TIL中主要生物質組分之合成，其可添加到TIL之第二擴增(REP)中。

L-精胺酸係蛋白質合成之構築塊，經由代謝修飾來改善T細胞功能(Geiger R.等人, Cell 2016: 167；829-842；Fultang, L., Blood 2020；136: 1155-60；其內容以引用之方式整體併入本文中)。

NAD+ (菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸)係一種電子受體，在生物質合成過程中被大量消耗，且其補充可改善T細胞功能(Canto C等人, Cell Metabolism 2015；22:31-53；Wang Y.等人, Cell Reports 2021；36:1-12；其內容以引用之方式整體併入本文中。

NAD+ (菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸)係細胞代謝中之中心輔酶，特別是在氧化還原反應中，其在氧化(NAD+)及還原(NADH)狀態之間循環。在TIL之背景下，NAD+在調節其代謝適應性及功能方面發揮關鍵作用。TIL在腫瘤微環境中發揮作用，腫瘤微環境的特徵通常在於營養缺乏及缺氧。在此充滿挑戰之微環境中，TIL必須調整其代謝以維持其抗腫瘤活性。

NAD+以多種方式增強T細胞之代謝適應性：糖解作用及磷酸戊糖路徑(PPP)：雖然糖解作用不直接使用NAD+，但自NADH再生NAD+對於維持糖解通量至關重要，此在粒線體呼吸受限之缺氧條件下尤其重要。PPP係糖解作用之分支，依賴於NADP+ (NAD+之磷酸化形式)來產生5-磷酸核糖且還原麩胱甘肽，從而有助於核苷酸合成及抗氧化防禦機制。粒線體功能：NAD+在粒線體中至關重要，因為其為三羧酸(TCA)循環及氧化磷酸化(OXPHOS)中之關鍵電子受體。增強之粒線體功能可支持記憶T細胞之分化及存活，此對於持續之抗腫瘤免疫性至關重要。長壽蛋白(Sirtuin)活化：長壽蛋白係NAD+依賴性去乙醯化酶家族，其可調節細胞代謝、壓力反應及發炎。藉由活化長壽蛋白，NAD+可促進記憶T細胞之形成，且增強其抗腫瘤功能。 PARP活性：NAD+係聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)之受質，其參與DNA修復及基因體穩定性。藉由促進PARP之功能，NAD+有助於在腫瘤內DNA損傷之情況下維持TIL完整性。

為複製及增強NAD+為TIL提供之益處，可考慮藥理學及遺傳學方法：藥理學方法： - NAD+前驅物：經由投與NAD+前驅物(諸如菸鹼醯胺核苷(NR)或菸鹼醯胺單核苷酸(NMN))來增強NAD+可增加細胞內NAD+水準，從而支持TIL代謝及功能。 - NAD+：提高NAD+代謝受質直接對TIL之可用性 - 長壽蛋白活化劑：如白藜蘆醇或SRT1720之化合物可活化長壽蛋白，從而模仿高NAD+水準之作用且促進TIL抗腫瘤活性。 - PARP抑制劑：雖然PARP活性依賴於NAD+，且可能為有益的，但過度活化會耗盡細胞NAD+儲備。PARP抑制劑可幫助在壓力條件下保持NAD+水平，從而有可能支持T細胞功能。 - CD38抑制劑：CD38使用NAD+產生ADP-核糖及環狀ADP-核糖，此對鈣信號傳導很重要，但亦會消耗NAD+。CD38抑制劑可能有助於維持TIL中之NAD+水準。遺傳學方法： - NAMPT過度表現：此為NAD+挽救路徑中之限速酶。過度表現NAMPT可提高TIL中NAD+之細胞內濃度。 - 長壽蛋白基因之操縱：進行基因修飾以過度表現長壽蛋白基因，有可能模擬高NAD+水準之作用且增強TIL功能。 - NAD+消耗酶之基因緘默：編碼大量消耗NAD+之酶(如CD38或PARP家族成員)之基因緘默或減弱，可能會保留TIL必需之代謝過程中之NAD+。 - TCA循環及OXPHOS支持：增強參與粒線體生物發生及功能之基因可支持NAD+之有效利用且維持TIL代謝適應性。

加強TIL中之NAD+利用之藥理學及遺傳學工具以特定分子標靶及路徑為中心。在一些實施例中，用於加強NAD+利用之示例性工具集中於以下功能中之一或多種：粒線體生物發生、促進有效能量利用以及培育抗腫瘤表型。在實施例中，此類工具以協調一致之方式實施，注意增強TIL功能與避免可能導致衰竭或細胞凋亡之過度刺激之間的平衡。在一些實施例中，在設計此等干預措施時考慮TIL群體內之異質性及每個腫瘤之獨特微環境。因此，透過藥理學及遺傳學方法調節粒線體功能可能為增強授受性TIL療法功效之強大策略。以下進一步詳述加強NAD+利用之工具。 NAD+ 路徑之藥理學操縱： 1. NAD+ 前驅物與 NAD+： ○ 菸鹼醯胺核苷 (NR)及 菸鹼醯胺單核苷酸 (NMN)係NAD+前驅物。其經由挽救路徑轉化為NAD+，NR涉及菸鹼醯胺核苷激酶(NRK1/2)且NMN涉及NMN腺苷醯轉移酶(NMNAT1/2/3)。 ○ 亦可使用 菸鹼酸 (NA)，其經由普萊斯-漢德勒路徑(Preiss-Handler pathway)轉化為NAD+，但其會因前列腺素介導之血管舒張而導致潮紅。 ○ 菸鹼醯胺二核苷酸 (NAD+)本身亦可使用，因為已證明其可穿過脂質雙層且進入粒線體。 2. 長壽蛋白調節劑： ○ 白藜蘆醇係一種活化長壽蛋白之化合物(STAC)，可增強SIRT1活性，進而可去乙醯化且活化過氧化體增殖物活化受體γ共活化因子1-α (PGC-1α)，後者為粒線體生物合成之主要調節因子。 ○ SRT1720係另一種STAC，已證明其可選擇性活化SIRT1，從而增強粒線體功能且可能改善TIL存活及功能。 3. PARP 抑制劑： ○ 如 奧拉帕利 (Olaparib)及 尼拉帕利 ( Niraparib )之化合物可抑制PARP酶，從而為T細胞功能至關重要之其他代謝過程保留NAD+，且可能減少PARP與SIRT1之間對NAD+之代謝競爭。 4. CD38 抑制劑： ○ 艾薩妥昔單抗 (Isatuximab)及 達雷妥尤單抗 ( Daratumumab)係靶向CD38 (負責NAD+降解)之單株抗體。CD38之小分子抑制劑亦在開發中，且可重新用於提高TIL中之NAD+水準。 5. 粒線體代謝調節劑： ○ 二甲雙胍 (Metformin)已證明可活化AMP活化蛋白激酶(AMPK)，進而活化PGC-1α，改善粒線體生物發生且有可能恢復TIL功能。 ○ 比格列酮 (Pioglitazone)係一種PPARγ促效劑，其亦可能透過PGC-1α誘導增強TIL中之粒線體生物發生及功能。 ○ 苯扎貝特 (Bezafibrate)：一種泛PPAR促效劑，其可誘導PGC-1α，增強粒線體功能及脂肪酸氧化 粒線體生物發生及動力學： 1. PGC-1 α 活化： ○ PGC-1α之特定活化劑或經由基因遞送系統之直接過度表現可用於刺激粒線體生物發生。 2. 粒線體動力學： ○ 操縱參與粒線體融合(例如， MFN1/2、 OPA1)及分裂(例如， DRP1、 FIS1)之基因，以維持粒線體網路之完整性及功能。 遺傳工具： 1. NAD+ 合成基因之過度表現：○ NAMPT：過度表現可增加補救路徑通量，提高NAD+水準。 ○ NMNAT1/2/3：增加NMN腺苷醯轉移酶表現，催化NMN轉化為NAD+。 2. 長壽蛋白基因操縱：○ SIRT1-7：過度表現長壽蛋白基因，重點在於SIRT1在粒線體生物發生中之作用、SIRT3用於粒線體蛋白去乙醯化以及SIRT6用於維持基因體穩定性。 3. TCA 循環及 OXPHOS 基因之上調：○ PC ( 丙酮酸羧化酶 )：增強回補反應以補充TCA循環中間物。 ○ PDK ( 丙酮酸去氫酶激酶 )抑制劑：PDK基因緘默，增加PDH活性切促進葡萄糖氧化。 4. NAD+ 消耗酶之下調：○ 使用CRISPR/Cas9或siRNA方法減弱CD38或PARP家族成員，以保留NAD+從而增強TIL功能。 5. 促進粒線體 DNA 穩定性及生物發生：○ TFAM ( 粒線體轉錄因子 A)：過度表現可促進粒線體DNA複製及轉錄，進而增強粒線體功能。 ○ OGG1 或 MUTYH：過度表現以增強鹼基切除修復且維持粒線體DNA完整性。 6. 氧化還原平衡：○ GCLC/GCLM ( 麩胺酸 - 半胱胺酸連接酶催化及修飾次單元 )：過度表現以增加麩胱甘肽合成，穀胱甘肽係粒線體內之關鍵抗氧化劑。 7. 代謝再程式化：○ CPT1A ( 肉鹼棕櫚醯轉移酶 1A)：基因修飾可促進脂肪酸氧化，可在營養匱乏之條件下維持TIL功能。 8. 粒線體自噬及自噬調節因子：○ PRKN (Parkin)及 PINK1：增強粒線體自噬作用以去除功能失調之粒線體。 ○ ATG5 或 ATG7：調節自噬相關基因以平衡TIL中之能量及細胞器品質控制。

在一些實施例中，此等策略可針對劑量、時間安排及遞送機制進行最佳化，以確保TIL在代謝上得到增強，而不誘導有害作用，例如細胞凋亡或老化。在實施例中，亦評估此類策略以避免促進腫瘤細胞存活或免疫逃脫。在一些實施例中，根據自個別腫瘤分離之TIL中觀測到之特定代謝缺陷得知，此等策略之組合為授受性細胞療法提供TIL功能之有效且個性化之增強。

方法 / 化合物	作用機制	標靶過程 / 路徑	在 TIL 中之潛在用途	考慮因素 / 挑戰
煙鹼醯胺核苷(NR)	NAD+前驅物；轉化為NMN，且接著轉化為NAD+	NAD+挽救路徑	增強TIL代謝及功能	劑量最佳化以避免副作用
菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)	NAD+之直接前驅物；藉由NMNAT酶轉化為NAD+	NAD+挽救路徑	提高TIL抗腫瘤活性	穩定性及細胞攝取考慮因素
菸鹼酸(維生素B3)	經由普萊斯-漢德勒路徑轉化為NAD+	NAD+生物合成路徑	支持TIL能量生成及DNA修復	高劑量時出現潮紅反應
NAMPT抑制劑	藉由抑制NAD+降解來提高NAD+水平	NAD+挽救路徑	可能延長TIL壽命	全身NAD+耗減之風險
PARP抑制劑	藉由抑制PARP酶來防止NAD+耗減	DNA修復路徑	保留TIL中NAD+之代謝功能	抑制PARP與癌症療法之間的平衡
長壽蛋白活化劑	提高NAD+利用效率	長壽蛋白介導之去乙醯化	增強TIL粒線體功能	對TIL之長期影響尚未完全了解
CD38抑制劑	減少NAD+降解	ADP-核糖基環化酶/環ADP-核糖水解酶路徑	提高TIL之NAD+生體可用率	可能影響鈣信號傳導
生酮飲食	可能經由增加脂肪酸氧化來提高NAD+水準	代謝轉變為酮體使用	可間接支持活體內TIL	在患者中之可行性及其對免疫細胞之影響
熱量限制	可上調NAD+生物合成路徑	一般代謝下調	潛在提高TIL功效	患者依從性及營養問題
鍛煉	上調NAD+生物合成及補救路徑	增強肌肉收縮及能量需求	對免疫功能之間接全身影響	對TIL之直接影響尚不清楚
NAD+輸注	直接補充NAD+	繞過NAD+生物合成路徑	立即補充TIL中之NAD+	失衡與穩態破壞之風險
基因療法	NAD+生物合成酶之過度表現	有針對性地提高NAD+產量	TIL NAD+水準持續增加	載體設計、遞送及整合風險

進化上保守之Wnt/β-連環蛋白路徑經由維持DNA甲基化模式而至關重要地參與胚胎幹細胞之多潛能性及分化，從而促進高細胞分裂狀態下正確細胞命運決定所必需之表觀遺傳穩定性(Clevers, H.及R. Nusse, Cell, 2012. 149(6): 第1192-205頁)。在人類中，記憶T細胞在重新暴露於抗原後之快速回憶表明需要穩定的表觀遺傳程式。用於實體腫瘤之大多數基於TIL之ACT方案由終末分化之效應記憶T細胞生成，此等細胞係在離體階段重複數輪TCR連接而產生(Hinrichs, C.S.及S.A. Rosenberg, Immunol Rev, 2014. 257(1): 第56-71頁)。然而，DNA甲基化在塑造擴增、記憶狀態情形以及因此經歷TCR連接依賴性離體擴增之抗原特異性TIL之功能中的關鍵參與尚不清楚(Abdelsamed, H.A.等人, J Exp Med, 2017. 214(6): 第1593-1606頁)。

有證據表明，Wnt/β-連環蛋白信號傳導之藥理學活化藉由增加Tcf1 (由Tcf7編碼)之表現對荷瘤小鼠中之腫瘤特異性CD8+ TIL進行再程式化(Gattinoni, L.等人, Nat Med, 2009. 15(7): 第808-13頁)。在人類黑色素瘤中，CD8+TCF7+揭露具有記憶前驅體樣細胞狀態之TIL子集，其具有旁觀者細胞毒性功能，且與免疫檢查點阻斷之積極結果相關(Li, H.等人, Cell, 2019. 176(4): 第775-789 e18頁；Sade-Feldman, M.等人, Cell, 2018. 175(4): 第998-1013 e20頁)。據報導，Wnt路徑組分在活體內PD1+CD8+記憶TIL中下調，且在所有T細胞群體在活體外擴增後進一步下調(Lipp, J.J.等人, Oncoimmunology, 2022. 11(1): 第2019466頁)，而透過藥理學抑制GSK3β來補償Wnt信號傳導之缺失可改善活體外擴增群體之效應功能。由於已知Wnt信號傳導可阻止效應CD8+ T細胞之發育，因此其亦可能參與表觀遺傳學上對TIL進行再程式化。GSK-3為CD8+ T細胞中PD-1表現之正調節因子，且GSK-3之抑制可增強T細胞功能，且有效控制腫瘤生長(Taylor, A.等人, Immunity, 2016. 44(2): 第274-86頁；Steele, L.等人, iScience, 2021. 24(6): 第102555頁)。除作為PD-1之中心調節因子外，GSK-3亦負向調節CD4+及CD8+ T細胞上之淋巴球活化基因3 (LAG-3)表現，且GSK-3之小分子抑製劑比單獨之LAG-3阻斷更有效抑制黑色素瘤鼠模型之腫瘤生長(Rudd, C.E.等人, Cell Rep, 2020. 30(7): 第2075-2082頁e4)。最近，已顯示Wnt活化可經由表觀遺傳調節因子PRMT1促進人類記憶T細胞之多功能性(Sung, B.Y.等人, J Clin Invest, 2022. 132(2))。

因此，在一些實施例中，第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。在一些實施例中，GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。 J. 收穫 TIL

在第二擴增步驟之後，可收穫細胞。TIL可以任何適當且無菌之方式收穫，包括例如離心。收穫TIL之方法為此項技術中熟知的且任何此類已知之方法均可與本發明過程一起使用。在一些實施例中，使用自動化系統收穫TIL。

細胞收穫器及/或細胞加工系統可購自各種來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International公司。在一些實施例中，本發明之方法可採用任何基於細胞之收穫器。在一些實施例中，細胞收穫器及/或細胞加工系統為基於膜之細胞收穫器。在一些實施例中，細胞收穫係經由細胞加工系統，諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。術語「LOVO細胞加工系統」亦係指由任何供應商製造之任何可在無菌及/或密閉系統環境中將包含細胞之溶液泵送通過膜或過濾器(諸如旋轉膜或旋轉過濾器)的儀器或裝置，從而允許連續流動及細胞加工以移除上清液或細胞培養基而不發生團塊化。在一些實施例中，細胞收穫器及/或細胞加工系統可在密閉無菌系統中進行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞加工步驟。

在一些實施例中，收穫係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。

在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所描述之密閉系統。 K. 最終調配及轉移至輸注容器

在如上文及本文中所詳述之步驟完成之後，將TIL轉移至用於向患者投與之容器，諸如輸注袋或無菌小瓶。在一些實施例中，一旦使用上文所描述之擴增方法獲得治療足夠數目之TIL後，將其轉移至容器，諸如輸注袋，用於向患者投與。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施例中，TIL係在置於輸注袋中之前冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存TIL且不將其置於輸注袋中。在一些實施例中，使用冷凍保存介質進行冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存介質含有二甲亞碸(DMSO)。此一般藉由將TIL群體放至冷凍溶液(例如85%補體不活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中來完成。將溶液中之細胞置放於低溫小瓶中且儲存在-80℃24小時，其中視情況轉移至氣態氮冷凍器用於冷凍保存。參見Sadeghi等人, Acta Oncologica 2013, 52,978-986。

在適當時，自冷凍器取出細胞且在37℃水浴中解凍直至大約4/5之溶液解凍。一般將細胞再懸浮於完全培養基中且視情況洗滌一或多次。在一些實施例中，可計算解凍之TIL且如此項技術中已知來評估存活率。

在一些實施例中，TIL群體係使用CS10冷凍保存介質(CryoStor 10，BioLife Solutions)冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用含有二甲亞碸(DMSO)之冷凍保存介質冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用1:1 (vol:vol)比率之CS10與細胞培養基冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用約1:1 (vol:vol)比率之CS10與細胞培養基(進一步包含額外IL-2)冷凍保存。

在一些實施例中，TIL以醫藥組合物之形式向患者投與。在一些實施例中，醫藥組合物為TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。藉由本揭示案中所述之方法擴增之TIL可藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與。在一些實施例中，T細胞係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。 L. 用於 TIL 製造之密閉系統

本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。此類密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少燒瓶且允許成本降低。在一些實施例中，密閉系統使用兩個容器。

此類密閉系統為此項技術中熟知的且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。

無菌連接裝置(Sterile connecting device；STCD)在兩件相容性管之間產生無菌熔接部分(weld)。此程序允許無菌連接多個容器及管直徑。在一些實施例中，密閉系統包括如實例中所描述之魯爾鎖(luer lock)及熱封系統。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所描述之密閉系統。在一些實施例中，根據本文實例中所描述之方法，將TIL調配至最終產物調配容器中。

在一些實施例中，自獲得腫瘤片段之時間至準備向患者投與TIL或冷凍保存為止，密閉系統使用一個容器。在一些實施例中，當使用兩個容器時，第一容器為密閉G容器(諸如G-rex100M系列或G-rex500M系列燒瓶)，且在不打開第一密閉G容器之情況下將TIL群體離心且轉移至輸注袋。在一些實施例中，當使用兩個容器時，輸注袋為含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統之特徵在於，一旦已添加腫瘤樣品及/或腫瘤片段，則系統自外部緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。

在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施例中，微生物污染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。

密閉系統允許TIL在不存在微生物污染下及/或在微生物污染顯著減少下生長。

此外，TIL細胞培養環境之pH值、二氧化碳分壓及氧氣分壓各自隨細胞培養而變化。因此，即使適合於細胞培養之培養基循環，但密閉環境仍需要不斷地維持為TIL增殖之最佳環境。為此，需要藉助於感測器監測密閉環境之培養液內之pH值、二氧化碳分壓及氧氣分壓之物理因素，其信號用於控制安設在培養環境之入口處的氣體交換器，及根據培養液中之變化即時調整密閉環境之氣體分壓以便最佳化細胞培養環境。在一些實施例中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在至密閉環境之入口處併入配備有量測密閉環境之pH值、二氧化碳分壓及氧氣分壓之監測裝置的氣體交換器，且藉由基於來自監測裝置之信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。

在一些實施例中，連續地或間歇地控制密閉環境內之壓力。亦即，密閉環境中之壓力可藉助於例如壓力維持裝置來改變，從而確保空間在正壓力狀態下適合於TIL生長或促進在負壓力狀態下滲出流體且因此促進細胞增殖。此外，藉由間歇性地施加負壓力，有可能藉助於暫時性縮小密閉環境之容積而均勻且有效地置換密閉環境中之循環液體。

在一些實施例中，附加設備，諸如電穿孔器(例如Neon電穿孔器)為全密閉系統之組件。在一些實施例中，可替換或添加TIL增殖之最佳培養物組分，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3以及組合之因子。

在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-10。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-100M。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-500M。 VII. 製造 TIL 群體之方法

製造TIL群體之方法(例如Gen 2方法)已描述於國際專利申請公開案第WO 2018/182817 A1號及國際專利申請公開案第WO 2019/190579 A1號中，該等案之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。

本文揭示之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；及 b) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15及L-精胺酸。

本文揭示之一些實施例提供一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；及 b) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15、L-精胺酸及NAD+。

本揭示案之一些實施例提供一種將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、NAD+、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第二TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 收穫自步驟(c)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫之治療性TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (e) 將自步驟(d)收穫之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(d)至(e)之轉移在不打開該系統下進行，及 (f) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。 A. 獲得患者腫瘤樣品

在一些實施例中，獲得第一TIL群體包括多病灶取樣方法。

在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶復原。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如漢克平衡鹽溶液(HBSS))中復原。

在一些實施例中，酶混合物包括約4.7 mL無菌HBSS中的約10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3 µL膠原蛋白酶(1.2 PZ/mL)及250 μl DNA酶I (200 U/mL)。 C. 第一擴增

在腫瘤片段分割或消化之後，將所得細胞在有利於TIL生長但不利於腫瘤及其他細胞生長的條件下於含有IL-2之血清中培養。在一些實施例中，腫瘤消化物在2 mL孔中在包含具有6000 IU/mL IL-2之不活化人類AB血清之培養基中培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，通常3至14天，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養7至14天之時段，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養10至14天之時段，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養約11天之時段，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。

在一些實施例中，TIL之擴增可使用如下文及本文所描述之初始主體TIL擴增步驟(其可包括稱為預REP之過程)進行，接著進行如下文及本文所描述之第二擴增(包括稱為快速擴增方案(REP)步驟之過程)，隨後進行視情況選用之冷凍保存，且接著進行如下文及本文所描述之第二REP步驟。獲自此過程之TIL可視情況針對如本文所描述之表型特徵及代謝參數進行表徵。

在TIL培養係在24孔盤中起始，例如，使用Costar 24孔細胞培養簇平底(Corning公司, Corning, NY)之一些實施例中，各孔可在具有IL-2 (6000 IU/mL；Chiron公司，Emeryville，CA)之2 mL完全培養基(CM)中用1×10 ⁶個腫瘤消化物細胞或一個腫瘤片段接種。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm ³與10 mm ³之間。

在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，步驟B之CM由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在具有40 mL容量及10 cm ²透氣矽底之透氣瓶(例如，G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)中起始培養之一些實施例中，各瓶裝載有含10-40×10 ⁶個活腫瘤消化物細胞或5-30個腫瘤片段之10-40 mL具有IL-2之CM。G-REX10及24孔盤皆在濕氣培育箱中在37℃、5% CO ₂下培育且在培養起始後5天，移除一半培養基且更換為新鮮的CM及IL-2，且在第5天之後，每2-3天更換一半培養基。

在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包括(但不限於)以下中之一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、CO ₂+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。

在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含一或多種選自由以下組成之群的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自由以下組成之群的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、CO ₂+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。

在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以下表4中之標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列舉之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中之標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列舉之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包含上表11中之標題「補充劑之較佳實施例」欄中列舉之類型及濃度的非微量部分成分。

在製備腫瘤片段之後，所得細胞(亦即，片段)在含有IL-2之血清中，在相對於腫瘤及其他細胞有利於TIL生長之條件下培養。在一些實施例中，將腫瘤消化物在2 mL孔中，在包含不活化人類AB血清(或在一些情況下，如本文所概述，在存在APC細胞群體之情況下)及6000 IU/mL IL-2的培養基中培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，通常10至14天，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，第一擴增期間之生長培養基包含IL-2或其變異體。在一些實施例中，IL為重組人類IL-2 (rhIL-2)。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20-30×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備液具有4-8×10 ⁶IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有5-7×10 ⁶IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有6×10 ⁶IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，如實例5中所描述製備IL-2儲備溶液。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含1000與2000 IU/mL之間、2000與3000 IU/mL之間、3000與4000 IU/mL之間、4000與5000 IU/mL之間、5000與6000 IU/mL之間、6000與7000 IU/mL之間、7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。

在一些實施例中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。

在一些實施例中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。

在一些實施例中，細胞培養基包含抗CD3促效劑抗體，例如OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、1 ng/mL與5 ng/mL之間、5 ng/mL與10 ng/mL之間、10 ng/mL與20 ng/mL之間、20 ng/mL與30 ng/mL之間、30 ng/mL與40 ng/mL之間、40 ng/mL與50 ng/mL之間及50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。參見例如表1。

在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑係選自由以下組成之群：烏瑞魯單抗(urelumab)、烏圖木單抗(utomilumab)、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變異體、生物類似物及組合。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成0.1 µg/mL至100 µg/mL之濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成20 µg/mL至40 µg/mL之濃度。

在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。

在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1 (培養基1)。在一些實施例中，CM由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在具有40 mL容量及10 cm ²透氣矽底之透氣瓶(例如，G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)中起始培養之一些實施例中，各瓶裝載有含10-40×10 ⁶個活腫瘤消化物細胞或5-30個腫瘤片段之10-40 mL具有IL-2之CM。G-REX10及24孔盤皆在濕氣培育箱中在37℃、5% CO ₂下培育且在培養起始後5天，移除一半培養基且更換為新鮮的CM及IL-2，且在第5天之後，每2-3天更換一半培養基。在一些實施例中，CM為實例中所描述之CM1，參見實例1。在一些實施例中，第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中進行。在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2。

在一些實施例中，如實例及圖式中所論述，第一擴增(包括諸如描述於圖2之步驟B中之過程的過程，其可包括有時稱為預REP之過程)縮短為3-14天。在一些實施例中，第一擴增(包括諸如圖82之步驟B中所描述之過程的過程，其可包括有時稱為預REP之過程)縮短為7至14天，如包括例如圖82之步驟B中所描述之擴增。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短為10-14天。在一些實施例中，第一擴增縮短為11天，如例如圖82之步驟B中所描述之擴增中所論述。

在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天。

在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為第一擴增期間之組合。在一些實施例中，在第一擴增期間，包括例如在根據圖82以及本文所描述之步驟B過程期間可包括IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為第一擴增期間之組合。在一些實施例中，在根據圖82以及如本文所描述之步驟B過程期間可包括IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合。

在一些實施例中，如實例及圖式中所論述，第一擴增(包括稱為預REP之過程；例如，根據圖82之步驟B)過程縮短為3至14天。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短為7至14天。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短為10至14天。在一些實施例中，第一擴增縮短為11天。在一些實施例中，在密閉系統生物反應器中進行第一擴增，例如根據圖82之步驟B。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 1.細胞介素及其他添加劑

或者，使用細胞介素之組合進行TIL之快速擴增及/或第二擴增亦係可能的，如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述，利用IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或更多者的組合。因此，可能組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21以及IL-2或IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且尤其如其中所描述之T細胞。

在一些實施例中，步驟B亦可包括向培養基中添加OKT-3抗體或莫羅單抗，如本文中其他地方所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包括向培養基中添加4-1BB促效劑，如本文中其他地方所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包括向培養基中添加OX-40促效劑，如本文中其他地方所描述。在其他實施例中，可在步驟B期間在培養基中使用添加劑，諸如過氧化體增殖物活化受體γ共活化因子I-α促效劑，包括增殖物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如噻唑啶二酮化合物，如在美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號中所描述，其揭示內容以引用之方式併入本文中。 D. 第二擴增

在一些實施例中，TIL細胞群體之數目在初始主體加工及預REP擴增之後擴增以產生TIL群體。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在此項技術中通常稱為快速擴增過程(REP)之擴增過程。第二擴增通常使用包含多種組分(包括飼養細胞、細胞介素來源及抗CD3促效劑抗體)之培養基在透氣容器中完成。

在一些實施例中，國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基(其以引用之方式併入本文中)適用於本發明中。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含一或多種選自由以下組成之群的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自由以下組成之群的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、Co ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。

在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以下表12中之標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列舉之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表12中之標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列舉之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包含上表12中之標題「補充劑之較佳實施例」欄中列舉之類型及濃度的非微量部分成分。

在一些實施例中，第二細胞培養基進一步包含選自由以下組成之群的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。在一些實施例中，第二細胞培養基及/或第三培養基進一步包含選自由以下組成之群的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。 1.飼養細胞及抗原呈遞細胞

在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP之第0天及/或第二擴增之第0天(亦即第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係無複製能力的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體、約10 ng/mL濃度之IL-15及約10 ng/mL濃度之IL-21存在下培養。

在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3、IL-15及IL-21存在下培養的活細胞總數與在REP之第0天及/或第二擴增之第0天(亦即第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係無複製能力的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5-60 ng/mL OKT3抗體、約10 ng/mL濃度之IL-15及約10 ng/mL濃度之IL-21存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10-50 ng/mL OKT3抗體、約10 ng/mL濃度之IL-15及約10 ng/mL濃度之IL-21存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20-40 ng/mL OKT3抗體、約10 ng/mL濃度之IL-15及約10 ng/mL濃度之IL-21存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25-35 ng/mL OKT3抗體、約10 ng/mL濃度之IL-15及約10 ng/mL濃度之IL-21存在下培養。

NAD+以多種方式增強T細胞之代謝適應性：

糖解作用及磷酸戊糖路徑(PPP)：雖然糖解作用不直接使用NAD+，但自NADH再生NAD+對於維持糖解通量至關重要，此在粒線體呼吸受限之缺氧條件下尤其重要。PPP係糖解作用之分支，依賴於NADP+ (NAD+之磷酸化形式)來產生5-磷酸核糖且還原麩胱甘肽，從而有助於核苷酸合成及抗氧化防禦機制。

粒線體功能：NAD+在粒線體中至關重要，因為其為三羧酸(TCA)循環及氧化磷酸化(OXPHOS)中之關鍵電子受體。增強之粒線體功能可支持記憶T細胞之分化及存活，此對於持續之抗腫瘤免疫性至關重要。

長壽蛋白(Sirtuin)活化：長壽蛋白係NAD+依賴性去乙醯化酶家族，其可調節細胞代謝、壓力反應及發炎。藉由活化長壽蛋白，NAD+可促進記憶T細胞之形成，且增強其抗腫瘤功能。

PARP活性：NAD+係聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)之受質，其參與DNA修復及基因體穩定性。藉由促進PARP之功能，NAD+有助於在腫瘤內DNA損傷之情況下維持TIL完整性。

加強TIL中之NAD+利用之藥理學及遺傳學工具以特定分子標靶及路徑為中心。在一些實施例中，用於加強NAD+利用之示例性工具集中於以下功能中之一或多種：粒線體生物發生、促進有效能量利用以及培育抗腫瘤表型。在實施例中，此類工具以協調一致之方式實施，注意增強TIL功能與避免可能導致衰竭或細胞凋亡之過度刺激之間的平衡。在一些實施例中，在設計此等干預措施時考慮TIL群體內之異質性及每個腫瘤之獨特微環境。因此，透過藥理學及遺傳學方法調節粒線體功能可能為增強授受性TIL療法功效之強大策略。以下進一步詳述加強NAD+利用之工具。 NAD+ 路徑之藥理學操縱：6. NAD+ 前驅物與 NAD+： ○ 菸鹼醯胺核苷 (NR)及 菸鹼醯胺單核苷酸 (NMN)係NAD+前驅物。其經由挽救路徑轉化為NAD+，NR涉及菸鹼醯胺核苷激酶(NRK1/2)且NMN涉及NMN腺苷醯轉移酶(NMNAT1/2/3)。 ○ 亦可使用 菸鹼酸 (NA)，其經由普萊斯-漢德勒路徑(Preiss-Handler pathway)轉化為NAD+，但其會因前列腺素介導之血管舒張而導致潮紅。 ○ 菸鹼醯胺二核苷酸 (NAD+)本身亦可使用，因為已證明其可穿過脂質雙層且進入粒線體。 7. 長壽蛋白調節劑： ○ 白藜蘆醇係一種活化長壽蛋白之化合物(STAC)，可增強SIRT1活性，進而可去乙醯化且活化過氧化體增殖物活化受體γ共活化因子1-α (PGC-1α)，後者為粒線體生物合成之主要調節因子。 ○ SRT1720係另一種STAC，已證明其可選擇性活化SIRT1，從而增強粒線體功能且可能改善TIL存活及功能。 8. PARP 抑制劑： ○ 如 奧拉帕利 (Olaparib)及 尼拉帕利 ( Niraparib )之化合物可抑制PARP酶，從而為T細胞功能至關重要之其他代謝過程保留NAD+，且可能減少PARP與SIRT1之間對NAD+之代謝競爭。 9. CD38 抑制劑： ○ 艾薩妥昔單抗 (Isatuximab)及 達雷妥尤單抗 ( Daratumumab)係靶向CD38 (負責NAD+降解)之單株抗體。CD38之小分子抑制劑亦在開發中，且可重新用於提高TIL中之NAD+水準。 10. 粒線體代謝調節劑： ○ 二甲雙胍 (Metformin)已證明可活化AMP活化蛋白激酶(AMPK)，進而活化PGC-1α，改善粒線體生物發生且有可能恢復TIL功能。 ○ 比格列酮 (Pioglitazone)係一種PPARγ促效劑，其亦可能透過PGC-1α誘導增強TIL中之粒線體生物發生及功能。 ○ 苯扎貝特 (Bezafibrate)：一種泛PPAR促效劑，其可誘導PGC-1α，增強粒線體功能及脂肪酸氧化 粒線體生物發生及動力學： 3. PGC-1 α 活化： ○ PGC-1α之特定活化劑或經由基因遞送系統之直接過度表現可用於刺激粒線體生物發生。 4. 粒線體動力學： ○ 操縱參與粒線體融合(例如， MFN1/2、 OPA1)及分裂(例如， DRP1、 FIS1)之基因，以維持粒線體網路之完整性及功能。 遺傳工具：9. NAD+ 合成基因之過度表現：○ NAMPT：過度表現可增加補救路徑通量，提高NAD+水準。 ○ NMNAT1/2/3：增加NMN腺苷醯轉移酶表現，催化NMN轉化為NAD+。 10. 長壽蛋白基因操縱：○ SIRT1-7：過度表現長壽蛋白基因，重點在於SIRT1在粒線體生物發生中之作用、SIRT3用於粒線體蛋白去乙醯化以及SIRT6用於維持基因體穩定性。 11. TCA 循環及 OXPHOS 基因之上調：○ PC ( 丙酮酸羧化酶 )：增強回補反應以補充TCA循環中間物。 ○ PDK ( 丙酮酸去氫酶激酶 )抑制劑：PDK基因緘默，增加PDH活性切促進葡萄糖氧化。 12. NAD+ 消耗酶之下調：○ 使用CRISPR/Cas9或siRNA方法減弱CD38或PARP家族成員，以保留NAD+從而增強TIL功能。 13. 促進粒線體 DNA 穩定性及生物發生：○ TFAM ( 粒線體轉錄因子 A)：過度表現可促進粒線體DNA複製及轉錄，進而增強粒線體功能。 ○ OGG1 或 MUTYH：過度表現以增強鹼基切除修復且維持粒線體DNA完整性。 14. 氧化還原平衡：○ GCLC/GCLM ( 麩胺酸 - 半胱胺酸連接酶催化及修飾次單元 )：過度表現以增加麩胱甘肽合成，穀胱甘肽係粒線體內之關鍵抗氧化劑。 15. 代謝再程式化：○ CPT1A ( 肉鹼棕櫚醯轉移酶 1A)：基因修飾可促進脂肪酸氧化，可在營養匱乏之條件下維持TIL功能。 16. 粒線體自噬及自噬調節因子：○ PRKN (Parkin)及 PINK1：增強粒線體自噬作用以去除功能失調之粒線體。 ○ ATG5 或 ATG7：調節自噬相關基因以平衡TIL中之能量及細胞器品質控制。

因此，在一些實施例中，第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。在一些實施例中，GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。 E. 收穫 TIL

在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所描述之密閉系統。 F. 最終調配及轉移至輸注容器

在一些實施例中，TIL以醫藥組合物之形式向患者投與。在一些實施例中，醫藥組合物為TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。藉由本揭示案中所述之方法擴增之TIL可藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與。在一些實施例中，T細胞係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。 G. 用於 TIL 製造之密閉系統

在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-10。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-100M。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-500M。 VIII. Gen 2 TIL 製造方法

圖82及圖83中描繪含有一些此等特徵之稱為Gen 2 (亦被稱為方法2A)之例示性TIL方法系列。Gen 2之實施例展示於圖83中。

如本文所論述，本發明可包括與再刺激經冷凍保存之TIL以在移植至患者中之前提高其代謝活性且因此提高相對健康狀況相關之步驟，及測試該代謝健康狀況之方法。如本文中所概述，TIL一般係取自患者樣品，且經操縱以在移植至患者中之前擴增其數目。在一些實施例中，TIL可視情況如下文所論述經基因操縱。

在一些實施例中，TIL可經冷凍保存。在解凍後，其亦可在輸注至患者中之前經再刺激以提高其代謝。

在一些實施例中，第一擴增(包括稱為預REP之過程以及圖82中示為步驟A之過程)縮短為3至14天且第二擴增(包括稱為REP之過程以及圖82中示為步驟B之過程)縮短為7至14天，如下文以及實例及圖式中所詳細論述。在一些實施例中，第一擴增(例如，如圖82中描述為步驟B之擴增)縮短為11天且第二擴增(例如，如圖82中之步驟D中描述之擴增)縮短為11天。在一些實施例中，第一擴增與第二擴增(例如，如圖82中之步驟B及步驟D描述之擴增)之組合縮短為22天，如下文以及實例及圖式中所詳細論述。

下文中的「步驟」標識A、B、C等係參考圖82及參考本文所描述之某些實施例。以下及圖82中的步驟次序為例示性的，且本申請案及本文中所揭示之方法涵蓋步驟之任何組合或次序，以及另外的步驟、步驟重複及/或步驟省略。 A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣品

一般而言，TIL最初獲自患者腫瘤樣品且隨後擴增成更大的群體以用於如本文所描述之進一步操縱、視情況進行之冷凍保存、如本文所概述之再刺激及視情況評估作為TIL健康狀況之指標的表型及代謝參數。

患者腫瘤樣品可使用此項技術中已知之方法獲得，通常經由手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品的其他手段獲得。在一些實施例中，使用多病灶取樣。在一些實施例中，手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品的其他手段包括多病灶取樣(亦即，自患者中之一或多個腫瘤位點及/或位置以及在相同位置或緊密相鄰的一或多個腫瘤處獲得樣品)。一般而言，腫瘤樣品可來自任何實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣品亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。實體腫瘤可為肺組織。在一些實施例中，適用之TIL係獲自子宮內膜癌。實體腫瘤可為皮膚組織。在一些實施例中，適用之TIL係獲自黑色素瘤。

一旦獲得，腫瘤樣品通常使用銳器分割片段化成1至約8 mm ³之間的小型片狀物，其中約2-3 mm ³為尤其適用的。在一些實施例中，使用酶促腫瘤消化物自此等片段培養TIL。此類腫瘤消化物可藉由在酶促培養基(例如羅斯威爾公園癌症研究所(RPMI) 1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，接著進行機械解離(例如使用組織解離器)來產生。腫瘤消化物可藉由以下產生：將腫瘤置放於酶促培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環，直至僅存在小組織片。在此過程結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用FICOLL分支鏈親水性多醣之密度梯度分離以移除此等細胞。可使用此項技術中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所描述之方法，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所描述之任何實施例中擴增TIL之方法或治療癌症之方法。

在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶復原。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如HBSS)中復原。

在一些情況下，膠原蛋白酶(諸如無動物源1型膠原蛋白酶)係在10 mL無菌HBSS或另一緩衝液中復原。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶289.2 PZ U。在一些實施例中，膠原蛋白酶係在5 mL至15 mL緩衝液中復原。在一些實施例中，在復原後，膠原蛋白酶儲備液之範圍為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL，例如約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約350 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約300 PZ U/mL、約150 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL、約150 PZ U/mL、約200 PZ U/mL、約210 PZ U/mL、約220 PZ U/mL、約230 PZ U/mL、約240 PZ U/mL、約250 PZ U/mL、約260 PZ U/mL、約270 PZ U/mL、約280 PZ U/mL、約289.2 PZ U/mL、約300 PZ U/mL、約350 PZ U/mL或約400 PZ U/mL。

在一些實施例中，中性蛋白酶係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中復原。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶175 DMC U。在一些實施例中，在復原後，中性蛋白酶儲備液之範圍為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL，例如約100 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL-約350 DMC/mL、約100 DMC/mL-約300 DMC/mL、約150 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL、約110 DMC/mL、約120 DMC/mL、約130 DMC/mL、約140 DMC/mL、約150 DMC/mL、約160 DMC/mL、約170 DMC/mL、約175 DMC/mL、約180 DMC/mL、約190 DMC/mL、約200 DMC/mL、約250 DMC/mL、約300 DMC/mL、約350 DMC/m或約400 DMC/mL。

在一些實施例中，DNA酶I係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中復原。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶4 KU。在一些實施例中，在復原後，DNA酶I儲備液之範圍為約1 KU/mL-10 KU/mL，例如約1 KU/mL、約2 KU/mL、約3 KU/mL、約4 KU/mL、約5 KU/mL、約6 KU/mL、約7 KU/mL、約8 KU/mL、約9 KU/mL或約10 KU/mL。

在一些實施例中，酶之儲備液係可變的且可能需要確定濃度。在一些實施例中，可檢驗凍乾儲備液之濃度。在一些實施例中，添加至消化混合液中之酶之最終量係基於所確定之儲備液濃度調節。

在一些實施例中，酶混合物包括約4.7 mL無菌HBSS中的約10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3 µL膠原蛋白酶(1.2 PZ/mL)及250 μl DNA酶I (200 U/mL)。

如上文所指出，在一些實施例中，TIL係衍生自實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化且以全腫瘤進行酶消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂下在包含膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂、旋轉下在包含膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂、恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，整個腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。

在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂下在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂、旋轉下在包含膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO ₂、恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，整個腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。

在一些實施例中，片段化包括物理片段化，包括例如分割以及消化。在一些實施例中，片段化為物理片段化。在一些實施例中，片段化為分割。在一些實施例中，片段化係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養，該等酶促腫瘤消化物及腫瘤片段係由獲自患者之腫瘤樣品的消化或片段化獲得。

在一些實施例中，當腫瘤為實體腫瘤時，在例如步驟A (如圖82中所提供)中獲得腫瘤樣品之後，對腫瘤進行物理片段化。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，片段化在獲得腫瘤之後並且在不進行任何冷凍保存的情況下發生。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將10、20、30、40或更多個片段或塊置於各容器中進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將30或40個片段或塊置於各容器中進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將40個片段或塊置於各容器中進行第一擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4個至約50個片段，其中各片段之體積為約27 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm ³至約1500 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。

在一些實施例中，細胞可視情況在樣品收穫之後冷凍，且在進入步驟B中所描述之擴增之前冷凍儲存，該步驟B進一步詳細描述於下文且例示於圖82中。 1.胸膜滲出液T細胞、腹水液T細胞及TIL

在一些實施例中，樣品為胸膜液樣品。在一些實施例中，根據本文所描述之方法進行擴增之T細胞或TIL的來源為胸膜液樣品。在一些實施例中，樣品為源於胸膜滲出液之樣品。在一些實施例中，根據本文所描述之方法進行擴增之T細胞或TIL的來源為源於胸膜滲出液之樣品。參見例如美國專利公開案US 2014/0295426中所描述之方法，其出於所有目的以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，樣品為腹水液樣品。在一些實施例中，根據本文所描述之方法進行擴增之T細胞或TIL的來源為腹水液樣品。在一些實施例中，樣品為源於腹水之樣品。在任何前述實施例中，腹水液樣品或源於腹水之樣品係獲自子宮內膜癌患者。在一些實施例中，來自子宮內膜癌患者腹部之腹水液可用於獲得TIL以根據本文所描述之方法進行擴增及使用TIL及視情況選用之本文所描述之協同療法治療子宮內膜癌患者。

在一些實施例中，可以採用疑似及/或含有TIL之任何胸膜液或胸膜滲出液。此類樣品可來源於原發性或轉移性肺癌，諸如NSCLC或SCLC。在一些實施例中，樣品可源自來源於另一器官(例如乳房、卵巢、結腸或前列腺)之繼發轉移性癌細胞。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣品為胸膜滲出物(pleural exudate)。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣品為胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物樣品可包括含有TIL之其他漿液，包括例如來自腹部之腹水液或胰囊腫液。腹水液及胸膜液涉及非常類似的化學系統；腹部及肺兩者在相同的惡性腫瘤事件中於胸腔及腹腔中皆具有間皮細胞株及流體形式，且在一些實施例中，此類流體含有TIL。在所揭示之方法利用胸膜液的一些實施例中，可使用含有TIL之腹水或其他囊腫液進行相同的方法以得到類似結果。

在一些實施例中，胸膜液或腹水液呈未經加工之形式直接自患者移除。在一些實施例中，在進一步加工步驟之前，將未經加工之胸膜液或腹水液置於標準血液收集管(諸如EDTA或肝素管)中。在一些實施例中，在進一步加工步驟之前，將未經加工之胸膜液或腹水液置於標準CellSave®管(Veridex)中。在一些實施例中，在自患者收集之後立即將樣品置於CellSave管中，以避免活TIL之數目減少。若保留在未經加工之胸膜液或腹水液中，即使在4℃下，活TIL之數目可能在24小時內顯著降低。在一些實施例中，樣品係在自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，樣品係在4℃下自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。

在一些實施例中，可稀釋來自所選個體之胸膜液或腹水液樣品。在一些實施例中，稀釋度為1:10胸膜液或腹水液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:9胸膜液或腹水液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:8胸膜液或腹水液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:5胸膜液或腹水液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:2胸膜液或腹水液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:1胸膜液或腹水液比稀釋劑。在一些實施例中，稀釋劑包括鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、另一緩衝液或生理學上可接受之稀釋劑。在一些實施例中，樣品係在自患者收集及稀釋之後立即置於CellSave管中，以避免活TIL減少，若保留在未經加工之胸膜液中，則即使在4℃下，活TIL可能在24至48小時內顯著減少。在一些實施例中，胸膜液或腹水液樣品係在自患者移除且稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，胸膜液或腹水液樣品係在自患者移除且在4℃下稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。

在其他實施例中，在進一步加工步驟之前，藉由習知手段濃縮胸膜液或腹水液樣品。在一些實施例中，在胸膜液或腹水液必須冷凍保存以便運送至進行該方法之實驗室或用於後續分析(例如，在收集後24至48小時之後)之情形下，此胸膜液或腹水液之預處理較佳。在一些實施例中，藉由在將胸膜液或腹水液樣品自個體中取出後將其離心並將離心液或團塊再懸浮於緩衝液中來製備胸膜液或腹水液樣品。在一些實施例中，對胸膜液或腹水液樣品進行多次離心及再懸浮，隨後將其冷凍保存以用於運輸或以後的分析及/或加工。

在一些實施例中，在進一步加工步驟之前，藉由使用過濾方法濃縮胸膜液或腹水液樣品。在一些實施例中，在進一步加工中使用之胸膜液或腹水液樣品係藉由將流體經由含有已知且基本均勻之孔徑的過濾器過濾而製備的，該孔徑允許胸膜液或腹水液通過膜但保留腫瘤細胞。在一些實施例中，膜中之孔直徑可為至少4 μM。在其他實施例中，孔直徑可為5 μM或更大，且在其他實施例中，可為6 μM、7 μM、8 μM、9 μM或10 μM中之任一者。過濾之後，可將被膜保留之細胞(包括TIL)自膜上衝出至適合的生理學上可接受之緩衝液中。接著可以將以此方式濃縮之細胞(包括TIL)用於該方法之進一步加工步驟中。

在一些實施例中，使胸膜液或腹水液樣品(包括例如未經處理之胸膜液或腹水液)、經稀釋之胸膜液或腹水液或再懸浮之細胞團塊與溶解試劑接觸，該溶解試劑差異性地溶解樣品中存在之無核紅血球。在一些實施例中，在胸膜液或腹水液含有大量RBC之情形下，此步驟係在進一步加工步驟之前進行。適合的溶解試劑包括單一溶解試劑或溶解試劑及淬滅試劑，或溶解試劑、淬滅試劑及固定試劑。適合的溶解系統為市售的，且包括BD Pharm Lyse™系統(Becton Dickenson)。其他溶解系統包括Versalyse™系統、FACSlyse™系統(Becton Dickenson)、Immunoprep™系統或Erythrolyse II系統(Beckman Coulter公司)或氯化銨系統。在一些實施例中，溶解試劑可隨主要需求而變化，該等需求為紅血球之有效溶解及TIL之保守性及胸膜液或腹水液中TIL之表型特性。除使用單一試劑用於溶解以外，適用於本文所描述之方法的溶解系統可包括第二試劑，例如在該方法之剩餘步驟期間淬滅或延遲溶解試劑之作用的第二試劑，例如Stabilyse™試劑(Beckman Coulter公司)。視溶解試劑之選擇或該方法之較佳實施而定，亦可採用習知固定試劑。

在一些實施例中，在約-140℃之溫度下冷凍保存如上文所描述之未經加工、稀釋或多次離心或加工的胸膜液或腹水液樣品，隨後如本文所提供進行進一步加工及/或擴增。 B. 步驟 B ：第一擴增

在一些實施例中，本發明方法提供獲得年輕TIL，該等年輕TIL能夠增加在投與個體/患者後之複製週期，且因而相較於較老TIL (亦即，在向個體/患者投與之前已進一步進行更多輪複製的TIL)可能提供額外治療益處。年輕TIL之特徵已描述於文獻中，例如於Donia等人, Scand. J. Immunol. 2012, 75, 157-167；Dudley等人, Clin. Cancer Res. 2010, 16, 6122-6131；Huang等人, J. Immunother. 2005, 28, 258-267；Besser等人, Clin. Cancer Res. 2013, 19, OF1-OF9；Besser等人, J. Immunother. 2009, 32:415-423；Robbins等人, J. Immunol. 2004, 173, 7125-7130；Shen等人, J. Immunother., 2007, 30, 123-129；Zhou等人, J. Immunother. 2005, 28, 53-62；及Tran等人, J. Immunother., 2008, 31, 742-751，其中之各者以引用之方式併入本文中。

T淋巴球及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V (可變區)、D (多樣區)、J (聯結區)及C (恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，相較於新鮮收穫的TIL及/或使用除本文中提供之方法以外之其他方法，包括例如除圖82中實施之方法以外的方法製備的TIL，藉由本發明之方法獲得的TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，相較於新鮮收穫的TIL及/或使用如圖5及/或圖6中例示之稱為過程1C之方法製備的TIL，藉由本發明之方法獲得的TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第一擴增中獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性係增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β之表現增加。在一些實施例中，TCRab (亦即，TCRα/β)之表現增加。

在例如圖82之步驟A中所描述的腫瘤片段之分割或消化之後，將所得細胞在有利於TIL生長但不利於腫瘤及其他細胞生長的條件下於含有IL-2之血清中培養。在一些實施例中，腫瘤消化物在2 mL孔中在包含具有6000 IU/mL IL-2之不活化人類AB血清之培養基中培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，通常3至14天，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養7至14天之時段，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養10至14天之時段，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養約11天之時段，產生通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。

在一些實施例中，TIL之擴增可使用如下文及本文所描述之初始主體TIL擴增步驟(例如圖82之步驟B中所描述之步驟，其可包括稱為預REP之過程)進行，接著進行如下文在步驟D中及本文所描述之第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增方案(REP)步驟之過程)，隨後進行視情況選用之冷凍保存，且接著進行如下文及本文所描述之第二步驟D (包括稱為再刺激REP步驟之過程)。獲自此過程之TIL可視情況針對如本文所描述之表型特徵及代謝參數進行表徵。

在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以下表4中之標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列舉之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中之標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列舉之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包含下表4中之標題「補充劑之較佳實施例」欄中列舉之類型及濃度的非微量部分成分。

在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑係選自由以下組成之群：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變異體、生物類似物及組合。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成0.1 µg/mL至100 µg/mL之濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成20 µg/mL至40 µg/mL之濃度。

在一些實施例中，步驟B亦可包括向培養基中添加OKT-3抗體或莫羅單抗，如本文中其他地方所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包括向培養基中添加4-1BB促效劑，如本文中其他地方所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包括向培養基中添加OX-40促效劑，如本文中其他地方所描述。在其他實施例中，可在步驟B期間在培養基中使用添加劑，諸如過氧化體增殖物活化受體γ共活化因子I-α促效劑，包括增殖物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如噻唑啶二酮化合物，如在美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號中所描述，其揭示內容以引用之方式併入本文中。 C. 步驟 C ：第一擴增至第二擴增之轉變

在一些情況下，自第一擴增獲得之主體TIL群體，包括例如自例如圖82中所示之步驟B獲得的TIL群體，可使用下文所論述之方案立即冷凍保存。或者，自第一擴增獲得之TIL群體(稱為第二TIL群體)可經歷第二擴增(其可包括有時稱為REP之擴增)且接著如下文所論述冷凍保存。類似地，在經基因修飾之TIL將用於療法的情況下，第一TIL群體(有時稱為主體TIL群體)或第二TIL群體(其在一些實施例中可包括稱為REP TIL群體之群體)可在擴增之前或在第一擴增之後及在第二擴增之前進行基因修飾以用於適合的治療。

在一些實施例中，儲存自第一擴增(例如，來自如圖82中所示之步驟B)獲得之TIL直至進行表型分析以用於選擇。在一些實施例中，自第一擴增(例如，來自如圖82中所示之步驟B)獲得之TIL未經儲存且直接繼續進行第二擴增。在一些實施例中，自第一擴增獲得之TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前未經冷凍保存。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後約3天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後約4天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後約4天至約10天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後約7天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後約14天發生。

在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後1天至14天發生。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後3天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後4天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後5天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後6天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後7天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後8天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後9天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後10天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後11天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後12天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後13天至14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後14天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後1天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後2天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後3天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後4天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後5天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後6天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後7天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後8天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後9天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後10天至11天發生。在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變在片段化發生後11天發生。

在一些實施例中，TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前未經儲存，且TIL直接進行第二擴增(例如在一些實施例中，在如圖82中所示之步驟B至步驟D之轉變期間未進行儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所描述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自第一擴增之TIL (第二TIL群體)直接進行第二擴增而無轉變期。

在一些實施例中，第一擴增至第二擴增之轉變(例如根據圖82之步驟C)係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100生物反應器。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 D. 步驟 D ：第二擴增

在一些實施例中，TIL細胞群體之數目在收穫及初始主體加工之後，例如在步驟A及步驟B以及稱為步驟C之轉變之後擴增(如圖82中所指示)。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在此項技術中通常稱為快速擴增過程(REP)之擴增過程；以及如圖82之步驟D中所指示之過程。第二擴增通常使用包含多種組分(包括飼養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)之培養基在透氣容器中完成。

在一些實施例中，TIL之第二擴增或第二TIL擴增(其可包括有時稱為REP之擴增；以及如圖82之步驟D中所指示之過程)可使用熟習此項技術者已知之任何TIL瓶或容器進行。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約14天。

在一些實施例中，第二擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖82之步驟D中所指示之過程)進行。舉例而言，TIL可在介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激而快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包括例如抗CD3抗體，諸如約30 ng/mL OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil (Raritan, NJ)或Miltenyi Biotech (Auburn, CA))或UHCT-1 (可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種抗原(包括其抗原部分，諸如抗原決定基)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該等抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體表現，該載體諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1:26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他適合的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈遞細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經照射之自體淋巴球或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二擴增之部分發生。在一些實施例中，第二擴增在經照射之自體淋巴球或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下發生。

在一些實施例中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、1 ng/mL與5 ng/mL之間、5 ng/mL與10 ng/mL之間、10 ng/mL與20 ng/mL之間、20 ng/mL與30 ng/mL之間、30 ng/mL與40 ng/mL之間、40 ng/mL與50 ng/mL之間及50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。

在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，在第二擴增期間，包括例如在根據圖82以及本文所描述之步驟D過程期間可包括IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，在根據圖82以及如本文所描述之步驟D過程期間可包括IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合。

在一些實施例中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈遞飼養細胞且視情況包含TNFRSF促效劑之補充細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二擴增在補充細胞培養基中發生。在一些實施例中，補充細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞飼養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC；亦稱為抗原呈遞飼養細胞)。在一些實施例中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞飼養細胞(亦即抗原呈遞細胞)之細胞培養基中發生。

在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。

在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。

在一些實施例中，如實例及圖式中所論述，第二擴增(其可包括稱為REP過程之過程)縮短為7-14天。在一些實施例中，第二擴增縮短為11天。

在一些實施例中，REP及/或第二擴增可使用如先前描述的T-175瓶及透氣袋(Tran等人, J. Immunother. 2008, 31,742-51；Dudley等人, J. Immunother. 2003, 26,332-42)或透氣性培養器皿(G-REX瓶)進行。在一些實施例中，第二擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係在T-175瓶中進行，且可將懸浮於150 mL培養基中之約1×10 ⁶個TIL添加至各T-175瓶中。TIL可在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物中培養。T-175瓶可在37℃、5% CO ₂下培育。可在第5天使用具有3000 IU/mL IL-2的50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，可將來自兩個T-175瓶之細胞在3 L袋中合併，且將300 mL AIM V與5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2添加至300 mL TIL懸浮液中。每天或每兩天對各袋中之細胞數目進行計數，且添加新鮮培養基以使細胞計數保持在0.5與2.0×10 ⁶個細胞/毫升之間。

在一些實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及在圖82之步驟D中提及之擴增)可在500 mL容量的具有100 cm透氣矽底之透氣瓶(G-REX-100，可購自Wilson Wolf Manufacturing公司(New Brighton, MN, USA))中進行，5×10 ⁶或10×10 ⁶個TIL可與PBMC一起在400 mL補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養。G-REX-100瓶可在37℃、5% CO ₂下培育。在第5天，可移出250 mL上清液且置放於離心瓶中且以1500 rpm (491 × g)離心10分鐘。TIL離心塊可用150 mL具有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回初始G-REX-100瓶中。當TIL在G-REX-100瓶中連續擴增時，在第7天，各G-REX-100中之TIL可懸浮於各瓶中存在之300 mL培養基中，且細胞懸浮液可分成可用於接種3個G-REX-100瓶之3份100 mL等分試樣。隨後可將150 mL具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各瓶中。G-REX-100瓶可在37℃、5% CO ₂下培育且在4天之後，可將具有3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V添加至各G-REX-100瓶中。可在培養之第14天收穫細胞。

在一些實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在燒瓶中進行，其中在150 mL培養基中混合主體TIL與100倍或200倍過量之不活化飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，替換培養基直至細胞轉移至替代生長箱室。在一些實施例中，藉由抽吸新鮮培養基來置換2/3的培養基。在一些實施例中，替代生長箱室包括G-REX瓶及透氣容器，如下文更充分論述。

在一些實施例中，進行第二擴增(包括稱為REP之擴增)，且進一步包含其中針對優良腫瘤反應性來選擇TIL之步驟。可使用此項技術中已知之任何選擇方法。舉例而言，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述之方法可用於選擇具有優異腫瘤反應性之TIL。

視情況地，細胞存活率分析法可在第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後使用此項技術中已知之標準分析法進行。舉例而言，可在主體TIL樣品上進行台盼藍排除分析(trypan blue exclusion assay)，其選擇性標記死細胞且允許存活率評估。在一些實施例中，TIL樣品可使用Cellometer K2自動化細胞計數器(Nexcelom Bioscience (Lawrence, MA))計算且確定存活率。在一些實施例中，存活率係根據標準Cellometer K2 Image Cytometer自動化細胞計數器方案確定。

在一些實施例中，TIL之第二擴增(包括稱為REP之擴增)可使用如先前所描述之T-175瓶及透氣袋(Tran等人, 2008, J Immunother., 31, 742-751，及Dudley等人 2003, J Immunother., 26, 332-342)或透氣G-REX瓶進行。在一些實施例中，使用燒瓶進行第二擴增。在一些實施例中，使用透氣G-REX瓶進行第二擴增。在一些實施例中，第二擴增係在T-175瓶中進行，且將約1×10 ⁶個TIL懸浮於約150 mL培養基中且將其添加至各T-175瓶中。TIL與作為「飼養」細胞的經照射(50 Gy)之同種異體PBMC以1:100之比率一起培養且細胞在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物(50/50培養基)中培養。T-175瓶在37℃、5% CO ₂下培育。在一些實施例中，在第5天使用具有3000 IU/mL IL-2的50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，在3 L袋中將來自2個T-175瓶之細胞合併且將具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之300 mL AIM-V添加至300 mL TIL懸浮液中。可每天或每兩天對各袋中之細胞數目進行計數，且可添加新鮮培養基以使細胞計數保持在約0.5與約2.0×10 ⁶個細胞/毫升之間。

在一些實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在500 mL容量的具有100 cm ²透氣矽底之透氣瓶(G-REX-100，Wilson Wolf)中進行，將約5×10 ⁶或10×10 ⁶個TIL與經照射之同種異體PBMC以1:100的比率在400 mL補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3之50/50培養基中培養。G-REX-100瓶在37℃、5% CO ₂下培育。在一些實施例中，在第5天，移出250 mL上清液且置放於離心瓶中且以1500 rpm (491 g)離心10分鐘。TIL離心塊可隨後用具有3000 IU/mL IL-2之150 mL新鮮50/50培養基再懸浮且添加回初始G-REX-100瓶中。在TIL在G-REX-100瓶中連續擴增之一些實施例中，在第7天，將各G-REX-100中之TIL懸浮於各燒瓶中存在之300 mL培養基中，且將細胞懸浮液分成用於接種3個G-REX-100瓶之三份100 mL等分試樣。隨後將150 mL具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各瓶中。G-REX-100瓶在37℃、5% CO ₂下培育且在4天之後，將具有3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V添加至各G-REX-100瓶中。在培養之第14天收穫細胞。

T淋巴球及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V (可變區)、D (多樣區)、J (聯結區)及C (恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第二擴增中獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性係增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β之表現增加。在一些實施例中，TCRab (亦即，TCRα/β)之表現增加。

在一些實施例中，第二擴增培養基(例如，有時稱為CM ²或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈遞飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。

在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包括(但不限於)以下中之一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、CO ₂ ⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。

在一些實施例中，國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基(其以引用之方式併入本文中)適用於本發明中。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含一或多種選自由以下組成之群的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自由以下組成之群的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由以下組成之群的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、CO ₂ ⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。

在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中之標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列舉之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中之標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列舉之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包含表4中之標題「補充劑之較佳實施例」欄中列舉之類型及濃度的非微量部分成分。

在一些實施例中，第二擴增(例如根據圖82之步驟D)係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。

在一些實施例中，快速或第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模之縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)中之小規模培養中培養TIL約3天至7天之時段來進行快速或第二擴增；且接著(b)實現小規模培養中之TIL轉移至比第一容器大之第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)且在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養之TIL約4天至7天之時段。

在一些實施例中，快速或第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模之橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)中之第一小規模培養中培養TIL約3天至7天之時段來進行快速或第二擴增；且接著(b)實現自第一小規模培養之TIL轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小與第一容器相等之第二容器中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之TIL部分在第二小規模培養中培養約4天至7天之時段。

在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配至複數個約2至5個TIL亞群中。

在一些實施例中，快速或第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模之橫向擴大及縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)中之小規模培養中培養TIL約3天至7天之時段來進行快速或第二擴增；且接著(b)實現自小規模培養之TIL轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器的來自小規模培養之TIL部分在較大規模培養中培養約4天至7天之時段。

在一些實施例中，快速或第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模之橫向擴大及縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)中之小規模培養中培養TIL約5天之時段來進行快速或第二擴增；且接著(b)實現自小規模培養之TIL轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX-500 MCS容器)中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器的來自小規模培養之TIL部分於較大規模培養中培養約6天之時段。

在一些實施例中，在快速或第二擴增之分裂後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL。在一些實施例中，在快速或第二擴增之分裂後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL、至少10 ⁹個TIL或至少10 ¹⁰個TIL。在一個例示性實施例中，各第二容器包含至少10 ¹⁰個TIL。

在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配至複數個亞群中。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配至複數個約2至5個亞群中。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配至複數個約2、3、4或5個亞群中。

在一些實施例中，在完成快速或第二擴增後，複數個亞群包含治療有效量之TIL。在一些實施例中，在完成快速或第二擴增後，將一或多個TIL亞群匯集在一起以產生治療有效量之TIL。在一些實施例中，在完成快速擴增後，各TIL亞群包含治療有效量之TIL。

在一些實施例中，在分成複數個步驟之前將快速或第二擴增進行約3至7天之時段。在一些實施例中，快速或第二擴增之分裂發生在快速或第二擴增開始後約第3天、第4天、第5天、第6天或第7天。

在一些實施例中，快速或第二擴增之分裂發生在第一擴增(亦即預REP擴增)開始後約第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天。在一個例示性實施例中，快速或第二擴增之分裂發生在第一擴增開始後約第16天。

在一些實施例中，在分裂之後，快速或第二擴增進一步進行約7至11天之時段。在一些實施例中，在分裂之後，快速或第二擴增進一步進行約5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段。

在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基包含與分裂後用於快速或第二擴增之細胞培養基相同的組分。在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基包含與分裂後用於快速或第二擴增之細胞培養基不同的組分。

在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC。

在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC之新鮮培養基來補充第一擴增中之細胞培養基而產生。在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮培養基來補充第一擴增中之細胞培養基而產生。在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC之新鮮細胞培養基來替換第一擴增中之細胞培養基而產生。在一些實施例中，在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮細胞培養基來替換第一擴增中的細胞培養基而產生。

在一些實施例中，分裂後用於快速或第二擴增之細胞培養基包含IL-2及視情況選用之OKT-3。在一些實施例中，分裂後用於快速或第二擴增之細胞培養基包含IL-2及OKT-3。在一些實施例中，分裂後用於快速或第二擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及視情況選用之OKT-3之新鮮培養基來替換在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基而產生。在一些實施例中，分裂後用於快速或第二擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及OKT-3之新鮮培養基來替換在分裂前用於快速或第二擴增之細胞培養基而產生。

在一些實施例中，快速擴增之分裂係在密閉系統中進行。

在一些實施例中，在快速或第二擴增期間之TIL培養規模之縱向擴大包括向TIL培養物中添加新鮮細胞培養基(亦稱為饋送TIL)。在一些實施例中，饋送包括頻繁地向TIL培養物中添加新鮮細胞培養基。在一些實施例中，饋送包括以規則間隔將新鮮細胞培養基添加至TIL培養物中。在一些實施例中，新鮮細胞培養基經由恆定流動供應至TIL。在一些實施例中，使用諸如Xuri W25之自動化細胞擴增系統進行快速擴增及饋送。 1.飼養細胞及抗原呈遞細胞

在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序(例如包括如下擴增，諸如圖82之步驟D中所描述之擴增以及稱為REP之彼等擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二擴增期間需要過量的飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係自健康血液供體之標準全血單位獲得的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。

一般而言，同種異體PBMC係經由照射或熱處理而不活化，且用於本文所描述之TIL擴增程序，包括圖式及實例中所描述之例示性程序。

或者，使用細胞介素之組合進行TIL之快速擴增及/或第二擴增亦係可能的，如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述，使用IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或更多者的組合。因此，可能組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21以及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且尤其如其中所描述之T細胞。

在一些實施例中，步驟D亦可包括將OKT-3抗體或莫羅單抗添加至培養基中，如本文中其他地方所描述。在一些實施例中，步驟D亦可包括向培養基中添加4-1BB促效劑，如本文中其他地方所描述。在一些實施例中，步驟D亦可包括將OX-40促效劑添加至培養基中，如本文中其他地方所描述。此外，可在步驟D期間在培養基中使用添加劑，諸如過氧化體增殖物活化受體γ共活化因子I-α促效劑，包括增殖物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如噻唑啶二酮化合物，如在美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號中所描述，其揭示內容以引用之方式併入本文中。 E. 步驟 E ：收穫 TIL

在第二擴增步驟之後，可收穫細胞。在一些實施例中，在例如圖82中所提供之一、二、三、四個或更多個擴增步驟之後收穫TIL。在一些實施例中，在例如圖82中所提供之兩個擴增步驟之後收穫TIL。

TIL可以任何適當且無菌之方式收穫，包括例如離心。收穫TIL之方法為此項技術中熟知的且任何此類已知之方法均可與本發明過程一起使用。在一些實施例中，使用自動化系統收穫TIL。

在一些實施例中，收穫(例如根據圖82之步驟E)係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。

在一些實施例中，根據圖82之步驟E係根據本文所描述之過程進行。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所描述之密閉系統。

在一些實施例中，根據實例中所描述之方法收穫TIL。在一些實施例中，使用如本文提及之步驟中所描述之方法收穫第1天與第11天之間的TIL，諸如實例中之第11天TIL收穫物。在一些實施例中，使用如本文提及之步驟中所描述之方法收穫第12天與第24天之間的TIL，諸如實例中之第22天TIL收穫物。在一些實施例中，使用如本文提及之步驟中所描述之方法收穫第12天與第22天之間的TIL，諸如實例中之第22天TIL收穫物。 F. 步驟 F ：最終調配及轉移至輸注容器

在如圖82中以例示性次序提供且如上文及本文中所詳述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器，用於向患者投與，諸如輸注袋或無菌小瓶。在一些實施例中，一旦使用上文所描述之擴增方法獲得治療足夠數目之TIL後，將其轉移至容器，用於向患者投與。

在一些實施例中，使用本揭示案之APC擴增之TIL係以醫藥組合物之形式向患者投與。在一些實施例中，醫藥組合物為TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增之TIL可藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與。在一些實施例中，T細胞係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。 IX. 醫藥組合物、劑量及給藥方案

在一些實施例中，使用本揭示案之方法製備之經基因編輯之TIL或未經基因編輯之TIL以醫藥組合物形式投與至患者。在一些實施例中，醫藥組合物為TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增之TIL可藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與。在一些實施例中，T細胞係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括一或多種選自由以下組成之群的細胞介素：IL-12、IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。在一些實施例中，一或多種細胞介素為栓繫細胞介素。

在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含編碼shRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，shRNA抑制免疫檢查點基因之表現。可藉由shRNA緘默化或抑制之免疫檢查點基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12。在一些實施例中，第二細胞介素為IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-15。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-2。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-21。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-18。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-6。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-7。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-9。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-23。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-27。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-33。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IFN γ。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為TNFa。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IFN α。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IFN β。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為GM-CSF。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為GCSF。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-15，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-2，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-21，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-18，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-6，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-7，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-9，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-23，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-27，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IL-33，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IFN γ，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為TNFa，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IFN α，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為IFN β，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為GM-CSF，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

在示例性實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL包括兩種膜錨定之細胞介素，其中第一細胞介素為IL-12且第二細胞介素為GCSF，且抑制免疫檢查點基因之表現的shRNA選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。在一些實施例中，本文提供之經基因編輯之TIL進一步包含PD-1 shRNA。

進一步提供本文揭示之經基因編輯之TIL或未治療性經基因編輯之TIL群體，例如，使用本揭示案中製造經基因編輯之TIL或未經基因編輯之TIL之方法製造的經基因編輯之TIL或未治療性經基因編輯之TIL群體。在一些實施例中，經基因編輯之TIL或未治療性經基因編輯之TIL群體可呈醫藥組合物之形式投與至患者。

可投與任何適合劑量之TIL。在一些實施例中，投與約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個TIL，平均約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其在癌症為NSCLC或黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，投與約1.2×10 ¹⁰至約4.3×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約3×10 ¹⁰至約12×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約4×10 ¹⁰至約10×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約5×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約6×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約7×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其在癌症為黑色素瘤。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其在癌症為NSCLC。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×10 ¹⁰至約4.3×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×10 ¹⁰至約12×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×10 ¹⁰至約10×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。

在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之數目為約1×10 ⁶、2×10 ⁶、3×10 ⁶、4×10 ⁶、5×10 ⁶、6×10 ⁶、7×10 ⁶、8×10 ⁶、9×10 ⁶、1×10 ⁷、2×10 ⁷、3×10 ⁷、4×10 ⁷、5×10 ⁷、6×10 ⁷、7×10 ⁷、8×10 ⁷、9×10 ⁷、1×10 ⁸、2×10 ⁸、3×10 ⁸、4×10 ⁸、5×10 ⁸、6×10 ⁸、7×10 ⁸、8×10 ⁸、9×10 ⁸、1×10 ⁹、2×10 ⁹、3×10 ⁹、4×10 ⁹、5×10 ⁹、6×10 ⁹、7×10 ⁹、8×10 ⁹、9×10 ⁹、1×10 ¹⁰、2×10 ¹⁰、3×10 ¹⁰、4×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰、6×10 ¹⁰、7×10 ¹⁰、8×10 ¹⁰、9×10 ¹⁰、1×10 ¹¹、2×10 ¹¹、3×10 ¹¹、4×10 ¹¹、5×10 ¹¹、6×10 ¹¹、7×10 ¹¹、8×10 ¹¹、9×10 ¹¹、1×10 ¹²、2×10 ¹²、3×10 ¹²、4×10 ¹²、5×10 ¹²、6×10 ¹²、7×10 ¹²、8×10 ¹²、9×10 ¹²、1×10 ¹³、2×10 ¹³、3×10 ¹³、4×10 ¹³、5×10 ¹³、6×10 ¹³、7×10 ¹³、8×10 ¹³及9×10 ¹³。在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之數目在1×10 ⁶至5×10 ⁶、5×10 ⁶至1×10 ⁷、1×10 ⁷至5×10 ⁷、5×10 ⁷至1×10 ⁸、1×10 ⁸至5×10 ⁸、5×10 ⁸至1×10 ⁹、1×10 ⁹至5×10 ⁹、5×10 ⁹至1×10 ¹⁰、1×10 ¹⁰至5×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰至1×10 ¹¹、5×10 ¹¹至1×10 ¹²、1×10 ¹²至5×10 ¹²及5×10 ¹²至1×10 ¹³之範圍內。

在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之濃度小於例如醫藥組合物之100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。

在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之濃度大於醫藥組合物之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。

在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之濃度在醫藥組合物的約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v之範圍內。

在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之濃度在醫藥組合物之約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v之範圍內。

在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。

在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。

提供於本發明之醫藥組合物中的TIL在廣泛劑量範圍內有效。準確劑量將視投與途徑、化合物投與形式、待治療個體之性別及年齡、待治療個體之體重及主治醫師之偏好及經驗而定。適當時亦可使用TIL之臨床確定劑量。使用本文之方法投與之醫藥組合物的量，諸如TIL之劑量將視所治療之人類或哺乳動物、病症或病狀之嚴重程度、投與速率、活性醫藥成分之配置及開處方醫師之判斷而定。

在一些實施例中，TIL可以單次劑量投與。此類投與可藉由例如靜脈內注射之注射進行。在一些實施例中，TIL可以多次劑量投與。給藥可為每年一次、兩次、三次、四次、五次、六次或超過六次。給藥可為每月一次、每兩週一次、一週一次或每隔一天一次。TIL之投與可視需要而繼續。

在一些實施例中，TIL之有效劑量為約1×10 ⁶、2×10 ⁶、3×10 ⁶、4×10 ⁶、5×10 ⁶、6×10 ⁶、7×10 ⁶、8×10 ⁶、9×10 ⁶、1×10 ⁷、2×10 ⁷、3×10 ⁷、4×10 ⁷、5×10 ⁷、6×10 ⁷、7×10 ⁷、8×10 ⁷、9×10 ⁷、1×10 ⁸、2×10 ⁸、3×10 ⁸、4×10 ⁸、5×10 ⁸、6×10 ⁸、7×10 ⁸、8×10 ⁸、9×10 ⁸、1×10 ⁹、2×10 ⁹、3×10 ⁹、4×10 ⁹、5×10 ⁹、6×10 ⁹、7×10 ⁹、8×10 ⁹、9×10 ⁹、1×10 ¹⁰、2×10 ¹⁰、3×10 ¹⁰、4×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰、6×10 ¹⁰、7×10 ¹⁰、8×10 ¹⁰、9×10 ¹⁰、1×10 ¹¹、2×10 ¹¹、3×10 ¹¹、4×10 ¹¹、5×10 ¹¹、6×10 ¹¹、7×10 ¹¹、8×10 ¹¹、9×10 ¹¹、1×10 ¹²、2×10 ¹²、3×10 ¹²、4×10 ¹²、5×10 ¹²、6×10 ¹²、7×10 ¹²、8×10 ¹²、9×10 ¹²、1×10 ¹³、2×10 ¹³、3×10 ¹³、4×10 ¹³、5×10 ¹³、6×10 ¹³、7×10 ¹³、8×10 ¹³及9×10 ¹³。在一些實施例中，TIL之有效劑量在1×10 ⁶至5×10 ⁶、5×10 ⁶至1×10 ⁷、1×10 ⁷至5×10 ⁷、5×10 ⁷至1×10 ⁸、1×10 ⁸至5×10 ⁸、5×10 ⁸至1×10 ⁹、1×10 ⁹至5×10 ⁹、5×10 ⁹至1×10 ¹⁰、1×10 ¹⁰至5×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰至1×10 ¹¹、5×10 ¹¹至1×10 ¹²、1×10 ¹²至5×10 ¹²及5×10 ¹²至1×10 ¹³之範圍內。

在一些實施例中，TIL之有效劑量在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg之範圍內。

在一些實施例中，TIL之有效劑量在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg、或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg之範圍內。

有效量之TIL可藉由投與具有類似效用之試劑的任一種公認模式，包括鼻內及經皮途徑、藉由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌肉內、皮下、局部、藉由移植或藉由吸入，以單次或多次劑量投與。

在其他實施例中，本發明提供一種輸注袋，其包含如上在任何前述段落中描述的治療性TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)組合物，其包含如上在任何前述段落中描述的治療性TIL群體及醫藥學上可接受之載劑。

在其他實施例中，本發明提供一種輸注袋，其包含如上在任何前述段落中描述的TIL組合物。

在其他實施例中，本發明提供一種如上在任何前述段落中描述的治療性TIL群體的冷凍保存製劑。

在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)組合物，其包含如上在任何前述段落中描述的治療性TIL群體及冷凍保存培養基。

在其他實施例中，本發明提供經修改之如上任何前述段落中描述的TIL組合物，其中冷凍保存培養基含有DMSO。

在其他實施例中，本發明提供經修改之如上任何前述段落中描述的TIL組合物，其中冷凍保存培養基含有7%至10% DMSO。

在其他實施例中，本發明提供一種如上在任何前述段落中描述的TIL組合物的冷凍保存製劑。 X. 治療癌症患者之方法

在一些實施例中，將使用本揭示案之方法製造的未治療性經基因編輯之TIL群體投與至患者以治療癌症。在一些實施例中，本文提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a) 自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體； b) 藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增； c) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15及L-精胺酸；及 d) 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。

在一些實施例中，本文提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a) 自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體； b) 藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增； c) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15、L-精胺酸及NAD+；及 d) 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。

在一些實施例中，使用本揭示案之方法的經基因編輯之TIL投與至患者以治療癌症。在一些實施例中，本文提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a) 自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體； b) 藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增； c) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增； d) 在任何時間，用本文揭示之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生治療性經基因編輯之TIL群體；及 e) 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。

在一些實施例中，方法進一步包括在用重組慢病毒粒子轉導TIL群體之前活化TIL群體1天或2天。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與選自由以下組成之群的細胞介素接觸：IL-2、IL-15、IL-21、IL-7及其組合。在一些實施例中，活化步驟包括使TIL群體與TransAct接觸。在一些實施例中，轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟包括離心。在一些實施例中，轉導步驟在Lentibooster存在下進行。在一些實施例中，轉導步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。在一些實施例中，活化步驟在第一擴增步驟之後及第二擴增步驟之前進行。在一些實施例中，方法進一步包括使TIL群體靜置1天或2天在該轉導步驟之後。

在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療患者之步驟。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。在一些實施例中，環磷醯胺與美司鈉一起投與。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，方法進一步包括在向患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。在一些實施例中，方法不包括用IL-2方案治療患者之步驟。在一些實施例中，治療性TIL群體包含約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰TIL。

在一些實施例中，癌症為實體腫瘤癌症。在一些實施例中，實體腫瘤癌症係選自由以下組成之群：肛門癌、膀胱癌、乳癌(包括三陰性乳癌)、骨癌、由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)引起的癌症、中樞神經系統相關癌症(包括室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、神經母細胞瘤、松果體母細胞瘤及原始神經外胚層腫瘤)、子宮頸癌(包括鱗狀細胞子宮頸癌、腺鱗狀子宮頸癌及子宮頸腺癌)、大腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、食管胃交界處癌症、胃癌、胃腸癌、胃腸基質瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌)、黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、間皮瘤(包括惡性胸膜間皮瘤)、卵巢癌、胰臟癌(包括胰管腺癌)、陰莖癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤以及其他骨骼及軟組織肉瘤)、甲狀腺癌(包括退行性甲狀腺癌)、子宮癌及陰道癌。

在一些實施例中，癌症為前述癌症中之一者，包括實體腫瘤癌症及血液惡性病，其對於用至少一種先前療法(包括化學療法、放射療法或免疫療法)治療為復發性或難治性的。在一些實施例中，癌症對用至少兩種先前療法(包括化學療法、放射療法及/或免疫療法)治療為復發性或難治性的前述癌症之一。在一些實施例中，癌症對用至少三種先前療法(包括化學療法、放射療法及/或免疫療法)治療為復發性或難治性的前述癌症之一。

在一些實施例中，癌症為高微隨體不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型癌症。MSI-H及dMMR癌症及其檢測已描述於Kawakami等人, Curr. Treat. Options Oncol. 2015, 16,30中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，癌症為轉移性黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症為肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌)。在一些實施例中，癌症為子宮頸癌。在一些實施例中，癌症為頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)。在一些實施例中，癌症為子宮內膜癌。在一些實施例中，癌症為卵巢癌。 1.患者之淋巴球耗減預調節

在一些實施例中，本發明包括一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本揭示案之TIL之前經非清髓性化療預治療。在一些實施例中，本發明包括用於治療已用非清髓性化療預治療之患者之癌症的TIL群體。在一些實施例中，TIL群體係藉由輸注投與。在一些實施例中，非清髓性化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d持續5天(在TIL輸注前第27至23天)。在一些實施例中，在根據本揭示案之非清髓性化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2(阿地介白素，可以PROLEUKIN商購)之靜脈內輸注以達到生理耐受。在某些實施例中，TIL群體用於與IL-2組合治療癌症，其中IL-2係在TIL群體之後投與。

在一些實施例中，患者接受強度降低之非清髓性淋巴球耗減方案。在一些實施例中，強度降低之非清髓性淋巴球耗減方案包括以約250-750毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺以約250毫克/平方公尺/天之劑量投與。在一些實施例中，環磷醯胺以約500毫克/平方公尺/天之劑量投與。在一些實施例中，環磷醯胺以約750毫克/平方公尺/天之劑量投與。在一些實施例中，環磷醯胺經投與三天或四天。在一些實施例中，環磷醯胺投與後接著以30毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱。在一些實施例中，氟達拉濱經投與三天、四天或五天。在一些實施例中，環磷醯胺與美司鈉一起投與。在一些實施例中，患者不接受非清髓性淋巴球耗減方案。

實驗發現表明，在授受性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，淋巴球耗減藉由消除調節性T細胞且競爭免疫系統之元件(『細胞介素庫』)在增強治療功效方面發揮關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之TIL之前在患者身上採用淋巴球耗減步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調節」)。

一般而言，使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為馬磷醯胺)及其組合之投與實現淋巴球耗減。此類方法描述於Gassner等人, Cancer Immunol.Immunother2 011, 60, 75-85；Muranski等人, Nat. Clin. Pract. Oncol. , 2006, 3, 668-681；Dudley等人, J. Clin. Oncol. 2008, 26,5233-5239；及Dudley等人, J. Clin. Oncol. 2005, 23,2346-2357，所有該等文獻以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投與。在一些實施例中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投與。在一些實施例中，投與氟達拉濱治療1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，氟達拉濱係以10毫克/公斤/天、15毫克/公斤/天、20毫克/公斤/天、25毫克/公斤/天、30毫克/公斤/天、35毫克/公斤/天、40毫克/公斤/天或45毫克/公斤/天之劑量投與。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投與2至7天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投與4至5天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以25毫克/公斤/天投與4至5天。

在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得濃度為0.5 μg/mL至10 μg/mL的環磷醯胺之活性形式馬磷醯胺。在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得濃度為1 μg/mL的環磷醯胺之活性形式馬磷醯胺。在一些實施例中，投與環磷醯胺治療1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，環磷醯胺係以100毫克/平方公尺/天、150毫克/平方公尺/天、175毫克/平方公尺/天、200毫克/平方公尺/天、225毫克/平方公尺/天、250毫克/平方公尺/天、275毫克/平方公尺/天或300毫克/平方公尺/天之劑量投與。在一些實施例中，環磷醯胺係靜脈內(亦即i.v.)投與。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以35毫克/公斤/天投與2至7天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與4至5天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與4天。

在一些實施例中，藉由將氟達拉濱及環磷醯胺一起投與給患者進行淋巴球耗減。在一些實施例中，經4天以25毫克/平方公尺/天靜脈內投與氟達拉濱且以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與環磷醯胺。

在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天來進行淋巴球耗減。

在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天來進行淋巴球耗減，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗減。

在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗減，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗減。

在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗減，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗減。

在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗減，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗減。

在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約15毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗減，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗減。

在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天來進行淋巴球耗減。

在一些實施例中，環磷醯胺與美司鈉一起投與。在一些實施例中，美司鈉係以15 mg/kg投與。在一些實施例中，輸注美司鈉，且若連續輸注，則歷經24小時，伴隨各自環磷醯胺劑量開始，美司鈉可經大約2小時與環磷醯胺一起輸注(第-5天及/或第-4天)，隨後在剩餘22小時以3毫克/公斤/小時之速率輸注。

在一些實施例中，淋巴球耗減包括以下步驟：在向患者投與第三TIL群體之後第二天開始用IL-2方案治療患者。

在一些實施例中，淋巴球耗減包括以下步驟：在向患者投與第三TIL群體之同一天開始用IL-2方案治療患者。

在一些實施例中，淋巴球耗減包括5天之預調節治療。在一些實施例中，天數指示為第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的60 mg/kg靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺與美司鈉一起投與。在一些實施例中，該方案進一步包括氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括25 mg/m ²靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天及第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m ²靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天及第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m ²靜脈內氟達拉濱。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表11投與。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表12投與。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表13投與。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表14投與。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表15投與。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表16投與。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表17投與。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案係根據表18投與。

在一些實施例中，與前述清髓性淋巴球耗減方案之實施例一起使用之TIL輸注可為本文所描述之任何TIL組合物，以及添加IL-2方案及投與如本文中所描述的共同療法(諸如，PD-1及PD-L1抑制劑)。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注日之前1、2或3天之過程中投與美法侖(melphalan)至總劑量為100 mg/m ²。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注日之前1、2或3天之過程中投與美法侖至總劑量為200 mg/m ²。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注日之前1、2或3天之過程中投與美法侖至總劑量為100 mg/m ²且以30毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注日之前1、2或3天之過程中投與美法侖至總劑量為200 mg/m ²且以30毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱。

在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括投與抗CD45抗體。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括投與抗CD45抗體-藥物結合物。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括投與抗CD45抗體-放射性同位素結合物。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括投與阿帕米單抗(apamistamab)- ¹³¹I。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注前2天與9天之間以25 mCi、50 mCi、75 mCi、100 mCi、150 mCi或200 mCi之劑量投與之阿帕米單抗- ¹³¹I。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注前2天與9天之間以25 mCi至200 mCi之劑量投與之阿帕米單抗- ¹³¹I。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注前4天與8天之間以50 mCi至150 mCi之劑量投與之阿帕米單抗- ¹³¹I。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注前約6天以約75 mCi之劑量投與之阿帕米單抗- ¹³¹I。在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗減方案包括在TIL輸注前約7天以約100 mCi之劑量投與之阿帕米單抗- ¹³¹I。

在一些實施例中，與清髓性淋巴球耗減方案之前述實施例一起使用的TIL輸注可為本文所描述之任何TIL組合物，包括經基因修飾以包括一或多種附接於其表面之免疫調節劑之TIL產品，且亦可包括MIL及PBL之輸注以替代TIL輸注，以及添加替代淋巴球耗減方案，包括抗CD52抗體阿侖單抗(alemtuzumab)或其變異體、片段、抗體-藥物結合物或生物類似物。 2.IL-2方案

在一些實施例中，IL-2方案包括高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包括阿地介白素或其生物類似物或變異體，其在投與治療性TIL群體之治療有效部分之後當天開始靜脈內投與，其中阿地介白素或其生物類似物或變異體係每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸注以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg (患者體重)之劑量投與直至耐受，最多為14個劑量。在休止9天後，可重複此時程再投與14次劑量，最多總計28次劑量。在一些實施例中，IL-2係以1、2、3、4、5或6次劑量投與。在一些實施例中，IL-2係以至多6次劑量之最大劑量投與。

在一些實施例中，IL-2方案包括遞減IL-2方案。遞減IL-2方案已描述於O'Day等人, J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及Eton等人, Cancer 2000, 88,1703-9，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遞減IL-2療法包含經6小時靜脈內投與18×10 ⁶IU/m ²，接著經12小時靜脈內投與18×10 ⁶IU/m ²，接著經24小時靜脈內投與18×10 ⁶IU/m ²，接著經72小時靜脈內投與4.5×10 ⁶IU/m ²之阿地介白素或其生物類似物或變異體。此治療週期可每28天重複，達最多四個週期。在一些實施例中，遞減IL-2方案包括第1天18,000,000 IU/m ²，第2天9,000,000 IU/m ²以及第3天及第4天4,500,000 IU/m ²。

在一些實施例中，降低劑量之IL-2方案包括減少數量，例如1、2、3、4或5個劑量之600,000或720,000 IU/kg之阿地介白素或其生物類似物或變異體，其以每8小時15分鐘推注靜脈輸注形式投與直至耐受。在一些實施例中，患者不接受IL-2方案。

在一些實施例中，IL-2方案包括劑量遞減IL-2方案。可使用此項技術中已知之任何低劑量IL-2方案，包括Dominguez-Villar及Hafler, Nat. Immunology 2000, 19,665-673；Hartemann等人, Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1, 295-305；及Rosenzwaig等人, Ann. Rheum. Dis. 2019, 78,209-217中所描述之低劑量IL-2方案，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，低劑量IL-2方案包括每24小時18×10 ⁶IU/m ²之阿地介白素或其生物類似物或變異體，以連續輸注形式投與5天；隨後2至6天不投與IL-2療法；視情況接著以每24小時連續輸注18×10 ⁶IU/m ²之形式再靜脈內投與阿地介白素或其生物類似物或變異體5天；視情況在隨後3週不投與IL-2療法，隨後可進行其他週期之投藥。

在一些實施例中，IL-2係以至多6次劑量之最大劑量投與。在一些實施例中，高劑量IL-2方案適用於小兒用途。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為600,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為400,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為300,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為200,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為100,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。

在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與聚乙二醇化IL-2。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與貝培阿地白介素或其片段、變異體或生物類似物。

在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與THOR-707或其片段、變異體或生物類似物。

在一些實施例中，IL-2方案包括在投與TIL之後投與奈瓦紐金α或其片段、變異體或生物類似物。在某些實施例中，每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量向患者投與奈瓦紐金。

在一些實施例中，IL-2方案包括投與移植至抗體主鏈上之IL-2片段。在一些實施例中，IL-2方案包括投與結合IL-2低親和力受體之抗體細胞介素移植蛋白。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包含重鏈可變區(V _H)，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V _L)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V _H或V _L之CDR中，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包含重鏈可變區(V _H)，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V _L)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V _H或V _L之CDR中，其中該IL-2分子為突變蛋白，並且其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與抗體或其片段、變異體或生物類似物，該抗體包含選自由SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:38組成之群之重鏈及選自由SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39組成之群之輕鏈。

在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(諸如但不限於阿地介白素(Proleukin®)或可比分子)長。

在一些實施例中，與清髓性淋巴球耗減方案之前述實施例一起使用之TIL輸注可為本文所描述之任何TIL組合物且亦可包括代替TIL輸注之MIL及PBL輸注，以及添加IL-2方案及投與如本文所描述之共同療法(諸如PD-1及/或PD-L1抑制劑及/或CTLA-4抑制劑)。實例

現參考以下實例描述本文中涵蓋之實施例。此等實例僅出於說明之目的提供且本揭示案決不應理解為限於此等實例，而應理解為涵蓋由於本文提供之教示而變得顯而易見的任何及所有變化形式。實例 1 ：製備用於 PRE-REP 及 REP 過程之培養基

此實例描述用於製備適用於涉及衍生自各種實體腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之培養的方案之組織培養基的程序。此培養基可用於製備本申請案及實例中所描述之任一TIL。

製備CM1。自冷藏庫取出以下試劑且使其在37℃水浴中升溫：(RPMI1640、人類AB血清、200 mM L-麩醯胺酸)。根據下表19，藉由將各成分添加至適用於待過濾體積之0.2 µm過濾器單元的頂部來製備CM1培養基。在4℃下儲存。

使用當天，將所需量之CM1在37℃水浴中預熱且添加6000 IU/mL IL-2。

根據表20，可按需要進行額外補充。製備 CM2

自冰箱取出已製備之CM1或製備新鮮CM1。自冰箱取出AIM-V®，且藉由在無菌培養基瓶中混合已製備之CM1與等體積AIM-V®來製備所需量之CM2。在使用當天向CM2培養基中添加3000 IU/mL IL-2。在使用當天用3000 IU/mL IL-2製成足夠量之CM2。將CM2培養基瓶標記上名稱、製備者名字縮寫、過濾/製備日期、兩週之過期日期，且在需要用於組織培養之前儲存於4℃下。製備 CM3

在需要使用的當天，製備CM3。CM3與AIM-V®培養基相同，但在使用當天補充3000 IU/mL IL-2。藉由向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2儲備液，製備滿足實驗需求之量的CM3。藉由輕微振盪進行充分混合。添加AIM-V之後，立即將瓶子標記上「3000 IU/mL IL-2」。若存在過量CM3，則將其儲存於處於4℃下之瓶子中，標記上培養基名稱、製備者名字縮寫、製備培養基之日期及其過期日期(製備後7天)。儲存於4℃下7天後，捨棄補充有IL-2之培養基。製備 CM4

CM4與CM3相同，但另外補充2 mM GlutaMAX ^TM(最終濃度)。每1L CM3添加10 mL之200 mM GlutaMAX™。藉由向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2儲備液及GlutaMAX™儲備液，製備滿足實驗需求之量的CM4。藉由輕微振盪進行充分混合。在添加至AIM-V中之後，立即將瓶子標記為「3000 IL/mL IL-2及GlutaMAX」。若存在過量CM4，則將其在4℃下儲存於瓶子中，標記上培養基名稱、「GlutaMAX」及其過期日期(製備後7天)。在4℃下儲存超過7天後，捨棄補充有IL-2之培養基。實例 2 ：使用慢病毒粒子轉導 TILTIL活化

將預REP處理之TIL以1e6/mL CM2 (不含建它黴素+300 IU/mL IL-2)懸浮在24孔盤中，每孔2 mL。培育隔夜。

製備20x IL-15、IL-7混合液，每孔添加100 uL。 ○ 最終濃度：不含建它黴素之CM2中之IL-15 (10 ng/mL)、IL-7 (20 ng/mL) ○ 例如：需要10個孔 ■ 10孔×100 uL混合液 = 1 mL • 添加IL-15至濃度為200 ng/mL • 添加IL-7至濃度為400 ng/mL ○ 注意：在添加TransACT、IL-15及IL-7之前，自各孔中取出120 uL，使最終體積為2 mL

將100 uL 20x細胞介素混合液添加至24孔盤內之各TIL培養物中。接著，將20 uL TransACT添加至各孔中。用移液管輕輕混合各孔以均勻分散TIL且與刺激混合液混合。培育2天。基因轉導及靜置

藉由每孔添加250 uL，用Retronectin (在PBS中1:100稀釋)塗佈非組織培養48孔盤。將盤包裹在封口膜(parafilm)中，且接著在4℃下培育隔夜。

自retronectin盤移除塗佈溶液，且用250 uL 2% BSA部分V替代。注意：立即添加2% BSA部分V，以免孔變乾。

在室溫下培育30分鐘以進行阻斷。

移除阻斷溶液。添加計算體積之病毒上清液且用封口膜包裹。2000×g離心90分鐘，32℃。注意：在添加培養盤之前先預熱離心機。

在室溫下培育30分鐘以進行阻斷。移除阻斷溶液。添加以下： 1. 100 uL TIL懸浮液(1e5個細胞) 2. 300 uL CM2 + IL-15 (20 ng/mL) + IL-7 (40 ng/mL) + Lentibooster 1:50 3. 慢病毒(使用實例3之慢病毒粒子產生方案產生)，MOI在10-40範圍內 4. 以不含建它黴素之CM2調節，每孔總體積600 uL

2000×g離心，45分鐘，32℃。置於培育箱中且培育3天。實例 3 ：慢病毒粒子產生方案

將293T細胞重懸於病毒培養基中，將6E6/10 ml HEK293T細胞置於10CM培養皿中。病毒製造培養基：10% FBS、DMEM (高葡萄糖、麩醯胺酸)丙酮酸鈉(1% W/v)、碳酸氫鈉(0.075%)或HEPES (不含Pen/strep)。

第二天，將Gag/Pol輔助質體、Rev輔助質體、BaEVTR或VSV-G輔助質體以及轉移載體以1 µg/μL濃度以1:1莫耳比混合。混合後，添加30 µL TransIT ^®-Lenti試劑(Mirus Bio)，且在每個HEK 293T培養皿1 mL Opti-MEM™培養基中室溫培育10分鐘。

接著將HEK293T細胞在37℃、5% CO ₂下培育2天。

病毒粒子收穫：自培養皿中取出培養物上清液，且將新鮮培養基添加至每個培養皿中，以200 g離心5分鐘以移除細胞碎片，且接著使用0.45 µM過濾器過濾。接著經由60,000 g超速離心2小時濃縮病毒上清液。超速離心後，移除上清液，且將病毒團塊重新溶解在Opti-MEM™培養基中。

第二天可重複病毒粒子收穫步驟以最佳化病毒產生。實例 4 ： 經修飾之具有膜錨定之 IL-15 及 IL-21 免疫調節融合蛋白之 TIL 之製備及表徵 材料及方法病毒製備及T細胞轉導

為製備慢病毒，將含有栓繫細胞介素基因序列(表21)之pLenti-載體及封裝輔助載體(VSV-G，Gag/Pol)共同轉染至293T細胞中。自第2-3天培養物上清液收集慢病毒上清液，接著進行超離心(120,000 g)以濃縮慢病毒以用於TIL轉導。在T細胞轉導之前，用TransACT(1:100)刺激預REP細胞2天。將1E5個經活化之預REP細胞與經濃縮之慢病毒一起添加至預塗有Retronectin之48孔盤中。在基因轉導之後兩天，收穫預REP細胞以用於REP過程或其他表型表徵及功能分析法。流式細胞分析技術

為檢驗經轉導之細胞中之mIL-15表現，使用生物素-結合物IL-15(biolgend, San Diego, CA)加鏈黴抗生物素蛋白-BV421(Biolegend, San Diego, CA)將經轉導之細胞染色。為檢驗mIL-21表現，使用PE結合之IL-21抗體將經轉導之細胞染色。為檢驗T細胞分裂，使用CellTrace™紫細胞增殖染料(ThermoFisher scientific, Waltham, MA)預先標記T細胞。在5天之後，在存在或不存在IL-2 (20 IU/mL)之情況下，在離體培養物中分析T細胞分裂。為檢查T細胞之活化及分化，使用BD Bioscience、Biolegend、Thermofisher之抗體進行表型表徵。用BioRad ZE5流式細胞儀獲取資料且用FlowJo軟體(FlowJo, LLC, Ashland, OR)進行分析。 T細胞計數及存活率

在TIL擴增之後收穫REP細胞。使用Cellometer K2細胞計數器(Nexcelom, Lawrence, MA)藉由AOPI分析法評估活細胞數目。預REP及REP過程

將人類腫瘤樣品分割成約3 mm片狀物且與推薦的含有IL-2 (6000 IU/mL)之培養基一起在Grex10中培養。在培養11天之後，收穫預REP細胞以用於2天活化及2天慢病毒轉導。接著，在REP擴增過程中用經照射之PBMC、抗CD3抗體及3,000 IU/mL IL-2將經轉導之預REP細胞再繁殖11天。結果基因轉導之後的mIL-15/mIL-21之表現

在基因轉導之後，用300 IU/mL IL-2將經轉導之預REP細胞再離體擴增5天。藉由流式細胞分析技術染色，經轉導之預REP細胞呈現mIL-15及mIL-21之表現。如圖1A中所示，存在經mIL-15慢病毒轉導之TIL中之54.8% mIL-15之表現、經mIL-21轉導之TIL中之53.5% mIL-21之表現以及經mIL-15/IL21轉導之TIL中之36.5% mIL-15/mIL-21雙重陽性細胞之表現。使用未經轉導之細胞作為陰性對照。 mIL-15預REP細胞呈現pSTAT5信號傳導之持續活化且展示增加之增殖

在驗證表面細胞介素表現之後，檢驗T細胞功能性。STAT5之磷酸化為在γ鏈細胞介素刺激後T細胞活化之標誌。在血清饑餓之條件下，經mIL-15、mIL-21及mIL-15/IL-21慢病毒轉導之細胞顯示持續的pSTAT5信號傳導，指示mIL-15具有功能性。如圖1B中所示，在誘導pSTAT5活化方面，mIL-15優於mIL-21。此外，藉由CellTrace增殖分析法檢驗經mIL-15慢病毒轉導之TIL之細胞增殖。在存在或不存在IL-2之情況下，將預先經CellTrace紫標記之TIL離體培養5天。如圖1C中所示，在存在或不存在IL-2之情況下，mIL-15 TIL與mIL-21或mIL-15/IL-21 TIL相比呈現優良的增殖能力。mIL-15 TIL可在不存在IL-2之情況下增殖，表明mIL-15可替代IL-2提供增殖信號。 REP過程之後的mIL-15/mIL-21之表現

在慢病毒轉導之後，在REP過程中將TIL擴增11天。接著，藉由流式細胞分析技術評估膜結合之細胞介素受體之表面表現。如圖2A中所示，存在mIL-15 TIL中之31.1% mIL-15之表現、mIL-21 TIL中之63% mIL-21之表現以及mIL-15/IL21 TIL中之10.7% mIL-15/mIL-21雙重陽性細胞之表現。使用未經轉導之細胞作為陰性對照。 mIL-15/mIL-21之表現促進REP過程中之CD8T細胞擴增

在所收穫之REP細胞中，在經mIL-15、mIL-21及mIL-15/IL-21慢病毒轉導之TIL中偵測到CD8+ T細胞百分比之增加(圖2B及圖2C)。此與先前報導一致，該等先前報導證實IL-15及IL-21充當優先刺激CD8 T細胞之增殖及存活之強效刺激劑。表現mIL-15/mIL-21之REP TIL之表型

為表徵mIL-15及mIL-21對REP細胞之免疫調節作用，在圈選之CD8+CD3+ T細胞(圖3)及CD4+CD3+ T細胞子集(圖4)中用新鮮解凍之REP細胞進行表型分析。吾人發現mbIL-15顯著下調CD25(IL-2Rα)表現。與IL-2相同，IL-15在使用IL-2Rβ及IL-2Rγ方面進行競爭，表明調節CD25之負反饋機制。此外，mIL-15似乎活化T細胞，其特徵在於較高的TIM3、TOX之表現，而IL-21呈現拮抗劑作用。此外，mIL-15及mIL-21皆下調Eomes之表現。未觀測到其他表面標記物(諸如PD-1、CD27、CXCR3等)之表現之顯著差異。實例 5 ：經修飾之具有膜錨定之 IL-15 及 IL-21 免疫調節融合蛋白之 TIL 之製備及表徵

對於此研究，將製備經修飾之具有膜錨定之IL-15及/或IL-21免疫調節融合蛋白之TIL，其中使用NFAT啟動子控制膜錨定之免疫調節IL-15及IL-21之表現，該啟動子包括連接至最小人類IL-2啟動子之NFAT反應性元件，參見例如表23。將如以下所闡述來表徵經修飾之TIL。 材料及方法病毒製備及T細胞轉導

為製備慢病毒，將含有栓繫細胞介素基因序列(表22)之pLenti-載體及封裝輔助載體(BaEV-TR，Gag/Pol)共同轉染至293T細胞中。自第2-3天培養物上清液收集慢病毒上清液，接著進行超離心(120,000 g)以濃縮慢病毒以用於TIL轉導。將1E5個預REP細胞與經濃縮之慢病毒一起添加至預塗有Retronectin之48孔盤中。在基因轉導之後兩天，收穫預REP細胞以用於REP過程或其他表型表徵及功能分析法。流式細胞分析技術

為檢驗經轉導之細胞中之mIL-15表現，使用生物素-結合物IL-15 (biolgend, San Diego, CA)加鏈黴抗生物素蛋白-BV421 (Biolegend, San Diego, CA)將經轉導之細胞染色。為檢驗mIL-21表現，使用PE結合之IL-21抗體將經轉導之細胞染色。為檢驗T細胞分裂，使用CellTrace™紫細胞增殖染料(ThermoFisher scientific, Waltham, MA)預先標記T細胞。在5天之後，在存在或不存在IL-2 (20 IU/mL)之情況下，在離體培養物中分析T細胞分裂。為檢查T細胞之活化及分化，使用BD Bioscience、Biolegend、Thermofisher之抗體進行表型表徵。用BioRad ZE5流式細胞儀獲取資料且用FlowJo軟體(FlowJo, LLC, Ashland, OR)進行分析。 T細胞計數及存活率

在基因轉導之後，用300 IU/mL IL-2將經轉導之預REP細胞再離體擴增5天。藉由流式細胞分析技術染色，評估經轉導之預REP細胞之mIL-15及mIL-21之表現。使用未經轉導之細胞作為陰性對照。 mIL-15預REP細胞呈現pSTAT5信號傳導之持續活化且展示增加之增殖

在驗證表面細胞介素表現之後，檢驗T細胞功能性。特定言之，在血清饑餓條件下評估經修飾之TIL之STAT5之磷酸化，以測定經修飾之TIL是否表現功能性mIL-15及/或IL-21。此外，藉由CellTrace增殖分析法檢驗經mIL-15慢病毒轉導之TIL之細胞增殖。 REP過程之後的mIL-15/mIL-21之表現

在慢病毒轉導之後，在REP過程中將TIL擴增11天且接著藉由流式細胞分析技術評估膜結合之細胞介素受體之表面表現。針對CD8+ T細胞評估所收穫之REP細胞。先前報導證實IL-15及IL-21充當優先刺激CD8 T細胞之增殖及存活之強效刺激劑。表現mIL-15/mIL-21之REP TIL之表型

為表徵mIL-15及mIL-21對REP細胞之免疫調節作用，在圈選之CD8+CD3+ T細胞及CD4+CD3+ T細胞子集中用新鮮解凍之REP細胞進行表型分析。將評估以下之表現：CD27、PD1、TIM3、CD62L、TOX、T-bet、CD38、CXCR3、Eomes及CD25。實例 6 ：在 NFAT 啟動子之控制下表現經拴繫之 IL-12 且減少 PD-1 表現之經修飾 TIL 之製備及表徵

對於此項研究，將製備具有膜錨定之IL-12免疫調節融合蛋白及一或多種用於降低內源性PD-1表現之shRNA之經修飾TIL。圖5描繪允許表現膜錨定之IL-12 (TeIL-12)及PD-1 shRNA之例示性核酸構築體。如圖5所示，膜錨定之免疫調節IL-12之表現係使用NFAT啟動子控制，該啟動子包括與最小人類IL-2啟動子連接之NFAT反應元件，參見例如表23。shRNA在PolIII啟動子(U6)之控制下。病毒製備及T細胞轉導

為製備慢病毒，將含有栓繫細胞介素基因序列(表23)及PD-1 shRNA (表9)之pLenti-載體及封裝輔助載體(BaEV-TR，Gag/Pol)共同轉染至293T細胞中。自第2-3天培養物上清液收集慢病毒上清液，接著進行超離心(120,000 g)以濃縮慢病毒以用於TIL轉導。將1E5個預REP細胞與經濃縮之慢病毒一起添加至預塗有Retronectin之48孔盤中。在基因轉導之後兩天，收穫預REP細胞以用於根據本文所描述之REP過程或其他表型表徵及功能分析法。流式細胞分析技術

使用免疫螢光染色及流式細胞分析技術分析評估TIL TeIL-12及PD-1表現。 T細胞計數及存活率

將人類腫瘤樣品分割成約3 mm片狀物且與推薦的含有IL-2 (6000 IU/mL)之培養基一起在Grex10中培養。在培養11天之後，收穫預REP細胞以用於2天活化及2天慢病毒轉導。接著，在REP擴增過程中用經照射之PBMC、抗CD3抗體及3,000 IU/mL IL-2將經轉導之預REP細胞再繁殖11天。實例 7 ：在 NFAT 啟動子之控制下表現經拴繫之 IL-12 之經修飾 TIL 之製備及表徵

圖6展示例示性TIL擴增過程，其包括包含編碼TeIL-12之核苷酸序列之慢病毒載體的轉導，該TeIL-12由EF-1α啟動子或NFAT啟動子控制，該啟動子包括與最小人類IL-2啟動子連接之NFAT反應元件。

在包括6000 IU/mL IL-2之細胞培養基中預REP 11天後，在10 ng/mL IL-7及20 ng/mL IL-15之存在下以1:100之比率用TransACT刺激TIL 2天。

在RetroNectin®塗佈盤中，在CM2 + IL-7及IL-15中使用慢病毒+以1:100 Lentiboost-P進行旋轉轉導。轉導後，接著將TIL靜置2天，隨後使用25K TIL、CM2中之5E6個飼養細胞+ 3000 IU/mL之IL-2 + 30 ng/mL之OKT3 (總體積4 mL)在GREX-24中進行REP過程。培育5天後，向每個孔中添加額外4 mL CM2 + 3000 IU/mL IL-2。培育持續總共11天，接著收穫TIL。

在REP收穫後，使用IL-12P70流動抗體藉由流式細胞分析技術檢驗TIL上IL-12之表面表現(圖7A)。TIL亦用TransACT或PMA刺激。刺激後48小時，藉由流式細胞分析技術檢驗IL-12之表面表現(圖7B)。

亦分析表現TeIL-12之TIL之IL-12活性(圖53)。5E4個HEK-IL18報導細胞經接種於96孔盤中之DMEM + 10% FBS培養基中。附著後，經轉導之TIL以5:1、1:1及0.5:1之比率分別以2.5E5、5E4及2.5E4個細胞/孔接種。設置Transwell。在培育隔夜後，收集20 µl培養物上清液且轉移至另一96孔盤。向每個孔中添加180 µL Quantiblue試劑且於37℃下培育，直至最高之IL-12標準品變成深紫色。

本研究使用五個腫瘤樣品(2個肺、1個頭頸、1個乳房及1個卵巢)生成TIL。圖9展示REP後TIL之擴增倍數(A)及存活率(B)。圖10展示藉由數位PCR偵測到之TeIL-12之表現頻率(A)及每個細胞之病毒複本數(B)。

藉由KILR® THP-1分析法評估表現TeIL-12之TIL之細胞毒性。REP後TIL (1E5)及KILR-THP-1細胞(1E4)在96孔盤中以10:1之比率共培養。培育24小時後，收穫上清液用於細胞毒性分析。使用KILR偵測試劑來偵測THP-1標靶細胞死亡(圖11A及圖11B)。藉由ELISA檢驗培養上清液中之IFN-γ產生(圖11C及圖11D)及IL-12脫落(圖56E)。TeIL-12及NFAT驅動之誘導型TeIL-12 TIL在基於THP-1之同種異體細胞毒性分析中均展示改良之殺傷活性。在共培養分析法中偵測到IFN-γ增加＞ 30倍。TeIL-12脫落發生在TeIL-12 TIL及KILR® THP-1細胞之共培養期間。

亦藉由xCelligence RTCA分析法評估表現TeIL-12之TIL之細胞毒性。將10,000個標靶細胞#1接種於RTCA E盤中。培育隔夜後，以10:1或3:1之比率添加REP後TIL。藉由xCELLigence RTCA儀器動態監測細胞生長(圖12A)。用標靶細胞#2進行相同分析法(圖12B)。TeIL-12及NFAT TeIL-12 TIL展示優異之同種異體細胞毒性。

為測試連續殺傷能力，用TransACT (1:100)重複刺激REP後TIL，且在最後TransACT刺激後2天收穫(圖13A)。進行KILR® THP-1細胞毒性分析、IFN-γ定量(圖13B)及xCELLigence RTCA殺傷分析(圖13C)以評估TIL殺傷功效。

藉由流式細胞分析技術分析REP後TIL之CD8+、CD4+及CD4+FoxP3+T細胞子集(圖14)。在CD8+、CD4+及CD4+FoxP3+ T細胞子集之分佈上未觀測到差異。

藉由流式細胞分析技術偵測Tcm (CCR7+ CCR45RA-)、Tem (CCR7-CD45RA-)、Tema (CCR7-CD45RA+)子集及CD62L在REP後TIL上之表現(圖15)。在Tcm、Tem及Tema分佈中未觀測到統計學顯著差異。TeIL-12/NFAT-TeIL-12 REP後TIL展示較少分化，CD62L表現增加。

藉由流式細胞分析技術偵測T細胞耗減標記物PD-1、LAG-3、Tim-3及TIGIT在REP後TIL上之表現(圖16)。未觀測到PD-1及LAG-3表現之顯著變化。觀測到Tim-3及TIGIT之表現減少，在TIGIT中更明顯。

藉由流式細胞分析技術偵測T細胞活化標記物CD25、CD38、CD39及CD69在REP後TIL上之表現(圖17)。在TeIL-12 REP後TIL (CD8+T細胞)中觀測到活化標記物CD25表現增加，而在NFAT-TeIL-12 REP後TIL中觀測到CD25表現降低。未觀測到CD38表現之變化，而CD69表現降低。

藉由流式細胞分析技術偵測T細胞功能相關標記物IFN-γ、TNF-α、CD107a及顆粒酶B在REP後TIL上之表現(圖18)。在TeIL-12 REP後TIL中觀測到IFN-γ及顆粒酶B產生增加，且在CD8+ T細胞群體中更顯著。實例 8 ： REP 期間抗 CD3 抗體時間選擇及劑量之優化以及對經拴繫之 IL-15/IL-21 之擴增及表面表現之影響

本研究藉由在REP起始後之不同天數添加抗CD3抗體來測試對TIL擴增及TeIL-15/TeIL21表面表現之影響。上述實例在抗CD3抗體添加時間選擇方面如本文中所描述進行修改；抗CD3抗體之添加時間如下文段落所示。

使用實例1中描述之Gen 2過程製備REP前TIL，接著使用以下方案在EF-1α啟動子之控制下用包含編碼TeIL-15或TeIL-15及TeIL-21之核苷酸序列的慢病毒載體進行基因轉導。 TIL 之病毒轉導

藉由將1 mL解凍之細胞懸浮液添加至9 mL預熱之不含建它黴素之CM2中解凍TIL，且在室溫(RT)下以500×g離心4分鐘。

棄去上清液且將TIL懸浮於1 mL不含建它黴素之CM2 + 300 IU/mL IL-2中並計數。

將TIL以1e6/mL懸浮於24孔盤中不含建它黴素之CM2 + 300 IU/mL IL-2中，每孔2 mL。培育隔夜。

製備20x IL-15、IL-7混合液，每孔添加100 uL。，每孔添加100 uL。 ○ 最終濃度：不含建它黴素之CM2中之IL-15 (10 ng/mL)、IL-7 (20 ng/mL) ○ 例如：需要10個孔 ■ 10孔×100 uL混合液= 1 mL ● 添加IL-15至濃度為200 ng/mL ● 添加IL-7至濃度為400 ng/mL ○ 注意：在添加TransACT、IL-15及IL-7之前，自各孔中取出120 uL，使最終體積為2 mL

將100 uL 20x細胞介素混合液添加至24孔盤內之各TIL培養物中。接著，將20 uL TransACT添加至各孔中。用移液管輕輕混合各孔以均勻分散TIL且與刺激混合液混合。培育2天。

藉由每孔添加250 uL，用Retronectin (在PBS中1:100稀釋)塗佈非組織培養48孔盤。用封口膜(parafilm)包裹盤且隨後在4℃下培育隔夜。

在室溫下培育30分鐘以進行阻斷。

在盤與病毒一起旋轉的同時，收集TIL且計數。TIL以1e6/mL懸浮於不含建它黴素之CM2中。

一旦盤完成旋轉，即添加以下各物： 5. 100 uL TIL懸浮液(1e5個細胞) 6. 200 uL不含建它黴素之CM2 7. 300 uL CM2 + IL-15 (20 ng/mL) + IL-7 (40 ng/mL)+ Lentibooster 1:50 8. =每孔總計600 uL

離心2000×g，20分鐘，32℃。置於培育箱中且培育3天。

在用囊封能夠表現TeIL-15之重組慢病毒RNA分子之慢病毒載體對REP前TIL進行轉導後，使用飼養細胞、3000 IU/ml IL-2及抗CD3抗體OKT3或HIT3a處理REP前TIL以進行REP擴增。在開始REP過程後之不同天數(第0天、第2天及第4天)，將OKT3 (30 ng/ml)或HIT3a (30 ng/ml)添加至REP培養基中。在REP擴增11天後，收穫REP後TIL。使用以下方案分析TIL擴增及TeIL-15/TeIL-21之表面表現。在第2天或第4天添加OKT3或HIT3a導致TeIL-15之表面表現增加(圖19A及圖19B)。 經拴繫之細胞介素之表面表現檢查 ( 用 1E5 稀釋 2 倍 )Maker 20樣品 25ul/樣品X10 487.5ul DPBS 活/死 1:200 2.5ul FC塊 1:50 10ul 8分鐘，在室溫下 50染色緩衝液 50ul染色緩衝液20個樣品 860ul CD3 BUV737 UCHT1 1.5ul 30ul CD45 PerCP HI30 1ul 20ul IL-21 PE 4BG1 2.5ul 50ul IL15 生物素 BH1543 2ul 40ul AB在4C下培育45分鐘，洗滌兩次 50ul染色緩衝液20個樣品 992ul 抗生物素蛋白-BV421 1:200 0.25ul 5ul AB在4C下培育20分鐘，洗滌兩次添加200ul染色緩衝液，用於流式細胞分析技術操作

在用囊封能夠表現TeIL-15及TeIL-21之重組慢病毒RNA分子之慢病毒載體對REP前TIL進行轉導後，使用飼養細胞、3000 IU/ml IL-2及抗CD3抗體OKT3或HIT3a處理REP前TIL以進行REP擴增。在開始REP過程後之不同天數(第0天、第2天及第4天)，將OKT3 (30 ng/ml)或HIT3a (30 ng/ml)添加至REP培養基中。在REP擴增11天後，收穫REP後TIL。使用上述方案分析TIL擴增及TeIL-15/TeIL-21之表面表現。在第2天或第4天添加OKT3或HIT3a導致TeIL-15及TeIL-21之表面表現增加(圖20A及圖20B)。

在用囊封能夠表現TeIL-15之重組慢病毒RNA分子之慢病毒載體對REP前TIL進行轉導後，使用飼養細胞、3000 IU/ml IL-2及抗CD3抗體OKT3處理REP前TIL以進行REP擴增。OKT3在第0天以不同濃度(30 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、3 ng/mL及1 ng/mL)添加至REP培養基中。在REP擴增11天後，收穫REP後TIL。使用上述方案分析TIL擴增及TeIL-15/TeIL-21之表面表現。添加30 ng/mL之OKT3導致TeIL-15之最高表面表現(圖21A及圖21B)。

在用囊封能夠表現TeIL-15及TeIL-21之重組慢病毒RNA分子之慢病毒載體對REP前TIL進行轉導後，使用飼養細胞、3000 IU/ml IL-2及抗CD3抗體OKT3處理REP前TIL以進行REP擴增。OKT3在第0天以不同濃度(30 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、3 ng/mL及1 ng/mL)添加至REP培養基中。在REP擴增11天後，收穫REP後TIL。使用上述方案分析TIL擴增及TeIL-15/TeIL-21之表面表現。添加所有濃度之OKT3導致TeIL-15及TeIL-21之低表面表現(圖22A及圖22B)。實例 9 ： T e IL-12 表現之轉導條件之最佳化

將REP前TIL用或不用TransACT活化，接著用囊封能夠組成型表現TeIL-12之重組慢病毒RNA分子之慢病毒載體轉導，且接著進行REP過程。以流式分析檢查TeIL-12之表面表現(圖23)。

將活化之REP前TIL在retronection或vectofusin塗佈之培養盤中用囊封能夠組成型表現TeIL-12之重組慢病毒RNA分子的慢病毒載體轉導，離心或不離心。REP擴增後以流式分析檢查TeIL-12之表面表現。用Retronectin塗佈之培養盤進行轉導的轉導效率比用Vectofusin塗佈之培養盤進行轉導更好(圖24)。不進行離心之轉導會降低轉導效率(圖24)。

在用囊封編碼NFAT-TeIL-12之重組慢病毒RNA分子之慢病毒載體對活化之REP前TIL進行旋轉轉導期間添加Lentiboost。藉由TransACT或PMA-肌黴素刺激後之表面TeIL-12表現檢查來評估轉導效率。使用或不使用Lentiboost之轉導顯示出相似之TeIL-12表面表現(圖25)。

在用囊封編碼NFAT-TeIL-12之重組慢病毒RNA分子之慢病毒載體對活化之REP前TIL進行旋轉轉導期間添加Lentiboost。藉由TransACT或PMA-肌黴素刺激後之表面TeIL-12表現檢查來評估轉導效率。與使用RD114或VSV-G Env質體之轉導相比，使用BaEVTR Env質體之轉導引起更多之TeIL-12表面表現(圖26)。實例 10 ： NFAT-TeIL-12 工程改造之 TIL 顯示優異細胞毒性

將來自若干種實體腫瘤類型之腫瘤組織片段化且培養，然後經由NFAT啟動子用含有編碼膜結合IL-12 (TeIL-12)之基因的慢病毒轉導，接著用快速擴增方案(REP)進行擴增。在活體外評估IL-12分子之表現、生物功能及脫落。在各種分析中檢查TeIL-12基因工程改造之TIL的免疫表型及活體外細胞毒活性。

慢病毒基因轉移引起TIL經由膜錨在其表面表現IL-12。在使用HEK-IL-12-Blue報導細胞之分析中，此修飾以接觸依賴性方式增強IL-12受體下游信號傳導之活化。TeIL-12-TIL在KILR®分析中展現增加之IFN-γ產生及優異之細胞毒性。基於xCELLigence之細胞毒性分析進一步證實未刺激或刺激之TIL之殺傷作用增加。此外，表型分析揭露TeIL-12-TIL分化程度較低，免疫抑制受體之表現減少，且與抗腫瘤活性相關之細胞毒性分子之產生增加。共培養上清液中IL-12之脫落極少。

將KILR® THP-1細胞(1E4)與5種個別REP-TIL (1E5)共培養，該等TIL經NFAT-TeIL-12、模擬物、pLV-ctrl及模擬對照細胞工程改造。24小時後，收穫上清液。接著使用KILR® THP-1細胞毒性分析法評估細胞毒性(圖27A)，且藉由ELISA定量IFN-g (圖27B)。

將新鮮解凍之REP-TIL或3倍TransACT重複刺激之REP-TIL添加至預先接種標靶細胞(CaOV3)之E-盤中。藉由xCELLigence RTCA分析動態監測標靶細胞生長。表現NFAT-TeIL-12之TIL顯示優異細胞毒性(圖27C)及連續殺傷功效(圖27D)。

增強之活體外殺傷活性，加上具有誘導性及膜結合IL-12之TIL分化程度較低的表型，顯示可提高臨床療效。此外，最少之IL-12脫落支持降低IL-12相關毒性之可能性(Zhang等人, Clin Cancer Res. 2015;21:2278-88)。實例 11 ：經 nfat-teil-12 及 il-15/il-2 、 pd-1 shrna 工程改造之 TIL

為提高NFAT-TeIL-12 TIL之活體內擴增能力，且可能避免在TIL療法後患者中使用阿地介白素，NFAT-TeIL-12 TIL經進一步工程改造以在EF-1α啟動子之控制下共表現IL-15或IL-2 (有或無膜錨) (圖28)。亦測試PD-1 shRNA之共表現，以改善腫瘤微環境(TME)中之TIL功能。tCD19在相同EF-1α啟動子下共表現，可用作IL-15、IL-2或PD-1 shRNA之表現指示劑。

經過慢病毒載體(LV)轉導及11天之REP擴增後，收穫經基因編輯之TIL。進行活細胞計數，且基於初始轉導之REP前TIL計算倍數擴增(圖29A)；在Celica中檢查存活率(圖29B)。

在未刺激條件下藉由流式分析檢查之TeIL-12+/tCD19+及TeIL-12-/tCD19+ TIL之百分比來評估轉導效率(圖30A)。藉由ddPCR偵測每個細胞之病毒複本數(VCN) (圖30B)。

使用TCR信號活化劑TransACT (1:1000、1:100、1:10)及PMA/肌黴素活化下游NFAT信號傳導路徑，從而依序上調經基因編輯之TIL中NFAT驅動之TeIL-12表現。同時，tCD19作為EF-1a啟動子下TeIL-2、TeIL-15、IL-2、IL-15及PD-1 shRNA表現之指示劑。藉由流式細胞分析技術分析TeIL-12及tCD19 (在經基因編輯之TIL中以誘導性TeIL-12陽性細胞著稱)表面表現之共染色。TeIL-12及tCD19雙陽性T (TeIL12+CD19+)之百分比視TCR刺激之程度而定(圖31)。

進行xCELLgeneRTCA殺傷分析，以評估經基因編輯之TIL以0.3:1之效應與標靶(E/T)比率靶向CaOV3細胞之殺傷功效。經NFAT-TeIL-12及EF-1α-TeIL-15工程改造之TIL展現優異細胞毒性(圖32)。

將經基因編輯之TIL與CellTrace標記之模擬TIL (1:1)在96孔U形底之無血清AIM-V中共培養隔夜。洗滌、固定及透化後，藉由流式細胞分析技術分析閘控細胞中磷酸化STAT5之細胞內染色。同時，經IL-2或IL-15處理之模擬細胞用作磷酸化STAT5染色之陽性對照。TeIL-2及TeIL-15主要以順式方式作用(圖33)。

經基因編輯之TIL細胞以CellTrace Blue標記，且在不含IL-2之培養基中培養。96小時後，基於細胞跡線分析tCD19+ (細胞介素轉導)及tCD19- (細胞介素未轉導)亞群之細胞分裂。TeIL-2及TeIL-15顯示偏斜之順式增殖，與p-STAT5活化一致(圖34)。

Gen2 TIL經標記，且接著刺激表現可溶性IL-15或TeIL-15之TIL。藉由閘控Gen2 TIL及TeIL-15 TIL上之流動檢查p-stat5活化。資料顯示TeIL-15僅以順式方式活化T細胞(圖54)。

將經基因編輯之TIL洗滌且重懸於不含IL-2之CM2中。將5E5個細胞/孔添加至GREX24孔盤中。處理分為以下三組：1) TransACT加IL-2；2)單獨TransACT；3)無刺激。在Celica中檢查細胞計數及細胞存活率。EF-1a驅動之IL-2/IL-15在缺乏IL-2下改善T細胞增殖(圖35A及35B)。

在滴定之TransACT刺激條件下表現PD-1 shRNA之NFAT-TeIL-12 TIL上的PD-1表現頻率與作為對照組之表現GFP shRNA之NFAT-TeIL-12 TIL形成對比。在滴定之TransACT刺激條件下表現PD-1 shRNA之NFAT-TeIL-12 TIL上的PD-1表現gMFI與作為對照組之表現GFP shRNA之NFAT-TeIL-12 TIL形成對比。PD-1 shRNA有效降低表現PD-1 shRNA之NFAT-TeIL-12 TIL中之PD-1陽性(圖36A及36B)。

在不同環境下動態檢查T細胞存活率及TVC：TransACT刺激(1:100)加3000 IU/mlIL-2 (圖37A)；僅3000 IU/ml IL-2 (圖37B)；僅TransACT刺激(1:100) (圖37C)；及無TransACT刺激，無IL-2(圖37D)。資料顯示，在無IL-2下，TeIL-15可促進TIL活體外存活。實例 12 ：在 M1152 PDX 模型下，與 Gen2 加工之 TIL 相比， NFAT-TeIL-12 基因工程改造之 TIL 顯示出改善之活體內功效

M1152 PDX ACT模型用於測試NFAT-teIL-12 TIL之活體內功效(參見圖38A)。將1E6 M1152腫瘤細胞皮下接種至NOG-hIL2小鼠。26天後，使用不同製程之7.5E6 R-REP之TIL經由靜脈內途徑輸註至M1152小鼠體內。各種製程如下： i. Gen2 ii. pLV-ctrl轉導後進行Gen2 iii. NFAT-TeIL-12-tCD19轉導後進行Gen2 iv. NFAT-TeIL-12轉導後進行Invigo-T+L-Arg製程

每週檢查腫瘤大小及小鼠體重兩次，直至小鼠達到終點。在TIL輸注後第7天，收集PB用於血漿細胞介素檢查(參見圖38A)。

與未處理組相比，Gen2製程及Gen2-pLV-ctrl製程製造之TIL均顯示出腫瘤抑制功效；但腫瘤仍進行性生長(參見圖38B)。然而，藉由Gen2製程或Invigo-T+L-精胺酸製程製造的經NFAT-TeIL-12基因工程改造之TIL使得腫瘤生長得到控制(參見圖38B)。NFAT-TeIL-12-tCD19組中3/7之小鼠顯示完全消退，且經Invigo-T修飾之-NFAT-TeIL-12組中1/7之小鼠顯示完全消退(參見圖38B)。

檢查體重之動態變化(圖39A)及與基線相關之體重% (圖39B)。TIL輸注後，未處理組、Gen2 TIL及TeIL-12 TIL處理組未觀測到顯著體重變化。

TIL輸注後第7天收集週邊血液。藉由Bioplex分析檢查血漿IFNγ、TNFα、CCL4及IL-12 p70。在NFAT-TeIL-12 TIL輸注小鼠中未檢測到循環IL-12 p70及TNFα。與Gen2對照TIL (20.3 pg/ml)相比，在NFAT-TeIL-12 TIL處理組(47.9 pg/l)中觀測到血漿IFNγ增加。NFAT-TeIL-12 TIL處理組(13.92 pg/ml)及Gen2 TIL處理組(13.27 pg/ml)之間未觀測到CCL4之顯著差異。參見圖40。實例 13 ：在預 REP 階段後用 IFN γ 引發腫瘤消化物顯著增加反應性

將腫瘤消化成單細胞懸浮液且以600k細胞塗鋪於96孔平底盤中。接著將細胞在以下條件下培養11天：IL2 (6000 IU/mL)對照、ITIL細胞介素(IL-2 (6000 IU/mL)、IL-15 (10 ng/mL)及IL-21 (10 ng/mL))或ITIL細胞介素 + IFNγ (200 ng/ml)或ITIL + 抗PD1 (派姆單抗) 10 ug/mL或完全培養基中之ITIL細胞介素 + 抗PD1 + IFNγ。每2-3天更換一次培養基。11天後，將細胞計數且與自體腫瘤消化物(100k TIL：100k腫瘤消化物細胞)共培養24小時。為確定腫瘤消化物反應性T細胞之百分比，對細胞進行活化標記物4-1BB (Biolegend，純系：4B4-1，BV421)染色，且在Bio-Rad ZE5流式細胞儀上運行流式細胞分析技術以定量4-1BB+反應性T細胞之百分比。如圖41中所示，當TIL與ITIL細胞介素一起在IFNγ存在下培養時，增強腫瘤反應性。實例 14 ：使用 T 細胞活化標記物 4-1bb 分選腫瘤反應性 CD8 TIL

已知4-1BB會因TCR觸發而上調，特別是在CD8 T細胞上，但在CD4 T細胞之子集上亦如此。然而，4-1BB僅短暫表現，因此進行實驗以確定基於4-1BB表現分選TIL之最佳時間點。在本實驗中，將來自五個NSCLC腫瘤及五個腎細胞癌腫瘤之腫瘤消化物於補充有IL2 (3000 IU/mL)及IFNγ (200 ng/mL)之細胞培養基(AIM V)中以6e5細胞塗鋪在96孔平底盤中。如圖42A所示，發現4-1BB表現在將腫瘤消化物塗鋪後24小時達到最大，在塗鋪後48小時回至基線(t＝0)水準。因此，24小時被鑑定為分選腫瘤反應性TIL之較佳時間點。

為證明添加IFNγ以使腫瘤消化物反應性TIL上4-1BB表現最大化之重要性，將來自八個NSCLC腫瘤之腫瘤消化物細胞(96孔盤中之600k)於對照培養基(3000 IU/mL之IL-2)或TS-TIL培養基(IL-2 3000 ng/mL、IL-21 10 ng/mL + IFNγ 200 ng/mL)中塗鋪。24小時後，再次使用流式細胞分析技術量測CD8+ TIL上之4-1BB表現。如圖42B所示，發現相對於對照條件(僅IL-2)，4-1BB表現隨TS-TIL條件增加。該實驗突顯在培養基中添加IFNγ之重要性，以經由增加4-1BB表現來增強腫瘤消化物反應性TIL之恢復。在一項獨立實驗中，將五名患者之REP後TIL於補充IL-2 (有或無IFNγ)之培養基中以2e6細胞塗鋪於24孔盤中，持續24小時。值得注意地，IFNγ不會引起4-1BB+ CD8 T細胞百分比之非特異性增加，此意味上調可能為對TCR觸發增加之反應，此係腫瘤消化物中IFNγ介導之抗原呈遞增強之結果(現顯示資料)。實例 15 ：若干種方法富集腫瘤反應性 CD8 TIL 之能力的比較

分析若干種方法富集腫瘤反應性CD8 TIL之能力，如圖43所概述。在所有情況下，腫瘤消化物均如前所述產生，且腫瘤消化物最初以550k細胞塗鋪在96孔盤中，且在含有指定細胞介素之CM2培養基中擴增。 IL2 對照：預REP=6000 IU/mL之IL-2及REP = 3000 IU/mL之IL-2 CD103+ 富集：預REP=6000 IU/mL之IL-2及REP = 3000 IU/mL之IL2或IL-2 (1000 IU/mL)+ IL-15 (10 ng/mL)+IL-21 (10 ng/mL) 4-1BB+ 富集：預REP= IL-2 (1000 IU/mL)+ IL-15 (10 ng/mL)+IL-21 (10 ng/mL)及REP= IL-2 (1000 IU/mL)+ IL-15 (10 ng/mL)+IL-21 (10 ng/mL) (此等稱為「TS-TIL」細胞介素)。

根據需要每2-3天更換一次培養基且分裂細胞，以便在預REP擴增階段之初始腫瘤消化物塗鋪後3天保持少於400k且超過50k之活細胞群體。藉由將25k細胞自預REP群體轉移至REP中，在來自Biolegend之5e5經照射之供體PBMC及30 ng/mL OKT3存在下，所有預REP群體在24孔GREX盤中快速擴增(REP)。

如圖43之製程流程圖左側所示，採用主體TIL對照臂。對於對照臂，來自消化物之TIL在預REP期間擴增10天，且接著在REP期間快速擴增10天。

對於CD103富集，使用相同第10天預REP細胞群體作為對照群體。然而，在第10天，此等細胞經流式分選為四個不同群體：CD103+CD31+、CD103+CD31-、CD103-CD31+及CD103-CD31-。接著對此等群體進行單獨REP。

對於TS-TIL過程，在前24小時內將細胞於TS-TIL細胞介素加IFNγ (200 ng/mL)中塗鋪。接著在24小時使用4-1BB+磁珠(Miltenyia試劑盒)對其進行分選。接著，在24孔GREX中之預REP期間，在24孔GREX中，在TS-TIL細胞介素存在下，在無額外IFNγ (1XREP)之情況下，將分選之細胞在6e6 T細胞耗減飼養層(iPBMC)中再擴增9天，或可替代地，分選之細胞立即進行REP。第10天，然後將兩個群體在TS-TIL細胞介素中進行REP，從而產生兩個不同群體：1X REP及2X REP 4-1BB分選細胞。參見圖43右側。

在製程第20天，REP完成後，對所有群體進行計數、表面標記物表現之表型分析，且使用細胞內細胞介素染色分析自體腫瘤反應性，如下：

自體腫瘤反應性：在莫能菌素(Biolegend)、布雷菲德菌素A (Biolegend)及抗CD107a BUV395抗體(BD Biosciences)存在下，將200k TIL在200k消化物細胞存在下塗鋪七小時。7小時後，將細胞進行CD8、CD4、CD3及CD45表面染色，接著固定、透化且進行IFNγ (PE)及TNFα (BV650)染色，然後在Bio-Rad ZE5細胞儀上對細胞進行分析。為進行適當之控制，在以下條件下評估各TIL群體： 1) TIL+腫瘤消化物 2) TIL+腫瘤消化物+抗MHC I類抗體(W6/32) 100 ug/mL，用於解釋非TCR介導之(背景) CD107a、IFNγ及/或TNFα表現 3) 單獨TIL (陰性對照) 4) TIL+TransActCD3/CD28刺激物(陽性對照)

接著對流動資料進行閘控、加工且在FlowJo中分析，且接著在GraphPad Prism中進行繪圖。即使在由CD137 (4-1BB)分選製程產生之高百分比腫瘤反應性TIL驅動的較少細胞下，亦可觀測到產品效力提高約10倍。注意到CD103-CD31-組之腫瘤反應性極小，該組代表旁觀者。參見圖44。實例 16 ：來自細胞內細胞介素腫瘤消化物之雙變數流式圖資料 (IFN γ 及 CD107a)

如前所述，自細胞內細胞介素腫瘤消化物中分析雙變數流式圖資料(IFNγ及CD107a)。該等圖以活CD8+CD3+ T細胞「CD8 TIL」進行閘控。結果為GEN2 (左)及4-1BB Sort/1x REP「TS-TIL」(右)。參見圖45。上圖為TIL與自體腫瘤消化物共培養之情形。下圖為相同實驗設置，除了添加MHC I類阻斷抗體(W6/32)，以解釋效應細胞介素IFNγ或脫顆粒標記物CD107a之任何非TCR介導之(背景)表現。由於MHC I類阻斷抗體之存在，在下圖中觀測到最小反應性，如此會阻斷腫瘤抗原對CD8 TCR之刺激預期的那樣。在對照(GEN2/主體TIL)製程下產生之CD8 TIL中幾乎未發現腫瘤特異性反應性，僅0.58%之CD8 TIL共表現CD107a+ IFNγ+。值得注意地，TS-TIL (4-1BB分選/1x REP)製程中之反應性強得多，其中發現11.7%之細胞共表現CD107a及IFNγ，提高近20倍。在TS-TIL製程中，單一陽性群體(IFNγ+或CD107a+)亦有所增加。參見圖45。此表明富集由TS-TIL (4-1BB分選/1x REP)製程製造的腫瘤反應性TIL。實例 17 ：分析額外 3 名 NSCLC 患者之腫瘤

對額外3名NSCLC患者L4373、L4375及L4397之腫瘤進行分析。對多種REP條件(3000 IU/mL之IL2，CTRL)及稱為「Invigo-T」之測試條件(IL-15 (10 ng/mL) + IL-21 (10 ng/mL) + AKTi (AZD4673) 1 µM)進行測試，看看此將如何影響最終(REP後) TIL產物之擴增及腫瘤反應性。使用先前描述之4-1BB分選/1x REP條件。

在三名NSCLC患者中測試GEN2 TIL對照條件對比TS-TIL4-1BB分選/1x REP「TS-TIL」條件對比CD103預REP後分選。對於4-1BB分選，測試上述REP條件對CD8腫瘤特異性反應性之影響。與先前一樣，藉由自體消化物共培養ICS評估CD8腫瘤消化物反應性。結果顯示在圖46中，隨分選條件及REP條件而變。兩種CD137 (4-1BB)分選條件均提供TIL產物中之腫瘤反應性CD8 (IFNγ+CD107a+) TIL的最佳富集。CD103分選亦比GEN2主體TIL對照有所改進。

為測試此等製程變化對腫瘤反應性TIL富集之影響，分析L4397之雙變數流式圖。參見圖47。在GEN2主體TIL條件下，僅0.24%之CD8 TIL為IFNγ+CD107+，而在4-1BB分選/IL2 3000 IU/mL REP條件下，15.3%之CD8 TIL為IFNγ+CD107a+。

作為另一實例，來自患者L4463之原發性NSCLC腫瘤經消化，且使用TS-TIL製程「TS-TIL」(4-1BB選擇)或對照製程「CTRL」(主體、未選擇之TIL，僅用IL-2擴增)，自僅550k活消化物細胞產生TIL產物。如圖48所示，產生最終TIL產物之總加工時間為20天。為比較各第20天產物之腫瘤特異性反應性，將200k TIL與200k自體腫瘤消化物細胞在96孔平盤中在250 uL補充有300 IU/mL IL-2、布雷菲菌素A及莫能菌素之AIM V培養基中共培養7小時。隨後使用細胞內細胞介素染色方法對細胞進行CD3、CD45、CD8、CD4、CD107a (脫顆粒標記物)及IFNγ (效應細胞介素)染色，且使用Bio-Rad之ZE5流式細胞儀量測表現。藉由將腫瘤反應性TIL定義為表現MHC I類依賴之CD107a與IFNγ共表現的TIL，在CD8群體中量測腫瘤特異性反應性。具體而言，為使用適當對照進行完整分析，在以下五個條件下量測活IFNγ+CD107a+CD8+ TIL： A) 200k TIL+ 200k自體消化物 B) 200k TIL+ 200k自體消化物+抗MHC I類阻斷抗體(純系W6/32，Biologend) 100 ug/mL (背景扣除) C) 單獨200k TIL (陰性對照) D) 200k TIL+ CD3/CD8促效劑TransAct (Miltenyi Biosciences，130-111-160) 1:20稀釋度(陽性對照) E) 200k TIL+CEF肽混合物(1:100) (Miltenyi Biosciences，130-098-426) (用於評估TIL中之病毒反應性)。

條件B用於量測CD107a及IFNγ之非特異性(即非肽:MHC I類介導)表現。此等結果展示於圖49中。

特定腫瘤反應性計算為條件A中消化物反應性TIL之百分比減去條件B中消化物反應性TIL之百分比。因為TransAct為有效T細胞刺激化合物，已知可觸發T細胞受體(TCR)及共刺激受體(CD28)且誘導IFNγ及CD107a之分泌，所以單獨TIL用作陰性對照(不存在TCR刺激)且TIL + TransAct用作陽性對照。此外，TIL與CEF肽混合物一起培養，該混合物含有來自病毒抗原(CMV、EBV、流感)之多個已知MHC I類抗原決定基，已知該等抗原決定基可跨多種HLA類型被T細胞識別。

資料顯示TS-TIL產物(約7%)對比CTRL產物(約1%)中特定腫瘤反應性TIL百分比顯著增加。參見圖49。如預期，因為無TCR刺激，所以兩種產物在單獨靜置時顯示最低反應性，且當暴露於強效TCR刺激TransAct時，反應性高。值得注意地，CTRL TIL產物顯示出較高百分比的對MHC I類肽混合物有反應之TIL，此與未選擇之CTRL TIL含有較高百分比之「旁觀者」病毒特異性TIL之假設一致，預期此由於無法特異性識別腫瘤細胞，不會介導腫瘤消退。

對額外五名NSCLC患者重複相同製程，且結果展示於圖50中。為計算各製程中550k消化物細胞產生之CD8腫瘤反應性TIL總數，使用以下公式：

總CD8腫瘤反應性產量=(預REP階段(第1-10天)期間產生之細胞總數)×腫瘤特異性反應性(AB)×REP期間之擴增倍數。

由TS-TIL製程產生之CD8腫瘤反應性TIL總數平均比由CTRL製程產生之CD8腫瘤反應性TIL總數大7倍。參見圖50。實例 18 ：選擇允許腫瘤特異性 CD8 TIL 在 REP 階段期間最大擴增之條件

為選擇允許腫瘤特異性CD8 TIL在REP階段期間最大擴增之條件，測試多種REP條件。活細胞總數及擴增倍數之結果隨REP條件而變來顯示。參見圖51。GEN2 (主體TIL)對照細胞之擴增更加強勁。然而，在4-1BB及CD103分選群體中，使用3000 IU/mL IL-2之REP條件可實現腫瘤特異性TIL之最佳擴增。相較之下，使用Invigo-T (IL-15 + 1L-21均為10 ng/mL，L-精胺酸5 mM)之REP條件導致擴增較差。實例 19 ：用 HD IL-2 REP 分選 CD137

圖52展示隨分選及REP條件而變之CD8+腫瘤反應性TIL總產量(藉由自體消化物共培養ICS評估)。先後進行CD137 (4-1BB)分選及使用高劑量(HD) IL-2 (3000 ng/mL)進行REP被鑑定為擴展腫瘤特異性TIL之最佳製程。在三名患者(L4373、L4397及L4375)中，觀測到TS-TIL產量分別提高6.3、23.7及4.7倍。

使用標記物CD45RA及CD62L對活CD8+ TIL進行表面表型分析，該等標記物將CD8+ T細胞大致分為四類：CD45RA+CD62L+ (Tscm=幹細胞記憶)、CD45RA-CD62+ (Tcm-中央記憶)、CD45RA-CD62L- (Tem=效應記憶)及CD45RA+CD62L- (Temra=末端效應)細胞。如前所述，在ICS染色期間對細胞進行表型分析。參見圖53。根據結果，發現大多數(90-95%)細胞為Tem「效應記憶」細胞，不同製程製造之TIL之間的差異很小。相較之下，在REP結束時發現僅約1%之CD8+ TIL為Tscm細胞。實例 20 ：利用代謝再程式化對 TIL 進行擴增及表徵

在本研究中，研究REP TIL之不同策略，以增強其擴增及表型。文獻表明，一些AA之存在可調節T細胞代謝且增強抗腫瘤活性(Geiger等人, Cell 2016, 167(3):829-842；Chang等人, Cell 2015, 162(6):1229-41；其內容以引用之方式整體併入本文中)。總體而言，此想法引起對TIL中之代謝進行再程式化以達成兩個主要目的：i)抗腫瘤之表型及功能特性；及ii)腫瘤微環境(TME)條件下之存活與功能。事實上，已顯示CAR-T細胞中之精胺酸代謝工程改造以實現細胞增殖及治療活性(Fultang等人, Blood 2020, 136(10):1155-1160；其內容以引用之方式整體併入本文中)。 材料及方法T細胞計數及存活率

在TIL擴增之後收穫REP細胞。使用Cellometer細胞計數器(Nexcelom, Lawrence, MA)藉由AOPI分析法評估活細胞數目。預REP及REP過程

將人類腫瘤樣品分割成約3 mm片狀物且與推薦的含有IL-2 (6000 IU/mL)之培養基一起在Grex10中培養。在培養11天之後，接著在REP擴增過程中使用經照射之PBMC、抗CD3抗體及Invigo-T混合液10 ng/ml IL-15及10 ng/ml IL-21)對預REP細胞進行增殖，再歷時11天。

REP過程中要併入之化合物： L-精胺酸：已最佳化至5 mM。由於L-精胺酸為鹼性胺基酸，因此需要用25 mM HEPES進行平衡。 NAD+：已繪製劑量反應曲線。 GSK-3α/b小分子抑制劑(SMI)。流式細胞分析技術

為檢查T細胞之活化及分化，使用BD Bioscience、Biolegend、Thermofisher之抗體進行表型表徵。用BioRad ZE5流式細胞儀獲取資料且使用FlowJo軟體(FlowJo, LLC, Ashland, OR)進行分析。結果L-精胺酸可增強Invigo-T REP期間解凍後之擴增及細胞恢復

首先，REP過程補充不同胺基酸，且L-精胺酸顯示出擴增及存活率之增加(圖55A-B)。此外，為在遞送至患者之前模仿產品標準，REP之TIL經冷凍及解凍，以分析恢復及殺死能力。L-精胺酸保護TIL免於損毀(圖55C-D)。

L-精胺酸提供更好之表型及殺傷能力。

在REP期間補充L-精胺酸顯示藉由流式細胞分析技術分析之一些有利表型變化，諸如CD127、CD62L、CD25、CD28、ICOS及CD40L之增加(圖56A)。此外，觀測到CD4+CD107+ TIL增加(圖56B)。因此，藉由將TIL與KILR THP1細胞共培養且在REP中進行多次TxA刺激，在同種異體環境中測試TIL之細胞毒性。用L-精胺酸擴增之REP TIL顯示更好之殺傷能力(圖56C)。

NAD+與L-精胺酸協同作用，促進新陳代謝且提供獨特之TIL特徵。

TME條件對TIL而言具有挑戰性，因為營養物質有限且條件不利。L-精胺酸可能充當能量來源且幫助細胞增強其功能。此外，為促進新陳代謝，在REP期間研究NAD+增強劑之作用。篩選六種不同NAD+增強劑(L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑)，而NAD+在TIL產品中顯示有趣之表型(資料未顯示)。進行NAD+之劑量反應，且發現50-75 μM係實施REP過程之最佳濃度(圖57A-B)，因為其對擴增影響較小，但維持有利之表型。此外，NAD+補充劑增強解凍樣品中細胞之恢復，且在用TransAct活化細胞24小時後更加明顯(圖57C)。實例 21 ：使用各種改良之 rep 條件產生之 til 產品的慢病毒轉導效率及表型

在本研究中，將腫瘤片段化且在含有IL-2 (6000 IU/mL)之CM2中培養11天。11天結束時，收集細胞(REP前TIL)且冷凍保存或新鮮加工以供進一步製造。對於冷凍保存之REP前TIL，在進一步製造之前，將細胞解凍且在含有IL-2 (300 IU/mL)之CM2中靜置3天。參見圖58。

對於慢病毒轉導，用BaEVTR包膜病毒轉導100,000個REP前TIL，該病毒含有由NFAT啟動子驅動之編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核酸序列，隨後為編碼截短CD19 (tCD19)或栓繫IL-15 (TeIL-15)之序列。pCMV-3Tag-4a-BaEV-TR (SEQ ID NO:166)之載體圖參見圖76；pLenti- IRES-NFAT-TeIL12-EF1a-TeIL-15 (SEQ ID NO:167)之載體圖參見圖77。對於旋轉轉導，將TIL及病毒於含有IL-2 (3000 IU/mL)之培養基中添加至retronectin塗佈盤中，且接著在2000×g、32℃下離心45分鐘。旋轉轉導後，在開始REP之前將TIL培育72小時。參見圖58。同時，設定REP前TIL在相同條件下培養，但不進行旋轉轉導。此等細胞稱為未轉導之GEN2對照。

慢病毒轉導後，將TIL於含有OKT3 (30 ng/mL)、來自3個個別健康供體之經照射之同種異體飼養細胞及以下成分之培養基中置於REP中： 1. GEN2：IL-2 (3000 IU/mL) 2. GEN2+NAD：IL-2 (3000 IU/mL) + NAD (50 µM) 3. ITARG：IL-15 (10 ng/mL) + IL-21 (10 ng/mL) + L-arg (5 mM) + HEPES (25 mM) 4. ITARG+NAD：IL-15 (10 ng/mL) + IL-21 (10 ng/mL) + L-arg (5 mM) + HEPES (25 mM) + NAD (50 µM) 5. TSREP：IL-2 (3000 IU/mL) + IL-21 (10 ng/mL) + L-arg (5 mM) + HEPES (25 mM) + NAD (50 µM)

開始REP培養五天後，進行50%培養基更換。REP培養開始後11天收穫REP TIL。參見圖58。接著對REP產品中之TIL的總活細胞(TVC)、細胞存活率進行計數，且藉由流式細胞分析技術進行表型分析。

圖59展示NFAT-TeIL12-EF1α-tCD19 (平均值=30.3%)及NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 (平均值= 23.2%)在CD3+ T細胞中之轉導效率。圖60A展示CD4+及CD8+ T細胞子集中之轉導效率，證明在CD4+與CD8+細胞之間，經NFAT-TeIL12-EF1α-tCD19轉導之TIL中tCD19之表現相似。相比之下，圖60B展示與CD4+ T細胞相比，CD8+ T細胞中經NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15轉導之TIL中TeIL15之表現較高。

圖61展示慢病毒載體轉導之TIL展現REP TIL產物中CD4+或CD8+細胞百分比低/偏斜最小。圖62展示在CD3+ T細胞中REP細胞培養基條件展現相似之轉導效率。圖63展示在CD4+及CD8+ T細胞子集中REP細胞培養基條件展現相似之轉導效率。

圖64展示各種REP細胞培養基條件下擴增速率與存活率增強。圖65展示各種REP細胞培養基條件增加未轉導之TIL中之TIL (TVC)數量。圖66展示各種REP細胞培養基條件增加未轉導之TIL之存活率。

量測CD3+T細胞及CD4+/CD8+ T細胞子集上TeIL-15之表現。結果顯示GEN2+NAD及ITARG+NAD REP條件改善REP TIL中之TeIL-15表現(圖67)。

REP產物中之TIL亦與自體腫瘤消化物細胞懸浮液一起培養。將未轉導之TIL及NFAT-TeIL-12-EF1α TeIL-15 TIL解凍，且與自體腫瘤消化物以1:1之效應物:標靶比一起培養，且在含有IL-2 (300 IU/mL)之CM2培養基中培育18-24小時。在腫瘤消化物+/-抗HLA-I (50 µg/mL)及抗HLA-II (10 µg/mL)存在下培養TIL，以量測HLA依賴性T細胞活化。TIL亦單獨培養或用抗CD3/抗CD28 GMP TransAct (1:100濃度)刺激。收集上清液且用Bio-Plex多路免疫分析系統(Bio-Rad)分析IFN-γ、TNFα、IL-12p70、IL-15之濃度。

結果表明，IFNγ及TNFα之產生受到自體腫瘤消化物之刺激(圖68)且為HLA依賴性的(圖69)。此結果顯示IFNγ及TNFα之產生視TIL與HLA分子之相互作用而定。

結果進一步表明，NFAT-TeIL-12-EF1a-TeIL-15 TIL在自體刺激後比未轉導之TIL產生更多IFNγ，GEN2+NAD及ITARG+NAD增強此作用(圖70)，且NFAT-TeIL-12-EF1a-TeIL-15 TIL在自體刺激後產生更多TNFα，GEN2+NAD、ITARG及ITARG+NAD增強此作用(圖71)。實例 22 ：經 TeIL-12/TeIL-15 轉導之 TIL 展現針對自體黑色素瘤細胞株之優異細胞毒性

本研究中，黑色素瘤腫瘤細胞自患者來源之異種移植物中分離出來後在活體外生長。在與自體TIL一起培養之前，將黑色素瘤細胞維持在培養基254中。首先，將5000個黑色素瘤細胞接種在黑壁96孔細胞培養盤上，且在Incucyte S3中培育隔夜。以各種ET比(8:1、4:1、2:1、1:1及0.5:1)添加未轉導之NFAT-TeIL-12-EF1α-tCD19及NFAT-TeIL-12-EF1α-TeIL-15，且與螢光凋亡蛋白酶3/7染料一起培育24小時以定量腫瘤細胞死亡。

經TeIL-12/TeIL-15轉導之TIL展現針對自體黑色素瘤細胞株之優異細胞毒性(圖72)。實例 23 ：經 TeIL-12/TeIL-15 轉導之 TIL 展現增強之對 NY-ESO-1 A375 黑色素瘤細胞之殺傷

在本研究中，收穫NYESO1 REP TIL，且保存每種條件下之5e6個細胞，且在grex-24孔盤中之CM2 + 3000IU/mL IL-2中培育週末。用3 mL trypLE將A375標靶細胞自其燒瓶解離，用27 mL CM2培養基洗滌，以500 g離心4分鐘，且接著以2E5個細胞/毫升重懸於TME培養基中。

用於50 mL培養基之TME培養基製備：3.125 mL DMEM+10% FBS (高葡萄糖)；46.9 mL DMEM + 10% FBS (無葡萄糖)；30 IU/mL IL2及0.09 g乳酸。

將50 uL TME培養基添加至Xcelligence盤之各孔中，且進行背景量測以實現孔間正規化。接著將50 uL A375標靶細胞於TME培養基中以1E4個細胞/孔接種於Xcelligence盤上。接著將細胞在Xcelligence培育箱中培育隔夜。第二天，自grex-24孔盤收穫NYESO1 REP TIL，計數且以5E4個、1.25E4個細胞/毫升重懸，且接著將100 μL細胞添加至孔中，每種條件一式三份。根據下面之盤圖將細胞共培養48小時且分析殺傷功能。

與慢病毒骨架對照及模擬過程對照相比，經單一NFAT-teIL-12構築體或雙NFAT-teIL-12-EF1a-TeIL-15構築體轉導之NYESO1 TCR選擇之T細胞展示優異之殺傷功效(圖73)。實例 24 ：最佳化之培養基調配物增強解凍後 TIL 擴增及細胞恢復 材料及方法T細胞計數及存活率

在TIL擴增之後收穫REP細胞。使用Cellometer細胞計數器(Nexcelom, Lawrence, MA)藉由AOPI分析法評估活細胞數目。REP TIL使用CS10 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)低溫冷凍且儲存在液氮中直至進一步使用。解凍後，使用Cellometer細胞計數器藉由AOPI分析法評估活細胞數目。預REP及REP過程

收集人類腫瘤樣品且分割成約3 mm片狀物且與推薦的含有IL-2 (6000 IU/mL)之培養基一起在Grex10中培養。培養11天後，在使用經照射之PBMC、抗CD3抗體且含有IL-2 (6000 IU/ml)的REP擴增過程中對預REP細胞進行增殖。同時，使用經照射之PBMC、抗CD3抗體且含有10 ng/ml IL-15及10 ng/ml IL-21以及5 mM L-精胺酸(ITARG)且不含或含有NAD+ (ITARG+NAD+)的REP擴增過程中對預REP細胞再進行增殖11天。基因編輯過程

為使TIL經過基因修飾以表現栓繫細胞介素IL-12及IL-15，用BaEVTR包膜病毒轉導100,000個REP前TIL，該病毒含有由NFAT啟動子驅動之編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核酸序列，接著由EF1a啟動子驅動之編碼栓繫IL-15 (TeIL-15)之序列。對於旋轉轉導，將TIL及病毒於含有IL-2 (3000 IU/mL)之培養基中添加至retronectin塗佈盤中，且接著在2000×g、32℃下離心45分鐘。旋轉轉導後，在開始REP之前將TIL培育72小時。結果

首先，REP過程補充有IL-15及IL-21以及L-精胺酸(ITARG)，不含或含有NAD+ (ITARG+NAD+)，與僅含有IL之培養基調配物相比，未修飾之TIL之擴增及存活率有所增加(圖74A-C)。經基因修飾以表現栓繫細胞介素IL-12及IL-15之TIL的擴增亦有適度增加，但存活率顯著改善(圖75A-C)。當在含有ITARG但不含或含有NAD+ (ITARG+NAD+)之條件下擴增時，解凍後未修飾之TIL之恢復亦有所改善(圖74D)。相反，ITARG或ITARG+NAD+不增強經基因修飾之TIL的恢復(圖75D)。實例 25 ：最佳化之培養基調配物增強 TIL 擴增、存活率及細胞毒性 材料及方法T細胞計數及存活率

收集人類腫瘤樣品且分割成約3 mm片狀物且與推薦的含有IL-2 (6000 IU/mL)之培養基一起在Grex10中培養。培養11天後，接著在使用經照射之PBMC、抗CD3抗體且含有IL-2 (6000 IU/ml)的REP擴增過程中對預REP細胞進行增殖。同時，使用經照射之PBMC、抗CD3抗體且含有10 ng/ml IL-15及10 ng/ml IL-21以及5 mM L-精胺酸(ITARG)且不含或含有NAD+ (ITARG+NAD+)的REP擴增過程中對預REP細胞再進行增殖11天。基因編輯過程

為使TIL經過基因修飾以表現栓繫細胞介素IL-12及IL-15，用BaEVTR包膜病毒轉導100,000個REP前TIL，該病毒含有由NFAT啟動子驅動之編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核酸序列，接著由EF1a啟動子驅動之編碼栓繫IL-15 (TeIL-15)之序列。對於旋轉轉導，將TIL及病毒於含有IL-2 (3000 IU/mL)之培養基中添加至retronectin塗佈盤中，且接著在2000×g、32℃下離心45分鐘。旋轉轉導後，在開始REP之前將TIL培育72小時。 活體外細胞毒性分析

使用靶向克裡斯滕大鼠肉瘤病毒(Kirsten rat sarcoma virus，KRAS) G12D突變之轉殖基因TCR來評估活體外無或有細胞介素栓繫之TIL之功能。患者來源之新抗原特異性CD8 TCR識別C*08:02呈遞之常見KRAS G12D突變。HPAC胰臟癌細胞株含有KRAS G12D突變且表現C*08:02對偶基因。自腫瘤片段產生之REP前TIL用於腫瘤定向TIL產生。藉由將病毒添加至Retronectin塗佈之48孔非組織培養處理盤中補充有3000 IU/mL IL-2之完全培養基中的0.1e6 TIL中，CD8+REP前TIL經單獨KRAS慢病毒轉導，或經KRAS慢病毒及栓繫IL-12/IL-15慢病毒(KRAS.mteth.IL12.IL15)共轉導。將培養盤在32℃下以2000g離心45分鐘，接著置於37℃培育箱中3天。接著，如上所述，在進行REP過程之前，針對CD8+TCRb+表現，對此等細胞進行分選。為模擬實體腫瘤微環境(TME)之條件，將表現eGFP/mCherry之HPAC細胞於模擬實體腫瘤微環境之DMEM基礎培養基(無葡萄糖，補充有1.5 mM葡萄糖、20 mM乳酸、100 μM腺苷、5 ng/mL TGF β1，有或無30 IU/mL IL-2)中接種於96孔盤中。然後，將KRAS TCR+ TIL或KRAS.mteth.IL12.IL15 TIL添加至HPAC細胞中，一式三份。使用活細胞成像系統(IncuCyte，Sartorius)記錄4天內不同效應物與腫瘤(E:T)比下基於TIL之腫瘤細胞溶解情況。結果 最佳化之培養基調配物增強 TIL 之擴增及存活率

在多種腫瘤類型之41名供體中，與含有IL-2或IL-2與50 μM NAD+之培養基調配物相比，REP過程中使用的補充有IL-15及IL-21以及L-精胺酸(ITARG)且不含或含有50 µM NAD+ (ITARG+NAD+)的培養基引起未修飾之TIL的活細胞總數(TVC)、擴增倍數及存活率增加(圖78A-C)。 最佳化之培養基調配物增強抗原特異性 REP TIL 活體外細胞毒性

為評估培養基調配物對TIL功能在抑制腫瘤細胞生長方面之影響，將經靶向KRAS G12D之TCR構築體轉導之REP前TIL與表現KRAS G12D之HPAC腫瘤細胞在模擬實體TME之條件下一起培養。與僅含IL-2之培養基相比，當抗原特異性TIL在最佳化之培養基調配物中擴增時，觀測到控制腫瘤生長之適度益處(IL-2/NAD+，1.4倍變化；ITARG，1.2倍變化；ITARG/NAD+，1.7倍變化) (圖79A)。自模擬TME中移除IL-2 (30 IU/mL)導致TIL反應性喪失，無論用於擴增抗原特異性TIL之培養基條件如何(IL-2/NAD+，1.05倍變化；ITARG，1.03倍變化；ITARG/NAD+，1.2倍變化) (圖79B)。 膜栓繫之 IL12/IL15 抗原特異性 TIL 在活體外展示增強之細胞毒性

接下來，隨著時間之推移，在低E:T比下共培養時，評估在最佳化培養基中擴增之抗原定向TIL上的膜栓繫之細胞介素對腫瘤細胞生長之影響。與所有實驗組相比，在ITARG/NAD+中擴增之KRAS.mteth.IL15.IL21 TIL展現最有效之抗腫瘤活性(5.0倍變化) (圖80A)。此外，在缺乏IL-2下，在ITARG/NAD+中擴增之KRAS.mteth.IL15.IL21 TIL之活性增強得以維持(5.2倍變化) (圖80B)。使用流式細胞分析技術偵測之經KRAS轉導之TIL的表面的mteth.IL15水準用作轉導效率之對照，如圖80C所示。實例 26 ：表現膜栓繫之 IL-12/IL-15 之 TIL 顯示增強之活體內持久性 材料及方法

在第-10天，將1E6 PDX M1152腫瘤細胞接種至各實驗組#1-#7之7或8隻NOG小鼠。在第0天，將10E6 REP TIL輸注至治療組#2-#7中之各隻小鼠(參見表25)。

經由腹腔內注射對治療組#5、#6及#7中之各隻小鼠投與九個劑量之Proleukin (45,000IU)方案；投與時程為：第0天：ACT之後一劑Proleukin (45,000 IU) 第1天：兩劑Proleukin (45,000 IU)－清晨及傍晚第2天：兩劑Proleukin (45,000 IU)－清晨及傍晚第3天：一劑Proleukin (45,000IU) 第4-6天：每天一劑Proleukin (45,000 IU) 自第7天開始，如下自輸注TIL之小鼠收集週邊血液於EDTA塗佈管中：第7天：組#2、#3、#4 第8天：組#5、#6、#7 第14天：組#2、#3、#4 第15天：組#5、#6、#7

PB中之TIL持久性以CD2+CD3+抗體染色，且藉由流式細胞分析技術使用絕對計數珠進行定量。結果

在缺乏Proleukin下表現TeIL-12/TeIL-15之TIL顯示在輸注後持久性增加之趨勢(圖81)。 * * *

提供上述實例以為此項技術中熟習此項技術者提供如何製得並使用本發明之組合物、系統及方法之實施例的完整揭示內容及描述，且並不意欲限制本發明人定義其發明之範疇。此項技術中熟習此項技術者顯而易見的進行本發明之上文所描述模式的修改意欲在以下申請專利範圍之範疇內。本說明書中提及之所有專利及公開案指示此項技術中熟習本發明所屬領域者之技能水準。

所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應視為以任何方式具限制性。舉例而言，此項技術中熟習此項技術者應瞭解根據本文所描述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。

本文中引用之所有參考文獻以引用之方式整體且出於所有目的併入本文中，其引用程度如同各個別公開案或專利或專利申請案經特定且個別地指示出於所有目的以全文引用的方式併入本文中一般。

如本領域中熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本申請案之精神及範疇的情況下對其進行多種修改及改變。本文所描述之特定實施例及實例僅作為實例提供，且本申請案僅受隨附申請專利範圍之各項以及申請專利範圍授權之等效物之全部範疇限制。

[ 圖 1A] -[ 圖 1C] ：用於評估膜結合之IL-15/IL-21轉導之REP前TIL之表現及信號傳導的研究概述。 [ 圖 2 A] -[ 圖 2 B] ：用於評估經mIL-15/IL-21轉導之REP TIL中之mIL-15/IL21以及CD8及CD4 T細胞子集之表現的研究概述。 [ 圖 3 A] -[ 圖 3 C] ：用於評估經mIL-15/IL-21轉導之CD8+ REP TIL之表型的研究概述。 [ 圖 4A] -[ 圖 4C] ：用於評估經mIL-15/IL-21轉導之CD4+ REP TIL之表型的研究概述。 [ 圖 5]描繪允許在本文中提供之主題TIL之實施例中表現成員錨定IL-12 (TeIL-12)及PD-1 shRNA之例示性核酸。 [ 圖 6]描繪用於製備表現TeIL-12及/或NFAT-TeIL-12之TIL以投與至個體的例示性工作流程。 [ 圖 7 A] -[ 圖 7 B] ：用於評估REP TIL中之TeIL-12及/或NFAT-TeIL-12表現的研究概述。(A)在REP收穫後，TeIL-12在TeIL12 TIL上之表面表現係藉由流動式分析法用IL-12P70流動抗體(B)進行研究。NFAT-TeIL-12轉導之REP-TIL用具有指定稀釋度之TransACT或PMA刺激。刺激後48小時，研究表面表現TeIL-12表現。 [ 圖 8] ：用於評估表現TeIL-12之TIL中之IL-12活性的研究概述。 [ 圖 9 A] -[ 圖 9 B] ：用於評估經轉導以表現TeIL-12或NFAT-TeIL-12之REP後TIL之(A)擴增及(B)存活率的研究概述。 [ 圖 10A] -[ 圖 10B] ：用於評估(A)TeIL-12及/或NFAT-TeIL-12在來自不同組織(包括兩個肺、一個頭頸、一個乳房及一個卵巢腫瘤樣品)之REP TIL群體中之頻率及(B)每個細胞之病毒基因體複本數(VCN)的研究概述。 [ 圖 11 A] -[ 圖 11 D] ：用於評估(A)及(B)基於THP-1之同種異體細胞毒性分析中之細胞毒性，(C)及(D) TeIL-12 REP-TIL及NFAT驅動之誘導型TeIL-12 REP-TIL之IFN-γ產生的研究概述。 [ 圖 12 A] -[ 圖 12 B] ：亦藉由xCelligence RTCA分析使用兩個標靶細胞群體(A)及(B)評估用於評估表現TeIL-12之TIL之細胞毒性的研究概述。 [ 圖 13A] -[ 圖 13C] ：用於評估TIL殺傷功效之研究概述。進行(A)實驗設計示意圖。(B) KILR® THP-1細胞毒性分析及IFN-g定量，及(C) Xcellgene RTCA殺傷分析。 [ 圖 14]描繪用於評估CD8+、CD4+及CD4+/FoxP3- T細胞在經轉導以表現TeIL-12或NFAT-TeIL-12之REP TIL群體內之分佈的研究概述。 [ 圖 15 A] -[ 圖 15 B] ：用於評估(A) CD8+及(B) CD4+ T細胞在經轉導以表現TeIL-12或NFAT-TeIL-12之REP TIL群體內如藉由各種細胞標記物量測之T細胞分化的研究概述。 [ 圖 16 A] -[ 圖 16 B] ：用於評估(A) CD8+及(B) CD4+ T細胞在經轉導以表現TeIL-12或NFAT-TeIL-12之REP TIL群體內如藉由各種細胞標記物量測之T細胞耗減的研究概述。 [ 圖 17 A] -[ 圖 17 B] ：用於評估(A) CD8+及(B) CD4+ T細胞在經轉導以表現TeIL-12或NFAT-TeIL-12之REP TIL群體內如藉由各種細胞標記物量測之T細胞活化的研究概述。 [ 圖 18 A] -[ 圖 18 B] ：用於評估(A) CD8+及(B) CD4+ T細胞在經轉導以表現TeIL-12或NFAT-TeIL-12之REP TIL群體內如藉由各種細胞標記物量測之T細胞功能的研究概述。 [ 圖 19 A] -[ 圖 19 B] ：顯示以下程序後TeIL-15之(A)細胞擴增及(B)表面表現：在TeIL-15慢病毒基因轉導後，用飼養細胞、3000IU/ml IL-2及aCD3 Ab OKT3或HIT3a處理REP前TIL以進行REP擴增。在設置REP過程後之不同天數(第0天、第2天及第4天)，將OKT3 (30 ng/ml)或HIT3a (30 ng/ml)添加至REP培養基中。REP擴增11天後，收穫REP後TIL且分析。 [ 圖 20A] -[ 圖 20B] ：顯示以下程序後TeIL-15/TeIL-21之(A)細胞擴增及(B)表面表現：在TeIL-15/TeIL-21慢病毒基因轉導後，用飼養細胞、3000IU/ml IL-2及aCD3 Ab OKT3或HIT3a處理REP前TIL以進行REP擴增。在設置REP過程後之不同天數(第0天、第2天及第4天)，將OKT3 (30 ng/ml)或HIT3a (30 ng/ml)添加至REP培養基中。REP擴增11天後，收穫REP後TIL且分析。 [ 圖 21A] -[ 圖 21B] ：顯示以下程序後TeIL-15之(A)細胞擴增及(B)表面表現：在TeIL-15慢病毒基因轉導後，用飼養細胞、3000IU/ml IL-2及指定濃度之OKT3處理REP前TIL以進行11天REP擴增。REP擴增11天後，收穫REP後TIL且分析。 [ 圖 22A] -[ 圖 22B] ：顯示以下程序後TeIL-15/TeIL-21之(A)細胞擴增及(B)表面表現：在TeIL-15/TeIL-21慢病毒基因轉導後，用飼養細胞、3000IU/ml IL-2及指定濃度之OKT3處理REP前TIL以進行REP擴增。REP擴增11天後，收穫REP後TIL且分析。 [ 圖 23] ：展示使用或不使用TransAct轉導後TeIL-12之表面表現。 [ 圖 24] ：展示使用Retronection或Vectofusin塗佈盤轉導後且有或無離心下TeIL-12之表面表現。 [ 圖 25] ：展示使用TransACT或PMA-肌黴素刺激轉導後且使用或不使用Lentiboost之TeIL-12之表面表現。 [ 圖 26] ：展示使用BaEVTR、RD114或VSV-G Env質體轉導後TeIL-12之表面表現。 [ 圖 27A-27D] ：展示表現NFAT-TeIL-12之TIL在連續TransACT刺激後(A) KILR® THP-1細胞殺傷分析、(B) IFN產生、(C) xCelligence RTCA分析及(D) xCelligence RTCA分析之結果。 [ 圖 28] ：展示編碼NFAT驅動之TeIL-12及EF1α驅動之雙順反子tCD19及組分X之示例性表現載體。 [ 圖 29A-29B] ：展示經NFAT-TeIL-12及組分X轉導之TIL之(A)擴增倍數及(B)存活率。 [ 圖 30A-30B] ：展示經NFAT-TeIL-12及組分X轉導之TIL之(A)轉導效率及(B)每個細胞之病毒複本數(VCN)。 [ 圖 31] ：展示不同程度之TCR刺激後tCD19、TeIL-2、TeIL-15、IL-2、IL-15、GFP shRNA及PD-1 shRNA之表現。 [ 圖 32] ：展示表現tCD19、TeIL-2、TeIL-15、IL-2或IL-15之TIL之xCELLgene RTCA細胞殺傷分析的結果。 [ 圖 33] ：展示由表現TeIL-2、TeIL-15、IL-2或IL-15之TIL誘導之p-STAT活化。 [ 圖 34] ：展示表現TeIL-2、TeIL-15、IL-2或IL-15之TIL偏斜之順式增殖。 [ 圖 35A-35B] ：展示在缺乏IL-2下EF-1α驅動之IL-2/IL-15改善T細胞增殖。 [ 圖 36A-36B] ：展示藉由流式細胞分析技術(A)或gMFI (B)量測，PD-1 shRNA有效降低TIL中之PD-1陽性。 [ 圖 37A-37D] ：展示在缺乏IL-2下TeIL-15促進TIL活體外存活。 [ 圖 38A-38B] ：展示使用Gen 2或Invigo-T + I-Arg過程之經NFAT-IL-12基因工程改造之TIL的活體內功效之PDX資料。 [ 圖 39A-39B] ：展示使用Gen 2或Invigo-T + L-Arg過程之經NFAT-IL-12基因工程改造之TIL的體重(A)及相對於基線之體重% (B)的動態變化。 [ 圖 40] ：展示輸注有Gen 2或NFAT-IL-12基因工程改造之TIL之小鼠中IFN-γ、TNFa、CCL4及IL-12 p70之血漿水準。 [ 圖 41] ：展示當TIL與ITIL細胞介素在IFNγ存在下培養時腫瘤反應性增強。 [ 圖 42A-42B] ：展示發現4-1BB表現在腫瘤消化物塗鋪後24小時達到最大(A)，且隨著向細胞培養基中提供IFNγ而增加(TS-TIL條件) (B)。 [ 圖 43] ：概述對富集腫瘤反應性CD8 TIL之能力進行分析之若干個過程。 [ 圖 44] ：展示CD137分選過程製造之TIL之產品效力提高約10倍。 [ 圖 45] ：展示對TS-TIL (4-1BB分選/1x REP)過程製造之腫瘤反應性TIL的富集。 [ 圖 46] ：展示兩種CD137 (4-1BB)分選條件提供腫瘤反應性CD8 (IFNγ +CD107a+) TIL之最佳富集。 [ 圖 47] ：展示CD137 (4-1BB)分選條件將腫瘤反應性CD8 (IFNγ +CD107a+) TIL改善60倍。 [ 圖 48] ：概述用於產生腫瘤反應性TIL之「TS-TIL」(4-1BB選擇)過程。 [ 圖 49] ：展示TS-TIL產品中特定腫瘤反應性TIL之百分比(約7%)對比CTRL產品(約1%)顯著增加。 [ 圖 50] ：展示自TS-TIL過程產生之CD8腫瘤反應性TIL總數平均比自CTRL過程產生之CD8腫瘤反應性TIL總數大7倍。 [ 圖 51] ：展示總活細胞及擴增倍數隨REP條件而變之結果。 [ 圖 52] ：展示隨分選及REP條件而變之CD8+腫瘤反應性TIL總產量(藉由自體消化物共培養ICS評估)。 [ 圖 53] ：展示發現大多數細胞為Tem「效應記憶」細胞，不同過程製備之TIL之間差異極小。 [ 圖 54] ：展示TeIL-15僅以順式方式活化T細胞。 [ 圖 55A-55D] ：展示Invigo-T REP期間L-精胺酸增強解凍後之擴增及細胞恢復。 [ 圖 56A-56C] ：展示L-精胺酸提供更好之表型及殺傷能力。 [ 圖 57A-57C] ：展示NAD+與L-精胺酸協同作用，促進新陳代謝且提供獨特之T細胞特徵。 [ 圖 58]展示來自儲存及新鮮REP前TIL之TIL製造過程。 [ 圖 59]展示NFAT-TeIL12-EF1α-tCD19 (平均值=30.3%)及NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 (平均值= 23.2%)在CD3+ T細胞中之轉導效率。 [ 圖 60A]展示CD4+及CD8+ T細胞子集中之轉導效率，證明在CD4+與CD8+細胞之間，經NFAT-TeIL12-EF1α-tCD19轉導之TIL中tCD19之表現相似。 [ 圖 60B]展示與CD4+ T細胞相比，CD8+ T細胞中經NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15轉導之TIL中TeIL15之表現較高。 [ 圖 61]展示慢病毒載體轉導之TIL展現REP TIL產物中CD4+或CD8+細胞百分比低/偏斜最小。 [ 圖 62]展示在CD3+ T細胞中REP細胞培養基條件展現相似之轉導效率。 [ 圖 63A-63B]展示在CD4+及CD8+ T細胞子集中REP細胞培養基條件展現相似之轉導效率。 [ 圖 64]展示各種REP細胞培養基條件下擴增速率與存活率增強。 [ 圖 65]展示各種REP細胞培養基條件增加未轉導之TIL中之TIL (TVC)數量。 [ 圖 66]展示各種REP細胞培養基條件提高未轉導之TIL之存活率。 [ 圖 67]展示在CD3+細胞( A)、CD4+ T細胞( B)及CD8+ T細胞( C)中REP TIL中之TeIL-15之表現水準由GEN2+NAD及ITARG+NAD增強。 [ 圖 68]展示與未接受任何刺激之TIL (未刺激)相比，未轉導之TIL ( A 、 C)及NFAT-TeIL-12-EF1α-TeIL-15 TIL ( B 、 D)與自體腫瘤消化物(TIL+消化物)一起培養時展現IFNγ ( A 、 B)及TNFα ( C 、 D)之產生增加。 [ 圖 69]展示相比於與抗HLA-I及抗HLA-II (TIL+消化物+HLA阻斷)一起培育之共培養物，當與自體腫瘤消化物(TIL+消化物)一起培養時，未轉導之TIL ( A 、 C)及NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 TIL ( B 、 D)展示IFNγ ( A 、 B)及TNFα ( C 、 D)減少。 [ 圖 70]展示與未轉導之TIL相比，當自體腫瘤消化物(TIL+消化物)一起培養時，NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 TIL產生更多IFNγ，當TIL經歷GEN2+NAD或ITARG+NAD REP時，此作用增強( A)。在GEN2條件下擴增之NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 TIL展現IFNγ增加2.8倍，而NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 GEN2+NAD TIL及NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 ITARG+NAD TIL展示IFNγ分別增加6.7倍及5.1倍( B)。 [ 圖 7 1]展示與未轉導之TIL相比，當自體腫瘤消化物(TIL+消化物)一起培養時，NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 TIL產生更多TNFα，當TIL經歷GEN2+NAD或ITARG+NAD REP時，此作用增強( A)。與NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 GEN2+NAD TIL (1.8倍)、NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 ITARG TIL (1.7倍)及NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 ITARG+NAD TIL (1.7倍)相比，在GEN2條件下擴增之NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 TIL展現TNFα增加1.3倍( B)。 [ 圖 72]展示與未轉導之TIL相比，經NFAT-TeIL12-EF1α-tCD19或NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15轉導之TIL對自體黑色素瘤細胞株展現優異之細胞毒性。與未轉導之TIL相比，當腫瘤細胞與自體NFAT-TeIL12-EF1α-tCD19或NFAT-TeIL12-EF1α-TeIL15 TIL一起培養時，8:1 ET比( A)及4:1 ET比( B)之凋亡蛋白酶3/7+細胞百分比顯著更高。 [ 圖 73]展示與慢病毒骨架對照及模擬過程對照相比，經單一NFAT-teIL12構築體或雙NFAT-teIL12-EF1a-TeIL15構築體轉導之NYESO1 TCR選擇之T細胞展示優異之殺傷功效。 [ 圖 74]展示在各種培養基調配物下擴增之未修飾之TIL在22天REP過程結束時之( A)總活細胞、( B)擴增倍數及( C)存活率，及( D)解凍後1小時之存活率。資料展示為平均值±SD。重複量測混合模型之資料，事後圖基多重比較檢驗(post-hoc Tukey's multiple comparisons test)。* p＜0.01；**p＜0.001, ***p＜0.0001。縮寫：ITARG，IL-15、IL-21、L-精胺酸；NAD+，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸。 [ 圖 75]展示在各種條件下擴增之栓繫-細胞介素TIL (NFAT-TeIL12/TeIL15)在22天REP過程結束時之( A)總活細胞、( B)擴增倍數及( C)存活率，及( D)解凍後1小時之存活率。資料展示為平均值±SD。重複量測混合模型之資料，事後圖基多重比較檢驗。N，不顯著；* p＜0.01；**p＜0.001，***p＜0.0001。縮寫：ITARG，IL-15、IL-21、L-精胺酸；NAD+，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸。 [ 圖 76]展示pCMV-3Tag-4a-BaEV-TR (SEQ ID NO:166)之載體圖。 [ 圖 77]展示pLenti- IRES-NFAT-TeIL12-EF1a-TeIL-15 (SEQ ID NO:167)之載體圖。 [ 圖 78]. 來自各種腫瘤類型之41個供體的在各種培養基調配物下擴增之未修飾之TIL在22天REP過程結束時的( A)總活細胞、( B)擴增倍數及( C)存活率。資料展示為平均值±SD。重複量測混合效應模型之資料，事後圖基多重比較檢驗。* p＜0.01；**p＜0.001，***p＜0.0001。縮寫：ITARG，IL-15、IL-21、L-精胺酸；NAD+，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸。 [ 圖 79]. 腫瘤定向TIL之活體外細胞毒性。評估來自5名供體之KRAS-TCR TIL產品對KRAS (HPAC)腫瘤細胞之細胞毒性。將抗原特異性TIL添加至改良培養基中之相應HPAC細胞中，該培養基模擬實體腫瘤微環境(TME)中經常觀測到之條件(分別有及無IL-2，(A)及(B))。資料展示為平均值±SD。重複量測混合效應模型之資料，事後圖基多重比較檢驗。*p＜0.01；**p＜0.001，***p＜0.0001。縮寫：ITARG，IL-15、IL-21、L-精胺酸；NAD+，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸。 [ 圖 80]. 具有膜栓繫細胞介素之腫瘤定向TIL的活體外細胞毒性。在模擬實體腫瘤微環境(TME)中經常觀測到之條件(分別有及無IL-2，(A)及(B))的改良培養基中評估來自5名供體之KRAS.mteth.IL12.IL15 TIL產品對KRAS (HPAC)腫瘤細胞之細胞毒性。資料展示為平均值±SD。重複量測混合效應模型之資料，事後圖基多重比較檢驗。*p＜0.01；**p＜0.001，***p＜0.0001。縮寫：ITARG，IL-15、IL-21、L-精胺酸；NAD+，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸。使用流式細胞分析技術偵測之KRAS轉導之TIL的表面的mteth.IL15水平用作轉導效率之對照(C)， [ 圖 81]. 表現TeIL-12/TeIL-15之TIL展示輸注後持久性增加之趨勢。 [ 圖 82]. 提供步驟A至F之概述的示例性Gen2 (過程2A)圖。 [ 圖 83A-83C]. 用於TIL製造之Gen 2 (過程2A)實施例之製程流程圖。

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Claims

一種核酸分子，其包含編碼栓繫IL-12 (TeIL-12)之核苷酸序列，其中該TeIL-12處於活化T細胞核因子(NFAT)反應性啟動子之控制下。
如請求項1之核酸分子，其中該TeIL-12包含膜錨，及與人類IL-12 p35次單元融合之人類IL-12 p40次單元。
如請求項2之核酸分子，其中該人類IL-12 p35次單元具有SEQ ID NO:60之胺基酸序列且該人類IL-12 p40次單元具有SEQ ID NO:61之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之核酸分子，其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之核酸分子，其中編碼該TeIL-12之該核苷酸序列示於SEQ ID NO:162中。
如請求項1至5中任一項之核酸分子，其進一步包含編碼選自由以下組成之群之細胞介素的核苷酸序列：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF或其變異體。
如請求項6之核酸分子，其中該細胞介素處於組成型啟動子之控制下。
如請求項7之核酸分子，其中該組成型啟動子係選自由以下組成之群：EF1α啟動子、CMV啟動子、CAG啟動子、MND啟動子及SSFV啟動子。
如請求項7之核酸分子，其中該組成型啟動子為EF1α啟動子。
如請求項6至9中任一項之核酸分子，其中該細胞介素為IL-15或其變異體。
如請求項10之核酸分子，其中該IL-15為人類IL-15。
如請求項11之核酸分子，其中該人類IL-15具有SEQ ID NO:64之胺基酸序列。
如請求項10至12中任一項之核酸分子，其中該IL-15為栓繫IL-15 (TeIL-15)。
如請求項13之核酸分子，其中該TeIL-15包含膜錨，及人類IL-15。
如請求項14之核酸分子，其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。
如請求項6至9中任一項之核酸分子，其中該細胞介素為IL-2或其變異體。
如請求項16之核酸分子，其中該IL-2為人類IL-2。
如請求項17之核酸分子，其中該人類IL-2具有SEQ ID NO:138之胺基酸序列。
如請求項16至18中任一項之核酸分子，其中該IL-2為栓繫IL-2 (TeIL-2)。
如請求項19之核酸分子，其中該TeIL-2具有SEQ ID NO:139之胺基酸序列。
如請求項1至20中任一項之核酸分子，其包含SEQ ID NO:148-150中所示之核酸序列。
如請求項1至21中任一項之核酸分子，其進一步包含編碼shRNA之核苷酸序列。
如請求項22之核酸分子，其中該shRNA抑制免疫檢查點基因之表現。
如請求項23之核酸分子，其中該免疫檢查點基因係選自由以下組成之群：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。
如請求項23之核酸分子，其中該免疫檢查點基因為PD-1。
如請求項25之核酸分子，其中該PD-1 shRNA包含SEQ ID NO:141-147中所示之核酸序列。
如請求項1至26中任一項之核酸分子，其包含SEQ ID NO:151中所示之核酸序列。
一種重組表現載體，其包含如請求項1至27中任一項之核酸分子。
如請求項28之重組表現載體，其中該載體為轉移載體。
如請求項29之重組表現載體，其中該轉移載體來源於人類免疫缺乏病毒-1 (HIV-1)且為複製缺陷型的。
如請求項30之重組表現載體，其中該轉移載體為pLenti-IRES-EGFP載體。
一種慢病毒表現系統，其包含如請求項30或31之重組表現載體及一或多種編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白之輔助質體。
如請求項32之慢病毒表現系統，其包含編碼該Env蛋白、該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白之輔助質體。
如請求項32之慢病毒表現系統，其包含編碼該Env蛋白之輔助質體及編碼該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白之輔助質體。
如請求項32之慢病毒表現系統，其包含編碼該Env蛋白、該Gag蛋白及該Pol蛋白之輔助質體及編碼該Rev蛋白之輔助質體。
如請求項32之慢病毒表現系統，其包含編碼該Env蛋白及該Rev蛋白之輔助質體及編碼該Gag蛋白及該Pol蛋白之輔助質體。
如請求項32至36中任一項之慢病毒表現系統，其中該Env蛋白係選自由以下組成之群：Ba-EVTR、VSV-G及RD114。
如請求項37之慢病毒表現系統，其中該Env蛋白包含Ba-EVTR蛋白。
一種製造重組慢病毒粒子之方法，其包括： a) 在細胞培養基中培養包裝細胞群體； b) 使該包裝細胞群體與如請求項32至38中任一項之慢病毒表現系統接觸；及 c) 收穫該細胞培養基之上清液，其中該上清液包含該重組慢病毒粒子。
一種重組慢病毒RNA分子，其包含如請求項1至27中任一項之核酸分子。
一種重組慢病毒前病毒DNA，其包含如請求項1至27中任一項之核酸分子。
一種重組慢病毒粒子，其包含如請求項40之重組慢病毒RNA分子。
如請求項42之重組慢病毒粒子，其由如請求項240至284中任一項之包裝細胞株產生。
如請求項42或43之重組慢病毒粒子，其包含選自由以下組成之群的Env蛋白：Ba-EVTR、VSV-G及RD114。
如請求項42至44中任一項之重組慢病毒粒子，其進一步包含反轉錄酶。
如請求項42至45中任一項之重組慢病毒粒子，其進一步包含封裝該重組慢病毒RNA分子之殼體。
一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其包含如請求項41之重組慢病毒前病毒DNA。
如請求項47之經基因編輯之TIL，其中該重組慢病毒前病毒DNA整合至該經基因編輯之TIL之基因體中。
一種經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其表現外源性栓繫IL-12 (TeIL-12)。
如請求項49之經基因編輯之TIL，其中該TeIL-12包含膜錨，及與人類IL-12 p35次單元融合之人類IL-12 p40次單元。
如請求項50之經基因編輯之TIL，其中該人類IL-12 p35次單元具有SEQ ID NO:60之胺基酸序列且該人類IL-12 p40次單元具有SEQ ID NO:61之胺基酸序列。
如請求項51之經基因編輯之TIL，其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。
如請求項49至52中任一項之經基因編輯之TIL，其進一步表現選自由以下組成之群的細胞介素：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、IFN γ、TNFa、IFN α、IFN β、GM-CSF、GCSF及其變異體。
如請求項53之經基因編輯之TIL，其中該細胞介素為IL-15或其變異體。
如請求項54之經基因編輯之TIL，其中該IL-15為人類IL-15。
如請求項55之經基因編輯之TIL，其中該人類IL-15具有SEQ ID NO:64之胺基酸序列。
如請求項54至56中任一項之經基因編輯之TIL，其中該IL-15為栓繫IL-15 (TeIL-15)。
如請求項57之經基因編輯之TIL，其中該TeIL-15包含膜錨，及人類IL-15。
如請求項57之經基因編輯之TIL，其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。
一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增； b) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增；及 c) 在任何時間，用如請求項42至46中任一項之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體表現TeIL-12。
如請求項60之方法，其進一步包括在用該重組慢病毒粒子轉導該TIL群體之前活化該TIL群體1天或2天。
如請求項61之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與選自由以下組成之群的細胞介素接觸：IL-2、IL-15、IL-21、IL-7及其組合。
如請求項62之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與20 ng/mL IL-15接觸。
如請求項62之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與10 ng/mL IL-7接觸。
如請求項62之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與TransAct接觸。
如請求項62之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。
如請求項60至66中任一項之方法，其中該轉導步驟在10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度下進行。
如請求項60至67中任一項之方法，其中該轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。
如請求項60至68中任一項之方法，其中該轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。
如請求項60至69中任一項之方法，其中該轉導步驟包括離心。
如請求項60至70中任一項之方法，其中該轉導步驟在Lentibooster存在下進行。
如請求項60至71中任一項之方法，其中該轉導步驟在該第一擴增步驟之後及該第二擴增步驟之前進行。
如請求項61至72中任一項之方法，其中該活化步驟在該第一擴增步驟之後及該第二擴增步驟之前進行。
如請求項60至73中任一項之方法，其進一步包括在該轉導步驟之後使該TIL群體靜置2天或3天。
如請求項60至74中任一項之方法，其中該TIL群體係自腫瘤消化物獲得。
如請求項60至75中任一項之方法，其進一步包括引發步驟。
如請求項76之方法，其中該引發步驟在該第一擴增步驟之前進行。
如請求項76或77之方法，其中該引發步驟在IFNγ存在下進行。
如請求項78之方法，其中在該引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。
如請求項76至79中任一項之方法，其中該引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。
如請求項80之方法，其中在該引發步驟期間該IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。
如請求項80或81之方法，其中在該引發步驟期間該IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。
如請求項80或81之方法，其中在該引發步驟期間該IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。
如請求項76至83中任一項之方法，其中該引發步驟持續24-48小時。
如請求項76至83中任一項之方法，其中該引發步驟持續約30小時。
如請求項60至85中任一項之方法，其進一步包括富集步驟。
如請求項86之方法，其中該富集步驟在該引發步驟之後及該第一擴增步驟之前進行。
如請求項86或87之方法，其中使該TIL群體富集CD137+ T細胞。
如請求項86或87之方法，其中使該TIL群體富集CD137+及CD39+ T細胞。
如請求項86或87之方法，其中使該TIL群體富集CD137+及CD200+T細胞。
如請求項86或87之方法，其中使該TIL群體富集CD137+、CD200+、CD39+及/或OX40+ T細胞。
如請求項60至91中任一項之方法，其中該第一擴增在飼養細胞存在下進行。
如請求項92之方法，其中該飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。
如請求項60至93中任一項之方法，其中該第一擴增進行約3-11天之時段。
如請求項60至93中任一項之方法，其中該第一擴增進行約9天之時段。
如請求項60至95中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。
如請求項96之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。
如請求項60至97中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。
如請求項98之方法，其中該L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。
如請求項98之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項60至100中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項101之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項60至102中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。
如請求項103之方法，其中該GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。
如請求項60至104中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及蛋白激酶B (AKT)抑制劑。
如請求項105之方法，其中該AKT抑制劑係選自由以下組成之群：帕他色替(ipatasertib)、GSK690693、GSK2141795、GSK2110183、AZD5363、GDC-0068、AT7867、CCT128930、MK-2206、BAY 1125976、哌立福辛(Perifosine)、冬淩草甲素(Oridonin)、草質素(Herbacetin)、特黑內酯(Tehranolide)、異甘草素(Isoliquiritigenin)、黃芩素(Scutellarin)及和厚樸酚(Honokiol)。
如請求項105之方法，其中該AKT抑制劑為AZD5363。
如請求項105至107中任一項之方法，其中該AKT抑制劑濃度為約0.1 µM至約10 µM。
如請求項105至107中任一項之方法，其中該AKT抑制劑濃度為約1 µM。
如請求項60至109中任一項之方法，其中該第二擴增進行約7-11天之時段。
如請求項60至109中任一項之方法，其中該第二擴增進行約10天之時段。
一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 在IFNγ存在下引發包含TIL群體之腫瘤消化物； b) 使該TIL群體富集CD137+ T細胞； c) 藉由在第一細胞培養基中培養富集CD137+ T細胞之該TIL群體進行第一擴增； d) 用包含編碼TeIL-12之核酸序列的重組慢病毒粒子轉導富集CD137+ T細胞之該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體；及 e) 藉由在第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增。
如請求項112之方法，其中該TeIL-12處於NFAT啟動子之控制下。
如請求項112或113之方法，其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。
如請求項112或113之方法，其中編碼該TeIL-12之該核苷酸序列示於SEQ ID NO:162中。
如請求項112至115中任一項之方法，其進一步包括在用該重組慢病毒粒子轉導該TIL群體之前活化該TIL群體1天或2天。
如請求項116之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。
如請求項112至117中任一項之方法，其中該轉導步驟在10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度下進行。
如請求項112至118中任一項之方法，其中該轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。
如請求項112至119中任一項之方法，其中該轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。
如請求項112至120中任一項之方法，其中該轉導步驟包括離心。
如請求項112至121中任一項之方法，其中該轉導步驟在Lentibooster存在下進行。
如請求項112至122中任一項之方法，其進一步包括在該轉導步驟之後使該TIL群體靜置2天或3天。
如請求項112至123中任一項之方法，其中在該引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。
如請求項112至124中任一項之方法，其中該引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。
如請求項125之方法，其中在該引發步驟期間該IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。
如請求項125或126之方法，其中在該引發步驟期間該IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。
如請求項112至127中任一項之方法，其中該引發步驟持續約30小時。
如請求項112至128中任一項之方法，其中該第一擴增在飼養細胞存在下進行。
如請求項129之方法，其中該飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。
如請求項112至130中任一項之方法，其中該第一擴增在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。
如請求項131之方法，其中在該引發步驟期間該IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。
如請求項130或131之方法，其中在該第一擴增期間該IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。
如請求項112至133中任一項之方法，其中該第一擴增進行約9天之時段。
如請求項112至134中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。
如請求項135之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。
如請求項112至136中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。
如請求項137之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項112至138中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項139之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項112至140中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。
如請求項141之方法，其中該GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。
如請求項112至142中任一項之方法，其中該第二擴增進行約10天之時段。
一種製造經基因編輯之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 在IFNγ存在下引發包含TIL群體之腫瘤消化物； b) 使該TIL群體富集CD137+ T細胞； c) 藉由在第一細胞培養基中培養富集CD137+ T細胞之該TIL群體進行第一擴增； d) 用包含編碼TeIL-12及TeIL-15之核酸序列的重組慢病毒粒子轉導富集CD137+ T細胞之該TIL群體以產生該經基因編輯之TIL群體；及 e) 藉由在第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增。
如請求項144之方法，其中該TeIL-12處於NFAT啟動子之控制下。
如請求項144或145之方法，其中該TeIL-15處於組成型啟動子之控制下。
如請求項146之方法，其中該組成型啟動子為EF1α啟動子。
如請求項145至147中任一項之方法，其中該NFAT啟動子及該組成型啟動子引入編碼序列之相同核酸中。
如請求項144至148中任一項之方法，其中該TeIL-12包含SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列。
如請求項144至148中任一項之方法，其中編碼該TeIL-12之核苷酸序列示於SEQ ID NO:162中。
如請求項144至150中任一項之方法，其中該TeIL-15具有SEQ ID NO:73之胺基酸序列。
如請求項144至151中任一項之方法，其進一步包括在用該重組慢病毒粒子轉導該TIL群體之前活化該TIL群體1天或2天。
如請求項152之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。
如請求項144至153中任一項之方法，其進一步包括在該轉導步驟之後使該TIL群體靜置2天或3天。
如請求項144至154中任一項之方法，其中在該引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。
如請求項144至155中任一項之方法，其中該引發步驟在IL-2、IL-15及/或IL-21存在下進行。
如請求項156之方法，其中在該引發步驟期間該IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。
如請求項156或157之方法，其中在該引發步驟期間該IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。
如請求項144至158中任一項之方法，其中該引發步驟持續約30小時。
如請求項144至159中任一項之方法，其中該第一擴增在飼養細胞存在下進行。
如請求項160之方法，其中該飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。
如請求項144至161中任一項之方法，其中該第一擴增進行約9天之時段。
如請求項144至162中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。
如請求項163之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。
如請求項144至164中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。
如請求項165之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項144至166中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項167之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項144至168中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。
如請求項169之方法，其中該GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。
如請求項144至170中任一項之方法，其中該第二擴增進行約10天之時段。
一種治療性經基因編輯之TIL群體，其藉由如請求項60至171中任一項之方法產生。
如請求項172之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體之約15-60%表現該TeIL-12。
如請求項172之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過30%表現該TeIL-12。
如請求項172之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過50%表現該TeIL-12。
如請求項172至175中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體之約15-60%表現該TeIL-15。
如請求項172至175中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過30%表現該TeIL-15。
如請求項172至175中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過50%表現該TeIL-15。
如請求項172至178中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體之約15-60%表現該TeIL-2。
如請求項172至178中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過30%表現該TeIL-2。
如請求項172至178中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過50%表現該TeIL-2。
如請求項172至181中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過30%具有減少之PD-1表現。
如請求項172至181中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過40%具有減少之PD-1表現。
如請求項172至181中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體，其中該經基因編輯之TIL群體超過60%具有減少之PD-1表現。
一種醫藥組合物，其包含如請求項172至184中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體。
一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a) 自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體； b) 藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增； c) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增； d) 在任何時間，用如請求項42至46中任一項之重組慢病毒粒子轉導該TIL群體以產生治療性經基因編輯之TIL群體；及 e) 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。
如請求項186之方法，其進一步包括在用該重組慢病毒粒子轉導該TIL群體之前活化該TIL群體1天或2天。
如請求項187之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與選自由以下組成之群的細胞介素接觸：IL-2、IL-15、IL-21、IL-7及其組合。
如請求項187之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與TransAct接觸。
如請求項186至189中任一項之方法，其中該轉導步驟在10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度下進行。
如請求項186至190中任一項之方法，其中該轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。
如請求項186至191中任一項之方法，其中該轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。
如請求項186至192中任一項之方法，其中該轉導步驟包括離心。
如請求項186至193中任一項之方法，其中該轉導步驟在Lentibooster存在下進行。
如請求項186至194中任一項之方法，其中該轉導步驟在該第一擴增步驟之後及該第二擴增步驟之前進行。
如請求項187至195中任一項之方法，其中該活化步驟在該第一擴增步驟之後及該第二擴增步驟之前進行。
如請求項186至196中任一項之方法，其進一步包括在該轉導步驟之後使該TIL群體靜置2天或3天。
如請求項186至197中任一項之方法，其中該TIL群體係自腫瘤消化物獲得。
如請求項198之方法，其進一步包括引發步驟，其中該腫瘤消化物在IL-2、IL-15、IL-21及IFNγ存在下引發。
如請求項199之方法，其中在該引發步驟期間IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。
如請求項199之方法，其中在該引發步驟期間該IL-2濃度為3000 IU/mL或更低。
如請求項199至201中任一項之方法，其中在該引發步驟期間該IL-15及/或IL-21以約1 ng/mL至約100 ng/mL之濃度存在。
如請求項199至201中任一項之方法，其中在該引發步驟期間該IL-15及/或IL-21以約10 ng/mL之濃度存在。
如請求項199至203中任一項之方法，其中該引發步驟持續24-48小時。
如請求項199至203中任一項之方法，其中該引發步驟持續約30小時。
如請求項186至205中任一項之方法，其進一步包括富集步驟，其中使該TIL群體富集CD137+ T細胞。
如請求項186至205中任一項之方法，其進一步包括富集步驟，其中使該TIL群體富集CD137+及CD39+ T細胞。
如請求項186至205中任一項之方法，其進一步包括富集步驟，其中使該TIL群體富集CD137+及CD200+T細胞。
如請求項186至205中任一項之方法，其進一步包括富集步驟，其中使該TIL群體富集CD137+、CD200+、CD39+及/或OX40+ T細胞。
如請求項186至209中任一項之方法，其中該第一擴增在飼養細胞存在下進行。
如請求項210之方法，其中該飼養細胞為T細胞耗減之PBMC。
如請求項186至211中任一項之方法，其中該第一擴增進行約3-11天之時段。
如請求項186至211中任一項之方法，其中該第一擴增進行約9天之時段。
如請求項186至213中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含IL-15及IL-21。
如請求項214之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。
如請求項186至215中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。
如請求項216之方法，其中該L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。
如請求項216之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項186至218中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項219之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項186至220中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。
如請求項221之方法，其中該GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。
如請求項186至222中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及蛋白激酶B (AKT)抑制劑。
如請求項223之方法，其中該AKT抑制劑係選自由以下組成之群：帕他色替、GSK690693、GSK2141795、GSK2110183、AZD5363、GDC-0068、AT7867、CCT128930、MK-2206、BAY 1125976、哌立福辛、冬淩草甲素、草質素、特黑內酯、異甘草素、黃芩素及和厚樸酚。
如請求項223之方法，其中該AKT抑制劑為AZD5363。
如請求項223至225中任一項之方法，其中該AKT抑制劑濃度為約0.1 µM至約10 µM。
如請求項223至225中任一項之方法，其中該AKT抑制劑濃度為約1 µM。
如請求項186至227中任一項之方法，其中該第二擴增進行約7-11天之時段。
如請求項186至227中任一項之方法，其中該第二擴增進行約10天之時段。
如請求項186至227中任一項之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
如請求項186至230中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與該等TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療該患者之步驟。
如請求項231之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺(cyclophosphamide)持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱(fludarabine)持續三天。
如請求項231之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。
如請求項231之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。
如請求項232至234中任一項之方法，其中該環磷醯胺與美司鈉(mesna)一起投與。
如請求項186至235中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項186至235中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項236或237之方法，其中該IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素(aldesleukin)或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。
如請求項186至235中任一項之方法，其不包括用IL-2方案治療該患者之步驟。
一種包裝細胞株，其包含如請求項28至31中任一項之重組表現載體及一或多種重組DNA分子，該一或多種重組DNA分子中之各者編碼選自由以下組成之群的任一種蛋白質、任兩種蛋白質、任三種蛋白質或所有四種蛋白質：編碼Env蛋白、Gag蛋白、Pol蛋白及Rev蛋白，其限制條件為選自由該Env蛋白、該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白組成之群的任何蛋白質由該一或多種重組DNA分子之至少一種重組DNA分子編碼，其中該一或多種重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。
如請求項240之包裝細胞株，其中該一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子組成。
如請求項241之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。
如請求項241之包裝細胞株，其中該一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子及第二重組DNA分子組成。
如請求項243之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼選自由該Env蛋白、該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白組成之群的單一蛋白質。
如請求項244之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Env蛋白。
如請求項244之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Gag蛋白。
如請求項244之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Pol蛋白。
如請求項244之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Rev蛋白。
如請求項243之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼選自由該Env蛋白、該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白組成之群的兩種蛋白質。
如請求項249之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Env蛋白及該Gag蛋白。
如請求項249之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Env蛋白及該Pol蛋白。
如請求項249之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Env蛋白及該Rev蛋白。
如請求項249之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Gag蛋白及該Pol蛋白。
如請求項249之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Gag蛋白及該Rev蛋白。
如請求項249之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼該Pol蛋白及該Rev蛋白。
如請求項243至255中任一項之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子及該第二重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。
如請求項240之包裝細胞株，其中該一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子、第二重組DNA分子及第三重組DNA分子組成。
如請求項257之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼第一蛋白質且該第二重組DNA分子編碼第二蛋白質，其中該第一蛋白質及該第二蛋白質獨立地選自由該Env蛋白、該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白組成之群，其限制條件為該第一蛋白質及該第二蛋白質不相同。
如請求項258之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Env蛋白且該第二蛋白質為該Gag蛋白。
如請求項258之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Env蛋白且該第二蛋白質為該Pol蛋白。
如請求項258之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Env蛋白且該第二蛋白質為該Rev蛋白。
如請求項258之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Gag蛋白且該第二蛋白質為該Pol蛋白。
如請求項258之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Gag蛋白且該第二蛋白質為該Rev蛋白。
如請求項258之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Pol蛋白且該第二蛋白質為該Rev蛋白。
如請求項257之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子編碼第一蛋白質且該第二重組DNA分子編碼兩種蛋白質，其中該第一蛋白質及該兩種蛋白質中之各者獨立地選自由該Env蛋白、該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白組成之群，其限制條件為任何蛋白質與由該第一蛋白質及該兩種蛋白質組成之群中的任何其他蛋白質不相同。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Env蛋白，且該兩種蛋白質為該Gag蛋白及該Pol蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Env蛋白，且該兩種蛋白質為該Gag蛋白及該Rev蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Env蛋白，且該兩種蛋白質為該Pol蛋白及該Rev蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Gag蛋白，且該兩種蛋白質為該Env蛋白及該Pol蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Gag蛋白，且該兩種蛋白質為該Env蛋白及該Rev蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Gag蛋白，且該兩種蛋白質為該Pol蛋白及該Rev蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Pol蛋白，且該兩種蛋白質為該Env蛋白及該Gag蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Pol蛋白，且該兩種蛋白質為該Env蛋白及該Rev蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Pol蛋白，且該兩種蛋白質為該Gag蛋白及該Rev蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Rev蛋白，且該兩種蛋白質為該Env蛋白及該Gag蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Rev蛋白，且該兩種蛋白質為該Env蛋白及該Pol蛋白。
如請求項265之包裝細胞株，其中該第一蛋白質為該Rev蛋白，且該兩種蛋白質為該Gag蛋白及該Pol蛋白。
如請求項257至277中任一項之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子、該第二重組DNA分子及該第三重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。
如請求項240之包裝細胞株，其中該一或多種重組DNA分子由第一重組DNA分子、第二重組DNA分子、第三重組DNA分子及第四重組DNA分子組成。
如請求項279之包裝細胞株，其中該第一重組DNA分子、該第二重組DNA分子、該第三重組DNA分子及該第四重組DNA分子中之各者整合至該包裝細胞株之基因體中或由輔助質體包含。
如請求項240至280中任一項之包裝細胞株，其中該Env蛋白包含Ba-EVTR蛋白。
如請求項240至281中任一項之包裝細胞株，其中該編碼TeIL-12之核酸分子整合至該包裝細胞株之基因體中。
如請求項240至282中任一項之包裝細胞株，其中編碼該Env蛋白、該Gag蛋白、該Pol蛋白及該Rev蛋白中之一或多者的該重組DNA分子處於誘導型啟動子之控制下。
如請求項240至283中任一項之包裝細胞株，其包含293T細胞株。
一種用於富集腫瘤反應性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之方法，其包括： a. 在IFNγ存在下引發自腫瘤消化物獲得之TIL群體； b. 使該TIL群體富集CD137+ TIL； c. 藉由在第一細胞培養基中培養富集CD137+ T細胞之該TIL群體進行第一擴增；及 d. 藉由在第二細胞培養基中培養富集CD137+ TIL之該TIL群體進行第二擴增以產生富集腫瘤反應性TIL之TIL群體。
如請求項285之方法，其中與使用參考擴增程序擴增之TIL相比，該富集腫瘤反應性TIL之TIL群體包含增加百分比之腫瘤反應性TIL。
如請求項285或286之方法，其中步驟(a)進行約30小時。
如請求項285至287中任一項之方法，其中步驟(c)進行約9天。
如請求項285至288中任一項之方法，其中步驟(d)進行約10天。
如請求項285至289中任一項之方法，其中該第一細胞培養基包含濃度為3000 IU/mL之IL-2、濃度為10 ng/mL之IL-15及濃度為10 ng/mL之IL-21。
如請求項285至289中任一項之方法，其中該第一細胞培養基包含濃度為6000 IU/mL之IL-2。
如請求項285至291中任一項之方法，其中步驟(c)在iPBMC存在下進行。
如請求項292之方法，其中該iPBMC耗減T細胞。
如請求項285至293中任一項之方法，其中該IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。
如請求項285至294中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為3000 IU/mL之IL-2、濃度為10 ng/mL之IL-21及濃度為10 ng/mL之IL-15。
如請求項285至295中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。
如請求項296之方法，其中該L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。
如請求項296之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項285至298中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項299之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項285至300中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。
如請求項301之方法，其中該GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。
如請求項285至302中任一項之方法，其中使該TIL群體富集CD137+ TIL包括使該TIL群體與固定在珠粒上之抗CD137抗體接觸。
如請求項285至303中任一項之方法，其進一步包括使該TIL群體與抗CD39抗體接觸。
如請求項285至304中任一項之方法，其進一步包括使該TIL群體與抗CD200抗體接觸。
一種用於富集腫瘤反應性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之方法，其包括： a. 在IFNγ存在下引發自腫瘤消化物獲得之TIL群體； b. 使該TIL群體富集CD103+ TIL； c. 藉由在第一細胞培養基中培養富集CD103+ T細胞之該TIL群體進行第一擴增；及 d. 藉由在第二細胞培養基中培養富集CD103+ T細胞之該TIL群體進行第二擴增以產生富集腫瘤反應性TIL之TIL群體。
如請求項306之方法，其中與使用參考擴增程序擴增之TIL相比，該富集腫瘤反應性TIL之TIL群體包含增加百分比之腫瘤反應性TIL。
如請求項306或307之方法，其中步驟(a)進行約24小時。
如請求項306至308中任一項之方法，其中選擇CD103+ TIL包括使用流式細胞分析技術分選該第二TIL群體。
如請求項306至309中任一項之方法，其中步驟(b)包括選擇CD103+CD31- TIL。
如請求項306至310中任一項之方法，其中步驟(c)進行約9天。
如請求項306至311中任一項之方法，其中步驟(d)進行約10天。
如請求項306至312中任一項之方法，其中該第一細胞培養基包含濃度為3000 IU/mL之IL-2、濃度為10 ng/mL之IL-15及濃度為10 ng/mL之IL-21。
如請求項306至313中任一項之方法，其中該第一細胞培養基包含濃度為6000 IU/mL之IL-2。
如請求項306至314中任一項之方法，其中步驟(c)在iPBMC存在下進行。
如請求項315之方法，其中該iPBMC耗減T細胞。
如請求項306至316中任一項之方法，其中該IFNγ以200 ng/mL之濃度存在。
如請求項306至317中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為3000 IU/mL之IL-2、濃度為10 ng/mL之IL-21及濃度為10 ng/mL之IL-15。
如請求項306至318中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)及L-精胺酸。
如請求項319之方法，其中該L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。
如請求項319之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項306至321中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項322之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項306至323中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含GSK-3α/β抑制劑。
如請求項324之方法，其中該GSK-3α/β抑制劑係選自由以下組成之群：SB415286、SB216763、CHIR99021、AR-AO14418、TZD8、TWS119、氯化鋰水合物、BIO及3F8。
一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a. 自該患者切除腫瘤樣品； b. 消化該腫瘤樣品以獲得腫瘤消化物； c. 使用如請求項285至325中任一項之方法自該腫瘤消化物產生富集腫瘤反應性TIL之TIL群體；及 d. 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。
如請求項326之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
如請求項326或327之方法，其進一步包括在向該患者投與該等TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療該患者之步驟。
如請求項328之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。
如請求項328之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。
如請求項328之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。
如請求項329至331中任一項之方法，其中該環磷醯胺與美司鈉一起投與。
如請求項326至332中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項326至332中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項333或334之方法，其中該IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。
如請求項326至332中任一項之方法，其不包括用IL-2方案治療該患者之步驟。
一種製造腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體之方法，其包括： a) 藉由在第一細胞培養基中培養TIL群體進行第一擴增；及 b) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15及L-精胺酸。
如請求項337之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。
如請求項337或338之方法，其中該L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。
如請求項337或338之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項337至340中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項341之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項341之方法，其中該NAD+增強劑為NAD+。
如請求項343之方法，其中該NAD+以約50-75 µM之濃度存在。
如請求項337至344中任一項之方法，其中該第一擴增進行約3-14天之時段。
如請求項337至344中任一項之方法，其中該第一擴增進行約11天之時段。
如請求項337至345中任一項之方法，其中該第二擴增進行約7-14天之時段。
如請求項337至345中任一項之方法，其中該第二擴增進行約11天之時段。
一種治療性TIL群體，其藉由如請求項337至348中任一項之方法產生。
一種醫藥組合物，其包含如請求項349之治療性TIL群體。
一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包括： a) 自該患者切除腫瘤樣品，其中該腫瘤樣品包含TIL群體； b) 藉由在第一細胞培養基中培養該TIL群體進行第一擴增； c) 藉由在第二細胞培養基中培養該TIL群體進行第二擴增，其中該第二細胞培養基包含OKT-3、抗原呈遞細胞(APC)、IL-21、IL-15及L-精胺酸；及 d) 向該患者投與該治療性經基因編輯之TIL群體。
如請求項351之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。
如請求項351或352之方法，其中該L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。
如請求項351或352之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項351至354中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含NAD+增強劑。
如請求項355之方法，其中該NAD+增強劑係選自由以下組成之群：L-Trp、NR、NMN、NAD+、NAM及P7C3活化劑。
如請求項355之方法，其中該NAD+增強劑為NAD+。
如請求項357之方法，其中該NAD+以約50-75 µM之濃度存在。
如請求項351至358中任一項之方法，其中該第一擴增進行約3-14天之時段。
如請求項351至358中任一項之方法，其中該第一擴增進行約11天之時段。
如請求項351至360中任一項之方法，其中該第二擴增進行約7-14天之時段。
如請求項351至360中任一項之方法，其中該第二擴增進行約11天之時段。
如請求項351至362中任一項之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
如請求項351至363中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與該等TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療該患者之步驟。
如請求項364之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。
如請求項364之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。
如請求項364之方法，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。
如請求項365至367中任一項之方法，其中該環磷醯胺與美司鈉一起投與。
如請求項351至368中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項351至368中任一項之方法，其進一步包括在向該患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項369或370之方法，其中該IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。
如請求項351至368中任一項之方法，其不包括用IL-2方案治療該患者之步驟。
一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之細胞培養基中培養該第二TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 收穫自步驟(c)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫之治療性TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (e) 將自步驟(d)收穫之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(d)至(e)之轉移在不打開該系統下進行，及 (f) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。
一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、NAD+、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第二TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 收穫自步驟(c)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫之治療性TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (e) 將自步驟(d)收穫之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(d)至(e)之轉移在不打開該系統下進行，及 (f) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。
一種用於製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 用如請求項42至46中任一項之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至(f)之轉移在不打開該系統下進行，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。
一種用於製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 將由自患者切除之腫瘤加工而成之腫瘤片段添加至密閉系統中以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(a)至步驟(b)之轉變在不打開該系統下進行； (c) 用如請求項42至46中任一項之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變在不打開該系統下進行； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、NAD+、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變在不打開該系統下進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變在不打開該系統下進行，且其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至(f)之轉移在不打開該系統下進行，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。
一種用於製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 加工自患者切除之腫瘤以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體； (c) 用如請求項42至46中任一項之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，且其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。
一種用於製造治療性經基因編輯之TIL群體的方法，其包括： (a) 加工自患者切除之腫瘤以獲得第一TIL群體； (b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體進行第一擴增以產生第二TIL群體，其中該第一擴增在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中該第一擴增進行約3-11天以獲得該第二TIL群體； (c) 用如請求項42至46中任一項之重組慢病毒粒子轉導該第二TIL群體以產生經基因編輯之TIL群體； (d) 藉由在包含IL-21、IL-15、L-精胺酸、NAD+、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該經基因編輯之TIL群體進行第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二擴增進行約7-11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為該治療性經基因編輯之TIL群體，且其中該第二擴增在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (e) 收穫自步驟(d)獲得的該治療性經基因編輯之TIL群體，其中所收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體包含足夠TIL以用於該等TIL之治療有效劑量； (f) 將自步驟(e)收穫的該治療性經基因編輯之TIL群體轉移至輸注袋，及 (g) 使用冷凍保存製程冷凍保存包含該收穫之TIL群體之該輸注袋。
如請求項373至378中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包含濃度為約10 ng/mL之IL-15及濃度為約10 ng/mL之IL-21。
如請求項373至379中任一項之方法，其中該L-精胺酸以約1 mM至約10 mM之濃度存在。
如請求項373至379中任一項之方法，其中該L-精胺酸以約5 mM之濃度存在。
如請求項374、376、378至381中任一項之方法，其中該NAD+以約50-75 µM之濃度存在。
如請求項373至382中任一項之方法，其中該第一擴增進行約3-11天之時段。
如請求項373至382中任一項之方法，其中該第一擴增進行約11天之時段。
如請求項373至384中任一項之方法，其中該第二擴增進行約7-11天之時段。
如請求項373至384中任一項之方法，其中該第二擴增進行約11天之時段。
如請求項373至386中任一項之方法，其進一步包括在用該重組慢病毒粒子轉導該TIL群體之前活化該TIL群體1天或2天。
如請求項387之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與TransAct接觸。
如請求項387之方法，其中該活化步驟包括使該TIL群體與TransAct以1:100之比率接觸。
如請求項373至389中任一項之方法，其中該轉導步驟在10 ⁵個細胞/毫升之TIL濃度下進行。
如請求項373至390中任一項之方法，其中該轉導步驟以約10至約40之感染倍率(MOI)進行。
如請求項373至391中任一項之方法，其中該轉導步驟在RetroNectin或Vectofusin-1存在下進行。
如請求項373至392中任一項之方法，其中該轉導步驟包括離心。
如請求項373至393中任一項之方法，其中該轉導步驟在Lentibooster存在下進行。
如請求項373至394中任一項之方法，其進一步包括在該轉導步驟之後使該TIL群體靜置2天或3天。
一種治療性經基因編輯之TIL群體，其藉由如請求項373至395中任一項之方法產生。
一種醫藥組合物，其包含如請求項396之治療性經基因編輯之TIL群體。
一種如請求項349之治療性TIL群體或如請求項172至184及396中任一項之治療性經基因編輯之TIL群體用於治療有需要之患者之癌症的用途，其包括向該患者投與該治療性TIL群體或該治療性經基因編輯之TIL群體。
如請求項398之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤(包括黏膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
如請求項398或399之用途，其進一步包括在向該患者投與該等TIL之前用非清髓性淋巴球耗減方案治療該患者之步驟。
如請求項400之用途，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。
如請求項400之用途，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天。
如請求項400之用途，其中該非清髓性淋巴球耗減方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，接著以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天。
如請求項401至403中任一項之用途，其中該環磷醯胺與美司鈉一起投與。
如請求項398至404中任一項之用途，其進一步包括在向該患者投與TIL之後第二天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項398至404中任一項之用途，其進一步包括在向該患者投與TIL之同一天開始用IL-2方案治療該患者之步驟。
如請求項405或406之用途，其中該IL-2方案為包含600,000或720,000 IU/kg阿地介白素或其生物類似物或變異體之高劑量IL-2方案，其以每八小時一次15分鐘推注型靜脈內輸注形式投與直至耐受。
如請求項398至404中任一項之方法，其不包括用IL-2方案治療該患者之步驟。