SK6572001A3

SK6572001A3 - N-[4-(3-chloro-4-fluoro-phenylamino)-7-(3-morpholin-4-yl- propoxy)-quinazolin-6-yl]-acrylamide, an irreversible inhibitor of tyrosine kinases

Info

Publication number: SK6572001A3
Application number: SK657-2001A
Authority: SK
Inventors: Alexander James Bridges; Denise Driscoll; Wayne Daniel Klohs
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2002-02-05
Also published as: DE69904358D1; JP2002530386A; HUP0104211A3; BG105608A; AU6261299A; PL347717A1; CZ20011759A3; CO5150185A1; ZA200103535B; AR023706A1; AU763626B2; EE200100271A; BR9915487A; DK1131304T3; IL143089A0; PE20001242A1; JP3687900B2; US6344455B1; GEP20032997B; UY25809A1

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález se týka zlúčeniny N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamidu, ktorá je ireverzibilným inhibitorom tyrozínkináz. Predkládaný vynález sa tiež týka spôsobov liečby nádorov, aterosklerózy, restenózy, endometriózy a psoriázy za použitia zlúčeniny N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolín-6-yl] -akrylamidu a farmaceutických prostriedkov obsahujúcich zlúčeninu N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenvlamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl] -akrylamid.

Doterajší stav techniky

Nádory sa považujú za ochorenia vznikajúci v dôsledku intracelulárnej signalizácie alebo mechanizmu prenosu signálu. Bunky dostávajú príkazy z vela extracelulárnych zdrojov, a tieto príkazy určujú to, či budú alebo nebudú bunky proliferovať. Účelom systémov prenosu signálu je získať tieto a iné signály na povrchu buniek, preniesť je do buniek a potom do jadra, cytoskeletu, transportných systémov a systémov pre syntézu proteínov.

Najčastejšou príčinou nádorov je séria defektov, buď v týchto proteinoch, ak sú mutované, alebo v regulácii množstva proteínu v bunkách tak, že je nadmerne alebo nedostatečne produkovaný. Najčastejšie existujú klúčové lézie v bunkách, ktoré vedú k trvalému stavu, pri ktorom dostávajú bunečné jadrá signál k proliferácii, aj keď nie je v skutočnosti tento signál prítomný. Toto môže prebehnúť vela mechanizmy. Niekedy môže bunka začať produkovať skutočný rastový faktor pre svoje vlastné receptory, keď by v skutočnosti nemala, čo sa označuje ako mechanizmus autokrínnej smyčky. Mutácie receptorov bunečného povrchu, ktoré používajú zvyčajne k signalizácii do buniek tyrozín-kináz, môžu viesť k aktivácii kinázy za neprítomnosti ligandu a k prenosu signálu, ktorý v skutočnosti neexistuje. Alternatívne môže byť veľa povrchových kináz nadmerne exprimované na povrchu buniek, čo vedie k neprimerane silnej odpovedi na slabý signál. V bunke existuje veľa úrovní, na ktorých môžu mutácie alebo nadmerná expresia viesť k rovnakému chybnému signálu v bunke, a na nádoroch sa účastní veľa druhov defektov signalizácie. Predkládaný vynález sa týka nádorov, na ktorých sa účastnia tri práve popísané mechanizmy a ktoré nesú povrchové receptory pre tyrozin-kinázovou rodinu receptorov pre epidermálny rastový faktor (EGFR). Táto rodina sa skladá z EGF receptoru (tiež označovaného ako erbBl), erbB2 receptoru a ich konštitutívne aktivovaných mutantných onkoproteínov Neu, erbB3 receptoru a erbB4 receptoru. Ďalej, iné biologické procesy riadené prostredníctvom členov EGF rodiny receptorov môžu byť tiež liečené zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu popísanými ďalej.

Nejdôležitejšími ligandmi pre EGFR sú epidermálny rastový faktor (EGF) a transformujúci rastový faktor a (TGTa). Zdá sa, že tieto receptory majú iba minimálny význam u dospelých ľudí, ale jednoznačne sa účastnia chorobných procesov, ako je veľké množstvo nádorov, najmä nádorov tlstého čreva a prsu. Hlavnými liaandmi pre blízke príbuzné erbB2 (HER2), erbB3 (HER3) a erbB4 (HER4) receptory je rodina Heregulinov, a nadmerné expresie a mutácie receptoru boli preukázané ako hlavný rizikový faktor pre zlú prognózu karcinómu prsu. Ďalej bolo preukázané, že všetky štyri členovia tejto rodiny receptorov môžu tvoriť heterodimerické signalizačné komplexy s inými člennmi rodiny, a že toto môže viesť pri nadmernej expresii viacej ako jedného člena rodiny u malignity k synergnej transformačnej kapacite. Bolo preukázané, že nadmerná expresia viacej ako jedného člena rodiny je u ľudských malignít relatívne bežná.

Okrem nádorov je restenóza tiež ochorením, pri ktorom dochádza k nežiadúcej proliferácii buniek. Restenóza vzniká v dôsledku proliferácie buniek hladkého svalu ciev. Restenóza je hlavným klinickým problémom spojeným s koronárnou zákrokmi. Restenóza sa angioplastikou a inými zvyčajne vyskytuje počas

30% až 50% pacientov, ktorí predelali balónkovú angioplastiku liečbe lekárskymi približne 0 až 6 mesiacov u približne pre spriechodnenie upchatých srdca spôsobeného ochorenia restenóza spôsobuje značnú náklady na zdravotnú péči.

Proces restenózy tepien a žíl, vazoaktivných a hlbších vrstiev trombu, zápalu a koronárnych artérií pri zúženými artériami.

morbiditu pacienta a je iniciovaný poranením ciev,

Vzniklá zvyšuje vrátane s následným uvoľnením trombogenných, mitogenných faktorov. Poranenie endotelu a cievy vedie k agregácii trombocytov, tvorbe aktiváciu makrofágov a buniek hladkého svalu.

Tieto deje indukujú produkciu a uvoľňovanie rastových faktorov a cytokínov,ktoré potom môžu podporovať svoju vlastnú syntézu a uvoľňovanie z cieľových buniek. Tak je zahájený proces, ktorý sa sám udržuje a ktorý zahrnuje rastové faktory ako je

EGF, trombocytárny rastový faktor (PDGF) alebo fibroblastový rastový faktor (FGF). Preto je výhodné mať ireverzibilný inhibítory dráh prenosu signálu, najmä tyrozin-kináz ako je

EGF, PDGF, FGF alebo src tyrozín-kináza.

Pre proliferatívne ochorenie kože psoriázu nie je v súčasnosti žiadna dobrá liečba. Toto ochorenie sa často lieči protinádorovými činidlami, ako je methothrexat, ktoré majú výrazné vedľajšie účinky a ktoré nemajú - pri dávkach limitovaných toxicitou - prílišnú účinnosť. Predpokladá sa, že TGFa je hlavným rastovým faktorom nadprodukovaným u psoriázy, pretože u 50% transgenných myší, ktoré nadmerne exprimujú TGFa, vznikne psoriáza. Toto naznačuje, že dobrý inhibítor EGFR signalizácie môže byť použitý ako antipsoriatické činidlo, výhodne, ale ne nezbytne, za lokálnej aplikácie.

V zrovnaní s reverzibilnými inhibítormi tyrozin-kináz sú ireversibilné inhibítory najmä výhodné, pretože môžu byť použité pre predĺženú inhibíciu tyrozin-kináz, ktorá je obmedzená iba normálnou rýchlosťou resyntézy receptorov, ktorá sa označuje tiež ako obrat.

Informácie o úlohe src tyrozin-kináz v biologických procesoch, ktoré súvisia s nádormi a restenózou sú uvedené v nasledujúcich dokumentoch, ktoré sú tu všetky inkorporované ako odkazy.

Benjamín, C.W. and Jones, D.A., Plaetled-Derived Growth Factor Stimulates Growth Factor Receptor Binding Protein-2 Association with Src In Vascular Smooth Muscle Cells, JBC, 1994, 269: 30911-30916;

Kovalenko, M. et al., Selective Plateled-Derived Growth Factor Receptor Kinase Blockers Reverse Cis-transformation, Cancer Res., 1994, 54: 6106-6114;

Schwartz R.S., et al., The Restenosis Paradigm Revisted: An Alternatíve Proposal for Cellular Mechanisms, J. Am. Coli. Cardiol, 1992:20:1284-1293;

Libby P. et al., Cascade Model for Restenosis - A Special Čase of Atherosclerosis Progression, Circulation, 1992;86:47-

52.

Ďalšie informácie o úlohe EGF tyrozin-kináz v biologických procesoch, ktoré súvisia s nádormi a restenózou sú uvedené v nasledujúcich dokumentoch, ktoré sú tu všetky inkorporované ako odkazy.

Jonathan Blay and Morley D. Hollenberg, Heterologous Regulation Of EGF Receptor Function In Cultured Aortic Smooth Muscle Cells, Eur. J. Pharmacol., Mol. Pharmacol. Sect., 1989,-172 (1) : 17.

Informácie o tom, že protilátky k EGF alebo EGFR majú protinádorovú aktivitu, sú uvedené v nasledujúcich dokumentoch, ktoré sú tu všetky inkorporované ako odkazy.

Modjahedi H., Eccles S., Box G., Styles J., Dean C., Immunotherapy Of Human Tumour Xenografts Overexpressing The EGF Receptor With Rat Antibodies That Block Growth FactorReceptor Interaction, Br. J. Cancer, 1993;67:254-261.

Kurachi H., Morishige K.I., Amemiya K., Adachi H., Hirota

K., Miyake A., Tanizawa 0., Importance Of Transfonning Growth Factor Alpha/Epidermal Growth Factor Receptor Autocrine Growth Mechanism In An Ovarian Cancer Celí Line In Vivo, Cancer Res., 1991;51:5956-5959.

Masui H., Moroyama T., Mendelsohn J., Mechanism Of

Antitumor Activity In Mice For Anti-Epidermal Growth Factor

Receptor Monoclonal Antibodies With Different Isotypes, Cancer

Res., 1986;46:5592-5598.

Rodeck U., Herlyn M., Herlyn D., Molthoff C., Atkinson B., Varello M., Steplewski Z., Koprowski H., Tumor Growth Modulation By A Monoclonal Antibody To The Epidermal Growth Factor Receptor: Immunologically Mediated And Effector CellIndependent Effects, Cancer Res., 1987;47:3692-3696.

Guán E., Zhou T., Wang J., Huang P., Táng W., Zhao M., Chen Y., Sun Y., Growth Inhibition Of Human Nasopharyngeal Carcinoma In Athymic Mice By Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies, Internát. J. Celí Clôn., 1989;7:242-256.

Masui H., Kawamoto T., Sato J.D.,

Wolf B.,

Sato G.,

Mendelsohn J.,

Growth Inhibition Of Human Tumor

Cells In

Athymic Mice By Anti-Epidermal Growth Factor

Receptor

Monoclonal Antibodies, Cancer Res. 1984:44:10021007.

Ďalej, nasledujúce dokumenty uvádzajú protinádorovú aktivitu inhibítorov proteín tyrozín-kináz. Tieto dokumenty sú tu uvedené ako odkazy.

Buchdunger E., Trinks U., Mett H., Regenass U., Muller M.,

Meyer T., McGlynn E., Pinna L.A., Traxler P., Lydon N.B. 4,5-Dianilinophthalimide: A Proteín Tyrosine Kinase Inhibítor With Selectivity For The Epidermal Growth Factor Receptor Signál Transduction Pathway And Potent In Vivo Antitumor Activity Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994;91 :2334-2338.

Buchdunger E., Mett H., Trinks U., Regenass U., Muller M., Meyer T., Beilstein P., Wirz B., Schneider P., Traxler P., Lydon N., 4,5-Bis(4-Fluoroanilino)Phthalimide: A Selective

Inhibitor Of The Epidermal Growth Factor Receptor Signál Transduction Pathway With Potent In Vivo Mdd Antitumor Activity, Clinical Cancer Research, 1995;1:813-821.

Zlúčeniny, ktoré sú ireverzibilnými inhibitormi tyrozínkináz, boli popísané v US patentoch č. 5,457,105, 5,475,001, a 5, 409, 930 a v PCT prihláškach č. WO 9519774 a WO 9519970. Zlúčenina podlá predkladaného vynálezu, ktorá je štrukturálne odlišná od inhibitorov tyrozin-kináz popísaných vo vyššie uvedených dokumentoch, je ireverzibilným inhibitorom tyrozinkináz .

PCT prihláška č. PCT/US97/05778 (prihláška č. WO 97/38983), ktorá je tu uvedená ako odkaz, popisuje zlúčeniny, ktoré sú ireversibilnými inhibitormi tyrozin-kináz.

Generický vzorec uvedený v PCT prihláške zahrnuje zlúčeninu N- [4- (3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-chinazolín-6-yl]-akrylamid (tu zlúčeninu 1), ale zlúčenina 1 nie je v PCT prihláške špecificky uvedená.

Zlúčenina 1 má nasledujúcu chemickú štruktúru:

Zlúčenina 1

PCT prihláška popisuje v príklade 21 zlúčeninu N-[4-(3brómfenyl) amino] -7- [3- (4-morfolin) -propoxy] chinazolin-6-yl]-akrylamid, ktorá má nasledujúci chemický vzorec:

Príklad 21

Zlúčenina 1 sa liší od zlúčeniny príkladu 21 v substitúcii fenylového kruhu, ktorý je naviazaný na chinolínovú skupinu prostredníctvom atómu dusíka. Fenylový kruh zlúčeniny 1 je substituovaný v 3-pozícii chlórom a v 4-pozícii fluórom. Naopak, fenylový kruh zlúčeniny príkladu 21 PCT prihlášky (tu príklad 21) je substituovaný iba v 3-pozicii brómom. Ačkoľvek majú tieto dve zlúčeniny podobnú štruktúru, vykazuje zlúčenina 1 prekvapivé a neočakávané vlastnosti in vivo v srovnaní so zlúčeninou príkladu 21 PCT prihlášky.

v niektorých testoch, ale majú výrazne odlišnú aktivitu in vivo.

Podstata vynálezu

Predkládaný vynález poskytuje zlúčeninu N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamid, alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ.

Vynález tiež poskytuje farmaceutický prijateľný prostriedok, ktorý obsahuje N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid.

Vynález tiež zahrnuje spôsob pre liečbu nádorov, pri ktorom je pacientovi s nádorovým ochorením podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamidu.

Ve výhodném karcinóm prsu.	prevedení	spôsobu	liečby	nádorov	je nádorom
Ve výhodnom karcinóm tlstého	prevedení čreva.	spôsobu	liečby	nádorov	je nádorom
Vynález tiež	zahrnuje	spôsob	pre liečbu alebo	prevenciu

restenózy, pri ktorom je pacientovi s restenózou alebo rizikom restenózy podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chl6r-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamidu.

Vynález tiež zahrnuje spôsob pre ireversibilnú inhibíciu tvrozin-kináz, pri ktorom je pacientovi, ktorý potrebuje inhibíciu tyrozín-kináz, podané množstvo N-[4-(3-chlór-410 fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolín-6yl]-akrylamidu inhibujúci tyrozin-kinázy.

Ve výhodnom prevedení spôsobu pre ireverzibilnú inhibíciu tyrozín-kináz je tyrozín-kinázou EGFR.

Ve výhodnom prevedení spôsobu pre ireverzibilnú inhibíciu tyrozín-kináz je tyrozín-kinázou erbB2.

Ve výhodnom prevedení spôsobu pre ireverzibilnú inhibíciu tyrozín-kináz je tyrozín-kinázou erbB4.

Vynález tiež zahrnuje spôsob pre liečbu psoriázy, pri ktorom je pacientovi s psoriázou podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-ylpropoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamidu.

Vynález tiež zahrnuje spôsob pre aterosklerózy, pri ktorom je pacientovi s aterosklerózou podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-ylpropoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamidu.

Vynález tiež zahrnuje spôsob pre liečbu endometriózy, pri ktorom je pacientovi s endometriózou podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamidu.

Vynález tiež zahrnuje spôsob pre inhibíciu sekrecie VEGF, pri ktorom je pacientovi, ktorý potrebuje inhibíciu sekrecie VEGF, podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chlór-4fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-vl-propoxy)-chinazolin-6yl ]-akrylamidu.

Vynález tiež zahrnuje spôsob pre inhibíciu fosforylácie tyrozínu erbB3, pri ktorom je pacientovi, ktorý potrebuje inhibíciu fosforylácie tyrozínu erbB3, podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yľpropoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamidu.

Podrobný popis vynálezu

Predkládaný vynález poskytuje zlúčeninu N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7- (3-morfolín-4-yľpropoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamid (zlúčeninu 1), alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ.

Zlúčenina 1 je ireverzibilný inhibítor tyrozín-kináz, konkrétne EGFR tyrozin-kinázy. Medzi ďalšie tyrozín-kinázy, ktoré môžu byť inhibované zlúčeninou 1, patria FGFR, PDGFR, csrc, erbB2 a erbB4. Terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny 1 môže byť podané pacientovi s nádorom, pacientovi s restenózou alebo s rizikom restenózy, pacientovi s psoriázou, aterosklerózou alebo rizikom aterosklerózy, alebo s endometriózou. Odborníci v obore ľahko identifikujú pacientov s nádorom, restenózou, psoriázou, aterosklerózou alebo endometriózou, alebo pacientov s rizikom restenózy alebo aterosklerózy. Napríklad, pacienti s rizikom restenózy sú pacienti po angioplastike, by-passu alebo transplantácii. Obdobne, medzi pacientov s rizikom vzniku aterosklerózy patria pacienti, ktorí sú obézni, jedia veľa tukov, majú vysoké hladiny cholesterolu alebo majú hypertenziu. Termín pacient označuje zvieratá, ako sú psi, mačky, kravy, ovce, a tiež zahrnuje lidi.

Termín nádorové ochorenie zahrnuje, napríklad, nasledujúce nádory: prsu, vaječníkov, čipku deložného, prostaty, varlat, jícnu, glioblastóm, neuroblastóm, žalúdka, kože (keratoakantóm), pľúc (epidermoidný karcinóm, veľkobunečný karcinóm, adenokarcinóm), kosti, tlstého čreva (adenokarcinóm, adenóm), štítnej žlazy (folikulárny karcinóm, nediferencovaný karcinóm, papilárny karcinóm), seminóm, melanóm, sarkóm, karcinóm močového mechúra, karcinóm pečene a žlčových ciest, karcinóm ľadvín, nádorové ochorenia myeloídneho radu, nádorové ochorenia lymfoídneho radu (Hodgkinova choroba, vlasatobunečná leukémia), nádory dutiny ústnej, pery, jazyka, úst, hltanu, tenkého čreva, tlstého čreva - rekta, mozgu a centrálneho nervového systému a leukémie.

Medzi výhodné nádory, ktoré môžu byť liečené zlúčeninou 1, patrí karcinóm prsu, tlstého čreva, rekta a vaječníkov.

Ďalej, zlúčenina 1 môže byť použitá pre liečbu pacientov, ktorí potrebujú inhibíciu sekrecie vaskulárneho endotelového rastového faktoru (VEGF). Medzi pacienty, ktorí potrebujú inhibíciu sekrecie VEGF patria pacienti s nádormi, diabetickou retinopatiou, reumatoídnou artritídou, psoriázou, restenózou, aterosklerózou, osteoporózou, endometriózou, pacienti pri implantácii embrya alebo pacienti s iným ochorením, pri ktorom hraje úlohu angiogenézia alebo neovaskularizácia.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité pre inhibíciu fosforylácie tyrozínu erbB3. Pacienti, ktorí potrebujú inhibíciu fosforylácie tyrozínu erbB3 sú pacienti, ktorí majú alebo sú rizikoví z hľadiska ochorení uvedených v súvislosti s inhibiciou EGFR a inhibiciou sekrecie VEGF.

Zlúčenina 1 môže byť podaná ľuďom alebo zvieraťom orálne, rektálne, parenterálne (intravenózne, intramuskulárne alebo podkožné), intracisternálne, intrarvaginálne, intraperitoneálne, intravezikálne, lokálne (prášky, masti a alebo kvapky) alebo vo forme bukálnych alebo nasálnych sprejov. Zlúčenina môže byť podaná samostatne alebo ako súčasť farmaceutický prijateľného prostriedku, ktorý obsahuje farmaceutický prijateľné prísady.

Prostriedky vhodné pre parenterálne injekcie môžu obsahovať fyziologicky prijateľné sterilné vodné alebo nevodné roztoky, disperzie, suspenzie alebo emulzie, a sterilné prášky pre rekonštitúciu do sterilných injekčných roztokov alebo disperzií. Príklady vhodných vodných a nevodných nosičov, riedidel, polyoly rozpúšťadiel alebo vehikúl zahrnujú vodu, etanol, (propylénglykol, polyetylénglykol, glycerol a podobne), ich zmesi, rastlinné oleje (ako je olivový olej) a injekčné organické estery, ako je etyloleát. Správna tekutosť môže bvť udržovaná, napríklad, použitím poťahov ako je lecitin, udržovanie vhodnej veľkosti častíc v prípade disperzie a použitím surfaktantov.

Tieto prostriedky môžu tiež obsahovať pomocné činidlá, ako sú konzervačné činidlá, zmáčavé činidlá, emulgačné činidlá a dávkovacie činidlá. Prevencia pôsobenia mikroorganizmov môže byť zaistená rožnými antibakteriálnymi a antimykotickými činidlami, ako sú napríklad parabény, chlórbutanol, fenol, kyselina sorbová a podobne. Môže byť žiadúce použitie činidiel upravujúcich izotonicitu, ako sú napríklad cukry, chlorid sodný a podobne. Predĺžené absorpcie injekčných farmaceutických foriem môže byť dosiahnuté za použitia činidiel odďaľujúcich absorpciu, ako je napríklad monostearan hlinitý a želatína.

Medzi tablety, formách pevné dávkové formy pre orálne podanie patria kapsle, pilulky, prášky a granule. V takých pevných dávkových je aktívna zlúčenina prísadou (alebo nosičom), zmiešaná s aspoň jednou bežnou ako je citrát sodný alebo fosforečnan vápenatý alebo (a) plnivami alebo činidlami zvyšujúcimi objem, ako sú napríklad sacharóza, glukóza, manitol škroby, kremičitá; (b) laktóza, poj ivami, želatína, ako je napríklad polyvinylpyrrolidón, (c) zvlhčovacími činidlami, ako je a kyselina karboxymetylcelulóza, algináty, sacharóza a arabská klovatina;

napríklad glycerol; (d) činidlami podporujúcimi rozpadavosť, agár, uhličitan vápenatý, zemiakový kyselina alginová, niektoré komplexné ako je napríklad agáralebo tapiokový škrob, kremičitany a uhličitan rozpúšťanie, ako je napríklad parafín; (f) činidlami zrychlujúcimi sodný; (e) činidlami spomalujúcimi absorpciu, ako sú napríklad kvartérne činidlami, ako je amóniové zlúčeniny; napríklad (g) zmáčavými alkohol glycetrolmonostearát; (h) alebo bentonit; a (i) talk, stearan horečnatý, alebo ich zmesi.

sodný môžu tieto dávkové formy cetyl i adsorbenty, ako je napríklad kaolín klznými činidlami, ako je napríklad pevné polyetvlénglykolv, lauryl síran V prípade kapslí, tabliet a piluliek obsahovať tiež pufrovacie činidla.

Pevné prostriedky podobného typu môžu byť použité tiež ako náplne kapsli z tuhej alebo mäkkej želatíny, za použitia priesad ako je laktóza alebo mliečny cukor, rovnako ako polyetylénglykoly s vysokou molekulovou hmotnosťou a podobne.

Pevné dávkové formy, ako sú tablety, dražé, kapsle, pilulky a granule môžu byť pripravené s poťahmi alebo obalmi, ako sú enterálne poťahy a iné poťahy známe v obore. Tieto poťahy môžu obsahovať činidla nepriepustná pre svetlo a môžu mať také zloženie, že uvoľňujú aktívnu zlúčeninu v niektorej časti črevného traktu. Príklady prostriedkov pre inkorporáciu aktívnej zložky sú polymerické substancie a vosky. Aktívna zlúčenina môže byť tiež v mikroenkapsuľovanej forme, pokiaľ je to vhodné, tak s jednou alebo viacej z vyššie uvedených priesad.

Kvapalné dávkové formy pre orálne podanie zahrnujú farmaceutický prijateľné emulzie, roztoky, suspenzie, sirupy a elixíry. Kvapalné dávkové formy môžu okrem aktívnej zlúčeniny obsahovať inertné riedidlá bežne používané v obore, ako je voda a iné rozpúšťadlá, solubilizačné činidlá a emulgačné činidlá, ako je napríklad etylalkohol, izopropylalkohol, etylkarbonát, etylacetát, benzylalkohol, benzylbenzoát, propylénglykol, 1,3-butylénglykol, dimetylformamid, oleje, konkrétne olej z bavlníkových semien, podzemnicový olej, kukuričný olej, olivový olej, ricínový olej a sezamový olej, glycerol, tetrahydrofurfurylalkohol, polyetylénglykoly a sorbitanové estery mastných kyselín alebo zmesi týchto substancií, a podobne.

Okrem inertných riedidiel môže prostriedok tiež obsahovať pomocné činidlá, ako sú zmáčavé činidlá, emulgačné alebo suspendačné činidlá, sladidla, chuťové korigens a činidlá upravujúca vôňu prostriedku.

Suspenzia môže okrem aktívnej zlúčeniny obsahovať suspendačné činidlá, ako sú napríklad etoxylované izostearylalkoholy, polyoxyetvlénsorbitan a sorbitanové estery, mikrokryštalická celulóza, metahydroxid hlinitý, bentonit, agár-agár a tragant, alebo zmesi týchto substancii a podobne.

Prostriedky pre rektálne podanie sú výhodne čipky, ktoré môžu byť pripravené zmiešaním zlúčenín podía predkladaného vynálezu s vhodnými nedráždivými priesadami alebo nosičmi, ako je kakaové maslo, polyetylénglykol alebo čipkový vosk, ktoré sú pevné pri teplote miestnosti, ale kvapalné pri telesnej teplote a preto sa topia v rekte alebo vagíne a uvoľňujú aktívnu zložku.

Medzi dávkové formy pre lokálne podanie patria masti, prášky, spreje a inhalačné prostriedky. Aktívna zložka sa zmieša za sterilných podmienok s fyziologicky prijateľným nosičom a akýmkoľvek konzervačným činidlom, pufrom alebo hnacím plynom, ktoré sú potrebné. Oftalmologické prostriedky, očné masti, prášky a roztoky tiež spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.

Termín farmaceutický prijateľné soli, estery, amidy a proliečiva, ako je tu použitý, označuje tie karboxylatové soli, adičné soli s aminokyselinami, estery, amidy a proliečiva zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu, ktoré sú podľa lekárskych znalosti vhodné pre použitie v kontakte s tkanivami pacienta bez nežiadúcej toxicity, dráždenia, alergické reakcie a podobne, s prijateľným pomerom prínos/riziko, a účinné pre požadované použitie, rovnako ako formy zlúčenín podľa predkladaného vynálezu tvorené obojetnými iónmi. Termín soli označuje relatívne netoxické adičné soli zlúčenín podľa predkladaného vynálezu s organickými a anorganickými kyselinami. Tieto soli môžu byť pripravené in situ počas konečnej izolácie a prečistenie zlúčeniny alebo samostatne reakciou prečistené zlúčeniny vo forme voľnej bázy s vhodnou organickou alebo anorganickou kyselinou a izoláciou takto vzniklej soli. Príklady soli je hydrochlorid, hvdrobromid, síran, kvselý síran, dusičnan, octan, šťavelan, valerát, oleát, palmitát, stearát, laurát, boritan, benzoát, laktát, fosforečnan, tosylát, citrát, maleinan, fumarát, jantaran, vinan, naftylát, mesylát, glukoheptanoát, laktobionát a laurysiran a podobne. Tieto soli môžu obsahovať katióny alkalických kovov a kovov alkalických zemín, ako je sodík, lítium, draslík, vápnik, horčík a podobne, rovnako ako netoxické amóniové, kvartérne amóniové a aminové katióny vrátane napríklad amónia, tetrametylamónia, tetraetylamónia, metylamínu, dimetylamínu, trimetylamínu, trietylamínu, etylamínu a podobne (viď napríklad S.M. Berge et al., Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci. 1977; 66: 1-19, ktorá je tu uvedená ako odkaz).

Príklady farmaceutický prijateľných, netoxických esterov zlúčenín podľa predkladaného vynálezu zahrnujú Ci-C^alkyl estery, kde alkylová skupina má priamy alebo rozvetvený reťazec. Prijateľnými estermi sú tiež CE-CMcykloalkyl estery, rovnako ako arylalkyl estery, ako napríklad benzyl estery. Výhodné sú C--Cjalkyl estery. Estery zlúčenín podlá predkladaného vynálezu môžu byť pripravené bežnými technikami.

Príklady farmaceutický prijateľných, netoxických amidových zlúčenín podľa predkladaného vynálezu zahrnujú amidy odvodené od amoniaku, primárnych O-Cr.alkylaminov a sekundárnych CjCsdialkylamínov, kde alkylová skupina má priamy alebo rozvetvený reťazec. V prípade sekundárnych amínov môže byť amín tiež vo forme 5- alebo 6-článkového heterocyklu obsahujúceho jeden atóm dusíka. Výhodné sú amidy odvodené od amoniaku, primárnych Ci-C₃alkylaminov a sekundárnych CjC'dialkylamínov. Amidy zlúčenín podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené bežnými metódami.

Termín proliečivo označuje zlúčeniny, ktoré sú rýchlo transformované in vivo za vzniku pôvodnej zlúčeniny vyššie uvedeného vzorca, napríklad hydrolýzou v krvi. Podrobnosti týkajúce sa proliečiv sú uvedené v T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, zväzok 14 A.C.S. Symposium Šerieš, a v Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward, B. Roche, Američan Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.

Zlúčenina podlá predkladaného vynálezu môže byť podaná pacientovi v dávke v rozmedzí od približne 0,1 do približne 1000 mg na deň. Pre normálneho ľudského dospelého jedinca o telesnej hmotnosti približné 70 kg je dostatočná dávka v rozmedzí od približne 0,01 do približne 100 mg na kg telesnej hmotnosti na deň. Presná použitá dávka môže byť, ale však, rôzna. Dávka závisí na rožných faktoroch, ako sú požiadavky pacienta, závažnosť liečeného ochorenia a farmakologická aktivita použitej zlúčeniny. Stanovenie optimálných dávok pre jednotlivé pacienty je dobre známe odborníkom v obore.

Zlúčeniny podľa predkládaného vynálezu môžu existovať ako nerozpustené formy, rovnako ako formy rozpustené vo farmaceutický prijateľných rozpúšťadloch, ako je voda, etanol a podobne. Obecne, rozpustené formy sú pre účely predkladaného vynálezu považované za rovnocenné nerozpusteným formám.

Predpokladá sa, že zlúčenina 1 môže byť produkovaná synteticky rovnako ako biologicky, napríklad metabolický.

Nasledujúce príklady ilustrujú jednotlivé prevedenia vynálezu a nijako neobmedzujú predkladaný vynález, vrátane patentových nárokov.

Príklady prevedenia vynálezu

Zlúčenina 1 môže byť syntetizovaná nasledujúcim spôsobom:

N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid

Stupeň A: N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenyl)amino]-7-fluór-6-nitrochinazolin

Práškový 4-chlór~7-fluór-6-nitrochinazolín (J. Med. Chem. 1996; 39: 918) (82,77 g, 363,7 mmol) sa pridá po dávkach počas minút k mechanicky miešanému roztoku 3-chlór-4-fluoranilinu (53, 183 g, 365, 3 mmol) a N,N-dimetylanilínu (88,5 g, 730 mmol) v izopropanolu (1,09 1) pod atmosférou dusíka v ľadovej lázni. Ľadová lázeň sa odstráni na konci pridávania a zmes sa mieša pri teplote 25°C po dobu 6 hodín. Zmes sa potom znovu ochladí na ľadovej lázni a po kvapkách sa za miešania pridá voda (200 ml) a potom vodný roztok Na<Ch (10% hmôt./ob j., 200 ml). Po ďalších 10 minútach sa zmes prefiltruje cez Buchnerovov lievik a reziduálna pevná látka sa vypláchne riedeným roztokom NaHCO-, (nasyteným/5, 2 x 100 ml), vodou (2 x 100 ml) a izopropanolom (2 x 100 ml) . Zmes sa suší vzduchom a potom sa suší vo vákuovej piecke cez Ρ.Ό- pri 75 *-C po dobu 12 hodín za zisku 4[(3-chlór-4-fluorofenyl)amino]- 7-fluór-6-nitrochinazolínu (110,71 g, 90,4%) vo forme horčicovo žltej pevnej substancie. ¹H NMP (DMSO-d_:) : δ 10,44 (s, 1 H, NH), 9,51 (d, J= 8,0 Hz, 1 H, H-5), 8,67 (s, 1 H, H-2), 8,07 (dd, J= 2,7, 6,8 Hz, 1 H, H-2’), 7,79 (d, J= 12,4 Hz, 1 H, H-8),

7,74 (ddd, J= 2,7, 4,2, 9,0 Hz, 1 H, H-6'), 7,43 (t, J= 9,2 Hz, 1 H, H-5').

Stupeň B: 4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3-(420

-morfolín)propoxy]-6-nitrochinazolin

Roztok trimetylsilanolátu draselného (57,73 g, 0,45 mol) v dimetylsulfoxidu (DMSO) (150 ml) sa po kvapkách pridá počas 50 minút do svetlo žltej kaše 4-[ (3-chlór-4-fluorofenyl)amino]-7-fluór-6-nitrochinazolinu (50,503 g, 150 mmol) a 3—(4— -morfolín)propán-l-olu (32, 67 g, 225 mmol) v DMSO (250 ml), miešanej dôkladne pod N pri 25 °C vo vodnej lázni. Ihneď vznikne tmavo červené sfarbenie a na konci adície vznikne tmavo červeno-čierna viskózna zmes. Po 6 hodinách sa reakčná zmes pomalú naleje na miešaný lad-vodu (4 1) obsahujúci nasýtený roztok Na?COi (150 ml). Po stániu po dobu 13 hodín sa oranžovo-červená kaša získa Buchnerovou filtráciou. Zrazenina sa vypláchne riedeným roztokom NaOH (0,05 M, 500 ml; 0,02 M, 500 ml), riedeným roztokom NaHCCh (nasýteným/5, 500 ml) a vodou (2 x 500 ml) a suší sa vzduchom a potom sa suší vo vákuovej piecke cez P-O-. pri 50 ”c po dobu 12 hodín za zisku 4—[(3— chlór-4-fluórfenyl)amino1-7-[3-(4-morfolín)propoxy]-6nitrochinazolínu (62,47 g, 89% korigovaný) vo forme svetiel oranžovo-žltej pevnej látky. ^:H NMR (DMSO-d ) : δ 10,11 (s, 1 H, NH) , 9,18(s,

H, H-5), 8,65 (s, 1 H, H-2), 8,15 ( dd, J = 2,4, 6,8 Hz, 1

H, H—2'), 7,79 (ddd, J = 2,7 , 4,3, 9,0 Hz, 1 H, H-6'), 7,45 (t, J = 9,0 Hz, 1 H, H-5'), 7,44 (s, 1 H, H-8) , 4,32 (t,J=

6,1 Hz, ArOCH') , 3,57 (J= 4,5 Hz, 4 H, H-2 morfolín), 2,45(t,

J = 6,5 Hz, 2 H, NCHJ, 2,34 (brs, 4 H, H-3 morfolín), 1,93 (pentet, J= 6,5 Hz, 2 H, H-2 propoxy).

Stupeň C: 6-amino-4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]chinazolín

Roztok 4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-í 3(4-morfolin)propoxy]-6-nitrochinazolinu (62,9 g, 136,2 mmol) v tetrahydrofuráne (THF) (1200 ml) sa hydrogenuje cez Raneyho nikel (20 g) pri 50 psi a 23°C po dobu 17,67 hodín. Pridá sa ďalší Raneyho nikel (20 g) a zmes sa hydrogenuje po dobu ďalších 4,33 hodín za rovnakých podmienok. Reakčná zmes sa prefiltruje cez celit a rozpúšťadlo sa odparí za redukovaného tlaku za zisku 6-amino-4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)-amino]-7-[3(4-morfolín)propoxy]chinazolínu (57,81 g, 97,6% korigovaný) vo forme svetlo zeleného pevného materiálu. ^XH NMR (DMSO-ds) : δ 9,40 (s, 1 H, NH), 8,38 (s, 1 H, H-2) , 8,20 (dd,

J = 2,5, 7,0 Hz, 1 H, H-2'), 7,79 ( ddd, J= 2,5, 4,5, 9,0 Hz, 1 H, H-6'), 7,40 (s, 1 H, H-5) , 7,40 (t, J= 9,1 Hz, 1 H, H5'), 7,08 (s, 1 H, H-8), 5,38 (brs, NH-J, 4,19 (t, J= 6,1 Hz, ArOCH-J , 3,58 (t, J= 4,4 Hz, 4 H, H-2 morfolin) , 2,49 (t, J= 7,0 Hz, 2 H, NCH·') , 2,36 (brs, 4 H, H-3 morfolin), 1,97 (pentet, J = 6,5 Hz, 2 H, H-2 propoxy).

Stupeň D: N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolín-6-yl]-akrylamid

Izobutylchlorformiát (27,2 g, 0,20 mol) sa po kvapkách pridá počas 10 minút do roztoku kyseliny akrylovej (14,40 g, 0,20 mol) a trietylamínu (40,48 g, 0,40 mol) v THF (800 ml) miešaného pod dusíkom pri O°C. Po ďalších 10 minútach sa biela kaša prenesie do chladiacej lázne o teplote -25°C a mieša sa pod dusíkom po dobu 20 minút. Po kvapkách sa počas 1,33 hodiny pridá 6-amino-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]chinazolin (43,19 g, 0,100 mol) v THF (500 ml). Teplota chladiacej lázne sa upraví na -20°C, a po ďalších 2,33 hodinách sa reakcia utlmi pridaním vody (100 ml) v jednom podiele. Po 20 minútach sa reakčná zmes vnesie na drcaný lad (2 kg) , vieri sa a postupne sa riedi vodou (5 1) . Zmes se nechá odstáť po dobu 16 hodín a potom sa filtruje cez Buchnerov lievik. Zrazenina sa vypláchne vodou (2x11), suší sa vzduchom po dobu 18 hodín a potom sa suší ve vákuovej piecke cez P-0₃ pri 60 °C po dobu 16 hodín za zisku surového N[4 - [ (3-chlór-4-fluórfenyl) -amino] -7- [3- (4-morfolín) propoxy] chinazolín-6-yl]-akrylamidu (35,76 g, 73% nekorigovaný) vo forme zeleno-žltého pevného materiálu. Z pôvodnej kvapaliny sa vyzráža ďalší pevný materiál, ktorý sa filtruje cez Buchnerov lievik, premyje sa vodou (1 1) a suší se vzduchom po dobu 14 hodín za zisku ďalšieho surového materiálu (4,73 g, 10% nekorigovaný) vo forme zeleno-žltého pevného materiálu. Rekryštalizáciou tohto materiálu z DMSO sa získa naspäť 55% tohto materiálu vo forme svetlo žltého - khaki čiastočného hydrátu. 1.1. 186, 5-188, 5 °C. Vypočítané pre C->^H'tN-O3ClF. 0, 85

HO: C, 57,61; H, 5,37; N, 13,97%. Zistené: C, 57,51; H, 5,26; N, 13,88%. ’*H NMR (DMSO-d ) : δ 9,81 (s, 1 H, NH) , 9,63 (s, 1 H, NH), 8,87 (s, 1 H, H-S), 8,54 (s, 1 H, H-2), 8,15 (dd, J= 2,5, 7,0, 1 H, H-2’), 7,81 (ddd, J= 2,7, 4,4, 9,0 Hz, 1 H, H-6’), 7,43 (t, J= 9,1 Hz, 1 H, H-5'), 7,30 (s, 1 H, H-8), 6,72 (dd, J= 10,1, 17,0 Hz, 1 H, H-2 akryloyl), 6,32 (d, J= 9, 17,0 Hz,

H, H-3 akryloyl), 5,83 (dd, J= 1,9, 10,1, Hz, 1 H, H-3 akryloyl), 4,27 (t, J= 6,2 Hz, ArOCH), 3,58 (t, J= 4,4 Hz, 4

H, H-2 morfolín), 2,48 (t, J= 7,1 Hz, 2 H, NCH ) . 2,36 (brs, 4 H, H-3 morfolín), 2,00 (pentet, J = 6,5 Hz, 2 H, H-2 propoxy). Hmotnostné spektrum APCI 489,2 (9), 488,2 (35), 487,2 (26),

486,2 (100).

Zlúčenina príkladu 21 PCT prihlášky č. PCT/US97/05778 môže byť syntetizovaná následujúcim spôsobom:

Zlúčenina príkladu 21: N-[4-(3-brómfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxvlchinazolin-6-yl]akrylamid

Sodík (27,6 mmol, 0,63 g) sa pridá do roztoku 3morfolínpropán-l-olu (22,0 mmol, 3,20 g) v THF (60 ml) pod atmosférou Nr. Vzniklá suspenzia sa mieša pri 20 °C a potom sa kanylou pridá do roztoku 4-[(3-brómfenyl)amino]-7-fluór-6-nitro-chinazolinu (J. Med. Chem.. 1996(39):918) (2.0 g, 5,51 mmol) v THF (50 ml) pod atmosférou N_?. Roztok sa potom zohrieva pri teplote spätného toku po dobu 24 hodín a potom sa nariedi vodou a extrahuje sa EtOAc. Kombinované organické extrakty sa sušia cez bezvodný Na?SO₄, zahustia sa za redukovaného tlaku a spracujú sa chromatografiou na oxidu hlinitom za elúcie EtOAc/hexánom (1:1) až MeOH/CH_?Cl₂/EtOAc (2:3:5) za zisku 4 [(3-brómfenyl)-amino]-7-[(3-morfolín)propoxy]-6nitrochinazolinu

1,75 g, 65%) vo forme svetlo žltého prášku,

t.t.

(MeOH)

216-220°C. ³H NMR [(CDJ-S0]: δ 10,12 (s, IH, NH) ,

9,24 (s~ IH, aromatický), 8,69 (s, IH, aromatický), 8,19 (t, J

1,8

Hz, 1

H, H-2'

H-6'), 7,49 (S, IH,

5'), 7,34 (dt, J.i

6,2 Hz, 2H, CH’CH-CHO) , morfolínmetylén), 2,45 (t, J aromatický)

8,1 Hz, Jr ), 7,88 (dt,

ld	= 7,8	Hz	, J = 1,4 Hz,
, 7,	38 (t,	J	= 8,0 Hz, IH
1,4	Hz, 1	H,	H-4'), 4,35 (
3, 58	(t,	J	= 4,6 Hz,
7,0	Hz,	2H,	NCH CH<H^) ,

2, 37

6, 6

J

Hz,

IH,

4H, , H1,94 (kvintet, t, J (br s, 4H, morfolínmetylén),

2H,

CH-CH'CH ) .

^:?C NMP: δ 157,76,

157,26, 1 53, 76,

153, 21,

140,32,

138,86,

130, 37, 126,38, 124,26, 121,70,

121,13,

120,72,

110,11,

107,88, 67,87, 66,13 (x2), 54,42, 53,28 (x2), 25,30.

Analýza vypočítaná pre C-iH—BrN^Oi. 0, 7 5 H-0 vyžaduje:

C, 50,3; H,

4,7; N,

14,0¾.

Zistené: C, 50,3; H,

4,4; N,

13,8¾.

Čerstvo premytý (IN HC1 a potom destilovaná HO) železný prášok (12 mmol, 0,686 g) sa po častiach pridá do refluxujúceho roztoku vyššie uvedeného nitrochinazolínu (1,50 q, 3,07 mmol) v EtOH/H-O (2:1, 80 ml), ktorý obsahuje ľadovú kyselinu octovú. Vzniklá suspenzia sa zohrieva pri teplote spätného toku za dôkladného miešania po dobu 20 minút a potom sa ochladí, alkalizuje sa pridaním koncentrovaného NH_X a prefiltruje sa cez vrstvu celitu. Celitová vrstva sa premyje EtOH a potom sa filtrát zahusti za redukovaného tlaku, riedi sa vodou a extrahuje sa EtOAc. Kombinované organické extrakty sa sušia cez bezvodný Na,SO₄, zahustia sa za redukovaného tlaku a spracujú sa chromatografiou na oxidu hlinitom gráde III za elúcie CH?Cl?/EtOAc (1:1) až MeOH/EtOAc (2:98) za zisku 6amino-4-[(3-brómfenyl)-amino]-7-[(3morfolín)propyloxy]chinazolinu (1,08 g, 77%) ve forme svetlo hnedého prášku, t.t. (EtOAc/hexán) 158-160 °C.

^:H NMR [(CD.).-SO), (400 MHZ): δ 9,37 (s, 1H, NH) , 8,40 (s, 1H, aromatický), 8,24 (t, J = 1,9 Hz, 1H,

H-2'),

7,86 (ddd, J =

8,2,

0,8, 1,8 Hz, 1H, H-6'), 7,42 (s,

1H, aromatický),

7, 30 (t, J = 8,1 Hz,

1,0, 1,9 Hz, 1

H, H-4'), 7,09 (s, 1H, aromatický), 5,36 (s, 2H, ΝΗΌ , 4,20 (t,

J = 6,2 Hz, 2H, CHCHCHO), 3,59 (t, J = 4,6 Hz, 4H, morfolin metylén), 2,50 (t, J = 7,3 Hz, 2H, NCHCHCHJ, 2,39 (br s, 4H, morfolinmetylén), 1,99 (kvintet, J= 6,7 Hz, 2H, CH-CH-.CH··) .

^:jC NMR: δ 154,88, 151,94, 150,19, 144,84, 141,94, 138, 50,

130, 16, 124,66, 123,02, 121,09, 119,65, 110, 42, 106,37, 100,81, 66,45, 66, 14 (x2) , 54,77, 53,29(x2), 25, 50.

Analýza vypočítaná pre C--H :BrN=Cl·. 0, 25 H O vyžaduje:

C, 54,5; H, 5,3; N, 15,1%.

Zistené: C, 54,6; H, 5,5; N, 15,0%.

Do miešaného roztoku vyššie uvedeného 6-amino-chinazolínu (0,50 g, 1,09 mmol), kyseliny akrylovej (6 mol, 6,54 mmol, 449 μΐ) a EtiN (nadbytku, 2,0 ml) v DMF (20 ml) pod atmosférou N sa pridá 1-(3-dimetyl-aminopropyl)-3-etvlkarbodiimid, hvdrochlorid (EDC1.HC1) (3 mol, 3,27 mmol, 627 mg). Reakčná zmes sa mieša pri 0 Ό po dobu 15 minút a potom sa nechá zohriať na teplotu miestnosti a mieša se po dobu ďalších 2 hodín. Rozpúšťadlo sa odstráni za redukovaného tlaku a získaný zvyšok sa nariedi nasýteným roztokom NaHCO.i a opakovane sa extrahuje EtOAc. Kombinované organické extrakty sa premyjú solankou, sušia sa cez bezvodný Na2SO< a zahustia sa za redukovaného tlaku. Po chromatografii na oxidu hlinitém gráde III za elúcie EtOAc/hexán (9:1) až MeOH/EtOAc (2:98) sa získa

N-[4-[(3-brómfenyl)amino]-7-[(3-morfolín)propyloxy]-chinazolin-6—yl]akrylamid (329 mg, 59%) vo forme krémovo (EtOAc/EtoO/hexán) 170-172°C.

sfarbeného prášku, t.t.

^XH NMR f (CDa)rSO]: δ 9,78 (s, 1H, CONH) , 9,62 (s, 1H,

NH) ,

8, 89

(s, 1H, aromatický),

1,9 Hz, 1H, H-2' ) , 7

J = 8,1 Hz, 1H, H-5'

= 7, 9, 1,4, 0,8 Hz,

1H, ) ,

8,56 (s, 1H, aromatický), 8,18 ,88 (br d, J = 8,2 Hz, 1H, H-6') (t, J , 7,34 (t,

7,30 (s, 1H, aromatický), 7,27 (ddd, J

H-4’), 6,72 (dd,

J = 17,0, 10,2 Hz,

1H, CHCHCO) , 6,33 (dd,

J = 17,0, 1,9 Hz,

1H, CH<HCO), 5,83 (dd, J = 10,2, 1,9 Hz,

1H, CH,CHCO) ,

4,27 (t, J = 6,3 Hz; 2H,

CHCHCHO), 3,58 (t, J = 4,6 Hz, 4H, morfolínmetylén), 2,48 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH->CH->CH-) , 2,38 (br s, 4H, morfolinmetylén), 1,99 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH CH'CH·») .

¹³C NMR: δ 163,49, 156,68, 154,96, 153,92, 149,19, 141,20,

131,58, 130, 19, 127, 16, 126,95, 125, 52, 123, 97, 121,03,

120, 52, 116, 78, 108, 80, 107, 28, 66, 96, 66, 14 (x2), 54,54,

53,28 (x2), 25,31.

Analýza vypočítaná pre ΟιΗ-^ΒγΝ^Ο. 0, 5 H-0 vyžaduje:

C, 55,3; H, 5,2; N, 13,4%.

Zistené: C, 55,3; H, 4,9; N, 13,3%.

Srovnávacie testy

Tkanivová kultúra

Α431 ľudské bunky epidermoidného karcinómu a MDA-MB-453 bunky boli získané z Američan Type Culture Collection, Rockville, MD a boli uchovávané ako monovrstvy v DMEM (Dulbeccove modifikovanom Eaglove médiu)/FT2, 50:50 (Gibco/BRL, Bethesda, MD) obsahujúcom 10¾ fetálne hovädzie sérum. Bunky boli kultivované pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% CO? vo vzduchu.

Prečistenie tyrozín-kinázy receptoru pre epidermálny rastový faktor

Ľudská tyrozin-kináza receptoru pre EGF (EGFR) bola izolovaná z A431 buniek ľudského epidermoidného karcinómu nasledujúcim spôsobom. Bunky boli kultivované ve valcovitých skúmavkách v DMEM/F12 médiu (G.ibco/BRL, Bethesda, MD) obsahujúcom 10° fetálné teľacie sérum. Približné 10^q buniek bolo lyzované v 2 objemoch pufra obsahujúceho 20 mM Hepes, pH 7,4, 5 mM EGTA, 1° Tritónu X-100, 10% glycerolu, 0,1 mM ortovanadatanu sodného, 5 mM fluoridu sodného, 4 mM pyrofosforečnanu, 4mM benzamidu, 1 mM DTT, 80 μα/ml aprotininu, 40 μς/ιηΐ leupeptidu a 1 mM fenylmetylsulfonylfluoridu (PMSF) . Po odstredení pri 25000 x g po dobu 10 minút sa supernatant aplikoval do fast Q sepharózovej kolóny (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) a eluoval sa lineárnym gradientom od 0,1 M NaCl do 0,4 M NaCl v 50 mM Hepes, 10% glycerolu, pH 7,4. Enzymaticky aktívne frakcie sa zhromáždili, rozdelili sa do podielov a uskladnili sa pri -100 ^cC. Tyrozín-kinázy receptoru pre fibroblastový rastový faktor (FGFR), trombocytárny rastový faktor (PDGF), inzulín a c-src sa získali spôsobmi dobre známymi odborníkom v obore. Viď napríklad Fry et al., Strategies For The Discovery Of Novel Tyrosine Kinase Inhibitors With Anticancer Activity, Anticancer Drua Desian, 1994; 9: 331-351, ktorá je tu uvedená ako odkaz.

Tyrozín-kinázové testy

Enzýmové testy pre stanovenie ICsn boli prevedené v 96jamkových filtračných platňách (Millipore MADVN6550, Millipore, Bedford, MA). Celkový objem bol 0,1 ml a obsahoval 20 mM Hepes, pH 7,4, 50 μΜ vanadatu sodného, 40 mM chloridu horečnatého, 10 j.iM ATP obsahujúci 0,5 nCi [³²P]ATP, 20 ng kyseliny polyglutamovej/tyrozínu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , 10 ng tyrozín kinázy receptoru pre EGF, a vhodné riedenie inhibítoru. Všetky zložky okrem ATP sa pridali do jamky a platňa sa inkubovala za trasenia po dobu 10 minút pri 25 °C. Reakcia sa zahájila pridaním [³²P]ATP a platňa sa inkubovala pri 25 ^UC po dobu 10 minút. Reakcia sa ukončila pridaním 0,1 ml 20% kyseliny trichlóroctovej (TCA). Platňa sa ponechala pri teplote 4 °C po dobu aspoň 15 minút, aby sa umožnilo vyzrážanie substrátu. Jamky sa potom premyli 5-krát 0,2 ml 10% TCA a inkorporácia ^J P sa určila β-čítačkou plátien (Wallac). Testy využívajúce intracelulárnych kinázových domén PDGF, FGF a inzulínových receptorov, rovnako ako c-src, boli prevedené rovnako ako pre EGF receptor s tou výnimkou, že reakcie sa účastnil chlorid manaanatý.

Testy fosforylácie tyrozínu závislé na Heregulínu a EGF

A431 bunky ludského epidermoidneho karcinómu alebo MDA-MB453 bunky sa kultivovali v 6-jamkových platňách do približne 80% konfluencie a potom sa inkubovali v bezsérovom médiu po dobu 18 hodín. Bunky sa vystavili pôsobeniu rôznych koncentrácií buď zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny príkladu 21 po dobu 2 hodín a potom sa stimulovali buď 100 ηα/ml EGF (A431) alebo 10 ng/ml heregulínu (MDA-MB-453) po dobu 5 minút. Pripravili sa bunečné extrakty a westernovým prenosom sa určila redukcia fosfotyrozínu.

Westernový prenos

Extrakty sa pripravili lýzou monovrstiev vo 0,2 ml variaceho Laemliho pufre (2% dodecylsiran sodný, 5% βmerkaptoetanol, 10% glycerol a 50 mM Tris, pH 6,8) a lyzáty sa zohrievaly po dobu 5 minút pri teplote 100 °C. Proteiny v lyzátu sa separovali elektroforézou na polyakrylamidovom géle a elektroforeticky sa preniesli na nitrocelulózu. Membrána sa premyla jednou v (10 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01% azid sodný) (TNA) a blokovala sa cez noc v TNA obsahujúcom 5% hovädzí sérový albumín a 1% ovalbumín. Membrána sa spracovávala po dobu 2 hodín antifosfotyrozínovou protilátkou (UBI, Lake Placid, NY, 1 gg/ml v blokovacom pufre) a potom se dvakrát premyla v TNA, jednou v TNA obsahujúcom 0,05% Tween-20 a 0,05% nonidet P-40 a dvakrát v TNA. Membrány sa potom inkubovali po dobu 2 hodín v blokovacom pufre obsahujúcom 0,1 nCi/ml [^12dI] proteínu A a potom sa znovu premyli rovnakým spôsobom ako skoršie. Potom, čo škvrny uschli, sa vložili do filmovej kazety a exponovali sa na X-AR-róntgenovom filme po dobu 1 až 7 dní. Intenzity pásikov sa určili lazerovým denzitometrom.

Dáta v tabuľke 1 ukazujú, že zlúčenina príkladu 21 a zlúčenina 1 sú približne rovnako aktívne oproti prečistenej tyrozin-kináze EGF receptoru, autofosforylácii receptora sprostredkovanej EGF a fosforylácii tyrozínu sprostredkovanej heregulínom in vitro.

Zlúčenina

IC- (nM) Tvrozin-kinázy receptora pre

IC-· (nM) autofosforvlácia receptora

T ^{r 1} r.M) fosforyláceia tyrozínu

	EGF	sprostredkovaná EGF	sprostredkovaná heregulínom
Príklad 21	3, 6	5, 3	6,4
Zlúčenina 1	2, 0	2,9	9,0

Test inhibície nádorov in vivo

Ľudský epidermoidny karcinóm A431 bol prepagovaný in vivo sériovou transplantáciou. Tento nádorový model bol vybraný pre tieto štúdie pre známu závislosť rastu na EGF receptore a pre svoju reaktivitu v časnom štádiu na terapii monoklonálnymi protilátkami in vivo. V tomto pokuse boli holým myšiam o hmotnosti 18-22 g implantované podkožné 30 mg fragmenty A431 nádoru do oblasti pravej axily v den 0. Nádory sa nechali narásť do hmotnosti 100-150 mg a v túto dobu sa zvieratá s nádormi náhodne rozdelila a umiestnila sa do liečebných boxov. Zvieratá sa liečila perorálne po dobu 15 nasledujúcich vode. Izetionátové soli môžu byť dní izetionátovou solou zlúčeniny príkladu 21 a zlúčeniny 1 vo pripravené titráciou zlúčeniny do roztoku sa ekvivalentmi

Liečba bola založená na priemernej kyseliny izetiónovej. hmotnosti skupiny.

Kontrolným zviratom bola podaná voda. Pokus sa hodnotil podlá spomalenia rastu nádoru,

T-C, ktorý je definovaný ako rozdiel, v dňoch, v dosiahnutiu hmotnosti 750 mg pre liečené a kontrolné nádory. Dáta môžu byť tiež uvedené ako percento inhibície rastu nádorov, ktoré je definováné ako spomalenie rastu nádorov delené počtom liečebných dávok x 100%. Väčšie spomalenie rastu nádorov a vyššia inhibícia rastu nádoru ukazujú na aktívnejšie zlúčeniny. Štatistická analýza bola prevedená za použitia JMP pre Macintosh (SAS Inštitúte, Inc.,

Carv, NC).

Testovaná zlúčenina	Dávka (mg/kg)	Spomalenie rastu nádoru (dni)	Inhibicia rastu nádoru (%)
Príklad 21	18	18, 4	123
Príklad 21	5	25, 7	171
Zlúčenina 1	18	41,3	275
Zlúčenina 1	5	53,2	355

Hodnoty pre zlúčeninu 1 sú Štatisticky významne odlišné od hodnôt pre zlúčeninu príkladu 21 v čase nutnom pre to, aby jednotlivé nádory dosiahli hmotnosti 750 mg. P < 0,05, študent t-test.

Test na sekreciu VEGF

Predpokladá se, že vaskulárny endotelový rastový faktor (VEGF), ktorý je tiež známy ako faktor cévnej permeability (VPF), je hlavným stimulátorom angiogenézie u väčšiny typov nádorov. Existuje vela induktorov sekrecie VEGF a dvomi najúčinnejšími sú epidermálny rastový faktor (EGF) a transformujúci rastový faktor a, ktoré sú obaja ligandmi pre EGF receptor (EGFR).

Inhibicia sekrecie VEGF vedie k antiangiogénnemu účinku a môže viesť k regresii nádoru, pretože aj čiastočná inhibicia sekrecie VEGF môže viesť k deštrukcii novo vytvorených nezrelých ciev v nádoroch (Benjamín, L.E. and Keshel, E., Conditional switching of VEGF expression in tumors: induction of endotelial celí shedding and regresion of hemangioma-like vessels by VEGF withdrawal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 8761-8766).

Zrovnávali sme dva inhibítory EGFR tyrozín-kinázy, zlúčeninu 1 a zlúčeninu príkladu 21, z hľadiska ich účinku na A4 31 nádorovej bunky. Proti A431 nádorom in vivo má zlúčenina 1 neočekávane vyššiu protinádorovú účinnosť (T-C = 53 dni) ako zlúčenina príkladu 21 (T-C = 26 dní) . Viď test popísaný vyššie. Potom sme hodnotili efekty oboch zlúčenín na sekreciu VEGF v A431. K nášmu prekvapeniu bola zlúčenina 1 lepšia v inhibícii sekrecie VEGF v A431 bunkách in vitro. Pri 0,5 μΜ blokovala zlúčenina 1 sekreciu VEGF stimulovanú EGF alebo TGFa. Naopak, 0,5 μΜ sloučeniny príkladu 21 inhibovalo sekreciu VEGF takmer rovnako, ako 0,1 μΜ zlúčeniny 1. 0,1 μΜ zlúčeniny 1 inhibovalo sekreciu VEGF stimulovanú EGF o 63% a 0,5 μΜ inhibovalo túto sekreciu VEGF stimulovanú EGF o 86%. Naopak, 0,1 μΜ Zlúčeniny príkladu 21 inhibovalo sekreciu VEGF stimulovanú EGF o 48% a 0,5 μΜ zlúčeniny príkladu 21 inhibovalo túto sekreciu VEGF stimulovanú EGF o 57%. Podobné výsledky boli získané za použitia TGFa miesto EGF pre stimuláciu sekrecie VEGF. 0,5 μΜ zlúčeniny 1 inhibovalo sekreciu VEGF stimulovanú TGFa o viacej ako 80%, zatial čo rovnaká koncentrácia zlúčeniny príkladu 21 inhibovala sekreciu VEGF o 57%. Tiež sa zdá, že zlúčenina 1 inhibuje bazálnu sekreciu VEGF v A431 bunkách, zatiaľ čo zlúčenina príkladu 21 nikoľvek.

Metódy

A431 ľudské bunky epidermoídneho karcinómu, získané z

Američan Type Culture Collection,

Rockville,

MD, boli kultivované DMEM/F12 médiu doplnenom

10% fetálnym hovädzím sérom.

Pred pridaním lieku a rastového faktoru sa bunky premy]i trikrát v bezsérovom

DMEM/F12. Bunky sa ošetrovali po dobu 2 hodín uvedenou koncentráciou zlúčeniny alebo zlúčeniny príkladu 1 a potorr. sa pridalo 10 ng/ml buď EGF, alebo TGFa. Po 48 hodinovej inkubácii pri 37 -'c sa médium .32 odstránilo a skladovalo sa zmrazené pri -70 ^LC. VEGF ELISA testy (Intergen, Co., Purchase, NY) sa previedli na vzorkách média podlá návodu výrobca. Výsledky tohto testu sú uvedené následujúcej tabulke.

Ošetrenie	Sekrecia VEGF (pg/10⁵ buniek ± SE)	% Inhi- bícia
Bezsérové médium (SF)	490 ± 32
SF + 0,1 μΜ zlúčeniny 1	280 ± 41	43
SF + 0,5 μΜ zlúčeniny 1	250 ± 46	49
SF + 0,1 μΜ zlúčeniny príkladu 21	600 ± 37	0
SF + 0,5 μΜ zlúčeniny príkladu 21	440 + 110	10
SF + 10 ng/ml EGF	3980 + 85
SF + EGF +0,1 μΜ zlúčeniny 1	1490 ± 180	63
SF + EGF +0,5 μΜ zlúčeniny 1	560 + 29	86
SF í EGF + 0,1 μΜ sl. príkladu 21	2070 ± 160	48
SF J EGF 4 0,5 μΜ sl. príkladu 21	1710 ± 65	57
SF f TGFa	4034 ± 190
SF + TGF + 0,1 μΜ zlúčeniny 1	1976 ± 37	51
SF -t TGF 4 0,5 μΜ zlúčeniny 1	766 ± 75	81
SF 4 TGF 4 0,1 μΜ sl. príkladu 21	3065 ± 161	24
SF 4 TGF + 0,5 μΜ sl. príkladu 21	1734 ± 21	57

pyíff-M

Claims

Patentové nároky

1. Zlúčenina N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid, alebo jej farmaceutický prijateľné soli.
2. Farmaceutický prijateľný prostriedok vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 1.
3. Spôsob liečby nádorov vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 pacientovi s nádorom.
4. Spôsob podľa nároku 3vyznačujúci sa tým, že nádorom je nádor prsu.
5. Spôsob podľa nároku 3vyznačujúci sa tým, že nádorom je nádor tlstého čreva.
6. Spôsob liečby alebo prevencie restenózy vyznačujúc i sa t ý m, že zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 pacientovi s restenózou alebo rizikom restenózy.
7. Spôsob pre ireverzibilnú inhibiciu tyrozin-kináz vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie množstva zlúčeniny podľa nároku 1 inhibujúceho tyrozín-kinázy pacientovi s potrebou inhibicie tyrozin-kináz.
8. Spôsob podľa nároku vyznačujúci sa tým, že tyrozín-kinázou je EGFR.
9. Spôsob podlá nároku 7vyznačujúci sa tým, že tyrozín-kinázou je erbB2.
10. Spôsob podľa nároku 7vyznačujúci sa tým, že tyrozín-kinázou je erbB4.
11. Spôsob pre pro inhibíciu fosforylácie tyrozinu erbB3 vyznačujúci sa tým, že pacientovi, ktorý potrebuje inhibíciu fosforylácie tyrozinu erbB3, je podané terapeuticky účinné množstvo N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamidu.
12 Spôsob liečby psoriázy vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 pacientovi s psoriázou.
13. Spôsob liečby alebo prevencie aterosklerózy vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 pacientovi s aterosklerózou alebo rizikom aterosklerózy.
14. Spôsob liečby endometriózy vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 pacientovi s endometriózou.
15. Spôsob pre inhibíciu sekrecie VEGF vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 pacientovi s potrebou inhibície sekrecie VEGF.