NO319357B1 - N-(4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazolin-6-yl)-akrylamid, en irreversibel inhibitor av tyrosin-kinaser - Google Patents

Description

Oppfinnelsesområde

Denne oppfinnelse vedrører forbindelsen N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid som er en irreversibel inhibitor for tyrosin-kinaser. Denne oppfinnelsen vedrører også anvendelse av denne forbindelsen til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av kreft, aterosklerose, restenose, endometriose og psoriasis og en farmasøytisk blanding som inneholder forbindelsen N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kreft har vært ansett som en sykdom i det intracellulære signalsystem eller signaltransduksjonsmekanisme. Celler får instruksjoner fra mange ekstracellulæ-re kilder som instruerer dem til enten å formere seg eller ikke formere seg. Hen-sikten med signaltransduksjonssystemet er å motta disse og andre signaler på celleoverflaten, få dem inn i cellen og deretter føre signalene videre til kjernen, cytoskjellettet, og transport og proteinsyntese maskineriet.

Den vanligste årsak til kreft er en rekke defekter, enten i disse proteiner når de muteres, eller i reguleringen av mengden av protein i cellen slik at det produse-res for mye eller for lite. Oftest er det nøkkel-lesjoner i cellen som fører til en konstitutiv tilstand hvorved cellekjernen får et signal om å formere seg, når dette signalet faktisk ikke foreligger. Dette kan forekomme gjennom en rekke mekanismer. Noen ganger kan cellen starte å produsere en autentisk vekstfaktor for sine egne reseptorer når den ikke skulle, den såkalte autokrine sløyfemekanisme. Mutasjoner på celleoverflatereseptorene, som normalt signaliserer inn i cellen ved hjelp av tyrosin-kinaser, kan føre til aktivering av kinasen i fravær av ligande, og føre et signal videre som i virkeligheten ikke er der. Alternativt kan mange overfla-te kinaser overuttrykkes på celleoverflaten, som fører til utilsiktet sterk respons på et svakt signal. Det er mange nivåer inne i cellen ved hvilke mutasjon eller overekspresjon kan føre til de samme falske signal i cellen, og det er mange andre typer signaldefekter som er involvert i kreft. Denne oppfinnelsen berører kreft som drives av de tre nettopp beskrevne mekanismer, og som involverer celleoverflate-reseptorer av den epidermale vektsfaktorreseptor tyrosin-kinasefamilie (EGFR). Denne familie består av EGF reseptoren (også kjent som erbB1), erbB2 reseptoren, og dens konstitutive aktive onkoprotein mutant Neu, erbB3 reseptoren, og erbB4 reseptoren. I tillegg kan andre biologiske prosesser som drives gjennom medlemmer av EGF familien av reseptorer også behandles med forbindelser iføl-ge oppfinnelsen beskrevet nedenunder.

EGFR har sine to viktigste ligander epidermal vekstfaktor (EGF) og Transformeringsvekstfaktor alpha (TGFalpha). Reseptorene synes bare å ha små funk-sjoner hos voksne mennesker, men er åpenbart involvert i sykdomsprosessen ved en stor del av alle kreftformer, spesielt tykktarm- og brystkreft. De nær beslektede erbB2 (HER2), erbB3 (HER3), og erbB4 (HER4) har en familie av Hereguliner som sine hovedligander, og reseptor-overekspresjon og mutanter er entydig blitt påvist som hovedrisikofaktoren hos brystkreft med dårlig prognose. I tillegg har det blitt demonstrert at alle fire medlemmer av denne familien av reseptor kan danne heterodimere signalkomplekser med andre medlemmer av familien, og at dette kan føre til synergistisk transformeringskapasitet hvis mer enn ett medlem av familien overuttrykkes i en ondartet kreft. Overekspresjon av flere enn ett familie-medlem har vært vist å være relativt vanlig i ondartet kreft hos mennesker.

I tillegg til kreft er restenose også en sykdom hvori uønsket cellulær formering opptrer. Restenose medfører formering av vaskulære, glatte muskelceller. Restenose er et klinisk hovedproblem i forbindelse med koronær angioplasti og andre medisinske fremgangsmåter. Restenose opptrer generelt innenfor 0 til 6 måneder hos ca. 30% til 50% av pasienter som gjennomgår ballong-angioplasti for å klare tilstoppede koronære arterier i et forsøk på å behandle hjertesykdom som skyldes tilstoppede arterier. Den resulterende restenose forårsaker betydelig pasient-morbiditet og helsevern-omkostninger.

Prosessen restenose igangsettes ved skade på blodkaret, innbefattende arterier og vener, med den etterfølgende frigjøring av trombogene, vasoaktive og mitogene faktorer. Endothelial og dyp-kar skade fører til blodplate-aggregering, trombedannelse, inflammasjon og aktivering av makrofage og glattmuskelceller. Disse hendelser induserer produksjon av og frigjøring av vekstfaktorer og cytoki-ner, som igjen kan bevirke sin egen syntese og frigjøring fra målceller. Således igangsettes en selvdrivende prosess som involvever vekstfaktorer så som EGF, blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) eller fibroblastvekstfaktor (FGFer). Således vil det være nyttig å ha irreversible inhibitorer for signaltransduksjons-veier, spesielt av tyrosin-kinaser som EGF, PDGF, FGF, eller src tyronin kinaser.

Den proliferatiye hudsykdom psoriasis har for tiden ingen god kur. Den behandles ofte med antikreftmidlet så som methotrexat, som har meget alvorlige bivirkninger, og som ikke er meget effektiv, da toksisiteten begrenser doser som skal brukes. Det antas at TGF alpha er hovedvekstfaktoren som overproduseres i psoriasis, da 50% av transgene mus som overuttrykker TGF alpha utviklet psoriasis. Dette tyder på at en god inhibitor for EGFR signalisering kunne anvendes som antipsoriasis-middel, fortrinnsvis men ikke nødvendigvis, ved topisk dosering.

Det er spesielt fordelaktig å ha irreversible tyrosin-kinaseinhibitorer sammenlignet med reversible inhibitorer, fordi irreversible inhibitorer kan anvendes i forlenget undertrykkelse av tyrosin-kinasen, bare begrenset av den normale has-tighet av reseptor resyntese, også kalt turnover.

Informasjon om src tyrosin-kinasenes rolle i biologiske prosesser sammenlignet med kreft og restenose kan finne sted i de følgende dokumenter som alle er inntatt her som referanse.

Benjamin C.W. og Jones D.A., Platelet-Derived Growth Factor Stimulates Growth Factor Receptor Binding Protein-2 Association With Src In Vascular Smooth Muscle Cells, JBC, 1994; 269: 30911-30916.

Kovalenko M., et al., Selective Platelet-Derived Growth Factor Receptor Kinase Blockers Reverse Cis-transformation, Cancer Res, 1994; 54:6106-6114.

Schwartz R.S. et al., The Restenosis Paradigm Revisted: An Alternative Proposal for Cellular Mechanisms, JAm Coll Cardiol. 1992; 20:1284-1293.

Libby P., et al., Cascade Modell for Restenosis - A Special Case of Athero-scleroris Progression, Circulation, 1992; 6:47-52.

Ytterligere informasjon om EGF-tyrosin-kinasenes rolle i biologiske prosesser sammenlignet med kreft og restenose kan finne sted i det følgende dokument som her er inntatt som referanse.

Jonathan Blay and Morley D. Hollenberg, Heterologous Regulation Of EGF Receptor Function In Cultured Aortic Smooth Muscle Cells, Eur J Pharmacol. Mol Pharmacol Sect, 1989; 172 (1):1-7.

Informasjon som viser at antistoffer til EGF eller EGFR viser in vivo antitumor-aktivitet kan finne sted i de følgende dokumenter som her er inntatt som referanse.

Modjtahedi H., Eccles S., Box G, Styles, J., Dean C, Immunotherapy Of Human Tumor Xenografts Overexpressing The EGF Receptor With Rat Antibodies That Block Growth Factor-Receptor Interaction, Br J Cancer, 1993;67:254-261.

Kurachi H., Morishige K.I., Amemiya K., Adachi H„ Hirota K., Miyake A., Tanizawa 0, Importance Of Transforming Growth Factor Alpha/Epidermal Growth Factor Receptor Autocrine Growth Mechanism In An Ovarian Cancer Cell Line In Vivo, Cancer Res, 1991;51:5956-5959.

Masui H., Moroyama T., Mendelsohn J, Mechnism Of Antitumor Activity In Mice For Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies With Dif-ferent Isotypes, Cancer Res. 1986;46:5592-5598.

Rodeck U., Herlyn M., Herlyn D., Molthoff C, Atkinson B., Varello M., Ste-plewski Z., Koprowski H., Tumor Growth Modulation By A Monoclonal Antibody To The Epidermal Growth Factor Receptor: Immunologically Mediated And Effec-tor Cell-lndependent Effects, Cancer Res., 1987;47:3692-3696.

Guan E. Zhou T. Wang J.,Huang P., Tang W., Zhao M., Chen Y., Sun Y., Growth Inhibition Of Human Nasopharyngeal Carcinoma In Athymic Mice By Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies, Internat J Cell Clon, 1989;7:242-256.

Masui H., Kawamoto T., Sato J.D., Wolf B., Sato G., Mendelsohn J., Growth Inhibition Of Human Tumor Cells In Athymic Mice By Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies, Cancer Res. 1984:44:1002-1007.

I tillegg viser de følgende dokumenter antitumor aktivitet til protein tyrosin-kinaseinhibitorer. Dokumentene er her inntatt som referanse.

Buchdunger E., Trinks U., Mett H., Regenass U., Muller M., Meyer T., McGlynn E., Pinna L.A.. Traxler P., Lydon N.B., 4,5-Dianilinophthalimide: A Protein Tyrosin Kinase Inhibitor With Selectivity For the Epidermal Growth Factor Receptor Signal Transduction Pathway And Potent In Vivo Antitumor Activity, Proe Nati Acad Sei, USA, 1994;91:2334-2338.

Buchdunger E., Mett H., Trinks U., Regenass U., Muller M., Meyer T., Beil-stein P., Wirz B. Schneider P,. Traxler P, Lydon N. 4,5-Bis-(4-Fluoroanilino)Phthalimide: A Selective Inhibitor Of the Epidermal Growth Factor Receptor Signal Transduction Pathway With Potent In Vivo Mdd Antitumor Activity, Clinical Cancer Research, 1995; 1:813-821.

Forbindelser som er reversible inhibitorer av tyrosin-kinaser er blitt beskrevet I US Patent nr. 5.457.105, 5.475.001 og 5.409.930 og i PCT publikasjon nr. WO 9519774 og WO 9519970. Den foreliggende beskrevne forbindelse, som er strukturelt forskjellig fra tyrosin-kinaseinhibitorene som er beskrevet i de ovenfor angitte dokumenter, er en irreversibel inhibitor av tyrosin-kinaser.

PCT søknaden nr. PCT/US97/05778 (publikasjonsnr. W097/38983) som her inntas som referanse, beskriver forbindelser som er irreversible inhibitorer av tyrosin-kinaser.

Den generiske formel I presentert i PCT søknaden omfatter forbindelsen N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid (heri "forbindelse 1"), men forbindelse 1 er ikke spesifikt nevnt i PCT-søknaden.

Forbindelse 1 har den følgende kjemiske struktur:

Forbindelse 1

PCT-søknaden beskriver i Eksempel 21 forbindelsen N-[4-(3-bromfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolin)propoksy]kinazonlin-6-yl)-akrylamid som har den følgende kjemiske struktur:

Eksempel 21

Forbindelse 1 skiller seg fra Eksempel 21 ved substitusjonen på fenylringen som er knyttet til kinolingruppen gjennom et nitrogenatom. Fenylringen i Forbindelse 1 er substituert i 3-stilling med klor og i 4-stilling med fluor. Derimot er fenylringen i Eksempel 21 i PCT-søknaden (heri "Eksempel 21") bare substituert i 3-stilling med brom. Selv om disse to forbindelser har lignende struktur, viser Forbindelse 1 overraskende uventede egenskaper in vivo sammenlignet med Eksempel 21 i PCT-søknaden.

Enda mer overraskende og uventet er det at Forbindelse 1 og Eksempel 21 viser lignende in vitro aktivitet i visse målinger, men viser betydelig forskjellig in vivo aktivitet.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelsen N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]akrylamid, eller de farma-søytisk akseptable salter derav.

Videre tilveiebringes en farmasøytisk akseptabel blanding som omfatter N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid.

Videre tilveiebringes anvendelse av N-[4-(3-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av kreft.

I en foretrukket utførelsesform av anvendelsen er kreftformen brystkreft.

I en foretrukket utførelsesform av anvendelsen er kreftformen tykktarms-kreft.

Videre tilveiebringes anvendelse av N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av restenose.

Videre tilveiebringes anvendelse av N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)kinazonlin-6-yl]-akrylamid til fremstilling av et farmasøytisk preparat for irreversibel inhibering av tyrosin-kinaser.

1 en foretrukket utførelsesform av anvendelsen er tyrosin-kinasen EGFR.

I en foretrukket utførelsesform av anvendelsen er tyrosin-kinaser tyrosin-kinasen erbB2.

I en foretrukket utførelsesform av anvendelsen er tyrosin-kinaser tyrosin-kinasen erbB4.

Videre tilveiebringes anvendelse av N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]- akrylamid til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av psoriasis.

Videre tilveiebringes anvendelse av N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av aterosklerose.

Videre tilveiebringes anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av endometriose.

Videre tilveiebringes anvendelse av N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid til fremstilling av et farmasøy-tisk preprat for inhibering av VEGF-sekresjon.

Videre tilveiebringes anvendelse av N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid til fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av tyrosin-fosforylering av erbB3.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelsen N-[4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid (Forbindelse 1), eller de farmasøytisk akseptable salter derav.

Forbindelse 1 er en irreversibel inhibitor av tyrosin-kinaser, spesielt EGFR tyrosin-kinase. Andre tyrosin-kinaser som kan inhiberes med Forbindelse 1 omfatter FGFR, PDGFR, c-src, erbB2 og erbB4. En terapeutisk effektiv mengde av Forbindelse 1 kan administreres til en pasient med kreft, eller en pasient med restenose eller med risiko for å få restenose, eller en pasient med psoriasis, aterosklerose eller med risiko for å få aterosklerose eller endometriose. For fagfolk på området er det lett å identifisere pasienter med kreft, restenose, psoriasis aterosklerose eller endometriose, og pasienter som har risiko for å få restenose eller aterosklerose. For eksempel er pasienter med risiko for å få restenose pasienter som har gjennomgått angioplasti, by-pass eller implantatprosedyrer. Lignende er pasienter med risiko for å utvikle aterosklerose pasienter som er overvektige, spi-ser mat med høyt fett, har høye kolesterolnivåer eller har høyt blodtrykk. Uttrykket "pasient" betyr dyr så som hunder, katter, kuer, sauer og innbefatter også mennesker.

Uttrykket "kreft" innbefatter, men er ikke begrenset til de følgende kreftformer: bryst;

eggstokk;

servix;

prostata;

testikkel;

esofagus;

glioblastoma;

neuroblastoma;

mage;

hud, keratoakantoma;

lunge, epidermoid-karcinom, storcelle-karcinom, adenokarcinom;

ben;

tykktarm, adenokarcinom, adenoma;

bukspyttkjertel, adenokarcinom;

tyroid, follikulær karcinom, ikke-differensiert karcinom, papillær karcinom; . seminoma:

melanoma:

sarcoma:

blærekarcinom;

lever karcinom og gallepassasjer;

nyre karcinom;

myeloide sykdommer;

lymfesykdommer, Hodgkins, hårceller;

bukalrom og svelg (oral), leppe, tunge, munn, svelg;

tynntarm;

tykktarm-rektum, stortarm, rektum;

hjerne og sentralnervesystem; og

leukemi.

Foretrukne kreftformer som Forbindelse 1 kan anvendes for å behandle, omfatter bryst, tykktarm, tykktarm-rektum og eggstokk-kreft.

I tillegg kan Forbindelse 1 brukes til å behandle pasienter med behov for inhibering av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)-sekresjon. Pasienter med behov for inhibering av VEGF-sekresjon omfatter slike som har kreft, diabetisk retinopati, reumatoid artritt, psoriasis, restenose, aterosklerose, osteoporose, endometriose, personer som gjennomgår embryo-implantasjoner, eller personer med andre sykdommer hvori angiogenese eller neovaskularisering spiller en rolle.

Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å inhibere tyrosin-fosfory le ringen av erbB3. Pasienter med behov for inhibering av tyrosin fosforylering av erbB3 er pasienter som har eller risikerer å få sykdommer nevnt heri i forbindelse med inhiberingen av EGFR og inhiberingen av VEGF-sekresjon.

Forbindelsel kan administreres til mennesker og dyr enten oralt, rektalt, parenteralt (intravenøst, intramuskulært eller subkutant), intracistemalt, intravaginalt, intraperitonealt, intravesikalt, lokalt, (pulvere, salver eller dråper) eller som en bukal eller nesespray. Forbindelsene kan administreres alene eller som en del av en farmasøytisk akseptabel blanding som omfatter farmasøytisk akseptable eksipienter.

Blandinger egnet for parenteral injeksjon kan innbefatte fysiologisk akseptable, sterile, vandige eller ikke-vandige løsninger, dispersjoner, suspensjoner eller emulsjoner og sterile pulvere for rekonstrtusjon i sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. Eksempler på egnede vandige og ikke-vandige bærere og fortynningsmidler, løsningsmidler eller bærere omfatter vann, etanol, polyoler (propy-lenglykol, polyetylenglykol, glycerol og lignende), egnede blandinger derav, vege-tabilske oljer (så som olivenolje) og injiserbare organiske estere så som etyloleat. Riktig flyteevne kan opprettholdes, for eksempel ved bruk av et belegg så som lecithin, eller ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelse i dette tilfellet dispersjoner og ved anvendelse av overflateaktive midler.

Disse blandinger kan også inneholde hjelpemidler så som preserverings-, fukte-, emulgerings- og dispergeringsmidler. Forhindring av aktivitet av mikro-organismer kan sikres ved forskjellige antibakterielle og antisopp-midler, for eksempel parabener, klorbutanol, fenol, sorbinsyre og lignende. Det kan også være ønskelig å innta isotone midler, for eksempel sukkere, natriumklorid og lignende. Forlenget absorbsjon av den injiserbare farmasøytiske form kan tilveiebringes ved bruk av midler som forsinker absorbsjon, for eksempel aluminium-monostearat of gelatin.

Faste doseringsformer for oral administrasjon omfatter kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I slike faste doseringsformer blandes den aktive forbindelse med minst én intert vanlig eksipient (eller bærer) så som natriumcitrat eller dikalsiumfosfat eller (a) fyllmidler eller drøyningsmidler, som for eksempel stivelser, laktose, sukrose, glukose, mannitol og kiselsyre ; (b) bindemidler, som for eksempel karboksymetylcellulose, alignater, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sukrose og akasia; (c) fuktighetsbevarende, som for eksempel glycerol; (d) sprengningsmidler som for eksempel agar-agar, kalsiumkarbonat, potet- eller ta-pioka-stivelse, alginsyre, visse komplekse silikater og natriumkarbonat; (e) løs-nings-retarderingsmidler, for eksempel paraffin; (f) absorpsjonsakselleratorer, som for eksempel kvarternære ammoniumforbindelser; (g) f uktemidler, som for eksempel cetylalkohol og glyserolmonostearat; (h) adsorbenter, som for eksempel kaolin og bentonitt; og (i) smøremidler som for eksempel talkum, kalsiumstearat, magnesiumstearat, faste polyetylenglykoler, natriumlaurylsulfat eller blandinger derav. I tilfellet kapsler, tabletter og piller, kan doseringsformene også omfatte buffermidler.

Faste blandinger av en lignende type kan også anvendes som fyllmidler i fyllte myk- og hard-gelatinkapsler ved bruk av slike eksipienter som laktose eller melkesukker, så vel som høymolekylære polyetylenglykoler og lignende.

Faste doseringsformer slik som tabletter, drageer, kapsler, piller og granuler kan fremstilles med belegg og skall, så som enteriske belegg og andre som er velkjente på området. De kan inneholde opasiterende midler, og kan også være av slik sammensetning at de frigjør den aktive forbindelse i en viss del av fordøy-elseskanalen på en forsinket måte. Eksempler på innstøpte blandinger som kan brukes er polymersubstanser og vokser. Den aktive forbindelse kan også foreligge i mikroinnkapslet form om nødvendig med én eller flere av de ovenfor nevnte eksipienter.

Flytende doseringsformer for oral administrering omfatter farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer. I tillegg til den aktive forbindelse kan de flytende doseringsformer inneholde inerte fortynningsmidler som er vanlige å bruke på området så som vann eller andre løsningsmid-ler, solubiliseringsmidler og emulgeringsmidler, som for eksempel etylalkohol, isopropylalkohol, etylkarbonat.etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylen-glykol, 1,3-butylenglykol, dimetylformamid, oljer, spesielt bomullsfrøolje, jordnøtt-olje, maisfrøolje, olivenolje, kastorolje og sesamolje, glycerol, tetrahydrofurfuryl-alkohol, polyetylenglykoler og fettsyreestere av sorbitan eller blandinger av disse substanser eller lignende.

Ved siden av slike inerte fortynningsmidler kan blandingen også inneholde hjelpestoffer så som f uktemidler, emulgerings- og oppslemmingsmidler, søtnings-midler, smaksmidler og parfymeringsmidler.

Suspensjoner kan i tillegg til den aktive forbindelse inneholde oppslemmingsmidler som for eksempel etoksylerte isostearylalkoholer, polyoksyetylen-sorbitol og sorbitan-estere, mikrokrystallinsk cellulose, aluminium-metahydroksyd, bentonitt, agar-agar og tragakant, eller blandinger av slike substanser og lignende.

Blandinger for rektal administrering er fortrinnsvis suppositorer som kan fremstilles ved å blande forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse med egnede, ikke-irriterende eksipienter eller bærere så som kokossmør, polyetylenglykol eller en suppositorievoks, som er faste ved vanlig temperatur, men flytende ved legemstemperatur og derfor smelter i rektum eller vaginalrommet og frigjør den aktive forbindelse.

Doseringsformer for topisk administrering omfatter salver, pulvere, sprayer og inhalasjoner. Den aktive forbindelse blandes under sterile betingelser med en fysiologisk akseptabel bærer og andre preserveringsmidler, buffere eller driv-midler etter behov. Oftalmiske formuleringer, øyesalver, pulvere og løsninger ligger også innenfor omfanget av denne oppfinnelsen.

Uttrykket "farmasøytisk akseptable salter, estere, amider og prodrugs" slik de heri brukes, viser til slike karboksylatsalter, aminosyreaddisjonssalter, estere, amider og prodrugs av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som er innenfor omfanget av sunn medisinsk bedømmelse egnet for bruk i kontakt med vevene til pasienten uten uakseptabel toksisitet, irritasjon, allergisk reaksjon og lignende, i overensstemmelse med et rimelig gevinst/risk-forhold, og effektiv for den tilsiktede bruk, samt Zwitterionformene, hvor mulig, av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Uttrykket "salter" viser til de relativt ikke-toksiske, uorganiske og organiske syreaddisjonssalter av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse salter kan fremstilles in situ under den endelige isolering og rensing av forbindelsen eller ved separat å omsette den rensede forbindelse i sin fri baseform med en egnet organisk eller uorganisk syre og isolere det således dannede salt. Representative salter omfatter hydrobromidet, hydrokloridet, sulfatet, bisulfatet, nitratet, avcetatet, oksalatet, valeratet, oleatet, palmitatet, stearatet, lauratet, bora-tet, benzoatet, laktatet, fosfatet, tosylatet, citratet, maleatet, fumaratet, suksinatet, tartratet, naftylatet, mesylatet, glukoheptonatet, laktobionatet og laurylsulfonatsal-tene, og lignende. Disse kan omfatte kationer basert på alkali- og jordalkali-metallene, så som natrium, litium, kalium, kalsium, magnesium og lignende, samt ikke-toksiske ammonium, kvatemære ammonium og aminkationer, omfattende, men ikke begrenset til ammonium, tetrametylammonium, tetraetyl-ammonium, metylamin, dimetylamin, trimetylamin, trietylamin, etylamin og lignende (se for eksempel S.M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts,", J. Pharm.. Sei., 1977;66:1-19 som er inntatt her som referanse)

Eksempler på farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske estere av forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen omfatter Ci-C6-alkylestere hvori alkylgruppen er en rett eller forgrenet kjede. Akseptable estere innebefatter også C5-C7-cyklo-alkylestere samt arylalkylestere, så som, men ikke begrenset til, benzyl, C1-C4-alkylestere er foretrukket. Estere av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles i henhold til vanlige metoder.

Eksempler på farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske amider av forbindelsen ifølge oppfinnelsen omfatter amider som stammer fra ammoniakk, primære CrCe-alkylaminer og sekundære Ci-C6-dialkylaminer, hvori alkylgruppene er rette eller forgrenede. I tilfellet sekundære aminer, kan aminet også foreligge i form av en 5- eller 6-leddet heterocyklus inneholdende ett nitrogenatom. Amider avledet fra ammoniakk, primære Ci-C3-alkylaminer og sekundære Ci-C2-dialkylaminer er foretrukket. Amider av forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan fremstilles i henhold til vanlige metoder.

Uttrykket "prodrug" viser til forbindelser som raskt overføres in vitro og gir stamforbindelsen med formelen ovenfor, for eksempel ved hydrolyse i blod. En grundig diskusjon er gitt i T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, og i Bioreversible Carriers in Drug Design, utg. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association og Pergamon Press, 1987, som her begge er inntatt som referanse.

Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til en pasient i doseringsnivåer i området ca. 0,1 til ca. 1000 mg/dag. For et normalt, vok-sent menneske med en legemsvekt på ca. 70 kg er en dosering i området ca. 0,01 til ca. 100 mg pr. kg kroppsvekt tilstrekkelig. Den spesifikke anvendte dose kan imidlertid variere. For eksempel kan dosen, avhengig av en rekke faktorer omfattende pasientens behov, graden av tilstanden som behandles og den farmakolo-giske aktiviteten til forbindelsen som anvendes. Bestemmelse av de optimale doser for en spesiell pasient er velkjent for fagmannen på området.

Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan foreligge i både ikke-solvatiserte og solvatiserte former med farmasøytisk akseptable løsningsmidler så som vann, etanol og lignende. Generelt anses de solvatiserte former som ekviva-lente med de ikke-solvatiserte former for formålet med den foreliggende oppfinnelse.

Det tilsiktes at forbindelsen 1 fremstilles enten syntetisk eller fremstilles bio-logisk så som gjennom metabolisme.

De følgende eksempler illustrerer spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen og er ikke ment å begrense beskrivelsen, innbefattet kravene, på noen måte.

EKSEMPLER

Forbindelse 1 kan syntetiseres som følger: N- r4-( 3- klor- 4- fluor- fenylamino)- 7-( 3- morfolin- 4- vl- propoksv)- kinazonlin-

6- vllamid

Trinn A: 4- r( 3- klor- 4- fluorfenvnamino1- 7- fluor- 6- nitrokinazonlin

Pulverisert 4-klor-7-fluor-6-nitrokinazonltn ( J- Med. Chem., 1996; 39:918 (82,77 g, 363,7 mmol) ble satsvis tilsatt gjennom 10 minutter til en meka-nisk rørt løsning av 3-klor-4-fluoranilin (53,183 g, 365,3 mmol) og N,N-dimetylanilin (88,5 g, 730 mmol) i ispopropanol (1,09 I) holdt under nitrogen på et isbad. Isbadet ble fjernet ved slutten av tilsetningen, og blandingen ble rørt ved 25°C i 6 timer. Blandingen ble deretter igjen avkjølt på et isbad, og vann (200 ml) etterfulgt av vandig Na2C03 løsning (10 vekt% vekt/volum, 200 ml) ble tilsatt dråpevis under røring. Etter 10 minutter til, ble blandingen filtrert på Buchner-trakt, og det gjenværende faste stoff ble renset med fortynnet NaHCOa løsning (mettet/5,2x100 ml), vann (2x100 ml) og isopropanol (2x100 ml). Blandingen ble luft-tørket og deretter tørket i en vakuumovn over P2Os ved 75°C i 12 timer, hvilket ga 4-[{3-klor-4-fluorfenyl)amino]-7-fluor-6-nitrokinazonlin (110,71 g, 90,4 %) som et sennepsgult faststoff. <1>H NMR (DMSO-d6): 8 10,44 (s, 1 H, NH), 9,51 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, H-5), 8,67 (s 1 H, H-2), 8,07 (dd, J = 2,7, 6,8 Hz, 1 H, H-2'), 7,79 (d, J = 12,4 Hz, 1 H, H-8), 7,74 (ddd, DJ = 2,7, 4,2, 9,0 Hz, 1 H, H-6'), 7,43 (t, J = 9,2 Hz, 1 H, H-5<*>). ;Trinn B: 4-[( 4- klor- 4- fluorfenv^ amino1- 7- f3-( 4- morfolino^ propoksv1- 6-nitrokinaozlin ;En løsning av kaliumtrimetylsilanolat (57,73 g, 0,45 mol) i dimetylsulfoksyd (DMSO) (150 ml) ble satt dråpevis over 50 min. til en lys gul oppslemming av 4-[(3-klor-4-fluorfenyl)amino]-7-fluor-6-nitrokinazonlin (50,503 g, 150 mmol) og 3-(4-morfolino)propan-1-ol (32,67 g, 225 mmol) i DMSO (250 ml), rørt kraft under N2 på et 25°C vannbad. Umiddelbart dyp rød farge, og på slutten av tilsetningen var reaksjonsblandingen en dyp rødsvart viskøs blanding. Etter 6 timer ble reaksjonsblandingen langsomt helt på om rørt isvann (4 liter) inneholdende mettet Na2C03-løsning (150 ml). Etter henstand i 13 timer ble den orangerød oppslemming sam-let på en Buchner-filtertrakt. Filterkaken ble renset med fortynnet NaOH-løsning (0,05 M, 500 ml; 0,02 M, 500 ml), fortynnet NaHC03-løsning (mettet/5, 500 ml) og vann (2 x 500 ml), og lufttørket i 4 timer, og deretter natten over ved 50°C i en vakuumovn over P2O5, hvilket ga 4-[(3-klor-4-fluorfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolino)propoksy]-6-nitrokinaolin (62,47 g, 89% korrigert) som et lyst orange-gult faststoff. <1>H NMR (DMSO-d6): 5 10,11 (s, 1 H, NH), 9,18 (s, 1 H, H-5), 8,65 (s, 1 H, H-2), 8,15 (dd, J = 2,4, 6,8 Hz, 1 H, H-2'), 7,79 (ddd, J = 2,7, 4,3, 9,0 Hz, 1 H, H-6'), 7,45 (t, J = 9,0 Hz, 1 H, H-5'), 7,44 (s, 1 H, H-8),4,32 (t J = 6,1 Hz, ArOCH2), 3,57 (t, J = 4,5 Hz, 4 H, H-2 morfolino), 2,45 (t, J = 6,5 Hz, 2 H, NCH2), 2,34 (brs, 4 H, H-3 morfolino), 1,94 (pentet, J = 6,5 Hz, 2 H, H-2 propoksy). ;Trinn C: 6- amino- 4- r( 3- klor- 4- fluorfenvlWminoT- 7-[ 3-( 3-morfolino) propoksvlkinazonlin ;En løsning av 4-[(3-klor-4-fluorfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolino)propoksy]-6-nitrokinazonlin (62,9 g, 136,2 mmol) i tetrahydrofuran (THF) (1200 ml) ble hydrogenert over Raney nikkel (20 g) ved 3,4 atm. og 23°C i 17,67 timer. Ytterligere Raney nikkel (20 g) ble tilsatt, og blandingen ble hydrogenert i 4,33 timer til under de samme betingelser. Reaksjonsblandingen ble filtrert med celitt, og løsnignsmidlet ble fjernet under redusert trykk, hvilket ga 6-amino-4-[(3-klor-4-fluorfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolino)propoksy]kinazonlin (57,81 g, 97,6% korrigert) som et blekt grønnaktig faststoff. * H NMR (DMSO-d6): 5 9,40 (s, 1 H, NH), 8,38 (s, 1 H, H-2), 8,20 (dd J = 2,5, 7,0 Hz, 1 H, H-2'), 7,79 (ddd, J = 2,5, 4,5, 9,0 Hz, 1 H, H-6'), 7,40 (s, 1H, H-5), 7,0 (t, J = 9,1 Hz, 1 H, H-5'), 7,08 (s, 1 H, H-8), 5,38 (brs, NH2), 4,19 (t J = 6,1 Hz, ArOCH2' 3,58 (t, J = 4,4 Hz, 4 H, H-2 morfolino), 2,49 (t, J = 7,0 Hz, 2 H, NCH2), 2,36 (brs, 4 H, H-3 morfolino), 1,97 (pentet, J = 6,5 Hz, 2 H, H-2 propoksy).

Trinn D: N- r4- f3- klor- 4- fluor- fenvlamino)- 7- f3- mofolin- 4- vl- proDoksvV kinazonlin- 6- vll- akrvlamid

Isobutylklorformiat (27,2 g, 0,20 mol) ble tilsatt dråpevis over 10 min. til en løsning av akrylsyre (14,40 g, 0,20 mol) og trietylamin (40,48 g, 0,40 mol) i THF (800 ml) rørt under nitrogen ved 0°C. Etter 10 min. til ble den hvite oppslemming overført til et -25°C kjølebad og rørt under nitrogen i 20 min. 6-amino-[(3-klor-4-fluorfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolino)propoksy]kinazonlin (43,19 g, 0,100 mol) i THF (500 ml) ble tilsatt dråpevis over 1,33 timer. Kjølebadet ble justert til -20°C, og etter ytterligere 2,33 timer ble reaksjonsblandingen behandlet ved tilsetning av vann (100 ml) i én porsjon. Etter 20 min. ble reaksjonsblandingen helt på knust is (2 kg), virvlet, og gradvis fortynnet med vann (5 I). Blandingen fikk stå i 16 timer og ble så filtret på Buchner-trakt. Filterkaken ble renset med vann (2 x 1 I), luftørket i 18 timer, og deretter tørket i en vakuumovn over P205 ved 60°C i 16 timer hvilket ga rått N-[4-[(3-klor-4-fluorfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolino)propoksy]kinazonlin-6-yljakrylamid (35,76 g, 73% ukorrigert) som et grønngult faststoff. Moderlutene ut-felte ytterligere faststoff som ble filtrert med Buchner-trakt, renset med vann (1 I) og lufttørket i 14 timer, hvilket ga ytterligere råprodukt (4,73 g, 10% ukorrigert) som et grønngult faststoff. Omkrystallisering av dette materialet fra DMSO ga 55% av det som et lyst kakigult partielt hydrat, sm.p. 186,5-188,5°C. Beregnet for C24H25N5O3CIF.0,85H2O: C, 57,61; H, 5,37; N, 13,97%. Funnet: C, 57,51; H, 5,26; N, 13,88%. <1>H NMR (DMSO-d6): 8 9,81 (s, 1 H, NH), 9,63(s, 1 H, NH), 8,87 (s, 1 H, H-5), 8,54 (s, 1 H, H-2), 8,15 (dd, J = 2,5, 7,0 Hz, 1 H, H-2'), 7,81 (ddd, J = 2,7, 4,4, 9,0 Hz, 1 H, H-6'), 7,43 (t J = 9,1 Hz, 1 H, H-5'), 7,30 (s, 1 H, H-8), 6,72 (dd, J = 10,1, 17,0 Hz, 1 H, H-2 akryloyl), 6,32 (dd, J = 9,17,0 Hz, 1 H, H-3 akryloyl), 5,83 (dd, J = 1,9, 10,1, Hz, 1 H, H-3 akryloyl), 4,27 (t, J = 6,2 Hz, ArOCH2), 3,58 (t, J = 4,4 Hz, 4 H, H-2 morfolin), 2,48 (t, J = 7,1 Hz, 2 H, NCH2), 2,36 (brs, 4 H, H-3 morfolino), 2,00 (pentet, J = 6,5 Hz, 2 H, H-2 propoksy). Massespektrum APCI 489, 2 (9), 4,88,2 (35), 487,2 (26), 486,2 (100).

Forbindelsen fra eksempel 21 i PCT-søknad nr. PCT/US97/05778 kan syntetiseres som følger: EKSEMPEL 21

N- f4- ff3- bromfenvl) aminol- 7- r3- f4- morfolino) propoksv1kinazonlin- 6- vllakrvlamid

Metallisk natrium (27,6 mmol, 0,63 g) ble satt til en løsning av 3-morfolinopropan-1-ol (22,0 mmol, 3,20 g) i THF (60 ml) under N2. Den resulterende suspensjon ble rørt ved 20°C i 2 timer og deretter kanylert inn i en løsning av 4-[(3-bromfenyl)amino]-7-fluor-6-nitro-kinazonlin, J. Med. Chem., 1996(349:918) (2,0 g, 5,51 mmol) i THF (50 ml) under N2. Løsningen ble deretter oppvarmet ved tilba-keløp i 24 timer før den ble fortynnet med vann og ekstrahert med EtOAc. De sammenslåtte organiske ekstrakter ble tørket over vannfritt Na2S04, inndampet under redusert trykk og kromatografert på alumniumoksyd under eluering med EtOAc/heksan (1:1) til MeOH/CH2CI2/EtOAc (2:3:5) hvilket ga4-[(3-bromfenyl)amino]-7-[(3-morfolino)propyloksy]-6-nitrokinazonlin (1,75 g, 65%) som et gult pudder, sm.p. (MeOH) 216-220°C.

nH NMR l(CD3)2SO]: 8 10,12 (s, 1H, NH), 9,24 (s, 1H, aromat), 8,69 (s, 1H, aromat), 8,19 (t, J = 1,8 Hz, 1H, H-2'), 7,88 (dt, Jd = 7,8 Hz, Jt = 1,4 Hz, 1H, H-6'), 7,49 (s, 1H, aromat), 7,38 (t, J = 8,0 Hz, 1H, H-5'), 7,34 (dt, Jd = 8,1 Hz, J» = 1,4 Hz, 1H, H-4'), 4,35 (t, J = 6,2 Hz, 2H, CH2CH2CH20), 3,58 (t, J = 4,6 Hz, 4H, morfolinometylen), 2,45 (t, J = 7,0 Hz, 2H, NCH2CH2CH2), 2,37 (br s, 4H, morfolinometylen), 1,94 (kvintett, J = 6,6 Hz, 2H, CH2CH2CH2).

<13>C NMR: 8 157,76, 157,26, 153,76, 153,21, 140,32, 138,86, 130,37, 126,38, 124,26, 121,70, 121,13, 120,72, 110,11, 107,88, 67,87, 66,13 (x2), 54,42, 53,28 (x2), 25,30.

Analyse beregnet for C2iH22BrN5O4-0,75 H20 gir:

C, 50,3; H,4,7; N, 14,0%

Funnet: C, 50,3; H, 4,4; N, 13,8%.

Nyvasket (1N HCI deretter fortynnet H20) jempulver (12 mmol, 0,686 g) ble satt i porsjoner til en tilbakeløpskokende løsning av nitrokinazonlinet (1,50 g, 3,07 mmol) i EtOH/hkO (2:1, 80 ml) ovenfor inneholdende iseddik (2,0 ml). Den resulterende suspensjonen ble oppvarmet ved tilbakeløp under kraftig røring i 20 min. og deretter avkjølt, gjort basisk ved tilsetning av konsentrert NH3 og filtrert gjennom et sjikt av celitt. Celittsjiktet ble vasket med EtOH før filtratet ble inndampet under redusert trykk, fortynnet med vann og ekstrahert med EtOAc. De sammenslåtte organiske ekstrakter ble tørket over vannfritt Na2S04, inndampet under redusert trykk og kromatografert på Grad III aluminiumoksyd under eluering med CH2Cl2/EtOAc (1:1) til MeOH/EtOAc (2:98) som ga 6-amino-4-[(3-bromfenyl)-amino]-7-[(3-morfolino)propyloksy]kinazonlin (1,08 g, 77%) som et lysebrunt pulver, sm.p. (EtOAc/heksan) 158-160°C.

<1>H NMR [(CD3)2SO], (400 MHz): 8 9,37 (s, 1H, NH), 8,40 (s, 1H, aromat), 8,24 (t, J = 1,9 Hz, 1H, H-2'), 7,86 (ddd, J = 8,2, 0,8, 1,8 Hz, 1H, H-6'), 7,42 (s, 1H, aromat), 7,30 (t, J = 8,1 Hz, 1H, H-5'), 7,21 (ddd, J = 8,2,1,0, 1,9 Hz, 1H, H-4'), 7,09 (s, 1H, aromat), 5,36 (s, 2H, NH2), 4,20 (t, J = 6,2 Hz, 2H, CH2CH2CH20), 3,59 (t, J = 4,6 Hz, 4H, morfolinometylen), 2,50t, J 7,3 Hz, 2H, NCH2CH2CH2), 2,39 (br, s, 4H, morfolinometylen), 1,99 (kvintett, J = 6,7 Hz, 2H, CH2CH2CH2).

<13>C NMR: 5 154,88, 151,94, 150,19, 144,84, 141,94, 138,50, 130,16, 124,66, 123,02, 121,09, 119,65, 110,42, 106,37, 100,81, 66,45, 66,14 (x2), 54,77, 53,29 (x2), 25,50.

Analyse beregnet for C2iH24BrN5O2 0,25 H20 gir:

C, 54,5; H, 5,3; N, 15,1%.

Funnet: C, 54,6; H, 5,5; N, 15,0%.

Til en rørt løsning av 6-amino-kinazonlin (0,50 g, 10,09 mmol), akrylsyre (6 mol, 6,54 mmol, 449 uj), og Et3N (overskudd, 2,0 ml) i DMF (20 ml) under N2 sat-tes 1-(3-dimetyl-aminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (EDCI-HCI) (3 mol, 3,27 mmol, 627 mg). Reaksjonsblandingen ble rørt ved 0°C i 15 min. og fikk deretter oppvarmes til romtemperatur og ble rørt i 2 timer til. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk, og den resulterende rest ble fortynnet med mettet med NaHCC>3 og gjentatte ganger ekstrahert med EtOAc. De sammenslåtte organiske ekstrakter ble vasket med saltvann, tørket over vannfritt Na2S04, og inndampet under redusert trykk. Kromatografi på Grad III aluminiumoksyd under eluering med EtOAc/heksan (9:1) til MeOH/EtOAc (2:98), N-[4-[(3-bromfenyl)amino]-7-[(morfolino)propyloksy]-kinazonlin-6-yl]akrylamid (329 mg, 59%) som et kremfar-get pulver, sm.p. (EtOAc/Et20/heksan) 170-172°C.

<1>H NMR [(CD3)2SO]: 5 9,78 (s, 1H, CONH), 9,62 (s, 1H, NH), 8,89 (s, 1H, aromat), 8,56 (s, 1H, aromat), 8,18 (t, J = 1,9 Hz, 1H, H-2'), 7,88 (brd, J = 8,2 Hz, 1H, H-6'), 7,34 (t, J = 8,1 Hz, 1H, H-5'), 7,30 (s, 1H, aromat), 7,27 (ddd, J = 7,9, 1,4, 0,8 Hz, 1H, H-4'), 6,72 (dd, J = 17,0, 10,2 Hz, 1H, CH2CHCO), 6,33 (dd, J =

17,0, 1,9 Hz, 1H, CH2CHCO), 5,83 (dd, J = 10,2,1,9 Hz, 1H, CH2CHCO), 4,27 (t, J = 6, 3 Hz, 2H, CH2CH2CH20), 3,58 (t, J = 4,6 Hz, 4H, morfolinometylen), 2,48 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH2CH2CH2), 2,38 (br s, 4H, morfolinometylen), 1,99 (kvintett, J = 6,7 Hz, 2H, CH2CH2CH2).

<13>C NMR: 5 163,49, 156,68, 154,96, 153,92, 149,19, 141,20 ,131,58, 130,19, 127,16, 126,95, 125,52, 123,97, 121,03, 120,52, 116,78, 108,80, 107,28, 66,96, 66,14 (x2), 54,54, 53,28 (x2), 25,31.

Analyse beregnet for C24H26BrN5O3-0,5 H20 gir.

C, 55,3; H, 5,2; N, 13,4%

Funnet: C, 55,3; H, 4,9; N, 13,3%.

SAMMENLIGNINGSSTUDIER

Vevskultur

A431 humane epidermoide karcinomaceller og MDA-MB-453-celler erholdtes fra the American Type Culture Collection, Rockville, MD og ble holdt som mo-nosjikt i dMEM (Dulbecco's modified eagle medium)/F12, 50:50 (Gibco(BRL, Bethesda, MD) inneholdende 10% føtalt bovinserum. Cellene ble dyrket ved 37°C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% C02 i luft.

Rensing av e<p>idermal vekstfaktorreseptortvrosin- kinase

Human EGF reseptortyrosin-kinase (EGFR) ble isolert fra A431 humane epidermoide karcinomaceller ved den følgende metode. Celler ble dyrket i fulle flasker i dMEM/F12 media (Gibco/BRL, Bethesda, MD) inneholdende 10% føtalt kalveserum. Ca. 10<9> celler ble lyset i 2 volumer buffer inneholdende 20 mM Hepes, pH 7,4, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% glyserol, 0,1 mM natriumortova-nadat, 5 mM natriumfluorid, 4 mM pyrofosfat, 4 mM benzaid, 1 mM DTT, 80 ug/ml aprotinin, 40 ug/ml leupeptin, og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Etter sentrifugering ved 25.000 x g i 10 min. ble supernatanten brakt på en rask Q sefa-rosekolonne {Pharmacia Biotechn., Inc., Piscataway, NJ) og eluert med en lineær gradient fra 0,1 M NaCI til 0,4 M NaCI i 50 mM Hepes, 10% glyserol, pH 7,4. Aktive enzymfraksjoner ble slått sammen, delt i alikvoter og lagret ved -100°C. Fi-broblast vekstfaktorreseptor (FGFR), blodplateavledet vektsfaktor (PDGF), insulin og c-src-tyrosin-kinaser erholdtes ved velkjente metoder for fagfolk på området. Se for eksempel Fry, et al., "Strategies For The Discovery Of Novel Tyrosine Kinase Inhibitors With Anticancer Activity, Anticancer Drug Design, 1994; 9:331-351, som her er inntatt som referanse.

Tyrosin- kinasemålinaer

Enzymmålinger for IC5o-bestemmelser ble utført i 96 brønns filterplater (Millipore MADVN6550, Millipore, Bedford, MA). Totalvolumet var 0,1 ml inneholdende 20 mM Hepes, pH 7,4, 50 uM natriumvanadat, 40 mM magnesiumklorid, 10 uM ATP inneholdende 0,5 uCi [<32>0]ATP, 20 ug poly Glutaminsyre/tyrosin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 10 ng EGF reseptortyrosin-kinase, og tilsvarende fortynninger av inhibitor Alle komponenter unntatt ATP settes til brønnen og platen inkuberes under risting i 10 min. ved 25°C. Reaksjonen startes ved tilsetning av [^PjATP, og platen inkuberes ved 25°C i 10 min.. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 0,1 ml 20% trikloreddiksyre (TCA). Platen holdes på 4°C i minst 15 min. for å la substratet utfelles. Brønnene vaskes så 5 ganger med 0,2 ml 10% TCA og <32>P innbygging bestemmes med en Wallac beta platefeller. Målinger som anven-der intracellulære kinaseområder av PDGF, FGF og insulinreseptorer, samt slike for c-src ble utført som beskrevet for EGF-reseptoren, unntatt at 10 mM mangan-klorid ble tatt med i reaksjonen.

EGF- oa Hereaulin- avhenqiqe tvrosinfosforvlerinasmålinaer

A431 humane epidermoide karcinomaceller eller MDA-MB-453-celler ble dyrket i 6-brønnsplater til ca. 80% sammenflytning og deretter inkubert i serumfrie media i 18 timer. Cellene ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av enten forbindelse 1 eller eksempel 21 i 2 timer og deretter stimulert med enten 100 ng/ml EGF (A431) eller 10 ng/ml heregulin (MDA-MB-453) i 5 min.. Celleekstrakter ble foretatt, og reduksjonen i fosfotyrosin ble bestemt ved western blot.

Western blot prosedyre

Ekstrakter ble foretatt ved å lyse monosjiktene i 0,2 ml av kokende Laemlli buffer (2% natriumdodecylsulfat, 5% beta-merkaptoetanol, 10% glyserol og 50 mM Tris, pH 6,8), og lysatene ble oppvarmet til 100°C i 5 min.. Proteiner i lysatet ble skilt ved polyakrylamidgelelektroforese og elektroforetisk overført til nitrocellu-lose. Membran ble vasket én gang i [10 mM Tris, pH 7,2,150 mM NaCI, 0,01% natriumazid] (TNA) og blokket natten over i TNA inneholdende 5% bovin serumal-bumin og 1% ovalbumin. Membranen ble blottet i 2 timer med antifosfotyrosin-antistoff (UBl, Lake Placid, NY, 1 ug/ml i blokkeringsbuffer) og deretter vasket to ganger i TNA, én gang i TNA inneholdende 0,05% Tween-20 og 0,05% nonidet P-40 og to ganger i TNA. Membranene ble deretter inkubert i 2 timer i blokkingsbuf-fer inneholdende 0,1 |iCi/ml [<125>l] protein A og deretter vasket igjen som ovenfor. Etter blottene var tørre, ble de satt i en filmkassett og eksponert mot X-AR x-røntgenfilm i 1 til 7 dager. Båndintensiteter ble bestemt med et laserdensitometer.

Dataen i tabell 1 viser at eksempel 21 og forbindelse 1 var omtrent like aktive mot renset EGF-reseptortyrosin-kinase, EGF-bevirket reseptor-autofosforylering, og heregulin-bevirket tyrosinfosforylering in vitro.

IN VIVO TUMOR INHIBERINGSMÅLING

Det humane epidermoide karcinoma, A431, ble propagert in vivo ved seriell transplantasjon. Denne tumormodell ble valgt for disse studier pga. sin kjente av-hengighet av EGF-reseptoren for vekst og i tidlig stadium respons på monoklonal antistoffterapi in vivo. I dette eksperimentet ble hårløse mus som veide 18-22 gram implantert subkutant med 30 mg A431 tumorfragmenter i området for høyre aksille på dag 0. Tumorer fikk vokse til en masse på 100 til 150 mg, på hvilket tidspunkt de tumorbærende dyr ble statistisk oppdelt og fordelt i behandlingsbur. Dyr ble behandlet peroralt i 15 påfølgende dager med isetionatsaltene fra eksempel 21 og forbindelse 1 i vann. Isetionatsaltene kan fremstilles ved titrering av forbindelsene i løsning med 2 ekvivalenter isetionsyre. Behandling var basert på gjennomsnittsgruppevekt Kontrolldyrene fikk vann.

Evaluering av eksperimentet ble basert på tumorvekstforsinkelse, T-C, definert som forskjellen i dager for de behandlede og kontrolltumorer skulle nå en evalueringsstørrelse på 750 mg. Data kan også representeres som prosentdel av tumorvekstinhibering, definert som tumorvekstforsinkelsen delt på antallet av be-handlingstider 100%. Større tumorvekstforsinkelser og tumorvekstinhiberingsver-dier er indikative for mer aktive forbindelser. Statistisk analyse ble utført ved å bruke JMP for Macintosh (SAS Institute, Inc., Cary, NC).

Verdiene for forbindelse 1 er signifikant forskjellig fra dem for eksempel 21 basert på den nødvendige tid for individuelle tumorer skulle nå 750 mg. p<0,05, studentens t-test.

VEGF-SEKRESJONSMÅLING

Vaskulære endotelial vekstfaktor (VEGF) som også er kjent som vaskulær permeabilitetsfaktor (VPF) antas å være angiogenesehovedstimulatoren for de fleste typer kreft. Det finnes mange indusere for tumor VEGF-sekresjon, og to av de sterkeste er epidermal vekstfaktor (EGF) og transformeringsvekstfaktor alfa, som begge er ligander for EGF-reseptor (EGFR).

Inhiberingen av VEGF-sekresjon fører til en antiangiogen effekt og kan føre til tumorregresjon, da selv delvis inhibering av VEGF-sekresjon kan føre til dest-ruksjon av nydannede uferdige blodkar i tumorer. (Benjamin L.E. and Keshel E., Conditional switching of VEGF expression in tumors: induction of endothelial cell shedding and regression of hemangioblastoma-like vessels by VEGF withdrawal. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1997; 94:8761-8766).

Vi har sammenlignet to EGFR-tyrosin-kinaseinhibitorer, forbindelse 1 og eksempel 21, for deres effekt på A431-tumorceller. Mot A431 tumorer in vivo ga forbindelse 1 uventet en større antitumorrespons (T-C = 53 dager) enn eksempel 21 (T-C - 26 dager). Se målingen som er angitt ovenfor. Så undersøkte vi effek-ten av begge forbindelser på A431 sekresjon av VEGF. Til vår overraskelse var forbindelse 1 bedre enn eksempel 21 ved inhibering av VEGF-sekresjon fra A431 celler in vitro. Ved 0,5 uM blokkerte forbindelse 1 EGF- eller TGF-alfastimulert VEGF-sekresjon. Derimot inhiberte 0,5 jiM eksempel 21 VEGF-sekresjon i nesten samme grad som observert med 0,1 uM av forbindelse 1. 0,1 |iM av forbindelse 1 inhiberte EGF-stimulert VEGF-sekresjon med 63% og 0,5 |iM inhiberte med 86%. Derimot inhiberte 0,1 \ iM av eksempel 21 EGF-stimulert VEGF-sekresjon med 48% og 0,5 jiM av eksempel 21 inhiberte EGF-stimulert VEGF-sekresjon med 57%. Lignende resultater ble oppnådd ved å bruke TGF-alfa til å stimulere VEGF-sekresjon i stedet for EGF. 0,5 u.M av forbindelse 1 inhiberte TGF-alfa-stimulert VEGF-sekresjon med mer enn 80%, mens den samme konsentrasjon av eksempel 21 inhiberte VEGF-sekresjon med 57%. Forbindelse 1 viste seg også å inhibere grunn-nivået av VEGF-sekrsjon fra A431-celler, mens eksempel 21 ikke hadde noen effekt.

Metoder

A431 humane epidermoide karcinomaceller oppnådd fra the American Type Culture Collection (Rockville, MD) ble dyrket i Dulbecco's MEM/F12 media (DMEM/F12) tilsatt 10% føtalt bovinserum. Før medikament og vekstbehandling ble cellene vasket tre ganger i serumfritt DMEM/F12. Celler ble behandlet i 2 timer med den angitte konsentrasjon av forbindelse 1 eller eksempel 21 før tilsetningen av enten 10 ng/ml EGF eller TGF-alfa. Etter 48 timer inkubasjon ved 37°C ble media fjernet og lagret frosset ved -70°C. VEGF ELISA-målinger (Intergren, Co., Purchase, NY) utføres på mediaprøver etter produsentens instruksjoner. Resultater av denne måling er vist nedenunder i tabellform.

Claims (15)

1. Forbindelsen: N-{4-(3-klor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoksy)-kinazonlin-6-yl]-akrylamid, eller de farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Farmasøytisk akseptabel blanding, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge krav 1.

3. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av kreft.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvori kreften er brystkreft.

5. Anvendelse ifølge krav 3, hvori kreften er tykktarmkreft.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av restenose.

7. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav t til fremstilling av et farmasøytisk preparat for irreversibel inhibering av tyrosin-kinaser.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvori tyrosin-kinasen er EGFR.

9. Anvendelse ifølge krav 7, hvori tyrosin-kinasen er erbB2.

10. Anvendelse ifølge krav 7, hvori tyrosin-kinasen er erbB4.

11. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av tyrosinfosforylering av erbB3.

12. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av psoriasis.

13. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av aterosklerose.

14. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av endometriose.

15. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av VEGF-sekresjon.