[go: up one dir, main page]

RS56909B1 - Roseburia flagelin i imunomodulacija - Google Patents

Roseburia flagelin i imunomodulacija

Info

Publication number
RS56909B1
RS56909B1 RS20180240A RSP20180240A RS56909B1 RS 56909 B1 RS56909 B1 RS 56909B1 RS 20180240 A RS20180240 A RS 20180240A RS P20180240 A RSP20180240 A RS P20180240A RS 56909 B1 RS56909 B1 RS 56909B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
roseburia
polynucleotide sequence
vector
host cell
flagellin
Prior art date
Application number
RS20180240A
Other languages
English (en)
Inventor
Denise Kelly
Angela Patterson
Edouard Monnais
Imke Mulder
Original Assignee
4D Pharma Res Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 4D Pharma Res Ltd filed Critical 4D Pharma Res Ltd
Publication of RS56909B1 publication Critical patent/RS56909B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/30—Encapsulation of particles, e.g. foodstuff additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na flageline iz Roseburia, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenutue flageline iz Roseburia, i/ili vektore koji obuhvaćaju pomenute polinukleotidne sekvence, i/ili ćelije domaćine, uključijući bekterije, koje poseduju pomenute vektore, i/ili domaćinske ćelije, uključijući bakterije, koje poseduju pomenute polinukleotidne sekvence, za različite terapeutske i nutricione upotrebe.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Humani intestinalni trakt se smatra sterilnim in utero, ali je ujedno nakon rađanja izložen je velikom broju mikroba poreklom od majke i sredine. Zato se odigravaju procesi dinamičkog perioda kolonizacije mikroorganizmima i njihove smene i to pod uticajem faktora kao što su način porođaja, sredinski faktori, način ishrane i genotip domaćina, i svi oni utiču na kompoziciju mikrobiota intestinalnog trakta (stomaka), posebno tokom ranog perioda života. Kao posledica toga miktrobiota se stabilizuje I postaje slična odraslom organizmu (Spor, Koren & Ley 2011). Ljudska mikrobiota stomaka sadrži preko 500-1000 razločitih fenotipova koji u principu mogu da se svrstaju u dve glavne razdela bakterioide i firmikute (Bacteroidetes i Firmicutes) (Eckburg et al. 2005). Uspešan simbiotski odnos koji se javlja kao posledica kolonizacije bakterijama intestinalnog trakta čoveka doneo je različite koristi uključujući metaboličke, strukturne, protektivne i druge korisne funkcije. Pojačane metaboličke fukcije kolonizovanog intestinalnog trakta omogućavaju da se inače nesvarljivie komponente degraduju uz oslobađanje nus produkata koji predstavljaju vežan izvor nutrijenata za domaćina. Slično tome, imunološka važnost mikrobote je već dobro poznata i pokazana u primerima gnotobiotičkih životinja (životinja bez mikroorganizama) koje imaju poremećaj u imunološkom sistemu koji se funkcionalno nadomešćuje nakon introdukcije komensalnih bakterija (Macpherson et al. 2001, Macpherson, Martinic & Harris 2002, Mazmanian et al.2005).
[0003] Kao sušta suprotnos produkciji sekretornih intestinalnih IgA, koja je per se pod uticajem kolonizacije mikroorganizmima (Chung, Kasper 2010, Macpherson 2006), razvoj T ćelija i njihova diferencijacija izgleda da zahtevaju kolonizaciju specifičnim komensalnim mikroorganzimima. Izgleda da su različite vrste klostridija, a posebo sporulišuće segmentirane filamentozne bakterije (SFB, segmented filamentous bacteria), potentni stimulus za diferencijaciju i sazrevanje Th1, Th17 i Tregs kako intestinalnih tako i onih u debelom crevu (Gaboriau-Routhiau et al. 2009, Ivanov et al.
2009). Skorašnje studije su pokazale da i druge bakterije stomaka uključujući one koje pripadaju rodu Clostridium u okviru klastera IV i XIVa kao ipromenjena Šedlerova flora (Altered Schaedler Flora, ASF), mogu da indukuju de novo formiranje Treg-ov dok mono kolonizacija sa Bacteroides fragilis može da popravi disbalans Th1/Th2 kod gnotobiotičkih (životinja bez mikroorganizama) miševa preko promovisanja ekspanzije Treg-ova (Treg ćelija, T regulatorne ćelije) (Mazmanian et al. 2005, Geuking et al.
2011, Atarashi et al. 2011). Ovi podaci ukazuju na važan imuno-regulatorni efekat drugih bakterijskih stanovnika u intestinalnom traktu (stomaku). Jasno je da su efekti komensalnih bakterija na T ćelijske puteve diferencijacije različiti i varijabilni, kao što je već usvojeno ranije da mogu biti pod uticajem niza TLR liganda koji su povezani sa specifičnim bakterijama (Nutsch, Hsieh 2012). Na primer, mehanizam kojim SFB utiče na odgovore T ćelija je trenutno nepoznat, ali nedavne analize genoma potvrđuju prisustvo gena za flagelin i ukazuju na to da unutrašnji (urođeni) imunološki odgovori koji su posredovani preko TLR5-flagelin interakcija imaju možda važnu ulogu u ovom procesu (Prakash et al. 2011, Sczesnak et al. 2011). Dalje, efekti B. fragilis preko pojačavanja Trag, povezani su sa PSA i posredovanjem TLR signanim događajima (Round et al.2011).
[0004] Dramatične promene u kompoziciji mikrobiota dokumentovani su kod poremećaja gastrointestinalnog trakta kao što je inflamatorna bolest creva (IBD, inflammatory bowel disease). Na primer, nivo Clostridium sp. klastera XIVa bakterija je redukovano kod IBD pacijenata dok je broj E. coli povećan, što ukazuje na pomeranje balansa tj ravnoteže simbionata i patobionata u stomaku (Frank et al.2007, Scanlan et al. 2006, Kang et al. 2010, Machiels K. et al. 2013). Interesantno je da je mikrobijalna disbioza povezana sa poremećajem balansa u populaciji T efektornih ćeija.
[0005] Roseburia pripada klasteru XIVa razdela Firmicutes. Trenutno u okviru roda Roseburia identifikovano i okarakterisano je pet vrsta: Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia hominis, Roseburia intestinalis, Roseburia inulinivorans (Stanton and Savage 1983, Duncan et al 2006). Baterije su anaerobni komensali sa flagelama i takođe glavni proizvođači butirata (Duncan et al. 2006). Iako nije tačno procenjen precizan broj ovih bakterija koje kolonizuju intestinalni trakt čoveka, Roseburia spp. predstavlja dominantnu grupu bakterija kod zdravog čoveka, a koja je ujedno redukovana kod IBD pacijenata (Machiels K. et al.2013).
[0006] Otkrivena je uloge bakterijskih gena, posebno flagelina, koji učestvuje u kolonizaciji i adaptaciji u okviru mišijeg intestinalnog trakta, kao i domaćinskih imunoloških gena koji odgovaraju na kolonizaciju od starne Roseburia bakterija. Pronalazači pokazuju da specifične strukture flagelina poreklom od R. hominis i R. intestinalis indukuju odrežene signane odgovore kako u epitelijalnim ćelijama tako i u dendritičnim ćelijama u odnosu na druge flagelatne enterične bakterije. Važnost TLR5-Roseburia, kao što je TLR5-R.hominis, interakcije koje usmeravaju ka adaptivnom imunom odgovoru, posebno Treg odgovori su ovde demonstrirani. Kompletna genomska sekvenca i anotacija genoma R. hominis koja je ovde opisana, prikazna je u GenBank pod brojem pristupa CP003040 (verzija 1). Za R. intestinalis (GenBank broj pristupa za 16S rRNK gen soj L1-82: AJ312385) koji je ovde opisan referentna genomska sekvenca je prikazana u GenBank pod brojem pristupa ABYJ02000000 (verzija 2) i sastoji se od sekvenci ABYJ02000001- ABYJ02000409.
IZJAVE PRONALASKA
[0007] Iznenađujuće, ovi pronalazači su pronašli da su flagelin proteini iz Roseburia važni za modulaciju imunološkog odgovora
[0008] Dodatno, ovi pronalazači su na iznenađenje pronašli da su flagelin protein dobijeni ili dostavljeni od strane Roseburia hominis ili Roseburia intestinalis važni za proces modulacije imunološkog odgovora. Ovaj pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[0009] Ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u modulaciji inflaminacije (zapaljenskog procesa, upale) tkiva ili organa (kao na primer intestinuma) u subjektu. [0010] Sa drugog aspekta, ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u modulaciji proizvodnje T ćelija (na pr. regulatornih T ćelija kao što su regulatorne T ćelije sposobne da eksprimiraju TLR5) u subjektu.
[0011] Ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u restauraciji imunološke tolerancije.
[0012] U budućem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u regulaciji imunološkog sistema subjekta.
[0013] U okviru drugog aspekta, ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u tretmanu poremećaja u subjektu što je poremećaj inflamatorni (zapaljenski) poremećaj i/ili autoimuni poremećaj.
[0014] Ovaj pronalazak, u drugom aspektu, se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u modulaciji dendritičnih ćelija (kao što su dendritične ćelije koštane srži) i/ili epitelijalnih ćelija u tkivu ili organu subjekta.
[0015] Ovaj pronalazak, u budućem aspektu, se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u regulaciji proizvodnje IL-10 i/ili TGF β
subjekta.
[0016] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u regulaciji proizvodnje ćelijskih površinskih markera koji su uključeni u imunološke odgovore i prepoznavanje antigena kao što su CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H i/ili ekvivalenti u vrstama u ćeliji ili ćelijama subjekta.
[0017] U okviru drugog aspekta, ovaj pronalazak se odnosi na, se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u regulaciji (na primer smanjenju – downregulating) ekspresije jednog ili više IFN gena Tip I (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od IFN- β1, IFN- β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 i Irf4) u ćeliji ili ćelijama subjekta.
[0018] Ovaj pronalazak, u budućem aspektu, se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u regulaciji (na primer smanjenju – downregulating) ekspresije jednog ili više proinflamatornih gena (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od 1- β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFN β, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13, i TNF-α) u ćeliji ili ćelijama subjekta.
[0019] Ovaj pronalazak, u okviru drugog aspekta, se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u poboljšanju intestinalne mikrobiota u subjektu. [0020] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na relates to Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u regulaciji apetita subjekta.
[0021] U daljem askpektu, ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u regulaciji (na primer smanjenju – downregulating) ekspresije gena koji kodira holecistokinin (Cck) i/ili gena koji kodira glukagon (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta.
[0022] Ovaj pronalazak, u budućem aspektu, se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), za upotrebu u poboljšanju zdravlja allmientarnog kanala subjekta.
[0023] Ovaj pronalazak, u drugom aspektu, se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i na farmaceutski prihvatljiv ekspicijent, nosač ili rastvarač.
[0024] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i nutricioni (hranljivi) prihvatljiv ekspicijent, nosač ili rastvarač. [0025] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi hranu (namirnicu), prehrambeni proizvod, pomoćno lekovito sredstvo, dodatak ishrani, koji obuhvata Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis).
[0026] Ovaj pronalazak, u budućem aspektu se odnosi na proces proizvodnje farmaceutske kompozicije na osnovu ovog ptonalaska, pomenuti proces obuhvata mešanje Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) sa farmaceutski farmaceutski prihvatljivim ekspicijentom, nosačem ili rastvaračem; opcionalno pomenuta Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) je inkapsulirana.
[0027] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na proces proizvodnje dodatka ishrani na osnovu ovog pronalaska, pomenuti proces obuhvata mešanje Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) sa nutriciono prihvatljivim ekspicijentom, nosačem ili rastvaračem; opcionalno pomenuta Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) je inkapsuliran.
[0028] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na modulaciju inflamacije tkiva ili organa (kao što su creva) u subjektu, koja obuhvata Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) i što je inflamacija tkiva ili organa (kao što su creva) u subjektu modulisana.
[0029] Ovaj pronalazak, u drugom aspektu, se odnosi na modulaciju proizvodnje T ćelija (na pr. regulatornih T ćelija kao što su regulatorne T ćelije sposobne da eksprimiraju TLR5) u subjektu, koja obuhvata administraciju (davanje) Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) i što je proizvodnja T ćelija (na pr. regulatornih T ćelija kao što su regulatorne T ćelije sposobne da eksprimiraju TLR5) u subjektu modulisana.
[0030] Ovaj pronalazak, u budućem aspektu se odnosi na regulaciju imunološkog sistema subjekta, koja obuhvata davanje Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) i što je imuni subjekta regulisan.
[0031] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na flagelin iz Roseburia za upotrebu u metodi tretmana poremećaja subjekta, gde pomenuta metoda obuhvata davanje Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) što je pomenuti poremećaj inflamatorni poremećaj i/ili autoimuni poremećaj.
[0032] U okviru drugog apekta, ovaj pronalazak se odnosi na modulaciju dendritičnih ćelija (kao što su dendritične ćelije koštane srži) i/ili epitelijalnih ćelija u subjektu, i koji obuhvata davanje Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) što su dendritične ćelije (kao što su dendritične ćelije koštane srži) i/ili epitelijalne ćelije u subjektu modulisane.
[0033] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na regulaciju proizvodnje IL-10 i/ili TGF β-ćeliji ili ćelijama subjekta, i sastoji se od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu, što je proizvodnja IL-10 i/ili TGF β-ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
[0034] Ovaj pronalazak, u drugom aspektu se odnosi na regulaciju proizvodnje površinskih ćelijskih markera koji su uključeni u imune odgovore i prepoznavanje antigena kao što su CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H i/ili ekvivalenti u vrstama u ćeliji ili ćelijama subjekta, koji se sastoji od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu, što je proizvodnja površinskih ćelijskih markera koji su uključeni u imunološke odgovore i prepoznavanje antigena kao što su CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H i/ili ekvivalenti u vrstama u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
[0035] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na regulaciju (na primer smanjenje – downregulating) ekspresije jednog ili više IFN gena Tip I (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od IFN-β1, IFN-β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 i Irf4) u ćeliji ili ćelijama subjekta, koja se sastoji od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu, što je ekspresija jednog ili više IFN gena Tip I (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od IFN- β1, IFN- β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 i Irf4) u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
[0036] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na regulaciju (na primer smanjenje – downregulating) ekspresije jednog ili više proinflamatornih gena (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od 1- β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFN γ, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13, i TNF-α) u ćeliji ili ćelijama subjekta, sastoji se od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu, što je ekspresija jednog ili više proinflamatornih gena (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od 1- β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFN γ, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13, i TNF-α) u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
[0037] Ovaj pronalazak, u drugom aspektu se odnosi na poboljšanje intestinalne mikrobiota u subjektu, satoji se od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) što je intestinalna mikrobiota u subjektu poboljšana.
[0038] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia u regulaciji apetita subjekta, i sastoji se od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) što je apetit subjekta regulisan.
[0039] Ovaj pronalazak, u drugom aspektu se odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia u regulaciji (na primer smanjenje – downregulating) ekspresije gena koji kodira holecistokinin (Cck) i/ili ekspresije gena koji kodira glukagon (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta, koji se sastoji od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) što je ekspresije gena koji kodira holecistokinin (Cck) i/ili ekspresije gena koji kodira glukagon (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
[0040] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na poboljšanje zdravlja alimentarnog kanala subjekta, koji se sastoji od davanja Roseburia flagelina, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) što je zdravlje alimentarnog kanala subjekta poboljšano.
[0041] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenata (lekova) za modulaciju inflaminacije tkiva ili organa (kao creva) u subjektu. Dalje je otkrivena upotreba flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) u proizvodnji medikamenta za modulaciju proizvodnje T ćelija (na pr. regulatornih T ćelija kao što su regulatorne T ćelije sposobne da eksprimiraju TLR5) u subjektu. Dalje otkrivena je upotreba flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta za regulaciju imunološkog sistema subjekta. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta za lečenje poremećaja u subjektu, što je poremećaj inflaminatroni poremećaj i/ili autoimunološki poremećaj. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta za modulaciju dendritičnih ćelija (kao što su dendritične ćelije koštane srži) i/ili epitelijalnih ćelija u tkivu ili organu subjekta. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta za regulaciju proizvodnje IL-10 i/ili TGFβ upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta za regulaciju površinskih ćelijskih markera koji su uključeni u imune odgovore i prepoznavanje antigena kao što su CD40, I-A/I-E, CD317/BST2, CD103, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H ili ekvivalenti u vrstama u ćeliji ili ćelijama subjekta. Ovde je takođe otkrivena upotreba flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta za regulaciju na regulaciju (na primer uamnjivanje – downregulating) ekspresije jednog ili više IFN gena Tip I (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od IFN- β1, IFN- β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 i Irf4) u ćeliji ili ćelijama subjekta.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta za regulaciju (na primer umanjivanje – downregulating) ekspresije jednog ili više proinflamatornih gena (kao što je ali bez ograničavanja na njih, jedan ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od 1- β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFN γ, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13, i TNF-α) u ćeliji ili ćelijama subjekta. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za proizvodnju medikamenta poboljšanje intestinalne mikrobiota u subjektu. Naznačeno time ovde je otkrivena upotreba flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) u proizvodnji medikamenta za regulaciju apetita subjekta.
Daljem ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) u proizvodnji medikamenta za regulaciju (na primer smanjivanje – downregulating) ekspresije gena koji kodira holecistokinin (Cck) i/ili ekspresije gena koji kodira glukagon (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) u proizvodnji medikamenta za poboljšanje zdravlja alimentarnog kanala subjekta. Dalje je otkrivena upotreba flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za upotrebu u medicini.
[0042] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na flagelin iz Roseburia, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za upotrebu u restauraciji imunološke tolerancije.
[0043] U drugom aspektu, ovo otkrivanje se odnosi na upotrebu flagelina iz Roseburia, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) u proizvodnji medikamenta za restauraciju imunološke tolerancije u subjektu.
[0044] Ovaj pronalazak se u drugom aspektu odnosi na metod za restauraciju imunološke toleransije u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje flagelina iz Roseburia, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) i što je imunološka tolerancija u subjektu popravljena.
SLIKE
[0045]
Slika 1. Sekvenca i anotacija genoma R. hominis. Kompletna genomska sekvenca R. hominis A2-183 je napravljena. Predstavljena je jednim hromozomom veličine 3,592,125-bp sa četiri ribozomalna operona, 66 RNK i 3,273 pretpostvljenih proteina. (A) Cirkularna genomska mapa R. hominis sa lokacijama PCR eksperimenata (Tabela S1) je označena u regionima koje su obuhvatali prajmeri. Obeležja (znakovi) na genomskoj mapi, počevši od spoljnog su: staza (track) 0 (plavi) - Real-time PCR eksperimenti obeleženi sa zadebljanim brojevima; staza (track) (svetlo plavo) -Uzivodni CDS; staza (track) (pale blue) - NizvodniCDS; staza (track) (grey) - rRNA; staza (track) (green) - tRNA; staza (track) 5 (crveno) - STS obeleženi regioni vezani za Real-time PCR; grafik 1 - GC sastav; grafik 2 - GC bias. (B) Funkcionalna anotacija R. hominis genoma pokazuje da najveći broj gena kodira ugljene hidrate, metaboličke protein i amino kiseline i derivate.
Slika 2. R. hominis odgovara na sredinu u stomaku putem pojačane ekspresije gena za pokretljivost, mobilizaciju i hemotaksiju. GF C3H/HeN streilnim (bez bakterija) miševima je davana kultura R. hominis putema gavaže tokom 28 dana, i poređeni su sa kontrolnim streilnim (bez bakterija) životinjama. 14. i 28. dana R. hominis–om tretirane životinje (N=5) i kontrolne životinje (N=4) su žrtvovane i uzeti su ileum, debelo crevo i cekum. A) Real-time PCR (lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu) validacija gena koji su uključeni u konjugacioni/mobilizacioni transfer. B) Real-time PCR (lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu) validacija gena koji su uključeni u pokretljivost i hemotaksiju. (C) Western blot analiza R. hominis gajenog in vitro u prisustvu UV ozračene briketirane hrane za miševe imuno obeležen sa afinitetno prećišćenima Fla1 antitelom, Fla2 specifičnim antiserumon i anti-DNA giraza A antitelom (traka 1: bez ishrane, (traka 2: 0.01g ishrana/10 mL of R. hominis culture, (traka 3: 0.02g ishrana /10 mL, (traka 4: 0.05g ishrana /10 mL, (traka 5: 0.1g ishrana /10 mL, (traka 6: 0.2g ishrana /10 mL, (traka: 0.5g ishrana /10 mL, traka 8: 1g ishrana /10 mL). Elektronska mikroskopija (EM) na kojoj se vidi flgela R. hominis (crne strelice). Imunohistohemija koja je primenjena na bakterije iz luminalnog sadržaja kolonizovanih miševa i iz R. hominis koji je gajen in vitro upotrebom FlaA1 i FlaA2 specifičnog antiseruma. Originalno uvećanje x1000. (D) Real-time PCR (lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu) validacija gena koji su uključeni u metabolizam butirata. (E) Real-time PCR analiza (lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu) R. hominis transkripta tokom in vitro izlaganja humanism intestinalnim epitelijalnim ćelijama. Rezultati Real-time PCR prikazani su kao promena reda veličine (fold change) *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
Slika 3. Identifikacija transkripata diferencijalno eksprimiranih u mišijem stomaku nakon monoasocijacije sa R. hominis
(A) Afimetriks mikroerej analiza diferencijalno eksprimiranih gena u miševima kolonizovanim sa R. hominis (N=5) u dnosu na GF (N=4). Bar grafikoni predstavljaju brojeve gena koji su više i niže eksprimirani nakon 14 i 28 dana. (B) Toplotne mape (heatmap) generisane od diferencijalno eksprimiranih gena sa funkcionalnom značajnošću između GF i miševa kolonizovanih sa R. hominis 14. i 28. dana. (C) Realtime PCR (lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu) validacija gena za koje je pokazano da se značajno razlikuju između miševa kolonizovanih sa R. hominis i GF miševa. Rezultati Real-time PCR prikazani su kao promena reda veličine (fold change), *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
Slika 4. Indukcija FoxP3+ Treg ćelija od strane Roseburia hominis. Analiza protošne citometrije FoxP3+ Treg ćelija u lamina propria (P=0.0425 između kontrole i tretmana sa R. hominis) i mezenteričnih limfnih čvorova (P=0.0683) konvencionalnih C3H/HeN tretiranih tokom 14 dana sa R. hominis.
Slika 5. T cell markers debelog creva su značajno indukovani sa monokolonizacijom od strane R. hominis. (A) Imunofluoresnetna analiza ćelijalamina propria uzlaznog dela debelog creva of ascending colon lamina sa anti-CD3 i anti-FoxP3 u sterilnim (bez bakterija) miševima monokolonizovanim sa R. hominis monokolonizovanim sa C3H/HeN (N=8) i C57BI/6 (N=3). (B) Imunofluoresnetna analiza ćelijalamina propria obeleženih sa (i) anti-Ly6G, (ii) anti-CD11b, (iii) anti-CD3, i (iv) anti-CD3 i anti-FoxP3 u uzlaznom delu debelog creva GF i tretiranih sa R. hominis C3H/HeN miševima. Podaci su prikazani kao broj pozitivnih ćelija po vidnom polju u GF miševima (N=7-8) i miševima tretiranim sa R. hominis (N=8-10). *P<0.05. Originalno uvećanje x630.
Slika 6. R. hominis flagelin RH1 ima specifičan efekat na intestinalne epitelijalne ćelije i mišije dendritične ćelije izvedene iz koštane srži.
(A) Toplotne mape (heatmap) generisane od diferencijalno eksprimiranih gena u Caco-2 intestinalnim epiteijalnim ćelijama (N=1) tretiranim sa različitim bakterijskim flagelinima Salmonella enteritidis (SE), E. coli K12 (EC), RH1 i RH2. (B) ekspresija (i) CD40; (ii) I-A/I-E i (iii) CD103 od strane CD11c+B220+CD317+ Flt3L- izvedenih dendritičnih ćelija iz konvencionalnih C3H/HeN, kontrola (plava) i nakom 24 sata inkubacije sa rekombinantnim flagelinom (SE, K12, RH1, RH2; green) određene protočnom citometrijom. Histogram predstavlja podatke iz tri ekperimenta. (C) Frekvence rekombinantnih flagelinom (SE, K12, RH1, RH2) ttretiranih Flt3L- i GMCSF-izvedenih populacija dendritičnih ćelija iz konvencionalnih C3H/HeN definisan ulaz na (gated on) CD11c+B220+CD317+ ćelije iCD11c+CD11b+B220- ćelije. Podaci su prikazani kao procenat ukupnih, živih pojedinačnih ćelija, srednja vrednost 6 SEM iz tri merenja. (D) Porteinska ekspresija citokina IL-10 i IL-12 merena putem CBA u supernatantima iz kontrolnih (nestimulisanih DCs; N=3) i RH1- tretiranih DCs (N=3) izvedenih iz C3H/HeN i C57Bl/6. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD. ***P<0.001. (E) Kvantitativna analiza imunofluorescentnog obeležavanja ćelija lamina propria uzlaznog dela debelog creva sa anti-CD3 i anti-FoxP3 u sterilnim (bez bakterija) i monokolonizovanim sa R. hominis TLR5KO miševima (N=2).
Slika 7. R. hominis atenuira inflamaciju u eksperimentalnom modelu kolitisa.
Dvadaset dve ženke C57BL/6 miševa je korišćeno za procenu terapeutskog efekta R. hominis tokom DSS-om indukovanog kolitisa. Tretirani miševi su dozirani na dnevnoj bazi sa 10<9>CFU R. hoministokom 14 dana. Od 8. Dana, miševima je divan DSS u vodu za piće tokom 6 dana. Ţivotinje su eutanazirane i uzeti su uzorci intestinalnog tkiva. (A) Netretirani DSS miševi (N=8) imali su jako povećanje gena kada se porede sa genima iz kontrolnih miševa (N=4), dok je diferencijalna ekspresija gena bila niža u životinjama tretiranim sa R. hominis (N=10). Rezultati Real-time PCR-a (lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu) su prikazani kao promena reda veličine, ***P<0.001. (B) Ocene histopatologije su predstavljene kao srednja vrednost procenta vidnih polja (fields of view) pri datoj oceni. R. hominis je značajno redukovao % vidnih polja za ocenu patologije 4 (p=0.02) I povećao % vidnih polja za ocenu 0. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD. (C) Uzlazni deo debelog creva (obojen hematoksilinomeozinom) kontrolnih, DSS-om tretiranih i tretiranih sa DSS/R. hoministreated IL-10KO životinja. Slike su prikaz vidnih polja svake tretirane grupe. Originalno uvećanje x100.
Dodatne slike
[0046]
Slika S1. R. hominis preferencijalno kolonizuje uzlazni deo debelog creva kod monokilonizovanih miševa. R. hominis kolonizuju uzlazni deo debelog creva u bliskoj asocijaciji sa bektreRijama epitela domaćina, detektovani pomoću FISH upotrebom A2-183 (R. hominis-specifina proba; FITC), Eub338 (univerzalna 16S proba; Cy3) i DAPI (jedra; plavo). Slojevi A2-183 Eub338 i Eub338 DAPI takođe su prikazani. Gama za crveni kanal je pojačan Eub338 DAPI sloj kako bi ilustrovao obeležene bakterije. Originalno uvećenje x630. (B) PCR sa R. hominis-specifičnim prajmerima pokazao je jak pozitivan signal za DNK fecesa kod post kolonizacije, dok je feces GF životinja bio negativan za prisustvo bilo koje bakterije. (C) Real-time PCR (lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu) analiza prikazuje novoe kolonizacije sa R. hominis/g fecesa. Bakterijska DNK izolovana iz fecesa je poređena sa poznatim standardnim koncentracijama R. hominis koji je gajen u kulturi. Slični nivoi bakterija su detektovani kod monokolonizovanih miševa približno 1x10<10>bacterija/g fecesa. Feces GF životinja bio je negativan na prisustvo bilo kakvih bakterija.
Slika S2. Analiza ontologije gena na genima koji su pojačani (up-regulated) 28. dana u uzlaznom delu debelog creva.
Ontologija gena (GO) bazirana na funkcionalnoj interpretaciji podataka izvedena je korišćenjem (http://david.ab- cc.ncifcrf.gov). Značajno različiti transkripti (P<0.05) su dodeljeni u GO categoriju 'Biološki proces' kako bi se našli značajno obogaćeni GO izrazi. GO biološki procesi za 'polimerizaciju aktina' (GO:0030041) i 'negativnu regulaciju I-kappaB kinaza/NF-kappaB kaskadu' (GO:0043124) su zahvaćeni.
Slika S3. Identifikacija trankripata koji su diferencijalno eksprimirani u mišijem stomaku nakon monokolonizacije sa E. coli. (A) Afimetriks mikroerej analiza diferencijalno eksprimiranih gena u miševima kolonizovanim sa E. coli i R. hominis tokom vremena. Bar grafikoni predstavljaju broj gena više i niže eksprimiranih nakon 22 i 28 dana. Toplotna mapa generisana iz diferencijalno eksprimiranih gena sa funkcionalnom značajnošću u miševima kolonizovanim sa E. coli 22. d vs.10.d.
Slika S4. Identifikacija trankripata koji su diferencijalno eksprimirani u TLR5KO mišijem stomaku nakon monokolonizacije sa R. hominis. Toplotna mapa generisana iz diferencijalno eksprimiranih gena u uzlaznom delu debelog creva u TLR5KO miševima kolinizovanim sa R. hominis (N=3) i divljim miševima (N=3) 28d. (B) Toplotna mapa generisana iz diferencijalno eksprimiranih gena povezanih sa imunitetom u uzlaznom delu debelog creva u TLR5KO miševima kolinizovanim sa R. hominis i divljim miševima 28d. (C) Toplotna mapa generisana iz diferencijalno eksprimiranih gena u ileumu u TLR5KO miševima kolinizovanim sa R. hominis i divljim miševima 28d. (D) Toplotna mapa generisana iz diferencijalno eksprimiranih gena povezanih sa imunitetom u ileumu u TLR5KO miševima kolinizovanim sa R. hominis i divljim miševima 28d.
Slika S5. Analiza ontologije gena na genima koji su smanjeni (down-regulated) 28. dana u uzlaznom delu debelog creva.
GO bioloških procesa koji su uključeni u regulaciju apetita kao 'negativna regulacija odgovora na hranu' (GO:0032096), 'negativna regulacija apetita' (GO:0032099) i 'regulacija sekrecije kateoholamina' (GO:0050433) bili su najviše zahvaćeni.
Slika S6. Kolonizacija sa R. hominis utiče na gene sitosti i telesnu težinu. Izvedene su analize suve telesne mase i lipida trupla životinja. (A) Suve težine trupla životinja miševa povezanih sa R. hominis bile su značajno veće kada se uporede sa GF životinjama. (B) Analiza lipida trupla životinja pokazala je da je ukupna adipoznost takoše veća u životinjama tretiranim sa R. hominis bile 14. dana. Podaci su predstavljeni kao ± SD.
Slika 1A Prikaz vektora za kloniranje pCR-Blunt II-TOPO koji je korišćen za kloniranje rekombinantnih flagelina koji su nerastvorljivi nakon lize ćelija. Omogućava visoko efikasno DNK kloniranje PCR proizvoda sa ravnim krajevima (blunt end). Kodira genee za rezistenciju na kanamicin i zeocin za selekciju u E. coli, i insert je okružen sa višestrukim restrikcionim mestima za izrezivanje.
Slika 2A Prikaz eskpresionog vektora T7-MAT-Tag-FLAG- koji je korišćen za kloniranje rekombinantnih flagelina koji su nerastvorljivi nakon lize ćelija. Mesto za višestruka kloniranja (MCS) je okruženo sa MAT sekvencom (Metal Affinity Tag, oznaka za afinitet ka metalu) i FLAG peptidnom sekvencom (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), što rezultuje u proizvodnji dvostruko označenog (double tag) flagelina, koji se dalje može prečititi sa afinitativnom kolonom. Ovaj ekspresioni vektor takođe kodira pT7/lac (fagni T7 lac operon) promotor za IPTG iinducibilne, vusoko eksprimirane MAT-ORF-FLAG rekombinantne flageline, unutrašnji lacI gene koji reprimira transkripociju na bazalni nivo u bilo kom E. coli domaćinu, i gen AmpR gene za ampicilinsku selekciju.
Slika 3A Vizualizacija SDS-PAGE rekombinantnog flagelina kloniranog sa pCR-Blunt II-TOPO vektor za kloniranje i ekspresija preko pT7-MAT-Tag-FLAG-2 skpresionog vremena. Opis u traci: 1, proteinski standard (kDa); 2, RH1.
Slika B1A i B1 B prikazuje SDS-analizu rekombinantnih proteina.
(A) K12 (Escherichia coli K12); ER (Eubacterium rectale 33656); RI1 (Roseburia intestinalis Fla 1); RI2 (Roseburia intestinalis Fla 2);
 (B) RH1 (Roseburia hominis Fla 1); RH2 (Roseburia hominis Fla 2); RI3 (Roseburia intestinalis Fla 3); RI4 (Roseburia intestinalis Fla 4).
Slika C1-C4. Višestruko poravnanje sekvenci potvrđuje nukleotidnu sekvencu flagelina i broj pristupa.
Slika D.2 Komparativna analiza indukcije CCL20 gena od strane različitih flagelina. HT-29 i Caco-2 ćelije su stimulisane tokom 2 sata sa pojedinačnim flagelinom u koncentraciji 100 ng/mL. Ukipna RNK je izolovana urađena je kvatitativna analiza lančane reakcije u realnom vremenu za CCL20 i β-aktinske gene. Eksperimenti su urađeni u triplikatu u tri odvojena događaja. Tabela D2 pokazuje značajne razlike između svakog tretmana izračunato sa uporednim t testom (paired T test) u HT-29. Slika D.3. Sekrecija hemokina posredovana flagelinom u HT-29 i Caco-2 ćelijama. tebele D3a, D3b, D3c i D3d pokazuju značajne razlike između svakog tretmana izračunato sa sa uporednim t testom (paired T test) u HT-29.
Slika D4, neutralizacija TLR5 sa anti-TLR5 specifičnim antitelom.
Slika D5A: Frekvence GM-CSF/IL-4 izvedenih dendritičnih ćelija stimulisanih sa rekombinantnim flagelinima, podaci su prikazani kao promene reda veličine (fold) u poređenju sa nestimulisanim GM-CSF/IL-4 izvedenim dendritičnim ćelijama.
Slika D5B: Frekvenca Flt3L izvedenih dendritičnih ćelija stimulisanih sa rekombinantnim flagelinima, podaci su prikazani kao promene reda veličine (fold) u poređenju sa nestimulisanim Flt3L izvedenim dendritičnm ćelijama.
Slika D 6 A i B Analiza tečne citometrije FoxP3+ Tregs u lamina propria BOY/J WT i TLR5KO miševima tretiranim sa R. hominis.
DETALJAN OPIS
Flagelin
[0047] Flagelin je sastavni konstituent flagele bakterija i prisutan je u velikim količinama kod skoro svih bakterija sa flagelama. Tipično, flagelini su globularni proteini koji su organizovani u šuplji cilindar koji formira filament u okviru bakterijske flagele.
[0048] Diverzitet strukturnih proteina flagelina i sekvenci gena je prepoznata i varira u okviru bakterijskih vrsta, u zavisnosti od geografije porekla, da li se radi o kliničkim ili sredinskim izolatima. Postoji hiljade flagelina i gena povezanih sa flagelinima. Neke od važnih bakterija gastrointestinalnog trakta uključuju flageline FLA, FliC, FlgC, FLiE, FlaB, MoA i FliG.
[0049] Postoji nekoliko tipova FLA (Fla) polipeptida. FlaA1, FlaA2, FlaA3, FlaA4 i FlaB su primeri FLA polipeptida.
Polipeptid FlaA1
[0050] Izraz "polipeptid FlaA1" koji se ovde koristi odnosi se na protein flagelin FlaA1. Primeri ovakvih polipeptida uključuju FlaA1 polipeptid iz Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, i Roseburia inulinivorans; polipeptidna sekvenca prikazana kao SEQ ID NO 2 iliSEQ ID No 6; I polipeptidi koji imaju najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičnost sa SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6 ili njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima.
[0051] SEQ ID NO 2 ima sledeću sekvencu:
[0052] SEQ ID NO 2 je deponovan u NCBI pod brojem za pristup ABI8297.1.
[0053] Izrazi "polipeptid FlaA1" i "FlaA1 polipeptid" se ovde koriste recipročno (podjednako i zamenjuju jedan drugog).
[0054] Izrazi "FlaA1", "Fla1" i "RH1" mogu se ovde koristiti recipročno (podjednako i zamenjuju jedan drugog).
[0055] U jednom izvođenju, polipeptid FlaA1 je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan SEQ ID NO 2 ili njegovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima. U jednom aspektu amino kiseline na poziciji 79 do 117 I pozicijama 408 do 439 kao i 411, 412, 420 od SEQ ID NO 2 (ili njegovih ekvivalenata) smatraju se važnim U jednom aspektu, amino kiseline na pozicijama 411, 412, 420 odSEQ ID NO 2 (ili njegovih ekvivalenata) su alanine (A), glutamin (Q) i serin (S).
[0056] U jednom izvođenju polipeptid FlaA1 je polipeptid prikazan kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6.
[0057] FlaA1 polipeptid se može dobiti iz određenih mikroorganizama. U okviru jednog aspekta, FlaA1 polipeptid se dobija iz bakterije kao što je Firmicute (grupa firmikuta). U sledećem aspektu FlaA1 polipeptid je dobijen iz Roseburia spp kao što je Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, ili Roseburia inulinivorans.
[0058] Roseburia hominis i Roseburia intestinalis su nedavno opisani anaerobni komensali stomaka iz filogenetičkog klastera XIVa u okviru carstva Firmicutes, i predstavljaju dominantnu grupu bakterija u crevima čoveka, a takođe su glavni proizvođači butirata. Primer Roseburia hominis je soj deponovan pod Budapest Treaty u National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) u NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB21 9YA, 21 Oktobra 2004 od strane Rowett Research Institute pod brojem pristupa NCIMB 14029<T>Roseburia hominis A2-183<T>(DSM = 16839<T>). Drugi primer je bakterijska vrsta Roseburia hominis opisana kod Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B., & Flint, H. J. (2006) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2437-2441. primer Roseburia intestinalis je soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 13810 Rosburia intestinalis L1-82<T>(DSM = 14610<T>) Još jedan primer je bakterijska vrsta Roseburia hominis opisana kod Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B., & Flint, H. J. (2006) Int. J. Syst. Evol. Microbiol.56: 2437-2441.
[0059] Izraz "polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid FlaA1" koji se ovde koristi odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein flagelin FlaA1. Primeri ovakvih polinukleotidnih sekvenci uključuju gen FlaA1 iz R. hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, ili Roseburia inulinivorans; polinukleotidna sekvenca prikazana kao SEQ ID NO 1 ili SEQ ID No 5; polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptid prikazan kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6; polinukleotidne sekvence koje imaju najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO 1 ili SEQ ID No 5 ili njeihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima, bilo koja polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid prikazan kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6 ili kodira polipeptid koji je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan u odnosu na polipeptid prikazan kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6 ili sa njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima.
[0060] SEQ ID NO 1 ima sledeću sekvencu:
[0061] SEQ ID NO 1 je deponovan u NCBI pod brojem pristupa DQ789140.1.
[0062] U jednom izvođenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid FlaA1 je najmanje 75%, 80%, 85%, 
 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa polinukleotidnom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO 1 ili SEQ ID No 5 ili sa njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima.
[0063] U jednom izvođenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid FlaA1 kodira polipeptid prikazan kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6 ili polipeptid koji je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa polipeptidom prikazanim kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6 ili sa njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima.
[0064] U jednom izvođenju, polipeptid FlaA1 je skraćen FlaA1 polipeptid. Na primer, skraćen polipeptid obuhvata najmanje 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ili 200 amino kiselina polipeptida prikazanog kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID No 6.
[0065] Bez namere vezivanja za teoriju, dva esencijalna regiona proteina flagelina koji su ukljuleni u prepoznavanje i aktivaciju TLR5 su amino kiseline 79-117 iz sekvence SEQ ID NO 2 (N-D1 domen) i amino kiseline 408-439 iz sekvence SEQ ID NO 2 (C-D1 domen). Bez namere vezivanja za teoriju, amino kiseline: A411, Q412, S420 su važne amino kiseline.
[0066] Primeri skraćenih polipeptida FlaA1 uključuju: polypeptide koji obuhvataju amino kiseline 79-117 i amino kiseline 408-439 iz sekvence SEQ ID NO 2; polipeptide koji su najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identični amino kiselinama 79-117 i amino kisleinama 408-439 iz sekvence SEQ ID NO 2; polipeptide koji su najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identični amino kiselinama 79-117 i amino kiselinama 408-439 iz sekvence SEQ ID NO 2 što je amino kiselina na poziciji 411 (ili na ekvivalentu te pozicije) alanin (A) i/ili da je amino kiselina na poziciji 214 glutamin (Q) Ii/ili da je amino kiselina na poziciji 420 serin (S); polipeptidi koji obuhvataju amino kiseline 79-439 iz sekvence SEQ ID NO 2; polipeptidi koji obuhvataju amino kiseline 79-439 iz sekvence SEQ ID NO 2 što je amino kiselina na poziciji 411 (ili na ekvivalentu te pozicije) alanin (A); polipeptidi koji imaju najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa amino kiselinama 79-439 iz sekvence SEQ ID NO 2; i polipeptidi koji su najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identični sa amino kisleinama 79-439 iz sekvence SEQ ID NO 2 što je amino kiselina na poziciji 411 (ili na ekvivalentu te pozicije) alanin (A) i/ili da je amino kiselina na poziciji 214 glutamin (Q) Ii/ili da je amino kiselina na poziciji 420 serin (S);
[0067] U jednom aspektu amino kisleine na pozicijama 411, 412, 420 iz sekvence SEQ ID NO 2 (ili na ekvivalentu tih pozicija) u skraćenom FlaA1 polipeptidu su alanin (A), glutamin (Q) i serin (S).
[0068] U jednom izvođenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid FlaA1 kodira skraćeni FlaA1 polipeptid.
[0069] U jednom izvođenju, polipeptid FlaA1 je fuzioni polipeptid. Na primer, polipeptid je fuzionisan sa glutation S transferazom (GST).
Rod Roseburia
[0070] Roseburia bakterije su zaobljene štapićaste ćelije koje su striktni anaerobi i predstavljaju domaće stanovnike creva sisara. Ove bakterije su producenti butirata i aktivno su pokretne zahvaljujući višestrukim flagelama (bičevima) koji su prisutni na konkavnoj strain ćelije i nalaze se u skupini (klasteru) na jednom kraju (Stanton and Savage 1983). Trenutno, u okviru roda Roseburia identifikovano je i okarakterisano pet vrsta: Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia hominis, Roseburia intestinalis, i Roseburia inulinivorans (Stanton and Savage 1983, Duncan et al 2006).
[0071] Stanton and Savage (1983 - Roseburia cecicola gen. nov., sp. nov., a motile, obligately anaerobic bacterium from a mouse cecum. Int. J. Syst. Bacterial., 1983, 33, 618-627.) opisuje Roseburia cecicola.
[0072] Duncan et al. (2006 - Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 2437-2441) opisuje Roseburia faecis.

[0073] Duncan et al. (2006 - Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 2437-2441) opisuje Roseburia hominis.
[0074] Duncan et al. (2002 - Roseburia intestinalis sp. nov., a novel saccharolytic, butyrate-producing bacterium from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52, 1615-1620) opisuje Roseburia intestinalis.
[0075] Duncan et al. (2006 - Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulin- ivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 2437-2441) opisuje Roseburia inulinivorans.
Roseburia flagelin
[0076] Izraz Roseburia flagelin koji se ovde koristi odnosi se na protein flagelin dobijen iz bakterije Roseburia kao što su Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, i Roseburia inulinivorans.
[0077] Roseburia flagelin može biti flaA1, flaA2, flaA3, flaA4 ili njihova kombinacija.
[0078] Izrazi "FlaA1", "FlaB1", "flaA1" i "fla1" ovde se mogu međusobno zameniti. 

[0079] Izrazi "FlaA2", "Fla2", "flaA2" i "fla2" ovde se mogu međusobno zameniti. 

[0080] Izraz Fla se ovde koristi da obuhvati polipeptide koji mogu bitibe flaA1, flaA2, flaA3 flaA4 ili fliC.
[0081] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obuhvata upotrebu najmanje jednog Roseburia flagelina. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata upotrebu kombinacije najmanje dva, namanje tri, najmanje četiri ili najmanje pet Roseburia flagelina.
[0082] U nekim izvođenjima kombinacija Roseburia flagelina obuhvata flageline koji su izvedeni iz ili dostavljeni od strane dve, tri, četiri ili pet različitih vrsta Roseburia.
[0083] Primeri Roseburia flagelina uključuju flageline koji su izvedeni iz ili dostavljeni od strane Roseburia bakterija kao što su Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, i Roseburia inulinivorans. U jednom izvođenju flagelin je izveden iz ili dostavljen od strane Roseburia hominis. U drugom izvođenju flagelin je izveden iz ili dostavljen od strane Roseburia intestinalis.
0084] Primeri Roseburia flagelina uključuju polipeptidne sekvence koje su najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identične sa SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12 ili njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima.
[0085] U jednom izvođenju, Roseburia flagelin ima polipeptidnu sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12.
[0086] Primeri of Roseburia hominis flagellina su Roseburia hominis Fla1 i Fla2.
[0087] Primer za Roseburia hominis Fla1 je prikazan kao SEQ ID NO 2. Roseburia hominis Fla1 i ovde se takođe odnos i na RhFlaA1, RHFlaA1, RhFla1, RHFla1, RH1 ili Rh1.
[0088] SEQ ID NO 2 ima sledeću skevencu:
[0089] SEQ ID NO 2 deponovan u NCBI pod brojem za pristup ABI48297.1.
[0090] Primer za of Roseburia hominis Fla2 je prikazan kao SEQ ID NO 4. Roseburia hominis Fla2 i ovde se takođe odnosi i na RhFla22, RHFlaA2, RhFla2, RHFla2, Rh2 ili RH2.
[0091] SEQ ID NO 4 ima sledeću skevencu:
[0092] Primeri za Roseburia intestinalis flagellins include Roseburia intestinalis Fla1, Fla2, Fla3 i Fla4.
[0093] Primer za Roseburia intestinalis Fla1 je prikazan kao SEQ ID No 6. Roseburia intestinalis i ovde se takođe odnosi i na RiFlaA1, RIFlaA1, RiFla1, RIFla1, Ri1 ili RI1.
[0094] SEQ ID NO 6 ima sledeću skevencu:
[0095] Priemer za Roseburia infestinalis Fla2 je prikazan kao SEQ ID No 8. Roseburia intestinalis Fla2 i ovde se takođe odnosi i na RiFlaA2 ili RIFlaA2 ili Ri2 ili RI2.
[0096] SEQ ID NO 8 ima sledeću skevencu:
[0097] Primer za Roseburia intestinalis Fla3 je prikazan kao SEQ ID No 10. Roseburia intestinalis Fla3 i ovde se takođe odnosi i na RiFla3 ili RIFla3 ili Ri3 ili RI3.
[0098] SEQ ID NO 10 ima sledeću skevencu:
[0099] Primer za Roseburia intestinalis Fla4 je prikazan kao SEQ ID No 12. Roseburia intestinalis Fla4 i ovde se takođe odnosi i na RiFla4 ili RIFla4 ili Ri4 ili RI4.
[0100] SEQ ID NO 12 ima sledeću skevencu:
[0101] Izrazi "polipeptid FlaA1", "FlaA1 polipeptid", "polipeptid Fla1" i "Fla1 polipeptid " ovde se mogu međusobno zameniti odnosno isto se koriste. Izrazi "polipeptid Fla2" i "Fla2 polipeptid" ovde se mogu međusobno zameniti odnosno isto se koriste. Izrazi " polipeptid Fla3" i "Fla3 polipeptid" ovde se mogu međusobno zameniti odnosno isto koristiti. The terms "polipeptid Fla4" i "Fla4 polipeptid" ovde se mogu međusobno zameniti odnosno isto koristiti.
[0102] U jednom aspektu, Roseburia flagelin je odabran iz grupe koja se sastoji od Fla1, Fla2, Fla3 i Fla4. U jednom izvođenju, Roseburia flagelin je odabran iz grupe koja se sastoji od Fla2, Fla1, Fla4 i njihove kombinacije. U budućem izvođenju, Roseburia flagelin je Fla2.
[0103] U jednom aspektu, Roseburia flagelin je odabran iz grupe koja se sastoji od Roseburia hominis Fla1, Roseburia hominis Fla2, Roseburia intestinalis Fla1, Roseburia intestinalis Fla2, Roseburia intestinalis Fla3 i Roseburia intes- tinalis Fla4. U jednom izvođenju, Roseburia flagelin je odabran iz grupe koja se sastoji od Roseburia hominis Fla2, Roseburia intestinalis Fla2, Roseburia intestinalis Fla1, Roseburia intestinalis Fla4 i njihove kombinacije. U budućem izvođenju, Roseburia flagelin je odabran iz grupe koja se sastoji od Roseburia hominis Fla2, Roseburia intestinalis Fla2 i njihove kombinacije. U drugom izvođenju, Roseburia flagelin je Roseburia intestinalis Fla2.
[0104] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obuhvata upotrebu najmanje jedne polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia flagelin. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata kombinaciju najmanje dve, najmanje, tri, najmanje četiri ili najmanje pet polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju Roseburia flageline.
[0105] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obuhvata upotrebu najmanje jedne polinukleotidne sekvence koja kodira najmanje jedan Roseburia flagelin. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata kombinaciju najmanje dva, najmanje, tri, najmanje četiri ili najmanje pet polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju Roseburia flageline.
[0106] Polinukleotidne sekvence koja kodira a Roseburia flagelin može da kodira flaA1, flaA2, fla3, fla4 ili njihovu kombinaciju.
[0107] U nekim izvođenjima, kombinacija polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju Roseburia flageline sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju flageline koji su dobijeni iz ili dostavljeni iz najmanje jedne, dve, tri, četiri ili pet različitih vrsta Roseburia.
[0108] U nekim izvođenjima, polinukleotidna sekvenca kodira kombinaciju Roseburia flagelina koji su dobijeni iz ili dostavljeni iz najmanje jedne, dve, tri, četiri ili pet različitih vrsta Roseburia.
[0109] U drugom izvođenjimu, ovaj pronalazak obuhvata kombinaciju najmanje jednog Roseburia flageline i najmanje jedne polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia flagelin.
[0110] Primeri polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia flageline uključuju flagelina koji su dobijeni iz ili dostavljeni iz Roseburia bacterium kao što je Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, i Roseburia inulinivorans. U jednom izvođenju, polinukleotidna sekvenca kodira Roseburia flagelin koji je dobijen iz ili dostavljen iz Roseburia hominis U drugom izvođenjimu, polinukleotidna sekvenca kodira Roseburia flagelin koji je dobijen iz ili dostavljen iz Roseburia intestinalis.
[0111] Primeri polinukleotidnih sekvenci koja kodiraju Roseburia flagelin uključuju polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptid koji je najmanje 75% identičan sa SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12 ili njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima i polinukleotidne sekvence koje su najmanje 75% identične sa SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9 ili SEQ ID NO 11 ili njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima.
[0112] U jednom izvođenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin ima polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12.

[0113] U jednom izvođenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin ima polinukleotidnu sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9 ili SEQ ID NO 11.
[0114] Primeri polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia flageline su polinukleotidne sekvence koje kodiraju Roseburia hominis Fla1 i Fla2.
[0115] Primer polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia hominis Fla1 je prikazan kao SEQ ID NO 1.
[0116] SEQ ID No 1 ima sledeću sekvencu:
[0117] Primer polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia hominis Fla2 je prikazan kao SEQ ID NO 3.
[0118] SEQ ID No 3 ima sledeću sekvencu:
[0119] Primeri polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju Roseburia intestinalis flageline su polinukleotidne sekvence koje kodiraju Roseburia intestinalis Fla1, Fla2, Fla3 i Fla4.
[0120] Primer polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla1 je prikazan kao SEQ ID NO 5.
[0121] SEQ ID No 5 ima sledeću sekvencu:
[0122] Primer polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla2 je prikazan kao SEQ ID NO 7. 

[0123] SEQ ID No 7 ima sledeću sekvencu:
[0124] Primer polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla3 je prikazan kao SEQ ID NO 9.
[0125] SEQ ID No 9 ima sledeću sekvencu:
[0126] Primer polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla4 je prikazan kao SEQ ID NO 11.
[0127] SEQ ID No 11 ima sledeću sekvencu:
[0128] U jednom aspektu, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin je odabrana iz grupe koja se sastoji od Fla1, Fla2, Fla3 i Fla4. U jednom izvođenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin je odabrana iz grupe koja se sastoji od Fla1, Fla2, Fla3 i Fla4 i njihovih kombinacija. U daljem izvođenju polinukleotidna sekvenca kodira Roseburia flagelin Fla2.
[0129] U jednom aspektu, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin je odabrana iz grupe koja se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia hominis Fla1, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia hominis Fla2, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla1, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla2, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla3 i polinukleotidne sekvence koja kodira Fla4. U jednom ostvarenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin je odabrana iz grupe koja se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia hominis Fla2, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla2, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla1, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla4 i njihove kombinacije. U budućem ostvarenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin je odabrana iz grupe koja se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia hominis Fla2, polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla2 i njihove kombinacije. U drugom ostvarenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin je polinukleotidne sekvence koja kodira Roseburia intestinalis Fla2.
[0130] Terapeutski efekat flagelina je evaluiran od strane inventora (pronalazača) funkcionalnim esejima.
[0131] U jednom ostvarenju, Roseburia flagelin je skraćen Roseburia flagelin. Na primer, skraćeni Roseburia flagelin obuhvata najmanje 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ili 200 amino kiselina polipeptida prikazanog kao SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12.
[0132] U jednom ostvarenju, Roseburia flagelin je skraćen Roseburia hominis flagelin ili skraćen Roseburia intestinalis flagelin.
[0133] U jednom ostvarenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin kodira skraćeni FlaA1, Fla2, Fla3 ili Fla4. Na primer, polinukleotidna sekvenca kodira skraćeni Roseburia flagelin koji obuhvata najmanje 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ili 200 amino kiselina polipeptida prikazanog kao SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12.
[0134] U jednom ostvarenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin kodira skraćeni FlaA1 ili Fla3.
[0135] U jednom ostvarenju, Roseburia flagelinje fuzioni polipeptid. Na primer, polipeptid je fuzionisan sa glutation S-transferazom (GST).
Tabela B - sumarno pristupni brojevi za ovde opisane Roseburia flageline
Modulacija/regulacija
[0136] Izrazi "modulacija" i "regulacija" ovde se mogu koristiti na isti način I međusobno zameniti.
[0137] U jednom ostvarenju, izraz "modulacija" odnosi se na povećabnje i/ili indukciju i/ili promociju i/ili aktivaciju, U alternativnom izvođenju, izraz "modulacija" odnosi se na smanjenje i/ili redukciju i/ili inhibiciju.
[0138] U jednom ostvarenju, izraz "regulacija" odnosi se na pojačanu ekspresiju (up regulation). U alternativnom izvođenju, izraz " regulacija " odnosi se na smanjenu ekspresiju (downregulation).
[0139] U jednom ostvarenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, I/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) redukuju upalu (inflamaciju) tkiva ili organa.
[0140] Na primer, upala alimentarnog kanala ili njegovog dela kao što su creva je redukovana.
[0141] Izraz "upala (infalmacija)" koji se ovde koristi odnosi se na jedno ili više od sledećeg: crvenilo, oticanje, bol, osetljivost, toplotu, i poremećenu funkciju tkiva ili organa usled upalnog procesa koji je izazvan perkomernom reakcijom imunskog sistema.
[0142] Redukcija upale kod subjekta može se dorediti na osnovu nivoa pro zapaljenskih citokina i hemokina u tkivu, serumu i/ili uzorku fecesa u subjektu pre, i nakon što je Roseburia flagelin, i/ili polipeptida Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) dostavljen subjektu. Na primer, nivo jednog ili više interleukina može da se prati: IL-1, IL-4, IL5, IL6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-17, IL-21, IL-22, IL23, TNFα, IFN-γ, CXCL1, CXCL10, CCL2, CCL20 serumski kalprotektin i u fecesu kalprotektin, SA1009/SA1008 kalcijum vezujuči proteini, i interferoni Tipa 1, CD marker kao što su CD163, CD14, upalni transkripcioni faktori kao NF-kB, STAT, i MAPkinaze, c-reaktivni protein (CRP), nivo sedimentacije eritrocita (ESR), protein komplementa, serumski albumin, hustološka procena ciljnih tkiva i organa, indikatori aktivnosti bolesti. Dalje, u humanism studijama upitnici za procenu kvalitet života mogu se popuniti pre, i nakon što je Roseburia flagelin, i/ili polipeptida Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) data subjektu.
[0143] U jednom izvođenju, količina tkiva ili organa koja je zahvaćena zapaljenskim procesom je najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% niža kada se uporedi sa količinom tkiva ili organa koji je upaljen u subjektu pre, i nakon što je Roseburia flagelin, i/ili polipeptida Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) dostavljena subjektu.
[0144] U jednom izvođenju Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) redukuje upalu od strane epitelijalnih ćelija tkiva ili organa.
[0145] Na primer, epitelijalne ćelije su epitelijalne ćelije alimentarnog kanala ili njegovog dela (kao creva) (kao FlaA1 ili FlaA2).
[0146] U jednom izvođenju Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) povećava proizvodnju T ćelija u subjektu.
[0147] U jednom izvođenju, T ćelije su regulatorne T ćelije (nazvane takođe i Tregs) kao regulatorne T ćelije sposobne da eksprimiraju TLR5 (tolični receprtor 5, Toll-like receptor 5).
[0148] Bez namere vezivanja za teoriju, povećanje u broju Treg će nadjačati efekte drugih efektornih T ćelija (takođe se nazivaju i Teffs) kao Th1, Th17 i Th2 koji dovode do zapaljenskih procesaautoimunoloških i/ili alergijskih stanja. Tako da se svojstva Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) se mogu eksploatisati na mnogo načina u smislu adresiranja mnogih oboljenja gde je došlo do gubitka balansa Teff/Treg ćelija, na primer kod Kronove bolesti ili ulcerativnog kolitisa.
[0149] U jednom izvođenju proizvodnja T ćelija u subjektu je povećana tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% viđe čelija ili više od 100% T ćelija, kada se uporedi sa brojem T ćelija u subjektu pre davanja Roseburia flagelina i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0150] Izraz "imunksi sistem" koji se ovde koristi može da se odnosi na adaptivni imunksi system i/ili urođeni imuni.
[0151] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za upotrebu u regulaciji adaptivnog imunskog sistema subjekta.
[0152] Kao što se ovde koristi, "adaptvini imuni", ili drugačije poznat kao "specifični imuni", odnosi se na visoko specijalizovane, sistemske ćelije i process koji eliminišu ili sprečavaju rast patogena. Adaptivni imunološki odgovor obezbeđuje imuni kičmenjaka sa sposobnošću da prepoznaju i da se sete određenih patogena (da stvore imunološkitet) i da podignu jače odgovore svaki put kada dođu u susret sa petogenom.
[0153] Kao što se ovde koristi, "reguliše adaptivni imuni", znači indukciju aktivnosti adaptivnog imunskog sistema, i/ili poboljšanje imunoloških homeostatskih mehanizama kroz povećanje nivoa aktivnosti u odnosu na bazičan nivo aktivnosti. Poželjno je da je adaptivni imuni modulisan ka imuno regulaciji (a ne ka imuno aktivaciji i samim tim redukciji inflamacije tj upale).
[0154] Defekti i poremećaji koji su povezani za adaptivnim imunološkim sistemom, posebno oni povezani sa funkcijom T ćelija, povezani su sa mnogim zapaljenskim i autoimunološkim bolestima. Odgovori T ćelija povezani sa Th1, Th2 i Th17 su povezani sa atopijskim, zapaljenskim i autoimunološkim bolestima. Terapije koje poboljšavaju ili povećavaju populacije T regulatornih ćelija (Treg) su važne za kontrolu bolesti koja je izazvana suvipnim Th1, Th2 i Th17 ćelijskim odgovorima.
[0155] Još jedan aspect pronalaska odnosi se na Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) u upotrebi u regulaciji urođenog imunskog sistema subjekta.
[0156] Kao što se ovde koristi, "urođeni imuni", ili drugačije poznat kao "nespecifični imuni ", odnosi se na ćelije i mehanizme koji obezbeđuju domaćina sa trenutnom odbranom protiv infekcija od strane drugih organizama na nespecifičan način. Ovo znači da ćelije urođenog imunskog sistema prepoznaju i odgovaraju na patogen na uopšten način, ali za razliku od adaptivnog imunskog sistema ne obezbeđuju dugotrajan ili protektivan imunološkitet u domaćinu.
[0157] Kao što se ovde koristi, "reguliše urođeni imuni" znači indukciju aktivnosti urođenog imunskog sistema, I/ili povećanje nivoa aktivnosti u odnosu na baznu aktivnost na način da poboljšava imunsku homeostazu.
[0158] Gubitak ili deregulacija funkcije urođenog imunskog sistema, ili usled gubitka epitelijalne barijere, urođenih imunoloških peptida kao što su defensini, hemokini I citokini ili defektan TLR signalni sut su povezani sa povećanim rizikom od nastanka zapaljenskih bolesti, u nekoliko organa u telu uključujući creva. Ovakve bolesti uključuju zapaljensku bolest creva.
[0159] U jednom ostvarenju, Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) restaurira imunološku toleranciju.
[0160] Kao što se ovde koristi izraz "imunološka tolerancija" odnosi se na proces putem koga imunološki system ne napada antigen kao na primer sopstveni antigen.
[0161] Kao što se ovde koristi izraz "restaurira imunološku toleranciju" odnosi se na restauraciju imunološke tolerancije na jedan ili više antigena (kao što je sopstveni antigen) u subjektu na takav način da nivo imunološke tolerancije na antige je veći kada se uporedi sa nivoima u subjektu pre davanja Roseburia flagelina i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0162] U jednom izvođenju Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) aktivira dendritične ćelije i/ili epitelijalne ćelije.
[0163] Kao što se ovde koristi "aktivira dendritične ćelije " odnosi se na pojačanu aktivaciju (up regulation) jednog ili više ćelijskih markera (kao što su-A/I-E ćelijski markeri, CD80 i CD86 i CD40) i/ili povećanje proizvodnje jednog ili više citokina (kao što su IL-10 i TGFβ) od strane ćelija (kao što su dendritične ćelije) u subjektu kada se uporede sa nivoima u subjektu pre dostavljanja Roseburia flagelina i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0164] Izraz "I-A/I-E" koji se ovde koristi odnosi se na ćelijske markere MHC klase II.
[0165] CD40 ima ključnu ulogu u imunološkitetu, i predstavlja jedan od najbolje okarakterisanih kostimulatornih molekula. Receptor, član familije receptora faktora nekroze tumora je eksprimiran od strane profesionalnih antigen prezentujućih ćelija kao što su dendritične ćelije. CD40 vezuje svoj ligand CD40L, koji se tranzijentno eksprimiran na T ćelijama I drugim neimunološkim ćelijama u uslovima upale.
[0166] CD40L je primer T ćelijskog markera. CD3, CD4, CD25, FoxP3, CTLA-4, Ly6g i CD11b su sledeći primeri T ćelijskih markera.
[0167] CD80 i CD86 se eksprimiraju na antigen prezentujućim ćelijama (kao što su dendritične ćelije) i neophodni su za razvoj i kostimulaciju T ćelijskih odgovora. CD28 i CTLA-4 molekuli na T ćeljama služe kao receptori za CD80 i CD86 kostimulatorne antigene.
[0168] CD3, CD4, CD25, FoxP3, CTLA-4, Ly6g i CD11b su primeri markera T regulatornih ćelija debelog creva.
[0169] Bez želje vezivanja za teoriju, raspad Ly6g (npr. Ly6g6c i ly6g6e) povećava opasnost od infekcije, kako u stomaku tako I u respiratornom traktu I povezan je sa oboljenjima kao što je neutropenija. Zato, u jednom izvođenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) se koristi za upotrebu u lečenju neutropenije.
[0170] Još jedan aspect pronalaska odnosi se na Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) za održavanje imunske homeostaze u subjektu. Kao što se ovde koristi, izraz "održavanje imunske homeostaze "odnosi se na samo regulaciju imunskog sistema tela u cilju održavanja oralne tolerancije ili imunske stabilnosti kao odgovor na promenu uslova. Oralna tolerancija se odnosi na normalne imunske odgovore na hranu i komensalne bakterije u zdravom stomaku. Oni su izgubljeni kod celijačne bolesti i zapaljninske bolesti creva kao što je Kronova bolest i ulceraticni colitis. Zato u jednom aspektu Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) se koristi za lečenje celijalne bolesti i zapaljinske bolesti creva kao što su Kronova bolest i ulcerativni colitis.
[0171] U jednom izvođenju pojačani su brojevi ćelijskih markera na ćelijama u subjektu tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelijskih markera na ćeliji ili više od 100% više ćelijskih markera na ćelijama, kada se uporedi sa brojem ćelijskih markera na ćelijama u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koje poseduju ćelijski marker se povećava tako da najmanje10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima ćelijski marker ili više od 100% ćelija koje imaju ćelijski marker kada se uporede sa brojem ćelija sa ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0172] U jednom aspektu, ćelije su T ćelije.
[0173] U drugom aspektu, ćelije su ćelije alimetarnog kanala (kao ćelije creva).
[0174] U daljem aspektu, ćelije su T regulatorne ćelije debelog creva i/ili tankog creva i mogu biti CD4 i CD8 pozitivne.
[0175] U jednom aspektu, ćeliski marker je T ćelijski marker. U drugom aspektu ćelijski marker je T ćelijski marker debelog creva.
[0176] Markeri koji su tipa I-A/I-E su primeri ćelijskog markera. CD40 je još jedan primer ćelijskog markera I oba senalaze na dendritičnim ćelijama.
[0177] U jednom izvođenju nivo citokina je povećan u subjektu tako je nivo citokina najmanje najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% viši ili viši od 100% kada se uporedi sa nivoom citokina u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0178] Primeri dendritičnih ćelija uključuju dendritične ćelije koštane srži i dendritične ćelije mukoze stomaka.
[0179] Kao što se ovde koristi, izraz "aktivira epitelijelne ćelije" odnosi se na povećanje ekspresije jednog ili više pro-inflamatornih gena u epitelijalnim ćelijama u subjektu kada se uporedi sa nivoima ekspresije u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0180] Izraz "pro-infalamatorni geni" kako se ovde koristi odnosi se na gen koji kada je eksprimiram pojačava upalu. Primeri por-inflamatornih gena uključuje gene koji kodiraju ali nisu limitirani samo na IL1-β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFN-γ, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13, i TNFα.
[0181] U jednom izvođenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) povećava proizvodnju citokina.
[0182] Izraz " povećava proizvodnju citokina " koji se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa citokina u subjektu kada se uporedi sa nivoom citokina u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0183] U jednom izvođenju, nivo citokina je povećano tako da je nivo najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% viši, ili više od 100% viši, kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0184] U drugom izvođenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) dovodi do povećane produkcije IL-10 i/ili TGFβ.
[0185] Izraz "dovodi do povećane produkcije IL-10" kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa IL-10 u subjektu kada se uporedi sa nivoom IL-10 u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0186] U jednom izvođenju, nivo IL-10 je povećan tako da je nivo najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% viši, ili više od 100% viši, kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0187] U nekim apsektima, IL-10 proizvode dendritične ćelije kao što su dendritične ćelije koštane srži i dendritične ćelije mukoze stomaka posebno CD103+ podsetovi.
[0188] U jednom izvođenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) povećava porizvodnju ćelijskih površinskih markera koji su uključeni u imunske odgovore i prepoznavanje antigena u ćeliji ili ćelijama u subjektu.
[0189] Primeri površinskih ćelijskih markera koji su uključeni u immune odgovore I prepoznavanje antigena uključuju CD40, I-A/I- E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H i/ili njihove ekvivalente u vrstama.
[0190] Površinski ćelijski markeri (npr. CD317/BST-2) mogu se voditi pod različitim imenima u različitim vrstama ili površinski ćelijski marker još nije identifikovan na ćelijama određene vrste. Izraz "ekvivalent u vrsti" kao što se ovde koristu obuhvata ove površinske ćelijske markere.
[0191] Izraz "povećava proizvodnju CD40" kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa CD40 u subjektu kada se uporedi sa nivoom CD40 u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose ćelijski marker CD40 je povećan i/ili broj CD40 markera na ćeliji je povećan.
[0192] U jednom izvođenju, broj CD40 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu je povećano tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju ćelijski marker CD40 je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0193] Izraz "povećava proizvodnju I-A/I-E " kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa I-A/I-E u subjektu kada se uporedi sa nivoom I-A/I-E u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose jedan ili više ćelijskih markera I-A/I-E je povećan i/ili broj I-A/I-E ćelijskih markera na ćeliji je povećan.
[0194] U jednom izvođenju, brojevi I-A/I-E ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu su povećani tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više I-A/I-E ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više I-A/I-E ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem I-A/I-E ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju I-A/I-E ćelijske markere je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima I-A/I-E ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju I-A/I-E ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa I-A/I-E ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0195] Izraz "povećava proizvodnju CD317/BST-2" kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa CD317/BST-2u subjektu kada se uporedi sa nivoom CD317/BST-2u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose jedan ili više CD317/BST-2 ćelijskih markera je povećan i/ili broj CD317/BST-2 ćelijskih markera na ćeliji je povećan.
[0196] U jednom izvođenju, brojevi CD317/BST-2 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu su povećani tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više CD317/BST-2 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više CD317/BST-2 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem CD317/BST-2 ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju CD317/BST-2 ćelijske markere je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima CD317/BST-2 ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju CD317/BST-2 ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa I-A/I-E ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0197] Izraz "povećava proizvodnju CD103" kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa CD103 subjektu kada se uporedi sa nivoom CD103 u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose jedan ili više CD103 ćelijskih markera je povećan i/ili broj CD103ćelijskih markera na ćeliji je povećan.
[0198] U jednom izvođenju, brojevi CD103 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu su povećani tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više CD103 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više CD103 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem CD103 ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju CD103 ćelijske markere je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima CD103 ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju CD103 ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa I-A/I-E ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0199] Izraz "povećava proizvodnju CD80" kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa CD80 subjektu kada se uporedi sa nivoom CD80 u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose jedan ili više CD80 ćelijskih markera je povećan i/ili broj CD80 ćelijskih markera na ćeliji je povećan.
[0200] U jednom izvođenju, brojevi CD80 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu su povećani tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više CD80 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više CD80 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem CD80 ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju CD80 ćelijske markere je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima CD80 ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju CD80 ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa I-A/I-E ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0201] Izraz "povećava proizvodnju CD86" kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa CD86 subjektu kada se uporedi sa nivoom CD86 u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose jedan ili više CD86 ćelijskih markera je povećan i/ili broj CD80 ćelijskih markera na ćeliji je povećan.
[0202] U jednom izvođenju, brojevi CD86 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu su povećani tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više CD86 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više CD86 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem CD86 ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju CD86 ćelijske markere je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima CD86 ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju CD86 ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa I-A/I-E ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0203] Izraz "povećava proizvodnju CD83" kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa CD83 subjektu kada se uporedi sa nivoom CD83 u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose jedan ili više CD86 ćelijskih markera je povećan i/ili broj CD83 ćelijskih markera na ćeliji je povećan.
[0204] U jednom izvođenju, brojevi CD83 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu su povećani tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više CD83 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više CD83 ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem CD83 ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju CD83 ćelijske markere je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima CD83 ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju CD83 ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa I-A/I-E ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0205] Izraz "povećava proizvodnju Siglec-H " kao što se ovde koristi odnosi se na povećanje nivoa Siglec-H subjektu kada se uporedi sa nivoom Siglec-H u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Na primer, broj ćelija koje nose jedan ili više Siglec-H ćelijskih markera je povećan i/ili broj Siglec-H ćelijskih markera na ćeliji je povećan.
[0206] U jednom izvođenju, brojevi Siglec-H ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama) u subjektu su povećani tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više Siglec-H ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), ili više od 100% više Siglec-H ćelijskih markera na ćeliji (ćelijama), kada se uporedi brojem Siglec-H ćelijskih markera u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, broj ćelija u subjektu koji imaju Siglec-H ćelijske markere je povećan tako da najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% više ćelija ima Siglec-H ćelijski marker, ili više od 100% više ćelija koje imaju Siglec-H ćelijski marker, kad se uporedi sa brojem ćelija sa I-A/I-E ćelijskim markerom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0207] U nekim apektima, CD40 I-A/I-E, CD317/BST-2, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H proizvode dendritične ćelije (kao tolerogenične CD103<+>dendritične ćelije razvijene od strane FLT3L.).
[0208] U jednom ostvarenju, ekspresija jednog ili više ifn gena Tipa 1 u ćeliji ili ćelijama je umanejno.
[0209] U jednom ostvarenju, nivo ekpresije jednog ili više IFN Tip 1 gena je smanjeno tako da je nivo najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% niži kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0210] Primeri IFN Tip 1 gena uključuju ali bez ograničenja, IFN-γ1, IFN-γ3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 i Irf4.
[0211] U jednom ostvarenju, ekspresija jednog ili više pro-inflamatornih gena u ćeliji ili ćelijama je umanjena.
[0212] U jednom ostvarenju, nivo ekpresije ekspresija jednog ili više pro-inflamatornih gena je smanjena tako da je nivo najmanje10%, 20%, 30%, 40% ili 50% niži kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0213] Izraz "intestinalna mikrobiota" koji se ovde koristi odnosi se na mikroorganizme koji žive u digestivnom traktu ćivotinje domaćina. Ovi mikroorganizmi obavljaju različite metaboličke, strukturne, zaštitne i druge za domaćna korisne funkcije.
[0214] Kao što se ovde koristi, izraz "poboljšanje intestinalne mikrobiota" odnosi se na povećanje broja i/ili tipova mikroorganizama koji su prisutni u stomaku subjekta (na. pr. domaćina) i/ili na povećanje aktivnosti pomenutih mikroorganizama u smislu njihovih metaboličkih, strukturnih, zaštitnih i drugih za domaćna korisnih funkcije. Na primer, brojevi (to jest nivoi) bakterija Clostridium klaster XIVa je povećan I brojevi E. coli su smanjeni; ovakvo poboljšanje crevne mikrobiota može da se odigra u subjektu sa zapaljinskom bolesti creva (IBD) nakon davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptida Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0215] U jednom izvođenju, broj mikroorganizama prisutnih u stomaku subjekta (na pr. domaćina) je povećan tako da ima najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% veći, ili više od 100% veći,), kada se uporedi bsa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno ili alternativno, tipovi mikroorganizama prisutni u stomaku subjekta (na pr. domaćina) su povećani tako da ima najmanje 5%, 10%, ili 15% više tipova mikroorganizama u odnosu na tipove u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0216] Kao što se ovde koristi, izraz "reguliše apetit" odnosi se na sposobnost modulacije) povećanje ili smanjenje) želje subjekta za unošenjem hrane (jelom).
[0217] U jednom izvođenju, apetit subjekta je stimulisan (to jest pojačan).
[0218] Bez namere vezivanja za teoriju, Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) pokazuje stimulativni efekat na apetit subjekta putem smanjenja ekspresije gena povezanih sa supresijom apetita (kao što su geni koji kodiraju hormone sitosti). Agt, Cartpt, Cck, Cxcl12 i Gcg su primeri gena povezanih sa regulacijom apetita I smanjenjem ekspresije jednog ili više ovih gena koji su povezani sa supresijom apetita.
[0219] Cck i Gcg su primeri hormona sitosti.
[0220] U jednom aspektu Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) stimuliše apetitu subjektu tako da subject konzumira najmanje 5%, 10%, ili 15% više hrane kada se uporedi sa subjektom pre davanja Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu. Dodatno, ili alternativno, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) stimuliše apetit u subjektu tako da nakon 1 meseca od davanja, težina subjekta je najmanje 2%, 5%, ili 10% veća kada se uporedi sa subjektom pre davanja Roseburia flagelina i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0221] U jednom izvođenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) redukuje nivo holecistokina (Cck) i/ili glukagona (Gcg) u krvi subjekta.
[0222] U jednom aspektu, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) redukuje nivo holecistokina (Cck) i/ili glukagona (Gcg) u krvi subjekta za najmanje 5%, 10%, 15% ili 20% kada se uporedi sa subjektom pre davanja Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0223] U jednom izvođenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) smanjuje ekspresiju gena koji kodira holecistokin (Cck) i/ili ekspresiju gena koji kodira glukagon (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta.
[0224] U jednom aspektu, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) smanjuje ekspresiju gena koji kodira holecistokin (Cck) tako da je nivo ekpresije najmanje 5%, 10%, 15% ili 20% niži u odnosu na nivo u subjektu pre davanja Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0225] U jednom aspektu, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) smanjuje ekspresiju gena koji kodira glukagon (Gcg) tako da je nivo ekpresije najmanje 5%, 10%, 15% ili 20% niži u odnosu na nivo u subjektu pre davanja Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0226] Izraz "poboljšava zdravlje alimentarnog kanala" koji se ovde koristi odnosi se na redukciju nivoa inflamacije u elimentarnom kanalu ili njegovom delu i/ili na poboljšanje intestinalne mikrobiota.
[0227] U jednom izvođenju, nivo inflamacije u alimentarnom kanalu je najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% niži, kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0228] U jednom izvođenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) reguliše ekspresiju najmanje jednog gena odabranog iz: Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a. Mnogi od ovih gena su geni crevne barijere i antimikrobijalni i samim tim rde na redukciji invazije patogena stomaka i takođe redukuju brojeve vijabilnih (živih) patogen.
[0229] U jednom izvođenju, ekspresija jednog ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od gena vezanih za TLR (na primer Tlr5, Tlr1, i Vnn1), gena koji kodiraju antimikrobne peptide (na pr. Defb37, Pla2g, Muc16, i Itln), gene vezane za funkcije crevne barijere (na pr. Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, i Magi3), gene vezane za urođeni imunološkitet (na pr. Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a) u ćeliji ili ćelijama domaćina je povećana.
[0230] U jednom izvođenju, ekspresija jednog ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od gena vezanih za TLR (na primer Tlr5, Tlr1, i Vnn1), gena koji kodiraju antimikrobne peptide (na pr. Defb37, Pla2g, Muc16, i Itln), gene vezane za funkcije crevne barijere (na pr. Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, i Magi3), gene vezane za urođeni imunološkitet (na pr. Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a) je povećana tako da je nivo najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% viši, ili više od 100% viši, kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0231] U jednom izvođenju, ekspresija jednog ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od: Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a u ćeliji ili ćelijam domaćina je povećana.
[0232] U jednom izvođenju, nivo ekspresije jednog ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od: Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a) je povećana tako da je nivo najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% viši, ili više od 100% viši, kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0233] U jednom izvođenju, ekspresija jednog ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju acetil-CoA acetiltransferazu, 3-hidroksiacil-CoA dehidrogenazu, butiril-CoA dehidrogenazu i fosfoenolpiruvat karboxksikinazu [ATP] u ćeliji ili ćelijama subjekta je modulisana.
[0234] U jednom izvođenju, nivo ekspresije jednog ili više gena odabranih iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju acetil-CoA acetiltransferazu, 3-hidroksiacil-CoA dehidrogenazu, butiril-CoA dehidrogenazu i fosfoenolpiruvat karboxksikinazu [ATP] je modulisana tako da je nivo najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% viši ili niži kada se uporedi sa nivoom u subjektu pre davanja Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) subjektu.
[0235] U daljem aspektu ovaj pronalazak se odnosi na transformisani mikroorganizam (kao na primer Firmicutes na primer Roseburia spp kao R. hominis ili R. intestinalis) u kome je ekpresija flagelina (na pr. Roseburia flagellin) kao što je FlaA1 ili FlaA2 pojačana u odnosu na ekvivalentni mikroorganizam pre transformacije i njihove upotrebe u različite terapeutske i nutricione svrhe kao što je ovde opisano. Na primer, transformisni mikroorganizam mogao je biti transformisa sa nukleotidnom sekvecom (kao što je promotor) na takav način da je mikroorganizam sposoban da poveća ekspresiju gena koji kodira flagelin (na pr. Roseburia flagellin) kao što je FlaA1 ili FlaA2. U drugom primeru, transformisni mikroorganizam mogao je biti transformisa sa vektorom koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira flagelin (na pr. Roseburia flagellin) kao što je FlaA1 ili FlaA2 koja je operativno povezana sa regulatornom sekvencom (kao što je promotor) i to tako da je mikroorganizam sposoban da prekomerno eksprimira (overexpression) gen koji kodira flagelin (na pr. Roseburia flagellin) kao što je FlaA1 ili FlaA2.
[0236] Kao što se ovde koristi izraz "ekspresioni vektor" odnosi se na DNK konstrukt koji sadrži DNK kodirajuću sekvencu (na pr. gensku sekvencu) koja je operativno povezana za jednom ili viže odgovarajućih kontrolnih sekvenci koje su sposobne da utiču na ekspresiju kodirajuće sekvence u domaćinu. Ove kontrolne sekvence uključuju promotor koji utiče na transkripciju, opcionalnu operatersku sekvencu koja kontroliše ovakvu transkripciju, sekvencu koja kodira pogodne mesta vezivanja ribozoma na iRNK, i skevence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Vektor može biti plazmid, fagna čestica, ili jednostavno potencijalna genomska sekvenca za ubacivanje (insert). Kada se transformiše i ubaci u odgovarajućeg domaćina, vektor može d se replikuje (umnožava) i da funkcioniše nezavisno od genoma domaćina, ili može u nekim slučajevima da se integriše (ugradi) u sam genom. Plazmid je najćešće oblik ekspresionog vektora koji se koristi. Međutim, ovaj opis ima za cilj da uključi i druge oblike ekspresionih vektora koji imaju ekvivalentnu funkciju i koji su ili će postati poznati u stanju tehnike.
[0237] Izraz “operativno povezan” odnosi se na povezanu poziciju gde su elementi pozicionirani na takav način koji im omogućava da funkcionalno budu povezani. Na primer, promotor je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ukoliko kontroliše transkripciju kodirajuće sekvence.
Tkiva
[0238] U jednom izvođenju, tkivo ili organ je alimentarni kanal ili njegov deo (na pr. ezofagus, želudac ili creva kao što su tanko crevo i debelo crevo) ili druga mesta mukoze (kao nazalni prolaz i pluća).
[0239] U jednom izvođenju, tkivo ili organ je alimentarni kanal ili njegov deo
[0240] Primeri delova alimentarnog kanala uključuju ezofagus, želudac ili creva (kao što je tanko crevo (na pr. duodenum, jejunum - završni deo tankog creva) i/ili debelo crevo (na pr. cekum, uzlazno debelo crevo, poprečno debelo crevo, silazno debelo crevo i sigmoidno (zavijeno) debelo crevo)).
Subjekat
[0241] U jednom izvođenju, subjekat je monogastrična životinja.
[0242] Primeri monogastričnih životinja uključuju živinu, ljude, pacove, svinje, pse, mačke, konje i zečeve.
[0243] U drugom izvođenju, subjekat je sisar kao što je monogastrična životinja.
[0244] Primeri monogastričnih sisara uključuju svaštojede (kao ljude, pacove i svinje) I biljojede (kao konje i zečeve)
[0245] U jednom izvođenju, subjekat je čovek.
[0246] Tipično, TLR5 je sposoban da bude eksprimiran u ćelijama pomenutog subjekta.
Poremećaji
[0247] Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) mogu se koristiti za lečenje poremećaja u subjektu, što pomenuti poremećaj je inflamatorni (zapaljinski) poremećaj i/ili autoimunološki poremećaj.
[0248] U jednom izvođenju, infalminatorni poremećaj i/ili autoimunološki poremećaj zahvata alimentarni kanal, ili njegov deo, u pomenutom subjektu.
[0249] U jednom izvođenju, infalmatorni poremećaj i/ili autoimunološki poremećaj zahvata mesto sa mukozom u subjektu. Primeri mesta sa mukozom uključuju alimentarni kanal ili njegov deo (na pr. ezofagus, želudac ili creva kao što su tanko crevo i debelo crevo) ili druga mesta mukoze (kao nazalni prolaz i pluća).
[0250] U jednom izvođenju, infalmatorni poremećaj i/ili autoimunološki poremećaj je odabran iz grupe koja se obuhvata reumatoidni artritis, psorijazu, multiplu sklerozu, dijabetes tipa 1, celijačnu bolest, atopijski dermatitis, rinitis, sindrom iritabilnog creva (IBS), kolitis, zapaljinsku bolesti creva (IBD), ulcerativni kolitisa, paučitisa (upala ilealnog rezervoara), Kronovu bolest, funkcionalnu dispepsiju, atopijske bolesti, nekrotični enterokolitis, i njihove kombinacije
[0251] U jednom aspektu, inflamatorni poremećaj je kolitis. U daljem aspektu, inflamatorni poremećaj je Kronova bolest, ulcerativni kolitis ili paučitis (upala ilealnog rezervoara).
[0252] U jednom aspektu, inflamatorni poremećaj i/ili autoimunološki poremećaj zahvata creva.
[0253] U jednom aspektu, inflamatorni poremećaj je IBS. Tačna patofiziologija IBS tek treba da se rasvetli. Nedavne studije su opisale inflamaciju mukoze i promene u intestinalnoj mikrobiota kod IBS pacijenata i korelaciju bolesti sa infekcijama creva.
[0254] U daljem aspektu, poremećaj u crevima je Kronova bolest.
[0255] U jednom aspektu, poremećaj je autoimunološki poremećaj.
[0256] U jednom aspektu, autoimunološki poremećaj je selektovan iz grupe koja se sastoji od ulcerativnog kolitisa, paučitisa (upala ilealnog rezervoara), reumatoidni artritisa, psorijaza, multiple skleroze, dijabetesa tipa 1, celijačne bolesti, atopijskog dermatitis i rhinitisa.
[0257] Zbog značajne funkcije u restauraciji imonološke tolerancije, autoimmune bolesti reumatoidni artritis, psorijaza, multipla skleroza, i dijabetes tipa 1 su od posebnog značaja.
[0258] Kao što se ovde koristi, izraz "medikament" obuhvata medikamente za upotrebu kod ljudi i životinja u medicine i veterini. Dodatno, izraz "medikament" koji se ovde koristi označava bilo koju supstancu, koja obezbeđuje terapeutski i/ili koristan efekat. Dodatno, izraz "medikament" koji se ovde koristi nije neophodno limitiran na supsatnce, za koje je neophodno marketinško odobrenje, ali može da obuhvati supstance koje mogu da se koriste u kozmetici, hranljive dodatke (nutraceuticals), hranu (uključujući stočnu hranu i pića na primer), probiotske culture, hranjlive dodatke i prirodne lekove. Dodatno izraz "medikament" koji se ovde koristi obuhvata proizvod dizajniran za ugradnju u stočnu hranu i/ili hranu za kućne ljubimce.
Profilaktička primena
[0259] Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) na osnovu pronalaska može se takođe koristiti I imati profilaktiču primenu. U profilaktičkim primenama Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) na osnovu pronalaska daje se pacijentu koji je suspektibilan ili na drugi način rizičan za odreženu bolest u količini koja je u najmanju ruku dovoljna da delimično redukuje rizik od razvoja bolesti. Takva količina je definisana kao “profilaktička efektivna doza”. Precizne količine zaviše od broja specifičnih faktora kao što je zdravstveno stanje i težina subjekta.
Inkapsulacija
[0260] U jednom ostvarenju, Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) je inkapsuliran.
[0261] U daljem ostvarenju, farmaceutska kompozicija koja sadrži Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) je inkapsulirana.
[0262] U drugom ostvarenju, hranljivi dodatak koji sadrži Roseburia flagelin, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) je inkapsulirana.
[0263] U daljem ostvarenju, stočna hrana, prehrambeni proizvod, dodatak ishrani ili dijetetski suplement je inkapsuliran.
[0264] Izraz " inkapsuliran " koji se ovde koristi odnosi se na načine za zaštitu polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence, i/ili vektora, i/ili domaćinske ćelije, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) od nekompatibilne sredine putem fizičkog odvajanje tako da može da se dostavi do ciljnog mesta (na pr. creva) bez degradacije ili značajne degradacije na način da polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili domaćinska ćelija, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) može imati efekat na ciljno mesto. Primer je entero obložena kapsula.
[0265] Ĉak i kada je cilj inkapsulacije izolacija polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence, i/ili vektora, i/ili domaćinske ćelije, i/ili i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) od njihovog okruženja, zaštitno oblaganje ili školjka moraju se perforirati u momentu željenog delovanja. Peroforacija protektivne obloge se najčešće izvodi pomoću hemijskih ili fizičkih stimulus kao što su pritisak, napad enzimima, hemijska reakcija i fizički raspad.
[0266] Na primer inkapsulacija obezbeđuje da polipeptid, i/ili polinukleotidnea sekvenca, i/ili vektor, i/ili domaćinska ćelija, i/ili i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) mogu biti progutani tako da polipeptid, i/ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili domaćinska ćelija, i/ili i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) mogu da se dostave do creva (na pr. ciljnog mesta) u količini koja je efektivna da proizvede efekat u crevima.
Farmaceutska kompozicija
[0267] Farmaceutska kompozicija može biti bilo koja farmaceutska kompozicija. U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija se daje oralno, enteralno ili rektalno. Na primer, kompozicija može biti jestiva kompozicija. "Jestiva" znači materijal koji je odobren za humanu i životinjsku konzumaciju.
[0268] Farmaceutska kompozicija može biti za humanu i životinjsku upotrebu u medicine i veterini.
[0269] Primeri ovako pogodnih ekscipijenasa za različite raznolike forme faramaceutskih kompozicija su ovde opisane i mogu se naći u "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller.
[0270] Pogodni nosači ili rastvarači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u stanju tehnike farmaceutike i opisani su u na primer Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.1985).
[0271] Primeri pogodnih nosača uključuju laktozu, skrob, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearate, manitol, sorbitol i slične. Primeri pogodnih rastvarača uključuju etanol, glicerol i voda.
[0272] Izbor farmaceutskog nosača, ekcipijensa ili rastvarača može biti odabran u odnosu na željeni put davanja i standardne farmaceutske prakse. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže kao ili kao dodatak uz, nosač, escipijens ili rastvarač bilo koji od stabilanih vezujućih agensa, lubriknata, agenasa za suspenziju, agenasa za oblaganje, agenasa za rastvaranje.
[0273] Primeri pogodnih vezujućih agensa uključuju skrob, želatin, prorodne šećere kao glukozu, anhidrovanu laktozu, slobodno plutajuću laktozu, beta laktozu, zaslađivače kukuruza, prirodne iI sintetičke gume kao akaciju, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetil celulozu i polietilen glikol.
[0274] Primeri pogodnih lubrikanata uključuju natrijum oleat, natrijum stearate, magnezijum stearate, natrijum benzoate, natrijum acetat, natrijum hlorid u slične.
[0275] Prezervativi (konzervansi), stabilizatori, boje čak i agensi ukusa mogu biti obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama. Primeri prezervativa uključuju natrijum benzoat, sorbičnu kiselinu i estar p-hidroksibenzoične kiseline. Antioksidansi i agensi za rastvaranje se mogu takođe koristiti.
Hranljivi suplementi (dodaci)
[0276] Nutriciono prihvatljivi nosači, rastvarači i ekspiciensi uključuju one pogodne za konzumaciju kod ljudi i životinja i koji se koriste kao standard u prehrambenoj industriji. Tipični nutriciono prihvatljivi nosači, rastvarači i ekspiciensi biće poznati stručnjacima iz oblasti.
Stočna hrana/proizvodi
[0277] Dalji apsekt ovog pronalaska odnosi se na stočne hrane, prehrambene proizvode, dijetetski suplemente i dodatke hrani koji sadrže Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis).
[0278] Izrazi "stočna hrana", "prehrambeni proizvod", "dodatak hrani" i "dijetetski suplement" kao što se ovde koristi pokrivaju sve proizvode za konzumaciju koji mogu biti čvrsti, u obluku želatina ili tečni.
[0279] Pogodni prehrambeni proizvodi mogu da uključe na primer, prizvode koji su funkcionalna hrana, kompozicije hrane, hranu za kućne ljubimce, stočnu hranu (livestock feed), hrane za zdravlje, stočne hrane (feedstuff) i slične. U drugom aspektu prehrambeni proizvod je hrana za zdravlje.
[0280] Kao što se ovde koristi izraz "proizvod koji je funkcionalna hrana" znači hranu koja može da obezbedi kako nutricioni efekat tako i može da dostavi koristan efekat potrošaču. U skladu sa tim, funkcionalne hrane su obične hrane koje imaju komponente ili sastojke (kao one koji su ovde opisani) inkorporisane u njima tako da obezbeđuju hrani specifičnu funkcionalnu na pr. medicinsku ili fiziološku korist – a ne samo čisti nutricioni efekat.
[0281] Primeri specifičnih prehrambenih proizvoda koji su primenljivi u ovom pronalasku uključuju proizvode na bazi mleka, dezerte spremne za jelo, pudere za rekonstituciju sa na pr. mlekom ili vodom, čokoladna mleka, napitke na bazi ječmenog slada, instant obroke ili pića za ljude ili kompozicije hrane koje predstavljaju kompletnu ili delimičnu dijetu za kućne ljubimce ili stoku.
[0282] U jednom aspektu, stočna hrana (feedstuff), prehrambeni proizvod, dijejetski suplement ili dodatak hrani na osnovu ovog pronalaska namenjeni su ljudima, kućnim ljubimcima ili stoki kao što su monogastrične životinje. Stočna hrana (feedstuff), prehrambeni proizvod, dijejetski supplement ili dodatak hrani mogu biti namenjeni životinjama koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od pasa, mačaka, svinja, konja ili živine. U daljem izvođenju, prehrambeni proizvod, dijejetski supplement ili dodatak hrani je namenjen adultnim vrstama posebno ljudskim adultima.
[0283] Izraz "proizvode na bazi mleka" koji se ovde koristi označava bilo koji proizvod na bazi tečnost ili polu-čvrstog mleka ili surutke koji sa različitim sadržajem masti. Proizvode na bazi mleka može biti na pr. kravlje mleko, kozije mleko, ovčije mleko, obrano mleko, neobrano mleko, mleko rekombinovano od mleka u prahu i surutke neprocesovano, ili procesovani proizvod, kao što je jogurt, zgrušano mleko, gruš, kiselo mleko, neobrano kiselo mleko, puter mleko I druge proizvode od kiselog mleka. Joše jedna važna grupa uključuje mlečne napitake kao što su napici na bazi surutke, fermentisana mleka, kondenzovana mleka, mleka za odojčad i bebe; mleka sa različitim ukusima, sladoled; hrana koja sadrži mleko kao slatkiši.
[0284] Stočna hrana (feedstuff), prehrambeni proizvod, dijejetski suplement ili dodatak hrani iz ovog pronlaska može biti – ili može se dodati u dodatak ishrani, koji se ovde tekože pominje kao dijetetski ili hranljivi suplemeni ili dodaci hrani.
[0285] Stočne hrane (feedstuff), prehrambeni proizvodi, dijejetski suplementi ili dodataci hrani iz ovog pronlaska mogu se koristiti u ishrani životinja (na pr. ishrani svinja), posebno u ranom periodu odbijanja od majke i u period rasta i debljanja. Za stočne hrane (feedstuff), prehrambene proizvode, dijejetske suplemente ili dodatatke hrani očekuje se da pojačaju imunološki funkciju, redukuju i spreče zarazne bolesti, na koristan način izmene kompoziciju mikrobiota i poboljšaju rast i performance životinja, na primer kroz povećanu efikasnost konverzije stočne hrane.
Probiotici ili živi bioterapeutski proizvodi
[0286] Roseburia flagelin, i/ili polipeptida Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) mogu se koristiti kao probiotik ili živi bioterapeustki proizvod.
[0287] Drugi aspekt pronalaska odnosi se na probiotsku kompoziciju koja obuhvata Roseburia flagelin, i/ili polipeptida Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis)
[0288] Kao što seo vde koristi, izraz "probiotik" označava mikrobijalne ćelijske preparate ili komponente mikrobijalnih ćelija koje imaju koristan efekat na zdravlje ili dobrobit domaćina. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol.1999:10107-10).
[0289] Ujednom aspektu, porbiotska kompozicija je kompozicija koja se može davati oralno i sastoji se od metabolički aktivnih to jest živih ili liofilizovanih, neživih ubijenih toplotom, ozračenih ili liziranih bakterija. Probiotska kompozicija može da sadrži druge sastojke. Probiotska kompozicija može da se daje oralno to jest u formi tablet, kapsula ili pudera. Probiotska kompozicija može da obuhvati bekterijske vrste R. hominis ili R. intestinalis. Za R. hominis i R. intestinalis s obzirom da su anaerobi najbolji su inkapsulirani proizvodi. Inkapsulirani proizvodi (kao što je vitamin C na primer) mogu uključiti sakupljače kiseonika (scavangers) i prebiotske supstrate (kao takvi poboljšavaju kolonizaciju Ii opstanak in vivo). Alternativno, probiotska kompozicija iz ovog pronalaska može da se daje oralno kao hrana ili hranljivi proizvod, kao fermentisani mlečni proizvod baziran na mleku ili surutki, ili kao farmaceutski proizvod.
[0290] Podesna dnevna doza probiotskih bakterija je od otprilike 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>kolonija (colony forming units - CFU); na primer, od oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<10>CFU; u drugom primeru od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<10>CFU.
[0291] U jednom aspektu probiotska kompozicija sadrži bakterijsku vrstu i/ili njene ćelijske koponente, aktivne sastojke, u količini od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<11>CFU/g, u odnosu na težinu kompozicije; na primer od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU/g. ove doze mogu biti 1g, 3g, 5g, i 10g.
[0292] Tipično probiotik je kombinovan sa najmanje jednim podesnim jedinjenjem. Probiotik je uobičajeno nesvraljivi ugljeni hidrat kao oligo ili polisaharid, ili šećerni alkohol, koji se ne degraduje ili absorbuje u gornjem digestivnom traktu. Poznati prebiotici uključuju komercijalne proizvode kao inulin i transgalakto oligosaharide.
[0293] U jednom aspektu probiotska kompozicija iz ovog pronaska uključuje prbiotik u količini od oko 1 do oko 30% težine, u odnosu na ukupnu težinu kompozicije, (na primer 5 do 20% težine). Ugljeni hidrati mogu da se odaberu iz grupe koja se sastoji od: frukto-oligosaharida (FOS), frukto-oligosaharida kratkih lanaca, inulina, izomaltooligosaharida, pektina, ksilo-oligosaharida (ili XOS), hitozan-oligosaharida (ili COS), beta glukana, obradive gume modifikovanih i rezistentnih skrobova, polidekstroze, D-tagatoze, vlakana akacije, vlakana rogača, ovsa i citrusa. U jednom aspektu, prebiotici su frukto-oligosaharida kratkih lanaca (radi pojadnostavljenja nadalje obeleženi kao FOSs-c.c); pomenuti FOSs-c.c nisu svarljivi ugljeni hidrati, generalono se dobijaju konverzijom šećerne repe i uključuju molekul saharoze za koji su vezana tri molekula glukoze.
Davanje
[0294] Farmaceutske kompozicije, hranljivi suplementi, stočna hrana (feedstuffs), prehrambeni proizvodi, dijejetski suplementi ili dodaci hrani iz ovog pronalaska mogu se prilagoditi za oralne, rektalni, vaginalni, perenteralni, intramuskulatorni, intraperitonealne, intraarterijalni, intratekalne, intrabronhijalne, subkutanozne, intradermalne, intravenozne, nazalne, buklane ili sublingvalne (podjezične) puteve davanja.
[0295] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije, hranljivi suplementi, stočna hrana (feedstuffs), prehrambeni proizvodi, dijetetski suplementi ili dodaci hrani iz ovog pronalaska su prilagođeni za oralne, rektalne, vaginalne, perenteralne, nazalne, buklane ili sublingvalne (podjezične) puteve davanja.
[0296] U daljem aspektu, farmaceutske kompozicije, hranljivi suplementi, stočna hrana (feedstuffs), prehrambeni proizvodi, dijejetski suplementi ili dodaci hrani iz ovog pronalaska su prilagođeni za oralne puteve davanja.
[0297] Za oralno davanjo, posebno se iskorišćavaju komrimovane tablete, pilule, tablete, gelue, kapi i kapsule.
[0298] Drugi oblici davanja obuhvataju rastvore ili emulzije koje mogu biti injektovane intravenozno, intraarterijalno, intratekalno, subkutanozno, intradermalno, intraperitonealno, ili intramuskulatorno, I koji su pripremljeni od sterilnih ili sterilisanih rastvora. Farmaceutske kompozicije ovog ptonalaska mogu takođe biti u formi supozitorija, pesara, suspenzija, emulzija, losiona, masti, krema, gelova, sprejeva, rastvora ili praškastih pudera.
[0299] Alternativni način transdermalnog davanja je upotreba flastera za kožu. Na primer, aktivni sastojak može biti ugrađen u kremu koja se sastoji od vodene emulzije polietilen glikola ili tečnog parafina. U drugom primeru, aktivni sastojak može takođe biti ugrađen u mast koja se sastoji od baze belog voska ili belog mekanog parafina zajedno sa takvim stabilizatorima i konzervansima koji se mogu biti potrebni tom slučaju.
[0300] Farmaceutske kompozicije, hranljivi suplementi, stočna hrana (feedstuffs), prehrambeni proizvodi, dijejetski suplementi ili dodaci hrani mogu biti formulisani u obliku jedinične doze to jest u obliku diskretne porcije koja sadrži jediničnu dozu, ili višestruke doze ili podjedinice jedinične doze.
Doza
[0301] Prosečna osoba koja je u oblasti može lako da odredi prigodnu dozu Roseburia flagelina, i/ili polipeptida Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) koju terba dati subjektu bez nepotrebnog eksperimentisanja. Tipično, lekar će odrediti pravu dozu koja će biti najprigodnija za pojedinačnog pacijenta i zavisiće od mnogobrojnih faktora uključujući aktivnost specifičnog soja koji se primenjuje, metaboličke stabilnosti I dućine delovanja soja koji se primenjuje, opšteg zdravstvenog stanja, pola, ishrane, načina i vremena davanja, stope ekskrecije, kombinacije leka, tećine određenog stanja, I individualne terapije koja je u toku. Doze koje su ovde otkrivene su primeri prosečnih slučajeva. Naravno mogu na osnovu individue opravdano je da se povećava ili smanjuje opseg doza, i sve ovo je u području ovog pronalaska.
Kombinacije
[0302] U jednom aspektu Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) se daju u kombinaciji sa najmanje jednim ili dva, ili tri ili četiri ili pet drugih aktivnih agenasa. U takvim slučajevima, Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis) mogu se davati uzastopno, simultano ili sekvencijalno sa jednim ili više aktivnih agenasa.
[0303] Najmanje jedan ili dva, ili tri ili četiri ili pet drugih aktivnih agenasa mogu biti odabrani iz grupe koja se sastoji od Roseburia flagelina, i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili polipeptid Fla (kao FlaA1 ili FlaA2), /ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis).
[0304] Najmanje jedan ili dva, ili tri ili četiri ili pet drugih aktivnih agenasa mogu biti mikroorganizam (ns pr. Roseburia kao R. hominis i/ili R. intestinalis). Primeri prigodnih mikroorganizama uključuju: Roseburia hominis A2-183 i Roseburia intestinalis L1-82.
Identičnost sekvence ili homologija sekvence
[0305] Izrazi "polipeptid", "polipeptidna sekvena", "protein" i "amino kiselinska sekvenca" se ovde koriste recipročno (mogu se zamenjivati).
[0306] Izrazi "polinukleotidna sekvenca" i "nukleotidna sekvenca" se ovde koriste recipročno.
[0307] Ovaj pronalazak takođe obuhvata upotrebu sekvenci koje imaju određen nivo sekvencne identičnosti ili sekvencne homologije sa amino kiselinskom sekvencom (sekvencama) polipeptida koji je ovde opisan (na primer varijanti, homologa ili derivate) ili bilo koje nukleotidne sekvence koja kodira takav polipeptid (ovde i na dalje odnosi se na "homologu(e) sekvencu(e)"). Ovde izraz "homolog" znači da entitet ima određenu homologiju sa amino kiselinskim sekvencam subjekta i nukleotidnim sekvencama subjekta. Ovde, se izraz "homologija" može izjednačiti sa "identičnost".
[0308] U ovom kontekstu, homologa sekvenca je uzeta da uključuje amino ili nukleotidnu sekvencu koja može biti najmanje 50, 60, 70, 75, 80, 85 ili 90% identična, u nekim izvođenjima najmanje 95, 96, 97, 98 ili 99% identična sa sekvencom subjekta. Iako se homologija može razmatrati u smislu sličnosti (to jest amino kisleinski ostaci koji imaju slične hemijske osobine/funkcije) u kontekstu ovog pronalaska poželjno je homologiju izraziti u smislu sekvencne identičnosti.
[0309] U nekim izvođenjima, homologa sekvenca je uzeta da uključuje amino kiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja ima jedan ili više dodataka, delecija i/ili zamena kada se uporedi sa sekvencom subjekta.
[0310] U nekim izvođenjima, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu proteina čija je amino kiselinska sekvenca ovde prikazana ili protein izveden iz ovog (ishodnog) proteina putem zamene, delecije ili adicije jedne ili više amino kiselina, kao 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 amino kisleina, ili više amino kiselina, kao 10 ili više ili više od 10 amino kiselina u amino kiselinskoj skevenci ishodnog proteina I koji ima aktivnost ishodnog proteina.
[0311] U nekim izvođenjima, odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline (ili gen) koji kodira protein čija je amino kisleinska sekvenca ovde prikazana ili koja kodira protein izveden iz ovog (ishodnog) proteina putem putem zamene, delecije ili adicije jedne ili više amino kiselina, kao 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 amino kisleina, ili više amino kiselina, kao 10 ili više ili više od 10 amino kisleina u amino kisleinskoj skevenci ishodnog proteina i koji ima aktivnost ishodnog proteina.
[0312] U ovom kontekstu, homologa sekvenca je uzeta da uključuje nukleotidnu sekvencu koja može biti najmanje 50, 60, 70, 75, 80, 85 ili 90% identična, u nekim izvođenjima najmanje 95, 96, 97, 98 ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid opisan ovde (sekvenca subjekta). Tipišno, homolozi će sadržati iste ili ekvivalentne sekvence koje kodiraju za domen(e) itd. kao i sekvenca subjekta. Iako se homologija može razmatrati u smislu sličnosti (to jest amino kisleinski ostaci koji imaju slične hemijske osobine/funkcije) u kontekstu ovog pronalaska poželjno je homologiju izraziti u smislu sekvencne identičnosti.
[0313] Homologe amino kiselinske sekvence i/ili nukleotidne sekvence mogu obezbediti i/ili kodirati polipeptid koji zadržava funkcionalnu aktivnost i/ili pojačava aktivnost polipeptida.
[0314] U nekim aspektima, amino kiselinska sekvenca koja je ovde opisana je najmanje 50, 60, 70, 75, 80, 85 ili 90% identična, u nekim izvođenjima najmanje 95, 96, 97, 98 ili 99% identična sa sekvencom subjekta.
[0315] U nekim aspektima, nukleotidna sekvenca koja je ovde opisana je najmanje 50, 60, 70, 75, 80, 85 ili 90% identična, u nekim izvođenjima najmanje 95, 96, 97, 98 ili 99% identična sa sekvencom subjekta.
[0316] Poređenje homologije može da se uradi golim okom, ili ono što je češće uz pomoć već dosptupnih programa za poređenje sekvenci. Ovi komercijalno dostupni programi mogu da proračunaju % homologije između dve ili više sekvenci.
[0317] % homologije može da se izračuna na osnovu kontinuiranih sekvenci (kontigovi, uzastopne sekvence), to jest jedna sekvenca je poravnana sa drugom sekvencom i svaka amino kisleina u jednoj sekvenci se direktno poredi sa odgovarajućom amino kiselinom u drugoj sekvenci, jedan ostatak po jedna ostatak. Ovo se naziva poravnanje "bez međuprostora" ("ungapped"). Tipično, ovekva poravnanja bez međuprostora se izvode na relativno malom broju ostataka.
[0318] Iako je ovaj metod jednostavan i dosledan, ipak ne uspeva da uzme u obzir da, na primer, slučaj da iako su dve sekvence identične, jedna insercija ili delecija će dovesti do toga da amino kiselinski ostaci iza te promene više ne budu poravnani, što može rezultovati u velikoj redukciji % homologije kada se primenjuje globalno poravnanje. Stoga, većina metoda za poređenje sekvence je dizajnirano da proizvede optimalna poravnanja koja uzimaju u obzir potencijalne insercije i delecije bez bezrazložnog remećenja sveukupnog rezultata homologije. Ovo se postiže ubacivanjem međuprostora (gaps) u toku poravnanja sekvence kako bi se lokalna homologija maksimalizovala.
[0319] Međutim, ove komplikovanije metode dodeljuju "penale za međuprostor" ("gap penalties") svakom međuprostoru koji nastane tokom poravnanja tako da, za isti broj identičnih amino kiselina, poravnanje sekvence koja ima najmanji mogući broj međuprostora – što odražava viši stepen povezanosti između dve sekvence koje se porede - ostvariće bolju ocenu nego ona sa više međuprostora. "Afine troškovi međuprostora" ("Affine gap costs") se tipično koriste da naplate relativno visoku cenu prisustva međuprostora I manje penale za svaki sledeći ostatak u međuprostoru. Ovo je nejčešće korišćen sistem za ocenu (bodovanje) međuprostora.
[0320] Izračunavanje maksimalnog % homologije prvo zahteva proizvodnju optimalnog poravnanja, uzimajući u obzir penale za međuprostor. Pogodna kompjuterski program za izvođenje ovakvog poravnanja je Vector NTI (Invitrogen Corp.). Primeri softvera koji mogu izvesti poređenje sekvenci uključuju ali bez ograničenja na njih, BLAST paket (videti Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), BLAST 2 (videti FEMS Microbiol Lett 1999174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol.
403-410) i AlignX na primer. Najmanje BLAST, BLAST 2 i FASTA su dostupni i za online (na mreži) i za offline (van mreže) pretraživnja (videti Ausubel et al 1999, strane 7-58 do 7-60).
[0321] Iako se finalni % homologije može meriti u smislu identičnosti, process poravnanja sam po sebi tipično nije baziran na sve ili ništa poređenju parova. Umesto toga, generalno se koristi "scaled similarity score matrix" koji dodeljuje bodove svakom paru koji se poredi na onvou hemijske sličnosti ili evolucione udaljenosit. Primer takvog matriska koji se često koristi je BLOSUM62 matriks za BLAST grupu programa. Vector NTI programi se generalno koriste za javne dodeljene (default) vrednosti ili naručenu tabelu poređenja simbola ako je obezbeđena (videti priručnik za upotrebu za dalje detalje). Za neke primene pođeljno je da se koriste dodeljene (default) za Vector NTI paket.
[0322] Alternativno, procenat homologija može se izračunati upotrebom opcije višestrukog poravnanja u Vector NTI (Invitrogen Corp.), koji se bazira na algoritmu koji je analogan CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
[0323] Jednom kada softver proizvede optimalno poravnanje, moće se izračunati % homologije, na primer % sekvencne identičnosti. Softver tipično radi ovaj deo poređenja sekvenci i generiše numerički rezultat.
[0324] Ukoliko se koriste Penali za međuprostor (Gap Penalties) kada se određuje identičnost sekveci, tada sledeći parametri treba da se koriste za poravnanje parova na primer:
[0325] U jednom izvođenju, CLUSTAL može da se koristi sa setom penala za međuprostor i ektenzijama za međuprostor (gap extension) kao što je gore definisano.
[0326] U jednom izvođenju, stepen identičnosti u odnosu na nukleotidnu sekvencu je određena u okviru najmanje 20 uzastopnih nukleotida, na primer u okviru najmanje 30 uzastopnih nukleotida, na primer u okviru najmanje 40 uzastopnih nukleotida, na primer u okviru najmanje 50 uzastopnih nukleotida, na primer u okviru najmanje 60 uzastopnih nukleotida, na primer u okviru najmanje 100 uzastopnih nukleotida, na primer u okviru najmanje 200 uzastopnih nukleotida, na primer u okviru najmanje 300 uzastopnih nukleotida.
[0327] U jednom izvođenju, stepen identičnosti u odnosu na nukleotidnu sekvencu može se dorediti u odnosu na celu sekvencu.
Rekombinant
[0328] U jednom aspektu Roseburia flagelin polipeptid i/ili polinukleotidna sekvenca za upotrebu u ovom pronalasku je rekombinantna sekvenca – to jest sekvenca koja je pripremljena primenom tehnika rekombinantne DNK.
[0329] Ove tehnika rekombinantne DNK su u okviru sposobnosti prosečnog stručnjaka iz oblasti. Ove tehnike su objašnjene I opisane u literature, na primer, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sintetička
[0330] U jednom aspektu, polinukleotidna sekvenca Roseburia flagelina za upotrebu u ovom pronalasku je sintetička sekvenca to jest sekvenca koja je pripremljena in vitro hemijskim ili enzimatskim sintezama. To uključuje ali bez ograničenja, sekvence napravljene sa optimalnim korišćenje kodona za domaćinski organizam – kao što su metilotrofni kvasci Pichia i Hansenula.
Ekspresija enzima
[0331] Nukleotidna sekvenca za upotrebu u ovom pronalasku može biti inkorporisana u rekombinantni replicirajući vektor. Vektor se može koristiti za replikaciju i ekspresiju nukleotidne skevence u proteinskom obliku u i/ili iz kompatibilne domaćinske ćelije.
[0332] Ekspresija se može kontrolisati korišćenjem kontrolne sekvence na pr. regulatorne sekvence.
[0333] Protein koji proizvodi domaćinska rekombinantna ćelija putem ekspresije nukleotidne sekvence može biti sekretovan ili može biti intacelularno pozicioniran u zavisnosti od sekvence i/ili vektora koji se koristi. Kodirajuće sekvence mogu biti dizajnirane sa signalnim sekvencama koje usmeravaju sekreciju supstancno kodirajućih sekvenci kroz određenu prokariotsku ili eukariotsku ćelijsku membranu. Ekspresioni vektor
[0334] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na vektor (kao što je ekspresioni vektor) koji obuhvata najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan Roseburia flagelin.
[0335] Izraz "ekspresioni vektor" označava konstrukt koji je sposoban za in vivo ili in vitro ekspresiju.
[0336] U jednom izvođenju ekspresioni vektor je inkorporisan u genom pogodnog domaćinskog organizma. Izraz "inkorporisan" u jednom aspektu pokriva stabilnu inkorporaciju u genom.
[0337] Nukleotidna sekvenca iz ovog opisa može biti u vektoru u kome je nukleotidna sekvenca operativno povezana sa regulatornim sekvencama koje mogu da obezbede ekspersiju nukleotidne sekvence u pogodnoj domaćinskoj ćeliji ili domaćinskom organizmu.
[0338] Vektori za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti transformisani u pogodnu domaćinsku ćeliju ili domaćinski organizam kako je ovde opisano da bi obezbedili ekspresiju polipeprida u ovom opisu.
[0339] Izbor vektora to jest plazmida, kozmida, ili fagnog vektora može često zavisiti od domaćinske ćelije u koju treba da se unese.
[0340] Vektori za upotrebu u ovom pronalasku mogu da sadrže jedan ili više selektivnih markera kao što je gen koji obezbeđuje antibiotsku rezistenciju na pr. ampicillinsku, kanamicinsku, hloramfenikolsku ili tetraciklinsku rezistenciju. Alternativno, selekcija može da se postigne putem ko-tarnsformacije (kao što je opisano u WO91/17243).
[0341] Vektori se mogu koristiti in vitro, na primer za proizvodnju RNK ili se mogu koristiti za transfekciju, transdukciju ili infekciju domaćinske ćelije.
[0342] Zato, u daljem izvođenju, opis obezbeđuje metod za pravljenje nukleotidnih sekvenci iz ovog opisa putem unošenja nukleotidne sekvence iz ovog opisa u replicirajući vektor, unošenja vektora u kompatibilnu domaćinsku ćeliju, i gajenje domaćinske ćelije u uslovima koji će dovesti do replikacije vektora.
[0343] Vektor dalje mođe da obuhvati nukleotidnu sekvencu koja omogućava vektoru da se replicira u domaćinskij ćeliji koja je u pitanju. Primeri ovakvih sekvenci su počeci (origin) replikacije plazmida pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 i pIJ702.
[0344] Ekspresioni vektor može da obuhvati najmanje dve, tri, četiri ili pet polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju Roseburia flageline.
[0345] Primeri ekspresionih vektora uključuju pGEX-6P-1, pCR-Blunt II-TOPO i T7-MAT-Tag-FLAG-.
[0346] Ekspresioni vektor pGEX-6P-1 može da se koristi za kloniranje rekombinantnih flagelina. Ekspresioni vektor pGEX-6P-1 obuhvata tac promotor za hemijski inducibilnu visoku ekspresiju GST obeleženih rekombinantnih proteina, unutrašnji laclq gen za upotrebu u bilo kom E. coli domaćinu, AmpR gen za ampicilinsku selekciju i PreScission Protease mesto za sečenje, ukoliko se želi, proteina iz fuzionog produkta.
[0347] Vektor za kloniranje pCR-Blunt II-TOPO može da se koristi za kloniranje rekombnantnih flagelina, posebno onih koji su nerastvorni nakon lize ćelija. Tipično ovaj vektor omogućava visoku efikasnost DNK kloniranja DNK kada se kloniraju PCR proizvodi sa ravnim krajem (blunt end). Vektor obuhvata gene za kanamicinsku i zeocinsku rezistenciju u E. coli, i insert je okružen sa obe strane višestrukim restrikcionim mestima.
[0348] Ekspresioni vektor T7-MAT-Tag-FLAG- može da se koristi za kloniranje rekombinantnih flagelina, posebno onih koji su nerastvorni nakon lize ćelija. Mesto za višestruko kloniranje (MCS, multiple cloning site) okruženo je sa obe strane, MAT sekvencom sa jedne (deo koji ima afinitet za metal, metal affinity tag) i FLAG peptidnom sekvencom (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) sa druge strane, što rezultira u proizvodnji duplo obeleženog flagelina, koji se dalje može prečistiti afinitativnim kolonoma. Ekspresioni vektor takođe obuhvata pT7/lac (fagni T7 lac operon) promotor za IPTG inducibilnu, visoku ekpresiju MAT-ORF-FLAG rekombinantne flageline, unutraćnji lacl gen koji reprimira transkripciju i svodi na bazalni nivo u bilo kojoj domaćinskoj E. coli, I AmpR gen za ampicilinsku selekciju.
Regulatorne sekvence
[0349] U nekim primenama, nukleotidna sekvenca za upotrebu u ovom pronalasku je operativno povezana za regulatornom sekvencom koja je sposobna da obezbedi ekspresiju nukleotidne sekvence, od strane odabrane domaćinske ćelije. U smislu primera, ovaj pronalazak pokriva vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu iz ovog pronalaska operatovno vezanu za takvu regulatornu sekvencu, to jest vektor je ekspresioni vektor.
[0350] Izraz "operativno povezan" odnosi se odnosi se na povezanu poziciju gde su opisane komponente u takovim odnosu koji ima dozvoljava da funkcionišu na planiran način. Regulatorna sekvenca "operativno povezana" sa kodirajućom sekvencom je vezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže u uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnim sekvencama.
[0351] Izraz "regulatorne sekvence" uključuju promotore I pojačivače i druge signale regulatore ekspresije.
[0352] Izraz "promotor" se koristi na uobičajen način na pr. mesto za vezivanje RNK polimeraze.
[0353] Pojačana ekspresija nukleotidne sekvence koja kodira flagelin iz ovog ptonalaska može se takođe postići selekcijom heterologih regulatornih regiona, na pr. promotora, sekrecionog lidera i terminatorskih regiona.
[0354] U jednom izvođenju, nukleotidna sekveca na osnovu ovog pronalaska je operativno povezana u najmanju ruku sa promotorom.
[0355] Drugi promotori se mogu koristiti za usmeravanje ekpresije polipeptida iz ovog pronalaska. 

[0356] Primeri pogodnih promotora za usmeravanje transkripcije nukleotidne sekvence u bakterijskom, fungalnom (glivičnom) i kvaščevom domaćinu poznate su u stanju tehnike.
[0357] Promotor može dalje da uključi svojstva kako bi se obezbedila ili povećala ekspresija u prigodnom domaćinu. Na primer, svojstvo može biti konzervirani regioni kao Pribnow Box ili TATA box.
Konstrukti
[0358] Izraz "konstrukt" – koji je sinonim sa Izraz "konjugat" ("conjugate"), "kaseta" i "hibrid" – uključuje nukleoridnu sekvencu za upotrebu na osnovu ovog pronalaska direktno ili indirektno vezanu za promotor.
[0359] Primer indirektne vezanosti je obezbeđivanje prigodne spejser grupe kao što je intronska sekvenca, kao Sh1-intron ili ADH intron, između promotora i nukleotidne sekvence iz ovog pronalaska. Isto važi i za izraz "fuzionisan" u odnosu na ovaj opis koji uključuje direktno ili indirektni povezivanje. U nekim slučajevima, izrazi ne pokrivaju priridnu kombinaciju nukleotidne sekvence koja kodira protein koji je uobičajeno povezan sa divljim genskim promotorom i kada su oba u svom prirodnom okruženju.
[0360] Konstrukt može takođe da sadrži ili eksprimira marker, koji omogućava selekciju genetičkog konstrukta.
[0361] Za neke upotrebe, konstrukt iz ovog opisa obuhvata najmanje nukleotidnu sekvencu iz ovog opisa kojaje operativno povezana sa romotorom.
Domaćinske ćelije (ćelije domaćina)
[0362] Izraz "domaćinska ćelija" – u odnosu na ovaj opis uključuje bilo koju ćeliju koja obuhvata nukleotidnu skevencu i/ili ekspresioni vektor kao što je ovde opisano.
Tipično, domaćinska ćelija je sposobna da proizvodi rekombinantni protein koji ima specifična svojstva koja su ovde opisana.
[0363] Primeri domaćinskih ćelija uključuju bakterije ka što je Roseburia spp. i kompetentne ćelije. Primeri Roseburia spp su Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, i Roseburia inulinivorans. Primeri kompetentnih ćelija uključuju kompetentne E. colićelije (kao E. coli BL21 (DE3) pLysS i/ili E. coli B21 Rosetta).
[0364] Zato, dalje izvođenje ovog opisa obezbeđuje domaćinske ćelije koje su transformisane ili transfektovane sa nukleotidnom sekvencom iz ovog ptonalaska. Dodatno ili alternativno, dalje izvođenje ovog prinalaska obezbeđuje domaćinske ćelije koje su transformisane ili transfektovane sa nukleotidnom sekvencom (na pr. promotor kao što je heterologni promotor ili egzogeni) koji može da pojača (prekomerno eksprimira) ekspresiju nukleotidne sekvence (na pr. gena - kao što je homologni gen ili endogeni gen) koji kodira flagelin iz ovog opisa kada se uporedi sa ekvivalentnim mikroorganizmom pre transformacije. Ćelije će biti odabrane da budu kompatibilne sa pomenutim vektorom i mogu biti na primer bakterijske ćelije (na pr. prokariotske), ćelije gljiva ili kvasca.
[0365] Nukleotidna sekvenca koja kodira flagelin iz ovog opisa može biti heterologna ili homologna domaćinska ćelija. Tipično, kada nukleotidna sekvenca koja kodira flagelin je homologna sa domaćinskom ćelijom domaćinska ćelija obuhvata veći broj kopija nukleotidne skevence. Dodatno ili alternativno, nukleotidna sekvenca koja kodira flagelin je opertaivno povezana sa heterolognim promotorom; tipično pomenuti promotor je sposoban da pojača (prekomerno eksprimira) homolognu nukleotidnu sekvencu koja kodira flagelin.
[0366] U jednom primeru, domaćinska ćelija nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelin iz ovog opisa (kao homologna ili endogena nukleotidna sekvenca) pod kontrolom heterolognog ili egzogenog promotora.
[0367] U jednom izvođenju domaćinska ćelija je transfromisana ili transfektovana sa jednom ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju najmanje jedan flagelin (na pr. Roseburia flagellin) odabran iz grupe koja se sastoji od Fla1, Fla2, Fla3 i Fla4. U drugom izvođenju domaćinska ćelija je transfromisana ili transfektovana sa jednom ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju najmanje jedan flagelin (na pr. Roseburia flagellin) odabran iz grupe koja se sastoji od Fla2, Fla1 i Fla4. U daljem izvođenju, domaćinska ćelija je transfromisana ili transfektovana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira flagelin (na pr. Roseburia flagellin) Fla2.
[0368] Domaćinska ćelija može da sadrži veći broj kopija polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju Roseburia flageline.
[0369] Domaćinska ćelija može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 Roseburia flagelina.
[0370] U jednom izvođenju, domaćinska ćelija sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje Roseburia flagelin izveden ili dobijen iz jedne vrste Roseburia i najmanje još jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan Roseburia flagelin izveden ili dobijen iz druge vrste Roseburia. Na primer, domaćinska ćelija sadrži najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira R. hominis flagelin (na pr. Fla1 ili Fla2) i najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira R. hominis flagelin (na pr. Fla1 ili Fla2).
[0371] Domaćinska ćelija može da obuhvati najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 ekspresionih vektora koji sadrže najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju Roseburia flagelin.
[0372] U jednom izvođenju, domaćinska ćelija sadrži ekpresioni vektor koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja kodira Roseburia flageline izvedene ili dobijene iz jedne vrste Roseburia i najmanje još jedan ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja kodira Roseburia flageline izvedene ili dobijene iz druge vrste Roseburia. Na primer, domaćinska ćelija sadrži najmanje jedan ekspresioni vektor koji obuhvata j polinukleotidnu sekvencu koja kodira R. hominis flagelin (na pr. Fla1 ili Fla2) i najmanje jedan ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja kodira R. hominis flagelin (na pr. Fla1 ili Fla2).
[0373] Nukleotidna sekvenca koja kodira flagelin može biti endogena ili egzogena za domaćinsku ćeliju. Tipično kada je nukleotidna sekvenca koja kodira flagelin endogena za domaćinsku ćeliju domaćinska ćelija obuhvata veći broj kopija nukleotidne sekvence. Dodatno ili alternativno, nukleotidna sekvenca koja kodira flagelin je operativno povezana sa egzogenim promotorom; tipično pomenutu promotor je sposoban za pojačavanjem (prkomerno eksprimiranje) endogene nukleotidne skevence koja kodira flagelin.
[0374] Primeri pogodnih bakterijskih domaćina su gram pozitivne ili gram negativne bakterijske vrste.
[0375] U jednom izvođenju domaćinska ćelija je mikroorganizam
[0376] U jednom izvođenju domaćinska ćelija vrsta iz grupe bakterija mlečne kiseline, vrsta Lactococcus, vrsta Bifidobacterium, vrsta Lactobacillus ili vrsta Propionibacterium.
[0377] Primeri bakterija mlečne kiseline uključuju, ali bez ograničenja na njih, Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Lactococcus spp., Streptococcus spp., Aerococcus spp., Carnobacterium spp., Enterococcus spp., Oenococcus spp., Sporolactobacillus spp., Tetragenococcus spp., Vagococcus spp., i Weisella spp.
[0378] Primeri Lactobacillus spp uključuju Lactobacillus paracasei, L. acidophilus, L. fermentum, L. brevis, L. gasseri, L. plantarum, L. bulgaricus, L. helveticus, L. reuteri, L. casei, L. jensenii, L. rhamnosus, L. crispatus, L. johnsonii, L. salivarius, L. acetotolerans, L. acidifarinae, L. acidipiscis, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius, L. amylolyticus, L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. animalis, L. antri, L. apodemi, L. aviarius, L. bifermentans, L. buchneri, L. camelliae, L. catenaformis, L. ceti, L. coleohominis, L. collinoides, L. composti, L. concavus, L. coryniformis, L. crustorum, L. curvatus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. dextrinicus, L. diolivorans, L. equi, L. equigenerosi, L. farraginis, L. farciminis, L. fornicalis, L. fructivorans, L. frumenti, L. fuchuensis, L. galUnarum, L. gastricus, L. ghanensis, L. graminis, L. hammesii, L. hamsteri, L. harbinensis, L. hay- akitensis, L. hilgardii, L. homohiochii, L. iners, L. ingluviei, L. intestinalis, L. kalixensis, L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. kimchii, L. kitasafonis, L. kunkeei, L. leichmannii, L. lindneri, L. malefermentans, L. mail, L. manihotivorans, L. mindensis, L. mucosae, L. murinus, L. nagelii, L. namurensis, L. nantensis, L. oligofermentans, L. oris, L. panis, L. pantheris, L. parabrevis, L. parabuchneri, L. paracollinoides, L. parafarraginis, L. parakefiri, L. paralimentarius, L. paraplantarum, L. pentosus, L. perolens, L. pontis, L. psittaci, L. rennini, L. rimae, L. rogosae, L. rossiae, L. ruminis, L. saerimneri, L. sakei, L. sanfranciscensis, L. satsumensis, L. secaliphilus, L. sharpeae, L. siliginis, L. spicheri, L. suebicus, L. fhailandensis, L. ultunensis, L. vaccinostercus, L. vaginalis, L. versmoldensis, L. vini, L. vitulinus, L. zeae, i L. zymae.
[0379] Primeri Propionibacterium uključuju, ali bez ograničenja na njih, Propionibacterium freudenrechli subsp. shermanii (PAB), Propionibacterium acidifaciens, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacferium acnes, Propionibacterium australiense, Propionibacterium avidum, Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium freudenrelchli subsp. freudenrelchli, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium microaerophilum, Propionibacterium propionicum, i Propionibacterium thoenii.
[0380] U jednom izvođenju, Propionibacterium je Propionibacterium freudenrechli subsp. shermanii (PAB).
[0381] Primeri Bifidobacterium uključuju, ali bez ograničenja na njih, Bifidobacterium adolescentis, B. breve, B. longum, B. animalis, B. infantis, B. thermophilum, B. bifidum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium angulatum i B. lactis.
[0382] U jednom izvođenju, domaćinska ćelija je firmikuta – na primer vrsta Roseburia kao što je grupe Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, ili Roseburia inulinivorans. U jednom izvođenju domaćinska ćelija obuhvata najmanje jednu heterolognu polin domaćinska ćelija ukleotidnu sekvencu koja kodira flagelin iz Roseburia. Dodatno ili alternativno, domaćinska ćelija obuhvata najmanje dve kopije homologne polinukleotidne sekvence koja kodira flagelin iz Roseburia; na primer domaćinska ćelija obuhvata najmanje 3, 4 ili 5 homolognih kopija polinukleotidne sekvence koja kodira flagelin iz Roseburia.
[0383] U zavisnosti od prirode nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid u ovom opisu, i/ili zelje za daljom obradom eksprimiranog proteina, eukariotski domaćini kao što su kvasci ili gljive mogu da se koriste. Uopšteno, ćelije kvasca se pre koriste nego ćelije gljiva jer su lakše za manipulaciju. Međutim, neki proteini se sekretuju u malim količinama u ćelijama kvasca, ili u nekim slučajevima se ne obrađuju na adekvatan način (na.pr. hiperglikozilacija u kvascu). U ovakvim slulčajevima, trebao bi se odabrati drugi domaćin iz grupe gljiva kao domaćinski organizam.
[0384] Upotreba pogodnih domaćinskih ćelija – kao što su ćelije kvasca, gljiva ili biljne ćelije mogu da obezbede post-translacione modifikacije (na primer, dodavanje miristoil grupe, glikozilaciju, sečenje, lipidaciju i fosforilaciju tirozina, serina ili treonina) ukoliko je potrebno da se obezbedi optimalna biološka aktivnost eksprimiranog rekombinantnog proizvoda iz ovog opisa.
[0385] Domaćinska ćelija može biti deficijentna za proteazu ili može biti proteaza minus soj. Ovo može na primer biti proteazno deficijentni soj Aspergillus oryzae JaL 125 koji ima deletiran (izbačen) gen za alkalnu proteazu pod nazivom "alp". Ovaj soj je opisan u WO97/35956.
[0386] Izraz "domaćinska ćelija" ne pokriva prirodnu nukleotidnu kodirajuću sekvencu u njenoj prirodnoj sredini kada je pod kontrolom svog prirodnog promotora koji je takođe u svom prirodnom okruženju.
Organizam
[0387] Izraz "organizam" u odnosu na ovaj pronalazak opisuje bilo koji organizam koji može da obuhvatite nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid na osnovu ovog opisa i/ili proizvode koji se iz njih dobijaju, i/ili gde promotor može da omogući ekpresiju nukleotidne sekvence na osnovu ovog pronalaska kad je prisutna u organizmu.
[0388] Pogodni organizmi mogu uključiti bakteriju (kao što je prokariotaska), gljivu, kvasac ili biljku.
[0389] Izraz "transgeni organizam" u odnosu na ovaj pronalazak opisuje bilo koji organizam koji može da obuhvatite nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid na osnovu ovog opisa i/ili proizvode koji se iz njih dobijaju, i/ili gde promotor može da omogući ekpresiju nukleotidne sekvence na osnovu ovog pronalaska kad je prisutna u organizmu. U jednom izvođenju nukleotidna sekvenca je inkorporisana u genom organizma.
[0390] Izraz "transgeni organizam" ne pokriva nativnu (prirodnu) nukleotidnu kodirajuću sekvencu u njenom priridnom okruženju kada je pod kontrolom njegovog rpirpdnog promotora koji je takođe u svom prirodnom okruženju.
[0391] Zato transgeni organizam iz ovog pronalaska uključuje organizam koji obuhvata bilo koji od, ili kombinaciju, nukleotidne selvence koja kodira polipeptid na osnovu ovog opisa, konstrukte na osnovu ovog opisa, vektore na osnovu ovog opisa, plazmide na osnobu ovog opisa, ćelije na osnovu ovog opisa ili njihove proizvode.
[0392] Na primer transgeni organizam može da obuhvati nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid iz ovog pronalaska (kao što je homologna nukleotidna sekvenca) pod kontrolom heterolognog promotora.
Transformacija domaćinske ćelije/organizma
[0393] Kao što je naznačeno ranije, domaćinski organizam može biti prokariotski ili eukariotski organizam Primeri pogodnih prokariotskih domaćina uključuju Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, Roseburia inulinivorans, E. coli i Bacillus subtilis.
[0394] Učenja vezana za transformaciju prokariotskih domaćina je dobro dokumentpvana u stanju tehnike, na primer Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Ako se koristi prokariotski domaćin nukleotidna sekvenca mošda treba da se prigodno modifikuje prenego što se transformiše – na primer da se primeni uklanjanje introna.
[0395] Ćelije filamentoznih gljiva mogu se transformisati promenom različitih metoda koje su poznate u stanju tehnike – kao process koji uključuje formiranje protoplasta I transformaciju protoplasta nakon čega sledi regeneracija ćelisjkog zida na već poznati način. Upotreba Aspergillus kao domaćinskog organizma opisan je u EP 0238023.

[0396] Još jedan dmaćinski organizam mođe biti biljka. Revija opštih tehnika koje se koriste za transformaciju biljaka može se nači u članku koji je objavio Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) i Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27). Da lje učenja vezana za transformaciju bilja mogu se naći u EP-A-0449375.
[0397] Opšta učenja vezana za transformaciju gljiva, kvasaca i biljaka su prikazana u sledećim odeljcima.
Transformisana gljiva
[0398] Domaćinski organziam može biti gljiva, kao što je plesan. Primeri pogodnih domaćina uključuju bilo kog člana koji pripada rodovima Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma i slične.
[0399] U jednom izvođenju, domaćinski organizam može biti filamentozna gljiva.
[0400] Transformacija filamentoznih gljiva je diskutovana u US-A-5741665 u kome se iznosi da standardne tehnike za transformaciju fillamentoznih gljiva i gajenje gljiva je poznato u stanju tehnike. Može se naći proširena revija tehnika kao što je primenjeno na N. crassa, na primer u Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
[0401] Dalja učenja koja se takođe mogu koristiti u transformaciji filamentoznih gljiva je prikazana US-A-5674707. 

[0402] Dodatno, genska ekspresija u filamzntoznim gljivama je podučena u
Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 
 May;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
[0403] Ovaj opis obuhvata proizvodnju transgenih filamentoznih gljiva na osnovu ovog opisa pripremljene upotrebom ovih standardnih tehnika.
[0404] U jednom aspektu, domaćinski organizam može biti iz roda Aspergillus, kao što je Aspergillus niger. 

[0405] Transgeni Aspergillus na osnovu ovog opisa može biti pripremljen na osnovu, na primer, učenja Turner G.1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp.641-666).
Transformisani kvasac
[0406] U jednom ostvarenju, transgeni organizam može biti kvasac.
[0407] Revija koja opisuje principe ekpresike heterolognih gena u kvascu je obebeđena u na primer Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, and Curr Opin Biotechnol (1997) Oct;8(5):554-60
[0408] U ovom smislu, kvasac – kao što je vrsta, yeast - Saccharomyces cerevisi ili Pichia pastoris (see FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), mogu se koristiti kao transportna sredstva za heterolognu gensku ekpresiju.
[0409] Revija o principima heterologne genske ekspresije u Saccharomyces cerevisiae i sekrecije genskih produkata je data od strane E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.).
[0410] Za transfromaciju kavsca, razvijeno je nekoliko protokola za transformaciju. Na primer, transgeni Saccharomyces na osnovu ovog opisa može se pripremiti praćenjem učenja Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); i Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
[0411] Transformisane ćelije kvasca mogu se odabrati upotrebom različitih selektivnih markera kao što su auksotrofni marker dominantni marker antibiotske rezistencije.
Transformisane biljke/biljne ćelije
[0412] Domaćinski organizam pogodan za ovaj prionalazak može biti biljka. U tom smislu, osnovni princip konstruisanja genetski mdifikovanih biljaka je da se ubaci (insertuje) genetička infromacija u billjni genom tako da se dobije stabilno održavanje ubačenog genetičkog materijala. Revija o opštim tehnikama može se naći u radu Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27).
[0413] Direktna infekcija biljnih tkiva sa Agrobacterium je jednostavna tehnika koja se naširoko koristi i koja je opisana u Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams i J.P. Helgeson, 203-208.
[0414] Druga učenja o transformaciji biljaka uključuju balističku transformaciju, tehniku sa vlaknima silikon karbida (whiskers) (see Frame BR, Drayton PR, Bagnaall SV, Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson HM, Dunwell JM, Thompson JA & Wang K (1994). Proizvodnja fertilnih transgenih biljaka kukuruza pomoću transformacije sa vlaknima silikon karbida The Plant Journal 6: 941-948) i tehnike transformacije virusa (npr. videti Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992) The use of cassava mosaic virus as a vector system for plants, Gene 110: 213-217).
[0415] Dalja učenja o tarnsformaciji biljaka mogu se naći EP-A-0449375.
[0416] Biljne ćelije mogu da se gaje i održavaju u skladu sa dobro poznatim metodama za gajenje kao što je gajenje ćelija u pogodnim medijumima za gajenje kojima su obezbeđeni neophodni faktori rasta kao što su amino kiseline, biljni hormone, vitamin, itd.
[0417] U daljem aspektu, ovaj opis se odnosi na vektorski sistem koji nosi nukleotidnu sekvencu ili konstrukt na osnovu ovog opisa I koji je sposoban da introdkuje nukleotidnu sekvencu ili konstrukt u genom organizma kao što je biljka. Vektorski sistem može da obuhvati jedan vektor ali može da obuhvati i dva vektora. U slučaju dva vektora vektorski system se označava kao binarni vektorski sistem. Binarni vektorski system je dalje detaljno opisan u Gynheung An et al., (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.
[0418] Jedan široko korišćeni system trensformacije biljnih ćelija koristi Ti plasmid iz Agrobacterium tumefaciens ili Ri plazmid iz Agrobacterium rhizogenes An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 and Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologisfs, eds.: D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208. Nakon svake primene metoda za introdukciju željenog promotora ili nukleotidne sekvence iz ovog pronalaska u biljke, može biti potrebno prisustvo i/ili dalja insercija DNK sekvenci. Ukoliko se na primer za transformaciju koristi Ti- ili Ri- plasmid iz biljnih ćelija, najmanje desna granica i često leva granica Ti- i Ri-plazmidna T-DNK, kao regioni koji okružuju ubačene gene, mogu se povezati. Upotreba T-DNK za transformaciju biljnih ćelija je intenzivno proučavana i opisan je u EP-A-120516; Hoekema, u: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; and An et al., EMBO J. (1985) 4:277-284.
Gajenje i proizvodnja
[0419] Domaćinske ćelije sa nukleotidnom sekvencom iz ovog pronalsaka i/ili ekspresionim vektorom iz ovog pronalaska mogu da se gaje u uslovima koji su pogodni za proizvodnju kodiranog polipeptida i koji olakšavaju oporavak polipeptida iz ćelija i/ili medijuma za gajenje.
[0420] Medijum koji se koristi za gajenje može biti konvencionala madijum pogodan za sart domaćinske ćelije koja je u pitanju i dobijanje ekspresije polipeptida.
[0421] Protein koji je prizveden od strane rekombinantne ćelije može biti izložen na površini ćelije.
[0422] Protein može biti skeretovan iz domaćinske ćelije i može konvencionalno da se povrtai tj dobije iz medijuma za gajenje poznatim procedurama.
Sekrecija
[0423] U nekim izvođenjima protein se sekretuje iz ekpresionog domaćina u medijum za gajenje odakle se može protein povratiti. Na osnovu ovog pronalaskalider sekvenca za sekreciju može biti odabrana na bazi željenog ekspresionog domaćina. Hibridna signalna sekvenca može da se koristi takođe u kontekstu ovog opisa.
[0424] Tipični primeri heterolognih lider sekvenci za sekreciju su oni poreklom iz gljivičnog gena za amiloglukozidazu (AG) (glaA - obe 18 i 24 amino kiselinske verzije na pr. iz Aspergillus), gen za a-faktor (kvasci na pr. Saccharomyces, Kluyveromyces i Hansenula) ili gen za α-amylazu (Bacillus).
[0425] Kao primer sekrecija heterolognog proteina u E. coli je prikazana u
Methods Enzymol (1990) 182:132-43.
Detekcija
[0426] U stanju tehnike su poznatirazličiti protokoli za detekciju I merenje ekspresije amino kiselina. Primeri uključuju ELISA esej (esej imunoabsorbcije pomoću enzima), radioimuno esej (RIA) I FACS (ćelisjko sortiranjeaktivirano fluorescencijom).
[0427] Različita obeležja u konjugovane tehnike su poznate onima iz oblasti i mogu se koristiti u različitim esejima sa nukleinskim i amino kiselinama.
[0428] Mnogobrojne kompanije kao što je Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) i US Bio-chemical Corp (Cleveland, OH) snabdevaju s a komercijalnim kitovima i protokolima za ove procedure.
[0429] Pogodni reporter molekuli ili obeležja uključuju radionuklide, enzime, fluorescentne, hemiluminescentne ili hormogene agense kao i supstrate, kofaktore, inhibitore, magnetne čestice i slično. Patenti u kojima se objašnjava korišćenje ovakvih obeležja uključuju US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; US- A-4,275,149 i US-A-4,366,241.
[0430] Takođe, rekombinantni imunološkoglobulini mogu da se prizvode kao što je prikazano u US-A-4, 816,567.
Fuzioni proteini
[0431] Amino kiselinska sekvenca za upotrebu u ovom opisuy može biti proizvedena kao fuzioni protein, na primer da pomogne ekstrakciju I prečišćavanje. Primeri partnera fuzionih proteina uključuju glutation S transferazu (GST), 6xHis, GAL4 (DNK vezujuće domene i/ili domene za transkripcionu aktivaciju) i (β-galatozidazu). Takođe mođe biti zgodno da se uključi mesto za proteolitičko sečenje između partnerskog fuzionog proteina i proteinske sekvence od interesa kako bi se uklonila fuziona proteinska skevenca.
[0432] Tipično, fuzioni protein neće ometati aktivnst proteinske sekvence.
[0433] Ekpsresioni sistemi za gensku fuziju u E. coli je prikazan u Curr Opin Biotechnol (1995) 6(5):501-6.
[0434] U jednom ostvarenju aminokiselinska sekvenca može biti ligirana (povezana) sa heterolognom sekvencom da bi kodirala fuzioni protein. Na primer, za pregledavanje peptidnih biblioteka i potragu za agensima koji su sposobni da utiču na aktivnost supsatnce, može biti korisno da kodira himernu supstancu koja eksprimira heterologni epitope koji je prepoznat od strane komercijlano dostupnog antitela.
[0435] Ovaj pronalazak je dalje opisan na način ne limitirajućih primera koji slede.
PRIMERI
[0436] Praksa u ovom pronalasku predviđa upotrebu, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalnih tehnika hemije, molekularne biologije, mikrobiologije, tehnologije rekombinantne DNK i imunologije, koje su u sklopu sposobnosti osobe koja je normalno edukovana i prosečno stručna u oblasti. Ove tehnike su objašnjene u literaturi. Videti na primer, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Col d Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch.9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; and E. M. Shevach and W. Strober, 1992 and periodic supplements, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY.
Materijal i Metode
FLAGELINI RODA ROSEBURIA
Raznovrsnost flagelina
[0437] Flagelini iz bakterijskog roda Roseburia posebno, Roseburia hominis i Roseburia intestinalis su klonirani, eksprimirani, prečišćeni i analizirani.
[0438] Slike B1A i B1B pokazuju SDS analizu rekombinantnih flagelina.
[0439] Nomenklatura proteina flagelina: 

Roseburia R
Roseburia vrsta
[0440]
Roseburia hominis
Roseburia hominis FlaA1 (ovde se odnosi takođe i na RhFlaA1 ili Rh1) Roseburia hominis FlaA2 (ovde se odnosi takođe i na RhFlaA2 ili Rh2)
Roseburia intestinalis
Roseburia intestinalis FlaA1 (ovde se odnosi takođe i na RiFlaA2 ili Ri1 ili RI1) Roseburia intestinalis FlaA2 (ovde se odnosi takođe i na RiFlaA2 ili Ri2 ili RI2) Roseburia intestinalis FlaA3 (ovde se odnosi takođe i na RiFlaA3 ili Ri3 ili RI3) Roseburia intestinalis FlaA4 (ovde se odnosi takođe i na RiFlaA1 ili Ri4 ili R14)
Videti:
ELY, B., ELY, T.W., CRYMES, W.B.,JR and MINNICH, S.A., 2000. A family of six flagellin genes contributes to the Caulobacter crescentus flagellar filament. Journal of Bacteriology, 182(17), pp.5001-5004. IBRAHIM, G.F., FLEET, G.H., LYONS, M.J. and WALKER, R.A., 1985. Method for the isolation of highly purified Salmonella flagellins. Journal of clinical microbiology, 22(6), pp. 10 NEVILLE,B.A.,FORDE,B.M.,CLAESSON,M.J.,DARBY,T.,COGHLAN,A.,NALLY,K.,RO SS,R.P.andO'TOOLE, P.W., 2012. Characterization of pro-inflammatory flagellin proteins produced by Lactobacillus ruminis and related motile Lactobacilli. PloS one, 7(7), pp. e40592. NG, S.Y., CHABAN, B. and JARRELL, K.F., 2006. Archaeal flagella, bacterial flagella and type IV pili: a comparison of genes and posttranslational modifications. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 11(3-5), pp. 167-191. WATSON, R.O. and GALAN, J.E., 2005. Signal transduction in Campylobacter jejuni-induced cytokine production. Cellular microbiology, 7(5), pp.655-665.
Uslovi za rast bakerija
[0441] R. hominis A2-183<T>(=DSM 16839<T>=NCIMB 14029<T>) je rasla anaerobno na 37°C u YCFA mediumu. Bakterijska kultura je oborena i talog rastvoren u jednom mL YCFA medijuma, obogaćenim sa 2% cisteina (w/v, Sigma-Aldrich) i 3% askorbinske kiseline (w/v, Sigma-Aldrich).
[0442] R. intestinalis L1-82<T>(=DSM 14610<T>=NCIMB 13810<T>) je rastla anaerobno na 37°C u YCFA mediumu. Bakterijska kultura je oborena i talog je rastvoren u jednom mL YCFA medijuma, obogaćenim sa 2% cisteina (w/v, Sigma-Aldrich) i 3% askorbinske kiseline (w/v, Sigma-Aldrich).
MIŠEVI
[0443] C3H/HeN i C57Bl/6 su kupljeni od Harlan Laboratorije. GnotoBiotički (životinje bez mikroorganizama (GB)) GB C3H/HeN su obezbeđeni i održavani u gnotobiotičkoj laboratoriji za uzgajanje glodara u labboratoriji Jouy-en-Josas, u okviru INRA-e (ANAXEM plateform, Institut Micalis, INRA, Jouy-en- Josas, France). GB TLR5KO i divlji soj C57Bl/6 su obezbeđeni od strane Andrew Gewirtz (Center for Inflammation, Immunity, and Infection i Department of Biology, Georgia State University, Atlanta, GA 30303, USA) i održavani u laboratoriji za uzgoj gnotobiotičkih glodara u Joui-en-Josasu. Konvencionalni soj TLR5KO i divlji soj BOY/J su obezbeđeni od strane Adama Cunningham (MRC Centre for Immune Regulation, Institute of Microbiology and Infection, Division of Immunity and Infection University of Birmingham UK). Rukovođenje i eksperimentalne procedure odobrene su od strane lokalnih etičkih odbora.
Eksperimenti sa životinjama
[0444] Eksperimenti sa gnotobiotičkim životinjama su urađeni u laboratoriji za uzgoj gnotobiotičkih glodara u Joui-en-Josasu (ANAXEM plateform, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, France). GB C3H/HeN miševi mužijaci su podeljeni u kontrolnu (N=8) i tretiranu (N=10) grupu i odvajani u kaveze pojedinačno u plastičnim izolatorima. Na dan 0, 1 i 2 životinjama iz tretirane grupe davano je 100 mL bakterijske kulture R. hominis dok su kontrolne životinje dobijale 100 mL čistog YCFA medijuma. Uzorci Ileuma, uzlaznog kolona i uzorci cekuma su sakupljeni 14 i 28 dana. Šest GB C3H/HeN miševa mužijaka je tretirano sa E. coli MG1655 (K12) kao što je već opisano i tri životinje su žrtvovane 10-og i 22-gog dana kako bi dali N=3. Tri GB TLR5KO miša i tri C57Bl/6 WT miša su inokulisana kulturom R. hominis, kao sto je gore već opisano, kako bi se procenio funkcionalni značaj flagelina koji potiče od of R. hominis. Nakon 28 dana ove životinje su žrtvovane zajedno sa njihovim GB parovima. Dvadeset dve ženke miševa C57BL/6 su hranjene 14 dana sa po 50 µL 10<9>bakterija R. hominis dnevno. Kontrolne životinje su hranjene čistim medijumom. Od 8-og dana, narednih 6 dana miševima je davan DSS (MW 50kDa, 30g/l) u vodi za piće. Ţivotinje su žrtvovane 14-tog dana i uzorci tkiva su pripremljeni na predhodno opisan način.
Eksperimenti u kulturi tkiva
[0445] Caco-2 (Homo sapiens epitelijalne kolorektalne ćelije adenokarcinoma) i HT29 (Homo sapiens kolorektalni adenokarcinom) ćelije su gajene u “Transwell” plastičnim pločama (sa bunarima) u anaerobnoj komori. Bakterijske ćelije R. hominis A2-183 ili R. intestinalis L1-82<T>su sakupljane u eksponencijalnoj fazi rasta i 100 μL bakterijske suspenzije (10<8>CFU/mL) je dodato u ekperimentalne bunare. Bakterijske (nezalepljene i zalepljene) i eukariotske ćelije (Caco-2 i HT-29) su sakupljane nakon 2h i 4h inkubacije i odloženo u “RNAlater” rastvoru. Za ekperimente u kulturi tkiva, sa rekombinantnim flagelinima, 5x10<4>Caco-2 ćelija je gajeno u plastičnim pločama sa 24 bunarića na temperaturi od 37°C, pri 75% vlažnosti atmosfere i 5% CO2. Ćelije su dostizale konfluentni rast 5-6 dana i korišćene su tri dana nakon postizanja konfluentnosti. Ćelije su inkubirane sa rekombinantnim flagellinima u finalnoj koncentraciji of 100 ng/μl tokom 2h na 37°C, pri 75% vlažnosti atmosfere i 5% CO2.
FISH analiza
[0446] FISH analiza je urađena sa neutralno puferisanom i formalinom fiksiranom crevnom isečku uz korišćenje univerzalne bakterijske probe Eub338 i novodizajniranih specifičnih proba R. hominis A2-183 i R. intestinalis L1-82<T>.
Konstrukcija biblioteke R. hominis
[0447] R. hominis hromozomalna DNK, za konstrukciju genske biblioteke malih fragmenata i pirosekvenciranje izolovana je pomoću UltraCleanTM Microbial DNK izolacionog Kit-a (Mo Bio Laboratories Inc) dok je visokomolekulska DNK, za konstrukciju fosmidne biblioteke, izolovana pomoću Wizard Genomic DNA Purification kit-a (Promega).
“Microarray” analiza
Bacterijski “microarray”
[0448] Bakterijska RNK je izolovana iz sadržaja mišijeg cekuma i dalje obrađena korišćenjem komercijalnog kita prateći uputstva proizvođača. Iz 6000 E. coli plazmidnih klonova, koji čine biblioteku R. hominis, umnoženi su PCR produkti koji su poređani u duplikatu na aminosilanom obloženoj mikroskopskoj pločici korišćenjem MicroGrid II TAS (BioRo- botics).
Mišija “microarray” analiza
[0449] Totalna RNK je ekstrahovana iz ileuma i tkiva uzlaznog debelog creva, cRNA/aRNA obeležena biotinom (u zavisnosti od korišćenog Affymetrix kita), i hibridizovana pomoću GeneChip NuGO Mouse Array i GeneChip Mouse Genome Array-a (Affymetrix). Analiza podataka urađena je uz pomoć softeverskih paketa R (http://www.r- project.org) i Bioconductor (http://www.bioconductor.org).
RT-PCR analysis
[0450] Prajmeri specifični za vrstu R. hominis i to: 5'-CCCACTGACAGAGTATGTAATGTAC-3' i 5'-GCACCACCTGTCAC- CAC-3' su korišćeni za PCR analizu fekalnih uzoraka kako bi se validirao (proverio) nivo kolonizacije u crevima. “Real-time” PCR analiza je urađena na 7500 Fast Real-Time PCR System-u (Applied Biosystems) aparatu uz korišćenje smeše za PCR -Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Sve analize uzoraka su urađene u triplikatu. GyrA gen je korišćen kao referentni gen, za normalizaciju. Za ekspresiju gena domaćina totalna eukariotska RNK, izolovana iz ileuma i uzlaznog debelog creva je reverznom transkripcijom prevedena u cDNK pomoću High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit-a (Applied Biosystems). “Real-time” PCR analiza je urađena na 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) aparatu sa QuantiFast SYBR Green PCR Kit-om (Qiagen) i QuantiTect Primer Assays (Qiagen). Sve analize uzoraka su urađene u triplikatu. Hprt gen je korišćen kao referentni gen, za normalizaciju. Svi dobijeni RT-PCR podaci su su analizirani na logaritamskoj skali sa osnovom 2 pomoću programa ANOVA sa značajnošću P<0.05. Relativne razlike su izražene sa netransformisanim podacima.
“Western blot” analiza
[0451] Imunoprečišćena zečija poliklonska antitela na Roseburia hominis FlaA1 i FlaA2 su proizvedena kako je opisano u radu Duck-a i saradnika (Duck et al. 2007). Za “Western blot” analizu, R. hominis je gajena u prisustvu različitih količina (0.01g do 1g hrane/10 mL kulture) UV-om pretretirane mišije hrane tokom 3h, filtrirane da bi se odstranili ostaci hrane i razblažene u “laemmli” puferu koji je sadržao 8M ureu. Uzorci su naneti na NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) i nakon elektroforeze dalje obrađeni korišćenjem WesternBreeze Chromogenic Immunodetection System (Invitrogen) kita. FlaA1 i FlaA2 antitela su korišćena u odnosu (razblaženju) 1:1000 a kontrolna anti-DNA gyrase A (Abcam), u odnosu 1:300, korišćenjem zečijih antitela sa konjugovanih alkalnom fosfatazom. Detekcija je praćena promenom boje supstrata u odnosu na promenu boje kod kontrole.
Imunofluorescencija
[0452] Imunolokalizacija R. hominis flagellina ispitana je u sadržaju kolona kod miševa korišćenjem specifičnih antiseruma nastalih protiv definisanih peptidnih sekvenci poreklom od FlaA1 i FlaA2 flagellin proteina. Uzorci sadržaja creva su fiksirani u prethodno ohlađenom metanolu, inkubirani sa anti-FlaA1 ili anti-FlaA2 antiserumom zeca (CovaLabs) preko noći na 4°C i vizualizovani pomoću Alexa donkey anti rabbit 488 (Molecular Probes).
[0453] T ćelijski markeri su analizirani na kriopresecima debljine 8 μm. Fiksirani uzorak tkiva je inkubiran sa Ly6G- FITC, CD3-FITC, CD11b-FITC (BD Biosciences), dvostruko obeleženim sa FoxP3 (Abcam) i CD3-FITC (BD Biosciences) primarnim antitelom ili izospecifičnim IgG. Uzorci su kontrastirani pomoću DAPI i fiksirani uz pomoć Vectashield (Vector Laboratories). Za brojanje pozitivnih ćelija, minimum pet mikroskopskih polja, za svaki od uzoraka miša je pregledano.
Kloniranje i prečišćavanje rekombinantnih flagellina
[0454] Geni odgovorni za sintezu flagelina izolovani su iz tečnih bakterijskih kultura R. hominis, R. intestinalis, S. typhimurium, S. enteritidis, Eubacterium rectale 33656 i E. coli K12 nakon umnožavanja pomoću PCR-a i prečišćavanja. Caco-2 ćelije su inkubirane sa rekombinantnim flagelinima u finalnoj koncentraciji od 100 ng/mL tokom 2h na 37°C pri 75% vlažnosti atmosfere i 5% CO2.
Izolacija intestinalnih i MLĈ ćelija
[0455] Ćelije su izolovane iz tankog creva i mezenteričnih linfnih čvorova (MLĈ) kao što je prethodno opisano, sa malim izmenama (Monteleone et al. 2008). Ukratko, ćelijska suspenzija je inkubirana sa 100U/mL collagenase VIII (Sigma-Aldrich) u RPMI obogaćenim sa 20% FBS na 37°C tokom 20 min (mezenterični limfni čvorovi) ili 1 sat (crevni isečci). Pojedinačne ćelijske suspenzije su dalje analizirane pomoću protočnog citometra (kao što je opisano).
Generisanje dendritskih ćelija i kultura iz kostne srži
[0456] Koštana srž je uzimana iz femura i tibije C3H/HeN i C57Bl6 miševa. Za dendritične ćelije poreklom od GMCSF, ćelije koštane srži su rastvorene kao 1x10<6>/mL u RPMI obogaćenim sa 10% FCS i 20ng/mL rmGM-CSF i zasejane u 10mL/po ploči u 100mm<2>pločama za ćelijsku kulturu. Nakon tri dana u kuluri, ćelije koje su slabo adherirale pokupljene su i prelivene sa GM-CSF obogaćenim medijumom na 1x10<6>/mL u pločama za ćelijsku kulturu sa 12 bunarića.
[0457] Petog dana ćelije su stimulisane sa 100ng/mL flagellina, a nakon toga šestog dana pokupljene. Za dendritične ćelije poreklom od Flt3L, ćelije koštane srži su rastvorene kao 2x10<6>/mL u RPMI obogaćenim sa 10% FCS i 200ng/mL rmFlt3 i zasejane u 2mL/po bunaru u u pločama za ćelijsku kulturu sa 12 bunarića. Ćelije su gajene 10 dana, a od četvrtog dana medijum je obogaćivan sa Flt3. Devetog dana ćelije su stimulisane sa 100ng/mL flagellina, a desetog dana pokupljene i analizirane pomoću protočnog citometra.
Protočna citometrija
[0458] Pre bojenja specifičnim fluorohrom konjugovanim antitelima pojedinačne ćelijske suspenzije poreklom od ćelija lamina propria i dendritične ćelije inkubirane su u “blocking” puferu (sadrži serum i CD16/CD32 antitela) na 4°C tokom 15 min. Ćelije lamina propria su obeležene mišijim antitelima CD4-FITC i CD25-APC (eBioscience), CD8-APC-Cy7 i CD3-PerCP (Biolegend), i B220-BV570 (BD Biosciences). Intraćelijsko FoxP3 obeležavanje je rađeno nakon ekstraćelijskog bojenja i ćelijske fiksacije/permeabilizacije po uputstvima proizvođača (eBioscience). GMCSF-derived dendritične ćelije su obeležene antitelima CD11c-PE-Cy7, CD11-PerCP Cy5. I-A/I-E -APC-Cy7, CD80-PE, CD86-APC, CD8-FITC, B220-BV570. Dendritične ćelije poreklom od Flt3 su obeležene sa CD11c-PE-Cy7-, CD11b- ili Siglec-H-PerCP Cy5-, I-A/I-E -APC-Cy7, CD317 -PE, CD40-APC, CD103-FITC, B220-BV570. Ćelije su analizirane pomoću FACSArria (BD Biosciences) i FlowJo softvera verzija 7.2.5.
CITOMETRIJA POMOĆU KUGLICA (CPK) (Cytometric Bead Array (CBA))
[0459] Ćelije koštane srži izolovane su iz femura i tibije sa RPMI medijumom od C3H/HeN i C57Bl/6 miševa i Flt3L-proširen kao što je ranije opisano. Ćelije su stimulisane sa 100 ng/mL flagellina (na primer Roseburia flagellin) nakon 9 dana kultivisanja, a supernatant sakupljan desetog dana. Eksperiment je urađen u tri nezavisna ponavljanja da bi se dobio N=3.
[0460] CBK analiza je urađena na ćelijskim supernatantima korišćenjem Cytometric Bead Array Mouse Enhanced Sensitivity Master Buffer Kit-a (BD Biosciences). Uzorci i standardi su nanošeni na ploče sa 96 bunarića za merenje u FACSArray-ja (BD Biosciences). Rezultati suanalizirani pomoću BD FCAP softvera (BD Biosciences).
Histologija
[0461] Uzorci tkiva uzlaznog dela debelog creva su fiksirani u neutralnom puferisanom formalinu (Sigma), fiksirani u smrznutoj smoli, a 4 mm uzorka tkiva je obojeno standardnim hemotoksilina/eozina bojenjem. Kompletna poprečno presečna površina debelog creva svake životinje je pregledna pri uvećanju x200 na Zeiss Akioskop mikroskopu pomoću Klmaging kamere kontrolisane softverom Image Pro Plus. Svako vidno polje je zatim skorovano od 0-4 prema metodi opisanoj kod Berg i saradnika (Berg et al., 1996). Srednja vrednost vidnih polja u datom rasponu je izračunata, a tretirane grupe upoređene pomoću student t-test analize.
[0462] Dodatni detalljni protokoli su opisani u dodatku Materijala i Metoda
Dopunske Informacije (DI) Materijali i Metode
Uslovi za rast bakterija
[0463] R. hominis A2-183<T>(=DSM 16839<T>=NCIMB 14029<T>) je gajena anaerobno na sintetičkom YCFA ili kompleksnom M2GSC medijumu. Kultura je inokulisana iz smrznutog stoka u “Hungate” epruvete i inkubirana preko noći na 37°C. Bakterije su nakon toga gajene na M2GSC agaroznim pločama 48h u MACS-MG-1000 anaerobnim komorama (Don Whitley Scientific) u prisustvu 80% N2, 10% CO2i 10% H2na 37°C. Efekat mucina je istražen dodavanjem 0.5% (w/v) mucina iz “porcine stomach type III” (Sigma-Aldrich) u YCFA mediujumu.
[0464] Za potrebe kolonizacije gnotobiotičkih (GB) miševa R. hominis je gajena u YCFA medijumu preko noći na 37°C. Prekonoćna kultura je oborena i talog resuspendovan u jednom mL YCFA medijuma, obogaćenom sa 2% cisteina (w/v, Sigma- Aldrich) i 3% askorbinske kiseline (w/v, Sigma-Aldrich).
Miševi
[0465] C3H/HeN i C57Bl/6 su kupljeni od Harlan Laboratorije. Miševi su gajeni u prisustvu HEPA filtriranih “flexi-film” izolatora (Bell Isolation Systems) na Aberden Univerzitetu. GB C3H/HeN su obezbeđeni i održavani u laboratoriji za uzgoj gnotobiotičkih glodara u Jouy-en-Josas (ANAXEM platforma, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, France). GB TLR5KO i divlji soj C57Bl/6 obezbeđeni su odstrane Andrew Gewirtz (Center for Inflammation, Immunity, and Infection and Department of Biology, Georgia State University, Atlanta, GA 30303, USA) i održavani u INRA u laboratoriji za uzgoj gnotobiotičkih glodara Jouy-en-Josas. Menadžment i eksperimentalne procedure su odobrene od strane lokalnih etičkih odbora.
Eksperimenti na miševima
[0466] Osamnaest GB C3H/HeN mužjaka su podeljeni u kontrolnu (N=8) i tretiranu (N=10) grupu i odvajani u kaveze pojedinačno u plastičnim izolatorima. Miševi su hranjeni ad libitum komercijalnom, sterilisanom hranom (R03-40; UAR). Dana 0-og, 1-og i 2-og životinje iz tretirane grupe su dobijale 100 µL R. hominis kulture kljukanjem (pomoću sonde), dok su kontrolne životinje dobijale 100 μL YCFA medijuma. Dana 14-og i 28-og, četiri kontrolne životinje i pet tretiranih sa R. hominis su žrtvovane. Uzorci ileuma i uzlaznog debelog creva su podeljeni na četiri jednaka dela i prebačeni u RNAlater (Ambion), neutralni puferisani formalin (NBF; Sigma-Aldrich) ili tečni azot. Kompletni cekum je prebačen u RNAlater.
[0467] Da bi utvrdili specifičnost odgovora na R. hominis, šest GB C3H/HeN miševa mužjaka tretirano je sa E. coli MG1655 (K12), i tri životinje se žrtvovane 10-tog i 22-gog kao što je gore već opisano, tako da N=3.
[0468] Tri GB TLR5KO i tri C57Bl/6 WT miša inokulisana su kulturom R. hominis kao što je ranije opisano kako bi se utvrdio funkcionalni značaj R. hominis flagellina. Nakon 28 d ove životinje su žrtvovane zajedno sa njihovim GB parovima.
[0469] Dvadeset dve C57BL/6 ženke miša (6 nedelja starosti) korišćene su da bi se utrvdio terapeutski efekat R. hominis u prisustvu DSS-om indukovanog kolitisa. Nakon perioda aklimatizacije tokom 7-10 dana, miševima je davano 50 µL 10<9>CFU R. hominis dnevno, narednih 14 dana. Kontrolne životinje su dobijale čist medijum. Od 8-og dana, miševi su dobijali DSS (MW 50kDa, 30g/l) u vodi za piće, narednih 6 dana. Ţivotinje su žrtvovane 14-og dana i uzorak tkiva je pripremljen kao što je već opisano.
Eksperimenti u kulturi tkiva
[0470] Svi reagensi za ćelijsku kulturu, ukoliko nije drugačije naznačeno, su isporučeni od strane Sigma-Aldrich. Eksperimenti vezani za kulturu tkiva rađeni su u anaerobnim uslovima, 2x10<5>Caco-2 ili HT29 ćelije u 1.5 mL DMEM (visoka koncentracija glukoze, HEPES) medijumu obogaćenom temeraturno inaktivisanim fetalnim goveđim serumom (Gibco), penicilinom, streptomicinom, amfotericinom B i L-glutaminom zasejane su u gornje delove bunarića sa insertom u ploču sa 6 bunarića (Corning). Donji delovi bunarića sadržali su 3.0 mL istog medijuma. Ćelije su inkubirane na 37°C u prisustvu 5% CO2do tri dana, a onda isprane sa “Hanks”-ovim rastvorom kako bi se odstranio antibiotik i FCS i gajene u DMEM-u obogaćenim sa L-glutaminom, natrijum selenitom i transferinom naredna 24h bez antibiotika. Inserti iz bunarića su onda prebačeni na 37°C u anaerobni boks u okviru anaerobne komore. Gornji delovi svakog inserta su dopunjeni anaerobnim DMEM ćelijskim medijumom, a donji oksigenisanim DMEM-om.
[0471] R. hominis A2-183 kultura je oborena u eksponencijalnoj fazi rasta centrifugiranjem na 3,500xg tokom 5 min. Pelet je ispran i resuspendovan u 0.8 mL anaerobnog DMEM-a. Sto mikrolitara bakterijske suspenzije (10<8>CFU/mL) dodat je u eksperimentalne bunare. U kontrolne bunare ulivena je ista količina medijuma bez bakterijskih ćelija. Dodatne kontrole uključivale su bakterijske ćelije inkubirane bez Caco-2 ili HT29 ćelija. Bakterijske i eukariotske ćelije su obarane nakon 2h i 4h incubacije. Bakterije koje su adherirale i one koje nisu su pokupljene i prebačene u RNAlater (Ambion). Vijabilnost R. hominis ćelija je testirana zasejavanjem na YCFA podlogu. Caco-2 ili HT-29 ćelije su pokupljene iz bunarića i takođe prebačene u RNAlater.
[0472] R. intestinalis L1-82<T>(=DSM 14610<T>=NCIMB 13810<T>) kultura je oborena u eksponencijalnoj fazi rasta centrifugiranjem na 3,500xg tokom 5 min. Pelet je ispran i resuspendovan u 0.8 mL anaerobnog DMEM-a. Sto mikrolitara bakterijske suspenzije (10<8>CFU/mL) dodat je u eksperimentalne bunare. U kontrolne bunare ulivena je ista količina medijuma bez bakterijskih ćelija. Dodatne kontrole uključivale su bakterijske ćelije inkubirane bez Caco-2 ili HT29 ćelija. Bakterijske i eukariotske ćelije su obarane nakon 2h i 4h incubacije. Bakterije koje su adherirale i one koje nisu su pokupljene i prebačene u RNAlater (Ambion). Vijabilnost R. intestinalis ćelija je testirana zasejavanjem na YCFA podlogu. Caco-2 ili HT-29 ćelije su pokupljene iz bunarića i takođe prebačene u RNAlater.
[0473] Za eksperimente sa rekombinantnim flagelinima u kulturi tkiva, 5x10<4>Caco-2 ćelija je zasejano u mikrotitar ploče sa 24 bunarića, i to u DMEM (visoka koncentracija glukoze, HEPES) medijumu obogaćenom temeraturno inaktivisanim fetalnim goveđim serumom (Gibco), penicilinom, streptomicinom, amfotericinom B i L-glutaminom na 37°C u atmosferi 75% vlažnosti i 5% CO2. Ćelije dostižu konfluentnost 5-6 dana, i korišćene su u naredna 3 dana. Pre bilo kog tretmana, ćelije su oprane dva puta sa “Hanks”' puferisanom rastvoru soli i čuvane u DMEM-u obogaćenom L-Glutaminom, selenom i transferinom narednih 24h.
Konstrukcija biblioteke R. hominis
[0474] Hromozomalna DNK R. hominis izolovana je za konstrukciju genske biblioteke malih fragmenata i pirosekvenciranje pomoću UltraCleanTM Microbial DNA Isolation Kit-a (Mo Bio Laboratories Inc) dok je visokomolekulska DNK, za konstrukciju fosmidne biblioteke, izolovana pomoću Wizard Genomic DNA Purification kit-a (Promega). DNA integritet je proveren elektroforezom na gelu.
[0475] DNK je mehanički obrađena (isečena) pomoću Nebulizer Kit-a (Invitrogen) i razdvojena elektroforezom na gelu. DNK fragmenti željene dužine su isečeni iz gela i prečišćeni pomoću Wizard® SV Gel kao i PCR Clean-Up System (Promega). DNK krajevi su obrađeni pomoću DNA Terminator End Repair Kit-a (Lucigen). Fragmenti veličine 1.5-3.5 kb klonirani su pomoću CloneSmart® LCAmp Kit-a (Lucigen) dok je biblioteka sa fragmentima 4-8 kb konstruisana pomoću pJAZZ®-OC Vector (Lucigen). Fozmidna biblioteka je konstruisana pomoću CopyControlTM Fosmid Library Production Kit-a (Epicentre Biotechnologies). Kolonije su sakupljene pomoću automata za sakupljanje kolonija (automated colony picker) (BioRobotics BioPick, Genomic Solutions) i arhivirani u mikrotitar ploče sa 384 bunarčića koji su sadržali 70 µL 2xLB medijuma obogaćenog sa 10% glicerola i odgovarajućim antibiotikom. Ćelije su gajene preko noći na 37 °C sa šejkiranjem i čuvane na -80 °C.
Sekvenciranje, sklapanje i anotacija genoma
[0476] Templeti za sekvenciranje biblioteke malih fragmenata su dobijeni pomoću PCR-a korišćenjem 1 µL uzorka i prajmera SL1 i SR2 koji su obezbeđivali mesta za kloniranje u pSMART-LCAmp. PCR produkti su prečišćeni pomoću Multiscreen PCR Clean-up filter plates (Millipore). Rekombinantna DnK iz pJAZZ®-OC klonova je izolovana pomoću Wizard® SV 96 Plasmid DNA Purification System (Promega). Fosmidna DNK je izolovana pomoću FosmidMAXTM DNA Purification Kit-a (Epicentre). Sekvence krajeva DNK fragmenata iz biblioteke kompletnog genoma R. hominis dobijeni su pomoću DNK sekvencera CEQ8000 (Beckman Coulter) i ABI 3770 (Applied Biosystems). Genomska DNK iz R. hominis je takođe sekvencirana pomoću 454 GS20 (454 Life Sciences) i 454 FLX sekvencera (Roche). Podaci dobijeni nakon Sanger i 454 sekvenciranja su sastavljeni pomoću MIRA verzije 3 (http://chevreux.org/projects_mira.html; (1). RAST annotation pipeline (http://rast.nmpdr.org; (2)) program je korišćen za automatsko i ručno anotiranje genoma i komparativnu genomsku analizu. Genomske sekvence R. hominis A2-183 deponovane su u GenBank bazu pod brojem CP003040.
“Microarray” analiza
Bakterijski “microarray”
[0477] Bakterijska RNK izolovana je iz sadržaja mišijeg cekuma pomoću RNeasy Mini Kit-a (Qiagen) i dalje obrađena korišćenjem MICROBEnrichTM Kit-a (Ambion), MICROBExpressTM Bacterial mRNA Enrichment Kit-a (Ambion) i MessageAmpTM II-Bacteria RNA Amplification Kit-a (Applied Biosystems). RNK je obeležena bilo sa dCTP- Cy3 ili dCTP-Cy5 tokom cDNK sinteze (CyScribe First Strand cDNA Labelling Kit; Amersham). Obeleženi produkti prečišćeni su pomoću CyScribe GFX Purification Kit-a (Amersham). PCR produkti umnoženi iz 6000 klonova poreklom iz E. coli plazmidne RA8 biblioteke R. hominis su naneti u duplikatu na aminosilanom obložene mikroskopske pločice (Corning) korišćenjem MicroGrid II TAS (BioRobotics). Unmoženi fragmenti “housekeeping” (stalno prisutnih) gena rpoD i gyrA nasumično su raspoređeni na ploči, kao kontrole. Hibridizacija je urađena u GeneTAC hybridizacionoj komori (Genomic Solutions). Nakon obeležavanja bojom sledila je druga hibridizacija, a nezavisno prečišćena RNK je takođe obeležena i hibridizovana dva puta da bi se obezbedila ponovljivost i postigli statistički značajni rezultati. Kada se na kraju preračuna, ukupno četiri slajda su hibridizovana i na kraju ukupno dobili 12 hibridizovanih spotova po umnoženom klonu. Fluorescencija je merena u dva kanala pomoću GeneTAC LS IV (Genomic Solutions) koji je sadržao GeneTac Integrator version 3.0.1 softver. Intenziteti signala su prebačeni na logaritam (log-transformed) i Loess normalizacija je primenjena kako bi se izbegle razlike između obeležavanja probe i efikasnosti hibridizacije. T-test za jedan uzorak je korišćen za vrednosti logodnosa kako bi se testirale razlike u ekspresiji. Rezultati se smatraju validnim u opsegu >2 i P<0.05.
Mišija “microarray” analiza
[0478] Tkivo Ileum-a i uzlaznog debelog creva je izvađeno iz RNAlater-a i lizirano u Trizol-u (Invitrogen). RNK je izolovana korišćenjem standardnih hloroform/izopropanol koraka. Totalna RNK je dodatno prečišćena RNeasy Kit-om (Qiagen), uključujući RNase-free DNase I (Qiagen) korake digestije (sečenja). RNA kavalitet je odrađivan pomoću Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Totalna RNK je je prevedena u biotinom-obeleženu cRNA pomoću One-Cycle Target Labeling Kit-a (Affymetrix) ili biotinom-obeleženu aRNA pomoću 3' IVT Express Kit-a (Affymetrix). Hibridizacija GeneChip NuGO Mouse Array i GeneChip Mouse Genome Array (Affymetrix) na GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix) je uradjena u Institutu za Medicinske Nauke, koji imaju opremu za “Microarray” (University of Aberdeen, UK). Ĉipovi su skenirani pomoću Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Analiza kvaliteta slika je potvrđena korišćenjem Gene Chip Operating Softvera (GCOS) (Affymetrix). Dalja analiza podataka je urađena pomoću dostupnih (slobodnih) softver paketa R (http://www.r-project.org) i Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Umereni F-test, koji je obezbeđen od Bio-conductor paket limma, korišćen je za testiranje diferencijalne ekspresije. Podaci su smatrani značajnim kada je P<0.05 korišćenjem Benjamini i Hochberg metoda za otkrivanje netačnih rezultata: Statistička analiza je urađena odvojeno za svaku od dve vremenske tačke. Svi različito eksprimirani geni (P<0.05) su uneti u MetaCore analitički softver (Gene- Go, St Joseph, MI) da bi se generisale mape puteva. Analiza integrisanog obogaćivanja puteva (integrated pathway enrichment analysis) izvršena je pomoću kanonskih puteva baziranih na znanju i endogenih metaboličkih puteva. Rangiranje relevantnih integrisanih puteva zasnovano je na P-vrednostima izračunatim pomoću hipergeometrijske distribucije. P vrednosti predstavljaju verovatnoću datog broja gena sa ulazne liste koji odgovaraju određenom broju gena na mapi veroavtnoće, uzimajući u obzir broj gena u eksperimentu naspram broja gena na mapi u okviru celokupnog skupa gena na mapama.
[0479] Funkcionalno tumačenje podataka bazirano na genskoj ontologiji (GO) je urađeno pomoću programa DAVID (http://david.ab- cc.ncifcrf.gov), proširene verzije originalnog programa dostupnog na web portalu (3). Značajno različiti transkripti (P<0.05) stavljeni su u kategoriju “Biološki proces” kako bi se otkrili paterni (obrasci) genske ekspresije značajno pojačani za specifične GO izraze.
[0480] “Microarray” podaci podneti su u Nacionalni centar za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) Gene Expression Omnibus (pristupni broj GSE25544;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
RT-PCR analiza
[0481] Prajmeri specifični za R. hominis 5'-CCCACTGACAGAGTATGTAATGTAC-3' i 5'-GCACCACCTGTCAC- CAC-3' su korišćeni za semi-kvantitativnu i “Real-time” PCR analizu fekalnih uzoraka za potvrđivanje nivoa kolonizacije u crevima. Ostali bakterijski PCR prajmeri su dizajnirani pomoću on-line alata Primer3Plus (4) i kupljeni od Sigma-Aldrich. “Real-time” PCR analiza je urađena pomoću 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) sa Power SYBR Green PCR Master Mix-om (Applied Biosystems). PCR je pripremljen na sledeći način: jedan ciklus na 95°C tokom 10 min, zatim 40 ciklusa na 95°C tokom 15 sek i 60°C tokom 1 min, završani korak disocijacije. Svi uzorci su puštani u triplikatu. GyrA je korišćen kao referentni gen za normalizaciju obzirom na njegovu nisku varijaciju između uzoraka.
[0482] Za ekspresiju gena domaćina 2µg totalne eukariotske RNK, izolovane iz ileuma i uzlaznog kolona, reverzno je transkribovano u cDNK sa High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit-om (Applied Biosystems) pomoću nasumičnih prajmera. “Real-time” PCR analiza je urađena pomoću 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) sa QuantiFast SYBR Green PCR Kit-om (Qiagen) i QuantiTect Primer Assays (Qiagen). Uslovi za PCR cikluse su bili sledeći: jedan ciklus na 95°C tokom 5 min, zatim 40 ciklusa na 95°C tokom 10 sek i 60°C u trajanju od 30 sek, završni korak disocijacije. Svi uzorci su puštani u triplikatu. Hprt je korišćen kao referentni gen za normalizaciju s obzirom na njegovu nisku varijaciju između uzoraka.
[0483] RT-PCR podaci su su analizirani na logaritamskoj skali sa osnovom 2 pomoću programa jednosmerna ANOVA (jednosmerna analiza varijanse) sa značajnošću P<0.05. Relativne razlike su unatrag transformisane (back transformed) da bi se izračunale promene u redu veličine.
“Western blot” analiza
[0484] Imunopprečišćena zečija poliklonska antitela na Roseburia hominis Fla1 i Fla2 su proizvedena kako je opisano u radu Duck-a i saradni (5). Ukratko, “New Zealand” bele ženke, zečevi, su imunizovane pomoću sintetičkog peptida u kompletnom Freund-ovom adjuvantu sa pojačavanjem (boosted) nekoliko puta. Za R. hominis Fla1, korišćeni su peptidi NH2-CRSQVRGLNKASDNA-CONH2i NH2-IDGNFTSKKLQVGSLC-COOH, a za R. hominis Fla2, korišćeni su peptidi C-AQYNDDAKSVLEILK-COOH i C-GLNKASRNSQDGIS-CONH2. Nakon imunizacije antitela su prečišćena na imunoafinitetnoj koloni kačenjem peptida na 1 mL aktiviranih sefaroznih kuglica.
[0485] Za “Western blot”, R. hominis je gajena u prisustvu različitih količina (0.01 g do 1g hrane/10 mL kulture) UV-om pretretirane mišije hrane tokom 3h, filtrirane da bi se odstranili ostaci hrane i razblažene u “laemmli” puferu koji je sadržao 8M ureu. Trideset µL svakog uzorka naneto je u bunariće NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris gel-a (Invitrogen) pušteno na elektroforezu i dalje obrađeno korišćenjem WesternBreeze Chromogenic Immunodetection System (Invitrogen). Fla1 i Fla2 antitela su korišćena razblažena u rastvaraču u odnosu 1:1000 a kontrolna anti-DNA gyrase A (Abcam), razblažena u odnosu 1:300 i inkubirana preko noći na 4°C, a zatim 1h na sobnoj temperaturi korišćenjem zečijih antitela konjugovanih alkalnom fosfatazom. Detekcija je praćena promenom boje supstrata u odnosu na promenu boje kod kontrole.
“FISH” analiza
[0486] Tkiva fiksirana u neutralnom puferisanom formalinu su postavljena (utisnuta) u Technovit 8100 (Heraeus Kulzer). Dvomikronski isečci su dobijeni pomoću rotirajućeg mikrotoma (Leica/Reichert Autocut). Tri isečka su uzimana po slajdu na 100 µm, 200 µm i 300 µm u tkivo, rezultujući u devet isečaka po životinji.
[0487] Slajdovi su dehidrirani uzastopnim inkubacijama u 50% (v/v), 80% i 96% etanolu i sušeni na sobnoj temperaturi (ST). Korišćene 16S rRNK “FISH” probe bile su opšta bakterijska proba Eub338 (GCTGCCTCCCGTAG- GAGT; Cy3) i novodizajnirana R. hominis A2-183-specifična proba (GTACATTACATACTCTGTCAGTG; FITC), koja je u velikoj meri bila testirana protiv (nasuprot) panela intestinalnih bakterijskih izolata. Deset mikrolitara probe (30 ng/mL) u 100 μL hibridizacionom puferu dodato je u dehidrirani uzorak i inkubirano na temperaturi specifičnoj za probu. Isečci su oprani u puferu za pranje na 50°C tokom 30 min, uronjeni u ledenu vodu da bi se odstranio zaostali puffer za pranje i osušeni komprimovanim protokom vazduha. Kontrastno bojenje je urađeno 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI; Vector Laboratories Inc) i isečci na pločici (slides) su fiksirani (mounted) pomoću Vectashield Mounting Mediuma za fluorescenciju (Vector Laboratories Inc) da bi se sprečilo izbleđivanje. Bakterije su vizualizovane pomoću Leica DM RBE fluorescentnog mikroskopa (Leitz GMBH) i slikane pomoću Penguin 600CL kamere (Pixera) i Viewfinder 3.0 softvera (Studio Lite). Slike sa velikog uvećanja (x630) dobijene su pomoću Apochromatics sistema (Leica).
Imunofluorescencija
[0488] Imunolokalizacija R. hominis flagelina je ispitivana u sadržaju debelog creva miševa kolonizovanih sa R. hominis korišćenjem specifičnog antiseruma using specific antisera koji prepoznaje definisane peptidne sekvence oba Fla1 i Fla2 flagelin proteina. Sadržaj creva je razblažen u PBS-u, razmazan na staklenoj ploči i osušen na vazduhu. Razmazi su fiksirani u predhodno ohlađenom metanolu 5 min na -20 °C, inkubirani sa anti-Fla1 ili anti-Fla2 antiserumom zeca (1:125, CovaLabs) overnight at 4 °C preko noći na 4°C i vizualizovani pomoću Alexa donkey anti rabbit 488 (1:1000, Molecular Probes).
[0489] Isečci su fiksirani u predhodno ohlađenom metanolu 30 min na -20 °C. Imunolokalizacija T ćelijskih markera je ispitivana na sekvencijalnim krioisečcima (8mm). Isečci su fiksirani bilo u prethodno ohlađenom metanolu 30 min na -20 °C (Ly6G FITC, CD3 FITC, CD11b FITC, svi kao 1:50 (BD Biosciences)), ili, za dvostruko obeležene FoxP3 (1:500, Abcam) sa CD3 FITC (1:100, BD Biosciences) fiksirani u 1% paraformaldehidu (PFA) tokom 2 min na ST i dalje 3 min u 0.01% Triton X u PBS-u. Svi isečci su blokirani sa 10% BSA (Sigma) koji je sadržao 10% relevantnog pre-imuno seruma u PBS-u (pH 7.4). Metanolom fiksirana tkiva su inkubirana sa primarnim antitelima 1h na ST. PFA-fiksirani isečci su inkubirani sa antitelima preko noći na 4 °C. FoxP3 je vizualizovan pomoću Alexa kozije anti zečije 594 (1:1000, Molecular Probes). Isečci su kontrasno obojeni sa i Vectashield (Vector Laboratories). Za kvantifikaciju pozitivnih ćelija, minimum pet vidnih polja, za svaki od uzoraka miša je pregledano, koristeći softver za vizualizaciju slike i setovanjem mikroskopa kao što je opisano ranije.
Histologija
[0490] Uzorci tkiva uzlaznog debelog creva su fiksirani tri sata u neutralnom puferisanom formalinu (Sigma) na sobnoj temperaturi sa stalnom agitacijom (mešanjem). Uzorci su isprani u PBS-u, preneti u 70% etanol i ostavljeni na sobnoj temperaturi sve dok nisu orjentisani za poprečno sečenje i utisnuti u hladnu otvrdlu smolu pomoću Technovit 8100 (Heraeus Kulzer) po uputstvima proizvođača. Utisnuto tkivo je postavljeno na histoblok pomoću Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Isečci od četiri mikrona su isečeni pomoću rotirajućeg mikrotoma (Leica Autocut) opremljenog staklenim nožem (TAAB Laboratories Equipment Ltd.). Isečci tkiva su bojeni korišćenjem standardnih hemotoxilin/eosin methoda. uzlaznog debelog creva svake životinje je prikazana na uvećanju x200 na mikroskopu Zeiss Axioskop korišćenjem Qlmaging camera kontrolisane Image Pro Plus softvarom. Svako vidno polje je onda ocenjeno od 0-4 na osnovu metoda opisanom u radu Berg-a i saradnika (6). Histopatološke ocene su 0 = Plitke kripte, bez ili nekoliko infiltriranih inflamatornih ćelija, neoštećeni epitel, peharaste ćelije se pojavljuju sa puno mucina (bez patologije); 1 = Kripte mogu pokazati blagu epilijalnu ćelijsku hiperplaziju, neke difuzne infiltracione inflamatorne ćelije se mogu videti između kripti, luminalni epitel se pojavljuje netaknut, peharaste ćelije mogu izgledati pomalo osiromašene od mucina; 2 = Kripte se pojavljuju dublje sa različitim pokazateljima epitelne hiperplazije, smanjenje mucina kod peharastih ćelija, evidentno infiltriranje inflamatornih ćelija koje mogu biti multifokalne po prirodi, mada infiltrati nisu vidljivi u submucosi; 3 = Lezije uključuju veću površinu sluznice i/ili su češće nego što je je viđeno u oceni 2. Lezije ne uključuju submukozu. Luminalne epitelne ćelije pokazuju male erozije. Lezije nisu transmuralne; 4 = Epitel kripte se pojavljuje erodiran (sa erozijama). Apscesi mogu biti prisutni. Luminalne epitelne ćelije izgledaju nepravilno, ponekad sa potpunim gubitkom. Zapažen je transmuralni infiltrat - često povezan sa potpunim gubitkom epitelnih ćelija u lumenu.
[0491] Srednja vrednost vidnih polja u datom rasponu je izračunata, a tretirane grupe upoređene pomoću student t-test analize.
Kloniranje i prečišćavanje rekombinantnih flagelina
[0492] Geni odgovorni za sintezu flagelina izolovani su iz tečnih bakterijskih kultura R. hominis, R. intestinalis, S. typhimurium, S. enteritidis, Eubacterium rectale 33656 i E. coli K12 nakon PCR umnožavanja i prečišćavanja. Prečišćen fragment koji nosi gen za flagelin iz R. hominis je ubačen u ekspresioni vektor pT7-MAT-Tag-FLAG (Sigma), a fragmenti koji nose gene za flagelin iz S. en- teritidis i E. coli K12 su ubačeni ekspresioni vektor epGEX-6P-1 (GE Healthcare). Rekombinantni flagelin je eksprimiran nakon transformacije plazmidne DNK u E. coli BL21 Rosetta i E. coli BL21 (DE3) ćelije, redom, a indukcija je vršena sa 1mM IPTG (izopropil β-D-galaktozidaza). Flagelini su pokupljeni iz rastvora (vraćeni) pomoću FLAG kuglica (Sigma) i Ni-NTA (nikl-nitriloacetatne) kuglica (Clontech, Takara), po uputstvu proizvođača. Ĉistoća uzorka je proverena na SDS-PAGE bojenjem “coomassie” plavo rastvorom. Aktivnost fragmenata flagelina određivana je pomoću Luciferase Assay (Promega), po uputstvu proizvođača, korišćenjem Caco-2 ćelijske linije transformisane sa NF-κB.
[0493] Caco-2 ćelije su inkubirane sa rekombinantnim flagelinima u finalnoj koncentraciji od 100 ng/μL, 2h na 37°C u uslovima 75% vlažnosti atmosfere i 5% CO2. Nakon tretmana ćelije su dva puta oprane PBS rastvorom i sakupljene za RNK izolaciju.
Izolacija intestinalnih i MLĈ ćelija
[0494] Ćelije su izolovane iz tankog creva i mezenteričnih limfnih čvorova (MLĈ) kao što je prethodno opisano, sa malim izmenama (7). Ukratko, ćelijska suspenzija je inkubirana sa 100U/mL collagenase VIII (Sigma-Aldrich) u RPMI obogaćenim sa 20% FBS na 37°C tokom 20 min (mezenterični limfni čvorovi) ili 1 sat (crevni isečci). Pojedinačne ćelijske suspenzije su dalje analizirane pomoću protočnog citometra.
Generisanje dendritičnih ćelija i kultura iz kostne srži
[0495] Koštana srž je uzimana iz femura i tibije C3H/HeN i C57Bl6 miševa kao što je prethodno opisano (8-11). Za GMCSF-derived dendritične ćelije, čelije koštane srži su rastvorene kao 1x10<6>/mL u RPMI obogaćenim sa 10% FCS i 20ng/mL rmGM-CSF i zasejane u 10mL/po ploči u 100mm<2>pločama za ćelijsku kulturu. Nakon tri dana u kuluri, ćelije koje su slabo adherirale su pokupljene i prelivene sa GM-CSF obogaćenim medijumom na 1x10<6>/mL u pločama za ćelijsku kulturu sa 12 bunarića. Petog dana ćelije su stimulisane sa 100ng/mL flagelina pre nego su bile pokupljene šestog dana. Za dendritične ćelije poreklom od Flt3L, ćelije koštane srži su rastvorene u 2x10<6>/mL u RPMI obogaćenim sa 10% FCS i 200ng/mL rmFlt3 i zasejane u 2mL/bunar u pločama za ćelijsku kulturu sa 12 bunrića. Ćelije su gajene 10 dana sa dodatnih 2mL, u medijumu obogaćenom sa Flt3, koji su četvrtog dana dodati u dodatim u svaki bunarić. Devetog dana ćelije su stimulisane sa 100ng/mL flagelina pre nego što su sakupljene desetog dana. Ćelije su pokupljene sa ploča blagim pipetiranjem i analizirane protočnom citometrijom.
Protočna citometrija
[0496] Pre bojenja specifičnim fluorohrom konjugovanim antitelima pojedinačne ćelijske suspenzije poreklom od ćelija lamina propria i dendritične ćelije inkubirane su u “blocking” puferu (sadrži serum i CD16/CD32 antitela) na 4°C tokom 15 min. Ćelije lamina propria su obeležene mišijim antitelima CD4-FITC i CD25-APC (eBioscience), CD8-APC-Cy7, CD3-PerCP Cy5.5 i B220-BV570 (Biolegend). Intraćelijsko FoxP3 obeležavanje je rađeno nakon ekstraćelijskog bojenja i ćelijske fiksacije/permeabilizacije po uputstvima proizvođača (eBioscience). GM-CSF dendritične ćelije su obeležene antitelima CD11b-PerCP Cy5.5 (BD Biosciences), CD11c-PE-Cy7, I-A/I-E -APC-Cy7, CD80-PE, CD86-APC, CDB-FITC, B220-BV570 (Biolegend). Flt3L derived dendritične ćelije su obeležene sa CD11c-PE-Cy7-, CD11bili Siglec-H-PerCP Cy5.5 (Bioegend), I-A/I-E -APC-Cy7, CD317-PE, CD40-Alexa Fluor 647, CD103-FITC, B220-BV570. Ćelije su analizirane pomoću FACSAriall (BD Biosciences) i FlowJo softvera verzija 7.2.5.
CITOMETRIJA POMOĆU KUGLICA (CPK) (Cytometric Bead Array (CBA))
[0497] Ćelije koštane srži su izolovane iz femura i tibije sa RPMI medijumom poreklom od C3H/HeN i C57Bl/6 miševa i Flt3L-expanded kao što je ranije opisano. Ćelije su stimulisane sa 100 ng/mL flagellina (na primer Roseburia flagellin) nakon 9 dana kultivisanja, a supernatant je sakupljan desetog dana. Eksperiment je urađen u tri nezavisna ponavljanja da bi se dobio N=3.
[0498] CPK analiza je urađena was na ćelijskim supernatantima pomoću Cytometric Bead Array Mouse Enhanced Sensitivity Master Buffer Kit-a (BD Biosciences) po uputstvima proizvođača. Standardi i uzorci su nasuti u ploče sa 96 bunarića za merenje u FACSArray (BD Biosciences). Resultati suanalizirani pomoću BD FCAP softveara (BD Biosciences).
Suva telesna masa i lipidna analiza trupla
[0499] Truplo miša bez utrobe izmeren, liofilizovan do konstantne težine i zatim samleven za analizu. Sadržaj lipida je određen ekstrakcijom (1:100 w/v) hloroformom/metanol (2:1 vlv) kao što je prethodno opisano (12).
Kloniranje Roseburia flagelina.
Umnožavanje flagelinskig gena iz tečne bakterijske kulture pomoću PCR-a
[0500] Roseburia hominis A2-183 flagelin sekvence su preuzete sa National Center for biotechnology Information (NCBI) web-stranice (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[0501] Roseburia intestinalis L1-82<T>(NCIMB = 13810; DSM = 14610<T>) flagelin sekvence su preuzete sa National Center for biotechnology Information (NCBI) webstranice (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Pristupni brojevi za gene i proteine navedeni u Tabeli B (Tabela B – rezime pristupnih brojeva za Roseburia flageline opisane ovde) ***
Izolacija totalne RNK iz bakterija
[0502] Totalna RNK je izolovana iz 1 mL tečne ćelijske culture bakterija iz log faze rasta korišćenjem RNAeasy minkit-a (Qiagen, Sussex, UK), a spojeno sa RNase-free DNase I (Qiagen) digestijom, na osnovu uputstva proizvođača. Ukratko, jedan mililitar tečne kulture prebačen je u epruvete od 1.5 mL, centrifugiran na 5.000 x g tokom 5 min na 4°C nakon čega je supernatant odliven. Bakterijski talog je rastvoren u 100 µL TE puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) koji je sadržao lizozim i inkubiran na ST (sobna temperatura). Gram-positivna bakterija RH (Roseburia hominis) je inkubirana 10 min sa lizozimom koncentracije 3 mg/mL. Onda je u epruvete dodato tristapedeset mikrolitara pufera za liziranje, koji je sadržao 1 % β-merkaptoetanola, da bi se ćelije razbile vorteksovanjem i na kraju je dodato 250 µL 100 % ethanol-a (Molecular grade, Merck). Sedamsto mikrolitara rezultujuće suspenzije je prebačeno u RNeasy mini kolone, u koje su fitovale epruvete, centrifugirano 15 sekundi na 8.000 x g, a onda su kolone pražnjene. Ponovo je u kolonu dodato 350 µL pufera za pranje i dalje centrifugirano 15 s na 8.000 x g kada je tečnost koja je prošla odlivena. DNK digestija je vršena tako što je u svaku kolonu dodato 30 jedinica DNase I pomešane sa 70 µL RDD pufera i inkubirano na ST tokom 15 min. Kolone su ponovo oprane kao što je prethodno opisano sa 350 µL pufera za pranje, a onda dva puta sa 500 µL RPE pufera. Nakon sušenja kolona centrifugiranjem 1 min na 8.000 x g, 40 µL vode oslobođene od RNK je dodato direktno u kolonu i inkubirano 1 min na ST, a onda centrifugirano 1 min na 8.000 x g. Eluat koji je sadržao totalnu RNK spektrofotometrijski je izmeren pomoću “Nanodrop” tehnike kako bi se utvrdila koncentracija. RNK integritet proveren je na RINH odeljenju za genomiku (University of Aberdeen, UK) pomoću Agilent 2100 Bioanalyzer-a (Agilent Technologies). RNK čiji je integritet broj (RIN) bio između 9.5 i 10 se smatrala kao da je odličnog kvaliteta. Totalna RNK je ostavljena na -80°C radi kasnijeg korišćenja.
Reverzna transkripcija
[0503] Totalna RNK je reverzno transkribovana (prepisana) pomoću Quantitect reverse Transcription kit-a (Qiagen), po uputstvima proizvođača. Ukratko, jedan microgram totalne RNK u totalnoj zapremini od 12 µL inkubiran je 2 min na 42°C sa 1 X gDNK puferom koji uništava DNK (wipeout buffer) i dalje mešan sa 1X Quantiscript RT puferom (3 µL), RT prajmer mix-om (2 µL) i Quantiscript reverznom transkriptazom (1 µL) u finalnoj zapremini od 20 µL. Program za reverznu transkripciju bio je 15 min na 42°C zatim 3 min na 95°C da bi se inaktivirao enzim. Rezultujuća komplementarna DNK (cDNK) koncentracija bila je 50 ng/ µL i cDNK je ostavljena na -20°C radi kasnijeg korišćenja.
PCR umnožavanje gena za flagelin
[0504] Da bi umnožili flagelin iz genomske DNK, uzvodni (forward) i nizvodni (reverse) prajmeri su manualno dizajnirani i kupljeni od Sigma- Aldrich (Poole, UK). PCR umnožavanje flagelinskih fragmenata je urađeno sa uzvodnim prajmerom sa insertovanim BgIII restrikcionim mestom na 5' kraju i nizvodnim prajmerom sa insertovanim XhoI restrikcionim mestom na 3' kraju.
Roseburia hominis (fla1)

Uzvodni prajmer (5'-3'): CTCGAGATATGGTAGTACAGCACAA
Nizvodni prajmer (5'-3'): CTTAGATCTCTGTAATAAGGATAATA
Roseburia hominis (fla2)
Uzvodni prajmer (5'-3'): CTCGAGATATGGTGGTTAATCATAA
Nizvodni prajmer (5'-3'): CTTAGATCTTTTCAAAATCTCAAGCAC
Roseburia intestinalis (Fla1)
Uzvodni prajmer (5'-3'): GCAGGATCCATGCGTGGCGGAGACAAT
Nizvodni prajmer (5'-3'):AATGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGCAGAATCTGCAA Roseburia intestinalis (Fla2)
Uzvodni prajmer (5'-3'): CTCGAGATATGGTAGTTAATCATAA
Nizvodni prajmer (5'-3'): CTTAGATCTTTTTAACATTTCCAACAC
Roseburia intestinalis (Fla3)

Uzvodni prajmer (5'-3'): CTCGAGATATGGTAGTACAGCACAA
Nizvodni prajmer (5'-3'): CTTAGATCTCTGTAACAGAGAAAGTA
Roseburia intestinalis (Fla4)
Uzvodni prajmer (5'-3'): CCGGGATCCATGGTAGTACAGCACAAT

Nizvodni prajmer (5'-3'): TTAGTGGTGGTGATGATGATGCTGTAACAGAGAAAG
[0505] Koristeći 1 µL bakterijske kulture kao mustru (tempate), geni za flagelin su umnoženi PCR-om. Temperatura u programu za je usvojena od Fermentas-a (Fermentas GMBH, Germany) za optimalno KOD polimerazno (Novagen, Madison, WI) funkcionisanje i bila je 95°C tokom 2 min za polimeraznu aktivaciju praćenu sa 34 ciklusa umnožavanja, 95°C tokom 20 s, temperatura vezivanja 10s na 70°C za 20s završavanje 2 min na 70°C korišćenjem KOD polimeraze. Detalji PCR miksa su dati u Tabeli 1. PCR produkti su puštani na 1% agarozni gel 30 min na 120 V i trake od interesa su isečene i prečišćene. Inserti su prvo klonirani u vektor za kloniranje pCRTM-Blunt II-TOPO pomoću Zero Blunt TOPO PCR cloning kit-a (Invitrogen) po uputstvima proizvođača i mešanjem kao što je opisano na Slici 1A i u Tabeli 1.
Tabela 1. Sastav mešavine za ugradnju PCR produkta u pCR-Blunt II-TOPO vektoru za kloniranje. Koncentracija soli i enzimska mešavina za vektor su bili u rastvorima spremnim za upotrebu (ready-to-use solutions).
Elektroforetsko razdvajanje i prečišćavanje PCR produkata
[0506] Da bi videli izolovani produkt flagelina, umnožen pomoću PCR-a, PCR reakcija (smeša) je pomešana sa 1 X Blue-orange loading dye (Plavo-narandžasta boja) (Promega) i naneta na 1% agarozni gel (napravljen od 1% agaroze rastvorene u TAE puferu (40 mM Tris baza, 0.1% (v/v) sirćetna kiselina, 1 mM EDTA) prokuvan i sipan u kadicu) koji sadrži 0.5 µg/mL etidijum bromida za bojenje nukleinskih kiselina. Uzorci su migrirali 30 min na 120 V pomoću TAE kao pufera za kretanje. Kada je migracija završena gel je vizualizovan pod ultraljubičastim svetlom (UV) i produkti su identifikovani korišćenjem referentnog standarda i isečeni čistim skalperom. Parče (isečak) gela je zatim prebačeno u prethodno izmerenu “eppendorf” epruvetu i njegova težina odrađena oduzimanjem od težine prazne epruvete. PCR produkt je prečišćen. Rastvor za vezivanje za membranu (membrane binding solution) je dodat u isečak gela u odnosu 10 ml rastvora na 10 mg isečka agarznog gela. Smeša je tada inkubirana na 65°C tokom 10 min uz često mešanje dok isečak gela nije bio potpuno rastvoren. Epruveta je kratko centrifugirana na ST kako bi se osiguralo da sav sadržaj bude na dnu epruvete pre nego se nastavi sa prečišćavanjem DNK. Od ove tačke PCR prečišćavanje je uključivalo korišćenje Vizard® SV Gel i PCR Clean-up system-a (Promega, Southampton, UK) u skladu sa uputstvima proizvođača. Jedna SV mini kolona po PCR produktu je postavljana u kolekcionu epruvetu. PCR proizvod je dodat u kompletno sastavljenu SV mini kolonu i inkubiran 1 min na sobnoj temperaturi (ST). Kolona je centrifugirana na 16.000 x g tokom 1 min, a protok odliven. Kolona je onda oprana dodavanjem 700 mL rastvora za pranje membrane (membrane wash solution) i centrifugirana 5 min na ST. Protok je odliven, a sadržaj ponovo oboren tokom 1 min i sušen na ST tokom 2 min da ispari preostali etanol. Kolona je zatim prebačena u novu epruvetu oslobođenu od nukleaza. Da bi se povratio PCR produkt, 25 µL vode oslobođene od nukleaze dodato je u centar kolone i DNK je eluirana nakon 1 min inkubacije na ST i 1 min obaranja na 16.000 x g. Koncentracija eluata merena je spektrofotometrijski pomoću Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) i ostavljena na -20°C.
Digestija flagelina i vektor za ekspresiju.
[0507] Dvesta mikrolitara sveže odmrznutih DH5α, kompetentnih ćelija su drzane na ledu i 4 µL PCR produkt miksa, i ostavljene na ledu tokom 5 min. Toplotni šok je urađen tokom 1 min na 42°C i ćelije su vraćene na led 5 min, pre dodavanja of 400 µL SOC medijuma. SOC Medium (Sigma) je bogati medijum koji se prvenstveno koristi u koraku oporavka Escherichia coli transformisanih kompetentnih ćelija. Korišćenje SOC-a maksimizuje efikasnost transformacije kompetentnih ćelija.
[0508] Ćelije koje su porasle na 37°C tokom 1 sata, i 200 µL miksa je naneto na LB agarozne ploče obogaćene kanamicinom 50 µg/mL. Pozitivni klonovi su pripremljeni kao minipreparacije (minipreps), nanodropped (nano kapljice) i isečeni sa BamH1 i Xho1 tokom 2 sata da bi se isekao flagelin. Vektor za ekspresiju pT7-MAT-Tag-FLAG-2 (Sigma), prikazan na Slici 2A, je takođe isečen sa BamH1 i Xho1. Nakon razdvajanja produkata na 1% agaroznom gelu i i prečišćavanja isečenog vektora i fragmenta t.j. vektor i insert su ligirani (zalepljeni) na 4°C preko noći i transformisani u E.coli DH5 α. Produkti ligacije su su naneti na LB agar obogaćen ampicilinom 100 µg/mL. Pozitivni klonovi su pripremljeni kao minipreparacije (minipreps) i transformisani u E.coli BL21 (DE3) kompetentne ćelije. Pozitivne kolonije su sekvencirane odgovarajućim prajmerima kako bi se proverilo prisustvo inserta. Od pozitivnih klonova su napravljeni alikvoti u glicerolu. Ekspresioni vektori koji kodiraju flageline Roseburia su dalje pripremljeni kao minipreparacije (minipreps) i transformisani u Ecoli kompetentne ćelije radi poboljšanja prinosa nakon prečišćavanja; za Rh1, Rh2 i Ri2 E. coli kompetentne ćelije su bile E.coli BL21 Rosetta, a za RI3, Ri1 Ri4, Se, St, K12, i Er E. coli kompetentne ćelije su bile E.coli BL21 (DE3).
Ekspresija i prečišćavanje Roseburia flagelina
[0509] Transformisane E.coli (na pr. BL21 Rosetta) koje kodiraju gene za flagelin (RH1 ili FLaA1) su rasle u 1 litru LB medijuma sa ampicilinom (100 µg/mL), i obogaćenim hloramfenikolom (50 µg/mL) za Rosetta ćelije, na 37°C uz mućkanje (shaking) na 180 obrtaja tokom log faze. Kultura je indukovana tokom 3 sata sa 1 mM IPTG, pod istim uslovima, kako bi se omogućila specifična ekspresija proteina flagelina. Bakterije su oborene centrifugiranjem 4.000 x g, 4°C, tokom10 min i rastvorene u 60 mL pufera 1 (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl) i tretiran ultrazvukom (sonicated) sa Soniprep 150 (Sanio, Japan), u trajanju od 1 min kada se koriste BL21 (DE3) ili 3 min kada se koristie Rosetta sa 1 minutom pauze posle svakog minuta. Ćelijski lizati su centrifugirani na 9.000 x g tokom 10 min na 4°C i supernatant je odliven. Talog, koji sadrži nerastvorljive proteine je rastvoren u 60 mL pufera 2 (50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton-X100, 1 mM DTT) ponovo tertian ultrazvukom do potpune resuspenzije i centrifugiran na 5.000 x g tokom 15 min na 4°C. Nerastvorna frakcija je oprana drugi i treći put puferom 2. Poslednje pranje je urađeno pomoću pufera 2 bez Tx-100 i DTT, kao sto je opisano ranije. Za solubilizaciju proteina nerastvorna frakcija je resuspendovana pomoću ultrazvuka u 4 mL urea pufera (2 M urea, 50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl) i centrifugirana na 5.000 x g, 5 min na ST. Supernatant je odliven i talog resuspendovan u 2 mL 4 M uree, 50 mM Tris (pH7.4), 150 mM NaCl uz tretiranje ultrazvukom i centrifugiranje na 5.000 x g, 5 min na ST. Supernatant je sakupljen odlivanjem i pellet je rastvoren u 2 mL 8 M urea, 50 mM Tris (pH7.4), 150 mM NaCl rastvora tretiranjem ultrazvukom i centrifugiranjem na 5.000 x g, 5 min na ST. Supernatant je skupljen odlivanjem i mešan sa 4M urea frakcijom, da se napravi 6M rastvor uree koji sadrži solubilizovane flageline. Jedan millilitar Talon smole (Clontech, Takara, UK) je opran dva puta sa 2 mL pufera 1 (50 mM Tris (pH7.4), 150 mM NaCl) i centrifugiran na 1.000 x g, 2 min na ST. Supernatant je odliven, dodata je frakcija 6 M uree koja sadrži flagelin i ostavljena na rotaciji na 4°C tokom 1 sata. Posle centrifugiranja na 1.000 x g tokom 2 min na ST, smola je isprana dva puta puferom koji sadrži 2 M ureu, 50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 15 mM imidazola. Nakon centrifugiranja, smola je inkubirana 10 min sa 300 µ L elucionog pufera (360 mM Tris-HCl, 680 mM imidazol, 360 mM NaCl, 0,35 N HCl, 1.43 M urea), nežno promešana, i eluat je pokupljen nakon centrifugiranja na 2.000 x g tokom 2 min na ST. Elucija je ponovljena i dva eluata su pomešana. Drugi korak prečišćavanja pomoću anti-FLAG M2 magnetskih kuglica (Sigma) urađeno je da bi se poboljšala čistoća proteinske pripreme. Ĉetristo mikrolitara ultra čiste vode polako je dodato eluatu Talon smole kako bi se dobila finalna koncentracija od 0.9 M uree, pogodna za FLAG kuglice. Dvestapedeset mikrolitara FLAG magnetnih kuglica su oprane dva puta sa 750 µ L pufera 1, mešanjem i ostavljanjen na magnetnom postolju (Ambion) da bi se odstranio supernatant. Talon-eluat je dodat kuglicama i rotiran 30 min na 4°C. Kuglice su isprane pet puta sa 1 mL 0.9 M uree, 50 mM Tris (pH7.4), 150 mM NaCl. Elucija se sastojala u dodavanju, u 250 µ L kuglica, 200 µg/mL FLAG peptida u rastvoru koji sadrži 0.9 M ureu, 50 mM Tris (pH7.4), 150 mM NaCl, dobrog mešanja i inkubacije 30 min na ST. Epruvete su postavljene na magnetno postolje i konačni produkt je prikupljen. Ovaj korak elucije je ponovljen jednom i 500 µ L finalnog produkta je dalje dijalizirano u PBS-u sa 0.9 M uree tokom 1 sata na 4°C, pripremljeni kao alikvoti i odloženi na -80°C. Ĉistoća preparata je proveravana pomoću SDS-PAGE bojenjem “coomassie” plavo puferom (Slika 3A). Neposredno pre upotrebe, alikvot proteina je dijaliziran 1 sat u PBS-u, dva puta je promenjen pufer, u kaseti za dijalizu (slide-a-lyser) sa presekom 20 kDa moleculske težine (Pierce, UK), a koncentracija proteina je merena pomoću Bradfordove metode. Utvrđene vrednosti merenja endotoksina bile su <0.25 EU/mL.
[0510] Nukleotidna sekvenca koja kodira Fla1 je prikazana u SEQ ID NO 1, a aminokiselinska sekvenca Fla1 je prikazana u SEQ ID NO 2.
Flagelinska struktura se sastoji od četiri domena DO, D1, D2 i D3. Vidi Sliku 4A.
[0511]
D0: N-terminus α-helix počinje od Gln 2 i proteže se do Ser 32 (ND0). C-terminus <-helix počinje od Ala 459 i proteže se do Ser 491 (CD0).
 Region zupca (the spoke region), koji povezuje D0 i D1 domene, sastoji se od dva lanca (Ns i Cs), jedan od Ser 32 do Ala 44 i drugi od Glu 454 do Ala 459.
D1: N-terminalni segment se proteže od Ala 44 do Gln 176 i C-terminalni segment od Asn 406 do Glu 454. N- terminalni segment je sastavljen od α-helix-a (od Ala 44 do Ala 99) (ND1a), praćenog petljom koja se povezuje sa drugim, kraćim α-helix-om (ND1b) koji se spušta, a lanac se nastavlja do dve β-zavojnice, β-ukosnica usmerena je na dole i produženi lanac ide na gore, a ostatak lanca finalno ulazi u domen D2. C-terminalni α-helix u domenu 1 (CD1) počinje od Asn 406 i proteže se do Glu 454.
Domeni D0 i D1 su upakovani u protofilamentnu strukturu tako da je N-D0 orjentisan prema spolja i C-D0 izložen centralnom kanalu.

D2 domain obuhvata dva segmenta: N-terminalni segment od Lys 177 do Gly 189 i C-terminalni segment od Ala 284 do Glu 405. Napravljen je uglavom od β lanaca osim dva heliksa 285-289 i 288-298.
D3 domain centralni segment od Tyr 190 do Val 283. Uglavnom je napravljen od β lanaca sa jednim kratkim regionom sa uvijenim heliksom (199-209).
[0512] Bez želje da bude vezan za teoriju, smatra se da su dva osnovna regiona flagelarnog proteina uključena u prepoznavanje i aktivaciju TLR5, aminokiseline na pozicijama 79-117 SEQ ID NO 2 (N-D1 domen) i aminokiseline na pozicijama 408-439 SEQ ID NO 2 (C- D1 domen), kao i aminokiselina alanin (A) na poziciji 411 SEQ ID NO 2, aminokiselina glutamin (Q) na poziciji 412 SEQ ID NO 2 i aminokiselina serin (S) na poziciji 420 SEQ ID NO 2.
PRIMERI
R. hominis preferencijalno kolonizuje debelo crevo
[0513] C3H/HeN gnotobiotički (GB) miševi inokulisani su sa R. hominis tri puta kljukanjem (pomoću sonde) narednih dana. Inovatori izveštavaju o prvoj uspešnoj monokolonizaciji gnotobiotičkih miševa sa pojedinačnom bakterijskom vrstom iz razdeo Firmicutes. Uspešna kolonizacija postignuta je pomoću medijuma za inokulaciju koji je sadržao 3% askorbinske kiseline i 2% cisteina radi zaštite ove bakterije, osetljive na kiseonik. Analiza crevnog tkiva fluorescentnom in situ hibridizacijom (FISH) otkrila je da R. hominis kolonizuje oba, ileum i debelo crevo, ali je pronađena u znatno većem broju u debelom crevu. Nađeno je da su bakterije takođe bile usko povezane sa sluzokožom debelog creva (Slika S1A). Kolonizacija je dodatno potvrđena i kvantifikovana pomoću PCR-a korišćenjem prajmera specifičnih za R. hominis sa brojevima približnim 1x10<10>bacterija/g fecesa (Slika S1 B-C). Fecesi GB životinja su bili negativni na prisustvo bilo koje bakterije.
Genom R. hominis otkriva jedinstvene gene koji omogućavaju interakciju sa domaćinom
[0514] Kompletna sekcenca genoma R. hominis A2-183 je generisana (određena) i predstavljena kao jedan hromozom veličine 3,592,125 bp (Slika 1A). Automatsko i ručno anotiranje genoma pomoću RAST platforme otkrilo je prisustvo četiri ribozomalna operona, 66 RNK i 3,273 pretpostavljenih proteina. Najveća grupa gena pripadala je podsistemu iz kategorije gljenih hidrata (Subsystem Category Carbohydrates) (271 gena), koji kodiraju proteine uključene u metabolizam ugljenih hidrata, slede metabolizam proteina (197) i aminokiseline i derivati (175) (Slika 1B). Druge važne funkcionalne kategorije uključivale su pokretljivost i hemotaksu (49) i dormanciju i sporulaciju (12). Komparativna genomska aanalliza utvrdila je da je relativno najbliži u smislu genomske strukture i funkcije među celokupnim bakterijskim genomima, genom Eubacterium rectale (Mahowald et al.2009), što nije iznenađujuće s obzirom na blisku taksonomsku povezanost ovih organizama (Duncan i saradnici 2006, Aminov i saradnici 2006). Komparativna rekonstrukcija dva genoma sa 1.095 gena otkrila je da se razlikuju za oko 25% gena. Konkretno, ove razlike obuhvataju gene koje kodiraju važne funkcije za interakciju sa domaćinom. Na primer, geni za pokretljivost i hemotaksu koji kodiraju tip IV fimbrijalni protein za sklapanje PilB i PilC bili su prisutni u E. rectale ali odsutni u R. hominis dok su flagelarni protein bazalnog tela FlgC, flagelarni kompleksni protein kuke bazalnog tela FliE, flagelarni protein FlaB i flagelarni motorni prekidač FliG bili jedinstveni za R. hominis (Tabela S1). Dva bakterijska genoma se takođe razlikuju u 42 gena za ugljene hidrate, što odražava njihove različite nutritivne zahteve. Interesantno jeda je R. hominis jedinstven po tome što eksprimira dva gena za flagelin koji su oba FLA tipa za razliku od homologih flagelina FliC eksprimiranih kod Salmonella i E. coli bakterijskih vrsta.
Tabela S1. Uporedna analiza R. hominis i E. rectale genoma.
[0515] Uporedna genomska analiza pokazala je da je Eubacterium rectale najbliži poznati relativ sa R. hominis, u smislu genomske strukture i funkcije i da se dva genoma razlikuju za oko 25% gena. (A) Geni prisutni u R. hominis, ali odsutni u E. rectale i (B) genom prisutni u E. rectale, ali odsutni u R. hominis.
Tabela S1A. Geni prisutni u R. hominis ali odsutni u E. rectale.
Tabela S1B. Geni prisutni u E. rectale ali odsutni u R. hominis
R. hominis odgovara na okruženje u crevima pojačanim regulisanjem gena za pokretljivost, mobilizaciju i hemotaksu
[0516] Da bi odredili gene različito eksprimirane od strane R. hominis kao odgovor na asocijaciju sa domaćinom i ishranu, “microarray” je konstruisan pomoću 6,000 PCR fragmenata iz biblioteke inserata male veličine za sekvenciranje. Ksnija “Real-time” PCR validacija urađena je na 42 različito eksprimirana gena (Tabele S2 i S3), koje su grupisane u specifičnim regionima R. hominis genoma kao što je ilustrovano na Slici 2A. Da bi se napravila razlika između okruženja u crevima i komponemti ishrane, bacterijska RNK je izolovana iz četiri različita eksperimentalna uslova: (i) in vivo iz the cekuma mono-asociranih miševa; (ii) in vitro, iz bakterija odgajenih u medijumu; (iii) in vitro, od bakterija odgajenih u prisustvu komponenti ishrane; i (iv) od bakterija inkubiranih na površinikonfluentnih Caco-2 i HT-29 ćelija.
Tabela S2. 'Real-time' PCR analize na bakterijskoj RNK pomoću R. hominis specifičnih prajemera.
[0517] Bakterijski PCR prajmeri su dizajnirani za različito eksprimirane gene pomoću Primer3Plus. Svi uzorci su pušteni u triplikatu. GyrA je korišćen kao referentni gen za normalizaciju.
Tabela S3. Indeks R. hominis PCR experimenata plotovana na cirkularnu genomsku mapu. Lista R. hominis PCR experimenata kao što je prikazana ma cirkularnoj genomskoj mapi.
[0518] Identifikovano je pedeset različito eksprimiranih gena (in vivo nasuprot in vitro). Najiznenađujuće otkriće bilo je visok nivo pojačane regulacije in vivo gena uključenih u konjugaciju/mobilizaciju, mobA- i mobL-sličnih gena (Slika 2A). Prisustvo takvih gena u studijama transkripcije bilo je iznenađujuće, jer nisu dodeljeni geni koji se mogu identifikovati sa fazima, profazima, transpozabilnim elementima i plazmidima u funkciji. Ova razlika u detekciji gena i nepronalaženju (alokaciji) je verovatno usled priznatog ograničenja anotacije kategorije podsistema. Stimulativni efekat komponenti ishrane bio je mnogo manje izražen, što ukazuje na to da je okruženje u crevima per se glavni pokretač gena koji su uključeni u horizontalni prenos gena.
[0519] Ostali crevnim okruženjem-indukovani podsistemi uljučili su membranski ransport, naročito transport magneziuma i pokretljivost i hemotaksu uključujuću veći broj metil-vezujućih proteina hemotakse i gene flagelarnog operona (Slika 2B). R. hominis poseduje više flagelarnih gena flaA1, flaA2, flaA3 i flaB. Kod miša u crevima, ekspresija flagelina potvrđena je “Western-blot”-om i imunocitohemijski pomoću bakterija izolovanih iz oba, in vivo colonizovanih miševa i iz in vitro kultura uzgajanih u prisustvu ishrane, sa specifičnim antitelima nastalim (podignutim) protiv rekombinantnih proteina flagelina FlaA1 FlaA2 (RH1 i RH2) (Slika 2C). Ova pozitivna validacija ekspresije flagelina in vivo e u skladu sa prethodnim izveštajima koji ukazuju na to da samo određeni pogrupe Firmicutes proizvode flagele in vivo (Turnbaugh i saradnici, 2008) za razliku od drugih vrsta bakterija koje aktivno smanjuju (downregulate) ekspresiju bakterijskog proteina. Ekspresija R. hominis gena kataboličkog metabolizma u crevnom okruženju je takođe bila pod uticajem crevnog okruženja (Slika 2D). Ti geni su: acetil-CoA acetiltransferaza, 3-hidroksiacil-CoA dehidrogenaza, butiril-CoA dehidrogenaza i phosphoenolpiruvat carbokskinaza [ATP].
[0520] Da bi dalje istražili efekte adaptacije domaćina na transkriptom R. hominis-a, urađena je in vitro stimulacija humanih intestinalnih epitelijalnih ćelija (Caco-2 i HT-29). Ovo je pokazalo da je conjugaciono/mobilizacioni gen za transfer mobA/mobL protein1, koji je indukovan adaptacijom na mišija cteva, takođe povišen u obe ćelijske linije (Slika 2E). U skladu sa in vivo podacima, gen za flagelin MotA je bio pojačan (upregulated) u in Caco-2 ćelijama. Geni uključeni u metabolizam butirata pokazali su razlike između dve ćelijske linije, sa uočenim smanjenjem (down-regulation) u Caco-2 ćelijama i pojačavanjem u HT-29.
R. hominis utiče na urođene signalne puteve domaćina uglavnom u debelom crevu
[0521] Kolonizacija GB miševa sa R. hominisom korelira je sa povećanom ekspresijom gena domaćina, a najviša je u debelom crevu (Slika 3A i Tabela S4). Razlika u ekspresiji je bila najizraženija 28 d nakon kolonizacije, sa 159 pojačanih (up-regulated) i 143 gena smanjene ekspresije. Broj različito eksprimiranih gena u ileumu 14-tog dana bio je sličan uzlaznom debelom crevu, sa 79 pojačanih (up-regulated) gena i 119 (down-regulated) gena smanjene ekspresije. Razlika u ekspresiji u ileumu bila je vrlo niska 28-og dana, u skladu sa smanjenim nivoima kolonizacije. Transkriptomski odgovor se razlikovao u dve vremenske tačke što je pokazno jasnim razdvajanjem značajnih transkripata pomoću “heatmap” analize (Slika 3B). Pozitivna “Real-time” PCR validacija Affymetrix podataka je prikazana na Slici 3C.
Tabela S4. 'Affymetrix' podaci između životinja inokulisanih R. hominis i GB životinja.
[0522] Affymetrix “microarray” analiza je urađena na RNK izolovanoj iz tkiva uzraznog debelog creva i ileuma. Podaci su smatrani značajnim kada je P<0.05 korišćenjem Benjamini i Hochberg metode za otkrivanje grešaka. (A) Transkripti različito eksprimirani u uzlaznom debelom crevu 14-og dana. (B) Transkripti različito eksprimirani u silaznom debelom crevu 28-og dana. (C) Transkripti različito eksprimirani u ileumu 14-og dana. (D) Transcripti različito eksprimirani u ileumu 28-og dana.
Tabela S4A. Transkripti različito eksprimirani u uzlaznom debelom crevu 14-og dana između životinja inokulisanih sa R. hominis i gnotobiotičkih životinja (životinje bez bakterija, sterilne).
Tabela S4B. Transkripti različito eksprimirani u silaznom debelom crevu 28-og dana između životinja inokulisanih sa R. hominis i gnotobiotičkih životinja (životinje bez bakterija, sterilne).
Tabela S4C. Transkripti različito eksprimirani u ileumu 14-og dana između životinja inokulisanih sa R. hominis i gnotobiotičkih životinja (životinje bez bakterija, sterilne).
Tabela S4D. Transkripti različito eksprimirani u ileumu 28-og dana između životinja inokulisanih sa R. hominis i gnotobiotičkih životinja (životinje bez bakterija, sterilne).
[0523] Geni koji su uključeni u urođeni imunitet i funkcionisanje crevne barijere bili su značajno indukovani u prisustvu R. hominis u uzlaznom kolonu. GO-proces 'urođeni imunski odgovor' (GO:0045087) bio je pojačan i uključio je važne TLR povezane gene Tlr5, Tlr1 i Vnn1. Pojačavanje Tlr5 bila je od posebnog interesa, imajući u vidu odgovarajuću indukciju flagelarnih gena i proteina flagelina u R. hominis tokom kolonizacije creva i može da nagovesti ulogu ovog urođenog signalnog puta u posredovanju urođenih i adaptivnih imunih odgovora. Urođeni geni za imunost pod uticajem R. hominis u crevima uključuju antimikrobne peptide Defb37, Pla2g3, Muc16 i Itln i gene odgovorne za funkciju crevne barijere Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3 i Magi3 Urođeni geni za imunost koji su pojačani u ileumu u odgovoru na R. hominis uključuju Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a. Interesantno, ovde je pokazana negativna regulacija NF-κB puta (GO:0043124) (Slika S2) od strane R. hominis, koja kao i B. thetaiotaomicron (Kelly i saradnici 2004), može doprineti imunskoj homeostazi smanjenjem (down-regulating) ove inflamatorne kaskade.
[0524] Da bi se pokazalo da su ovi odgovori specifični za R. hominis, ispitan je odgovor ćelija gnotobiotičkih životinja na drugu komensalnu bakteriju. Odgovor genske ekspresije na kolonizaciju sa E. coli MG1655 (K12) su upoređeni sa R. hominis nakon 10-14-og dana i 22-28-og dana posle kolonizacije. U ovom vremenskom intervalu primećene su velike razlike u genskoj ekspresiji u odgovoru na R. hominis ali ne i na E. coli, što ukazuje da je R. hominis bio biološki vrlo aktivan u crevima, za razliku od minimalnog uticaja E. coli (Slika S3). Odgovor na E. coli koji je proizašao iz podataka o ekspresiji gena u uzlaznom debelom crevu čini se da je uglavnom bio odgovor antitela posredovanih B-ćelijama.
R. hominis utiče na T ćelijske puteve uglavnom u debelom crevu
[0525] Većina puteva koji su zahvaćeni 14-og dana grupisani su u kategorije ćelijska diferencijacija, regulacija ćelijskog ciklusa i remodelovanje tkiva. Važno je da je imunski odgovor bio glavni put indukovan 28-og dana u uzlaznom kolonu. Značajno pogođeni putevi u ovoj kategoriji su većinom uključeni u T ćelijsku funkciju, uključujući signalizaciju IL-10 i regulaciju funkcije T ćelija sa CTLA-4 (Tabela S5). Geni uključeni u ove puteve su pokazali oba pojačavanje (up-regulation) i smanjenje (down-regulation), tako da, dok je na ove puteve značajno delovalo prisustvo R. hominis, precizni neto funkcionalni efekti na T ćelijsku diferencijaciju zahtevali su dalja istraživanja. Da bi se razjasnila uloga R. hominis u odnosu na T ćelijsku diferencijaciju, konvencionalni miševi sa R. hominis su tretirani 14 dana i determinisan je uticaj T ćelijskih subsetova u oba, lamina propria i mesenteričnim limfnim čvorovima (MLĈ). Tretman sa R. hominis povećao je populaciju CD3<+>CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>T ćelija na obe lokacije(Slika4). Urađena je procena broja dvostruko pozitivnih CD3<+>FoxP3<+>ćelija u lamina propria uzlaznog i silaznog debelog creva mono asociranih C3H/HeN i C57BI6 životinja i potvrđen značajan porast regulatornih T ćelija umiševima tretiranim sa R. hominis (Slika 5A). GO-proces za 'aktin polimerizaciju' (GO:0030041) (Arpc3, Capg, Cdc42ep5 i Rhoc) je bio pojačan (up-regulated) 28-og dana u debelom crevu u miševima kolonizovanim sa R. hominis (Slika S2). Polimerizacija aktina kod imune sinapse neophodna je za aktivaciju T ćelija i efektorsku funkciju. Sveukupno, ovi podaci ukazuju na to da R. aktivno utiče na adaptivni imunski odgovor u debelom crevu pozitivno utičući na T ćelijsku regulaciju.
[0526] Tabela S5. Analiza puta odgovora imunog sistema transktipata različito eksprimiranih u uzlaznom debelom crevu između miševa tretiranih sa R. hominis i gnotobiotičkih miševa 28-og dana. Različito eksprimirani geni (P<0.05) su uvezeni u analitički softver GeneGo MetaCore da bi se odredile značajno obogaćene kanonski putevi u svakoj grupi. * Broj gena na svakoj mapi koji su različito eksprimirani u specifičnom tretmanu poređenja. ** Ukupan broj gena na svakoj mapi.
[0527] Vezano za ove rezultate je indukcija Ly6 genske familije u uzlaznom debelom crevu. Posebno, GPI-ukotvljen genski produkt Ly6g6c je pojačan (up-regulated) 25 puta, a povezani gen Ly6g6e je pojačan (up-regulated) dva puta 28-og dana. Većina hematopoetskih ćelija, uključujući neutrofile i plazmacitoidne dendritične ćelije, eksprimira jedan ili više članova Ly6 familije. Štaviše, predložena je moguća uloga Ly6 u T ćelijskoj aktivaciji, diferencijaciji i maturaciji (Mallya, Campbell & Aguado 2006). Imunocitohemija je potvrdila povećano prisustvo Ly6G<+>, CD11b<+>i CD3<+>FoxP3<+>ćelija u miševima kolonizovanim sa R. hominis (Slika 5B).
R. hominis flagelini modulišu T ćelijsku diferencijaciju
[0528] Uticaj bakterija na diferencijaciju T ćelija može da odražava “array” prikazanih TLR liganda. Na primer, veza između TLR5 signalizacije i CD4<+>T ćelijskih odgovora nedavno je pokazana za flagellate pathogens (Letran i saradnici 2011). Interesantno, u zavisnosti od eksperimentalnog setovanja, flagelin može izazvati (primeniti) niz T ćelijskih odgovora uključujući Th1, Th2, Th17 i Treg odgovore (Wilson i saradnici
[0529] Funkcionalnost bakterijskih flagelina FlaA1 (RH1) i FlaA2 (RH2) ispitana je korišćenjem novih rastvorljivih rekombinantnih proteina flagelina, generisanih protiv jedinstvenih sekvenci flaginina R. hominis. Upoređene su sposobnosti i upoređeni u odnosu na različite komensalne i patogene flagelinime proizvedene korišćenjem identičnih protokola, da bi se aktivirali signalni odgovori u crevnim epitelijalnim ćelijskim linijama i dendritičnim ćelijama koje su izvedene iz koštane srži proširene sa FLT3L ili GM-CSF.
[0530] Epitelijalne ćelije tretirane identičnim koncentracijama različitih bakterijskih flagelina otkrile su različite obrasce ekspresije gena (Slika 6A). Važno je da nije detektovana kontaminacija endotoksinom u pripremama rekombinantnog proteina. Salmonella enteritidis (SE) je potentnija od E. coli K12 (EC) ili RH1 flagelina. RH1 flagelin je takođe pokazao snažan odgovor, ali je clustered in a distinct clad zajedno sa komensalnom EK. Koristeći epitelijalne ćelije koje izražavaju dominantno-negativan TLR5 pokazalo se da su odgovori zavisni od TLR5. Nasuprot tome, pokazano je da je RH2 minimalno aktivan; generalno nije proinflamatoran niti je aktivirao konzervisan genski potpis (IL-8, CKSCL-1, CKSCL-2 i CKSCL-10) indukovan drugim rekombinantnim bakterijskim flagelinima. RH1 flagelinski protein je biološki aktivniji od RH2 in vitro; iako su oba rekombinantna proteina eksprimiran in vivo RH1 je takođe značajno pojačan (up-regulated) na nivou ekspresije gena in vivo. Pokazano je da je RH1 flagelin iz R. hominis indukovao različite odgovore udendritičnim ćelijama poreklom od Flt3L GM-CSF u odnosu na komensalnu E. coli i patogenu Salmonella enteritidis (Slika 6B-C). Konkretno, RH1 je jedinstven u svojoj sposobnosti da aktivira Flt3L-ekspandirane DĆ (dendritične ćelije), uz pojačanu (up-regulation) regulaciju I-A/I-E i CD40 i produkciju IL-10 iz koštane srži dobijenih DĆ, iz miševa C3H/HeN i C57BI/6. Odnos IL-10/IL-12 je bio posebno povećan kod C57BI/6 DĆ (Slika 6D), za koje je utvrđeno da su CD103+ Siglec-H+. U skladu sa ovim zapažanjima, brojni nedavni izveštaji takođe pokazuju da flagelin može aktivirati CD103+DĆ populacije (Flores-Langarica i saradnici 2012, Kinnebrew i saradnici 2012).
[0531] Da bi se procenio funkcionalni značaj of R. hominis i njegovih flagelina, gnotobiotički TLR5KO i WT (divlji soj) miševi were monokolonizovani. “Heatmap”-a koja prikazuje različito eksprimirane gene za oba, TLR5KO i divlji soj kolonizovane sa R. hominis, otkriva veoma snažan efekat TLR5 (Slika S4). Iako su T ćelijski putevii dalje bili pod uticajem R. hominis kolinizacije u TLR5KO miševima, odgovori su više bili vezani za IL4, IL5, IL-6, IL-9 puteve a ne za IL-10 i CTLA- 4 (Tabela S6). Osim toga, broj dvostruko pozitivnih CD3<+>FoxP3<+>ćelija u lamina propria TLR5KO miševa nisu povećani tretmanom sa R. hominis (Slika 6E), za razliku od monoasociranih C3H/HeN i C57BI6 životinja (Slika 5A).
[0532] Tabela S6. Analiza puta odgovora imunog sistema transkripata različito eksprimiranih u uzlaznom debelom crevu između TLR5 KO i WT (divlji tip) miševa, monokononizovanih sa R. hominis. Različito eksprimirani geni (P<0.05) su uvezeni u analitički softver GeneGo MetaCore da bi se odredile značajno obogaćene kanonski putevi u svakoj grupi. * Broj gena na svakoj mapi koji su različito eksprimirani u specifičnom tretmanu poređenja. ** Ukupan broj gena na svakoj mapi.
[0533] Ovde se vidi da R. hominis utiče na Tregs u konvencionalnim i gnotobiotičm miševima ali ne u TLR5KO u skladu sa izveštajima o interakcijama flagelin-TLR5 koji promovišu CD4<+>CD25<+>Foxp3<+>regulatorne T ćelije (Crellin i saradnici 2005, Hossain i saradnici 2011). Slično tome, nedavno je opisana sposobnost fagelin-ovalbumin fuzionog proteina da suprimira produkciju IL-4 receptorima CD4 (+) T receptora OVA-T-ćelija pomoću mehanizma zavisnog od IL-10 (Schulke i saradnici 2011) što ukazuje na to flagelin može uticati na usmerenu diferencijaciju T ćelijskih podsetova. Dodatno, uticaj TLR5KO na T ćelijski odgovor vođen R. hominis pokazuje da je RH1 (signalni flagelin) ključan u posredovanju Treg odgovora a ne RH2 (nesignalni flagelin). Konačno, dodatno zapažanje bilo je poboljšanje (pojačanje) Tip I IFN gena kod TLR5KO miševa (uključujući Ifi202b, Ifi203 i Irf4), što ukazuje na to da TLR5 signalizacija može utopiti odgovore interferona Tipa I.
R. hominis moduliše gene urođenog imunog odgovora kako kod oba, ileuma i debelog creva i atenuira kolitis kod DSS–om tretiranih miševa
[0534] Model DSS miša korišćen je za testiranje terapeutske efikasnosti R. hominis, zbog kontrole inflamatornih puteva, kao i pozitivnih efekata na indukciju Treg-a u monoasociranim miševima. Miševi su dozirani ( <50 mL, 10<9>CFU) dnevno u periodu od 14 dana, a DSS je dat (MW 50kDa, 30g/l) u njihovoj pijaćoj vodi od 8. dana pa nadalje. Genska ekspresija panela proinflamatornih biomarkera pokazala je da su netretirani DSS miševi imali jaku elevaciju svih ispitivanih gena u poređenju sa miševima divljeg tipa, sa genskom indukcijom u rasponu od 4 do 49 puta (Slika 7A). Proinflamatorna genska indukcija bila je znatno niža u miševima tretiranim sa R. hominis u poređenju sa netretiranim miševima, što ukazuje na jake terapeutske prednosti oralne primene R. hominis. Histološka analiza pokazala je prisustvo teške inflamacije u uzlaznom debelom crevu netretiranog DSS-a, dok je mukoza debelog creva životinja tretiranih sa R. hominis bila normalna, sa niskim nivoom inflamacije, u skladu sa smanjenom ekspresijom inflamatornih gena (Slika 7B i C).
R. hominis kolonizacija utiče natelesni sastav i ekspresiju gena sitosti
[0535] Značajne metaboličke aktivnosti R. hominis-a kod monoasociranih miševa takođe su evidentne. GO-proces 'negativna regulacija odgovora na hranu' (GO:0032096), 'negativna regulacija apetita' (GO:0032099), i 'regulacija sekrecije kateholamina' (GO:0050433), sve su smanjene ekspresije (down-regulated) u uzlaznom debelom crevu nakon kolonizacije sa R. hominis (Slika S5). Ovi podaci pokazuju da R. hominis ima (vrši) stimulativni efekat na apetit domaćina. Geni koji su uključeni u ove procese su Agt, Cartpt, Cck i Cxcl12, sa promenama u rasponu od 2 do 12 puta. Cck, posebno, igra glavnu ulogu u varenju i sitosti kao suzbijanju gladi. Gcg je takođe pokazao smanjenje (down-regulation) na ovom mestu u crevima.
[0536] Da bi se utvrdilo da li su ove genske promene imale fiziološki značaj u odnosu na unos hrane i sastav tela, izvršena je analiza težine u suve mase. Suve mase carcass miševa asociranih sa R. hominis bile su znatno teže u poređenju sa GB životinjama, a razlike su bile najočitije 14-og dana (Slika S6A). Dalja analiza lipida trupla je pokazala da je ukupna gojaznost (adipoznost) takođe značajno veća kod životinja koje su tretirane R. hominis-om 14 dana (Slika S6B). Ovi nalazi su u skladu sa najnovijim podacima koji otkrivaju ulogu Firmicutes u prikupljanju energije kroz fermentaciju ishrane, ali takođe podržavaju zamisao da crevne bakterije u stvari mogu modulisati crevno moždanu sponu (axis) i hormone koji regulišu apetit.
Diskusija
[0537] Dugotrajna koevolucija mutualizma mikroorganizam-domaćin verovatno je dovela do selekcije funkcionalno važnih bakterijskih vrsta u crevima od kojih većina nije visoko zastupljena u drugim ekosistemima. Trenutno postoje ograničene informacije o doprinosu pojedinačnih članova mikrobiološke zajednice funkcionisanju creva naročito u pogledu razvoja imunog sistema sluzokože.
[0538] Predhodni rad je, koristeći reverzibilni model za kolonizaciju zasnovan na E. coli (HA 107), pokazao da se neophodan broj živih bakterija približava 108 CFU po gramu sadržaja za imuno indukovane efekate na IgA (Hapfelmeier i saradnici 2010). Specifične funkcije SFB i Bacteroides fragilis su istražene u mišijim crevima kako bi se definisao njihov pojedinačni doprinos T biološkoj biologiji i ove obe bakterije su pokazale da su snažni induktori Tregs i Th17 ćelija (Mazmanian i saradnici 2005, Gaboriau-Routhiau i saradnici 2009, Ivanov i saradnici 2009). Efekti pojedinih članova klastera XIVa Firmicutes nisu prethodno objavavljeni, iako je njihovo prisustvo u ASF-u i doprinos mešane kulture od 46 Clostridial sojeva, koji takođe utiču na T-ćelijsku diferencijaciju zabeleženo (Geuking i saradnici 2011, Atarashi i saradnici 2011).
[0539] Ovde je prijavljena prva uspešna monoasocijacija gnotobiotičkog miša sa anaerobnom bakterijom, R. hominis, koja je član Firmicutes razdela. Ekstremna senzitivnost na kiseonik bakterije kao što je Roseburia zahteva stroge tehnike anaerobne kultivacije, što otežava obavljanje funkcionalne karakterizacije. Uspostavljena je stabilna monokononizacija R. hominis u gnotobiotičkim miševima i kompletno sklopljena (anotirana) genomska sekvenca koja otkriva njegovu metaboličku organizaciju, fiziologiju i simbiotička svostva. Utvrđeno je da transkripcijski odgovori R. hominis nakon kolonizacije mogu biti pripisani okruženju u crevima domaćina i ishrani. Efekti izazvan domaćinom dominiraju u odgovoru na R. hominis nakon monoasocijacije. Ovo uključuje transfer gena, membranski transport, chemotaksu i podsisteme za pokretljivost. Snažna pojačana (up-regulation) regulacija gena uključenih u mobilizacioni transfer podržava gledište da okruženje u crevima veoma pogoduje horizontalnoj genskoj razmjeni između pripadnika crevne mikrobiote. Stoga, ovo okruženje može ubrzati diseminaciju gena značajnih za preživljavanje bakterija, kolonizaciju i funkciju unutar crevnog ekosistema. Uloga pokretljivosti i flagelarnog aparata u kolonizaciji domaćina je dobro razrađena za patogene bakterije, ali se mnogo manje zna o ulozi flagelarnih proteina u komensalnim bakterijama. In vivo eksperimenti su otkrili stimulativni efekat sredine ucrevima domaćina na ekspresiju flagelinskig gena.
[0540] Određena je jasna uloga R. hominis u promovisanju funkcije crevne barijere i urođene imunosti u debelom crevu miša. Ĉvretse spojnice, spojnice međuporstora, spojnice preko adherencije, (tight junctions, gap junctions i adherens junctions) funkcionišu tako da se bakterijska translokacija ograniči na subepitelijalni sloj (Werth i saradnici 2010). Kronova bolest i ulcerativni kolitis su karakterisana gubitkom barijere i integriteta čvrste spojnice. Zanimljivo je da je disbioza crevne mikrobiote u zapaljinskoj bolesti creva (IBD) povezana sa smanjenjem Firmicutes (Spor, Koren & Ley 2011, Qin i saradnici 2010). Ovde se vidi da R. aktivno povećava ekspresiju barijernih gena koji sugeriše da njihov gubitak kod pacijenata sa IBD može biti funkcionalno značajan. Aktivacija kompleksa čvrste spojnice nije samo prednost R. hominis-a; drugi komensali, kao što su Bacteroides thetaiotaomicron i Lactobacillus acidophilus, takođe pojačavaju funkciju mukozne barijere (Hooper i saradnici 2001, Ukena i saradnici 2007), ukazujući na probiotske mogućnosti ovih bakterija u humanom IBD.
[0541] Efekti R. hominis na imunološki system creva su intrigantni. Najsnažniji efekti su zabeleženi u uzlaznom debelom crevu, a geni kao što je Ly6g6c su snažno pojačani (up-regulated), kao i putevi uključeni u T ćelijsku regulaciju i diferencijaciju i polimerizaciju aktina u imunoj sinapsi, koji su uključeni u aktivaciju T ćelija i efektorske funkcije. Najviše zahvaćeni T ćelijski putevi uključivali su one povezane sa IL-10, ICOS i CTLA-4, koji su svi uključeni u podršku Treg diferencijacije. Važno je da je korišćenjem protočne citometrije i imunocitohemije pokazano značajano povećanje CD3<+>CD4+CD25+FoxP3<+>ćelija u crevima gnotobiotičkih miševa i konvencionalnim miševima kolonizovanim sa R. hominis. Ovi nalazi upotpunjuju nedavne podatke o ostalim Clostridium vrstama koje usmeravaju Treg diferencijaciju. Očigledno, R. hominis može, kao jedinstvena bakterijska vrsta, promovisati mukoznu T ćelijsku ekspanziju i uticajti na T ćelijsku diferencijaciju.
[0542] Flagelinski signali primećeni su od strane domaćih TLR5 receptora i mnoge patogene strukture flagelina indukuju snažne proinflamatorne reakcije (Hayashi i saradnici 2001). Signalizacija putem TLR5 u odgovoru na rezidentne komensale sa flagelama may može biti važna za homeostazu, jer delecija TLR5 dovodi do spontanog kolitisa kod miševa (Vijay-Kumar i saradnici 2007). Pojačana ekspresija R. hominis flagelina FlaA1 (RH1) in vivo i njegova moć u aktiviranju epitelnih ćelija i BMDCs je od velike koristi. Drugi rad je pokazao da E. coli flagelarni mutanti imaju prednost u kolonizacijom u odnosu na flagelarne vrste divljeg tipa, verovatno zbog odsustva urođenog prepoznavanja putem signalizacije TLR5 (De Paepe i saradnici 2011, Giraud i saradnici 2008). Ovde je pokazano da je za određene Firmicutes ekspresija ili moguća pojačana (up-regulation) regulacija flagelina prirodni odgovor na kolonizaciju creva. R. hominis flagelarni protein ostaje eksprimiran in vivo i korelira sa trajnom kolonizacijom, odsustvom otvorene inflamacije i ekspanzijom T ćelija regulatornog fenotipa. Nedavna potvrda flagelinskih gena u SFB (Prakash i saradnici 2011, Sczesnak i saradnici 2011) može korelirati sa T ćelijskim odgovorom domaćina indukovanih ovom bakterijom (Gaboriau-Routhiau i saradnici 2009, Ivanov i saradnici 2009). Zanimljivo je da je RH1 indukovao jedinstveni efekat na obe, epitelijalne i DC culture, u poređenju sa drugim flagelnima, iako sve ispitivane strukture poseduju konzerviran Arg90 koji je povezan sa flagelinima koji se vezuju i aktiviraju TLR5 (Yoon i saradnici 2012) što ukazuje na to da druge sekvence/strukturne razlike mogu računati na jedinstvene signalne odgovore posredovane od strane RH1. Značaj flagelin-TLR5 signalinga u Treg odgovorima indukovanim sa R. hominis potvrđen je pomoću TLR5KO. Bez đelje da budu vezane teorijom, određene komensalne flagelarne strukture mogu pomoći u pomoći u usmeravanju odgovora imunotolerancije putem TLR5 izraženog na CD103+DC ili Treg podsetovima (Flores-Langarica i saradnici 2012, Kinnebrew i saradnici 2012, Crellin i saradnici 2005). Osim toga, imuni homeostatski R. hominis potvrđen je kod miševa tretiranih DSS-om, iako druge signalne grupe, kao što je butirat, takođe mogu doprinijeti imunološkoj toleranci. Podaci ukazuju na potencijalnu terapeutsku korist R. hominis u IBD.
[0543] Interesantni dodatni biološki efekat kolonizacije sa R. hominis bio je regulacija gena koji su uticali na reakcije na hranu i kontrolu apetita. Posebno, hormoni sitosti Cck i Gcg su značajno smanjeni. Efekti Cck on na unos hrane posredovani su vagalnog aferentnog puta. Ovo je glavni neuralni put kojim informacije o unetim hranljivim materijama stižu u centralni nervni sistem kako bi uticale na funkcionisanje creva i ponašanje tokom hranjenja. Cck djeluje na vagalni sistem kako bi smanjio ekspresiju molekula koji stimulišu apetit i ishranu i povećavaju ekspresiju molekula koji inhibiraju ishranu i smanjuju apetit (Npy2r i Cartpt, oba smanjene ekspresije (downregulated) dvostruko u aktualnoj studiji Do sada nije utvrđena veza između Cck, Gcg i komensalnih bakterija, međutim, i masne kiseline i proteini su snažni induktori Cck i Gcg (Geraedts i saradnici 2010). R. hominis proizvodi masne kiseline kratkog lanca kao što je butirat sa alifatičnim repovima sa manje od šest ugljenika; zabeleženo je da ova metabolička aktivnost smanjuje stimulativni efekat na plazmu Cck koji se primećuje kod masnih kiselina dužeg lanca (McLaughlin I saradnici 1999). Analiza telesne težine otkrila je da su i telesna težina i sadržaj lipida stvarno značajno povećani sa R. hominisom, u skladu sa porastom telesne težine koja se primećuje kod konvencionalizacije gnotobiotičkih miševa (Turnbaugh I saradnici 2006). Da li je ovo direktan efekat redukcije hormona sitosti, kako se vidi u sadašnjem istraživanju, ostaje da se vidi, jer učešće Cck i Gcg nije bilo prethodno objavljeno. Međutim, važno je priznati da je i ranije pokazana veza između kolonizacije mikrobiota i energije dobijene iz ishrane delimično kroz oslobađanje SCFA-a (Turnbaugh i saradnici 2006) (Tremaroli, Kovatcheva-Datchari & Backhed 2010). S obzirom na to da je R. hominis glavni proizvođač butirata, ovaj mehanizam će takođe doprineti metaboličkoj efikasnosti koja je primećena nakon tretmana sa R. hominis.
[0544] Ukratko, monoasocijacija mišjeg creva sa R. hominis indukovala je snažne dvosmerne genske ekspresione događaje koji su kulminirali u adaptaciji komensalnih bakterija i toleranciji domaćina. Izgleda da flagelinski produkt RH1 ima jedinstveni signalizacijski efekat koji preferencijalno dovodi do ekspanzije Tregs-a. Prikazan je značaj TLR5 u usmeravanju diferencijacije i ekspanzije Treg-a. Kolektivno, ovi podaci naglašavaju dodatnu funkcionalnost komensalnih flagelina, TLR5 signalizaciju i neto pravac mukoznog T ćelijskog odgovora.
Funkcionalni eseji
In vitro Model
Analiza odgovora intestinalnih epitelijalnih ćelija (IEĆ, IEC) na različite rekombinantne flageline.
[0545] Molekularna analiza CCL20 genske ekspresije (proinflaminatorni gen) nakon stimulacije IEĆ sa različitim rekombinantnim flagelinima (Slika D.2) patogenim flagelinima (SE, ST, LF, iHM) indukuje slične ali ne i identične nivoe CCL20 iRNK, komensalni flagelini su pokazivali mnogo veće nivoe vijabilnosti ER (Eubacterium rectale 33656), K12 (Escherichia coli K12), RH1 i RI3 flagelini su indukovali CCL20 na lsičnom nivou kao patogeni flagelini, RI1 i RI4 su imalči srednje stimulatornu aktivnost, RH2 se pokazao kao slab inducer CCL20 u HT-29 i nije imao agonistički potencijal u Caco-2 ćelijama i R12 nije imao opažajnu aktivnost u obe ćelijske linije. U zaključku, pronalazači su razlikovali tri kategorije TLR5 antagonista (i) oni koji nemaju ili imaju nisku imunostimulatornu aktivnost, (ii) oni sa intermedijernom imunostimulatornom aktivnošću I (III) oni sa visoko imunostimulatornom aktivnošću.
[0546] Tabela D2 ukazuje na značajne razlike između svakog tertmana izračunata na osnovu uporednog t testa (paired T test) u HT-29 (gore desno) i Caco-2 (dole levo). T testovi koji su korišćeni su unilaterlani za poređenje tretmana sa nestimulisanim ćelijama (unstim) i bilaterlani za poređenje jednog tretmana sa drugim. NS (non significant, nije značajno); *(p<0.05); ** (p<0.01); ***(p<0.001).
[0547] Ćelijska i imunološka analiza efekata rekombinantnih flagelina na IEĆ određena je merenjem sekrecije citokina CXCL8, CXCL10 i CCL2 (MCP-1). IEĆ su stimulisane tokom 24 h rekombinantnim flagelinima (Slika D3).
[0548] Flagelini ST, SE, K12, ER, RI3 i RH1 su indukovali nivoe IL-8, IP-10 i MCP-1 hemokina, dok su se RI1, RI2, RI4 i RH2, a posebno u Caco-2 ponašali kao slabi agonisti TLR5, indukujući značajno niže količine sekretovanih hemokina.
[0549] Tabele D3a, D3b, D3c i D3d ukazuju na značajnost razlika između svakog tretmana izračunatu sa uporednim t testom. Gornja desna strana Tabele D3a i D3b daje t vrednosti za IL/8 a donja leva strana za IP-10, I Tabele D3c I D3d daju t vrednosti za MCP-1. NS (nema značajnost); *(p<0.05); ** (p<0.01); ); *** (p<0.001).

[0550] Kao što je prikazano na slici D4, neutralizacija TLR5 sa anti-TLR5 specifičnim antitelom ukinula je inflaminatorni ogovor posredovan flagelinom, nezavisno od komensalnog ili patogenog porekla flagelina. Zato, proinflaminatorni efekti flagelina koji se primećuju u Caco-2 ćelijama su nezavisni od TLR5 aktivacije.
Generisanje dendritičnih ćelija i kultura iz koštane srži
[0551] Koštana srž je pokupljena iz butne kosti i tibije C3H/HeN i C57BI6 miševa. Za GMCSF-izvedene dendritične ćelije, ćelije koštane srži su resuspendovane do 1x10<6>/mL u RPMI obogaćenim sa 10% FCS i 20ng/mL rmGM-CSF i zasejane u10mL/plate in 100mm2 pločama za culture tkiva. Nakon tri dana u kulturi, blago adherirane ćelije su pokupljene i ponovo zasejane u GM-CSF obogaćenom medijumu pri koncentraciji 1x10<6>u pločama za kulture tkiva sa 12 bunarčića. 5. Dana ćelije su stimulisane sa 100 ng/mL flagelina pre nego što su pokupljene 6. Dana. Za Flt3L izvedene dendritične ćelije, ćelije koštane srži su resuspendovane do 2x10<6>u RPMI obogaćenim sa 10% FCS I 200 ng-mL rmFlt3 I zasejane po 2 mL/po bunarčiću na pločama za kultivaciju tkiva sa 12 bunarčića. Ćelije su gajene tokom 10 dana u Flt3 obogaćenim medijumu koji je dodat u svaki bunarčić 4. Dana. 9. Dana ćelije su stimulisane sa 100 ng/mL flagelina pre nego što su pokupljene 10. Dana i analizirane protočnom citometrijom.
[0552] Urađena je analiza protošne citometrije GM-CSF/IL-4 izvedenih dendritičnih ćelija (Slika D5) i Flt3L izvedenih dendritičnih ćelija (slika D6) stimulisanih sa rekombinantnim flagelinima. Flagelin Rh1 je bio najpotentniji i indukovao je ćelijski odgovor u GM-CSF/IL-4 izvedenim dendritičnim ćelijama pri čemu su Ri4 i Ri3 imali sličan odgovor na komensalne flageline K12 i Er i patogene flageline SE i ST. Za razliku od Rh2, i Ri2 nije indukovao ćelijski odgovor u GM- CSF/IL-4 izvedenim dendritičnim ćelijama ali je značajno pojačao ćelijske odgovore na Fit3L izvedene dendritične ćelije. Ovi flagelini, posebno Ri1 su posebni u svojoj sposobnosti da izazovu razlike u odgovoru aktivirajući Flt3L izvedene dendritične ćelije. Odgovor ukazuje na važnost specifičnosti flagelina na specifičnu podgrupu (podset) dendritičnih ćelija. Ove Flt3L izvedene dendritične ćelije su kategorisane kao plazmocitoidne dendritične ćelije koje igraju važnu ulogu u imunološkoj toleranciji.
In Vivo Model
[0553] BOY/J WT i TLR5KO miševi su korišćeni za procenu funkcionalne važnosti R. hominis i njegovih flagelina, Mićevi su kolonizovani sa R. hominis. Ţivotinje su eutanazirane i uzimanje uzoraka creva je izvedeno. Tanko crevo je sakupljeno za imunoločke analize putem protočne citometrije.
[0554] Urađena je analiza protočne cotomrtrije T ćelijske populacije, posebno T regulatornih (Treg) ćelija, u lamina propria tankog cerva (slika 6A i B). Procenat FoxP3+CD25+ ćelija u CD4+ T populaciji ćelija je bio značajno viši u BOY/J WT miševima u poređenju sa TLR5KO miševima. Ovo ukazuje na to da R. hominis I još specifičnije flagelini utiču na Tregove putem promocije CD4+ FoxP3+CD25+ regulatornih T ćelija. Znači može se zaključiti da su flagelini važni za usmeravanje imunskog odgovora domaćina kroz TLR5 interakcije.
KRATAK PRIKAZ KLAUZULA
[0555] Ovaj pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Radi pogodnosti drugi apekti ovog otkrića su prikazani ovde u obliku numerisanih klauzula.
1. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili Fla (kao FlaA1 ili FlaA2) polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u regulaciji imunološkog sistema domaćina.
2. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu na osnovu klauzule 1 za upotrebu u regulaciji adaptivnog imunološkog sistema subjekta.
3. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u regulaciji urođenog imunološkog sistema subjekta.
4. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u održavanju imunološke homeostaze u subjektu.
5. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u lečenju imunoloških poremećaja u subjektu.
6. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu kaluzule 5, gde je imunološki poremećaj odabran od ulcerativnog kolitisa, paučitisa (upala ilealnog rezervoara) i drugih autoimunoloških stanja uključujući reumatoidni artritis, psorijazu, multiplu sklerozu, alergije uključujući celijačnu bolest, atopijski dermatitis i rhinitis.
7. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u lečenju poremećaja odabranih iz inflaminatornog poremećaja, imunološkog poremećaj a i intestinalnog poremećaja subjekta.
8. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu klauzule 7, wherein poremećaj je odabran iz sindroma iritabilnog creva (IBS), kolitis, zapaljinsku bolesti creva (IBD) uključujući Kronovu bolest i ulcerativni kolitis, paučitisa (upala ilealnog rezervoara), funkcionalnu dispepsiju, funkcionalnu konstipaciju, funkcionalnu dijareju (uključujući diareju povezanu za antibioticima, putničku dijareju i pedijatrijsku dijareju), funkcionalni abdominalni bol, funkcionalno nadimanje, sindrom epigastričnog bola, Postprandial Distress Syndrome (sindrom poremećaja nakon jela), bolest gastrointestinalnog refluksa (GERD), autoimmune bolesti kao dijabetes, artritis, multipla skleroza, i psorijazne alergije, atopijske bolesti na primer atopijski dermatitis, nekrotični enterokolitis, druge infekcije i njihove kombinacije.
9. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u poboljšanju intestinalne mikrobiota u subjektu.
10. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u regulaciji apetita kod subjekta.
11. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu unapređenje zdravlja stomaka subjekta.
12. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u unapređenju Treg ćelija i mehanizama tolerancije u imunom sistemu subjekta.
13. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje od klauzula 1 do 12 koje regulišu indukciju i/ili ekspresiju najmanje jednog mobilizacionog gena ili gena za hemotaksiju.
14. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu klauzule 13, koja pojačava ekpresiju najmanje jednog gena za mobilizaciju ili hemotaksiju, i wherein pomenuti gen je selektovan od MobA i MobL.
15. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje prethodne klauzule, FlaA1, Fla2, FlaA3, i FlaB.
16. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje prethodne klauzule, koja reguliše ekpsresiju najmanje jednog od sledećih: acetil-CoA acetiltransferazu, 3-hidrksiacil- CoA dehydrogenazu, butiril-CoA dehydrogenazu, elezktron transfer flavoprotein beta subjedinicu, elektron transfer flavoprotein alfa subjedinicu.
17. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje prethodne klauzule, koji umanjuje skepresiju najmanje jednog gena odabranog od Agt, Cartpt, Cck, Cxcl12 i Gcg.
18. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje prethodne klauzule, koji aktivira najmanje jedan gen imunološkog odgovora u debelom crevu ili ileumu.
19. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje prethodne klauzule, koji aktivira adaptivni imunološki odgovor putem regulacije i/ili ekspresije gena povezanih sa T-ćelijskom regulacijom.
20. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje prethodne klauzule, koji pojačava ekspresiju najmanje jednog gena odabranog iz Ly6g6c i Ly6g6e u okviru uzlaznog dela debelog creva.
21. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje prethodne klauzule, koja reguliše ekspresiju najmanje jednog gena odabranog od Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, ltln, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, lgsf8 i Tcfe2a.
22. Upotreba Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelina, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu u pripremi medikamenta za regulaciju imunološkog sistema subjekta.
23. Upotreba Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelina, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, na osnovu klauzule 22 u pripremi medikamenta za regulaciju urođenog imunološkog sistema subjekta.
24. Upotreba Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelina, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, na osnovu klauzule 22 u pripremi medikamenta za regulaciju adaptivnog imunološkog sistema subjekta.
25. Upotreba Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelina, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, u pripremi medikamenta za održavenje imunološke homeostaze u subjektu.
26. Upotreba Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelina, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu, u pripremi medikamenta za lečenje imunoloških poremećaja u subjektu.
27. Metoda za regulaciju imunološkog sistema subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu kompozicije koja sadrži Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu.
28. Metoda za aktivaciju urođenog imunološkog sistema subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu kompozicije koja sadrži Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu.
29. Metoda za aktivaciju adaptivnog imunološkog sistema subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu kompozicije koja sadrži Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu.
30. Metoda za lečenje imunoloških poremećaja u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu kompozicije koja sadrži Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu.
31. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu na osnovu bilo koje od klauzula 1 do 21, ili metoda na na osnovu bilo koje od klauzula 127 do 30, ili za upotrebu na osnovu bilo koje od klauzula 22 do 26, u kome je subjekat sisar.
32. Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu za upotrebu u medicini.
33. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu i farmaceutski prihvatljiv ekspicijent, nosač ili rastvarač.
34. Hranljivi supplement koji obuhvata Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu i nutriciono prihvatljiv ekspicijent, nosač ili rastvarač.
35. Probiotska kompozicija koji obuhvata Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu.
36. Stočna hrana, prehrambeni proizvod, dijetetski supplement, hranljivi (nutricioni) supplement ili dodatak hrani koji obuhvata Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptid, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu.
37. Proces za proizvodnju farmaceutske kompozicije na osnovu klauzule 32, pomenuti proces obuhvata mešanje Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelina, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu sa farmaceutski prihvatljivim ekspicijentom, nosačem ili rastvaračem.
38. Proces za proizvodnju hranljivog suplementa na osnovu klauzule 33, pomenut proces obuhvata mešanje Roseburia (kao bakterijska vrsta Roseburia hominis, ili bakterijska vrsta Roseburia intestinalis), i/ili FlaA1 polipeptida, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid, i/ili Roseburia flagelina, i/ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina koja sadrži pomenutu polinukleotidnu sekvencu sa nutriciono prihvatljivim ekspicijentom, nosačem ili rastvaračem.
KRATAK PRIKAZ PARAGRAFA
[0556]
Radi pogodnosti drugi aspekti ovog otkrića su ovde prikazani u formi numerisanih paragrafa.
1. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u modulaciji inflamacije tkiva ili organa u subjektu.
2. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 1 gde pomenuti polipeptid ili polinukleotid redukuje infalamciju tkiva ili organa.
3. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 2 gde pomenuti polipeptid ili polinukleotid redukuje infalamciju epitelijalnih ćelija tkiva ili organa.
4. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 3 gde pomenute epitelijalne ćelije su epitelijalne ćelije alimentarnog kanala.
5. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u modulaciji proizvodnje T ćelija u subjektu; poželjno, polipeptid ili polinukleotid povećava proizvodnju T regulatornih ćelia u subjektu.
6. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u restauraciji imunološke tolerancije
7. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u regulaciji imunološkog sistema I restauracijI imunološke tolerancije u subjektu.
8. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 7 za upotrebu u regulaciji adaptivnog imunološkog sistema u subjektu.
9. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 7 za upotrebu u regulaciji urođenog imunološkog sistema u subjektu.
10. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u lečenju poremećaja u subjektu, gde je pomenuti poremećaj inflaminatorni poremećaj i/ili autoimuni poremećaj.
11. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 10 gde pomenuti poremećaj zahvata alimentarni kanal ili njegov deo u pomenutom subjektu.
12. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 10 gde je pomenuti poremećaj odabran iz grupe koja obuhvata reumatoidni artritis, psorijazu, multiplu sklerozu, dijabetes tipa 1, celijačnu bolest, atopijski dermatitis, rinitis, sindrom iritabilnog creva (IBS), kolitis, zapaljinsku bolesti creva (IBD), ulcerativni kolitisa, paučitisa (upala ilealnog rezervoara), Kronovu bolest, funkcionalnu dispepsiju, atopijske bolesti, nekrotični enterokolitis, i njihove kombinacije.
13. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u modulaciji dendritičnih ćelija i/ili epitelijalnih ćelija u tkivu ili organu subjekta.
14. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 13 gde pomenuti polipeptid ili polinukleotid aktivira dendritične ćelije i/ili epitelijalne ćelije.
15. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u regulaciji proizvodnje IL-10 i/ili TGFβ u ćeliji ili ćelijama subjekta.
16. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 15 gde dendritične ćelije prizvode IL-10.
17. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 15 ili 16 gde pomenuti polipeptid ili polinukleotid pojačava proizvodnju IL-10 i/ili GFβ.
18. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u regulaciji proizvodnje CD40 i/ili I-A/I-E u ćeliji ili ćelijama subjekta.
19. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 18 gde dendritične ćelije prizvode CD40 i/ili I-A/I-E.
20. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 18 ili 19 gde pomenuti polipeptid ili polinukleotid pojačava proizvodnju CD40 i/ili I-A/I-E.
21. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u regulaciji eskpresije jednog ili više Tip I IFN gena u ćeliji ili ćelijama subjekta.
22. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u regulaciji eskpresije jednog ili više proinflaminatornih gena u ćeliji ili ćelijama subjekta.
23. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u poboljšanjeu intestinalne mikrobiota u subjektu.
24. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u regulaciji apetita subjekta.
25. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 24 gde pomenuti polipeptid ili polinukleotid stimuliše apetit subjekta.
26. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu paragrafa 24 ili 25 gde je nivo holecistokina (Cck) i/ili glikagona (Gcg) redukovan u krvi subjekta.
27. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u regulaciji ekspresije gena koji kodira holecistokin (Cck) i/ili glikagon (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta.
28. FlaA1 polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid za upotrebu u poboljšanju zdravlja alimentarnog kanala u subjektu.
29. Polipeptid ili polinukleotid na osnovu bilo kog od paragrafa 1 ili 28 gde je pomenuti polipeptid ili polinukleotid inkapsuliran.
30. Framaceutska kompozicija koja obuhvata FlaA1 polipeptid ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili rastvarač.
31. Framaceutkso kompozicija na osnovu paragrafa 30 gde je pomenuti polipeptid ili polinukleotid inkapsuliran.
32. Hranljivi supplement koji sadrži FlaA1 polipeptid ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti pomenuti polipeptid i nutriciono prihvatljiv ekscipijent, nosač ili rastvarač.
33. Hranljivi supplement na osnovu paragrafa 32 gde je pomenuti polipeptid ili polinukleotid inkapsuliran.
34. Stočna hrana, prehrambeni proizvod, dijetetski suplement ili dodatak hrani obuhvataju FlaA1 polipeptid ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid.
35. Stočna hrana, prehrambeni proizvod, dijetetski suplement ili dodatak hrani na osnovu paragrafa 34 gde je pomenuta stočna hrana, prehrambeni proizvod, dijetetski supplement ili dodatak hrani inkapsuliran.
36. Proces za proizvodnju faraceutske kompozicije na osnovu paragrafa 30. Pomenuti proces obuhvata mešanje pomenutog polipeptida ili polinukleotidnse sekvence sa nutriciono prihvatljivim ekscipijentom, nosačem ili rastvaračem; opcionalno polipeptid ili polinukleotid je inkapsuliran.
37. Proces za proizvodnju nutricionog suplementa na osnovu paragrafa 32. Pomenuti proces obuhvata mešanje pomenutog polipeptida ili polinukleotidnse sekvence sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, nosačem ili rastvaračem; opcionalno polipeptid ili polinukleotid je inkapsuliran.
38. Metoda za modulaciju inflaminacije tkiva ili organa subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid igde je infalamcija tkiva ili organa u subjektu modulisana.
39. Metoda za modulaciju proizvodnje T ćelija u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je proizvodnja T ćelija u subjektu je modulisana, posebno T regulatornih ćelija.
40. Metoda za regulaciju imunološkog sistema u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid t gde je imuni u subjektu regulisan.
41. Metoda za lečenje poremećaja u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je pomenuti poremećaj inflaminatorni poremećaj i/ili autoimuni poremećaj.
42. Metoda za modulaciju dendritičnih ćelija i/ili epitelijalnih ćelija u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde su dendritične ćelije i/ili epitelijalen ćelije modulisane u subjektu.
43. Metoda za regulaciju proizvodnje u subjektu IL-10 i/ili TGFβ u ćeliji ili ćelijama subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je proizvodnja IL-10 i/ili TGFβ u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
44. Metoda za regulaciju proizvodnje CD40 i/ili I-A/I-E u ćeliji ili ćelijama subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je proizvodnja CD40 i/ili I-A/I-E u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
45. Metoda za regulaciju ekspresije jednog ili više Type I IFN gena u ćeliji ili ćelijama subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je ekspresija jednog ili više Type I IFN gena u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
46. Metoda za regulaciju ekspresije jednog ili više proinflaminatornih gena u ćeliji ili ćelijama subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je ekspresija jednog ili više proinflaminatornih gena u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
47. Metoda za poboljšanje intestinalne mikrobiota u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je intestinalna mikrobiota u subjektu poboljšana.
48. Metoda za regulaciju apetita subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je apetit subjekta regulisan.
49. Metoda za regulaciju ekspresije gena koji kodira holecistokina (Cck) i/ili) i/ili ekspresije gena koji kodira glikagona (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je ekspresija gena koji kodira holecistokina (Cck) i/ili) i/ili ekspresija gena koji kodira glikagona (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta regulisana.
50. Metoda za poboljšanje zdravlja alimentarnog kanala u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je zdravlje alimentarnog kanala u subjektu poboljšano.
51. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za modulaciju inflamacije tkiva ili organa subjekta.
52. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za modulaciju inflamacije proizvodnje T ćelija u subjektu.
53. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za regulaciju imunološkog sistema subjekta.
54. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za lečenje poremećaja u subjektu, gde je pomenuti poremećaj inflaminatorni poremećaj i/ili autoimuni poremećaj.
55. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za modulaciju dendritičnih ćečija i/ili epitelijanih ćelija u tkivu ili organu subjekta.
56. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za regulaciju proizvodnje IL-10 i/ili TGFβ u ćeliji ili ćelijama subjekta.
57. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za regulaciju proizvodnje CD40 i/ili I-A/I-E u ćeliji ili ćelijama subjekta.
58. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za regulaciju ekspresije jednog ili više Tip I IFN gena u ćeliji ili ćelijama subjekta.
59. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za regulaciju ekspresije jednog ili više proinflaminatornih gena u ćeliji ili ćelijama subjekta.
60. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za poboljšanje intestinalne mikrobiota u subjektu.
61. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za regulaciju apetita subjekta.
62. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta regulaciju ekspresije gena koji kodira holecistokina (Cck) i/ili) i/ili ekspresije gena koji kodira glikagona (Gcg) u ćeliji ili ćelijama subjekta.
63. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za poboljšanje zdravlja alimentarnog kanala subjekta.
64. Upotreba FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid za proizvodnju medikamenta za restauraciju imunološkog sistema subjekta.
65. Metoda za restauraciju imunološke tolerancije u subjektu, pomenuta metoda obuhvata davanje subjektu FlaA1 polipeptida ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti polipeptid i gde je imunološka tolerancija u subjektu restaurirana.
REFERENCE
[0557]
Aminov, R.I., Walker, A.W., Duncan, S.H., Harmsen, H.J., Welling, G.W. & Flint, H.J.
2006, "Molecular diversity, cultivation, and improved detection by fluorescent in situ hybridization of a dominant group of human gut bacteria related to Roseburia spp. or Eubacterium rectale", Applied and Environmental Microbiology, vol. 72, no. 9, pp.
6371-6376.
Atarashi, K., Tanoue, T., Shima, T., Imaoka, A., Kuwahara, T., Momose, Y., Cheng, G., Yamasaki, S., Saito, T., Ohba, Y., Taniguchi, T., Takeda, K., Hori, S., Ivanov, I.I., Umesaki, Y., Itoh, K. & Honda, K. 2011, "Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species", Science (New York, N.Y.), vol. 331, no. 6015, pp.
337-341.
Berg, D.J., Davidson, N., Kuhn, R., Muller, W., Menon, S., Holland, G., Thompson-Snipes, L., Leach, M.W. & Rennick, D. 1996, "Enterocolitis and colon cancer in interleukin-10-deficient mice are associated with aberrant cytokine production and CD4(+) TH1-like responses", The Journal of clinical investigation, vol. 98, no. 4, pp, 1010-1020.
Chung, H. & Kasper, D.L. 2010, "Microbiota-stimulated immune mechanisms to maintain gut homeostasis", Current opinion in immunology, vol. 22, no. 4, pp. 455-460.
 Crellin, N.K., Garcia, R.V., Hadisfar, O., Allan, S.E., Steiner, T.S. & Levings, M.K.
2005, "Human CD4+ T cells express TLR5 and its ligand flagellin enhances the suppressive capacity and expression of FOXP3 in CD4+CD25+ T regulatory cells", Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950), vol. 175, no. 12, pp. 8051-8059.
 De Paepe, M., Gaboriau-Routhiau, V., Rainteau, D., Rakotobe, S., Taddei, F. & Cerf-Bensussan, N. 2011, "Trade- off between bile resistance and nutritional competence drives Escherichia coli diversification in the mouse gut", PLoS genetics, vol. 7, no. 6, pp. e1002107. Duck, L.W., Walter, M.R., Novak, J., Kelly, D., Tomasi, M., Cong, Y. & Elson, C.O. 2007, "Isolation of flagellated bacteria implicated in Crohn's disease", Inflammatory bowel diseases, vol.13, no.10, pp.1191-1201.
Duncan, S.H., Aminov, R.I., Scott, K.P., Louis, P., Stanton, T.B. & Flint, H.J. 2006, "Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol.56, no. Pt 10, pp.2437-2441. Eckburg, P.B., Bik, E.M., Bernstein, C.N., Purdom, E., Dethlefsen, L., Sargent, M., Gill, S.R., Nelson, K.E. & Relman, D.A. 2005, "Diversity of the human intestinal microbial flora", Science (New York, N.Y.), vol.308, no.5728, pp.1635-1638.
Flores-Langarica, A., Marshall, J.L., Hitchcock, J., Cook, C., Jobanputra, J., Bobat, S., Ross, E.A., Coughlan, R.E., Henderson, I.R., Uematsu, S., Akira, S. & Cunningham, A.F.2012, "Systemic flagellin immunization stimulates mucosal CD103+ dendritic cells and drives Foxp3+ regulatory T CELL and IgA responses in the mesenteric lymph node", Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950), vol.189, no.12, pp.5745-5754.
Frank, D.N., StAmand, A.L., Feldman, R.A., Boedeker, E.C., Harpaz, N. & Pace, N.R.
2007, "Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 104, no. 34, pp. 13780-13785. Gaboriau-Routhiau, V., Rakotobe, S., Lecuyer, E., Mulder, I., Lan, A., Bridonneau, C., Rochet, V., Pisi, A., De Paepe, M., Brandi, G., Eberl, G., Snel, J., Kelly, D. & Cerf-Bensussan, N. 2009, "The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses", Immunity, vol. 31, no. 4, pp.
677-689. Geraedts, M.C., Troost, F.J., Tinnemans, R., Soderholm, J.D., Brummer, R.J. & Saris, W.H. 2010, "Release of satiety hormones in response to specific dietary proteins is different between human and murine small intestinal mucosa", Annals of Nutrition & Metabolism, vol.56, no.4, pp.308-313.
Geuking, M.B., Cahenzli, J., Lawson, M.A., Ng, D.C., Slack, E., Hapfelmeier, S., McCoy, K.D. & Macpherson, A.J. 2011, "Intestinal bacterial colonization induces mutualistic regulatory T cell responses", Immunity, vol.34, no.5, pp.794-806.
 Giraud, A., Arous, S., De Paepe, M., Gaboriau-Routhiau, V., Bambou, J.C., Rakotobe, S., Lindner, A.B., Taddei, F. & Cerf-Bensussan, N. 2008, "Dissecting the genetic components of adaptation of Escherichia coli to the mouse gut", PLoS genetics, vol.4, no. 1, pp. e2. Hapfelmeier, S., Lawson, M.A., Slack, E., Kirundi, J.K., Stoel, M., Heikenwalder, M., Cahenzli, J., Velykoredko, Y., Balder, M.L., Endt, K., Geuking, M.B., Curtiss, R.,3rd, McCoy, K.D. & Macpherson, A.J. 2010, "Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses", Science (New York, N.Y.), vol.328, no.5986, pp.1705-1709.
Hayashi, F., Smith, K.D., Ozinsky, A., Hawn, T.R., Yi, E.C., Goodlett, D.R., Eng, J.K., Akira, S., Underhill, D.M. & Aderem, A. 2001, "The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5", Nature, vol. 410, no. 6832, pp.
1099-1103.
 Hooper, L.V., Wong, M.H., Thelin, A., Hansson, L., Falk, P.G. & Gordon, J.I. 2001, "Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine", Science (New York, N. Y.), vol. 291, no. 5505, pp. 881-884. Hossain, M.S., Jaye, D.L., Pollack, B.P., Farris, A.B., Tselanyane, M.L., David, E., Roback, J.D., Gewirtz, A.T. & Waller, E.K. 2011, "Flagellin, a TLR5 agonist, reduces graft-versushost disease in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation recipients while enhancing antiviral immunity", Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950), vol. 187, no. 10, pp.5130-5140.
Ivanov, I.I., Atarashi, K., Manel, N., Brodie, E.L., Shima, T., Karaoz, U., Wei, D., Goldfarb, K.C., Santee, C.A., Lynch, S.V., Tanoue, T., Imaoka, A., Itoh, K., Takeda, K., Umesaki, Y., Honda, K. & Littman, D.R. 2009, "Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria", Cell, vol. 139, no. 3, pp. 485-498.
 Kang, S., Denman, S.E., Morrison, M., Yu, Z., Dore, J., Leclerc, M. & McSweeney, C.S. 2010, "Dysbiosis of fecal microbiota in Crohn's disease patients as revealed by a custom phylogenetic microarray", Inflammatory bowel diseases, vol.16, no.12, pp.2034-2042. Kelly, D., Campbell, J.I., King, T.P., Grant, G., Jansson, E.A., Coutts, A.G., Pettersson, S. & Conway, S. 2004, "Commensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation by regulating nuclear- cytoplasmic shuttling of PPAR-gamma and RelA", Nature immunology, vol.5, no.1, pp.104-112.
Kinnebrew, M.A., Buffie, C.G., Diehl, G.E., Zenewicz, L.A., Leiner, I., Hohl, T.M., Flavell, R.A., Littman, D.R. & Pamer, NPR. 2012, "Interleukin 23 production by intestinal CD103(+)CD11b(+) dendritic cells in response to bacterial flagellin enhances mucosal innate immune defense", Immunity, vol.36, no.2, pp.276-287.
 Letran, S.E., Lee, S.J., Atif, S.M., Flores-Langarica, A., Uematsu, S., Akira, S., Cunningham, A.F. & McSorley, S.J. 2011, "TLR5-deficient mice lack basal inflammatory and metabolic defects but exhibit impaired CD4 T cell responses to a flagellated pathogen", Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950), vol.186, no.9, pp.5406-5412.
Machiels K., Joossens M., Sabino J., De Preter V., Arijs I., Ballet V., Claes K., Verhaegen J., Van Assche G., Rutgeerts P. & Vermeire S. 2013, "Predominant dysbiosis in patients with ulcerative colitis is different from Crohn's disease patients", Inflammatory Bowel Diseases. 8th Congress of ECCO, Feb 14-16, 2013.
 Macpherson, A.J.2006, "IgA adaptation to the presence of commensal bacteria in the intestine", Current topics in microbiology and immunology, vol.308, pp.117-136. Macpherson, A.J., Hunziker, L., McCoy, K. & Lamarre, A.2001, "IgA responses in the intestinal mucosa against pathogenic and non-pathogenic microorganisms", Microbes and infection/Institut Pasteur, vol.3, no.12, pp.1021-1035.
Macpherson, A.J., Martinic, M.M. & Harris, N. 2002, "The functions of mucosal T cells in containing the indigenous commensal flora of the intestine", Cellular and molecular life sciences : CMLS, vol. 59, no. 12, pp. 2088-2096. Mahowald, M.A., Rey, F.E., Seedorf, H., Turnbaugh, P.J., Fulton, R.S., Wollam, A., Shah, N., Wang, C., Magrini, V., Wilson, R.K., Cantarel, B.L., Coutinho, P.M., Henrissat, B., Crock, L.W., Russell, A., Verberkmoes, N.C., Hettich, R.L. & Gordon, J.I.2009, "Characterizing a model human gut microbiota composed of members of its two dominant bacterial phyla", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol.106, no.14, pp. 5859-5864.
Mallya, M., Campbell, R.D. & Aguado, B.2006, "Characterization of the five novel Ly-6 superfamily members encoded in the MHC, and detection of cells expressing their potential ligands", Protein science : a publication of the Protein Society, vol.15, no.10, pp. 2244-2256.
 Mazmanian, S.K., Liu, C.H., Tzianabos, A.O. & Kasper, D.L. 2005, "An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system", Cell, vol.122, no.1, pp.107-118.
McLaughlin, J., Grazia Luca, M., Jones, M.N., D'Amato, M., Dockray, G.J. & Thompson, D.G. 1999, "Fatty acid chain length determines cholecystokinin secretion and effect on human gastric motility", Gastroenterology, vol. 116, no. 1, pp. 46-53.
 Monteleone, I., Platt, A.M., Jaensson, E., Agace, W.W. & Mowat, A.M. 2008, "IL-10-dependent partial refractoriness to Toll-like receptor stimulation modulates gut mucosal dendritic cell function", European journal of immunology, vol. 38, no. 6, pp.
1533-1547. Nutsch, K.M. & Hsieh, C.S. 2012, "T cell tolerance and immunity to commensal bacteria", Current opinion in immunology, vol.24, no.4, pp.385-391.
Prakash, T., Oshima, K., Morita, H., Fukuda, S., Imaoka, A., Kumar, N., Sharma, V.K., Kim, S.W., Takahashi, M., Saitou, N., Taylor, T.D., Ohno, H., Umesaki, Y. & Hattori, M.
2011, "Complete genome sequences of rat and mouse segmented filamentous bacteria, a potent inducer of th17 cell differentiation", Cell host & microbe, vol.10, no.
3, pp.273-284.
Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K.S., Manichanh, C., Nielsen, T., Pons, N., Levenez, F., Yamada, T., Mende, D.R., Li, J., Xu, J., Li, S., Li, D., Cao, J., Wang, B., Liang, H., Zheng, H., Xie, Y., Tap, J., Lepage, P., Bertalan, M., Batto, J.M., Hansen, T., Le Paslier, D., Linneberg, A., Nielsen, H.B., Pelletier, E., Renault, P., Sicheritz- Ponten, T., Turner, K., Zhu, H., Yu, C., Li, S., Jian, M., Zhou, Y., Li, Y., Zhang, X., Li, S., Qin, N., Yang, H., Wang, J., Brunak, S., Dore, J., Guarner, F., Kristiansen, K., Pedersen, O., Parkhill, J., Weissenbach, J., MetaHIT Consortium, Bork, P., Ehrlich, S.D. & Wang, J. 2010, "A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing", Nature, vol.464, no.7285, pp.59-65.
Round, J.L., Lee, S.M., Li, J., Tran, G., Jabri, B., Chatila, T.A. & Mazmanian, S.K.
2011, "The Toll-like receptor 2 pathway establishes colonization by a commensal of the human microbiota", Science (New York, N.Y.), vol. 332, no. 6032, pp. 974-977.
 Scanlan, P.D., Shanahan, F., O'Mahony, C. & Marchesi, J.R. 2006, "Cultureindependent analyses of temporal variation of the dominant fecal microbiota and targeted bacterial subgroups in Crohn's disease", Journal of clinical microbiology, vol.
44, no.11, pp.3980-3988.
Schulke, S., Burggraf, M., Waibler, Z., Wangorsch, A., Wolfheimer, S., Kalinke, U., Vieths, S., Toda, M. & Scheurer, S. 2011, "A fusion protein of flagellin and ovalbumin suppresses the TH2 response and prevents murine intestinal allergy", The Journal of allergy and clinical immunology, vol. 128, no. 6, pp. 1340-1348.e12.
 Sczesnak, A., Segata, N., Qin, X., Gevers, D., Petrosino, J.F., Huttenhower, C., Littman, D.R. & Ivanov, I.I. 2011, "The genome of th17 cell-inducing segmented filamentous bacteria reveals extensive auxotrophy and adaptations to the intestinal environment", Cell host & microbe, vol.10, no.3, pp.260-272.
Spor, A., Koren, O. & Ley, R. 2011, "Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome", Nature reviews.Microbiology, vol. 9, no. 4, pp.
279-290. Tremaroli, V., Kovatcheva-Datchary, P. & Backhed, F. 2010, "A role for the gut microbiota in energy harvesting?", Gut, vol.59, no.12, pp.1589-1590. Turnbaugh, P.J., Backhed, F., Fulton, L. & Gordon, J.I. 2008, "Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome", Cell host & microbe, vol.3, no.4, pp.213-223.
Turnbaugh, P.J., Ley, R.E., Mahowald, M.A., Magrini, V., Mardis, E.R. & Gordon, J.I.
2006, "An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest", Nature, vol. 444, no. 7122, pp. 1027-1031. Ukena, S.N., Singh, A., Dringenberg, U., Engelhardt, R., Seidler, U., Hansen, W., Bleich, A., Bruder, D., Franzke, A., Rogler, G., Suerbaum, S., Buer, J., Gunzer, F. & Westendorf, A.M. 2007, "Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 inhibits leaky gut by enhancing mucosal integrity", P/oS one, vol. 2, no. 12, pp. e1308. Vijay-Kumar, M., Sanders, C.J., Taylor, R.T., Kumar, A., Aitken, J.D., Sitaraman, S.V., Neish, A.S., Uematsu, S., Akira, S., Williams, I.R. & Gewirtz, A.T.2007, "Deletion of TLR5 results in spontaneous colitis in mice", The Journal of clinical investigation, vol.117, no.12, pp.3909-3921.
Werth, M., Walentin, K., Aue, A., Schonheit, J., Wuebken, A., Pode-Shakked, N., Vilianovitch, L., Erdmann, B., Dekel, B., Bader, M., Barasch, J., Rosenbauer, F., Luft, F.C. & Schmidt-Ott, K.M. 2010, "The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex", Development (Cambridge, England), vol. 137, no. 22, pp. 3835-3845.
Wilson, R.H., Maruoka, S., Whitehead, G.S., Foley, J.F., Flake, G.P., Sever, M.L., Zeldin, D.C., Kraft, M., Garantziotis, S., Nakano, H. & Cook, D.N. 2012, "The Toll-like receptor 5 ligand flagellin promotes asthma by priming allergic responses to indoor allergens", Nature medicine, vol. 18, no. 11, pp. 1705-1710.
 Yoon, S.I., Kurnasov, O., Natarajan, V., Hong, M., Gudkov, A.V., Osterman, A.L. & Wilson, I.A.2012, "Structural basis of TLR5-flagellin recognition and signaling", Science (New York, N.Y.), vol.335, no.6070, pp.859-864.
Lista referencI za dopunske informacije
[0558]
(1) Genome sequence assembly using trace signals and additional sequence information. Computer Science and Biology: Proceedings of the German Conference on Bioinformatics (GCB); 1999. (2) Aziz RK, Bartels D, Best AA, DeJongh M, Disz T, Edwards RA, et al. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics 2008 Feb 8;9:75-2164-9-75.
(3) Dennis G,Jr, Sherman BT, Hosack DA, Yang J, Gao W, Lane HC, et al. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol 2003;4(5):P3.
 (4) Untergasser A, Nijveen H, Rao X, Bisseling T, Geurts R, Leunissen JA. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Res 2007 Jul;35(Web Server issue):W71-4.
(5) Duck LW, Walter MR, Novak J, Kelly D, Tomasi M, Cong Y, et al. Isolation of flagellated bacteria implicated in Crohn's disease. Inflamm Bowel Dis 2007 Oct;13(10):1191-1201. (6) Berg DJ, Davidson N, Kuhn R, Muller W, Menon S, Holland G, Thompson-Snipes L, Leach MW, Rennick D. Enterocolitis and colon cancer in interleukin-10-deficient mice are associated with aberrant cytokine production and CD4(+) TH1-like responses. J.Clin.lnvest., 1996, 98, 4, 1010-1020.
(7) Monteleone I, Platt AM, Jaensson E, Agace WW, Mowat AM. IL-10-dependent partial refractoriness to Toll-like receptor stimulation modulates gut mucosal dendritic cell function. Eur J Immunol.200838(6): 1533-47 (8) Inaba K, Inaba M, Romani N, Aya H, Deguchi M, Ikehara S, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colonystimulating factor. J Exp Med 1992 Dec 1;176(6):1693-1702.
(9) Brasel K, De Smedt T, Smith JL, Maliszewski CR. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supple- mented bone marrow cultures. Blood 2000 Nov 1;96(9):3029-3039. (10) Weigel BJ, Nath N, Taylor PA, Panoskaltsis-Mortari A, Chen W, Krieg AM, et al. Comparative analysis of murine marrow-derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and matured with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses. Blood 2002 Dec 1;100(12):4169-4176.
(10) Xu Y, Zhan Y, Lew AM, Naik SH, Kershaw MH. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol 2007 Dec 1;179(11):7577-7584. (12) Olivera L, Canul RR, Pereira-Pacheco F, Cockburn J, Soldani F, McKenzie NH, et al. Nutritional and physiological responses of young growing rats to diets containing raw cowpea seed meal, protein isolate (globulins), or starch. J Agric Food Chem 2003 Jan 1;51(1):319-325.

Claims (18)

Patentni zahtevi
1. Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju inflamatornih poremećaja i/ili autoimunoloških poremećaja u subjektu.
2. Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili domaćinska ćelija, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili domaćinska ćelija, uključijući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu skevencu, za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1 gde je pomenuti Roseburia flagelin odabran iz grupe koja se sastoji od:
polipeptida koji su najmanje 75% identični sa SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12 ili njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima i njihovim kombinacijama; i gde je polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin selektovana iz grupe koja se sastoji od:
polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju polipeptid koji je najmanje 75% identičan sa SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12 ili njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima i njihovim kombinacijama;
polinukleotidnih sekvenci koje su najmanje 75% identične sa SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 ili SEQ ID NO 12 ili njihovim varijantama, homolozima, fragmentima ili derivatima i njihovim kombinacijama;
3. Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili domaćinska ćelija, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili domaćinska ćelija, uključijući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu skevencu, a upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1, što je pomenuti poremećaj iz grupe koja obuhvata reumatoidni artritis, psorijazu, multiplu sklerozu, dijabetes tipa 1, celijačnu bolest, atopijski dermatitis, rinitis, sindrom iritabilnog creva (IBS), kolitis, zapaljinsku bolesti creva (IBD), ulcerativni kolitis, paučitis (upala ilealnog rezervoara), Kronovu bolest, funkcionalnu dispepsiju, atopijske bolesti, nekrotični enterokolitis, i njihove kombinacije.
4. Roseburia flagelin, ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju koja poseduje pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1, gde Roseburia flagelin ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu ili i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, povećava proizvodnju T regulatornih ćelija u subjektu.
5. Roseburia flagelin, ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1, gde Roseburia flagelin ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu ili i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu povećava porizvodnju IL-10 i/ili TGFβ u ćeliji ili ćelijama subjekta.
6. Roseburia flagelin, ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1, gde Roseburia flagelin ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu ili i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu povećava porizvodnju površinskih ćelijskih markera koji učestvuju u imunološkim odgovorima i prepoznavanjeu antigena kao CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H i/ili ekvivalent u vrstama u ćeliji ili ćelijama domaćina.
7. Roseburia flagelin, ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 6, gde se površinski ćelijski marker koji učestvuju u imunološkim odgovorima i prepoznavanju antigena kao CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 i/ili Siglec-H i/ili ekvivalent u vrstama proizvode u dendritičnim ćelijama.
8. Roseburia flagelin, ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1 gde Roseburia flagelin, ili polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu smanjuje ekspresiju jednog ili više gTip I IFN gena u ćeliji ili ćelijama subjekta.
9. Upotreba Roseburia flagelina, ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu za stimulaciju apetita subjekta.
10. Upotreba Roseburia flagelina, ili polinukleotidne sekvence koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektora koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćelije domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelije domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu za, na osnovu patentnog zahteva 9, gde je nivo holecistokinina (Cck) i/ili glukagona (Gcg) redukovan u krvi subjekta.
11. Farmaceutska kompozicija i/ili nutricioni (hranljivi) suplement obuhvata Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti Roseburia flagelin, i/ili vektor koji obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, i/ili ćeliju domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćeliju domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu i farmaceutski i/ili nutriciono prihvatljiv ekspicijent, nosač ili rastvarač.
12. Farmaceutska kompozicija i/ili nutricioni (hranljivi) suplement na osnovu patentnog zahtev 11, gde je pomenuti Roseburia flagelin, i/ili pomenuta polinukleotidna sekvenca i/ili pomenuti vektor i/ili pomenuta ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili pomenuta ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu inkapsuliran.
13. Farmaceutska kompozicija i/ili nutricioni (hranljivi) suplement na osnovu patentnog zahteva 11 ili patentnog zahteva 12 za upotrebu u lečenju poremećaja u subjektu, gde je poremećaj inflamacioni poremećaj i/ili autoimuni poremećaj.
14. Upotreba farmaceutske kompozicije i/ili nutricionog (hranljiviog) suplementa na osnovu patentnog zahteva 11 ili patentnog zahteva 12 u stimulaciji apetita subjekta.
15. Proces za proizvodnju farmaceutske kompozicije i/ili nutricionog (hranljivog) suplementa na osnovu patentnog zahteva 11, pomenuti process obuhvata mešanje pomenutog Roseburia flagelina, i/ili pomenute polinukleotidne sekvence i/ili pomenutog vektora, i/ili pomenute ćelije domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili pomenute ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu sa farmaceutski i/ili nutriciono prihvatljivim ekspicijentom, nosačem ili rastvaračem; opcionalno, pomenuti Roseburia flagelin, i/ili pomenuta polinukleotidna sekvenca i/ili pomenuti vektora, i/ili pomenuta ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili pomenuta ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu je inkapsuliran.
16. Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 1-10, farmaceutska kompozicija i/ili nutricioni (hranljivi) suplement na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 11-14 i proces na osnovu patentnog zahteva 15, gde je pomenuti Roseburia flagelin dobijen iz ili dostavljen od Roseburia hominis.
17. Roseburia hominis flagelin, i/ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu bilo kog od patentnog zahteva 16, gde je pomenuti Roseburia hominis flagelin polipeptid koji je najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO 2 ili SEQ ID NO 4, gde je polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia hominis flagelin najmanje 99% identična sa SEQ ID NO 2 ili SEQ ID NO 4 ili polinukleotidna sekvenca koja je najmanje 99% identična sa SEQ ID NO 1 iliSEQ ID NO 3.
18. Roseburia flagelin, i/ili polinukleotidna sekvenca, i/ili vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenuti vektor, i/ili ćelija domaćina, uključujući bakteriju, koja obuhvata pomenutu polinukleotidnu sekvencu, za upotrebu na osnovu bilo kog od patentnog zahteva 16 ili 17, gde pomenuti Roseburia hominis flagelin ima polipeptidnu sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID NO 4, i gde polinukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti Roseburia hominis flagelin ima polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO 2 ili SEQ ID NO 4 ili polinukelotidnu sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO 1 ili SEQ ID NO 3.
RS20180240A 2013-04-10 2014-04-10 Roseburia flagelin i imunomodulacija RS56909B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1306536.2A GB201306536D0 (en) 2013-04-10 2013-04-10 Polypeptide and immune modulation
EP14717823.0A EP3010523B1 (en) 2013-04-10 2014-04-10 Roseburia flagellin and immune modulation
PCT/GB2014/051123 WO2014167338A1 (en) 2013-04-10 2014-04-10 Roseburia flagellin and immune modulation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56909B1 true RS56909B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=48483707

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180240A RS56909B1 (sr) 2013-04-10 2014-04-10 Roseburia flagelin i imunomodulacija
RS20211439A RS62599B1 (sr) 2013-04-10 2014-04-10 Flagelin bakterije roseburia i imunomodulacija

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211439A RS62599B1 (sr) 2013-04-10 2014-04-10 Flagelin bakterije roseburia i imunomodulacija

Country Status (25)

Country Link
US (3) US9796762B2 (sr)
EP (2) EP3318268B1 (sr)
JP (3) JP6641262B2 (sr)
CN (1) CN105407908A (sr)
AU (2) AU2014202021B2 (sr)
BR (1) BR112015025854A8 (sr)
CA (1) CA2848725A1 (sr)
CY (2) CY1120177T1 (sr)
DK (2) DK3010523T3 (sr)
ES (2) ES2660823T3 (sr)
GB (1) GB201306536D0 (sr)
HR (2) HRP20211643T1 (sr)
HU (2) HUE056167T2 (sr)
LT (2) LT3010523T (sr)
ME (1) ME03020B (sr)
MX (1) MX363015B (sr)
NO (1) NO3010523T3 (sr)
PL (2) PL3010523T3 (sr)
PT (2) PT3010523T (sr)
RS (2) RS56909B1 (sr)
RU (1) RU2682651C2 (sr)
SI (2) SI3318268T1 (sr)
SM (2) SMT202100690T1 (sr)
TR (1) TR201802752T4 (sr)
WO (1) WO2014167338A1 (sr)

Families Citing this family (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US8241623B1 (en) 2009-02-09 2012-08-14 David Bermudes Protease sensitivity expression system
US9457077B2 (en) 2009-11-18 2016-10-04 Katherine Rose Kovarik Method and system for targeting the microbiome to promote health and treat allergic and inflammatory diseases
US9585920B2 (en) 2011-02-04 2017-03-07 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US10940169B2 (en) 2015-11-30 2021-03-09 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US11357722B2 (en) 2011-02-04 2022-06-14 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US11523934B2 (en) 2011-02-04 2022-12-13 Seed Health, Inc. Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US10010568B2 (en) 2011-02-04 2018-07-03 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a spirochetes infection in a human being
US10687975B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Joseph E. Kovarik Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US10245288B2 (en) 2011-02-04 2019-04-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing NASH in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10085938B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing sore throat in humans
US9987224B2 (en) 2011-02-04 2018-06-05 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing migraine headaches, cluster headaches and dizziness
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US10086018B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US10512661B2 (en) 2011-02-04 2019-12-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10842834B2 (en) 2016-01-06 2020-11-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US11191665B2 (en) 2011-02-04 2021-12-07 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US10583033B2 (en) 2011-02-04 2020-03-10 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US10111913B2 (en) 2011-02-04 2018-10-30 Joseph E. Kovarik Method of reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
US10835560B2 (en) 2013-12-20 2020-11-17 Joseph E. Kovarik Reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
US10548761B2 (en) 2011-02-04 2020-02-04 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US11273187B2 (en) 2015-11-30 2022-03-15 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
GB201112091D0 (en) 2011-07-14 2011-08-31 Gt Biolog Ltd Bacterial strains isolated from pigs
GB201117313D0 (en) 2011-10-07 2011-11-16 Gt Biolog Ltd Bacterium for use in medicine
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
GB201306536D0 (en) 2013-04-10 2013-05-22 Gt Biolog Ltd Polypeptide and immune modulation
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US12318377B2 (en) 2013-12-20 2025-06-03 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
WO2015195845A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Xycrobe Therapeutics, Inc. Genetically modified bacteria and methods for genetic modification of bacteria
EP3193901B1 (en) 2014-12-23 2018-04-04 4D Pharma Research Limited Pirin polypeptide and immune modulation
LT3065748T (lt) 2014-12-23 2018-03-12 4D Pharma Research Limited Bacteroides thetaiotaomicron padermė ir jos panaudojimas uždegimo sumažinimui
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
MA41060B1 (fr) 2015-06-15 2019-11-29 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
PL3307288T3 (pl) * 2015-06-15 2019-12-31 4D Pharma Research Limited Kompozycje zawierające szczepy bakteryjne
MA41010B1 (fr) 2015-06-15 2020-01-31 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
SG10201912323VA (en) 2015-06-15 2020-02-27 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
SMT202200174T1 (it) 2015-06-15 2022-05-12 4D Pharma Res Limited Composizioni comprendenti ceppi batterici
HK1254843B (zh) 2015-11-20 2020-04-17 希杰生物科技株式会社 包含细菌菌株的组合物
GB201520497D0 (en) 2015-11-20 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
GB201520638D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
GB201520631D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
US10086024B2 (en) 2015-11-30 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
US10568916B2 (en) 2015-11-30 2020-02-25 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
US11529412B2 (en) 2015-11-30 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for protecting honey bees from pesticides
US10933128B2 (en) 2015-11-30 2021-03-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from pesticides
US10675347B2 (en) 2015-11-30 2020-06-09 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from fipronil pesticides
US12239706B2 (en) 2015-11-30 2025-03-04 Seed Health, Inc. Method and system for protecting monarch butterflies from pesticides
US11504404B2 (en) 2016-02-24 2022-11-22 Crown Laboratories, Inc. Skin probiotic formulation
EP3520801A1 (en) 2016-03-04 2019-08-07 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial blautia strains for treating visceral hypersensitivity
GB201612191D0 (en) 2016-07-13 2016-08-24 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial strains
TWI802545B (zh) 2016-07-13 2023-05-21 英商４Ｄ製藥有限公司 包含細菌菌株之組合物
US11401332B2 (en) * 2016-08-23 2022-08-02 The Regents Of The University Of California Proteolytically cleavable chimeric polypeptides and methods of use thereof
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
WO2018088933A1 (en) * 2016-11-14 2018-05-17 Limited Liability Company "Panacela Labs" Anti-tumor effects of a viral vector encoding a toll-like receptor and a toll-like receptor agonist
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
GB201621123D0 (en) 2016-12-12 2017-01-25 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial strains
WO2018136702A1 (en) 2017-01-23 2018-07-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 13 (hsd17b13) variants and uses thereof
US11666627B2 (en) 2017-04-07 2023-06-06 Second Genome, Inc. Proteins for the treatment of epithelial barrier function disorders
KR20200003821A (ko) 2017-04-07 2020-01-10 세컨드 게놈, 아이엔씨. 상피 장벽 기능 장애 치료용 단백질
EP3610029A1 (en) 2017-04-11 2020-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assays for screening activity of modulators of members of the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase (hsd17b) family
JP7212945B2 (ja) 2017-05-22 2023-01-26 フォーディー ファーマ リサーチ リミテッド 細菌株を含む組成物
EP3630942B1 (en) 2017-05-24 2022-11-30 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strain
TWI767013B (zh) 2017-06-14 2022-06-11 英商4D製藥研究有限公司 包含細菌品系之組成物
MA49373B1 (fr) 2017-06-14 2021-02-26 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
MA49425A (fr) 2017-06-14 2020-04-22 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
JP7033655B2 (ja) * 2017-09-28 2022-03-10 コバイオラブス，インコーポレーテッド 短鎖脂肪酸生成腸内細菌群集の変化を用いたアルコール性肝疾患の診断および治療用組成物
CN111183234A (zh) 2017-10-11 2020-05-19 雷杰纳荣制药公司 在表达pnpla3 i148m变异的患者的肝病治疗中对hsd17b13的抑制
CA3088338A1 (en) 2018-01-19 2019-07-25 4D Pharma Research Limited Combination therapy for treating or preventing cancer
CN111902153A (zh) 2018-01-19 2020-11-06 4D制药研究有限公司 用于治疗或预防癌症的组合疗法
MX2020007671A (es) 2018-01-19 2020-09-14 4D Pharma Res Limited Terapia de combinacion para tratar o prevenir el cancer.
WO2019141997A1 (en) 2018-01-19 2019-07-25 4D Pharma Research Limited Combination therapy for treating or preventing cancer
CN108159397A (zh) * 2018-02-28 2018-06-15 中南大学湘雅三医院 一种肠罗斯氏菌重组鞭毛蛋白在制备防治炎症性肠病药物中的应用
WO2019180051A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
BR112020018758A2 (pt) 2018-03-21 2021-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. agente de ácido ribonucleico de fita dupla, célula, vetor, composição farmacêutica, e, métodos para inibição da expressão de 17¿-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13, para tratamento de um indivíduo, para prevenção de um sintoma em um indivíduo, para redução do risco de desenvolver doença hepática crônica, para inibição da progressão de esteatose, para inibição do acúmulo de gotículas de lipídios
WO2019195859A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-10 Second Genome, Inc. Proteins for the treatment of epithelial barrier function disorders
RS63273B1 (sr) 2018-05-11 2022-06-30 4D Pharma Res Ltd Kompozicije koje sadrže bakterijski soj
SG11202010958YA (en) * 2018-06-14 2020-12-30 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
HRP20210772T1 (hr) 2018-06-25 2021-09-17 4D Pharma Research Limited Pripravci koji sadrže bakterijske sojeve
KR20210032426A (ko) 2018-07-16 2021-03-24 4디 파마 리서치 리미티드 박테리아 균주를 포함하는 조성물
TW202023590A (zh) 2018-08-17 2020-07-01 英商4D製藥研究有限公司 包含細菌菌株之組合物
US12150967B2 (en) 2018-08-18 2024-11-26 Seed Health, Inc. Methods and compositions for honey bee health
WO2020058499A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
TW202027767A (zh) 2018-10-09 2020-08-01 英商4D製藥研究有限公司 包含細菌菌株之組合物
JP2022504423A (ja) 2018-10-19 2022-01-13 フォーディー ファーマ リサーチ リミテッド 細菌株を含む組成物
SG11202104258TA (en) 2018-11-02 2021-05-28 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
AU2019398763A1 (en) 2018-12-12 2021-07-08 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
TW202038978A (zh) 2018-12-12 2020-11-01 英商4D製藥研究有限公司 包含細菌菌株之組成物
EP3893906A1 (en) 2018-12-12 2021-10-20 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
WO2020197296A1 (ko) * 2019-03-28 2020-10-01 가톨릭대학교 산학협력단 플라젤린으로부터 유도된 tlr5 작용제를 유효성분으로 포함하는 이식편대숙주질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102524577B1 (ko) 2019-04-22 2023-04-21 전남대학교산학협력단 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
AU2020276670A1 (en) 2019-05-10 2021-12-09 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
CA3145904A1 (en) 2019-07-05 2021-01-14 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
WO2021057985A1 (zh) * 2019-09-27 2021-04-01 成都中医药大学 检测粪钙卫蛋白含量的试剂在制备子宫病变筛查试剂盒中的用途
KR20220118423A (ko) 2019-11-20 2022-08-25 4디 파마 리서치 리미티드 박테리아 균주를 포함하는 조성물
KR102215592B1 (ko) * 2019-12-11 2021-02-15 주식회사 에이치이엠 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 hem 1036 균주, 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 장내 환경 개선용 조성물
EP3838281A1 (en) 2019-12-20 2021-06-23 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
TW202140773A (zh) 2020-01-27 2021-11-01 英商4D製藥研究有限公司 包含細菌菌株之組成物
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
CA3183350A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Thomas M. Hitchcock Probiotic skin formulations
CA3208643A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof

Family Cites Families (358)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
FR2613624B1 (fr) 1987-04-10 1990-11-23 Roussy Inst Gustave Composition pharmaceutique, administrable par voie orale, destinee a reduire les effets des b-lactamines
DE68928665T2 (de) 1988-08-02 1998-11-12 Gastro Services Pty Ltd Behandlung von gastro-intestinalen krankheiten
US5443826A (en) 1988-08-02 1995-08-22 Borody; Thomas J. Treatment of gastro-intestinal disorders with a fecal composition or a composition of bacteroides and E. Coli
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
DE69107455T3 (de) 1990-05-09 2004-09-23 Novozymes A/S Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung.
GB9107305D0 (en) 1991-04-08 1991-05-22 Unilever Plc Probiotic
US5443951A (en) 1992-07-20 1995-08-22 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same
AU666443B2 (en) 1992-12-10 1996-02-08 Dsm N.V. Production of heterologous proteins in filamentous fungi
US5741665A (en) 1994-05-10 1998-04-21 University Of Hawaii Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi
US5599795A (en) 1994-08-19 1997-02-04 Mccann; Michael Method for treatment of idiopathic inflammatory bowel disease (IIBD)
AUPM823094A0 (en) 1994-09-16 1994-10-13 Goodman Fielder Limited Probiotic compositions
AUPM864894A0 (en) 1994-10-07 1994-11-03 Borody, Thomas Julius Treatment of bowel-dependent neurological disorders
RU2078815C1 (ru) 1995-01-17 1997-05-10 Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского Штамм бактерий bifidobacterium breve, используемый для получения бактерийных лечебно-профилактических бифидосодержащих препаратов
JPH08259450A (ja) 1995-03-17 1996-10-08 Nichinichi Seiyaku Kk インターフェロン産生増強剤
US6861053B1 (en) 1999-08-11 2005-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing or treating irritable bowel syndrome and other disorders caused by small intestinal bacterial overgrowth
AUPN698495A0 (en) 1995-12-06 1996-01-04 Pharma Pacific Pty Ltd Improved therapeutic formulation and method
SE508045C2 (sv) 1996-02-26 1998-08-17 Arla Ekonomisk Foerening Adhesionsinhibitorer, preparat innehållande desamma och förfarande för framställning därav
AUPN881396A0 (en) 1996-03-20 1996-04-18 Arnott's Biscuits Limited Enhancement of microbial colonization of the gastrointestinal tract
WO1997034591A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 The University Of New South Wales Alteration of microbial populations in the gastrointestinal tract
DK0894126T3 (da) 1996-03-27 2006-06-12 Novozymes As Alkalisk phosphatase-deficient trådformet svamp
US6033864A (en) 1996-04-12 2000-03-07 The Regents Of The University Of California Diagnosis, prevention and treatment of ulcerative colitis, and clinical subtypes thereof, using microbial UC pANCA antigens
SE9604322D0 (sv) 1996-11-25 1996-11-25 Astra Ab Bacterial antigens and vaccine compositions II
WO1998043081A1 (en) 1997-03-26 1998-10-01 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Treatment of gastrointestinal disease with ppar modulators
SE511524C2 (sv) 1997-06-02 1999-10-11 Essum Ab Lactobacillus casei rhamnosus-stam samt farmaceutisk beredning för bekämpning av patogena tarmbakterier
US5925657A (en) 1997-06-18 1999-07-20 The General Hospital Corporation Use of PPARγ agonists for inhibition of inflammatory cytokine production
AUPO758297A0 (en) 1997-06-27 1997-07-24 Rowe, James Baber Control of acidic gut syndrome
US5951977A (en) 1997-10-14 1999-09-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Competitive exclusion culture for swine
IT1298918B1 (it) 1998-02-20 2000-02-07 Mendes Srl Uso di batteri dotati di arginina deiminasi per indurre apoptosi e/o ridurre una reazione infiammatoria e composizioni farmaceutiche
DE19826928A1 (de) 1998-06-17 1999-12-23 Novartis Consumer Health Gmbh Arzneimittel, lebensfähige anaerobe Bakterien enthaltend, die die Sulfatreduktion sulfatreduzierender Bakterien hemmen
ID29150A (id) 1999-01-15 2001-08-02 Entpr Ireland Cs Penggunaan lactobacillus salivarius
US7090973B1 (en) 1999-04-09 2006-08-15 Oscient Pharmaceuticals Corporation Nucleic acid sequences relating to Bacteroides fragilis for diagnostics and therapeutics
DE60005973T2 (de) 1999-08-27 2004-05-13 Eli Lilly And Co., Indianapolis Biaryl-oxa(thia)zolderivate und ihre verwendung als ppars modulatoren
WO2001058276A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 F Hoffmann-La Roche Ag Use of acid-stable proteases in animal feed
FR2808689B1 (fr) 2000-05-11 2004-09-03 Agronomique Inst Nat Rech Utilisation de souches acetogenes hydrogenotrophes pour la prevention ou le traitement de troubles digestifs
US20020013270A1 (en) 2000-06-05 2002-01-31 Bolte Ellen R. Method for treating a mental disorder
AUPQ899700A0 (en) 2000-07-25 2000-08-17 Borody, Thomas Julius Probiotic recolonisation therapy
JP2004536557A (ja) 2000-11-27 2004-12-09 ワシントン・ユニバーシティ 哺乳動物の腸に対する共生ミクロフローラの効果を調べるための方法およびそれに基づく胃腸関連疾患の治療
DE10101793A1 (de) 2001-01-17 2002-08-01 Manfred Nilius Verwendung von SLPI zur Behandlung chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen
EP1227152A1 (en) 2001-01-30 2002-07-31 Société des Produits Nestlé S.A. Bacterial strain and genome of bifidobacterium
KR100437497B1 (ko) 2001-03-07 2004-06-25 주식회사 프로바이오닉 로타바이러스 및 유해 미생물 억제 활성을 가지는 신규내산성 락토바실러스 루테리 프로바이오-16 및 이를함유하는 생균활성제
EP1243273A1 (en) 2001-03-22 2002-09-25 Societe Des Produits Nestle S.A. Composition comprising a prebiotic for decreasing infammatory process and abnormal activation of non-specific immune parameters
EP1379552B2 (en) * 2001-04-20 2014-11-19 The Institute for Systems Biology Toll-like receptor 5 ligands and methods of use
EP1260227A1 (en) 2001-05-23 2002-11-27 Societe Des Produits Nestle S.A. Lipoteichoic acid from lactic acid bacteria and its use to modulate immune responses mediated by gram-negative bacteria, potential pathogenic gram-positive bacteria
US20030092163A1 (en) 2001-07-26 2003-05-15 Collins John Kevin Probiotic bifidobacterium strains
AU2002341384A1 (en) 2001-09-05 2003-03-24 Actial Farmaceutica, Lda. Lactic acid bacteria comprising unmethylated cytosine-guanine dinucleotides for use in therapy
GB0127916D0 (en) 2001-11-21 2002-01-16 Rowett Res Inst Method
WO2003045317A2 (en) 2001-11-27 2003-06-05 Washington University Therapeutic protein and treatments
DK2224012T3 (da) * 2001-12-17 2013-05-13 Corixa Corp Sammensætninger og fremgangsmåder til terapi og diagnose af inflammatoriske tarmsygdomme
US7101565B2 (en) 2002-02-05 2006-09-05 Corpak Medsystems, Inc. Probiotic/prebiotic composition and delivery method
DE10206995B4 (de) 2002-02-19 2014-01-02 Orthomol Pharmazeutische Vertriebs Gmbh Mikronährstoffkombinationsprodukt mit Pro- und Prebiotika
JP2003261453A (ja) 2002-03-11 2003-09-16 Nippon Berumu Kk Ｅ．フェカリスからなる抗腫瘍剤及び放射線防護剤
US20040057943A1 (en) 2002-06-28 2004-03-25 Jordi Xaus Pey Probiotic strains, a process for the selection of them, compositions thereof, and their use
US20040005304A1 (en) 2002-07-08 2004-01-08 Mak Wood, Inc. Novel compositions and methods for treating neurological disorders and associated gastrointestinal conditions
GB0307026D0 (en) 2003-03-27 2003-04-30 Rowett Res Inst Bacterial supplement
EP1481681A1 (en) 2003-05-30 2004-12-01 Claudio De Simone Lactic acid bacteria combination and compositions thereof
GB0316915D0 (en) 2003-07-18 2003-08-20 Glaxo Group Ltd Compounds
AU2003247193A1 (en) 2003-07-23 2005-02-04 M.D.Lab Corp. Acid tolerant probiotic lactobacillus plantarum probio-38 that can suppress the growth of pathogenic microorganism and tge coronavirus
US7485325B2 (en) 2003-08-06 2009-02-03 Gayle Dorothy Swain Animal food supplement compositions and methods of use
JP4683881B2 (ja) 2003-08-27 2011-05-18 有限会社アーク技研 抗腫瘍活性剤
US8192733B2 (en) 2003-08-29 2012-06-05 Cobb & Associates Probiotic composition useful for dietary augmentation and/or combating disease states and adverse physiological conditions
US20050163764A1 (en) * 2003-09-22 2005-07-28 Yale University Treatment with agonists of toll-like receptors
GB0323039D0 (en) 2003-10-01 2003-11-05 Danisco Method
DE602004017885D1 (de) 2003-10-24 2009-01-02 Nutricia Nv Symbiotische zusammensetzung für kleinkinder
US20050239706A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Washington University In St. Louis Modulation of fiaf and the gastrointestinal microbiota as a means to control energy storage in a subject
RU2407784C2 (ru) 2003-12-17 2010-12-27 Н.В. Нютрисиа Пробиотический штамм lactobacillus casei, продуцирующий молочную кислоту, применение штамма для приготовления питательной композиции для лечения или профилактики легочной дисфункции, питательная композиция и способ ее получения, лекарственное средство для лечения или профилактики хронической обструктивной болезни легких у субъекта и применение штамма для приготовления лекарственного средства, контейнер
ES2235642B2 (es) 2003-12-18 2006-03-01 Gat Formulation Gmbh Proceso de multi-microencapsulacion continuo para la mejora de la estabilidad y almacenamiento de ingredientes biologicamente activos.
CA2557800A1 (en) 2004-03-22 2005-10-06 Yossef Raviv Cellular and viral inactivation
EP1755668A2 (en) * 2004-05-07 2007-02-28 Hans-Gustaf Ljunggren Adjuvants
US7638513B2 (en) 2004-06-02 2009-12-29 Schering Corporation Compounds for the treatment of inflammatory disorders
PE20060426A1 (es) 2004-06-02 2006-06-28 Schering Corp DERIVADOS DE ACIDO TARTARICO COMO INHIBIDORES DE MMPs, ADAMs, TACE Y TNF-alfa
PL1765391T3 (pl) 2004-06-07 2013-08-30 Qu Biologics Inc Kompozycje bakteryjne do leczenia nowotworów
EP1629850B2 (en) 2004-08-24 2013-05-22 N.V. Nutricia Nutritional composition comprising indigestible transgalactooligosaccharides and digestible galactose saccharides
US20060062742A1 (en) 2004-09-21 2006-03-23 The Procter & Gamble Company Compositions for reduction of human malodor
KR100468522B1 (ko) 2004-10-12 2005-01-31 주식회사 프로바이오닉 코로나바이러스와 돼지 써코바이러스 2형의 생육을 억제하는 신규한 내산성 프로바이오틱 엔테로코커스훼시움 프로바이오-63
US20060115465A1 (en) 2004-10-29 2006-06-01 Macfarlane George Treatment of gastrointestinal disorders
ITMI20042189A1 (it) 2004-11-16 2005-02-16 Anidral Srl Composizione a base di batteri probiotici e suo uso nella prevenzione e-o nel trattamento di patologie e-o infezioni respiratorie e nel miglioramento della funzionalita' intestinale
WO2006091103A2 (en) 2005-02-28 2006-08-31 N.V. Nutricia Nutritional composition with probiotics
WO2006102536A2 (en) 2005-03-23 2006-09-28 University Of Southern California Treatment of disease conditions through modulation of hydrogen sulfide produced by small intestinal bacterial overgrowth
US20100048595A1 (en) 2005-03-23 2010-02-25 Washington University In St. Louis Use of archaea to modulate the nutrient harvesting functions of the gastrointestinal microbiota
JP2006265212A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Institute Of Physical & Chemical Research Ｉｌ−２１産生誘導剤
US20100233312A9 (en) 2005-04-11 2010-09-16 The Procter & Gamble Company Compositions comprising probiotic and sweetener components
EP1714660A1 (en) 2005-04-21 2006-10-25 N.V. Nutricia Uronic acid and probiotics
WO2006114778A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Teagasc- The Agriculture And Food Development Authority Probiotic composition suitable for animals
EP2439273B1 (en) 2005-05-09 2019-02-27 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
US7572474B2 (en) 2005-06-01 2009-08-11 Mead Johnson Nutrition Company Method for simulating the functional attributes of human milk oligosaccharides in formula-fed infants
US8075934B2 (en) 2008-10-24 2011-12-13 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional composition with improved digestibility
JP2007084533A (ja) 2005-08-24 2007-04-05 Prima Meat Packers Ltd 免疫応答調節組成物及び該組成物を有効成分とする食品
US7625704B2 (en) 2005-08-31 2009-12-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for identifying bacteria associated with bacteria vaginosis
EP2116258A1 (en) 2005-09-01 2009-11-11 Schering Corporation Use of IL-23 and IL-17 antagonists to treat autoimmune ocular inflammatory disease
US20090028840A1 (en) 2005-09-23 2009-01-29 Gwangju Institute Of Sciecne And Technology Compositions For Preventing Or Treating Arthritis Comprising Lactic Acid Bacteria and Collangen As Active Ingredients
EP1776877A1 (en) 2005-10-21 2007-04-25 N.V. Nutricia Method for stimulating the intestinal flora
JP5030960B2 (ja) 2005-10-24 2012-09-19 ネステク ソシエテ アノニム 食物繊維製剤及び投与方法
JP2007116991A (ja) 2005-10-28 2007-05-17 Eternal Light General Institute Inc 機能性食品
US7767420B2 (en) 2005-11-03 2010-08-03 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Heparan sulfate glycosaminoglycan lyase and uses thereof
US7553864B2 (en) 2005-12-01 2009-06-30 Schering Corporation Compounds for the treatment of inflammatory disorders and microbial diseases
US8889149B2 (en) 2006-02-16 2014-11-18 Wayne State University Use of flagellin to prevent and treat gram negative bacterial infection
US20080260898A1 (en) 2006-03-17 2008-10-23 Marko Stojanovic Compositions comprising probiotic and sweetener components
JP5031249B2 (ja) 2006-03-22 2012-09-19 学校法人北里研究所 炎症抑制作用のある菌体含有組成物
EP2040724B1 (en) 2006-05-18 2011-10-05 Biobalance Llc Biotherapeutic compositions comprising probiotic escherichia coli and metronidazole and uses thereof
US8815312B2 (en) 2006-05-26 2014-08-26 Nestec S.A. Methods of use and nutritional compositions of Touchi Extract
CA2654457A1 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Mcgill University Fermented milk product and use thereof
TW200819540A (en) 2006-07-11 2008-05-01 Genelux Corp Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders
ES2525223T3 (es) 2006-08-04 2014-12-19 Shs International Ltd. Fórmula sin proteínas
WO2008031438A2 (en) 2006-09-13 2008-03-20 Region Hovedstaden V/Gentofte Hospital Treatment of asthma, eczema and/or allergy using non-pathogenic organisms
US20080069861A1 (en) 2006-09-19 2008-03-20 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Probiotic/Non-Probiotic Combinations
US20100168410A1 (en) 2006-10-27 2010-07-01 Pfizer Products Inc. Hydroxypropyl Methyl Cellulose Hard Capsules and Process of Manufacture
US20080118473A1 (en) 2006-11-01 2008-05-22 The Procter & Gamble Company Methods of treating a respiratory condition comprising probiotic treatment
PL1920781T3 (pl) 2006-11-10 2015-06-30 Glycotope Gmbh Kompozycje zawierające core-1-dodatnie mikroorganizmy i ich zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce nowotworów
WO2008064489A1 (en) 2006-12-01 2008-06-05 Mcmaster University Probiotics to inhibit inflammation
WO2008076696A2 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Washington University In St. Louis The gut microbiome as a biomarker and therapeutic target for treating obesity or an obesity related disorder
DE102006062250A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Roland Saur-Brosch Verwendung einer Zusammensetzung aus Mineralstoffen und/oder Vitaminen und gegebenenfalls acetogenen und/oder butyrogenen Bakterien zur oralen oder rektalen Verabreichung für die Behandlung und Vorbeugung von abdominalen Beschwerden
WO2008083157A2 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Washington University In St. Louis Altering pgc-1alapha, ampk, fiaf, or the gastrointestinal microbiota as a means to modulate body fat and/or weight loss in a subject
JP2008195635A (ja) 2007-02-09 2008-08-28 Crossfield Bio Inc 馬用乳酸菌製剤
RU2468808C2 (ru) 2007-02-28 2012-12-10 Мид Джонсон Нутришен Компани Способ лечения или предотвращения системного воспаления
CA2682327A1 (en) 2007-03-28 2008-10-02 Alimentary Health Limited Probiotic bifidobacterium strains
WO2008117266A2 (en) 2007-03-28 2008-10-02 Alimentary Health Limited Probiotic bifidobacterium strains
AU2008245685B2 (en) 2007-04-24 2013-06-27 Kemin Industries, Inc. Broad-spectrum antibacterial and antifungal activity of Lactobacillus johnsonii D115
EP1997499A1 (en) 2007-05-31 2008-12-03 Puleva Biotech, S.A. Mammalian milk microorganisms, compositions containing them and their use for the treatment of mastitis
EP1997907A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 Friesland Brands B.V. Bifidobacteria
EP1997906A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 Friesland Brands B.V. Lactobacillus
EP1997905A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 Friesland Brands B.V. Nucleic acid amplification
WO2008153377A1 (en) 2007-06-15 2008-12-18 N.V. Nutricia Nutrition with non-viable bifidobacterium and non-digestible oligosaccharide
WO2009000899A1 (en) 2007-06-27 2008-12-31 Laboratorios Ordesa, S.L. A novel strain of bifidobacterium and active peptides against rotavirus infections
HUP0700552A2 (en) 2007-08-27 2009-03-30 Janos Dr Feher Method and composition inhibiting inflammation
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
US20100284979A1 (en) 2007-10-01 2010-11-11 University College Cork, National University Of Ireland, Cork Modulation of Tissue Fatty Acid Composition of a Host by Human Gut Bacteria
DK2203551T3 (da) 2007-10-20 2013-10-28 Univ Liege Bifidobakterieart
US9371510B2 (en) 2007-10-26 2016-06-21 Brenda E. Moore Probiotic compositions and methods for inducing and supporting weight loss
EP2205642B1 (en) 2007-11-02 2016-01-27 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Non-anticoagulant polysaccharide compositions
EP2065048A1 (en) 2007-11-30 2009-06-03 Institut Pasteur Use of a L. casei strain, for the preparation of a composition for inhibiting mast cell activation
EP2356992B1 (en) 2007-12-07 2017-08-16 N.V. Nutricia Bifidobactrium for dust mite allergy
US20100330190A1 (en) 2007-12-17 2010-12-30 Compans Richard W Immunogenic compositions and methods of use thereof
ES2343499B1 (es) 2007-12-24 2011-06-10 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Microorganismos para mejorar el estado de salud de individuos con desordenes relacionados con la ingesta de gluten.
WO2009100331A2 (en) 2008-02-06 2009-08-13 The Procter & Gamble Company Compositions methods and kits for enhancing immune response to a respiratory condition
EP2103226A1 (en) 2008-03-18 2009-09-23 Friesland Brands B.V. Long-life probiotic food product
AU2009236585B2 (en) * 2008-04-18 2013-03-07 Vaxinnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
JP2011520435A (ja) 2008-05-13 2011-07-21 グリコトープ ゲーエムベーハー 発酵プロセス
MX2008006546A (es) 2008-05-21 2009-11-23 Sigma Alimentos Sa De Cv Bifidobacteria productora de ácido fólico, composición alimenticia y uso de la bifidobacteria.
CN101590081A (zh) 2008-05-28 2009-12-02 青岛东海药业有限公司 凸腹真杆菌和两形真杆菌制剂及其应用
CN102940652B (zh) 2008-05-28 2015-03-25 青岛东海药业有限公司 两形真杆菌制剂及其应用
US8586029B2 (en) 2008-06-04 2013-11-19 Trustees Of Dartmouth College Prevention or treatment of immune-relevant disease by modification of microfloral populations
EP2133088A3 (en) 2008-06-09 2010-01-27 Nestec S.A. Rooibos and inflammation
WO2009151315A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 N.V. Nutricia Nutritional composition for infants delivered via caesarean section
WO2009154463A2 (en) 2008-06-20 2009-12-23 Stichting Top Institute Food And Nutrition Butyrate as a medicament to improve visceral perception in humans
EP2138186A1 (en) 2008-06-24 2009-12-30 Nestec S.A. Probiotics, secretory IgA and inflammation
WO2010002241A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 N.V. Nutricia Nutritional composition for infants delivered via caesarean section
KR101017448B1 (ko) 2008-09-18 2011-02-23 주식회사한국야쿠르트 대장의 건강 증진 효능을 갖는 비피도박테리움 롱검 에이취와이8004 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
US8137718B2 (en) 2008-09-19 2012-03-20 Mead Johnson Nutrition Company Probiotic infant products
US20100074870A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Probiotic infant products
KR101057357B1 (ko) 2008-09-22 2011-08-17 광주과학기술원 유산균 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물
US9603876B2 (en) 2008-09-25 2017-03-28 New York University Compositions and methods for restoring gastrointestinal microbiota following antibiotic treatment
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2010037402A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
BRPI0922296A2 (pt) 2008-12-05 2015-08-11 Nestec Sa Composições para o uso em recém-nascidos com baixo peso no nascimento.
MX2011006701A (es) 2008-12-19 2011-07-28 Nestec Sa Prevencion y tratamiento de diarrea por rotavirus.
IT1392672B1 (it) 2009-01-12 2012-03-16 Wyeth Consumer Healthcare S P A Composizioni comprendenti componenti probiotici e prebiotici e sali minerali, con lactoferrina
TW201613969A (en) 2009-03-05 2016-04-16 Abbvie Inc IL-17 binding proteins
JP5710876B2 (ja) 2009-03-26 2015-04-30 クロスフィールドバイオ株式会社 新規ビフィドバクテリウム属微生物およびその利用
MX2011011659A (es) 2009-05-07 2012-02-28 Tate & Lyle Ingredients France SAS Composiciones y metodos para elaborar alfa-(1,6) oligodextranos ramificados en alfa-(1,2).
EP2251020A1 (en) 2009-05-11 2010-11-17 Nestec S.A. Short-time high temperature treatment generates microbial preparations with anti-inflammatory profiles
MX338680B (es) 2009-05-11 2016-04-27 Nestec Sa Bifidobacterium longum ncc2705 (cncm i-2618) y padecimientos inmunes.
EP2251022A1 (en) 2009-05-11 2010-11-17 Nestec S.A. Non-replicating micro-organisms and their immune boosting effect
KR20100128168A (ko) 2009-05-27 2010-12-07 중앙대학교 산학협력단 공액 리놀레산 생산능이 우수한 신규한 균주
US20100311686A1 (en) 2009-06-03 2010-12-09 Kasper Lloyd H Nutraceutical composition and methods for preventing or treating multiple sclerosis
WO2010143940A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 N.V. Nutricia Synergistic mixture of beta-galacto-oligosaccharides with beta-1,3 and beta-1,4/1,6 linkages
EP2443259A4 (en) 2009-06-16 2012-10-10 Univ Columbia BIOMARKERS ASSOCIATED WITH AUTISM AND USES THEREOF
WO2011005756A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Puretech Ventures, Llc Delivery of agents targeted to microbiota niches
WO2011011094A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Dowd Scot E Universal microbial diagnosis, detection, quantification, and specimen-targeted therapy
SG178167A1 (en) 2009-08-18 2012-03-29 Nestec Sa A nutritional composition comprising bifidobacterium longum strains and reducing food allergy symptoms, especially in infants and children
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
JP2013505289A (ja) 2009-09-23 2013-02-14 トーマス・ジュリアス・ボロディ 腸管感染症の治療法
EP2308498A1 (en) 2009-09-30 2011-04-13 Nestec S.A. Administration of Bifidobacterium breve during infancy to prevent inflammation later in life
CA2776420A1 (en) 2009-10-05 2011-04-14 Aak Patent B.V. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
EP3144004A1 (en) 2009-10-06 2017-03-22 Scott Dorfner Antibiotic formulations providing reduced gastrointestinal side effects and clostridium difficile infection relapse, and related methods
PL2498789T3 (pl) 2009-11-11 2017-01-31 Alimentary Health Limited Probiotyczny szczep bifidobacterium
BR112012013571A2 (pt) 2009-12-18 2015-09-15 Hills Pet Nutrition Inc composições alimentares para animais de estimação,incluindo probióticos e os métodos de fabricação e á sua uitlização.
US20150104418A1 (en) 2014-12-18 2015-04-16 Microbios, Inc. Bacterial composition
FR2955774A1 (fr) 2010-02-02 2011-08-05 Aragan Preparation destinee a traiter l'exces ponderal et les desordres associes et applications de ladite preparation
NL2004201C2 (en) 2010-02-05 2011-08-08 Friesland Brands Bv Use of sialyl oligosaccharides to modulate the immune system.
NL2004200C2 (en) 2010-02-05 2011-08-08 Friesland Brands Bv Use of sialyl oligosaccharides in weight management.
IT1398553B1 (it) 2010-03-08 2013-03-01 Probiotical Spa Composizione comprendente batteri probiotici per il trattamento di patologie associate con le alterazioni del sistema immunitario.
JP5737646B2 (ja) 2010-03-24 2015-06-17 森下仁丹株式会社 抗アレルギー剤
WO2011121379A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Assistance Publique - Hopitaux De Paris Use of bifidobacteria for preventing allergy in breastfed infants
US8951512B2 (en) 2010-05-04 2015-02-10 New York University Methods for treating bone disorders by characterizing and restoring mammalian bacterial microbiota
WO2011149335A1 (en) 2010-05-25 2011-12-01 N.V. Nutricia Immune imprinting nutritional composition
AU2011261528A1 (en) 2010-06-01 2013-01-10 Moore Research Enterprises Llc Cellular constituents from Bacteroides, compositions thereof, and therapeutic methods employing Bacteroides or cellular constituents thereof
WO2011151941A1 (ja) 2010-06-04 2011-12-08 国立大学法人東京大学 制御性ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物
TWI417054B (zh) 2010-06-15 2013-12-01 Jen Shine Biotechnology Co Ltd 新穎糞腸球菌ｌｊｓ－０１及其益生用途
EP2397145A1 (en) 2010-06-18 2011-12-21 Nestec S.A. L. johnsonii La1, B. longum NCC2705 and immune disorders
FR2962045B1 (fr) 2010-07-05 2012-08-17 Bifinove Complexe macromoleculaire d'origine bacterienne et utilisation dudit complexe moleculaire pour prevenir et traiter les rhumatismes inflammatoires
TWI401086B (zh) 2010-07-20 2013-07-11 Univ China Medical 胚芽乳酸桿菌及其用途
SG10201604175XA (en) 2010-07-26 2016-07-28 Qu Biolog Inc Immunogenic anti-inflammatory compositions
EP3424515A3 (en) 2010-08-04 2019-06-19 Thomas Julius Borody Stool collection devices and methods for using them
US9386793B2 (en) 2010-08-20 2016-07-12 New York University Compositions and methods for treating obesity and related disorders by characterizing and restoring mammalian bacterial microbiota
KR101250463B1 (ko) 2010-10-12 2013-04-15 대한민국 신생아 분변에서 분리한 내산소성 비피도박테리움 롱검 비피더스 유산균 및 이를 이용한 프로바이오틱 조성물
JP2013544507A (ja) 2010-10-27 2013-12-19 カンティバクト・アクティーゼルスカブ インターカレータ分子を含むプローブによる標的ｄｎａ及びｒｎａの捕捉
CN102031235B (zh) 2010-11-09 2012-07-25 中国农业大学 一种粪肠球菌anse228及其应用
EP2455092A1 (en) 2010-11-11 2012-05-23 Nestec S.A. Non-replicating probiotic micro-organisms protect against upper respiratory tract infections
US20120128644A1 (en) 2010-11-24 2012-05-24 Oragenics, Inc. Use of Bacteria to Treat and Prevent Respiratory Infections
CN102093967B (zh) 2010-12-02 2013-01-30 中国农业科学院特产研究所 一株水貂源屎肠球菌及其应用
ES2389547B1 (es) 2010-12-07 2013-08-08 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Bifidobacterium cect 7765 y su uso en la prevención y/o tratamiento del sobrepeso, la obesidad y patologías asociadas.
CN103476458B (zh) 2011-01-10 2017-02-15 克利夫兰生物实验室公司 Toll样受体激动剂治疗癌症的用途
PT2481299T (pt) 2011-01-31 2017-03-08 Synformulas Gmbh Estirpes de bifidobacterium bifidum para aplicação em doenças gastrointestinais
JP5840368B2 (ja) 2011-02-02 2016-01-06 カルピス株式会社 関節炎予防改善用物質
LT2672980T (lt) 2011-02-09 2018-03-12 Lavivo Ab Simbiozinės kompozicijos žarnyno mikrobiotos atkūrimui ir rekonstrukcijai
EP2683390B1 (en) 2011-03-09 2017-05-03 Regents Of The University Of Minnesota Compositions and methods for transplantation of colon microbiota
BRPI1100857A2 (pt) 2011-03-18 2013-05-21 Alexandre Eduardo Nowill agente imunomodulador e suas combinaÇÕes, seu uso e mÉtodo imunoterÁpico para a recontextualizaÇço, reprogramaÇço e reconduÇço do sistema imune em tempo real
WO2012140636A1 (en) 2011-04-11 2012-10-18 Alimentary Health Limited A probiotic formulation
WO2012142605A1 (en) 2011-04-15 2012-10-18 Samaritan Health Services Rapid recolonization deployment agent
JP2014512388A (ja) 2011-04-20 2014-05-22 マイコ・バイオ，インコーポレーテッド 免疫反応を増進するための組成物および方法
EP2707379A4 (en) 2011-05-13 2014-10-08 Glycosyn LLC USE OF PURIFIED 2'-FUCOSYLLACTOSIS, 3-FUCOSYLLACTOSIS AND LACTODIFUCOTETRAOSE AS PREBIOTICS
KR20120133133A (ko) 2011-05-30 2012-12-10 한국 한의학 연구원 생약 추출물 또는 이의 유산균 발효물을 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물
US20140171339A1 (en) 2011-06-06 2014-06-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and kits for detecting adenomas, colorectal cancer, and uses thereof
GB201110095D0 (en) 2011-06-15 2011-07-27 Danisco Method of treatment
JP2013005759A (ja) 2011-06-24 2013-01-10 Kyodo Milk Industry Co Ltd マウス腸内菌叢の推測方法
JP6222626B2 (ja) 2011-07-07 2017-11-01 長岡香料株式会社 フルクトース吸収阻害剤
WO2013008102A2 (en) 2011-07-14 2013-01-17 R.E.D. Laboratories N.V../ S.A. Methods and compositions for evaluating and/or treating chronic immune diseases
GB201112091D0 (en) 2011-07-14 2011-08-31 Gt Biolog Ltd Bacterial strains isolated from pigs
US20130022575A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Microbial Rx Systems and methods of replacing intestinal flora
CN102304483A (zh) 2011-08-12 2012-01-04 北京金泰得生物科技股份有限公司 一株饲用屎肠球菌及其应用
KR101261872B1 (ko) 2011-08-23 2013-05-14 대한민국 (식품의약품안전처장) 장내 미생물 효소복합체 및 이의 제조방법
ES2662793T3 (es) 2011-09-14 2018-04-09 Nubiyota Llc Complementos de medio y métodos para cultivar microorganismos anaerobios gastrointestinales humanos
GB201117313D0 (en) 2011-10-07 2011-11-16 Gt Biolog Ltd Bacterium for use in medicine
ES2582284T3 (es) 2011-10-11 2016-09-12 Achim Biotherapeutics Ab Composición que comprende microbiota intestinal humana anaeróbicamente cultivada
CN103082292B (zh) 2011-11-02 2015-03-04 深圳华大基因研究院 罗斯氏菌(Roseburia)在治疗和预防肥胖相关疾病中的应用
CN102373172B (zh) 2011-11-03 2013-03-20 北京龙科方舟生物工程技术有限公司 一株屎肠球菌及其应用
ES2993669T3 (en) 2011-12-01 2025-01-03 Univ Tokyo Human-derived bacteria that induce proliferation or accumulation of regulatory t cells
ES2408279B1 (es) 2011-12-15 2014-09-09 Universidad De Las Palmas De Gran Canaria Bacteria acido láctica probiótica
ITBG20120010A1 (it) 2012-02-24 2013-08-25 Milano Politecnico Dispositivo per l'addestramento chirurgico
ITMI20120471A1 (it) 2012-03-26 2013-09-27 Giovanni Mogna Composizione a base di ceppi di batteri bifidobacterium longum in grado di aiutare il prolungamento della vita
JP5792105B2 (ja) 2012-03-27 2015-10-07 森永乳業株式会社 ラクト−ｎ−ビオースｉの製造方法
EP2832859B1 (en) 2012-03-30 2018-07-25 Ajinomoto Co., Inc. Diabetes-inducible bacterium
US20130280724A1 (en) 2012-04-11 2013-10-24 Nestec Sa Methods for diagnosing impending diarrhea
GB201206599D0 (en) 2012-04-13 2012-05-30 Univ Manchester Probiotic bacteria
WO2013154725A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Trustees Of Boston College Prebiotic compositions and methods of use
WO2013171515A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Genome Research Limited Methods and groups
ES2436251B1 (es) 2012-05-25 2014-10-08 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Bacteroides cect 7771 y su uso en la prevención y tratamiento de sobrepeso, obesidad y alteraciones metabólicas e inmunológicas.
JP6436580B2 (ja) 2012-06-04 2018-12-12 ガウラブ アグラーワル， クローン病および関連する状態および感染症を処置するための組成物および方法
CN102743420A (zh) 2012-06-06 2012-10-24 上海交通大学 改善肠道菌群结构的方法及应用
EP2864355B1 (en) 2012-06-25 2016-10-12 Orega Biotech Il-17 antagonist antibodies
EP2879523B1 (en) 2012-07-31 2016-11-16 Nestec S.A. Nutritional composition for promoting musculoskeletal health in patients with inflammatory bowel disease (ibd)
US20150211053A1 (en) 2012-08-01 2015-07-30 Bgi-Shenzhen Biomarkers for diabetes and usages thereof
HK1212222A1 (en) 2012-08-29 2016-06-10 Salix Pharmaceuticals, Inc. Laxative compositions and methods for treating constipation and related gastrointestinal diseases and conditions
EP2890808A4 (en) 2012-08-29 2016-09-28 California Inst Of Techn DIAGNOSIS AND TREATMENT OF AUTISTICAL DISEASES
WO2014043593A2 (en) 2012-09-13 2014-03-20 Massachusetts Institute Of Technology Programmable drug delivery profiles of tumor-targeted bacteria
KR101473058B1 (ko) 2012-09-19 2014-12-16 주식회사 쎌바이오텍 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물
CN103652322B (zh) 2012-09-21 2016-02-10 临沂思科生物科技有限公司 一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法
EP2904096A1 (en) 2012-10-03 2015-08-12 Metabogen AB Identification of a person having risk for atherosclerosis and associated diseases by the person's gut microbiome and the prevention of such diseases
FR2997091B1 (fr) 2012-10-22 2016-05-06 Fond Mediterranee Infection Utilisation d'un compose antioxydant pour la culture de bacteries sensibles a la tension en oxygene
CN104755092A (zh) 2012-10-30 2015-07-01 雀巢产品技术援助有限公司 用于递送协同免疫作用的包含微粒和益生菌的组合物
US9839657B2 (en) 2012-10-30 2017-12-12 Deerland Enzymes, Inc. Prebiotic compositions comprising one or more types of bacteriophage
WO2014070014A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Rijksuniversiteit Groningen Methods and compositions for stimulating beneficial bacteria in the gastrointestinal tract
WO2014075745A1 (en) 2012-11-19 2014-05-22 Université Catholique de Louvain Use of akkermansia for treating metabolic disorders
US8906668B2 (en) 2012-11-23 2014-12-09 Seres Health, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
PL3628161T3 (pl) 2012-11-23 2023-08-07 Seres Therapeutics, Inc. Synergistyczne kompozycje bakteryjne i sposoby ich wytwarzania oraz stosowanie
WO2014078911A1 (en) 2012-11-26 2014-05-30 Borody Thomas J Compositions for the restoration of a fecal microbiota and methods for making and using them
EP4299741A3 (en) 2012-12-12 2024-02-28 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP2898075B1 (en) 2012-12-12 2016-03-09 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
US20140193464A1 (en) 2013-01-08 2014-07-10 Imagilin Technology, Llc Effects of probiotics on humans and animals under environmental or biological changes
EP3904502A3 (en) 2013-02-04 2022-02-23 Seres Therapeutics, Inc. Compositions and methods
HK1219022A1 (zh) 2013-02-04 2017-03-24 Seres Therapeutics, Inc. 填充胃肠道的方法
EP2958575B1 (en) 2013-02-22 2019-04-03 The Regents of The University of California Composition comprising lactobaccilus johnsonii 456 and its use in treating or preventing diseases
US20160000838A1 (en) 2013-03-05 2016-01-07 Rijksuniversiteit Groningen Use of Faecalibacterium Prausnitzii Htf-f (DSM 26943) to Suppress Inflammation
HK1220495A1 (zh) 2013-03-14 2017-05-05 Seres Therapeutics, Inc. 从材料和组合物中检测和富集病原体的方法
RU2015140610A (ru) 2013-03-14 2017-04-17 ТЕРАБАЙОМ, ЭлЭлСи Направленная доставка в желудочно-кишечный тракт пробиотических микроорганизмов и/или терапевтических средств
US9669059B2 (en) 2013-03-15 2017-06-06 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Butyrogenic bacteria as probiotics to treat clostridium difficile
US10076546B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Seres Therapeutics, Inc. Network-based microbial compositions and methods
CN103156888A (zh) 2013-03-18 2013-06-19 广州知光生物科技有限公司 脆弱拟杆菌在制备治疗炎症性肠病组合物中的应用
CN103142656A (zh) 2013-03-18 2013-06-12 广州知光生物科技有限公司 脆弱拟杆菌在制备防治结肠癌组合物中的应用
CN103146620A (zh) 2013-03-25 2013-06-12 广州知光生物科技有限公司 具有益生菌特性的脆弱拟杆菌
JP2014196260A (ja) 2013-03-29 2014-10-16 公立大学法人奈良県立医科大学 慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療用組成物
GB201306536D0 (en) 2013-04-10 2013-05-22 Gt Biolog Ltd Polypeptide and immune modulation
JP2016521284A (ja) 2013-05-10 2016-07-21 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 大腸ガンのプロバイオティクスによる防止および処置
US9511099B2 (en) 2013-06-05 2016-12-06 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture
JP6330032B2 (ja) 2013-06-05 2018-05-23 レビオティクス インコーポレイテッドＲｅｂｉｏｔｉｘ，Ｉｎｃ． 微生物叢回復療法組成物を製造、処理、および梱包するための方法
WO2014201037A2 (en) 2013-06-10 2014-12-18 New York University Methods for manipulating immune responses by altering microbiota
WO2014200334A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 N.V. Nutricia Synbiotic composition for treatment of infections in allergic patients
WO2015003001A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 The Washington University Methods for identifying supplements that increase gut colonization by an isolated bacterial species, and compositions derived therefrom
WO2015003305A1 (zh) 2013-07-08 2015-01-15 吉瑞高新科技股份有限公司 电子烟盒
JP2016530239A (ja) 2013-07-09 2016-09-29 ピュアテック ベンチャーズ、エルエルシー 微生物叢由来生物活性分子の組み合わせを含む疾患治療用組成物
US10633714B2 (en) 2013-07-21 2020-04-28 Pendulum Therapeutics, Inc. Methods and systems for microbiome characterization, monitoring and treatment
US20160192689A1 (en) 2013-07-31 2016-07-07 Wikifoods, Inc. Encapsulated functional food compositions
WO2015021936A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 The University Of Hong Kong Method and compositions for treating cancer using probiotics cross-reference to related application
CN103509741B (zh) 2013-08-22 2015-02-18 河北农业大学 布劳特菌auh-jld56及其在牛蒡苷元转化中的应用
ITMI20131467A1 (it) 2013-09-06 2015-03-07 Sofar Spa Uso di una composizione comprendente microrganismi per aumentare la produzione intestinale di acido butirrico, di acido folico o di niacina e/o per diminuire la produzione intestinale di acido succinico
WO2015038731A1 (en) 2013-09-12 2015-03-19 The Johns Hopkins University Biofilm formation to define risk for colon cancer
CA2962736C (en) 2013-10-18 2021-08-31 Innovachildfood Ab A nutritionally balanced composite meal for infants and small children and a method of producing said meal
PL229020B1 (pl) 2013-11-13 2018-05-30 Inst Biotechnologii Surowic I Szczepionek Biomed Spolka Akcyjna Nowy szczep Bifidobacterium breve
WO2015077794A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 Seres Health, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
EP3082431A4 (en) 2013-12-16 2017-11-15 Seres Therapeutics, Inc. Bacterial compositions and methods of use thereof for treatment of immune system disorders
CN103981117B (zh) 2013-12-24 2018-10-26 北京大伟嘉生物技术股份有限公司 一株高抗逆性屎肠球菌及其培养方法和应用
CN103981115B (zh) 2013-12-24 2018-10-26 北京大伟嘉生物技术股份有限公司 一株高抗逆性屎肠球菌及其应用
CN103820363B (zh) 2014-01-27 2016-02-24 福建省农业科学院生物技术研究所 一种屎肠球菌菌粉的制备与应用
CN103865846B (zh) 2014-02-27 2016-03-30 扬州绿保生物科技有限公司 一种屎肠球菌及其制备方法
CN103849590B (zh) 2014-03-25 2016-07-06 上海交通大学 一株耐酸短双歧杆菌BB8dpH及其应用
KR101683474B1 (ko) 2014-03-26 2016-12-08 주식회사 쎌바이오텍 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물
US9783858B2 (en) 2014-04-02 2017-10-10 Northwestern University Altered microbiome of chronic pelvic pain
KR101583546B1 (ko) 2014-04-09 2016-01-11 국립암센터 유전자 다형성을 이용한 소라페닙 치료에 대한 반응성 예측방법
JP6617935B2 (ja) 2014-04-10 2019-12-11 国立研究開発法人理化学研究所 Ｔｈ１７細胞の誘導のための組成物及び方法
CN104195075B (zh) 2014-08-14 2017-04-19 生合生物科技股份有限公司 一种屎肠球菌ef08及包含它的饲料添加物和饲料
WO2015168534A1 (en) 2014-05-02 2015-11-05 Novogy, Inc. Therapeutic treatment of gastrointestinal microbial imbalances through competitive microbe displacement
ES2960598T3 (es) 2014-05-08 2024-03-05 Kiora Pharmaceuticals Gmbh Compuestos para el tratamiento de enfermedades y trastornos oftálmicos
CN106687130B (zh) 2014-08-05 2020-01-21 深圳华大基因科技有限公司 真杆菌属在预防和治疗结直肠癌相关疾病中的用途
WO2016033439A2 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Yale University Compositions and methods for the treating an inflammatory disease or disorder
US20160058808A1 (en) 2014-09-03 2016-03-03 California Institute Of Technology Microbe-based modulation of serotonin biosynthesis
CN104546935A (zh) 2014-09-30 2015-04-29 深圳华大基因科技有限公司 多形拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
CN104546934B (zh) 2014-09-30 2019-04-09 深圳华大基因科技有限公司 粪副拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
CN104546932A (zh) 2014-09-30 2015-04-29 深圳华大基因科技有限公司 卵形拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
CN104546940A (zh) 2014-09-30 2015-04-29 深圳华大基因科技有限公司 平常拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
CN104546942A (zh) 2014-09-30 2015-04-29 深圳华大基因科技有限公司 多氏拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
CN104546933A (zh) 2014-09-30 2015-04-29 深圳华大基因科技有限公司 粪拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
US10046030B2 (en) 2014-10-07 2018-08-14 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for preventing and treating infection
MX382478B (es) 2014-10-24 2025-03-13 Infinant Health Inc Bifidobacterias activadas y metodos de uso de las mismas.
KR102511878B1 (ko) 2014-10-30 2023-03-20 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 신경발달 장애에서의 행동을 개선하기 위한 박테리아를 포함하는 조성물 및 방법
BR112017009004A2 (pt) 2014-10-30 2017-12-19 California Inst Of Techn composições e métodos compreendendo bactérias para melhorar o comportamento em distúrbios do desenvolvimento neurológico
CN113730442A (zh) 2014-10-31 2021-12-03 潘德勒姆治疗公司 与病症的微生物治疗和诊断有关的方法和组合物
CN104435000A (zh) 2014-11-12 2015-03-25 江南大学 乳酸菌对支气管哮喘治疗中的应用
FI3223835T3 (fi) 2014-11-25 2025-06-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Suolen mikrobisto ja gvhd
MA41020A (fr) 2014-11-25 2017-10-03 Evelo Biosciences Inc Compositions probiotiques et prébiotiques, et leurs procédés d'utilisation pour la modulation du microbiome
EP3193901B1 (en) 2014-12-23 2018-04-04 4D Pharma Research Limited Pirin polypeptide and immune modulation
LT3065748T (lt) 2014-12-23 2018-03-12 4D Pharma Research Limited Bacteroides thetaiotaomicron padermė ir jos panaudojimas uždegimo sumažinimui
CN104560820B (zh) 2014-12-30 2017-10-20 杭州师范大学 屎肠球菌kq2.6及应用
EP3247342A4 (en) 2015-01-23 2018-10-10 Temple University - Of The Commonwealth System of Higher Education Use of short chain fatty acids in cancer prevention
CN105982919A (zh) 2015-02-26 2016-10-05 王汉成 生物减速剂抗癌技术
WO2016139217A1 (en) 2015-03-04 2016-09-09 Ab-Biotics, S.A. Composition comprising anaerobically cultivated human intestinal microbiota
SG11201707657UA (en) 2015-03-18 2017-10-30 Whole Biome Inc Methods and compositions relating to microbial treatment and diagnosis of skin disorders
WO2016149449A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Tufts University Compositions and methods for preventing colorectal cancer
EP3303401B1 (en) 2015-06-01 2024-10-16 The University of Chicago Treatment of cancer by manipulation of commensal microflora
MA41060B1 (fr) 2015-06-15 2019-11-29 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
SMT202200174T1 (it) 2015-06-15 2022-05-12 4D Pharma Res Limited Composizioni comprendenti ceppi batterici
MA41010B1 (fr) 2015-06-15 2020-01-31 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
SG10201912323VA (en) 2015-06-15 2020-02-27 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
PL3307288T3 (pl) 2015-06-15 2019-12-31 4D Pharma Research Limited Kompozycje zawierające szczepy bakteryjne
CN105112333A (zh) 2015-08-31 2015-12-02 江南大学 一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及筛选方法和应用
GB201520497D0 (en) 2015-11-20 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
HK1254843B (zh) 2015-11-20 2020-04-17 希杰生物科技株式会社 包含细菌菌株的组合物
GB201520638D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
GB201520631D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
CA3006105A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and compositions for reducing vancomycin-resistant enterococci infection or colonization
EP3520801A1 (en) 2016-03-04 2019-08-07 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial blautia strains for treating visceral hypersensitivity
TWI802545B (zh) 2016-07-13 2023-05-21 英商４Ｄ製藥有限公司 包含細菌菌株之組合物
GB201621123D0 (en) 2016-12-12 2017-01-25 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial strains
US20190314427A1 (en) 2016-12-16 2019-10-17 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating cancer using parabacteroides
WO2018112365A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating colorectal cancer and melanoma using parabacteroides goldsteinii
EP3630942B1 (en) 2017-05-24 2022-11-30 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strain
AR112328A1 (es) 2017-07-05 2019-10-16 Evelo Biosciences Inc Composiciones y métodos para tratamiento de cáncer usando bifidobacterium animalis ssp. lactis

Also Published As

Publication number Publication date
DK3318268T3 (da) 2021-12-20
PL3010523T3 (pl) 2018-05-30
PT3010523T (pt) 2018-03-08
EP3318268B1 (en) 2021-09-15
AU2019203688B2 (en) 2020-10-15
RU2682651C2 (ru) 2019-03-20
US20180072778A1 (en) 2018-03-15
LT3318268T (lt) 2021-11-10
EP3010523A1 (en) 2016-04-27
AU2014202021A1 (en) 2014-10-30
AU2014202021B2 (en) 2019-02-28
US11414463B2 (en) 2022-08-16
US10851137B2 (en) 2020-12-01
SMT202100690T1 (it) 2022-01-10
HRP20180360T1 (hr) 2018-04-20
DK3010523T3 (en) 2018-02-19
ME03020B (me) 2018-10-20
RU2015147864A (ru) 2017-05-12
CY1120177T1 (el) 2018-12-12
HUE036109T2 (hu) 2018-06-28
ES2898918T3 (es) 2022-03-09
JP2022050448A (ja) 2022-03-30
RU2015147864A3 (sr) 2018-04-25
JP6641262B2 (ja) 2020-02-05
NO3010523T3 (sr) 2018-04-28
BR112015025854A8 (pt) 2019-12-24
ES2660823T3 (es) 2018-03-26
US20210054031A1 (en) 2021-02-25
MX363015B (es) 2019-03-04
EP3318268A1 (en) 2018-05-09
GB201306536D0 (en) 2013-05-22
US20150071957A1 (en) 2015-03-12
AU2019203688A1 (en) 2019-06-20
HRP20211643T1 (hr) 2022-04-01
EP3010523B1 (en) 2017-11-29
JP2020075925A (ja) 2020-05-21
JP2016517848A (ja) 2016-06-20
CN105407908A (zh) 2016-03-16
CA2848725A1 (en) 2014-10-10
HUE056167T2 (hu) 2022-01-28
SI3318268T1 (sl) 2021-11-30
PL3318268T3 (pl) 2022-01-24
CY1124805T1 (el) 2022-11-25
SMT201800122T1 (it) 2018-05-02
RS62599B1 (sr) 2021-12-31
SI3010523T1 (en) 2018-06-29
WO2014167338A1 (en) 2014-10-16
TR201802752T4 (tr) 2018-03-21
HK1223289A1 (en) 2017-07-28
PT3318268T (pt) 2021-11-30
US9796762B2 (en) 2017-10-24
LT3010523T (lt) 2018-03-12
BR112015025854A2 (pt) 2017-07-25
MX2015014281A (es) 2017-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019203688B2 (en) Polypeptide and immune modulation
AU2017202497B2 (en) Bacterium for use as a probiotic for nutritional and medical applications
HK1247090A1 (en) Roseburia flagellin and immune modulation
HK1247090B (en) Roseburia flagellin and immune modulation
HK1223289B (en) Roseburia flagellin and immune modulation
HK1230077A1 (en) Bacterium for use as a probiotic for nutritional and medical applications
HK1230077A (en) Bacterium for use as a probiotic for nutritional and medical applications
HK1230077B (en) Bacterium for use as a probiotic for nutritional and medical applications