[go: up one dir, main page]

RS63273B1 - Kompozicije koje sadrže bakterijski soj - Google Patents

Kompozicije koje sadrže bakterijski soj

Info

Publication number
RS63273B1
RS63273B1 RS20220465A RSP20220465A RS63273B1 RS 63273 B1 RS63273 B1 RS 63273B1 RS 20220465 A RS20220465 A RS 20220465A RS P20220465 A RSP20220465 A RS P20220465A RS 63273 B1 RS63273 B1 RS 63273B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cancer
compositions
treatment
bacterial strain
certain embodiments
Prior art date
Application number
RS20220465A
Other languages
English (en)
Inventor
Imke Elisabeth MULDER
Parthena Fotiadou
Amy Beth HOLT
Suaad Ahmed
Anna Ettorre
Samantha Yuille
Ted Dinan
John Cryan
Original Assignee
4D Pharma Res Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1810386.1A external-priority patent/GB201810386D0/en
Priority claimed from GBGB1813460.1A external-priority patent/GB201813460D0/en
Priority claimed from GBGB1817642.0A external-priority patent/GB201817642D0/en
Priority claimed from GBGB1820264.8A external-priority patent/GB201820264D0/en
Priority claimed from GBGB1820256.4A external-priority patent/GB201820256D0/en
Application filed by 4D Pharma Res Ltd filed Critical 4D Pharma Res Ltd
Publication of RS63273B1 publication Critical patent/RS63273B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Description

Opis
POLJE PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak je u oblasti kompozicija koje sadrže sojeve bakterija izolovanih iz digestivnog trakta sisara i oblasti upotrebe takvih kompozicija u lečenju bolesti, posebno raka, a posebno u stimulisanju imunološkog sistema u lečenju bolesti, kako je definisano u patentnim zahtevima.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Smatra se da je ljudsko crevo sterilno in utero, ali je izloženo velikom broju majčinih mikroba i mikroba iz okoline odmah nakon rođenja. Nakon toga, dolazi do dinamičkog perioda kolonizacije i sukcesije mikroba, na koji utiču faktori kao što su način isporuke, okruženje, ishrana i genotip domaćina, što sve utiče na sastav mikrobiote creva, posebno tokom ranog života. Nakon toga, mikrobiota se stabilizuje i postaje slična odrasloj osobi [1]. Ljudska crevna mikrobiota sadrži više od 500-1000 različitih filotipova koji u suštini pripadaju dvema velikim bakterijskim divizijama, Bacteroidetes i Firmicutes [2]. Uspešni simbiotski odnosi koji proističu iz bakterijske kolonizacije ljudskog creva doneli su širok spektar metaboličkih, strukturnih, zaštitnih i drugih korisnih funkcija. Poboljšane metaboličke aktivnosti kolonizovanog creva obezbeđuju da se inače neprobavljive komponente ishrane razgrađuju uz oslobađanje nusproizvoda koji predstavljaju važan izvor hranljivih materija za domaćina. Slično tome, imunološki značaj crevne mikrobiote je dobro prepoznat i prikazan je kod životinja koje nisu kliconoše koje imaju oslabljen imuni sistem koji se funkcionalno rekonstituiše nakon uvođenja komenzalnih bakterija [3-5].
[0003] Dramatične promene u sastavu mikrobiote su dokumentovane kod gastrointestinalnih poremećaja kao što je inflamatorna bolest creva (IBD). Na primer, nivoi bakterija Clostridium klaster XIVa su smanjeni kod pacijenata sa IBD, dok je broj E. coli povećan, što sugeriše promenu u ravnoteži simbionta i patobiota u crevima [6-9]. Zanimljivo je da je ova mikrobna disbioza takođe povezana sa neravnotežama u populaciji T efektorskih ćelija.
[0004] Uvažavajući potencijalni pozitivan efekat koji određeni sojevi bakterija mogu imati na creva životinja, predloženi su različiti sojevi za upotrebu u lečenju različitih bolesti (videti, na primer, [10-13]). Takođe, određeni sojevi, uključujući uglavnom sojeve Lactobacillus i Bifidobacterium, predloženi su za upotrebu u lečenju različitih inflamatornih i autoimunih bolesti koje nisu direktno povezane sa crevima (vidi [14] i [15] za komentare). Međutim, veza između različitih bolesti i različitih bakterijskih sojeva, kao i precizni efekti pojedinih bakterijskih sojeva na creva i na sistemskom nivou i na bilo koju određenu vrstu bolesti, slabo su određeni.
[0005] WO2015038731 razmatra metodu lečenja raka debelog creva narušavanjem biofilma debelog creva primenom antimikrobnog agensa ili probiotičkog agensa. Prijava navodi veliki broj bakterija koje se mogu koristiti kroz probiotik, ali ne pruža demonstraciju efikasnosti bilo koje od bakterija u lečenju raka debelog creva. Umesto toga, ova prijava se fokusira na dijagnostički potencijal biofilma kod kolorektalnog raka.
[0006] Pristupni broj EMBL baze podataka XP002787383 obezbeđuje sekvencu gena 16S rRNA predloženog Megasphaera sp, dok pristupni broj EMBL baze podataka XP002787384 obezbeđuje 16S rRNA gen soja Megasphaera massiliensis. Ovi dokumenti detaljno opisuju genomsku analizu izolovanih sojeva i ne daju uputstva za terapijsku korist Megasphaere.
[0007] Ahmed i dr. (prijavljeni Frontiers Cellular Neuroscience) razmatraju in vitro karakterizaciju sojeva bakterija dobijenih iz crevnih mikrobiota. US2004/120963 opisuje kompozicije koje sadrže bakterije sposobne da pretvore mlečnu kiselinu u maslačnu kiselinu i metodu prevencije/lečenja hiperlaktične acidemije kod raka digestivnog trakta i debelog creva korišćenjem istih. CN104415060A opisuje jestivu kompoziciju koja sadrži bakterije koje proizvode inulin i buternu kiselinu. JPS5557520 opisuje pripremu karcinostatske supstance tretiranjem ćelijskih zidova bakterija koje pripadaju rodu Bacteroides itd. sa enzimom i dijalizom vodom. US2017/354697 opisuje lečenje infekcije Clostridium difficile. US2016/223553 opisuje formiranje biofilma da bi se definisao rizik od raka debelog creva. WO2017122197A1 opisuje genetski modifikovane bakterije koje koriste mlečnu kiselinu da luče enzime koji razgrađuju polisaharide. US2016199424A1 opisuje probiotičke i prebiotičke kompozicije i metode njihove upotrebe za modulaciju mikrobioma. WO2004085628 opisuje bakterije koje koriste mlečnu kiselinu i njihovu terapeutsku upotrebu. Nallabelli i dr. (Scientific Reports, 6(1), 2016) opisuje biohemijske analize i analize sekvenci genoma Megasphaera sp. soj DISK18 od dentalnog plaka zdrave osobe. Padmanabhan i dr. (Standards in Genomic Sciences, 8(3), 2013) otkriva neprekidnu gotovu sekvencu genoma i daje opis Megasphaera massiliensis sp.
[0008] U struci postoji potreba za novim metodama lečenja bolesti. Takođe postoji potreba da se potencijalni efekti crevnih bakterija okarakterišu tako da se mogu razviti nove terapije koje koriste crevne bakterije.
SAŽETAK PRONALASKA
[0009] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, za upotrebu u lečenju bolesti stimulacijom imunološkog sistema, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 97% identična SEK ID BR: 1. Pronalazak dalje obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 95% identična SEK ID BR:1; (a) za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka, (b) za upotrebu u lečenju, prevenciji ili odlaganju imunosenescencije, (c) za upotrebu kao adjuvant za vakcinu, ili (d) za upotrebu u terapiji himernim T ćelijama receptora antigena (CAR-T ), terapiji mezenhimalnim matičnim ćelijama (MSC) ili terapiji transplantacijom matičnih ćelija; u ljudskom subjektu.
[0010] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži ćeliju bakterijskog soja kao što je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu ćelija eksprimira jedan ili više heterolognih antigena; za upotrebu kao vakcina; opciono pri čemu ćelija predstavlja jedan ili više heterolognih antigena. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju bakterijskog soja kao što je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu ćelija eksprimira jedan ili više heterolognih antigena; za upotrebu kao vakcina; opciono pri čemu ćelija predstavlja jedan ili više heterolognih antigena.
[0011] Pronalazak dalje obezbeđuje bakterijski soj za upotrebu u terapiji, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 99,5% ili 99,9% identična bilo kojoj od SEK ID BR: 8, 11 ili 12. Pronalazak takođe obezbeđuje bakterijski soj koji ima sekvencu 16S rRNA predstavljenu bilo kojim od SEK ID BR: 8, 10, 11 ili 12 za upotrebu u terapiji.
[0012] Pronalazači su razvili nove kompozicije koje sadrže soj bakterija iz roda Megasphaera koji se može koristiti u stimulaciji imunološkog sistema i lečenju i prevenciji bolesti, posebno raka.
[0013] Pronalazak stoga obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, za upotrebu u lečenju bolesti stimulisanjem imunološkog sistema, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 97% identična SEK ID BR:1. Poželjno, bakterijski soj je vrste Megasphaera massiliensis.
[0014] U daljim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 95% identična SEK ID BR:1; za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka, kao što je metastatski melanom, rak dojke, rak jajnika, rak grlića materice, neuroblastom, glioblastom, karcinom, rak pluća, hronična limfocitna leukemija, rak prostate, limfom i/ili rak želuca. U daljim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 95% identična SEK ID BR:1, za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka, kao što su kolorektalni rak i/ili hematološki maligniteti.
[0015] U daljim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 95% identična SEK ID BR:1, za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili odlaganju imunonescencije.
[0016] U daljim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 95% identična SEK ID BR:1, za upotrebu kao adjuvant za vakcinu.
[0017] U daljim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 95% identična SEK ID BR: 1, za upotrebu u poboljšanju ćelijske terapije, kao što je CAR-T.
[0018] Poželjno, bakterija korišćena u pronalasku je soj deponovan pod pristupnim brojem 42787 u NCIMB.
KRATKI OPISI CRTEŽA
[0019]
Slika 1 Nivoi ekspresije β3 tubulina: imunobojenje i slikanje ćelija (Slika 1A); imunobloting (slika 1B)
Slika 2 Nivoi ekspresije MAP2: imunobojenje i slikanje ćelija (Slika 2A); imunobloting (slika 2B); promena preklopa u ekspresiji (slika 2C)
Slika 3: Promena ekspresije DRD2
Slika 4: Promena ekspresije Casp3
Slika 5: Promena vitalnosti ćelije
Slika 6: Ćelijska fenotipizacija CD4 T pomoćnih ćelija (Slika 6A); CD4+ aktivirane ćelije (Slika 6B); Tregs ćelije (slika 6C); CD8 citotoksične T ćelije (Slika 6D); CD8+ aktivirane ćelije (Slika 6E); B ćelije (slika 6F); odnos CD8/Treg (Slika 6G); odnos iktivirani CD8/Treg (Slika 6H).
Slika 7: Analiza citokina IL-1β (Slika 7A); TNF-α (Slika 7B); IL-23 (Slika 7C); IL-6 (Slika 7D); MIP-3α (Slika 7E); CXCL9 (slika 7F); MCP-1 (Slika 7G); IL-10 (Slika 7H); GM-CSF (Slika 7I).
Slika 8: Strategija ulaska koja se koristi za analizu različite populacije imunih ćelija (CD4, CD8 i CD19+ ćelije) pomoću protočne citometrije za podatke predstavljene na Slici 6.
Slika 9 Sekrecija interleukina-8 (IL-8)).
Slika 10: Promena aktivnosti histon deacetilaze (HDAC)
Slika 11A: Promene izazvane sojem u celoj ćeliji i aktivnosti ćelijskog lizata histon deacetilaze; Slika 11B: proizvodnja metabolita sojevima; Slika 11C: kiselinom izazvane promene aktivnosti histon deacetilaze
Slika 12A: HDAC1 inhibicija; Slika 12B: HDAC2 inhibicija; Slika 12C: Inhibicija HDAC3.
Slika 13A: Inhibicija HDAC klase I; Slika 13B: inhibicija HDAC1; Slika 13C: inhibicija HDAC2; Slika 13D: inhibicija HDAC3.
Slika 14: Efekti na funkciju crevne barijere.
Slika 15: Promene u hipokampalnoj ekspresiji toličnih receptora 4 (TLR-4).
Slika 16: Promene u hipokampalnoj ekspresiji TNF-α.
Slika 17: Promene u Hipokampalnoj ekspresiji interleukina-1β (IL-1β).
Slika 18: Promene u hipokampalnoj ekspresiji interleukina-6 (IL-6).
Slika 19: Promene u hipokampalnoj ekspresiji CD11b.
Slika 20: Promene u ekspresiji amigdale TLR-4.
Slika 21: Promene u ekspresiji amigdale CD11b.
Slika 22: Promene u ekspresiji amigdale IL-6.
Slika 23: Promene u ekspresiji prefrontalnog korteksa TLR-4.
Slika 24: Promene u ekspresiji prefrontalnog korteksa CD11b.
Slika 25: Promene u ekspresiji prefrontalnog korteksa IL-6.
Slika 26: Efekat na proizvodnju interferona-y iz splenocita miševa kod miševa kojima je primenjen MRx0029.
Slika 27: Efekat na proizvodnju IL-1β iz splenocita miševa od miševa kojima je dat MRx0029.
Slika 28: Efekat na proizvodnju IL-6 iz splenocita miševa od miševa kojima je dat MRx0029.
Slika 29: Efekat na proizvodnju TNF-α iz splenocita miševa kojima je dat MRx0029.
Slika 30: Efekat na proizvodnju CXCL1 iz splenocita miševa kojima je dat MRx0029.
Slika 31: Ekspresija gena MAP2 u ćelijskoj liniji SKMEL2 nakon različitih tretmana, u odnosu na GAPDH. „YCFA“ = YCFA+
Slika 32: Klonogeno preživljavanje ćelijske linije SKMEL2 nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 33: Rast mekog agara SKMEL2 ćelijske linije nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 34: ERK signalizacija (fosforilovani ERK1 i 2 (p44 i p42)/ukupni ERK) u ćelijskoj liniji SKMEL2 nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 35: Ekspresija gena MAP2 u ćelijskoj liniji SKMEL28 nakon različitih tretmana, u odnosu na GAPDH. „YCFA“ = YCFA+
Slika 36: Klonogeno preživljavanje ćelijske linije SKMEL28 nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 37: Rast mekog agara SKMEL28 ćelijske linije nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 38: ERK signalizacija (fosforilovani ERK1 i 2 (p44 i p42)/ukupni ERK) u ćelijskoj liniji SKMEL28 nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 39: Ekspresija gena MAP2 u ćelijskoj liniji SKMEL31 nakon različitih tretmana, u odnosu na GAPDH. „YCFA“ = YCFA+
Slika 40: Klonogeno preživljavanje ćelijske linije SKMEL31 nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 41: Rast mekog agara SKMEL31 ćelijske linije nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 42: ERK signalizacija (fosforilovani ERK1 i 2 (p44 i p42)/ukupni ERK) u ćelijskoj liniji SKMEL31 nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 43: Ekspresija gena MAP2 u ćelijskoj liniji 451Lu nakon različitih tretmana, u odnosu na GAPDH. „YCFA“ = YCFA+
Slika 44: Klonogeno preživljavanje ćelijske linije 451Lu nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 45: Rast mekog agara ćelijske linije 451Lu nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 46: ERK signalizacija (fosforilovani ERK1 i 2 (p44 i p42)/ukupni ERK) u ćelijskoj liniji 451Lu nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 47: Ekspresija gena MAP2 u ćelijskoj liniji HT-29 nakon različitih tretmana, u odnosu na GAPDH. „YCFA“ = YCFA+
Slika 48: Klonogeno preživljavanje ćelijske linije HT-29 nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 49A: Rast mekog agara HT-29 ćelijske linije nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 49B: Meki agar rast ćelijske linije HT-29 nakon različitih tretmana (fotografija agar ploča). „YCFA“ = YCFA+
Slika 50: ERK signalizacija (fosforilovani ERK1 i 2 (p44 i p42)/ukupni ERK) u HT29 ćelijskoj liniji nakon različitih tretmana. „YCFA“ = YCFA+
Slika 51: Pregled putanje MAP-kinaze (iz [72]).
Slika 52: Ekspresija GPR109a RNK u diferenciranim Caco-2 ćelijama (A) bez i (B) sa tretmanom s forbolmiristatom u dodatku MRx0029. „YCFA“ = YCFA+
Slika 53: Indukcija sekrecije IL-8 iz HT29 ćelija pomoću (A) MRx0029 sa kondicioniranim medijumom i (B) samog MRx0029.
Slika 54: Analiza metabolita za soj Megasphaera massiliensis NCIMB 42787.
Slika 55: Proizvodnja valerijanske kiseline u supernatantu za MRx0029 i referentne sojeve Megasphaera massiliensis.
Slika 56: Proizvodnja i potrošnja organske kiseline od strane MRx0029 i referentnih sojeva Megasphaera massiliensis.
Slika 57: Supresija NSE/enolaze 2 od strane MRX029. „YCFA“ = YCFA+.
Slika 58: Proizvodnja i potrošnja organske kiseline od strane NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388 i NCIMB 43389.
Slika 59: Povećana regulacija sekrecije IL-6 u U373 ćelijama od strane NCIMB 42787 i drugih deponovanih sojeva (n=3).
Slika 60: Suzbijanje enolaze 2 od strane NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 i NCIMB 43387.
Slika 61A: NCIMB 42787 i drugi deponovani povećavaju ekspresiju MAP2; Slika 61B i C: Modulacija nivoa citokina i promotora NPκB-AP1 od NCIMB 42787.
Slika 62: NCIMB 42787 proizvodi buternu, valerijansku i heksansku kiselinu
Slika 63: Imunostimulaciona aktivnost metabolita koje proizvodi NCIMB 42787.
Slika 64: Analiza uloge metabolita u imunostimulacionoj aktivnosti NCIMB 42787.
Slika 65: Megasphaera soj NCIMB 43387 utiče na ekspresiju mRNK IDO-1 debelog creva kod BALB/c miševa.
Slika 66: Megasphaera sojevi NCIMB 43385 i NCIMB 43387 utiču na ekspresiju mRNK Tph1 debelog creva kod BALB/c miševa.
Slika 67: Megasphaera soj NCIMB 43385 modulira proizvodnju IPNγ i IL-6 nakon ConA stimulacije splenocita BALB/c miševa.
Slika 68: Megasphaera soj NCIMB 43385 modulira ekspresiju IL-6 i CD11b u mozgu BALB/c miševa.
Slika 69: NCIMB 42787 modulira ekspresiju TLR4 u amigdali BALB/c miševa.
PREDSTAVLJANJE PRONALASKA
Bakterijski sojevi
[0020] Kompozicije pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, sadrže soj bakterija iz roda Megasphaera. Primeri pokazuju da su bakterije ovog roda korisne za stimulisanje imunološkog sistema i za lečenje bolesti, posebno raka. Poželjni sojevi bakterija su vrste Megasphaera massiliensis.
[0021] Primeri vrsta Megasphaera za upotrebu u pronalasku uključuju Megasphaera elsdenii, Megasphaera cerevisiae, Megasphaera massiliensis, Megasphaera indica, Megasphaera paucivorans, Megasphaera sueciensis i Megasphaera micronuciformis. Sledeći primer vrste Megasphaera za upotrebu u pronalasku je Megasphaera hexanoica. Megasphaera su obavezno anaerobni, laktat-fermentirajući, gastrointestinalni mikrobi sisara preživara i nepreživara, uključujući ljude.
[0022] Tip soja M massiliensis je NP3 (=CSUR P245=DSM 26228) [16]. GenBank pristupni broj za sekvence gena 16S rRNA soja NP3 M massiliensis je JX424772.1.
[0023] Bakterija Megasphaera massiliensis testirana u Primerima se ovde pominje kao soj MRx0029. 16S rRNA sekvenca za soj MRx0029 koji je testiran je dat u SEK ID BR:1.
[0024] Soj MRx0029 je deponovan kod međunarodnog depozitarnog organa NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland) od strane 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25, Scotland) 13. jula 2017. kao „Megasphaera massiliensis MRx0029“ i dodeljen mu je pristupni broj NCIMB 42787.
[0025] Takođe se očekuje da bakterijski sojevi koji su blisko povezani sa sojem testiranim u Primerima budu efikasni za stimulaciju imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR:1. Poželjno, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA predstavljenu SEK ID BR:1.
[0026] Takođe se očekuje da će sojevi bakterija koji su biotipovi sojeva MRx0029 biti efikasni za stimulaciju imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. Biotip je blisko srodni soj koji ima iste ili vrlo slične fiziološke i biohemijske karakteristike.
[0027] Sojevi koji su biotipovi sojeva MRx0029i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku mogu se identifikovati sekvenciranjem drugih nukleotidnih sekvenci za sojeve MRx0029. Na primer, suštinski ceo genom može biti sekvencioniran i soj biotipa za upotrebu u pronalasku može imati najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identitet sekvence u najmanje 80% njegovog celog genoma (npr. u najmanje 85%, 90%, 95% ili 99%, ili u celom njegovom genomu). Druge pogodne sekvence za upotrebu u identifikaciji sojeva biotipa mogu uključivati hsp60 ili ponavljajuće sekvence kao što su BOX, ERIC, (GTG)5ili REP ili [17]. Sojevi biotipa mogu imati sekvence sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa odgovarajućom sekvencom sojeva MRx0029.
[0028] Alternativno, sojevi koji su biotipovi sojeva MRx0029i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku mogu se identifikovati korišćenjem sojeva MRx0029 i analizom restrikcionih fragmenata i/ili PCR analizom, na primer korišćenjem polimorfizma dužine fluorescentnog amplifikovanog fragmenta (FAFLP) i ponavljajućeg DNK elementa (rep)-PCR otiskom prsta, ili profilisanjem proteina, ili delimičnim sekvenciranjem 16S ili 23S rDNK. U poželjnim izvođenjima, takve tehnike se mogu koristiti za identifikaciju drugih sojeva Megasphaera massiliensis.
[0029] U određenim izvođenjima, sojevi koji su biotipovi sojeva MRx0029 i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku su sojevi koji daju isti obrazac kao soj MRx0029 kada se analiziraju amplifikovanom ribozomalnom DNK restriktivnom analizom (ARDRA), na primer kada se koristi Sau3AI restrikcioni enzim (za primere metoda i uputstva videti, na primer, [18]). Alternativno, sojevi biotipa se identifikuju kao sojevi koji imaju iste obrasce fermentacije ugljenih hidrata kao sojevi MRx0029.
[0030] Drugi Megasphaera sojevi koji su korisni u kompozicijama i metodama pronalaska, kao što su biotipovi soja MRx0029, mogu se identifikovati korišćenjem bilo koje odgovarajuće metode ili strategije, uključujući testove opisane u Primerima. Na primer, sojevi za upotrebu u pronalasku mogu se identifikovati dodavanjem ćelijskog lizata ili celih ćelija i testiranjem ekspresije MAP2, ekspresije DRD2, nivoa citokina ili preživljavanja ćelije. Posebno, bakterijski sojevi koji imaju slične obrasce rasta, metabolički tip i/ili površinske antigene kao sojevi MRx0029 mogu biti korisni u pronalasku. Koristan soj će imati uporedivu imunomodulatornu aktivnost sa sojevima MRx0029. Posebno, soj biotipa će izazvati uporedive efekte na ekspresiju MAP2, ekspresiju DRD2, nivoe citokina ili preživljavanje ćelija kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima. Soj biotipa može da izazove uporedive efekte na inhibitornu aktivnost histon deacetilaze kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima.
[0031] U nekim izvođenjima, bakterijski sojevi korisni u pronalasku mogu se identifikovati rutinskim profilisanjem proizvodnje i potrošnje metabolita od strane bakterijskog soja. Pronalazači su otkrili da bakterijski soj korišćen u Primerima proizvodi butirat, valerijansku kiselinu i heksansku kiselinu i troši acetat i propionat (videti slike 54-56). Takođe je utvrđeno da sojevi Megasphaera massiliensis Ref 1, Ref 2 i Ref 3 konzumiraju i proizvode ove metabolite (videti slike 54-56). Zbog toga, u nekim izvođenjima, bakterijski soj pronalaska proizvodi jedan ili više metabolita butirata, valerijanske kiseline i heksanske kiseline. U nekim izvođenjima, bakterijski soj pronalaska troši jedan ili oba acetata i propionata. U poželjnim izvođenjima, bakterijski soj pronalaska proizvodi butirat, valerijansku kiselinu i heksansku kiselinu i troši acetat i propionat.
[0032] Posebno poželjan soj pronalaska je soj Megasphaera massiliensis MRx0029. Ovo je primer soja koji je testiran u Primerima i pokazao se efikasnim u lečenju bolesti. Stoga, pronalazak obezbeđuje ćeliju, kao što je izolovana ćelija, soja Megasphaera massiliensis MRx0029, ili njegov derivat. Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži ćeliju soja Megasphaera massiliensis MRx0029, ili njegov derivat. Pronalazak takođe obezbeđuje biološki čistu kulturu soja Megasphaera massiliensis MRx0029. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju soja Megasphaera massiliensis MRx0029, ili njegov derivat, za upotrebu u terapiji, posebno za bolesti opisane ovde.
[0033] Posebno poželjan soj pronalaska je soj Megasphaera massiliensis deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42787. Ovo je primer MRx0029 soja
1
testiranog u Primerima i pokazalo se da je efikasan u stimulisanju imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. Stoga, pronalazak obezbeđuje ćeliju, kao što je izolovana ćelija, soja Megasphaera massiliensis deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42787, ili njegov derivat. Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži ćeliju soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 42787, ili njen derivat. Pronalazak takođe obezbeđuje biološki čistu kulturu soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 42787. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 42787, ili njegov derivat, za upotrebu u terapiji, posebno za bolesti opisane ovde.
[0034] Derivat soja pronalaska može biti ćerka soj (potomak) ili soj kultivisan (subkloniran) iz originala. Derivat soja pronalaska može biti modifikovan, na primer na genetskom nivou, bez uklanjanja biološke aktivnosti. Konkretno, derivatni soj pronalaska je terapeutski aktivan. Derivatni soj će imati uporedivu terapeutsku aktivnost sa sojem MRx0029. Konkretno, derivatni soj će izazvati uporedive efekte na ekspresiju MAP2, ekspresiju DRD2, nivoe citokina ili preživljavanje ćelija kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima. Derivatni soj može da izazove uporedive efekte na inhibitornu aktivnost histon deacetilaze kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima. Derivat soja MRx0029 generalno će biti biotip soja MRx0029.
[0035] Reference ćelija soja Megasphaera massiliensis MRx0029 obuhvataju sve ćelije koje imaju iste karakteristike bezbednosti i terapeutske efikasnosti kao soj MRx0029, a takve ćelije su obuhvaćene pronalaskom.
[0036] U poželjnim izvođenjima, sojevi bakterija u kompozicijama pronalaska su održivi i sposobni da delimično ili potpuno kolonizuju creva.
[0037] Pronalazači su otkrili da sojevi Megasphaera massiliensis povećavaju aktivaciju inflamatornih citokina kao što su IL-1β, TNF-α, MIP-3 α, IL-23, IL-8 i/ili IL-6.
[0038] Pronalazači su otkrili da sojevi Megasphaera massiliensis povećavaju aktivaciju imunih ćelija i pojačavaju sekreciju citokina kao što su IL-1β, TNF-α, MIP-3 α, IL-23, IL-8 i/ili IL-6.
[0039] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 42787, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka, najpoželjnije raka mozga, kao što je neuroblastom. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 42787, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, limfoma, raka želuca, kolorektalnog raka i/ili hematološkog maligniteta.
[0040] U poželjnim izvođenjima, sojevi bakterija u kompozicijama pronalaska su održivi i sposobni da delimično ili potpuno kolonizuju creva.
[0041] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska ne sadrži ćeliju soja Megasphaera massiliensis 42787.
[0042] U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama pronalaska je bakterijski soj iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42787.
[0043] U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama pronalaska je bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42787.
[0044] Ovi bakterijski sojevi su deponovani kod međunarodnog depozitarnog organa NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9IA, Scotland) od strane 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland) 6. maja 2019. kao Megasphaera massiliensis (pod pristupnim brojevima NCIMB 43388 i NCIMB 43389) i Megasphaera spp. (pristupni brojevi NCIMB 43385, NCIMB 43386 i NCIMB 43387). Shodno tome, u alternativnom izvođenju, kompozicije pronalaska sadrže jedan ili više ovih bakterijskih sojeva, ili biotipove ili njihove derivate. Da bi se otklonile sve sumnje, Ref 1 koji je gore pomenut je soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43385, Ref 2 koji je gore pomenut je soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43388, a Ref 3 koji je gore pomenut je soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43389.
[0045] Takođe se očekuje da bakterijski sojevi koji su blisko povezani sa sojevima testiranim u Primerima budu efikasni za stimulaciju imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka.
[0046] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku je soj Megasphaera massiliensis deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43388. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43388, ili njegov derivat, za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43388, ili njegov derivat za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43388, za upotrebu kod bilo koje od bolesti opisanih ovde.
[0047] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje upotrebu kompozicije koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43388, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, naročito raka, najpoželjnije raka mozga, kao što je neuroblastom. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje upotrebu kompozicije koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43388, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, limfoma, raka želuca, kolorektalnog karcinoma i/ili hematoloških maligniteta.
[0048] U određenim izvođenjima, kompozicija za upotrebu prema pronalasku ne sadrži ćeliju soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43388. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama za upotrebu prema pronalasku je bakterijski soj iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43388. U nekim izvođenjima, soj bakterije u kompozicijama za upotrebu prema pronalasku je bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis, gde bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43388.
[0049] Shodno tome, u određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku je Megasphaera massiliensis deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43389. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43389, ili njegov derivat, za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43389, ili njegov derivat za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43389, za upotrebu u bilo kojoj od bolesti opisanih ovde.
[0050] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43389, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka, najpoželjnije rak mozga, kao što je neuroblastom. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43389, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, limfoma, raka želuca, kolorektalnog raka i/ili hematoloških maligniteta.
[0051] U određenim izvođenjima, kompozicija za upotrebu prema pronalasku ne sadrži ćeliju soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43389. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama za upotrebu prema pronalasku je bakterijski soj iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43389. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama za upotrebu prema pronalasku je bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis, gde bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43389.
[0052] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična SEK ID
1
BR:9. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA predstavljenu SEK ID BR:9. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje bakterijski soj koji ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR:9 za upotrebu u terapiji.
[0053] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16S rRNA sekvencu koja je najmanje 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR: 10. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16S rRNA sekvencu predstavljenu SEK ID BR:10. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje bakterijski soj koji ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR: 10 za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje soj bakterija koji ima sekvencu 16S rRNA predstavljenu SEK ID BR: 10 za upotrebu u terapiji.
[0054] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16S rRNA sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična sekvenci 16S rRNA bakterijskog soja iz roda Megasphaera. Bakterijski soj za upotrebu u pronalasku je iz roda Megasphaera.
[0055] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku je soj Megasphaera deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43385. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43385, ili njegov derivat, za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43385, ili njegov derivat za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43385, za upotrebu kod bilo koje od bolesti opisanih ovde.
[0056] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43385, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka, najpoželjnije raka mozga, kao što je neuroblastom. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43385, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, limfoma, raka želuca, kolorektalni raka i/ili hematoloških maligniteta.
[0057] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska ne sadrži ćeliju soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43385. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama pronalaska je bakterijski soj iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43385. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama pronalaska je bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan prilikom pristupanja broj NCIMB 43385.
[0058] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku je soj Megasphaera deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43386. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43386, ili njegov derivat, za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43386, ili njegov derivat za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43386, za upotrebu kod bilo koje od bolesti opisanih ovde.
[0059] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43386, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka, najpoželjnije raka mozga, kao što je neuroblastom. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43386, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, limfoma, raka želuca, kolorektalni raka i/ili hematoloških maligniteta.
[0060] U određenim izvođenjima, kompozicija za upotrebu prema pronalasku ne sadrži ć eliju soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43386. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama pronalaska je bakterijski soj rod Megasphaera, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43386. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama za upotrebu prema pronalasku je bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis, pri čemu je bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43386.
[0061] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku je soj Megasphaera deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43387. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43387, ili njegov derivat, za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 43387, ili njegov derivat za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43387, za upotrebu kod bilo koje od bolesti opisanih ovde.
[0062] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43387, ili njegov derivat ili biotip, poželjno za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema i za lečenje i prevenciju bolesti, posebno raka, najpoželjnije raka mozga, kao što je neuroblastom. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43387, ili njegov derivat ili
1
biotip, poželjno za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, limfoma, raka želuca, kolorektalni raka i/ili hematoloških maligniteta.
[0063] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska ne sadrži ćeliju soja Megasphaera massiliensis deponovanu pod pristupnim brojem NCIMB 43387. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama pronalaska je bakterijski soj iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43387. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompozicijama pronalaska je bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis, pri čemu bakterijski soj nije soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43387.
[0064] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR:8. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR:11. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR:12. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16S rRNA sekvencu koja je najmanje 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR: 8, 11 ili 12. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje bakterijski soj koji ima 16S rRNA sekvenca koja je najmanje 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR: 8, 11 ili 12 za upotrebu u terapiji.
[0065] U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16S rRNA sekvencu predstavljenu SEK ID BR:8. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA predstavljenu SEK ID BR:11. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima sekvencu 16S rRNA predstavljenu SEK ID BR:12. U određenim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16S rRNA sekvencu predstavljenu SEK ID BR: 8, 11 ili 12. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje bakterijski soj koji ima 16S rRNA sekvencu predstavljenu SEK ID BR: 8, 11 ili 12 za upotrebu u terapiji.
[0066] Od bakterijskih sojeva koji su biotipovi jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 takođe se očekuje da budu efikasni za stimulaciju i stimulaciju imunološkog sistema i tretiranje i sprečavanje bolesti, posebno raka. Biotip je blisko srodni soj koji ima iste ili vrlo slične fiziološke i biohemijske karakteristike.
[0067] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje sojeve bakterija deponovane pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389, ili njihove biotipove, za upotrebu u terapiji.
[0068] Sojevi koji su biotipovi jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku mogu se identifikovati
1
sekvencioniranjem drugih sekvenci za jedan ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389. Na primer, suštinski ceo genom može biti sekvenciran i soj biotipa može imati soj za upotrebu u pronalasku najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identitet sekvence u najmanje 80% njegovog celog genoma (npr. preko najmanje 85%, 90%, 95% ili 99%, ili u celom njegovom genomu). Druge pogodne sekvence za upotrebu u identifikaciji sojeva biotipa mogu uključivati hsp60 ili ponavljajuće sekvence kao što su BOX, ERIC, (GTG)5ili REP. Sojevi biotipa mogu imati sekvence sa najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa odgovarajućom sekvencom jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389.
[0069] Alternativno, sojevi koji su biotipovi jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku mogu biti identifikovani korišćenjem jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 i analizom restrikcionih fragmenata i/ili PCR analizom, na primer korišćenjem fluorescentnog pojačanog polimorfizma dužine fragmenta (FLP) i repetitivnog polimorfizma DNK element (rep)-PCR otiskom prsta, ili profilisanjem proteina, ili delimičnim sekvenciranjem 16S ili 23S rDNK. U poželjnim izvođenjima, takve tehnike se mogu koristiti za identifikaciju drugih sojeva Megasphaera massiliensis.
[0070] U određenim izvođenjima, sojevi koji su biotipovi jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku pružaju isti obrazac kao jedan ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 kada se analiziraju amplifikovanom ribozomalnom DNK restriktivnom analizom (ARDRA), na primer, kada se koristi Sau3AI restrikcija enzima. Alternativno, sojevi biotipa se identifikuju kao sojevi koji imaju iste obrasce fermentacije ugljenih hidrata kao jedan ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389.
[0071] Drugi sojevi koji su korisni u kompozicijama i metodama pronalaska, kao što su biotipovi jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389, mogu biti identifikovani korišćenjem bilo koje odgovarajuće metode ili strategije, uključujući testove opisane u Primerima. Na primer, sojevi za upotrebu u pronalasku mogu se identifikovati dodavanjem ćelijskog lizata ili celih ćelija i testiranjem ekspresije MAP2, ekspresije DRD2, nivoa citokina ili preživljavanja ćelije. Posebno, bakterijski sojevi koji imaju slične obrasce rasta, metabolički tip i/ili površinske antigene kao jedan ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 mogu biti korisni u pronalasku. Korisni soj će imati uporedivu imunomodulacionu aktivnost sa jednim ili više sojeva
1
deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389. Posebno, soj biotipa će izazvati uporedive efekte na ekspresiju MAP2, ekspresiju DRD2, nivoe citokina ili preživljavanje ćelija kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima. Soj biotipa može da izazove uporedive efekte na inhibitornu aktivnost histon deacetilaze kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima.
[0072] U određenim izvođenjima, poželjni sojevi pronalaska su sojevi deponovani pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389. Ovo su primeri efikasnih sojeva koji su testirani u Primeru i pokazano je da su efikasni u lečenju bolesti. Stoga, pronalazak obezbeđuje ćeliju, kao što je izolovana ćelija, jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389, ili njihov derivat. Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži ćeliju jednog od više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389, ili njihov derivat. Pronalazak takođe obezbeđuje biološki čistu kulturu jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389, ili njihov derivat, za upotrebu u terapiji, posebno za bolesti opisane ovde.
[0073] Derivat soja pronalaska može biti ćerka soj (potomak) ili soj kultivisan (subkloniran) iz originala. Derivat soja pronalaska može biti modifikovan, na primer na genetskom nivou, bez uklanjanja biološke aktivnosti. Konkretno, derivatni soj pronalaska je terapeutski aktivan. Derivatni soj će imati uporedivu terapijsku aktivnost sa jednim ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389. Konkretno, derivativni soj će izazvati ekspresiju komparativnog soja na MAP2, ekspresije DRD2, nivoa citokina ili preživljavanja ćelija kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima. Derivatni soj može da izazove uporedive efekte na inhibitornu aktivnost histon deacetilaze kao što je prikazano u Primerima, koji se mogu identifikovati korišćenjem protokola kultivisanja i primene opisanih u Primerima. Derivat jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389 generalno će biti biotip jednog ili više sojeva deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 i/ili NCIMB 43389, ovim redom.
[0074] Pronalazači su otkrili da bakterijski soj korišćen u Primerima proizvodi 2-metil-propansku kiselinu i 3-metil-butansku kiselinu i troši mravlju kiselinu (videti sliku 58). Takođe je utvrđeno da sojevi deponovani pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43388 i NCIMB 43389 proizvode 2-metil-propansku kiselinu i 3-
1
metilbutansku kiselinu. Pored toga, otkriveno je da sojevi deponovani pod pristupnim brojevima NCIMB 43385 i NCIMB 43388 troše mravlju kiselinu.
[0075] Zbog toga, u nekim izvođenjima, bakterijski soj pronalaska proizvodi jedan ili više metabolita 2-metil-propanske kiseline i 3-metil-butanske kiseline. U nekim izvođenjima, bakterijski soj pronalaska troši mravlju kiselinu. U nekim izvođenjima, bakterijski soj pronalaska proizvodi 2-metil-propansku kiselinu i 3-metilbutansku kiselinu i troši mravlju kiselinu. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija pronalaska proizvodi butirat, valerijansku kiselinu, heksansku kiselinu, 2-metil-propansku kiselinu i 3-metil-butansku kiselinu, i troši acetat, propionat i mravlju kiselinu.
[0076] U određenim izvođenjima, proizvodnja butirata i/ili valerijanske kiseline stvara sekreciju IL-8. Shodno tome, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska mogu da stimulišu imuni sistem kroz proizvodnju butirata i/ili valerijanske kiseline.
[0077] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska ne sadrže Megasphaera elsdenii. U određenim izvođenjima, bakterijski soj koristan u kompozicijama i postupcima pronalaska nije Megasphaera elsdenii.
Terapeutske upotrebe
Stimulisanje imunološkog sistema
[0078] Primeri pokazuju da primena kompozicija za upotrebu prema pronalasku može dovesti do imunološke stimulacije u mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC). Pošto je pokazano da primena kompozicija pronalaska ima imunostimulatorni efekat na PBMC, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti, posebno bolesti koje karakteriše smanjena imunološka aktivacija i bolesti koje se leče povećanim imunološkim odgovorom. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti stimulisanjem imunološkog sistema. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora.
[0079] Primeri pokazuju da primena kompozicija za upotrebu prema pronalasku može dovesti do smanjenja procenta Treg-ova u PBMC (Slika 6C). Tregovi, takođe poznati kao supresorske T ćelije, su populacija T ćelija koje funkcionišu da potiskuju imunološki odgovor. Tregove karakteriše visoka ekspresija markera ćelijske površine CD25 i niska ekspresija CD127 [19]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku selektivno smanjuje populaciju Treg-ova (Slika 6C), kompozicije za upotrebu prema pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše povećanje procenta Treg-ova u ćelijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije za upotrebu prema pronalasku mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju bolesti koje karakteriše povećanje procenta Treg-ova u ćelijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju bolesti koje karakteriše povećanje procenta CD4+CD25+CD127- ćelija u ćelijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti smanjenjem procenta Treg-ova u ćelijskoj populaciji. U jednom izvođenju,
1
kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju supresije imunološkog odgovora pomoću Tregs-a. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora selektivnom redukcijom Tregova. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u imunostimulaciji, pri čemu kompozicije pronalaska smanjuju broj ili procenat Tregova.
[0080] Primeri pokazuju da kompozicije pronalaska mogu biti u stanju da selektivno ciljaju Tregove, bez značajnog uticaja na ćelije kao što su B ćelije, CD4 T ćelije ili CD8 T ćelije. Prema tome, kompozicije pronalaska mogu selektivno smanjiti Tregove u PBMC, bez značajnog uticaja na procenat drugih testiranih tipova ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u selektivnom smanjenju broja ili procenta Tregova, pri čemu se broj ili procenat CD4 T ćelija ne menja značajno. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u selektivnom smanjenju broja ili procenta Tregova, pri čemu se broj ili procenat CD8 T ćelija ne menja značajno. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u selektivnom smanjenju broja ili procenta Treg-ova, pri čemu se broj ili procenat B ćelija ne menja značajno. U sledećem izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u selektivnom smanjenju broja ili procenta Treg-ova, pri čemu se broj ili procenat B ćelija, CD4 T ćelija i/ili CD8 T ćelija ne menja značajno.
[0081] Smanjenje procenta Treg-ova je bilo posebno iznenađujuće jer soj Megasphaera massiliensis MRx0029 proizvodi butirat, a butirat je povezan sa povećanim nivoima Treg ćelija u krvi i povećanom aktivnošću Treg-a [20]. Stoga je bilo neočekivano da će kompozicije pronalaska dovesti do smanjenja procenta Tregova u PBMC.
[0082] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja odnosa CD8 ćelija prema Treg ćelijama. CD8+ T ćelije (CD8 ćelije) su citotoksične T ćelije i igraju ključnu ulogu u imunološkoj odbrani od intracelularnih patogena. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava odnos i CD8/Treg ćelija i aktiviranih CD8/Treg ćelija (Slika 6G i Slika 6H), kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje u odnosu CD8/Treg i/ili aktiviranih CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje odnosa CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje odnosa aktiviranih CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti smanjenjem procenta Treg-ova u ćelijskoj populaciji, čime se povećava odnos CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti smanjenjem procenta Treg u ćelijskim populacijama, čime se povećava odnos CD8/Treg ćelija, pri čemu povećanje odnosa CD8/Treg ćelija dovodi do imunostimulacija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti smanjenjem procenta Treg-ova u ćelijskoj populaciji, čime se povećava odnos aktiviranih CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti smanjenjem procenta Treg u ćelijskoj populaciji, čime se
2
povećava odnos CD8/Treg ćelija, pri čemu povećanje odnosa aktiviranih CD8/Treg ćelija rezultira u stimulaciji imuniteta. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povećanjem odnosa CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povećanjem odnosa aktiviranih CD8/Treg ćelija.
[0083] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja procenta CD19+CD3- ćelija u PBMC (Slika 6F). Prema tome, primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja procenta B ćelija u ćelijskoj populaciji. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava procenat B ćelija, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta B ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta B ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD19+CD3-ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem broja ili procenta B ćelija u ćelijskoj populaciji, pri čemu povećanje broja ili procenta B ćelija dovodi do imunološke stimulacije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povećanjem broja ili procenta B ćelija.
[0084] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja procenta CD8 T-citotoksičnih ćelija (Slika 6D) u PBMC. Prema tome, primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja procenta CD8 T ćelija u ćelijskoj populaciji. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava procenat CD8 T-citotoksičnih ćelija, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih ćelija u ćelijskoj populaciji, pri čemu povećanje broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih ćelija dovodi do imunološke stimulacije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povećanjem broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih ćelija.
[0085] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja procenta CD8+ aktiviranih ćelija (Slika 6E) u PBMC. Stoga, primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja procenta CD8+ aktiviranih ćelija u ćelijskoj populaciji. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava procenat ćelija aktiviranih CD8+, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta ćelija aktiviranih CD8+. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD8+ aktiviranih ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem broja ili procenta CD8+ aktiviranih ćelija u ćelijskoj populaciji, pri čemu povećanje broja ili procenta CD8+ aktiviranih ćelija dovodi do imunološke stimulacije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povećanjem broja ili procenta CD8+ aktiviranih ćelija.
[0086] Primeri pokazuju da primena kompozicija za upotrebu prema pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije proinflamatornih molekula u PBMC, kao što su proinflamatorni citokini (Slika 7 i Slika 9). Primeri imuno-stimulativnih (npr. proinflamatornih) molekula koji su pokazali povećanje nivoa ekspresije nakon primene kompozicija pronalaska uključuju IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α, IL-8 i IL-6. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju imunostimulativnih (npr. proinflamatornih) molekula, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije proinflamatornih molekula, kao što su proinflamatorni citokini. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti proinflamatornih molekula, posebno bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti proinflamatornih citokina. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α, IL-8 i IL-6. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-8. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti CD11b. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α i/ili IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-8. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti CD11b. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α i/ili IL6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-8. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti CD11b.
[0087] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-1β u PBMC. IL-1β je proinflamatorni citokin [21]. Proizvodnju i lučenje IL-1β reguliše inflamazom, proteinski kompleks koji je povezan sa aktivacijom inflamatornog odgovora [22]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju IL-1β, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-1β. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β. U jednom izvođenju, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β.
[0088] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-23. IL-23 je povezan sa zapaljenjem [23,24]. Predložene funkcije IL-23 u imunološkom odgovoru uključuju promovisanje proliferacije CD4+ memorijskih T ćelija i promovisanje lučenja IFN-γ dendritskim ćelijama (DC) [25]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju IL23, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-23. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-23. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-23. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23.
[0089] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije inflamatornog proteina makrofaga-3 (MIP3-α), ili CCL20 u PBMC. MIP3-α je inflamatorni hemokin koji se vezuje za CCR6 receptor i funkcioniše kao hemoatraktant za DC i memorijske T-ćelije. MIP3-α je povezan sa aktiviranjem adaptivnog imunološkog odgovora regrutovanjem nezrelih DC na mesto zapaljenja [26]. Disregulisana ekspresija MIP3-α je povezana sa bolestima kao što je inflamatorna bolest creva [27]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju MIP3-α, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije MIP3-α. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti MIP3-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti MIP3-. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti MIP3-α. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti MIP3-α. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera
2
massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti MIP3-α. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti MIP3-α.
[0090] Primeri pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije Faktora nekroze tumora alfa (TNF-α). TNF-α je proinflamatorni citokin za koji je poznato da je uključen u različite signalne puteve za promociju ćelijske smrti. TNF-α inicira apoptozu vezivanjem za njegov srodni receptor, TNFR-1, što dovodi do kaskade događaja cepanja u apoptotičkom putu [28]. TNF-α takođe može izazvati nekrozu putem mehanizma koji zavisi od RIP kinaze [29]. Pošto primena kompozicija pronalaska pokazuje povećanje ekspresije TNF-α, kompozicija pronalaska mogu biti korisna u lečenju bolesti, posebno za lečenje ili prevenciju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjena ekspresija TNF-α. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicija pronalaska mogu biti korisna za lečenje ili prevenciju bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanja ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanja ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α.
[0091] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-6 u PBMC. IL-6 je proinflamatorni citokin koji se proizvodi tokom upale i promoviše diferencijaciju nezrelih CD4+ T ćelija i diferencijaciju CD8+ T ćelija u citotoksične T ćelije [30]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju IL-6, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-6. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-6. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-6.
[0092] Bettelli i dr. [31] je objavio da IL-6 inhibira proizvodnju Treg-ova. Pošto Primeri pokazuju da kompozicije pronalaska povećavaju ekspresiju IL-6, kompozicije pronalaska mogu selektivno smanjiti broj ili procenat Treg-ova povećanjem ekspresije IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u imunostimulaciji povećanjem ekspresije IL-6. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u imunostimulaciji smanjenjem broja ili procenta Tregova. U jednom izvođenju, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u imunostimulaciji povećanjem ekspresije IL-6. U drugom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u imunostimulaciji smanjenjem broja ili procenta Treg-ova.
[0093] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-8 (videti Primer 8). IL-8 je proinflamatorni citokin koji pretežno luče makrofagi sa imunostimulativnim efektima. On indukuje hemotaksiju u ciljnim ćelijama, prvenstveno neutrofilima, ali i drugim granulocitima, uzrokujući da migriraju ka mestu infekcije. IL-8 takođe stimuliše fagocitozu. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju IL-8, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-8. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-8. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-8. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-8. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-8 i/ili aktivnosti IL-8. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-8. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-8.
[0094] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije CD11b (videti Primer 12). CD11b je proinflamatorni citokin sa imunostimulativnim efektima. CD11b se eksprimira na površini mnogih leukocita uključenih u urođeni imuni sistem i posreduje u zapaljenju regulacijom adhezije i migracije leukocita. CD11b je umešan u nekoliko imunoloških procesa, na primer u fagocitozu, ćelijski posredovanu citotoksičnost, hemotaksu i ćelijsku aktivaciju. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju CD11b, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje u ekspresiji CD11b. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti CD11b. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti CD11b. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti CD11b. U određenim izvođenjima,
2
bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije CD11b i/ili aktivnosti CD11b. U jednom izvođenju, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti CD11b. U jednom izvođenju, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povećanjem ekspresije i/ili aktivnosti CD11b.
[0095] Primeri pokazuju da kompozicije pronalaska mogu da indukuju aktivaciju NF-κB-Ap1 promotera (videti sliku 61). NF-κB je uključen u aktivaciju imunološkog odgovora, posebno stimulisanjem ekspresije medijatora zapaljenja i citokina uključenih u imunološki odgovor, na primer IL-6. Kao što je gore navedeno, povećanje ekspresije IL-6 pomaže da se stimuliše imuni sistem i stoga aktivacija NF-κB puta ima imunostimulacionu aktivnost. Shodno tome, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska aktiviraju NF-κB signalizaciju i na taj način stimulišu imuni sistem. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska stimulišu ekspresiju medijatora zapaljenja i imunostimulacionih citokina povećanjem aktivacije NF-κB promotera.
Kanceri
[0096] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka mozga, posebno neuroblastoma. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma, posebno metastatskog melanoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka mozga. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji neuroblastoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma. U najpoželjnijoj varijanti, kompozicija pronalaska sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis i za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka mozga, posebno neuroblastoma. U sledećem najpoželjnijem izvođenju, kompozicija pronalaska sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis i za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma, posebno metastatskog melanoma.
[0097] Primeri (Primer 1) pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije beta tubulina (β3 tubulina) klase III u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma. β3 tubulin je široko poznat kao neuronski marker [32]. Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije proteina 2 (MAP2) povezanog sa mikrotubulama u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma. MAP2 se pretežno eksprimuje u neuronima i funkcioniše tako da stabilizuje mikrotubule, da podstiče razvoj dendrita i izrastanje neurita [33]. MAP2 je poznat kao marker diferenciranih neurona.
[0098] Sredstva koja izazivaju ćelijsku diferencijaciju su povezana sa terapijom raka, pošto je primena agenasa za diferencijaciju ćelija bila povezana sa inhibicijom
2
rasta tumora [34]. Stoga, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka izazivanjem ćelijske diferencijacije, posebno neuronske diferencijacije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka mozga izazivanjem neuronske diferencijacije, posebno za lečenje neuroblastoma.
[0099] Štaviše, utvrđeno je da je MAP2 visoko eksprimiran u primarnim kožnim melanomima, ali ima smanjenu ekspresiju u metastatskim melanomima [35]. Pretpostavka je da povećana ekspresija proteina koji stabilizuju mikrotubule ili tretman proteinima koji stabilizuju mikrotubule kao što je MAP2 može ometati dinamičku nestabilnost mikrotubula koja je potrebna tokom ćelijske deobe. Zbog toga se smatra da povećanje regulacije MAP2 ometa deobu ćelija i odlaže rast tumora kod raka [35]. Prema tome, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje raka, posebno metastatskih kancera. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u postupku lečenja raka. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera posredovanih smanjenom ekspresijom MAP2. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera koje karakteriše smanjena ili odsutna ekspresija MAP2. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u povećanju ekspresije MAP2 u lečenju raka. U poželjnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma.
[0100] U određenim izvođenjima, terapeutske kombinacije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma. Prema nekim izvođenjima, terapeutske kombinacije pronalaska imaju efekat na melanocite i mogu biti efikasne za lečenje melanoma. U određenim izvođenjima, terapeutske kombinacije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju melanoma.
[0101] Posebno, Primeri pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije MAP2 u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma. Pošto je MAP2 široko poznat kao marker diferenciranih neurona i pokazalo se da njegova ekspresija ima implikacije na rak, kompozicije pronalaska mogu biti posebno korisne za lečenje raka mozga, kao što je neuroblastom. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u postupku lečenja raka mozga. U poželjnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u postupku lečenja neuroblastoma.
[0102] Dalje, Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do značajnog smanjenja ekspresije dopaminskog receptora D2 (DRD2) (videti Primer 2 i Sliku 3). DRD2 je receptor povezan sa G-proteinom (GPCR) i deo je porodice dopaminskih receptora. DRD2 je uključen u signalne puteve koji promovišu opstanak ćelija, i stoga je povezan sa rakom. Prekomerna ekspresija ili pojačana regulacija DRD2 je umešana u nekoliko tipova raka, pošto maligne ćelije pokazuju povećanu ekspresiju DRD2 u poređenju sa normalnim ćelijama [36]. Pokazalo se da
2
inhibicija DRD2 preko DRD2-specifičnih antagonista ima antitumorske efekte. Pokazalo se da antagonisti DRD2 imaju antitumorsku efikasnost kod mnogih karcinoma, uključujući rak dojke [37][38], glioblastom [39][40][41], neuroblastom [42], hepatocelularni karcinom [43], rak pluća, rak prostate [44], rak grlića materice [45], rak jajnika [46], limfom [47] i rak želuca [48]. Stoga, kompozicije koje smanjuju nivo ekspresije DRD2 mogu biti korisne za lečenje raka. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku smanjuje ekspresiju DRD2, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka, posebno za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka koje karakteriše povećana ekspresija DRD2. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju karcinoma koje karakteriše povećana ekspresija i/ili aktivnost DRD2. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju ekspresije i/ili aktivnosti DRD2 u lečenju kancera. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje raka, posebno raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, raka mozga, posebno glioblastoma i neuroblastoma, karcinoma, posebno hepatocelularnog karcinoma, raka pluća, limfoma raka prostate i / ili raka želuca. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju raka smanjenjem nivoa i/ili aktivnosti DRD2.
[0103] Prabhu i dr. Ističe da je ONC201, antagonist DRD2, pokazao efikasnost u smanjenju tumora na modelima glioblastoma. Ekspresija DRD2 je pojačana u tumorima glioblastoma, i stoga je DRD2 atraktivna meta za terapiju raka [49]. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji glioblastoma.
[0104] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije kaspaze 3 (Casp3) u ćelijama SH-SY5Y. Kaspaze su deo porodice cistein proteaza i poznato je da promovišu apoptozu. Casp3 je poznat kao "izvršna kaspaza", koja igra važnu ulogu u kaskadi cepanja ćelijskih proteina u apoptotičkom putu. Smanjenje ekspresije Casp3 je ranije prikazano kod karcinoma raka dojke, jajnika i grlića materice, a smatra se da smanjena ekspresija Casp3 promoviše opstanak ćelija u kanceroznom tkivu [50]. Stoga, kompozicije koje povećavaju nivo ekspresije izvršnih kaspaza, posebno Casp3, mogu biti korisne za lečenje raka. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju Casp3, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka, posebno za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera posredovanih ekspresijom Casp3. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji karcinoma koje karakteriše smanjena ili odsutna ekspresija Casp3. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje kancera koje karakteriše smanjena ili odsutna ekspresija izvršne kaspaze. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju kancera koji se karakteriše smanjenom ili odsutnom ekspresijom Casp3. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u povećanju ekspresije Casp3 u lečenju kancera. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje raka, posebno raka dojke, raka jajnika i/ili raka grlića materice. U jednom izvođenju,
2
kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje raka povećanjem nivoa i/ili aktivnosti Casp3.
[0105] Štaviše, prijavljeno je da su kaspaze uključene u druge procese osim apoptoze, kao što je diferencijacija ćelija [51]. Primeri (Primer 1 i Primer 3) pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije neuronskih markera β3 tubulina i MAP2, i takođe povećati ekspresiju Casp3 u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma. Pošto kompozicije pronalaska mogu dovesti do povećanja ekspresije neuronskih markera i proteina za koje je poznato da igraju ulogu u diferencijaciji ćelija, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u diferencijaciji neurona od nediferenciranih ćelija.
[0106] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do smanjenja vitalnosti ćelija u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma (Slika 5). Konkretno, Primeri pokazuju da primena MRx0029 u koncentraciji od 5% ili 10% izaziva značajno smanjenje vitalnosti ćelije u zavisnosti od doze (Slika 5).
[0107] Poznato je da je smanjenje vitalnosti ćelije ili povećana ćelijska smrt kancerogenih ćelija meta za lečenje raka [52]. Stoga, kompozicije koje smanjuju vitalnost ćelija u ćelijskim linijama raka, kao što su ćelijske linije neuroblastoma, mogu biti korisne za lečenje raka. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka smanjenjem vitalnosti ćelija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka povećanjem ćelijske smrti.
[0108] Dalje, pošto Primeri pokazuju da kompozicije pronalaska istovremeno povećavaju ekspresiju Casp3 i smanjuju vitalnost ćelije (Slika 4 i Slika 5), predloženo je da kompozicije pronalaska smanjuju vitalnost ćelije povećanjem regulacije apoptoze. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u regulaciji apoptoze. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka povećanjem ćelijske smrti, posebno povećanjem apoptoze. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka smanjenjem vitalnosti ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka smanjenjem vitalnosti ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka povećanjem apoptoze. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka povećanjem apoptoze. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju karcinoma koje karakteriše smanjena ili odsutna ekspresija Casp3 povećanjem apoptoze. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u povećanju apoptoze u lečenju raka. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju vitalnosti ćelija u lečenju raka.
[0109] Primeri pokazuju da kompozicije pronalaska povećavaju ekspresiju i Casp3 i MAP2. Stoga, povećana regulacija Casp3 i povećana regulacija MAP2 mogu biti povezane.
[0110] Acetilacija i deacetilacija histona su važni epigenetski regulatori ekspresije gena. Epigenetska regulacija je moćno sredstvo za regulisanje svih aspekata funkcije
2
ćelije. Histon deacetilaze (HDAC) potiskuju ekspresiju gena uklanjanjem acetil grupa iz aminokiseline ε-N-acetil lizin na histonu, omogućavajući histonima da čvršće omotaju DNK i rezultiraju supresijom transkripcije kroz nukleozomsku nedostupnost. HDAC ima 18 izoforma koje su organizovane u četiri klase: Klasa I, II, III i IV. Promene u nivoima HDAC primećene su kod mnogih tipova bolesti uključujući, na primer, rak, zarazne bolesti, inflamatorne bolesti i neurodegenerativne bolesti [53,54,55].
[0111] HDAC inhibitori (HDACi) su nova klasa obećavajućih lekova protiv raka za koje se pokazalo da izazivaju zaustavljanje rasta, diferencijaciju, apoptozu, smanjenje angiogeneze i modulaciju imunološkog odgovora u različitim ćelijskim linijama raka [56, 57,58,59]. Iako precizan mehanizam kojim se posreduje klinička aktivnost ovih agenasa ostaje nejasan, širok spektar HDACi se trenutno istražuje kao potencijalni agens protiv raka. Štaviše, zbog dokazane antikancerogene aktivnosti u in vitro i in vivo studijama, mnogi HDACi su brzo napredovali kroz klinički razvoj, bilo kao monoterapije ili u kombinaciji sa drugim agensima protiv raka [60]. Među njima, vorinostat (Zolinza™), romidepsin (Istodak™) i belinostat (Beleodak™) su dobili odobrenje američke FDA za lečenje limfoma. Limfom i drugi karcinomi krvi (koji se takođe nazivaju hematološki karcinomi ili hematološki maligniteti) su posebno osetljivi na HDACi. Mikrobiota creva, sa svojom ogromnom raznovrsnošću i metaboličkim kapacitetom, predstavlja ogroman metabolički rezervoar za proizvodnju velikog broja molekula sa potencijalnim efektima na aktivnost HDAC. Nekoliko studija je procenilo HDAC inhibitornu aktivnost metabolita dobijenih iz mikroba, osim butirata, za koji se pokazalo da inhibira HDAC i povezan je sa poboljšanjem motoričke funkcije kod Hantingtonove bolesti [61].
[0112] Primeri pokazuju da kompozicije pronalaska inhibiraju HDAC aktivnost, posebno HDAC klase I, na primer HDAC2 (Primeri 9 i 10). Shodno tome, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska moduliraju HDAC aktivnost. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska inhibiraju HDAC. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su HDACi. U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC klase I. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC klase II. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC klase III. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC klase IV. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC1. U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC2. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC3. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC kroz proizvodnju valerijanske kiseline. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju aktivnost HDAC kroz proizvodnju natrijum butirata. U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka smanjenjem HDAC aktivnosti. U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera povezanih sa HDAC. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, neuroblastoma, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, limfoma, kolorektalnog karcinoma, hematoloških maligniteta i/ili raka želuca smanjenjem aktivnosti HDAC. U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji hematoloških maligniteta smanjenjem HDAC aktivnosti.
[0113] U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost kompozicija pronalaska dovodi do zaustavljanja rasta. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost kompozicija pronalaska dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost kompozicija pronalaska dovodi do diferencijacije ćelija. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost kompozicija pronalaska dovodi do apoptoze. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost kompozicija prema pronalasku dovodi do smanjenja angiogeneze. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost kompozicija pronalaska dovodi do modulacije imunološkog odgovora. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju HDAC aktivnosti kao monoterapija. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju HDAC aktivnosti kao kombinovana terapija. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u kombinaciji sa drugim agensom protiv raka. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u kombinaciji sa više od jednim drugim sredstvom protiv raka. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u kombinaciji sa inhibitorom proteazoma. U daljim izvođenjima, kompozicije pronalaska su epigenetski regulatori. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakterišu epigenetske aberacije.
[0114] U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis modulira aktivnost HDAC. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis inhibira HDAC. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je HDACi. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC klase I. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC klase II. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC klase III. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC klase IV. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC1. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC2. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC3. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC kroz proizvodnju valerijanske kiseline. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste
1
Megasphaera massiliensis smanjuje aktivnost HDAC kroz proizvodnju natrijum butirata. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka smanjenjem HDAC aktivnosti. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera povezanih sa HDAC. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, raka dojke, raka jajnika, raka grlića materice, neuroblastoma, glioblastoma, karcinoma, raka pluća, hronične limfocitne leukemije, raka prostate, kolornog limfoma, raka, hematoloških maligniteta i/ili raka želuca smanjenjem aktivnosti HDAC. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji hematoloških maligniteta smanjenjem HDAC aktivnosti.
[0115] U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost bakterijskog soja vrste Megasphaera massiliensis dovodi do zaustavljanja rasta. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost bakterijskog soja vrste Megasphaera massiliensis dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost bakterijskog soja vrste Megasphaera massiliensis dovodi do diferencijacije ćelija. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost bakterijskog soja vrste Megasphaera massiliensis dovodi do apoptoze. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis dovodi do smanjenja angiogeneze. U određenim izvođenjima, HDAC inhibitorna aktivnost bakterijskog soja vrste Megasphaera massiliensis rezultira modulacijom imunološkog odgovora. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju HDAC aktivnosti kao monoterapija. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju HDAC aktivnosti kao kombinovana terapija. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u kombinaciji sa drugim sredstvom protiv raka. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u kombinaciji sa više od jednim drugim sredstvom protiv raka. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u kombinaciji sa inhibitorom proteazoma. U daljim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je epigenetski regulator. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakterišu epigenetske aberacije.
[0116] Kompozicije pronalaska su u stanju da regulišu permeabilnost epitela modifikovanjem intracelularne signalne transdukcije uključene u ekspresiju i lokalizaciju proteina uključenih u funkciju barijere creva. Posebno, kompozicije pronalaska pojačavaju ekspresiju mRNA Occludin, Villin, proteina čvrstog spoja 1 (TJP1) i proteina čvrstog spoja 2 (TJP2). Kompozicije pronalaska stoga funkcionišu tako da povećavaju funkciju barijere creva i smanjuju propustljivost creva (Primer 11). U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u povećanju
2
funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju permeabilnosti creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji smanjenja funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji povećane permeabilnosti creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja koje karakteriše smanjenje funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja koje karakteriše povećana propustljivost creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji smanjenja funkcije barijere creva koja je rezultat radioterapije ili hemoterapije. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji povećane permeabilnosti creva koja je rezultat radioterapije ili hemoterapije. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji kaheksije povećanjem funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji kaheksije smanjenjem propustljivosti creva. U određenim izvođenjima, kaheksija je kaheksija raka.
[0117] U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u povećanju funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju permeabilnosti creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji smanjenja funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji povećane permeabilnosti creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja koje karakteriše smanjenje funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja koje karakteriše povećana permeabilnost creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji smanjenja funkcije barijere creva koja je rezultat radioterapije ili hemoterapije. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji povećane permeabilnosti creva koja je rezultat radioterapije ili hemoterapije. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kaheksije povećanjem funkcije barijere creva. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kaheksije smanjenjem propustljivosti creva. U određenim izvođenjima, kaheksija je kaheksija raka.
[0118] U poželjnim izvođenjima, kompozicije su za lečenje raka kod pacijenata koji su podvrgnuti radioterapiji ili hemoterapiji. U takvim izvođenjima, kompozicija se može primeniti pre, tokom ili posle radioterapije ili hemoterapije. Pacijentima koji su podvrgnuti radioterapiji ili hemoterapiji ne bi trebalo davati sredstva koja izazivaju curenje iz creva, ali Megasphaera massiliensis promoviše funkciju barijere creva
[62], tako da su kompozicije pronalaska posebno pogodne za lečenje pacijenata koji su podvrgnuti radioterapiji ili hemoterapiji. Pokazalo se da aktivacija TLR-5 poboljšava oštećenje epitela izazvano zračenjem in vivo [63]. Kompozicije pronalaska takođe aktiviraju imuni sistem. U nekim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju oštećenja izazvanih radioterapijom. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju oštećenja izazvanih radioterapijom.
[0119] U nekim izvođenjima, kompozicije pronalaska mogu dovesti do smanjenja rasta tumora.
[0120] U određenim izvođenjima, tretman sa kompozicijama pronalaska dovodi do smanjenja veličine tumora ili smanjenja rasta tumora. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora ili smanjenju rasta tumora. Kompozicije pronalaska mogu biti efikasne za smanjenje veličine ili rasta tumora. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu kod pacijenata sa čvrstim tumorima. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju ili prevenciji angiogeneze u lečenju raka. Kompozicije pronalaska mogu imati efekat na imuni ili inflamatorni sistem, koji imaju centralnu ulogu u angiogenezi. Kompozicije pronalaska mogu imati antimetastatsku aktivnost. Bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis može imati antimetastatsku aktivnost. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u prevenciji metastaza. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u prevenciji metastaza.
[0121] Primeri pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do smanjenja procenta Treg-ova u PBMC (Slika 6C). Tregovi su upleteni u rak, a infiltracija Treg-ova u tumorsko tkivo je povezana sa lošom prognozom [64]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska selektivno smanjuje populaciju Tregova (Slika 6C), kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji karcinoma koje karakteriše povećanje procenta Treg-ova u ćelijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju raka koji se karakteriše povećanjem procenta CD4+CD25+CD127- ćelija u ćelijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka smanjenjem broja ili procenta Treg-ova, posebno u kanceroznom tkivu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka selektivnom redukcijom Tregova.
[0122] Predloženo je da će selektivno smanjenje broja Treg-ova i aktiviranje efektorskih T ćelija, kao što su CD8+ T ćelije, biti efikasna terapija raka [64]. Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja odnosa CD8 ćelija prema Treg ćelijama. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava i odnos CD8/Treg ćelija i aktiviranih CD8/Treg ćelija (Slika 6G i Slika 6H), kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji karcinoma
4
koje karakteriše smanjenje odnosa CD8/Treg i/ili aktiviranih CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka koji karakteriše smanjenje odnosa CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka koji se karakteriše smanjenjem odnosa aktiviranih CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka smanjenjem procenta Tregova u ćelijskoj populaciji, čime se povećava odnos CD8/Treg ćelija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka smanjenjem procenta Treg-ova u ćelijskoj populaciji, čime se povećava odnos aktiviranih CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka povećanjem odnosa CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka povećanjem odnosa aktiviranih CD8/Treg ćelija.
[0123] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija prema pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije IL-1β. Kod raka povezanog sa kolitisom, smanjena ekspresija IL-1β na tumorskim mestima je povezana sa simptomima kao što su povećan ishod bolesti i morbiditet [65]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava ekspresiju IL-1β, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka koje karakteriše smanjena ili odsutna ekspresija IL-1β. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka povećanjem ekspresije IL-1β.
[0124] Primeri pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije Faktora nekroze tumora alfa (TNF-α). TNF-α je proinflamatorni citokin za koji je poznato da je uključen u različite signalne puteve za promociju ćelijske smrti. TNF-α inicira apoptozu vezivanjem za njegov srodni receptor, TNFR-1, što dovodi do kaskade događaja cepanja u apoptotičkom putu. TNF-α takođe može izazvati nekrozu putem mehanizma koji zavisi od RIP kinaze. Pošto mnoge vrste raka imaju defektne apoptotičke i nekrotične puteve, a poznato je da TNF-α posreduje u ovim putevima ćelijske smrti, TNF-α je potencijalna meta za terapiju raka. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava ekspresiju TNF-α, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka, posebno za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera posredovanih ekspresijom TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje karcinoma posredovanih ekspresijom TNF-α, posebno kancera sa smanjenom ekspresijom i/ili aktivnošću TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje raka. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje raka povećanjem nivoa i/ili aktivnosti TNF-α.
[0125] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka dojke. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka dojke. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka dojke. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju an iogeneze u lečenju raka dojke. U poželjnim izvođenjima rak je karcinom dojke. U poželjnim izvođenjima, rak je stadijum IV raka dojke.
[0126] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka pluća. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka pluća. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka pluća. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka pluća. U poželjnim izvođenjima rak je karcinom pluća.
[0127] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka jetre. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka jetre. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka jetre. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka jetre. U poželjnim izvođenjima rak je hepatom (hepatocelularni karcinom).
[0128] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju melanoma. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angio geneze u lečenju melanoma. U poželjnim izvođenjima, melanom je metastatski melanom.
[0129] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka jajnika. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka jajnika. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka jajnika. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka jajnika.
[0130] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka grlića materice. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka grlića materice. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka grlića materice. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka grlića materice.
[0131] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji neuroblastoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju neuroblastoma. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji neuroblastoma. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju neuroblastoma.
[0132] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji glioblastoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju glioblastoma. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji glioblastoma. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju glioblastoma.
[0133] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka prostate. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka prostate. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka prostate. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka prostate.
[0134] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji hematoloških maligniteta. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju hematoloških maligniteta. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji hematoloških malignih bolesti. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju hematoloških maligniteta. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je akutna leukemija. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je hronična leukemija. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je akutna mijeloidna leukemija. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je hronična mijeloidna leukemija. U određenim izvođenjima hematološki malignitet je akutna limfocitna leukemija. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je hronična limfocitna leukemija. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je limfom. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je multipli mijelom. U određenim izvođenjima, hematološki malignitet je mijelodisplastični sindrom.
[0135] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji hronične limfocitne leukemije. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju hronične limfocitne leukemije. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji hronične limfocitne leukemije. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju hronične limfocitne leukemije.
[0136] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji limfoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju limfoma. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji limfoma. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angio geneze u lečenju limfoma. U određenim izvođenjima, limfom je Hodgkinov limfom. U određenim izvođenjima, limfom je Non-Hodgkinov limfom.
[0137] U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka želuca. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka želuca. U poželjnim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka želuca. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka želuca.
[0138] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka debelog creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji kolorektalnog raka. Kompozicije pronalaska mogu imati efekat na ćelije raka debelog creva i mogu biti efikasne za lečenje raka debelog creva. Kompozicije pronalaska mogu imati efekat na ćelije raka debelog creva i mogu biti efikasne za lečenje kolorektalnog raka. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka debelog creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju kolorektalnog raka. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka debelog creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kolorektalnog raka. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka debelog creva. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju kolorektalnog raka. U poželjnim izvođenjima rak je kolorektalni adenokarcinom.
[0139] U određenim izvođenjima, terapeutske kombinacije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka bubrega (koji se ovde takođe naziva rak bubrega). U određenim izvođenjima, terapeutske kombinacije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka bubrega. U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka bubrega (koji se ovde takođe naziva rak bubrega). U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka bubrega. Primeri pokazuju da terapeutske kombinacije pronalaska imaju efekat na ćelije raka bubrega i mogu biti efikasne za lečenje raka bubrega. U poželjnim izvođenjima rak je karcinom bubrežnih ćelija ili karcinom prelaznih ćelija. U nekim izvođenjima, rak je rak creva. U nekim izvođenjima, rak je na delu tela koji nije crevo. U nekim izvođenjima, rak nije rak creva. U nekim izvođenjima, rak nije kolorektalni rak. U nekim izvođenjima, rak nije rak tankog creva. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija se dešava na mestu koje nije u crevima. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija se dešava u crevima i takođe na mestu koje nije u crevima.
[0140] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji karcinoma. Kompozicije pronalaska mogu biti efikasne za lečenje brojnih tipova karcinoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji neimunogenog raka. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji karcinoma. Bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis može biti efikasan za lečenje brojnih vrsta karcinoma. U određenim izvođenjima, bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju ili prevenciji neimunogenog raka. Primeri pokazuju da kompozicije pronalaska mogu biti efikasne za lečenje neimunogenih kancera.
[0141] Terapeutski efekti kompozicija pronalaska za lečenje raka mogu biti posredovani proinflamatornim mehanizmom. Ekspresija brojnih proinflamatornih citokina može biti povećana nakon primene MRx0029. Zapaljenje može imati efekat supresije raka [66], a proinflamatorni citokini kao što je TNF-α se razmatraju kao terapije za lečenje raka [67]. Povećana regulacija gena kao što je TNF-α prikazana u Primerima može ukazivati na to da kompozicije pronalaska mogu biti korisne za lečenje raka putem sličnog mehanizma. Povećanje regulacije CXCR3 liganda kao što je (CXCL9) može ukazivati na to da kompozicije pronalaska izazivaju odgovor tipa IPNγ. IPNγ je snažan faktor aktiviranja makrofaga koji može da stimuliše tumoricidnu aktivnost [68], a CXCL9, na primer, takođe ima antikancerogene efekte
[69-71]. Primeri pokazuju da ekspresija određenog broja proinflamatornih citokina može biti povećana nakon primene MRx0029. Prema tome, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u podsticanju zapaljenja u lečenju raka. U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju Th1 inflamacije u lečenju raka. Th1 ćelije proizvode IPNγ i imaju snažno dejstvo protiv raka [66]. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka u ranom stadijumu, kao što je rak koji nije metastazirao, ili stadijum 0 ili stadijum 1 raka. Podsticanje zapaljenja može biti efikasnije protiv raka u ranoj fazi [66]. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za poboljšanje efekta drugog sredstva protiv raka. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u podsticanju zapaljenja da bi se pojačao efekat drugog agensa protiv raka. U određenim izvođenjima, lečenje ili prevencija raka obuhvata povećanje nivoa ekspresije jednog ili više citokina. U određenim izvođenjima, lečenje ili prevencija raka obuhvata povećanje nivoa ekspresije jednog ili više proinflamatornih citokina. Na primer, u određenim izvođenjima, lečenje ili prevencija raka obuhvata povećanje nivoa ekspresije jednog ili više IL-1β, IL-6, MIP-3α, CXCL9, IL-23, MCP-1, GMCSF i TNF-α. U određenim izvođenjima, lečenje ili prevencija raka obuhvata povećanje nivoa ekspresije jednog ili više IL-1b i MIP-3α. Poznato je da povećanje nivoa ekspresije bilo kog od IL-1β, IL-6 i TNF-α ukazuje na efikasnost u lečenju raka.
[0142] Kada se bakterijski soj kako je ovde opisan koristi u kombinaciji sa lipopolisaharidom (LPS), može doći do sinergističkog povećanja IL-1β Poznato je da LPS izaziva proinflamatorni efekat. Prema tome, u određenim izvođenjima, tretman ili prevencija obuhvata korišćenje soja bakterije kako je ovde opisano u kombinaciji sa agensom koji povećava IL-1β. U određenim izvođenjima, tretman ili prevencija obuhvata korišćenje soja bakterije kako je ovde opisano u kombinaciji sa LPS. Shodno tome, kompozicija pronalaska može dodatno da sadrži agens koji povećava IL-1β. Shodno tome, kompozicija pronalaska može dodatno da sadrži LPS.
[0143] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju pacijenata koji su prethodno primali hemoterapiju. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju pacijenata koji nisu tolerisali hemoterapijski tretman. Kompozicije pronalaska mogu biti posebno pogodne za takve pacijente.
[0144] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska služe za sprečavanje relapsa. Kompozicije pronalaska mogu biti pogodne za dugotrajnu primenu. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u prevenciji progresije raka.
[0145] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju nestinoćelijskog karcinoma pluća. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju stinoćelijskog karcinoma pluća. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju skvamocelularnog karcinoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju
4
adenokarcinoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju tumora žlezda, karcinoidnih tumora ili nediferenciranih karcinoma.
[0146] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju hepatoblastoma, holangiokarcinoma, holangiocelularnog cistadenokarcinoma ili raka jetre koji je rezultat virusne infekcije.
[0147] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju invazivnog duktalnog karcinoma, duktalnog karcinoma in situ ili invazivnog lobularnog karcinoma.
[0148] U daljim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji akutne limfoblastne leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije, adrenokortikalnog karcinoma, karcinoma bazalnih ćelija, karcinoma žučnih kanala, raka bešike, tumora kostiju, osteosarkoma/malignog fibroznog histiocitoma, glioma moždanog stabla, tumora mozga, cerebelarnog astrocitoma, cerebralnog astrocitoma/malignog glioma, ependimoma, meduloblastoma, supratentorijalnih primitivnih neuroektodermalnih tumora, raka dojke, bronhijalnih adenoma/karcinoida, Burkitovog limfoma, karcinoidnog tumora, raka grlića materice, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije, hroničnih mijeloproliferativnih poremećaja, karcinoma debelog creva, kožnog T-ćelijskog limfoma, raka endometrijuma, ependimoma, raka jednjaka, Juingovog sarkoma, intraokularnog melanoma, retinoblastoma, raka žučne kese, raka želuca, gastrointestinalnog karcinoidnog tumora, gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST), tumora zametnih ćelija, glioma, vizuelnog puta u detinjstvu i hipotalamusa, Hodgkinovog limfoma, melanoma, karcinoma ćelija ostrvaca, Kaposijevog sarkoma, raka bubrežnih ćelija, raka larinksa, leukemija, limfoma, mezotelioma, neuroblastoma, ne-Hodgkinovog limfoma, orofaringealnog karcinoma, osteosarkoma, raka jajnika, raka pankreasa, raka paratiroidne žlezde, raka faringesa, adenoma hipofize, neoplazije plazma ćelija, raka prostate, karcinoma bubrežnih ćelija, retinoblastoma, sarkoma, raka testisa, raka štitne žlezde ili rak materice. U daljim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji hematoloških maligniteta, multiplog mijeloma ili mijelodisplastičnih sindroma.
[0149] Kompozicije pronalaska mogu biti posebno efikasne kada se koriste u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima. Imunomodulatorni efekti kompozicija prema pronalasku mogu biti efikasni kada se kombinuju sa direktnijim agensima protiv raka. Stoga, u određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis i sredstvo protiv raka. U određenim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku koja sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u stimulisanju kancera da bi se povećala njegova osetljivost na tretman sa drugim sredstvom protiv raka. U određenim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku koja sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis je za upotrebu u lečenju raka, kao što je rak mozga, povećanjem njegove osetljivosti na lečenje drugim agensom protiv raka. Drugi agens protiv raka može se davati istovremeno, ili se može primeniti nakon kompozicije koja sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis, kao što je najmanje dan, nedelju ili mesec posle.
[0150] U poželjnim izvođenjima, agens protiv raka je inhibitor imunološke kontrolne tačke, ciljana imunoterapija antitelom, terapija CAR-T ćelijama, onkolitički virus ili citostatski lek. U poželjnim izvođenjima, kompozicija sadrži sredstvo protiv raka izabrano iz grupe koju čine: Yervoy (ipilimumab, BMS); Keytruda (pembrolizumab, Merck); Opdivo (nivolumab, BMS); MEDI4736 (AZ/MedImmune); MPDL3280A (Roche/Genentech); Tremelimumab (AZ/MedImmune); CT-011 (pidilizumab, CureTech); BMS-986015 (lirilumab, BMS); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MSB-0010718C (Merck); PF-05082566 (Pfizer); MEDI6469 (AZ/MedImmune); BMS-986016 (BMS); BMS663513 (urelumab, BMS); IMP321 (Prima Biomed); LAG525 (Novartis); ARGX-110 (arGEN-X); PF-05082466 (Pfizer); CDX-1127 (varlilumab; CellDex Therapeutics); TRX-518 (GITR Inc.); MK-4166 (Merck); JTX-2011 (Jounce Therapeutics); ARGX-115 (arGEN-X); NLG-9189 (indoximod, NewLink Genetics); INCB024360 (Incyte); IPH2201 (Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919 (NewLink Genetics); anti-VISTA (JnJ); Epacadostat (INCB24360, Incyte); F001287 (Flexus/BMS); CP 870893 (University of Pennsylvania); MGA271 (Macrogenix); Emactuzumab (Roche/Genentech); sertib (Eli Lilly); Ulocuplumab (BMS); BKT140/BL8040 (Biokine Therapeutics); Bavituximab (Peregrine Pharmaceuticals); CC 90002 (Celgene); 852A (Pfizer); VTX-2337 (VentiRx Pharmaceuticals); IMO-2055 (Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299 (Eli Lilly); EW-7197 (Ewha Women’s University, Korea); Vemurafenib (Plexxikon); Dabrafenib (Genentech/GSK); BMS-777607 (BMS); BLZ945 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); Unituxin (dinutuximab, United Therapeutics Corporation); Blincyto (blinatumomab, Amgen); Cyramza (ramucirumab, Eli Lilly); Gazyva (obinutuzumab, Roche/Biogen); Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine, Roche/Genentech); Perjeta (pertuzumab, Roche/Genentech); Adcetris (brentuximab vedotin, Takeda/Millennium); Arzerra (ofatumumab, GSK); Vectibix (panitumumab, Amgen); Avastin (bevacizumab, Roche/Genentech); Erbitux (cetuximab, BMS/Merck); Bexxar (tositumomab-I131, GSK); Zevalin (ibritumomab tiuxetan, Biogen); Campath (alemtuzumab, Bayer); Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, Pfizer); Herceptin (trastuzumab, Roche/Genentech); Rituxan (rituximab, Genentech/Biogen); volociximab (Abbvie); Enavatuzumab (Abbvie); ABT-414 (Abbvie); Elotuzumab (Abbvie/BMS); ALX-0141 (Ablynx); Ozaralizumab (Ablynx); Actimab-C (Actinium); Actimab-P (Actinium); Milatuzumab-dox (Actinium); Emab-SN-38 (Actinium); Naptumonmab estafenatox (Active Biotech); AFM13 (Affimed); AFM11 (Affimed); AGS-16C3F (Agensys); AGS-16M8F (Agensys); AGS-22ME (Agensys); AGS-15ME (Agensys); GS-67E (Agensys); ALXN6000 (samalizumab, Alexion); ALT-836 (Altor Bioscience); ALT-801 (Altor Bioscience); ALT-803 (Altor Bioscience); AMG780 (Amgen); AMG 228 (Amgen); AMG820 (Amgen); AMG172 (Amgen); AMG595 (Amgen); AMG110 (Amgen); AMG232 (adecatumumab, Amgen); AMG211 (Amgen/MedImmune); BAY20-10112 (Amgen/Bayer); Rilotumumab (Amgen); Denosumab (Amgen); AMP-514 (Amgen); MEDI575 (AZ/MedImmune); MEDI3617 (AZ/MedImmune); MEDI6383 (AZ/MedImmune); MEDI551 (AZ/MedImmune); Moxetumomab pasudotox (AZ/MedImmune); MEDI565 (AZ/MedImmune); MEDI0639 (AZ/MedImmune); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MEDI562 (AZ/MedImmune); AV-380 (AVEO); AV203 (AVEO); AV299 (AVEO); BAY79-4620 (Bayer); Anetumab ravtansine (Bayer); vantictumab (Bayer); BAY94-9343 (Bayer); Sibrotuzumab (Boehringer Ingleheim); BI-836845 (Boehringer Ingleheim); B-701 (BioClin); BIIB015 (Biogen); Obinutuzumab (Biogen/Genentech); BI-505 (Bioinvent); BI-1206 (Bioinvent); TB-403 (Bioinvent); BT-062 (Biotest) BIL-010t (Biosceptre); MDX-1203 (BMS); MDX-1204 (BMS); Necitumumab (BMS); CAN-4 (Cantargia AB); CDX-011 (Celldex); CDX1401 (Celldex); CDX301 (Celldex); U3-1565 (Daiichi Sankyo); patritumab (Daiichi Sankyo); tigatuzumab (Daiichi Sankyo); nimotuzumab (Daiichi Sankyo); DS-8895 (Daiichi Sankyo); DS-8873 (Daiichi Sankyo); DS-5573 (Daiichi Sankyo); MORab-004 (Eisai); MORab-009 (Eisai); MORab-003 (Eisai); MORab-066 (Eisai); LY3012207 (Eli Lilly); LY2875358 (Eli Lilly); LY2812176 (Eli Lilly); LY3012217(Eli Lilly); LY2495655 (Eli Lilly); LY3012212 (Eli Lilly); LY3012211 (Eli Lilly); LY3009806 (Eli Lilly); cixutumumab (Eli Lilly); Flanvotumab (Eli Lilly); IMC-TR1 (Eli Lilly); Ramucirumab (Eli Lilly); Tabalumab (Eli Lilly); Zanolimumab (Emergent Biosolution); FG-3019 (FibroGen); FPA008 (Five Prime Therapeutics); FP-1039 (Five Prime Therapeutics); FPA144 (Five Prime Therapeutics); catumaxomab (Fresenius Biotech); IMAB362 (Ganymed); IMAB027 (Ganymed); HuMax-CD74 (Genmab); HuMaxTFADC (Genmab); GS-5745 (Gilead); GS-6624 (Gilead); OMP-21M18 (demcizumab, GSK); mapatumumab (GSK); IMGN289 (ImmunoGen); IMGN901 (ImmunoGen); IMGN853 (ImmunoGen); IMGN529 (ImmunoGen); IMMU-130 (Immunomedics); milatuzumabdox (Immunomedics); IMMU-115 (Immunomedics); IMMU-132 (Immunomedics); IMMU106 (Immunomedics); IMMU-102 (Immunomedics); Epratuzumab (Immunomedics); Clivatuzumab (Immunomedics); IPH41 (Innate Immunotherapeutics); Daratumumab (Janssen/Genmab); CNTO-95 (Intetumumab, Janssen); CNTO-328 (siltuximab, Janssen); KB004 (KaloBios); mogamulizumab (Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871 (ecromeximab, Life Science); Sonepcizumab (Lpath); Margetuximab (Macrogenics); Enoblituzumab (Macrogenics); MGD006 (Macrogenics); MGF007 (Macrogenics); MK-0646 (dalotuzumab, Merck); MK-3475 (Merck); Sym004 (Symphogen/Merck Serono); DI17E6 (Merck Serono); MOR208 (Morphosys); MOR202 (Morphosys); Xmab5574 (Morphosys); BPC-1C (ensituximab, Precision Biologics); TAS266 (Novartis); LFA102 (Novartis); BHQ880 (Novartis/Morphosys); QGE031 (Novartis); HCD122 (lucatumumab, Novartis); LJM716 (Novartis); AT355 (Novartis); OMP-21M18 (Demcizumab, OncoMed); OMP52M51 (Oncomed/GSK); OMP-59R5 (Oncomed/GSK); vantictumab (Oncomed/Bayer); CMC-544 (inotuzumab ozogamicin, Pfizer); PF-03446962 (Pfizer); PF-04856884 (Pfizer); PSMA-ADC (Progenics); REGN1400 (Regeneron); REGN910 (nesvacumab, Regeneron/Sanofi); REGN421 (enoticumab, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414 (parsatuzumab), RG7160 (imgatuzumab), RG7159 (obintuzumab), RG7686, RG3638 (onartuzumab), RG7597 (Roche/Genentech); SAR307746 (Sanofi); SAR566658 (Sanofi); SAR650984 (Sanofi); SAR153192 (Sanofi); SAR3419 (Sanofi); SAR256212 (Sanofi), SGN-LIV1A
4
(lintuzumab, Seattle Genetics); SGN-CD33A (Seattle Genetics); SGN-75 (vorsetuzumab mafodotin, Seattle Genetics); SGN-19A (Seattle Genetics) SGN-CD70A (Seattle Genetics); SEA-CD40 (Seattle Genetics); ibritumomab tiuxetan (Spectrum); MLN0264 (Takeda); ganitumab (Takeda/Amgen); CEP-37250 (Teva); TB-403 (Thrombogenic); VB4-845 (Viventia); Xmab2512 (Xencor); Xmab5574 (Xencor); nimotuzumab (YM Biosciences); Carlumab (Janssen); NY-ESO TCR (Adaptimmune); MAGE-A-10 TCR (Adaptimmune); CTL019 (Novartis); JCAR015 (Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR (Kite Pharma); UCART19 (Cellectis); BPX-401 (Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20 (Unum Therapeutics); CAR-NKG2D (Celyad); Onyx-015 (Onyx Pharmaceuticals); H101 (Shanghai Sunwaybio); DNX-2401 (DNAtrix); VCN-01 (VCN Biosciences); Colo-Adl (PsiOxus Therapeutics); ProstAtak (Advantagene); Oncos-102 (Oncos Therapeutics); CG0070 (Cold Genesys); Pexa-vac (JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1 (Genelux); T-VEC (Amgen); G207 (Medigene); HF10 (Takara Bio); SEPREHVIR (HSV1716, Virttu Biologics); OrienX010 (OrienGene Biotechnology); Reolysin (Oncolytics Biotech); SVV-001 (Neotropix); Cacatak (CVA21, Viralytics); Alimta (Eli Lilly), cisplatin, oxaliplatin, irinotecan, folinic acid, methotrexate, cyclophosphamide, 5- fluorouracil, Zykadia (Novartis), Tafinlar (GSK), Xalkori (Pfizer), Iressa (AZ), Gilotrif (Boehringer Ingelheim), Tarceva (Astellas Pharma), Halaven (Eisai Pharma), Veliparib (Abbvie), AZD9291 (AZ), Alectinib (Chugai), LDK378 (Novartis), Genetespib (Synta Pharma), Tergenpumatucel-L (NewLink Genetics), GV1001 (Kael-GemVax), Tivantinib (ArQule); Cytoxan (BMS); Oncovin (Eli Lilly); Adriamycin (Pfizer); Gemzar (Eli Lilly); Xeloda (Roche); Ixempra (BMS); Abraxane (Celgene); Trelstar (Debiopharm); Taxotere (Sanofi); Nexavar (Bayer); IMMU-132 (Immunomedics); E7449 (Eisai); Thermodox (Celsion); Cometriq (Exellxis); Lonsurf (Taiho Pharmaceuticals); Camptosar (Pfizer); UFT (Taiho Pharmaceuticals); and TS-1 (Taiho Pharmaceuticals).
[0151] U nekim izvođenjima, bakterijski soj Megasphaera massiliensis deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42761 je jedini terapeutski aktivan agens u kompoziciji pronalaska.
[0152] Pronalazači su identifikovali da sojevi bakterija iz roda Megasphaera mogu biti posebno efikasni za lečenje ili prevenciju raka koji obuhvata onkogenu ekstracelularnu signalizaciju kinaze povezane sa signalom (ERK). Ekstracelularna kinaza povezana sa signalom (ERK) je nizvodni efektor u putu kinaze proteina aktiviranog mitogenom (MAP), visoko očuvanom putu transdukcije signala koji se nalazi kod svih eukariota [72]. Put MAP-kinaze reguliše procese kao što su proliferacija ćelija, diferencijacija, preživljavanje i apoptoza, a aberantna aktivacija puta je usko povezana sa patogenezom raka. Kao što je opisano u primerima, primena kompozicija koje sadrže sojeve Megasphaera može inhibirati ERK signalizaciju u ćelijskim linijama raka; odnosno smanjiti ćelijske nivoe fosforilisanog ERK u odnosu na ukupni ERK protein. Pronalazači su takođe identifikovali da tretman sojevima Megasphaera može smanjiti klonogeno preživljavanje ćelijskih linija raka koje sadrže onkogenu ERK signalizaciju, posebno kod melanoma i ćelijskih linija kolorektalnog raka. Pronalazači su takođe identifikovali da tretman sojevima Megasphaera može da izazove ekspresiju gena proteina 2 povezanog sa mikrotubulama (MAP2), što ukazuje na posebnu korisnost u lečenju metastatskih kancera.
[0153] Prema tome, u određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija roda Megasphaera, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka, pri čemu rak obuhvata onkogenu ERK signalizaciju.
[0154] Kako se ovde koristi, "onkogena ERK signalizacija" se odnosi na rak koji obuhvata disregulisanu ćelijsku signalizaciju, kao što je signalizacija nezavisno od stimulusa, preko puta MAP kinaze, čiji je rezultat prekomerno aktivna signalizacija od strane ERK (bilo ERK1 ili ERK2 izoforma, ili oboje), što podstiče povećanu proliferaciju i/ili preživljavanje ćelija raka. ERK1 je aktivan (tj. signalizira) kada je fosforilisan na pozicijama Thr202 i Tir204. ERK 2 je aktivan (tj. signalizira) kada je fosforilisan na pozicijama Thr173 i Tir185. Shodno tome, "onkogena ERK signalizacija" može biti rezultat prisustva onkogenih mutacija u (mutacija dobijanja funkcije) ili prekomerne ekspresije pozitivnih regulatora puta MAP kinaze, ili onkogenih mutacija u (mutacija gubitka funkcije) ili smanjene ekspresije negativnih regulatora put MAP kinaze.
[0155] Rak koji obuhvata onkogenu ERK signalizaciju može se alternativno definisati kao rak koji je "izložen" ili "okarakterisan" onkogenom ERK signalizacijom. Rak koji obuhvata onkogenu ERK signalizaciju može se alternativno definisati kao rak gde je proliferacija i/ili preživljavanje malignih ćelija "stimulisano", "indukovano" ili "regulisano" ERK signalizacijom. Rak koji sadrži onkogeni ERK može se alternativno definisati kao rak koji sadrži, ispoljava ili karakteriše ERK signalizaciju "nezavisno od stimulansa".
[0156] "Onkogena mutacija" obuhvata bilo koju varijaciju amino kiselina u proteinu, u odnosu na protein divljeg tipa, koji promoviše proliferaciju i/ili preživljavanje ćelija raka, uključujući, ali ne ograničavajući se na, supstitucije (uključujući supstitucije pojedinačnih aminokiselina), umetanja i/ ili brisanja. Kao što je gore navedeno, onkogene mutacije mogu biti mutacije gubitka funkcije ili dobijanja funkcije, u zavisnosti od proteina i njegove funkcije unutar puta MAP-kinaze. "Prekomerna ekspresija" ili "smanjena ekspresija" se odnose na povećanu ili smanjenu ekspresiju proteina u ćeliji kancerozne u odnosu na nekanceroznu ćeliju.
[0157] Shodno tome, kanceri koji sadrže onkogenu ERK signalizaciju uključuju one koji sadrže onkogenu mutaciju u, ili prekomernu ekspresiju, BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, KRAS4A, KRAS4B, MEK1, MEK2, ERK1 ili ERK2; kao što su BRAF, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 ili ERK2. Ovi proteini su pozitivni regulatori puta MAP kinaze (tj. onkoproteini) [72]. Na primer, rak može da sadrži onkogenu mutaciju u BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 ili ERK2.
4
[0158] Kanceri koji obuhvataju onkogeno ERK signalizaciju takođe uključuju one koji sadrže (ili alternativno, ili kao dodatak gore navedenim onkogenim mutacijama/ prekomernoj ekspresiji) onkogenu mutaciju u, ili smanjenu ekspresiju RSK, DUSP1, DUSP5, DUSP6 ili SPRI. Ovi proteini su negativni regulatori puta MAP kinaze (tj. tumor supresorski proteini) [72].
[0159] Bilo koji rak koji sadrži onkogenu ERK signalizaciju može se lečiti ili sprečiti upotrebom kompozicija prema pronalasku, kao što su solidni tumori ili hematološki maligniteti. Takvi kanceri uključuju, ali nisu ograničeni na, kolorektalni rak, melanom, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), akutnu mijeloidnu leukemiju, adrenokortikalni rak, rak bazalnih ćelija, rak žučnih kanala, rak mokraćne bešike, tumor kostiju, osteosarkom/malignu fibrozu mozga, tumor mozga, cerebralni astrocitom/maligni gliom, ependimom, meduloblastom, supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, rak dojke, bronhijalne adenome/karcinoide, Burkitov limfom, karcinoidni tumor, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, hronične mijeloproliferativne poremećaje, kožni limfom T-ćelija, rak endometrijuma, ependimom, rak jednjaka, Evingov sarkom, intraokularni melanom, retinoblastom, rak žučne kese, rak želuca, karcinoidni tumor gastrointestinalnog trakta, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), tumor zametnih ćelija, gliom, vizuelni put u detinjstvu i hipotalamus, Hodgkinov limfom, karcinom ćelija ostrvaca, Kaposi sarkom, rak bubrežnih ćelija, rak larinksa, leukemije, limfome, mezoteliom, neuroblastom, ne-Hodgkin limfom, orofaringealni rak, osteosarkom, rak jajnika, pankreasa, rak paratireoidne žlezde, rak faringesa, adenom hipofize, neoplaziju plazma ćelija, rak prostate, karcinom bubrežnih ćelija, retinoblastom, sarkom, rak testisa, rak štitne žlezde ili rak materice.
[0160] Svaki rak koji sadrži onkogenu ERK signalizaciju može se lečiti ili sprečiti kompozicijom koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, i poželjno kolorektalni rak, melanom, rak prostate, adenokarcinom pluća kao što je nestinoćelijski adenokarcinom pluća, rak pankreasa, rak mokraćne bešike, leukemija kao što je leukemija vlašastih ćelija ili akutna mijeloidna leukemija, gliom, pilocitni astrocitom, rak jajnika, papilarni ili folikularni karcinom štitaste žlezde, seminom, rak jetre, mijelodisplastični sindrom, rak bubrega ili Hodgkinova bolest.
[0161] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija roda Megasphaera, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka koji obuhvata onkogenu mutaciju u BRAF, opciono gde rak dalje obuhvata prekomernu ekspresiju BRAF. Pronalazači su identifikovali da tretman sa sojevima Megasphaera može inhibirati klonogeno preživljavanje, inhibirati ERK signalizaciju i pojačati ekspresiju MAP2 gena u ćelijskim linijama raka koje sadrže onkogene BRAF mutacije, posebno onkogenu BRAF V600E mutaciju u ćelijskim linijama kolorektalnog raka i melanoma. Stoga, u poželjnim izvođenjima, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija roda Megasphaera, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka koji obuhvata onkogenu mutaciju na poziciji 600 BRAF-a, poželjno BRAF V600E. U posebno poželjnim izvođenjima, rak je kolorektalni rak ili melanom.
4
[0162] Pored, ili umesto, onkogene mutacije na poziciji 600 BRAF-a (kao što je V600E), rak može da sadrži onkogenu mutaciju izabranu između BRAF K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N571S, L58V G464R, G466A ili G469E; opciono pri čemu je rak kolorektalni rak. U drugom izvođenju, pored ili umesto mutacije V600E, rak može da sadrži onkogenu mutaciju izabranu između BRAF V600K, V600R ili V600D; opciono pri čemu je rak melanom.
[0163] U daljem izvođenju, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis, za upotrebu u postupku lečenja kolorektalnog raka, kao što je metastatski kolorektalni rak. Kao što je prikazano u primerima, pronalazači su otkrili da sojevi Megasphaera massiliensis mogu inhibirati klonogeno preživljavanje i ERK signalizaciju u ćelijskim linijama kolorektalnog raka.
[0164] U daljem izvođenju, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis, za upotrebu u postupku lečenja melanoma, kao što je metastatski melanom. Kao što je prikazano u primerima, pronalazači su otkrili da sojevi Megasphaera massiliensis mogu inhibirati klonogeno preživljavanje i ERK signalizaciju u ćelijskim linijama melanoma. Štaviše, sposobnost sojeva Megasphaera massiliensis da indukuju ekspresiju gena MAP2 u ćelijskim linijama melanoma ukazuje na posebnu efikasnost protiv metastatskog melanoma.
[0165] U poželjnim izvođenjima, BRAF inhibitor se primenjuje istovremeno, odvojeno ili uzastopno, u odnosu na primenu kompozicije koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera. Poželjno, BRAF inhibitor je selektivni inhibitor BRAF<V600E>, poželjno izabran između Vemurafeniba, Dabrafiniba ili Encorafeniba. Poželjnije, BRAF inhibitor je Vemurafenib.
[0166] U daljem izvođenju pronalazaka, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja se sastoji od bakterijskog soja roda Megasphaera i BRAF inhibitora, poželjno onih definisanih gore, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.
[0167] U drugim poželjnim izvođenjima, analog citidina se primenjuje istovremeno, odvojeno ili uzastopno, u odnosu na primenu kompozicije koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera. Poželjno, analog citidina se bira između Azacitidina-c, Decitabina ili Zebularina. Još poželjnije, analog citidina je Azacitidin-c.
[0168] U daljem izvođenju, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera i analoge citidina, poželjno onih definisanih gore, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.
[0169] U drugim poželjnim izvođenjima, inhibitor polimerizacije tubulina ili inhibitor depolimerizacije tubulina se primenjuje istovremeno, odvojeno ili uzastopno, u odnosu na primenu kompozicije koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera. Poželjno, inhibitor polimerizacije tubulina ili inhibitor depolimerizacije tubulina se bira između Paklitaksela, Abraksana, Docetaksela, Epotilona, (+)-Diskodermolida, Kolhicina, Kombretastatina, 2-Metoksiestradiola, E7010, Vinkristina, Vinblastina, Vinorelbina ili Vinflunina; poželjnije Paklitaksel.
4
[0170] U daljem izvođenju, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija roda Megasphaera i inhibitor polimerizacije tubulina ili inhibitor depolimerizacije tubulina, poželjno one definisane gore, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju ili prevenciji raka. U daljem izvođenju, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, za upotrebu u terapiji raka povećanjem osetljivosti raka na inhibitor polimerizacije ili depolimerizacije tubulina, poželjno u onima koji su gore definisani.
[0171] U daljim takvim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje:
1. Kompozicija koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 95% identična sa SEK ID BR:1, za upotrebu u metodi lečenja ili prevencije raka, posebno, pri čemu rak obuhvata onkogeno ERK signalizaciju.
2. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju u, ili smanjenu ekspresiju RSK, DUSP1, DUSP5, DUSP6 ili SPRI.
3. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju u, ili smanjenu ekspresiju RSK, DUSP1, DUSP5, DUSP6 ili SPRI.
4. Kompozicija za upotrebu prema izvođenju 2, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju ili prekomernu ekspresiju BRAF, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 ili ERK2.
5. Kompozicija za upotrebu prema izvođenju 2, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju u BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 ili ERK2.
6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju u BRAF ili NRAS, opciono gde rak dalje obuhvata prekomernu ekspresiju BRAF ili NRAS.
7. Kompozicija za upotrebu prema izvođenju 6, gde kancer sadrži onkogenu mutaciju u BRAF, opciono gde kancer dalje sadrži prekomernu ekspresiju BRAF.
8. Kompozicija za upotrebu prema izvođenju 7, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju na poziciji 600 BRAF-a.
9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom izvođenju od 6 do 8, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju izabranu između BRAF V600E, K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N581S, L597K, G469R ili G469A ; opciono pri čemu je rak kolorektalni rak.
10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom izvođenju od 6 do 8, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju izabranu između BRAF V600E, V600K, V600R ili V600D; opciono pri čemu je rak melanom.
4
11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom izvođenju od 6 do 10, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju BRAF V600E.
12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom izvođenju od 6 do 11, pri čemu rak sadrži onkogenu mutaciju NRAS K61R, opciono gde je rak melanom.
13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu je raka izabran između kolorektalnog raka, melanoma, raka prostate, adenokarcinoma pluća kao što je nesitnoćelijski adenokarcinom pluća, raka pankreasa, raka bešike, leukemije kao što je leukemija vlašastih ćelija ili akutne mijeloidne leukemije, glioma, pilocitnog astrocitoma, raka jajnika, papilarnog ili folikularnog raka štitaste žlezde, seminoma, raka jetre, mijelodisplastičnog sindroma, raka bubrega ili Hodgkinove bolesti.
14. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu je rak kolorektalni rak.
15. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom izvođenju od 1 do 13, pri čemu je rak melanom.
16. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu je bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis.
17. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, u postupku inhibicije ERK1 i/ili ERK2 signalizacije u lečenju ili prevenciji raka.
18. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, u postupku inhibicije ERK1 i/ili ERK2 fosforilacije u lečenju ili prevenciji raka.
19. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, u postupku indukovanja ekspresije gena MAP2 u lečenju ili prevenciji raka.
20. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, u postupku smanjenja veličine tumora, rasta tumora, prevencije ili inhibicije metastaza, ili sprečavanja angiogeneze u lečenju ili prevenciji raka.
21. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, u postupku inhibicije metastaza u lečenju raka.
22. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu postupak obuhvata istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu BRAF inhibitora, u odnosu na primenu kompozicije.
23. Kompozicija za upotrebu prema realizaciji 22, pri čemu BRAF selektivno inhibira BRAF<V600E>, poželjno pri čemu je BRAF inhibitor izabran između Vemurafeniba, Dabrafiniba ili Encorafeniba.
24. Kompozicija za upotrebu prema realizaciji 23, pri čemu je BRAF inhibitor Vemurafenib.
4
25. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu postupak obuhvata istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu analoga citidina, u odnosu na primenu kompozicije.
26. Kompozicija za upotrebu prema realizaciji 25, pri čemu je analog citidina izabran između Azacitidineka, Decitabina ili Zebularina.
27. Kompozicija za upotrebu prema realizaciji 26, pri čemu je analog citidina Azacitidin-c.
28. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom izvođenju, pri čemu postupak obuhvata istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu inhibitora polimerizacije tubulina ili inhibitora depolimerizacije tubulina, u odnosu na davanje kompozicije.
29. Kompozicija za upotrebu prema izvođenju 28, pri čemu je inhibitor polimerizacije tubulina ili inhibitor depolimerizacije tubulina izabran između Paklitaksela, Abraksana, Docetaksela, Epotilona, (+)-Diskodermolida, Kolhicina, Kombretastatina, 2-Metoksiestradiola, Vinbistinestradiola, Vinbistinestradiola, Ili Vinflunin.
[0172] Poželjno, kanceri koji sadrže onkogenu ERK signalizaciju koja se može lečiti ili sprečiti korišćenjem kompozicija pronalaska (posebno onih koji sadrže soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis) uključuju, ali nisu ograničeni na, kolorektalni rak, melanom, rak prostate, adenokarcinom pluća kao što je nesitnoćelisjki adenokarcinom pluća, rak pankreasa, rak mokraćne bešike, leukemija kao što je leukemija vlašastih ćelija ili akutna mijeloidna leukemija, gliom, pilocitni astrocitom, rak jajnika, papilarni ili folikularni karcinom štitaste žlezde, seminom, rak jetre, mijelodisplastični sindrom, rak bubrega i Hodgkinova bolest. Prijavljeno je da takvi kanceri obuhvataju prekomerno aktivan put MAP-kinaze (tj. onkogena ERK signalizacija) [72].
[0173] U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka koji sadrži onkogenu mutaciju u BRAF ili NRAS, opciono gde rak dalje obuhvata prekomernu ekspresiju BRAF ili NRAS. Poželjno, kompozicije prema pronalasku (posebno one koje sadrže bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis) su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka koji obuhvata onkogenu mutaciju u BRAF-u i opciono prekomernu ekspresiju BRAF-a.
[0174] Onkogene mutacije u BRAF-u obuhvataju V600E, K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N581S, L597Q, A598V, G464R, G466A ili G469E, koje su identifikovane kod kolorektalnog karcinoma [73], i kompozicije prema pronalasku (posebno one koje sadrže bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis) mogu se koristiti za lečenje ili prevenciju takvih kancera. Dalje onkogene mutacije u BRAF uključuju V600E, V600K, V600R ili V600D, koje su identifikovane kod melanoma [74], a kompozicije prema pronalasku (posebno one koje sadrže bakterijski soj vrste Megasphaera massiliensis) mogu se koristiti za lečenje ili sprečiti takve vrste raka. Aminokiseline u BRAF-u su numerisane prema UniProt unosu P15056 [75] (BRAF divljeg tipa).
[0175] U posebno poželjnom izvođenju, kompozicije pronalaska (posebno one koje sadrže soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis) su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka koji obuhvata mutaciju BRAF V600E. Ćelijske linije raka SKMEL28, 451Lu i HT29 sadrže ovu mutaciju u BRAF-u, a pronađeno je da soj Megasphaera u Primerima inhibira klonogeno preživljavanje, inhibira ERK signalizaciju i indukuje ekspresiju gena MAP2 u takvim ćelijskim linijama. Rak može dalje da obuhvata onkogenu mutaciju NRAS K61R. Ćelijska linija raka SKMEL2 sadrži ovu mutaciju u NRAS-u, a soj Megasphaera je pronađen u Primerima da indukuje ekspresiju gena MAP2 u ovoj ćelijskoj liniji.
[0176] Ćelijska linija HT29 korišćena u Primerima je ćelijska linija kolorektalnog raka, a pronađeno je da soj Megasphaera inhibira klonogeno preživljavanje i inhibira ERK signalizaciju u ovoj ćelijskoj liniji. Prema tome, u posebno poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska (posebno one koje sadrže soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis) se koriste za lečenje ili prevenciju kolorektalnog raka, kao što je kolorektalni raka koji sadrži mutaciju BRAF V600E.
[0177] Ćelijske linije SKMEL2 i SKMEL28 i 451Lu korišćene u Primerima su ćelijske linije melanoma, a pronađeno je da soj Megasphaera inhibira klonogeno preživljavanje, inhibira ERK signalizaciju i indukuje ekspresiju gena MAP2 u takvim ćelijskim linijama. Stoga, u posebno poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska (posebno one koje sadrže soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis) se koriste za lečenje ili prevenciju melanoma, kao što je melanom koji sadrži mutaciju BRAF V600E.
[0178] U drugom izvođenju, kompozicija pronalaska sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis, za upotrebu u postupku lečenja kolorektalnog raka. U drugom izvođenju, kompozicija pronalaska sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis, za upotrebu u postupku lečenja melanoma.
[0179] U bilo kom od gore navedenih aspekata i izvođenja, kompozicija pronalaska (posebno, kompozicija koja sadrži soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis) je poželjno za upotrebu u lečenju metastatskog raka. Kao što je navedeno u Primerima, pronađeno je da soj Megasphaera pojačava ekspresiju gena MAP2. Utvrđeno je da je MAP2 visoko eksprimiran u primarnim kožnim melanomima, ali ima smanjenu ekspresiju u metastatskim melanomima [76]. Predloženo je da povećana ekspresija proteina koji stabilizuju mikrotubule ili tretman proteinima koji stabilizuju mikrotubule kao što je MAP2 može ometati dinamičku nestabilnost mikrotubula koja je potrebna tokom ćelijske deobe. Zbog toga se smatra da pojačana regulacija MAP2 ometa deobu ćelija i odlaže rast tumora kod raka [76], što ukazuje da kompozicije pronalaska mogu imati posebnu primenu u lečenju metastatskih kancera.
[0180] Kao š to je pokazano u Primerima, kompozicije pronalaska koje sadrže soj Megasphaera imaju efekte indukovanja ekspresije gena MAP2 i inhibiranja ERK signalizacije u ćelijskim linijama melanoma i kolorektalnog raka. Prema tome, kompozicije pronalaska su korisne u postupcima inhibicije ERK signalizacije, kao što je ERK1 i/ili ERK2 signalizacija, u lečenju ili prevenciji raka koji obuhvata onkogeno
1
ERK signalizaciju, kao što je gore definisano. Kompozicije pronalaska su takođe korisne u postupcima inhibicije ERK fosforilacije, kao što je ERK1 i/ili ERK2 fosforilacija, u lečenju ili prevenciji takvih kancera. Kompozicije pronalaska su takođe korisne u postupcima indukovanja ekspresije gena MAP2 u lečenju ili prevenciji takvih kancera. Ekspresija gena MAP2 je povezana sa povećanom osetljivošću raka na jedinjenja koja ciljaju na mikrotubule kao što je paklitaksel [77]. Prema tome, kompozicije pronalaska mogu da se koriste za povećanje osetljivosti takvih karcinoma na inhibitor polimerizacije ili depolimerizacije tubulina, posebno Paklitaksel. Kompozicije pronalaska su takođe korisne u postupcima za smanjenje veličine tumora, smanjenje rasta tumora, prevenciju ili inhibiciju metastaza, ili prevenciju angiogeneze u lečenju ili prevenciji kancera koji obuhvataju onkogeno ERK signalizaciju. Zbog efekata na ekspresiju gena MAP2 prikazanih u Primerima, kompozicije pronalaska su poželjne za upotrebu u postupcima inhibicije metastaza u lečenju takvih kancera.
[0181] U daljem izvođenju, kompozicija koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera je za upotrebu u postupku inhibicije ERK1 i/ili ERK2 signalizacije u lečenju ili prevenciji raka. U daljem izvođenju, kompozicija koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera je za upotrebu u postupku inhibicije ERK1 i/ili ERK2 fosforilacije u lečenju ili prevenciji raka. U daljem izvođenju, kompozicija koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera je za upotrebu u postupku indukovanja ekspresije MAP2 gena u lečenju ili prevenciji raka. U navedenim daljim izvođenjima, poželjno je da se kanceri okarakterišu kao što je gore navedeno („Kanceri i njihove karakteristike“).
[0182] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju raka tankog creva, kao što je adenokarcinom tankog creva. HT29 ćelijska linija tretirana metotreksatom korišćena u primerima ima fenotip koji podseća na epitelne ćelije tankog creva i pokazalo se da kompozicije pronalaska imaju koristan efekat na takve ćelije. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska se koriste za promovisanje apoptoze u lečenju ili prevenciji raka, posebno raka tankog creva.
[0183] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska je za upotrebu u postupku indukovanja ekspresije gena GPR109a u lečenju ili prevenciji raka.
[0184] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska je za upotrebu u postupku povećanja nivoa IL-8 u lečenju ili prevenciji raka.
[0185] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju kolorektalnog raka, kao što je kolorektalni adenokarcinom. Ćelijska linija Caco-2 korišćena u primerima je ćelijska linija kolorektalnog adenokarcinoma i pokazalo se da kompozicije pronalaska imaju koristan efekat na takve ćelije.
[0186] U određenim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog melanoma, sitnoćelijskog raka pluća ili adenoskamoznog karcinoma pluća. Efekat na NSE prikazan u primerima sugeriše da kompozicije pronalaska mogu biti posebno efikasne protiv ovih karcinoma.
2
[0187] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska nije za upotrebu u lečenju raka. U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaja koji nije rak.
Upotreba kao adjuvanta za vakcinu
[0188] Primeri pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije Faktora nekroze tumora alfa (TNF-α). Poznato je da je TNF-α važan za odgovor na vakcinu. Na primer, pokazalo se da je TNFa neophodan za efikasan odgovor na vakcinu u vakcinaciji starije populacije protiv gripa [78]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava ekspresiju TNF-α, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvant za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao pomoćna sredstva za vakcinu povećanjem nivoa i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu u terapiji gripa. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u poboljšanju imunološkog odgovora protiv antigena. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja se primenjuje u kombinaciji sa antigenom. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za davanje pacijentu neposredno pre ili posle vakcinacije.
[0189] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-6. Povećana ekspresija IL-6 povezana je sa odgovorima na vakcinu za mnoge bolesti. Na primer, IL-6 su proizveli CD14+CD16- inflamatorni monociti nakon što su odrasli primili vakcinu protiv gripa [79], a viši nivoi IL-6 su bili povezani sa postizanjem odgovora vakcine na vakcinu protiv gripa [80]. Štaviše, IL-6 je proizveden nakon injekcije AS03 adjuvantnog sistema [81] i pokazalo se da smanjenje IL-6 kod miševa smanjuje odgovor T ćelija pomagača nakon primene vakcine protiv tuberkuloze [82]. Od primene kompozicija pokazalo se da pronalazak povećava ekspresiju IL-6, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu povećanjem nivoa i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu u terapiji tuberkuloze.
[0190] Štaviše, pokazalo se da je ekspresija IL-6 i TNF-α u korelaciji sa efikasnošću terapijske HIV vakcine [Huang i dr.], vakcine protiv tuberkuloze i vakcine protiv hlamidije [83]. Su i dr. [84] su pokazali da je ko-inokulacija IL-6 ili TNF-α sa FMDV DNK vakcinom rezultirala povećanom ekspresijom IFN-g u CD4+ i CD8+ T ćelijama, većom ekspresijom IL-4 u CD4+ T ćelijama i većim antigen-specifični citotoksičnim odgovorom. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava ekspresiju IL-6 i TNF-α, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvant za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvant za vakcinu povećanjem nivoa i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvant za vakcinu povećanjem nivoa i/ili aktivnosti IL-6. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu povećanjem nivoa i/ili aktivnosti TNF-α i IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu u terapiji HIV-a. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu u terapiji hlamidije.
[0191] Primeri pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije MIP-3α. Pokazalo se da MIP-3α povećava odgovor na HIV vakcinu [85]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava ekspresiju MIP-3α, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvant za vakcinu.
[0192] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-1β. Li i dr. [86] su pokazali da adjuvans aluminijum hidroksid aktivira sekreciju IL-1β i sugerisao da sam IL-1β može delovati kao adjuvant. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava ekspresiju IL-1β, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu. Primeri pokazuju da primena kompozicija pronalaska može povećati odnos CD8+ T ćelija prema Tregs. Pokazalo se da adjuvansi stimulišu CD8+ T ćelije [87] i pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava odnos CD8+ T ćelija prema Tregs, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu povećanjem odnosa CD8+ T ćelija prema Tregs.
[0193] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-8. Povećana ekspresija IL-8 je povezana sa odgovorima na vakcinu za mnoge bolesti. Na primer, viši nivoi IL-8 bili su povezani sa postizanjem odgovora vakcine na vakcinu protiv ptičjeg gripa [88]. Štaviše, IL-8 služi kao molekularni adjuvans u modelu DNK vakcinacije [89]. Stoga, IL-8 može da se koristi kao imunostimulans za poboljšanje imunološke efikasnosti, na primer, vakcine protiv ptičjeg gripa. Pošto se pokazalo da primena kompozicija prema pronalasku povećava ekspresiju IL-8, kompozicije pronalaska mogu biti korisne kao adjuvant za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvant za vakcinu povećanjem nivoa i/ili aktivnosti IL-8. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu u terapiji gripa. U nekim izvođenjima, kada se koriste kao adjuvansi za vakcinu, kompozicije pronalaska će se davati same da bi se obezbedio efekat adjuvansa za antigen koji je posebno davan pacijentu. U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska se primenjuje oralno, dok se antigen ubrizgava parenteralno.
[0194] Kompozicije pronalaska se mogu koristiti za poboljšanje imunološkog odgovora na bilo koji korisni antigen. Primeri antigena za upotrebu sa pronalaskom uključuju: virusne antigene, kao što su virusni površinski proteini; bakterijski
4
antigeni, kao što su proteinski i/ili saharidni antigeni; gljivični antigeni; antigeni parazita; i tumorskih antigena. Pronalazak je posebno koristan za vakcine protiv virusa gripa, HIV-a, ankilostome, virusa hepatitisa B, virusa herpes simpleksa, besnila, respiratornog sincicijalnog virusa, citomegalovirusa, Staphilococcus aureus, hlamidije, SARS korona virusa, virusa varičela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Micobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Epstein Barr virusa, humanog papiloma virusa itd. Dalji antigeni za upotrebu u pronalasku uključuju antigene glikoproteina i lipoglikana, antigene arheje, antigen melanoma E (MAGE), karcinoembrionalni antigen (CEA), MUC-1, HER2, sialyl-Tn (STn), reverznu humanu transkriptazu telomeraze (hTERT), Wilmsov tumorski gen (WT1), CA-125, antigen specifičan za prostatu (PSA), antigeni Epstein-Barr virusa, neoantigeni, onkoproteini, amiloid-beta, Tau, PCSK9 i supstance koje stvaraju zavisnost, na primer nikotin, alkohol ili opijati.
[0195] Poželjni antigeni za upotrebu u pronalasku uključuju antigene patogena i tumorske antigene. Antigen će izazvati imuni odgovor specifičan za antigen koji će biti efikasan u zaštiti od infekcije patogenom ili napada na tumor. Antigeni mogu biti, na primer, peptidi ili polisaharidi.
[0196] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu: (i) vodenog preparata antigena; i (ii) kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, poželjno vrste Megasphaera massiliensis, u proizvodnji leka za podizanje imunološkog odgovora kod pacijenta.
[0197] Imuni odgovor izazvan ovim metodama i primenama će generalno uključivati odgovor antitela, poželjno zaštitni odgovor antitela.
[0198] U nekim izvođenjima, soj bakterija iz roda Megasphaera je projektovan da predstavlja antigen. Predstavljanje antigena na bakterijskom soju pronalaska može maksimizirati imunostimulativne aktivnosti i dalje poboljšati zaštitni imuni odgovor koji se stvara protiv antigena. Pored toga, proizvodnja i isporuka terapeutika koji sadrže antigen i bakteriju prema pronalasku mogu biti efikasniji i delotvorniji na ovaj način nego kada se svaki od antigena i kompozicije koja sadrži bakterijski soj proizvodi i primenjuje odvojeno. Prema tome, u nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera koji predstavlja antigen, na primer na svojoj ćelijskoj površini. U nekim izvođenjima, kompozicija koja sadrži bakterijski soj koji predstavlja antigen je za upotrebu kao antigen vakcine. U nekim izvođenjima, antigen je izveden iz HIV-a, ankilostome, virusa hepatitisa B, virusa herpes simpleksa, besnila, respiratornog sincicijalnog virusa, citomegalovirusa, Staphilococcus aureus, hlamidije, SARS koronavirusa, virusa varičela zoster, Streptococcus pneumoniabercusis, Neumoniaberium meningae, Bacillus anthracis, Epstein Barr virusa ili humanog papiloma virusa. U nekim izvođenjima, antigen je glikoproteinski antigen, lipoglikan antigen, antigen arheje, antigen melanoma E (MAGE), karcinoembrionalni antigen (CEA), MUC-1, HER2, sialyl-Tn (STn), reverzna humana transkriptaza telomeraze (hTERT) , Wilmsov tumorski gen (WT1), CA-125, antigen specifičan za prostatu (PSA), antigeni EpsteinBarr virusa, neoantigeni, onkoproteini, amiloid-beta, Tau, PCSK9 ili supstance koje stvaraju zavisnost, kao što su alkohol, opijati i slično.
[0199] U nekim izvođenjima, bakterije pronalaska eksprimiraju jedan ili više antigena. Generalno, antigen će biti eksprimiran rekombinantno i biće heterologan za bakterije pronalaska. Stoga, pronalazak obezbeđuje soj bakterija iz roda Megasphaera koji eksprimira heterologni antigen. Antigen može biti deo fuzionog polipeptida koji je eksprimiran sa jednim ili više polipeptida homolognih bakterijama. U nekim izvođenjima, bakterija eksprimira antigen kao nefuzioni polipeptid. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži ćeliju bakterijskog soja iz roda Megasphaera, pri čemu ćelija eksprimira heterologni antigen. U nekim izvođenjima, kompozicija je za upotrebu kao vakcina. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ćeliju bakterijskog soja iz roda Megasphaera, pri čemu ćelija eksprimira heterologni antigen. U nekim izvođenjima, ćelija je za upotrebu kao vakcina.
[0200] Primeri antigena za upotrebu sa pronalaskom uključuju: virusne antigene, kao što su virusni površinski proteini; bakterijski antigeni, kao što su proteinski i/ili saharidni antigeni; gljivični antigeni; antigeni parazita; i tumorski antigeni. Dalji antigeni za ekspresiju u bakterijskom soju roda Megasphaera uključuju antigene glikoproteina i lipoglikana, antigene arheje, antigen melanoma E (MAGE), karcinoembrionalni antigen (CEA), MUC-1, HER2, sialyl-Tn (STn), reverznu humanu transkriptazu telomeraze (hTERT), Wilms tumor gen (WT1), CA-125, antigen specifičan za prostatu (PSA), antigeni Epstein-Barr virusa, neoantigeni, onkoproteini, amiloid-beta, Tau, PCSK9 i supstance koje stvaraju zavisnost, na primer nikotin, alkohol, opijati i slično.
[0201] Pronalazak takođe može biti koristan za poboljšanje odgovora na vakcine protiv nezaraznih bolesti kao što je Alchajmerova bolest i drugih neurodegenerativnih poremećaja, u kom slučaju antigen za upotrebu sa pronalaskom može biti amiloid-beta ili Tau. Drugi takvi antigeni za nezarazne bolesti uključuju PCSK9 (za lečenje povišenog holesterola).
[0202] Pronalazak takođe može biti koristan za poboljšanje odgovora na vakcine protiv supstanci koje stvaraju zavisnost, na primer nikotina, alkohola ili opijata.
Ćelijske terapije
Terapija himernim antigenskim receptorima T ćelija (CAR-T).
[0203] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može dovesti do povećanja ekspresije IL-6. Povećana ekspresija IL-6 je u korelaciji sa odgovorom na CD19 CAR-T terapiju hronične limfocitne leukemije. Povećanje serumskog IL-6 bilo je povezano sa ekspanzijom CAR-T ćelija, dok je inhibicija IL6 bila povezana sa inhibicijom proliferacije CAR-T ćelija [90]. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska povećava ekspresiju IL-6, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u ćelijskoj terapiji, posebno u terapiji ćelijama CART. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u ćelijskoj terapiji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u CAR-T ćelijskoj terapiji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju hronične limfocitne leukemije.
[0204] Iznenađujuće, Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska selektivno smanjuje procenat Treg-ova u populaciji PBMC (Slika 6C). Pokazalo se da selektivno smanjenje Tregs povećava efikasnost citotoksičnih limfocita [91]. CAR-T ćelije su podskup citotoksičnih limfocita, i stoga se smatra da je selektivno smanjenje Treg-ova efikasno u terapiji CAR-T ćelijama. Pošto se pokazalo da primena kompozicija pronalaska smanjuje Tregs, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u ćelijskoj terapiji, posebno u terapiji CART ćelijama.
[0205] Stoga, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u ćelijskoj terapiji, posebno u poboljšanju odgovora na ćelijsku terapiju.
Terapija mezenhimalnim matičnim ćelijama (MSC).
[0206] Prijavljeno je da terapija mezinhimalnim matičnim ćelijama (MSC) ima imunostimulaciona svojstva. Kada se MSC leče LPS-om, oni pojačavaju regulaciju proinflamatornih citokina IL-6 i IL-8 što uzrokuje povećanu proliferaciju B ćelija [92]. Zbog toga, pošto je pokazano da kompozicije pronalaska povećavaju ekspresiju IL-6, one mogu biti korisne u kombinaciji sa MSC ćelijskom terapijom.
Terapija transplantacije matičnih ćelija
[0207] Prijavljeno je da, umesto korišćenja nediferenciranih matičnih ćelija u terapiji transplantacije matičnih ćelija, može biti korisno da se matične ćelije u određenoj meri diferenciraju pre transplantacije. Na primer, Heng i dr. [93] su izvestili da kardiomiogena diferencijacija matičnih ćelija može biti korisna jer ima veću efikasnost presađivanja, pojačanu regeneraciju miocita i povećanu restauraciju srčane funkcije. Pošto je primena kompozicija pronalaska inicirala diferencijaciju neurona u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za diferencijaciju matičnih ćelija u terapiji transplantacije matičnih ćelija.
Imunosenescencija
[0208] Primeri takođe pokazuju da primena kompozicija pronalaska može selektivno da smanjuje Tregs i poveća broj B ćelija (Slika 6C i Slika 6F). Fulop i dr.
[94] su identifikovali da su povećanje broja Treg ćelija i smanjenje broja B ćelija povezani sa starenjem u adaptivnom imunološkom sistemu. Prema tome, kompozicije prema pronalasku mogu da se koriste za sprečavanje ili odlaganje imunonescencije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u prevenciji imunosenscencije. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije koju karakteriše povećanje broja Treg ćelija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije koju karakteriše smanjenje broja B ćelija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije koju karakteriše povećanje broja Treg ćelija i smanjenje broja B ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije smanjenjem broja Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije povećanjem broja B ćelija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije smanjenjem broja Treg ćelija i povećanjem broja B ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti izazvanih imunosenscencijom. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa starenjem odlaganjem i/ili sprečavanjem imunosenscencije.
[0209] Štaviše, predloženo je da adjuvansi vakcine mogu da prevaziđu imunosenescenciju [95]. Pošto su kompozicije pronalaska pogodne za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu, kompozicije pronalaska mogu biti korisne za sprečavanje ili odlaganje imunosenscencije. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju i/ili prevenciji imunosenescencije kao adjuvansi za vakcinu. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu, pri čemu kompozicije odlažu i/ili sprečavaju imunosenescenciju.
[0210] Bolesti koje su povezane sa imunosescencijom uključuju kardiovaskularne bolesti, neurodegenerativne bolesti, kao što su Alchajmerova bolest i Parkinsonova bolest, rak, dijabetes melitus tip 2 [96] i autoimune poremećaje [97]. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju kardiovaskularnih bolesti odlaganjem i/ili prevencijom imunosenscencije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju neurodegenerativnih bolesti. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju neurodegenerativnih bolesti, posebno Alchajmerove bolesti i Parkinsonove bolesti, odlaganjem i/ili sprečavanjem imunosenscencije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka odlaganjem i/ili sprečavanjem imunosenscencije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju dijabetes melitusa tipa 2. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju dijabetes melitusa tipa 2 odlaganjem i/ili sprečavanjem imunosenscencije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju autoimunih poremećaja. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju autoimunih poremećaja odlaganjem i/ili prevencijom imunosenscencije.
Načini davanja
[0211] Poželjno je da se kompozicije prema pronalasku daju u gastrointestinalni trakt da bi se omogućila isporuka i/ili delimična ili potpuna kolonizacija creva sa bakterijskim sojem pronalaska. Uopšteno, kompozicije pronalaska se primenjuju oralno, ali se mogu primeniti rektalno, intranazalno, ili bukalnim ili sublingvalnim putevima.
[0212] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska se mogu primeniti kao pena, kao sprej ili gel.
[0213] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska mogu se davati kao supozitorije, kao što su rektalne supozitorije, na primer u obliku teobroma ulja (kakao puter), sintetičke tvrde masti (npr. suppocire, witepsol), glicero-želatina, polietilen glikola ili glicerinske kompozicije sapuna.
[0214] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska se primenjuje u gastrointestinalni trakt preko cevi, kao što je nazogastrična sonda, orogastrična sonda, želudačna sonda, sonda za jejunostomiju (J cev), perkutana endoskopska gastrostomija (PEG) ili otovr, kao što je kao otvor na zidu grudnog koša koji omogućava pristup stomaku, jejunumu i drugim odgovarajućim pristupnim otvorima.
[0215] Kompozicije pronalaska se mogu davati jednokratno, ili se mogu davati uzastopno kao deo režima lečenja. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska treba da se daju svakodnevno.
[0216] U određenim izvođenjima pronalaska, tretman prema pronalasku je praćen procenom mikrobiote creva pacijenta. Tretman se može ponoviti ako isporuka i/ili delimična ili potpuna kolonizacija sojem pronalaska nije postignuta tako da se ne primećuje efikasnost, ili se tretman može prekinuti ako je isporuka i/ili delimična ili potpuna kolonizacija uspešna i efikasnost se primećuje.
[0217] U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska se može primeniti trudnoj životinji, na primer sisaru kao što je čovek, da bi se smanjila verovatnoća razvoja raka kod njenog deteta u materici i/ili nakon što se rodi.
[0218] Kompozicije pronalaska se mogu davati pacijentu kome je dijagnostikovana bolest ili stanje izazvano smanjenom imunološkom aktivnošću, ili za koji je identifikovan rizik od bolesti ili stanja posredovanog smanjenom imunološkom aktivnošću. Kompozicije se takođe mogu davati kao profilaktička mera za sprečavanje razvoja bolesti ili stanja posredovanih smanjenom imunološkom aktivnošću kod zdravog pacijenta.
[0219] Kompozicije pronalaska se mogu davati pacijentu kome je dijagnostikovan rak, ili za koji je identifikovan rizik od raka. Na primer, pacijent može imati smanjenu ili odsutan kolonizaciju Megasphaera, a posebno Megasphaera massiliensis.
[0220] Kompozicije pronalaska se mogu davati kao prehrambeni proizvod, kao što je dodatak ishrani.
[0221] Generalno, kompozicije pronalaska su za lečenje ljudi, iako se mogu koristiti za lečenje životinja uključujući monogastrične sisare kao što su živina, svinje, mačke, psi, konji ili zečevi. Kompozicije pronalaska mogu biti korisne za poboljšanje rasta i performansi životinja. Ako se daje životinjama, može se koristiti oralna sonda.
Kompozicije
[0222] Generalno, kompozicija pronalaska sadrži bakterije. U poželjnim izvođenjima pronalaska, kompozicija je formulisana u liofilizovanom obliku. Na primer, kompozicija pronalaska može da sadrži granule ili želatinske kapsule, na primer tvrde želatinske kapsule, koje sadrže soj bakterija prema pronalasku.
[0223] Poželjno, kompozicija pronalaska sadrži liofilizovane bakterije. Liofilizacija bakterija je dobro uspostavljena procedura i relevantne smernice su dostupne u, na primer, referencama [98,100].
[0224] Alternativno, kompozicija pronalaska može da sadrži živu, aktivnu bakterijsku kulturu.
[0225] U poželjnim izvođenjima, kompozicija pronalaska je inkapsulirana da bi se omogućila isporuka bakterijskog soja u crevo. Inkapsulacija štiti kompoziciju od degradacije do isporuke na ciljnu lokaciju kroz, na primer, pucanje hemijskim ili fizičkim stimulansima kao što su pritisak, enzimska aktivnost ili fizička dezintegracija, što može biti izazvano promenama pH. Može se koristiti bilo koja odgovarajuća metoda inkapsulacije. Primeri tehnika inkapsulacije obuhvataju zarobljavanje unutar porozne matrice, vezivanje ili adsorpciju na čvrstim površinama nosača, samoagregaciju flokulacijom ili sa agensima za unakrsno povezivanje i mehaničko zadržavanje iza mikroporozne membrane ili mikrokapsule. Smernice za inkapsulaciju koje mogu biti korisne za pripremu kompozicija pronalaska su dostupne u, na primer, referencama [101] i [102].
[0226] Kompozicija se može davati oralno i može biti u obliku tablete, kapsule ili praha. Inkapsulirani proizvodi su poželjniji jer su Megasphaera anaerobi. Ostali sastojci (kao što je vitamin C, na primer) mogu biti uključeni kao hvatači kiseonika i prebiotski supstrati da bi se poboljšala isporuka i/ili delimična ili potpuna kolonizacija i preživljavanje in vivo. Alternativno, probiotička kompozicija ovog pronalaska može se davati oralno kao hrana ili nutritivni proizvod, kao što je fermentisani mlečni proizvod na bazi mleka ili surutke, ili kao farmaceutski proizvod.
[0227] Kompozicija se može formulisati kao probiotik.
[0228] Kompozicija pronalaska uključuje terapeutski efikasnu količinu bakterijskog soja pronalaska. Terapijski efikasna količina bakterijskog soja je dovoljna da izvrši blagotvorno dejstvo na pacijenta. Terapeutski efikasna količina bakterijskog soja može biti dovoljna da dovede do isporuke u creva pacijenta i/ili delimične ili potpune kolonizacije creva pacijenta.
[0229] Pogodna dnevna doza bakterije, na primer za odraslog čoveka, može biti od oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje formiraju koloniju (CFU); na primer, od oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<10>CFU; u drugom primeru od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<10>CFU; u drugom primeru od oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<11>CFU; u drugom primeru od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU; u drugom primeru od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<11>CFU.
[0230] U određenim izvođenjima, doza bakterije je najmanje 109 ćelija dnevno, kao što je najmanje 10<10>, najmanje 10<11>ili najmanje 10<12>ćelija dnevno.
[0231] U određenim izvođenjima, kompozicija sadrži bakterijski soj u količini od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<11>CFU/g, u odnosu na težinu kompozicije; na primer, od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU/g. Doza može biti, na primer, 1 g, 3 g, 5 g i 10 g.
[0232] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu je količina bakterijskog soja od oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje formiraju koloniju po gramu u odnosu na težinu kompozicije.
[0233] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu se kompozicija primenjuje u dozi između 500 mg i 1000 mg, između 600 mg i 900 mg, između 700 mg i 800 mg, između 500 mg i 750 mg ili između 750 mg ili između 710 mg. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, gde se liofilizovane bakterije u farmaceutskoj kompoziciji primenjuju u dozi između 500mg i 1000mg, između 600mg i 900mg, između 700mg i 8000mg i između 500mg i 505mg i 507mg ili 500mg.
[0234] Tipično, probiotik, kao što je kompozicija pronalaska, opciono se kombinuje sa najmanje jednim pogodnim prebiotičkim jedinjenjem. Prebiotičko jedinjenje je obično nesvarljivi ugljeni hidrat, kao što je oligo- ili polisaharid, ili šećerni alkohol, koji se ne razgrađuje ili apsorbuje u gornjem digestivnom traktu. Poznati prebiotici uključuju komercijalne proizvode kao što su inulin i transgalakto-oligosaharidi.
[0235] U određenim izvođenjima, probiotička kompozicija iz ovog pronalaska uključuje prebiotičko jedinjenje u količini od oko 1 do oko 30% težinskih, u odnosu na ukupnu težinu kompozicije, (npr. od 5 do 20% težinskih). Ugljeni hidrati mogu biti izabrani iz grupe koju čine: frukto-oligosaharidi (ili FOS), frukto-oligosaharidi kratkog lanca, inulin, izomalt-oligosaharidi, pektini, ksilo-oligosaharidi (ili XOS), hitozan-oligosaharidi (ili COS), beta-glukani, modifikovane obradive gume i otporni skrobovi, polidekstroza, D-tagatoza,vlakna gumirabike, rogač, ovas i vlakna citrusa. U jednom izvođenju, prebiotici su frukto-oligosaharidi kratkog lanca (radi jednostavnosti prikazani u nastavku kao FOS-c.c); navedeni FOS-c.c. nisu lako svarljivi ugljeni hidrati, generalno se dobijaju konverzijom šećerne repe i uključuju molekul saharoze za koji su vezana tri molekula glukoze.
[0236] Kompozicije pronalaska mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive ekscipijente ili nosače. Primeri takvih pogodnih ekscipijenata mogu se naći u referenci [103]. Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer, u referenci [104]. Primeri pogodnih nosača uključuju laktozu, skrob, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slično. Primeri pogodnih razblaživača uključuju etanol, glicerol i vodu. Izbor farmaceutskog nosača, ekscipijensa ili razblaživača može se izabrati s obzirom na nameravani put primene i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže kao, ili kao dodatak, nosač, ekscipijens ili razblaživač, bilo koje pogodno vezivno sredstvo(a), lubrikant(e), agens(e) za suspendovanje, agens(e) za premazivanje, agens(e) za rastvaranje. Primeri
1
pogodnih veziva uključuju skrob, želatin, prirodne šećere kao što su glukoza, anhidrovana laktoza, laktoza, beta-laktoza, kukuruzni zaslađivači, prirodne i sintetičke gume, kao što su gumirabika, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetil celuloza i polietilen glikol. Primeri pogodnih lubrikanata uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. U farmaceutskoj kompoziciji mogu biti obezbeđeni konzervansi, stabilizatori, boje, pa čak i arome. Primeri konzervansa uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzoeve kiseline. Antioksidansi i agensi za suspendovanje se takođe mogu koristiti.
[0237] Kompozicije pronalaska mogu biti formulisane kao prehrambeni proizvod. Na primer, prehrambeni proizvod može pružiti nutritivnu korist pored terapeutskog efekta pronalaska, kao što je dodatak ishrani. Slično, prehrambeni proizvod može biti formulisan da poboljša ukus kompozicije prema pronalasku ili da učini kompoziciju privlačnijom za konzumiranje tako što će biti sličnija uobičajenoj hrani, pre nego farmaceutskoj kompoziciji. U određenim izvođenjima, kompozicija pronalaska je formulisana kao proizvod na bazi mleka. Termin "proizvod na bazi mleka" označava bilo koji tečni ili polučvrsti proizvod na bazi mleka ili surutke koji ima različit sadržaj masti. Proizvod na bazi mleka može biti, na primer, kravlje mleko, kozje mleko, ovčije mleko, obrano mleko, punomasno mleko, mleko rekombinovano od mleka u prahu i surutke bez ikakve prerade, ili prerađeni proizvod, kao što je jogurt, kiselo mleko, vurda, kiselo mleko, kiselo punomasno mleko, mlečni puter i drugi proizvodi od kiselog mleka. Druga važna grupa uključuje mlečne napitke, kao što su napitci od surutke, fermentisano mleko, kondenzovano mleko, mleko za odojčad ili bebe; aromatizovano mleko, sladoled; hranu koja sadrži mleko kao što su slatkiši.
[0238] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska sadrže jedan soj ili vrstu bakterije i ne sadrže nikakve druge bakterijske sojeve ili vrste. Takve kompozicije mogu da sadrže samo de minimis ili biološki irelevantne količine drugih bakterijskih sojeva ili vrsta. Takve kompozicije mogu biti kultura koja je suštinski slobodna od drugih vrsta organizama.
[0239] Kompozicije za upotrebu u skladu sa pronalaskom mogu ili ne moraju zahtevati marketinško odobrenje.
[0240] U nekim slučajevima, liofilizovani bakterijski soj se rekonstituiše pre primene. U nekim slučajevima, rekonstitucija se vrši upotrebom razblaživača koji je ovde opisan.
[0241] Kompozicije pronalaska mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive ekscipijente, razblaživače ili nosače.
[0242] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj za lečenje poremećaja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremećaj rak, kao što je neuroblastom, rak mozga, melanom, rak prostate, kolorektalni kancer, rak dojke, rak
2
pluća, rak jetre ili rak želuca. U sledećem izvođenju rak je rak jajnika, kancer grlića materice, glioblastom, karcinom, hronična limfocitna leukemija, limfom ili hematološki malignitet.
[0243] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano MAP2. U poželjnim izvođenjima, navedena bolest ili stanje je rak, kao što je neuroblastom, rak mozga, melanom, rak prostate, kolorektalni rak, rak dojke, rak pluća, rak jetre ili želuca, rak jajnika, rakgrlića materice, glioblastom, karcinom, hronična limfocitna leukemija, limfom ili hematološki malignitet.
[0244] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano B3 tubulinom. U poželjnim izvođenjima, navedena bolest ili stanje je rak, kao što je neuroblastom, rak mozga, melanom, rak prostate, kolorektalni rak, rak dojke, rak pluća, rak jetre ili želuca, rak jajnika, rakgrlića materice, glioblastom, karcinom, hronična limfocitna leukemija, limfom ili hematološki malignitet.
[0245] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano DRD2. U poželjnim izvođenjima, navedena bolest ili stanje je rak, kao što je neuroblastom, rak mozga, melanom, rak prostate, kolorektalni rak, rak dojke, rak pluća, rak jetre ili želuca, rak jajnika, rakgrlića materice, glioblastom, karcinom, hronična limfocitna leukemija, limfom ili hematološki malignitet.
[0246] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano HDAC. U poželjnim izvođenjima, navedena bolest ili stanje je rak, kao što je neuroblastom, rak mozga, melanom, rak prostate, kolorektalni rak, rak dojke, rak pluća, rak jetre ili želuca, rak jajnika, rakgrlića materice, glioblastom, karcinom, hronična limfocitna leukemija, limfom ili hematološki malignitet.
[0247] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano proinflamatornim citokinima, kao što su IL-1β, TNF-α, MIP3α, IL-23 ili IL-6. U poželjnoj varijanti, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano TNF-α. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano IL-8. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano CD11b. U poželjnim izvođenjima, navedena bolest ili stanje je rak, kao što je neuroblastom, rak mozga, melanom, rak prostate, kolorektalni rak, rak dojke, rak pluća, rak jetre ili rak želuca. U dodatnom izvođenju, navedeni rak je rak jajnika, rak grlića materice, glioblastom, karcinom, hronična limfocitna leukemija, limfom ili hematološki malignitet.
[0248] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj pronalaska; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je bakterijski soj u količini dovoljnoj da leči ili spreči bolest ili stanje posredovano Casp3. U poželjnim izvođenjima, navedena bolest ili stanje je rak, kao što je neuroblastom, rak mozga, melanom, rak prostate, kolorektalni rak, rak dojke, rak pluća, rak jetre ili rak želuca.
[0249] U dodatnom izvođenju, navedeni rak je rak jajnika, rak grlića materice, glioblastom, karcinom, hronična limfocitna leukemija, limfom ili hematološki malignitet.
[0250] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, pri čemu je količina bakterijskog soja od oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje formiraju koloniju po gramu u odnosu na težinu kompozicije.
[0251] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, pri čemu se kompozicija primenjuje u dozi od 1 g, 3 g, 5 g ili 10 g.
[0252] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu se kompozicija primenjuje metodom izabranom iz grupe koju čine oralni, rektalni, subkutani, nazalni, bukalni i sublingvalni.
[0253] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži nosač izabran iz grupe koju čine laktoza, skrob, glukoza, metil celuloza, magnezijum stearat, manitol i sorbitol.
[0254] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži razblaživač izabran iz grupe koju čine etanol, glicerol i voda.
[0255] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži ekscipijent izabran iz grupe koju čine skrob, želatin, glukoza, anhidrovana laktoza, laktoza, beta-laktoza, kukuruzni zaslađivač, gumirabika, tragakant, natrijum alginat, karboksimetil celuloza, polietilen glikol, natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat i natrijum hlorid.
4
[0256] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, koja dalje sadrži najmanje jedan od konzervansa, antioksidansa i stabilizatora.
[0257] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži konzervans izabran iz grupe koju čine natrijum benzoat, sorbinska kiselina i estri p-hidroksibenzoeve kiseline.
[0258] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu je navedeni bakterijski soj liofilizovan.
[0259] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gorenavedenu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu kada se kompozicija čuva u zatvorenoj posudi na oko 4°C ili oko 25°C i posuda se stavlja u atmosferu koja ima 50% relativne vlažnosti, najmanje 80% bakterijskog soja, mereno u jedinicama koje formiraju kolonije, ostaje nakon perioda od najmanje: 1 mesec, 3 meseca, 6 meseci, 1 godina, 1,5 godina, 2 godine, 2,5 godine ili 3 godine.
Metode kultivisanja
[0260] Sojevi bakterija za upotrebu u ovom pronalasku mogu se kultivisati korišćenjem standardnih mikrobioloških tehnika kao što je detaljno opisano u, na primer, referencama [105,107].
[0261] Čvrsti ili tečni medijum koji se koristi za kulturu može biti YCFA agar ili YCFA medijum. YCFA medijum može da sadrži (na 100 ml, približne vrednosti): kasiton (1,0 g), ekstrakt kvasca (0,25 g), NaHCO3(0,4 g), cistein (0,1 g), K2HPO4(0,045 g), KH2PO4(0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SO4(0,09 g), MgSO4·7H2O (0,009 g), CaCl2(0,009 g), resazurin (0,1 mg), hemin (1 mg), biotin (1 mg), kobalamin (1 mg ), paminobenzoeva kiselina (3 mg), folna kiselina (5 mg) i piridoksamin (15 mg).
Sojevi bakterija za upotrebu u kompozicijama vakcina
[0262] Pronalazači su identifikovali da su bakterijski sojevi pronalaska korisni za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja povezanih sa smanjenjem imunološke aktivnosti. Ovo je verovatno rezultat efekta koji sojevi bakterija prema pronalasku imaju na imuni sistem domaćina. Prema tome, kompozicije pronalaska mogu takođe biti korisne za prevenciju bolesti ili stanja kao što je rak, kada se primenjuju kao kompozicije vakcine. Pronalazači su identifikovali da su bakterijski sojevi pronalaska korisni za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja povezanih sa smanjenjem imunološke aktivnosti. Ovo je verovatno rezultat efekta koji sojevi bakterija prema pronalasku imaju na imuni sistem domaćina. Prema tome, kompozicije pronalaska mogu takođe biti korisne za prevenciju bolesti ili stanja kao što je rak, kada se primenjuju kao kompozicije vakcine.
[0263] U određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis smanjuje nivoe mravlje kiseline. Mravlja kiselina je konjugovana baza formata koja je umešana u ometanje mitohondrijalnog transporta elektrona i proizvodnje energije inhibiranjem aktivnosti citohrom oksidaze, krajnjeg akceptora elektrona u lancu transporta elektrona. Shodno tome, redukcija mravlje kiseline, a samim tim i formata, bi smanjila učestalost ćelijske smrti putem bilo koje inhibicije citohrom oksidaze akumulacije reaktivnih vrsta kiseonika. Shodno tome, u određenim izvođenjima, soj bakterija vrste Megasphaera massiliensis stimuliše imuni sistem u lečenju bolesti smanjenjem nivoa mravlje kiseline.
Generalno
[0264] Praksa ovog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru struke. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, reference [108] i [109,115], itd.
[0265] Termin "sadrži" obuhvata "uključuje" kao i "sastoji se od" npr. kompozicija "sadrži" X može se sastojati isključivo od X ili može uključivati nešto dodatno, npr. X Y.
[0266] Termin "oko" u odnosu na numeričku vrednost x je opcioni i znači, na primer, x+10%.
[0267] Reč „suštinski“ ne isključuje „u potpunosti“ npr. kompozicija koja je "suštinski ne sadrži" Y može u potpunosti biti bez Y. Gde je potrebno, reč "u suštini" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.
[0268] Pozivanje na procentualni identitet sekvence između dve nukleotidne sekvence znači da je, kada su poređani, taj procenat nukleotida isti u poređenju ove dve sekvence. Ovo poravnanje i procenat homologije ili identiteta sekvence mogu se odrediti korišćenjem softverskih programa poznatih u tehnici, na primer onih opisanih u odeljku 7.7.18 ref. [116]. Poželjno poravnanje je određeno Smith-Waterman algoritmom za pretragu homologije korišćenjem afine pretrage gap-a sa gap open penalty od 12 i gap extend penalty od 2, BLOSUM matrica od 62. Smith-Waterman algoritam za pretragu homologije je otkriven u ref. [117].
koriste modifikovani algoritam Smith-Vaterman (vidi http://vvv.ebi.ac.uk/Tools/psa/ i Smith, TF & Vaterman, MS "Identifikacija uobičajenih molekularnih sledova" Journal of Molecular Biologi, 1981, 147 (1): 195-197). Prilikom poravnanja koriste se zadani parametri definisani EMBL-EBI. Ti parametri su (i) za sekvence aminokiselina: Matrica = BLOSUM62, gap open penalty = 10 i gap extend penalty = 0,5 ili (ii) za sekvence nukleinskih kiselina: Matrica = DNK full, gap open penalty = 10 i gap extend penalty = 0,5.
[0269] Osim ako nije izričito navedeno, proces ili metoda koji se sastoji od brojnih koraka može sadržati dodatne korake na početku ili na kraju postupka, ili može sadržati dodatne korake između. Takođe, koraci mogu biti kombinovani, izostavljeni ili izvedeni alternativnim redosledom, ako je potrebno.
[0270] Ovde su opisana različita izvođenja pronalaska. Biće cenjeno da se karakteristike navedene u svakom izvođenju mogu kombinovati sa drugim specificiranim karakteristikama, da bi se obezbedila dalja izvođenja. Posebno, izvođenja koje su ovde istaknuta kao pogodna, tipična ili poželjna mogu se kombinovati jedna sa drugim (osim kada se međusobno isključuju).
NAČINI ZA SPROVOĐENJE PRONALASKA
Primer 1 - MRx0029 indukuje zreli fenotip u SH-SI5I ćelijama
Uvod
[0271] Pronalazači su nastojali da identifikuju efekat MRx0029 na ekspresiju markera neurodiferencijacije, β3Tubulina i MAP2 u ćelijama neuroblastoma. β 3Tubulin je marker pre-diferencijacije u neuronima, a MAP2 je marker zrelih (diferenciranih) neurona.
Bakterijski soj
[0272] Megasphaera massiliensis MRx0029
Ćelijska linija
[0273] SH-SI5I ćelije
Metoda
[0274] qPCR
[0275] SH-SI5I su postavljeni u petrijeve šolje od 10 cm gustine 2x10<6>ćelija. Posle 24 sata ćelije su tretirane u medijumu za diferencijaciju (medijum za rast koji sadrži 1% FBS bez RA) sa 10% supernatanta bakterija ili YCFA+, 10uM RA, 200uM heksanske kiseline ili 200uM valerijanske kiseline, tokom 17 sati. Nakon toga reprezentativne slike snimljene korišćenjem faznog kontrasta EVOS XL mikroskopa sa jezgrom pri uvećanju od 40x/0,65. Ćelije su sakupljene, a ukupna RNK je izolovana prema RNeasi mini kit protokolu (Qiagen). cDNK su napravljene korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosystems). Ekspresija gena je merena korišćenjem qPCR. GAPDH je korišćen kao interna kontrola. Promena preklopa je izračunata prema 2(-ΔΔct) metodi
Imunoobeležavanje i snimanje ćelija
[0276] Ćelije su zasejane na pločice sa 8 bunarića (Marienfeld Laboratory Glassware) na 5x10<4>ćelija/bunariću preko noći i tretirane su sa 10% bakterijskog supernatanta tokom 24 h. Za diferencijaciju, ćelije su tretirane sa 10 nM RA tokom 5 dana pre nego što su tretirane bakterijskim supernatantom bez ćelija tokom 24 sata.
[0277] Nakon toga, ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehida u PBS tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Fiksirane ćelije su isprane sa PBS, i permeabilizovane sa 1% Triton X-100 u PBS tokom 10 minuta. Nakon ispiranja sa PBS, pločice su inkubirane sa puferom za blokiranje (4% BSA/PBS) 1 h na sobnoj temperaturi pre dodavanja razblaženog anti-MAP2 antitela ili β3-tubulina (sc-74421 i sc-80005, redom, Santa Cruz Biotechnology Inc). u 1% BSA/PBS tokom 12 h na 4°C. Zatim su dva puta isprani sa PBS, nakon čega je usledila inkubacija sa Alexa Flour 488 konjugovanim anti-mišjem (Molecular Probes Inc) i Alexa Flour 594 konjugovanim faloidinom (ab176757, Abcam) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Posle pranja 3x sa PBS, slajdovi su obojena DAPI i montirana sa Vectashield<®>(Vector Laboratories). Slajdovi su pregledani korišćenjem mikroskopa Axioskop 50 (Zeiss) opremljenog sa 63x/1.2 W Korr objektivom i setovima filtera koji su pogodni za detekciju korišćenih fluorohroma. Vremena manualne ekspozicije za digitalno dobijanje slika imuno obeleženih sa MAP-2 održala su se konstantnim, što je omogućilo poređenje između različitih bunarića i tretmana. Vremena ekspozicije faloidina (F-aktina) i DAPI varirala su kako bi odgovarala vidnom polju. Nasumična polja vida su dobijena pomoću QImaging kamere koju kontroliše softver Image Pro Plus. Slike su sačuvane kao TIFF datoteke i otvorene u Adobe Photoshop CC 2015.1.2. Slike MAP2, DAPI i Phalloidin slika su zatim preklopljene i spojene. Reprezentativne slike su odabrane da ilustruju razlike u rasprostanjenosti i lokaciji ispitanih proteina.
Imunobloting
[0278] Ćelije SH-SI5I kultivisane pod gore navedenim uslovima, tretirane sa MRx0029 tokom 24 sata i zatim lizirane u RIPA puferu koji sadrži koktel inhibitora proteaze (Roche Diagnostics, UK). Koncentracija proteina je procenjena korišćenjem kompleta za analizu proteina BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), odvojenog pomoću SDS-PAGE i prebačenog na PVDF membranu. Membrane su zatim blokirane sa 5% nemasnog suvog mleka ili 5% BSA i inkubirane preko noći na 4°C sa primarnim antitelima (redom MAP2 i β3-tubulinom). Membrana se zatim inkubira sa odgovarajućim sekundarnim antitelom konjugovanim s peroksidazom rena (HRP), a proteini su detektovani hemiluminiscencijskim kompletom za detekciju (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). I za MAP2 i za β3-tubulin, β-aktin je služio kao kontrola za praćenje varijabilnosti učitavanja proteina među uzorcima.
Rezultati
[0279] MRx0029 indukuje ekspresiju β3Tubulina u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma SH-SI5I. Slika 1 pokazuje da tretman sa MRx0029 povećava ekspresiju β3Tubulina u poređenju sa netretiranim SH-SI5I ćelijama.
[0280] MRx0029 indukuje ekspresiju MAP2 u nediferenciranim ć elijama neuroblastoma SH-SI5I. Slika 2 pokazuje da tretman sa MRx0029 značajno povećava ekspresiju MAP2 u poređenju sa netretiranim SH-SI5I ćelijama.
Diskusija
[0281] Rezultati pokazuju da MRx0029 može biti efikasana kompozicija u promovisanju diferencijacije, posebno neuronske diferencijacije. Štaviše, rezultati pokazuju da MRx0029 može biti efikasana kompozicija u lečenju raka mozga, posebno neuroblastoma, i melanoma, posebno metastatskog melanoma.
Primer 2 - MRx0029 smanjuje ekspresiju DRD2 u SH-SI5I ćelijama
Uvod
[0282] Pronalazači su nastojali da identifikuju efekat MRx0029 na ekspresiju DRD2 u ćelijama neuroblastoma.
Bakterijski soj
[0283] Megasphaera massiliensis MRx0029
Ćelijska linija
[0284] SH-SI5I ćelije
Metoda
[0285] Pronalazači su izmerili promenu u ekspresiji DRD2 u ćelijama neuroblastoma koristeći istu metodu kao što je opisano u Primeru 1.
Rezultati
[0286] MRx0029 smanjuje ekspresiju DRD2 u ćelijama neuroblastoma SH-SI5I. Slika 3 pokazuje da tretman sa MRx0029 značajno smanjuje ekspresiju DRD2 u poređenju sa netretiranim SH-SI5I ćelijama.
Diskusija
[0287] Ovo pokazuje da MRx0029 može biti efikasana kompozicija u lečenju raka.
Primer 3 - MRx0029 indukuje povećanje regulacije kaspaze 3 u ćelijama SH-SI5I
Uvod
[0288] Pronalazači su nastojali da identifikuju efekat MRx0029 na ekspresiju kaspaze 3 (Casp3) u neuroblastomu ćelije.
Bakterijski soj
[0289] Megasphaera massiliensis MRx0029
Ćelijska linija
[0290] SH-SI5I ćelije
Metoda
[0291] Pronalazači su merili promenu u ekspresiji Casp3 u ćelijama neuroblastoma. Rezultati
[0292] MRx0029 indukuje regulaciju Casp3 u nediferenciranim ćelijama neuroblastoma SH-SI5I. Slika 4 pokazuje da tretman sa MRx0029 povećava ekspresiju Casp3 u poređenju sa netretiranim SH-SI5I ćelijama. Konkretno, slika 4 pokazuje da je primena MRx0029 tri puta povećala ekspresiju Casp3 u poređenju sa kontrolom.
Diskusija
[0293] U nediferenciranim SH-SI5I ćelijama, povećanje ekspresije Casp3 gena pomoću MRx0029 moglo bi biti povezano i sa ćelijskom diferencijacijom i sa indukcijom programirane ćelijske smrti, kao što je apoptoza.
[0294] Caspaza 3 je kaspaza dželata i stoga je povezana sa apoptozom. Disregulisana apoptoza je umešana u rak i stoga rezultati pokazuju da MRx0029 može biti efikasana kompozicija u lečenju raka.
[0295] Pokazalo se da kaspaze imaju ulogu u ćelijskoj diferencijaciji. Stoga povećanje ekspresije Casp3 nakon tretmana sa MRx0029 pokazuje da MRx0029 može biti efikasana kompozicija za povećanje diferencijacije ćelija.
Primer 4 - MTT test u SH-SI5I ćelijama:
Uvod
[0296] Pronalazači su pokušali da identifikuju efekat MRx0029 na vitalnost ćelija neuroblastoma, koristeći MTT test, koja je široko korišćena metoda za procenu metaboličke aktivnosti ćelije koja se odražava u broju živih ćelija.
Bakterijski sojevi
[0297] Megasphaera massiliensis MRx0029
Ćelijska linija
[0298] SH-SI5I ćelije
Metoda
MTT test
[0299] SH-SI5I ćelije su postavljene pri gustini zasejavanja od 10.000 ćelija/bunariću, 24 sata kasnije ćelije su tretirane u 100 ul 1% FBS medijuma za rast sa različitim koncentracijama (izraženim u procentima v/v) bakterijskih supernatanata bez ćelija iz stacionarne faze kulture tokom 22 sata. Zatim je dodato 10 µl MTT rastvora i ćelije su inkubirane u CO2inkubatoru 4 h, a na kraju ovog vremena je u svaki bunarić dodato 100 µl izopropanola sa 0,04 HCL. Apsorbanca je merena na talasnoj dužini od 560 nm i referentnoj talasnoj dužini od 655 nm. Komplet za MTT test je kupljen od Merck Millipore (Kat. br. CT01).
Rezultati
[0300] MRx0029 je pokazao efekte zavisne od doze na vitalnost ćelija neuroblastoma, pri čemu je 10% MRx0029 smanjilo vitalnost za približno 70% u poređenju sa kontrolom. Tretman sa 10% bakterijskog supernatanta bez ćelija MRx0029 pokazao je smanjenje vitalnosti ćelija. Rezultati eksperimenata su prikazani na slici 5.
Diskusija
[0301] Ovo pokazuje da MRx0029 može biti efikasna kompozicija u povećanju ćelijske smrti, i stoga MRx0029 može biti efikasna kompozicija za upotrebu u lečenju raka.
Primer 5 - osnovna fenotipizacija ćelija na PBMCs iz zdravih donora
Bakterijski soj
[0302] Megasphaera massiliensis MRx0029
Metoda
PBMCs Treatment
[0303] Zamrznuti zdravi ljudski PBMC su kupljeni od Stem Cells Technologies (Cambridge UK). Ukratko, ćelije su odmrznute i ostavljene da odleže preko noći u punoj podlozi za rast (RPMI 1640 sa 10% FBS, 2mM L. glutamina, 55mM 2-merkapoetanola i 100 U/ml penicilina, 100mg/ml streptomicina) u CO2inkubatoru na 37°C. Za eksperiment, ćelije su postavljene u ploče sa 48 bunarića pri gustini od 750.000 ćelija/bunariću i tretirane u punom medijumu za rast sa 10% supernatanta bakterija u prisustvu ili odsustvu 1 ng/ml LPS. Medijum za ćelijsku kulturu je dodat u neobrađene bunariće. Ćelije su ostavljene da miruju 72 h, nakon toga su sakupljeni supernatanti bez ćelija i centrifugirani 3 minuta na 10.000 g na 4°C. Uzorci su čuvani na -80°C za analizu citokina.
Imunofenotipizacija
[0304] 1.5x10<6>ćelija po uzorku je obojeno bojom za fiksiranje održivosti (Miltenyi) da bi se napravila razlika između živih i mrtvih ćelija tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su obojene dole navedenim koktelom antitela (Miltenyi) za osnovnu imunofenotipizaciju (CD3/CD4/CD8/CD25/CD127 i CD19) i inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi.
[0305] Eksperimenti su sprovedeni da bi se izmerio procenat sledećih ćelijskih populacija:
• CD4+ CD3+ ćelije (markeri CD4 T-pomoćnih ćelija)
• CD4+ CD25+ ćelije (markeri ćelija aktiviranih CD4+)
• CD25++ CD17- ćelije van populacije CD4+ ćelija (markeri Tregs ćelija)
• CD8+ CD3+ ćelije (markeri citotoksičnih T ćelija)
• CD25+ CD8+ ćelije (markeri CD8+ aktiviranih ćelija)
• CD19+ CD3- ćelije (markeri B ćelija).
[0306] Određen je odnos CD8+/Treg i odnos aktiviranih CD8/Treg ćelija.
Antitela
[0307]
1
Rezultati
[0308] Rezultati eksperimenata su prikazani na slici 6.
[0309] Najiznenađujući rezultat je efekat tretmana MRx0029 na procenat CD25++ CD17-ćelija, koje predstavljaju Treg ćelije (videti sliku 6C). MRx0029 je selektivno smanjio procenat Treg-ova u populaciji PBMC. Tretman MRx0029 nije značajno promenio procenat CD4 T-pomoćnih ćelija, CD4+ aktiviranih ćelija, citotoksičnih T ćelija, CD8+ aktiviranih ćelija ili B ćelija.
[0310] Tretman sa MRx0029 povećao je odnos CD8+/Treg i odnos aktiviranih CD8/Treg ćelija u poređenju sa netretiranim ćelijama (videti sliku 6G i sliku 6H).
Diskusija
[0311] Iznenađujuće je zapažanje da je tretman sa MRx0029 selektivno smanjio procenat Treg-ova, čime se povećavaju odnosi CD8/Treg i aktiviranog CD8/Treg, jer MRx0029 proizvodi butirat, a proizvodnja butirata je povezana sa povećanjem populacije Treg-ova.
[0312] Osnovni profil imunofenotipizacije MRx0029 u PBMCs od zdravih donatora sugeriše da tretman sa MRx0029 smanjuje relativni procenat Treg-ova u populaciji limfocita, što se odražava u rastućem odnosu između CD8/Treg ćelija.
[0313] Ovo pokazuje da MRx0029 može biti efikasna kompozicija u stimulisanju imunološkog odgovora i smanjenju imunološke supresije od strane Tregs-a. Rezultati takođe pokazuju da MRx0029 može biti efikasna kompozicija za upotrebu u lečenju raka.
Primer 6 - Analiza citokina PBMCs iz zdravih donora
Uvod
[0314] Pronalazači su nastojali da dalje analiziraju PBMC nakon inkubacije sa MRx0029. Pronalazači su analizirali ekspresiju određenih citokina iz PBMC nakon tretmana sa MRx0029, uključujući proinflamatorne citokine TNF- α, IL-1β i IL-23.
Bakterijski soj
Megasphaera massiliensis MRx0029
Metoda
PBMCs Treatment
2
[0315] PBMC su tretirani kao što je opisano u Primeru 5.
Kvantifikacija citokina
[0316] Kvantifikacija citokina je sprovedena korišćenjem ProcartaPlex multipleks imunoeseja prema preporukama proizvođača (Thermo Fischer Scientific). Ukratko, 50 ml supernatanata kokulture bez ćelija korišćeno je za kvantifikaciju citokina korišćenjem MAGPIX<®>MILLIPLEX<®>sistema (Merck) sa xPONENT softverom (Luminex, Austin, TX, USA). Podaci su analizirani korišćenjem MILLIPLEX<®>analitičkog softvera (Merck) korišćenjem kalibracione krive od 5 tačaka i oduzimanja pozadine da bi se konvertovao srednji intenzitet fluorescencije u vrednosti pg/ml.
Rezultati
[0317] Rezultati za analizu citokina MRx0029 u kulturi PBMC od zdravih donatora pokazali su imunostimulaciona svojstva za MRx0029. Konkretno, tretman MRx0029 povećao je ekspresiju TNF-α, IL-1β i IL-23.
[0318] Rezultati takođe pokazuju da tretman sa MRx0029 povećava ekspresiju MIP-3α, IL-6 i IL-10. Nivoi ekspresije MCP-1, CKSCL9 i GMCSF bili su slični kontrolama.
Diskusija
[0319] Ovo pokazuje da MRx0029 ima imunostimulaciona svojstva i može biti efikasana kompozicija za imunostimulaciju. Rezultati takođe pokazuju da MRx0029 može biti efikasana kompozicija u lečenju raka.
Primer 7 - Analiza protočne citometrije različitih populacija ćelija
Uvod
[0320] Pronalazači su nastojali da dalje analiziraju PBMC nakon inkubacije sa MRx0029. Analiza protočne citometrije je korišćena za određivanje procenata CD4 ćelija (CD4+ CD3+), Tregs (CD25++ CD127-), CD8 ćelija (CD8+ CD3+) i B ćelija (CD19+ CD3-).
Metoda
PBMC tretman
[0321] PBMC su tretirani kao što je opisano u Primeru 5.
Analiza protočne citometrije različitih populacija ćelija
[0322] 1.5x10<6>ćelija po uzorku je obojeno bojom za fiksiranje održivosti (Miltenyi) da bi se napravila razlika između živih i mrtvih ćelija tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su obojene dole navedenim koktelom antitela (Miltenyi) za osnovnu imunofenotipizaciju (CD3/CD4/CD8/CD25/CD127 i CD19) i inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim isprane i resuspendovane u PBS-u i odmah analizirane korišćenjem FACS Aria II opremljenog plavim (488 nm), crvenim (633 nm) i ljubičastim (405 nm) laserima. FMO su bili uključeni u sve eksperimente. Za analizu je korišćen softver FlowJo verzije 10.4.2 (FlowJo, LLC).
Rezultati
[0323] Rezultati za eksperimente protočne citometrije prikazani su na Slici 8.
[0324] Slika 8A pokazuje da su 0,73% PBMC bili Tregovi (CD25++ CD127-).
Diskusija
[0325] Rezultati pokazuju da MRx0029 može biti koristan za smanjenje Treg-ova. Štaviše, rezultati pokazuju da MRx0029 može biti efikasna kompozicija u stimulisanju imunološkog odgovora i smanjenju imunološke supresije pomoću Tregs-a. Rezultati takođe pokazuju da MRx0029 može biti efikasna kompozicija za upotrebu u lečenju raka.
Primer 8 - MRx0029 povećava sekreciju IL-8 u ćelijama MG U373
Uvod
[0326] Pronalazači su nastojali da identifikuju efekat MRx0029 na lučenje IL-8 u ćelijama neuroblastoma. Ćelije astrocitoma humanog glioblastoma su tretirane kompozicijama koje sadrže MRx0029 u kombinaciji sa LPS da bi se posmatrala njihova sposobnost da modulišu nivoe IL-8. IL-8 je proinflamatorni citokin koji pretežno luče makrofagi sa imunostimulacionim efektima.
Bakterijski soj
Megasphaera massiliensis MRx0029
Ćelijska linija
[0327] MG U373 je humani astrocitom glioblastoma koji potiče od malignog tumora i kupljen je od Sigma-Aldrich (kat. br. 08061901-1VL). Ćelije astrocitoma humanog glioblastoma MG U373 su uzgajane u MEM (Sigma Aldrich, kat. br. M-2279) sa dodatkom 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 1X MEM rastvora neesencijalne aminokiseline i 1X natrijum Piruva.
Metoda
[0328] Kada su porasle, ćelije MG U373 su postavljene na ploču sa 24 bunarića pri 100.000 ćelija/bunariću. Ćelije su tretirane samo LPS-om (1 ug/mL) ili sa 10% supernatanta bakterija iz MRx0029 tokom 24 sata. LPS je poznati stimulator proinflamatornih citokina kao što je IL-8. Nakon toga su sakupljeni supernatanti bez ćelija, centrifugirani na 10.000 g tokom 3 minuta na 4°C. IL-8 je meren korišćenjem humanog IL-8 ELISA kompleta iz Peprotech-a (kat br. #900-K18) prema uputstvu proizvođača.
Rezultati
4
[0329] Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 9. Tretman ćelija sojevima bakterija dovodi do povećanja sekrecije IL-8 nezavisno od prisustva LPS.
Diskusija
[0330] Rezultati pokazuju da MRx0029 može biti koristan za povećanje lučenja IL-8. Prema tome, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti, posebno bolesti koje karakteriše smanjena imunološka aktivacija i bolesti koje se leče povećanim imunološkim odgovorom.
Primer 9 - MRx0029 smanjuje nivoe aktivnosti histon deacetilaze u HT-29 ćelijama
Uvod
[0331] Ispitivana je sposobnost kompozicija koje sadrže MRx0029 da menjaju aktivnost histon deacetilaze. Pokazalo se da HDACi izaziva zaustavljanje rasta, diferencijaciju, apoptozu, smanjenje angiogeneze i modulaciju imunološkog odgovora u različitim ćelijskim linijama raka.
Bakterijski soj
Megasphaera massiliensis MRx0029
Ćelijska linija
[0332] Ćelijska linija HT-29 je korišćena jer je prisutna histon deacetilaza.
Metoda
[0333] Supernatanti bez ćelija stacionarne faze bakterijskih kultura su izolovani centrifugiranjem i filtriranjem na filteru od 0,22 uM. HT-29 ćelije su korišćene 3 dana nakon konfluencije i dodate u 1 mL DTS 24 sata pre početka eksperimenta. HT-29 ćelije su izazvane sa 10% supernatanta bez ćelija razblaženim u DTS i ostavljene su da se inkubiraju 48 sati. Nukleazni proteini su zatim ekstrahovani korišćenjem kompleta za ekstrakciju Sigma Aldrich nukleaze i uzorci su brzo zamrznuti pre merenja HDAC aktivnosti. HDAC aktivnost je procenjena fluorometrijski korišćenjem kompleta Sigma Aldrich (UK).
Rezultati
[0334] Rezultati eksperimenata su prikazani na Slici 10. Slika 109 pokazuje da MRx0029 može da smanji nivoe aktivnosti histon deacetilaze.
Diskusija
[0335] Rezultati pokazuju da je MRx0029 obećavajući kandidat za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakterišu epigenetske aberacije, kroz inhibiciju HDAC aktivnosti. Rak je bolest koju karakterišu epigenetske aberacije. Štaviše, inhibitori HDAC (HDACi) su nova klasa obećavajućih lekova protiv raka za koje se pokazalo da izazivaju zaustavljanje rasta, diferencijaciju, apoptozu, smanjenje angiogeneze i modulaciju imunološkog odgovora u različitim ćelijskim linijama raka.
Prema tome, rezultati pokazuju da kompozicije pronalaska mogu biti efikasne za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.
Primer 10 - Dalja analiza mehanizma inhibicije deacetilacije histona
Uvod
[0336] Mikrobiota creva, sa svojom ogromnom raznovrsnošću i metaboličkim kapacitetom, predstavlja ogroman metabolički rezervoar za proizvodnju velikog broja molekula sa potencijalom da utiče na aktivnost HDAC. Pronalazači su stoga nastojali da odrede koji su metaboliti odgovorni za inhibiciju HDAC i dalje razjasne mehanizme pomoću kojih se inhibicija postiže.
Bakterijski soj
Megasphaera massiliensis MRx0029
Metoda
Sakupljanje bakterijske kulture i supernatanta bez ćelija
[0337] Čiste kulture bakterija su uzgajane anaerobno u YCFA+ bujonu sve dok nisu dostigle stacionarnu fazu rasta. Kulture su centrifugirane na 5.000 x g tokom 5 minuta i supernatant bez ćelija (CFS) je filtriran korišćenjem 0,2 mM filtera (Millipore, UK). Alikvoti od 1 mL CFS-a su čuvani na -80 °C do upotrebe. Natrijum butirat, heksanska i valerijanska kiselina su dobijeni od Sigma Aldrich (UK) i suspenzije su pripremljene u YCFA+ bujonu.
SCFA i MCFA kvantifikacija bakterijskih supernatanata
[0338] Masne kiseline kratkog lanca (SCFA) i masne kiseline srednjeg lanca (MCFA) iz bakterijskih supernatanata su analizirane i kvantifikovane pomoću MS Omics APS na sledeći način. Uzorci su zakiseljeni pomoću hlorovodonične kiseline i dodati su interni standardi sa deuterijumom. Svi uzorci su analizirani randomizovanim redosledom. Analiza je obavljena korišćenjem kolone visokog polariteta (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. Column 30 m x 0.25 mm x 0.25 mm) postavljene u GC (7890B, Agilent) zajedno sa kvadropolnim detektorom (59977B, Agilent). Sistem je kontrolisan pomoću ChemStation (Agilent). Neobrađeni podaci su konvertovani u netCDF format korišćenjem Chemstation (Agilent), pre nego što su podaci obrađeni u Matlab R2014b (Mathvorks, Inc.) korišćenjem softvera PARADISE opisanog u [118].
Analiza specifične HDAC aktivnosti
[0339] Specifična aktivnost inhibicije HDAC je analizirana za HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 korišćenjem kompleta za fluorogene testove za svaki tip HDAC (BPS Bioscience, CA). Testovi su sprovedeni prema uputstvima proizvođača i svaki uzorak je izveden u ponavljanjima. Supernatanti bez ćelija su razblaženi 1 u 10 i izloženi specifičnim HDAC proteinima koji su obezbeđeni u kompletu da bi se održala konzistentnost između metoda.
Rezultati
Komensalni mikrobni metaboliti creva koji inhibiraju histon deacetilazu su butirat i valerijanska kiselina
[0340] MRx0029, čiji je supernatant pokazao snažnu inhibiciju HDAC u celim ćelijama HT29 i lizatima HT29 ćelija (videti sliku 11A), proizvodi valerijansku kiselinu i heksansku kiselinu u srednjim koncentracijama od 5,08 mM i 1,60 mM, redom (videti sliku 11B).
[0341] Da bi se istražilo koji su metaboliti odgovorni za inhibiciju HDAC izazvanu sojem, merene su različite koncentracije heksanske kiseline, valerijanske kiseline i natrijum butirata za njihovu inhibiciju HDAC na celim HT-29 ćelijama i na HT-29 ćelijskom lizatu. Rezultati na Slici 11C pokazuju značajnu (P<0,05) inhibiciju HDAC aktivnosti natrijum butiratom na celim ćelijama kao i na ćelijskom lizatu, dok heksanska kiselina nije pokazala značajnu inhibitornu aktivnost. Valerijanska kiselina je takođe inhibirala aktivnost HDAC na celim ćelijama, kao i na ćelijskom lizatu (<∗>(p<0.05),<∗∗>(p<0.005),<∗∗∗>(P<0.001),<∗∗∗∗>(p<0.0001)).
[0342] Potentni ukupni inhibitori HDAC ispitivali su HDAC ciljne klase I.
[0343] Ispitivan je specifični profil inhibicije HDAC test soja bakterija. Specifični testovi inhibicije HDAC (BPS Bioscience, CA) su sprovedeni za HDAC klase I i klase II. Sposobnost bakterijskog soja da inhibira HDAC enzime upoređena je sa butiratom, heksanoičnom i valerijanskom kiselinom. Naši rezultati pokazuju da je MRx0029 veoma moćan inhibitor HDAC enzima klase 1 (HDAC1, 2 i 3). Inhibicija HDAC klase II nije bila toliko značajna (podaci nisu prikazani).
Diskusija
[0344] Soj sa HDAC inhibitornom aktivnošću proizveo je značajne količine valerijanske kiseline i heksanske kiseline, kao i značajne količine natrijum butirata (Slika 11B). Kada su testirani kao čiste supstance, valerijanska kiselina i natrijum butirat su rezultirali značajnom inhibicijom HDAC (p<0,0001).
[0345] Zanimljivo je da rezultati za specifičnu aktivnost HDAC pokazuju da je testirani soj snažan inhibitor HDAC klase I, a posebno HDAC2 (Slika 12 i Slika 13). HDAC klase I (HDAC1, 2, 3 i 8) nalaze se u jezgru i sveprisutno se eksprimiraju u nekoliko tipova ljudskih ćelija. HDAC 1-3 dele više od 50% homologije, ali imaju različite strukture i ćelijske funkcije [119]. Oni su prvenstveno uključeni u preživljavanje ćelija, proliferaciju i diferencijaciju, i stoga njihova inhibicija može biti korisna kod širokog spektra bolesti [120]; [121]; [122]; [123]; [124]. Stoga, kompozicije pronalaska mogu biti posebno korisne za lečenje bolesti gde je aktivnost HDAC klase I povećana. Posebno, kompozicije pronalaska mogu biti posebno korisne za lečenje raka gde je aktivnost HDAC klase I povećana. Na primer, kompozicije pronalaska mogu biti posebno korisne za lečenje raka gde je aktivnost HDAC2 povećana.
Primer 11 - Modulacija funkcije barijere creva i permeabilnosti creva pomoću MRx0029
Uvod
[0346] Ispitivana je sposobnost MRx0029 da izazove bilo kakvu disfunkciju crevne barijere. HT29-mtk epitelni monoslojevi ćelija koji proizvode mucin [125] korišćeni su kao in vitro model za procenu poremećaja crevne barijere i imunološke stimulacije nakon tretmana sa MRx0029.
Bakterijski soj
Megasphaera massiliensis MRx0029
Metode
Ekstrakcija RNK i qPCR analiza
[0347] Ukupna RNK je ekstrahovana korišćenjem RNeasi mini kita (Qiagen, Mančester, JUK) prema uputstvima proizvođača, a koncentracija RNK određena apsorbanciom na 260/280 nm pomoću spektrofotometra (nanoDrop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE). Za analizu ekspresije mRNA, cDNK je pripremljena od ukupne RNK korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosystems, UK) prema uputstvima proizvođača. Reakcije reverzne transkripcije su izvedene u termocikleru (Biometra, Nemačka) na 25°C tokom 10 min, na 37°C tokom 120 min i na 85°C tokom 5 min, održavane na 4°C. Dobijena cDNK je amplifikovana u duplikatima SIBRGreen PCR testom, a proizvodi su detektovani na QuantStudio 6 flex real-time PCR mašini (Applied Biosistems, UK) korišćenjem standardizovanog profila (početna denaturacija od 95°C tokom 10 minuta, nakon čega je usledilo 40 ciklusa od 15 sekundi denaturacije na 95°C i 60 sekundi žarenja/ekstenzije na 60/65°C, u zavisnosti od prajmera. Faza disocijacije je dodata nakon 40 ciklusa da bi se generisala kriva topljenja. Analiza je izvršena korišćenjem Applied Biosystems QuantStudio Real-Time PCR Software v1.2.
Rezultati
[0348] Diferencirane HT29-mtk ćelije izložene forbol 12-miristat-13-acetatu (PMA) luče značajnu količinu IL-8; u kontrastnom tretmanu tokom 24 sata sa MRx0029 bakterijskim supernatantima, indukovao je čak niže lučenje IL-8 u poređenju sa netretiranim i YCFA+ ćelijama koje su tretirane (Slika 14A).
[0349] Zatim je ispitana sposobnost MRx0029 da reguliše permeabilnost epitela modifikovanjem intracelularne signalne transdukcije uključene u ekspresiju i lokalizaciju proteina uključenih u formiranje barijere creva.
[0350] RNK je izolovana i urađena je kvantitativna RT-PCR (kRT-PCR) analiza da bi se karakterisale promene u ekspresiji gena proteina čvrstog spoja tokom inkubacije sa MRx0029. Primena MRx0029 pojačala je ekspresiju mRNK Occludin, Villin, proteina čvrstog spoja 1 i 2 (respektivno TJP1 i TJP2) nakon 2h inkubacije (Slika 14B).
[0351] Rezultati in vitro su upoređeni sa podacima iz ex vivo paralelne analize na crevima miševa hranjenih sa MRx0029. Ekspresija gena TJP1 i okludina je kvantifikovana u debelom crevu i ileumu. Podaci ex vivo savršeno preslikavaju in vitro podatke pošto je MRx0029 bio u stanju da značajno poveća TJP1 i okludin (p=0,073) u regionu debelog creva mišjeg creva (Slika 14C+14D). MRx0029 je takođe mogao da smanji funkciju permeabilnosti u debelom crevu istih miševa (Slika 14F).
Diskusija
[0352] Rezultati pokazuju da je MRx0029 u stanju da reguliše permeabilnost epitela modifikovanjem intracelularne signalne transdukcije uključene u ekspresiju i lokalizaciju proteina uključenih u funkciju barijere creva (npr. Occludin, Villin, TJP1 i TJP2). Rezultati stoga pokazuju da MRx0029 funkcioniše tako da povećava funkciju barijere creva i smanjuje propusnost creva. Prema tome, kompozicije pronalaska su efikasne za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja koje karakteriše smanjenje funkcije barijere creva ili povećana permeabilnost creva.
Primer 12
Uvod
[0353] Pronalazači su pokušali da analiziraju ekspresiju gena za inflamatorne markere u moždanom tkivu iz hipokampusa, amigdale i prefrontalnog korteksa miševa hranjenih sa MRx0029. Pronalazači su takođe istraživali efekte na proizvodnju citokina iz slezine kod istih miševa kojima je primenjen MRx0029.
Bakterijski soj
Megasphaera massiliensis MRx0029
Metode
Životinje
[0354] Odrasli muški miševi BALBc (Envigo, UK) bili su smešteni u 12-časovnom ciklusu svetlo-mrak; standardna hrana za glodare i voda bili su dostupni ad libitum. Svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa evropskim smernicama nakon odobrenja Komiteta za eksperimentisanje etike na životinjama Univerzitetskog koledža u Korku. Životinje su bile stare 8 nedelja na početku eksperimenta.
Dizajn studija
[0355] Životinjama je dozvoljeno da se naviknu na svoju sobu za čuvanje nedelju dana nakon dolaska u jedinicu za životinje. Oni oralno na silu primaju (doza od 200 ml) žive bioterapeutike u dozi od 1 x 10<9>CFU tokom 6 uzastopnih dana između 15:00 i 17:00. Sedmog dana, životinje su obezglavljene, a tkiva su sakupljena za eksperimentisanje.
Skupljanje tkiva
[0356] Životinje su žrtvovane na nasumičan način u pogledu tretmana i uslova testiranja; uzorkovanje je obavljeno između 9.00 i 14.30 časova. Krv iz trupa je sakupljena u epruvete sa kalijumom EDTA (etilen diamin tetra sirćetna kiselina) i centrifugirana 15 minuta na 4000 g. Plazma je izolovana i čuvana na -80 °C za dalju analizu. Mozak je brzo izrezan, seciran i svaki region mozga je brzo zamrznut na suvom ledu i čuvan na -80 °C za dalju analizu. Slezina je uklonjena, sakupljena u RPMI medijumu od 5 mL (sa L-glutaminom i natrijum bikarbonatom, R8758 Sigma 10 % FBS (F7524, Sigma) 1% Pen/Strep (P4333, Sigma)) i obrađena odmah nakon odvajanja za npr. vivo imunološku stimulaciju. Intestinalno tkivo (izrezano je 2 segmenta od 3 cm ileuma i debelog creva koji su najbliži slepom crevu, a korišćeno je najudaljeniji 1 cm i 2 cm tkiva od slepog creva) postavljeno je u Ussingove komore za ispitivanje propusnosti creva. Slepo crevo je uklonjeno, izmereno i uskladišteno na -80 °C za analizu SCFA.
Analiza citokina slezine
[0357] Slezine su odmah sakupljene u 5 mL RPMI medijuma nakon žrtvovanja i odmah kultivisane. Ćelije slezine su prvo homogenizovane u ovom RPMI medijumu, nakon čega je usledila inkubacija od 5 minuta sa 1 ml pufera za lizu RBC (11814389001 ROCHE, Sigma). Dodato je još 10 ml RPMI medijuma, nakon čega je usledilo centrifugiranje na 200G tokom 5 minuta. Supernatant je zatim filtriran kroz sito od 40 um. Ćelije su izbrojane i zasejane (4,000,000/mL medijum). Posle 2,5 h adaptacije, ćelije su stimulisane lipopolisaharidom (LPS-2 mg/ml) ili konkavalinom A (ConA-2,5 mg/ml) tokom 24 h. Nakon stimulacije, supernatanti su sakupljeni da bi se procenilo oslobađanje citokina korišćenjem Proinflamatornog panela 1 (miš) V-PLEX kompleta (Meso Scale Discovery, Merilend, SAD) za TNF-α, IL-10, IL-1β, interferon γ, CXCL2 i IL6. Analize su obavljene korišćenjem MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR Imager 2400, SECTOR Imager 6000, SECTOR S 600.
Analiza ekspresije gena
[0358] Ukupna RNK je ekstrahovana korišćenjem kompleta za izolaciju mirVana™ miRNA (Ambion/Llife technologies, Paisley, UK) i tretirana DNase (Turbo DNA-free, Ambion/life technologies) u skladu sa preporukama proizvođača. RNK je kvantifikovan korišćenjem NanoDrop™ spektrofotometra (Thermo Fisher Scientific Inc., ‚Wilmington, Delaware, SAD) prema uputstvima proizvođača. Kvalitet RNK je procenjen korišćenjem Agilent Bioanalizer-a (Agilent, Stockport, UK) prema proceduri proizvođača i izračunat je broj integriteta RNK (RIN). Za naredne eksperimente korišćena je RNK sa RIN vrednošću >7. RNK je reverzno transkribovana u cDNK korišćenjem Applied Biosystems High Capacity cDNK kompleta (Applied Biosystems, Warrington, UK) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, Multiscribe reverzna transkriptaza (50 U/mL) (1)(2)(1)(10) je dodata kao deo RT master mešavine, inkubirana na 25°C 10 min, 37°C 2 h, 85° C 5 min i čuvana na 4°C. Kvantitativni PCR je sproveden korišćenjem sondi (6 karboksi fluorescein - FAM) koje je dizajnirao Applied Biosystems za miševe specifične ciljane gene, uz korišćenje β-aktina kao endogene kontrole. Reakcije amplifikacije su sadržale 1 ml cDNK, 5 ml 2x PCR Master mešavine (Roche), 900 nM svakog prajmera i dovedene su do ukupno 10 ml dodatkom vode bez RNaze. Sve reakcije su izvedene u tri primerka korišćenjem ploča sa 96 bunarića na LightCicler®480 sistemu. Uslovi termičkog ciklusa bili su prema preporuci proizvođača (Roche) za 55 ciklusa. Da bi se proverila kontaminacija amplikonom, svaka serija nije sadržala nikakve kontrole šablona u tri primerka za svaku korišćenu sondu. Vrednosti praga ciklusa (Ct) su zabeležene. Podaci su normalizovani korišćenjem β-aktina i transformisani korišćenjem 2-ΔΔCT metode i predstavljeni kao promena preklopa u odnosu na kontrolnu grupu.
Statisktička Analiza
[0359] Normalno raspoređeni podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM; Neparametarski skupovi podataka su predstavljeni kao medijana sa međukvartilnim opsegom. Neupareni dvostrani t-test je primenjen za analizu parametarskih podataka, a Man-Whitney test je korišćen za neparametarske. Spearmanov koeficijent korelacije ranga korišćen je za analizu korelacije u objedinjenim skupovima podataka. Vrednost p < 0,05 se smatrala značajnom u svim slučajevima.
Rezultati - Ekspresija gena
[0360] Ekspresija gena za inflamatorne markere [IL-1β, IL6, CD11b, TNF-α i TLR-4] analizirana je u moždanom tkivu iz hipokampusa, amigdale i prefrontalnog korteksa. Slike 15-25 pokazuju promene u ekspresiji gena nakon tretmana MRx0029 u hipokampusu, amigdali i prefrontalnom korteksu. Tretman sa MRx0029 značajno je povećao ekspresiju TLR-4 u amigdali (Slika 20). Tretman sa MRx0029 je takođe povećao ekspresiju CD11b u amigdali (Slika 21).
Rezultati - Uticaj na ekspresiju citokina iz splenocita
[0361] Ex-vivo test splenocita uključuje izazivanje splenocita (ćelije izolovane iz slezine - glavnog organa uključenog u imunološku odbranu), uz pomoć bakterio- ili virusno-mimetičkog izazova.
[0362] Tretman sa MRx0029 je doveo do smanjenja interferona-y, interleukina-1β i interleukina-6 nakon izazova sa LPS (Slike 26, 27 i 28, respektivno).
[0363] Tretman sa MRx0029 je doveo do povećanja nivoa hemoatraktanta CKSCL1 (Slika 30).
Diskusija
[0364] Tretman sa MRx0029 značajno je povećao ekspresiju proinflamatornih citokina TLR-4 i CD11b u amigdali. Prema tome, kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti, posebno bolesti koje karakteriše smanjena imunološka aktivacija i bolesti koje se leče povećanim imunološkim odgovorom.
Example 13 - Stability testing
[0365] Ovde opisana kompozicija koja sadrži najmanje jedan bakterijski soj koji je ovde opisan čuva se u zatvorenoj boci na 25°C ili 4°C i boca se stavlja u atmosferu
1
sa 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ili 95% relativne vlažnosti. Posle 1. meseca, 2. meseca, 3. meseca, 6. meseci, 1. godine, 1,5 godine, 2. godine, 2,5 godine ili 3. godine, najmanje 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% bakterijskog soja će ostati mereno u jedinicama koje formiraju kolonije utvrđenim standardnim protokolima.
Primer 14 - analiza uticaja M.massiliensis na ERK signalni put
Materijali i metode
Ekstrakcija RNK i MAP2 qPCR analiza
[0366] Ćelije su postavljene u ploče sa 12 bunarića pri gustini od 2x10<5>ćelija/bunariću. Posle 24 sata ćelije su tretirane ili DMSO ili Vemurafenibom (662005; EMD Millipore; VEMU; SKMEL28, SKMEL31, 451Lu, HT29 (1mM) SKMEL2 (10mM) ili azacitidinom-C (A3656;Sigma Aldrich; AzaC; 5mg/ml) ili oba leka (VEMU+Aza) zajedno, u prisustvu 10% supernatanta bakterija ili u odsustvu (YCFA+). Ukupna RNK je ekstrahovana korišćenjem RNeasi mini kita (Qiagen, Manchester, UK) prema uputstvima proizvođača, a koncentracija RNK je određena spektrofotometrom na 260/280 nm (NanoDrop ND-1000; Thermo Fisher Scientific, Loughborough). Za analizu ekspresije mRNA, cDNK je pripremljena od 2000 ng ukupne RNK korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Thermo Fisher, Loughborough) prema uputstvima proizvođača. Reakcije reverzne transkripcije izvedene su u termocikleru (Biometra, Nemačka) na 25°C tokom 10 min, na 37°C tokom 120 min i na 85°C tokom 5 min. Dobijena cDNK je amplifikovana u duplikatima SIBR-Green PCR testom, a proizvodi su detektovani na QuantStudio 6 flex real-time PCR mašini (Applied Biosistems, UK) korišćenjem standardizovanog profila (početna denaturacija od 95°C u trajanju od 10 minuta, a zatim 40 ciklusa od 10 sekundi denaturacije na 95°C i 30 sekundi žarenja/produživanja na 65°C). Faza disocijacije je dodata nakon 40 ciklusa da bi se stvorila kriva topljenja. Analiza je obavljena korišćenjem Applied Biosystems QuantStudio Real-Time PCR softvera v1.2. Sekvence prajmera za GAPDH i MAP2 su prikazane ispod.
Western blot analiza
[0367] Nakon 24-časovnog tretmana sa odgovarajućim lekovima, bilo u prisustvu 10% bakterijskog supernatanta ili u odsustvu (YCFA+), proteinski ekstrakti su dobijeni liziranjem ćelija u RIPA puferu (R0278; Sigma Aldrich) sa dodatkom inhibitora proteaze (kompletne koktel tablete inhibitora proteaze; Roche, Švajcarska) i 1 mM/L natrijum ortovanadata, 0,5 mM/L PMSF. Kvantifikacija proteina je urađena BCA proteinskim testom. Jednake količine ukupnog proteina (20 mg/traka) su zatim razdvojene pomoću SDS-PAGE na 4-15% gradijent gelu (BioRad) i prenete na membrane od poliviniliden difluorida (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Loughborough). Nakon blokiranja sa 5% BSA ili nemasnim suvim mlekom u TBST (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Tween 20) tokom 60 minuta, membrane su ispitane primarnim antitelima protiv fosfo-ERK (9101S, 1:1000 Cell Signalling; Nev
2
England Biolabs (UK)) ili total ERK (4696S, 1:1000, Cell signaling; New England Biolabs (UK)).
[0368] Proteini od interesa su otkriveni odgovarajućim HRP-konjugovanim sekundarnim antitelom (1:10,000, Thermo Fisher Scientific, Loughborough), razvijenim sa ECL Western blotting Super Signal PicoPlus supstratom (34577; Thermo Fisher Scientific, Loughborough) i vizuelizovani u Chemidoc KSRS Imager (BioRad).
Rast nezavisan od sidrenja (test rasta mekog agara) u pločama sa 96 bunarića
[0369] Mešavina od 25 µL prethodno zagrejanog (37°C) 2x odgovarajućeg medijuma za rast (EMEM za ćelijske linije melanoma; DMEM visoka glukoza za HT29) koji sadrži 20% FBS, 4 mM L-Glu, 23 NEAA, 0,6% natrijum bikarbonat, 200 U/ mL penicilina/streptomicina (Invitrogen) i 25 mL prethodno zagrejanog (47°C) 1,2% plemenitog agara (A5431; Sigma Aldrich) su postavljeni u svaki bunarić mikroploče sa 96 bunarića da bi poslužili kao predsloj za test. Deset mikrolitara ćelijskih suspenzija koje sadrže 0-2 x10<3>ćelija pomešano je sa 25µL 2x medijuma za rast i 35 µL 0,8% plemenitog agara u polipropilenskoj mikroploči sa okruglim dnom sa 96 bunarića i prebačeno u mikroploču sa 96 bunarića koja sadrži očvrsnuti predsloj. Ćelije su ostavljene da rastu 2 dana, a zatim su hranjene medijumom koji sadrži lekove u prisustvu 10% bakterijskih supernatanata ili YCFA+ svaka tri dana. Oni su ostavljeni da rastu u vlažnom inkubatoru na 37°C sa 5% CO2tokom 1-2 nedelje pre nego što je rast mekog agara ocenjen korišćenjem CitoSelect 96 testa transformacije ćelija (CBA-130; Cell Biolabs) prema protokolu proizvođača. Rast ćelija je meren korišćenjem Tecan Infinite F200 Pro serije čitača ploča sa više bunarića (Tecan Biosistems), sa ekscitacijom na 485 nm i emisijom na 530 nm.
Rast nezavisan od sidrenja (test rasta mekog agara) u ploči od 32 mm
[0370] Mešavina od 1 mL prethodno zagrejanog (37°C) 2x odgovarajućeg medijuma za rast (EMEM za ćelijske linije melanoma; DMEM visoka glukoza za HT29) i 1 mL prethodno zagrejanog (47°C) 0,8% plemenitog agara po ploči (0,4% finalnog agara) su pomešani sa 1 mL ćelijske suspenzije i zasejani preko 0,6% agar/predsloja za rast ćelija (2 mL) u ploču sa 6 bunarića. Ćelije su ostavljene da rastu u vlažnom inkubatoru na 37°C sa 5% CO2tokom 21-28 dana. Hranili su se lekovima u odsustvu (YCFA+) ili u prisustvu 10% bakterijskog supernatanta svaka tri dana. Kolonije su fotografisane pomoću mikroskopa Evos KSL Core (Thermo Fisher Scientific, Loughborough).
Klonogeni test
[0371] Ćelije su tripsinizovane i 200 ćelija/bunariću je zasejano u ploče sa 12 bunarića. Posle 48 sati ćelije su tretirane odgovarajućim lekovima u odsustvu (YCFA+) ili u prisustvu 10% bakterijskog supernatanta i ponovo su hranjene svaka tri dana. 21. dana nakon zasejavanja, ćelije su fiksirane u ledeno hladnom metanolu i obojene kristalno ljubičastom plavom bojom. Kolonije (.50 ćelija) su prebrojane i frakcija preživljavanja je izračunata kao broj kolonija podeljen brojem tretiranih ćelija na ploči (efikasnost postavljanja) podeljen sa efikasnošću kontrole.
Primer 14A - SKMEL2 ćelijska linija melanoma
[0372] Efekti sledećih tretmana su procenjeni na ćelijsku liniju melanoma SKMEL2 (VT BRAF; N61R onkogena mutacija u Nras): (1) MRKS0029; (2) Vemurafenib (VEMU) u IFCA+ medijumu; (3) VEMU i MRKS029; (4) Azacitidin-C (Aza-c) u IFCA+ medijumu; (5) Aza-c i MRKS029; (6) VEMU, Aza-c i MRKS0029.
[0373] Ekspresija MAP2 gena u ćelijskoj liniji SKMEL2 je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 31. Svi tretmani sa MRKS029 (sam ili u kombinaciji sa VEMU i/ili Aza-c) su povećali ekspresiju gena MAP2 u odnosu na na obe negativne kontrole (samo ćelijska linija i YCFA+). Klonogeno preživljavanje SKMEL2 ćelijske linije je procenjeno korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 32. Rast mekog agara SKMEL2 ćelijske linije je procenjen korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani u Slika 33. VEMU+Aza-c je poboljšao inhibiciju rasta mekog agara pomoću MRKS029.
[0374] Ovi rezultati ukazuju da MRKS0029 sam ili u kombinaciji sa vemurafenibom i/ili azacitidinom-C može imati efekte indukovanja ekspresije gena MAP2 u ćelijskoj liniji melanoma (SKMEL2). Štaviše, Vemurafenib+Azacitidin-C je poboljšao inhibiciju rasta mekog agara pomoću MRKS0029. Na osnovu toga, očekuje se da kompozicije pronalaska budu korisne u lečenju ili prevenciji različitih kancera, posebno metastatskih kancera, posebno metastatskog melanoma.
Primer 14B - SKMEL28 ćelijska linija melanoma
[0375] Efekti sledećih tretmana su procenjeni na ćelijsku liniju melanoma SKMEL28 (onkogena mutacija V600E u BRAF): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) u medijumu YCFA+; (3) VEMU i MRx0029; (4) AzacitidinC (Aza-c) u YCFA+ medijumu; (5) Aza-c i MRKS0029; (6) VEMU, Aza-c i MRx0029.
[0376] Ekspresija MAP2 gena u ćelijskoj liniji SKMEL28 je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 35. Klonogeno preživljavanje ćelijske linije SKMEL28 je procenjeno korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani u Slika 36. MRx0029 u kombinaciji sa VEMU i/ili Aza-c smanjio je klonogeno preživljavanje u odnosu na obe negativne kontrole (samo YCFA+ i ćelijska linija). Rast mekog agara SKMEL28 ćelijske linije je procenjen korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 37. ERK signalizacija u ćelijskoj liniji SKMEL28 je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 38 (VEMU, Azac i MRx0029 nisu procenjeni). Svi tretmani sa MRx0029 (sam ili u kombinaciji sa VEMU ili Aza-c) smanjili su ERK signalizaciju u odnosu na negativnu kontrolu (IFCA+).
4
[0377] Ovi rezultati ukazuju na to da MRx0029 sam ili u kombinaciji sa vemurafenibom i/ili azacitidinom-C može imati efekte inhibicije ERK signalizacije i smanjenja klonogenog preživljavanja ćelijske linije melanoma koja sadrži mutaciju BRAF V600E (SKMEL28). Na osnovu toga, očekuje se da kompozicije pronalaska budu korisne u lečenju ili prevenciji raka, posebno onih koji sadrže onkogeno ERK signalizaciju, posebno melanoma. Posebno se očekuje da će kompozicije pronalaska biti korisne u lečenju ili prevenciji takvih karcinoma koji sadrže onkogenu mutaciju u BRAF, posebno na poziciji 600, a posebno mutaciju BRAF V600E.
Primer 14C -SKMEL31 ćelijska linija melanoma
[0378] Efekti sledećih tretmana su procenjeni na ćelijsku liniju melanoma SKMEL31 (heterozigot za BRAF V600E): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) u IFCA+ medijumu; (3) VEMU i MRx0029; (4) Azacitidin-C (Aza-c) u IFCA+ medijumu; (5) Aza-c i MRx0029; (6) VEMU, Aza-c i MRx0029.
[0379] Ekspresija MAP2 gena u ćelijskoj liniji SKMEL31 je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 39. Klonogeno preživljavanje ćelijske linije SKMEL31 je procenjeno korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati prikazani su na slici 40. Rast mekog agara SKMEL31 ć elijske linije je procenjen korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 41. VEMU, Aza-c i VEMU+Aza-c poboljšali su rast mekog agara i inhibiciju klonogenog preživljavanja pomoću MRx0029. ERK signalizacija u ć elijskoj liniji SKMEL31 je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 42 (VEMU, Azac i MRx0029 u kombinaciji nisu procenjeni). Svi tretmani sa MRx0029 (sam ili u kombinaciji sa VEMU ili Aza-c) smanjili su ERK signalizaciju u odnosu na negativnu kontrolu (IFCA+).
Primer 14D - 451Lu ćelijska linija melanoma
[0380] Efekti sledećih tretmana su procenjeni na ćelijsku liniju melanoma 451Lu (V600E onkogena mutacija u BRAF): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) u IFCA+ medijumu; (3) VEMU i MRx0029; (4) AzacitidinC (Aza-c) u IFCA+ medijumu; (5) Aza-c i MRx0029; (6) VEMU, Aza-c i MRx0029.
[0381] Ekspresija MAP2 gena u ćelijskoj liniji 451Lu je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 43. Svi tretmani sa MRx0029 (pojedinačni ili u kombinaciji sa VEMU i/ili Aza-c) su povećali ekspresiju gena MAP2 relativno na ćelijsku liniju samo negativnu kontrolu. Klonogeno preživljavanje ćelijske linije 451Lu je procenjeno korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 44. Svi tretmani sa MRx0029 (pojedinačni ili u kombinaciji sa VEMU i/ili Aza-c) smanjili su klonogeno preživljavanje u odnosu na obe negativne kontrole (samo ćelijska linija i YCFA+ DMSO). Rast mekog agara 451Lu ćelijske linije je procenjen korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 45. Azacitidin C je pojačao inhibiciju rasta mekog agara pomoću MRx0029. ERK signalizacija u ćelijskoj liniji 451Lu je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 46 (VEMU, Aza-c i MRx0029 u kombinaciji nisu procenjeni). MRx0029 u kombinaciji sa VEMU ili Aza-c smanjio je ERK signalizaciju u odnosu na negativnu kontrolu (IFCA+ DMSO).
[0382] Ovi rezultati pokazuju da MRx0029 sam ili u kombinaciji sa Vemurafenibom i/ili azacitidinom-C ima efekte indukovanja ekspresije gena MAP2 i smanjenja klonogenog preživljavanja i rasta ćelijske linije melanoma koja nosi onkogenu mutaciju BRAF V600E (451Lu). Na osnovu toga, očekuje se da će kompozicije pronalaska biti korisne u lečenju ili prevenciji raka, posebno onih koji sadrže onkogeno ERK signalizaciju, posebno melanoma kao što su metastatski melanomi. Posebno se očekuje da će kompozicije pronalaska biti korisne u lečenju ili prevenciji takvih kancera koji sadrže onkogenu mutaciju u BRAF, posebno na poziciji 600, a posebno mutaciju BRAF V600E.
Primer 14E - HT29 ćelijska linija kolorektalnog raka
[0383] Efekti sledećih tretmana su procenjeni na ćelijsku liniju kolorektalnog karcinoma HT29 (onkogena mutacija V600E u BRAF): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) u IFCA+ medijumu; (3) VEMU i MRx0029; (4) AzacitidinC (Aza-c) u YCFA+ medijumu; (5) Aza-c i MRx0029; (6) VEMU, Aza-c i MRx0029.
[0384] Ekspresija MAP2 gena u ćelijskoj liniji HT29 je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 47. MRx0029 u kombinaciji sa VEMU i/ili Aza-c povećava ekspresiju gena MAP2 u odnosu na obe negativne kontrole (ćelijska linija samo i YCFA+). Klonogeno preživljavanje ćelijske linije HT29 je procenjeno korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 48. Svi tretmani sa MRx0029 (sam ili u kombinaciji sa VEMU i/ili Aza-c) smanjili su klonogeno preživljavanje u odnosu na oba negativne kontrole (samo ćelijska linija i YCFA+ DMSO). Aza-c je poboljšao efekte MRx0029 u inhibiciji klonogenog preživljavanja. Rast mekog agara HT29 ćelijske linije je procenjen korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 49a i b. ERK signalizacija u ćelijskoj liniji HT29 je procenjena korišćenjem protokola u materijalima i metodama, a rezultati su prikazani na slici 50 (VEMU, Azac i MRx0029 u kombinaciji nisu procenjeni). Samo MRx0029 ERK signalizacija u odnosu na negativnu kontrolu (IFCA+ DMSO).
[0385] Ovi rezultati ukazuju da MRx0029 sam ili u kombinaciji sa vemurafenibom i/ili azacitidinom-C ima efekte indukovanja ekspresije gena MAP2, smanjenja klonogenog preživljavanja i inhibicije ERK signalizacije u ćelijskoj liniji koja nosi onkogenu mutaciju V600E (HT29). Na osnovu toga, očekuje se da će kompozicije pronalaska biti korisne u lečenju ili prevenciji raka, posebno onih koji sadrže onkogeno ERK signalizaciju, posebno kolorektalnog raka kao što je metastatski kolorektalni rak. Posebno se očekuje da će kompozicije pronalaska biti korisne u lečenju ili prevenciji takvih kancera koji sadrže onkogenu mutaciju u BRAF, posebno na poziciji 600, a posebno mutaciju BRAF V600E.
Primer 15 - Ekspresija GPR109a RNK u diferenciranim Caco-2 ćelijama
[0386] GPR109a je receptor povezan sa G-proteinom koji se eksprimuje u apikalnim membranama epitelnih ćelija debelog creva i creva okrenute ka lumenu. Utišavanje ekspresije GPR109a je pronađeno u ćelijskim linijama raka debelog creva, a prijavljeno je da indukcija njegove ekspresije izaziva apoptozu tumorskih ćelija u prisustvu proizvoda bakterijske fermentacije kao što je butirat [126].
[0387] HT29mtk ćelije zasejane na ploče sa 12 bunarića i diferencirane 10 dana; zatim su izgladnjeni u serumu 12 sati i zatim izloženi 10% supernatantu dobijenog iz bakterija stacionarne faze tokom 24 sata. Ćelije su sakupljene, a ukupna RNK je izolovana prema RNeasi mini kit protokolu (Qiagen). cDNK je napravljena korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosistems). Ekspresija gena je merena qPCR. βaktin je korišćen kao interna kontrola. Promena preklopa je izračunata prema metodi 2^(-ΔΔct) [127]. Sekvence korišćenih normalnih i reverznih prajmera date su kao SEK ID BR: 6 i 7, respektivno.
[0388] Diferencirani Caco-2 formiraju polarizovane apikalne/mukozne i bazolateralne/serozne membrane koje su nepropusne i strukturno i funkcionalno su slične epitelnim ćelijama tankog creva. Tretman Caco-2 ćelija sa MRx0029 je izazvao povećanu ekspresiju GPR109a (Slika 52A). Takođe, Caco-2 tretiran supernatantom forbol-12-miristat-13-acetata (PMA) pokazao je veću ekspresiju GPR109a RNK nego tretman samo sa PMA (ili PMA u YCFA+ medijumu) - videti sliku 52B. Stoga, ovi podaci sugerišu da kompozicije pronalaska mogu biti korisne u lečenju raka, posebno metastatskih karcinoma, posebno metastatskog kolorektalnog raka ili raka tankog creva kao što je adenokarcinom tankog creva, a posebno onih koji sadrže onkogeno ERK signalizaciju. Ovi podaci takođe sugerišu da kompozicije pronalaska mogu uticati na takav tretman kroz mehanizam indukovanja apoptoze, kao rezultat ekspresije GPR109a.
Primer 16 - Efekat MRx0029 na sekreciju IL-8 od strane HT29 ćelijske linije
[0389] Diferencirane HT29 ćelije formiraju polarizovane apikalne/mukozne i bazolateralne/serozne membrane koje su nepropusne i strukturno i funkcionalno slične epitelnim ć elijama tankog creva. HT29 ćelije su postavljene u ploče sa 12 bunarića pri gustini od 200.000 ćelija/bunariću. Ćelije su diferencirane 10 dana (promena medijuma svaka 2 dana). Na dan eksperimenta ćelije su stavljene u anaerobni digestor i isprane anaerobnim ekvilibrisanim HANKs rastvorom. Zatim je ćelijama dodato 900 ul medijuma za rast (bez FBS i antibiotika). Ćelije bakterija su resuspendovane u medijumu za rast (bez FBS-a i antibiotika) i zatim su dodate na 10^7 CFU ukupno u 100ul. Ćelije su koinkubirane sa bakterijama 2 sata u anaerobnom digestoru. Nakon toga ćelije su isprane u medijumu za rast bez FBS-a, ali u medijumu koji sadrži antibiotike. Ćelije su ostavljene da miruju u 1 ml THP1 medijuma za kondicioniranje tokom 24 h. Posle 24h inkubacije, supernatant je sakupljen i centrifugiran na 10,000 g tokom 3 min i 4°C. Uzorci su zamrznuti na -80°C do dalje upotrebe.
[0390] THP1 medijum za kondicioniranje: THp1 je zasejan u T25 bocu pri gustini od 4x10^<6>/boci. Ćelije su tretirane u RPMI medijumu (sadrže 2 mM L-glutamina bez FBS) sa 1 ug/ml LPS ili LPS 5 mM ATP (ATP je dodat 3 sata posle LPS). Ćelije su ostavljene da miruju 24 sata. Nakon toga je sakupljen medijum za kondicinoiranje (CM) centrifugiranjem ćelija na 250 g tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Za lečenje HT29 ćelija korišćeni su različiti CM. Mali alikvot je zamrznut na 80°C za ELISA.
[0391] Sakupljeni su supernatanti iz različitih uzoraka i izvršena je analiza citokina u skladu sa uputstvima proizvođača korišćenjem humanog IL-8 ELISA kompleta iz Peprotech-a. GraphPad Prism7 je korišćen za crtanje i analizu podataka.
[0392] MRx0029 je povećao lučenje IL-8, koji je snažan imunostimulacioni citokin (Slika 53). Ovi podaci pokazuju imunostimulacionu aktivnost MRx0029.
[0393] Kao što je gore navedeno, lučenje IL-8 povećava proliferaciju B ćelija. B ćelije su uključene u modulaciju imunološkog odgovora na tumore. Zaista, lučenje antitumorskih antitela od strane B ćelija je moćan mehanizam kontrole tumora. Dobro je poznato da proizvodnja antitela specifičnih za tumor može pokrenuti prirodne ćelije ubice da se vežu za konstantni domen antitela, što rezultira lizom tumorskih ćelija putem citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela (ADCC). Prema tome, kompozicije pronalaska mogu uticati na lečenje raka kroz odgovarajuću modulaciju odgovora B ćelija, obezbeđujući povećane antitumorske imune odgovore.
[0394] Na osnovu činjenice da mehanizam patologije većine karcinoma podrazumeva izbegavanje nadzora od strane imunološkog sistema domaćina, svaki mehanizam uključen u stimulaciju imunološkog odgovora bi imao terapeutski blagotvoran uticaj. Stoga se očekuje da će kompozicije pronalaska biti korisne u lečenju ili prevenciji različitih karcinoma.
Primer 17 - analiza metabolita
Uvod
[0395] Mikrobiota creva, sa svojom ogromnom raznovrsnošću i metaboličkim kapacitetom, predstavlja ogroman metabolički rezervoar za proizvodnju velikog broja različitih molekula. Pronalazači su pokušali da odrede koje masne kiseline kratkog lanca i masne kiseline srednjeg lanca proizvode i konzumiraju soj M.massiliensis NCIMB 42787 i drugi soj M.massiliensis koji je ovde identifikovan kao Ref 1, Ref 2 i Ref 3.
Materijal i metode
Sakupljanje bakterijske kulture i supernatanta bez ćelija
[0396] Čiste kulture bakterija su uzgajane anaerobno u YCFA+ bujonu sve dok nisu dostigle stacionarnu fazu rasta. Kulture su centrifugirane na 5.000 x g tokom 5 minuta i supernatant bez ćelija (CFS) je filtriran korišćenjem 0,2 µM filtera (Millipore, UK). Alikvoti od 1 mL CFS-a su čuvani na -80 °C do upotrebe. Natrijum butirat, heksanska i valerijanska kiselina su dobijeni od Sigma Aldrich (UK) i suspenzije su pripremljene u YCFA+ bujonu.
SCFA i MCFA kvantifikacija bakterijskih supernatanata
[0397] Masne kiseline kratkog lanca (SCFA) i masne kiseline srednjeg lanca (MCFA) iz bakterijskih supernatanata su analizirane i kvantifikovane pomoću MS Omics APS na sledeći način. Uzorci su zakiseljeni pomoću hlorovodonične kiseline i dodati su interni standardi sa deuterijumom. Svi uzorci su analizirani randomizovanim redosledom. Analiza je obavljena korišćenjem kolone visokog polariteta (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. Column 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) postavljene u GC (7890B, Agilent) zajedno sa kvadropolnim detektorom (59977B, Agilent). Sistem je kontrolisan pomoću ChemStation (Agilent). Neobrađeni podaci su konvertovani u netCDF format korišćenjem Chemstation (Agilent), pre nego što su podaci obrađeni u Matlab R2014b (Mathvorks, Inc.) korišćenjem softvera PARADISE opisanog u [128].
Rezultati
[0398] Kao što je prikazano na slikama 54-56, soj 42787 proizvodi valerinsku kiselinu, butirat i heksansku kiselinu i troši propionat i acetat. Pronalazači su takođe pronašli druge sojeve vrste M.massiliensis koji proizvode uporedive nivoe valerijanske kiseline, heksanske kiseline i butirata i koji troše slične količine acetata i propionata.
Primer 18 - supresija enolaze 2
[0399] Slika 57 pokazuje da MRx0029 ima statistički značajan efekat potiskivanja neuronske specifične enolaze (NSE)/enolaze 2. Smatra se da NSE podržava povećane metaboličke zahteve tumorskih ćelija, štiti ćelije tumora od stresnih uslova i promoviše njihovu invaziju i migraciju [129]. Takođe je impliciran u progresiji metastatskog melanoma [130], preživljavanju i progresiji karcinoma pluća malih ćelija [131] i prognozi adenoskamoznog karcinoma pluća [132]. Stoga se očekuje da kompozicije pronalaska budu efikasne za lečenje i prevenciju raka, posebno metastatskog melanoma, sitnoćelijskog karcinoma pluća i adenoskamoznog karcinoma pluća.
Primer 19 - Analiza metabolita
[0400] Pored podataka datih u Primeru 17, Slika 58 pokazuje koje druge masne kiseline kratkog lanca proizvodi i konzumira soj M.massiliensis NCIMB 42787 i drugi sojevi deponovani pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43388 i NCIMB 43389.
[0401] M. massiliensis soj NCIMB 42787 smanjuje mravlju kiselinu dok povećava nivoe 2-metil-propanske i 3-metil-butanske kiseline (Slika 58). Dakle, soj NCIMB 42787 proizvodi 2-metil-propansku i 3-metil-butansku kiselinu i konzumira mravlju kiselinu. Pronalazači su takođe otkrili da drugi deponovani sojevi proizvode uporedive nivoe 2-metil-propanske i 3-metil-butanske kiseline i konzumiraju slične količine mravlje kiseline.
Primer 20 - Povećana regulacija IL-6
Uvod
[0402] Ispitivana je sposobnost bakterijskih sojeva da izazovu povećanje sekrecije IL-6 putem ćelijske linije astrocitoma U373.
Materijali i metode
[0403] Ćelijska linija astrocitoma humanog glioblastoma (U373), održavana je u 25 ml MEME 4,5 g/L D-glukoze sa dodatkom 10% toplotno inaktiviranog FBS, 4 mM L-glutamina, 100 µ/ml penicilina, 100 mg/ml 5 mg/ml plazmocina, 1% neesencijalnih aminokiselina, 1% natrijum piruvata (koji se nazivaju puni medijumi za rast).
[0404] Ćelije su postavljene u ploče sa 24 bunarića sa gustinom od 100.000 ćelija/bunariću u 1 ml punog medijuma za rast i ostavljene da miruju na 37°C/5% CO2tokom 72h. Na dan tretmana, medijum je uklonjen iz svakog bunarića, ćelije su isprane sa 0,5 ml medijuma za ispiranje (MEME bez seruma), 0,9 ml medijuma za stimulaciju (MEME medijum koji sadrži 2% FBS). Posle 1 h predinkubacije, ćelije su uklonjene iz CO2inkubatora i tretirane sa 100 ml bakterijskog supernatanta. YCFA+ medijum je korišćen kao kontrola. Ćelije su zatim inkubirane još 24 sata na 37°C/5% CO2, nakon čega su sakupljeni supernatanti bez ćelija i centrifugirani na 10.000 g na 4°C tokom 3 minuta. Uzorci su podeljeni u alikvote u mikroepruvetama od 1,5 ml i čuvani na -80°C za hIL-6 ELISA.
Rezultati i zaključci
[0405] Slika 59 pokazuje da soj M.massiliensis NCIMB 42787 povećava sekreciju IL-6 u U373 ćelijama u poređenju sa netretiranim i YCFA+ kontrolama. Drugi deponovani sojevi, posebno NCIMB 43389, takođe su povećali lučenje IL-6. Dodatni deponovani sojevi su NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43386 i NCIMB 43387.
[0406] Sekrecija IL-6 povećava proliferaciju B ćelija. Kao što je gore navedeno, povećana proliferacija B ćelija može delovati kao moćan mehanizam za poboljšanje imunološkog odgovora protiv raka (npr. putem proizvodnje antitela i pokretanja ADCC-a)
[0407] Zaista, imunostimulaciona aktivnost se pokazuje, ne samo deponovanim sojem, već i srodnim deponovanim sojevima. Stoga se očekuje da kompozicije pronalaska koje sadrže sojeve roda Megasphaera, ili njihove biotipove, budu korisne u lečenju ili prevenciji različitih karcinoma.
Primer 21 - Supresija enolaze 2
Materijali i metode
[0408] Ćelijska linija neuroblastoma SH-SY5Y, uzgajana je u medijumu sa 50% MEM i 50% smeše hranljivih materija F-12 Ham sa dodatkom 2 mM L-glutamina, 10% toplotno inaktiviranim FBS, 100 µ/ml penicilina i 100 mg/ml streptomicina. SHSY5Y su postavljene u ploče sa 6 bunarića pri gustini od 0,5x10<6>ćelija. Posle 24 sata, ćelije su tretirane u medijumu za diferencijaciju (medijum za rast koji sadrži 1% FBS) sa 10% bakterijskih supernatanata ili YCFA+ tokom 17 sati. Ćelije su sakupljene, a ukupna RNK je izolovana prema RNeasi mini kit protokolu (Qiagen). cDNK je napravljena korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosistems). Ekspresija gena je merena qPCR. GAPDH je korišćen kao interna kontrola. Promena preklopa je izračunata prema 2(<-ΔΔct>) metodi. Korišćeni setovi prajmera navedeni su kao SEK ID BR: 2, 3, 13 i 14.
Rezultati
[0409] Slika 60 pokazuje da soj M. massiliensis NCIMB 42787 ima statistički značajan efekat supresije neuronske specifične enolaze (NSE)/enolaze 2. Pored toga, pronalazači su takođe otkrili da deponovani referentni sojevi izazivaju statistički značajno smanjenje Enolaze 2 u poređenju sa YCFA+ kontrolnom kulturom. Posebno, sojevi deponovani pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 i NCIMB 43387 izazvali su značajnu supresiju enolaze 2.
Zaključak
[0410] Shodno tome, u skladu sa komentarima u Primeru 18 iznad, očekuje se da kompozicije pronalaska, u određenim izvođenjima koje sadrže primere referentnih sojeva, budu efikasne za lečenje i prevenciju raka, posebno metastatskog melanoma, malih ćelija pluća rak i adenoskamozni karcinom pluća.
Primer 22 - Upregulacija MAP2
Materijali i metode
[0411] Ćelijska linija neuroblastoma SH-SY5Y, uzgajana je u medijumu sa 50% MEM i 50% smeše hranljivih materija F-12 Ham sa dodatkom 2 mM L-glutamina, 10% toplotno inaktiviranim FBS, 100 µ/ml penicilina i 100 mg/ml streptomicina. SHSY5Y su postavljene u ploče sa 6 bunarića pri gustini od 0,5x10<6>ćelija. Posle 24 sata, ćelije su tretirane u medijumu za diferencijaciju (medijum za rast koji sadrži 1% FBS) sa 10% bakterijskih supernatanata ili YCFA+ tokom 17 sati. Ćelije su sakupljene, a ukupna RNK je izolovana prema RNeasy mini kit protokolu (Qiagen). cDNK je napravljena korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosistems). Ekspresija gena je merena qPCR. GAPDH je korišćen kao interna kontrola. Promena preklopa je izračunata prema 2(<-ΔΔct>) metodi. Korišćeni setovi prajmera su navedeni kao SEK ID BR: 2, 3, 4 i 5.
Rezultati
[0412] Slika 61A prikazuje da M massiliensis soj NCIMB 42787 i drugi deponovani sojevi izazivaju statistički značajno povećanje ekspresije MAP2 u poređenju sa kontrolama (tj. negativna kontrola i kontrolnim medijumom). Posebno, sojevi deponovani pod pristupnim brojevima NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389,
1
NCIMB 43386 i NCIMB 43387 izazvali su značajno povećanje ekspresije MAP2. Na osnovu toga, očekuje se da kompozicije pronalaska budu korisne u lečenju ili prevenciji različitih kancera, posebno metastatskih kancera, posebno metastatskog melanoma.
Primer 23 – Modulacija sekrecije citokina u HMC3 ćelijama izloženim TNFα nakon tretmana sojem M. massiliensis NCIMB 42787
Uvod
[0413] HMC3 ćelije su tretirane sa TNF-α, a sekrecija IL-8 je merena nakon tretmana supernatantima bez ćelija iz kulture stacionarne faze NCIMB 42787.
[0414] Ćelije humane mikroglije HMC3 su uzgajane u EMEM medijumu sa dodatkom glutamina koji sadrži 15% toplotno inaktivirani FBS i 100µ/ml penicilina i 100mg/ml streptomicina. HMC3 ćelije su postavljene u ploče sa 24 bunarića pri gustini od 50.000 ćelija/bunariću. Ćelije su ostavljene u CO2inkubatoru da miruju 48 h. Ćelije su zatim isprane u praznom EMEM-u i prethodno tretirane u 2% FBS medijumu za rast sa 10 ng/ml TNF- α tokom 1 sata. Nakon toga, 10% bakterijskih supernatanata bez ćelija za stacionarne kulture rasta NCIMB 42787 (izolovane kao što je gore opisano) dodato je u TNF-α-tretirane i neobrađene bunariće i inkubirano u CO2inkubatoru na 37°C tokom 24 sata. Supernatanti bez ćelija su sakupljeni i centrifugirani na 10,000xg tokom 3 min i 4°C. Uzorci su podeljeni u alikvote u mikroepruvetama od 1,5 ml i čuvani na -80°C za hIL-8 ELISA.
[0415] Sekrecija IL-8 je analizirana korišćenjem hIL-8 standardnih ELISA kompleta, u skladu sa protokolom proizvođača u supernatantima bez ćelija iz HMC3 ćelija tretiranih kao što je gore opisano. Uzorci su mereni na 405 nm sa korekcijom talasne dužine postavljene na 655 nm na čitaču mikroploče (iMark, Bio-Rad). Neobrađeni podaci su upisani u kartu i analizirani korišćenjem softvera GraphPad Prism 7.
Statistička analiza
[0416] Normalno raspoređeni podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM; Jednosmerna Anova (Sidakov test višestrukog poređenja) korišćena je za analizu podataka predstavljenih u ovom radu. Vrednost p <0,05 se smatrala značajnom u svim slučajevima.
Rezultati
[0417] NCIMB 42787 indukuje lučenje IL-8 u odsustvu stimulacije (Slika 61B). Kao što je gore navedeno, IL-8 je uključen u aktivaciju imunološkog sistema, posebno stimulacijom proliferacije B ćelija.
Primer 24 - Aktivacija NF-κB promotora u HEK-TLR4 ćelijama od strane M. massiliensis NCIMB 42787
Uvod
2
[0418] Da bi se proverilo da li bi tretman sa NCIMB 42787 indukovao aktivnost NF-κB-Ap1 promotora izazvanu angažovanjem TLR4, HEK-TLR4 ćelije su tretirane bakterijskim supernatantima bez ćelija za NCIMB 42787 pojedinačno ili u kombinaciji sa LPS.
Materijali i metode
[0419] HEK293-Plave reporterske ćelije koje stabilno eksprimiraju humani TLR4 (HEK-TLR4), kultivisane su prema uputstvima proizvođača. Ukratko, HEK-TLR4 ćelije su održavane u DMEM 4,5 g/L D-glukoze dopunjene sa 10% (v/v) toplotno inaktiviranim FBS, 4 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina/100mg ml normocina, 1x HEKBlue medijum za selekciju.
[0420] Ukratko, ćelije su isprane sa PBS, disocirane u PBS i sakupljene u medijumu za rast. Ćelije su postavljene u ploče sa 96 bunarća pri gustini od 25.000 ćelija/bunariću. Da bi se procenio efekat sojeva bakterija na LPS koji indukuje aktivaciju NF-κB promotora, ćelije su tretirane sa 10 ng/ml LPS u prisustvu ili odsustvu 10% supernatanta (izolovanih kao što je gore opisano) i inkubirane u CO2inkubatoru. Tretmani su nastavljeni tokom 22 sata na 37°C i 5% CO, nakon čega je izvršena detekcija aktivnosti izlučene embrionalne alkalne fosfataze (SEAP) iz supernatanta ćelijske kulture korišćenjem KUANTIblue rastvora prema uputstvima proizvođača. Ukratko, 20 ml supernatanta bez ćelija je sakupljeno i analizirano na prisustvo SEAP mešanjem sa 200 ml sterilno filtriranog QUANTI-Blue medijuma za detekciju. Posle 2h inkubacije na 37°C, optička gustina je izmerena na 655nm na čitaču mikroploča (iMark mikroploča, Bio-Rad).
Statistička analiza
[0421] Normalno raspoređeni podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM; Jednosmerna Anova (Sidakov test višestrukog poređenja) korišćena je za analizu podataka predstavljenih u ovom radu. Vrednost p <0,05 se smatrala značajnom u svim slučajevima.
Rezultati
[0422] NCIMB 42787 je indukovao samu aktivaciju NF-κB-Ap1 promotora (Slika 61C).
[0423] NF-κB je uključen u aktivaciju imunološkog odgovora, posebno stimulisanjem ekspresije medijatora upale i citokina uključenih u imuni odgovor, na primer IL-6. Kao što je gore navedeno, povećanje ekspresije IL-6 pomaže da se stimuliše imuni sistem i stoga aktivacija NF-κB puta ima imunostimulacionu aktivnost. Shodno tome, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska aktiviraju NF-κB signalizaciju i na taj način stimulišu imuni sistem.
Primer 25 - Sojevi M. massiliensis proizvode buternu, valerijansku i heksansku kiselinu
Materijali i metode
[0424] Ekstrakcija SCFA iz YCFA+, YCFA+ uz dodatak standardne mešavine SCFA (40 mM sirćetne kiseline i 20 mM mravlje kiseline, propionske kiseline, buterne kiseline, valerijanske kiseline i heksanske kiseline) sprovedena je prema metodi De Baere i dr.<133>.
HPLC analiza SCFA
[0425] HPLC detekcija i kvantifikacija SCFA je sprovedena prema metodi De Baere i dr.<133>sa malim modifikacijama. Ukratko, HPLC analiza je izvedena korišćenjem Waters e2695 HPLC sistema opremljenog Waters Photodiode Array (PDA) detektorom 2998 (Vaters Limited, Elstree, UK). HPLC analiza SCFA standarda, SCFA ekstrahovanih iz MRx0005 i MRx0029 BCFS i MRx0005 i MRx0029 kao i ekstrakta heksana, dietil etra, etilacetata, acetonitrila i metanola izvedena je korišćenjem Xselect® HSS T3, 3.5 mm kolone, 3.5 mm elit. ). LC analiza je izvedena korišćenjem detektora fotodiodnog niza (PDA) postavljenog za analizu talasnih dužina od 200-800 nm. SCFA detekcija i kvantifikacija su izvedeni na 210 nm. Mobilna faza se sastojala od 25 mM natrijum-fosfatnog pufera u HPLC vodi (pH podešen na 3,0 pomoću fosforne kiseline (A) i acetonitrila (B). LC metoda za detekciju i kvantifikaciju SCFA izvedena je korišćenjem sistema rastvarača sa sledećim gradijentom: t0’ A=95%, B=5%; t10’ A=95%, B=5%; t30’ A=30%, B=70%; t31’ A=0%, B=100%; t36’ A=0%, B=100%; t38’ A=5%, B=95%; t60’ A=5%, B=95%; flow=1ml/min
[0426] Kalibraciona kriva u sedam tačaka je pripremljena za svaki SCFA ubrizgavanjem 20 ml dvostrukog serijskog razblaženja SCFA (40 mM sirćetne kiseline i 20 mM mravlje kiseline, propionske kiseline, buterne kiseline, valerijanske kiseline i heksanske kiseline). Efikasnost kvantifikacije – ekstrakcije je izračunata korišćenjem formule u nastavku:
[SCFA u YCFA+ spajkovan i ekstrahovan]/[SCFA u YCFA+ spajkovan neekstrahovan]
[0427] Efikasnost ekstrakcije je korišćena za određivanje koncentracija pojedinačnih SCFA u svakom uzorku. Proizvodnja specifičnih SCFA je izračunata oduzimanjem količine odgovarajućeg SCFA prisutnog u kontrnom medijumu bez spajka.
Ciljana metabolomika: bakterijski metaboliti i analiza masnih kiselina
[0428] Analizu uzoraka izvršio je MS-Omics (Kopenhagen, Danska). Mešoviti zbirni uzorak (QC uzorak ) je napravljen uzimanjem alikvota iz svakog uzorka. Ovaj uzorak je analiziran u redovnim intervalima kroz čitavu sekvencu. Matriks efekti su testirani za kvantifikovana jedinjenja dodavanjem QC uzorka na najmanje dva nivoa.
[0429] Za analizu GC-metabolita, uzorci su derivatizovani metil hloroformatom korišćenjem blago modifikovane verzije protokola koji su opisali Smart i dr.<134>. Svi uzorci su analizirani nasumičnim redosledom. Analiza je izvedena korišćenjem GC (7890B, Agilent) u kombinaciji sa kvadrupolnim detektorom (59977B, Agilent). Neobrađeni podaci su konvertovani u netCDF format korišćenjem Chemstation
4
(Agilent), pre nego što su podaci obrađeni u Matlab R2014b (Mathvorks, Inc.) korišćenjem softvera PARADISe koji su opisali Johnsen i dr.<135>
[0430] Za SCFA analizu, uzorci su zakiseljeni hlorovodoničnom kiselinom i dodati su interni standardi sa deuterijumom. Analiza je izvedena korišćenjem kolone visokog polariteta (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. Kolona 30mx0.25mmx0.25mm) instalirane u GC (7890B, Agilent) u kombinaciji sa kvadrupolnim detektorom (59977B, Agilent). Neobrađeni podaci su konvertovani u netCDF format korišćenjem Chemstation (Agilent), pre nego što su podaci obrađeni u Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) korišćenjem softvera PARADISe koji su opisali Johnsen i dr.<135>.
Rezultati
[0431] Analiza masnih kiselina, korišćenjem ciljane metabolomike, pokazala je da NCIMB 42787 proizvodi buternu (butirnu ), pentansku (valerinsku) i heksansku (kapronsku) kiselinu, u linearnom i razgranatom obliku (C4-C6) (Slika 62A). Štaviše, odnos 4-hidroksi-fenilsirćetna kiselina:medijum je povećan u supernatantu bez ćelija NCIMB 42787. HPLC analiza supernatanata bez ćelija je korišćena za praćenje proizvodnje mravlje, sirćetne, propionske, buterne, valerijanske i heksanske kiseline (na osnovu retencionog vremena i apsorpcionog spektra relevantnih SCFA) od strane NCIMB 42787. Reprezentativni hromatogrami za SCFA standarde koji su prekriveni supernatantima bez ćelija NCIMB 42787 ekstrahovani za SCFA prikazani su na slici 62C. HPLC analiza je potvrdila proizvodnju buterne, valerijanske i heksanske kiseline od strane NCIMB 42787.
Primer 26 - metanolne frakcije M. massiliensis koje sadrže butirat i valerat pokazuju imunostimulacionu aktivnost u U373 ćelijama
[0432] Da bi se istražila uloga SCFA u smanjenju sekrecije IL-8, ćelije U373 su tretirane povećanom koncentracijom natrijum butirata (SB), natrijum valerata (SV) i heksanske kiseline (HA).
Metode
[0433] U373 ćelije su pripremljene kao što je gore opisano. Ćelije su prethodno tretirane 1 h sa 1 mg/ml LPS opisanim gore i inkubirane na 37°C i 5% CO2. Posle 1 h pre-inkubacije, ćelije su uklonjene iz CO2inkubatora i tretirane rastućom koncentracijom sveže pripremljenog natrijum butirata (SB), natrijum valerata (SV) i heksanske kiseline (HA).
Statistička analiza
[0434] Normalno raspoređeni podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM; Jednosmerna Anova (Sidakov test višestrukog poređenja) korišćena je za analizu podataka predstavljenih u ovom radu. Vrednost p <0,05 se smatrala značajnom u svim slučajevima.
Rezultati i zaključci
[0435] Testirane koncentracije pokrivale su opseg koncentracija izmerenih u supernatantima bez ćelija za različite masne kiseline i uzele su u obzir činjenicu da je samo 10% gore navedenih supernatanata korišćeno u testovima zasnovanim na ćelijama. I SB i SV su povećali lučenje IL-8 izazvano LPS-om u istim ćelijama (Slika 63), što sugeriše da je prisustvo oba SCFA verovatno doprinelo indukciji IL-8 kada se kulturi doda NCIMB 42787. HA nije inhibirao lučenje IL-8 nakon izazivanja sa LPS. Nijedan od testiranih SFCA nije indukovao per se sekreciju IL-8 iznad bazalnog nivoa (netretirana ćelijska kontrola). Rekonstituisana mešavina tri SCFA reprodukovala je biološku aktivnost supernatanta bez ćelija NCIMB 42787, i u prisustvu i u odsustvu LPS.
[0436] Shodno tome, u određenim izvođenjima buterna i/ili valerijanska kiselina su uključene u stvaranje IL-8, i stoga su važne za stimulaciju imunološkog sistema, na primer putem proliferacije B ćelija. Stoga, u određenim izvođenjima, sojevi bakterija prema pronalasku stimulišu imuni sistem kroz proizvodnju buterne i/ili valerijnske kiseline.
Primer 27 – SCFA koje generiše NCIMB 42787 su bar delimično odgovorni za imunostimulacionu aktivnost
Uvod
[0437] Da bi se dalje potvrdilo da li je aktivnost NCIMB 42787 barem delimično posledica SCFA, bakterijski supernatant bez ćelija je frakcionisan sa različitim rastvaračima sve većeg polariteta. HPLC analiza deproteinizovanih sirovih ekstrakata (heksan, F5; dietil etar, F4; etil acetat, F3; acetonitril, F4; metanol, F1) supernatanata ovog soja je sprovedena da bi se analizirala biohemijska složenost supernatanata stacionarne faze bez ćelija NCIMB 42787, kao i da bi se jedinjenja subfrakcionisala na osnovu polariteta i rastvorljivosti.
Metode
Sekvencijalne ekstrakcije rastvaračem - priprema sirovih ekstrakata
[0438] Tri biološke replike NCIMB 42787 soja BCFS i YCFA+ (kontrolni medijum) ekstrahovane su sekvencijalno sa heksanom (HEKS), dietil etrom (DE), etil acetatom (EtOAc), acetonitrilom (ACN) i metanolom (MeOH). Ukratko, 20 ml BCFS je stavljeno u staklene bočice i ekstrahovano na sobnoj temperaturi (RT) u 20 ml HEKS na rotacionoj mešalici (70 obrtaja u minuti) tokom 30 minuta. Na svakom kontrolnom medijumu BCFS i YCFA+ izvedene su ukupno tri ekstrakcije. Preostali vodeni slojevi su zatim ekstrahovani na sobnoj temperaturi u 20 ml DE, EtOAc na MKS-RD-Pro rotacionoj mešalici (70 rpm) tokom 30 minuta ukupno tri puta. Kombinovani ekstrakti svakog uzorka su sušeni pod sniženim pritiskom u rotacionom uparivaču R-300 opremljenom vakuum pumpom V-300 (Buchi, Flavil, Švajcarska) na temperaturi koja ne prelazi 30°C. Dobijeni ekstrakti su ponovo rastvoreni u 2ml odgovarajućeg rastvarača i podeljeni u alikvote u četiri Eppendorf epruvete od 1,5ml (500ml svaka odgovara 5ml originalnog uzorka). Preostali vodeni slojevi su zatim ekstrahovani na sobnoj temperaturi u 20 ml DE, EtOAc na MKS-RD-Pro rotacionoj mešalici (70 rpm) tokom 30 minuta ukupno tri puta. Kombinovani ekstrakti svakog uzorka su sušeni pod sniženim pritiskom u rotacionom uparivaču R-300 opremljenom vakuum pumpom V-300 (Buchi, Flavil, Švajcarska) na temperaturi koja ne prelazi 30°C. Dobijeni ekstrakti su ponovo rastvoreni u 2ml odgovarajućeg rastvarača i podeljeni u alikvote u četiri Eppendorf epruvete od 1,5ml (500ml svaka odgovara 5ml originalnog uzorka).
[0439] Preostali vodeni slojevi su upareni do suva pomoću R-300 rotacionog uparivača. Dobijeni suvi ekstrakti su ekstrahovani 30 minuta u 20 ml ACN ukupno tri puta. Ekstrakti ACN su kombinovani, upareni do suva korišćenjem rotacionog uparivača, ponovo rastvoreni u 2 ml ACN i podeljeni u alikvote u četiri Ependorfove epruvete od 1,5 ml (svaka po 500 ml). Preostali suvi ekstrakti (ACN nerastvorljivi deo ekstrakata) su zatim ekstrahovani 30 minuta u 20 ml MeOH ukupno tri puta. Ekstrakti MeOH su kombinovani, upareni do suva korišćenjem rotacionog uparivača R-300, ponovo rastvoreni u 2ml MeOH i podeljeni u alikvote u četiri Ependorfove epruvete od 1,5ml (svaka po 500ml).
[0440] Alikvoti sirovih ekstrakata su držani preko noći na -20°C izazivajući precipitaciju proteinskih komponenti. Nakon taloženja preko noći, svaki alikvot je centrifugiran na 10,000xg tokom 6 minuta i prebačen u novu epruvetu od 2 ml. Taloženje preko noći je ponovljeno tri puta nakon čega su ekstrakti sušeni u RVC 2-18 CDPlus speedvac (Christ, Osterode am Harz, Nemačka) i izmereni. Svi osušeni alikvoti svakog ekstrakta su čuvani na -80°C do dalje upotrebe.
Tretman
[0441] U373 ćelije su pripremljene kao što je gore opisano. Ćelije su prethodno tretirane 1 h sa 1 mg/ml LPS kao što je gore navedeno. Nakon toga, ćelije su uklonjene iz CO2inkubatora i tretirane sa 100 ml različitih frakcija. Kao kontrole su korišćene frakcije iz medijuma. Supernatanti bez ćelija su sakupljeni 24 sata nakon tretmana i analizirani ELISA testom na sekreciju IL-8 (kao što je gore navedeno).
Statistička analiza
[0442] Normalno raspoređeni podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM; Jednosmerna Anova (Sidakov test višestrukog poređenja) korišćena je za analizu podataka predstavljenih u ovom radu. Vrednost p <0,05 se smatrala značajnom u svim slučajevima.
Rezultati
[0443] HPLC analiza je potvrdila selektivnu ekstrakciju i sirovo frakcionisanje jedinjenja prisutnih u deproteinizovanim supernatantima. Nefrakcionisani NCIMB 42787 indukovao je sekreciju IL-8 u U373 ćelijama i u prisustvu i u odsustvu LPS-a, a istu aktivnost je proizvela metanolna frakcija F1, čime se ponavlja značajna uloga buterne i valerijanske kiseline u proizvodnji IL-8 od strane ovih tipovi ćelija (Slika 64A i B).
[0444] Stoga, kao što je gore navedeno, u određenim izvođenjima, proizvodnja buterne i/ili valerijanske kiseline stimuliše imuni sistem. Shodno tome, u određenim izvođenjima, bakterijski sojevi pronalaska stimulišu imuni sistem kroz proizvodnju buterne i/ili valerijanske kiseline.
Primer 28 - Megasphaera referentni soj NCIMB 43387 značajno smanjuje ekspresiju IDO-1 mRNA debelog creva kod BALB/c miševa
[0445] Slika 65 pokazuje da NCIMB 43387 izaziva značajno smanjenje (kvantifikovano pomoću qPCR normalizovanog na b-aktin) ekspresije IDO-1 mRNK u debelom crevu BALB/c miševa u poređenju sa kontrolnim nosačem.
[0446] IDO-1 je uključen u promovisanje imunosupresije kao odgovora na upalu ili infekciju. Shodno tome, smanjenje ekspresije IDO-1 povezano je sa imunostimulacijom. Štaviše, smanjenje IDO-1 smanjuje proliferatorni i migracioni kapacitet ćelija raka i poboljšava imunološki nadzor protiv tumora. Zbog toga, u određenim izvođenjima, bakterijski sojevi pronalaska služe za smanjenje ekspresije IDO-1. U određenim izvođenjima, imunostimulacija je povezana sa smanjenjem ekspresije IDO-1. Pored toga, u određenim izvođenjima, kompozicije iz ovog pronalaska sprečavaju rast metastatskog raka. U određenim izvođenjima, kompozicije iz ovog pronalaska su efikasne za lečenje i prevenciju raka, posebno metastatskog melanoma, sitnoćelijskog karcinoma pluća i adenoskamoznog karcinoma pluća u svetlu njihove aktivnosti protiv metastaza.
Primer 29 - Megasphaera sojevi deponovani pod pristupnim brojevima NCIMB 43385 i NCIMB 43387 smanjuju ekspresiju Tph-1 mRNA debelog creva kod BALB/c miševa
[0447] BALB/c miševima je davan živi bioterapeut i tkiva su izolovana za analizu ekspresije gena korišćenjem qPCR
[0448] Slika 66 pokazuje sposobnost kompozicija pronalaska da smanje ekspresiju Tph-1 mRNK (koristeći kvantifikaciju pomoću qPCR normalizovane na b-aktin) u poređenju sa kontrolnim nosačem.
[0449] Poznato je da je smanjenje Tph-1 povezano sa povećanom otpornošću na rak i smanjenim rastom ćelija raka. Pored toga, smanjenje aktivnosti Tph-1 stimuliše imuni sistem obezbeđujući dovoljne nivoe esencijalne aminokiseline triptofana za mastocite da pokreću antitumorski imunitet. Shodno tome, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska smanjuju nivoe ekspresije Tph-1. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska pokreću imunostimulaciju i leče i/ili sprečavaju bolesti koje su ovde otkrivene smanjenjem nivoa Tph-1.
Primer 30 - Megasphaera soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43385 povećava proizvodnju IFNg i IL-6 nakon ConA stimulacije splenocita iz BALB/c miševa
[0450] Živi bioterapeutski sojevi su testirani ex vivo na efikasnost proizvodnje imunoloških markera u splenocitima izolovanim iz BALB/c miševa i stimulisanim ConA.
[0451] Slika 67 prikazuje sposobnost kompozicija prema pronalasku da značajno povećaju proizvodnju proinflamatornih citokina i IL-6. Kao što je gore navedeno, oba ova citokina su uključena u stimulaciju imunološkog odgovora. Osim toga, ima značajno tumorcidno dejstvo.
[0452] Shodno tome, kao što je gore navedeno, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska povećavaju proizvodnju i/ili IL-6 i stoga podstiču stimulaciju imunološkog odgovora. Shodno tome, u određenim izvođenjima, terapeutska korist od kompozicija ovog pronalaska je povezana sa povećanjem i/ili proizvodnjom IL-6.
Primer 30 - Megasphaera referentni soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43385 značajno povećava ekspresiju IL-6 i CD11b
[0453] BALB/c miševima je davan živi bioterapeut i tkiva su izolovana za analizu ekspresije gena korišćenjem qPCR
[0454] Slika 68 pokazuje sposobnost NCIMB 43385 da značajno poveća ekspresiju IL-6 i CD11b u hipokampusu BALB/c miševa u poređenju sa kontrolnim nosačem.
[0455] Shodno tome, kao što je gore navedeno, kompozicije iz ovog pronalaska, u određenim izvođenjima povećavaju ekspresiju proinflamatornih citokina uključenih u stimulaciju imunološkog odgovora, posebno IL-6 i CD11b. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su terapeutski efikasne u svetlu povećanja ekspresije IL-6 i CD11b.
Primer 31 – NCIMB 42787 povećava ekspresiju TLR4
[0456] BALB/c miševima je davan živi bioterapeut i tkiva su izolovana za analizu ekspresije gena korišćenjem qPCR
[0457] Slika 69 pokazuje sposobnost NCIMB 42787 da značajno poveća ekspresiju TLR4 u amigdali BALB/c miševa u poređenju sa kontrolnim nosačem.
[0458] TLR4 je povezan sa aktiviranjem imunološkog odgovora. Shodno tome, povećanje ekspresije TLR4 će poboljšati imunostimulaciju. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska povećavaju ekspresiju TLR4. U određenim izvođenjima, povećanje ekspresije TLR4 povećava imuni odgovor. U određenim izvođenjima, kompozicije iz ovog pronalaska povećavaju imuni odgovor i imaju terapeutski efekat u lečenju bolesti koje su ovde otkrivene preko povećanja ekspresije TLR4.
Sekvence
[0459]
SEK ID BR: 1 (konsenzus 16S rRNA sekvenca za Megasphaera massiliensis soj MRx0029)
Prajmeri koji se koriste za qPCR
SEK ID BR: 8 (konsenzus 16S rRNA sekvenca za soj Megasphaera deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43385)
1
SEK ID BR: 9 (konsenzus 16S rRNA sekvenca za soj Megasphaera massilliensis deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43388)
1 1
SEK ID BR: 10 (konsenzus 16S rRNA sekvenca za soj Megasphaera massilliensis deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43389)
1 2
SEK ID BR: 11 (konsenzus 16S rRNA sekvenca za soj Megasphaera deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43386)
1 4
SEK ID BR: 12 (konsenzus 16S rRNA sekvenca za soj Megasphaera deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 43387)
1
Prajmeri koji se koriste za qPCR enolaze
REFERNCE
[0460]
[1] Spor et al. (2011) Nat Rev Microbiol. 9(4):279-90.
[2] Eckburg et al. (2005) Science. 10;308(5728):1635-8.
[3] Macpherson et al. (2001) Microbes Infect. 3(12):1021-35
[4] Macpherson et al. (2002) Cell Mol Life Sci. 59(12):2088-96.
[5] Mazmanian et al. (2005) Cell 15;122(1):107-18.
[6] Frank et al. (2007) PNAS 104(34):13780-5.
[7] Scanlan et al. (2006) J Clin Microbiol. 44(11):3980-8.
[8] Kang et al. (2010) Inflamm Bowel Dis. 16(12):2034-42.
[9] Machiels et al. (2013) Gut. 63(8):1275-83.
[10] WO 2013/050792
[11] WO 03/046580
[12] WO 2013/008039
[13] WO 2014/167338
[14] Goldin and Gorbach (2008) Clin Infect Dis. 46 Suppl 2:S96-100.
[15] Azad et al. (2013) BMJ. 347:f6471.
[16] Padmanabhan et al. (2013) Standards in Genomic Sciences 8:525-538 [17] Masco et al. (2003) Systematic and Applied Microbiology, 26:557-563.
[18] Srutková et al. (2011) J. Microbiol. Methods, 87(1):10-6.
[19] Kondelková et al. (2010) Acta Medica (Hradec Kralove).;53(2):73-7.
[20] Zhang et al. (2016) BMC Gastroenterol.; 16: 84.
[21] Ren and Torres (2009) Brain Res Rev.;60(1):57-64
[22] Martinon et al. (2002) Mol Cell.;10(2):417-26.
[23] Murphy et al. (2003) J Exp Med. 2003; 198(12): 1951-1957.
1
[24] Chan et al. (2006) J Exp Med.; 203(12): 2577-2587.
[25] The Immune Response Basic and Clinical Principles, 1st Edition (2006) [26] Hoover et al. (2002) J Biol Chem. 277(40):37647-54.
[27] Kaser et al. (2004) J Clin Immunol.;24(1):74-85.
[28] Gaur and Aggarwal (2003).Biochem Pharmacol.;66(8):1403-8.
[29] Wang and Lin (2008) Acta Pharmacol Sin.; 29(11): 1275-1288.
[30] Tanaka et al. (2014) Cold Spring Harb Perspect Biol.; 6(10): a016295.
[31] Bettelli et al. (2006) Nature 441:235-238
[32] Menezes and Luskin (1994) Journal of Neuroscience, 14 (9) 5399-5416;
[33] Bhat et al. (2006) Nucleic Acids Res.;34(13):3819-32.
[34] Andreeff et al. (2003), Holland-Frei Cancer Medicine. 6th edition.
[35] Soltani MH et al, (2005) Am J Pathol;166:1841-50
[36] Jandaghi et al. (2016) Gastroenterology;151(6):1218-1231.
[37] Pornour et al. (2015) Recent Pat Anticancer Drug Discov.;10(2):214-23.
[38] Sachlos et al. (2012) Cell.;149(6):1284-97
[39] Li et al. (2014), Oncotarget.;5(4):882-93.
[40] Visnyei et al. (2011) Mol Cancer Ther.;10(10):1818-28.
[41] Cheng et al. (2015) Cell Death Dis.;6:e1753
[42] Shin et al. (2012) Biol Pharm Bull. ;35(7):1069-75.
[43] Chen et al. (2011) PLoS One.;6(11):e27186
[44] Arvigo et al. (2010) J Endocrinol. ;207(3):309-17.
[45] Mao et al. (2015) J Obstet Gynaecol Res.;41(8):1240-5
[46] Park et al. (2014) Oncotarget.;5(13):4929-34.
[47] Spengler et al. (2011) Anticancer Res.;31(12):4201-5.
[48] Mu et al. (2014) Oncol Rep.;31(5):2107-14.
[49] Prabhu et al. (2017) Neuro-Oncology, 19(6) vi60
[50] Devarajan et al. (2002) Oncogene. 12;21(57):8843-51.
[51] Bell and Megeney (2017) Cell Death Differ.;24(8):1359-1368.
[52] Gerl and Vaux (2005) Carcinogenesis. 2005 Feb;26(2):263-70.
1
[53] Barnes et al. (2005) Eur Respir J. 25:552-563.
[54] Gray SG, Dangond F. (2006) Epigenetics. 1:67-75.
[55] Grabiec et al. (2008) Arthritis Res Ther. 10:226.
[56] Saito et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA. 96:4592-4597.
[57] Butler et al. (2000) Cancer Res. 60:5165-5170.
[58] Mwakwari et al. (2010) Curr Top Med Chem. 10 (14): 1423-40.
[59] Monneret C. (2007) Anti-Cancer Drugs. 18 (4): 363-70.
[60] Chun, (2015) Arch Pharm Res. 38(6):933-49.
[61] Abel and Zukin (2008) Curr Opin Pharmacol, 2008. 8(1): 57-64.
[62] PCT/EP2018/065858
[63] Toshkov et al. (2017) Radiat Res. 187(5):570-580
[64] Tanaka and Sakaguchi (2017) Cell Res.;27(1):109-118.
[65] Allen et al. (2010) J Exp Med.;207(5):1045-56.
[66] Haabeth et al. (2012) Oncolmmunology 1(1):1146-1152.
[67] Lejeune et al. (2006) Cancer Immun. 6:6
[68] Pace et al. (1983) PNAS. 80:8782-6.
[69] Sgadari et al. (1996) PNAS. 93:13791-6.
[70] Arenberg et al. (1996) J. Exp. Med. 184:981-92.
[71] Sgadari et al. (1997) Blood. 89:2635-43.
[72] Liu et al., (2018) Acta Pharmaceutica Sinica B; 8, 4; 552-562
[73] Jones et al. (2017). J Clin Oncol. 2017 Aug 10; 35(23): 2624-2630 [74] Ascierto et al. (2012) Journal of Translational Medicine. 10, 85 [75] https://www.uniprot.org/uniprot/P15056
[76] Soltani MH et al, (2005) Am J Pathol;166:1841-50
[77] Xie (2016); Med Res Rev; 36,2: 300-312
[78] Bloch et al. (2016) Eur Cytokine Netw.;27(3):63-67
[79] Mohanty et al. (2015) J Infect Dis, 211(7) 1174-1184.
[80] Fernandez-Ruiz et al.,(2015) Vaccine 2015 33(51)
[81] Morel et al., (2011) Vaccine, 29(13) 2461-2473.
1
[82] Leal et al.,(2001) Immunol 103(3) 375-381
[83] Knudsen et al. (2016), Sci Reps, 6 (19570).
[84] Su et al.,(2008) Vaccine 26(40), 5111-22
[85] Song, Mol Ther 2007
[86] Li et al, (2007) J Immunol, 178(8), 5271-5276
[87] Coffman et al.,(2012) Immunity 33(4) 492-503
[88] Ruan et al. (2014) Acta Virol. 58(4):356-8
[89] Wang et al. (2016) Oncotarget. 20; 7(51)
[90] Fraietta, Nat Med 2018
[91] Zhou, Blood 2010
[92] Glenn and Whartenby (2014) World J Stem Cells.; 6(5): 526-539.
[93] Heng et al. (2004) Cardiovasc Res. 2004 Apr 1;62(1):34-42.
[94] Fulop et al
[95] Bektas et al. (2017) J Leukoc Biol.;102(4):977-988.
[96] Fulop et al (2016) Rev Invest Clin.;68(2):84-91.
[97] Fulop et al. (2018) Front lmmunol.;8:1960.
[98] Miyamoto-Shinohara et al. (2008) J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24.
[99] Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, ed. by Day and McLellan, Humana Press.
[100] Leslie et al. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61, 3592-3597.
[101] Mitropoulou et al. (2013) JNutr Metab. (2013) 716861.
[102] Kailasapathy et al. (2002) Curr Issues Intest Microbiol. 3(2):39-48.
[103] Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller
[104] Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)
[105] Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition (2010) Ronald Atlas, CRC Press.
[106] Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry (1996) Jennie C. Hunter-Cevera, Academic Press
[107] Strobel (2009) Methods Mol Biol. 581:247-61.
1
[108] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[109] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press).
[110] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)
[111] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C.
Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)
[112] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory
Press).
[113] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997) [114] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[115] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)
[116] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30
[117] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489
[118] Johnsen et al (2017) Journal of Chromatography A. 1503: 57-64
[119] West and Johnstone (2014) J Clin Invest. 124, 30-39
[120] Glauben et al. (2006) J Immunol, 176: 5015-5022
[121] Angiolilli et a/. (2017) Ann Rheum Dis, 76: 277-285
[122] Gonneaud et al. (2014) J Inflamm, 11: 43
[123] Alenghat et al. (2013) Nature, 504: 153-157
[124] Felice et al. (2015) Ailment Pharmacol Ther, 41: 26-38
[125] Gagnon et al (2013) J Microbiological Methods. 94: 274-279
[126] Thangaraju et al. (2009). Cancer Res. 67, 9: 2826-2832
[127] Livak & Schmittgen (2001). Methods. 25,4:402-8
[128] Johnsen et al (2017) Journal of Chromatography A. 1503: 57-64
[129] Vizin and Kos (2015) Radiol Oncol. 49(3): 217-226
[130] Selvan et al. (2008) AACR Annual Meeting Apr 12-16, 2008
11
[131] Bonner et al. (2000) Clinical Cancer Research 6:597-601 [132] Zhi et al. (2016) Oncotarget. 7(40):64798-64809
[133] De Baere et al. (2013) J Pharm Biomed Anal, 80: 107-115 [134] Smart et al. (2010) Nat Protoc, 5(10), 1709-1729
[135] Johnsen et al. (2017) J Chromatogr A, 1503, 57-64
LISTA SEKVENCI
[0461]
11
11
11
11

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, za upotrebu u lečenju bolesti stimulacijom imunološkog sistema, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 97% identična sa SEK ID BR:1
2. Kompozicija koja sadrži soj bakterija iz roda Megasphaera, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu gena od 16s rRNA koja je najmanje 95% identična sa SEK ID BR:1; (a) za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka, (b) za upotrebu u lečenju, prevenciji ili odlaganju imunosenescencije, (c) za upotrebu kao adjuvant za vakcinu, ili (d) za upotrebu u terapiji himernim antigen receptorom T ćelija (CAR-T), terapiji mezenhimalnim matičnim ćelijama (MSC) ili terapiji transplantacijom matičnih ćelija; u ljudskom subjektu.
3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka, kao što je metastatski melanom, rak dojke, rak jajnika, rak grlića materice, neuroblastom, glioblastom, karcinom, rak pluća, hronična limfocitna leukemija, rak prostate, limfom, rak želuca, kolorektalni rak i/ili hematološki maligniteti.
4. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu kompozicija sadrži inhibitornu aktivnost histon deacetilaze, i/ili pri čemu kompozicija pojačano reguliše proinflamatorne citokine.
5. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, za upotrebu u lečenju, prevenciji ili odlaganju imunosenscencije.
6. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, za upotrebu kao adjuvant za vakcinu.
7. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu patentnom 1 ili 2, za upotrebu u CAR-T terapiji, MSC terapiji ili terapiji transplantacijom matičnih ćelija.
8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu bakterijski soj sadrži sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična bilo kojoj sekvenci od SEK ID BR: 8, 9, 10, 11 ili 12 ili pri čemu bakterijski soj sadrži sekvencu gena 16s rRNA predstavljenu bilo kojom sekvencom od SEK ID BR: 8, 9, 10, 11 ili 12.
9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je bakterijski soj Megasphaera massiliensis.
10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu bakterijski soj sadrži sekvencu gena 16s rRNA koja je najmanje 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identična SEK ID BR:1 ili pri čemu bakterijski soj sadrži sekvencu gena 16s rRNA predstavljenu sekvencom SEK ID BR:1; opciono pri čemu je bakterijski soj je soj koji je deponovan pod pristupnim brojem 42787 u NCIMB.
11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je kompozicija za oralnu primenu, i/ili pri čemu kompozicija sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača, i/ili pri čemu je bakterijski soj liofilizovan; ili prehrambeni proizvod koji sadrži pomenutu kompoziciju, za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
12. Kompozicija koja sadrži ćeliju bakterijskog soja definisanog u bilo kom od patentnih zahteva 1, 2 ili 8-10, pri čemu ćelija eksprimira jedan ili više heterolognih antigena; za upotrebu kao vakcina; opciono pri čemu ćelija predstavlja jedan ili više heterolognih antigena.
13. Ćelija bakterijskog soja definisanog u bilo kom od patentnih zahteva 1, 2 ili od 8 do 10, pri čemu ćelija eksprimira jedan ili više heterolognih antigena; za upotrebu kao vakcina; opciono pri čemu ćelija predstavlja jedan ili više heterolognih antigena.
14. Bakterijski soj za upotrebu u terapiji, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu 16S rRNA koja je najmanje 99,5% ili 99,9% identična bilo kojoj od SEK ID BR: 8, 11 ili 12.
15. Bakterijski soj koji ima sekvencu 16S rRNA predstavljenu bilo kojim od SEK ID BR: 8, 10, 11 ili 12 za upotrebu u terapiji.
16. Bakterijski soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB. 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB. 43388, ili NCIMB 43389, za upotrebu u terapiji.
11
RS20220465A 2018-05-11 2019-05-13 Kompozicije koje sadrže bakterijski soj RS63273B1 (sr)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18171893 2018-05-11
EP18178136 2018-06-15
GBGB1810386.1A GB201810386D0 (en) 2018-06-25 2018-06-25 Compositions comprising bacterial strains
GBGB1813460.1A GB201813460D0 (en) 2018-08-17 2018-08-17 Compositions comprising bacterial strains
GBGB1817642.0A GB201817642D0 (en) 2018-10-29 2018-10-29 Compositions comprising bacterial strains
GBGB1820264.8A GB201820264D0 (en) 2018-12-12 2018-12-12 Compositions comprising bacterial strains
GBGB1820256.4A GB201820256D0 (en) 2018-12-12 2018-12-12 Compositions comprising bacterial strains
PCT/EP2019/062238 WO2019215346A1 (en) 2018-05-11 2019-05-13 Compositions comprising bacterial strains
EP19725068.1A EP3743086B1 (en) 2018-05-11 2019-05-13 Compositions comprising bacterial strains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63273B1 true RS63273B1 (sr) 2022-06-30

Family

ID=66597549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220465A RS63273B1 (sr) 2018-05-11 2019-05-13 Kompozicije koje sadrže bakterijski soj

Country Status (23)

Country Link
US (3) US11419902B2 (sr)
EP (4) EP4056192A1 (sr)
JP (3) JP7058449B2 (sr)
KR (2) KR20210008393A (sr)
CN (2) CN112512539A (sr)
AU (3) AU2019267171A1 (sr)
BR (1) BR112020022833A2 (sr)
CA (2) CA3099209A1 (sr)
CY (1) CY1125211T1 (sr)
DK (1) DK3743086T3 (sr)
ES (1) ES2916601T3 (sr)
HR (1) HRP20220578T1 (sr)
IL (1) IL278471B2 (sr)
LT (1) LT3743086T (sr)
MD (1) MD3743086T2 (sr)
MX (1) MX2020012061A (sr)
PL (1) PL3743086T3 (sr)
RS (1) RS63273B1 (sr)
SG (2) SG11202011031UA (sr)
SI (1) SI3743086T1 (sr)
SM (1) SMT202200217T1 (sr)
TW (2) TW202011975A (sr)
WO (2) WO2019215346A1 (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018215216B2 (en) 2017-01-31 2024-04-18 Axiota U.S., Inc. Microbial cells, methods of producing the same, and uses thereof
HUE052258T2 (hu) 2017-06-14 2021-04-28 4D Pharma Res Ltd Megasphaera nemzetségbe tartozó baktériumtörzset tartalmazó készítmény, és alkalmazása
UY37944A (es) 2017-10-20 2019-05-31 Ms Biotech Inc Métodos para producir materiales vegetales ensilados usando megasphaera elsdenii
AU2019267171A1 (en) 2018-05-11 2021-01-07 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
SG11202106230XA (en) * 2018-12-12 2021-07-29 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
JP2022511975A (ja) * 2018-12-12 2022-02-01 フォーディー ファーマ リサーチ リミテッド 細菌株を含む組成物
WO2021252861A1 (en) * 2020-06-11 2021-12-16 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating diseases and disorders using megasphaera sp
CN112877275B (zh) * 2021-02-04 2023-03-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 Hdac2基因敲除的bhk-21细胞系及其构建方法和应用
CN112980878B (zh) * 2021-02-04 2023-03-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 Hdac8基因敲除的bhk-21细胞系及其构建方法和应用
WO2023208223A1 (zh) 2022-04-28 2023-11-02 慕恩（广州）生物科技有限公司 药物组合物、巨球型菌及其应用
EP4516892A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Moon (Guangzhou) Biotech Co., Ltd. Pharmaceutical composition, megasphaera, and use thereof
KR102551061B1 (ko) * 2022-05-26 2023-07-03 중앙대학교 산학협력단 Saha를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 속 균주에 의한 바이오필름 생성 저해용 조성물
CN117018036B (zh) * 2023-07-28 2025-09-05 深圳未知君生物科技有限公司 巨球形菌属细菌在制备治疗癌症的药物中的应用

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5557520A (en) * 1978-10-26 1980-04-28 Nisshin Flour Milling Co Ltd Preparation of carcinostatic substance
WO2002080947A1 (fr) * 2001-04-06 2002-10-17 Kyodoken Institute For Animal Science Research & Development Compositions contenant une bacterie pouvant convertir de l'acide lactique en acide butyrique, et methode utilisant ces compositions pour prevenir ou traiter l'hyperlactacidemie dans le systeme digestif ou le cancer du colon
GB0127916D0 (en) 2001-11-21 2002-01-16 Rowett Res Inst Method
US20040005304A1 (en) 2002-07-08 2004-01-08 Mak Wood, Inc. Novel compositions and methods for treating neurological disorders and associated gastrointestinal conditions
GB0307026D0 (en) * 2003-03-27 2003-04-30 Rowett Res Inst Bacterial supplement
JP2007504131A (ja) 2003-08-29 2007-03-01 エートン ファーマ インコーポレーティッド 癌の組み合わせ処置法
GB201112091D0 (en) 2011-07-14 2011-08-31 Gt Biolog Ltd Bacterial strains isolated from pigs
GB201117313D0 (en) 2011-10-07 2011-11-16 Gt Biolog Ltd Bacterium for use in medicine
NZ709392A (en) 2012-11-23 2016-10-28 Seres Therapeutics Inc Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
WO2014121304A1 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Seres Health, Inc. Compositions and methods
GB201306536D0 (en) 2013-04-10 2013-05-22 Gt Biolog Ltd Polypeptide and immune modulation
EP3021853A1 (en) * 2013-07-18 2016-05-25 Baylor College Of Medicine Method of enhancing potency of immune cells
CN104415060A (zh) * 2013-08-30 2015-03-18 深圳华大基因科技有限公司 可食用组合物及其制备方法和用途
WO2015038731A1 (en) 2013-09-12 2015-03-19 The Johns Hopkins University Biofilm formation to define risk for colon cancer
DK3074027T3 (da) 2013-11-25 2025-03-17 Nestle Sa Synergistiske bakteriesammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse heraf
US9650654B2 (en) * 2014-06-25 2017-05-16 William Marsh Rice University Making C4+ products in bacteria
US10366793B2 (en) 2014-10-21 2019-07-30 uBiome, Inc. Method and system for characterizing microorganism-related conditions
US10688166B2 (en) * 2014-11-03 2020-06-23 Cerus Corporation Compositions and methods for improved car-T cell therapies
MA41020A (fr) * 2014-11-25 2017-10-03 Evelo Biosciences Inc Compositions probiotiques et prébiotiques, et leurs procédés d'utilisation pour la modulation du microbiome
RU2017127597A (ru) * 2015-01-23 2019-02-25 Темпл Юнивёрсити-Оф Дзе Коммонвелс Систем Оф Хайе Эдьюкейшен Применение короткоцепочечных жирных кислот для профилактики рака
US20180078587A1 (en) 2015-03-18 2018-03-22 Trustees Of Tufts College Compositions and methods for preventing colorectal cancer
MA41060B1 (fr) 2015-06-15 2019-11-29 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
CA3005781C (en) * 2015-11-20 2019-01-22 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
MX2018006283A (es) * 2015-11-24 2019-09-06 Seres Therapeutics Inc Composiciones bacterianas diseñadas.
MX2018008523A (es) * 2016-01-11 2019-05-15 3Plw Ltd Bacterias que utilizan el acido lactico geneticamente modificadas para secretar enzimas degradantes de los polisacaridos.
CN107028985A (zh) * 2016-02-04 2017-08-11 深圳华大基因研究院 厚壁菌类益生菌在预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病中的应用
US20190125808A1 (en) * 2016-03-30 2019-05-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of preventing, treating and detecting colorectal cancer using butyrate producing bacteria
US9999641B2 (en) * 2016-06-14 2018-06-19 Vedanta Biosciences, Inc. Treatment of clostridium difficile infection
BR112019006041A2 (pt) * 2016-09-27 2019-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System métodos para aprimorar a terapia de bloqueio do ponto de verificação imunológico por modulação do microbioma
US11571446B2 (en) 2016-11-18 2023-02-07 Sanford Bumham Prebys Medical Discovery Institute Gut microbiota and treatment of cancer
WO2018112365A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating colorectal cancer and melanoma using parabacteroides goldsteinii
WO2018112363A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating cancer using parabacteroides
EP3600363B1 (en) * 2017-06-14 2020-12-02 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
HUE052258T2 (hu) * 2017-06-14 2021-04-28 4D Pharma Res Ltd Megasphaera nemzetségbe tartozó baktériumtörzset tartalmazó készítmény, és alkalmazása
AU2019267171A1 (en) * 2018-05-11 2021-01-07 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
SG11202106230XA (en) 2018-12-12 2021-07-29 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
JP2022511975A (ja) * 2018-12-12 2022-02-01 フォーディー ファーマ リサーチ リミテッド 細菌株を含む組成物

Also Published As

Publication number Publication date
TW202011975A (zh) 2020-04-01
SMT202200217T1 (it) 2022-07-21
IL278471B1 (en) 2023-04-01
IL278471A (sr) 2020-12-31
AU2023200562A1 (en) 2023-03-02
US20210052671A1 (en) 2021-02-25
EP3790564A1 (en) 2021-03-17
CN112512539A (zh) 2021-03-16
US20210275605A1 (en) 2021-09-09
JP2021517560A (ja) 2021-07-26
US11419902B2 (en) 2022-08-23
DK3743086T3 (da) 2022-05-02
BR112020022833A2 (pt) 2021-02-02
AU2019267170A1 (en) 2021-01-07
SG11202011031UA (en) 2020-12-30
WO2019215345A1 (en) 2019-11-14
ES2916601T3 (es) 2022-07-04
HRP20220578T1 (hr) 2022-09-16
KR20210008391A (ko) 2021-01-21
CN112601534A (zh) 2021-04-02
SG11202011028SA (en) 2020-12-30
AU2019267171A1 (en) 2021-01-07
EP4056192A1 (en) 2022-09-14
EP3743086B1 (en) 2022-03-16
MX2020012061A (es) 2022-10-13
LT3743086T (lt) 2022-06-10
MD3743086T2 (ro) 2022-12-31
JP2021523895A (ja) 2021-09-09
CY1125211T1 (el) 2024-02-16
WO2019215346A1 (en) 2019-11-14
EP4066845A1 (en) 2022-10-05
KR20210008393A (ko) 2021-01-21
TW202014513A (zh) 2020-04-16
US20230158083A1 (en) 2023-05-25
EP3743086A1 (en) 2020-12-02
CA3099209A1 (en) 2019-11-14
IL278471B2 (en) 2023-08-01
JP7058449B2 (ja) 2022-04-22
PL3743086T3 (pl) 2022-06-20
CA3098971A1 (en) 2019-11-14
JP2022088631A (ja) 2022-06-14
SI3743086T1 (sl) 2022-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230158083A1 (en) Compositions comprising bacterial strains
CA2988686C (en) Compositions comprising bacterial strains
EP3626248A1 (en) Compositions comprising bacterial strains
EP3636272A1 (en) Compositions comprising bacterial strains
CA3122347A1 (en) Compositions comprising parabacteroides bacterial strains for treating cancer
HK40042717B (en) Compositions comprising bacterial strains
HK40042717A (en) Compositions comprising bacterial strains
OA20345A (en) Compositions comprising bacterial strains.
OA20635A (en) Compositions comprising parabacteroides bacterial strains for treating cancer.
HK40025556A (en) Compositions comprising bacterial strains
HK1260125A1 (en) Compositions comprising bacterial strains
HK40023525A (en) Compositions comprising bacterial strains
HK40014436A (en) Compositions comprising bacterial strains
HK40014436B (en) Compositions comprising bacterial strains