KR101057357B1 - 유산균 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유산균 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 관절염의 예방 또는 치료에 매우 우수한 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 성분들은 이미 안전성이 인정된 것이기 때문에 본 발명의 조성물의 인체에 대한 안전성도 매우 우수하다.

유산균, 콜라겐, 관절염, 면역관용

Description

유산균 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물{Pharmaceutical and Food Compositions for Preventing or Treating Arthritis Comprising Lactic Acid Bacteria and Collagen as Active Ingredients}

본 발명은 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

관절염은 세계 인구의 5%가 앓고 있는 만성 질환으로서 관절낭 내층의 활액막에 염증성 변화가 일어나 전신의 관절에서 부종과 통증이 유발되는 질환이다. 관절염은 진행성이고 관절의 변형 및 관절 굽힘이 어려운 장애를 일으켜 치료되지 않을 경우 계속 악화되어 심각한 결과를 초래하게 된다.

관절염이 유발되는 직접적 원인은 아직까지 명확하지 않으며 치료를 위해서는 전통적으로 코르티손 및 다른 부신피질 호르몬과 같은 스테로이드계, 아스피린, 피록시캄 및 인도메타신과 같은 비스테로이드계 항염증제, 클로로퀴논제제 및 D-페니실아민과 같은 항류마티스제, 콜치신과 같은 통풍억제제, 그리고 시클로포스프아 미드, 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 레바미솔과 같은 면역 억제제를 포함한 다양한 치료제가 사용되어 왔다. 그러나 상기 치료제는 근본적인 치료제가 아니며 스테로이드 호르몬제의 경우에는 부작용으로 인해 사용이 제한되고 있다. 또한, 관절염의 통증을 완화시키거나 염증을 제거하는 약제로서 널리 사용되고 있는 아스피린제 및 브타졸린제 등은 사람의 위에 치명적인 영향을 주므로 관절염을 치료하는데 필요한 양을 계속적으로 복용하는 것은 불가능하다.

기존의 이러한 화학요법적 약제는 약제의 장기간 사용을 방해하는 부작용, 항염증 효과의 결핍 및 이미 발생한 관절염에 대한 효능의 부족과 같은 결점을 가지고 있었다. 현재는 진통작용이 우수한 인도메타신 및 푸르페낭산과 비스테로이드성의 각종 소염제 정도가 사용되고 있는 실정이다.

따라서, 상기 문제를 해결함과 동시에 염증성 증상과 통증에 대해 효과를 보여주는 관절염 치료제의 개발이 요망되고 있으며, 관절염 치료약제는 장기간 복용이 필요하므로 부작용이 적은 약제를 개발하는 것이 매우 중요하다. 또한, 기존 약제 중 일부는 정맥 주사나 복강 주사로 투여하는 경우가 있는데, 이 경우에는 번거로울 뿐 아니라, 앨러지, 쇼크 및 위생상의 문제도 생길 수 있으므로, 복용이 간편하면서 안전한 치료제가 필요한 실정이다.

현재까지 관절염 치료를 위한 대부분의 건강식품이 연골 구성성분을 주원료로 하고 있다. 대한민국 특허출원 제10-1997-0035934에는 II형 콜라겐의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 관절염 치료제에 관한 내용이 기재되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2003-00433119호에는 글루코사민 40-50%, 뮤코 다당 단백 질 30%, 비타민 C, 우슬, 모과, 두충 및 상어연골 추출분말을 포함하는 퇴행성관절염 치료용 건강보조식품 조성물에 관한 내용이 기재되어 있다.

유산균을 이용한 치료제의 예로는, 미국특허출원공개 제20050074441호에 비피도박테리아의 섭취에 의한 민감 대장증상이나 염증반응을 완화하는 내용이 기재되어 있다. 또한, Ehud Baharav의 논문에는 생균 상태의 락토바실러스 GG와 열로 사멸화된 사균 상태의 락토바실러스 GG를 구강으로 투여하면 사균과 생균 모두 관절염으로 진행되는 것을 어느 정도 억제하는 효과가 있다는 내용이 기재되어 있다(Ehud Baharav et al., Nutritional Immunology, 134:1964-1969(2004)). 또한, B Sheil의 논문에는 락토바실러스 살리바루스 118(Lactobacillus salivarus 118)을 피과민성 대장질환 및 관절염 모델 마우스에 피하와 구강을 통해 주입하여 관절염 증상이 완화되었다는 결과가 개시되어 있는데, 이러한 유산균의 면역 조절작용은 관절염과 대장질환에 공통적으로 효능이 있는 것으로 비추어, 항원 특이적이지 않고 T-림프구에 TGF-β의 생산을 조율하여 면역과민 반응 및 자가 면역 반응을 조율하는 것으로 여겨진다(B Sheil et al., Gut, 53:694-700(2004)).

관절염 치료에 면역관용을 도입한 예로는, 양형인의 논문에 면역관용을 유도하기위해 T 세포 항원 결정기를 포함하는 II형 콜라겐 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 관절염의 치료제를 콜라겐 유도성 관절염의 마우스에 경구 투여하여 콜라겐 유도성 관절염을 예방 및 치료하였다는 내용이 기재되어 있다(양형인 등, 대한류마티스학회지, 12;7(04)(2000)).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 관절염 예방 치료 효능이 우수하면서도 부작용이 크게 감소된 관절염 예방 및 치료용 조성물을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 관절염의 발병에서 자가 항원으로 작용하는 콜라겐을 유산균과 함께 투여하는 경우에는 면역관용(tolerance) 반응이 크게 증대되어, 관절염 특이적 염증반응이 크게 감소됨으로써, 결국 관절염 예방 및 치료 효능을 달성할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 관절염 개선, 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 유산균 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 관절염 개선, 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 관절염 예방 치료 효능이 우수하면서도 부작용이 크게 감소된 관절염 예방 및 치료용 조성물을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 관절염의 발병에서 자가 항원으로 작용하는 콜라겐을 유산균과 함께 투여하는 경우에는 면역관용(tolerance) 반응이 크게 증대되어, 관절염 특이적 염증반응이 크게 감소됨으로써, 결국 관절염 예방 및 치료 효능을 달성할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물에서, 기본적인 유효성분은 유산균 및 콜라겐이다.

본 발명의 유효성분 중 하나인 유산균은 과민성 대장증상의 완화 및 장 기능 증진과 같은 정장 효능이 있는 것으로 알려져 있는 미생물이다. 한편, 본 발명자들은 콜라겐에 의해 유도되는 면역관용 반응을 유산균이 상승적(synergic)으로 증가시키는 작용을 한다는 것을 발견하였다. 본 발명의 조성물은 이러한 신규한 발견에 기초하여 조성된 것이다. 또한, 본 발명의 조성물에서 유산균은 IL-10과 TGF-β와 같은 항염증 사이토카인의 생성을 촉진하는 작용을 한다.

본 명세서에서 용어 “유산균(lactic acid bacteria)”은 탄수화물 대사의 주산물로서 유산을 생산하는 박테리아 군을 의미하며, 예컨대, 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 프로리오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 페디오코커스(Pediococcus)를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 이용될 수 있는 유산균은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 엔테로코커스 파에시엄(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리엄 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리엄 브라베(Bifidobacterium brave) 및 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유산균이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 이용될 수 있는 유산균은 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)이다.

본 발명의 조성물에서 유산균의 바람직한 양은, 조성물의 단위중량(g) 당 10⁵ cfu-10¹¹ cfu이다.

본 발명의 또 다른 유효성분 중 하나인, 콜라겐은 면역관용 반응을 유도하는 자가 항원으로 작용한다. 관절염은 면역반응에 관계되는 자가 항원의 종류가 매우 다양하여 특이적인 치료제 개발이 불가능하였다. 본 발명의 핵심 원리는 생체내 장관계 면역 시스템(Gut Associated Lymphoid Tissue: GALT)에서 일어나는 면역 관용을 이용하는 것이다. 면역관용이란, 경구를 통해 전달된 물질에 대해 소장의 상피세포 아래에 존재하는 면역시스템(GALT)이 선택적인 면역 억제 반응을 일으키는 것이다. 본 발명의 유효성분인 콜라겐은 상기 GALT에 의한 면역관용 반응을 통해 관절염 특이적인 염증반응을 선택적으로 억제하는 작용을 한다.

본 발명에서 이용되는 콜라겐은 타입 I 또는 타입 II 콜라겐이며, 바람직하게는 타입 II 콜라겐이다. 본 발명의 조성물에서 콜라겐의 바람직한 함유량은 0.1-2.0 중량%이고, 보다 바람직하게는 0.2-1.5 중량%이고, 가장 바람직하게는 0.2-1.1 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 글루코사민, 콘드로이틴 또는 이의 조합을 추가적으로 포함한다. 상기 콜라겐, 글루코사민 및 콘드로이틴은 모두 연골 구성성분이다. 따라서, 콜라겐 이외에 자가 항원으로 작용할 수 있는 다른 연골 구성성분(글루코사민 및 콘드로이틴)을 이용하면 보다 향상된 면역관용 반응을 유도할 수 있다. 또한, 글루코사민은 연골형성과 재생을 촉진하는 작용을 한다. 콘드로이틴은 면역관용 반응을 유도하는 것뿐만 아니라 연골을 파괴하는 효소들을 억제하여 연골 보호 작용을 한다.

본 발명의 조성물에서, 글루코사민은 바람직하게는 D-(+)-글루코사민 하이드로클로라이드 형태로 존재하는 것이다. 본 발명의 조성물에서 콘드로이틴은 바람직하게는 콘드로이틴 6-설페이트 형태의 염 형태이다. 본 발명의 조성물에서 글루코사민의 바람직한 함유량은 1.0-4.0 중량%이고, 보다 바람직하게는 1.3-3.0 중량%이며, 가장 바람직하게는 2.0-3.0 중량%이다. 본 발명의 조성물에서 콘드로이틴의 바람직한 함유량은 0.5-4.0 중량%이고, 보다 바람직하게는 0.7-3.0 중량%이며, 가장 바람직하게는 1.4-2.3 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 맥아추출물, 비타민 D 또는 이의 조합을 추가적으로 포함한다.

본 발명에 이용되는 맥아추출물은 바람직하게는, 발효된 맥아추출물이며, 보다 바람직하게는 약 2 wt%의 클로라이드 및 60-70 wt%의 환원당(예컨대, 말토스, 수크로스 및 덱스트로스)를 포함하는 맥아추출물이다. 본 발명의 조성물에서 맥아추출물은 염증 반응을 감소시키는 작용을 한다. 본 발명의 조성물에서 맥아추출물의 함유량은 바람직하게는, 10-70 중량%, 보다 바람직하게는 20-60 중량%, 가장 바람직하게는 35-55 중량%이다.

본 발명에 이용되는 비타민 D는 뼈의 대사와 인산칼슘의 생체내 항상성 유지에 중요한 역할을 지용성 비타민이다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 비타민 D는 비타민 D₃이다. 본 발명의 조성물에서 비타민 D는 항염증 사이토카인인 IL-10의 생성 촉진 및 조절 T-세포(Tr1: Regulatory T cell) 생성을 촉진하는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 개다래, 백년초, 두충, 홍화씨, 율무 및 모과로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 한약성분을 추가적으로 포함한다. 상기 한약성분은 한의학에서 진통과 소염에 효과가 알려져 있는 것이다. 본 발명의 조성물에서 한약성분의 함유량은 바람직하게는, 5-50 중량%, 보다 바람직하게는 10-35 중량%, 가장 바람직하게는 20-35 중량%이다.

본 발명의 관절염 예방 또는 치료 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 성분들 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 면역관용 반응 유도하여 효능을 발휘하여야 하기 때문에 경구로 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.01-2000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 관절염 예방 또는 치료 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 관절염의 치료 또는 예방에 매우 유용하다.

하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 면역관용 반응을 유도함으로써 친염증 사이토카인(proinflammatory cytokines), 예컨대, TNF-α, IL-1β 및 IL-12의 발현량을 감소시키고, 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokines), 예컨대, IL-10, Foxp3 및 TGF-β의 발현량을 증가시켜, Th2 타입 면역반응을 증가시키며 이는 Th1 타입 면역반응을 감소시키게 된다. 결국, 관절 특이적으로 발생하는 자가 면역반응 및 염증반응이 격감됨으로써 관절염 예방 또는 치료 효능을 발휘한다.

본 발명의 조성물은 관절염(골관절염 및 류마티스성 관절염), 바람직하게는 자가면역 질환의 일종으로서 염증성 질환인 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료에 매우 우수한 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 성분들은 이미 안전성이 인정된 것이기 때문에 본 발명의 조성물의 인체에 대한 안전성도 매우 우수하다. 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분들은 식품 원료로서 인정된 안전성이 우수한 것으로서, 이러한 성분들에 의해 종래의 의약(예컨대, 메토트렉세이트)보다 우수한 관절염 예방 또는 치료 효능을 발휘하는 것은 놀라운 것이다.

종래 관절염 치료의 한계성은 면역 반응에 관여하는 자가 항원의 종류가 매우 다양하여 관절염 특이적인 치료제 개발이 어렵고, 개발되어 있는 종래의 관절염 치료제는 단순히 염증 반응만을 억제하는 의약들이며 이들은 장기간 복용 시 안전성 문제와 같은 여러 부작용이 존재하는 문제점이 있었다. 또한, 대부분의 관절염 치료용 건강식품들은 연골구성 성분 중의 하나인 글루코사민 복합체 및 상어 연골 추출물 등을 주원료로 하는 단편적인 기능을 갖고 있었다. 이에 반해, 본 발명의 조성물은 장관계 면역 시스템에서 일어나는 면역관용을 유도함으로써 부작용없 이 관절에 특이적으로 일어나는 자가 면역반응 및 염증을 효과적으로 제어하여 관절염을 예방 및 치료할 수 있다.

종래 관절염 치료의 한계성은 면역 반응에 관여하는 자가 항원의 종류가 매우 다양하여 관절염 특이적인 치료제 개발이 어렵고, 개발되어 있는 종래의 관절염 치료제는 단순히 염증 반응만을 억제하는 의약들이며 이들은 장기간 복용 시 안전성 문제와 같은 여러 부작용이 존재하는 문제점이 있었다. 또한, 대부분의 관절염 치료용 건강식품들은 연골구성 성분중의 하나인 글루코사민 복합체 및 상어 연골 추출물 등을 주원료로 하는 단편적인 기능을 갖고 있었다. 이에 반해, 본 발명의 조성물은 장관계 면역 시스템에서 일어나는 면역관용을 유도함으로써 부작용 없이 관절에 특이적으로 일어나는 자가 면역반응 및 염증을 효과적으로 제어하여 관절염을 예방 및 치료할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 본 발명 조성물의 제조

6가지 한약재(경동시장, 한국), 개다래 200 g, 두충 120 g, 모과 120 g, 율무 120 g, 홍화씨 120 g 및 백년초 잎 120 g을 75℃의 건조기에서 2일 동안 건조한 후 분쇄하여 분말상태로 혼합하였다. 여기에 글루코사민(Sigma) 60 g, 콘드로이틴(Sigma) 50 g, 타입 I 콜라겐(Sigma) 25 g, 맥아추출물(Bacto) 1200 g, 비타민 D(Sigma) 36 mg 및 건조된 상태의 유산균(Lactobacillus casei, Cell Biotech) 60 g을 첨가하여 교반기에서 혼합하여, 본 발명의 면역조절 조성물을 제조하였다.

동물실험을 위한 Lewis 래트의 1일 섭취량을 25 g(본 발명 조성물 1.8 g 및 분말 상태의 사료 23 g)으로 정하고 본 발명 조성물 총량 2160 g과 분말 상태의 사료 총량 27600 g을 혼합하여 래트의 사료를 준비하였다.

구체적인 조성은 하기와 같다.

성분	함량	중량%
유산균	약 7.5 x 109 cfu (50 mg)	2.7
글루코사민	50 mg	2.7
콘드로이틴	40 mg	2.2
콜라겐	20 mg	1.1
비타민 D	30 ㎍	미량
맥아추출물	1 g	54.6
개다래	170 mg	9.29
모과	100 mg	5.5
율무	100 mg	5.5
홍화씨	100 mg	5.5
백년초 잎	100 mg	5.5
두충	100 mg	5.5

비교예 1 내지 4: 단일성분만을 포함한 비교예 제조

하기의 표 2와 같은 조성의 비교예들을 제조하였다.

성분	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4
유산균	+	-	-	-
글루코사민	-	+	-	-
콘드로이틴	-	+	-	-
콜라겐	-	+	-	-
맥아추출물	-	-	+	-
개다래	-	-	-	+
모과	-	-	-	+
율무	-	-	-	+
홍화씨	-	-	-	+
백년초	-	-	-	+

실험예 1: 본 발명 조성물의 관절염 예방 및 치료 효능 분석

콜라겐 유도 관절염(collagen induced arthritis: CIA) 동물 모델은 관절 구성성분인 II형 콜라겐에 의해서 유도되는 관절염으로 사람의 류마티스 관절염과 병리학적, 임상적 및 면역학적으로 여러 측면에서 유사함을 보인다. 이 동물모델은 콜라겐 특이적인 면역 반응을 가지는 T 세포와 콜라겐과 같은 자가 항원에 대한 항체에 의해 자가면역 질환을 나타낸다.

아쥬번트 유도 관절염(adjuvant induced arthritis: AIA) 동물 모델은 자가 항원이 아닌 결핵균에 의해서 유도되는 관절염으로 만성 관절염의 병리학적 상태를 보인다. 정확한 자가 항원으로 작용하는 것은 알려져 있지 않지만, 면역반응 T 세포에 의해 관절의 염증이나 조직 파괴와 같은 자가면역질환을 나타낸다. 이 동물모델은 사람에게서 자연적으로 일어나는 관절염과 비슷하다.

류마티스 관절염의 직접적인 원인이 정확히 알려져 있지 않기 때문에 이 2가지의 동물 모델을 가지고 실험을 함으로써 효능을 더욱 효과적으로 평가할 수 있다.

실험예 1-1: 콜라겐 유도 관절염 동물 모델의 제조

콜라겐 유도 관절염(collagen induced arthritis, CIA) 동물 모델은 류마티스 관절염의 원인으로 여겨지는 콜라겐을 주입하여 하기와 같이 제조하였다.

닭의 II 형 콜라겐(Sigma) 4 mg을 100 mM 아세트산 1 ml에 혼합하여 4℃에서 하루 동안 용해시켰다. 이를 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 4 mg/ml이 들어있는 프로인트 완전 아쥬번트(Freund's complete adjuvant, DIFCO) 1 ml에 혼합하여 에멀젼화한 후, 6 내지 8주령의 Lewis 래트의 꼬리 부위에 150 ㎕(300 ㎍)을 피내 주사하여 면역시켰다. 1차 면역 후 7일째에 닭의 II형 콜라겐 4 mg을 100 mM 아세트산 1 ml에 혼합하여 4℃에서 하루 동안 용해한 후 이를 프로인트 불완전 아쥬번트(Freund's incomplete adjuvant, DIFCO) 1 ml에 혼합하여 에멀젼화시켰다. 상기 에멀젼의 150 ㎕(300 ㎍)를 꼬리 부위에 피내 주사하여 2차 면역(boosting) 반응을 유도하였고, 2차 면역 후 1-2주가 경과하자 관절염 증상인 홍반이나 부풀어 오름이 점차적으로 나타나기 시작하였다.

실험예 1-2: 아쥬번트 유도 관절염 동물 모델의 제조

아쥬번트 유도 관절염(adjuvant induced arthritis, AIA) 동물 모델 역시 사람의 류마티스 관절염과 유사한 병리적 특성을 보이는 동물 모델로서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델과 같이 널리 사용되고 있다.

결핵균 10 mg을 분쇄기로 분말상태로 분쇄한 후, 1 ml의 프로인트 불완전 아쥬번트(Freund's incomplete adjuvant, DIFCO)에 혼합하였다. 이중 100 ㎕(1 mg)를 6-8 주령의 Lewis 래트의 꼬리 부위에 피내 주사하여 면역시켰다. 면역 후 1주가 지나자 관절염 증상이 점차적으로 나타나기 시작하였다.

실험예 1-3: 본 발명 조성물의 관절염 예방 및 치료 효능 분석

면역 반응 유도 후, 그 다음 날부터 매일 식이용 거치대를 이용하여 시험물질을 경구 투여하였다. 그룹 당 10 마리의 Lewis 래트를 선택한 후, 한 그룹은 아쥬번트 유도 관절염 동물 모델을 이용하여 분말 상태의 사료와 본 발명 조성물의 혼합물을 하루 25 g씩(본 발명 조성물 11.5 g/kg) 투여하였고, 또 다른 그룹은 음성대조군으로는 분말 사료만을 투여한 아쥬번트 유도 관절염 동물 모델을 사용하였다. 이 후 관절 부위 종창(joint swelling), 관절의 붓기 정도(paw thickness), 홍반과 같은 육안적 소견을 통한 관절염의 진행 정도, 몸무게 변화 추이를 측정하여 각각의 그룹을 비교하였다.

관절염 예방 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1의 조성물을 경구투여한 후 2주 경과한 시점에서 AIA 유도 면역화 반응을 실시하였다. 실험은 총 9주를 실시하였다. 또한, 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, AIA 유도 1차 면역화 반응을 실시한 바로 직후 실시예 1의 조성물을 경구 투여하였다. 실험은 총 9주를 실시하였다. 그룹 당 10 마리의 래트를 이용하였다. 각각의 그룹에 속하는 래트의 각 발마다 관절과 마디의 붓기 정도, 홍반 등을 관찰하고, 표 3과 표 4에 기재된 점수체계(scoring index)에 따라 임상점수를 계산하였다.

CIA 모델의 점수체계

점수	병의 경과 상태
0	홍반과 부풀어 오름이 나타나지 않음
1	발 중간부분 또는 발목관절에 한해 홍반과 약간의 부풀어 오름이 나타남
2	발목관절로부터 발 중간부분에 걸쳐 홍반과 약간의 부풀어 오름이 나타남
3	발목관절에서 중족골관절에 걸쳐 홍반과 중간정도의 부풀어 오름이 나타남
4	발목, 발 및 발가락을 포함하여 홍반과 심한 부풀어 오름이 나타남

AIA 모델의 점수체계

점수	병의 경과 상태
0	홍반이나 부풀어 오름이 나타나지 않음
1	발가락이나 손가락 중 하나에 약간의 홍반이나 부풀어 오름이 나타남
2	발가락이나 손가락 중 하나 이상에 홍반이나 부풀어 오름이 나타남
3	발목 또는 손목에 홍반이나 부풀어 오름이 나타남
4	발가락 또는 손가락 및 발목 또는 손목에 완전한 홍반 및 부풀어 오름이 나타나고 발목 또는 손목을 구부릴 수 없음

관절염 예방 효과에 대한 실험 결과인 도 1의 임상점수를 보면, 대조군은 아쥬번트 유도 관절염 모델로서, 면역반응을 유도한 후 약 2주부터 관절염 증상이 나타나는 것을 알 수 있으며, 약 5주가 지나면 점차 증세가 약해지는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 조성물을 투여한 군에서는 대조군과 달리 그 증세가 많이 억제 되어있는 것을 알 수 있다. 도 1의 발두께 변화를 보면, 대조군은 약 2주부터 발이 많이 부풀어 오르는 것을 관찰할 수 있다. 본 발명의 조성물을 투여한 군에서는 발이 부풀어 오르는 것이 많이 억제 되어 있는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 관절염에 대한 우수한 예방 효능을 발휘하고 있음을 알 수 있다.

관절염 치료 효과에 대한 실험 결과인 도 2의 임상점수를 보면, 대조군은 아쥬번트 유도 관절염 모델로서, 면역반응을 유도한 후 약 2주부터 관절염 증상이 나타나는 것을 알 수 있으며, 약 5주가 지나면 점차 증세가 약해지는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 조성물을 투여한 군에서는 관절염 그 증세가 많이 억제 되어있는 것을 관찰할 수 있다. 도2의 발두께 변화를 보면, 대조군은 약 2주부터 발이 많이 부풀어 오르는 것을 관찰할 수 있다. 본 발명의 조성물을 투여한 군에서는 발이 부풀어 오르는 것이 많이 억제 되어 있는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 관절염에 대한 우수한 치료 효능을 발휘하고 있음을 알 수 있다.

실험예 2: 관절염 치료 효능 비교 실험

상기 실험예 1에서 효능이 우수한 것으로 판명된 실시예 1의 조성물을 이용하여, 보다 정밀하게 관절염 예방 또는 치료 효능을 분석하였다.

본 발명 조성물(특히, 실시예 1의 조성물)의 관절염 치료 효능을 표 2에 나와 있는 비교예와 같이 다른 조성물들과 비교 실험 하였다. 실험 방법은 상기 실험예 1-3과 유사하다. 각각의 군에 대하여 10 마리의 래트를 이용하였다.

대조군은 비투여군이고, MTX는 종래에 관절염 치료제로 이용되고 있는 메토트렉세이트 처리군이며 래트 1마리 당 약 60 ㎍씩 일주일에 두 번 투여하였다. 한약재는, 개다래, 두충, 백년초잎, 홍화씨, 율무 및 모과 추출물의 혼합물을 투여한 군이며, 관절구성성분은, 글루코사민, 콜라겐 및 콘드로이친의 혼합물을 투여한 군이다. 본 발명조성물은 본 발명의 실시예 1의 조성물을 투여한 군이다. 각 조성물을 2주간 먼저 경구투여한 후, 콜라겐을 이용한 1차 면역반응을 유도하였다. 일주일 후 2차 면역반응을 유도하였고 임상 점수 및 발두께를 측정하여 각각의 그룹을 비교하였다.

도 3 및 도 4에서 볼 수 있듯이, CIA 유도 면역반응 후 약 20일부터 관절염 증상이 나타났다. 한약재 복합성분을 투여한 군에서는 치료 효과가 거의 없었다. 관절구성성분을 투여한 군에서는 어느 정도 치료 효과가 나타났으나, 만족할 수준은 아니었으며, 특히 급성단계(acute phase)에서는 치료 효능이 낮았다. 유산균을 투여한 군에서도 어느 정도 치료 효과가 나타났으나, 만족할 수준은 아니었으며, 특히 급성단계에서는 치료 효능이 낮았다. 한편, 35일까지의 급성단계에서는 MTX의 효과가 본 발명의 조성물보다 뛰어났지만 그 이후의 만성단계(chronic phase)에서는 오히려 본 발명의 조성물의 치료 효능이 더 우수하였다 (도 3 및 도 4).

따라서, 본 발명의 조성물은 종래의 관절염 치료제인 MTX 보다 동등한 또는 우수한 관절염 치료 효능을 발휘한다는 것을 알 수 있다. 더불어, 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효능이 크게 개선된 것은, 관절염구성성분인 콜라겐에 의한 면역관용 반응이 유산균에 의해 상승적(synergic)으로 증가하였기 때문인 것으로 판단된다.

실험예 3: 관절염 치료 효능에 대한 조직학적 분석

상기 실험예 2과 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하였다. 관절염 유도 면역화 반응 후 35일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 부풀어 오른 발목 관절에 대한 조직학적 분석을 하였다. 관절 적출 후 PBS로 잘 세척한 다음, 4% 파라포름알데하이드에 24시간 정도 고정화시킨 후, 탈회용액(decalcification solution, Merck)에서 2-3일 동안 탈회시켰다. 그런 다음, 파라핀으로 임베딩하고, 0.6-1 ㎛ 크기로 절단한 다음, 탈파라핀을 거친 후, 헤마토자일린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 헤마토자일린은 염기성 염색제로서 (-)전하를 나타내는 DNA와 RNA가 들어있는 핵에 결합하고, 에오신은 산성 염색제로서 (+)전하를 나타내는 세포질단백질이나 콜라겐에 결합을 한다.

도 5에서 볼 수 있듯이, 대조군인 CIA 동물 모델에서 많은 수의 림프구가 조직내에 침투(infiltration)된 것을 확인할 수 있다. 림프구들은 헤마토자일린으로 염색되어 청색의 점으로 관찰되고, 주변의 관절 조직들은 에오신으로 염색되어 적색으로 관찰된다. 한편, 본 발명의 조성물을 투여한 군과 MTX 투여군에서는 림프구의 침투 현상을 거의 볼 수 없다.

따라서 본 발명의 조성물은 림프구에 의해 유도되는 면역염증반응을 매우 효율적으로 억제하고 있음을 알 수 있다.

실험예 4: 친염증 ( proinflammatory ) 사이토카인의 발현에 미치는 영향 분석(혼합 림프구 이용)

상기 실험예 2와 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하였다. 관절염 유도 면역화 반응 후 35일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 비장과 드레이닝(draining) 림프 노드를 분리한 후, 이들 조직을 그라인딩하여 혼합 림프구(mixed lymphocytes)를 얻었다. 그런 다음, 혼합 림프구를 24-웰 플레이트에 5 x 10⁶ 세포/웰로 분주한 후 타입 II 콜라겐 20 ㎍/웰을 첨가하여 6시간 동안 자극을 주었다. 그리고 나서, 세포를 수집하고, 여기에 Trizol을 처리하여 총 RNA를 수득하였다. 각 실험군의 RNA 1 ㎍으로부터 oligo dT 프라이머 및 역전사효소(Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어, 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 각 사이토카인에 대한 10 pmol의 프라이머 및 SYBR premix를 이용하여 정량적 실시간 PCR를 실시하여, 사이토카인 발현 수준을 분석 및 비교하였다(도 6). 정량적 실시간 PCR은 95℃ 10분간 인큐베이션한 후, 95℃ 30초, 62℃ 30초 및 72℃ 30초의 40 사이클을 거치면서 매 사이클마다 정량을 하였다. 각 사이토카인에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다: β-액틴, 5'-TAC TGC CCT GGC TCC TAG CA-3'(전방향 프라이머)와 5'-TGG ACA GTG AGG CCA GGA TAG(역방향 프라이머); TNF-α, 5'-CAC GTC GTA GCA AAC C-3'(전방향 프라이머)와 5'-GGT GAG GAG CAC ATA GT-3'(역방향 프라이머); IL-1β, 5'-GGG TTC CAT GGT GAA GTC AAC-3'(전방향 프라이머)와 5'-CAC CTC TCA AGC AGA GCA CAG-3'(역방향 프라이머).

도 6의 데이터는, 하우스 키핑 유전자인 β-액틴에 대한 값을 정량한 후 대조군인 비처리군의 값을 100으로 하였을 때 그에 대한 상대적인 값이다. 친염증반응(proinflammatory) 사이토카인인 TNF-α의 발현량이 본 발명의 조성물 투여군에서 가장 낮게 나왔다. 또 다른 친염증반응 사이토카인인 IL-1β에 대해서도, 본 발명의 조성물을 투여한 군에서 낮게 나왔으나, 관절염 치료제인 MTX 군 보다는 높게 나왔다.

따라서 본 발명의 조성물은 전체적인 면역시스템에서 친염증반응 사이토카인의 발현을 억제하여 염증반응을 억제함으로써, 결국 관절염 치료 효능을 발휘한다는 것을 알 수 있다.

실험예 5: 친염증 사이토카인의 발현에 미치는 영향 분석( CD4 ⁺ T 세포 이용)

우선 정상 래트에서 비장만 분리한 후 조직을 그라인딩하고, 25 ㎍/ml의 마이토마이신 C(Sigma)를 30분간 처리 후 APC(antigen presenting cell)로 사용할 비장세포를 얻었다. 이 비장세포를 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰로 분주한 후, 타입 II 콜라겐 20 ㎍/웰을 첨가하여 30분간 자극시켰다.

상기 실험예 2와 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하는 과정에서, 관절염 유도 면역화 반응 후 70일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 드레이닝(draining) 림프 노드만을 분리한 후, 이들 조직을 그라인딩하여 혼합 림프구(mixed lymphocytes)를 얻었다. CD4⁺ 자성비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 혼합 림프구로부터 CD4⁺ T 세포를 분리한 후 이를 상기 APC와 콜라겐이 분주되어있는 24-웰 플레이트에 5 x 10⁶ 세포/웰로 분주한 후 24시간 동안 자극시켰다. 그러고 나서, 세포를 수집하고, 여기에 Trizol을 처리하여 총 RNA를 수득하였다. 각 실험군의 RNA 1 ㎍으로부터 oligo dT 프라이머 및 역전사효소(Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어, 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 각 사이토카인에 대한 10 pmol의 프라이머 및 SYBR premix를 이용하여 정량적 실시간 PCR를 실시하여, 사이토카인 발현 수준을 분석 및 비교하였다(도 7). 정량적 실시간 PCR은 95 ℃ 10분간 인큐베이션한 후, 95℃ 30초, 62℃ 30초 및 72℃ 30초의 40 사이클을 거치면서 매 사이클마다 정량을 하였다. 각 사이토카인에 대한 프라이머의 서열은 다음과 같다: β-액틴, 5'-TAC TGC CCT GGC TCC TAG CA-3'(전방향 프라이머)와 5'-TGG ACA GTG AGG CCA GGA TAG(역방향 프라이머); IL-12, 5'-GGT CAC ACT GAA CCA AAG(전방향 프라이머)와 5'-GTG GGT CCG GTT TGA T(역방향 프라이머); TNF-α, 5'-CAC GTC GTA GCA AAC C-3'(전방향 프라이머)와 5'-GGT GAG GAG CAC ATA GT-3'(역방향 프라이머); IL-1β, 5'-GGG TTC CAT GGT GAA GTC AAC-3'(전방향 프라이머)와 5'-CAC CTC TCA AGC AGA GCA CAG-3'(역방향 프라이머); IL-10, 5'-ACC AGC TGG ACA ACA TAG TGC(전방향 프라이머)와 5'-ATC CAG AGG GTC TTC AGC TTC(역방향 프라이머).

도 7의 데이터는, 하우스 키핑 유전자인 β-액틴에 대한 값을 정량한 후 대조군인 비처리군의 값을 100으로 하였을 때 그에 대한 상대적인 값이다. 콜라겐으로 자극한 시료와 그렇지 않은 시료를 비교한 결과, 친염증반응 사이토카인인 IL-12, TNF-α 및 IL-1β의 발현량이 본 발명의 조성물 투여군에서 낮은 것을 확인할 수 있다. 특히 IL-1β의 경우 자극을 준 CD4⁺ T 세포에서 대조군보다 50% 이상 발현이 감소하였다. 또한, Th1 중재 염증반응을 억제시키는 기능을 가지고 있는 Th2 사이토카인인 IL-10의 발현량을 보면 본 발명의 조성물을 투여한 군이 대조군보다 높은 것을 알 수 있다.

면역반응에 중요한 역할을 하고 있는 CD4⁺ T 세포의 사이토카인 발현 분석을 통해, 본 발명의 조성물은 친염증 사이토카인의 발현은 억제하면서도 항염증 사이토카인의 발현은 증가시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 6: 친염증 및 항염증 사이토카인의 발현에 미치는 영향 분석(관절 주위 림프구 이용)

상기 실험예 2와 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하였다. 관절염 유도 면역화 반응 후 75일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 관절 주위에 있는 슬와부(popliteal) 림프노드와 서혜부(inguinal) 림프노드만 분리한 후, 이들 조직을 그라인딩하여 혼합 림프구(mixed lymphocytes)를 얻었다.

그런 다음, 혼합 림프구를 24-웰 플레이트에 5 x 10⁶ 세포/웰로 분주한 후 타입 II 콜라겐 40 ㎍/웰을 첨가하여 24시간 동안 자극을 주었다. 그러고 나서, 세포를 수집하고, 여기에 Trizol을 처리하여 총 RNA를 수득하였다. 각 실험군의 RNA 1 ㎍으로부터 oligo dT 프라이머와 역전사효소(Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어, 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 각 사이토카인에 대한 10 pmol의 프라이머 및 SYBR premix를 이용하여 정량적 실시간 PCR를 실시하여, 사이토카인 발현 수준을 분석 및 비교하였다(도 8). 정량적 실시간 PCR은 95℃ 10분간 인큐베이션한 후, 95℃ 30초, 62℃ 30초 및 72℃ 30초의 40 사이클을 거치면서 매 사이클마다 정량을 하였다.

도 8의 데이터는, 하우스 키핑 유전자인 β-액틴에 대한 값을 정량한 후 대조군인 비처리군의 값을 100으로 하였을 때 그에 대한 상대적인 값이다. 친염증 사이토카인인 IL-12, TNF-α 및 IL-1β의 발현량이 CD4⁺ T 세포 실험결과와 동일하게, 본 발명 조성물의 투여군에서 낮은 것을 확인할 수 있다. 특히, IL-12 및 IL-1β의 경우, 본 발명 조성물 투여군은 대조군보다 50% 이상 발현이 감소하는 것을 알 수 있다. 또한 항-염증 기능을 가지고 있는 Foxp3, IL-10 및 TGF-β의 발현량을 보면, 본 발명 조성물 투여군이 대조군보다 높은 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명 조성물에 의해 관절 주위의 림프구에서 경구 면역관용이 유도되었음을 알 수 있다. 특히 조절 T 세포 마커인 Foxp3의 발현량이 증가되었을 뿐만 아니라, 억제(suppression) 기능을 가지고 있는 사이토카인인 TGF-β의 발현량도 크게 증가하였다.

위의 결과들을 종합하면, 관절염에 직접적으로 연관되어 있는 관절 주위의 림프노드에서 본 발명의 조성물은 경구 면역관용을 유도하고, 이는 Foxp3, IL-10 및 TGF-β 같은 항염증 사이토카인의 발현량을 증가시키고, IL-12, TNF-α 및 IL-1β와 같은 친염증 사이토카인의 발현량을 억제한다는 것을 파악할 수 있다.

실험예 7: 세포 증식 분석( CD4 ⁺ T 세포 이용)

우선 정상 래트에서 비장만 분리한 후 조직을 그라인딩하고, 25 ㎍/ml의 마이토마이신 C(Sigma)를 30분간 처리 후 APC(antigen presenting cell)로 사용할 비장세포를 얻었다. 이 비장세포를 96-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰로 분주한 후, 타입 II 콜라겐 20 ㎍/웰을 첨가하여 30분간 자극시켰다.

상기 실험예 2와 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하는 과정에서, 관절염 유도 면역화 반응 후 70일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 드레이닝(draining) 림프 노드만을 분리한 후, 이들 조직을 그라인딩하여 혼합 림프구(mixed lymphocytes)를 얻었다.

CD4⁺ 자성비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 혼합 림프구로부터 CD4⁺ T 세포를 분리한 후 이를 상기 APC와 콜라겐이 분주되어있는 96-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰로 분주한 후 56시간 동안 자극시켰다. 그런 다음, 0.5 μCi [³H]티미딘(Perkin Elmer)를 첨가하여 16시간 동안 펄스를 준 후 티미딘 혼입량을 측정하였다(도 9). 도 9의 데이터는 대조군을 10으로 하였을 때 그에 대한 상대적인 수치로 표시한 것이다.

관절염 병리 증상이 활발하다면, CD4⁺ T 세포가 관절염 항원에 대해 반응하여 증식하는 속도가 빠르기 때문에 티미딘 혼입이 높게 나타난다. 즉 관절염 증상이 심각할수록 높은 수치를 나타내게 된다. 도 9에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 조성물 투여군이 대조군보다 훨씬 작은 값을 나타내고, MTX 처리군과 유사한 값을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 조성물을 투여한 군의 CD4⁺ T 세포는 콜라겐에 대한 면역반응이 거의 없는 것을 알 수 있고, 이는 CD4⁺ T 세포에 면역관용이 유도되었다는 것을 보여주는 것이다.

실험예 8: 세포 증식 분석(관절 주위 혼합 림프구 이용)

상기 실험예 2과 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하였다. 관절염 유도 면역화 반응 후 75일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 관절 주위에 있는 슬와부(popliteal) 림프노드와 서혜부(inguinal) 림프노드만 분리한 후, 이들 조직을 그라인딩하여 혼합 림프구(mixed lymphocytes)를 얻었다. 그런 다음, 혼합 림프구를 96-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/웰로 분주한 후 타입 II 콜라겐 40 ㎍/웰을 첨가하여 56시간 동안 자극시켰다.

그런 다음, 0.5 μCi [³H]티미딘(Perkin Elmer)을 첨가하여 16시간 동안 펄스를 준 후 티미딘 혼입량을 측정하였다(도 10). 도 10의 데이터는 대조군을 10으로 하였을 때 그에 대한 상대적인 수치로 표시한 것이다.

도 10에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 조성물을 투여한 군에서, 가장 낮은 티미딘 혼입량을 나타내었다. 이 결과는, 관절염에 직접적으로 연관되어 있는 관절 주위의 림프노드에서 본 발명의 조성물은 경구 면역관용을 유도하고, 결국 콜라겐에 대한 면역반응이 크게 억제된다는 것을 파악할 수 있다.

실험예 9: 콜라겐 항체 및 IgG 이소타입 생성량 측정: ELISA 분석

상기 실험예 2과 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하였다. 관절염 유도 면역화 반응 후 35일째 및 70일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트에서 혈액을 채취하고 혈청만 분리한 후, ELISA 분석을 실시하였다.

우선 전체 혈액 내에 항-콜라겐 Ab가 어느 정도가 되는지를 알아보았다. 1 ㎍/ml 농도의 닭의 II형 콜라겐을 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후 4℃에서 12시간 반응시키고, 1/10000로 희석한 각 실험군의 혈청을 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 항-래트 2차 Ab를 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, OPD를 이용한 발색반응 후 495 nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 11에서 볼 수 있듯이, 면역반응 35일 및 70일째에 MTX 투여군 및 대조군보다 본 발명 조성물의 투여군에서 항-콜라겐 Ab의 농도가 낮다.

이어, 각 IgG 이소타입에 대한 항-Ab(Immunology Consultant Laboratory)를 이용하여 IgG 이소타이핑을 실시하였다. IgG에는 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG2c와 같이 다양한 이소타입이 존재하는데, 이 이소타입을 측정함으로써 병리 상태가 Th1 또는 Th2 면역반응에 의해 유도되는 지를 파악할 수 있다. IgG1은 Th2 타입 면역반응을 나타내며, IgG2는 Th1 타입 면역반응을 나타낸다. 각 IgG 이소타입에 대한 항-Ab(2 ㎍/ml)를 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 희석한 각 실험군의 혈청을 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 항-래트 2차 Ab를 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, OPD를 이용한 발색반응 후 495 nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 11에서 볼 수 있듯이, IgG1의 농도를 살펴보면 35일째의 혈청에서는 MTX 투여군과 대조군에서, 본 발명 조성물의 투여군보다 높게 나왔지만, 70일째의 혈청에 대해서는 MTX 투여군과 대조군에서는 농도가 많이 감소되어 있고, 본 발명의 조성물 투여군에서는 약간 증가했음을 알 수 있다. 이와 같은 결과는, 실시간 PCR로 분석한 Th2 타입 사이토카인인 IL-10의 발현량이 증가하는 것과 동일하게 Th2 타입의 면역반응을 통해 Th1 타입 중재 면역반응을 감소시키는 것을 가리키는 것이다.

이와는 반대로 IgG2a와 IgG2b의 분석양을 보면, 35일째 및 70일째 모두 대조군에서 본 발명 조성물의 투여군보다 농도가 높은 것을 알 수 있으며, 이는 TNF-α, IFN-γ 및 IL-1β와 같은 친염증 사이토카인이 본 발명 조성물의 투여군에서 낮은 수준을 보이는 것과 동일하게 Th1 타입 면역 반응이 감소되었음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 조성물의 관절염 예방 효능을 AIA(adjuvant induced arthritis) 유도된 래트를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. 발명 조성물을 투여했을 때 병이 가장 심한 시기에 약 50% 질환 증상을 감소시켰다. 임상점수 및 발 두께를 측정하였다.

도 2는 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효능을 AIA 유도 래트를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. 발명 조성물을 투여했을 때 병이 가장 심한 시기에 약 50% 질환 증상을 완화 하는 치료 효과를 가져왔다. 임상점수 및 발 두께를 측정하였다.

도 3은 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효능을 각각의 조성물, 본 발명의 혼합조성물 및 관절염 치료제(메토트렉세이트: MTX)와 비교한 실험 결과를 보여준다. 본 발명 조성물이 MTX와 비슷한 치료효과를 나타낸다.

도 4는 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효능을 관절염 치료제(메토트렉세이트: MTX)와 비교한 실험 결과를 보여준다. 임상점수 및 발 두께를 측정하였다. 본 발명 조성물이 MTX와 비슷한 치료효과를 나타낸다.

도 5는 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효능을 조직학적으로 분석한 결과를 보여주는 사진이다. 화살표는 면역세포를 가리킨다. 본 발명 조성물의 투여에 의해 면역세포의 관절 침투가 줄어들고 MTX와 비슷한 면역세포 침투의 억제 현상을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 조성물의 친염증(proinflammatory)사이토카인의 발현에 미치는 영향을 혼합 림프구를 이용하여 실시간 PCR 방법으로 분석한 결과이다.

도 7은 본 발명의 조성물의 친염증 및 항염증 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 CD4⁺ T 세포를 이용하여 실시간 PCR 방법으로 분석한 결과이다.

도 8은 본 발명의 조성물의 친염증 및 항염증 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 관절 주위 림프구를 이용하여 실시간 PCR 방법으로 분석한 결과이다.

도 9는 본 발명의 조성물의 세포 증식에 미치는 영향을 CD4⁺ T 세포를 이용하여 분석한 결과이다.

도 10은 본 발명의 조성물의 세포 증식에 미치는 영향을 관절 주위 혼합 림프구를 이용하여 분석한 결과이다.

도 11은 본 발명의 조성물 투여에 의해 변화되는 항체의 량을 ELISA로 분석한 결과이다.

Claims (12)

1. 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 락토바실러스 카세이 및 콜라겐의 혼합물은 친염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-12의 발현량을 감소시키고, 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)인 IL-10, Foxp3 및 TGF-β의 발현량을 증가시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 글루코사민, 콘드로이틴 또는 이의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 맥아추출물, 비타민 D 또는 이의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 개다래, 백년초, 두충, 홍화씨, 율무 및 모과로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 한약성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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7. 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 관절염 개선용 식품 조성물로서, 상기 락토바실러스 카세이 및 콜라겐의 혼합물은 친염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-12의 발현량을 감소시키고, 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)인 IL-10, Foxp3 및 TGF-β의 발현량을 증가시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 글루코사민, 콘드로이틴 또는 이의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 맥아추출물, 비타민 D 또는 이의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 개다래, 백년초, 두충, 홍화씨, 율무 및 모과로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 한약성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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