PT93554A

PT93554A - Metodo para a clivagem especifica de uma molecula rna separada

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Publication number: PT93554A
Application number: PT93554A
Authority: PT
Original assignee: University Patents Inc
Priority date: 1989-03-24
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1990-11-07
Also published as: US5116742A; AU5289790A; EP0389299A1; WO1990011364A1

Description

1” 1 62.077 Ref: RJW/University Patents-RNA Ribózyme 5 V 0 presente invento refere-se a um método para a clivagem específica de uma molécula RNA separada. 10 O presente pedido é uma continuação-em-parte do pedido Norte-Americano com o número de série 937..372 , agora pendente. 15 A presente invenção fõí conseguida em parte com fundos provenientes do Governo sob.a concessão GM 28039 dos "National Institutes of Health", pelo que o Governo dos Estados Unidos tem alguns direitos sobre a invenção. 8 i O § 0 r-* 1 20 A presente invenção incide sobre composições do AEN que funcionam como uma enzima do ARN, isto é, como uma ribozima, com várias aptidões': desfosforilase (fosfatase ácida e transfosforilase), ribonucleotidil--transferase (com actividade de polimerase) e endorribonuclease com acti vidade especificamente dirigida a determinadas sequências. 25 Verificou-se que o cácido ribonucleico (ARN). purificado pode . actuar ccmo enzima (ribozima) sobre outras moléculas de-ARN in vitro, coi as seguintes actividadesj_ 1 - actividade de enzima desfosforilante , catalizando a remoção do fosfato terminal 3 ' do ARN em substractos com uma sequência específica, 2 -actividade de ARN-polimerase, (nucleotidil transferase), catalizando a conversão de oligorribonucleõtidos a polirri-bonucleõtidos, 3 - actividade de endorribonuclease em substractos com uma sequência específica. (Esta última actividade é também designada coro: 30 actividade de endonuclease de restrição do ARN ou como actividade de endorribonuclease). 35

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DESCRICAO DAS FIGURAS Figura 1 - compara as actividades de auto-processamento <A) e de endorribonuclèase íB) do ARN. Figura 2 - apresenta os produtos de clivagem de uma série, de substractos ARN pela ARN-endorribonuclease Figura 3 - compara as actividades de três formas variantes de ribozima L.-1S IVS com diferentes substractos em ureia -2.5 M. Figura 4 - apresenta a clivagem de oligonucleótidos em função do tempo. Figura 5 - apresenta a clivagem e a reconstituição de substractos oligorribonucleótido pela L-19 IVS ARN. Figura 6 - apresenta a cinética da conversão de pGS em oligonucleótidos maiores e mais pequenos com a L- 19 IVS ARN. Figura 7 - mostra o intermediário enzima-substracto da L-19 IVS ARN. Figura 8 - apresenta um modelo para o mecanismo enzimático da L-19 IVS ARN quando esta actua como ribonucleotidil transferase. Figura 9 - mostra a inibição competitiva do dCS na reação cõm o pCS. 35 10 15

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Figura 10 - mostra a relação das reacçftes catalisadas pela 13 IVS ARN.. com as reacçbes de auto-processamento e similares mediadas pela IVS ARN. Figura 11 - mostra a desfosforilação do ácido c.oligocitidílico) 3-fosfatado. Figura 12 - · mostra o efeito do pH nas reacçães de transferência de fosfato e de transferência de nucleótidos. Figura 13 - mostra que a fosforilação da ribozima L-19 IVS ARN é reversível. Figura 14 - mostra que a C-19 IVS ARN actua cataiiticamente c orno f osf o t r ansf er ase. Figura 15 - mostra o modelo do centro activo único para a actividade da ' L-19 IVS ARN sobre substractos fosfato diéster e fosfato monoéster. Figura 16 - mostra a construção do plasmídeo que produz a L- 21 IVS ARN. Figura 17 - mostra o aumento da especificidade da clivagem' na presença de ureia ou de forrnamida. Figura 18 - mostra a sensibilidade do mau emparelhamento na presença de ureia. Figura 19 — mostra a construção do plasmídeo pTL—21. Figura 20 - mostra o efeito da ureia. 35

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Figura 21 - mostra o efeito da ureia usando a L-21 ARN.

Figuras 22 a 31 - mostram os perfis de velocidade das ribozimas TTC, TTA e TQT com substractos bem e mal emparelhados em função da presença de ureia, NH4AC ou Mg++. 10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 DESCRICAO DETALHADA DOS DESENHOS Legendas das f iquras

Fig.1 — Um modelo para a acção da L—19 IVS ARN como endonuclease de restrição do ARN através de um mecanismo que é uma versão intermolecular do primeiro passo do auto-processamento Cself-spl ic ing) do pré-rARN. As letras e as linhas finas representam as sequências da IVS, e as letras e as linhas grossas representam sequências dos ex.8es Cem cima) ou sequências do substracto ARN Cem baixo); o G em itálico é um nucleótido ou nucleôsido guanosina livre.

Fig.2 - A L-19 IVS-beta ARN efectua clivagem em grandes substractos de ARN com transferência de guanosina. a_, pAKlOS ARN C508 nt) 0.6 uM Cu = micro) uniformemente marcado, incubado com L-19 IVS-beta ARN 0.2 uM e 0, 0.1 ou 0.5 mM GTP Cnão marcado) durante 1 h nas condiçSes abaixo descritas. CM). Mistura de 4 substractos ARN usados como marcadores de peso molecular. b, vários substractos ARN substituídos com trítio Cl ug cada) incubados com L-19 IVS-beta ARN 0.2 uM e Calfa-32P1 GTP 120 uM durante 1 h nas mesmas condições reaccionais de a. Q auto-radiograma revela a presença de produtos marcados com C32p) v 4 * ♦

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4 1 STP apenas. A L~13 IVS-beta ARN também se torna marcada com GTP durante a incubação. ç_, sequência de nucleótidos do produto de clivagem pAKlQS(l) determinada pelo método enzimático 5 (Donis-Keller, H. <1380), Nucleic Acids Res. 8} 3133-3142). Alguns nucleótidos nSo puderam ser identificados devido â presença de uma banda na amostra de ARN não tratada (controle). GT, GTP marcado adicionado ao ARN durante a reacção. 10 15

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Métodos - A L-19 IVS ARN foi sintetizada por métodos semelhantes aos préviamente descritos CZaug, A.J. e Cech, T.R. (1996) Sc ience 231:470-475) . exceptuando o sistema cadeia-molde Cteniplate) - polimerase, que foi diferente. Q plasmideo pT7-TTlA3 (que contém um promotor da ARN-polimerase de T7, um exão 42 bp 5', a totalidade da 413 bp IVS e um exão 82 bp 3') foi submetido à clivagem com Eco RI e transcrito com ARN-polimerase do bacteriofago T7 (Davanloo, P.et al. (1384) proc. Nat'l. Acad. Sci.V.S.A. 81: 2035-2033). Os transcritos foram pósteriormente incubados em condições favoráveis ao auto-processamento, à ciclização e à hidrólise dirigida <site-specific>, produzindo-se a L—19 IVS ARN (Zaug, A.J., et al. (1984) Science 224: 574—5785 Zaug, A.J: and Cech, T.R. (1986) Science 231:470-475). A guanosina terminal 3' foi então removida por oxidação com periodato e eliminação beta (Winter, G. , et al.(1978) Nucleic Acids Res. 5, 3129-3133), originando a L-19 IVS-beta ARN. Ds substractos ARN foram produzidos pela transcrição com ARN-polimerase de T7, de pAKlOS cortados com BamHI, (Mount, S.M.,et al. (1383) Ceil 33i509-518) pT7-l cortado com Xrnnl ou Seal (comprados à U.S, Biochemical Corp.), e pDW27 cortado com SnaiBI 5 35

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15 52.077 Pef: RJW/University Patents-BNA Ribozyme

que codifica o ARN Ml (obtido de D.Uahl e N. Face). Os substractos ARN foram incubados com L-19 IVS-beta ARN em MgC12 S mM, NaCl 10 mM e Tris-HCl 50 mM pH=7.5 á temperatura de 50 °C, na presença de GTP com a concentração indicada. As reacçães foram paradas pela adição de EDTA até ser atingida a concentração final de 25.mM. Os produtos foram analisados por electroforese em geis de poliacrilamida a 4¾ e ureia 8M e sujeitos a fluorografia (a) ou auto-radiografia (b).

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Fig.3 - Três ribozimas diferentes conseguem distinguir sequências que diferem de apenas uma base dentro do elemento de reconhecimento, a, Síntese de substractos oligorribonucleótido pré-definidos, pelo método de Lowary et al. (Lowary, P., et al. NATO ASI Series A, vol. 110, 69-76, 1986). 0 AON foi transcrito com ARN-põlimerase. do T7 na presença de Calfa-3£pl ATP para produzir oligorribonucleótidos marcados com 32P nas posiçdes indicadas com CIO. b^, Interacç3es propostas entre os três substractos oligorribonucleótidos C cadeias superiores, letras grossas) e os sítios activos das ribozimas emparelhadas (cadeias inferiores). As setas indicam os locais onde se dá a clivagem e a adição de guanos i na.. ç_, Clivagem de três substactos oligorribonucleótidos pelos L-19 IVS ARNs selvagem (wild type) s variante, analisado por electroforese em acrilamída a 20¾ e ureia 7M. C-), substracto não tratado. Noutros pares de faixas, c substracto 1.0 uM marcado com 32P foi incubado com ribozima 0.12S M durante 15 min. (faixa da esquerda) ou 60 min. (faixa da direita) a S0°C em MgC12 10 mM, NaCl 10 mM, Tris-Hcl 50 mt* pH=7.5, GTP (não marcado) 0.5 mM e ureia 2.5M. Dado que ο 32P se 6 «san· 1 5 15

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encontra confinado aos nucleótidos a jusante do sitio de clivagem, só aparece o menor dos produtos. A identidade do produto GA5 foi confirmada por tratamento do substracto e das misturas reaccionais com RNase de T2 e controlando a transferência do 32P para o Sp. A banda que migra acima da do QA5 nas faixas 2 e 3 não foi consistentemente produzida e nSo foi identificada.

25 30 35 Métodos: Os substractos foram preparados pela transcrição de deoxioligonucleótidos sintetizados num sintetizador de ADN da "Applied Bi osys tems". Ut i1izou-se a mesma c ade ia (cadeia superior) como promotor para cada transcrição. A cadeia inferior, que contém as sequências do promotor e da cadeia-moIde, foi modificada de forma a serem obtidos diferentes substractos ARN. 0 ADN foi transcrito com ARN-polimerase purificada do fago T7 (Davanloo, P. et al.,(1984) Proc Nat'l. Acad. Sei. U.8.A. 81:2035-2039), como foi anteriormente descrito CLowary, P., et al.,NATQ ASI Series, vol.110, indicado acima). As ribozimas variantes são descritas por Been e Cech (Been, M.D. , et al.,C198S) Cell, 47:2Q7-21S). A ribozima 24C foi preparada de forma semelhante a partir de transcritos de pBG/-3G:24C. As ribozimas variantes não foram submetidas à eliminação beta para remover o seu G terminal 3'.

Fig.4 - Análise cinética da reacção da ARN-endorribonuclease. a, Q substracto oligorribonucleótido (2.5 uM) foi incubado com ARN L-19 IVS-beta selvagem (0.2 uM) como na fig.3, excepto que se omitiu a ureia, b, Cinética da clivagem de

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Fef: ]^/University Patents-ΒΝΆ Rxbozyite GGCCCUCUAS em função· da concentração de GTP. A concentração do substracto ARN foi mantida constante a 2.5 uM. £, Cinética da clivagem em função da concent-rção do substracto ARN, sendo a concentração de GTP mantida constante a 0.5 mH. Métodos: Os produtos foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida. Utilizando o auto-radiograma como guia, cada gel foi cortado em fitas, e a radioactividade presente no substracto que "não reagiu e no produto GA-5 foi determinada por contagem de cintilações em líquido Cliquid scintillation counting). A velocidade inicial da clivagem CVp) foi determinada a partir de um registo semilogaritmico da fracção que reagiu era função do tempo. 1/V0 foi então registado em função do inverso da concentração do substracto» os gráficos apresentam as rectas que melhor se ajustam aos pontos experimentais por aplicação do método dos mínimos quadrados.

Fig.S - A L-19 IVS ARN cataliza a clivagem e reconstituição de substractos oligorribonucleótidos; CA) pC5 10 uM, e CB) d-pC5 10 uM ambos com L-19 IVS ARN 1.6 uM ; CC) pCS 45 uM na ausência de L-19 IVS ARN; CD) pU6 45 uM com L-13 IVS ARN 1.6 uM; CE) pCS 10 uM ; CF) pCS 50 uM, e CG) pC5 100 uM, todos com L-13 IVS ARN I. 6 uM. Os oligonucleótidos estavam marcados no terminal 5" por tratamento com Cgama-32 PI ATP e polinucleótido-cinase; foram diluídos com oligonucleótidos não marcados com a mesma sequência para manter constante a quantidade de radioactividade por reacção. A L-19 IVS ARN foi sintetizada por transcrição e processamento in vitro. 0 ADN pSPTTlAS super-ehrolado CPrice, J. V., et al., C1985) Sc.ience 223:713) foi cortado com Eco RI e 8 1 10 15

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depois transcrito com ARN-polimerase SP6 (Butler, E.T., et al. , £1982) J.Biol.Chem. 257:5772; Melton, D.A., et al., (1984) Nucleic Acids Res.12:7035) durante 2 horas a 370C numa solução de nucleósidos trifosfatados (0.5 mM cada), MgC12 6 mM, sspermidina 4mM, ditiotreitol 10 mM, Tris-HCl 40 mM pH=7.5, contendo também 100 unidades de ARN-polimerase SP6 por micrograma de ADN plasmidico. Adicionou-se então NaCl até se atingir a concentração final de 240 mM e a incubação foi continuada a 37°C durante 30 minutos para promover a extracção e a ciclização da IVS do ARN. □s ácidos nucleicos foram precipitados com três volumes de etanol e redissolvidos em CHES 50 mM pH=9.0; adicionou-se MgC12 até se atingir a concentração final de 20 mM e a solução foi incubada a 42°C durante 1 hora para promover a hidrólise dirigida do ARN IVS: circular, para dar a L-19 IVS ARN £2aug, A.J., et al. , Science 224, 574 (1984)). A reacção foi parada por adição de EDTA até ser atingida a concentração de 25 mM. A L-19 IVS ARN foi purificada pôr* electroforese preparativa em gel' e por cromatograf-ia em Sephadex G-50. Os ol igonuc leót-idos marcados foram incubados com L-19 IVS ARN a 42°C em MgC12 20 mM, Tris 50 mM pH=7.5 durante 0, 1, 2, 5, 10, 30 e 60 minutos. As reacçdes foram paradas por adição de EDTA até ser atingida a concentração final de 25 mM. Qs produtos foram analisados por ·electroforese em gel de poliacrilamida a 20¾ e ureia 7M, mostrando-se os respectivos auto-r ad i og ramas.

Fig. 6 - Cinética da conversão do pC'5 em o 1 igonucleótidos maiores e menores com L-19 IVS ARN 1.6 uM. Qs produtos foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida. Utilizando

Q 1 1 10 15

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Bef: lOT/Urãversity Patents-BNA Ribozyrre o auto-radiograma coroo guia, o gel foi. cortado em fitas e a radioactividade de cada espécie de ARN foi determinada por contagem de cintilações em liquido. Q estado da reacç-So (quantidade de produto formado em relação à do composto inicial) a cada valor de tempo foi tomado como a razão entre as radioactividades C - pC3 + pC4 + pC6 + pC7 +...) e a radioactividade total na faixa. A velocidade inicial de formação do produto, VO, foi determinada a partir de um registo semi logarítmico da fracção que reagiu em função do tempo. VO foi então registado em função da concentração de substracto; a curva é a que melhor se ajusta aos pontos experimentais pelo método dos mínimos quadrados aplicado à equação de Michaelis-Menten. Os parâmetros cinéticos resultantes são : Km = 42 uM, Vmax = 2.8 uM min-1, e kcat'= 1.7 min-1. Os parâmetros cinéticos referentes aos primeiro e segundo passos da reacção ainda não foram determinados separadamente.

Fig. 7 - Formação e resolução do intermediário enzima-substracto. CA) Para formar o -intermediário-covalente L-19 IVS· ARN - substracto, tratou-se CSp-t 8.5 nM com L-13 IVS ARN 0.15 uM em condições reaccionais Standard de 0 a 60 minutos. CB) Fez-se reagir pt'C5 C0.01 uM) com L—19 IVS ARN 0.16 uM. A clivagem ocorreu normalmente mas houve muito pouca reconstituição. CC) 0 intermediário covalente marcado foi preparado como em CA) (60-minutos) , e purificado por electroforese em gel de poliacri-lamida a 4% e ureia ÕM. Foi então incubado com CS não marcado 10 uM em condições reaccionais Standard de 0 a 60 minutos. 0 produto, designado como C6, co—migrou com o padrão C6 marcado (não 10 * * 10 15 62.077 Ref: Rjw/University Patents-FNA. Rxbozyme

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 25 30 apresentado). (D) 0 intermediário cova lente isolado como em CC) foi incubado em condições de hidrólise dirigida (MgC12 20 mM, CHE’3 50 mM pH-9.0) a 42 °C de 0 a 60 minutos. As posições dos mono- e dinucleótidos marcados encontram-se indicadas. Nas faixas correspondentes a 10 e 30 minutos em CA), e a 10, 30 e 60 minutos em CC), a compressão das bandas Credução das diferenças de mobilidade electroforética) é verificada entre C6 e C7 e menos óbviamente entre C7 e C8. Isto é devido à ausência de fosfato 5". Assim, a razão carga/massa aumenta com o aumento do tamanho da cadeia, enquanto no caso de oligonucleôtidos fosforilados em 5' a razão carga/massa é independente do tamanho da. cadeia. Quando estes produtos foram fosforilados por tratamento com polinucleótido-cinase e ATP, a distribuição voltou a apresentar o espaçamento normal análogo ao da Fig.1 C 2aug, A., et al., C resu 1 t-ados não pub 1 i cados) 3.

Fig. 8 - Modelo para o mecanismo enzimático da L-19 IVS ARN. 0 ARN catalisa a clivagem e a reconstituição de oligoCC) pelo caminho . 1-2-3-4-1. A enzima L-19 IVS ARN Cl) é apresentada com o local de fixação CRRRRRR, seis purinas) próximo dd seu terminal 5', e com a 6414 com um grupo 3'-hidroxilo no seu terminal 3". A complexa estrutura terciária da molécula CDavies, R.W., et. al.,C1982) Nature CLondon) 300: 719; Waring, R.W., et al. , C1983) -J. Mol. Biol. 167:595? Michel, F. , et al. , C1983) EMBQ J. 2:33; Cech, T.R., et al.,C1983) Proc. Nai'l. Acad. Sei. U.S.A. 80:3903; Inoue, T. et al., C1985) ibid. 82:648) está representada como uma simples linha curva. A enzima liga-se ao seu substracto CCS) por emparelhamento de bases tipo Watson- 11 35 zzmw

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Crick) formando o complexo enzima-substracto não covalente C2>. 0 ataque nucleôfilo pela 6414 leva à formação do intermediário covalente £3). Na reacção com o substracto pentanucleótido CS, o intermediário covalente comporta geralmente um único nucleótido, como está indicado? com substractos de cadeia maior pode existir um oligonucleótido ligado ao terminal 3'' da 64Í4. Se o CS se liga ao intermediário £3) conforme indicado em £4), pode ocorrer transest-erificação que origina o novo produto CS e regenera a enzima £1). Note-se que todas as quatro reacçbes neste caminho reaccional são reversíveis. Quando actua como ribonuclease, a L-19 IVS ARN segue o caminho 1--2-3 - 1. 0 intermediário covalente £3) sofre hidrólise libertando o nucleótido ou oligonucleótido ligado ao seu terminal 3" (neste caso, pC) e regenerando a enzima Cl).

Fig. 9 - Inibição competitiva provocada por d-C5 na reacção com o pCS. CA) p$C5 5 uM, apresentado (sem reacção prévia) na faixa 0, foi incubado com L-19 IVS ARN 0.16 uM em condiçSes reaccionais Standard. As reacçóes foram efectuadas na ausência de d-CS ou na presença de d—CS SG uíi, SOO ui*l ou 1000 uM, . como indicado. CE!) Gráficos de Lineweaver-Burk da velocidade da reacção da conversão de pCS a pC4 + pC3 na presença de d-C5 não marcado nas seguintes concentraçSes: Co) 0 uM, (quadrado aberto) S0 uM, (triângulo aberto) ISO uM. (circulo a cheio) 300 uM, ou (quadrado a cheio) SOO uM. A análise limitou-se aos produtos mais pequenos porque a respectiva produção é afectada apenas pela primeira reacção de transesterificação (Fig.8). Embora o d-C5 seja inactivo na primeira reacção de transesterificação apresenta 1

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Mod. 71-10000 ex. - 89/07 25 30 &2.077

Bef; RJW/University Patents-BNA Ribozyine 5 alguma actividade como substracto na segunda reacção de transester if icação CZaug, A., et al. , resultados não publicados)., podendo assim afeetar a produção de cadeias de tamanho superior a 5. <C) Q Km/Vmax" determinado a partir dos coeficientes 10 angulares das curvas em C8) encontra-se registado em função da concentração de inibidor. A intercepção no eixo dos xx é igual a -K i ? K i = 260 uM.

Fig. 10 - Relação entre as reacçSes catalisadas pela L-13 IVS ARN e as reacçbes de auto-processamento e similares mediadas pela IVS ARN. A formação do intermediário enzima-substracto covalente (A) é análoga à auiociclização da IVS ARN CB). A resolução do intermediário enzima-substracto CC) é análoga à ligação do exão CD) ou à iversão da ciclização CSullivan, F.X. and Cech, T.R <1985) Cell 42:639). A hidrólise do intermediário enzima-substracto CE) é análoga à hidrólise dirigida da IVS ARN circular CF) ou do pré-rARN C Inoue, T. et al <1986) J. Mol.

Biol. 1891143—165).

Fig. 11 - A L-19 IVS ARN catalisa a desfosforilação do ácido ol igoC citidí lico) fosfatado em 3'-. CA) A L—19 IVS ARN ^0.16 uM^ foi incubada com ptC-5 CIO uM) , p#AS CIO uli) , CSpfCp Ccerca de 2 nM) , e A6p#Cp- C cerca de 3 nM> em MgCI2 20 mil e tris-HCl 50 mM pH-7.5 a 42°C durante os tempos indicados. Qs produtos da reacção foram separados por electroforese em gel de sequenciação de poliacrilamida a 20% e ureia 7M, de que se apresenta um auto-radiograma. CB) A L-19 IVS ARN <0.2 uM) foi incubada com CSp# (cerca de 2nM) como indicado acima. A fosfoenzima Ε-ρΐ é a

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.“13 IVS ARN com um fosfato monoéster no terminal Electroforese em gel e auto-radiografia como em CA). Apenas :arregou no gel uma porção da amostra obtida após 5 minutos.

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Fig. 12 - Efeito do pH nas reacçóes de transferência de fosfato e de grupos nucieôtido. CA) faixa 1, CSptCp não tratado; faixas 2-11, CSpXCp C15 nM) incubados com excesso de L-19 IVS ARN CSOO nM) em MgC12 20 mM e tampão S0 mM C NaOAc para os pH 4.0 e 5.0, Tris-Hcl para o pH=7.5 CHÉS para os pH 3.0 e 10.0)? faixa 12, C5p$ Cp tratado cora fosfatase do intestino de vitelo, para fornecer um marcador para o CSp#C-QH; faixa 13, ptCS não tratado; faixas 14-23, p.*C5 <15 nM) incubado com excesso de L-13 IVS ARN CSOO nM), como nas faixas 2-11. As reacçóes processaram-se a 42°C durante os tempos indicados, após o que foram paradas por adição de um volume igual de tampão de ureia contendo EDTA 50 mM. CB> C5p$Cp Ccerca de 2 nM),foi incubado com L-19 IVS ARN C0.2 uM) a dH=5.0 durante os tempos indicados. CC) Dados semelhantes aos apresentados em CB) excepto com C5p$Cp 15 nM, que - foram quantificados por contagem de cintilações em liquido nas fitas de gel. Os registos semi logarítmicos Clineares para os três ou quatro primeiros valores do tempo) foram utilizados para a determinação de tl/2. A constante de velocidade de primeira ordem observada, CKobsd) foi calculada como (In 2) /tl/2). Os tampões utilizados foram o NaOAc (para os pH 4.0 e 5.0), MES (para os pH 5.5 e 6.0) e Tris-HCl CpH 7). (A estimativa foi baseada num único ponto experimental obtido quando tinha ocorrido cerca de 50% da reacção). 14 35

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Fig. 13 - A fosforilação da enzima é reversível. A L-13 IVS ARN CG. 2 uM) foi fosforilada incubando com C5p nSo marcado 2.5 uM a durante íalguns) minutos a 42°C a pH 5.0. Adicionaram-se então à E-p não marcada quantidades mínimas Cvestigiais) de: (A) , CSp# Cl. 2 nM) , ou: CB), p#C5 C20 nM) , e a incubação continuou durante os tempos indicados.

Fig. 14 - A L-13 IVS ARN act-ua cataliticamente como fosfotransferasè. CA) incubaram-se concentrações sucessivamente menores de C5p$ com L—19 IVS ARN 0.32 uM e UCU—0H não marcado 100 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 uH durante 30 minutos. A radioactividadè especifica do CSp$ foi ajustada por adição de CSp# não marcado para manter a radioactividadè constante nas amostras. A pequena banda intermédia observada em algumas reacções, é provavelmente devida 20 a UCUCp formado pelo ataque do UCU a um intermediário covalente E-pCp . Faixa <-), C5p$ antes da incubação. CB) C5p:t C2.5 uM) incubado com L—19 IVS ARN 0.16 uM e UCU—QH não marcado 200 uM. <C) Quantif icação dos dados' apresentados em CB)-, incluindo o E-p 25 marcado, que migrou junto ao topo do gel. Em todos os casos a incubação processou-se a 42°C e MgCI2 20 mM e MES 50 mM pH=6.0. 30

Fig. 15 - Modelo de um centro activo único para a actividade da L-13 IVS ARN com os substactos fosfato diéster e fosfato monoéster. CA) Nucleotidi1ização reversível da L—13 IVS ARN, proposta como o passo fulcral na reacção da poliCO-polimerase CZaug & Cech, <1386) Science CWash. D.C. 231:47o-475). CB) Fosforilação reversível da L-19 IVS ARN que permite à enzima actuar como fosfotransferase. Em ambos os casos o substracto oligoCC) emparelha-se através das bases com o local 15

£2.077

Hef: RJW/University Patents-RNA. Ribozyme de fixação ol igoCpirimidinsJ C se is R"s) para formar um complexo não covalente. 0 local de fixação da IVS ARN consiste nos nucleótidos 22 a 27 e tem a sequência CGGAGGG) CW.D.Been e T.R. Cech (1986) Cell 47:206-216). 0 ataque nucleófilo pelo hidroxilo 3' da guanosina G414 do centro activo leva à formação de E-pC CA) ou E-p CB) e à libertação de C5. A complexa estrutura terciária da molécula é representada por urna simples linha curva.

Fig. 16 - 0 plasmideo pBGST7 contém um fragmento com a IVS inserida no local de clonagem múltipla de um pequeno derivado do pUC18, que por sua vez contém um promotor do fago T7. A linha dupla representa o ADN do plasmideo com a IVS. As posições relativas dos promotores encontram-se indicadas. As posições do local EcoRI e Hind III estão indicadas pelas setas. A linha superior representa o transcrito feito in vitrò a partir do ADN do plasmideo purificado com a ARN-polimerase do fago T7. Os números acima da linhá referem-se ao tamanho, em nucleótidos, dos exões e da IVS. A linha inferior representa o transcrito in vivo do terminal 5' do lacZ', A IVS (linha grossa) contém códões de paragem em todas as três zonas de leitura Creadig frarnes),' pelo que um fragmento alfa funcional pode apenas ser produzido se a IVS for retirada e os exões forem juntos por autoprocessamento em E.coli.

Fig. 17 - Aumento na especificidade de clivagem na presença de ureia ou de formam ida', (a) Um substracto ol igonuc leõtido (GGCCCUCUAS), de tamanho igual a 13, marcado com 32P no seu terminal 5-, foi incubado com a 1-19 IVSbeta ut selvagem ou com 16 i.

£2.077 Ref: RJW/University Patents-ΒΚΆ Ribozyme

a variante 24C, ambas preparadas'como é descrito por Zaug et al., Nature ¢1996). Os diagramas mostram os complexos propostos (com as bases emparelhadas) entre o substracto (cadeia de cima) e o sitio activo da ribozima (cadeia de baixo). As reacções contém substracto 0.12 uM, ribozima 0.05 uM, STP 0.5 mM, NaCl 10 mM, MgC12 10 mM, Tris-Hcl 50 mM pH=7.5 e as concentações de ureia indicadas. A incubação fez-se a S0°C durante 15 ou 60 minutos conforme o indicado. As amds-tras foram analisadas por electrofo-rese em gel de poliacrilamida a 20% e ureia 7M, de que se

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 apresenta um auto-radiograma. (b) Um substracto oligonucleótido CGGCCGCUA5), de tamanho igual a 12, foi incubado com a L-19 IVSbeta ARN selvagem ou com a variante 24C. As condições são as descritas em Ca), excepto as concentrações de substracto 1.0 uM, a de ribozima 0.10 uM. íc) As mesmas condições reaccionais e de substracto que em Cb>, mas substituindo a ureia pela formamida CA formamida 2.SM corresponde a 10% v/v). A clivagem pela ribozima da variante 24C ultrapassa a clivagem pela ribozima selvagem entre 1-0 M e 2.0 M de formamida. 25

Fig. 18 - A clivagem de um substracto nucleótido que forma um complexo ribozima-substacto mal emparelhado é muito sensível à ureia. Os dados da fig. 17a referentes aos pontos obtidos cipós 15 minutos foram quantificados por contagem de cintilações em 30 líquido nas fitas de gel. (·>, ribozima selvagem, (>) ribozima da variante 24C (complexo mal emparelhado).

Fig. 19 - Construção do pT7L-21, um plasmideo que facilita a síntese da ribozima selvagem C L-21 Seal ARN). 0 vector pUC18 foi preparado por remoção do fragmento Sphl/EcoRI do local de 17 35 1 €2.077

Raf: RJW/University Patents-RNA Ribozyme 5 : lonagem múltipla. Um fragmento de AON sintético contendo um terminal EcoRI saliente em 5'CS' overhang), um promotor da ARN-Do1imerase do fago T7 CDunn & Studier, (1983) J. Mol. Biol. 166:477-535), e as bases 22-44 do rARN do IVS do Tetrahvmena thermophila (incluindo o terminal Sphl saliente em 3") foram inseridos no vector. Este plasmídeo foi clonado e sequenciado, e em seguida cortado com Sphl e HindIII. Q fragmento Sphl/HindiII do pBGST7 (395 bp) CBeen & Gech, (1386) CeII (Cambrige, llass. ) 47:207-216·), contendo as bases 45-414 da IVS e mais 25 bases do 15 “~

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 exão 3', fqi inserido para dar pT7L-21. 0 pT7L-21 foi linearizado com endonuclease de restrição -Seal, truncando a cadeia-roolde no IVS cinco nucleótidos a montante do local de processamento 3'. A transcrição in vitro com a ARN-polimerase de T7 purificada dá 20 então o ARN L-21 Seal, que contém os nucleótidos 22-409 da IVS. 25

Fig. 20 - Efeito da concentração de ureia na velocidade de. clivagem do substracto GGCCCGCUA5 com a L-21 Seal ARN. A concentração de ribozima era de 0.01 uM» a concentração do substracto oligonucleótido variou entre 0.10 e 3.78 uM. As concentrações de ureia (M) são as indicadas.

Fig. 21 - Efeito da concentração de ureia na velocidade de clivagem de substractos oligonucleótido pela L-21 Seal ARN. Os substract-os oligonucleótido continham as sequências de reconhecimento CCCCCU (), CCC6CU (♦), CCCUCU (·), CUCCCU (D), CUCGCU (Ό), e CUCUCU (o>. Em cada caso a sequência de reconhecimento era precedida por dois resíduos Θ e seguidas por cinco resíduos A. As reaeções continham oligonucleótido 0.80 uM e L-21 18 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62.077 Ref: RJW/University Patents-RM Ribozyms

Seal ARN 0.01 uM. Todas as velocidades são velocidades iniciais excepto para os substractos contendo CCCCCU, onde a c1ivagem era tão rápida qua algumas das velocidades são baseadas em dados em que houve clivagem de uma grande fraeção do substractoj nesses casos, a velocidade inicial é subestimada. Figs. 22-31 - mostram o efeito da ureia, do NH4Ac ou do Mg++ nos perfis da velocidade de clivagem das ribozimas TTC, TTA e TGT em substractos emparelhados e mal emparelhados. DESCRICÃO A sequência interveniente (IVS) do rARN de Tetrahymena é * uma molécula de ARN catalítica ou ribozima. E mediadora do auto-processamento do ARN, conseguindo a sua própria extraeção do grande percursor do ARN ribossomal e convertendo-se subsequentemente numa forma circular (Kruger, K., et al. (1982) Cell 31.:147-1575 Zaug, A.J. , et al. (1983) Nature 301:578-583). Nestas reacçóes os locais de processamento e os locais de ciclização podem ser visualizados como substractos intramoleeulares para uma actividade que reside na IVS do ARN (Zaug, A. J., et al. (1984) Science 224:574-578). Esta não é contudo uma verdadeira reacçSo enzimática , já que o ARN não é regenerado na sua forma original ao fim da reacção de auto-processamento. A IVS do ARN na sua forma linear é designada como L IVS ARN. Este ponto de vista foi corroborado por estudos com a L-19 IVS ARN, uma forma linear da IVS- em que faltam os 19 primeiros nucleótidos. Como os locais de ciclização estão ausentes, a L-19 19 35

62.077 i Bef: R)W/University Patents-RNA Rlbozyme

I 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 IVS ARN não pôde participar em reacçÕes intramoleculares CZaug, A.J., et ai. ,(1984-) Science 224:574-57S) . Contudo, mantém ainda a actividade e pode catalisar reacções de clivagem-ligaçâo em outras moléculas de ARN CZaug, A.J. and Cech, T.R. (1986) Science 231:470-475). Na presença de substracto ácido oligo(citidíli-CO) , a L-19 IVS ARN actua como uma enzima com activ idades de nucleotidi1-transferase EpoiiCO-polimerase], e de fosfodiestera-se Cribonuclease) (Zaug, A.J., and Cech, T.R.C1986) Science 231:470-475). Com sustráctos oligo-CC) fosforilados em 3', a mesma ribozima actua como uma fosfotransferase e como uma fosfatase ácida CZaug, A.J.,e Cech, T.R. (1986) Biochemistry 25:4478-4482). Uma caracteristica-chave, presente nos mecanismos de todas estas quatro reacções, consiste na formação de um intermediário enzima-substracto covalente no qual se dá a esterificação de um nucleótido ou de um fosfato com o 3'-Q da G414, a guanosina terminal 3' da IVS ARN. Além disso, iremos aqui descrever uma quinta actividade enzimática, relacionada com a actividade de endorribonuclease da L-19 IVS ARN sobre outras moléculas de ARN. A seguir ao auto-processamento do percursor do rARN de Tetrahvmena. a IVS ARN extraída (Abreviações: IVS, sequência interveniente ou intrão? L-19 IVS ARN Cleia-se "L menos 19") , um ARN com 395-nt sem os primeiros 19 nt Cnt, nucleótidos) da L IVS ARN (o produto directo do processamento do ARN pré-ribossomal); p$, 32P (isótopo fósforo 32) inserido num oiigonucleótido, em que, por exemplo, CSptC representa CpCpCpCpCC32P)C e ptCS representa (32P)CpCpCpCpC; d-CS, deoxi-C5> passa por uma série de 20 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 62.077 4 Eef: BJW/University Patents-RNA Ribozynie

reacções de ciclização e de hidrólise dirigida. Q produto final, a L-19 IVS ARN, é uma molécula linear que não tem os primeiros 19 nucleótidos do ARN originalmente extraído CZaug, A.J., et al. C1984) Science 224;574) Interpretámos a ausência de reacções posteriores da espécie L-19 como uma indicação de que todos os locais reactivos potencialmente existentes na molécula, e que podiam atingir o seu centro activo, Cisto é, os substractos intramoleculares) tinham sido consumidos; e propusémos que a actividade provávelmente não era perturbada CZaug, A. J. , et al.C19S4) Science 224:574) CL IVS é a IVS ARN linear). Testámos esta hipótese adicionando substractos oligonucleótido à L-19 IVS ARN. Verificámos que cada molécula de IVS ARN consegue catalisar a clivagem e a reconstituição de muitos oligonucleôtidos. Assim, a L-19 IVS ARN é uma verdadeira enzima. Embora a enzima possa actuar sobre moléculas de ARN com grandes dimensões e sequências complexas, verificámos que os estudos com oligorribonucleótidos simples como o pC5 Cácido pentacitidílico) são mais informativos, permitindo a determinação das quantidades mínimas de substracto necessárias à reacção, bem como do mecanismo da reacção desta enzima. Actividades de nucleotidi1-transferase ou de ARN—po1imerase

Quando a forma encurtada da sequência interveniente do ARN ribosomal CrARN) auto-processsda de Tetrahvmena thermophila actua como uma nucleotidi1-transferase, catalisa a clivagem e a reconstituição de substractos nucleótido de uma maneira que depende da sequência, com Km =42 uM e kcat = 2 min-1. 0 mecanismo da reacção é semelhante ao dp auto-processamento do 21 35 5 &.077

Ref: RJW/University Patehts-FNA RLbozyire percursor do rARN. Usando o ácido pentacitidilico como substracto, as sucessivas reacçbes de clivagem e de reconstituição levam â síntese de ácido policitidílico. Quando o sitio activo é mudado da sequência de nucleótidos natural, 66AG68, para a sequência 6AAAA6, o ácido oligo-uridilico é polimerizado a ácido poliuridílico CBeen e Cech, Cell 47:207(1386)3. Assim, a molécula de ARN pode actuar como uma ARN-polimerase, diferindo da enzima proteica na medida em que utiliza uma cadeia-molde interna em vez de uma externa. Assim, poderiam ser construídos vários heteropolímeros por formas variantes da enzima ARN. Prevê—se, por exemplo , a formação de moléculas de ARN mensageiro para determinados peptídeos ou proteínas. Este mensageiro poderia ser Sintetizado com ou sem intrSes. A valores de pH de.cerca de 3, a mesma enzima ARN apresenta comportamento de ribonuclease com actividade especificamente dirigida a uma ou mais sequências determinadas. 25 30

A L-19 IVS ARN faz poli(C) com 30 nucleótidos ou mais ao reagir com o substracto CS, actuando como uma ARN-polimerase ou como uma nucleotidil-transferase. Assim, podem formar-se oligonucleòtidos mais longos Cpolinucleôtidos) a partir de oligonucleótidos curtos. □ número de ligaçóes P-0 não é alterado durante o processo. Na síntese de poliCC) numa cadeia-molde de poliídS) pela ARN-polimerase, uma CTP sofre clivagem por cada resíduo polimerizado. Assim, a reacção da ARN-polimerase é também conservativa em ordem ao número de licções P—0 no sistema. A L—19 IVS ARN pode portanto ser considerada como uma poliCO-polime-rase, que utiliza C4pC como substracto em vez de pppC. Incorpora 22 35 4’

Í2.077 1 íef: RJW/University Patents-RNA. RLbozyme 5 10 15 unidades pC nõ terminal 3" da cadeia em crescimento, e liberta C45 a C4. é análoga ao pirofosfato libertado pela ARN-polimerase. A síntese é dirigida por uma cadeia-molde, mas essa cadeia-molde encontra-ae no interior da própria enzima ARN. Talvez seja possível separar fisicamente o troço contendo a cadeia-molde do troço catalítico na enzima ARN, com retenção de actividade. Se for esse o caso, a enzima ARN poderia , por hipótese, actuar como uma ARN-replicase primordial, catalisando tanto a sua própria replicação como a de outras moléculas de ARN (T.R. Cech (1386)

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30

Proc Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. 83:4360-4363). A L-19 IVS ARN catalisa a reacção de clivagem-ligação da pC5 com Km = 42 uM, kcat = 2 min-1, e kcat/Km = 1 X 103 s-1 M-l; 0 Km á da ordem de grandeza dos determinados para as enzimas proteicas. Qs valores de kcat e kcat/Km são mais baixos que os de muitas enzimas proteicas. Contudo, o kcat encontra-se dentro dos valores normais para proteínas que reconhecem sequências específicas de ácidos nueleicos e que catalisam a clivagem na cadeia ou o início da polimerização. Por exemplo, a endonuclease de restrição Eco RI efectua clivagem na sua sequência de reconhecimento em vários substractos ADN, incluindo um fragmento especifico de AON 8 bp, com kcat = 1 min-1 a 18 min-1 CSreene, P. J., et al. (1975) J. Mol. Biol. 93:237; Modrich, et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:5866; Wells, R.D., et al., (1981) Enzymes 14:1575 Brennan, M.B., em preparação, e Terry, B., et al., em preparação). 0 kcat é também semelhante ao da enzima de ARN ribonuclease P, que efectua clivagem no percursor do tARN com kcat = 2 min-1 (Quer.rier-Takada, C. , et al. , (1983) Cell 35:849;

-“IO 35 1 5 10 15 62.077 Fef: HJW/CJniversity Patents-RM Ribozyire

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

Marsh, T. L., et al. em " Sequence Speeificity in Transçription and Translation" , R. Calendar e L. Qold Eds., UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology» <Plenum, New York), a publicar). Outra maneira de avaliar a eficiência da L-19 IVS ARN consiste em comparar a velocidade da reacção catalisada com a velocidade da reacção puramente química. A reacção de transesterificação entre dois oligonueleótidos livres nunca foi observada, pelo que a velocidade da reacção não catalisada é desconhecida. Por outro lado, a velocidade de hidrólise de fosfatos diéster simples tem sido estudada CKumamotó, -J., et al. <1356) J. Am. Chem. Soc. 78:4853; P.C. Haake et al. ibid <1961) 83:1102; Kirby, A. J. et al, <1970) J. Ghem. Soc. Ser. 5‘. , p. 1165; Bunton, C.A., et al. <1969) J. Org. Chem. 34:767)). A constante de velocidade de segunda ordem para a hidrólise alcalina da ligação fosfodiéster lâbil na IVS ARN circular <Zaug, A.J., et al., <19S5) Biochemistry 24:6211) é 12 ordens de grandeza superior â determinada para o dimetilfosfato <Kumamoto, J. et al <1956) supra), e dez ordens de grandeza superior à esperada para uma ligação fosfodiéster normal no ARN < a velocidade de ataque nucleófilo nos ésteres de fosfato pelo ião hidróxido é sensível ao pKa do ácido conjugado do grupo libertado. Um grupo fosfato no ARN deveria ser mais reactivo que o no dimetilfosfato* porque o pKa =12.5 para uma ribose nucleosídica e o pKa = 15.5 para o metanol t valores a 25°C, de P.G.P. T'so, Basic Principies in Nuçleic Acid Chemistry <Academic Press, New York <1974), yol.I, pp462-463, e P. Ballinger e F.A. Long, J. Am. Chem.Soc.82:735 C1960), respectivamente]. Tomando os 24 35 γχ4:ν.·\..

62.077 Bef: RJW/University Patents-RNA. RIbozyiTie 10 15 .δ § ο £ :;ϊ 20 ·;;"μ.•fft: 25 30 illl 35 dados cinéticos conhecidos para a hidrólise alcalina dos fos-fatos diéster (Kumamoto, J. et al. (1956) J. Am. Chem. Soc. 79:4858? Haafce, P.G. (1961) et al. ibid 83:1102? Kirby, A. J., et al. (1970) J. Qhem. Soc. Ser. B, p.1165? Bunton, C.A., et al. (1969) J. Qrg. Chem. 34:767), pode estimar-se grosseiramente o coeficiente angular do gráfico do logaritmo da constante de velocidade de hidrólise em função do pKa, que tem o valor aproximado de 0.6. Assim, é de esperar que o ARN seja mais 0 6 %(15 5** reactivo que o dimetil fosfato por um factor de 10 l"'1 5) 1 8 *’’ -10 . A estimativa para o ARN aponta para o ataque directo no fosfato pelo OH-, o que resulta na formação de terminais hidroxil-3' e fosfato S'. (A clivagem do ARN por t-ransf osf or i lação catalisada por 0H-, produzindo o fosfato cíclico 2', 3·', é uma reacção (intramoleeular) muito mais rápida, mas não é relevante para as reacçSes da L—19 IVS ARN). De acordo com os dados da fig. 7D o complexo enzima-substacto covalente sofre hidrólise com velocidade aproximadamente igual à da hidrólise de uma ligação equivalente na IVS ARN circular. Assim, estima-se que a L-19 IVS ARN, quando actua como ribonuclease, aumente a velocidade de hidrólise do seu substracto cerca de IO10 vezes. A parte ARN da ribonuclease P, a enzima responsável pela clivagem dos percursores do ARN de transferência CtARN) para gerar o terminal 5'‘ do tARN,. é o exemplo de uma molécula de enzima-ARN. CSuerrier—Takada, C. et al. (1983) Ce11 35:849? Guerrier-Takada, C., et al. (1984) Science 223:285? Marsh, T.L., et al. in "Sequence Specificity in Transcription and 25 a

IWod. 71-10000 ex. - 89/07 1 62.077Ref : lUW/University Pàtents-RNA RLbozyme Transiation", R.Calendar and L. Gold, Eds.

I UCLA Symposium on

Molecular and Cellular Biology CPlenum, New York), . a publicai1)? 5 Marsh, T.L. ei al. C1985) Science 229?793. Contudo, esta enzima catalisa apenas uma reacçSo especifica do tARN, sem apresentar actividade em relação ao ARN em geral. A especificidade é de tal ordem que substituiçftes em bases únicas .na porção tARN do 10 substracto pré-ARN impedem a enzima de efectuar clivagem no substract-o.

Actividade de desfosforilacão 15 20 25 30

Verificámos também que a mesma enzima apresenta actividade em relação aos monoésteres de fosfato. 0 fosfato 3' de CSp ou CSp é transferido para a guanosina terminal 3' da enzima . A dependência da reacção com o pH (óptimo a pH 5) indica que a enzima tem actividade em relação ao dianião, e actividade muito maior em relação ã forma monoaniônica do fosfato 3' do substracto. A fosforilação da enzima é reversível na presença dè CS-QH e outras oligoCpiriraidinas) como o UCU-QH. Assim, a enzima ARN âctua como uma fosfotransferase, transferindo o fosfato terminal 3' do CSp para UCU-QH num processo envolvendo uma multiplicidade de ciclos. A pH 4 e 5, a fosfoenzima sofre hidrólise lenta para dar fosfato inorgânico. Assim, a enzima tem actividade de fosfatase ácida. Estes são dois novos aspectos da sua actividade como desfosforilase. A enzima ARN desfosforila substractos oligonucleótido com especificidade muito dirigida a uma dada sequência , o que a distingue das enzimas proteicas conhecidas. 26 1 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 30 £2.077Pef: RJW/University Patents-RNA Rlbozyme

A L-19~ IVS ARN tem actividade de transfosforilação em relação aos substractos oligoCC) fosforilados em 3". As propriedades da reacção de transfosforilação indicam que esta se dá no mesmo sítio activo que as reacçães envolvendo as activida-des de poliCC)-polimerase e de ribonuclease (Figura 15). Essas propriedades incluem a especificidade das reacções em relação aos substractos oligoCC), a produção de produtos oligoCC) com terminais 3" hidroxilados e a formação de complexos enzima-substracto covalentes semelhantes. 0 provável intermediário é uma fosfoenzima, E—p, no caso da reacção da fosfotransferase, - e uma nucleotidi 1—enzima, E—pC ou E-CpOn.. no caso das reacçbes da poliCO-polimerase e da ribonuclease CZaug & Cech (1998) Science CWash. D.C. 231:4-70-475) . Em ambos os casos o provável intermediário covalente envolve uma ligação éster-fosfato através do 3"-Q da G414 da L-19 IVS ARN CZaug e Cech, resultados não publicados). A reacção de transfosforilação é prontamente reversível. 0 fosfato pode ser transferido da enzima para um aceitador com um gupo hidroxilo 3'- , como 05 ou UCU. Com os co-subst-ractos C5p e UCU, a L-19 IVS ARN consegue catalisar a reacção CSp + VCU-QH C5-0H + UCUp. 0 caminho reaccional proposto é"

C--0H UCU-OH5 f I E + CgP * E.C5p = E-p - E-p.UCU-OH = UCUp + E

Assim. a L-19 IVS ARN tem actividade de transfosforilação 35 semelhante à da fosfatase alcalina da Escherichia coli (Reid & 27

62.077

Ref: RJW/University Patents-RNA Ribozyme

Wilson.. <1371) , Enzymes <3á ed. ) 4_2 373-4.15? Coleman & Gettins <1*383) Adv. Enzymol Relat. Area Mol. Biol. , 55; 381) , à. da fosfatase ácida, e à de uma série de outras fosfotransferases que formam intermediários enzima-substracto covalentes. < Knowles, (1980) Ann. Rev. Biochem. 49:877). Além disso, a fosfoenzima da L-19 IVS ARN pode transferir o seu fosfato para água a pH 4 e 5, indicando que tem actividade de fosfatase ácida.

Quando se baixa o pH de 7.5 para 5.0, a velocidade da reacção de transfosfar ilação aumenta substancialmente. Nesta mesma gama de pH, o fosfato 3' do C5p é convertido a monoanião [pKa aproximadamente igual a 6.0, baseado no valor para a citidina 3'-fosfato de Ts"o <1974) Basic Principies in Nucleic Acid Chemistry vol.I, pp 462 Academic, N.Y.3. A protonação de um fosfato monoéster faz com que este possa reagir como um diéster <Benkovic 2; Schray, <1973) Enzymes <3a Ed. ) 8:235). Assim, parece razoável que uma enzima que reage com diést-eres possa utilizar o mesmo mecanismo para reagir com monoaniões monoéster. A necessidade- de-pH acidico para a hidrólise da fosfoenzima- pode ser explicada de forma semelhante, se a reacção ocorrer por ataque da água no monoanião fosfato monoéster. A independência da transfosforilação a pHs entre pH 7.5 e pH 3 sugere fortemente que o dianião monoéster é também reactivo, embora a reacção se processe com uma velocidade menor que 5% da do monoanião monoéster. A reactividade do dianião monoéster é surpreendente e talvez indique que a enzima fornece "ajuda" eleetrofí1ica á saida do grupo eliminado através de um protão ou de uni ião metálico. id 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 52.077 ítef: RJW/University Patents-KNA. Ribozyine

A pHs alcalinos, a ligação fosfod-iéster que se seque á 6414 é lábil na IVS ARN circular <Zaug et al, 1384 Science CWash. D.C. 224:5744; no pré-rARN CInoue et al 1386, J. Mol. Biol. 183:143), e na E-pC CZaug, A.J. e Cech, T, 138S, Science CWash. D.C.) 231:470-475), enquanto a ligação fosfomonoéster a seguir à 6414 é estável no E-p. A hidrólise especifica das ligações fosfodiéster envolve o ataque do ião hidróxido CZaug, A.J, et al (.1985) Biochemistry 24:6211). Não é surpreendente que o ataque do ião hidróxido ao aniãò fosfato monoést-sr de E-p possa ser impedido devido á repulsão electrostátiea CKirby & Younas, (1370) ._T. Chem. Soc. B, 1165). A pH = 5 a fosfoenzima sofre hidrólise muito lenta, mas transfere prontamente o seu grupo fosfato para o C5-0H. A velocidade da reacção de hidrólise é 2 a 3 ordens de grandeza mais lenta qua a da reacção de transferência de fosfato, apesar de H2Q estar presente com a concentração de 55M e o oligonucleó- tido com concentração inferior a íuM. Assim, o C5-QH έ melhor 10 aceitador que H20 por um factor em excesso de 10 . CNão é raro um factor tão elevado nas fosfotransferases; por exemplo, Ray et al.C1376) Biochemistry 15:4006 referem que a fosfoglucomutase transfere um fosfato para o hidroxilo C-6 da glucose-l-fosfato com uma velocidade 3X1Q10 superior à da transferência para Η2θ}. A diferença de velocidades é demasiado elevada para ser explicada peia nucleofilicidade superior do hidroxilo 3' do CS-QH em relação à de H2Q, que podia talvez originar um factor de 10 CLohrmann & Qrgel <1378) Tetrahedron 34:8-54; Kirby & Varvogiis <1367) J. Am. Chem. Soc. 83:415-423). Grande parte da diferença 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex. -89/07 20 25 30 52.077 Sef: RJW/University Patents-RNA. Ribozyitie

de velocidades reflecte provávelmente a capacidade que a enzima tem para utilizar as energias de ligação envolvidas nas interacções com porções do C5-QH que não reagem CJencks, W.P. 1975, Adv. Enzymol. Relat. fireas Md. Biol. 43:219). Por exemplo, as interacções devidas às ligações especificas posicionariam o hidroxilo 3' do CS-QH na orientação precisa para a remoção do fosfato da enzima, mas não estariam disponíveis para facilitar a adição de água. Para além disso, a aparelhagem catalítica pode não estar completamente montada até que o aceitador oligonucleé-tido se encontre correctamente posicionado e a água esteja ausente CKoshland,(91363) Cold Spring Harbor Symp. Quani. Biol. 285473, Knowies, (1980) Ann. ReV. Biochem. 495877). Começamos apenas a compreender como é que a L-19 IVS ARN catalisa a transferência de fosfato. A reacção de transferência global é sem dúvida facilitada pela formação de uma ligação covalente entre a enzima e o fosfato do substracto. Este tipo de catálise covalente é comum em reacções de transferência de grupo cataiizadas enzimáticamente CJencks, (1969) Catalysis in Chemistry and Enzymology McGraw-Hill, New York; Walsh, (1979) Enzymat-ic Reaction Mechanisms W.H. Freeman, San Francisco). Os locais na IVS ARN para a ligação do substracto oligoípirimidina) CZaug & Cech, (1986) Science (Wash., Q.C. 2315470-475), e do resíduo G nucleófilo no seu próprio terminal 3'', CN.K. Tanner & T.R. Cech, resultados não publicados) contribuem para a catálise das reacções de transferência. Estas interacções ligantes colocam provávelmerite o grupo hidroxilo 3" da Θ414 numa orientação óptima para o ataque nucleófilo no fosfato terminal da C5p (Figura 15B), 30 35 52.077

Ref: RJW/University Patents-RKA. Ribozyme

10 cu num fosfato interno do CS-0H (figurei ISA). Suspeitamos que a catálise possa também envolver um papel especifico para o Mg2+ CSteffens et ai., (1973) -J. Am. Chem. Soc. 95:935 e (137-5) Biochemistry 14:2431; Anderson et al. , (1377) -J. Απί. Chem. Soc. 99:2552? ve j a-se também Zaug et al. (1935) Biochemistry 24:6211 and Guer r ier-Takada et al. (198É ϊ) B i o c h e m i s t r y 25: 1509 3 , e catálise âc ido—base geral (ve .1 a—se Cech â Bass (1986) Ann. Rev. Biochem. 55:559-629), , mas não temos evidência directa para estes 15

Mqd. 71 -10000 ex. - 89/07

30 mecanismos. Os requerentes admitem não considerar os mecanismos discutidos nesta publicação como hipóteses únicas.

Uma questão não respondida diz respeito á pouquíssima transferência de nucleótídos com o substracto C5p verificada a pH neutro. Como o C5-QH é prontamente atacado no fosfato seguinte ao quarto C para produzir E-pC, porque será que o C5p não é atacado no fosfato equivalente para produzir E-pCp ? Talvez o fosfato terminal do CSp esteja coordenado ao Mg (II) ou sirva de aceitante de uma ligação de hidrogénio, o que resulta num modo preferencial de ligação diferente do que ocorre no CS—0H. A descoberta de uma enzima com ambas as actividades de fosfodiesterase e de fosfomonoesterase é invulgar mas não sem precedente. A exonuclease III (Richardson & Kornberg, (1964) J. Biol. Chem. 239:242-250), a Pi-nuclease e a nuclease do feijão CShishido & Ando, 1382 in Nucleases (Linn, S.M. & Roberts, R.J. Eds) pp. 155-185, Cold. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) têm todas actividade de 3'-fosfat-ase. 35 31 £2.077 Ref: KJWAJniversity Patents-RKA. Rlbozyma

1 5 10 15 A L~19 IVS ARN é única entre as enzimas conhecidas, na medida em que apresenta a capacidade de remover fosfatos 3' do

Mod. 71 -10000 ex/-89/07 20 25 30 35 ARN com grande especificidade em relação ao substracto. As fosfatases alcalinas da E. coli e dos mamíferos são não-específicas. Estas enzimas removem fosfatos 5", 3' e 2" do ARN sem grande sensibilidade á sequência de bases na molécula CGaren & Levinthal, ¢1360) Biochem.· Biophys. Acta. 38:470; Harkness, C1968) Arch. Biochem. Biophys. 126:513). A polinucleótido-cinase tem actividades de 3'-fosfatase, 2'-fosfatase e 2', 3', cíclico-fosfatase CCameron & Uhlenbeck, <1977) Biochemistry 16:5120=! Web_er, <13S5) Ph. D. Thesis, University of Illinois). Substactos tão diversos como o U5p, o ASCp e o pCp são prontamente desfosforilados e, nós casos em que foram feitos estudos cinéticos cuidadosos, as velocidades de desfosforilação de diferentes substactos ARN raramente variam de um factor maior que 2 (Weber, <1385), supra). A pl-nucleasé e a nuclease do feijão têm uma preferência limitada por alguns nucleósidos monofosfatados em 3' CShishido & Ando , <1982), supra). A L-1S IVS ARN, por outro lado, transfere com grande especificidade o fosfato 3' do ARN para uma molécula doadora; o CSp e o C6p são substractos, enquanto o pGp e o A6pCp não o são. Esta especificidade em relação ao tamanho e â sequência é explicada pela exigência do substracto se ligar ã enzima através de emparelhamento de bases tipo Watson-Crick , no sitio activo rico em guanosinas <Figura 15). Se este modelo for correcto, deverá ser possível alterar a especificidade da fosfotransferase em relação a uma dada sequência através dè mutagénese dirigida <site-specific mutagenesis) no sitio activo.

Mod. 71 -10000 ex;-83/07

1

Uma série de enzimas 3'-P desfósforilant.es contituiriãm um instrumento útil para o estudo da bioquímica do ARM e para as manipulações do ARM recombinante. Contudo, a enzima ARN aqui 5 descrita tem actividade de clivagem-ligação, para além da actividade de desfósforilação. A não ser que estas actividades possam ser separadas, a utilidade da enzima com reagente para a desfósforilação é limitada. 10 15 20 25 30 £2.077

Ref: Rjw/University Patents-RNA Ribozyme

I

Actividade de endorribonucIease úu de "Endonuclease de restrição do ARN"

Vamos descrever aqui_uma quinta actividade enzimática da ribozima de Tetrahymena. Esta eféctua clivagem noutras moléculas de ARN, em sequências que se assemelham ao local de processamento 5' do percursor do ARN. A clivagem é concomitante com a adição de um nucleótido guanosina livre ao terminal 5' do fragmento de ARN situado a jusante? assim, um produto pode ser prontamente marcado no terminal durante a reacção. A reacção é análoga ao primeiro passo do auto-processamento do pré—rARN CFig.l). A clivagem não requer o nucleótido G414 da ribozima; ao contrário das primeiras quatro actividades, não envolve a formação de um intermediário enzima-substracto covalente. Assim existem, como resultado do trabalho desta invenção, endorribonucleases especificamente dirigidas a determinadas sequências, sem proteína, ie., capazes de actuar na ausência de proteína, e compostas de ARN, que são enzimáticamente activas sobre outras moléculas de ARN. Estas ribozimas de ARN actuam sobre ARN exógeno. Assim, a enzima ou ribozima é composta por ARN e o substracto é também ARN (ou polímeros mistos de ARN-ADN). 35 162.077 Bef: RJW/Dniversity Patents-FNA. Ribozyme

A ribozima tem grande especificidade-para efect-uar clivagem

15 a seguir à sequência de nuçleôtidos CUCU; sob condições severas, consegue discriminar esta sequência de reconhecimento em relação a locais com 3 das 4 posições análogas. Por exemplo, numa solução contendo ureia 2.5 ΙΊ a enzima efectua clivagem a seguir a CUCU, e ignora as sequências relacionadas CUGU e CGCU (Fig. _3c). A especificidade em relação à sequência é próxima da das endonu-cleases de restrição do AON (Nathans, D. and Smit-h, H.Q. (1375) Annu. Rev. Biochem. 44:273-293). Mostramos também qué as mutações dirigidas no sitio activo da IVS ARN, as chamadas sequência-guia

Mpd. 71-10000 ex.·' 89/07 20

25 30 35 interna COavies, R.W. , et al. (1932) Nature 300Ϊ 719—724j Waring, R.B., et al. (1386) Nature 321:133-139), ou locais de ligação ao exão 5" (Inoue, T. , et al. (1985) Cell 43:431-437; Sarriga, G. , et al. (1986) Nature 322:86-89; Beén, M.D. and Cech, T.R. (1986) Cell 47, 207-216), alteram a especificidade da ribozima em relação à sequência de uma maneira previsível. Como endorribonuclease, a L-19 IVS ARN reconhece quatro ou mais nuçleôtidos quando escolhe um sítio de reacção. As ribonucleases proteicas que são activas em substractos de ADN de cadeia simples apenas apresentam especificidade ao nível dos mononucleótidos (por exemplo, a ribonuclease TI efectua clivagem a seguir â guanosina). Assim, a L-19 tem maior especificidade em relação à sequência das bases do ARN de cadeia simples do que qualquer ribonuclease proteica conhecida, podendo aproximar-se da especificidade apresentada por algumas endonucleases de restrição do ADN. Unia particularidade atraente desta nova endorribonuclease é a de que a sua especificidade em relação ao substracto pode ser 34

Mod. 71 -lOOOO βχ. - 89/07 20 25 30 í2.077 1 lef: RJWAJniversity Patents-PM Ribozyme completa e previsivelmente modificada por alteração da sequência no local de fixação interno. A reacção da endorribonucleâse é análoga ao primeiro passo do auto-processamento do prd-rARN (Fig.l). Ambas as reacções, enzimática e de auto-processamento, utilizam os mesmos dois locais de fixação, um local de fixação oligopirimidina e um local de fixação guanosina, para obter especificidade e contribuir para a catálise. Q local de fixação oligopirimidina é também conhecido como a sequênciâ-guia 5' (Waririg, R.B., et al*,¢1386) Nature 321;133-139) ou local de fixação exão 5' CXnoue, T., et al. <1385) Cell 43:431, Garriga, G. , et al. ¢1386) Nature 322:86-83,

Been, M.D. and Cech', T.R. , Cell (1986) 47 , 207-216) . 0 seu papel no auto-processamento tem sido demonstrado conclusivamente pela análise de mutações em bases únicas e de mutações em supressores secundários C second-site suppressors ,) (Waring R.B., et al. ¢1986) Suora; Been, M.D. e Cèch, T.R., C1986) Supra; Perea, J. e Jacq, C., C1985) EMBG, J. 4J3281) . 0 papel destes mesmos nucleótidos na reacção da endorribonuclease é demonstrado pela alteração da especificidade de enzimas de mutantes em relação ao substracto (Fig. 3), sendo essa especificidade alterada de acordo com as regras de emparelhamento das bases de Watson-Crick. 0 local de fixação guanosina envolvido no auto-processamento não foi localizado em nenhum grupo especial de nucleótidos, mas as suas características gerais já foram descritas CBass, B.L. and Cech, T.R., (1984) Nature 308:820; C1986) Biochemistry 25:4473). A actividade da endorribonuclease parece utilizar o mesmo local de 35 35

I

6 2.077 lef: RJW/University Patents-RNA. Rlbozyme ‘23Mâ? fixação guanosinai a partir dos seguintes critérios: · em ambos os casos, a guanosina ê tão açtiva como o GTP, enquanto os UTP, CTP, ATP e dGTP tem pouca ou nenhuma actividade. Além disso, o Krn = 44 uM obtido para o ΘΤΡ é razoávelmente semelhante ao valor de 32+ 3 uM determinado para o auto-processamento em condiçóes reaccionais um pouco diferentes CBass, B.L. & Cech, T.R., Biochemistry (1386) supra). 15

Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 20 25

30 35 A actividade da endorribonuclease da L-13 IVS ARN não requer a sua guanosina (G414) terminal 3'. Neste ponto difere das actividades de transferência de nucleótidos , de transferência de fosfato e hidrolitica apresentadas pela mesma enzima. Nessas reacçSes, a G414 participa num complexo enzima-substracto covalente, que parece ser um intermediário obrigatório da reacção (Zaug, A.J. and Cech, T.R. (1986) Science 231:470-475; Zaug, A.J. and Cech, T.R. (1986) Biochemistry 25:4478). Assim, a L-19 IVS ARN não se restringe a mecanismos de reacção envolvendo a formação de um intermediário enzima-substracto covalente. Pode também catalisar reacçbes a dois substractos por um mecanismo de substituição simples. A ribonuclease P, uma enzima de ARN que catalisa a clivagem através da hidrólise em vez de através da transesterificação, também parece actuar sem a formação de um intermediário covalente (Marsh, T.L., et al. (1985) Science 223:73-31; Guerrier-Takeda, C., et al. (1986) Biochemistry 25.: 1503) . A actividade da L-19 IVS ARN como endorribonuclease aqui referida parece exigir substractos de ARN de cadeia simples. Com base num trabalho recentemente publicado por Szostak (1986) 36

5 >.077 1 Rsf: RlW/Uhiversity Patenhs-RKA Ribozyme 5 15

Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 20 25 30

Nlaiure 322:83-86. parece possível que uma versão mais pequena da IVS ARN da Tetrahvmena em que falta q seu sítio de ligação ao exão 5, possa apresentar actividade de endorribonuclease sobre substract-os com bases emparelhadas. 0 substracto testado por Szostak (C1936) Nature supra) consistia num fragmento de ARN que apresentava o terminal 5' emparelhado com o local de ligação do exão 5''. Contudo, este " substracto" ARN incluía igualment-e uma parte substancial da IVS ARN, pelo que ainda está em dúvida se a ribozima tem actividade de endorribonuclease com substractos ARNs de cadeia dupla em geral.

Potencial utilidade de endorribonucleases com especificidade dirigida a determinadas sequências. As endorribonucleases com especificidade dirigida podem ter muitas das aplicações para o estudo do ARN, que as endonucleases de restrição do ADN tem para o estudo do ADN CNathans, D. and Smith, H.O., (1975) Ann. Rev. Biochem. 44:273). For exemplo, o padrão dos fragmentos da restrição podia ser usado para estabelecer comparações entre as sequências de ARNs relacionados, e ARNs grandes podem ser submetidos a clivagem especifica dando origem a fragmentos com dimensões mais adequadas para o seu estudo. A especificidade da ribozima em relação à sequência de quatro nucleótidos torna-a ideal para a clivagem de ARNs de sequência desconhecida; um ARN com sequência aleatória teria em média um local de clivagem para cada 256 bases. Além disso, a marcação automática do terminal de um dos fragmentos durante a clivagem pela ribozima é uma vantagem prática. 37 35 -

5 10 15 52-077 Kef: R3W/0niversity Patents-KNA Riboz^me

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 0 desenvolvimento das ribozimâs como instrumentos úteis em biologia molecular encontra-se no seu inicio. A eficiência da clivagem em grandes substractos ARN precisa de ser melhorada, para se conseguirem obter reacçbes de digestão completas e não parciais, como acontece agora. Qs efeitos de desnaiurantes como a ureia e a formamida têm que ser mais explorados? parecem aumentar a especificidade da clivagem em relação a uma dada sequência, e ao mesmo tempo desfazer Cmelt) a estrutura do substracto, maximizando a disponibilidade das sequências-alvo. Por último, pode efectuar-se mutagénese no sitio activo da ribozima ~ por quem seja perito nessas artes - de modo a serem conseguidas'todas as permutas possíveis correspondentes às enzimas capazes de clivagem em todas as 256 sequências de te t r anu c1eót idos possíveis.

30

Reconhecimento da sequência do ARN. As ribonucleases proteicas conseguem efectuar clivagem nos substractos de ARN com grande especificidade, através do reconhecimento de uma combinação da estrutura e sequência do ARN, com ênfase na estrutura Cp. ex., RNase III (Robertson, H.O. ¢1982) Ce11 30:669) e RNase MS (Stahl, D.A., et al. <1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:5644). Por outro lado, as proteínas conhecidas que efectuam clivagem em substractos ARN de cadeia simples apresentam especificidade apenas ao nível de mononucleótidos ou dinucleótidos Cp.ex., a RNase TI efect.ua clivagem a seguir às guanosinas EEgami, F., st al. <1980) Molec Bio. Biochem. Biophys: 32:250-2773. Assim, a L-19 IVS ARN procede à clivagem do ARN de cadeia simples com uma especificidade em relação à sequência de 1 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 $2.077 Bef: BJW/University Patents-HNA. Ribozyite

Dases - do ARN considerávelmente superior à de qualquer ribonuclease proteica conhecida.

Ribozimas Variantes (ou outras versões da ribozima que mantêm a actividade) Trabalhos anteriores sobre as caracteristicas das sequências necessárias para o auto-processamento (Price, J.V., et al. (1985) Nucleic Acid. Res. 13:1871) mostram que essas caracteristicas podem ser examinadas, como é indicado na referência, efectuando inserções e cortes para obter outras IVS ARNs capazes de auto-processamento. De forma semelhante, poderíamos alterar a L-19 IVS ARN para obter toda uma série de moléculas de endorrribonuclease com especificidade dirigida a várias sequências do ARN. Assim, Price et al concluíram que são necessárias três' regiões para o auto-processamento da IVS. Experiências semelhantes poderiam revelar as porções da L-19 IVS ARN necessárias para a sua actividade como endorribonuclease. Burke, J.M. et al., (1386) Cell 45:167-176, mostram o papel dos elementos conservados para o auto-processamento da IVS; esse trabalho mostra uma utilização adicional das experiências de mutagénese, no sentido de modificar sequências extremamente conservadas, com alteração consequente da actividade. Assim, e de maneira semelhante, a sequência da L-19 IVS ARN podia ser alterada com concomitante alteração na actividade, para originar toda uma série de endorribonucleases. 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex.- 89/07 20 25 30 62.077Ref: HJW/ttniversity Patents-RKA Ribozyme

Cech, T.R., et al. descobriram recentemente um troço ainda ruais pequeno da L-19 IVS ARN que apresenta actividade enzimática total e que inclui os nucleótidos '19-331 do ARN. Também foi verificado que o troço 21-331 é inteiramente activo. Construi- ilasmideos para produzir directaménte as cadeias das L-19 ’am- e L-21 IVS ARN. Neste caso o pr omotor 19 para -Ξι píOSÍçãtO Â1 â o ADN que codif i s i tua-se na posição 331 em vez da 414.

Been, M.D., and Cech, T.R.¢1986) Cell £7:207) demonstram, usando mu tagénese dirigi da, que a a1 te r ação na espe c i f i c idade apresentada pela poiimerase vai afectar a actividade da polimerase sobre o oligoCU). Assim, os peritos nesta arte podem utilizá-la prontamente para obter outras enzimas L-19 IVS ARIM activas. Waring, R.B. & Davies, ¢19814) Gene 28:277, apresentam uma classe de moléculas de IVS com estrutura semelhante. Este trabalho é semelhante ao de Cech, T.R., et al. ¢1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.3.A. 80:3903, descrevendo uma classe de IVS ARN presente nas mitoncôndrias de fungos. Verificou-se que algumas destas outras moléculas de IVS são auto-processadoras. Ί1 27:487? Kruoer, K.. et al. (1982)

(Cech , T. R. , et al. (1 98 1) ibid. 31 :i47; Ga r r iga, G Horst , g. , et al . (1 38 5) i: B i o 1. Ch em. 260 : 106 3 PS' der V een, D Λ* 1 \ . <t 'ma V ΰ 1 . - ib id traba lho desta i nv snçã O 40 35

10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62-077

Bef: MW/University Patents-KNA Ribozyme séries, ou de famílias inteiras de endorribonucleases derivadas da mesma ou de diferentes fontes naturais. Qs peritos nesta arte serão capazes de pesquisar a existência de outras enzimas de ARN a partir de fontes naturais várias.

De acordo com (Ceçh, st al. , PiMAS ¢1983), a Waring â Davies, supra), pode considerar-se que o sítio activo mínimo para a actividade da ribozima á fornecido pelos elementos na sequência do ARN a seguir descritos. Qs elementos A e B interagem um com o outro, tal como o 3L e o 2. Em muitas posições da sequência é permitida mais que uma base? mostram-se as substituições observadas colocando uma letra abaixo da base substituída. Por exemplo, na posição 1 do elemento de sequência A podem observar— se os nucleôtidos A e U, sendo A o mais comum. A C também chamado P) 1 2345678910 ;· 5’-A UGCUGGAAA | I U GAAAG U 1 i G 3L (também chamado R) N - qualquer, base5' -ucagaSãSSna U AG C ; B (também chamado Q) opc ionaloocional 5'-AAUCA(C)GCAGG U CUU C C ; Ctambém chamado S)

AAGAUAOSSEE. U G

com GACUA iquerda e com uÃGUC à direita, como está ío permitidas mudanças de bases compensai i Burke, et ai. í 1.3oo) Suara 41 35

Ref: HOW/Cniversity Patents-RKA RUbozyrtE

S ARN á mostrada em baixo. A codificação . da IVS ARN começa no local indicado pela seia e fribozima" L-13 estenda-se até ao final (6414).

Como é óbvio, no ARN os TT são 10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 • I t « G AM7 AG(JAT ATTT ACCTpTGGAuGGAÀAAGTTATGASGCATGCACCTCGT A 13 i1 (<•11 6C7AG7C7T7AAACCAA7AíiA77GCA7CGGTT7AAAAGGCAA<jACCSTCAAA 10Γ

I < t I I T7GCGGGAAAGGGG7 CMCAGCCG77CAGTACCAAGTCTCAfiSGSAAACT7T 157

eAGA7GGCCnfiCJUUk6BCTATBfiTMTAA6CT6AaGACATS5TCCTUtt W • I I I · t ACGCA£CCAAG7CC7MG7CAAGAGA7CT7CTSTTÍA7A7WATGCAG7tCA. líl ii li CWCTMA76TCeGTCeeeftUCAJÇ-eTATTCnCTCATAA«7A7MT 3(0

t I I I I I

Ctt1ACCTC7CCTTAAT6ÍKAôCTAâCtGA7GAAG7GA7GCAACACTíGAGCC JQ. 4: 35 1 . I < < «

$C7eGiAAC7M77TSTA7BCfiXUG7A7AT75tA7TAC7TTT6GASTArrCG 4TV 1 S2.077

Be£: RJW/University Patenfcs-HNA Ribozyne

2mt99C

5

Durante a discus são da L- 13 IVS ARN, a região da sequência do sitio activo que vai ser discutida do ponto de vista da actividade e das variantes é ct seguinte: U U Θ 6 A a a G 20 21 22 23 24 25 26 27 10 0 primeiro ribonucleótido da L-Í9 IVS ARN no terminal 5' 0H· é equivalente ao nucleótido 20 na L IVS ARN intacta. Quanto às posições 23, 24, 25, etc., estas são as posições 23, 24, 25 da L IVS ARN (como se as primeiras 13 posições estivessem presentes). Como o dC5 se liga ao L-19 IVS ARN (veja-se acima), é 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 provável que a endorribonuclease funcione sobre polímeros mistos de ARN e ADN. Por exemplo, a L-19 IVS ARN ligar-se-á ao troço de ADN, enquanto a enzima de ARN actua no troço de ARN do polímero misto. Alterações efectuadas no local de fixação de forma a fixar os outros nucleótidos poderão resultar em todo um conjunto de actividades sobre polímeros mistos, originadas por toda uma série de endorribonucleases deste tipo. Abreviações: IVS, sequência interveniente; L—13 IVS ARN (leia-se "L menós 19"), um ARN linear com 395 nucleótidos sem os 30 primeiros 19 nucleótidos da IVS; CHES, ácido 2-Cciclohexilamina) etanosulfónico; EDTA, ácido etilenodiaminotetracético; MES, á c i do2-(N-mo rfo1ino)-etanosu1f ôn i c o 5 Tris, trisChidfox i metil) aminoetano? p$, "'“p presente num oligonucieótido (por exemplo, CSpt é CpCpCpCpC C '"’^Ρ 1 -pCp ) . 35 43 1 1

Mpd. 71-10000 ex,- 89/07

15 20

(2.077 lie£: PJW/Dniversity Patents-SNA. Ribozynie PREPARAÇAQ DA ENZIMA - A L-19 IVS ARN pode ser sintetizada e

Durifiçada como é descrito por Zaug & Cech (1986) Science (Wash., 5 D.C.) 231:4.70—4.75 (.veja—se a descrição detalhada na Fig. 5).

Resumindo, o ARIM foi transcrito in vitro, do pSF‘TTlA3, com ARN-joIimerase do bacteriofago 8P6. (Em alternativa, o ARN pode ser transcrito do pT7-TTlÀ3 ou de qualquer dos plasmideos da série 10 sBG com ARN-polimerase do bacteriofago T7 in vitro). Os transcritos foram depois incubados para promover o auto-processamento e a ciclizaçSo da IVS ARN. 0 ARN foi subsequente-mente incubado na presença de MgC12 a pH=9.0 CcondiçSes favoráveis â hidrólise dirigida), para converter a IVS ARN circular à L-19 IVS ARN. A L-19 IVS ARN foi purificada por electroforese em gel de poliacrilamida e por cromatografia em Sephadex G-SO, A, concentração da enzima foi determinada espèctroscópicamente tomando um coeficiente de extinção molar de 3.26 X 10 fa M-l cm-1 a 260 nm.

Os plasmideos activos utilizados foram os seguintes: pSPTTlAS, pT7-TTlA3, pBGST7, pBG/-2G:23C, pBG/23C, pBG/-25

3G:24C, pBG/24C, pBG/-4G:25C, pBG/25C e pBG/23A4 e pT7L-21. A série de plasmideos PBG encontra-se descrita em Been, M. Si Cech, T.R. (1986) Cell 407;207. Por exemplo, os plasmideos pBG/3G:24C e pBG/24C produzem a variante 24C da L-19 IVS ARN, que efectua 30 clivagem a seguir â sequência de quatro bases CGGU do ARN. Esses plasmideos encontram-se guardados e estão disponíveis no

Departamento de Química e Bioquímica , Universidade do Colorado,

Boulder, Colorado 80309-0215. Qs exemplares, incluindo pBG 3T7 35 (ATCC 40288), pT7-TTlA3 CATCC 40290) e pBG/-3G:24C CATCC 40289) 44 1 1

62.077

Sef: aJW/Oniversxty Patents-RKA Rxbozyue foram depositados na Colecção de Culturas-tipo Americanas (American Type Culture Collection, (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20301, em 25 dé Novembro de 1386. 0 plasmídeo pT7L-21 origina a L-21 IVS ARN em que faltam as primeiras 21 bases. Este plasmídeo CATCC 40231) também foi depositado na ATCC em 2 de Dezembro de 1385.

#W PREFARAÇA0 DOS SUBSTRACTOS - os substractos C5p:£Cp e ASpíCp foram preparados a partir de C5-QH e de AS-QH» respectivamente, com ARN-ligase de T4 (New England Nuclear), p&Cp, e ATP. Os produtos foram purificados por electroforese em gel de poliacri-

Mod. 71-10000 ex. r 89/07 lamida a 20¾ e ureia 7 M, e por cromatograf ia em Sephadex G—25. 0 substracto C5p$ foi preparado a partir de CSp.tCp por tratamento com fosfatase do intestino de vitelo e eliminação beta (Winter & Brownlee, 1378 Nucieic Acid Res. 5:3129). 0 CSp não marcado foi 20 preparado de forma semelhante, usando pCp não marcado como doador na reacção da ligase. A concentração foi determinada por espectroscopia usando um. coeficiente de extinção molar de 30 % . 3 ..... ... ..... . . . ........ 10 M-l cm-1 a 270 nm. 25 30 PREPARAÇAO DE E-p# - Incubou-se L-13 IVS ARN não marcada (16 pmol) com CSp* 5.2 pmol em NaQAc 50 mM, pH 5.0 e MgC12 20 mM a 42° C durante 10 minutos. A reacção foi parada adicionando EDTA até atingir a concentração de 40 mM. A espécie E-p£ foi purificada (separada) do C5p$ que não reagiu por cromatograf ia em coluna com Sephadex G-100-120, préviamente equilibrada com Tris-HC1 0.01 M pH 7.5, NaCl 0.25 M, e EDTA 0.001 M. As fracçSes que continham o complexo E-pf. foram juntas e fez-se precipitar com 3 45 35 10 15

Mod. 71 -10 000 ex. · 89/07 20 25 30

«2.077

Ref: Rjw/Oniversity Patents-BKA Ribozyme volumes de et.anol. 0 precipitado depois de seco foi então dissolvido em H20. ondiçges Standard para a reaccão da nucleotidi1-transferase 0 substracto oligorribonucleótido (por exemplo, pCS 10-100 jM) é incubado com ribozima (por exemplo L-19 IVS ARN 0.1-2.0 jM) a 42° C em MgC12 20 mM e Tris 50 mH pH 7.5, durante uma hora.

Pndicftes Standard para a t-ransfosforilase 0 substracto ARN fosforilado em 3' (por exemplo, C5p 2.5 uM) â incubado com ribozima (por exemplo L-13 IVS ARN 0.1 uM) e com jm oligonucleótido aceitante (por exemplo, UpCpU “200 uM) a 42° C sm MgC12 20 mM e MES 50 mM pH 6.0, durante 3 horas.

Condições Standard para a fosfatase ácida Q substracto ARN .fosforilado em 3' (por exemplo, C5p 2.5 uM) é incubado com ribozima em concentaçãó equimolar (por exemplo L-13 IVS ARN 2.5 uM) a 42° C em MgC12 20 mM e NaC2H302 (acetato de sódio) 50 mM pH 5.0, durante 24 horas.

Reaccbes Standard da endorr ibonuc1ease 0 substracto ARN é pré-tratado com glioxal de acordo com o processo descrito por Carmichael and McMaster (1380) Meth. in Enzymol. 65:380-331, precipitado com etanol, e o precipitado é aglut-inado por centrifugação numa centrífuga de eppendorf. 0 aglutinado (pellet) é seco e o ARN é ressuspenso em água. Q substracto ARN glioxilado.(0.2 uM) é incubado com ribozima (por exemplo, L—13 IVS—beta ARN 0.2 uM) a 50° C em MgC12 10 mM, NaCl 10 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7.5, ΘΤΡ 0.5 mM ureia 2.5 M, durante uma hora. 46 35 52.077 Ref: SJW/University Paterxts-RNA Ribozyrre

Paragem das reaccSes e anàlise dos produtos

Em todos os casos as reacç8es foram paradas por adição de 5 EDTA até ser atingida a concentração de 25 mM. Qs produtos podem ser analisados por electroforese em gel de poliacrilamida a 20¾ e ureia 7.0 M (gel de sequenciação Standard). Qs produtos podem ser localizados por auto-radiografia se forem usados substractos 10 32_ ARN marcados com P. □s exemplos seguintes e as condiç8es Standard precedentes servem para ilustrar a invenção, mas não para a limitar. 15

Mod. 7Ϊ-10000 ex.-89/07 20 25 30

Exemplo I

Clivagem dirigida em ARNs de grandes dimensães : A enzima L-19 IVS ARN foi preparada por incubação do pré-rARN sob condiç8es que promovem o auto-processamento, a ciclização e a hidrólise dirigida,CZaug, A.J. , et al. (1984) Science 224:574; 2aug, A.J., et al. (1386) Science 231:470). A guanosina terminal 3' CG414) foi então removida da L-19 IVS ARN por oxidação com peviodato seguida de eliminação beta (Winter, G. , et al. (1378) Nucleic Acids Res. 5:3129-3139). Tal como era esperado, a ribozima resultante CL-19 IVS-beta) tem a actividade como nucleotidil-transferase grandemente reduzida , o que foi avaliado usando C^Pl-pCC)5 como substract-o. Quando se adicionou GTP, contudo, a ribozima foi capaz de efectuar clivagem no p(C)5 bem como em grandes moléculas de ARN. Por exemplo, o transcrito pAKlOS (504 nt) íMount, S.M., et al. (1983) Cell 33:509-518), um fragmento do pré-ARN da beta-globina do rato que contém o primeiro intrão, sofreu clivagem dando origem a fragmentos 47 35 1

I

1 I

62.077

Bef: Rjw/Oniversity Patents-RNA. Ribozyme principais com 14-8, 360 e 464 nt, bem como a alguns fragmentos secundários (Fig. 2a). Como se mostra adiante, os fragmentos com 5 360 e 148 nt seriam os produtos da clivagem em 3' e 5' na posição 360. 0 fragmento com 464 nt é o produto da clivagem em 3' na posição 44, sendo o produto (com 44 nt) da clivagem em 5" demasiado pequeno para ser observado. A ausência de um ARN com 10 316 nt, que seria previsto devido à clivagem nas duas posições 44 a 360, como produto principal, ê indicativa de digestão parcial em que poucas moléculas sofrem clivagem mais do que uma vez. 15

Mpd. 7Ϊ-10000 ex. - 80/07 20 25 30

A clivagem exigiu o ião magnésio (concentração óptima de MgC12 entre 10 e 20 mM), e era essencialmente independente do catião monovalente na gama de 0 a 200 mM NaCl. 0 pH óptimo estava compreendido entre 7.5 e 8.0, e a temperatura óptima era de aproximadamente 50° C. Apesar da L-19 IVS ARN com eliminação beta ser capaz de Catalisar a reacção de clivagem, a remoção da G414 da ribozima não é necessária para a actividade de clivagem. A enzima funcionava com a mesma velocidade quer a G414 tivesse sido removida, quer não. Explicamos a actividade da L-19 IVS ARN intacta postulando que, a concentrações saturantes de STP, o ataque ao substracto pelo GTP compete muito eficientemente com o ataque pela <3414. Fazemos notar que a IVS ARN e a L-19 IVS ARN se encontram isentas de proteína. A L-13 IV8 ARN é portanto uma enzima composta por ARN isenta de proteína (ou ribozima). A L-19 IVS ARN e outras similares funcionam também como enzimas na ausência de proteínas. Isto aplica-se tanto às proteínas endógenas como às exógenas. Isto é evidenciado pela manutenção da actividade 48

Moa. 71-10000 ex.-.89/07

©.077

Bef: BJW/University Patents-BNA Ribozyme quando as ribozimas são sujeitas à actividade de proteases, à ebulição ou ao dodecilsulfato de sódio. Qualquer resíduo de ARN-polimerase proteica proveniente do sistema de transcrição utilizado para produzir a IVS ARN é removido por extracção com fenol. A capacidade de produzir a IVS ARN num sistema completamente definido e de remover a ARN-polimerase por extracção com fenol é uma evidência adicional na natureza não proteica da reacção.

Exemplo II

Produtos de clivagem marcados 3·?

Quando a Calfa-’ "‘"PI STP foi incluída na reacção do ARN de pAK105.de forma análoga à do exemplo I, os produtos de clivagem com 148 e 464 nt encontravam-se marcados íFig. 2b). A sequenciação directa destes fragmentos de ARN marcados (e.g., Fig. 2c) mostrou que a clivagem e a adição de GTP ocorrem nos nucleótidos 44 e 360 da sequência, pelo que os produtos de clivagem a jusante se encontram marcados com GTP 5'. As ligaçdes formadas pela adição do GTP são sensíveis à RNase Tl, confirmando que o GTP foi adicionado covalentemente através do seu 0-3' por uma ligação fosfodiéster normal 3-5'' . A reacção do ARN C841 nt) pT7-l (Xmn 1), (essencialmente sequências pBR322> produziu quatro fragmentos marcados principais. Estes foram sequenciados de maneira análoga. No caso do ARN pT7-l com 122 nt adicionais no seu terminal 3', produzido pela transcrição do ADN pT7-i que sofrera corte no local Sca I, ocorreu o aumento esperado nos pesos moleculares dos produtos marcados. Em todas as reacçSes, 49 1 5 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30

35 ©.077 Bef: MW/Oniversity Patents-BNA Riboaçme

Incluindo aquelas em que o substracto ARN foi omitido, a L-19 IVS 2|RN ficou marcada, talvez devido à reacção de permuta de guanosina, proposta alhures CZaug, A.J. , et al. C198S) Science 229:1060-1064; Price, J.V., et al. ¢1987) J. Mol, Biol., a ser impresso). Os locais de auto-marcação eram heterogéneos.

Exemplo III

Avaliação da especificidade A sequência próxima do terminal 5" de cada produto marcado no terminal (veja-se o exemplo II) foi comparada â sequência conhecida do ARN para identificar o nucleótido que precede o local da clivagem. Os resultados encontram-se resumidos na tabela 1. Tanto os locais de clivagem principais como os secundários são precedidos por.quatro pirimidinas, sendo a sequência CUCU a que é consensual. Esta é exactamente a sequência tetranucleoti-dica que se previa ser um alvo óptimo para a ribozima. A importância dos nucleótidos nas posiçóes -5 e -6 relativamente ao local de clivagem ainda .não é clara, embora a ausência, de resíduos Θ possa ser significativa. Não parecem existir preferências em relação à sequência a jusante do local de clivagem, estando todos os quatro nucleótidos representados na posição +1. Quando se avalia a especificidade, é também necessário considerar os locais de clivagem potencial no ARN que não sofreram clivagem pela ribozima. No caso do ARN pAK105, existia apenas um local CUCU em que não se observou clivagem. CA clivagem neste local iria produzir um ARN de 378 nt marcado.) Por outro 50

52.077

Bef: MW/University Patents-RKA Ribozyme lado, muitos locais que se assemelham a CUCU em 3 das 4 posições também não sofreram clivagem. Estes incluem 17 sequências CUMU Conde M 4 C) e 7 sequências GNCU Conde N 4 U). No ARN pT7-l, a clivagem foi observada em ambas as sequências CUCU presentes. Assim, a ribozima tem uma forte preferência para efectuar a clivagem a seguir ao tetranucleótido CUCU. 10

Exemplo IV

Clivagem em regiões do ARN com emparelhamento de bases e estrutura secundária: 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 0 ARN Ml, a subunidade ARN da RNase P da E.coli CReed, R.E., et al. C1982) Cell 30:627-636), não sofreu clivagem pela L-13 IVS ARN-beta em condições reaccionais Standard CFig. 2b). 0 ARN Ml contém a sequência UCCUCU, que deveria ser um excelente local para a clivagem. Contudo, esta sequência está inserida numa estrutura secundária em gancho Chairpin stem) estável CGuerrier--Takada, C., et al. <1984) Biochemistry 23:6327-6334j Pace, N.R., et al. C1985) Qrig. of Life 16:97-116), o que provávelmente a torna indisponível para actuar como substracto. Verificámos que a desnaturação do ARN Ml com glioxal permitia uma clivagem eficiente nesse local pela L-19 IVS ARN, o que apoia a interpretação de que a estrutura secundária do ARN pode inibir a clivagem. Q procedimento Ccom glioxal) utilizado para a desnaturação foi feito de acordo com Carmichael, G.G., et al. <1980) Meth. in Enzymol. 65:380-391. 51 35 1 1

5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 52.077

Bef: RJW/University Patenfcs-BNA Eibõzyme

Exemplo V

As mutações no sitio"activo alteram a especificidade em relação ao substracto

Em seguida foi estudada a especificidade em relação ao substracto, num sistema controlado onde podíamos ter a certeza de que a estrutura secundária do substracto ARN nSo afectava a reacção de clivagem. Os substractos oligorribonucleótido foram sintetizados pelo método de transcrição com ARN-polimerase do fago T7 desenvolvido por Ulhenbeck e colaboradores (Lowary, P., et- al. ¢1386) ΝΑΤΟ A8I Series, vol. 110, 63-76) (Fig.Sar). Um dos substractos apresentava um emparelhamento perfeito com sequência-consenso tetránucleotidica. Outros dois substractos tinham substituições numa única base, com emparelhamentos de 3-em-4 em relação à sequência-consenso.

Estes substractos foram testados com a L-19. IVS ARN selvagem e com duas ribozimas alteradas (Been, M.D. and Cech, T.R. , (1386)

Cell 47, 207-216). As duas variantes tem alterações numa única base no local de fixação 5' do exão, o que altera a 25 especificidade em relação à sequência no primeiro passo do auto-processamento do pré-ARN CBeen, M.D., et al. , suor a.) A variante 23C (com S convertida a C na posição 23 da L-19 IVS ARN) deveria reconhecer os substractos CUSU, e a variante 24C (A convertida a 30 C na posição 24) deveria reconhecer os CGCU (Fig. 3b). Durante estes estudos, verificámos que a adição à reacção de ureia 2.5 íl ou de formamida a 15% aumentava considerávelmente a especificidade, permitindo a cada ribozima distinguir substractos com uma única mudança de base na sequência de reconhecimento. 0 52 1 1 5 10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 3.077 5e£: RDW/Dniversity Patents-RNA Ribozyite modelo por nós admitido é o de que estes desnaturantes desestabi-lizam o emparelhamento das bases entre o substracto e os nucleótidos que constituem o sitio activo da ribozima, discriminando dessa forma os complexos mal emparelhados. Qs resultados do tratamento dos três substractos com cada uma das t-rês ribozimas na presença dê ureia 2.5 M encontram—se apresentados na Fig. 3c. Cada substracto sofre clivagem exclusivamente pela ribozima que tem capacidade para formar um complexo enzima-substracto .com emparelhamento perfeito das bases £Fig. 3b). Assim» admite-se que o sitio activo possa ser manipulado de forma a reconhecer qualquer sequência de bases, desde que esta seja do tipo XYZU, onde X, Y, e Z podem ser qualquer das quatro bases A,U,C,S e os nucleótidos contidos na sequência de quatro bases podem ser iguais ou diferentes.

Quando se incubaram ribozimas variantes com o ARN C504 nt> pAKlOS, cada ribozima originou um padrão diferente de produtos de clivagem. Um dos locais de clivagem mais importante foi localizado e caracterizado em três ribozimas variantes, incluindo a variante 25C C6 convertido a C na posição 25). Qs locais clivados pelas ribozimas 23C, 24.C e 25C são precedidos por CCCCUGU, UCUGCU e CUSUCU, respectivamentep as bases sublinhadas são as que formam ligaçSes G.C com o nucleótido mudado na ribozima variante. Cada uma dest-âs sequências pode formar 6 pares de bases seguidos com os nucleótidos do sitio activo da ribozima variante. Estes resultados iniciais são prometedores, embora seja necessário sequenciar rnais locais de clivagem antes de se poder avaliar correctamente a especificidade. 53 35

/ $2.077

Ref: RJW/UniversitY Patents-RKa. Ribozyite 5

Exemp1ο V Γ A c1ivagem catalítica 10 15 A variação da clivagem no substracto oligonucleótido G G C C C: U C U :¾ A A A A A Conde o asterisco indica o local de clivagem) pela ribozima selvagem em ordem ao tempo é apresentada na Fig. 4a. A reacção de suhsiracto 2.S uH com ribozima 0.2 uM está 66% completa em 90 minutos. Assim, é óbvio que a ribozima actua catalíticamente.

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 A velocidade da reacção foi determinada para uma série de concentrações de substracto. A cinética é adequadamente descrita pela lei de velocidades de Michaelis-Menten. A dependência da velocidade da concentração de GIF’ é apresentada na Fig. 4b, sob a forma de um gráfico de Lineweaver-Burk. Q Km para o GTP é 44 uM. A dependência da velocidade da concentração de substracto ARN a concentrações saturantes de GTP encontr-se apresentada na Fig. 4C. 0 Km para este substracto oligorribinucleótido é 0.8 uM, e o kçat é 0..13. min-1... Assim, sob condições de Vmax a enzima recomeça o seu ciclo catalítico cerca de 8 vezes por hora.

Exemplo VII Na ausência de ureia e formaldeido, as mudanças de uma única 30 base na sequência de três nucleótidos do substracto ARN que precedem o local de clivagem com a ribozima ARN, dando um complexo substracto-ribozima mal emparelhado, aumentam a velocidade da clivagem com a endorribonuclease. Qs substractos 35 mal emparelhados apresentam um aumento até 100 vezes no valor de 54 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 25 62.077Bef: RJW/Oniversity Patents-RKA Rxbozyme

kcat e, em alguns casos, de kcat/Km. Um mau emparelhamento Introduzido por mudança de um nucleótido no sitio activo da ribozima tem um efeito semelhante. A adição de ureia 2.5 ΙΊ ou de formamida 3.8 M, ou a diminuição da concentração do ião metálico divalente de 10 para 2 mM inverte a especificidade em relação ao substracto, permitindo á enzima discriminar o substracto mal emparelhado. 0 efeito da ureia é o de diminuir o kcat·/ Km para a clivagem do substracto mal emparelhado! o Km não é significativa-mente afectado em ureia de 0 a 2.5 ΙΊ. Assim, a desestabi 1 ização progressiva da ligação ribozima-substfacto por maus emparelhamen-tos ou por adição de desnaturantes como a ureia, aumenta inicialmente a velocidade de clivagem até se atingir um valor óptimo, e depois faz diminuir essa velocidade. A ribozima, e as variantes com especificidade alterada em relação à sequência, dão origem a uma série de endorribonucleases com especificidade dirigida a determinadas sequências, que podem ser reagentes úteis para vários estudos da biologia molecular do ARN. 30 - Materiais. Os nucleósido trifosfatados não marcados foram adquiridos à "P - L Biochemicals", os nucleósido trifosfatados marcados à "New England Nuclear", a fosfatase de intestino de vitelo à" New England Nuclear", a polinucleòtido-cinase do T4 ao "United States Biochemicals", e as endonucleases de restrição aos "New England Biolabs". A ARN-polimerase de T7 foi isolada da estirpe BL.21 da escherichia coli contendo o plasmideo pAR1213 (Davanloo et al., (1384) Proc. IMatl. Acad. Sei. USA 81:2035— -2033). 55 35 1 52-077

Bef: RJW/Ohiversity Patents-HNA. RLbozyme 5 - Preparação da L-21 Sca I ARN. 0 plasmideo pT7L~21 foi cortado com endonuclease de restrição Seal, extraído com fenol e clorofórmio, precipitado com etanol, e depois ressuspenso em H2Q de forma a ter uma concentração de 1 ug/uL. A transcrição foi

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 efectuada em 2 ml de Tris-HCl 40 mM pH=7.5, MgC12 12 mM, DTT 10 10 mM, espermidina 4 mM, 1 'mM em cada nucleósido trifosfatado, 10 ug/rnL em plasmideo linearizado, e 200 unidades de ARN-polimerase de T7/uq de ADN. A incubação foi feita durante 1 h a.37° C. Os produtos foram precipitados em etanol e purificados por 1g electroforese em gel de poliacrilamidar a 4¾ e ureia 8 Μ. A L-21 Seal ARN foi detectada por iluminação com UV, retirada, e eluida ídurante a noite) a 4o C em NaCl 250 mM, Tris-HCl 10 mM pH=7.5 e EDTA 1 mM. 0 gel foi removido por centrifugação. 0 ARN foi precipitado em etanol, e submetido a cromatografia numa coluna de Sephadex Q-fíO equilibrada em NaCl 250 mM, Tris-HCl 10 mM pH=7.5 e EDTA 1 mM. As fracçSes que continham ARN foram juntas e precipitadas em etanol. 0 precipitado foi lavado com etanol a

70%. seco, e ressuspenso em H2Q. A concentração da L-21 Seal ARN 25 30 foi determinada por espectofotometria. 0 coeficiente de extinção

G (E 2S0nm = 3.2 X 10 M-l cm-1) foi determinado tomando uma amostra de L-21 Seal ARN CA260nm = 0.534), submendo em seguida essa amostra a uma hidrólise completa com uma mistura de ribonucleases ΤΙ, T2 e A e tornando a medir a absorvância CA260nm = 0.753), e multiplicando a razão entre estas absorvâncias pelo coeficiente de extinção calculado para uma mistura de nucleótidos livres com proporç5es análogas âs que ocorrem na L—21 Seal ARN. 56 35 1 1

0s 10 15

Mod. 71-10000 ex.-89/07 25 62.077

Bef: RJW/University Patenfcs-BKÁ RLbozyme Síntese dos substrac tos· oligorribonucleótido. oligorribonucleòtidos foram produzidos por transcrição de sequências-moIde de AON sintético como é descrito por Lowary et al. NATO ASI ser, ser A 110:63-76 (1986) e Milligan et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8783. As soluçSes dos transcritos (2 mL) continham MgC12 12 mM, Tris-HCl 40 rnM pH=7\5, DTT 10 mM, espermidina 4 mM, 2 mM em cada nucleósido trifosfatado, í.S uM em ADN promotor (cadeia superior, top strand), '1.5 uM em ADN promotor sequência-moIde (cadeia inferior, bottom strand), e 100.000 unidades/mL de ARN-ρο1i merase de T7. (Os deoxioligonucleòtidos das cadeias superior e inferior foram sintetizados num sintetizador de ADN 380B da "Applied Biosystems", desprotegidos, precipitados em etanol e utilizados sem serem mais purificados). A incubação foi feita durante 2 horas a 37° C. Qs produtos foram precipitados em etanol e purificados por electroforese em gel de poliacrilamida a 20¾ e ureia 7 Μ. A purificação continuou como foi descrito para a L-21 Seal ARN, excepto que a cromat-ografia foi feita numa coluna de Sephadex Θ—25.

Marcação dos oligorribonucleòtidos. 0 oligonucleótido purificado (100 pM) foi incubado com 8 unidades de fosfatase de

intestino de vitelo em 100 uL de H20 a 37° C durante 1 hora. A 30 solução foi extraída com fenol e éter e deixada evaporar até â secura. A marcação no terminal 5" foi conseguida utilizando polinucleótido-cinase de T4 e Cgama-32P] ATP, □ ARN marcado foi purificado por electroforese em gel (sequenciador) de poliacrila-35 rnida a 20¾ e ureia 7 M, visualizado por auto-radiografia, 57 1 1 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

€2.077

Ie£: BJW/University Patents-HNR. Ribozyire retirado, e ei ui do corno foi acima descrito. - Determinação da velocidade inicial. As reacções (30 uL ) continham L-21 Seal ARN 0.01 uM, STP SOO uM, MgC12 10 mH, Tris-HC1 50 rnM pH=7.5, e uma mistura de substractos não marcados e marcados no terminal 5'' com concentrações que variavam entre 0.1 e 4.0 uil. As reacções foram iniciadas por adição de MgC12 e prosseguiram a 50° C. Foram removidas porções de 3uL a intervalos de tempos entre 1 e 120 minutos e a reacção foi parada por adição de uma mistura que continha 100 mM EDTA. As amostras foram submetidas a electroforese em gel de poliacrilami-da a 20% e ureia 7ΙΊ. As bandas foram visualizadas por auto-radiografia, cortadas do gel, e quantificadas por contagem num flúor baseado em tolueno, num contador de cintilações Beckman LS7000, As velocidades iniciais foram determinadas como foi descrito por Bass an Cech 11984) Nature CLondon) 308:820. - Aumento da especificidade da clivagem na presença de ureia e formamida. ' Um' substracto 'oiigorribonucleótido contendo -a sequência de reconhecimento CUCU foi incubado com a L-19 IVSbeta ARN selvagem ou, alternativamente, com a ribozima variante 24C. Como se mostra na Fig. 17a, ambas as ribozimas efectuaram clivagem no mesmo local do substracto. Já se tinha mostrado que o local de clivagem sê encontra imediatamente a seguir à sequência de reconhecimento (Zaug et al., 11986) Nature (London) 324:429). Na ausência de ureia, a velocidade de clivagem é realmente maior com a ribozima variante do que com a ribozima selvagem, apesar da ribozima variante não poder formar um complexo enzima-substracto totalmente emparelhado. A medida que 58 1 1 10

Mod. 71 -10 OOO ex. - 89/07 20 25 52.077

Bef: RjW/Quversity Patents-ENA. Rlbozyme se aumentou a concentração de ureia, a velocidade .de clivagem :om a ribozima da variante 24 C diminuiu continuamente, enquanto a velocidade de clivagem com a ribozima nativa se manteve aproximadamente constante para concentrações de ureia entre 0 e 2 Ί. Assim, quando a ureia apresenta uma concentrações de cerca- de 2 M, existe uma discriminação óptima entre os substractos que formavam complexos ribozima-substacto bem e mal emparelhados CFiguras 17 e 18).

Um substracto oligorribonucleõtido contendo uma sequência CSCU foi incubado com as duas ribozimas de forma semelhante à. descrita. Neste caso, esperava—se que a ribozima nativa originasse um complexo enzima-substracto mal emparelhado, enquanto a variante 24C se emparelharia perfeitamente ao substracto. Como se mostra na Fig. 17b, a velocidade de clivagem pela ribozima nativa diminuiu contínuamente com o aumento de concentração de ureia, enquanto a velocidade- de clivagem pela variante 24C aumentou e depois mantave-se constante até a ureia atingir a concentração de 3 M, a concentração mais alta que foi testada. Qbteve-se uma boa discriminação entre os substractos bem e mal emparelhados na extensa gama de concentrações de ureia entre 1.5 e 3 M.

Um desnaturante do ARN diferente, a formamida, também afectou a especificidade da clivagem no substracto contendo CSCU. Como se mostra na Fig. 17c, a velocidade da clivagem pela ribozima selvagem diminui com o aumento de concentração de formamida, enquanto a velocidade de clivagem pela variante 24C aumenta a depois diminuí para concentrações de formamida 59 35 1 1 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20

S2.077

Bef: RJW/University Patents-RKA Ribozyme superiores a 5 Μ. A clivagem óptima pela variante 24C foi obtida entre 2 e 4 M. Assim, a dependência da velocidade de clivagem com a concentração de desnaturante è semelhante para os dois desnaturantes e no caso das duas enzimas, tendo a formamida 2.5 M o mesmo efeito que a ureia 1.5 M. Os efeitos relativos da ureia e da formamida são consistentes com a sua acção como desestabili— zantes de duplexes de ARN. Estudos utilizando ADN mostraram que a formamida 2.5 M ¢40¾ v/v) é aprox.' tão desestabi 1 izante como a ureia 2.1 M (Lerman et al. , ¢1384) Annu. Rev. Biophy. Bioeng. 13:333)5 espera-se que este efeito seja um pouco diferente para os duplexes ARN-ADN (.veja-se a discussão por Casey and Davidson (.1377) Nucleic Acíds. Res. Res. .4:1533). - Síntese da ribozima por transcri.ção direct-a. A L-19 IVSbeta ARN utilizada como ribozima nas experiências acima descritas foi feita por transcrição ín vitro do pré-ARN seguida por uma cascata de auto~reacç5es mediadas pela estrutura tridimensional nativa da IVS: o processamento, a ciclização da IVS cortada e a hidrólise dirigida na junção de ciclização (!Zaug et al., ¢1384) Science 224:574). A L-13 IVS ARN foi então purificada dos exPes ligados e de outros produtos das reacçPes, e a sua guanosina terminal 3' foi removida por oxidação com periodato e eliminação beta para dar a L-13 IVSbeta ARN. Para facilitar a síntese de grandes quantidades de ribozima, construíu-se um plasmideo <Figura 13) de forma a que o produto inicial da transcrição fosse a própria ribozima act-iva, sem necessidade de mais auto-processamento. Um promotor do fago T7 foi justaposto ao ADN que codifica o nucleótido 22 da IVS, para 60 5 5 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 30

52.077

Baf: BJW/Oniversity Patents-BNA Rtbozyms que a sequência GGAG6G do sitio activo englobasse os nucleótidos 1 a 6 do. transcrito.. A iruncagem do plasmideo com endonuclease de restrição Seal e a transcrição com ARN-polimerase pura do fago T7 CDavanloo et al, 1984 supra) dá origem à L-21 Seal ARN. A transcrição das cadeias-molde lineares de ADM pela ARN-pol imer ase de T7 produz frequentemente ARN com um ou mais nucleótidos adicionais no seu terminal 3, para além dos especificados pela càdeia-molde CLowary et al. , 1986? Millingan et al. 13S75. 0 terminal 3" da L-19 IVS ARN foi analisada por marcação deste terminal com C32P3pCp e ARN-ligase, seguida por uma digestão completa com RNase de T2 e análise dos produtos nucleôsido fosfatados em 3' por cromatografia em camada fina. 0 marcador distribuiu-se da seguinte maneira: 47% C, 32% U, 9% Θ, 12% A. (considerando a cadeia-moIde, o último nucleôsido previsto deveria ser um U). Assim, embora a L-21 Seal ARN pareça ser homogénea quando é analisada por electroforese em gel de poliacrilamida a 4%, tem da facto um terminal 3" heterogéneo. A L-21 Seal ARN difere da L-19 IVSbeta ARN por ter dois nucleótidos a menos no seu terminal 5' e aprox. 3-4 nucleótidos a menos no seu terminal 3". A actividade destas duas ribozimas é semelhante. Por exemplo, com um subst-racto GGCCCUCUA5 em condiçóes reaccionais Standard, a L-21 Seal ARN tem kcat/Km = 0.2' min-1 uM-l (tabela 3), comparável aos valores de kcat/Km (entre 0,05 e 0.16 min—1 uM—1) determinados para a L—19 IVSbeta ARN (Figura 4b, c de Zaug et al.(1386)). - Análise cinét-ica da c 1 ivagem de o 1 igorribonuc 1 eótidos na ausência de ureia. Mostrámos que. na ausência dê ureia, certos 61 35 52.077

Bef: RJW/University Patents-BNA Ribozyme substractos sofriam uma clivagem mais rápida por uma ribozima que forma um complexo enzima-substracto mal emparelhado, do que por uma ribozima com complementaridade perfeita com o substracto (Figura 17). Mostramos agora que se observa o mesmo comportamento na clivagem quando o mau emparalhamento é introduzido por 10 variação da sequência do substracto, enquanto a da ribozima se mantém c onstante.

Mod. 71-10000 ex. - 89/07

Preparámos uma série de substractos pTGGCCCNCU AS, em que p# indica o fosfato radioactivo marcado, e N = C, A, Θ e U, e incubámo-los com L-21 Seal ARN na presença de GTP 0.5 mM. Mos casos de M = A, Ge U, o único produto marcado foi um octanucleó-

tido, com o tamanho previsto supondo a clivagem no sitio indicado pela seta vertical. No caso de N * C, a clivagem inicial ocorreu no mesmo local? mais tarde durante a reacção, o octanucleótido sofreu nova clivagem, originando um heptanucleótido, o que indica a existência de clivagem secundária a seguir aos cinco resíduos C. □ valor do kcat da clivagem variava de um factor até 100 quando N era modificado: C > A * G·>> U (tabela-3). Qs valores de Km apresentam muito menor variabilidade. 0 substracto emparelhado (N - U) , e outros substract-os contendo pirimidina (N = C) , tem valores de Km ligeiramente mais baixos que os dois substractos que se esperaria que formassem maus emparelhament-os purina-pufina com a ribozima. Também estudámos a série de substractos p$GGCuc 1MCU-AS, em que N = C, A, Q e U. Em todos os Casos a clivagem ocorreu predominantemente na posição indicada pela seta. Q kcat da clivagem variou de um factor até 50 quando N foi modificado? a ordem C > A ~ G > U é idêntica á obtida para a série pJfcGGCCCNCUAS (tabela 31. 0 Km variou segundo a ordem C > A 62 2Z 'm iQÇih/

<8.077

Bef: RJW/umversity Patents-RNS. Rlbozyme > G >> U, semelhante à do kcat·, 10 15

Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 E útil comparar cada substracto que contém um C na posição -S (primeiras quatro linhas da tabela 33 com o substracto correspondente que contem um U na posição -5 (últimas quatro linhas da tabela 33. Q kcat para cada substracto GGCCCNCUA5 é sempre semelhante ao obtido para o correspondente substracto GGCUCNCUAS; a maioria das comparações mostram uma diferença de valores inferior a duas vezes, o que não é considerado significativo. Os Km para os dois substractos com N= U (um nuc leótido emparelhado na posição -33 não foram significativamente diferentes. Nos casos em que houve um nucleótido mal emparelhado na posição -3 C N = C, A ou G3, o Km foi significativamente mais baixo quando existia um C na posição —5 do que quando existia um U na posição -5. De acordo com o nosso modelo (Figura 13. um C na posição -5 origina a formação de um par de bases G-C com a ribozima , enquanto um U formaria um par de bases G-U vacilante. ..... — Análise cinética da clivagem na· presença- de ureia.· 0 25 efeito da ureia na clivagem foi estudado com algum detalhe usando p$GGCCCGCUA5, um substracto cuja clivagem pela ribozima selvagem se previa ser fortemente inibida a concentrações de ureia mais elevadas (Figura 17b) . Corão se mostra na Figura 20 e na tabela 4, 30 a presença de ureia em concentrações baixas aumentava ligeiramente a clivagem pelo L-21 Seal ARN, enquanto a ureia 2.0 e 2.S M inibia a clivagem, como o previsto. Qs efeitos foram devidos na sua quase totalidade a variações no kcat, mantendo-se o Km 35 constante com o valor de 0.5 +/- 0.2 uM. Este não é o resultado esperado se se considerar que o Km representa simplesmente a 53 1 é2.077 I ef: RJW/Otaiversity Pateots-RNA Ribozyme

L aumentasse o valor de Km.

Determinou-se o efeito da ureia nas velocidades iniciais com

:iara que as velocidades medidas se aproximassem de Vmax. CA concentração de substracto foi inferior a Km' para dois substracto, GGCUCíCG) CUA;. (os nucleót-idos ent-re parêntesis

Mod. 71 -10000 βχ. - 89/07 15 correspondem a substrâctos alternativos) pelo que as velocidades de clivagem para estes substrâctos subestimam o Vmax.3 Os substrâctos podem ser divididos em três grupos, com base na resposta da respectiva. velocidade de clivagem à presença de 20 ureia. Os substrâctos SGCUCCC6)CUAg (mal emparelhados na posição-3 e com emparelhamento de bases vacilante na posição -5) apresentam um aumento na velocidade de clivagem a concentrações baixas de ureia, seguido por uma diminuição quando a ureia está a 25 1 M. Os substrâctos CGGCCCCGOCU^ (emparelhados na posição -3 e emparelhados com ligações G-U ou G-C na posição -5) apresentam um aumento na velocidade de clivagem com o aumento da concentração de ureia em toda a gama de valores testada. □ mais bem emparelhado destes dois substracto, G6CCCCUCUA5, apresentou pouca

wU alteração na velocidade de clivagem a concentrações de ureia compreendidas entre 0 e 1.5 Μ, o que é consistente com os resultados préviamente obtidos com o mesmo substracto e a ribozima L-19 IVSbeta (Figura .18, círculos a cheio). S4 35 1 1

5 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 52.077

Sef: RJW/University Patents-SNA Rzbozyme - Clivagem em excesso de ribozima. Para testar se o aumento de velocidade do subst-racto _ mal emparelhado persistia em condições em que. se dava um único ciclo catalítico, GGCCCGCUA5 e GGCCCUCUAg Í0.05 uM) foram tratados com L-21 Seal ARN 20 vezes em excesso Cl.00 uil), na ausência de ureia. A clivagem do subst-racto mal emparelhado foi mais rápida que a clivagem do subst-racto bem emparelhado. Apesar da clivagem do substracto mal emparelhado ocorrer demasiado depressa pára ser obtida uma velocidade fiável, essa velocidade foi pelo menos 8 vezes maior que a determinada para o substracto emparelhado. A partir dos valores de kcai e Km apresentados na tabela 3, previa—se uma diferença de velocidades da ordem das 23 vezes , usando a equação V0 - kcat CE03 í801/ (Km + CE03) para a reaeção em excesso de enzima. Assim, os resultados desta experiência não forneceram indicação dê um passo limit-ante da velocidade anteriormente não datectado. Contudo, os resultados não permitem pôr de parte s possibilidade de alguma da diferença de velocidades verificada com os substractos bem e mal emparelhados ser devida a diferentes velocidades de libertação dos produtos.

- Clivagem em função da concentração de iões divalentes. A ureia e a formamida, ambas desestabi1iZadoras dos duplexes de ARN. permitem á ribozima discriminar negativamente os substractos 30 mal emparelhados. Para testar a generalidade desta correlação, examinamos a clivagem de um substracto emparelhado CGGCCCUCUA5), e de um mal emparelhado CGGCCCGCUAg), pela L-21 Seal ARN, em função de concentrações decrescentes de Mg2+. As experiências 35 foram efectuadas na presença de ureia. A velocidade inicial da 65 1 1

52.077

Bef: RJW/University Patents-RKA Ribozyma clivagem do substracto mal emparelhado excedeu a do substracto emparelhado a concentrações de MgClZ entre 10 mM e 5 mM, mas a especificidade foi invertida a ligC12 1 mM. Outro conjunto de reacções foi efectuado na presença de CaC12 lmM, que diminui a necessidade em ião magnésio. Neste caso. a velocidade inicial de 10 clivagem d 3 substracto mal emparelhado excedeu a do substracto emparelhado a concentrações de iigC12 entre lOmM e 5 mM, e a especificid ade foi invertida a MgC12 2 mM e 1 mM. Assim, o abaixamento da concentração de iões c ii vai entes, que é outra

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 maneira de desestabilizar os duplexes de ARN, também permite à ribozima discriminar negativamente os substractos mal emparelha dos .

Focámos inicialmente a importância do emparelhamento das bases entre a ribozima e o seu substracto tanto para a especificidade em relação ao substracto, como para a catálise CZaug & Cech, C1986) Science 231:470 and Bipchemistry 28:4478; Been & Cech, Cell 1986; Zaug et al., Nature 1986). A actual descoberta de' que um mau emparelhamento'rto complexo ribozima-substracto pode de facto aumentar a velocidade de clivagem até 100 vezes, parece, à primeira vista, contradizer a importância do emparelhamento de bases entra a ribozima e o substracto. E portanto útil fazer uma revisão da evidência que inicialmente nos levou a propòr o modelo de emparelhamento das bases indicado na Figura 1. Em primeiro lugar, há uma semelhança clara entre os mecanismos da clivagem cataiizada pela ribozima e do auto-processamento do ARN. No caso do auto-processamento, o emparelhamento das bases entre a sequência CUCUGU no terminal 3" do exão 5' e o sitio activo GGAGGG do exão 5", encontra-se provado por análise comparativa de 66 35 1 1

52.077

Ref: RJW/Ohiversity Patents-RNA Ribozyroe

sequências CQavies et- al. , Nature 300:719 1982; Mie.hei h Dujon, 5 EMBO J. 2:33-38 (1983)), e por análise de mutações numa base única e de mutações em supressores secundários CWaring et al. , Nature 321:133 (1986); Been & Cech, Cell 1986). Em segundo lugar, a clivagem ribozimica de grandes moléculas de ARN ocorre apenas 10 em sequências int.imamente relacionadas com CUCUCU—N, dando-se a clivagem na posição indicada pela set-a. Por exemplo, um pré-ARN 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 25 com 504 nucleótidos da beta-globina do rato sofre clivagem pela L—13 IVSbeta ARN em dois locais principais, cada um deles precedido por CUCU, e um transcrito com 841 nucleótidos do p8R322 sofre clivagem em quatro locais principais, dois deles precedidos por CUCU, um por CCUU, e um por UUUU (2aug et al., Nature, 1386). Finalmente, as mutações efectuadas no sitio activo alteram a especificidade em relação ao substracto de uma forma prevista pelas regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick quando as reâcções se dão na presença de ureia CSaug et al. Nature, 1386). Temos portanto que modificar o modelo do emparelhamento das bases proposto para o mecanismo da clivagem de oligorribonucleótidos, e vamos fazé-lo da seguinte maneira: a formação de um duplex com emparelhamento de bases entre a ribozima e o seu substracto é necessária para haver reacção, mas um complexo mal emparelhado pode reagir melhor que um duplex perfeito.

Para facilitar a discussão dos dados, considere-se o seguinte esquema de reacção simples: 67 35 I [ 62.077 Ί íaf: HJW/University Patents-Bta. Rib02^ne 5

E + S

Íh.*7

E + P 10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 em que E é a ribozima, S é o substracto oligorribonucleôtido, e o produto P inclui tanto a metade 5" comõ a metade guanidilo 3' do substracto cortado ¢0 substracto guanosina encontra-se presente em grande excesso? a sua ligação não é apresentada explicitamen-te). Se Km = ktí^/k 1, a constante de dissociação de E—S, então as mudanças do substracto na posição -3 em relação ao local de clivagem que resultem num complexo enzima-substracto mal emparelhado deveriam aumentar o Km. A tendência esperada é observada nas linhas 5 - S da tabela 3. 0 substracto que se previa que formasse o complexo ribozima-substracto roais estável (·· g° ss -7.8 Kc a 1/roo 1) tem o menor valor de Km, e os três substractos com ligação roais fraca (-3.6 Kcal/mol) têm valores de Km considerávelmente superiores. Contudo, do ponto de vista quantitativo, a variação de Km é muito menor que a que se

O esperava dadas as diferenças de 4 S 5 o efeito de um mau emparelhamento parece ser amortecido por outras interações entre ribozima e substracto Ccf. Sugimoto et al. Biochemistry, 27:6384., C1988)). Além disso, no caso dos substractos das linhas 1-4 da tabela 3, o Km não é significativamente afectado por maus empare1hamentos. 68 1 5 10 15 IVIod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30

Ê2.077lef: BJW/University Patents-HNA Ribozyme

- Modelos para o efeito de maus emparelhamentos na velocidade de c1ivagem. Durante a realização das experiências aqui descritas, consideraram-se três modelos para explicar os maiores valores de fccat determinados para os substractos mal emparelhados. Efectuaram—se alguns testes para avaliar os modelos.

Cl) Ligação não produtiva. Prever-se-ia que os substractos contendo CUCU tivessem maior número de possibilidades de ligação não produtiva ao centro activo rico em G, que os substractos contendo CGCU ou CACU5 isto poderia explicar a redução de kcat no primeiro caso. Este modelo foi testado sintetizando os dois substractos contendo CGCU, que se esperaria terem pelo menos o mesmo número de possibilidades de de ligação não produtiva que CUCU. 0 elevado valor de kcat dos substractos contendo CCCU (tabela 3) op3e-se ao que se esperaria se houvesse ligaç3es não produtivas. Além disso, a ligação não produtiva pode diminuir o kcat , e o Km,, mas. não a razão kcat/Km CFersht, Enzyme Structure and Mechanism 2nd Ed. Freeman, New York, 1995). Se os valores de kcat para os substractos contendo CUCU fossem 10 a 100 vezes menores devido a ligação não produtiva, então os seus Kms na ausência dê ligação não produtiva deveriam ser 10 a 100 vezes maiores que os Kms medidos. Isto parece muito pouco provável, porque os substractos que contém CUCU são os que se emparelhari melhor com o centro activo. Continua a ser bastante provável que alguns dos valores de Km sejam diminuídos devido a ligação nãc produtiva. Por exemplo, o troço C5 do substraeto GQCCCCCUA5 pode ter múltiplas possibilidades de ligação não produtiva ao centre activo rico em G da ribozima. 69

I 62.077 Ref: RJW/University Patents-Bt®. Ribozyme (2) Libertação do produto como passo limitante velocidade. Se a libertação do produto for o passo limitante da da velocidade, o kcat poderia ser a constante de velocidade da dissociação do complexo r ibozima-produto <.k3'), em vez de

L 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 representar a constante de velocidade do passo químico (.k2> Os substractos mal emparelhados formariam complexos ribozima--produto também mal emparelhados, aumentando assim o kcat. Este modelo foi testado efectuando a clivagem em excesso de ribozima; não se esperaria que a libertação do produto contribuísse para o kcat em condiçbes às quais cada molécula de ribozima participa num único ciclo de catálise. A observação continuada de clivagem mais rápida nos casos de substracto mal emparelhado não sustenta este modelo. (3) □ mau emparelhamento desestabi1iza o E-S. De acordo com a teoria do estado de transição, os maus emparelhamentos poderiam fazer aumentar o kcat desestabilisando o estado fundamental do E-S sem desestabilizar o estado de transição (E-S++) no passo limitante da velocidade (Fersh, 1985). Esta desestabilização deixaria a razão kcat/Km invariávelde acordo com os dados nas linhas 4-8 da tabela 3. Se um mau emparelhamento estabilizasse também o CE-S++), a razão kçat/Km aumentaria, como se observa nas linhas 1-3 da tabela 3. Q aumento na clivagem dos substractos emparelhados originada por desnaturantes como a ureia e a formamida poderia ser explicado se estes desestabilizassem também o E-S. A inibição da clivagem pelos desnaturantes nos substractos mal emparelhados poderia ser explicada se a desestabilização do estado de transição ÍE-8++) se tornasse dominante. 70 35

Mod. 71-10000 èx. - S9/07 20 25 30

Como é que os maus empareihamentos podem desestabilizar o E--S e ter um efeito diferente no E-S++ ? Os nucleótidos que precedem o fosfato reactivo poderiam estar ligados à ribozima no estado E-S++ de uma forma diferente da que estão no complexo E-8.. Uma possibilidade extrema é a de que o substracto possa torna-se dèsemparelhado da sequência complementar no E-S++. Note-se que a E-3++ é o estado de transição para o passo limitante da velocidade; os dados não podem distinguir entre um passe limitante de natureza química e um passo limitante da velocidade envolvendo alterações conformacionais no E-8 antes do passe químico. Propomos que a clivagem óptima exige um grau apurado de estabilidade no complexo ribozima-substracto. Esta ideia é I atraente porque explica os dados obtidos para a clivagem ne ausência e na presença de ureia. De acordo com o modelo, oí substractos que se ligam mais fortemente <6SCCU)CUCUAs, Δδ® -10.9 e -7..Ô Kcal/mol) apresentam .as menores, .constantes. . dí; velocidade nâ ausência de ureia; a adição de ureia desestabi1izí. as suas ligações e aumenta as suas velocidades de reação CFigurii 21 e tabela 35. A classe de substractos seguinte CGGCCCCCCG)CUA.ç 46° * ' -6.7 Kcal/mol) ligam-se com uma estabilidade ligeiramente! menor que a óptima; a adição de ureia 1 M origina uma velocidade; de reacção máxima, enquanto subsequente adição de ureia diminui a velocidade porque E—S++ é desestabilizado. A última classe da substractos CGGCUCGCCGlíCUAg, ΔθΡ -3.6 Kcal/mol) liga-sis demasiado mal para originar uma velocidade de reacção óptima pelo que a desestabilização adicional provocada pela adição d>i ureia faz baixar ainda mais a velocidade da reacção. Poderá se’ 71 1 10 15

informativo' verificar se maus emparelhamentos na posição —4 afectam as velocidades de clivagem como é previsto pelo modelo. - Implicações para o auto-processamento. Na reacção de auto- processamento, a adição de guanosina dá-se no local indicado pela seta da sequência CUCUCU-A3. As mudanças de uma única base nas posiçbes -1, -2, -3 e --4 relativamente ao local de clivagem, originam todas um abaixamento da velocidade de processamento (Been et al., Cold Spring Harbor SYmp. Quant. Biol. 52:147-157 (1987)). Em especial, o pré-ARN contendo CUCUCU é muito mais reactivo ao auto-processamento que o pré-ARN contendo CUC6CU (Been & Cech, Cell (1986)). Na clivagem catalítica de oligorriboniji cleótidos pela L-21, Seal ARN, a especificidade é invertida, sendo um substracto contendo CUCSCU muito mais reactivo que um contendo CUCUCU íexcepto em ureia 1 M). 0 sistema enzimático tolera melhor algum mau emparelhamento no complexo substracto-centro I* acti.vo, que o., sistema de auto-processamento. E possível, que algumas das sequências dos exbes ou dos intrSes removidas quando o pré-ARN auto-processado se converte na L-21 Seal ARN aumentem a selectividade em relação ao local de processamento. - Utilização de ribozimas para clivagem em sequências especificas do ARN. 0 actual trabalho tem consequências na utilização das ribozimas como instrumentos para a clivagem em sequências especificas do ARN. Notamos a importância dos nucleótidos -5 e -6 em relação ao local de clivagem. E agora claro que a substituição de um C por um U na posição -5 tem um efeito mínimo no kcat, mas pode ter um efeito muito grande no Km da reacção de clivagem (tabela 3). Em segundo lugar, e com um 72 35 * S2.077Eef: RJW/tTniversity Patents-RKA RLbozyne

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5 10 15 20 25

aspecto muito mais fundamental, certas sequências mal emparelhadas sofrem clivagem eficiente mesmo na presença de ureia. 0 caso mais dramático diz respeito ao GGCCCCCU-A5; apesar da sua clivagem ser fortemente inibida pela ureia, é um substracto tão bom que continua a sofrer clivagem mais rápidamente que as sequências GGC(CU)CUCU-A5 em ureia 2-2.5 M. Verificou-se que uma sequência mal emparelhada semelhante CCUCU-) era .o principal local da clivagem pela L-21 Seal ARN do transcrito SV40 com 602 nucleótidos. Parece provável que a discriminação contra os substractos mal emparelhados possa ser melhorada aumentando a concentração de ureia para 3M ou diminuindo a concentração do ião magnésio para 2 mM. Contudo, a não ser que as condições reaccionais sejam bem especificadas, a clivagem de moléculas- de ARN com ribozima irá ocorrer geralmente numa família de locais que inclui a sequência que se emparelha com o sítio activo da ribozima, bem como as sequências relacionadas que contenham um ou dois nucleótidos mal emparelhados. Este texto engloba, como referência, o trabalho descrito em Zaug, Arthur J., et al. Bioehemistry (1988) 27:8924

Exemplo VIII 30 0 sitio activo do pBGST7 sofreu mutagéneses (veja-se o exemplo XV abaixo indicado), de forma a produzir novas ribozimas com a especificidade alterada. Seis destas ribozimas foram sintetizadas e caracterizadas. 73 35

62*077Bef: R3W/0niversity Patents-KRA Ribozyme

Estes mutantes podem ser produzidos a partir do plasmideo 5 que produz as ribozimas selvagens L-19 e L-21, onde os sítios activos sofrem mutagénese como é apresentado na tabela 5. A sequência-guia interna da IVS pode ser submetida a mutagénese de forma a construir estas variantes CBeen & Cech, 10 (1986) Cell 47:207-216). 0 ARN pode ser transcrito e preparado utilizando processos semelhantes aos descritos para a ribozima

Mod. 71-10000 éx. ' 89/07 20 30 selvagem. Cada uma das seis novas ribozimas reconhece e efectua clivagem nas novas sequências dos substractos, de acordo com as regras estabelecidas no nosso trabalho anterior CZaug, Been & Cech, Nature, 1986). As condições para a reactividade de algumas destas ribozimas variam em relação às condições usadas com a ribozima selvagem. Enquanto a ribozima selvagem tem uma concentração óptima de Mg++ de cerca de 2 mM, várias das nossas ribozimas variantes são mais reactivas a concentrações superiores de Mg++ (até 100 mil). A listagem das ribozimas selvagens e novas é apresentada na tabela 5. Utilizámos ureia 2.·5 M para aumentar a fidelidade da selecção do local de clivagem pela ribozima selvagem. Esta condição é adequada para algumas, mas não para todas as nossas variantes. As reactividades das ribozimas TTA e TTC diminuem substancialmente com o aumento da concentração de ureia. Verificou-se que a utilização de sais como o acetato de amónio

CNH4Ac) em altas concentrações aumenta a fidelidade nesses casos. Outros sais, incluindo NH4C1, LiCl, CaC12 e espermidina podem substituir o NH4Ac. 74 10 15

Mod. 71. -10000 êx; - .89/07 20 25 30 52.077Bef: R3W/University Patents-RNA Ribozyme

Estas questões encontram-se focadas nas figuras 22-31. A ribozima TCC tem pouca especificidade dentro de uma grande variedade de concentrações de MgC12, se o sal ou a ureia se encontrarem ausentes CFig. 22). Esta ribozima tem melhor especificicidade em ureia 1.5'M, mas nestas condições perde a actividade com o substracto emparelhado CFig. 23). O sal Cneste caso, NH4Ac) tem apenas um efeito mínimo na clivagem do substracto emparelhado CFig. 24·), mas reduz substancialmente a clivagem do substracto mal emparelhado CFig. 25), aumentando assim a especificidade. As mesmas questões encontram-se focadas para o caso da enzima TTA nas figuras 26-29. 0 NH4Ac também é usado para aumentar a especificidade da ribozima TGT CFiguras 30-31). Exemplo IX A L-19 IVS ARN cataiiza a clivagem e a reconstituição de oligonucleôtidos Incubou-se L-19 IVS ARN não marcada com pC5 marcado com na posição 5' numa solução contendo MgC12 20 mM e Tris-Hcl 50 mM pH 7.5. 0 pC5 foi sendo progressivamente convertido em ácido oligocitidilico, com cadeias de dimensão tanto superior como inferior à do composto inicial CFig, 5A). 0s maiores produtos chegaram a atingir pelo menos a pC30, de acordo com uma exposição rnais longa de um auto-radiograma como o apresentado na Fig. 5A. Os produtos mais curtos eram exclusivamente pC4 e p€3. A incubação de pC5 na ausência de L-19 IVS ARN não deu reacção CFig. 50. 75 35 1 52.077 Bef: RJW/Dniversity Patents-RNA. Ribozyme

Mod. 71 -10000 ex. -39/07

5 10 15 20 25 30 0 tratamento de urna mistura reaccional com fosfatase 60 minutos depois do inicio da reacção, resultou na transferência completa da radioactividade devida ao ^'"P para o fosfato inorgânico, o que foi verificado por cromatografia em camada fina com polietilenoimina CTLC) em formato de sódio 1 M, pH=3.5 CZaug, A., et al., resultados não publicados). Assim, o fosfato terminal 5' do substracto não se torna inacessível durante a reacção, e o substacto é aumentado no lado do seu terminal 3' formando o oligonucleótido maior. Quando se utilizou C5p:fC como substracto e se trataram os produtos com ribonuclease T2 ou ribonuclease A, a 32 radioactividade devida ao P encontrava-se inteiramente no composto cp$ CZaug, A. et al., resultados não publicados). Assim, as ligaçbes formadas durante a reacção consistem exclusivamente de ligaçóes fosfodiéster 3'-5'. Os produtos devidos à reacção com C5p#C foram totalmente resistentes ao tratamento com fosfatase. A reacção apresentava especificidade em relação ao ribonucleótidos, não se dando a reacção com d-pCS CFig. 1B), ou com d-pAS CZaug, A. et al., resultados não publiçados)! De entre os oligorribonucleótidos, a pU6 foi um substracto muito pior que a pCS ou a pC6 CFig. SD), e a pA6 não reagiu CZaug, A., and Cech, T.R., C1986), Biochemistry 25:4478). A reacção não ocorreu quando se omitiu o cloreto de magnésio. A actividade enzimática manteve-se aproximadamente constante na gama compreendida entre 5 mM e 40 mM em MgC12 CZaug, A., et al., resultados não publicados). Utilizou-se

rotineiramente a concentração de 20 mM para evitar o efeito da possível quelação do Mg2+ por substractos oligorribonucleótido em altas concentraçbes. 76

1 02.077 ]íef: HOW/University Patents-HNA. Ribozwe

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 A L-19 IVS ARN é regenerada depois de cada reacçâo, 'pelo que cada molécula de enzima pode reagir com muitas moléculas de substracto. Por exemplo, o tratamento dos dados apresentados na Fig. 5(3 revela que 16 pmol de enzima convertem 1080 pmol de pC5 a produtos durante um intervalo de 60 minutos. Estes números subestimam o número de ciclos enzimâticos por unidade de tempo (turnover number)? como os produtos iniciais sSo essencialmente constituídos por CS e C4, é provável que a produção de cadeias com dimensão superior a seis ou inferior a quatro nucleótidos envolva dois ou mais ciclos catalíticos. A quantificação da radioactividade em cada produto também fornece alguma indicação sobre o mecanismo da reacção. Pouco depois do inicio da reacção, a quantidade de radioactividade <uma medida do número de cadeias) presente nos produtos maiores que pCS é aproximadamente igual á encontrada na soma de pC4 e pC3, o que é consistente com um mecanismo em que se conserva o número total de ligaçBes fosfodiéster em cada reacção. A medida que a reacção prossegue, contudo, a distribuição da radioactividade desloca-se no sentido dos produtos com menores dimensftes. Isto é muito provávelmente devido à reacção de hidrólise, que entra em competição com a reacção em estudo e que é também cataiizada pela L-19 IVs -ARN, como é descrito abaixo.

77

52-077

Eef: RJW/CJniversity Patents-FNA. Ribozyma A velocidade de conversão de pC5 30 uM em produtos aumenta linearmente com a concentração da enzima L-19 IVS ARN na gama compreendida entre 0.06 e 1.00 uli (2aug, A. , et al. resultados não publicados). Existe uma relação hiperbólica entre a velocidade de reacção e a concentração de pC5 a uma dada concentração de enzima CFig. 5, E a G). Qs dados são ajustados com base na equação da lei de Michael is-Menten CFig. 6). Os parâmetros cinéticos resultantes são: Km = 42 uM e kcat = 1.7 min-1·.

Mod. 71 -10000 ex. 89/07 A estabilidade da enzima foi determinada por incubação preliminar a 42 °C durante 1 hora na presença de Mg2+ Ccondições reaccionais Standard}, ou durante 18 horas nas mesmas condições, mas na ausência de Mg2+. Em ambos os casos, a enzima apresentava uma actividade indistinguível da da enzima não tratada testada paralelamente, e não se observaram produtos de degradação por electroforese em gel de poliacrilamida CZaug, A. et al., resultados não publicados). Assim, a enzima L-19 IVS ARN não é urr bom substracto.- A enzima é-também estável durante, meses, quandc armazenada a -20 °C. A actividade especifica da enzima mantém-se consistente nas várias preparações.

Exemplo X 30

Intermediário covalente. Quando se usou o CSpM como substracto, a radioactividade passou a estar covalentement-o ligada à L-19 IVS ARN CFig. 7A>. 0 fosfato radioactivo estavo ligado covalentemente ã L-19 IVS ARN, o que foi verificado usando os seguintes critérios: manteve-se ligado quando o complexo fo . 78 51.077 Bsf: R3W/Dniversity Patents-RNA Ribozyne

5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 isolado e submetido a um segundo processo Cdesnaturamte) de electroforese em gel; foi libertado sob a forma de um nucleótido quando tratado com RNase T2; e foi libertado sob a forma de uma série de oligonucleótidos não identificados quando tratado com RNase TI CA. Zaug & T. Cech, dados não publicados). Estes resultados são consistentes com a existência de uma série de complexos enzima-substracto covalentes, em que vários troços do CSp-f se encontram ligados à L-19 IVS ARN através de uma ligação fosfodiéster 3"—5" normal. Esta observação, considerada em conjunto com o que já conhecíamos sobre o mecanismo da ciclização da IVS ARN CZaug, A.J., et al., (1984) Science 224:574; Sullivan and Cech, T.R. , (.1335) Cell 42:633; Zaug, A.-J. , et al. C1933) Nature CLondon) 301:578), Been, M. and Cech, T.R. C1385) Nucleic Acids Res. 13:8383), levou à proposta de um modelo para o mecanismo da reacção envolvendo um intermediário covalente enzima-substracto CFig.8). Este caminho reaccional é sustentado pela análise de reacçSes nas quais uma quantidade vestigial de p$C5 foi· incubada com um grande excesso (molar) da L-19 IVS ARN. A reacção de clivagem ocorreu com grande eficiência, o que foi verificado pela produção de p#C4 e p$C3, mas houve muito pouca síntese de produtos maiores que o composto original CFig.7B; compare-se com a Fig. 5A). Estes dados são facilmente interpretados com base no caminho reaccional proposto. 0 primeiro caso, a formação do intermediário covalent-e com libertação do fragmento terminal 5' do o1igonucleótido, ocorre normalmente; esse primeiro passo consome todo o substracto, deixando uma quantidade de C5 insuficiente para induzir a segunda reacção de transesterificação. 79. 35 1 15

Mod. 71-10000 ex. -89/07 20 25 30 52-077Sef: RJW/University Patents-ΒΚΆ Ribozyme

0 modelo apresentado na fig. 8 foi testado isolando o complexo enzima-substracto covalente preparado por reacção com C5p$C e incubando-o com C5 não marcado. Uma parte da radioactividade foi transferida para oligonucleótidos com mobilidades elect-roforéticas correspondentes a CS, C7, C8 e oligómeros de cadeia superior CFig. 70. Numa experiência confirmatória, o complexo covalente foi preparado com CS não marcado e feito reagir com ρΐCS. A radioactividade foi novamente transferida para uma série de oligonucleótidos de peso molecular superior CSaug, A., et al., dados não publicados). Nos dois tipos de experiência os dados são fácilmente explicados se o complexo covalente fôr uma mistura da L-19 IVS ARN terminandp em GpC, . . . GpCpC, ... GpCpCpC, etc. Dado que podem reagir com CS para completar o ciclo catalítico, estes complexos enzi ma-substracto covalentes são possíveis intermediários da reacção CFig.8). E necessária uma análise mais detalhada da velocidade da sua formação e resolução para avaliar se são ou não cinéticamente capazes de serem intermediários. Não podemos apresentar nenhuma conclusão firme sobre a porção do complexo enzima-substracto que não reagiu com CS. Este ARN não-reactivo poderia ser um intermediário covalente que sofreu desnaturação durante o processo de isolamento de forma a perder a reactividade, ou poderia representar uma pequena quantidade de um complexo enzima— substracto diferente, não produtivo, e que portanto se acumula durante a reacção. A ligação G414-A1S na C IVS ARN, a ligação G414-U20 na C·- IVS ARN, e a ligação G414-U41S no pré-ARN são ligáç8es fosfodiestér 80 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

J 62.077Bef: Kiw/Õniversity Patents-ΗΝΆ Ribozyne

alcalina, libertando os terminais fosfato 5' e hidroxil 3'CZaug, A.-J. et al, C 1384) Science 224:574 and Inoue, T. , et al. C1986) J. Mo1. Biol. 189, 143-185). Testámos por isso a labilidade da ligação G414-C no intermediário enzima—substracto covalente, incubando a pH 9.0 num tampão contendo Mg2+. Este tratamento originou a libertação de produtos que co-migraram com padrdes pC e pCpC, bem como de produtos maiores, possivelmente oligómeros de pC de maiores dimensães CFig. 7D). Utilizou-se a cromatografia em camada fina para confirmar a identidade dos produtos principais CZaug, A. et al., dados não publicados). No caso das moléculas em que se verificava libertação de pC, essa libertação estava essencialmente terminada ao fim de 5 minutos. Cerca de metade do complexo covalente ,era resistente ao tratamento a pH 9.0, Mais uma vez não podemos chegar a conclusSes firmes sobre as moléculas que não reagiram. A labilidade da ligação 8414-C ê a base da actuação da L-19 IVS ARN como ribonuclease CFig. 8), através de um mecanismo que é diferente do da endorribonuclease descrita nos exemplos I a VI. - Um inibidor competitivo. A deoxi-C5, que não é um substracto para a clivagem catalisada pela L—19 IVS ARN, inibe a clivagem da pCS CFig. 9A). A análise da velocidade de conversão de pCS a pC4 e pC3 em função da concentração de d-CS indica que o dC5 é um inibidor competitivo verdadeiro, com uma constante de inibição Ki = 2S0 uM. 0 d-A5 a 500 uM inibe a reacção apenas 16¾ do que inibe o d-CS. Assim, a inibição por d-C5 não é devida.a um efeito geral decorrente da adição de um deoxioligonuclebtido ao sistema, mas sim um efeito dependente da sequência. 81 35

62.077

Eef: RJW/University Patents-KNA. Ribozyme A formação do complexo enzima-substracto covalente pode representado da seguinte maneira: 10 E + C- f E .* C,.-^ EpC + C,

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25

k-.

Se k_^ >> ^2* então Km = k-i/kj, a constante de dissociação do complexo E.CS não-covalente. A observação de que o Ki para o d-CS é da mesma ordem de grandeza do que o Km para o C5 pode então ser interpretada em termos de o d-CS e o C5 terem constantes de ligação semelhantes para a interaeção com o centro activo da enzima. Isto está de acordo com a ideia de que o substracto se liga a uma sequência oligopurina CR5) no centro activo essencialmente através de emparelhamento de bases do tipo Watson-Crick, pelo que o duplex C5 . RS e o duplex d-CS . RS devem apresentar a mesma estabilidade. Q mecanismo da enzima' e a sua relação com o auto-processamento, a estequiometria dos produtos da reacção (produção de quantidades equimolecularés de oligonucleótidos maiores e mais pequenos que o composto original), a nSo-necessidade da energia proveniente do ATP ou do 6TP (adenosina trifosfatoj guanosina trifosfato), o envolvimento de um intermediário covalente, a especificidade em relação aos substractos oligo-C', e a inibição competitiva pelo d-CS, levaram â formulação de um modelo para o mecanismo da enzima (Fig. S). Prop3e-se que a L-13 IVS ARN se ligue não covalentemente ao 82

62.0771 Bef: BJW/TJniversity Patents-RNA Ribozyme 5 θ'*

substracto através interacçães devidas ao empareihamento de bases. A reacção de transest-erif icação ente o resíduo guanosina terminal 3'da enzima e o éster fosfatado do substracto produz então um intermediário enzima-substracto covalente.

L

10 15 é de esperar que a transest-erificação seja muito reversível.

Mad. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 35

Se o produto C4 se torna a ligar à enzima pode atacar o intermediário covalente e reconstituir o composto inicial CS. Contudo, no estádio inicial da reacção, a concentração de CS é muito maior que a de C4j se o CS se ligar e atacar o intermediário covalente, produz-se CS CFig.8). A reacção global consiste na conversão de 2 CS em C4 + CS. Os produtos actuam como substractos em reacçbes posteriores, por exemplo, na conversão de CS + CS em C7 + C4, e de C4 + CS em C3 + CS. A ausência de produtos menores que C3 é explicada tendo em conta a perca de interacçbes ligantes do C3 em relação ao C4 C o C3 só pode criar dois emparelhamentos de bases com o modo de ligação adequado para a clivagem produtiva)..... ...... As reacçÓes de transesterificação são conservativas no que diz respeito ao número de ligaçbes fosfodiéster no sistema. Assim, a ligação do ARN pode ocorrer na ausência de uma fonte externa de energia, ao contrário do que acontece nas AON- e ARN-ligases. A hidrólise do intermediário covalente compete com a transesterificação. A reacção global consiste na conversão de CS + H2Q em C4 + pC, com a L-19 IVS ARN a actuar como ribonuc lease. Baseando-nos nos nossos conhecimentos actuais sobre a reacção, as estrégias catalíticas da enzima L-19 IVS ARN parecem ser iguais às usadas pelas enzimas proteicas CJencks, W.P., 83 1 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 €2.077 Hef: RJW/University Patents-RNA Ribozyme

C19695 Catalysis in Chemistry and Enzymo 1 ogy (McGraw-Hill, New York). Em primeiro lugar, as enzimas de ARN, tal como as enzimas proteicas, formam um complexo não-covalente especifico com o seu substracto oligorribonucleótido. Admite—se a existência desta interacção para explicar a colocação do substracto à distância e conv a orientação adequadas a um ataque facilitado pelo grupo hidroxil 3' da guanosina terminal da enzima. Em segundo lugar, supõe-se que o intermediário na reacção com a L-19 IVS ARN seja um complexo enzima-substracto covalente. Qs intermediários covalentes são prevalecentes nas reacções de transferência de grupo catalisadas enzimáticamente. Em terceiro lugar, a ligação fosfodiéster formada no intermediário covalente ê invulgarmente susceptivel à hidrólise, indicando que se encontra tensa ou activada, facilitando portanto a formação do estado de transição pentavalente quando sujeita a ataque nucleófilo <Zaug, A.J., et al. C1985) Biochemistry 24:6211; Zaug, A. J., et al. (1984) Science 224:5745. De forma semelhante, pensa-se que os catalisadores proteicos facilitem a formação do estado de transição, por exemplo, fornecendo grupos no sitio activo que se ligam melhor ao estado de transição que ao substracto livre (Fersht, A., (1985) Enzyme Structure and Mechanism (Freeman, New York, ed. 2)5 Wells, T.N.C., et al. (1985) Nature (London) 316:655). Até agora não há evidência que outra categoria principal de catálise enzimática , a catálise geral ácido-base, ocorra nas reacções com a L-19 IVS ARN, mas pensamos que poderá estar envolvida nas transferências de protão necessárias ao processo. 84 35

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Jik. ..... 1 52.077 Bef: RlW/tlniversity Patents-FNA Riboz^me 5 Cada reacção de transester if icação ou de hidrólise catalisada pela L-19 IVS ARN é análoga a um dos passos da reacção de auto-processamento (ou outra auto-reacção do mesmo tipo) da Tetrahymena (Fio. 10). Assim. a descoberta de ac tiviriade 1° enzimática num troço da IVS ARN consolida o ponto de vista segundo o qual o pré-rARN tansporta a sua própria enzima de processamento como parte intrínseca da sua cadeia polinucleotídica. Parece provável que o o local de ligação do -10000 ex.-89/07 στ substracto CS da L-19 IVS ARN seja o local de ligação oligopirimidina que dirige a escolha do local de processamento 5' e os vários locais de ciclização da IVS ARN CSullivan, F.X., et al. ¢1985) Cell Suora; Been. M. , et al. C1985) Nucleic Acid •g I 20 Research Supras Inoue. T. . et al. J. Mol. Biol., Supra; Inoue. T. , et al. <1985) Cell 43:4.31). Apesar da localização desse sitio na IVS ARN não ter sido estabelecida, o melhor candidato é 1 25 uma porção da sequência-guia interna proposta por Davies e colaboradores (Davies, R.W.,- et al. - (1982) Nature CLondon) 300:7195 Waring, R. B,, etal. (1983) J. Mol, Biol. 167:595). Michel e Dujon (Michel, F. , et al., (1983) EMB0 J. 2:33) apresentam uma interacçãó de emparelhamento semelhante no seu modelo para a estrutura do ARN. 0 hipotético sítio de ligação 30 GGAGGG encontra-se localizado nos nucleótidos 22 a 27 da IVS ARN de Tetrahvmena intacta, e nas posiçSes 3 a 8, muito perto do terminal 5', da L-19 IVS ARN. Se este for o sitio de ligação ao substracto, a mutação num local especifico da sequência deveria ·;: 35 modificar de uma forma previsível a especificidade da enzima em relação ao substracto. 85 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 52.077Bef: MW/University Patents-FNA. Eiboz^ne

Exemplo XI ^ L-13 ivb ARN desfosforila C6p. Quando o ácido oligocitidílico, com um grupo hidroxilo no terminal 3', é incubado com a enzima L-19 IVS ARN em MgC12 20 mM, é convertido em oligo(C) tanto com cadeias maiores como menores (Figura IA) , como foi práviamente descrito (Exemplos VII e VIII e Zaug & Cech, 1.1986) Science CWash. D.C.) 231 s470-475) A reacção apresenta especificidade em relação ao oligo(C)? por exemplo, o pA6-QH não reage nas mesmas condições (Fig. ílA). Quando o ácido oligocitidilico com um fosfato no terminal 3' é incubado com excesso de L-19 IVS ARN em MgC12 20 mM, o substracto é convertido num produto que apresenta pouca mobilidade eleçtroforética (Fig. 11A). Esta redução abrupta na mobilidade elec trof orética , que é equi\'alente a um aumento de aproximadamente três nucleótidos na sequência, é exactamente igual ao obtido tratando o substracto com fosfatase alcalina (não ê mostrado na Fig. 11? apresenta-se um exemplo na Fig. 12). Assim, parecia que o produto era C6-0H. Quando se usou substracto marcado no meio <C5p#Cp), o fosfato marcado é retido no produto (Fig. 11A). Por outro lado, quando o substracto se encontra marcado no terminal (CSp$), o produto oligorribonucleótido não vem marcado e a L-19 IVS ARN aparece marcada (Fig. 118). Estas observações confirmaram que a reacção envolve a remoção do fosfato terminal 3“ do substracto. 86 35 1 1

5 10 ' 15

Mod. 71 -10000 ex, - 89/07 25 30 62.077

Bsf: RJW/Dniversity Patents-KNA. RLbozyme ft desfosforilação é especifica em relação ã forma fosfatada em 3' do ácido oligocitidílico. 0 fosfato 5' do pC5 não é reactivo (Fig. 11A), e nenhum dos grupos fosfato ê removido do pCp (dados não apresentados). Nem o ASCp (Figura 1 IA) nem o pASp (não mostrado) se comportam como substractos. (Estimamos que a reacção seria detect-ada se ocorresse a 0.1%). Com base nesta amostra, parece existir tanto a necessidade de uma dimensão mínima de cadeia, como de uma sequência determinada para o substracto, e essas necessidades são semelhantes às determinadas para a actividade de transferência de nucleótidos da L-19 IVS ARN (Zaug ã Cech, (1986) Science, suora).

Exemplo XXI - Formação e estabilidade do E-p. Em seguida, investigámos o destino do fosfato removido de CSp na presença de L-19 IVS ARN. A pH neutro não se formou fosfato inorgânico durante a reacção, o que foi verificado por cromatografia em camada f ina dos. produtos, da reacção (dados não apresentados). Quando a reacção se dá na presença de C-Sp:*:, torna-se claro que o fosfato é transferido para a L-19 ARN (Fig. 11B) . Q tratamento da L-19 IVS ARN f osforilada (Designada como E-P daqui em diante) com fosfatase alcalina leva à libertação quantitativa da radioactividade sob a forma de fosfato inorgânico. Assim, a desfosforilação do substracto é conseguida por transfosf ori lação. A estrutura do E-p foi determinada; o fosfato é esterificadò através do 3‘’-0 do resíduo guanosina terminal 3'(6414) do ARN (Zaug & Cech, resultados não publicados). 87 35 1 5 52.077Bef: RJW/aniversity Patents-FKA RLbozsme

A velocidade de conversão de C5p (N.T: 65p no original) em CS—QH + E—p é dependente do pH, com um ótimo próximo do pH S.O.

Mod. 7.1 -10000 ex. - 89/07

10 15 20 25 30

35

Na fig. 12 encontra-se uma amostragem dos dados. A reacção de transferência de fosfato é essencialmente independente do pH na gama compreendida entre 7.5 e 9, e processa—se a uma velocidade semelhante à da reacçâo de transferência de nucleótidos CFig. 12A). A pH=5 a reacção de transferência de fosfato é acelerada rnais de 20 vezes, equanto a reacção de transferência de nucleótidos não é afectada. A pH=4 a enzima ainda apresenta uma actividade substancial de transferência de fosfato, enquanto a sua actividade de transferência de nucleótidos se encontra fortemente diminuída. Dado que a enzima começa provavelmente a desnaturar-se a pH abaixo de 5 (Zaug, et al., ¢1985) Biochemistrv 24:6211). o perfil da actividade de transferência de fosfato nesta gama reflete provavelmente a inactivação da enzima e não o óptimo de pH para o passo de transferência. As constantes de velocidades resultantes do tratamento de dados semelhantes aos da fig. 12B encontram—se resumidas na Fig. 12C. 0 intermediário covalente formado durante a reacção do pC5— OH com a L-19 IV3 ARN (E-pC) é lábil em condiçSes alcalinas, sofrendo hidrólise a pH 9.0, em que se liberta o nucleòtido pC e se regenera a enzima livre CZaug & Cech, (1986) Science supra). Dado isto, resolvemos investigar a estabilidade do fosfato monoéster na fosfoenzima E-p. NSo há hidrólise detectável do fosfato monoéster a pH 9, condiçSes às quais o E-pC tratado paralelamente originou a libertação de pC, nem a qualque outro pH na gama comprendida entre 7 e 9. 88

\

5 10 15 62.077Sef: sjw/University Patents-HNA Ribozyme

Mod. 71-10000 e*. - 39/07

Por outro lado, a pH ácido o fosfato monoéster terminal de E-p sofreu hidrólise lenta . Quando o E-ρ foi incubado a pH 5.0, o fosfato foi libertado sob a forma de Pi com velocidade aprox. igual a 10% /hora. A velocidade é mais lenta a pH 4.0 e a pH 6.0 que a pH 5.0. A libertação do Pi foi também observada durante a reacção do C5p:t com L-19 IVS ARN a pH 5.0 depois da reacção ocorrer 2 e 4h. Assim, a L-19 IVS ARN apresenta actividade de fosfat-ase ácida. Contudo, esta reacção hidrol i ti ca é tão lenta que nem tentámos demonstrar a existência de múltiplos ciclos de catálise.

Exemplo XIII. A fosforilação da enzima é reversivel. Quando se incuba E-p não marcado com uma quantidade vestigial de C5p$, ocorre muito pouca reacção CFig. ISA). Em contrapartida, quando se incuba o mesmo E-p com uma quantidade vestigial de pC5-0H, forma-se 25 progressivamente pC5p (Fig. 13B). NSo são observados os produtos pC4-QH e pC3-0H que se formam normalmente aquando da reacção do pC5-0H com L-19 IVS ARN em excesso CSaug & Cech, 1985). Assim, o E-p é inactivo como nucleotidiltransferase mas é prontamente 30 submetida a desfosforilação. 35 A reversibilidade da fosfor ilação na L-19 IVS ARN foi confirmada fazendo reagir a enzima com C5p# para formar E-p$, purificando o £-p$ e incubando-o com CS-QH não marcado. Foi produzido um produto marcado correspondente a C5pt Cdados não apresentados). Este critério experimental permitiu testar rápida 89 1 52.077 Kef: RJW/Unxversity Patents-RNA Ribozyme

e coerentemente toda urna série de nucleótidos e de 5 oligonucleótidos quanto à sus capacidade para inverter a reacção de fosforilação. Como se mostra na tabela 2, dos oligonucleótidos testados apenas o UCU e o C4U apresentam uma actividade comparável á do CS. Continua a ser possível que outros 10 oligonucleótidos tenham valores de Km elevados e apresentassem actividade detectável a concentrações rnais elevadas.

Exemplo XIV 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07

35 20 25 30 A L—13 IVS ARN é uma fosfotransferase. As reacções de transferência de fosfato até aqui descritas foram todas efectuadas em excesso de enzima. Para provar que a L-13 IVS ARN podia actuar cataiiticamente, foi necessário demonstrar que cada molécula de enzima podia servir de mediadora na fosforilação de múltiplas moléculas de substracto. Isto foi conseguido incubando a L—19 IVS ARN com CSp:fc em excesso molar e com UCU não marcado em excesso molar ainda maior (para açtuar como aceitante de grupos fosfato). Como se mostra na Fig- I4A, a L-19 ÍVS ARN foi capaz de transferir o fofato terminal 3' do CSp para o UCU. Os resultados do tratamento do produto com RNase de T2, e da cromatografia em camada fina, confirmaram que o fosfato tinha sido transferido de um resíduo C para um resíduo U. A variação em ordem ao tempo apresentada na Fig. 14B foi feita a concentração de enzima mais baixa (0.16 uM), e a concentração de aceitante mais alta (200 uli> que as utilizadas na experiência da Fig.l4A. A quantificação dos dados (Fig. 140 mostra que nestas condições são desfosforiladas 11 moléculas de substracto por molécula de enzima após 120 minutos de reacção. A fosforilação da enzima 90 1 5 10

15

£0/68 - 'Χ3 00001' U 'P°W 20 S2.077 Se£: BJW/University Patents-HNA. Ribozyme

precede a formação de produto em quantidades substanciais , o que é consistente com a hipótese de E-p ser um intermediário obrigatório da reacção. Em condições de estado estacionário, 63¾ da enzima encontra-se sob a forma de E-p.

Construção dos plasmídeos pBGST7

Exemplo XV

35 25 30

Been, Michael D. and Cech, Thomas, R. (19863 Cell 47:207-216 indicam a construção da série de plasmideos pBG. Em geral, o plasrnideo utilizado para estes estudos, o (pSGST73, foi derivado do vector de clonagem pUClS. A metodologia utilizada nas manipulações seguintes é descrita por Maniatis, T., et al. (13823 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor). 0 pUC18 foi parcialmehte digerido com HaelI e as moléculas lineares de dimensão unitária foram isoladas por electroforese em gel de agarose e por electroeluição- 0 ADN recuperado foi tratado com ADN-polimerase do T4, e depois foi desfosforilado com fosfatase do intestino de vitelo. 0 pT7-2 CU.S. Biochemical Corp.3 foi cortado com Pvull e HindIII e tratado com ADN-polimerase de T4, e os fragmentos que continham o promotor do fago T7 foram isolados por electroforese em gel de poliacrilamida e por electroeluição. Gs fragmentos contendo o promotor foram ligados ao pUCIS linearizado e o plasrnideo foi transformado em E. coli (estirpe JM833. As colónias individuais foram recolhidas e a mini-prep(aração) do ADN foi sujeito à pesquisa (por digestão com endonuclease de restrição 3 da 91 1 1

52.077

Bef: RJW/Universxty - Patents-RNA Ribozyrne localização do fragmento promotor do local HaelI correcto (posição 680 no mapa do catálogo da New England Biolabs). A orientação do promotor T7 foi determinada transcrevendo o AON da mini-prep (cortado com EcoRi) com ARN-polimerase de T7, e determinando o tamanho do produto. Este plasmideo (pUT718) foi então cortado no local de clonagern múltipa com Kpnl e Sphl e submetido a um tratamento com ADN-polimerase de T4 seguido de um novo tratamento com fosfatase do intestino de vitelo. Um fragmento de ADN BamHI contendo a IVS foi isolado de pJE457 15

Mod. 71 -10000 e*. -89/D7 20 25

(Price, J.V. e Cech, T.R. , (198S) Science 228:719-722) tratado com nuclease Sl, extraído com fenol e precipitado em etanol. 0 fragmento tratado com Sl, que apresenta pequenos cortes (deletions) nos dois terminais, foi ligado ao pUT718 cortado com Kpnl e Sphl. A estirpe JM83 da E^_ coli foi transformada com o plasmideo recombinante e clocada num agar LB contendo ampicilina e X-gal ( 5-bromo, 4-cloro, '3-indoil- beta -D galactósido). 0 ADN isolado das colónias azuis foi sujeito à pesquisa de fragmentos intercalares (inserts) com o tamanho da IVS, por - electroforese em geis de agarose. As sequências dos exóes foram determinadas por sequenciação Cdideoxy-sequeneing) do ADN da mini-prep. Idealmente apenas os plasmideos que contenham IVS e exóes que mantém o local de leitura Creading frame) do fragmento do gene lacZ, irão dar origem a colónias azuis, e isto dependerá do processamento da mensagem em E. coli (Uaring, R.B., et al., (1985) Cel 1 4&:371-380; Price, J.V. and Cech, T.R. , (1985) Science 228í719-722). De facto, muitos dos plasmideos que originavam uma cor azul-clara nas colónias tinham exóes para os quais o processamento correcto da IVS não gera os locais de 92 10 15

leitura correctos? estes não foram mais investigados. 0 plasmidec pBGST7, que produziu uma colónia azul escura, e que tinha tambén o local de leitura esperado, foi o utilizado para estes estudos. tlutaqénese A mutagénese dirigida nos oligonucleótidos no ADN de plasrnídeos foi efectuada essencialmente como é descrito por Inouye, S. and -Inouye M. <1986) in DNA and RNA Synthesis, 3. Narang, ed. <New York: Academic Press), em impressão. Q ADN .do pBQST7 foi submetido a clivagem com Xmnl no gene que codifica a resistência à ampicilina. Numa reacção separada, o ADN do pBGST7 foi cortado com EcoRI e HindiII nos locais que ladeiam as sequências da IVS e do exão. A porção-vector do plasmídeo foi separada do fragmento contendo a IVS por electroforese em gel de agarose e recuperada por electroeluição. 0 ADN cortado por Xmnl foi misturado com o fragmento-vector na presença de oligonucleótido contendo a base modificada, aquecido a 95° C durante 5 min., colocado a-37? C durante 30 min. e depois a. 4° C durante 30 min, e posto em gelo. Os produtos foram tratados com dNTPs e fragmento Klenow pol I de ADN â temperatura ambiente durante 2 horas. A estirpe JM83 da E^_ coli foi transformada com o ADN e as colónias resistentes à ampicilina foram recolhidas com base na respectiva cor < as cores branca e azul-clara indicam perca de actividade de processamento), e o ADN da miniprep foi sequenciado. Os mutantes duplos foram feitos usando o ADN de plasrnídeos de mutantes simples pesquizando a presença de actividade restaurada da beta-galactosidase. 0 pB6/-2G:23C foi feito a 93 35

©.077

Bef: RJW/Oniversity Patents-ENA Ribozyne partir do pBG/-2G , e dirigiu-se um segundo nucleót-ido à posição 23. 0 pBG/—3G:24C foi feito a partir do pBG/24C usando um oligonucleótido dirigido á posição -3. G pBG/—4G:2SC foi feito gerando um heteroduplex circular a partir do pBG/-4G:2-5C que tinha sido linearizado em posiçSes diferentes. A transformação destes het-eroduplexes origina colónias azuis-escuras e azuis-claras, ambos com frequências baixas. As colónias azuis correspondem â estirpe selvagem e as azuis-claras aos mutantes duplos. □SPTT1A3 □ fragmento Thal do gene do ARN ribossomal da Tetrahymena contém a IVS e pequenas quantidades dos exbes que a ladeiam. Gs ligadores Clinkers) Hind ill foram ligados aos terminais do fragmento Thal e este foi inserido no local do Hind III do poliligador Cpolylinker) dó pSPS2 CNew England Nuclear), que contém o promotor SP6. 0 plasmideo recombinante foi clonado em E. oo1i usando métodos Standard. ΡΪ7ΤΤ1Α3: A construção do pT7TTlA3 foi idêntica à do pSFTT1A3 excepto que o fragmento Thal foi clonado no Cinto the) local Hind III do pT7-2 CU.S. Biochemical Corp.), que contém o promotor T7.

Plasmideo pT7 L-21 G pBGST7 Cdescrito por Been & Cech, C138S) Cell £7:207) foi submetido a clivagem com as endonucleases de restrição Sphl e 34 5 10 15 -lOOOffex,: : fs·i .. 20

25 30

S 35

Hind III, e purificou-se o pequeno fragmento contendo a IVS sem os seus primeiros 44 nucieótidos. 0 pUCIS foi submetido . a clivagem com SpH I e Hind III, misturado com o fragmento cortado pela Sphl e Hind III e tratado com ADN-ligase. Transformaram-se as células de E.co1i escolheram-se as colónias, o plasmideo foi isolado de colónias individuais e sequenciado. Foi seleccionado para os passos seguintes um plasmideo contendo o fragmento da IVS cortado por Sphl e Hind III correctamente inserido no pUCIS. Este plasmideo foi submetido a clivagem com as endonucleases de restrição Sphl e EcorI e inseriu-se um oligonucleótido sintético no plasmideo usando ADN-ligase. Q oligonucleótido sintético continha metade do local de restrição da ÉcorI, o promotor T7 e os nucieótidos 22-44 da IVS da Tetrahvmena. terminando no local da Sphl. Transformàram-se as colónias de £. coli, escolheram-se as colónias, isolou-se e sequenciou-se o ADN do plasmideo de colónias individuais. Verificou-se por análise à sequência que o plasmideo final pT7L-21' continha "o promotor T7 correctamente justaposto ao nucleótido 22 da IVS Cvejam-se as Figs. 16 e 19). Este método pode ser utilizados para criar troços de ARN previamente definidos. Por exemplo, esses troços definidos podem ser os troços terminais 5' OH ou 3' OH, ou troços centrais contendo o sitio activo, para o estudo e produção de formas variantes de ARN. 95 f γ·.

52.077 Bef: RJW/University Patents-KNA Rtbozyme

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 TABELA I - Locais de clivagem de substractos ARN de grandes dimensões pela L-19 IVS ARN selvagem

Substracto Local Tamanho Cnt) sequência 10 1 (h 1 H pAl >105 (l-globln prt-mRNA) 1 148 uccucu ^CCCUC 2 464 AACUC0 AAGAG PT' -1 (pBR322) ’ 1 145 UCCCUU 0UUUG 15 2 556 CACUCU CAGUA 3 603 UAUUUU cuccu 4 ,605 OCCUCU AGAGU Consenso observado · 20 ujcucu esperado c | CjjCUCU

C*3 Tamanho do fragmento marcado com STP CT3 As sequências estão apresentadas na direcçao 5'-3". As setas indicam os locais de clivagem e de adição de guanosina.

¢¢) A sequência-consenso prevista é baseada na sequência conhecida no terminal do exão 5" CCUCUCU3, modificada tendo em conta que tanto C como U na posição -5 podem emparelhar-se com G no sitio activo. Há evidência que leva a pensar que uma C não seja tão boa como uma U na posição -l.CDavies, R.W. , et al., C19823 Nature 300:710-724? Michel, F. et al., ¢19833 EMBQ J. 2:33-38? Inoue, T., et al., C19863 J. Mol.BiOl. 189:143-1653 96 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/Ú7 20 25 30 52.077Bef: RJW/University Patents-BNA Rxbozyme

UTP CTP uc ccAA CU uu cuAUU

Aceitante — Actividade relativa dos diferentes ac e itado r es na t r ansf osf orilação. Actividade Aceitante Actividade - ~ uuu 1 ' - ucu - ccu +/“ - AU, - - cu, - - c4u ++ - c, ++ - ué +/- · ! — dC, E-p foi incubado com oligonucleótido Cou mono- ou dinucleótido) 10 uM, em MgC12 20 mM e Tris-HCl 50 mH, pH=7.S, a 42 °C durante 30 minutos. A transferência do fosfato para o oligonucleótido foi avaliada. . por- . ..eleetroforese em gel sequenciador e. auto-radiografia. ++, actividade apro:-íimadamente igual a de CSj +/-, actividade dificilmente detectável (cerca de 1% da de C5).s - , actividade não detectada nestas condiçSes. 97 35

1 TABELA '3 - Parâmetros cinéticos da reaccão de clivagem de

substractos oligonucleótido com a L-21 Seal ARN 5 mal emparelhado

Substracto kcat Km kcat/Km à6J -5 -3 ímin-1) (uM) ímin-ΙμΜ-Ι) (Kcal/mol) 10 15 -* -J . GGCÇCÇCU1AAAAA GGCÇCACUAAAAA GCCÇCgCUAAAAA GGCÇCACUAAAAA GGQ>C£CUAAAAA GGCyC^CUAAAAA GGCyCQCUAAAAÂ GGCyCliCUAAAAA CA 3.7 0.14 . A-A 1.7 0.3 G-A 1.0 0.3 0.04 i 0.01 0.16 ±0.06 U-G , C-A 7.2 6.3 U-G A-A 1.0 3.9 • U-G 1 G-A 0.7 1.7 U-G 0.15 0,13

— · 26 6 -6.7 3 -6.7 0.3 -10.9 1 -3.6 . 0.3 -3.6 0.4 -3.6 | j > -7.S

Mod. 71-10000 ex. 89/07 20 ( ) Qs substractos foram incubados com L-21 Seal ARN 0.01 uM em condições reaecionais standâdard a 502 C na ausência de ureia Cveja-se Materiais e Métodos). No caso do substracto GGCÇCUCUA5, efectuaram-se três análises cinéticas completas abrangendo a gama de concentrações de substracto entre 0.1 e C ) uM. Encontrâm-se tabelados o valor médio de kcat +- (desvio padrão), e os valores ’ 25 de Km determinados a partir dos três gráficos de Lineweaver-Burk.

Em todos os outros casos, kcat e Km foram estimados com base em medidas efectuadas a concentrações de substracto iguais a 0.10 e 1.0 uM. Embora o valor relativo dos valores de kcat e de Km fosse reprodutível nas várias experiências, os valores absolutos variaram, de um factor máximo igual a dois. Cb) Variação da energia livre estimada para a formação do complexo ribozima-substracto a 502 C, baseada em parâmetros termodinâmicos obtidos 30 de estudos com oligorribonucleôtidos (Freier et al., 1386), s corrigidos para 502 C usando os valores para á H2 e β S2 determinados por TurnerC comunicação pessoal). Estes parâmetros partem do principio de que todos os maus emparelhamentos sao igualmente desestabilizadores; medidas termodinâmicas sobre o efeito dos maus emparelhamentos no ADN indicam que um mãe emparelhamento C.A é menos estável que os maus emparelhamentos A.A ou G.a (Aboul-ela et al. 198-5). 38 52.077

Bef: RJW/University Patents-KNA Rlbozynie

GGCCCCGCUA5

TABELA urei afecta a c 1 ivagem de pr incipaImante devi do à muda nça do :cat. Cureia3 Km Vmax kcat kcat/Km CM) CpM) CjjM m i n-í) C mi η—1> (μΜ-1 min 0 0.89 0.020 2.0 2.2 LO 0.83 0.025 2.5 3.0 1J 0.50 0.016 1.6 3.2 2.0 0.74 0.009 0.9 1.2 2.5 0.70 0.004 0.4 0.6 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 30 C ) Dados da figura 5. A temperatura foi de 502 C. '39 35

52.077

Ref: RJW/University Patents-RKA Ribozyme 5 TABELA 5 - Nome da Especificidade** Interseção μ X * Ribozima * r ibozima-substrac to

Condições reacc ionais J: x *

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 30

JC 10 20 25 Ribozima selvagem 5' -GAG C U C GTP 5'-6GGACC0C G^At | | | | . como foi descrito Ribozimas variantes ^-G G £ A £ G "5' 3' GCC <C) G G C 0^ GGG~ACGGC 0½¾ 1 1 1 Ια G £ £ S G © 20 mM MgCl, 2.5 M Urea 50 mM Tris pH 7.5 0.5 mM GTP GGT (C) iCC^ GGGACACC 0J-A5 .1111· G G 3. S £ G igual a ®‘ TGT (C) A C A. 0^ GGGACACA 0^"Ag IIM· 5 5 5'Sje @ 600 mM MH.Ac 20 mM MgCl2 50 mM Tris pH 7.5 0.5 mM GTP TTA (C) ϋ A A 0^ GGGACOAA O^Ac MM · G G A 2 U G © 100 mM NH.Ac 20 mM MgCl2 50 mM Tris pH 7.5; 0.5 mM GTP TTC (C) G A A U-*· GGGACGAA D^Ae I 1 l-l · G G £ 0 Π G igual a @ AAT (C) A 0· 0 0^ GGGACAU0 O^Ag 1 Ml· G G a A A G 20 mM MgCl2 50 mM Tris pH 7.5 0.5 mM GTP ou igual a @ Ofc) A designação do sitio activo C à sequência do das ribozimas faz-se de acordo com a sequência 2ã, 32 e 4â posições!, determinadas por análise ADN do plasmideo que codifica a ribozima. A primeira posição é sempre G, por isso não é incluída na designação.

Ct:*:) - A seta representa o local de adição do GTP. 0 CC) representa um nucleótido cuja contribuição para a clivagem não foi avaliada. ( ) - Em cada diagrama, a cadeia superior representa o substracto oligorribonucleótido testado. A cadeia inferior representa o troço da sequência da ribozima que faz parte do centro activo e que determina a especificidade em relação ao substracto. Qs nucleótidos sublinhados indicam as posições em que á baseada a designação da ribozima. (Note-se que a direcção 5'-3' corresponde à direcção da esquerda para a direita para a cadeia inferior, e da direita para a esquerda para a cadeia superior. Note-se igualmente que a um T no AQN corresponde um U no ARN). <$***) - NH4Ac corresponde a NH4C2H302. 100

Claims

S 1 10 15 62077 RJW/University Patents-RNA Ribozyme

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 - REIVINDICAÇÕES - 1ã.- Método para a clivagem específica de uma molécula RNA separada caracterizado por se proporcionar uma molécula RNA enzimática que tem uma actividade endonuclease independente de qualquer proteína, sendo a referida actividade endonuclease específica para uma sequência nucleótida que define um local de clivagem na molécula RNA separada, e por se pôr em contacto as referidas molécula RNA enzimática e molécula RNA separada para permitir que a referida actividade endonuclease provoque a clivagem específica da referida molécula RNA separada na referida sequência nucleótida/ 2â.— Método de acordo com a reivindicação 1 em que a molécula RNA enzimática tem uma actividade endonuclease independente de qualquer proteína, sendo a referida actividade endonuclease específica para uma sequência nucleótida que define um local de clivagem numa molécula RNA separada, caracterizado por o referido local de clivagem ser escolhido entre GGCXJ, ACCC, ACAU, UAAU, GAAU e ADUU. 3i.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado também por a referida molécula RNA enzimática ser separada de outras moléculas RNA e oligonucleótidos. 4ã.- Método de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado também, por a referida actividade endonuclease ser específica para uma sequência nucleótida que define um local de clivagem constitui-do essencialmente por uma zona de faixa única. 5â.- Método ce acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 3, caracterizado também por a referida actividade endonuclease dar origem a clivagem no referido local de clivagem por uma reacção de tran-sesterificação, 6â.- Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado também por a referida molécula RNA enzimática compreender uma zona local activa substancialmente homóloga da zona de local activa de uma molécula RNA existe naturalmente em Tetrahyrnena. - 101 - 35 4 1 10 15 62077 BJW/Univers ity Patents-RNA Ribozyme

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 7a.- Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado também por as referidas moléculas RNA enzimã-ticas terem um pH õptino para a referida actividade endonuclease entre 7,5 e 8,0. 8â.— Método de acordo ccm uma qualquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado também por a referida actividade endonuclease necessitar da presença de iões magnésio, um desnaturante ou um derivado de guanina. 9â.- Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado também por a referida actividade endonuclease necessitar da presença de um catião divalente. 10ã.- Método de acordo com a reivindicação 9, caracteri·· zado também por o referido catião divalente ser Mg^+. 11a.- Método de acordo com a reivindicação 6, caracteri·· zado também por a referida molécula RNA enzimãtica compreender substan-cialmente a sequência de base ribonucleõtida de sequência SNA. interveniente L-19 que tem uma sequência de base nucleõtida no seu local activo diferente da da L-19 isolada a partir de Tetrahymena. 12i.- Método de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado também por o referido local activo estar localizado em posições 22 a 25 numa sequência RNA interveniente isolada a partir de Tetrahymena. Lisboa, $01990 Por UNIVERSITY PAEENTS INC. 0 AGENTE OFICIAL

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