JP2003000268A - 血管新生にかかわる疾患を診断および治療するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 血管新生にかかわる疾患と関連のある核酸
配列に関する組成物および方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、癌などの血管新生関連疾患と
関連のある新規遺伝子であるイヌエンドスタチン遺伝子
に関する。また、エンドスタチン核酸、組換えDNA分
子、クローニングされた遺伝子、またはその縮重変異
体、エンドスタチン遺伝子産物、およびこのような遺伝
子産物を標的とする抗体、哺乳動物エンドスタチン遺伝
子分子を含むクローニングベクター、ならびにこのよう
な分子を発現するように遺伝子改変された宿主が含まれ
る。本発明はさらに、エンドスタチン遺伝子および遺伝
子産物の発現を調節する化合物の同定のための方法、お
よび、これを癌などの血管新生関連疾患の治療における
治療薬としての使用にも関する。また、癌などの血管新
生関連疾患の診断的評価、遺伝子検査、および予後判定
のための方法、ならびにこれらの疾患の治療のための方
法および組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、本明細書において
血管新生の調節に関連していることを示すポリヌクレオ
チド配列に関する。より詳細には、本発明は、血管新生
阻害因子エンドスタチン、より詳細にはイヌ血管新生阻
害因子をコードする新規ポリヌクレオチド配列に関す
る。本発明には、エンドスタチン核酸、組換えDNA分
子、クローニングされた遺伝子およびその縮重変異体、
このようなエンドスタチン核酸を含むベクター、ならび
にこのような分子を発現および／または含有するように
遺伝子操作を受けた宿主が含まれる。本発明はさらに、
エンドスタチン遺伝子産物およびこのような遺伝子産物
を標的とする抗体に関する。本発明はさらに、このよう
なエンドスタチン核酸の発現、合成、および活性を調節
する化合物の同定のための方法、ならびに本明細書で治
療薬として同定されたものなどの化合物を、癌を非制限
的に含む血管新生関連疾患の治療に用いる方法に関す
る。本発明はまた、癌を非制限的に含む血管新生関連疾
患の診断的評価、遺伝子検査、および予後判定のための
方法にも関する。

【０００２】

【従来の技術】血管新生は、既存の血管からの新たな血
管の成長または出芽と定義され、主として胚発生中に起
こる複雑な過程である。成体における通常の生理的条件
下では、血管新生は発毛および創傷治癒などの極めて限
定された状況でしか起こらない（Auerbach, W.およびAu
erbach, R.、1994、Pharmacol Ther 63（3）：265〜31
1；Ribattiら、1991、Haematologica 76（4）：311〜2
0；Risau、1997、Nature 386（6626）：671〜4）。無秩
序な血管新生は、癌、心血管疾患、慢性関節リウマチ、
乾癬、および糖尿病性網膜症を非制限的に含むさまざま
な疾患の原因であることが次第に認識されてきている
（Folkman、1995、Nat Med 1（1）：27〜31；Isner、19
99、Circulation 99（13）：1653〜5；Koch、1998、Art
hritis Rheum 41（6）：951〜62；Walsh、1999、Rheuma
tology（Oxford）38（2）：103〜12；WareおよびSimon
s、1997、Nat Med 3（2）：158〜64）。特に関心がもた
れるのは、固形腫瘍の増殖および転移には血管新生が必
要であるという観察結果である（Folkman、1986、Cance
r Res、46（2）467〜73．Folkman 1990、J Natl. Cance
rInst.、82（1）4〜6、Folkman、1992、Semin Cancer B
iol 3（2）：65〜71；Zetter、1998、Annu Rev Med 4
9：407〜24）。腫瘍は通常、単一の異常細胞として生じ
るが、利用可能な毛細血管床から離れているために数立
方ミリメーターのサイズにしか増殖できず、それ以上増
殖および播種を行わない「休眠」状態を長期間にわたっ
て保つ。続いて一部の腫瘍細胞が血管形成性表現型に切
り替わって内皮細胞を活性化し、その増殖および成熟に
よって新たな毛細血管が生じる。これらの新生血管によ
り、原発性腫瘍の連続的増殖が可能になるだけでなく、
転移性腫瘍細胞の播種および再定着も可能になる。この
血管形成性スイッチを制御する正確な機構は十分には解
明されていないが、腫瘍塊の血管新生は多数の血管新生
刺激因子および阻害因子の正味のバランスに起因するも
のと考えられている（Folkman、1995、Nat Med 1
（1）：27〜31）。

【０００３】最も強力な血管新生阻害因子の一つが、オ
ライリー（O'Reilly）およびフォークマン（Folkman）
によって同定されたエンドスタチンである（O'Reilly
ら、1997、Cell 88（2）：277〜85；O'Reillyら、199
4、Cell 79（2）：315〜28）。その発見は、ある種の原
発性腫瘍が離れた転移巣の増殖を抑制しうるという現象
に基づく。オライリー（O'Reilly）およびフォークマン
（Folkman）は、原発性腫瘍が血管新生刺激因子を阻害
因子よりも過剰に産生することによって血管新生を引き
起こすと仮定した。しかし、血管新生阻害因子の方が血
中循環系の半減期は長いため、転移性腫瘍の部位には刺
激因子よりも多く到達する。これを総合すると、原発性
腫瘍の増殖および二次腫瘍の抑制という結果に至る。原
発性腫瘍によって産生されるこのような血管新生阻害因
子は次々と明らかになっており、エンドスタチンはその
一つである。これはより大きなタンパク質の分解断片で
あり、すなわちエンドスタチンはコラーゲンXVIIIの20k
Da断片である （マウスコラーゲンXVIIIのアミノ酸H113
2〜K1315）。エンドスタチンはインビトロで内皮細胞増
殖を特異的に抑制し、インビボで血管新生を阻止するこ
とが示されている。さらに重要なことに、腫瘍を有する
マウスへのエンドスタチンの投与によって腫瘍が著明に
縮退し、多数の治療サイクルの後にも毒性および薬剤抵
抗性は認められていない（Boehmら、1997、Nature 390
（6658）：404〜407）。エンドスタチンが遺伝的に安定
な内皮細胞を標的とし、種々の固形腫瘍を抑制するとい
う事実から、これは抗癌療法の極めて有望な候補である
（FidlerおよびEllis、1994、Cell 79（2）：185〜8；G
astlら、1997、Oncology 54（3）：177〜84；van Hinsb
erghら、1999、Ann Oncol 10 Suppl 4：60〜3）。さら
に、血管新生阻害因子は、放射線または化学療法薬との
併用によってさらに効果が高まることが示されている
（Klement、2000、J. din Invest、105（8）R15〜24. B
rowder、2000、CancerRes. 6〜（7）1878〜86、Arap
ら、1998、Science 279（5349）：377〜80；Mauceri
ら、1998、Nature 394（6690）：287〜91）。

【０００４】癌はヒトにとって破壊的であるだけでな
く、イヌでも自然死の最も一般的な原因である（Bronso
n、1982、Am J Vet Res、43（11）2057〜9）。イヌでの
腫瘍の発生頻度はヒトの2倍であり、10年またはそれ以
上生きたイヌの45〜50％は癌が原因で死亡すると報告さ
れている；また年齢にかかわらず、剖検がなされたイヌ
の23％は癌が原因で死亡している（Bronson、1982、Am
J Vet Res、43（11）2057〜9）。腫瘍の外科的切除は最
も多くなされる治療であるが、浸潤性／転移性腫瘍に関
する予後は極めて不良であり、生存期間の中央値は数週
間から数カ月の範囲である。放射線療法および化学療法
などの他の治療法の成功率は極めて限られている（Bost
ock、1986、Br Vet J 142（6）：506〜15；Bostock、19
86、Br VetJ 142（1）：1〜19；MacEwen、1990、Cancer
Metastasis Rev 9（2）：125〜36）。このため、例え
ばイヌ癌などの血管形成性疾患に対するさらに有効な治
療法が必要である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明では、血管新生
にかかわる疾患と関連のある核酸配列に関する組成物お
よび方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明には、血管新生関
連疾患、例えば癌と関連のある新規ヌクレオチド配列が
含まれる。本発明は、より詳細には、エンドスタチンを
コードするヌクレオチド配列に関する。さらに、エンド
スタチン核酸、組換えDNA分子、クローニングされた遺
伝子、またはその縮重変異体も本明細書で提供される。
また、本発明は、エンドスタチン核酸分子を含む、発現
ベクターを含むベクター、ならびにこのようなエンドス
タチン遺伝子産物を発現および／または含有するように
遺伝子操作を受けた宿主も提供する。

【０００７】本発明はさらに、新規エンドスタチン遺伝
子産物、およびこのような遺伝子産物を標的とする抗
体、またはその変異体もしくは断片に関する。

【０００８】本発明はさらに、疾患の少なくとも1つの
症状の改善または予防を含む、エンドスタチンを介する
過程の調節のため、および癌などの血管新生がかかわる
疾患の治療のための方法であって、エンドスタチン遺伝
子の発現および／またはエンドスタチン遺伝子産物の合
成もしくは活性を調節する化合物を投与する段階を含む
方法に関する。1つの態様において、本発明は、このよ
うな疾患の症状を治療または改善するための、新規エン
ドスタチン遺伝子産物またはその断片、類似体もしくは
模倣物、またはエンドスタチン遺伝子産物を標的とする
抗体もしくは抗体断片の使用に関する。

【０００９】このような疾患には、血管新生に依存的な
癌、例えば固形腫瘍、白血病などの血液由来の腫瘍、お
よび腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神
経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；慢性関節
リウマチ；乾癬；眼の血管原性疾患、例えば、糖尿病性
網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶反
応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシ
ス；オスラー・ウェバー症候群；心筋血管新生；プラー
ク血管新生（plaque neovascularization）；末梢血管
拡張症；血友病性関節症；血管線維腫；創傷肉芽化；冠
動脈側副路（corornary collateral）；脳側副路（cere
bral collateral）；動静脈奇形；虚血肢（ischemic li
mb）血管新生；糖尿病性血管新生；黄斑変性症；骨折；
脈管形成；血球新生；排卵；月経；ならびに胎盤形成が
含まれるが、これらに限定されることはない。

【００１０】本発明はさらに、疾患の少なくとも1つの
症状の改善または予防を含む、エンドスタチンを介する
過程の調節のため、および内皮細胞の異常刺激がかかわ
る疾患の治療のための方法であって、エンドスタチン遺
伝子の発現および／またはエンドスタチン遺伝子産物の
合成もしくは活性を調節する化合物を投与する段階を含
む方法に関する。1つの態様において、本発明は、この
ような疾患の症状を治療または改善するための、新規エ
ンドスタチン遺伝子産物またはその断片、類似体もしく
は模倣物、またはエンドスタチン遺伝子産物を標的とす
る抗体もしくは抗体断片の使用に関する。

【００１１】本発明の内皮細胞増殖阻害タンパク質は、
内皮細胞の過剰または異常な刺激による疾患の治療に有
用である。これらの疾患には、腸管癒着、アテローム性
動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕、すなわちケロ
イドが含まれるが、これらに限定されることはない。こ
れはまた、病態の結果として血管新生を有するネコひっ
かき病（Rochele minalia quintosa）および潰瘍（Helo
bacter pylorri）などの疾患の治療にも有用である。

【００１２】本発明はさらに、受容体アンタゴニストと
して作用する類似体を用いて、エンドスタチンとその各
々の受容体との間の相互作用を遮断するための方法にも
関する。これらのアンタゴニストは内皮化および血管新
生を促進すると思われる。このような効果は、子宮内膜
の血管新生不全およびそれに関連した不妊、創傷修復、
切傷および切創の治癒、糖尿病における血管障害、特に
網膜および末梢血管障害の治療、筋肉および皮膚を含む
移植組織の血管新生の促進、特に心臓および心臓組織の
移植後ならびにバイパス手術後の心筋の血管新生の促
進、サイトトキシン送達強化のための充実性および比較
的無血管性の腫瘍の血管新生の促進、ならびに大脳皮質
および脊髄を非制限的に含む神経系への血流の増加、を
非制限的に含む状況において望ましいと考えられる。

【００１３】本明細書で用いる「エンドスタチン関連疾
患」という用語は、エンドスタチン遺伝子もしくは遺伝
子産物、または、正常で罹患していない障害のない個体
で認められるレベル、臨床的に正常な個体で認められる
レベル、および／もしくはそのレベルがベースラインの
平均エンドスタチンレベルである集団で認められるレベ
ルのそれぞれと対比して、エンドスタチン遺伝子の発
現、遺伝子産物の合成、および／もしくは遺伝子産物の
活性のレベルの異常がかかわる疾患のことを指す。

【００１４】本明細書で用いる「エンドスタチンを介す
る過程」という用語には、エンドスタチン遺伝子の発
現、遺伝子産物の合成、および／または遺伝子産物の活
性のレベルに、直接的または間接的のいずれかで、依存
および／または反応する過程が含まれる。

【００１５】もう1つの態様において、このような方法
は、エンドスタチンを介する過程または疾患が治療され
るように、例えば症状の改善がなされるように、細胞に
おけるエンドスタチン遺伝子産物の発現または活性のレ
ベルを調節することを含みうる。もう1つの態様におい
て、このような方法は、エンドスタチンを介する過程ま
たは疾患が治療されるように、例えば症状の改善がなさ
れるように、細胞内のエンドスタチン遺伝子産物のレベ
ル、発現、または活性を高めるためにエンドスタチン遺
伝子産物をコードする核酸分子を供給することを含みう
る。エンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子
は、活性または発現レベルが高い変異型エンドスタチン
遺伝子産物をコードしうる。

【００１６】本発明はさらに、エンドスタチンを介する
過程の調節のため、またはエンドスタチン遺伝子の変異
および／もしくはエンドスタチンの発現もしくは活性の
レベルの異常に起因する疾患、ならびに1つもしくは複
数のエンドスタチン遺伝子もしくは遺伝子産物がかかわ
る疾患を非制限的に含む、癌などのエンドスタチン関連
疾患の治療のための方法であって、治療がこのような疾
患の少なくとも1つの症状の改善または予防を含むよう
な方法にも関する。1つの態様において、このような方
法は、治療を必要とする哺乳動物に対して、障害のない
エンドスタチン遺伝子産物が発現されて疾患が治療され
るように、例えば症状が改善されるように、障害のない
エンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を供給
することを含みうる。もう1つの態様において、このよ
うな方法は、治療を必要とする哺乳動物に対して、細胞
が障害のないエンドスタチン遺伝子産物を発現して疾患
が治療される、例えば症状が改善されるように、障害の
ないエンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を
含む細胞を供給することを含みうる。さらにもう1つの
態様において、このような方法は、治療を必要とする哺
乳動物に対して、エンドスタチン遺伝子または遺伝子産
物の活性を調節しうる、例えば小分子、ペプチド、また
は抗体などの調節化合物を供給することを含む。

【００１７】さらに、本発明は、癌などの血管新生関連
疾患の診断的評価、遺伝子検査、および／または予後判
定のために、エンドスタチン遺伝子配列および／または
エンドスタチン遺伝子産物配列を用いる方法を指向す
る。例えば、本発明は、癌などの血管新生関連疾患を診
断するための方法であって、患者試料におけるエンドス
タチン遺伝子の発現を測定すること、またはこのような
疾患を呈している疑いのある哺乳動物のゲノムにおけ
る、このような疾患の存在もしくは発生と相関するエン
ドスタチン変異を検出することを含みうる方法に関す
る。

【００１８】本発明はまた、ヒト染色体のマッピングの
ためのマーカーとして、エンドスタチン遺伝子配列およ
び／または遺伝子産物を用いることも指向する。

【００１９】本発明はさらに、エンドスタチン遺伝子の
発現および／またはエンドスタチン遺伝子産物の合成も
しくは活性を調節しうる化合物を同定するための方法で
あって、化合物をこのようなエンドスタチン遺伝子を発
現する細胞と接触させる段階、エンドスタチン遺伝子発
現、遺伝子産物発現、または遺伝子産物活性のレベルを
測定する段階、ならびにこのようなレベルをこのような
化合物の非存在下での細胞によるエンドスタチン遺伝子
発現、遺伝子産物、または遺伝子産物活性のレベルと比
較する段階を含み、化合物の存在下で得られたレベルが
非存在下で得られたレベルと異なる場合にエンドスタチ
ン遺伝子の発現および／またはエンドスタチン遺伝子産
物の合成もしくは活性を調節しうる化合物が同定される
方法にも関する。

【００２０】定義 本明細書で用いる場合、以下の用語には表記した略号が
存在するものとする。 BAC：細菌人工染色体 bp：塩基対 dbEST：発現配列タグデータベース（米国国立バイオテ
クノロジー情報センター（Natlonal Center for Biotec
hnology Information）） EST：発現配列タグ RT-PCR：逆転写酵素PCR SSCP：一本鎖DNA高次構造多型 SNP：一塩基多型 YAC：酵母人工染色体

【００２１】本発明に係る単離核酸分子においては、
（１）a）配列番号：2に示されたポリペプチド、または
b）配列番号：4に示されたポリペプチドを含むエンドス
タチンをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸
分子であることを特徴とする。

【００２２】また、本発明に係る単離核酸分子において
は、（２）a）配列番号：1に示された核酸、またはb）
配列番号：3に示された核酸を含む、単離核酸分子であ
ることを特徴とする。

【００２３】また、本発明に係る単離核酸分子において
は、（３）上記(1)または(2)に記載の核酸分子の相補物
を含む、単離核酸分子であることを特徴とする。

【００２４】また、本発明に係る単離核酸分子において
は、（４）上記(1)または(2)に記載の核酸分子の相補物
と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
単離核酸分子であることを特徴とする。

【００２５】また、本発明に係る単離核酸分子において
は、（５）上記(1)または(2)に記載の核酸分子と中程度
にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単
離核酸分子であることを特徴とする。

【００２６】また、本発明に係る単離核酸分子において
は、（６）エンドスタチンが、ニワトリ、ヒト、または
マウスのエンドスタチンでないという条件で、単離核酸
分子がエンドスタチンをコードする、上記(4)記載の単
離核酸分子であることを特徴とする。

【００２７】また、本発明に係る単離核酸分子において
は、（７）エンドスタチンが、ニワトリ、ヒト、または
マウスのエンドスタチンでないという条件で、単離核酸
分子がエンドスタチンをコードする、上記(5)記載の単
離核酸分子であることを特徴とする。

【００２８】また、本発明に係るベクターにおいては、
（８）上記(1)または(2)に記載の核酸を含むベクターで
あることを特徴とする。

【００２９】また、本発明に係る発現ベクターにおいて
は、（９）核酸によってコードされるポリペプチドの発
現を制御する調節性核酸と機能的に関連した上記(1)ま
たは(2)に記載の核酸を含む発現ベクターであることを
特徴とする。

【００３０】また、本発明に係る宿主細胞においては、
（１０）上記(1)または(2)に記載の核酸を含むように遺
伝子操作を受けた宿主細胞であることを特徴とする。

【００３１】また、本発明に係る宿主細胞においては、
（１１）核酸によってコードされるポリペプチドの発現
を制御する調節性核酸と機能的に関連した上記(1)また
は(2)に記載の核酸を発現するように遺伝子操作を受け
た宿主細胞であることを特徴とする。

【００３２】また、本発明に係るトランスジェニック非
ヒト動物においては、（１２）上記(1)または(2)に記載
の核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝子操作を受け
たトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とす
る。

【００３３】また、本発明に係るトランスジェニック非
ヒト動物においては、（１３）導入遺伝子が発現され
る、上記(12)記載のトランスジェニック非ヒト動物であ
ることを特徴とする。

【００３４】また、本発明に係る単離ポリペプチドにお
いては、（１４）（a）配列番号：2、またはb）配列番
号：4のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドである
ことを特徴とする。

【００３５】また、本発明に係る抗体においては、（１
５）上記(14)記載の単離ポリペプチドと結合する抗体で
あることを特徴とする。

【００３６】また、本発明に係る単離ポリペプチドにお
いては、（１６）上記(4)記載の単離核酸分子によって
コードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドで
あることを特徴とする。

【００３７】また、本発明に係る単離ポリペプチドにお
いては、（１７）上記(5)記載の単離核酸分子によって
コードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドで
あることを特徴とする。

【００３８】また、本発明に係る単離融合ポリペプチド
においては、（１８）融合ペプチド、およびa）配列番
号：2、またはb）配列番号：4のアミノ酸配列を含む、
単離融合ポリペプチドであることを特徴とする。

【００３９】また、本発明に係る単離融合ポリペプチド
においては、（１９）融合ペプチドおよび上記(4)記載
の単離核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含
む、単離融合ポリペプチドであることを特徴とする。

【００４０】また、本発明に係る単離融合ポリペプチド
においては、（２０）融合ペプチドおよび上記(5)記載
の単離核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含
む、単離融合ポリペプチドであることを特徴とする。

【００４１】また、本発明に係る方法においては、（２
１）対象におけるエンドスタチン配列の機能、活性およ
び／または発現を調節する化合物を対象に投与する段階
を含む、対象における血管新生関連疾患を治療するため
の方法であることを特徴とする。

【００４２】また、本発明に係る方法においては、（２
２）化合物が、エンドスタチン配列の機能、活性、およ
び／または発現を増強または上昇させる、上記(21)記載
の方法であることを特徴とする。

【００４３】また、本発明に係る方法においては、（２
３）化合物が、有機低分子、抗体、リボザイム、または
アンチセンス分子からなる群より選択される、上記(21)
または(22)に記載の方法であることを特徴とする。

【００４４】また、本発明に係る方法においては、（２
４）血管新生関連疾患が、癌；固形腫瘍、白血病などの
血液由来の腫瘍、および腫瘍転移を含む、血管新生に依
存的な癌；血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ
および化膿性肉芽腫を含む良性腫瘍；慢性関節リウマ
チ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性
症、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線
維増殖、ルベオーシスを含む、眼の血管原性疾患；オス
ラー・ウェバー症候群；心筋血管新生；プラーク血管新
生（plaque neovascularization）；末梢血管拡張症；
血友病性関節症；血管線維腫；創傷肉芽化；冠動脈側副
路（corornary collateral）；脳側副路（cerebral col
lateral）；動静脈奇形；虚血肢（ischemic limb）血管
新生；糖尿病性血管新生；黄斑変性症；骨折；脈管形
成；血球新生；排卵；月経；ならびに胎盤形成からなる
群より選択される、上記(21)または(22)に記載の方法で
あることを特徴とする。

【００４５】また、本発明に係る方法においては、（２
５）エンドスタチン配列が、a）配列番号：2、または
b）配列番号：4を含むアミノ酸配列をコードする、上記
(21)記載の方法であることを特徴とする。

【００４６】また、本発明に係る方法においては、（２
６）対象がイヌである、上記(21)記載の方法であること
を特徴とする。

【００４７】また、本発明に係る方法においては、（２
７）エンドスタチン配列の発現を調節する化合物を同定
するための方法であって、a）被験化合物と、エンドス
タチン配列を発現する細胞とを接触させる段階、b）細
胞におけるエンドスタチン配列の発現レベルを測定する
段階、c）被験化合物の存在下での細胞におけるエンド
スタチン配列の発現レベルと、被験化合物の非存在下で
の細胞におけるエンドスタチン配列の発現レベルとを比
較する段階を含み、被験化合物の存在下での細胞におけ
るエンドスタチン配列の発現レベルが、被験化合物の非
存在下での細胞におけるエンドスタチン配列の発現レベ
ルと異なる場合に、エンドスタチン配列の発現を調節す
る化合物が同定される方法であることを特徴とする。

【００４８】また、本発明に係る方法においては、（２
８）エンドスタチン配列が細胞内で内因性に発現され
る、上記(27)記載の方法であることを特徴とする。

【００４９】また、本発明に係る方法においては、（２
９）エンドスタチン配列が、a）配列番号：2、または
b）配列番号：4のアミノ酸配列をコードする、上記(27)
記載の方法であることを特徴とする。

【００５０】また、本発明に係る方法においては、（３
０）エンドスタチン配列が、a）配列番号：1に示された
核酸、またはb）配列番号：3に示された核酸を含む、上
記(27)記載の方法であることを特徴とする。

【００５１】また、本発明に係る方法においては、（３
１）エンドスタチン配列産物の活性を調節する化合物を
同定するための方法であって、a）被験化合物と、エン
ドスタチン配列産物を発現する細胞とを接触させる段
階、b）細胞におけるエンドスタチン配列産物のレベル
を測定する段階、c）被験化合物の存在下での細胞にお
けるエンドスタチン配列産物の活性レベルと、被験化合
物の非存在下での細胞におけるエンドスタチン配列産物
の活性レベルとを比較する段階を含み、被験化合物の存
在下での細胞におけるエンドスタチン配列産物の活性レ
ベルが、被験化合物の非存在下での細胞におけるエンド
スタチン配列産物の活性レベルと異なる場合に、エンド
スタチン配列産物の活性を調節する化合物が同定される
方法であることを特徴とする。

【００５２】また、本発明に係る方法においては、（３
２）エンドスタチン配列産物が、a）配列番号：2、また
はb）配列番号：4を含む、上記(31)記載の方法であるこ
とを特徴とする。

【００５３】また、本発明に係る方法においては、（３
３）細胞におけるエンドスタチン配列の活性および／ま
たは発現を調節する化合物を細胞に投与する段階を含
む、細胞におけるエンドスタチン配列の活性および／ま
たは発現を調節するための方法であることを特徴とす
る。

【００５４】また、本発明に係る方法においては、（３
４）化合物が、有機低分子、抗体、リボザイム、または
アンチセンス分子からなる群より選択される、上記(33)
記載の方法であることを特徴とする。

【００５５】また、本発明に係る方法においては、（３
５）エンドスタチン配列が、a）配列番号：2、または
b）配列番号：4を含むアミノ酸配列をコードする、上記
(33)記載の方法であることを特徴とする。

【００５６】また、本発明に係る方法においては、（３
６）エンドスタチン配列が、a）配列番号：1に示された
核酸、またはb）配列番号：3に示された核酸を含む、上
記(33)記載の方法であることを特徴とする。

【００５７】

【発明の実施の形態】本明細書では、血管新生を伴う疾
患と関連のある核酸配列に関する組成物および方法を記
載する。血管新生関連疾患と関連のある新規遺伝子が同
定された。このような遺伝子はエンドスタチンをコード
する。特に、以下に述べるのは、エンドスタチン核酸分
子、さらに、これらの分子を含むベクター、このような
分子を含有および／または発現するように操作された宿
主細胞、エンドスタチン遺伝子産物、ならびにこのよう
な遺伝子産物を特異的に認識する抗体である。これらの
核酸、ポリペプチドおよび抗体の種々の用途のほか、そ
れらの検出のための方法も記載する。例えば、血管新生
関連過程の調節のため、および癌などの血管新生関連疾
患の治療のための、これらの分子を用いるための方法を
記載する。エンドスタチン遺伝子もしくは遺伝子産物と
相互作用する、またはエンドスタチン遺伝子または遺伝
子産物の活性を調節する化合物に関するスクリーニング
アッセイ法も以下に述べる。本発明の組成物および本発
明の方法によって同定される組成物を用いた血管新生関
連疾患の治療方法もさらに述べる。最後に、本発明の組
成物とともに用いるための薬学的組成物も記載する。

【００５８】この項では、エンドスタチン核酸分子につ
いて述べる。別に特記する場合を除き、「エンドスタチ
ン核酸」という用語は、本明細書に記載される配列を一
括して指す。

【００５９】本発明のエンドスタチン核酸分子には、以
下のものが含まれる： （a）エンドスタチンのDNA配列（図4（配列番号：3））
およびその断片を含む核酸分子； （b）エンドスタチン核酸配列（例えば、図2に示す核酸
配列（配列番号：1））またはその断片を含む核酸分
子； （c）エンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分
子； （d）エンドスタチン遺伝子の少なくとも1つのエキソン
を含む核酸分子； （e）上記の（b）におけるエンドスタチンヌクレオチド
配列の上流非翻訳領域、イントロン領域および／もしく
は下流非翻訳領域のエンドスタチン遺伝子配列、または
それらの断片を含む核酸分子； （f）1つまたは複数のドメインの全体または一部が欠失
または変化したエンドスタチン遺伝子産物の変異体をコ
ードする、本明細書に開示する新規エンドスタチン配列
及びその断片を含む核酸分子； （g）エンドスタチン遺伝子産物またはその断片を含む
異種ポリペプチドと融合した融合タンパク質をコードす
る核酸分子； （h）癌などの血管新生関連疾患のリスクがある、もし
くはそれを呈している個体を同定および診断するための
本発明の方法の一部として用いられうる、またはヒト染
色体のマッピングのために用いられうる、上記の（b）
に記載のエンドスタチン遺伝子の内部（例えば、プライ
マー）、またはエンドスタチン遺伝子と隣接する染色体
ヌクレオチド配列の内部にある核酸分子；ならびに （i）癌などの血管新生関連疾患と相関する、上記の
（b）に記載のエンドスタチン遺伝子の内部、またはエ
ンドスタチン遺伝子と隣接する染色体ヌクレオチド配列
の内部にある核酸分子。

【００６０】本発明のエンドスタチンヌクレオチド配列
にはさらに、1つまたは複数のエキソンまたはその断片
が欠失している、上記の（a）〜（i）のヌクレオチド配
列に対応するヌクレオチド配列が含まれる。

【００６１】また、本発明のエンドスタチンヌクレオチ
ド配列には、エンドスタチンが、ニワトリ、ヒト、また
はマウスのエンドスタチンではないという条件の下で、
上記の（a）〜（i）のエンドスタチンヌクレオチド配列
とのヌクレオチド配列の同一性が少なくとも85％、90
％、95％、98％またはそれ以上であって、長さが20、3
0、40、50、60、70、80、90、100塩基対またはそれ以上
の塩基対を上回るヌクレオチド配列も含まれる。

【００６２】本発明のエンドスタチンヌクレオチド配列
にはさらに、上記の（a）〜（i）のエンドスタチンヌク
レオチド配列によってコードされるポリペプチドとのア
ミノ酸配列の同一性が少なくとも85％、90％、95％、98
％またはそれ以上であるポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列が含まれる。

【００６３】2つのアミノ酸配列または2つの核酸の一致
率を決定するために、最適な比較を目的として配列を整
列化する（例えば、第2のアミノ酸配列または核酸配列
との最適なアラインメントのために、第1のアミノ酸配
列または核酸配列にギャップを導入できる）。続いて、
対応するアミノ酸部位またはヌクレオチド部位でアミノ
酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のあ
る部位が、第2の配列において対応する部位と同じアミ
ノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合に
は、分子はその部位で同一である。2つの配列間の一致
率（percent identity）は、配列が共有する同一な部位
の数の関数である（すなわち、一致率（％）＝同一な重
複する部位の数／重複する位置の総数×100）。1つの態
様において、2つの配列の長さは同一である。

【００６４】2つの配列間の一致率を、数学的アルゴリ
ズムを用いて決定することもできる。2つの配列の比較
に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な
一例には、カーリン（Karlin）およびアルトシュル（Al
tschul）、1993、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90：587
3〜5877のように改変された、カーリンおよびアルトシ
ュル、1990、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87：2264〜2
268のアルゴリズムがある。この種のアルゴリズムは、
アルトシュルら、1990、J. Mol. Biol. 215：403〜410
のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられてい
る。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得る
には、NBLASTプラグラムをスコア＝100、ワード長（wor
dlength）＝12の条件で用いてBLASTヌクレオチド検索を
行うとよい。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸
配列を得るには、XBLASTプラグラムをスコア＝50、ワー
ド長＝3の条件で用いてBLASTタンパク質検索を行うこと
ができる。比較のためのギャップが挿入された整列を得
るためには、アルトシュル（Altschul）ら、1997、Nucl
eic Acids Res. 25：3389〜3402に記載されたGapped BL
ASTを用いることができる。または、分子間の遠隔的な
関係を検出するための反復検索を行うためにPSI-Blast
を用いることもできる（Altschulら、前記）。BLAST、G
apped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを用いる際に
は、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLA
ST）のデフォルトパラメーターを用いうる（http://ww
w.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）。配列の比較のため
に用いられる数学的アルゴリズムのもう1つの好ましい
非制限的な例は、マイヤーズ（Myers）およびミラー（M
iller）、1988、CABIOS 4：11〜17のアルゴリズムであ
る。この種のアルゴリズムは、GCG配列アラインメント
ソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム
（バージョン2.0）に組み入れられている。ALIGNプログ
ラムをアミノ酸配列の比較のために用いる場合には、PA
M120荷重残基表（weight residue table）、ギャップ長
ペナルティ（gap length penalty）12およびギャップペ
ナルティ（gap penalty）4を用いることができる。

【００６５】2つの配列間の一致率は、ギャップを許容
又は許容しない場合で、上記と同様の技法を用いて決定
されうる。一致率の算出に際しては、正確な一致のみを
算定することが一般的である。

【００６６】本発明のエンドスタチンヌクレオチド配列
はさらに以下を含む：（a）例えば、約45℃の6×塩化ナ
トリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中でのフィルタ
ーに結合したDNAとのハイブリダイゼーション後に約50
〜65℃の0.2×SSC／0.1％SDS中で1回または複数回洗浄
するなどのストリンジェントな条件下で、本発明のエン
ドスタチン核酸分子とハイブリダイズする任意のヌクレ
オチド配列、または（b）例えば、約45℃の6×SSC中で
のフィルターに結合した核酸とのハイブリダイゼーショ
ン後に約68℃の0.1×SSC／0.2％SDS中で1回もしくは複
数回の洗浄を行うなどの高ストリンジェントな条件下、
または当業者に明らかなその他のハイブリダイゼーショ
ン条件下（例えば、Ausubel F.M.ら編、1989、分子生物
学における最新プロトコール（Current Protocols in M
olecular Biology）第I巻、GreenPublishing Associate
s, Inc.およびJohn Wiley & sons、Inc.、New York、p
p.6.3.1〜6.3.6および2.10.3を参照））において本発明
のエンドスタチン核酸分子とハイブリダイズする任意の
ヌクレオチド配列。上記（a）および（b）に記載の条件
下でハイブリダイズするエンドスタチン核酸分子は、エ
ンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子の相補物
を含むものであることが好ましい。1つの好ましい態様
において、上記の（a）および（b）の条件下でハイブリ
ダイズする核酸分子は、遺伝子産物、例えば、エンドス
タチン遺伝子産物と機能的に同等な遺伝子産物をコード
する。

【００６７】機能的に同等なエンドスタチン遺伝子産物
には、同じまたは異なる種に存在する天然の天然のエン
ドスタチン遺伝子産物が含まれる。また、機能的に同等
なエンドスタチン遺伝子産物には、エンドスタチン遺伝
子産物の生物活性の少なくとも1種類を保持する遺伝子
産物、および／または、このような遺伝子産物を標的と
する（ポリクローナルまたはモノクローナル）抗体によ
って認識されてそれと結合する遺伝子産物も含まれる。

【００６８】本発明の核酸分子の中には、高ストリンジ
ェントまたはストリンジェントな条件下で上記のエンド
スタチン核酸分子とハイブリダイズするデオキシオリゴ
ヌクレオチド（「オリゴ体（Oligos）」）がある。一般
に、長さが14ヌクレオチド〜70ヌクレオチドのプローブ
の場合、融解温度（Tm）は、Tm（℃）＝81.5＋16.6（lo
g［一価陽イオン（モル濃度）］）＋0.41（G＋Cの割
合）−（500／N）という式を用いて算出され、式中、N
はプローブの長さである。ハイブリダイゼーションがホ
ルムアミドを含む溶液中で行われる場合、融解温度は、
Tm（℃）＝81.5＋16.6（loglog［一価陽イオン（モル濃
度）］）＋ 0.41（％G＋C）−（0.61％ホルムアミド）
−（500／N）という式を用いて算出され、式中、Nはプ
ローブの長さである。一般に、ハイブリダイゼーション
は、Tmよりも約20℃〜25℃低い温度（DNA-DNAハイブリ
ッドの場合）またはTmよりも約10℃〜15℃低い温度（RN
A-DNAハイブリッドの場合）で行われる。

【００６９】例示的な高ストリンジェントな条件とは、
例えば、37℃（約14塩基オリゴ体の場合）、48℃（約17
塩基オリゴ体の場合）、55℃（約20塩基オリゴ体の場
合）および60℃（約23塩基オリゴ体の場合）の6×SSC／
0.05％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄でありうる。

【００７０】本発明の核酸分子はさらに、上記の核酸の
相補物を含む。例えば、このような分子は、例えばエン
ドスタチン遺伝子などの調節に有用なアンチセンス分子
として、および／またはエンドスタチン遺伝子核酸配列
の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして作用
することができる。

【００７１】本発明の核酸配列を、同じくエンドスタチ
ン遺伝子の調節のために有用な、リボザイムおよび／ま
たは三重らせん配列の一部として用いることもできる。
さらに、例えばこのような分子を、例えば、癌などの血
管新生関連疾患にかかわる特定のエンドスタチン対立遺
伝子の存在を検出する方法、対立遺伝子がまたがるヒト
染色体領域のマッピングを要する方法などの、診断法の
構成要素として用いることもできる。

【００７２】エンドスタチン核酸分子の断片とは、長さ
が少なくとも10、12、15、20、30、40、50、60、70、8
0、90、100、200、300、400、500、600、700、800、90
0,1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、
3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、50
00ヌクレオチドまたはそれ以上の連続したヌクレオチド
でありうるエンドスタチン核酸配列を指す。または、断
片には、エンドスタチン遺伝子産物の少なくとも10、2
0、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、
450アミノ酸またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を
コードする配列も含まれうる。1つの態様において、エ
ンドスタチン核酸分子は、ある対応するエンドスタチン
遺伝子産物の少なくとも1つの生物活性を示す遺伝子産
物、例えばエンドスタチン遺伝子産物をコードする。ま
た、エンドスタチン核酸分子の断片とはエンドスタチン
のエキソンまたはイントロンのことも指し、さらにエン
ドスタチン遺伝子産物のドメインをコードするエンドス
タチンコード領域の一部も指しうる。

【００７３】エンドスタチンヌクレオチド配列の同定お
よび単離に関しては、このような配列を、例えば、標準
的なシークエンシングおよび細菌人工染色体（BAC）技
術を用いることにより、容易に得ることができる。

【００７４】当業者は理解していると考えられるよう
に、個々の生物体の集団の内部（例えば、ヒトまたはイ
ヌの集団の内部）にはエンドスタチン遺伝子のDNA配列
多型が存在すると考えられる。天然の対立遺伝子変異の
ために、このような多型は例えば、集団内の個体間にも
存在しうる。このような多型には、アミノ酸配列の変化
をもたらすものが含まれる。本明細書で用いる「対立遺
伝子変異体」という語句は、所与の遺伝子座に生じるヌ
クレオチド配列、または該ヌクレオチド配列によってコ
ードされる遺伝子産物を指す。このような天然の対立遺
伝子変異は、所与の遺伝子のヌクレオチド配列において
1％〜5％、5％〜20％または20％〜50％の変化をもたら
すことができる。対立遺伝子とは、所与の遺伝子座にお
いてオルタナティブに生じる一群の遺伝子の1つのこと
である。オルタナティブな対立遺伝子は、異なる多数の
個体における関心対象の遺伝子のシークエンシングによ
って同定されうる。これは、種々の個体において同じ遺
伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプロー
ブを用いることによって容易に行うことができる。本明
細書で用いる「遺伝子」および「組換え遺伝子」という
用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリ
ーディングフレームを含む核酸分子のことを指す。この
用語にはさらに、上流配列および／またはエキソン／イ
ントロン配列ならびに構造を含む核酸分子も含まれう
る。

【００７５】ヒトエンドスタチン遺伝子ならびに他の種
（例えば、モルモット、ウシ、マウス、イヌ）に由来す
るホモログおよび相同分子種（ortholog）の更なる対立
遺伝子変異体のクローニングに関して、本明細書に開示
する単離されたエンドスタチン遺伝子配列を標識するこ
とができ、関心対象の生物体（例えば、モルモット、ウ
シ、マウス、イヌ）に由来する適切な細胞または組織
（例えば、肝臓）から入手したmRNAから構築したcDNAラ
イブラリーのスクリーニングに用いることもできる。用
いるハイブリダイゼーション条件は一般に、標識配列が
由来する生物体の種類とは異なる生物体にcDNAライブラ
リーが由来する場合には低ストリンジェンシーであるべ
きであり、通常は、例えば標的生物体および参照生物体
の相対的類縁性などに基づいて決定しうる。

【００７６】または、同じく適切なストリンジェントな
条件を用いて、標識断片を関心対象の生物体に由来する
ゲノムライブラリーのスクリーニングのために用いるこ
ともできる。適切なストリンジェンシー条件は上記のよ
うに当業者には周知であり、ライブラリーおよび標識配
列の由来である個々の生物体に応じて予測可能的に変形
すると考えられる。このような条件に関する手引きにつ
いては、例えば、そのいずれも全体が参照として組み入
れられる、サムブルック（Sambrook）ら、1989、「分子
クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning、L
aboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Pr
ess、N.Y.；およびアウスユーベル（Ausubel）ら、1989
〜1999、「分子生物学における最新プロトコール（Curr
ent Protocols in Molecular Biology）」、Green Publ
ishing Associates and Wiley lnterscience、N.Y.を参
照されたい。

【００７７】さらに、本明細書で示したエンドスタチン
遺伝子産物の内部のアミノ酸配列に基づいて設計した2
つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いて
PCRを行うことにより、エンドスタチン遺伝子の対立遺
伝子変異体を、例えばヒトまたはイヌの核酸から単離す
ることもできる。反応のためのテンプレートは、例え
ば、野生型または変異型エンドスタチン遺伝子対立遺伝
子を発現することが知られたまたは疑われるヒトまたは
非ヒトの細胞系または組織（例えば、肝細胞など）から
調製したmRNAの逆転写によって得られたcDNAであってよ
い。1つの態様において、対立遺伝子変異体は、血管新
生を介する疾患を有する個体から単離される。

【００７８】増幅された配列がエンドスタチン遺伝子核
酸配列の配列であることを確認するために、PCR産物の
サブクローニングおよびシークエンシングを行うことも
できる。続いて種々の方法により、PCR断片を用いて完
全長cDNAクローンを単離することができる。例えば、増
幅断片を標識し、バクテリオファージcDNAライブラリー
のスクリーニングに用いることができる。または、ゲノ
ムライブラリーのスクリーニングにより、標識断片を用
いてゲノムクローンを単離することもできる。

【００７９】また、完全長cDNA配列、さらには選択的ス
プライシングがなされたmRNA種に対応するcDNA配列を単
離するためにPCR技術を用いることもできる。例えば、
適切な細胞または組織供給源（すなわち、例えば生検ま
たは死後剖検によって採取された肝組織試料など、エン
ドスタチン遺伝子を発現することが知られたまたは疑わ
れるもの）から、標準的な方法に従ってRNAを単離する
ことができる。第1ストランドの合成の準備（priming）
のために、増幅断片の最も5'側の末端に対して特異的な
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、RNAに対する
逆転写反応を行うことができる。続いて、標準的な末端
転移酵素反応を用いて、グアニン末端を、得られたRNA
／DNAハイブリッドの「末端につなぎ」、ハイブリッド
をRNaseHで消化しその後、poly-Cプライマーを用いて第
2ストランドの合成の準備をすることができる。このよ
うにして、増幅断片の上流のcDNA配列は容易に単離され
うる。用いうるクローニング技法の概説については、例
えば、サムブルック（Sambrook）ら、1989、前記または
アウスユーベル（Ausubel）ら、前記を参照されたい。

【００８０】例えば変異などのエンドスタチン遺伝子の
対立遺伝子変異体のcDNAを、例えば、PCRなどの当業者
に周知の技法を用いることによって単離することができ
る。この場合には、オリゴ-dTオリゴヌクレオチドを、
変異型エンドスタチン対立遺伝子を有すると推定される
個体で発現されることが知られたまたは疑われる組織か
ら単離したmRNAとハイブリダイズさせ、新たなストラン
ドを逆転写酵素で伸長させることにより、第1のcDNAス
トランドを合成できる。続いて、正常遺伝子の5'末端と
特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用い
て、cDNAの第2のストランドを合成する。次にこれらの2
つのプライマーを用いて、PCRによって産物を増幅し、
適したベクター内にクローニングした上で、当業者に周
知の方法によるDNA配列分析に供する。変異型エンドス
タチン対立遺伝子のDNA配列を正常エンドスタチン対立
遺伝子のDNA配列と比較することにより、変異型エンド
スタチン遺伝子産物の機能の喪失または変化の原因とな
る変異を確認することができる。

【００８１】または、変異型エンドスタチン対立遺伝子
を有することが疑われるもしくは知られた個体から入手
したDNAを用いてゲノムライブラリーを構築することも
でき、または変異型エンドスタチン対立遺伝子を発現す
ることが知られたまたは疑われる組織由来のRNAを用い
てcDNAライブラリーを構築することもできる。続いて、
障害のないエンドスタチン遺伝子または任意の適したそ
の断片を標識し、このようなライブラリーにおける対応
する変異型エンドスタチン対立遺伝子を同定するための
プローブとして用いることができる。続いて、変異型エ
ンドスタチン遺伝子配列を含むクローンを精製し、当業
者に周知の方法に従って配列分析に供することもでき
る。

【００８２】さらに、例えば、このような変異型対立遺
伝子を有することが疑われるまたは知られた個体におい
て変異型エンドスタチン対立遺伝子を発現することが知
られたまたは疑われる組織から単離したRNAから合成し
たcDNAを用いて、発現ライブラリーを構築することもで
きる。この方式では、以下に述べる通り、推定変異型組
織によって産生される遺伝子産物を発現させ、正常エン
ドスタチン遺伝子産物に対して作製された抗体と共に標
準的な抗体スクリーニング法を用いるスクリーニングを
行える（スクリーニング法については、例えば、Harlow
およびLane編、1988、「抗体：実験マニュアル（Antibo
dies：A Laboratory Manual）」、CSH Press、Cold Spr
ing Harborを参照のこと）。

【００８３】エンドスタチン変異が機能の変化した遺伝
子産物の発現をもたらす場合（例えば、ミスセンスまた
はフレームシフト変異の結果として）、一連の抗エンド
スタチン遺伝子産物ポリクローナル抗体が、変異型エン
ドスタチン遺伝子産物と交差反応する可能性がある。こ
のような標識抗体との反応によって検出されたライブラ
リーのクローンを、当業者に周知の方法に従って精製し
て配列分析にかけることができる。

【００８４】さらに、エンドスタチン変異または多型を
PCR増幅法を用いて検出することもできる。プライマー
を通常、プロモーター調節領域を含むエンドスタチン配
列の全体の重複領域が増幅されるように設計できる。1
つの態様において、プライマーが、エキソン-イントロ
ン境界をカバーするように設計され、変異に関してコー
ド領域を精密に調べることができる。

【００８５】また、本発明には、前出の項のヌクレオチ
ド配列の相補体である核酸分子、好ましくはDNA分子も
含まれる。

【００８６】ある態様において、本発明の核酸分子は、
異種（例えば、ベクター、発現ベクターまたは融合タン
パク質）配列を含有またはコードする核酸配列を含む核
酸分子の一部として存在する。

【００８７】エンドスタチン遺伝子産物には、上記のエ
ンドスタチン遺伝子配列を含む核酸分子によってコード
される遺伝子産物が含まれる。さらに、エンドスタチン
遺伝子産物には、機能的に同等な遺伝子産物であるタン
パク質も含まれうる。このような同等なエンドスタチン
遺伝子産物は、上記のエンドスタチン遺伝子配列によっ
てコードされるアミノ酸配列の内部および／または近傍
に、アミノ酸残基の内部欠失を含む欠失、融合タンパク
質を生じる付加を含む付加、または置換を含みうるが、
これらは、変化が機能的に同等なエンドスタチン遺伝子
産物を生じるという点で「サイレントな」変化を生じ
る。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解
性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に
基づいてなされうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ
酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プ
ロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチ
オニンが含まれ、極性中性アミノ酸にはグリシン、セリ
ン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン
およびグルタミンが含まれ、陽性荷電（塩基性）アミノ
酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ、
陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグ
ルタミン酸が含まれる。

【００８８】または、機能の変化が望ましい場合には、
変化したエンドスタチン遺伝子産物を作製するために欠
失または非保存的変化を加えることができる。このよう
な変化により、例えば、エンドスタチン遺伝子産物の1
つまたは複数の生物的機能を変化させることができる。
さらに、このような変化は、選択した宿主細胞における
発現、スケールアップなどのためにより適したエンドス
タチン遺伝子産物が作製されるように選択することがで
きる。例えば、ジスルフィド架橋を除去するために、シ
ステイン残基を欠失させること、または別のアミノ酸残
基と置換することが可能である。

【００８９】エンドスタチンタンパク質の1つまたは複
数のドメインに対応するペプチドおよび／またはタンパ
ク質、さらにはエンドスタチンタンパク質、または切断
型エンドスタチンタンパク質もしくはペプチドもしくは
エンドスタチンタンパク質の1つのドメインなどのエン
ドスタチンタンパク質の一部を、関連のないタンパク質
と融合させた融合タンパク質も本発明の範囲に含まれ
る。このようなタンパク質およびペプチドは、上記のエ
ンドスタチンヌクレオチド配列に基づいて、および／ま
たは本明細書に示すエンドスタチンアミノ酸配列に基づ
いて設計することができる。融合タンパク質には、エン
ドスタチンタンパク質またはペプチドを安定化してイン
ビボ半減期を延長させるIgFc融合物、融合タンパク質を
細胞膜に係留させる何らかのアミノ酸配列との融合物、
またはエンドスタチンタンパク質ドメインとマーカー機
能を付与する酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質ま
たはフラグ（flag）エピトープタンパク質もしくはペプ
チドとの融合物が含まれるが、これらに限定されない。

【００９０】本発明のエンドスタチンタンパク質には、
cDNA配列の少なくとも1つのエキソンによってコードさ
れるドメインまたはその断片が欠失したエンドスタチン
タンパク質配列も含まれる。

【００９１】上記のエンドスタチンタンパク質配列は、
エンドスタチン遺伝子産物を標的化するシグナル配列を
含むドメインを分泌のために含みうる。本明細書で用い
るシグナル配列には、分泌型タンパク質および膜結合型
タンパク質のN末端で生じ、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、ト
リプトファンまたはバリンなどの疎水性アミノ酸残基を
少なくとも約70％含む、長さが少なくとも約15アミノ酸
残基または20アミノ酸残基であるペプチドが含まれる。
1つの好ましい態様において、シグナル配列は少なくと
も約10〜40アミノ酸残基、好ましくは約19アミノ酸残基
〜34アミノ酸残基を有し、疎水性残基を少なくとも約60
％〜80％、より好ましくは65％〜75％、さらにより好ま
しくは少なくとも約70％含む。シグナル配列はこのよう
な配列を含むタンパク質を脂質二重層に向かわせるよう
にはたらく。

【００９２】本発明のポリペプチドのシグナル配列を、
関心対象の分泌タンパク質または他のタンパク質の分泌
および単離を容易にするために用いることができる。シ
グナル配列は一般に、1つまたは複数の切断事象におけ
る分泌の際に成熟タンパク質から一般に切断される疎水
性アミノ酸のコアを特徴とする。このようなシグナルペ
プチドは、分泌経路を経る際に成熟タンパク質由来のシ
グナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含
む。このため、本発明は、シグナル配列を有する前記の
エンドスタチンポリペプチド（すなわち「未熟」ポリペ
プチド）、さらにはエンドスタチンシグナル配列それ自
体、およびシグナル配列をもたないエンドスタチンポリ
ペプチド（すなわち「成熟」エンドスタチン切断産物）
に関する。本発明のエンドスタチンポリペプチドにはさ
らに、上記の特徴を有する任意のシグナル配列および成
熟エンドスタチンポリペプチド配列を含むポリペプチド
が含まれうることが理解されるべきである。

【００９３】本発明のエンドスタチンポリペプチドはさ
らに、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチ
ル化、ミリスチル化およびリン酸化を含む、翻訳後修飾
を含みうる。天然型エンドスタチンタンパク質にこのよ
うな修飾を可能にする認識モチーフがない場合には、改
変型エンドスタチン遺伝子産物を作製するようにエンド
スタチン遺伝子に酵素認識シグナルなどのモチーフをコ
ードするヌクレオチド配列を導入することは当業者にと
って日常的であると思われる。

【００９４】エンドスタチン遺伝子産物、そのペプチド
断片およびその融合タンパク質を、当技術分野で周知の
技法を用いる組換えDNA技術によって作製することがで
きる。このため、エンドスタチン遺伝子配列を含む核酸
を発現させることによって本発明のエンドスタチン遺伝
子ポリペプチド、ペプチド、融合ペプチドおよび融合ポ
リペプチドを調製するための方法を本明細書で述べる。
エンドスタチン遺伝子産物のコード配列ならびに適切な
転写および翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築
するために、当業者に周知の方法を用いることができ
る。これらの方法には例えば、インビトロ組換えDNA技
術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。
例えば、サムブルック（Sambrook）ら、1989、前記、お
よびアウスユーベル（Ausubel）ら、1989、前記に記載
された技法を参照されたい。または、エンドスタチン遺
伝子産物配列をコードしうるRNAを、例えば合成装置を
用いて化学合成することもできる。例えば、「オリゴヌ
クレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」、198
4、ゲイト（Gait）編、IRL Press、Oxfordに記載された
技法を参照されたい。

【００９５】本発明のエンドスタチン遺伝子コード配列
を発現させるために、種々の宿主-発現ベクター系を用
いうる。このような宿主-発現系は関心対象のコード配
列を産生してその後精製するための媒体であるが、適切
なヌクレオチドコード配列による形質転換またはトラン
スフェクションされた場合に、本発明のエンドスタチン
遺伝子産物をインサイチューで提示しうる細胞でもあ
る。これらには、エンドスタチン遺伝子産物のコード配
列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA
またはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された
細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）などの微生物；エンド
スタチン遺伝子産物のコード配列を含む組換え酵母発現
ベクターにより形質転換された酵母（例えば、サッカロ
ミセス属、ピキア（Pichia）属）；エンドスタチン遺伝
子産物のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；
組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモ
ザイクウイルス、CaMV、タバコモザイクウイルス、TM
V）に感染した、もしくはエンドスタチン遺伝子産物の
コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例え
ば、Tiプラスミド）により形質転換された植物細胞系；
または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネイ
ンプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（例えば、
アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
7.5Kプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換
え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、C
HO、BHK、293、3T3）が含まれるが、これらに限定され
ない。

【００９６】細菌系においては、発現させるエンドスタ
チン遺伝子産物に対する意図した用途に応じて数多くの
発現ベクターを便利なように選択しうる。例えば、エン
ドスタチンタンパク質の薬学的組成物の製造のため、ま
たはエンドスタチンタンパク質に対する抗体の産生のた
めにこのようなタンパク質を大量に生産しようとする場
合には、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物
の高レベルの発現を指令するベクターが望ましい。この
ようなベクターには、融合タンパク質が産生されるよう
に、エンドスタチン遺伝子産物のコード配列がlac Zコ
ード領域とインフレームでベクター中に個別に連結され
うる大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら、1983、EMBO
J. 2、1791）；pINベクター（InouyeおよびInouye、19
85、Nucleic Acids Res. 13、3101〜3109；Van Heekeお
よびSchuster、1989、J. Biol. Chem. 264、5503〜550
9）などが含まれるが、これらに限定されない。pGEXベ
クターも、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）
との融合タンパク質として外因性ポリペプチドを発現さ
せるために用いられうる。一般に、このような融合タン
パク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズ
に吸着させた後に遊離グルタチオンの存在下で溶出させ
ることによって可溶化細胞から容易に精製可能である。
クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出
されうるように、pGEXベクターがトロンビンまたは第Xa
因子プロテアーゼによる切断部位を含むように設計され
る。

【００９７】昆虫系においては、オートグラファカリフ
ォルニカ（Autographa califoenica）核多角体ウイルス
（AcNPV）が、異種遺伝子を発現させるためのベクター
として用いられる。ウイルスはヨトウガ（Spodoptera f
rugiparda）細胞内で増殖する。エンドスタチン遺伝子
のコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘ
ドリン遺伝子）に個別にクローニングして、AcNPVプロ
モーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下
に置くことができる。エンドスタチン遺伝子コード配列
の挿入が良好に行われれば、ポリヘドリン遺伝子の不活
性化および非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘド
リン遺伝子によってコードされるタンパク質性（protei
naceous）コートを欠くウイルス）の産生が起こると考
えられる。続いて、これらの組換えウイルスを用いてヨ
トウガ細胞を感染させ、挿入遺伝子を発現させる（例え
ば、Smithら、1983、J. Virol. 46、584；Smith、米国
特許第4,215,051号を参照のこと）。

【００９８】哺乳動物宿主細胞においては、ウイルスを
基盤とする数多くの発現系を用いることができる。アデ
ノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、関心
対象のエンドスタチン遺伝子コード配列をアデノウイル
ス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターお
よび三部からなるリーダー配列と連結させることができ
る。続いて、このキメラ遺伝子をインビトロまたはイン
ビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入する。
ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE
3）への挿入により、感染宿主内で生存可能であってエ
ンドスタチン遺伝子産物を発現しうる組換えウイルスが
得られると考えられる（例えば、LoganおよびShenk、19
84、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81、3655〜3659を参
照）。挿入されたエンドスタチン遺伝子産物コード配列
の効率的な翻訳のためには特異的開始シグナルも必要で
ありうる。これらのシグナルにはATG開始コドンおよび
隣接配列が含まれる。開始コドンおよび隣接配列を含む
エンドスタチン遺伝子の全体を適切な発現ベクター中に
挿入する場合には、更なる翻訳制御シグナルは必要でな
いと思われる。エンドスタチン遺伝子コード配列の一部
のみを挿入する場合には、おそらくはATG開始コドンを
含む、類似の異種翻訳制御シグナルを供給する必要があ
る。さらに、全インサートを確実に翻訳させるために
は、開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレ
ームと同じ位相になければならない。これらの外因性翻
訳制御シグナルおよび開始コドンの起源は、天然物およ
び合成物の双方のさまざまなものであってよい。発現の
効率は、適切な転写エンハンサー因子、転写終結因子な
どを含めることによって高めることができる（Bittner
ら、1987、Methods in Enzymol. 153、516〜544を参照
のこと）。

【００９９】さらに、望ましい特定の様式で挿入配列の
発現が調節される、または遺伝子産物の修飾およびプロ
セシングがなされる宿主細胞株を選択しうる。タンパク
質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およ
びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能
に重要でありうる。さまざまな宿主細胞が、タンパク質
および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のた
めの特徴的および特異的な機構を有する。発現される異
種タンパク質の適切な修飾およびプロセシングが確実に
行われるように適切な細胞系または宿主系を選択するこ
とができる。この目的のためには、一次転写産物の適切
なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン
酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いるこ
とができる。このような哺乳動物宿主細胞には、CHO、V
ERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3およびWI38が含
まれるが、これらに限定されない。

【０１００】組換えタンパク質の長期にわたる高収率生
産のためには、安定的な発現が好ましい。例えば、エン
ドスタチン遺伝子産物を安定的に発現する細胞系を操作
することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクタ
ーを用いるのではなく、むしろ適切な発現調節因子（例
えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写終結
因子、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーに
よって制御されるDNAによる形質転換を宿主細胞に施す
ことができる。異種DNAの挿入後に組換え細胞を濃縮培
地中で1〜2日増殖させた後、選択培地に切り替えること
ができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に
対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定
的に組み込み、後にクローニングして細胞系へと増殖さ
せることができる増殖巣を増殖して形成することを可能
にする。この方法は、エンドスタチン遺伝子産物を発現
する細胞系の操作のために便利に用いられうる。このよ
うな組換え細胞系は、エンドスタチン遺伝子産物の内因
性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評
価において特に有用でありうる。

【０１０１】それぞれtk-細胞、hgprt-細胞またはaprt-
細胞において、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
（Wiglerら、1977、Cell 11、223）、ヒポキサンチン-
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalsk
aおよびSzybalski、1962、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
48、2026）およびアデニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（Lowyら、1980、Cell 22、817）遺伝子を含む
がこれらに限定されない、数多くの選択システムを用い
ることができる。また、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝
子に関する選択の基盤として用いることもできる：メト
トレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら、
1980、Natl. Acad. Sci. USA 77、3567；O'Hareら、198
1、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78、1527）；ミコフェ
ノール酸に対する耐性を付与するgpt（MulliganおよびB
erg、1981、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 78、2072）；
アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Co
lberre-Garapinら、1981、J. Mol. Biol. 150、1）；お
よびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（S
anterreら、1984、Gene 30、147）。

【０１０２】または、発現させる融合タンパク質に対し
て特異的な抗体を用いることにより、任意の融合タンパ
ク質を容易に精製することができる。例えば、ヤンクネ
ヒト（Janknecht）らによって記載された系により、ヒ
ト細胞系において発現された非変性融合タンパク質を容
易に精製することが可能となる（Janknechtら、1991、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 88、8972〜8976）。この系
では、関心対象の遺伝子を、その遺伝子のオープンリー
ディングフレームが6個のヒスチジン残基からなるアミ
ノ末端タグと翻訳的に融合されるように、ワクシニア組
換えプラスミド中にサブクローニングする。組換えワク
シニアウイルスに感染した細胞からの抽出物をNi^２＋ニ
トリロ酢酸-アガロースカラムにロードし、ヒスチジン
タグ標識されたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液に
よって選択的に溶出させる。

【０１０３】または、挿入調節因子が内因性エンドスタ
チン遺伝子と機能的に結合するように安定的細胞系また
はクローン化された微生物のゲノムに外因性DNA調節因
子を挿入することにより、1つの細胞、細胞系または微
生物における内因性エンドスタチン遺伝子の発現特性を
改変することもできる。例えば、通常は「転写的にサイ
レント」である内因性エンドスタチン遺伝子、すなわ
ち、細胞、細胞系または微生物において通常は全く発現
しないかまたは極めて低レベルでしか発現されないエン
ドスタチン遺伝子を、該細胞、細胞系または微生物で通
常発現される遺伝子産物の発現を促進しうる調節因子を
挿入することによって活性化することができる。また
は、転写的にサイレントな内因性エンドスタチン遺伝子
を、細胞種を越えて作用する無差別的（promiscuous）
調節因子の挿入によって活性化することもできる。

【０１０４】異種調節配列は、当業者に周知であって、
例えばチャペル（Chappel）、米国特許第5,272,071号；
1991年5月16日に公開された国際公開公報第91／06667号
に記載された、標的相同組換えなどの技法を用いて、内
因性エンドスタチン遺伝子と機能的に連結されるように
安定的細胞系またはクローニングされた微生物に挿入さ
れうる。

【０１０５】エンドスタチン遺伝子産物をトランスジェ
ニック動物で発現させることもできる。エンドスタチン
トランスジェニック動物の作出には、マウス、ラット、
ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジお
よび、例えばヒヒ、サルおよびチンパンジーなどの非ヒ
ト霊長類を含むがこれらに限定されない、任意の種の動
物を用いることができる。本明細書で用いる「トランス
ジェニック」という用語は、異なる種に由来するエンド
スタチン遺伝子配列を発現する動物（例えば、ヒトまた
はイヌのエンドスタチン配列を発現するマウス）、さら
に内因性（すなわち、同じ種の）エンドスタチン配列を
過剰発現するように遺伝子改変された動物、または内因
性エンドスタチン遺伝子配列を発現しないように遺伝子
改変された動物（すなわち「ノックアウト」動物）およ
びそれらの子孫を指す。

【０１０６】トランスジェニック動物の初代系統を作製
するためにエンドスタチン遺伝子の導入遺伝子を動物に
導入するために、当技術分野で知られた任意の技法を用
いることができる。このような技法には、前核微量注入
（pronuclear microinjection）（HoppeおよびWagner、
1989、米国特許第4,873,191号）；レトロウイルスを介
した生殖系列への遺伝子導入（van der Puttenら、198
5、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82、6148〜6152）；胚
性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Thompsonら、
1989、Cell 56、313〜321）；胚のエレクトロポレーシ
ョン（Lo、1983、Mol. Cell. Biol. 3、1803〜1814）お
よび精子を介した遺伝子導入（Lavitranoら、1989、Cel
l 57、717〜723）が含まれるがこれらに限定されない。
（このような技法の概説については、ゴードン（Gordo
n）、1989、トランスジェニック動物（Transgenic Anim
als）、Intl. Rev. Cytol. 115、171〜229）を参照され
たい。）

【０１０７】エンドスタチン導入遺伝子を含むトランス
ジェニック動物クローンを作製するためには、例えば、
静止状態に誘導した培養胚、胎児または成体細胞由来の
核の除核卵母細胞への核移植（Campbellら、1996、Natu
re 380、64〜66；Wilmut、ら、Nature 385、810〜813）
などの、当技術分野で知られた任意の技法を用いること
ができる。

【０１０８】本発明は、そのすべての細胞がエンドスタ
チン導入遺伝子を有するトランスジェニック動物同様、
細胞のすべてではなく一部が導入遺伝子を有する動物、
すなわちモザイク動物を提供する。導入遺伝子を、単一
の導入遺伝子として、または例えば頭部-頭部タンデム
もしくは頭部-尾部タンデムなどのコンカテマー中で組
み込むことができる。また、例えばラスコー（Lasko）
ら（Laskoら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、
6232〜6236）の教示に従って、導入遺伝子を特定の細胞
種に選択的に導入して活性化させることもできる。この
ような細胞種特異的活性化のために必要な調節配列は、
関心対象の特定の細胞種に依存すると考えられ、当業者
には明らかであると考えられる。エンドスタチン遺伝子
の導入遺伝子を内因性エンドスタチン遺伝子の染色体部
位に組み込むことが望ましい場合には、遺伝子ターゲテ
ィングが好ましい。簡潔に述べると、このような技法を
用いる場合には、染色体配列との相同組換えにる組み込
みと内因性エンドスタチン遺伝子のヌクレオチド配列の
機能の破壊という目的で、内因性エンドスタチン遺伝子
と相同なヌクレオチド配列をいくつか含むベクターを設
計する。また、例えばグー（Gu）ら（Guら、1994、Scie
nce 265、103〜106）の教示に従うことにより、導入遺
伝子を特定の細胞種に選択的に導入し、これによって内
因性エンドスタチン遺伝子を該細胞種のみにおいて不活
性化することもできる。このような細胞種特異的不活性
化のために必要な調節配列は、関心対象の特定の細胞種
に依存すると考えられ、当業者には明らかであると考え
られる。

【０１０９】ひとたびトランスジェニック動物が作出さ
れれば、組換えエンドスタチン遺伝子の表現型発現を標
準的な技法を用いてアッセイすることができる。初期ス
クリーニングは、導入遺伝子の組み込みが起こったか否
かをアッセイすることを目的に動物組織を分析するため
のサザンブロット分析またはPCR法によって行いうる。
トランスジェニック動物の組織中での導入遺伝子のmRNA
発現レベルを、動物から入手した組織試料のノーザンブ
ロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション分
析およびRT-PCR（逆転写酵素PCR）を非制限的に含む技
法を用いてアッセイしてもよい。エンドスタチン遺伝子
を発現する組織の試料を、エンドスタチン導入遺伝子産
物に対して特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価
することもできる。

【０１１０】エンドスタチン遺伝子産物またはそのペプ
チド断片は、さまざまな用途のために調製することがで
きる。例えば、このような遺伝子産物またはそのペプチ
ド断片は、抗体の作製のため、診断アッセイ法におい
て、または癌などの血管新生関連疾患の調節にかかわる
他の細胞性もしくは細胞外遺伝子産物のマッピングおよ
び同定のために用いることができる。このようなエンド
スタチン遺伝子産物には、エンドスタチン遺伝子産物の
1つもしくは複数のドメインに対応するペプチドまたは
ポリペプチドなどの可溶性誘導体、特に1つまたは複数
の疎水性ドメインが欠失するように改変されたエンドス
タチン遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されるこ
とはない。または、エンドスタチンタンパク質に対する
抗体、エンドスタチン遺伝子産物を模倣する抗イディオ
タイプ抗体（Fab断片を含む）、アンタゴニストまたは
アゴニストを癌などの血管新生関連疾患の治療のために
用いることもできる。さらに別のアプローチでは、この
ようなエンドスタチン遺伝子産物をコードするヌクレオ
チド構築物を用いて、このようなエンドスタチン遺伝子
産物をインビボで発現させる目的で宿主細胞の遺伝子操
作を行うことができる。これらの遺伝子組換え細胞は、
エンドスタチン遺伝子産物、エンドスタチンペプチド、
または可溶性エンドスタチンポリペプチドの連続的供給
をもたらす体内の「バイオリアクター」として機能しう
る。

【０１１１】ここで述べるのは、1つまたは複数のエン
ドスタチン遺伝子産物エピトープ、または遺伝子産物の
保存的変異体もしくはペプチド断片のエピトープを特異
的に認識しうる抗体の作製のための方法である。

【０１１２】このような抗体には、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体（mAb）、イヌ抗体、ヒト抗
体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖、Fab断片、F
（ab'）2断片、Fab発現ライブラリーによって作製され
た断片、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、および上記の
いずれかのエピトープ結合性断片が含まれうるが、これ
らに限定されることはない。このような抗体は、例え
ば、生体試料中のエンドスタチン遺伝子産物の検出に用
いることができ、このため、エンドスタチン遺伝子産物
の異常レベルおよび／または異常型のこのような遺伝子
産物の存在に関して対象を検査する、診断法または予後
判定法の一部として利用しうる。このような抗体を、例
えば、エンドスタチン遺伝子産物のレベルおよび／また
は活性に対する被験化合物の効果を評価するための、以
下に述べる化合物スクリーニング手法と組み合わせて用
いることもできる。さらに、このような抗体を、例え
ば、正常および／または遺伝子操作したエンドスタチン
発現細胞を対象に導入する前に評価するために、以下に
述べる遺伝子療法と組み合わせて用いることもできる。

【０１１３】抗エンドスタチン遺伝子産物抗体は、この
ほか、異常エンドスタチン遺伝子産物活性を抑制するた
めの方法として用いることもできる。このため、このよ
うな抗体は、例えば癌などの血管新生関連疾患に対する
治療法の一部として用いうる。

【０１１４】エンドスタチン遺伝子産物に対する抗体の
作製のためには、種々の宿主動物にエンドスタチン遺伝
子産物またはその一部を注射することによって免疫化を
行ってもよい。このような宿主動物には、いくつか例を
挙げれば、ウサギ、マウスおよびラットが含まれうる
が、これらに限定されることはない。免疫応答を増強さ
せるために、宿主種に応じて、フロイントアジュバント
（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの金属
ゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポ
リオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホー
ルリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、なら
びにBCG（カルメット-ゲラン菌）およびコリネバクテリ
ウムパルブム（Corynebacterium parvum）などの有用と
思われるヒトアジュバントを非制限的に含む、種々のア
ジュバントを用いることができる。

【０１１５】ポリクローナル抗体は、エンドスタチン遺
伝子産物または抗原性のあるその機能的誘導体などの抗
原による免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の
不均質な集団である。ポリクローナル抗体の作製のため
には、上記のものなどの宿主動物に、同じく上記のアジ
ュバントを添加したエンドスタチン遺伝子産物による注
射による免疫化を行うとよい。

【０１１６】モノクローナル抗体は、特定の抗原に対す
る抗体の均質な集団であり、培養下にある連続継代細胞
系による抗体分子の産生がもたらされる任意の技法によ
って入手しうる。これらには、コーラー（Kohler）およ
びミルスタイン（Milstein）のハイブリドーマ法（197
5、Nature 256、495〜497；および米国特許第4,376,110
号）、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（Kosborら、1983、I
mmunology Today 4、72；Coleら、1983、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 80、2026〜2030）ならびにEBVハイブリ
ドーマ法（Coleら、1985、「モノクローナル抗体および
癌治療（Monoclonal Antibodies And Cancer Therap
y）」、Alan R. Liss, Inc.、pp.77〜96）が含まれる
が、これらに限定されることはない。このような抗体
は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、および任意のサブクラ
スを含む任意のクラスの免疫グロブリンあってよい。本
発明のmAbを産生するハイブリドーマはインビトロまた
はインビボのいずれで培養してもよい。インビボでの高
い抗体価のmAbsの産生が現時点での好ましい産生方法で
ある。

【０１１７】さらに、キメラ性およびヒト化モノクロー
ナル抗体のような、標準的な組換えDNA技術を用いて作
製しうる、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含む組換
え抗体も本発明の範囲に含まれる。キメラ抗体とは、マ
ウスmAbに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン
定常領域を有するもののように、異なる部分が異なる動
物種に由来する分子のことである（例えば、Cabilly
ら、米国特許第4,816,567号およびBossら、米国特許第
4,816397号を参照のこと。これらはその全体が参照とし
て本明細書に組み入れられる）。ヒト化抗体とは、非ヒ
ト種由来の1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）およ
びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を
有する、非ヒト種に由来する抗体分子のことである（例
えば、Queen、米国特許第5,585,089号を参照。これはそ
の全体が参照として本明細書に組み入れられる）。この
ようなキメラ性およびヒト化モノクローナル抗体は、当
技術分野で知られた組換えDNA技術によって、例えば、
国際公開公報第87／02671号；欧州特許出願第184,187
号；欧州特許出願第171,496号；欧州特許出願第173,494
号；国際公開公報第86／01533号；米国特許第4,816,567
号；欧州特許出願第125,023号；ベター（Better）ら（1
988）Science 240：1041〜1043；リュウ（Liu）ら（198
7）Proc. Natl. A cad. Sci. USA 84：3439〜3443；リ
ュウ（Liu）ら（1987）J. Immunol. 139：3521〜3526；
サン（Sun）ら（1987）Proc. Natl. Acad.Sci. USA 8
4：214〜218；ニシムラ（Nishimura）ら（1987）Canc.
Res. 47：999〜1005；ウッド（Wood）ら（1985）Nature
314：446〜449；およびショウ（Shaw）ら（1988）J. N
atl. Cancer Inst. 80：1553〜1559）；モリソン（Morr
ison）（1985）Science 229：1202〜1207；オイ（Oi）
ら（1986）Bio/Techniques 4：214；米国特許第5,225,5
39号；ジョーンズ（Jones）ら（1986）Nature 321：552
〜525；バーホエアン（Verhoeyan）ら（1988）Science
239：1534；およびバイドラー（Beidler）ら（1988）J.
Immunol. 141：4053〜4060に記載された方法を用いて
作製しうる。

【０１１８】ヒト患者の治療的処置のためには完全ヒト
抗体が特に望ましい。このような抗体は、例えば、内因
性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子を発現できな
いが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現しうるトランス
ジェニックマウスを用いて産生させることができる。ト
ランスジェニックマウスに対して、選択した抗体、例え
ば本発明のポリペプチドの全体または一部を用いて通常
の方式で免疫化を行う。抗原を標的とするモノクローナ
ル抗体は、通常のハイブリドーマ技術を用いて入手しう
る。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブ
リン導入遺伝子はB細胞分化の際に再配列を生じ、その
後にクラス転換および体細胞変異を生じる。このため、
このような技法を用いることにより、治療的に有用なIg
G、IgAおよびIgE抗体を作製することが可能である。ヒ
ト抗体を作製するためのこの技術の概要については、ロ
ンバーグ（Lonberg）およびフサール（Huszar）（199
5、Int. Rev. Immunol. 13：65〜93）を参照されたい。
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するため
のこの技術ならびにこのような抗体を作製するための手
順に関する詳細な考察については、例えば、米国特許第
5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米国特許第5,56
9,825号；米国特許第5,661,016号および米国特許第5,54
5,806号を参照されたい。さらに、アブジェニクス社（A
bgenix, Inc.）（Fremont、CA）などの企業は、上記の
ものに類似した技術を用いて選択した抗原を標的とする
ヒト抗体を提供する業務を行っている。

【０１１９】選択したエピトープを認識する完全ヒト抗
体は、「誘導型選択（guided selection）」と呼ばれる
技法を用いて作製することができる。このアプローチで
は、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス
抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体
の選択を誘導する（Jespersら（1994）Bio/technology
12：899〜903）。

【０１２０】または、一本鎖抗体の作製のために記載さ
れた技法（米国特許第4,946,778号；Bird、1988、Scien
ce 242、423〜426；Hustonら、1988、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 85、5879〜5883およびWardら、1989、Natu
re 334、544〜546）を、エンドスタチン遺伝子産物に対
する一本鎖抗体の作製のために適合化することもでき
る。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖および軽鎖断片をアミ
ノ酸架橋を介して連結し、一本鎖ポリペプチドを得るこ
とによって形成される。

【０１２１】特異的エピトープを認識する抗体断片は既
知の技法によって作製しうる。例えば、このような断片
には、抗体分子のペプシン消化によって作製しうるF(a
b')2断片、およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還
元することによって作製しうるFab断片が含まれるが、
これらに限定されることはない。または、望ましい特異
性を備えたモノクローナル性Fab断片が迅速かつ容易に
同定されるように、Fab発現ライブラリーを構築するこ
ともできる（Huseら、1989、Science、246、1275〜128
1）。

【０１２２】ここで述べるのは、エンドスタチン遺伝子
配列、そのペプチド断片および融合タンパク質を含むエ
ンドスタチン遺伝子産物、ならびにエンドスタチン遺伝
子産物およびそのペプチド断片を標的とする抗体のさま
ざまな用途である。このような用途には例えば、癌など
の血管新生関連疾患の予後評価および診断的評価、なら
びに以下の項で述べるような疾患に対する素因のある対
象の同定が含まれる。さらに、このような用途には、以
下に述べるような、エンドスタチン遺伝子の発現および
／またはエンドスタチン遺伝子産物の合成もしくは活性
を調節する化合物の同定のため、ならびに以下に述べる
ような、例えば癌などの血管新生関連疾患の治療のため
の方法が含まれる。

【０１２３】さらに、エンドスタチン遺伝子配列、なら
びにそのペプチド断片および融合タンパク質を含む遺伝
子産物、ならびにエンドスタチン遺伝子産物およびその
ペプチド断片を標的とする抗体には、エンドスタチンが
血管新生に関連した疾患および過程で果たすと思われる
役割とは関係のない目的での用途もある。例えば、ペプ
チド断片を含むエンドスタチン遺伝子産物、さらにはエ
ンドスタチン特異的抗体を、対象となる他のタンパク質
の回収、検出、または位置決定を容易にするための融合
タンパク質の構築のために用いることができる。さら
に、エンドスタチン遺伝子および遺伝子産物を、遺伝子
マッピング、すなわち遺伝地図の精細化のために用いる
こともできる。例えば、エンドスタチンに対して特異的
な抗体は、ヒト染色体またはヒト染色体の部分を含む体
細胞ハイブリッドにおけるヒトエンドスタチンの発現を
検出するためのプローブとして用いうる。このようなエ
ンドスタチン特異的抗体は、エンドスタチン染色体領域
を含む細胞を同定するために用いることができる。この
方法は、例えば、対象となる遺伝子または特性を染色体
のこの領域に特定するために用いうる。

【０１２４】エンドスタチン遺伝子配列および遺伝子産
物は、染色体地図のマッピングおよび精細化のために用
いることができる。エンドスタチン配列は、癌を非制限
的に含む種々の血管新生関連疾患と関連のある染色体区
域をさらに精細化するための新たな遺伝マーカーを開発
する目的に用いることができる。当業者には明らかであ
ると思われるが、疾患と関連した遺伝子区域の内部の核
酸配列を、マイクロサテライトなどの新たなマーカーに
関してさらに走査することができる。マイクロサテライ
トは単純配列反復（SSR）として知られており、1〜5ヌ
クレオチドのジ-、トリ-またはテトラヌクレオチド反復
を含む超可変縦列反復配列である。このようなマイクロ
サテライトはヒトゲノムの全体にわたって遍在性に分布
しており、反復長が超可変性であり、多型性が高い傾向
にあるため、連鎖研究のための優れた遺伝マーカーとな
る。比較的頻度の高いマイクロサテライト（例えば、(C
A)nジヌクレオチド反復）は約300〜500kb毎にある。マ
イクロサテライト反復配列に加えて、はるかに頻度の低
い、ミニサテライト（9〜64ヌクレオチド反復）、制限
断片長多型（RFLP）および一塩基多型などの、マッピン
グに有用なその他の種類の多型部位に関して領域を走査
することもできる。新たな配列内に多型部位がひとたび
同定されれば、その多型部位に隣接するPCRプライマー
を合成し、それを用いてマイクロサテライトまたは他の
多型部位を増幅することができる。続いて、ポリアクリ
ルアミドシークエンシングゲルでPCR産物を分離するこ
とにより、反復の長さを決定しうる。続いて、反復の頻
度および変異性を決定するために、ヒト集団からのゲノ
ムDNAを単純配列長多型（SSLP）に関して分析すること
ができる。ひとたび質の高いSSLPが見いだされれば、癌
などの血管新生関連疾患が新たなマーカーと連鎖するか
否かを決定するために罹患集団に対する連鎖分析を行う
ことができる。ゲノム集団における多型を分析するため
に、PCRを用いる方法に加えて、またはそれと組み合わ
せて、サザンブロットハイブリダイゼーションおよびリ
ガーゼ連鎖反応（LCR）などの他の技法を用いることも
できる（「ヒト遺伝学における最新プロトコール（Curr
ent Protocols in Human Genetics）」、Dracopoliら
（編）John Wiley & Sons、1998を参照のこと）。

【０１２５】もう1つの態様では、融合タンパク質を作
製するためにエンドスタチン遺伝子、タンパク質または
その断片もしくはドメインを用いることができる。最終
的には、エンドスタチン核酸および遺伝子産物には、食
品添加物または化粧品に対する核酸、タンパク質および
アミノ酸の補給源としての一般的な用途もある。

【０１２６】本明細書で特定されるcDNA配列の部分また
は断片（および対応する完全遺伝子配列）は、さまざま
な形でポリヌクレオチド試薬として用いることができ
る。例えば、これらの配列は、（i）エンドスタチン遺
伝子特異的変異または多型に関するスクリーニングのた
め、（ii）それぞれの遺伝子の染色体へのマッピング、
およびそれによる遺伝性疾患に関連した遺伝子領域の位
置決定のため、（iii）微量の生体試料から個体を識別
するため（組織型判定）、ならびに（iv）生体試料の法
医学的鑑定を補助するために用いうる。以下のサブセク
ションではこれらの用途について説明する。

【０１２７】エンドスタチン遺伝子特異的変異または多
型（エンドスタチン遺伝子に隣接する多型、例えば、特
定のエンドスタチン対立遺伝子と共分離されるもの）の
存在に関するスクリーニングのため、ならびにエンドス
タチン核酸配列の検出および／またはレベルのアッセイ
のために、さまざまな方法を用いることができる。

【０１２８】エンドスタチン遺伝子に内在または隣接す
る変異または多型は、数多くの技法を利用することによ
って検出可能である。任意の有核細胞または対象となる
エンドスタチン遺伝子を発現する任意の細胞に由来する
核酸をこのようなアッセイ法の出発点として用いること
ができ、これは当業者に周知の標準的な核酸調製手順に
従って単離しうる。

【０１２９】エンドスタチン核酸配列を、点変異、挿
入、欠失、逆位、転座および染色体再配列を含む、エン
ドスタチン遺伝子構造がかかわる異常を検出するための
生体試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイ
法に用いることもできる。このようなアッセイ法には、
サザン分析、一本鎖DNA高次構造多型分析（SSCP）およ
びPCR分析が含まれうるが、これらに限定されることは
ない。

【０１３０】エンドスタチン遺伝子特異的変異または多
型の検出のための診断方法には、例えば、試料から得ら
れた核酸、例えば、患者試料または他の適切な細胞源に
由来するものを、上記のものなどの組換えDNA分子、ク
ローニングされた遺伝子、またはその縮重変異体を含む
1つもしくは複数の標識核酸試薬と、これらの試薬とエ
ンドスタチン遺伝子に内在または隣接する相補的配列と
の特異的アニーリングに適した条件下で、接触およびイ
ンキュベートすることが含まれうる。本発明の診断方法
はさらに、エンドスタチン遺伝子の一塩基変異または多
型の検出のために核酸を接触およびインキュベートする
ことを含む。好ましくは、エンドスタチン遺伝子内のこ
れらの核酸試薬配列、またはエンドスタチン遺伝子と隣
接する染色体ヌクレオチド配列の長さは15〜30ヌクレオ
チドである。

【０１３１】インキュベーションの後に、アニーリング
しなかったすべての核酸を核酸:エンドスタチン分子ハ
イブリッドから除去する。仮にこのような分子が存在す
る場合には、続いてハイブリダイズした核酸の存在を検
出する。このような検出方式を用いることにより、対象
となる細胞種または組織からの核酸を、例えば、膜、ま
たはマイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビ
ーズなどのプラスチック表面などの固体支持体に固定す
ることができる。この場合には、インキュベーションの
後に、アニーリングしなかった上記の種類の標識核酸試
薬が容易に除去される。残ったアニーリングした標識エ
ンドスタチン核酸試薬の検出は、当技術分野で周知の標
準的な技法を用いて行われる。エンドスタチン遺伝子変
異が存在するか否かを判定するために、核酸試薬がアニ
ーリングしたエンドスタチン遺伝子配列を、正常エンド
スタチン遺伝子配列から予想されるアニーリングパター
ンと比較することができる。

【０１３２】1つの好ましい態様において、エンドスタ
チン変異または多型は、基板または「遺伝子チップ」に
固定したエンドスタチン核酸配列のマイクロアッセイ法
を用いることによって検出可能である（例えば、Cronin
ら、1996、Human Mutation 7：244〜255を参照）。

【０１３３】患者試料または他の適切な細胞源における
エンドスタチン遺伝子特異的核酸分子（またはエンドス
タチン隣接配列）の検出のための代替的な診断方法に
は、例えばPCR（実験の態様はMullis、1987、米国特許
第4,683,202号に示されている）による増幅に続いて、
当技術分野で周知の技法、例えば、上記に挙げたものな
どを用いて、増幅分子を分析することが含まれうる。疾
患の原因となるエンドスタチン対立遺伝子と連鎖不平衡
にあるエンドスタチン遺伝子変異または多型が存在する
か否かを判定するために、この結果得られた増幅配列
を、増幅された核酸がエンドスタチン遺伝子の正常コピ
ーのみを含む場合に予想されるものと比較することがで
きる。

【０１３４】さらに、エンドスタチン遺伝子変異を有す
る個体を同定するために周知の遺伝子型判定法を用いる
こともできる。このような技法には、例えば、用いる特
定の制限酵素に対する認識部位の1つにおける配列変異
がかかわる、制限断片長多型（RFLP）の使用が含まれ
る。

【０１３５】さらに、制限酵素部位の間にさまざまな数
の短い縦列反復DNA配列が存在することを利用する、エ
ンドスタチン遺伝子特異的変異の同定に用いうる、DNA
多型を分析するための改良された方法も記載されてい
る。例えば、ウェーバー（Weber）（米国特許第5,075,2
17号）は、(dC-dA)n-(dG-dT)nという短い縦列反復配列
のブロックの長さの多型に基づくDNAマーカーを記載し
ている。(dC-dA)n-(dG-dT)nブロックの平均間隔は30,00
0bp〜60,000bpと推定されている。これほど密に存在す
るマーカーは共遺伝を高い頻度で示し、例えば、エンド
スタチン遺伝子内部の変異などの遺伝変異の同定、なら
びにエンドスタチン変異に関連した疾患および障害の診
断に極めて有用である。

【０１３６】また、カスキー（Caskey）ら（米国特許第
5,364,759号）も、短いトリ-およびテトラヌクレオチド
反復配列を検出するためのDNAプロファイリングアッセ
イ法を記載している。この方法には、エンドスタチン遺
伝子などの対象となるDNAを抽出する段階、抽出したDNA
を増幅する段階、および反復配列の標識による個体DNA
の遺伝子型マップを作製する段階が含まれる。

【０１３７】そのいずれもが集団内に極めて高い頻度で
存在する2つの対立遺伝子を有する二多型性（bialleli
c）SNPまたは二多型性マーカーを含む、一塩基多型（SN
Ps）を同定するために当技術分野で周知のその他の方法
を用いることもできる。SNPsを検出するための従来の方
法には、例えば、通常のドットブロット分析、SSCP分析
（例えば、Oritaら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 86：2766〜2770を参照）、変性勾配ゲル電気泳動（DG
GE）、ヘテロ二本鎖分析、ミスマッチ切断検出、および
当技術分野で周知の他のルーチン的な技法が含まれる
（例えば、Sheffieldら、1989、Proc. Natl. Acad. Sc
i. 86：5855〜5892；Grompe、1993、NatureGenetics
5：111〜117を参照）。SNPの検出およびマッピングのた
めの代替的な好ましい方法には、標的DNAにおけるSNP部
位を単一ヌクレオチドプライマー伸長反応によって検出
するマイクロシークエンシング法が含まれる（例えば、
Goeletら、国際公開公報第92／15712号；Mundy、米国特
許第4,656,127号；VaryおよびDiamond、米国特許第4,85
1,331号；Cohenら、国際公開公報第91／02087号；Chee
ら、国際公開公報第95／11995号；Landegrenら、1988、
Science 241：1077〜1080；Nicersonら、1990、Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A. 87：8923〜8927；Pastinen
ら、1997、Genome Res. 7：606〜614；Pastinenら、199
6、Clin. Chem. 42：1391〜1397；Jalankoら、1992、Cl
in. Chem. 38：39〜43；Shumakerら、1996、Hum. Mutat
ion 7：346〜354；Caskeyら、国際公開公報第95／00669
号を参照のこと）。

【０１３８】エンドスタチンの発現レベルを、遺伝子発
現レベルをまずアッセイすることによって決定すること
もできる。例えば、肝臓などの、エンドスタチン遺伝子
を発現することが知られたまたは疑われる細胞種または
組織からRNAを単離し、上記のものなどのハイブリダイ
ゼーションまたはPCR法を用いて検査することができ
る。単離する細胞は細胞培養物または対象に由来するも
のでよい。培養物から採取した細胞の分析は、細胞を用
いる遺伝子療法の一部として用いるため、またはエンド
スタチン遺伝子の発現に対する化合物の効果を検討する
ための細胞の評価において必要な段階と思われる。

【０１３９】このような検出方式の1つの態様では、対
象となるRNA分子からcDNA分子を合成する（例えば、RNA
分子からcDNAへの逆転写による）。続いて、cDNA内部の
配列をPCR増幅反応などの核酸増幅反応のためのテンプ
レートとして用いる。この方法の逆転写および核酸増幅
の段階で合成開始試薬（例えば、プライマー）として用
いる核酸試薬は、上記のエンドスタチン遺伝子核酸試薬
から選択される。このような核酸試薬の好ましい長さは
少なくとも9〜30ヌクレオチドである。増幅産物の検出
のためには、放射性または非放射性に標識したヌクレオ
チドを用いて核酸増幅を行うとよい。または、標準的な
臭化エチジウム染色によって、または任意の他の適した
核酸染色法によって産物を可視化できるように、増幅産
物を十分に生成させてもよい。

【０１４０】さらに、このようなエンドスタチン遺伝子
発現アッセイ法をインサイチューで、すなわち、核酸精
製を要さずに、生検または摘出によって採取した対象組
織の組織切片（固定および／または凍結したもの）に対
して直接に行うことも可能である。このようなインサイ
チュー手順のためのプローブおよび／またはプライマー
としては上記のものなどの核酸試薬を用いることができ
る（例えば、Nuovo, G.J.、1992、「PCRインサイチュー
ハイブリダイゼーション：プロトコールおよび応用（PC
R In Situ Hybridization: Protocols And Application
s）、Raven Press、NYを参照）。

【０１４１】または、十分な量の適切な細胞を入手しう
る場合には、エンドスタチン遺伝子のmRNA発現レベルを
決定するために標準的なノーザン分析を行うことができ
る。

【０１４２】ひとたび遺伝子の配列（または配列の一
部）が単離されれば、この配列を用いて遺伝子の染色体
上の位置をマッピングすることができる。このため、本
明細書に記載の核酸分子またはその断片は、対応する遺
伝子の染色体上の位置をマッピングするために用いるこ
とができる。配列の染色体へのマッピングは、これらの
配列を疾患と関連した遺伝子と相関づける上で重要な第
1の段階である。

【０１４３】簡潔に述べると、遺伝子の染色体へのマッ
ピングは、本発明の遺伝子の配列からPCRプライマー
（好ましくは15bp〜25bp長）を調製することによって行
うことができる。本発明の遺伝子配列のコンピュータ分
析を用いると、ゲノムDNA中の複数のエキソンにまたが
らないプライマーを迅速に選択し、増幅過程を簡略化す
ることが可能である。続いて、これらのプライマーを、
個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスク
リーニングに用いることができる。遺伝子配列に対応す
るヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみから増幅
断片が得られると考えられる。この技法の概説について
は、デスタチオ（D'Eustachio）ら、1983、Science、22
0：919〜924を参照されたい。

【０１４４】体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、
特定の配列を特定の染色体に対応づけるための迅速な手
順である。単一のサーマルサイクラーを用いて1日に3つ
またはそれ以上の配列を対応づけることができる。オリ
ゴヌクレオチドプライマーの設計に本発明の核酸配列を
用いることにより、特定の染色体からの一連の断片を用
いてサブローカリゼーション（sublocalization）を行
うことができる。遺伝子を染色体にマッピングするため
に同様に用いうるその他のマッピング手法には、インサ
イチューハイブリダイゼーション（Fanら、1990、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87：6223〜27に記載）、標識フ
ローソーティングを行った染色体によるプレスクリーニ
ング（Popp Sら、1993、Hum Genet.、92（6）：527〜3
2）および染色体特異的cDNAライブラリーとのハイブリ
ダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。さ
らに、DNA配列と中期染色体展開物との蛍光インサイチ
ューハイブリダイゼーション（FISH）を用いることによ
り、正確な染色体位置を1つのステップで得ることがで
きる（この技法の概説については、Vermaら、「ヒト染
色体：基本的技法マニュアル（Human Chromosome: A Ma
nual for Basic Techniques）」、Pergamon Press、New
York、1988を参照されたい）。

【０１４５】染色体マッピングのための試薬は単一の染
色体またはその染色体上の単一の部位を標識するために
個別に用いることができ、または一連の試薬を多数の部
位および／もしくは多数の染色体を標識するために用い
ることもできる。実際にはマッピングの目的には遺伝子
の非コード領域に対応する試薬が好ましい。コード配列
は遺伝子ファミリーの内部に保存されている可能性が高
いため、染色体マッピングの際にクロスハイブリダイゼ
ーションが起こる確率が高くなる。

【０１４６】ひとたび配列が正確な染色体位置にマッピ
ングされれば、配列の染色体上の物理的位置を遺伝地図
データと相関づけることができる（このようなデータは
例えば、V. McKusick、「ヒトにおけるメンデル遺伝（M
endelian Inheritance in Man）」に記載があり、これ
はJohns Hopkins University Welch Medical Libraryか
らオンラインで利用することができる）。続いて、同一
の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係
を、例えば、エゲランド（Egeland）ら、1987、Nature
325：783〜787に記載された連鎖解析（物理的に隣接し
た遺伝子の共遺伝）によって同定する。

【０１４７】さらに、本発明の遺伝子と関連のある疾患
に罹患した個体と罹患していない個体との間のDNA配列
の差異を決定することもできる。変異が罹患個体の一部
または全部に観察されるが非罹患個体では観察されない
ならば、その変異はその特定の疾患の原因である可能性
が高い。罹患個体と非罹患個体との比較では一般に、染
色体展開物から視覚化しうる、またはDNA配列に基づい
てPCRを用いて検出しうる、染色体における欠失または
転座などの構造的変化をまず探索する。最後に、変異の
存在を確認するため、および変異を多型と区別するため
に、いくつかの個体からの遺伝子の完全シークエンシン
グを行うことができる。

【０１４８】本発明の核酸配列を、微量の生体試料から
個体を識別するために用いることもできる。例えば、米
国陸軍は、個人の識別のために制限断片長多型（RFLP）
を用いることを検討している。この技法では、個体のゲ
ノムDNAを1つまたは複数の制限酵素で消化し、識別用の
ユニークなバンドを得るためにサザンブロット上でのプ
ローブ検索を行う。この方法は、紛失、取り替え、また
は盗難のおそれがあり、陽性識別を困難としている現在
の「犬の鑑札」の限界を免れている。本発明の配列はRF
LPのための付加的なDNAマーカーとして有用である（米
国特許第5,272,057号に記載されている）。

【０１４９】さらに、本発明の配列を、個体ゲノムの選
択した部分のDNA配列を実際に各塩基毎に決定する代替
的な技法を提供するために用いることもできる。すなわ
ち、本明細書に記載の核酸配列を用いて、配列の5'およ
び3'末端から2つのPCRプライマーを調製することができ
る。続いて、これらのプライマーを用いて、個体のDNA
を増幅し、その後にそのシークエンシングを行うことが
できる。

【０１５０】各個体は対立遺伝子の違いのためにこの種
のDNA配列の一意的なセットを有すると考えられるた
め、このようにして調製した個体からの一連の対応する
DNA配列により、一意的な個体識別がもたらされる。本
発明の配列は、個体および組織からこのような識別配列
を入手するために用いることができる。本発明の核酸配
列はヒトゲノムの部分を一意的な形で表現する。対立遺
伝子変異はこれらの配列のコード領域では一定の程度み
られ、非コード領域ではこれを上回る程度で生じる。ヒ
ト個体間の対立遺伝子変異は500塩基毎に約1個の頻度で
生じると推定されている。本明細書に記載の配列はそれ
ぞれ、一定の程度で、識別の目的で個体からのDNAと比
較するための標準物として用いることができる。非コー
ド領域にはさらに多くの多型があるため、個体を鑑別す
るために必要な配列はそれよりも少なくてよい。

【０１５１】本明細書に記載の核酸配列からの一連の試
薬を、個体に関する一意的な識別データベースを作成す
るために用いる場合には、その個体からの組織を識別す
るために同じ試薬を後に用いることができる。一意的な
識別データベースを用いることにより、極めて少量の組
織試料から、生存している個体または死亡した個体の陽
性識別を行える。

【０１５２】DNAを用いる識別法を法医生物学に用いる
こともできる。法医生物学は、例えば犯罪の加害者を明
確に識別するための手段として、犯罪現場で発見された
生物学的証拠の遺伝子型判定を用いる科学分野である。
このような識別を行うために、PCR技術を用いて、犯罪
現場で発見された毛髪もしくは皮膚などの組織、または
血液、唾液もしくは精液などの体液といった極めて少量
の生体試料から得られたDNA配列を増幅することができ
る。続いて、増幅配列を標準物と比較し、それによって
生体試料の由来を識別することが可能である。

【０１５３】本発明の配列は、ヒトゲノム中の特定の遺
伝子座を標的とするポリヌクレオチド試薬、例えばPCR
プライマーを得るために用いることができ、これは例え
ば、別の「識別マーカー」（すなわち、特定の個体に一
意的な別のDNA配列）を提供することにより、DNAを用い
る法医学的識別の信頼性を高めることができる。上記の
通り、実際の塩基配列情報は制限酵素によって生じた断
片によって形成されるパターンに代わる正確な選択肢と
して識別のために用いうる。非コード領域には多型がよ
り多くあり、この技法を用いた個体鑑別が容易であるた
め、非コード領域を標的とする配列はこの目的に特に適
している。ポリヌクレオチド試薬の例には、本発明の核
酸配列またはその部分、例えば、長さが少なくとも20塩
基または30塩基である非コード領域に由来する断片が含
まれる。

【０１５４】本明細書に記載の核酸配列はさらに、例え
ば、特定の組織、例えば肝組織を同定するためのインサ
イチューハイブリダイゼーション法に用いうるポリヌク
レオチド試薬、例えば標識性または標識可能なプローブ
を得るために用いることができる。これは法病理学者に
由来不明の組織が提出された場合には極めて有用であ
る。種および／または臓器の種類別に組織を識別するた
めに一連のこのようなプローブを用いることができる。

【０１５５】上記に考察した、障害のないもしくは変異
型エンドスタチン遺伝子産物またはその保存的変異体ま
たはそのペプチド断片を標的とする抗体を、本明細書に
記載の癌などの血管新生関連疾患に関する診断および予
後判定のために用いてもよい。このような方法は、エン
ドスタチン遺伝子産物の合成もしくは発現のレベルの異
常、またはエンドスタチン遺伝子産物の構造、時間的発
現および／もしくは物理的位置の異常を検出するために
用いることができる。以下に述べる抗体およびイムノア
ッセイ法には、例えば、エンドスタチン遺伝子産物の精
製および癌などの血管新生関連疾患に対する治療効果の
評価において重要なインビトロでの用途がある。以下に
述べるような抗体または抗体の断片は、エンドスタチン
遺伝子発現およびエンドスタチンペプチド産生に対する
効果を判定することを目的に、治療的化合物の候補をイ
ンビトロでスクリーニングするために用いることができ
る。癌などの血管新生関連疾患に対して有益な効果を有
する化合物を同定し、治療有効量を決定することができ
る。

【０１５６】例えば、癌などの血管新生関連疾患に対す
る細胞を用いる遺伝子療法の効果を評価するために、イ
ンビトロイムノアッセイ法を用いることができる。例え
ば、エンドスタチンペプチドを産生するように遺伝子改
変された細胞で得られるエンドスタチン遺伝子発現レベ
ルを決定するために、エンドスタチンペプチドを標的と
する抗体をインビトロで用いることもできる。細胞内エ
ンドスタチン遺伝子産物の場合には、このような評価
は、好ましくは、細胞可溶化物または抽出物を用いて行
われる。このような分析により、インビボでの治療効果
を得るために必要な形質転換細胞の数の決定、ならびに
遺伝子補充プロトコールの最適化が可能になる。

【０１５７】分析する組織または細胞種には一般に、エ
ンドスタチン遺伝子を発現することが知られたまたは疑
われる、当技術分野で知られたものが含まれる。本明細
書で用いうるタンパク質単離法は、例えば、ハーロウ
（Harlow）およびレーン（Lane）に記載されたものであ
る（1988、「抗体：実験マニュアル（Antibodies：A La
boratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、Cold Spring Harbor、New York）。単離する細
胞は細胞培養物または対象に由来するものでよい。培養
物から採取した細胞の分析は、細胞を用いる遺伝子療法
の一部として用いるため、またはエンドスタチン遺伝子
の発現に対する化合物の効果を検討するための細胞の評
価において必要な段階と思われる。

【０１５８】エンドスタチン遺伝子産物またはその保存
的変異体もしくはペプチド断片の検出のために好ましい
診断方法には、例えば、エンドスタチン遺伝子産物また
は保存的変異体もしくはペプチド断片を抗エンドスタチ
ン遺伝子産物特異的抗体との相互作用によって検出する
イムノアッセイ法が含まれる。

【０１５９】例えば、本発明において有用な上記のもの
などの抗体または抗体の断片は、エンドスタチン遺伝子
産物またはその保存的変異体もしくはペプチド断片の存
在を定量的または定性的に検出するために用いうる。こ
れは例えば、蛍光標識抗体（本項の以下の部分を参照）
を光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光定量に
よる検出と組み合わせて用いる免疫蛍光法によって行う
ことができる。このような技法は、 細胞表面に発現さ
れるエンドスタチン遺伝子産物に対して特に好ましい。

【０１６０】本発明において有用な抗体（またはその断
片）は、さらに、エンドスタチン遺伝子産物またはその
保存的変異体もしくはペプチド断片のインサイチュー検
出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法などにお
いて組織学的に用いることもできる。インサイチュー検
出は、対象から組織標本を採取し、それを本発明の標識
抗体に適用することによって行いうる。抗体（または断
片）は好ましくは、標識抗体（または断片）を生体試料
の上に重ねることによって適用される。このような手順
を用いることにより、エンドスタチン遺伝子産物または
保存的変異体もしくはペプチド断片の存在だけでなく、
検討した組織におけるその分布も決定することが可能で
ある。本発明を用いることにより、多岐にわたる組織学
的方法の任意のもの（染色手順など）を、このようなイ
ンサイチュー検出が得られるように改変しうることを当
業者は容易に理解すると考えられる。

【０１６１】エンドスタチン遺伝子産物またはその保存
的変異体もしくはペプチド断片に関するイムノアッセイ
法は一般に、生物液体、組織抽出物、新たに採取した細
胞または細胞培養物中でインキュベートした細胞の可溶
化物などの試料を、エンドスタチン遺伝子産物またはそ
の保存的変異体もしくはペプチド断片を同定しうる検出
可能な標識がなされた抗体の存在下でインキュベート
し、結合型抗体を当技術分野で周知の数多くの方法のう
ち任意のものによって検出することを含むと考えられ
る。

【０１６２】生体試料を、細胞、細胞粒子または可溶性
タンパク質を固定化しうるニトロセルロースまたは他の
固体支持体などの固相支持体または担体と接触させて固
定する。続いて、支持体を適した緩衝液で洗浄した後
に、検出可能な標識がなされたエンドスタチン遺伝子特
異的抗体で処理することができる。続いて、非結合型抗
体を除去するために固相支持体を再び緩衝液で洗浄する
とよい。続いて、固体支持体に結合した標識の量を従来
の手段によって検出しうる。

【０１６３】「固相支持体または担体」とは、抗原また
は抗体と結合しうる任意の支持体のことである。よく知
られた支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロ
ン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロー
ス、ポリアクリルアミド、斑糲岩および磁鉄鉱が含まれ
る。本発明の目的には、担体の性質はある程度可溶性で
あってもよく、不溶性であってもよい。支持体材料は、
結合分子が抗原または抗体と結合する限り、事実上あら
ゆる構造的形状を有しうる。このため、支持体の形状は
ビーズのように球形でもよく、試験管の内面または棒の
外表面のように円筒形でもよい。または、表面はシー
ト、試験紙片などのように平坦でもよい。好ましい支持
体にはポリスチレンビーズが含まれる。当業者は結合抗
体または抗原に適した多くの他の担体を認識している、
またはルーチンの実験を用いることによってそれを確認
しうると考えられる。

【０１６４】所定ロットの抗エンドスタチン遺伝子産物
抗体の結合活性は、よく知られた方法に従って測定しう
る。当業者はルーチンの実験を用いることにより、各測
定に関する機能的および最適なアッセイ条件を決定しう
ると考えられる。

【０１６５】エンドスタチン遺伝子ペプチド特異的抗体
に検出可能な標識を施しうる手法の一つは、それを酵素
と連結させ、酵素イムノアッセイ法（EIA）に用いるこ
とである（Voller, A.、「固相酵素免疫アッセイ法（Th
e Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（ELISA）」、
1978、Diagnostic Horizons 2、1〜7、Microbiological
Associates Quarterly Publication、Walkersville、M
D）；Voller, A.ら、1978、J. Clin. Pathol. 31、507
〜520；Butler, J.E.、1981、Meth. Enzymol. 73、482
〜523；Maggio, E.（編）、1980、酵素イムノアッセイ
法（Enzyme Immunoassay）、CRC Press、Boca Raton, F
L；Ishikawa, E.ら（編）、1981、酵素イムノアッセイ
法（Enzyme Immunoassay）、Kgaku Shoin、Tokyo）。抗
体と結合した酵素は適切な基質、好ましくは色素生産性
基質と、例えば分光光度的、蛍光定量的または視覚的手
段によって検出しうる化学部分が生成されるような様式
で反応すると考えられる。抗体に検出可能な標識を施す
ために用いうる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ-5-ステロイドイ
ソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、β-グ
リセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イ
ソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレ
アーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステ
ラーゼが非制限的に含まれる。検出は酵素に対する色素
産生性基質を用いる比色分析法によって行うことができ
る。また、検出を、基質の酵素反応の程度を同様に調製
した標準物質と比較する視覚的比較によって行ってもよ
い。

【０１６６】検出をさまざまな他のイムノアッセイ法の
任意のものを用いて行うこともできる。例えば、抗体ま
たは抗体断片を放射標識することにより、ラジオイムノ
アッセイ法（RIA）を用いてエンドスタチン遺伝子ペプ
チドを検出することが可能である（例えば、Weintraub,
B.、ラジオイムノアッセイ法の原理、放射リガンドア
ッセイ法演習過程第7回（Principles of Radioimmunoas
say, Seventh Training Course on Radioligand Assay
Techniques）、Endocrine Society、March、1986）。放
射性同位体はγ線計数管もしくはシンチレーション計数
管の使用などの手段またはオートラジオグラフィーによ
って検出しうる。

【０１６７】抗体を蛍光化合物で標識することも可能で
ある。蛍光標識抗体を適切な波長の光に曝露させると、
その存在を蛍光によって検出することができる。最も一
般的に用いられている蛍光標識用化合物には、フルオレ
セインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリト
リン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタル
アルデヒドおよびフルオレサミンがある。

【０１６８】152Euまたはランタン系列の他のものなど
の蛍光性金属を用いて抗体に検出可能な標識を施すこと
もできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢
酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）など
の金属キレート基を用いて抗体と結合させることができ
る。

【０１６９】化学発光化合物と結合させることによって
抗体に検出可能な標識を施すこともできる。続いて、化
学発光標識抗体の存在を、化学反応の過程で生じるルミ
ネセンスの存在を検出することによって判定する。特に
有用な化学発光標識用化合物の例には、ルミノール、イ
ソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジ
ニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およ
びシュウ酸エステルがある。

【０１７０】同様に、本発明の抗体を標識するために生
物発光化合物を用いてもよい。生物発光とは、触媒タン
パク質が化学発光反応の効率を高める、生体システムに
認められる一種の化学蛍光である。生物発光タンパク質
の存在は蛍光の存在を検出することによって決定され
る。標識の目的にとって重要な生物発光化合物はルシフ
ェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。

【０１７１】以下のアッセイ法は、エンドスタチン遺伝
子産物、タンパク質、例えばエンドスタチン遺伝子産物
と相互作用する細胞内タンパク質またはタンパク質の部
分と結合する化合物、エンドスタチン遺伝子産物と細胞
内タンパク質との相互作用を妨げる化合物、およびエン
ドスタチン遺伝子の活性を調節する（すなわち、エンド
スタチン遺伝子の発現レベルを調節する、および／また
はエンドスタチン遺伝子産物の活性レベルを調節する）
化合物を同定するために設計されたものである。本アッ
セイ法はさらに、エンドスタチン遺伝子調節配列（例え
ば、プロモーター配列；例えば、Platt、1994、J. Bio
l. Chem. 269、28558〜28562を参照）と結合する化合
物、およびエンドスタチン遺伝子の発現レベルを調節し
うる化合物を同定するために用いうる。化合物には、血
液脳関門を通過し、適切な細胞内に入り込み、エンドス
タチン遺伝子もしくはエンドスタチン調節経路にかかわ
る何らかの他の遺伝子の発現に影響を及ぼしうるものな
どの有機低分子、または細胞内タンパク質が非制限的に
含まれうる。

【０１７２】このような細胞内タンパク質を同定するた
めの方法は以下に述べる。このような細胞内タンパク質
は気分の制御および／または調節にかかわるものでもよ
い。さらに、これらの化合物にには、エンドスタチン遺
伝子発現および／またはエンドスタチン遺伝子産物活性
のレベルに影響を及ぼす化合物、ならびに、以下に述べ
るような、癌などのエンドスタチン性疾患の治療的処置
に用いうる化合物が含まれる。

【０１７３】化合物には、ペプチド、例えばIg尾部を有
する融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリー
のメンバーを非制限的に含む可溶性ペプチド；（例え
ば、Lamら、1991、Nature 354、82〜84；Houghtenら、1
991、Nature 354、84〜86を参照）ならびにD-および／
またはL-立体配置アミノ酸、ホスホペプチド（ランダム
または部分縮重性の定方向ホスホペプチドライブラリー
のメンバーを非制限的に含む；例えば、Songyangら、19
93、Cell 72、767〜778を参照）、抗体（ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、
抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または一本鎖抗体、
ならびにFAb、F(ab')2およびFAb発現ライブラリー断片
ならびにそれらのエピトープ結合断片）ならびに有機低
分子および無機分子から構成されるコンビナトリアル化
学に由来する分子ライブラリーが非制限的に含まれう
る。

【０１７４】このような化合物は、化合物、特に血管新
生関連疾患の症状を寛解または悪化させることが知られ
た薬物もしくは薬物のクラスまたはファミリーのメンバ
ーも含みうる。このような化合物には、血管新生阻害薬
である、メタロプロテイナーゼ阻害薬、FGF受容体阻害
薬およびVEGF受容体阻害薬、COX-2阻害薬、INF、IL-1
2、タキソール、ビンブラスチン、サリドマイドなどが
含まれるが、これらに限定されない。好ましくはこのよ
うな化合物は、該化合物が以前に投与された様式とは異
なる様式で用いられる（例えば、異なる投与量、投与様
式、および／または1つもしくは複数の別の化合物との
同時投与）。

【０１７５】本明細書に記載されたものなどのアッセイ
法によって同定された化合物は、例えば、エンドスタチ
ン遺伝子産物の生物的機能の補足説明、および癌などの
血管新生関連疾患の改善のために有用でありうる。例え
ば、このような技法によって同定された化合物から、エ
ンドスタチンを介する過程を調節する能力および／また
は血管新生関連疾患の症状を改善する能力に関して試験
するためのリード化合物が得られる。例えば上記のもの
などの技法によって同定された化合物の有効性を試験す
るためのアッセイ法については以下に述べる。

【０１７６】本発明のエンドスタチン遺伝子産物、例え
ばエンドスタチンポリペプチドなどと結合する化合物を
同定するためにインビトロ系を設計してもよい。同定さ
れた化合物は、例えば、障害のないおよび／もしくは変
異型エンドスタチン遺伝子産物の活性の調節に有用であ
ってよく、エンドスタチン遺伝子産物の生物的機能の解
明に有用であってよく、正常エンドスタチン遺伝子産物
の相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリー
ニングに用いられることができ、またはそれ自体におけ
るこのような相互作用を破壊しうり、エンドスタチンを
介する過程を調節する能力および／もしくは血管新生関
連疾患の症状を改善する能力に関してさらに試験するた
めのリード化合物をもたらすこともできる。

【０１７７】エンドスタチン遺伝子産物と結合する化合
物を同定するために用いられるアッセイ法の原理には、
エンドスタチン遺伝子産物と被験化合物の反応混合物
を、2つの成分を相互作用させて結合させるのに十分な
条件下および時間にわたって調製し、それによって反応
混合物から除去および／または検出されうる複合体を形
成させることが含まれる。これらのアッセイ法はさまざ
まな形で行うことができる。例えば、このようなアッセ
イ法を行うための方法の一つは、エンドスタチン遺伝子
産物または被験物質を固相に固定し、固相に固定された
エンドスタチン遺伝子産物／被験化合物複合体を反応終
了時に検出することを含む。このような方法の1つの態
様では、エンドスタチン遺伝子産物を固体表面に固定
し、固定されていない被験化合物を直接的または間接的
のどちらかで標識しうる。

【０１７８】実際には、マイクロタイタープレートを固
相として好都合に用いうる。固定された成分は非共有性
または共有性結合によって固定されうる。非共有結合は
単に固体表面をタンパク質の溶液でコートし、乾燥させ
ることによって行われうる。または、固定されるべきタ
ンパク質に対して特異的な固定化抗体、好ましくはモノ
クローナル抗体を用いて、タンパク質を固体表面に固定
させてもよい。表面をあらかじめ調製して保存しておい
てもよい。

【０１７９】アッセイを行うためには、固定されていな
い成分を、固定成分を含むコーティングされた表面に添
加する。反応が完了した後、形成された複合体が固体表
面に固定された状態を保つような条件下で、反応してい
ない成分を除去する（例えば、洗浄による）。固体表面
に固定された複合体の検出をさまざまな形で行える。以
前に固定されていなかった成分があらかじめ標識されて
いる場合には、表面に固定された標識の検出によって複
合体が形成されたことが示される。以前に固定されてい
なかった成分があらかじめ標識されていない場合には、
間接的標識を用いて、例えば、以前に固定されていなか
った成分に対して特異的な標識抗体（抗体は続いて、直
接標識または標識抗Ig抗体による間接標識されうる）を
用いて、表面に固定された複合体を検出することができ
る。

【０１８０】または、反応を液相で行い、反応産物を未
反応成分から分離した上で、例えば、溶液中に形成され
た任意の複合体を固定するためのエンドスタチン遺伝子
産物または被験化合物に対して特異的な固定化抗体、お
よび固定された複合体を検出するための可能な複合体の
他の成分に対して特異的な標識抗体を用いて、複合体を
検出することもできる。

【０１８１】タンパク質-タンパク質相互作用を検出す
るのに適した任意の方法を、エンドスタチンタンパク質
-タンパク質相互作用を同定するために用いることがで
きる。

【０１８２】用いうる伝統的な方法には、免疫共沈降、
架橋、および、勾配またはクロマトグラフィーカラムに
よる同時精製がある。このような手順を用いることによ
り、エンドスタチン遺伝子産物と相互作用する細胞内タ
ンパク質を含むタンパク質の同定が可能になる。ひとた
び単離されれば、このようなタンパク質を同定し、それ
と相互作用するタンパク質を同定するための標準的技法
と組み合わせて用いることができる。例えば、エンドス
タチン遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸
配列の少なくとも一部は、エドマン分解法などの当業者
に周知の技法を用いて確認されうる（例えば、Creighto
n、1983、「タンパク質：構造および分子的原理（Prote
in: Structures and Molecular Principles）」W.H. Fr
eeman &Co.、N.Y.、pp.34〜49を参照）。得られたアミ
ノ酸配列は、このようなタンパク質をコードする遺伝子
配列のスクリーニングに用いられうるオリゴヌクレオチ
ド混合物の作製のためのガイドとして用いられうる。ス
クリーニングは例えば、標準的なハイブリダイゼーショ
ン法またはPCR法によって行われる。オリゴヌクレオチ
ド混合物の作製およびスクリーニングのための技法は周
知である（例えば、Ausubel、前記および1990、「PCRプ
ロトコール：方法および応用の手引き（PCR Protocol
s：A Guide to Methods and Applications）」、Innis
ら編、Academic Press, Inc.、New York）。

【０１８３】さらに、エンドスタチンタンパク質と相互
作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定が得
られる方法を用いることもできる。これらの方法には、
例えば、よく知られた技法であるgt11ライブラリーの抗
体プローブ検索と類似した様式でエンドスタチンタンパ
ク質を用いて、標識エンドスタチンタンパク質に関して
発現ライブラリーを調べることが含まれる。

【０１８４】インビボタンパク質相互作用を検出する方
法の一つであるツーハイブリッドシステムを詳細に述べ
るが、これは例示のみを目的としており、限定を意図し
たものではない。このシステムの1種が記載されており
（Chienら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88：9
578〜9582）、クローンテック（Clontech）（Palo Alt
o、CA）社から市販されている。

【０１８５】簡潔に述べると、このようなシステムを用
いて、2つのハイブリッドタンパク質をコードするプラ
スミドを構築する。一方は、エンドスタチン遺伝子産物
と融合した転写アクチベータータンパク質のDNA結合ド
メインからなり、もう一方は、cDNAライブラリーの一部
としてこのプラスミドに組み込まれたcDNAによってコー
ドされる未知のタンパク質と融合した転写アクチベータ
ータンパク質の活性化ドメインからなる。DNA結合ドメ
イン融合プラスミドおよびcDNAライブラリーは、その調
節領域が転写アクチベーターの結合部位を含むレポータ
ー遺伝子（例えばHBSまたはlacZ）を含む酵母サッカロ
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の1
つの菌株に形質転換される。いずれのハイブリッドタン
パク質も単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化でき
ない。DNA結合ドメインのハイブリッドができないのは
それが活性化機能を提供しないためであり、活性化ドメ
インのハイブリッドができないのはそれがアクチベータ
ーの結合部位に局在化することができないためである。
2つのハイブリッドタンパク質同士の相互作用によって
機能的なアクチベータータンパク質が再構成され、レポ
ーター遺伝子の発現がもたらされて、それがレポーター
遺伝子の産物に関するアッセイ法によって検出される。

【０１８６】ツーハイブリッドシステムおよび関連した
方法は、「おとり（bait）」遺伝子産物と相互作用する
タンパク質に関して活性化ドメインライブラリーをスク
リーニングするために用いることができる。これに限定
されないが、一例として、エンドスタチン遺伝子産物を
ベイト遺伝子産物として用いることができる。ゲノム配
列またはcDNA配列の全体を、活性化ドメインをコードす
るDNAと融合させる。このライブラリー、およびDNA結合
ドメインと融合したおとりエンドスタチン遺伝子産物の
ハイブリッドをコードするプラスミドを、同時形質転換
によって酵母レポーター株に導入し、その結果得られた
形質転換株をレポーター遺伝子の発現に関してスクリー
ニングする。例えば、これらに限定されないが、エンド
スタチン遺伝子のオープンリーディングフレームなどの
おとりエンドスタチン遺伝子配列を、GAL4タンパク質の
DNA結合ドメインとをコードするDNAと翻訳的に融合され
るように、ベクター中にクローニングすることができ
る。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子の発
現の原因となるライブラリープラスミドを単離する。続
いて、DNAシークエンシングを用いることにより、ライ
ブラリープラスミドによってコードされるタンパク質が
同定される。

【０１８７】おとりエンドスタチン遺伝子産物と相互作
用するタンパク質を検出しようとする細胞系のcDNAライ
ブラリーを、当技術分野で通常実施されている方法を用
いて作製することができる。本明細書に記載された特定
の系によれば、例えば、cDNA断片をベクター中に挿入し
て、それらがGAL4の転写活性化ドメインと翻訳的に融合
されるようにすることができる。このライブラリーを、
おとりエンドスタチン遺伝子-GAL4融合プラスミドとと
もに、GAL4活性化配列を含むプロモーターによって駆動
されるlacZ遺伝子を含む酵母菌株に同時形質転換によっ
て導入することができる。おとりエンドスタチン遺伝子
産物と相互作用する、GAL4転写活性化ドメインと融合さ
れたcDNAによってコードされるタンパク質は、活性なGA
L4タンパク質を再構成し、それによってHIS3遺伝子の発
現を駆動すると考えられる。ヒスチジンを欠く半流動性
寒天を基剤とする培地を含むペトリ皿での増殖により、
HIS3を発現するコロニーを検出することができる。続い
て、当技術分野において通常実施されている技法を用い
て、これらの菌株からcDNAを精製し、おとりエンドスタ
チン遺伝子と相互作用するタンパク質の作製および単離
のために用いることができる。

【０１８８】本発明のエンドスタチン遺伝子産物は、タ
ンパク質などの細胞内または細胞外高分子を含む、1つ
または複数の高分子とインビボで相互作用すると思われ
る。このような高分子には、細胞受容体などの他のタン
パク質、または核酸分子、および上記のものなどの方法
によって同定されたタンパク質が含まれうるが、これら
に限定されない。例えば、エンドスタチン遺伝子産物は
ペプチドホルモンまたはニューロペプチドとして受容体
と相互作用すると思われる。この考察を目的として、本
明細書において高分子を「結合パートナー」と呼ぶ。エ
ンドスタチン結合をこのようにして妨げる化合物は、エ
ンドスタチン遺伝子産物、特に変異型エンドスタチン遺
伝子産物の活性の調節に有用でありうる。例えば、この
ような化合物はエンドスタチン遺伝子産物とその受容体
との相互作用を妨げうる。このような化合物には、エン
ドスタチン遺伝子産物と接触しうると思われる、たとえ
ば上記のようなペプチドなどの分子が含まれうるが、こ
れらに限定されない。

【０１８９】エンドスタチン遺伝子産物とその1つまた
は複数の結合パートナーとの相互作用を妨げる化合物を
同定するために用いられるアッセイ系の基本的原理に
は、エンドスタチン遺伝子産物と結合パートナーとの反
応混合物を、2つの成分を相互作用させて結合させるの
に十分な条件下および時間にわたって調製し、それによ
って複合体を形成させることが含まれる。化合物を阻害
活性に関して試験するために、反応混合物は被験化合物
の存在下および非存在下で調製する。被験化合物は最初
に反応混合物に含まれてもよく、エンドスタチン遺伝子
産物およびその結合パートナーを加えた後の時点で添加
されてもよい。対照反応混合物は被験化合物の非存在下
またはプラセボの存在下でインキュベートする。続い
て、エンドスタチン遺伝子タンパク質と結合パートナー
との任意の複合体の形成を検出する。被験化合物を含む
反応混合物でなく対照反応における複合体形成により、
化合物がエンドスタチン遺伝子タンパク質と相互作用性
結合パートナーとの相互作用を妨げることが示される。
さらに、被験化合物および正常エンドスタチン遺伝子タ
ンパク質を含む反応混合物における複合体の形成を、被
験化合物および変異型エンドスタチン遺伝子タンパク質
を含む反応混合物における複合体の形成と比較すること
もできる。正常エンドスタチン遺伝子タンパク質ではな
く変異型の相互作用を破壊する化合物を同定することが
望ましい場合には、この比較は重要と思われる。

【０１９０】エンドスタチン遺伝子産物と結合パートナ
ーとの相互作用を妨げる化合物に関するアッセイ法は、
不均一または均一な形式で行うことができる。不均一ア
ッセイ法は、エンドスタチン遺伝子産物または結合パー
トナーのいずれかを固相に固定すること及び、反応終了
時に固相に固定された複合体の検出を含む。均一アッセ
イ法では、反応全体を液相で行う。いずれのアプローチ
でも、試薬を添加する順序を、被験化合物に関して異な
る情報が得られるように変えることができる。例えば、
エンドスタチン遺伝子産物と結合パートナーとの相互作
用を例えば競合によって妨げる被験化合物は、被験物質
の存在下で反応を行うことにより、すなわち、エンドス
タチン遺伝子タンパク質および相互作用性細胞内結合パ
ートナーよりも前または同時に被験物質を反応混合物に
加えることによって同定しうる。または、すでに形成さ
れた複合体を破壊する被験化合物、例えば、複合体から
成分の1つを置換させる高い結合定数を有する化合物
は、複合体が形成された後に被験化合物を反応混合物に
添加することによって試験しうる。さまざまな形式を以
下に簡単に述べる。

【０１９１】不均一アッセイ系では、エンドスタチン遺
伝子産物または相互作用性結合パートナーのいずれかを
固体表面に固定し、一方、固定しない種には直接的また
は間接的に標識を施す。実際には、マイクロタイタープ
レートが好都合に用いられる。固定された分子種は非共
有性または共有性結合によって固定させることができ
る。非共有結合は単に固体表面をエンドスタチン遺伝子
産物の溶液でコーティングし、乾燥させることによって
行われうる。または、固定させようとする分子種に対し
て特異的な固定化抗体を用いて分子種を固体表面に固定
させてもよい。表面をあらかじめ調製して保存しておい
てもよい。

【０１９２】アッセイを行うためには、固定された分子
種のパートナーを、被験化合物の存在下または非存在下
で、コーティングされた表面に曝露する。反応が完了し
た後、反応していない成分を除去し（例えば、洗浄によ
る）、形成された全ての複合体が固体表面に固定された
ままにする。固体表面に固定された複合体の検出はさま
ざまな形で行える。以前に固定されていなかった成分が
あらかじめ標識されている場合には、表面に固定された
標識の検出によって複合体が形成されたことが示され
る。以前に固定されていなかった成分があらかじめ標識
されていない場合には、間接的標識を用いて、例えば、
以前に固定されていなかった成分に対して特異的な標識
抗体（抗体は、続いて直接標識または標識抗Ig抗体によ
り間接標識される）を用いて、表面に固定された複合体
を検出することができる。反応成分を添加する順序に応
じて、複合体の形成を阻害する、またはすでに形成され
た複合体を破壊する被験化合物を検出することができ
る。

【０１９３】または、被験化合物の存在下又は非存在下
で、反応を液相で行い、反応産物を未反応成分から分離
させ、例えば、溶液中に形成された複合体を固定するた
めのエンドスタチン遺伝子産物または被験化合物に対し
て特異的な固定化抗体、および固定された複合体を検出
するための複合体の他の成分に対して特異的な標識抗体
を用いて、複合体を検出することもできる。この場合
も、反応成分を液相に添加する順序に応じて、複合体の
形成を阻害する、またはすでに形成された複合体を破壊
する被験化合物を同定することができる。

【０１９４】本発明の1つの代替的な態様では、均一ア
ッセイ法を用うことができる。このアプローチでは、エ
ンドスタチン遺伝子産物またはその結合パートナーのい
ずれかを標識するが、標識によって生じるシグナルは複
合体形成によって消失するような形で、エンドスタチン
遺伝子タンパク質と相互作用性結合パートナーとの間に
すでに形成された複合体を調製する（例えば、このアプ
ローチをイムノアッセイ法に用いている、Rubensteinに
よる米国特許第4,109,496号を参照のこと）。すでに形
成された複合体と競合するか、またはその分子種の1つ
を置換する被験物質の添加により、バックグラウンドを
上回るシグナルが生じると考えられる。このようにし
て、エンドスタチン遺伝子タンパク質／結合パートナー
の相互作用を破壊する被験物質を同定することができ
る。

【０１９５】1つの特定の態様では、上記の組換えDNA技
術を用いて固定化用のエンドスタチン遺伝子産物を調製
することができる。例えば、pGEX-5X-1などの融合ベク
ターを用いて、その結合活性が得られた融合タンパク質
でも保たれるような様式で、エンドスタチンコード領域
を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子
と融合させる。相互作用性結合パートナーを、当技術分
野で通常実施されている方法および上記の方法を用いて
精製してモノクローナル抗体の作製に用いることができ
る。この抗体は、例えば当技術分野で通常実施されてい
る方法により、放射性同位体125Iで標識されうる。不均
一アッセイ法では、例えば、GST-エンドスタチン融合タ
ンパク質をグルタチオン-アガロースビーズと結合させ
ることができる。続いて、相互作用性結合パートナー
を、被験化合物の存在下または非存在下で、相互作用お
よび結合が起こるような様式で添加しうる。反応期間の
終了時に、非結合材料を洗い流し、標識モノクローナル
抗体を系に添加して、複合体を形成した成分と結合させ
ることができる。エンドスタチン遺伝子タンパク質と相
互作用性結合パートナーとの相互作用は、グルタチオン
-アガロースビーズに付随して保持された放射能の量を
測定することによって検出しうる。被験化合物による相
互作用の阻害が良好に行われれば、放射能の測定値が低
下すると考えられる。

【０１９６】または、GST-エンドスタチン遺伝子融合タ
ンパク質および相互作用性結合パートナーを、固体グル
タチオン-アガロースビーズのない液体中で混合するこ
ともできる。被験化合物は、分子種に相互作用させる時
点またはその後に添加されうる。続いて、この混合物を
グルタチオン-アガロースビーズに添加し、非結合材料
を洗い流す。同じく、エンドスタチン遺伝子産物／結合
パートナー相互作用の阻害の程度は、 標識抗体を添加
し、ビーズに付随した放射能を測定することによって検
出可能である。

【０１９７】本発明のもう1つの態様では、いずれかま
たは両方の完全長タンパク質の代わりに、エンドスタチ
ンタンパク質および／または相互作用パートナーもしく
は結合パートナー（結合パートナーがタンパク質の場
合）の結合ドメインに対応するペプチド断片を用いて、
これらの同じ技法を用いることができる。結合部位の同
定および単離には、当技術分野で通常実施されている任
意の数の方法を用いうる。これらの方法には、タンパク
質の1つをコードする遺伝子の変異誘発、および免疫共
沈降アッセイ法における結合破壊のスクリーニングが含
まれるが、これらに限定されない。続いて、複合体の第
2の分子種をコードする遺伝子における代償性変異を選
択することができる。それぞれのタンパク質をコードす
る遺伝子の配列解析により、相互作用性結合に関与する
タンパク質の領域に対応する変異が明らかになると考え
られる。または、1つのタンパク質を本項に記載した上
記の方法を用いて固体表面に固定し、トリプシンなどの
タンパク質分解酵素で処理した標識結合パートナーとの
相互作用および結合を行わせる。洗浄後に、結合ドメイ
ンを含む短い標識ペプチドは固体材料と結合した状態を
保つと思われ、これを単離してアミノ酸配列決定によっ
て同定できる。また、セグメントをコードする遺伝子を
操作してタンパク質のペプチド断片を発現させることが
できれば、それを結合活性に関して試験し、精製または
合成することができる。

【０１９８】例としては、これらに限定されないが、GS
T-エンドスタチン融合タンパク質を作製し、それをグル
タチオンアガロースビーズと結合させることにより、エ
ンドスタチン遺伝子産物を本項に記載した上記の固体材
料に固定する。得られた相互作用性結合パートナーを35
Sなどの放射性同位体で標識し、トリプシンなどのタン
パク質分解酵素で切断しうる。続いて切断産物を固定さ
れたGST-エンドスタチン融合タンパク質に添加して結合
させる。非結合ペプチドを洗い流した後、結合パートナ
ー結合ドメインを表す標識結合材料を周知の方法によっ
て溶出させ、精製し、アミノ酸配列を解析することがで
きる。このようにして同定されたペプチドを合成的に製
造することもでき、組換えDNA技術を用いて適切な促進
性タンパク質と融合させることもできる。

【０１９９】上記のものなどのアッセイ法によって同定
された結合性化合物を非制限的に含む化合物は、血管新
生に依存的な癌、例えば固形腫瘍、白血病などの血液由
来の腫瘍および腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫；
慢性関節リウマチ；乾癬；眼の血管原性疾患、例えば、
糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植
片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベ
オーシス；オスラー・ウェバー症候群；心筋血管新生；
プラーク血管新生；末梢血管拡張症；血友病性関節症；
血管線維腫；創傷肉芽化；冠動脈側副路；脳側副路；動
静脈奇形；虚血肢血管新生；糖尿病性血管新生；黄斑変
性症；骨折；脈管形成；血球新生；排卵；月経；胎盤形
成；腸管癒着；アテローム性動脈硬化症；強皮症；肥厚
性瘢痕すなわちケロイド；ネコひっかき病（Rochele mi
nalia quintosa）および潰瘍（Helobacter pylori）な
どの血管新生関連疾患の症状を改善する能力に関して試
験することができる。本明細書に記載のアッセイ法によ
り、エンドスタチン遺伝子の発現に影響を及ぼすことに
よって、またはエンドスタチン遺伝子産物の活性レベル
に影響を及ぼすことによってエンドスタチン遺伝子活性
に影響を及ぼす化合物を同定しうることを留意された
い。例えば、エンドスタチン遺伝子および／またはエン
ドスタチン遺伝子産物が関与する経路の別の段階にかか
わる化合物を同定することができ、この同じ経路に影響
を及ぼすことによって癌などの血管新生関連疾患の発生
に対するエンドスタチンの効果が調節される可能性があ
る。このような化合物を、疾患の治療のための治療的方
法の一部として用いうる。

【０２００】以下に述べるのは、癌などの血管新生関連
疾患の症状を改善するこのような能力を示す化合物を同
定するための細胞系（cell-based）アッセイ法および動
物モデル系アッセイ法である。

【０２０１】まず、細胞系システムは、癌などの血管新
生関連疾患の症状を改善するように作用すると思われる
化合物を同定するために用いることができる。このよう
な細胞系には、例えば、エンドスタチン遺伝子を発現す
る細胞系などの組換え細胞または非組換え細胞が含まれ
うる。

【０２０２】このような細胞システムを用いる際には、
エンドスタチンを発現する細胞を、癌などの血管新生関
連疾患の症状を改善する能力を示すと疑われる化合物に
対して、例えば、曝露細胞でこのような症状の改善が誘
発されるのに十分な濃度でかつ十分な時間にわたって曝
露させるとよい。曝露後には、例えば、エンドスタチン
mRNA転写物（例えばノーザン分析による）または細胞に
よって発現されたエンドスタチン遺伝子産物に関して細
胞可溶化物をアッセイすることにより、エンドスタチン
遺伝子の発現の変化を測定するために細胞をアッセイし
うる。エンドスタチン遺伝子の発現を調節する化合物は
治療薬としての優れた候補である。または、癌などの血
管新生関連疾患と関連のある1つまたは複数の細胞表現
型が、より正常もしくは障害のない非罹患型の表現型、
または疾患症状の発生率もしくは重症度が低い可能性が
高いと思われる表現型へと変化させたか否かを判定する
ために細胞を検討する。

【０２０３】さらに、疾患の症状を改善しうる化合物を
同定するために、癌などの血管新生関連疾患に関する動
物系システムまたはモデルを用いることもできる。この
ような動物系システムまたはモデルには、例えば、トラ
ンスジェニックマウス、例えば外因性もしくは内因性の
エンドスタチン配列を発現するように、または内因性エ
ンドスタチン遺伝子配列を発現しないように（すなわち
「ノックアウト」マウス）遺伝子改変されたマウスが含
まれうる。このような動物モデルは、このような疾患の
治療に有効と思われる薬物、医薬品、治療法および介入
を同定するための被験基質として用いることができる。
例えば、動物モデルを症状を改善する能力を示すと疑わ
れる化合物に対して、曝露された動物で癌などの血管新
生関連疾患の症状のこのような改善が誘発されるのに十
分な濃度かつ十分な時間にわたって曝露させることがで
きる。曝露に対する動物の反応を、このような症状の好
転を評価することによって観測しうる。

【０２０４】介入に関しては、癌などの血管新生関連疾
患の症状のいずれかの様相を好転させるあらゆる治療
を、このような疾患におけるヒトの治療的介入のための
候補とみなす必要がある。以下に述べるように、被験薬
剤の投与量は用量反応曲線を得ることによって決定しう
る。

【０２０５】癌などの血管新生関連疾患の診断的および
予後判定的評価のため、ならびにこのような疾患に対す
る素因のある対象の同定のためには、さまざまな方法を
用いることができる。

【０２０６】このような方法は、例えば、上記のエンド
スタチン遺伝子ヌクレオチド配列、および上記のような
ペプチド断片を含む、エンドスタチン遺伝子産物を標的
とする抗体などの試薬を用いうる。特に、このような試
薬は以下の目的に用いることができる： （1）エンドスタチン遺伝子変異の存在の検出、または
癌などの血管新生関連疾患の状態との対比によるエンド
スタチン遺伝子mRNAの過剰発現もしくは過少発現の検
出； （2）非罹患状態との対比によるエンドスタチン遺伝子
産物の過剰または過少の検出；および （3）非罹患状態との対比によるエンドスタチン遺伝子
産物活性の異常レベルの検出。

【０２０７】エンドスタチン遺伝子のヌクレオチド配列
は、例えば、上記のエンドスタチン変異検出のための技
法を用いて、血管新生関連疾患を診断するために用いる
ことができる。

【０２０８】本明細書に記載の方法を、例えば、本明細
書に記載の少なくとも1つの特異的エンドスタチン遺伝
子核酸または抗エンドスタチン遺伝子抗体試薬を含むパ
ッケージ化された診断キットを用いることによって行う
ことができ、これを例えば、臨床現場で癌などの血管新
生関連疾患の異常を呈している対象を診断するために好
都合に用いることができる。

【０２０９】エンドスタチン変異の検出のためには、任
意の有核細胞をゲノム核酸のための開始源として用いう
る。エンドスタチン遺伝子発現またはエンドスタチン遺
伝子産物の検出のためには、エンドスタチン遺伝子が発
現される任意の細胞種または組織を用いうる。

【０２１０】核酸を用いる検出法は前に述べている。ペ
プチド検出法は前に述べている。

【０２１１】本明細書に記載の方法をさらに、本発明の
ポリペプチドの異常発現または活性と関連のある疾患ま
たは障害を有するか、そのリスクのある対象を同定する
ための診断的または予後判定的アッセイ法に用いること
ができる。例えば、前記の診断アッセイ法または以下の
アッセイ法などの本明細書に記載のアッセイ法は、本発
明のポリペプチドの異常発現または活性と関連のある疾
患を有する、またはそれを発症するリスクのある対象を
同定するために用いることができる。または、このよう
な疾患または障害を有する、またはそれを発症するリス
クのある対象を同定するために予後判定アッセイ法を用
いることもできる。このため、本発明は、被験試料を対
象から入手し、本発明のポリペプチドまたは核酸（例え
ば、mRNA、ゲノムDNA）を検出する方法であって、ポリ
ペプチドまたは核酸の存在により、ポリペプチドの発現
もしくは発現の異常と関連のある疾患もしくは障害を有
する、またはそれを発症するリスクのある対象が診断さ
れるような方法を提供する。本明細書で用いる「被験試
料」とは、関心対象の対象から入手した生体試料のこと
を指す。例えば、被験試料は生物液体（例えば、血
清）、細胞試料または組織でありうる。

【０２１２】さらに、本明細書に記載の予後判定アッセ
イ法は、本発明のポリペプチドの発現または活性の異常
と関連のある疾患または障害を治療するための作用物質
（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣
物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬
物候補）を対象に投与しうるか否かを判定するために用
いることができる。例えば、このような方法を用いて、
対象を特異的作用物質または一群の作用物質（例えば、
ポリペプチドの活性を低下させる種類の作用物質）で有
効に治療しうるか否かを判定することができる。したが
って、本発明は、対象を本発明のポリペプチドの発現ま
たは活性の異常と関連のある疾患に対する作用物質によ
って有効に治療しうるか否かを判定するための方法であ
って、被験試料を入手し、ポリペプチドまたはポリペプ
チドをコードする核酸を検出する方法を提供する（例え
ば、ポリペプチドの発現または活性の異常と関連のある
疾患を治療するための作用物質を投与しうる対象が診断
される）。

【０２１３】また、本発明の方法を、本発明の遺伝子に
おける遺伝子障害または変異を検出し、それによって障
害遺伝子を有する対象が本発明のポリペプチドの発現ま
たは活性の異常を特徴とする疾患のリスクがあるかどう
かを判定するために用いることもできる。好ましい態様
において、本方法は、対象から得た細胞の試料におけ
る、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の完全性
に影響を及ぼす変化の少なくとも1つを特徴とする遺伝
子障害もしくは変異、または本発明のポリペプチドをコ
ードする遺伝子の誤発現の有無を検出することを含む。
例えば、このような遺伝子障害または変異は以下のうち
少なくとも1つの存在を確認することによって検出しう
る：1）遺伝子からの1つまたは複数のヌクレオチドの欠
失；2）遺伝子への1つまたは複数のヌクレオチドの付
加；3）遺伝子における1つまたは複数のヌクレオチドの
置換；4）遺伝子の染色体再配列；5）遺伝子のメッセン
ジャーRNA転写物のレベルの変化；6）ゲノムDNAのメチ
ル化パターンなどに関する遺伝子の異常修飾；7）遺伝
子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシン
グパターンの存在；8）遺伝子によってコードされるタ
ンパク質の非野生型レベル；9）遺伝子の対立遺伝子喪
失；および10）遺伝子によってコードされるタンパク質
の不適切な翻訳後修飾。本明細書に述べる通り、遺伝子
における障害を検出するための数多くのアッセイ技法が
当技術分野では知られている。

【０２１４】ある特定の態様において、障害の検出に
は、アンカーPCRもしくはRACE PCRなどのポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号およ
び第4683,202号を参照）または連結連鎖反応（LCR）
（例えば、Landegranら（1988）Science 241：1077〜10
80；およびNakazawaら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91：360〜364）におけるプローブ／プライマーの
使用が含まれ、このうち後者は遺伝子における点変異の
検出のために特に有用と考えられる（例えば、Abravaya
ら（1995）Nucleic Acids Res. 23：675〜682を参
照）。この方法は、患者からの細胞試料の採取、試料の
細胞からの核酸（例えばゲノム性、mRNAまたはその両
方）の単離、核酸試料と、遺伝子（存在すれば）のハイ
ブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で
選択した遺伝子と特異的にハイブリダイズする1つまた
は複数のプライマーとの接触、ならびに増幅産物の有無
の検出または増幅産物のサイズの検出および対照試料と
の長さの比較の段階を含みうる。PCRおよび／またはLCR
は、変異を検出するために用いられる本明細書に記載さ
れる任意の技法とともに予備的増幅段階として用いるこ
とが望ましいと考えられる。

【０２１５】代替的な増幅法には、自己持続的配列複製
（Guatelliら（1990）Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87：
1874〜1878）、転写増幅系（Kwohら（1989）Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 86：1173〜1177）、Q-βレプリカー
ゼ（Lizardiら（1988）Bio/Technology 6：1197）また
はその他の任意の核酸増幅法が含まれ、その後に当業者
に周知の技法を用いて増幅分子を検出する。これらの検
出方式は、核酸分子が極めて少数しか存在しない場合、
該分子の検出に特に有用である。

【０２１６】1つの代替的な態様において、試料細胞か
ら選択した遺伝子における変異を、制限酵素切断パター
ンの変化によって同定しうる。例えば、試料DNAおよび
対照DNAを単離し、（選択的に）増幅し、1つまたは複数
の制限酵素で消化し、ゲル電気泳動によって断片長のサ
イズを決定し、比較する。試料DNAおよび対照DNAの間の
断片長サイズの違いは、試料DNAにおける変異を意味す
る。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許
第5,498,531号を参照）を用いて、リボザイム切断部位
の発生または消失によって特異的変異の存在を評価する
こともできる。

【０２１７】その他の態様では、DNAまたはRNAなどの試
料核酸および対照核酸を数百または数千のオリゴヌクレ
オチドプローブを含む高密度アレイとハイブリダイズさ
せることによって遺伝子変異を同定することができる
（Croninら、1996、Human Mutation 7：244〜255、Koza
lら、1996、Nature Medicine 2：753〜759）。例えば、
遺伝子変異を、クローニン（Cronin）ら、前記に記載さ
れたような光発生（light-generated）DNAプローブを含
む二次元アレイにおいて同定しうる。簡潔に述べると、
プローブの第1のハイブリダイゼーションアレイを、連
続的に一部重複するプローブの線状アレイを作成するこ
とによって配列間の塩基変化を同定する目的で、試料お
よび対照における長いDNA片を走査するために用いるこ
とができる。この段階で点変異の同定が可能となる。こ
の段階に続いて、検出されたすべての変異体または変異
に対して相補的なより小型で特化したプローブアレイを
用いることにより、特定の変異の特徴を分析しうる第2
のハイブリダイゼーションアレイを用いる。それぞれの
変異アレイは、一方が野生型遺伝子に相補的であって他
方が変異遺伝子に相補的である、対応するプローブの組
から構成される。

【０２１８】さらにもう1つの態様において、当技術分
野で知られた種々の配列決定反応のうち任意のものを、
選択した遺伝子の配列を直接決定し、試料核酸の配列と
対応する野生型（対照）配列との比較によって変異を検
出するために用いることができる。配列決定反応の例に
は、マクサム（Maxim）およびギルバート（Gilbert）、
1977、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74：560またはサン
ガー（Sanger）、1977、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
4：5463によって開発された技法に基づくものが含まれ
る。診断的アッセイ法（1995、Bio/Techniques 19：44
8）を実施する際には、質量分析法による配列決定（例
えば、国際公開公報第94/16101号、Cohenら、1996、Ad
v. Chromatogr. 36：127〜162およびGriffinら、1993、
Appl. Biochem. Biotechnol. 38：147〜159を参照）を
含む、種々の自動的配列決定手順の任意のものを用いう
ることも考慮される。

【０２１９】選択した遺伝子における変異を検出するた
めのその他の方法には、RNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ二
本鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために切断剤か
らの保護を用いる方法が含まれる（Myersら、1985、Sci
ence 230：1242）。一般にミスマッチ切断の技法は、野
生型配列を含む（標識された）RNAまたはDNAと、組織試
料から得られた変異型の可能性のあるRNAまたはDNAをハ
イブリダイズさせることによって形成されたヘテロ二本
鎖を提供することによって開始される。この二本鎖を、
対照および試料鎖の間の塩基対ミスマッチのために存在
すると考えられるものなどの二本鎖の一本鎖領域を切断
する作用物質によって処理する。例えば、RNA/DNA 二本
鎖をRNaseで処理し、DNA/DNAハイブリッド体をS1ヌクレ
アーゼで処理することにより、ミスマッチ領域を酵素的
に消化することができる。その他の態様では、DNA/DNA
またはRNA/DNA 二本鎖をヒドロキシルアミンまたは四酸
化オスミウム、およびピペリジンで処理してミスマッチ
領域を消化することができる。ミスマッチ領域の消化後
に、変異の部位を決定するために、結果として得られた
材料を変性ポリアクリルアミドゲルにかけてサイズ別に
分離する（例えば、コットン（Cotton）ら、1988、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 85：4397、サレーバ（Saleeb
a）ら、1992、Methods Enzymol. 217：286〜295を参照
されたい。1つの好ましい態様において、対照DNAまたは
RNAを検出のために標識することができる。

【０２２０】さらにもう1つの態様において、ミスマッ
チ切断反応では、細胞の試料から得られたcDNAにおける
点変異の検出およびマッピングのために規定の系におい
て二本鎖DNAにおけるミスマッチ塩基対を認識する1つま
たは複数のタンパク質（いわゆる「DNAミスマッチ修
復」酵素）を用いる。例えば、大腸菌のmutY酵素はG/A
ミスマッチのAを切断し、ヒーラ（HeLa）細胞のチミジ
ンDNAグリコシラーゼはG/TミスマッチのTを切断する（H
suら、1994、Carcinogenesis 15：1657〜1662）。例示
的な態様によれば、野生型配列などの選択した配列に基
づくプローブを被験細胞からのcDNAまたは他のDNA産物
とハイブリダイズさせる。この二本鎖をDNAミスマッチ
修復酵素で処理し、切断産物が生じていれば、電気泳動
手順などによって検出することができる。（例えば、米
国特許第5,459,039号を参照されたい。）

【０２２１】その他の態様では、遺伝子における変異を
同定するために電気泳動移動度の変化が用いられうると
考えられる。例えば、変異型核酸および野生型核酸の間
の電気泳動移動度の差を検出するために、一本鎖高次構
造多型（SSCP）を用いうる（Oritaら、1989、Proc Nat
l. Acad. Sci USA：86：2766；Cotton、1993、Mutat.Re
s. 285：125〜144およびHayashi、1992、Genet. Anal.
Tech. Appl. 9：73〜79も参照のこと）。試料核酸およ
び対照核酸の一本鎖DNA断片を変性させ、再生させるこ
とができると考えられる。一本鎖核酸の二次構造は配列
によって異なるため、結果として生じた電気泳動移動度
の変化から単一塩基の変化すら検出することが可能とな
る。DNA断片を標識したり標識プローブによって検出し
たりすることもできる。アッセイ法の感度を、配列の変
化に対する二次構造の感受性がより大きい（DNAではな
く）RNAを用いることによって高めうる。1つの好ましい
態様において、本方法では、電気泳動移動度の変化に基
づいて二本鎖ヘテロ二本鎖分子を分離するためにヘテロ
二本鎖分析を用いる（Keenら、1991、Trends Genet 7：
5）。

【０２２２】さらにもう1つの態様では、変性勾配ゲル
電気泳動（DGGE）を用いて、変性剤の勾配を含むポリア
クリルアミドゲルにおける変異型断片または野生型断片
の移動をアッセイする（Myersら、1985、Nature 313：4
95）。DGGEを分析方法として用いる場合には、例えばPC
Rによる約40bpの高融解性GCリッチDNAのGCクランプ（GC
clamp）を加えることにより、確実に完全には変性しな
いようにDNAが改変されると思われる。さらなる態様で
は、対照および試料DNAの移動度の差を同定するため
に、変性勾配の代わりに温度勾配が用いられる（Rosenb
aumおよびReissner、1987、Biophys Chem 265：1275
3）。

【０２２３】点変異を検出するためのその他の技法の例
には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ン、選択的増幅または選択的プライマー伸長が含まれる
が、これらに限定されない。例えば、既知の変異が中心
に配置され、続いて完全な一致が認められた場合のみに
ハイブリダイゼーションを許容するような条件下で標的
DNAとハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドプライ
マーを調製しうる（Saikiら、1986、Nature 324：163；
Saikiら、1989、Proc. Natl Acad. Sci USA 86：623
0）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチ
ドは、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション膜
に付着させ、標識された標的DNAとハイブリダイズさせ
ると、PCRで増幅された標的DNAまたは多数の異なる変異
とハイブリダイズする。

【０２２４】または、選択的PCR増幅に依存する対立遺
伝子特異的増幅法を、本発明とともに用いることもでき
る。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオ
リゴヌクレオチドは、ミスマッチが防止されるか、また
はポリメラーゼ伸長が軽減される適切な条件下で、（増
幅がデイファレンシャルハイブリダイゼーションに依存
するように、）分子の中心部（Gibbsら、1989、Nucleic
Acids Res. 17：2437〜2448）または一方のプライマー
の3'最末端に関心対象の変異を有すると思われる（Pros
sner、1993、Tibtech 11：238）。さらに、切断に基づ
く検出部を作製するために変異領域に新規制限酵素部位
を導入することが望ましいと思われる（Gaspariniら、1
992、Mol. Cell Probes 6：1）。いくつかの態様におい
ては増幅用のTaqリガーゼを用いた増幅も実施しうると
考えられる（Barany、1991、Proc.Natl. Acad. Sci USA
88：189）。このような場合には、3'末端および5'末端
での完全な一致が存在する場合のみに連結が起こると考
えられ、増幅の有無を調べることによって特定の部位で
の既知の変異の存在を検出することが可能となる。

【０２２５】本明細書に記載の方法は、例えば、本明細
書に記載の核酸または抗体試薬の少なくとも1つを含
む、あらかじめパッケージされた診断用キットを用いる
ことによって行うことができ、これは本発明のポリペプ
チドをコードする遺伝子が関与する疾患または疾病の症
状または家族歴がある患者を診断する臨床的状況などで
便利に用いうると考えられる。さらに、本発明のポリペ
プチドが発現される任意の細胞種または組織、好ましく
は末梢血白血球を、本明細書に記載される予後判定アッ
セイ法に用いることもできる。

【０２２６】本発明はさらに、本明細書に記載のエンド
スタチン遺伝子および遺伝子産物の使用および/または
検出を容易にするキットを提供する。本明細書に記載の
キットは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が
関与する疾患または疾病の症状または家族歴がある患者
を診断する臨床的状況などで便利に用いうる。さらに、
本発明のポリペプチドが発現される任意の細胞種または
組織を本明細書に記載の予後判定アッセイ法に用いるこ
ともできる。

【０２２７】1つの態様において、エンドスタチン遺伝
子または遺伝子産物を誤発現する細胞または組織を同定
するための診断検査キットが提供される。この態様にお
いて、診断キットは、ポリペプチドをコードする核酸配
列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検
出可能な標識がなされたオリゴヌクレオチドを含む1つ
または複数の容器とともに提供される。もう1つの態様
において、本キットは、本発明のポリペプチドをコード
する核酸分子を増幅するのに有用な1対のプライマーを
含む1つまたは複数の容器とともに提供される。さまざ
まな他の態様において、本キットは例えば緩衝剤、保存
料またはタンパク質安定化剤なども含みうる。本キット
は、検出可能な物質（例えば、酵素または基質）を検出
するために必要な成分も含みうる。本キットは、アッセ
イされ被験試料と比較されうる1つまたは一連の対照試
料も含みうる。キットの各成分は通常、個別の容器内に
封入され、種々の容器はすべて、被験対象がポリペプチ
ドの発現異常と関連のある疾患に罹患しているか、また
はそれを発症するリスクがあるか否かを観察するための
指示とともに単一のパッケージに収められる。このよう
なキットは、例えば、対象から採取した細胞の試料にお
けるタンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定す
るため、例えば、mRNAレベルの検出またはタンパク質を
コードする遺伝子が変異もしくは欠失しているか否かの
判定に用いることができる。

【０２２８】もう1つの態様において、本発明は、生体
試料（被験試料）における本発明のポリペプチドまたは
核酸の存在を検出するためのキットを提供する。このよ
うなキットは、例えば本発明の配列の使用に関する上記
の項で考察したように、本発明のポリペプチドの異常発
現に関連した疾患に罹患しているか、またはそれを発症
するリスクがあるかどうかを判定するために用いうる。
この態様において、本キットは、（1）本発明のポリペ
プチドと結合する第1の抗体（例えば固体指示物に付着
したもの）；および選択的には（2）そのポリペプチド
または第1のタンパク質と結合し、検出可能な物質が結
合している第2の異なる抗体、を含む1つまたは複数の容
器とともに提供される。このようなキットは、対象が癌
などの血管新生関連疾患に罹患しているか、またはその
リスクが高いかどうかを判定するために用いることがで
きる。

【０２２９】以下に述べるのは、エンドスタチンを介す
る過程を調節しうる、および/または癌などの血管新生
関連疾患を治療しうる方法および組成物である。

【０２３０】例えば、このような方法は、過程が調節さ
れる、または疾患の症状が改善するように、エンドスタ
チン遺伝子の発現および/またはエンドスタチン遺伝子
産物の合成もしくは活性を調節する化合物を投与するこ
とを含みうる。

【０２３１】または、癌などの血管新生関連疾患がエン
ドスタチン活性を低下または消失させるエンドスタチン
遺伝子変異のそれぞれに起因する場合には、このような
方法は、障害のないエンドスタチン遺伝子産物が発現さ
れ、疾患の症状が改善されるように、障害のないエンド
スタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を哺乳動物に
供給することを含みうる。

【０２３２】エンドスタチン遺伝子の変異に起因する癌
などの哺乳動物の血管新生関連疾患の治療のための方法
のもう1つの態様において、このような方法は、細胞が
障害のないエンドスタチン遺伝子産物を発現し、および
疾患の症状が改善されるように、障害のないエンドスタ
チン遺伝子産物をコードする核酸分子を含む細胞を哺乳
動物に提供することを含みうる。

【０２３３】正常エンドスタチン遺伝子産物の機能喪失
が癌などの血管新生関連疾患表現型の発症をもたらす場
合には、エンドスタチン遺伝子産物の活性の上昇によ
り、エンドスタチン遺伝子の発現および/またはエンド
スタチン遺伝子産物活性のレベル低下を示している個体
において無症状状態への進行が促進されると考えられ
る。エンドスタチンの発現または合成を高めるための方
法には、例えば、以下に述べるような方法が含まれう
る。

【０２３４】または、癌などの血管新生関連疾患の表現
型の症状を、エンドスタチン遺伝子の発現および/また
はエンドスタチン遺伝子産物活性のレベルを低下させる
化合物を投与することによって改善することもできる。
エンドスタチンの合成または発現のレベルを阻害または
低下させるための方法には、例えば、以下に述べるよう
な方法が含まれうる。

【０２３５】治療方法の1つの態様において、投与され
る化合物には、血管新生関連疾患の症状を改善または悪
化させることが報告されている化合物、特に薬剤は含ま
れない。このような治療方法がこのような化合物を含む
場合には、好ましくは、該化合物は、該化合物が以前に
投与されたのとは異なる様式で用いられる（例えば、異
なる投与量、投与様式、および/または1つもしくは複数
の別の化合物との同時投与）。

【０２３６】もう1つの態様では、癌などの本明細書に
記載の疾患の症状を、例えば、上記のエンドスタチンタ
ンパク質、融合タンパク質およびペプチド配列を用いて
エンドスタチンのレベルおよび/もしくは活性を低下ま
たは上昇させることにより、またはエンドスタチン遺伝
子または遺伝子産物と相互作用し、それによってその活
性を阻害または増強するタンパク質またはタンパク質断
片（例えば、ペプチド）の投与により、エンドスタチン
タンパク質療法によって改善しうる。

【０２３７】このようなタンパク質療法には、例えば、
機能性エンドスタチンタンパク質、または機能性エンド
スタチンドメインを有するエンドスタチンタンパク質の
断片（例えば、ペプチド）の投与が含まれうる。

【０２３８】1つの態様では、機能性エンドスタチン結
合ドメインを有するエンドスタチン断片またはペプチド
を、ペプチドがエンドスタチン結合タンパク質、例えば
エンドスタチン受容体と結合するように、対象に投与す
る。このような断片またはペプチドは、エンドスタチン
の結合タンパク質との結合と競合することによってそれ
を阻害し、個体におけるエンドスタチン活性を阻害する
役割を果たして、それによって本明細書に記載の疾患の
症状を改善すると思われる。または、このような断片ま
たはペプチドは、エンドスタチンのインビボでの機能を
模倣し、それによって本明細書に記載の疾患の症状を改
善することにより、個体におけるエンドスタチン活性を
高めると思われる。

【０２３９】本発明の方法に用いうるタンパク質および
ペプチドには、合成（例えば、組換えまたは化学合成）
タンパク質およびペプチドのほか、天然のタンパク質お
よびペプチドが含まれる。タンパク質およびペプチドは
天然のアミノ酸残基および天然にみられないアミノ酸残
基（例えば、D-アミノ酸残基）の両方、ならびに/また
は1つまたは複数の非ペプチド結合（例えば、イミノ、
エステル、ヒドラジド、セミカルバジドおよびアゾ結
合）を含みうる。また、タンパク質またはペプチドに
は、例えばペプチドの安定性、生物学的利用能および/
または阻害活性が高まるように、別の化学基（すなわ
ち、官能基）がアミノおよび/またはカルボキシ末端に
存在してもよい。官能基の例には、疎水性基（例えば、
カルボベンゾキシル基、ダンシル基およびt-ブチロキシ
カルボニル基）、アセチル基、9-フルオレニルメトキシ
-カルボニル基、およびペプチド基を含む高分子担体基
（例えば、脂質-脂肪酸結合物、ポリエチレングリコー
ルまたは含水炭素）が含まれる。

【０２４０】もう1つの態様では、よく知られたアンチ
センス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイムおよび/
もしくは三重らせんによる方法と組み合わせてエンドス
タチン遺伝子配列を用いて、エンドスタチン遺伝子発現
および/またはエンドスタチン遺伝子産物活性のレベル
を低下させることにより、癌などの特定の血管新生関連
疾患の症状を改善することができる。癌などの血管新生
関連疾患の症状を改善する能力を含め、エンドスタチン
遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力を示すと
思われる化合物には、アンチセンス、リボザイムおよび
三本鎖分子がある。このような分子は、障害のない標的
遺伝子、または適宜、変異型標的遺伝子の活性が低下ま
たは阻害されるように設計されうる。このような分子の
作製および使用のための技法は、当業者には周知であ
る。

【０２４１】アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mR
NAとハイブリダイズし、タンパク質の翻訳を妨げること
によってmRNAの翻訳を直接的に阻止する。アンチセンス
の手法には、標的遺伝子のmRNAに対して相補的なオリゴ
ヌクレオチドの設計が含まれる。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは相補的な標的遺伝子mRNA転写物と結合して
翻訳を妨げると考えられる。完全な相補性が好ましい
が、必要ではない。

【０２４２】本明細書で言及される、RNAの一部に対し
て「相補的な」配列とは、そのRNAとハイブリダイズし
て安定な二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する配
列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合には、二
本鎖DNAのうち一本鎖を検討することができ、三本鎖の
形成をアッセイすることもできる。ハイブリダイズする
能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの
両方に応じて異なると思われる。一般に、ハイブリダイ
ズする核酸が長いほど、RNAとの塩基ミスマッチを多く
含むものでも安定な二本鎖（または場合によっては三本
鎖）を形成する能力が維持される。当業者は、ハイブリ
ダイズした複合体の融解点を調べるための標準的な手順
を用いることにより、許容されうるミスマッチの程度を
確かめることができる。

【０２４３】1つの態様においては、エンドスタチン遺
伝子の非コード領域に対して相補的なオリゴヌクレオチ
ドが、内因性エンドスタチンmRNAの翻訳を阻害するため
のアンチセンス手法に用いられうると考えられる。アン
チセンス核酸は少なくとも6ヌクレオチド長である必要
があり、好ましくは約6ヌクレオチド長〜約50ヌクレオ
チド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の面に
おいて、オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチ
ド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオ
チドまたは少なくとも50ヌクレオチドである。

【０２４４】標的配列の選択にかかわらず、アンチセン
スオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を抑制する能力を定
量化するためのインビボ試験を、はじめに実施すること
が好ましい。これらの試験では、オリゴヌクレオチドに
よるアンチセンス遺伝子の抑制と非特異的な生物学的効
果とを区別するための対照を用いることが好ましい。ま
た、これらの試験では、標的となるRNAまたはタンパク
質のレベルと、内部対照のRNAまたはタンパク質のレベ
ルとを比較することが好ましい。さらに、アンチセンス
オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照オリゴ
ヌクレオチドを用いて得られた結果と比較することが想
起される。対照オリゴヌクレオチドは被験オリゴヌクレ
オチドとほぼ同じ長さであって、そのオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列は標的配列との特異的なハイブリ
ダイゼーションを阻止するために必要な程度までアンチ
センスと異なっていないことが好ましい。

【０２４５】本オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAで
も、それらのキメラ性混合物または誘導体もしくは改変
物でもよく、1本鎖でも2本鎖でもよい。オリゴヌクレオ
チドには、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーショ
ンなどを改善するために、塩基部分、糖部分またはリン
酸骨格に改変を加えることができる。オリゴヌクレオチ
ドは、ペプチドなどの他の付随する基（例えば、インビ
ボで宿主細胞受容体を標的とするためのもの）、または
細胞膜（例えば、Letsingerら、1989、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA、86：6553〜6556；Lemaitreら、1987、Pro
c. Natl. Acad.Sci. USA、84：648〜652；国際公開公報
第88/09810号に記載されたもの）もしくは血液脳関門
（例えば、国際公開公報第89/10134号を参照）を介した
輸送を促進するための因子、またはハイブリダイゼーシ
ョンによって誘発される切断剤（例えばKrolら、1988、
BioTechniques、6：958〜676を参照）もしくはインター
カレート剤（例えばZon、1988、Pharm. Res.、5：539〜
549を参照）を含んでもよい。この目的のために、例え
ばペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発され
る架橋剤、輸送因子またはハイブリダイゼーションによ
って誘発される切断剤などの別の分子と、オリゴヌクレ
オチドを結合させることもできる。

【０２４６】本アンチセンスヌクレオチドは、5-フルオ
ロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-
ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセ
チルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラ
シル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジ
ン、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジヒ
ドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノ
シン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニ
ン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチ
ルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-
メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-
メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル
-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5-メ
トキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシ
ル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシ
ル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢
酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、2-(3-アミノ-3-N-
2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)wおよび2,6-ジ
アミノプリンを非制限的に含む群から選択される、少な
くとも1つの修飾された塩基部分を含みうる。

【０２４７】また、本アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、これらに限定されないが、アラビノース、2-アラビ
ノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選
択される、少なくとも1つの修飾された糖部分も含みう
る。

【０２４８】さらに別の態様において、本アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、例えばホスホロチオネート、ホ
スホロジチオネート、ホスホロアミドチオネート、ホス
ホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホ
ネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセ
タールまたはこれらの骨格のいずれかの類似体などの、
少なくとも1つの修飾されたリン酸骨格を含む。

【０２４９】さらに、本アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、相補的RNAと、通常のβユニットとは対照的にス
トランドが互いに平行に走行する、特異的な2本鎖ハイ
ブリッドを形成するα-アノマー性オリゴヌクレオチド
でもよい（Gautierら、Nucl.Acids. Res.、15：6625〜6
641、1987）。本オリゴヌクレオチドは、2'-o-メチルリ
ボヌクレオチド（Inoueら、1987、Nucl. Acids. Res.、
15：6131〜6148）またはキメラ性RNA-DNA類似体（Inoue
ら、1987、FEBS Lett.、215：327〜330）でもよい。

【０２５０】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、例えばDNA自動合成装置（Biosearch社、Applied Bi
osystems社などが販売しているもの）などを用いること
による、当技術分野で知られた標準的な方法によって合
成することができる。例えば、ホスホロチオネートオリ
ゴヌクレオチドをステイン（Stein）ら（1988、Nucl.Ac
ids. Res. 16：3209）の方法によって合成することがで
き、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御され
た孔のあるガラス重合体支持体を用いて調製することが
できる（Satinら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、85：7448〜7451）。

【０２５１】標的遺伝子コード領域に対して相補的なア
ンチセンスヌクレオチドを用いることができるが、転写
された非翻訳領域に対して相補的なものが最も好まし
い。

【０２５２】本アンチセンス分子は、標的遺伝子をイン
ビボで発現する細胞に送達される必要がある。例えば、
アンチセンス分子を組織部位内に直接注射することがで
き、または望ましい細胞を標的とするように設計された
改変アンチセンス分子（例えば、標的細胞上に発現され
る受容体または抗原と特異的に結合するペプチドまたは
抗体と結合させたアンチセンス）を全身投与することも
できる。

【０２５３】しかし、内因性mRNAの翻訳を抑制するのに
十分なアンチセンス分子の細胞内濃度を達成することは
しばしば困難である。したがって、1つの好ましい手法
では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なpol II
Iまたはpol IIプロモーターの制御下にあるように配置
された組換えDNA構築物を用いる。患者の体内の標的細
胞のトランスフェクションにこのような構築物を用いる
ことにより、内因性標的遺伝子転写物と相補的な塩基対
を形成し、それによって標的遺伝子mRNAの翻訳を阻止す
る、十分な量の一本鎖RNAの転写がもたらされると考え
られる。例えば、細胞に取り込まれてアンチセンスRNA
の転写が行われるように、インビボでベクターを導入す
ることができる。このようなベクターは、それが転写さ
れて望ましいアンチセンスRNAを産生することが可能で
ある限り、エピソームのままであってもよく、染色体に
組み込まれてもよい。このようなベクターは、当技術分
野で標準的な組換えDNA技術の方法によって作製するこ
とができる。ベクターは、哺乳動物細胞における複製お
よび発現のために用いられるプラスミド性、ウイルス
性、または当技術分野で知られた他のものであってよ
い。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳
動物、好ましくはヒトの細胞において作用する、当技術
分野で知られた任意のプロモーターであってよい。この
ようなプロモーターは誘導性でも構成性でもよい。この
ようなプロモーターには以下のものが非制限的に含まれ
る：SV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambo
n、1981、Nature、290：304〜310）；ラウス肉腫ウイル
スの3'末端反復配列中に含まれるプロモーター（Yanamo
toら、1980、Cell、22：787〜797）；ヘルペスチミジン
キナーゼプロモーター（Wagnerら、1981、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA、78：1441〜1445）；またはメタロチオ
ネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら、1982、Nature、
296：39〜42）など。組織部位に直接導入しうる組換えD
NA構築物を調節するためには、あらゆる種類のプラスミ
ド、コスミド、YACまたはウイルスベクターを用いるこ
とができる。または、所望の組織を選択的に感染させる
ためにウイルスベクターを用いることもでき、この場合
には別の経路（例えば全身投与）によって投与を行うこ
とができる。

【０２５４】標的遺伝子のmRNA転写物を触媒的に切断す
るように設計されたリボザイム分子を、標的遺伝子mRNA
の翻訳を妨げ、それによって標的遺伝子産物の発現を妨
げるために用いることもできる（例えば、1990年10月4
日に公開された国際公開公報第90/11364号；Sarverら、
1990、Science 247、1222〜1225を参照されたい）。

【０２５５】リボザイムとは、RNAの特異的切断を触媒
しうる酵素的RNA分子のことである（総説については、R
ossi、1994、Current Biology 4、469〜471を参照）。
リボザイムの作用機序には、リボザイム分子の相補的標
的RNAとの配列特異的ハイブリダイゼーション、および
その後のヌクレオチド鎖切断事象が含まれる。リボザイ
ム分子の組成物は、標的遺伝子mRNAに対して相補的な1
つまたは複数の配列を含む必要があり、mRNA切断をもた
らす既知の触媒配列を含む必要がある。この配列につい
ては、例えば、その全体が本明細書に参照として組み入
れられる米国特許第5,093,246号を参照されたい。

【０２５６】標的遺伝子mRNAを破壊するためにmRNAを部
位特異的認識配列の箇所で切断する種々のリボザイムを
用いることはできるが、ハンマーヘッド型リボザイムを
用いることが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム
は、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によっ
て指定される位置でmRNAを切断する。唯一の必要条件
は、標的mRNAが以下の2塩基を有することである：5'-UG
-3'。ハンマーヘッド型リボザイムの作製および産生は
当技術分野では周知であり、マイヤーズ（Myers）、199
5、「分子生物学およびバイオテクノロジー：包括的便
覧（Molecular Biology and Biotechnology：A Compreh
ensive Desk Reference）」、VCH Publishers、New Yor
k（特に833ページの図4を参照）、ならびにハセロフ（H
aseloff）およびゲルラッハ（Gerlach）、1988、Natur
e、334、585〜591にさらに詳細に記載されており、これ
らはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。

【０２５７】効率を高め、非機能性mRNA転写物の細胞内
蓄積を最小限に抑えるために、リボザイムは、切断認識
部位が標的遺伝子mRNAの5'末端の近傍に位置するように
組換え操作を受けることが好ましい。

【０２５８】本発明のリボザイムには、テトラヒメナ・
サーモフィラ（Tetrahymena Thermophila）に天然に存
在し（IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られる）、チェ
ック（Cech）および共同研究者によって詳細に記載され
ているもの（Zaugら、1984、Science、224：574〜578；
ZaugおよびCech、1986、Science、231：470〜475；Zaug
ら、1986、Nature、324：429〜433；University Patent
s Inc.による国際公開公報第88/04300号；BeenおよびCe
chら、1986、Cell、47：207〜216）などの、RNAエンド
リボヌクレアーゼ（以下では「チェック（Cech）型リボ
ザイム」と表記する）も含まれる。チェック型リボザイ
ムは標的RNA配列と結合する8塩基対の配列を有してお
り、そこで後に標的RNAの切断が起こる。本発明には、
標的遺伝子に存在する8塩基対の活性部位配列を標的と
するチェック型リボザイムが含まれる。

【０２５９】アンチセンス手法の場合と同じく、リボザ
イムは、改変されたオリゴヌクレオチドを含むことがで
き（例えば、安定性の改善、ターゲティングなどのた
め）、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に到達され
る必要がある。好ましい送達方法には、トランスフェク
ションされた細胞が内因性標的遺伝子メッセージを破壊
して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生す
るように、強力な構成性pol IIIまたはpol IIプロモー
ターの制御下にあるリボザイムを「コード」するDNA構
築物を用いることが含まれる。リボザイムはアンチセン
ス分子とは異なり触媒性であるため、効率を得るために
必要な細胞内濃度は低い。

【０２６０】内因性標的遺伝子の発現は、標的相同組換
えを用いる標的遺伝子またはそのプロモーターの不活性
化または「ノックアウト」によって低下させることもで
きる（例えば、Smithiesら、1985、Nature 317、230〜2
34；ThomasおよびCapecchi、1987、Cell 51、503〜51
2；Thompsonら、1989、Cell 5、313〜321を参照；これ
らのそれぞれはその全体が参照として本明細書に組み入
れられる）。インビボで標的遺伝子を発現する細胞のト
ランスフェクションのためには、例えば、選択マーカー
および/もしくは陰性選択マーカーを有するか、または
有しない、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域
または調節領域のいずれか）と相同なDNAが隣接した変
異型で非機能性の標的遺伝子（または完全に関連のない
DNA配列）を用いることができる。標的相同組換えを介
したDNA構築物の挿入により、標的遺伝子の不活性化が
生じる。このような手法は、ES（胚性幹）細胞に対する
改変を用いて不活性化型の標的遺伝子を有する動物子孫
を作製することができる、農業分野における使用に特に
適している（例えば、ThomasおよびCapecchi、1987およ
びThompson、1989、前記を参照）。しかし、組換えDNA
構築物が直接投与されるか、または適切なウイルスベク
ターを用いてインビボで必要な部位へのターゲティング
がなされるのであれば、この手法はヒトにおける使用に
適合化させることができる。

【０２６１】または、体内の標的細胞内での標的遺伝子
の転写を阻止する三本鎖ヘリックス構造を形成させるた
めに、標的遺伝子の調節領域に対して相補的なデオキシ
リボヌクレオチド配列（すなわち、標的遺伝子のプロモ
ーターおよび/またはエンハンサー）へのターゲティン
グを行うことにより、内因性標的遺伝子の発現を低下さ
せることもできる（概論については、Helene、1991、An
ti Cancer Drug Des.、6（6）、569〜584；Heleneら、1
992、Ann. N.Y. Acad. Sci.、660、27〜36；およびMahe
r、1992、Bioassays 14（12）、807〜815を参照された
い）。

【０２６２】転写阻害のための三本鎖ヘリックス形成に
用いる核酸分子は、デオキシヌクレオチドから構成され
る一本鎖である必要がある。これらのオリゴヌクレオチ
ドの塩基組成は、一般にプリンまたはピリミジンのかな
り長い連鎖が二本鎖の一方のストランドに存在すること
を必要とする、フーグスティーン型塩基対規則による三
本鎖形成を促進するように設計される必要がある。ヌク
レオチド配列はピリミジンを主体とするものでもよく、
この場合には結果として生じる三本鎖の3つの会合スト
ランドにわたってTATおよびCGCトリプレットが生じると
考えられる。ピリミジンに富む分子は、二本鎖の1つの
ストランドのプリンに富む領域に対して、そのストラン
ドに平行した方向での塩基相補性を提供する。さらに、
プリンに富む、例えばG残基の連鎖を含む核酸分子を選
択することもできる。これらの分子は、GC対に富むDNA
二本鎖との間で、プリン残基の大半が標的二本鎖の1つ
のストランドに位置し、三本鎖の3つのストランドにわ
たってGGCトリプレットを生じる三本鎖を形成すると考
えられる。

【０２６３】または、いわゆる「スイッチバック」核酸
分子を作製することにより、三本鎖形成の標的となる可
能性のある配列を増やすこともできる。スイッチバック
分子は、それらが塩基対を二本鎖の一方のストランドと
まず形成し、続いてもう一方と形成することにより、プ
リンまたはピリミジンのかなり長い連鎖が二本鎖の一方
のストランドに存在する必要がないように、5'〜3'、3'
〜5'が交代して存在するような様式で合成される。

【０２６４】変異型遺伝子の発現を阻害するために本明
細書に記載のアンチセンス、リボザイムおよび/または
三本鎖分子を用いる場合には、この技法によって正常な
標的遺伝子対立遺伝子によって生じるmRNAの転写（三本
鎖）および/または翻訳（アンチセンス、リボザイム）
が効果的に低下または阻害され、存在する正常な標的遺
伝子産物の濃度が正常表現型のために必要な値よりも低
くなる可能性がある。このため、このような場合には、
標的遺伝子活性が実質的に正常なレベルに確実に維持さ
れるように、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポ
リペプチドをコードおよび発現し、用いるアンチセン
ス、リボザイムまたは三本鎖処理に対する感受性のある
配列を含まない核酸分子を、以下のものなどの遺伝子療
法によって細胞に導入することができる。または、標的
遺伝子が細胞外タンパク質を発現する場合には、標的遺
伝子活性を必要なレベルに維持するために、正常な標的
遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましいと考え
られる。

【０２６５】本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボ
ザイムならびに三本鎖分子は、上記の通り、DNAおよびR
NA分子の合成のための当技術分野で知られた任意の方法
によって調整しうる。これらには、例えば固相ホスホル
アミダイト化学合成などの、当技術分野で周知のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチ
ドの化学合成のための技法が含まれる。または、アンチ
センスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよび
インビボ転写によってRNA分子を作製することもでき
る。このようなDNA配列は、T7ポリメラーゼプロモータ
ーまたはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適したRNA
ポリメラーゼプロモーターが組み入れられた多岐にわた
るベクターに組み入れることができる。または、用いる
プロモーターに応じてアンチセンスRNAを構成性または
誘導性に合成するアンチセンスcDNA構築物を、細胞系に
安定的に導入することもできる。

【０２６６】正常エンドスタチン遺伝子の発現および/
またはエンドスタチン遺伝子産物活性のレベルの上昇に
関連して、上記のエンドスタチン遺伝子核酸配列を、例
えば、癌などの血管新生関連疾患の治療のために用いる
ことができる。このような治療は、例えば、遺伝子補充
療法の形式で投与を行うことが可能である。具体的に
は、正常エンドスタチン遺伝子、または正常なエンドス
タチン遺伝子機能を示すエンドスタチン遺伝子産物の産
生をもたらすエンドスタチン遺伝子の一部の1つまたは
複数のコピーを、アデノウイルス、アデノ随伴ウイル
ス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスベクターを
非制限的に含むベクター、さらにはDNAを細胞に導入す
るリポソームなどの他の粒子を用いて、対象内部の適切
な細胞に挿入することができる。

【０２６７】エンドスタチン遺伝子は脳内で発現可能で
あるため、このような遺伝子補充療法により、対象内部
のこれらの細胞種へのエンドスタチン遺伝子配列の送達
が可能になるはずである。このため、1つの態様では、
当業者に周知の技法（例えば、1988年4月25日に公開さ
れた国際公開公報第89/10134号を参照）を用いて、エン
ドスタチン遺伝子配列に血液脳関門を容易に通過させ、
脳内の細胞に配列を送達することが可能である。血液脳
関門を通過しうる送達に関しては、例えば上記のものな
どのウイルスベクターが好ましい。

【０２６８】もう1つの態様において、送達のための技
法には、エンドスタチン遺伝子配列を発現させようとす
る細胞の部位にこのようなエンドスタチン遺伝子配列を
直接投与することが含まれる。

【０２６９】エンドスタチン遺伝子の発現および/また
はエンドスタチン遺伝子産物活性の全体的レベルを高め
るために用いられうるこのほかの方法には、適切なエン
ドスタチン発現細胞、好ましくは自己細胞を、癌などの
血管新生関連疾患の症状を改善するのに十分な位置およ
び数で対象に導入することが含まれる。このような細胞
は組換え細胞でも非組換え細胞でもよい。

【０２７０】対象におけるエンドスタチン遺伝子発現の
全体的レベルを高めるために投与することができる細胞
には、エンドスタチン遺伝子を発現する正常細胞、好ま
しくは肝細胞がある。

【０２７１】または、エンドスタチン遺伝子配列を発現
するように、細胞、好ましくは自己細胞に遺伝子操作を
行い、続いてそれを癌などの血管新生関連疾患の症状の
改善に適した位置に導入することもできる。または、障
害のないエンドスタチン遺伝子を発現する、MHCが一致
する個体に由来する細胞を用いることもでき、これには
例えば肝細胞が含まれうる。エンドスタチン遺伝子配列
の発現は、必要な細胞種におけるこのような発現を可能
にする適切な遺伝子調節配列によって制御される。この
ような遺伝子調節配列は当業者に周知である。このよう
な細胞を用いる遺伝子療法は当業者に周知であり、例え
ば、アンダーソン（Anderson）、米国特許第5,399,349
号を参照されたい。

【０２７２】投与しようとする細胞が非自己細胞である
場合には、導入細胞に対する宿主免疫応答が起こるのを
予防する周知の方法を用いてそれらを投与することがで
きる。例えば、隣接した細胞外環境との成分の交換は許
容するが導入細胞が宿主免疫系によって認識されること
は許容しないカプセル封入形態として、細胞を導入して
もよい。

【０２７３】さらに、エンドスタチン遺伝子産物活性を
調節しうる、上記のような技法によって同定されたもの
などの化合物を、当業者に周知の標準的な技法を用いて
投与することもできる。投与する化合物を脳細胞と相互
作用させようとする場合には、血液脳関門の通過を可能
にする公知のものを投与法に含める必要がある。

【０２７４】本明細書に記載のスクリーニングアッセイ
法によって同定されるような、本発明のポリペプチドの
活性または発現に対して刺激効果または抑制効果を有す
る作用物質または調節因子を、ポリペプチドの異常活性
と関連のある疾患の治療（予防的または治療的）のため
に個体に投与することができる。このような治療ととも
に、その個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子
型とその個体の外来性化合物または薬物に対する反応と
の間の関係に関する学問）が考慮される。治療薬の代謝
の違いは、薬理活性をもつ薬物の投与量と血中濃度との
間の関係が変化するために、高度の毒性または治療の失
敗につながりうる。このため、個体の薬理ゲノム学によ
り、該個体の遺伝子型の検討に基づいて予防的または治
療的治療のための有効な作用物質（例えば薬物）を選択
することが可能になる。このような薬理ゲノム学はさら
に、適切な投与量および治療方式の決定に用いることが
できる。したがって、個体における本発明のポリペプチ
ドの活性、本発明の核酸の発現、または本発明の遺伝子
の変異含有量を評価し、それによってその個人の治療的
治療または予防的治療に適した作用物質を選択すること
が可能である。

【０２７５】薬理ゲノム学では、罹患した個体における
薬物分布の変化および異常作用に起因する、薬物に対す
る反応における臨床的に有意な遺伝的変動を取り扱う。
例えば、リンダー（Linder）（1997）Clin. Chem. 43
（2）：254〜266を参照されたい。一般に、薬理ゲノム
学的状態は2つのタイプに区別されうる。すなわち、薬
物が身体に作用する様式を変化させる単一因子として伝
達される遺伝的状態は「薬物作用の変化」と呼ばれる。
また、身体が薬物に対して作用する様式を変化させる単
一因子として伝達される遺伝的状態は「薬物代謝の変
化」と呼ばれる。これらの薬理ゲノム学的状態は、稀な
欠損症または多型のいずれかとして出現しうる。例え
ば、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（G6P
D）は頻度の高い遺伝性酵素病であり、その主な臨床的
合併症はオキシダント類（抗マラリア薬、スルホンアミ
ド、鎮痛薬、ニトロフラン）の経口摂取後およびソラマ
メの摂食後に起こる溶血である。

【０２７６】一例となる態様において、薬物代謝酵素の
活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方に関する
主な決定要因である。薬物代謝酵素（例えば、N-アセチ
ルトランスフェラーゼ2（NAT2）又はシトクロムP450酵
素CYP2D6およびCYP2C19）の遺伝的多型の発見は、一部
の患者で期待された薬物効果が得られなかったり、また
は標準的で安全な用量の薬物を服用した後に薬物反応の
悪化および重篤な毒性が認められたりする理由の説明と
なった。これらの多型は集団において、高代謝能型（E
M）および低代謝能型（PM）という2つの表現型として発
現する。PMの出現率は集団によって異なる。例えば、CY
P2D6をコードする遺伝子は多型性が高く、PMにはいくつ
かの変異が同定されており、それらはいずれも機能的CY
P2D6の欠如をもたらす。CYP2D6およびCYP2Cl9に関し
て、標準的用量を投与された際に、低代謝能型の人々が
薬物反応の悪化および副作用を経験する頻度は極めて高
い。代謝産物が有効治療成分である場合には、CYP2D6に
よって生じる代謝産物であるモルヒネを介したコデイン
の鎮痛効果に関して示されているように、PMは何ら治療
的反応を示さない。他方の極端な例は、標準的な投与量
に反応しない、いわゆる超迅速代謝能型（ultra-rapid
metabolizer）である。最近、超迅速代謝にはCYP2D6遺
伝子増幅という分子的基盤があることが同定された。

【０２７７】このため、個体における本発明のポリペプ
チドの活性、本発明の核酸の発現、または本発明の遺伝
子の変異含有量を測定し、それによってその個体の治療
的または予防的治療のために適した作用物質を選択する
ことが可能である。さらに、薬理ゲノム学的検討を、薬
物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型同定
を個体の薬物反応に関する表現型の同定に適用すること
も可能である。この知見は、投薬または薬物選択に適用
された場合には、有害反応または治療の失敗を回避し、
それによって本明細書に記載された例示的なスクリーニ
ングアッセイ法の1つによって同定された調節因子など
の、ポリペプチドの活性または発現の調節因子よって対
象を治療する際の治療的または予防的効果を高めうる。

【０２７８】本発明のポリペプチドの発現または活性に
対する作用物質（例えば薬物、化合物）の影響（例えば
異常な細胞増殖および/または分化を調節する能力）の
モニタリングは、基礎的な薬物スクリーニングにおいて
のみならず、臨床試験にも適用されうる。例えば、本明
細書に記載のスクリーニングアッセイ法によって遺伝子
発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を上昇さ
せると判定された作用物質の有効性を、遺伝子発現、タ
ンパク質レベルまたはタンパク質活性の低下を呈する対
象の臨床試験において観測することができる。または、
本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法によって遺
伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を低
下させると判定された作用物質の有効性を、遺伝子発
現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の上昇を呈
する対象の臨床試験において観測することができる。こ
のような臨床試験では、本発明のポリペプチド、および
好ましくは例えば細胞増殖性疾患に関与するとみられる
他のポリペプチドの発現または活性を、特定の細胞の免
疫応答性のマーカーとして用いることができる。

【０２７９】例えば、非制限的ではあるが、本発明のポ
リペプチドの活性または発現を調節する（例えば、本明
細書に記載のスクリーニングアッセイ法で同定された）
作用物質（例えば化合物、薬物または低分子）による治
療によって細胞内で調節される、本発明のものを含む遺
伝子を同定することができる。このため、例えば臨床試
験において、細胞増殖性疾患に対する作用物質の効果を
検討するために、細胞を単離し、RNAを調製して、本発
明の遺伝子および疾患に関与するとみられる他の遺伝子
の発現レベルに関して分析することができる。遺伝子発
現レベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細
書に記載のノーザンブロット分析もしくはRT-PCRによ
り、またはその代わりに本明細書に記載の方法の1つに
よって産生タンパク質の量を測定することにより、また
は本発明の遺伝子もしくはその他の遺伝子の活性レベル
を測定することによって定量化されうる。このようにし
て、遺伝子発現パターンを作用物質に対する細胞の生理
的反応の指標となるマーカーとして役立てることができ
る。したがって、作用物質による個体の治療前および治
療中の種々の時点でこの反応状況を判定することができ
る。

【０２８０】1つの好ましい態様において本発明は、
（i）作用物質を投与する前の対象からの投与前試料の
採取、（ii）投与前試料における本発明のポリペプチド
または核酸のレベルの検出、（iii）対象からの1つまた
は複数の投与後試料の採取、（iv）投与後試料における
本発明のポリペプチドまたは核酸の発現レベルの検出、
（v）投与前試料における本発明のポリペプチドまたは
核酸のレベルと、投与後試料における本発明のポリペプ
チドまたは核酸のレベルとの比較、および（vi）それに
従って対象への作用物質の投与を変更すること、のステ
ップを含む、作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴ
ニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核
酸、低分子、または本明細書に記載のスクリーニングア
ッセイ法によって同定されるその他の薬物候補物質）に
よる対象の治療の有効性を観測するための方法を提供す
る。例えば、ポリペプチドの発現または活性を検出され
たレベルよりも高いレベルに上昇させるため、すなわち
作用物質の有効性を高めるためには、作用物質の投与量
を増やすことが望ましいと思われる。または、ポリペプ
チドの発現または活性を検出されたレベルよりも低いレ
ベルに低下させるため、すなわち作用物質の有効性を抑
えるためには、作用物質の投与量を減らすことが望まし
いと思われる。

【０２８１】本発明の化合物は、哺乳動物の体内の薬剤
作用部位に有効成分を接触させる任意の手段により、さ
まざまな血管新生関連疾患を抑制するために製剤化およ
び投与を行うことが可能である。それらは、個別の治療
的有効成分または治療的有効成分の組み合わせとして、
医薬品とともに用いられうる任意の従来の手段によって
投与されうる。それらは単独投与されることもできる
が、一般には、選択する投与経路および標準的な薬事業
務に基づいて選択される薬学的担体とともに投与され
る。

【０２８２】投与量は血管新生関連疾患の症状の改善を
もたらすのに十分な化合物の治療的有効量であると考え
られ、当然ながら、特定の有効成分の薬力学特性ならび
にその投与様式および投与経路；レシピエントの年齢、
性別、健康状態および体重；症状の性質および程度；併
用療法の種類；治療頻度ならびに望ましい効果などの既
知の要因に応じて異なる。

【０２８３】このような化合物の毒性および治療的有効
性を、培養された細胞または実験動物のいずれかを用い
る標準的な製薬学的手順によってLD50（集団の50％に対
して致死的な用量）およびED50（集団の50％で治療的に
有効な用量）を求めることによって決定することができ
る。毒性効果と治療効果との間の用量の比が治療係数で
あり、それはLD50：ED50の比として表現されうる。大き
な治療係数を示すポリペプチドが好ましい。有害な副作
用を示すポリペプチド増殖因子を用いることもできる
が、このような化合物を罹患組織に向かわせる送達系を
設計するためには、非罹患細胞に対する障害をできるだ
け少なくし、それによって副作用を軽減するように注意
する必要がある。

【０２８４】細胞培養アッセイ法および動物試験によっ
て得られたデータを、ヒトで使用するための用量の範囲
を設定するために用いることができる。このようなポリ
ペプチドの用量は、ほとんどまたは全く毒性を持たず、
ED50を含む循環血中濃度の範囲内にあることが好まし
い。用いられる剤形および用いる投与経路に応じて、こ
の範囲内で用量を変更することができる。本発明の方法
で用いるあらゆるポリペプチドに関して、治療的有効量
を細胞培養アッセイ法によってまず推定することができ
る。以下に記載するインビボ試験で決定されるようなIC
50（すなわち、誘導される最大の回復の半分が達成され
る被験化合物の濃度）を含む血中循環系の血漿中濃度が
達成される動物モデルで用量が設定される。このような
情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するため
に用いることができる。血漿中のレベルは、例えば高速
液体クロマトグラフィーによって測定することができ
る。

【０２８５】抗体についても特定の投与量を用いうる。
典型的には、好ましい投与量は0.1mg/kg〜100mg/kg体重
（一般に10mg/kg〜20mg/kg）であり、抗体を脳内で作用
させようとする場合には50mg/kg〜100mg/kgの投与量が
通常適切である。抗体が部分ヒト抗体または完全ヒト抗
体である場合には、一般に他の抗体よりもヒト体内での
半減期が長いと考えられる。したがって、部分ヒト抗体
および完全ヒト抗体はしばしば、より低い投与量であっ
てよい。抗体をさらに安定化するために付加的な修飾を
用いてもよい。例えば、抗体を安定化し、取り込みおよ
び組織浸透（例えば、脳内への）を増強させるために脂
質化を用いることができる。抗体の脂質化のための方法
はクルイクシャンク（Cruikshank）ら（（1997）J. Acq
uired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrov
irology 14：193）に記載されている。

【０２８６】タンパク質またはポリペプチドの治療的有
効量（すなわち、有効量）は、約0.001〜30mg/kg体重の
範囲、好ましくは約0.01〜25mg/kg体重、より好ましく
は約0.1〜20mg/kg体重、さらにより好ましくは約1〜10m
g/kg、2〜9mg/kg、3〜8mg/kg、4〜7mg/kgまたは5〜6mg/
kg体重の範囲である。

【０２８７】さらに、治療的有効量のタンパク質、ポリ
ペプチドまたは抗体による対象の治療には単回治療が含
まれ、または好ましくは、一連の治療が含まれうる。好
ましい一例において、対象は約0.1〜20mg/kg体重の範囲
の抗体、タンパク質またはポリペプチドによる週1回の
治療を、約1週間〜10週間、好ましくは2週間〜8週間、
より好ましくは約3週間〜7週間、さらにより好ましくは
約4週間、5週間または6週間にわたって受ける。

【０２８８】本発明にはさらに、発現または活性を調節
する作用物質が含まれる。作用物質は例えば小分子であ
ってもよい。例えば、このような小分子には、ペプチ
ド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリ
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチ
ド、ヌクレオチド類似体、分子量が約10,000グラム/モ
ル未満の有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機
化合物および有機金属化合物）、分子量が約5,000グラ
ム/モル未満の有機または無機化合物、分子量が約1,000
グラム/モル未満の有機または無機化合物、分子量が約5
00グラム/モル未満の有機または無機化合物、ならびに
このような化合物の塩、エステルおよび他の薬学的に許
容しうる形態が含まれるが、これらに限定されない。

【０２８９】小分子薬剤の適切な用量は当業者、例えば
医師に知られた数多くの要因に依存することが認識され
ている。小分子の用量は、例えば、治療しようとする対
象または試料の実体、サイズおよび状態に応じて異な
り、適用可能な場合には、組成物を投与しようとする経
路、および本発明の核酸またはポリペプチドに対して及
ぼすことを担当医が望む小分子の効果にもさらに依存す
ると考えられる。投与量の例には、対象または試料の重
量1キログラム当たり数ミリグラムまたは数マイクログ
ラムの量の小分子（例えば、約1マイクログラム/キログ
ラム〜約500ミリグラム/キログラム、約100マイクログ
ラム/キログラム〜約5ミリグラム/キログラムまたは約1
マイクログラム/キログラム〜約50マイクログラム/キロ
グラム）が含まれる。

【０２９０】本発明に従って用いるための薬学的組成物
は、1つまたはそれ以上の生理的に許容される担体また
は賦形剤を用いる従来の様式にて製剤化することができ
る。

【０２９１】このため、化合物および生理的に許容され
る塩および溶媒化合物を、吸入もしくは吹送法（口また
は鼻のいずれかを介する）または経口、口内、非経口的
もしくは直腸投与によって投与するために製剤化するこ
とができる。

【０２９２】経口投与のための医薬品組成物は、例え
ば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプ
ン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメ
チルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結
晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤
（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシ
リカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグ
リコール酸デンプンナトリウム。）または湿潤剤（例え
ばラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬学的に許容され
る賦形剤を用いる従来の方法によって調製される錠剤ま
たはカプセル剤の形態をとりうる。錠剤には、当技術分
野で周知の方法によってコーティングがなされる。経口
投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ剤ま
たは懸濁液の形態をとることができ、または使用前に水
もしくは他の適した溶媒と構成するための乾燥製品とし
て提供することもできる。このような液体製剤は、懸濁
剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体ま
たは硬化食用油）、乳濁剤（例えば、レシチンまたはア
ラビアゴム）、非水溶媒（例えば、アーモンド油、油性
エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）
および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒ
ドロキシベンゼン、またはソルビン酸）などの製薬学的
に許容される添加物を用いる従来の手段によって調製す
ることができる。また、製剤には緩衝塩、着香料、着色
料および甘味料を適宜含めることもできる。

【０２９３】経口投与のための製剤は、活性化合物の制
御された放出が得られるように適切に製剤化される。

【０２９４】口内投与のためには、組成物は、従来の様
式において製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態を
とりうる。

【０２９５】吸入による投与の場合、本発明に従って用
いるための化合物は、例えば、ジクロロジフルロメタ
ン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオ
ロエタン、二酸化炭素または他の適したガスなどの適し
た噴霧剤を用いて、加圧容器またはネブライザーからエ
アロゾル噴霧の形態で送達される。加圧エアロゾルの場
合、投与単位は一定量を送達するための弁を付与するこ
とによって決定されうる。化合物とラクトースまたはデ
ンプンなどの適した粉末基剤の粉末混合物を含む、吸入
器または吹入器で用いるためのゼラチン製などのカプセ
ル剤および薬包を製剤化することもできる。

【０２９６】化合物を、例えばボーラス注射または連続
注入による、注射による非経口投与のために製剤化する
こともできる。注射のための製剤を、例えば防腐剤を添
加したアンプルまたは多回分の用量を含む容器中での単
位投薬式剤形（unit dosageform）として提供すること
ができる。組成物は、油性もしくは水性溶媒における懸
濁液、溶液または乳濁液としての形態をとり、懸濁剤、
安定化剤および/または分散剤などの製剤化用剤を含む
ことができる。または、活性成分は、使用前に例えば発
熱物質を含まない滅菌水などの適切な溶媒によって構成
するための粉末形態をとってもよい。一般に、水、適し
た油、生理食塩水、水性デキストロース（グルコース）
および類似の糖溶液、ならびにプロピレングリコールま
たはポリスチレングリコールなどのグリコール類は非経
口溶液のために適した担体である。非経口投与のための
溶液は、好ましくは、有効成分の水溶性塩、適した安定
化剤、および必要に応じて緩衝剤を含む。重亜硫酸ナト
リウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの
抗酸化剤は、単独でも併用でも適した安定化剤である。
クエン酸およびその塩、ならびにエチレンジアミン四酢
酸（EDTA）ナトリウムも用いられる。さらに、非経口用
溶液は塩化ベンザルコニウム、メチル-またはプロピル-
パラベンおよびクロロブタノールなどの防腐剤も含みう
る。適した薬学的担体は、この分野の標準的な参考書で
ある「レミントン薬学的科学（Remington's Pharmaceut
ical Sciences）」に記載されている。

【０２９７】また、化合物を、例えばカカオ脂または他
のグリセリドなどの従来の坐剤用基剤を含む、坐剤また
は保持浣腸などの直腸用組成物の形に製剤化することも
できる。

【０２９８】これまでに記載した製剤に加えて、化合物
を持効性製剤として製剤化することもできる。このよう
な持続作用性製剤を、移植（例えば皮下または筋肉内）
または筋肉内注射によって投与することができる。した
がって、例えば化合物を適切な重合性もしくは疎水性材
料（例えば許容される油中での乳濁液として）またはイ
オン交換樹脂を用いて、または例えばやや難溶性の（sp
aringly soluble）塩などのやや難溶性の誘導体として
製剤化することもできる。

【０２９９】さらに、作用持続時間を調節するために標
準的な薬学の方法を用いることができる。これらは当技
術分野で周知であって、これには放出制御製剤が含ま
れ、例えば、ポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、
ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは
硫酸プロタミンなどの適切な高分子が含まれうる。高分
子の濃度ならびに組み入れの方法は放出が制御されるよ
うに調整することができる。

【０３００】さらに、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒ
ドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテー
ト共重合体などの重合材料の粒子に作用物質を組み入れ
ることもできる。組み入れることに加えて、これらの物
質をマイクロカプセル内に化合物を捕捉するために用い
ることもできる。

【０３０１】必要に応じて、組成物を、活性成分を含む
1つまたは複数の単位投薬式剤形を含む包装物またはデ
ィスペンサー装置として提供することもできる。この包
装物は例えばブリスター包装などの金属または合成樹脂
製の箔を含みうる。包装物またはディスペンサー装置に
投与のための指示を添付してもよい。

【０３０２】本発明の化合物の投与のための有用な医薬
品剤形の以下の通りに例示しうる：

【０３０３】カプセル剤：カプセル剤は、標準的な2つ
の部分からなるゼラチンカプセルにそれぞれ所要量の粉
末有効成分、175ミリグラムのラクトース、24ミリグラ
ムのタルクおよび6ミリグラムのステアリン酸マグネシ
ウムを充填することによって調製される。

【０３０４】軟ゼラチンカプセル剤：大豆油中にある有
効成分の混合物を調製して、容量型ポンプを用いてゼラ
チンに注入し、所要量の有効成分を含む軟ゼラチンカプ
セルを作製する。続いてカプセル剤を洗浄および乾燥す
る。

【０３０５】錠剤：錠剤は、投与単位が所要量の有効成
分、0.2ミリグラムのコロイド状二酸化珪素、5ミリグラ
ムのステアリン酸マグネシウム、275ミリグラムの微結
晶セルロース、11ミリグラムのコーンスターチおよび9
8.8ミリグラムのラクトースとなるように通常の手順に
よって調製される。嗜好性を高めるため、または吸収を
遅らせるために適切なコーティングを施してもよい。

【０３０６】注射剤：注射による投与のために適した非
経口用組成物は重量比率1.5％の有効成分を、容量比率1
0％のプロピレングリコールおよび水中で攪拌すること
によって調製される。溶液は塩化ナトリウムで等張にし
た上で滅菌する。

【０３０７】懸濁剤：水性懸濁剤は、各5ミリメーター
が100ミリグラムの微粉有効成分、200ミリグラムのカル
ボキシメチルセルロースナトリウム、5ミリグラムの安
息香酸ナトリウム、1.0グラムの米国薬局方（U.S.P.）
ソルビトール溶液および0.025ミリメートルのバニリン
を含むように経口投与用に調製される。

【０３０８】遺伝子療法投与用：適宜、遺伝子療法用の
ベクターは、それぞれの投与経路に応じた通常の形式
で、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐
剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾル剤などの固体、半
固体、液体または気体の形態に製剤化することができ
る。組成物が標的器官に達するまで放出および吸収され
るのを防ぐため、または組成物の持効性が確実に得られ
るように、当技術分野で知られた手段を用いうる。本発
明の組成物が無効にならない薬学的に許容される形態を
用いる必要がある。医薬品剤形において組成物は単独で
用いてもよく、他の薬理活性化合物との適切な会合物ま
たは配合物として用いることもできる。

【０３０９】したがって、本発明の薬学的組成物は特定
の効果を得るために、さまざまな経路を介して動物体内
のさまざまな部位へと送達させうる（例えば、Rosenfel
dら（1991）、前記；Rosenfeldら、Clin. Res.、39
（2）、311A（1991a）；Jaffeら、前記；Berkner、前記
を参照）。当業者は、投与には複数の経路を用いうる
が、特定の経路によって他の経路よりも迅速かつ有効な
効果が得られることを理解すると考えられる。製剤の体
腔への適用もしくは点滴注入、エアロゾルの吸入もしく
は吹入を含む投与により、または筋肉内、静脈内、腹腔
内、皮下、皮内さらには局所投与を含む非経口的導入に
より、局所的または全身的な送達を実現することができ
る。

【０３１０】本発明の組成物は、各投与単位、例えば茶
匙量、錠剤、溶液または坐剤が規定量の組成物を単独ま
たは他の有効成分との適切な配合物として含む単位投薬
式剤形として提供することができる。本明細書で用いる
「単位投薬式剤形」という用語は、各単位が、薬学的に
許容される希釈剤、担体または媒体と適宜組み合わせ
て、望ましい効果を生じるように計算された規定量の本
発明の組成物を単独または他の有効成分とともに含む、
ヒトまたは動物の対象に対する単位投薬量として適した
物理的に離散的な単位のことを指す。本発明の単位投薬
式剤形に関する仕様は、達成しようとする特定の効果、
および特定の宿主における薬学的組成物に関連した特定
の薬力学に依存する。

【０３１１】したがって、本発明は、宿主に治療的遺伝
子を導入する方法であって、前記のいずれかの投与経
路、または当業者に知られ、特定の用途に適する代替的
な経路を用いて、好ましくは組成物の一部として、本発
明のベクターを投与する段階を含む方法も提供する。組
成物の「有効量」とは、当業者に知られたいくつかのエ
ンドポイントを用いて観測しうる、宿主において望まし
い効果を生じるようなものである。本発明による宿主細
胞へのベクターの効果的な遺伝子導入は、治療効果（例
えば、治療しようとする特定の疾患と関連したいくつか
の症状の改善）に関して、またはさらに、宿主における
導入遺伝子の検出もしくは遺伝子の発現によって（例え
ば、宿主細胞内の核酸を検出するためにポリメラーゼ連
鎖反応をシークエンシング、ノーザンもしくはサザンハ
イブリダイゼーションもしくは転写アッセイ法とともに
用いて、またはイムノブロット分析、抗体を介した検
出、mRNAもしくはタンパク質半減期試験、もしくは導入
核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチ
ド、もしくはこのような導入によるレベルもしくは機能
の障害を検出するための特殊アッセイ法を用いて）観測
することができる。

【０３１２】本明細書に記載したこれらの方法は、決し
て包括的なものではなく、特定の用途に適したこれ以外
の方法が当業者には明らかであると考えられる。さら
に、組成物の有効量は、望ましい効果が発揮されること
が知られた化合物との類推によってさらに見積もること
ができる。

【０３１３】さらに、実際の用量およびスケジュール
は、組成物を他の薬学的組成物と併用投与するか否かに
応じて、または薬物動態、薬物の分布および代謝の個体
差に応じて異なると考えられる。同様に、量はインビト
ロ適用の場合には用いる特定の細胞系に応じて異なると
考えられる（例えば、細胞表面に存在するアデノウイル
ス受容体の数、または遺伝子導入のために用いた特定の
ベクターのその細胞系での増幅能に基づく）。さらに、
添加するベクターの細胞1個当たりの量は、ベクター中
に挿入された治療的遺伝子の長さおよび安定性、ならび
に配列の性質によっても異なると考えられ、これは経験
的に判定する必要のあるパラメーターであり、本発明の
方法に固有ではない要因によって変化する可能性がある
（例えば、合成に伴う費用）。当業者は特定の状況の緊
急性に即して必要な調整を容易に行うことができる。

【０３１４】以下の実施例は例として提供するものであ
り、いかなる意味でも発明の範囲を制限するためのもの
ではない。

【０３１５】

【実施例】エンドスタチン遺伝子の同定およびクローニ
ング 本項に提示する実施例では、例えば癌などの血管新生関
連疾患にかかわる、本明細書でエンドスタチンと称する
新規イヌ遺伝子を同定する試験について述べる。

【０３１６】材料および方法 1．イヌ肝臓組織からのRNAの単離 50mgのイヌ肝臓組織
を破砕し、ローター-ステーターホモジナイザー（Konte
s、Vineland、NJ）によってホモジネート化した後に、R
neasy Miniキットを製造者（Qiagen Inc.、Santa Clari
ta、CA）の指示に従って用いて全RNAを精製した。30μg
のRNAを単離し、0.5μg/μlの濃度でH2O中に懸濁化し
た。

【０３１７】2．エンドスタチンを包含するイヌコラー
ゲンXVIIIの領域のRT-PCR増幅およびクローニング エ
ンドスタチンはコラーゲンXVIIIのC末端断片である（マ
ウスコラーゲンXVIII中のアミノ酸H1132〜K1315）。ヒ
ト（アクセッション番号L22548）、マウス（アクセッシ
ョン番号U03714）およびニワトリ（アクセッション番号
AF083440）からの共通配列に基づき、イヌコラーゲンXV
III cDNAの領域を増幅するための1対のプライマーを設
計した。マウス部分コラーゲンXVIII cDNAのヌクレオチ
ド#766〜792に対応する5'プライマー：CCCTGGCGGGCAGAT
GACATCCTGGCC（配列番号：5）、およびマウス部分コラ
ーゲンXVIII cDNAのヌクレオチド#1569〜1603に対応す
る3'プライマー：CTCTTTGGCTTCCTTTTATTTCTTGAGGATTACA
T（配列番号：6）を増幅反応のために用いた。RT-PCR反
応は、ベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannhei
m GmbH）（Germany）のチタンワンチューブ（Titan One
Tube）RT-PCRキットを用いて行った。0.5μgのイヌ肝
臓RNAを68℃で2分間変性させた。逆転写反応は50℃で30
分間行い、PCRプログラムは94℃に3分間保った後、94℃
で30秒間、55℃で30秒間、68℃で1.5分間、および68℃
での伸長を5分間というサイクルを35サイクル行った。P
CR産物は電気泳動によって分析した。

【０３１８】PCR産物を、真核生物TAクローニングベク
ターpCR 3.1（Invitrogen、Carlsbad、CA）中に製造者
の指示に従ってクローニングして、pCR3.1-pro-ca-endo
statin（PCR3.1E:UC25432）と命名し、アメリカンタイ
プカルチャーコレクション（American Type Culture Co
llection）（ATCC）、Manassas、VA 20110-2209、USAに
特許寄託番号（Patent Deposit Designation）PTA 2096
として寄託した。予想されるサイズ（0.8kb）のインサ
ートを含む3つの独立したクローンのシークエンシング
を行った（Advanced Genetic Analysis Center、St. Pa
ul、MN）。配列のアセンブルを行い、DNAStar（DNAStar
Inc. Madison、WI）を用いて分析した。

【０３１９】3．HA標識イヌエンドスタチンのサブクロ
ーニング．エンドスタチンに対応するイヌコラーゲンXV
IIIの正確な断片を、5'プライマー-CTAGAGATCTCACACCCA
CCAGGACTTCCAGC（配列番号：11）、3'-プライマー- （配列番号：12）というプライマーを用いるイヌ肝臓RN
AのRT-PCR増幅により、pDisplayベクター中にサブクロ
ーニングした。クローニングを容易にするために、下線
によって示すように2つの制限酵素部位、BglII（5'プラ
イマー）およびSalI（3'プライマー）をプライマー配列
に組み入れた。インサートを、ベクター中に存在するシ
グナルペプチドおよびHAエピトープ配列とインフレーム
になるように融合させた。翻訳を終結させるために3'プ
ライマーにエンドスタチン停止コドンTAG（太字で示し
ている）を含めたため、インサートの下流にある、ベク
ターによってコードされるPDGFR膜貫通ドメインは、特
許寄託番号PTA-2097としてATCCに寄託された最終的なプ
ラスミド構築物pDisplay-HA-ca-endostatin（Pdisplay
E:UC25433）には翻訳されないと考えられる。

【０３２０】4．イヌエンドスタチン（HA標識を含まな
いもの）のサブクローニング イヌエンドスタチンを、
5'プライマー-GATTAAGCTTCACACCCACCAGGACTTCCAGCT（配
列番号：7）、3'-プライマー- （配列番号：8）というプライマーを用いるイヌ肝臓RNA
のRT-PCR増幅により、pSecTag2Bベクター中にサブクロ
ーニングした。クローニングを容易にするために、下線
によって示すように2つの制限酵素部位、HindIII（5'プ
ライマー）およびEcoRI（3'プライマー）をプライマー
配列に組み入れた。インサートを、ベクター中に存在す
るシグナルペプチドとインフレームになるように融合さ
せた。翻訳を終結させるために3'プライマーにエンドス
タチン停止コドンTAG（太字で示している）を含めた。
最終的なプラスミド構築物をpSecTag2-ca-endosutatin
（pSecTag2E:UC 25434）と命名し、特許寄託番号PTA-20
98としてATCCに寄託した。

【０３２１】5．マウスエンドスタチンのクローニング
クローニングしたイヌエンドスタチンの抗血管新生活
性をマウスでの対応物のものと比較するために、マウス
エンドスタチンをコードするcDNAをマウス肝臓RNAからR
T-PCR増幅し、pDisplayベクター中にクローニングし
た。マウスエンドスタチンを増幅するために用いたプラ
イマーは：5'-CTAGAGATCTCATACTCATCAGGACTTTCAGC（配
列番号：9）、 3'- （配列番号：10）である。隣接する制限酵素部位BglII
（5'プライマー）およびSalI（3'プライマー）には下線
を施し、停止コドンは太字で示している。この結果得ら
れたプラスミドを、pDisplay-HA-mu-エンドスタチン
（アクセッション番号U03714）と命名した。

【０３２２】結果 エンドスタチンのコード領域を含むイヌコラーゲンXVII
Iの断片をコードするcDNAを、いくつかの種からの共通
配列から設計したプライマーを用いるRT-PCRによってイ
ヌ肝臓mRNAから増幅した。プロ-エンドスタチンのヌク
レオチド配列は図2（配列番号：1）に示されており、そ
の推定アミノ酸配列は図3（配列番号：2）に示されてい
る。相同性に基づいてエンドスタチンに対応する領域を
図3に太字で示し、イヌエンドスタチン（184アミノ酸）
の正確なヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配
列をそれぞれ図4（配列番号：3）および図5（配列番
号：4）に示す。図6はエンドスタチンのすべての既知の
アミノ酸配列の整列化を示しており、イヌエンドスタチ
ンとヒト、マウスおよびニワトリのものとの相同性の程
度はそれぞれ84％、83％および76％である。

【０３２３】エンドスタチン遺伝子の発現 この項で提示する実施例では、新規イヌエンドスタチン
遺伝子の発現およびアッセイのための方法を特定する試
験について述べる。

【０３２４】材料および方法 1．エンドスタチンのトランスフェクション 6穴プレー
トで増殖させたヒト293細胞に、CalPhos哺乳動物トラン
スフェクションキット（CLONTECH Laboratories, In
c.、Palo Alto、CA）を用いて、イヌまたはマウスエン
ドスタチンをコードする2.5μgのプラスミドによるトラ
ンスフェクションを行った。

【０３２５】2．免疫蛍光によるエンドスタチンの検出
トランスフェクションから2日後に、細胞を4％パラホ
ルムアルデヒドにて固定し、0.05％Triton X100で透過
化処理を行い、1％ヤギ血清でブロッキングを行った
（化学物質はすべてSigma、St. Louis、Missouriによ
る）。HAエピトープに対するモノクローナル抗体である
HA.11（BabCO、Richmond、CA）を1：500に希釈して細胞
の染色に用い、TR1TC結合抗マウスIgG（Sigma）を1：1,
000希釈して検出に用いた。免疫蛍光細胞をニコン（Nik
on）TE 300顕微鏡下で観察した。

【０３２６】3．イムノブロット分析によるエンドスタ
チンの検出 トランスフェクションから2日後に、トリ
ス-グリシンSDS試料緩衝液（NOVEX、San Diego、CA）中
での可溶化によって細胞を回収した。3000rpmでの15分
間の遠心によって培養上清を回収した。タンパク質を4
〜20％SDS-PAGEによって分離し、PVDF膜（NOVEX、SanDi
ego、CA）に転写した。イムノブロット分析に関して
は、HAエピトープに対するHA抗体を1：500に希釈し、ブ
ロットとともに1.5時間にわたってインキュベートし
た。アルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG（1：10,0
0、Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）とともに
30分間インキュベートした後に、ホスファターゼ基質BC
IP/NBT（KPL、Gaithersburg、Maryland）を用いて結合
型抗体を検出した。

【０３２７】4．内皮細胞増殖アッセイ法．クローニン
グしたイヌエンドスタチンの増殖阻害作用を、ウシ肺動
脈内皮細胞（C-PAE、ATCC、Manassas、VA）を用いて検
討した。細胞（細胞10^４個/ウェル）を、2％ウシ胎児血
清（Nova-Tech Inc.、GrandIsland、NE）を添加したOpt
iMEM培地（GIBCO BRL、Rockville、MD）中にて、コラー
ゲンIがコーティングされた24穴プレート（Collaborati
ve Biomedical Products、Bedford、MA）に播種した。

【０３２８】5．24時間インキュベートした後、培地
を、1ng/ml bFGF（Collaborative Biomedical産物、Bed
ford、MA）を添加したトランスフェクト293細胞からの
馴化培地と交換した。48時間後に細胞をトリプシン処理
し、トリパンブルー染色および血球計を用いて生存細胞
を算定した。結果はPrizm 2.01（Graphpad Software In
c.、San Diego、CA）を用いて分析した。

【０３２９】結果 イヌエンドスタチンの発現 イヌエンドスタチンをコー
ドするcDNAを哺乳動物発現ベクターpDisplay中にサブク
ローニングした。エンドスタチンは分泌タンパク質の断
片であり、通常、血液中を循環するため、タンパク質を
分泌経路に向かわせるマウスIgκ鎖リーダー配列のN末
端にインフレームとなるように融合させた後、発現タン
パク質の検出を可能とするヘマグルチニンAエピトープ
タグ（HA）と融合させた。ヒト293細胞に対して、シグ
ナル配列ならびにイヌおよびマウス由来のHA標識エンド
スタチンをコードするプラスミドによるトランスフェク
ションを行い、トランスフェクションから48時間後に細
胞を分析のために回収した。図7は免疫蛍光アッセイ法
の結果を示す。エンドスタチンの染色パターンは、核周
辺小胞体およびトランスゴルジの特徴を有し、これはこ
のタンパク質が分泌経路に向けられるという見解に一致
するものであった。

【０３３０】1．エンドスタチンの発現をイムノブロッ
ト分析によってさらに検討した。トランスフェクトした
エンドスタチンの発現は細胞可溶化物（図8、レーン2お
よび4）および培養上清（図8、レーン6および8）のいず
れからも検出された。分子量が20〜25kDaの範囲にあ
る、いくつかの形態の細胞内エンドスタチンが存在する
（図8、レーン2および4）。分泌型では1つの離散的バン
ドのみが認められたことから、これらはタンパク質成熟
の中間生成物である可能性が高い。

【０３３１】2．内皮細胞の増殖阻害 エンドスタチン
の1つのユニークな特徴は、それが内皮細胞の増殖を特
異的に阻害する能力を持つということである（0'Reilly
ら、1997、Cell 88（2）：277〜85；O'Reillyら、199
4、Cell 79（2）：315〜28）。トランスフェクト293細
胞由来の馴化培地から得られたエンドスタチンタンパク
質の存在下または非存在下で、ウシ肺動脈内皮細胞（CP
AE細胞）（Dhanabalら、1999）を塩基性線維芽細胞増殖
因子（bFGF）によって刺激した。増殖速度は、bFGFおよ
び緑色蛍光タンパク質（GEP）トランスフェクト細胞か
らの馴化培地で処理した対照培地に対して標準化した。
4つの独立した実験の結果を図9にまとめた。bFGF活性化
を行わない場合にはCPAE細胞の増殖速度は低かった（対
照の38％）。HA標識イヌエンドスタチンの添加によって
bFGFの刺激作用は阻害され、CPAE細胞の増殖速度はそれ
ぞれ対照細胞の53％となった。HA標識イヌエンドスタチ
ンに認められた阻害活性はマウスタンパク質と同等であ
った（いずれも対照の57％のレベル）。対照群と各処理
群との間の増殖速度の差はすべて統計学的に有意であっ
た（P＜0.05）。これに対して、エンドスタチンによる
処理によって上皮293細胞の増殖は阻害されず、このこ
とからエンドスタチンの阻害作用は内皮細胞に特異的で
あることが示唆された。非標識イヌエンドスタチンでも
同様の結果が得られた（図10）。イヌエンドスタチンの
添加により、bFGFの刺激作用は特異的に阻害され、CPAE
細胞の増殖速度は対照の59％となった。対照群と各処理
群との間の増殖速度の差はすべて統計学的に有意であっ
た（P＜0.005、n＝3）。

【０３３２】考察 ここではイヌ血管新生阻害因子エンドスタチンのクロー
ニングを報告している。これはヒトおよびマウスでの対
応物と約80％の相同性を有する。クローニングしたタン
パク質の分泌を促すために、マウスIgκ鎖由来のシグナ
ル配列をエンドスタチンのN末端と融合させた。免疫蛍
光試験およびイムノブロットアッセイ法により、本タン
パク質が分泌経路に局在し、馴化培地に分泌されること
が確認された。イヌエンドスタチンもマウスでの対応物
と同等なレベルで内皮細胞の増殖を特異的に阻害するこ
とが示された。

【０３３３】マウスエンドスタチンは多岐にわたる原発
性および転移性腫瘍の増殖を抑制することが示されてい
る。さらに、エンドスタチンによる治療は、薬剤耐性お
よび副作用の誘導を伴わずに多数回繰り返すことができ
る。これらの血管新生阻害因子は新規標的（内皮細胞）
を指向するため、さらに優れた治療効果を得るために、
それらを外科手術、化学療法、放射線療法、および免疫
療法などの他の癌療法と好都合に併用することもでき
る。これらの特性から、エンドスタチンは安全で有効な
広域療法が強く求められているイヌの癌を治療するため
の極めて魅力のある候補となっている。しかし、エンド
スタチンを癌療法として、エンドスタチンを首尾良く適
用するには、長期的な腫瘍抑制および休止状態を実現す
るために、おそらく反復的で連続的な治療を要すると考
えられる（Boehmら、1997、Nature390（6658）：404〜4
07）。イヌエンドスタチンのクローニングおよび同定に
より、種特異的な血管新生阻害因子を用いたイヌ腫瘍の
治療が可能となり、これにより反復投与下で免疫応答が
誘発されるリスクが最小限に抑えられる。さらに、自然
発生性のイヌ腫瘍はヒトでの相関物と組織病理的および
生物的挙動の点で極めて類似しており（MacEwen、199
0、Cancer Metastasis Rev 9（2）：125〜36）、このた
め、イヌ腫瘍から得られた実験結果はヒト癌の生物学お
よび治療に対しても有意義な情報をもたらすと考えられ
る。

【０３３４】本発明は、本明細書に記載された特定の態
様による範囲に制限されるものではなく、それらは発明
の個々の局面の単なる例示に過ぎず、機能的に同等な方
法および構成要素も本発明の範囲内に含まれる。実際に
は、以上の説明および添付の図面から、本明細書に記載
されたもの以外にも本発明のさまざまな修正が当業者に
は明らかであると考えられる。このような修正も添付の
特許請求の範囲に含まれるものとする。

【０３３５】本明細書において言及したすべての刊行物
および特許出願は、それぞれの独立した刊行物または特
許出願が参照として組み入れられるように特定的および
個別的に示されている場合と同程度に参照として本明細
書に組み入れられる。

【０３３６】

【発明の効果】本発明により、血管新生にかかわる疾患
と関連のある核酸配列に関する組成物および方法が提供
された。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> PFIZER PRODUCTS INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING AND TREATING DISORDERS INVOLVING ANGIOGENESIS <130> PC10790A <150> US/60/227,924 <151> 2000-08-25 <160>12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 829 <212> DNA <213> CANINE PRO ENDOSTATIN NUCLEOTIDE SEQUENCE <400> 1 ccctggcggg cagatgacat cctggccggc cccccgcgcc tgctggaccc ccagccctac 60 cccggggccc cgcaccacgg ctcctacgtg cacttccagc cggctcgccc cactggtggg 120 cccgtccaca cccacaccca cacccaccag gacttccagc tggtgctgca cctggtggcc 180 ctgaacagcc cgcagccggg cggcatgcga ggcatccggg gagcggactt ccagtgcttc 240 cagcaggcgc gcgccgcggg gctggccggc accttccggg ccttcctgtc gtcgcggctg 300 caggacctct acagcatcgt gcgccgcgcc gaccgcaccg gggtgcccgt cgtcaacctc 360 agggacgagg tgctcttccc cagctgggag gccttattct cgggctccga gggccagctg 420 aagcccgggg cccgcatctt ctctttcgac ggcagagatg tcctgcagca ccccgcctgg 480 ccccggaaga gcgtgtggca cggctccgac cccagcgggc gccgcctgac cgacagctac 540 tgcgagacgt ggcggacgga ggccccggcg gccaccgggc aggcgtcgtc gctgctggcg 600 ggcaggctgc tggagcagga ggccgcgagc tgccgccacg ccttcgtggt gctctgcatc 660 gagaacagcg tcatgacctc cttctccaag tagggccgcg cggcccacgg acaggcgggg 720 gagggggcgc ccgcaggagc atccgccgcc ccgggggggc ctggccggga cgcttgcctg 780 caccgtcacg tttaatgtaa tcctcaagaa ataaaaggaa gccaaagag 829 <210> 2 <211> 230 <212> PRT <213> CANINE PRO ENDOSTATIN AMINO ACID SEQUENCE <400> 2 Pro Trp Arg Ala Asp Asp Ile Leu Ala Gly Pro Pro Arg Leu Leu Asp 1 5 10 15 Pro Gln Pro Tyr Pro Gly Ala Pro His His Gly Ser Tyr Val His Phe 20 25 30 Gln Pro Ala Arg Pro Thr Gly Gly Pro Val His Thr His Thr His Thr 35 40 45 His Gln Asp Phe Gln Leu Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro 50 55 60 Gln Pro Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe 65 70 75 80 Gln Gln Ala Arg Ala Ala Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu 85 90 95 Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg 100 105 110 Thr Gly Val Pro Val Val Asn Leu Arg Asp Glu Val Leu Phe Pro Ser 115 120 125 Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Gln Leu Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Gln His Pro Ala Trp 145 150 155 160 Pro Arg Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg Arg Leu 165 170 175 Thr Asp Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ala Ala Thr 180 185 190 Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Ala Gly Arg Leu Leu Glu Gln Glu Ala 195 200 205 Ala Ser Cys Arg His Ala Phe Val Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Val 210 215 220 Met Thr Ser Phe Ser Lys 225 230 <210> 3 <211> 555 <212> DNA <213> CANINE ENDOSTATIN NUCLEOTIDE SEQUENCE <400> 3 cacacccacc aggacttcca gctggtgctg cacctggtgg ccctgaacag cccgcagccg 60 ggcggcatgc gaggcatccg gggagcggac ttccagtgct tccagcaggc gcgcgccgcg 120 gggctggccg gcaccttccg ggccttcctg tcgtcgcggc tgcaggacct ctacagcatc 180 gtgcgccgcg ccgaccgcac cggggtgccc gtcgtcaacc tcagggacga ggtgctcttc 240 cccagctggg aggccttatt ctcgggctcc gagggccagc tgaagcccgg ggcccgcatc 300 ttctctttcg acggcagaga tgtcctgcag caccccgcct ggccccggaa gagcgtgtgg 360 cacggctccg accccagcgg gcgccgcctg accgacagct actgcgagac gtggcggacg 420 gaggccccgg cggccaccgg gcaggcgtcg tcgctgctgg cgggcaggct gctggagcag 480 gaggccgcga gctgccgcca cgccttcgtg gtgctctgca tcgagaacag cgtcatgacc 540 tccttctcca agtag 555 <210> 4 <211> 184 <212> PRT <213> CANINE ENDOSTATIN AMINO ACID SEQUENCE <400> 4 His Thr His Gln Asp Phe Gln Leu Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 1 5 10 15 Ser Pro Gln Pro Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln 20 25 30 Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Ala Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala 35 40 45 Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala 50 55 60 Asp Arg Thr Gly Val Pro Val Val Asn Leu Arg Asp Glu Val Leu Phe 65 70 75 80 Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Gln Leu Lys Pro 85 90 95 Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Gln His Pro 100 105 110 Ala Trp Pro Arg Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg 115 120 125 Arg Leu Thr Asp Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ala 130 135 140 Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Ala Gly Arg Leu Leu Glu Gln 145 150 155 160 Glu Ala Ala Ser Cys Arg His Ala Phe Val Val Leu Cys Ile Glu Asn 165 170 175 Ser Val Met Thr Ser Phe Ser Lys 180 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> murine <220> <223> murine partial collagen XVIII cDNA <400>5 ccctggcggg cagatgacat cctggcc 27 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> murine <220> <223> murine partial collagen XVIII cDNA <400>6 ctctttggct tccttttatt tcttgaggat tacat 35 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223>5' primer for subcloning of canine endostatin <400>7 gattaagctt cacacccacc aggacttcca gct 33 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223>3' primer for subcloning of canine endostatin <400>8 ctgagaattc ctacttggag aaggaggtca tgac 34 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223>5' primer for cloning of murine endostatin <400>9 ctagagatct catactcatc aggactttca gc 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223>3' primer for cloning of murine endostatin <400>10 gctagtcgac ctatttggag aaagaggtca tg 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223>5' primer for subcloning of HA-tagged canine endostatin <400>11 ctagagatct cacacccacc aggacttcca gc 32 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223>3' primer for subcloning of HA-tagged canine endostatin <400>12 cgtagtcgac ctacttggag aaggaggtca tgac 34

【図面の簡単な説明】

【図１】 イヌ肝臓RNAのRT-PCR分析を示す図である。
図1はイヌ肝臓RNAの増幅反応の結果を示している。エン
ドスタチン（pro-endo）を含むイヌコラーゲンXVIIIの
領域が特異的に増幅された。推定されたサイズのPCR産
物の位置を矢印で示している。

【図２】 イヌプロエンドスタチンのヌクレオチド配列
（配列番号：1）を示す図である。

【図３】 図2の配列から翻訳されたイヌプロエンドス
タチンのアミノ酸配列（配列番号：2）を示す図であ
る。エンドスタチンに対応する領域を太字で示している
（アミノ酸残基47〜230位）。停止コドンは*印で示して
いる。

【図４】 イヌエンドスタチンのヌクレオチド配列（配
列番号：3）。

【図５】 図4の配列から翻訳されたイヌエンドスタチ
ンのアミノ酸配列（配列番号：4）を示す図である。停
止コドンは*印で示している。

【図６】 イヌ、ニワトリ、ヒト、およびマウス由来の
エンドスタチンのアミノ酸の整列化を示す図である。用
いたプログラムはレーザージーンメガライン（Lasergen
e MegAlign）であり、整列化はクラスタル（Clustal）
法（DNA StarInc.、Madision、WI）によって行った。

【図７】 イヌおよびマウスのエンドスタチンの免疫蛍
光分析を示す図である。293細胞にHA標識したイヌエン
ドスタチン（ca-endo）およびマウスエンドスタチン（m
u-endo）によるトランスフェクションを行った。細胞は
HAエピトープに対する抗体およびTRITC結合二次抗体で
染色した。

【図８】 HA標識したイヌエンドスタチン（ca-endo）
およびマウスエンドスタチン（mu-endo）によるトラン
スフェクションを受けた293細胞のイムノブロット分析
を示す図である。細胞可溶化物に由来する細胞内タンパ
ク質および培養上清（sup）に由来する分泌タンパク質
をSDS-PAGEにかけ、HA抗体およびアルカリホスファター
ゼ結合二次抗体を用いるイムノブロットによって分析し
た。

【図９】 内皮細胞増殖アッセイ法を示す図である。こ
の図は、HA標識したイヌエンドスタチン（HA-ca-endo）
およびマウスエンドスタチン（HA-mu-endo）による内皮
細胞増殖の阻害の概要を示している。293細胞に血管新
生阻害因子または対照としての緑色蛍光タンパク質（GF
P）によるトランスフェクションを行った。トランスフ
ェクションの48時間後に上清を回収し、bFGFで刺激した
CPAEウシ内皮細胞または293細胞とともに72時間インキ
ュベートした。細胞の総数を算定してプロットした。4
つの独立した実験を行い、各実験は二重反復の形で行っ
た。

【図１０】 内皮細胞増殖アッセイ法を示す図である。
この図は、非標識イヌエンドスタチン（ca-endo）によ
る内皮細胞増殖の阻害の概要を示している。。293細胞
に血管新生阻害因子または対照としての緑色蛍光タンパ
ク質（GFP）によるトランスフェクションを行った。ト
ランスフェクションの48時間後に上清を回収し、bFGFで
刺激したCPAEウシ内皮細胞または293細胞とともに72時
間インキュベートした。細胞の総数を算定してプロット
した。3つの独立した実験を行い、各実験は二重反復の
形で行った。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/00 9/00 9/00 9/10 １０１ 9/10 １０１ 15/00 15/00 17/00 17/00 17/02 17/02 17/06 17/06 19/02 19/02 19/08 19/08 25/00 25/00 27/02 27/02 27/06 27/06 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/00 31/00 35/00 35/00 35/02 35/02 35/04 35/04 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (72)発明者 シァオ トン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 イ ースト ブランズウィック ハーシー ロ ード ２

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 a）配列番号：2に示されたポリペプチ
   ド、または b）配列番号：4に示されたポリペプチド を含むエンドスタチンをコードするヌクレオチド配列を
   含む、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 a）配列番号：1に示された核酸、または b）配列番号：3に示された核酸 を含む、単離核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項1または2に記載の核酸分子の相補
   物を含む、単離核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項1または2に記載の核酸分子の相補
   物と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
   る、単離核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項1または2に記載の核酸分子と中程
   度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
   単離核酸分子。
6. 【請求項６】 エンドスタチンが、ニワトリ、ヒト、ま
   たはマウスのエンドスタチンでないという条件で、単離
   核酸分子がエンドスタチンをコードする、請求項4記載
   の単離核酸分子。
7. 【請求項７】 エンドスタチンが、ニワトリ、ヒト、ま
   たはマウスのエンドスタチンでないという条件で、単離
   核酸分子がエンドスタチンをコードする、請求項5記載
   の単離核酸分子。
8. 【請求項８】 請求項1または2に記載の核酸を含むベク
   ター。
9. 【請求項９】 核酸によってコードされるポリペプチド
   の発現を制御する調節性核酸と機能的に関連した請求項
   1または2に記載の核酸を含む発現ベクター。
10. 【請求項10】 請求項1または2に記載の核酸を含むよう
    に遺伝子操作を受けた宿主細胞。
11. 【請求項11】 核酸によってコードされるポリペプチド
    の発現を制御する調節性核酸と機能的に関連した請求項
    1または2に記載の核酸を発現するように遺伝子操作を受
    けた宿主細胞。
12. 【請求項12】 請求項1または2に記載の核酸を含む導入
    遺伝子を含むように遺伝子操作を受けたトランスジェニ
    ック非ヒト動物。
13. 【請求項13】 導入遺伝子が発現される、請求項12記載
    のトランスジェニック非ヒト動物。
14. 【請求項14】 a）配列番号：2、または b）配列番号：4 のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
15. 【請求項15】 請求項14記載の単離ポリペプチドと結合
    する抗体。
16. 【請求項16】 請求項4記載の単離核酸分子によってコ
    ードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
17. 【請求項17】 請求項5記載の単離核酸分子によってコ
    ードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
18. 【請求項18】 融合ペプチド、および a）配列番号：2、または b）配列番号：4 のアミノ酸配列を含む、単離融合ポリペプチド。
19. 【請求項19】 融合ペプチドおよび請求項4記載の単離
    核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む、単
    離融合ポリペプチド。
20. 【請求項20】 融合ペプチドおよび請求項5記載の単離
    核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む、単
    離融合ポリペプチド。
21. 【請求項21】 対象におけるエンドスタチン配列の機
    能、活性および／または発現を調節する化合物を対象に
    投与する段階を含む、対象における血管新生関連疾患を
    治療するための方法。
22. 【請求項22】 化合物が、エンドスタチン配列の機能、
    活性、および／または発現を増強または上昇させる、請
    求項21記載の方法。
23. 【請求項23】 化合物が、有機低分子、抗体、リボザイ
    ム、またはアンチセンス分子からなる群より選択され
    る、請求項21または22に記載の方法。
24. 【請求項24】 血管新生関連疾患が、癌；固形腫瘍、白
    血病などの血液由来の腫瘍、および腫瘍転移を含む、血
    管新生に依存的な癌；血管腫、聴神経腫、神経線維腫、
    トラコーマおよび化膿性肉芽腫を含む良性腫瘍；慢性関
    節リウマチ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄
    斑変性症、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶
    体後線維増殖、ルベオーシスを含む、眼の血管原性疾
    患；オスラー・ウェバー症候群；心筋血管新生；プラー
    ク血管新生（plaque neovascularization）；末梢血管
    拡張症；血友病性関節症；血管線維腫；創傷肉芽化；冠
    動脈側副路（corornary collateral）；脳側副路（cere
    bral collateral）；動静脈奇形；虚血肢（ischemic li
    mb）血管新生；糖尿病性血管新生；黄斑変性症；骨折；
    脈管形成；血球新生；排卵；月経；ならびに胎盤形成か
    らなる群より選択される、請求項21または22に記載の方
    法。
25. 【請求項25】 エンドスタチン配列が、 a）配列番号：2、または b）配列番号：4 を含むアミノ酸配列をコードする、請求項21記載の方
    法。
26. 【請求項26】 対象がイヌである、請求項21記載の方
    法。
27. 【請求項27】 エンドスタチン配列の発現を調節する化
    合物を同定するための方法であって、 a）被験化合物と、エンドスタチン配列を発現する細胞
    とを接触させる段階、 b）細胞におけるエンドスタチン配列の発現レベルを測
    定する段階、 c）被験化合物の存在下での細胞におけるエンドスタチ
    ン配列の発現レベルと、被験化合物の非存在下での細胞
    におけるエンドスタチン配列の発現レベルとを比較する
    段階 を含み、被験化合物の存在下での細胞におけるエンドス
    タチン配列の発現レベルが、被験化合物の非存在下での
    細胞におけるエンドスタチン配列の発現レベルと異なる
    場合に、エンドスタチン配列の発現を調節する化合物が
    同定される方法。
28. 【請求項28】 エンドスタチン配列が細胞内で内因性に
    発現される、請求項27記載の方法。
29. 【請求項29】 エンドスタチン配列が、 a）配列番号：2、または b）配列番号：4 のアミノ酸配列をコードする、請求項27記載の方法。
30. 【請求項30】 エンドスタチン配列が、 a）配列番号：1に示された核酸、または b）配列番号：3に示された核酸 を含む、請求項27記載の方法。
31. 【請求項31】 エンドスタチン配列産物の活性を調節す
    る化合物を同定するための方法であって、 a）被験化合物と、エンドスタチン配列産物を発現する
    細胞とを接触させる段階、 b）細胞におけるエンドスタチン配列産物のレベルを測
    定する段階、 c）被験化合物の存在下での細胞におけるエンドスタチ
    ン配列産物の活性レベルと、被験化合物の非存在下での
    細胞におけるエンドスタチン配列産物の活性レベルとを
    比較する段階 を含み、被験化合物の存在下での細胞におけるエンドス
    タチン配列産物の活性レベルが、被験化合物の非存在下
    での細胞におけるエンドスタチン配列産物の活性レベル
    と異なる場合に、エンドスタチン配列産物の活性を調節
    する化合物が同定される方法。
32. 【請求項32】 エンドスタチン配列産物が、 a）配列番号：2、または b）配列番号：4 を含む、請求項31記載の方法。
33. 【請求項33】 細胞におけるエンドスタチン配列の活性
    および／または発現を調節する化合物を細胞に投与する
    段階を含む、細胞におけるエンドスタチン配列の活性お
    よび／または発現を調節するための方法。
34. 【請求項34】 化合物が、有機低分子、抗体、リボザイ
    ム、またはアンチセンス分子からなる群より選択され
    る、請求項33記載の方法。
35. 【請求項35】 エンドスタチン配列が、 a）配列番号：2、または b）配列番号：4 を含むアミノ酸配列をコードする、請求項33記載の方
    法。
36. 【請求項36】 エンドスタチン配列が、 a）配列番号：1に示された核酸、または b）配列番号：3に示された核酸 を含む、請求項33記載の方法。