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KR20130116858A - 추출 발효에서 알코올 수거를 위한 오일 유래의 추출 용매 - Google Patents

추출 발효에서 알코올 수거를 위한 오일 유래의 추출 용매 Download PDF

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Publication number
KR20130116858A
KR20130116858A KR1020137001250A KR20137001250A KR20130116858A KR 20130116858 A KR20130116858 A KR 20130116858A KR 1020137001250 A KR1020137001250 A KR 1020137001250A KR 20137001250 A KR20137001250 A KR 20137001250A KR 20130116858 A KR20130116858 A KR 20130116858A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oil
extractant
fatty
alcohol
fermentation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020137001250A
Other languages
English (en)
Inventor
더글라스 로버트 안톤
엘레나 시라코비치
브루스 에이. 디너
마이클 찰스 그라디
프란시스 제이. 워너
Original Assignee
부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/160,766 external-priority patent/US9012190B2/en
Application filed by 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 filed Critical 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨
Publication of KR20130116858A publication Critical patent/KR20130116858A/ko
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Abstract

알코올 발효 공정에서, 바이오매스 유래의 오일이, 발효 브로스로부터의 부탄올과 같은 산물 알코올의 원위치 수거에 이용가능한 추출제로 화학적으로 전환된다. 오일 중의 글리세라이드는 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 및 하이드록실화 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물과 같은 반응 산물로 화학적으로 전환될 수 있으며, 이는 바이오매스의 오일의 산물 알코올에 대한 분배 계수보다 큰 산물 알코올에 대한 분배 계수를 갖는 발효 산물 추출제를 형성한다. 알코올 발효 공정의 공급원료 유래의 오일은 발효 산물 추출제로 화학적으로 전환될 수 있다. 공급원료가 발효 용기에 공급되기 전에 공급원료로부터 오일을 분리할 수 있으며, 분리된 오일은 발효 산물 추출제로 화학적으로 전환될 수 있고, 그 후에 이를 산물 알코올을 포함하는 발효 산물과 접촉시킴으로써, 발효 산물로부터 산물 알코올을 분리한다.

Description

추출 발효에서 알코올 수거를 위한 오일 유래의 추출 용매 {EXTRACTION SOLVENTS DERIVED FROM OIL FOR ALCOHOL REMOVAL IN EXTRACTIVE FERMENTATION}
본 출원은 2010년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제61/356,290호; 2010년 7월 28일자로 출원된 미국 가출원 제61/368,451호; 2010년 7월 28일자로 출원된 미국 가출원 제61/368,436호; 2010년 7월 28일자로 출원된 미국 가출원 제61/368,444호; 2010년 7월 28일자로 출원된 미국 가출원 제61/368,429호; 2010년 9월 2일자로 출원된 미국 가출원 제61/379,546호; 및 2011년 2월 7일자로 출원된 미국 가출원 제61/440,034호; 2011년 6월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 제13/160,766호의 이익을 주장하며; 이들의 전체 내용은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 출원에 연계된 서열 목록은 EFS-웨브를 통해 전자 형태로 출원되므로, 그 전체로서 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 부탄올과 같은 발효 알코올의 생산, 및 특히 추출 발효용 추출 용매, 및 바이오매스 유래의 오일을 추출 용매로 전환하는 공정에 관한 것이다.
부탄올은 연료 첨가제로서, 플라스틱 산업에서의 공급원료 화학물질로서, 그리고 식품 및 향미료(flavor) 산업에서의 식품-등급 추출제로서의 용도를 포함하는 다양한 응용을 가지는 중요한 산업용 화학물질이다. 따라서, 부탄올에 대한 높은 필요성과 더불어, 효율적이고 환경 친화적인 생산 방법에 대한 높은 필요성이 존재한다.
미생물에 의한 발효를 이용하는 부탄올의 생산은 환경 친화적인 일 생산 방법이다. 높은 수율로 부탄올을 생산하는 일부 미생물은 또한 낮은 부탄올 독성 역치를 가지므로, 부탄올이 생산됨에 따라 그것을 발효 용기로부터 수거할 필요가 있다. 원위치 산물 수거(ISPR: In situ product removal)(추출 발효라고도 지칭함)는 부탄올이 생산됨에 따라 그것을 발효 용기로부터 수거함으로써, 미생물이 높은 수율로 부탄올을 생산하는 것을 가능하게 한다. 당업계에 기술되어 있는 ISPR을 위한 한가지 방법은 액-액 추출(미국 특허 출원 공개 제2009/0305370호)이다. 기술적으로, 그리고 경제적으로 실용적이기 위해서, 이상적으로는, 액-액 추출은 산물 알코올의 추출제 내로의 효율적인 물질 전달을 위한 추출제와 발효 브로스 사이의 양호한 접촉; 발효 브로스로부터의 추출제의 양호한 상 분리(발효 중에, 그리고 발효 후에); 추출제의 효율적인 회수 및 재사용; 산물 알코올을 추출하는 추출제 용량 저하의 최소화(예를 들어, 산물 알코올의 추출제 내로의 분배 계수가 낮아지는 것을 방지함에 의함), 및 장기 운전에 걸쳐 분배 계수를 낮아지게 하는 지질에 의한 추출제 오염의 최소화를 필요로 한다.
특히, 예를 들어 가수분해성 전분의 공급원료로서 발효 용기에 공급되는 바이오매스 내에 존재하는 지질의 축적에 의해, 각각의 재사용으로 인해 시간의 경과에 따라 추출제가 지질로 오염될 수 있다. 예를 들어, 30 중량% 건조 옥수수 고체로 발효 용기에 장입되는 액화 옥수수 매쉬(liquified corn mash)는, (글루코아밀라아제의 첨가에 의해 글루코스를 생산하기 위한 발효 중에 일어나는 액화 매쉬의 당화를 이용하는) 동시 당화 발효(SSF: simultaneous saccharification and fermentation)에 의해 글루코스가 부탄올로 전환되는 동안 약 1.2 중량% 옥수수 오일을 함유하는 발효 브로스를 유발할 수 있다. ISPR 중에 추출제로서 작용하는 올레일 알코올(OA)에 옥수수 오일 지질이 용해되는 것은, 각각의 OA 재사용으로 인한 지질 농도의 축적을 유발하여, 각각의 OA 재사용으로 인해 OA 중의 지질 농도가 증가함에 따라 OA 중의 산물 알코올에 대한 분배 계수를 감소시킬 수 있다.
또한, 추출 발효 중에 용해되지 않은 고체의 존재는 알코올 생산의 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 용해되지 않은 고체의 존재는 발효 용기 내부의 물질 전달 계수를 낮추고, 발효 용기 내의 상 분리를 방해하며, 추출제 내에 용해되지 않은 고체로부터의 옥수수 오일의 축적을 유발하여 시간의 경과에 따라 감소되는 추출 효율을 야기하고, 궁극적으로 건고형 옥수수 주정박(DDGS: Dried Distillers' Grains with Solubles)으로서 제거되는 고체 내에 용매가 포획됨으로 인한 용매의 손실을 증가시키며, 발효 브로스로부터 추출제 방울의 이탈을 지연시키고/시키거나, 더 낮은 발효 용기 부피 효율을 유발할 수 있다.
추출 발효에 사용되는 추출제의 분배 계수의 저하를 감소시키기 위한 몇가지 접근방법은 습식 제분, 분획화, 및 고체의 제거를 포함해 왔다. 습식 제분은, 각각의 부산물로부터 별도로 가치를 획득하기 위하여 바이오매스(예를 들어, 옥수수)를 그의 모든 주요 성분(배아, 과피 섬유(pericarp fiber), 전분, 및 글루텐)으로 분리하는 고비용의 다단계 공정이다. 이 공정은 정제된 전분 스트림을 제공하지만; 그것은 비용이 많이 들고 바이오매스를 발효 알코올 생산에 불필요한 그의 비-전분 성분으로 분리하는 단계를 포함한다. 분획화는, 분쇄 통옥수수에 존재하는 대부분의 지질을 함유하는 섬유 및 배아를 제거하여, 전분(내배유) 함량이 더 높은 옥수수를 생성시킨다. 건식 분획화는 배아 및 섬유를 분리하지 않으므로, 그것은 습식 제분보다 덜 고비용이다. 그러나, 분획화는 섬유 또는 배아 전부를 제거하지 않으며, 고체의 완전한 제거를 유발하지 않는다. 또한, 분획화에는 전분의 일부 손실이 있다. 옥수수의 습식 제분은 건식 분획화보다 고비용이지만, 건식 분획화는 분획화되지 않은 옥수수의 건식 분쇄보다 고비용이다. 예를 들어, 동시 계속 중이며 공통으로 소유된, 2010년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제61/356,290호에 기술된 바와 같이, 발효에 사용하기 전에 액화 매쉬로부터 지질을 함유하는 배아를 포함하는 고체를 제거하면, 용해되지 않은 고체를 실질적으로 제거할 수 있다. 그러나, 용해되지 않은 고체의 분획화 또는 제거조차 없이 추출제의 분배 계수의 저하를 감소시킬 수 있다면 유리할 것이다. 따라서, 추출제의 분배 계수의 저하가 감소된 추출 발효를 통해 부탄올과 같은 산물 알코올을 생산하기 위한 더 효율적인 방법 및 시스템을 개발할 필요성이 계속 존재한다.
또한, 추출제(예를 들어, 올레일 알코올)는 공정 중의 단계에서 생산되는 대신에 전형적으로 공정에 첨가되므로, 추출제는 원재료 비용이다. 추출제가 비-발효성 고체 상의 흡착으로 손실될 수 있고 공정 내로 도입되는 지질로 희석될 수 있으므로, 알코올 생산 공정의 경제성은 추출제 회수 및 재사용의 효율에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 자본 및/또는 운전 비용을 감소시킴으로써 더 경제적인 공정을 유발할 수 있는 ISPR을 위한 대안적인 추출제에 대한 필요성이 계속 존재한다.
발명의 개요
본 발명은, 바이오매스 중의 지질이 ISPR에 사용될 수 있는 추출제로 전환되고, 공급원료와 함께, 및/또는 추출제 재사용시에 발효 용기에 공급되는 지질의 양이 감소되는, 부탄올과 같은 산물 알코올의 생산 방법을 제공함으로써 상기 필요성을 만족시킨다. 본 발명은, 하기의 실시 형태의 기술에 의해 명백해질 추가의 관련 이점을 제공한다.
지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 및 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물(본 명세서에서는 집합적으로 "지방산 추출제"라고 지칭함)을 포함하는 추출제로의 바이오매스 유래의 지질의 화학적 전환은 ISPR 추출제 중에 존재하는 지질의 양을 감소시킬 수 있다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다. 지방산 추출제는 아이소부탄올과 같은 산물 알코올의 추출제 상 내로의 분배 계수를 지질 만큼 크게 감소시킬 것으로 예상되지 않을 것이다. 또한, 지방산 추출제는 ISPR 추출제로서 사용될 수 있다. 지방산 추출제는 발효 용기에 공급되는 발효성 탄소를 공급하는 바이오매스로부터 유래될 수 있다. 그러므로, 지방산 추출제는 알코올 생산 공정 중의 단계에서 생산될 수 있으며, 공정 중에 생산되지 않는 외인성의 공급된 ISPR 추출제(예를 들어, 외부에서 공급된 올레일 알코올) 대신에, 또는 이에 부가하여 사용될 수 있으므로, ISPR 추출제를 위한 원재료 비용을 감소시키거나 심지어 제거한다.
또한, 고온 및/또는 고압 조건을 사용하여 바이오매스 또는 공급원료 유래의 오일을 지방산으로 전환함으로써 추출제를 생산할 수도 있다. 또한, 바이오매스 또는 공급원료 유래의 오일을 하나 이상의 리파아제로 처리하여 지방산을 생산하거나 수소화시켜 지방 알코올을 생산할 수 있다.
본 발명은 공급원료로부터 알코올을 생산할 수 있는 재조합 미생물; 알코올; 및 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출제를 포함하며; 여기서, 추출제는 공급원료로부터 생산되는 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 추출제는 지방 아미드의 혼합물이고, 추가의 실시 형태에서, 지방 아미드의 혼합물은 리놀레아미드, 올레아미드, 팔미트아미드, 또는 스테아르아미드를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 추출제는 지방 아미드 및 지방산의 혼합물이고, 추가의 실시 형태에서, 지방 아미드 및 지방산의 혼합물은 리놀레아미드, 리놀레산, 올레아미드, 올레산, 팔미트아미드, 팔미트산, 스테아르아미드, 또는 스테아르산을 포함한다. 일 실시 형태에서, 추출제는 하이드록실화 트라이글리세라이드, 알콕실화 트라이글리세라이드, 하이드록실화 지방산, 알콕실화 지방산, 하이드록실화 지방 알코올, 및 알콕실화 지방 알코올로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 트라이글리세라이드는 메톡실화되거나 에톡실화될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 추출제는 포화 지방산, 불포화 지방산, 포화 지방 알코올, 불포화 지방 알코올, 포화 지방 아미드, 불포화 지방 아미드, 포화 지방 에스테르, 불포화 지방 에스테르, 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 추출제는 액체 또는 고체일 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 추출제는 비드의 형태일 수 있다. 일 실시 형태에서, 알코올은 C1 내지 C8 알킬 알코올이다. 다른 실시 형태에서, 공급원료는 호밀, 밀, 옥수수, 케인, 보리, 셀룰로스계 재료, 리그노셀룰로스계 재료, 또는 그의 혼합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, 추출제는 화학식 R(C=O)N(R')(R")의 하나 이상의 지방 아미드를 포함하며, 여기서,
R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R' 및 R"은 하나 이상의 하이드록실 기를 임의로 함유하는 C1 내지 C6 알킬 기 및 수소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
다른 실시 형태에서, 추출제는 화학식 R-(C=O)-OCHR'CHR"-OH의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며, 여기서,
R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R' 및 R"은 수소 및 C1 내지 C4 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시 형태에서, 추출제는 화학식 R-(C=O)-OR'의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며, 여기서,
R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R'은 8개 탄소 이하의 알킬 기이다.
본 발명은, 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계; 오일을 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 추출제로 화학적으로 전환할 수 있는 하나 이상의 물질과 오일을 접촉시킴으로써, 오일의 적어도 일부를 추출제로 전환하는 단계를 포함하는, 추출제의 생산 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다. 일 실시 형태에서, 추출제는 액체 또는 고체일 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 추출제는 비드의 형태일 수 있다. 본 방법은 일 실시 형태에서, 오일을 하나 이상의 물질과 접촉시키기 전에 바이오매스로부터 오일을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 하나 이상의 물질은 수성 암모늄 하이드록사이드, 무수 암모니아, 암모늄 아세테이트, 암모니아수, 과산화수소, 톨루엔, 빙초산, 리파아제, 및 양이온 교환 수지로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 산물 알코올에 대한 추출제의 분배 계수는, 오일이 추출제로 전환되기 전의 산물 알코올에 대한 오일의 분배 계수보다 크다. 일 실시 형태에서, 산물 알코올은 C1 내지 C8 알킬 알코올이다. 다른 실시 형태에서, 바이오매스는 옥수수 낟알, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 예를 들어, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보리짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스(switchgrass), 폐지, 사탕수수 버개스(bagasse), 수수, 사탕수수, 콩, 낟알의 제분으로부터 얻어지는 성분, 셀룰로스계 재료, 리그노셀룰로스계 재료, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 목재 조각, 톱밥, 관목 및 덤불, 야채, 과일, 꽃, 동물 퇴비, 또는 그의 혼합물을 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 올리고당류 및 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계; (b) 올리고당류를 단당류로 전환할 수 있는 당화 효소와 바이오매스를 접촉시키는 단계; (c) (a) 또는 (b)의 바이오매스로부터 오일을 분리하는 단계; (d) 분리된 오일을 하나 이상의 반응물 또는 용매와 접촉시켜 추출제를 형성시키는 단계; (e) 단당류를 산물 알코올로 전환할 수 있는 재조합 미생물을 포함하는 발효 브로스와 바이오매스를 접촉시킴으로써 산물 알코올을 생산하는 단계; 및 (f) 산물 알코올을 추출제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 추출제의 산물 알코올에 대한 분배 계수는 바이오매스의 오일의 산물 알코올에 대한 분배 계수보다 큰, 산물 알코올의 생산 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 하나 이상의 반응물 또는 용매는 수성 암모늄 하이드록사이드, 무수 암모니아, 암모늄 아세테이트, 암모니아수, 과산화수소, 톨루엔, 빙초산, 리파아제, 및 양이온 교환 수지로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 추출제는 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 추출제는 하이드록실화 트라이글리세라이드, 알콕실화 트라이글리세라이드(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화), 하이드록실화 지방산, 알콕실화 지방산, 하이드록실화 지방 알코올, 및 알콕실화 지방 알코올로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 추출제는 포화 지방산, 불포화 지방산, 포화 지방 알코올, 불포화 지방 알코올, 포화 지방 아미드, 불포화 지방 아미드, 포화 지방 에스테르, 불포화 지방 에스테르, 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 추출제는 액체 또는 고체일 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 추출제는 비드의 형태일 수 있다. 일 실시 형태에서, 알코올은 C1 내지 C8 알킬 알코올이다. 다른 실시 형태에서, 오일은 탤로우 오일, 옥수수 오일, 카놀라 오일, 카프릭/카프릴릭 트라이글리세라이드, 피마자 오일, 코코넛 오일, 목화씨 오일, 어류 오일, 조조바 오일, 라드, 아마인 오일, 우각 오일, 오이티시카 오일, 팜 오일, 땅콩 오일, 유채씨 오일, 쌀 오일, 홍화 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 유동 오일, 자트로파 오일, 밀 오일, 호밀 오일, 보리 오일, 및 야채 오일 블렌드로부터 선택된 하나 이상의 오일을 포함한다.
일 실시 형태에서, 추출제는 화학식 R(C=O)N(R')(R")의 하나 이상의 지방 아미드를 포함하며, 여기서,
R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R' 및 R"은 하나 이상의 하이드록실 기를 임의로 함유하는 C1 내지 C6 알킬 기 및 수소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
다른 실시 형태에서, 추출제는 화학식 R-(C=O)-OCHR'CHR"-OH의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며, 여기서,
R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R' 및 R"은 수소 및 C1 내지 C4 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시 형태에서, 추출제는 화학식 R-(C=O)-OR'의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며, 여기서,
R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R'은 8개 탄소 이하의 알킬 기이다.
본 발명은, (a) 발효 용기 내에서 산물 알코올을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 포함하는 발효 브로스를 제공함으로써 산물 알코올을 생산하는 단계; (b) 발효 브로스를 추출제와 접촉시켜 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성시키며, 여기서 산물 알코올 및 오일이 유기상 내로 분배됨으로써 유기상이 산물 알코올 및 오일을 포함하는 단계; (c) 수성상으로부터 유기상을 분리하는 단계; (d) 유기상으로부터 산물 알코올을 분리하는 단계를 포함하며; 임의로 단계 (b) 및 (c)가 동시에 일어나는, 산물 알코올의 생산 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 공급원료 슬러리를 생산하는 단계; 공급원료 슬러리를 분리하여 (i) 수성 층, (ii) 오일 층, 및 (iii) 고체 층을 생성시키는 단계; 및 수성 층을 발효 용기에 공급하는 단계를 추가로 포함한다. 본 방법은 다른 실시 형태에서, 오일을 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 추출제로 화학적으로 전환할 수 있는 하나 이상의 물질과 오일 층의 오일을 접촉시킴으로써, 오일의 적어도 일부를 추출제로 전환하는 단계를 추가로 포함하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 추출제는 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 추출제는 하이드록실화 트라이글리세라이드, 알콕실화 트라이글리세라이드(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화), 하이드록실화, 지방산, 알콕실화 지방산 하이드록실화 지방 알코올, 및 알콕실화 지방 알코올로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 추출제는 포화 지방산, 불포화 지방산, 포화 지방 알코올, 불포화 지방 알코올, 포화 지방 아미드, 불포화 지방 아미드, 포화 지방 에스테르, 불포화 지방 에스테르, 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 추출제는 액체 또는 고체일 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 추출제는 비드의 형태일 수 있다. 일 실시 형태에서, 산물 알코올은 C1 내지 C8 알킬 알코올이다. 다른 실시 형태에서, 추출제의 산물 알코올에 대한 분배 계수는 산물 알코올에 대한 오일 층의 오일의 분배 계수보다 크다. 일 실시 형태에서, 산물 알코올은 C1 내지 C8 알킬 알코올이다. 다른 실시 형태에서, 오일은 탤로우 오일, 옥수수 오일, 카놀라 오일, 카프릭/카프릴릭 트라이글리세라이드, 피마자 오일, 코코넛 오일, 목화씨 오일, 어류 오일, 조조바 오일, 라드, 아마인 오일, 우각 오일, 오이티시카 오일, 팜 오일, 땅콩 오일, 유채씨 오일, 쌀 오일, 홍화 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 유동 오일, 자트로파 오일, 밀 오일, 호밀 오일, 보리 오일, 및 야채 오일 블렌드로부터 선택된 하나 이상의 오일을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 발효 공정으로부터 바이오매스 유래의 오일을 수거하는 방법은, 소정량의 오일을 포함하는 바이오매스 공급스트림을, 오일을 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 추출제로 화학적으로 전환할 수 있는 하나 이상의 물질과 접촉시킴으로써 오일의 적어도 일부를 추출제로 전환하는 단계를 포함한다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다. 발효 알코올에 대한 추출제의 분배 계수는 발효 알코올에 대한 오일의 분배 계수보다 크다. 일부 실시 형태에서 바이오매스 공급스트림은 제분된 옥수수이고 오일은 옥수수 오일이다. 본 방법은 또한, 일부 실시 형태에서, 추출제를 가진 바이오매스 공급스트림을 발효 브로스와 접촉시키며, 발효 브로스는 발효 알코올을 포함하고, 여기서, 발효 알코올은 추출제 내로 분배되는 단계를 포함한다.
본 발명은, 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계; 및 오일의 적어도 일부를 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 추출제로 전환하는 단계를 포함하는, 추출제의 생산 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 오일을 추출제로 전환하는 단계는, 테트라하이드로퓨란 및 리튬 알루미늄 하이드라이드의 존재 하에 오일을 인큐베이션하는 단계; 오일을 소듐 하이드록사이드와 함께 인큐베이션하는 단계; 오일을 황산 및 메탄올과 함께 인큐베이션하는 단계; 암모늄 아세테이트의 존재 하에 오일을 무수 암모니아와 함께 인큐베이션하는 단계; 오일을 암모니아수와 함께 인큐베이션하는 단계; 오일을 톨루엔, 양이온 교환 수지, 빙초산, 리파아제, 및 과산화수소와 접촉시키는 단계; 오일을 고온 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 또는 오일을 고압 조건 하에 인큐베이션하는 단계 중의 하나 이상을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 산물 알코올의 원위치 수거를 위한 추출제의 원위치 생산 방법은, (a) 발효성 당 및 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하며, 오일은 트라이글리세라이드를 포함하는 단계; (b) 바이오매스로부터 (a)의 오일을 분리하는 단계; 및 (c) 분리된 오일을 트라이글리세라이드와 화학적으로 반응하여 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 아미드 및 지방산의 혼합물, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 반응 산물을 얻을 수 있는 하나 이상의 반응물 또는 용매와 접촉시킴으로써, 오일 중의 트라이글리세라이드를 반응 산물로 전환하는 단계를 포함한다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다. 반응 산물은, 산물 알코올에 대한 분배 계수가 산물 알코올에 대한 바이오매스의 오일의 분배 계수보다 큰 발효 산물 추출제를 형성한다.
일부 실시 형태에서, 부탄올의 생산 방법은, (a) 올리고당류 및 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하며, 오일은 글리세라이드를 포함하는 단계; (b) 올리고당류를 단당류로 전환할 수 있는 당화 효소와 바이오매스를 접촉시키는 단계; (c) (a) 또는 (b)의 바이오매스로부터 오일을 분리하는 단계; (d) 분리된 오일을 하나 이상의 반응물 또는 용매를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 오일 중의 글리세라이드가 추출제를 형성하는 단계; (e) 단당류를 부탄올로 전환할 수 있는 재조합 미생물과 바이오매스를 접촉시킴으로써 부탄올을 포함하는 발효 산물이 생산되는 단계; 및 (f) 발효 산물을 (d)의 추출제와 접촉시킴으로써 부탄올을 발효 산물로부터 분리하는 단계를 포함한다. 부탄올에 대한 추출제의 분배 계수는 부탄올에 대한 바이오매스의 오일의 분배 계수보다 크다. 일부 실시 형태에서, 단계 (d)의 추출제는 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 아미드 및 지방산의 혼합물, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 공급원료로부터 산물 알코올을 생산하는 공정 중의 단계에서 방법은, 식물-유래의 오일의 적어도 일부를 산물 알코올에 대한 추출제의 분배 계수가 산물 알코올에 대한 식물-유래의 오일의 분배 계수보다 큰 추출제로 전환하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 식물-유래의 오일은 공급원료로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 산물 알코올은 아이소부탄올이고 추출제 분배 계수는 약 0.28 이상이다. 일부 실시 형태에서, 아이소부탄올에 대한 추출제 분배 계수는 약 1 이상이다. 일부 실시 형태에서, 아이소부탄올에 대한 추출제 분배 계수는 약 2 이상이다.
일부 실시 형태에서, 공급원료로부터 산물 알코올을 생산하는 공정은, (a) 공급원료 슬러리를 생산하는 단계; (b) (a)의 공급원료 슬러리를 분리하여 (i) 수성 층, (ii) 오일 층, 및 (iii) 고체 층을 포함하는 산물을 생산하는 단계; 및 (c) (b)의 수성 층을 발효 용기에 공급하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공급원료 슬러리를 분리하는 단계는 원심분리에 의해 일어난다. 일부 실시 형태에서, 오일 층은 식물-유래의 오일 층이다. 본 방법은 일부 실시 형태에서, 식물-유래의 오일 층으로부터 식물-유래의 오일의 적어도 일부를 얻는 단계를 추가로 포함한다.
본 공정은 일부 실시 형태에서, 발효 용기에 추출제를 첨가하여 수성상 및 산물 알코올-함유 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성시킴으로써 산물 알코올-함유 유기상 내로 산물 알코올이 분배되는 단계를 추가로 포함한다.
본 공정은 일부 실시 형태에서, 수성상의 당을 발효시켜 산물 알코올을 생산함으로써 산물 알코올-함유 유기상 내로 산물 알코올이 분배되는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 발효 공정으로부터 바이오매스 유래의 오일을 수거하는 방법은, (a) 산물 알코올 및 바이오매스 유래의 오일을 포함하는 발효 브로스를 제공하며, 오일은 글리세라이드를 포함하는 단계; (b) 발효 브로스를 추출제와 접촉시켜 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성시키며, 산물 알코올 및 오일이 유기상 내로 분배됨으로써 유기상이 산물 알코올 및 오일을 포함하는 단계; (c) 수성상으로부터 유기상을 분리하는 단계; (d) 유기상으로부터 산물 알코올을 분리하는 단계; 및 (e) 유기상을 하나 이상의 반응물 또는 용매를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 오일 중의 글리세라이드가 추가의 추출제를 형성하는 단계; 및 (f) 발효 브로스를 단계 (e)의 추가의 추출제와 접촉시킴으로써 단계 (b)를 반복하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 추가의 추출제는 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 산물 알코올은 부탄올이다.
일부 실시 형태에서, 원위치 발효 추출제-형성 조성물은 (a) 바이오매스 유래의 오일; (b) 오일을 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 및 트라이글리세라이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 산물로 화학적으로 전환할 수 있는 하나 이상의 물질; 및 (c) 하나 이상의 산물을 포함하며, 여기서 하나 이상의 산물은 조성물의 약 50 중량% 내지 약 99 중량%의 양이다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 부탄올을 생산할 수 있는 재조합 미생물, 부탄올, 및 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 포함한다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 부탄올을 생산할 수 있는 재조합 미생물, 부탄올, 및 지방 알코올을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 부탄올을 생산할 수 있는 재조합 미생물, 부탄올, 및 지방 아미드의 혼합물을 포함하며, 여기서, 지방 아미드의 혼합물은 리놀레아미드, 올레아미드, 팔미트아미드, 및 스테아르아미드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 부탄올을 생산할 수 있는 재조합 미생물, 부탄올, 및 옥수수 오일을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서, 옥수수 오일은 약 28% 내지 약 67% 하이드록실화된다.
도면의 간단한 설명
본 명세서에 포함되며 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면은 본 발명을 예시하며, 추가로 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하고 관련 기술 분야의 당업자로 하여금 본 발명을 이해하고 사용할 수 있게 하는 역할을 한다.
도 1은, 액화 바이오매스로부터 발효 전에 지질이 수거되고, 수거된 지질이 추출제로 전환되어 발효 용기에 공급되는, 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한다.
도 2는, 액화 및 당화된 바이오매스로부터 발효 전에 지질이 수거되고, 수거된 지질이 추출제로 전환되어 발효 용기에 공급되는, 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한다.
도 3은, 바이오매스로부터 지질이 수거되어, 발효 용기에 공급되는 추출제로 전환되는, 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한다.
도 4는, 바이오매스 공급스트림 중의 지질이 추출제로 전환되어 발효 용기에 공급되는, 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한다.
도 5는, 발효 용기로부터 나오는 제1 추출제 중에 존재하는 지질이 제1 추출제로부터 분리되고, 발효 용기에 공급되는 제2 추출제로 전환되는, 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충될 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 좌우할 것이다. 또한, 문맥에 의해 다르게 필요로 하지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이며, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 발명을 추가로 정의하기 위하여, 하기의 용어 및 정의가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "구성하다", "구성하는", "갖다", "갖는", "함유하다", 또는 "함유하는", 또는 그들의 임의의 다른 변이형은 임의의 다른 정수 또는 정수의 군의 배제가 아닌, 언급된 정수 또는 정수의 군의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소만으로 한정되는 것이 아니고, 명확하게 열거되지 않거나 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치에 내재적인 다른 요소를 포함할 수 있다. 더욱이, 명백히 반대로 기술되지 않는다면, "또는"은 포괄적인 '또는'을 말하며 배타적인 '또는'을 말하는 것은 아니다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A는 참(또는 존재함)이고 B는 거짓(또는 존재하지 않음), A는 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B는 참(또는 존재함), A 및 B가 모두가 참(또는 존재함).
또한, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사 "a" 및 "an"은 요소 또는 성분의 경우, 즉, 출현의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 그러므로, 부정 관사("a" 또는 "an")는 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백하게 단수임을 의미하지 않는 한 복수형 또한 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적인 용어이며, 특정 발명의 임의의 단일의 실시 형태를 언급하는 것으로 의도되지 않고, 출원서에 기재된 바와 같은 모든 가능한 실시 형태들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 채용된 발명의 성분 또는 반응물의 분량을 수정하는 용어 "약"은, 예를 들어, 실제에서 농축물 또는 용액을 제조하는데 사용되는 통상적 측정 및 액체 취급 과정; 이들 과정에서의 우발적인 오차; 조성물을 제조하거나 방법을 실행하기 위해 채용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이; 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유발되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해 수식되는지 여부를 불문하고, 특허청구범위는 분량의 균등물을 포함한다. 일 실시 형태에서, 용어 "약"은 보고된 수치의 10% 이내, 대안적으로는 보고된 수치의 5%의 이내를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바이오매스"는 발효성 당을 제공하는 가수분해성 다당류를 함유하는 자연적 산물, 예를 들어, 옥수수, 케인, 밀과 같은 자연적 공급원 유래의 임의의 당 및 전분, 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 재료, 및 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌, 전분, 올리고당류, 이당류 및/또는 단당류를 포함하는 재료, 및 그의 혼합물을 지칭한다. 바이오매스는 또한 단백질 및/또는 지질과 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 바이오매스는 단일의 공급원으로부터 유래할 수 있거나, 바이오매스는 하나 초과의 공급원으로부터 유래된 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 옥수수 속대 및 옥수수 대의 혼합물, 또는 풀과 잎의 혼합물을 포함할 수 있다. 바이오매스는 바이오에너지 작물, 농업 잔류물, 도시 고형 폐기물(municipal solid waste), 산업 고형 폐기물, 제지 제조로부터의 슬러지, 마당 폐기물(yard waste), 나무 및 삼림지 폐기물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바이오매스의 예는, 옥수수 낟알, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 예를 들어, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보리짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스, 폐지, 사탕수수 버개스, 수수, 사탕수수, 콩, 낟알의 제분으로부터 얻어지는 성분, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 목재 조각, 톱밥, 관목 및 덤불, 야채, 과일, 꽃, 동물 퇴비, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 매쉬, 쥬스, 몰라세, 또는 가수분해물은, 제분, 처리, 및/또는 액화와 같이 발효 목적의 바이오매스 가공에 있어서 당업계에 공지된 임의의 가공에 의해 바이오매스로부터 형성될 수 있으며, 발효성 당을 포함하고, 물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 셀룰로스계 및/또는 리그노셀룰로스계 바이오매스를 가공하여 발효성 당을 함유하는 가수분해물을 얻을 수 있다. 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007/0031918A1호에 저암모니아 전처리(low ammonia pretreatmen)가 개시되어 있다. 셀룰로스계 및/또는 리그노셀룰로스계 바이오매스의 효소적 당화는 전형적으로, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스를 분해하는 효소 컨소시움을 이용하여 글루코스, 자일로스, 및 아라비노스를 포함하는 당을 함유하는 가수분해물을 생산한다. (셀룰로스계 및/또는 리그노셀룰로스계 바이오매스에 적합한 당화 효소는 문헌[Lynd, et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:506-577, 2002]에 개관되어 있음).
본 명세서에 기술된 바와 같이, 매쉬, 쥬스, 몰라세, 또는 가수분해물은 공급원료(12) 및 공급원료 슬러리(16)를 포함할 수 있다. 수성 공급스트림은 제분, 처리, 및/또는 액화와 같이 발효 목적의 바이오매스 가공에 있어서 당업계에 공지된 임의의 가공에 의해 바이오매스로부터 형성되거나 유래될 수 있으며, 발효성 탄소 기질(예를 들어, 당)을 포함하고, 물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수성 공급스트림은 공급원료(12) 및 공급원료 슬러리(16)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "공급원료"는, 발효 공정 중의 원료, 용해되지 않은 고체가 있거나 없는 발효성 탄소 공급원을 함유하는 원료, 및 응용가능한 경우에, 발효성 탄소 공급원이 액화, 당화, 또는 다른 공정에 의한 것과 같은 추가의 가공에 의해 복합당(complex sugar)의 분해로부터 얻어지거나 전분으로부터 유리되기 전 또는 후의 발효성 탄소 공급원을 함유하는 원료를 의미한다. 공급원료는 바이오매스를 포함하거나 바이오매스로부터 유래된다. 적합한 공급원료는 호밀, 밀, 옥수수, 케인, 보리, 셀룰로스계 재료, 리그노셀룰로스계 재료, 또는 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "옥수수 오일"을 언급하는 경우, 그 용어는 본 발명의 다른 실시 형태에 주어진 공급원료로부터 생산된 오일을 포함한다는 것이 인정될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효 브로스"는 물, 당, 용해된 고체, 임의로 알코올을 생산하는 미생물, 산물 알코올, 및 발효 용기에 담긴 재료의 다른 모든 구성요소의 혼합물을 의미하며, 여기서 산물 알코올은 존재하는 미생물에 의한 알코올, 물, 및 이산화탄소(CO2)로의 당의 반응에 의해 제조된다. 때때로, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "발효 배지" 및 "발효된 혼합물"은 "발효 브로스"와 동의어로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효성 탄소 공급원" 또는 "발효성 탄소 기질"은 발효 알코올의 생산을 위해 본 명세서에 개시된 미생물에 의해 대사될 수 있는 탄소 공급원을 의미한다. 적합한 발효성 탄소 공급원은, 글루코스 또는 프럭토스와 같은 단당류; 락토스 또는 수크로스와 같은 이당류; 올리고당류; 전분 또는 셀룰로스와 같은 다당류; 일원자-탄소(one-carbon) 기질; 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효성 당"은 발효 알코올의 생산을 위해 본 명세서에 개시된 미생물에 의해 대사될 수 있는 당을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효 용기"는 당으로부터 부탄올과 같은 산물 알코올이 제조되는 발효 반응이 실행되는 용기를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "액화 용기"는 액화가 실행되는 용기를 의미한다. 액화는 공급원료로부터 올리고당류가 유리되는 공정이다. 공급원료가 옥수수인 일부 실시 형태에서는, 액화 중에 옥수수 전분 함량으로부터 올리고당류가 유리된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "당화 용기"는 당화(즉, 올리고당류가 단당류로 분해됨)가 실행되는 용기를 의미한다. 발효 및 당화가 동시에 일어나는 경우, 당화 용기 및 발효 용기는 동일한 용기 내에 하나일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "당"은 올리고당류, 이당류, 및/또는 단당류를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "당화 효소"는 다당류 및/또는 올리고당류, 예를 들어, 전분, 또는 글리코겐의 알파-1,4-글루코시드 결합을 가수분해할 수 있는 하나 이상의 효소를 의미한다. 당화 효소는 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 재료 또한 가수분해할 수 있는 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "용해되지 않은 고체"는 공급원료의 비-발효성 일부, 예를 들어, 배아, 섬유, 및 글루텐을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "산물 알코올"은 바이오매스를 발효성 탄소 기질의 공급원으로서 이용하는 발효 공정 내의 미생물에 의해 생산될 수 있는 임의의 알코올을 지칭한다. 산물 알코올은, C1 내지 C8 알킬 알코올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 산물 알코올은 C2 내지 C8 알킬 알코올이다. 다른 실시 형태에서, 산물 알코올은 C2 내지 C5 알킬 알코올이다. C1 내지 C8 알킬 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 및 펜탄올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다는 것이 인정될 것이다. 마찬가지로, C2 내지 C8 알킬 알코올은 에탄올, 프로판올, 부탄올, 및 펜탄올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 "알코올"은 또한, 산물 알코올과 관련하여 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "부탄올"은 특이적으로 부탄올 이성체 1-부탄올(1-BuOH), 2-부탄올(2-BuOH), 및/또는 아이소부탄올(iBuOH 또는 I-BUOH, 또한 2-메틸-1-프로판올로도 공지됨)을 개별적으로 또는 그의 혼합물로서 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로판올"은 프로판올 이성체 아이소프로판올 또는 1-프로판올을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "펜탄올"은 펜탄올 이성체 1-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, , , , , , 또는 을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알코올 당량"은 소정량의 알코올 에스테르의 완전 가수분해 및 회수에 의해 얻어질 알코올의 중량을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "수성상 타이터(titer)"는 발효 브로스 내의 특정 알코올(예를 들어, 부탄올)의 농도를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유효 타이터"는 발효 배지 1 리터당 알코올 에스테르화에 의해 생산되는 알코올 에스테르의 알코올 당량 또는 발효에 의해 생산되는 특정 알코올(예를 들어, 부탄올)의 총량을 지칭한다. 예를 들어, 발효의 단위 부피 내의 부탄올의 유효 타이터는, (i) 발효 배지 내의 부탄올의 양; (ii) 유기 추출제로부터 회수되는 부탄올의 양; (iii) 기체 스트리핑을 사용하는 경우, 기체상으로부터 회수되는 부탄올의 양, 및 (iv) 유기상 또는 수성상 내의 부탄올 에스테르의 알코올 당량을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원위치 산물 수거(ISPR)"는, 산물이 생산됨에 따라 생물학적 공정 내의 산물 농도를 제어하기 위한, 발효와 같은 생물학적 공정으로부터의 특이적 발효 산물의 선택적 수거를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "추출제" 또는 "ISPR 추출제"는 부탄올 이성체와 같은 임의의 산물 알코올을 추출하기 위해 사용되는 유기 용매를 의미한다. 추출제는 발효 온도에서 고체 또는 액체일 수 있다. 때때로, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용매"는 "추출제"와 동의어로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "지방산 추출제"는, 천연 오일 중의 글리세라이드를 하나 이상의 용매 또는 반응물과 화학적으로 반응시켜 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응 산물을 얻음으로써 천연 오일로부터 유래되는 추출제를 의미한다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "천연 오일"은 식물(예를 들어, 바이오매스) 또는 동물로부터 얻어지는 지질을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "식물-유래의 오일"은 특히 식물로부터 얻어지는 지질을 지칭한다. 때때로, "지질"은 "오일" 및 "글리세라이드"와 동의어로 사용될 수 있다. 천연 오일은 탤로우, 옥수수, 카놀라, 카프릭/카프릴릭 트라이글리세라이드, 피마자, 코코넛, 목화씨, 어류, 조조바, 라드, 아마인, 우각, 오이티시카, 팜, 땅콩, 유채씨, 쌀, 홍화, 대두, 해바라기, 유동, 자트로파, 및 야채 오일 블렌드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지방산"은, 포화되거나 불포화된 C4 내지 C28 탄소 원자(가장 통상적으로는, C12 내지 C24 탄소 원자)를 갖는 카르복실산(예를 들어, 지방족 모노카르복실산)을 지칭한다. 지방산은 또한 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 지방산은 동물 또는 야채 지방, 오일 또는 왁스로부터 유래되거나, 에스테르화된 형태로 함유될 수 있다. 지방산은 지방 및 지방 오일 내에 글리세라이드의 형태로 자연적으로 나타나거나, 지방의 가수분해에 의해, 또는 합성에 의해 얻어질 수 있다. 용어 지방산은 단일 화학종 또는 지방산의 혼합물을 기술할 수 있다. 또한, 용어 지방산은 유리 지방산도 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지방 알코올"은, 포화되거나 불포화된 C4 내지 C22 탄소 원자의 지방족 장쇄를 갖는 알코올을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지방 알데하이드"는 포화되거나 불포화된 C4 내지 C22 탄소 원자의 지방족 장쇄를 갖는 알데하이드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지방 아미드"는 포화되거나 불포화된 C4 내지 C22 탄소 원자의 지방족 장쇄를 갖는 아미드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지방 에스테르"는 포화되거나 불포화된 C4 내지 C22 탄소 원자의 지방족 장쇄를 갖는 에스테르를 지칭한다.
용어 "수-비혼화성"은, 추출제 또는 용매와 같은 화학적 성분이, 하나의 액체상을 형성하는 것과 같은 방식으로 발효 브로스와 같은 수용액과 혼합될 수 없음을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "수성상"은 발효 브로스를 수-비혼화성 유기 추출제와 접촉시킴으로써 얻어진 2상 혼합물의 수성상을 지칭한다. 이때, 발효 추출을 포함하는 본 명세서에 기술된 공정의 일 실시 형태에서, 용어 "발효 브로스"는 2상 발효 추출에서의 수성상을 특이적으로 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유기상"은 발효 브로스를 수-비혼화성 유기 추출제와 접촉시킴으로써 얻어진 2상 혼합물의 비-수성상을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분리"는 "회수"와 동의어이며, 초기 혼합물 중의 화합물의 순도 또는 농도보다 높은 농도 또는 순도로 화합물을 얻기 위해 초기 혼합물로부터 화학적 화합물을 수거하는 단계를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "재조합 미생물"은, 예를 들어, 부탄올과 같은 알코올을 생산하는 생합성 경로와 같은 생합성 경로를 포함하도록 숙주 세포를 조작하는 것에 의한 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 개질된 박테리아 또는 효모와 같은 미생물을 지칭한다.
본 발명은 바이오매스 유래의 오일의 화학적 전환에 의해 얻어지는 추출제, 및 추출제의 생산 방법을 제공한다. 특히, 오일 중의 글리세라이드는, 본 명세서에서 지방산 추출제라고 집합적으로 지칭하는 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 및 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 산물로 화학적으로 전환될 수 있다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다. 지방산 추출제는 발효 브로스로부터 부탄올과 같은 산물 알코올의 원위치 수거를 위한 추출제로서의 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 바이오매스 오일로부터 생산된 추출제를 사용하는 추출 발효를 통해 부탄올과 같은 산물 알코올을 생산하는 방법 또한 제공한다. 본 발명은 공급원료 유래의 오일을 분리함으로써 알코올 발효 공정으로부터 오일을 수거하는 방법 또한 제공한다. 오일 수거 전에 공급원료를 액화하여 슬러리를 생성시킬 수 있다. 따라서, 슬러리는 발효성 탄소 공급원, 오일, 및 용해되지 않은 고체를 포함한다. 오일, 및 일부 실시 형태에서 용해되지 않은 고체는, 슬러리를 발효 용기에 공급하기 전에 슬러리로부터 제거될 수 있다. 오일 및 일부 실시 형태에서 용해되지 않은 고체의 제거는, 발효 용기 내의 오일(및 일부 실시 형태에서 고체)의 존재에 기인하는 시간의 경과에 따른 추출제의 분배 계수의 저하, 손실을 감소시킬 수 있다. 또한, 분리된 오일을 지방산 추출제로 화학적으로 전환할 수 있으며, 이를 발효 용기에 공급할 수 있다. 발효 알코올에 대한 지방산 추출제의 분배 계수는 발효 알코올에 대한 오일의 분배 계수보다 클 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법에 따라 공급원료로부터 화학적으로 전환되지 않은 올레일 알코올과 같은 상업적인 외인성 추출제 대신에, 또는 이에 부가하여, 지방산 추출제를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 공급원료 유래의 오일의 화학적 전환을 통해 발효 공정의 단계에서 추출제를 생산함으로써 외인성 추출제와 연계된 원재료 비용을 감소시킬 수 있다.
도면을 참조하여 본 발명을 기술하고자 한다. 도 1은, 본 발명의 실시 형태에 따른 발효 알코올의 생산을 위한 예시적인 공정 흐름도를 예시한다. 나타낸 바와 같이, 공급원료(12)를 액화 용기(10)의 입구에 도입하고 액화하여 공급원료 슬러리(16)를 생산할 수 있다. 공급원료(12)는 발효성 탄소 공급원(예를 들어, 글루코스와 같은 발효성 당)을 공급하는 가수분해성 전분을 함유하며, 호밀, 밀, 옥수수, 케인, 보리, 셀룰로스계 재료, 리그노셀룰로스계 재료, 또는 그의 혼합물과 같으나 이에 한정되지 않는 바이오매스일 수 있거나, 바이오매스로부터 다른 방법으로 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 공급원료(12)는 분획화 바이오매스의 하나 이상의 성분일 수 있고, 다른 실시 형태에서, 공급원료(12)는 제분된 비분획화 바이오매스일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 공급원료(12)는 건식 제분된 비분획화 옥수수 커넬(kernel)과 같은 옥수수일 수 있으며, 용해되지 않은 입자는 배아, 섬유, 및 글루텐을 포함할 수 있다. 용해되지 않은 고체는 공급원료(12)의 비-발효성 일부이다. 도면에 나타낸 실시 형태를 참조하는 본 명세서의 논의를 목적으로, 공급원료(12)는 종종, 용해되지 않은 고체가 그로부터 분리되지 않은 제분된 비분획화 옥수수를 구성하는 것으로 기술될 것이다. 그러나, 당업자에게 자명한 바와 같이, 본 명세서에 기술된 예시적인 방법 및 시스템은 분획화 여부를 불문하고 상이한 공급원료에 대해 개질될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 실시 형태에서, 공급원료(12)는 고-올레익 옥수수일 수 있으므로, 그로부터 유래된 옥수수 오일은 올레산 함량이 약 55 중량% 올레산 이상인 고-올레익 옥수수 오일이다. 보통의 옥수수 오일 중의 올레산 함량이 약 24 중량%임에 비교하여, 일부 실시 형태에서 고-올레익 옥수수 오일 중의 올레산 함량은 최대 약 65 중량%일 수 있다. 고-올레익 오일은 본 발명의 방법에 사용함에 있어서 일부 이점을 제공할 수 있으며, 이는 오일의 가수분해가 발효 브로스와 접촉시키기 위한 올레산 함량이 높은 지방산 추출제를 제공할 수 있기 때문이다. 일부 실시 형태에서, 지방산 또는 그의 혼합물은 불포화 지방산을 포함한다. 불포화 지방산의 존재는 융점을 감소시켜, 취급상의 이점을 제공한다. 불포화 지방산 중에서 모노불포화(즉, 단일의 탄소-탄소 이중 결합을 가짐)된 것들은, 공정 고려사항에 있어서 적합한 열안정성 및 산화안정성을 희생하지 않으면서 융점에 대한 이점을 제공할 수 있다.
공급원료(12) 액화 공정은 공급원료(12) 중의 전분을, 예를 들어, 덱스트린 및 올리고당류를 포함하는 당으로 가수분해하는 단계를 포함하며, 이는 관용적인 공정이다. 산 공정, 산-효소 공정, 또는 효소 공정을 포함하나 이에 한정되지 않는, 산업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 공지 액화 공정을 상응하는 액화 용기와 더불어 사용할 수 있다. 이러한 공정을 단독으로, 또는 조합하여 사용할 수 있다. 일부 실시 형태에서는 효소 공정을 이용할 수 있으며, 적절한 효소(14), 예를 들어, 알파-아밀라아제를 액화 용기(10)의 입구에 도입한다. 물 또한 액화 용기(10)에 도입할 수 있다.
공급원료(12) 액화로부터 생산된 공급원료 슬러리(16)는 당, 오일, 및 공급원료 유래의 용해되지 않은 고체를 포함한다. 공급원료 슬러리(16)는 액화 용기(10)의 출구로부터 배출될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 공급원료(12)는 옥수수 또는 옥수수 커넬이므로, 공급원료 슬러리(16)는 옥수수 매쉬 슬러리이다.
공급원료 슬러리(16) 내에 존재하는 오일의 일부, 또는 바람직하게는 실질적으로 전부를 수거하도록 구성된 분리기(20)의 입구 내로 공급원료 슬러리(16)를 도입한다. 수거된 오일은 스트림(26)으로서 반응 용기(40)에 제공되고, 당 및 물을 포함하는 나머지 공급원료는 수성 스트림(22)으로서 발효 용기(30)에 배출된다. 수성 스트림(22)은 슬러리(16)의 용해되지 않은 고체를 포함할 수 있으나, 오일(26)이 분리기(20)를 통해 수거되었으므로, 발효 용기(30) 내의 발효 브로스는 여전히 감소된 양의 오일을 갖는다. 분리기(20)로부터 배출된 오일 스트림(26)은 소정량의 글리세라이드, 특히 트라이글리세라이드를 가지며, 반응 용기(40) 내에서 이를 하나 이상의 물질(42)과 접촉시킨다. 물질(42)은 오일(26) 중의 글리세라이드의 적어도 일부를 지방산 추출제(28)로 화학적으로 전환할 수 있는 반응물 또는 용매이다. 일부 실시 형태에서, 물질(42)을 통한 글리세라이드의 화학적 전환으로부터의 오일 중의 지방산 추출제(28)의 양은 약 17 중량% 이상, 약 20 중량% 이상, 약 30 중량% 이상, 약 40 중량% 이상, 약 50 중량% 이상, 약 60 중량% 이상, 약 65 중량% 이상, 약 70 중량% 이상, 약 75 중량% 이상, 약 80 중량% 이상, 약 85 중량% 이상, 약 90 중량% 이상, 약 95 중량% 이상, 또는 약 99 중량% 이상일 수 있다.
분리기(20)는 수성 공급스트림으로부터 오일을 수거하기 위한 당업계에 공지된 임의의 적합한 분리기일 수 있으며, 사이포닝(siphoning), 흡인법(aspiration) 경사법(decantation), 원심분리, 중력 침강기(gravity settler)의 사용, 막-보조 상 분리(membrane-assisted phase splitting) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 분리기(20)는 또한 공급원료 슬러리(16) 중의 용해되지 않은 고체를 제거하고 용해되지 않은 고체를 고체상 또는 습윤 케이크(24)로서 배출할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 분리기(20)는 공급원료 슬러리(16)로부터 용해되지 않은 고체를 분리하기 위한 필터 프레스(filter press), 진공 여과, 또는 원심분리기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 분리기(20)는 공급원료 슬러리(16)를 교반하거나 회전시켜 당 및 물을 함유하는 수성 층(즉, 스트림(22)), 용해되지 않은 고체를 함유하는 고체 층(즉, 습윤 케이크(24)), 및 오일 층(즉, 오일 스트림(26))을 포함하는 원심분리 산물을 생산하는 트라이캔터 원심분리기(tricanter centrifuge)(20)를 포함한다. 슬러리(16)가 옥수수 매쉬 슬러리인 경우, 이때 오일(26)은 유리 옥수수 오일이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 유리 옥수수 오일은 옥수수 배아로부터 유리된 옥수수 오일을 의미한다. 공급원료 슬러리(16)로서의 옥수수 매쉬 슬러리에 있어서, 습윤 케이크(24)는 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 50 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 55 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 60 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 65 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 70 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 75 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 80 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 85 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 90 중량% 이상, 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 95 중량% 이상, 또는 공급원료 슬러리 중에 존재하는 용해되지 않은 입자의 약 99 중량% 이상을 포함한다.
원심분리기(20)를 통해 습윤 케이크(24)를 제거하는 경우, 일부 실시 형태에서, 공급원료가 옥수수인 경우에 옥수수 오일과 같은 공급원료(12)로부터의 오일의 일부가 습윤 케이크(24) 내에 남는다. 이러한 경우에, 습윤 케이크(24)는 습윤 케이크(24)의 건조 고체 함량의 약 20 중량% 미만의 양으로 옥수수 오일을 포함한다. 원심분리기(20)의 바닥 부근에 위치하는 출구 밖으로 습윤 케이크(24)를 배출할 수 있다. 습윤 케이크(24)는 또한 물 및 발효성 탄소의 일부를 포함할 수 있다. 일단 수용액(22)이 원심분리기(20)로부터 배출되면, 습윤 케이크(24)를 원심분리기 내에서 추가의 물로 세척할 수 있다. 습윤 케이크(24)를 세척하는 단계는 습윤 케이크 내에 존재하는 당(예를 들어, 올리고당류)을 회수할 것이며, 회수된 당 및 물은 액화 용기(10)에 재사용될 수 있다. 세척 후에, 임의의 적합한 공지 공정을 통해 습윤 케이크(24)를 건조시켜 건고형 옥수수 주정박(DDGS)을 형성시킬 수 있다. 원심분리기(20) 내에 형성된 습윤 케이크(24)로부터의 DDGS 형성은 몇가지 이익을 갖는다. 용해되지 않은 고체는 발효 용기로 가지 않으므로, DDGS는 포획된 추출제 및/또는 산물 알코올, 예를 들어, 부탄올을 갖지 않으며, 그것은 발효 용기의 조건에 놓이지 않고, 그것은 발효 용기 내에 존재하는 미생물과 접촉하지 않는다. 이들 이익은, 예를 들어, 동물 사료로서 DDGS를 가공하고 판매하는 것을 더욱 용이하게 한다. 원심분리를 통해 공급원료(16)로부터 용해되지 않은 고체를 제거하기 위한 방법 및 시스템은, 동시 계속 중이며 공통으로 소유된, 2010년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제61/356,290호에 상세하게 기술되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 그에 대한 참고로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 오일(26)은 습윤 케이크(24)로부터 별도로 배출되는 것이 아니라, 대신에 오일(26)이 습윤 케이크(24)의 일부로서 포함되어 궁극적으로 DDGS 내에 존재한다. 이러한 경우, 추후에 동일하거나 상이한 알코올 발효 공정에 사용하기 위하여, 오일을 DDGS로부터 분리하여 지방산 추출제로 전환할 수 있다. 어느 경우이든, 공급원료의 오일 성분의 수거는 부탄올 생산과 같은 알코올 생산에 유리하며, 이는 발효 용기 내에 존재하는 오일이 ISPR 추출제를 희석할 수 있고 발효 알코올의 유기상 내로의 분배 계수를 감소시킬 수 있기 때문이다. 또한, 오일은 지방산 및 글리세린으로 분해될 수 있으며, 이는 물 중에 축적되어 시스템 전체에 걸쳐 재사용에 이용가능한 물의 양을 감소시킬 수 있다. 따라서, 공급원료의 오일 성분의 수거는 또한, 시스템을 통해 재사용될 수 있는 물의 양을 증가시킴으로써 산물 알코올 생산의 효율을 증가시킬 수 있다.
수성 스트림(22) 및 미생물(32)을 발효 용기(30)에 도입하여, 발효 용기(30)에 담긴 발효 브로스에 포함되도록 한다. 발효 용기(30)는 수성 스트림(22)을 발효시켜 부탄올과 같은 산물 알코올을 생산하도록 구성된다. 특히, 미생물(32)은 슬러리(16) 중의 발효성 당을 대사시켜 산물 알코올을 분비한다. 미생물(32)은 박테리아, 시아노박테리아, 사상균, 및 효모의 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 미생물(32)은 E. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 미생물(32)은 발효 재조합 미생물일 수 있다. 수용액(22)은, 예를 들어, 올리고당류 형태의 당, 및 물을 포함할 수 있으며, 약 20 g/L 미만의 단량체성 글루코스, 더욱 바람직하게는 약 10 g/L 미만, 또는 약 5 g/L 미만의 단량체성 글루코스를 포함할 수 있다. 단량체성 글루코스의 양을 결정하는 적합한 기법은 당업계에 주지되어 있다. 당업계에 공지된 이러한 적합한 방법은 HPLC를 포함한다.
일부 실시 형태에서는, 스트림(22) 내에서 복합당(예를 들어, 올리고당류)을 미생물(32)에 의해 용이하게 대사될 수 있는 단당류로 분해하기 위하여 수성 스트림(22)에 당화 공정을 적용한다. 산 공정, 산-효소 공정, 또는 효소 공정을 포함하나 이에 한정되지 않는, 산업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 공지 당화 공정을 사용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 동시 당화 및 발효(SSF)는 발효 용기(30) 내부에서 일어날 수 있다. 일부 실시 형태에서는, 전분을 미생물(32)에 의해 대사될 수 있는 글루코스로 분해하기 위하여 글루코아밀라아제와 같은 효소(38)를 발효 용기(30)의 입구에 도입할 수 있다.
산물 알코올이 미생물(32)에 의해 생산됨에 따라, 원위치 산물 수거(ISPR)를 이용하여 산물 알코올을 발효 용기(30)로부터 수거할 수 있다. 추출 발효에 있어서, 이러한 ISPR은 액-액 추출을 포함한다. 액-액 추출은 미국 특허 출원 공개 제2009/0305370호에 기술된 공정에 따라 수행될 수 있으며, 그의 개시는 전체적으로 본 명세서에 포함된다. 미국 특허 출원 공개 제2009/030537호는, 발효 브로스를 수 비혼화성 추출제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 추출 발효를 사용하여 발효 브로스로부터 부탄올을 생산 및 회수하는 방법을 기술한다. 전형적으로 추출제는, 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하기 위한, 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 아미드 및 지방산의 혼합물, 지방산의 에스테르, 지방 알데하이드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 유기 추출제일 수 있다. 도 1의 실시 형태를 참조하면, 발효 용기(30)는 하나 이상의 수 비혼화성 ISPR 추출제, 예를 들어, 용기(40)로부터의 지방산 추출제(28)를 수용하기 위한 하나 이상의 입구를 갖는다. 지방산 추출제(28)는 발효 브로스와 접촉하여 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성한다. 발효 브로스 내에 존재하는 산물 알코올은 유기상 내로 분배된다. 2상 혼합물을 발효 용기(30)로부터 스트림(39)으로서 수거하여 용기(35) 내로 도입할 수 있으며, 여기서 수성상 및 유기상의 분리를 수행하여 알코올-함유 유기상(36) 및 수성상(34)을 생산한다. 사이포닝, 경사법, 원심분리, 중력 침강기의 사용, 막-보조 상 분리 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 2상 혼합물(39)의 수성상(34)으로부터 알코올-함유 유기상(36)을 분리한다. 수성상(34)의 전부 또는 일부를 발효 배지로서 발효 용기(30) 내로 재사용하거나(나타낸 바와 같음), 그렇지 않다면 폐기하고 새로운 배지로 대체하거나, 임의의 나머지 산물 알코올의 수거를 위해 처리한 후 발효 용기(30)로 재사용할 수 있다. 알코올-함유 유기상(36)을 처리하여 산물 알코올을 회수한 후, 생성된 알코올-저함유(alcohol-lean) 추출제를 통상적으로 새로운 보충 추출제(28)와 조합하여 산물 알코올의 추가 추출을 위해 발효 용기(30) 내로 다시 재사용할 수 있다(나타내지 않음). 대안적으로, 2상 혼합물 스트림(39) 내에서 제거되는 추출제를 대체하기 위하여 새로운 추출제(28)를 발효 용기에 연속적으로 첨가할 수 있다.
일부 실시 형태에서는, 도 3 내지 5의 실시 형태에 예시된 추출제(29)와 같은 하나 이상의 추가의 ISPR 추출제를 발효 용기(30) 내로 도입하여, 수성상 및 유기상을 포함하며 산물 알코올이 유기상 내로 분배되는 2-상 혼합물을 형성시킬 수 있다. 이러한 하나 이상의 추가의 추출제(29)는 다른 지방산 추출제 및/또는 외인성 유기 추출제, 예를 들어, 올레일 알코올, 베헤닐 알코올, 세틸 알코올, 라우릴 알코올, 미리스틸 알코올, 스테아릴 알코올, 1-운데칸올, 올레산, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산, 메틸 미리스테이트, 메틸 올레에이트, 운데칸알, 라우릭 알데하이드, 20-메틸운데칸알, 및 그의 혼합물일 수 있다. 일부 실시 형태에서, ISPR 추출제(29)는 카르복실산일 수 있고, 일부 실시 형태에서, ISPR 추출제(29)는 유리 지방산일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 카르복실산 또는 유리 지방산은, 4 내지 28개 탄소, 다른 실시 형태에서는 4 내지 22개 탄소 , 다른 실시 형태에서는 8 내지 22개 탄소, 다른 실시 형태에서는 10 내지 28개 탄소, 다른 실시 형태에서는 7 내지 22개 탄소, 다른 실시 형태에서는 12 내지 22개 탄소, 다른 실시 형태에서는 4 내지 18개 탄소, 다른 실시 형태에서는 12 내지 22개 탄소, 및 또 다른 실시 형태에서는 12 내지 18개 탄소의 쇄를 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, ISPR 추출제(29)는 하나 이상의 하기 지방산이다: 아잘레산, 카프르산, 카프릴산, 피마자 지방산, 코코넛 지방산(즉, 예를 들어, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 카프릴산, 카프르산, 스테아르산, 카프로산, 아라키드산, 올레산, 및 리놀레산을 포함하는 지방산의 자연적으로 나타나는 조합으로서), 다이머산, 아이소스테아르산, 라우르산, 아마인 지방산, 미리스트산, 올레산, 팜 오일 지방산, 팔미트산, 팜 커넬 지방산, 펠라르곤산, 리신올레산, 세바스산, 대두 지방산, 스테아르산, 톨 오일 지방산, 탤로우 지방산, 및 #12 하이드록시 스테아르산. 일부 실시 형태에서, ISPR 추출제(29)는 하나 이상의 2산, 예를 들어, 아젤라산 및 세바스산이다. 따라서, 일부 실시 형태에서, ISPR 추출제(29)는 2가지 이상의 상이한 지방산의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 2010년 7월 28일자로 출원된, 동시 계속 중이며 공통으로 소유된 미국 가출원 제61/368,444호에 기술된 바와 같이, 일부 실시 형태에서, ISPR 추출제(29)는 바이오매스 지질과 같은 천연 오일의 효소 가수분해로부터 생산된 유리 지방산일 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 추출제(29)를 생산하기 위한 바이오매스 지질은 공급원료(12)가 얻어지는 바이오매스 공급원과 동일하거나 상이한 바이오매스 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 추출제(29)를 생산하기 위한 바이오매스 지질은 대두로부터 유래될 수 있는 한편, 공급원료(12)의 바이오매스 공급원은 옥수수이다. 당업자에게 자명할 바와 같이, 추출제(29) 대 공급원료(12)에 있어서 상이한 바이오매스 공급원의 임의의 가능한 조합을 사용할 수 있다.
도 1의 실시 형태에서, 산물 알코올은 발효 브로스로부터 원위치에서 추출되며, 2상 혼합물(39)의 분리는 별도의 용기(35) 내에서 일어난다. 원위치 추출 발효는 발효 용기(30) 내에서 회분 모드 또는 연속 모드로 실행될 수 있다. 원위치 추출 발효에 있어서, 유기 추출제는 발효의 개시점에서 발효 배지와 접촉하여 2상 발효 배지를 형성할 수 있다. 대안적으로, 유기 추출제는, 배양물의 광학 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있는 목적하는 양의 성장을 미생물이 달성한 후에 발효 배지와 접촉될 수 있다. 추가로, 유기 추출제는, 발효 배지 내의 산물 알코올 수준이 사전 선택된 수준에 도달하는 시간에 발효 배지와 접촉될 수 있다. 부탄올 생산의 경우에, 예를 들어, ISPR 추출제는 부탄올 농도가 유독한 수준에 도달하기 전의 시간에 발효 배지와 접촉될 수 있다. 발효 배지를 ISPR 추출제와 접촉시킨 후에, 부탄올 산물은 추출제 내로 분배되어, 미생물을 함유하는 수성상 중의 부탄올의 농도가 감소되고, 이에 의해 저해성 부탄올 산물에 대한 생산 미생물의 노출이 제한된다.
사용될 ISPR 추출제의 부피는, 하기와 같이 발효 배지의 부피, 발효 용기의 크기, 부탄올 산물에 대한 추출제의 분배 계수, 및 선택된 발효 모드를 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 추출제의 부피는 발효 용기 작업 부피의 약 3% 내지 약 60%일 수 있다. 추출 효율에 따라, 발효 배지 중의 부탄올의 수성상 타이터는, 예를 들어, 약 5 g/L 내지 약 85 g/L, 약 10 g/L 내지 약 40 g/L, 약 10 g/L 내지 약 20 g/L, 약 15 g/L 내지 약 50 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 60 g/L일 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 부분적으로는, 발효 배지로부터 유독한 부탄올 산물을 수거하고, 이에 의해 그 수준을 미생물에 유독한 수준 미만으로 유지함으로써, 추출 발효 방법으로 더 높은 부탄올 타이터를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
원위치 추출 발효의 회분식 모드에서는, 소정 부피의 유기 추출제를 발효 용기에 첨가하고, 공정 중에 추출제를 제거하지 않는다. 이 모드는, 발효 배지 중의 저해성 부탄올 산물의 농도를 최소화하기 위해 더 큰 부피의 유기 추출제를 필요로 한다. 결과적으로, 발효 배지의 부피는 더 적고, 생산되는 산물의 양은 연속 모드를 사용하여 얻어지는 것보다 더 적다. 예를 들어, 회분식 모드에서 추출제의 부피는, 일 실시 형태에서는 발효 용기 작업 부피의 20% 내지 약 60%일 수 있고, 다른 실시 형태에서는 약 30% 내지 약 60%일 수 있다.
유기 추출제와 동시에 기체 스트리핑(나타내지 않음)을 사용하여 발효 배지로부터 산물 알코올을 수거할 수 있다.
이후에 기술되는 도 4 및 5의 실시 형태에 나타낸 바와 같이, 일부 실시 형태에서는, 2상 혼합물의 분리가 발효 용기 내에서 일어날 수 있다. 특히 원위치 추출 발효의 연속 모드에서, 일 실시 형태에서는, 추출제(28)가 발효 용기(30) 내로 도입되어 그 안에 2상 혼합물이 얻어질 수 있으며, 알코올-함유 유기-상 스트림(36)은 발효 용기(30)로부터 직접 나온다. 수성상 스트림(34) 또한 발효 용기(30)로부터 직접 나오거나, 임의의 나머지 산물 알코올의 제거를 위해 처리되어 재사용되거나, 폐기되고 새로운 발효 배지로 대체될 수 있다. ISPR 추출제에 의한 알코올 산물의 추출은, 발효 브로스로부터 미생물(32)을 제거하거나 제거하지 않고 실행할 수 있다. 여과 또는 원심분리를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 수단에 의해 발효 브로스로부터 미생물(32)을 제거할 수 있다. 예를 들어, 수성상 스트림(34)은 효모와 같은 미생물(32)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 원심분리기(나타내지 않음) 내에서 수성상 스트림으로부터 미생물(32)을 용이하게 분리할 수 있다. 그 후에 미생물(32)을 발효 용기(30)로 재사용할 수 있으며, 이는 시간의 경과에 따라 알코올 산물의 생산 속도를 증가시킴으로써 알코올 생산 효율의 증가를 유발할 수 있다.
원위치 추출 발효의 연속 모드에서 추출제의 부피는, 일 실시 형태에서는 발효 용기 작업 부피의 약 3% 내지 약 50%, 다른 실시 형태에서는 약 3% 내지 약 30%, 다른 실시 형태에서는 3% 내지 약 20%; 및 다른 실시 형태에서는 3% 내지 약 10%일 수 있다. 산물이 반응기로부터 계속해서 수거되기 때문에, 더 작은 부피의 추출제를 필요로 하여 더 큰 부피의 발효 배지의 사용이 가능해진다.
원위치 추출 발효의 대안으로서, 발효 용기(30)의 다운스트림의 발효 브로스로부터 산물 알코올을 추출할 수 있다. 이러한 경우에, 발효 브로스를 발효 용기(30)로부터 수거하여 용기(35) 내로 도입할 수 있다. 그 후에, 추출제(28)를 용기(35)에 도입하고 발효 브로스와 접촉시켜 용기(35) 내에 2상 혼합물(39)을 얻을 수 있으며, 이는 그 후에 유기상(36) 및 수성상(34)으로 분리된다. 대안적으로, 용기(35)에 도입하기 전에 별도의 용기(나타내지 않음) 내에서 발효 브로스에 추출제(28)를 첨가할 수 있다.
지방산 추출제(28)의 산물 알코올에 대한 분배 계수는 오일(26)의 산물 알코올에 대한 분배 계수보다 크다. 예를 들어, 공급원료(12)가 옥수수인 경우, 옥수수 오일(26)(발효 브로스 내에 존재한다면)의 산물 알코올에 대한 분배 계수는 약 0.28 미만일 수 있는 한편, 옥수수 오일(26) 유래의 지방산 추출제(28)의 분배 계수는 약 0.28 이상일 수 있다. 일 실시 형태에서, 부탄올과 같은 산물 알코올에 대한 지방산 추출제(28)의 분배 계수는 약 1 이상, 다른 실시 형태에서는 약 2 이상, 다른 실시 형태에서는 약 2.5 이상, 다른 실시 형태에서는 약 2.75 이상, 및 다른 실시 형태에서는 약 3 이상이다. 따라서, 공급원료의 오일 성분의 제거는, ISPR 추출제의 분배 계수의 저하에 대한 위협을 감소시킴에 의해서뿐 아니라, 오일 자체에 분배되는 것보다 수성상으로부터 산물 알코올이 더 많이 분배될 수 있는 지방산 추출제의 생산을 위한 원재료로서의 역할을 함으로써, 추출 발효에서 산물 알코올 생산의 효율을 증가시킨다. 또한, 공급원료(12) 중의 오일(26) 유래의 지방산 추출제(28)를 단독으로, 또는 외인성 추출제(예를 들어, 외부에서 공급된 올레일 알코올)와 조합하여 사용함으로써, 외인성 추출제와 연계된 비용을 감소시키거나 제거할 수 있다.
또한, 지방산 추출제(28)가 유리 지방산을 포함하는 경우에, 발효 용기(30) 내의 미생물(32)에 의한 글루코스의 소비 속도는, 이러한 유리 지방산이 없을 때보다 이러한 유리 지방산이 있을 때 더 높을 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시 형태에서는, 유리 지방산을 갖는 지방산 추출제와 발효 브로스를 접촉시킬 수 있으며, 이에 의해, 유리 지방산(예를 들어, 올레일 알코올)이 없는 ISPR 추출제를 추출 발효에 사용하는 경우의 글루코스 흡수에 비해 유리 지방산이 미생물(32)에 의한 글루코스 흡수를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 2의 표 1에 예시된 바와 같이, 추출 발효에 지방산 추출제로서 사용되는 지방 아미드/지방산 혼합물은, 올레일 알코올을 추출제로서 사용하는 경우에 비해, 사카로마이세스 부탄올로겐(Saccharomyces butanologen)에 의한 글루코스 흡수의 더 높은 속도를 제공할 수 있다. 미생물 성장 속도 및 글루코스 소비를 개선하기 위해 유리 지방산이 공정 중의 단계에서 생산되고 발효 용기 내의 미생물 배양물과 접촉되는, 발효 공정으로부터 산물 알코올을 생산하는 방법은, 2010년 7월 28일자로 출원된, 동시 계속 중이며 공통으로 소유된 미국 가출원 제61/368,451호에 기술되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 그에 대한 참고로 포함된다.
당업자에게 자명할 바와 같이, 일부 실시 형태에서는, 발효 용기(30) 내에서의 동시 당화 및 발효가 분리기(20)와 발효 용기(30) 사이의 별도의 당화 용기(60)로 대체되도록 도 1의 시스템 및 공정을 개질할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 예를 들어, 도 2의 실시 형태에 나타낸 바와 같이, 분리기(20)와 액화 용기(10) 사이에 위치하는 별도의 당화 용기(60) 내에서 당화가 일어날 수 있다. 효소(38)를 수용하는 별도의 당화 용기(60)가 포함되고 오일 스트림(26)이 액화, 당화 공급원료 스트림(62)으로부터 분리되는 점을 제외하고는, 도 2는 도 1과 실질적으로 동일하다. 공급원료 슬러리(16)를 글루코아밀라아제와 같은 효소(38)와 함께 당화 용기(60) 내로 도입함으로써, 슬러리(16) 중의 올리고당류 형태의 당을 단당류로 분해할 수 있다. 액화, 당화 공급원료 스트림(62)은 당화 용기(60)에서 나와 분리기(20) 내로 도입된다. 공급원료 스트림(62)은 단당류, 오일, 및 공급원료 유래의 용해되지 않은 고체를 포함한다. 분리기(20)에서는, 공급원료 스트림(62)이 오일 스트림(26) 및 실질적으로 수성인 스트림(23)으로 분리되고, 이는 발효 용기(30)에 공급된다. 나타낸 실시 형태에서, 수성 스트림(23)은 용해되지 않은 고체를 포함한다. 대안적으로, 도 1의 실시 형태와 관련하여 기술된 바와 같이, 고체는 분리기(20) 내에서 습윤 케이크(24)로서 제거될 수 있다. 분리기(20)로부터 배출된 오일 스트림(26)은 소정량의 글리세라이드, 특히 트라이글리세라이드를 가지며, 반응 용기(40) 내에서 이를 하나 이상의 물질(42)과 접촉시킨다. 물질(42)은 오일(26)로부터의 글리세라이드의 적어도 일부를 지방산 추출제(28)로 화학적으로 전환하며, 이는 발효 용기(30)에 공급된다. 도 2의 실시 형태의 나머지 공정 운전은 도 1과 동일하므로, 다시 상세하게 기술하지 않을 것이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 예를 들어, 도 3의 실시 형태에 나타낸 바와 같이 추출 발효는, 공급원료(12)의 바이오매스 공급원과 동일하거나 상이한 바이오매스 공급원으로부터 유래되나 공급원료(12)에 함유된 실제 오일로부터 유래되지 않는 지방산 추출제(28')를 채용할 수 있다. 예를 들어, 공급원료(12)가 옥수수인 경우에, 지방산 추출제(28')는 옥수수 오일로부터 유래될 수 있으나, 추출제(28')를 생산하는 옥수수 오일은 도 1의 실시 형태에 제공되는 바와 같이 공급원료(12)에 함유되고 반응 용기(40)에 분리되는 옥수수 오일이 아니다. 다른 예로서, 지방산 추출제(28')는 바이오매스 공급원으로서의 대두콩(또는 대두)으로부터 유래될 수 있는 한편, 공급원료(12)의 바이오매스 공급원은 옥수수이다. 당업자에게 자명할 바와 같이, 추출제(28') 대 공급원료(12)를 위한 상이한 바이오매스 공급원의 임의의 가능한 조합을 사용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 지방산 추출제(28')는 임의의 천연 오일로부터 유래되므로, 바이오매스 공급원 또는 대안적으로 동물 공급원으로부터 유래될 수 있다.
도 3의 실시 형태에서는, 액화 수성 스트림(22)을 발효 용기(30)에 당화 효소(38) 및 미생물(32)과 함께 공급함으로써, 동시 당화 및 발효(SSF)에 의해 산물 알코올을 생산한다. 일부 실시 형태에서는, 예를 들어, 도 2의 실시 형태와 관련하여 기술된 것과 같은 별도의 용기 내에서 당화가 일어날 수 있다. 일부 실시 형태에서, 바람직하게는, 액화 수성 스트림(22)은 적어도 분리기(20)를 통해 제거되는 오일(26)을 가졌으며(도 1 참조), 일부 실시 형태에서는, 발효 용기(30)에 도입되기 전에 습윤 케이크(24)로서 제거되는 용해되지 않은 고체 또한 갖는다(도 1 참조). 오일(26')의 적어도 일부를 지방산 추출제(28')로 화학적으로 전환하기 위한 물질(들)(42)과 함께 식물-유래의 오일과 같은 천연 오일을 스트림(26')으로서 반응 용기(40) 내로 도입한다. 오일 스트림(26')은 공급원료 슬러리(16) 업스트림으로부터 유래된 오일(26)이 아니다(도 1 참조). ISPR을 위해 지방산 추출제(28')로 화학적으로 전환될 수 있는 임의의 식물-유래의 오일 또는 다른 천연 오일이 오일 스트림(26')의 공급원일 수 있다. 그 후에, 반응 용기(40)로부터의 지방산 추출제(28')를 발효 용기(30)에 도입함으로써, 발효 용기 내에 존재한다면 오일(26') 내로 산물 알코올이 분배될 것보다 더 큰 정도로, 산물 알코올을 지방산 추출제(28') 내로 분배한다.
따라서, 일부 실시 형태에서는, 공급원료(12)를 통해 공정에 원래 도입된 동일한 오일(26)이 아닌 식물-유래의 오일(26')로부터 얻어진 지방산 추출제(28')를 사용하여 산물 알코올을 추출한다. 임의로, 수성상으로부터 산물 알코올을 우선적으로 분배하기 위하여, 하나 이상의 추가의 추출제(29)를 발효 용기(30) 내로 도입할 수 있다. 하나 이상의 추가의 추출제(29)는 공정 중에 생산된 것이 아니고/아니거나 다른 지방산 추출제일 수 있는 외인성으로 공급된 올레일 알코올과 같은 외인성 추출제일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이러한 다른 지방산 추출제(29)는, 발효 용기 공급 스트림(22) 및 오일 스트림(26')의 바이오매스 공급원 중 어느 하나와 동일하거나 상이한 바이오매스 공급원으로부터 유래된 오일로부터 생산될 수 있다.
발효 용기(30)으로 다시 공급되는 것으로 나타내지 않은 수성상(34)을 제외하고는, 도 3의 실시 형태의 나머지 공정 운전은 도 1 및 2와 동일하므로, 다시 상세하게 기술하지 않을 것이다. 그러나, 본 명세서에 제공되는 임의의 실시 형태에서, 수성상(34)의 전부 또는 일부가 재사용되고/되거나, 폐기되고/되거나, 도 1과 관련하여 상기한 바와 같이 산물 알코올을 수거하기 위해 추가로 처리할 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 공급원료(12) 유래의 오일은 분리기(20)에서 분리되는 것이 아니라, 대신에 예를 들어, 액화 전 또는 액화 중의 공급원료(12) 내에서, 슬러리(16) 내에서, 또는 당화 스트림(62) 내에서 지방산 추출제로 원위치에서 화학적으로 전환된다(도 2 참조). 예를 들어, 도 4의 실시 형태에서, 공급원료(12) 중의 전분을 가수분해하여 액화 공급원료를 생산하기 위하여, 공급원료(12)는 적절한 효소(14), 예를 들어, 알파-아밀라아제와 함께 액화 용기(10)에 공급된다. 공급원료(12)의 액화 전에, 액화 중에, 또는 액화 후에, 공급원료(12) 중에 존재하는 오일을 지방산 추출제(28)로 화학적으로 전환하기 위한 하나 이상의 물질(42) 또한 액화 용기(10) 내로 도입된다. 효소(14)의 첨가 전에, 또는 첨가 후에 물질(42)을 액화 용기(10)에 도입할 수 있으며, 공급원료(12)의 액화 전에, 액화 중에, 또는 액화 후에 공급원료(12) 중의 오일이 추출제(28)로 전환될 수 있다. 어느 경우이든, 공급원료(12) 중의 오일이 지방산 추출제(28)로 전환되어, 2상 스트림(18)이 액화 용기(10)로부터 나온다. 2상 스트림(18)은, 액화 수성상(22)을 형성하는 당, 물, 및 용해되지 않은 고체와 더불어 지방산 추출제(28) 양자 모두를 포함한다. 지방산 추출제가 지방산을 포함하는 일부 실시 형태에서, 2상 스트림(18)의 수성상(22)은 오일 중의 글리세라이드가 지방산으로 전환됨으로써 생성된 글리세롤(글리세린)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이러한 글리세롤은, 존재한다면, 발효 용기(30) 내로 도입되기 전에 스트림(18)으로부터 제거될 수 있다.
도 4를 참조하면, 2상 스트림(18)(즉, 스트림(22, 28))은 발효 용기(30) 내에서 발효 브로스와 접촉하여 2상 혼합물을 형성한다. 발효 용기(30) 내에서, SSF에 의해 생산된 산물 알코올은 지방산 추출제(28)를 포함하는 유기상 내로 분배된다. 대안적으로, 일부 실시 형태에서는, 도 2와 연관하여 논의된 바와 같이 별도의 당화 용기를 포함하도록 공정을 개질할 수 있다. 2상 혼합물의 분리는 발효 용기(30) 내에서 일어나며, 이에 의해 알코올-함유 유기상 스트림(36) 및 수성상 스트림(34)이 발효 용기(30)로부터 직접 나온다. 대안적으로, 2상 혼합물의 분리는 도 1 내지 3의 실시 형태에 제공된 바와 같이 별도의 용기(35) 내에서 수행될 수 있다. 임의로, 하나 이상의 추가의 추출제(29)를 발효 용기(30) 내로 도입하여 수성상으로부터 산물 알코올이 우선적으로 분배되는 유기상을 형성시킬 수 있다. 도 4의 실시 형태의 나머지 공정 운전은 앞서 기술된 도면과 동일하므로, 다시 상세하게 기술하지 않을 것이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서는, 공급원료(12) 중에 존재하는 바이오매스 오일을 알코올성 발효 후의 단계에서 공정 스트림으로부터 분리할 수 있다. 발효-후 분리된 오일을 그 후에 지방산 추출제로 전환하여 ISPR 추출제로서 발효 용기 내에 도입할 수 있다. 예를 들어, 도 5의 실시 형태에서는, 공급원료(12)를 액화하여 공급원료 유래의 오일(26)을 포함하는 공급원료 슬러리(16)를 생산한다. 공급원료 슬러리(16)는 또한 공급원료로부터의 용해되지 않은 고체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 원심분리기와 같은 분리기(나타내지 않음)를 통해 용해되지 않은 고체를 슬러리(16)로부터 분리할 수 있다. 오일(26)을 함유하는 공급원료 슬러리(16)를, 당화 효소(38) 및 미생물(32)을 포함하는 발효 브로스를 함유하는 발효 용기(30)에 직접 도입한다. 산물 알코올은 SSF에 의해 발효 용기(30) 내에서 생산된다. 대안적으로, 일부 실시 형태에서는, 도 2와 연관하여 논의된 바와 같이 별도의 당화 용기를 포함하도록 공정을 개질할 수 있다.
ISPR 추출제(29)를 발효 용기(30)에 도입하여 2상 혼합물을 형성시키고, 산물 알코올을 ISPR 추출제(29)의 유기상 내로 분배함으로써 수거한다. 오일(26) 또한 유기상 내로 분배된다. ISPR 추출제(29)는 하나 이상의 지방산 추출제 및/또는 천연 오일로부터 유래되지 않은 외인성 유기 추출제(예를 들어, 올레일 알코올)일 수 있다. 추출제(29)가 지방산 추출제라면, 추출제(29)는 공급원료(12)를 통해 공정에 원래 도입된 동일한 오일이 아닌 식물-유래의 오일과 같은 천연 오일로부터 생산된 지방산 추출제(28')(도 3 참조)일 수 있다.
2상 혼합물의 분리는 발효 용기(30) 내에서 일어나며, 이에 의해 알코올-함유 유기상 스트림(36) 및 수성상 스트림(34)이 발효 용기(30)로부터 직접 나온다. 대안적으로, 2상 혼합물의 분리는 도 1 내지 3의 실시 형태에 제공된 바와 같이 별도의 용기(35) 내에서 수행될 수 있다. 오일(26)을 포함하는 유기상 스트림(36)을 분리기(50) 내로 도입하여 추출제(29)로부터 산물 알코올(54)을 회수한다. 생성된 알코올-저함유 추출제(27)는 회수된 추출제(29) 및 오일(26)을 포함한다. 오일(26)을 포함하는 추출제(27)를 반응 용기(40) 내로 도입하고, 오일(26)의 적어도 일부를 지방산 추출제(28)로 화학적으로 전환하는 하나 이상의 물질(42)(예를 들어, 반응물 및/또는 용매)과 접촉시킨다.
지방산 추출제(28)를 포함하는 추출제(27)를 그 후에 발효 용기(30) 내로 다시 재사용할 수 있다. 이러한 재사용된 추출제 스트림(27)은 별도의 스트림이거나 새로운 보충 추출제 스트림(29)과 조합된 스트림일 수 있다. 이어지는 알코올-함유 유기상(36)의 회수는, 이때 오일(26) 및 산물 알코올에 부가하여 지방산 추출제(28) 및 ISPR 추출제(29)를 포함할 수 있다. 그 후에 유기상(36)을 처리하여 산물 알코올을 회수하고, 오일을 반응시켜 지방산 추출제를 형성시키고, 생성된 알코올-저함유 지방산 추출제(28) 및 알코올-저함유 추출제(29)로서 발효 용기(30) 내로 다시 재사용할 수 있다. 일부 실시 형태에서는, 시간이 경과하면서 발효 공정이 운전됨에 따라 추출제(29)의 사용을 단계적으로 폐지할 수 있으며, 이는 산물 알코올을 추출하기 위한 충분한 양의 지방산 추출제(28)를 공정 자체가 생산할 수 있기 때문이다. 따라서, ISPR 추출제는 반응 용기(40)를 통해 보충 ISPR 추출제로서 재사용된 추출제(27) 및 지방산 추출제(28)일 수 있다.
대안적으로, 일부 실시 형태에서는, 분리기(50)에서의 산물 알코올 회수(54) 전에 오일(26)을 포함하는 유기상 스트림(36)을 반응 용기(40) 내로 도입할 수 있다. 이러한 실시 형태에서는, 유기상 스트림(36)을 반응 용기(50)에 도입하고 지방산 추출제(28)를 생산하기 위한 하나 이상의 물질(42)과 접촉시킬 수 있다. 그 후에, 지방산 추출제(28)를 포함하는 생성된 유기상 스트림(36)을 분리기(50)에 도입하여 산물 알코올(54)을 회수할 수 있으며, 생성된 알코올-저함유 추출제를 그 후에 지방산 추출제(28)를 포함하는 추출제 스트림(27)으로서 발효 용기(30) 내로 다시 재사용할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서는, 지방산 추출제(28)를 생산하기 위한 물질(들)(42)과 오일(26)을 접촉시키기 전에 유기상 스트림(36) 또는 추출제 스트림(27)으로부터 오일(26)을 분리할 수 있다. 그 후에 지방산 추출제(28)를 발효 용기(30), 상이한 발효 용기(예를 들어, 알코올 제조 공장에서 발효 용기(30)와 병렬 또는 직렬로 운전됨)에 공급되는 ISPR 추출제로서 사용하거나, 이후에 사용하기 위해 저장할 수 있다.
따라서, 도 1 내지 5는 발효 공정 및 바이오매스-유래의 오일(26)로부터 생산되는 지방산 추출제(28), 및 추출 발효에서 산물 알코올을 수거하기 위해 사용될 수 있는 식물-유래의 오일(26')과 같은 천연 오일로부터 생산되는 지방산 추출제(28')를 포함하는 방법 및 시스템의 다양한 비한정적인 실시 형태를 제공한다. 이들 지방산 추출제(28 및 28')는 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 트라이글리세라이드는 하이드록실화되거나 알콕실화(예를 들어, 메톡실화, 에톡실화)될 수 있다. 본 명세서에 기술된 천연 오일로부터 지방산 추출제로의 글리세라이드의 화학적 전환은 당업계에 공지된 임의의 반응 스킴을 사용하여 수행할 수 있다. 옥수수 오일과 같은 식물-유래의 오일과 관련하여, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 오일(26 또는 26')로서의 옥수수 오일을 다양한 반응물 및 용매(42)와 접촉시켜 하기 반응식 I에 나타낸 하이드록실화를 달성함으로써 지방산 추출제(28 또는 28')로서의 하이드록실화 트라이글리세라이드를 생산할 수 있다(세부 사항에 관하여 하기 실시예 1 참조):
(I)
Figure pct00001
예를 들어, 문헌[Roe, et al., Am. Oil Chem. Soc. 29:18-22, 1952]에 기술되고 하기 반응식 II에 나타낸 바와 같이, 일부 실시 형태에서는, 오일(26 또는 26')로서의 옥수수 오일 트라이글리세라이드를 반응물(42)로서의 수성 암모늄 하이드록사이드와 반응시켜 지방 아미드 및 지방산을 얻을 수 있으며, 이들을 함께 또는 별도로 지방산 추출제(28 또는 28')로서 사용할 수 있다:
(II)
Figure pct00002
일부 실시 형태에서, 수성 암모늄 하이드록사이드는 약 28 중량% 암모니아수이다. 일부 실시 형태에서, 반응식 (II)에 따라 생산된 옥수수 오일 지방 아미드와 옥수수 오일 지방산의 혼합물을 사용하여 단일 지방산 추출제(28 또는 28')를 생산할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지방 아미드와 지방산의 혼합물은 리놀레아미드, 리놀레산, 올레아미드, 올레산, 팔미트아미드, 팔미트산, 스테아르아미드, 및 스테아르산을 포함할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 이러한 혼합물은 약 37 중량% 리놀레아미드, 약 18% 리놀레산, 약 19 중량% 올레아미드, 약 9 중량% 올레산, 약 8.7 중량% 팔미트아미드, 약 4.3 중량% 팔미트산, 약 1.2 중량% 스테아르아미드, 및 약 0.7 중량% 스테아르산으로 구성될 수 있다. 다른 조성물 양이 가능하며, 사용되는 옥수수 오일 중의 리놀레산, 올레산, 팔미트산, 및 스테아르산의 자연적으로 나타나는 양에 의존할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 올레산 함량이 예를 들어 최대 약 65 중량%일 수 있는, 오일(26 또는 26')로서의 고-올레익 옥수수 오일은, 올레산 함량이 약 24 중량%인 보통의 옥수수 오일을 사용하는 경우에 생산될 것보다 올레아미드 및 올레산 함량이 높은 혼합물을 반응식 (II)의 반응에 따라 생산할 것으로 예상될 것이다. 일부 실시 형태에서는, 반응식 (II)에 따라 생산되는 옥수수 오일 지방 아미드 및 옥수수 오일 지방산을 지방산과 혼합하여 지방산 추출제(28 또는 28') 중의 지방 아미드 대 지방산의 비율을 변동시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지방 아미드 대 지방산의 혼합물은 약 2:1 내지 약 1:2 혼합물의 비율일 수 있다.
예를 들어, 문헌[Kohlhase, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 48:265-270, 1971]에 기술된 바와 같이, 일부 실시 형태에서는, 촉매로서의 암모늄 아세테이트와 함께 반응물로서의 무수 암모니아를 물질(42)로 사용하여 오일(26 또는 26')로서의 옥수수 오일로부터 지방산 추출제(28 또는 28')로서의 순수한 옥수수 오일 지방 아미드를 합성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 순수한 옥수수 오일 지방 아미드는 리놀레아미드, 올레아미드, 팔미트아미드, 및 스테아르아미드를 포함할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 순수한 옥수수 오일 지방 아미드는 약 55 중량% 리놀레아미드, 약 28 중량% 올레아미드, 약 13 중량% 팔미트아미드, 및 약 2 중량% 스테아르아미드로 구성될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 다른 조성물 양이 가능하며, 사용되는 옥수수 오일 중의 리놀레산, 올레산, 팔미트산, 및 스테아르산의 자연적으로 나타나는 양에 의존할 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시 형태에서, 지방산 추출제(28 또는 28')는 화학식 R(C=O)N(R')(R")의 지방 아미드를 포함할 수 있으며, 여기서, R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, R' 및 R"은 하나 이상의 하이드록실 기를 임의로 함유하는 C1 내지 C6 알킬 기 및 수소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시 형태에서는, 예를 들어 하기 반응식 III의 반응에 따라, 물질(42)로서 NaOH 및 물을 사용하는 염기 가수분해에 의해(예를 들어, 하기 실시예 4 참조), 오일(26 또는 26')로서의 옥수수 오일로부터 지방산 추출제(28 또는 28')로서의 옥수수 오일 지방산을 합성할 수 있다:
(III)
Figure pct00003
일부 실시 형태에서는, 순수한 옥수수 오일 지방 아미드와 순수한 옥수수 오일 지방산을 혼합하여 단일 지방산 추출제(28 또는 28')를 생산할 수 있다. 지방 아미드 대 지방산의 이러한 혼합물은 2:1 혼합물일 수 있으며, 다른 실시 형태에서는, 예를 들어 1:2일 수 있다.
일부 실시 형태에서는, 예를 들어 하기 반응식 IV의 반응에 따라, 물질(42)로서 테트라하이드로퓨란(THF) 및 LiAlH4 를 사용하는 환원에 의해(예를 들어, 하기 실시예 3 참조), 오일(26 또는 26')로서의 옥수수 오일로부터 지방산 추출제(28 또는 28')로서의 지방 알코올을 생산할 수 있다:
(IV)
Figure pct00004
일부 실시 형태에서는, 오일(26 또는 26')로서의 옥수수 오일을 물질(42)로서의 메탄올 및 산 촉매와 접촉시켜 지방산 추출제(28 또는 28')로서의 지방산 에스테르를 생산할 수 있다. 예를 들어, 하기 반응식 V의 반응에 따라, 황산의 존재 하에 8개 탄소 이하의 알코올을 포함하나 이에 한정되지 않는 알코올과 옥수수 오일을 반응시켜 지방산 에스테르를 수득할 수 있다(예를 들어, 하기 실시예 4 참조):
(V)
Figure pct00005
일부 실시 형태에서는, 예를 들어 하기 반응식 VI의 반응에 따라, 지방산 메틸 에스테르(FAME: fatty acid methyl ester)를 생산하고(상기 반응식 V 참조) FAME을 추가의 물질(42)로서의 에틸렌 글리콜과 추가로 반응시킴으로써(예를 들어, 하기 실시예 5 참조), 오일(26 또는 26')로서의 옥수수 오일을 지방산 추출제(28 또는 28')로서의 옥수수 오일 에틸렌 글리콜 에스테르(FAGE)로 전환할 수 있다:
(VI)
R-(C=O)-OMe + HO-CH2CH2 -OH → R-(C=O)-O-CH2CH2 -OH
일부 실시 형태에서, 지방 알코올은 하이드록실화될 수 있으며 추출제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 반응식 VII에 나타낸 바와 같이, 지방 알코올을 퍼아세트산과 반응시킨 후에 수성 산과 반응시켜 쇄를 따라 이중 결합을 하이드록실화할 수 있다(예를 들어, 실시예 8 참조):
Figure pct00006
일부 실시 형태에서, 추출제는 액체 또는 고체, 예를 들어 비드일 수 있다. 비드와 같이 고체 형태로 이용가능한 추출제는 제조 공정 중에 용이하게 취급할 수 있을 것이다. 또한, 예를 들어, 기체 스트리핑, 다른 용매 중의 용해, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적용가능한 방법에 의해 이러한 추출제로부터 산물 알코올(예를 들어, 부탄올)을 회수할 수 있을 것이다.
도 1 내지 5와 관련하여 기술된 임의의 전기 실시 형태를 포함하는 일부 실시 형태에서, 발효 용기(30) 내의 발효 브로스는 하나 이상의 발효성 탄소 공급원으로부터 부탄올로의 생합성 경로를 통해 부탄올을 생산하도록 유전적으로 개질된(즉, 유전적으로 조작된) 하나 이상의 재조합 미생물(32)을 포함한다. 특히, 재조합 미생물은 적합한 탄소 기질을 함유하는 발효 브로스 중에 성장할 수 있다. 추가의 탄소 기질은, 프럭토스와 같은 단당류; 락토스 말토스, 또는 수크로스와 같은 올리고당류; 전분 또는 셀룰로스와 같은 다당류; 또는 그의 혼합물, 및 치즈 유청 투과액(cheese whey permeate), 옥수수 침지액, 사탕무 몰라세, 및 보리 맥아와 같은 재생가능한 공급원료로부터의 정제하지 않은 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 탄소 기질은 에탄올, 락테이트, 숙시네이트 또는 글리세롤을 포함할 수 있다.
부가적으로 탄소 기질은 또한 일원자-탄소 기질, 예를 들어 이산화탄소 또는 메탄올일 수 있으며, 이에 대해서는 주요 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 입증되었다. 메틸영양(methylotrophic) 유기체는 또한, 일원자 탄소 및 이원자 탄소 기질에 부가하여 다수의 다른 탄소 함유 화합물, 예를 들어 메틸아민, 글루코사민, 및 다양한 아미노산을 대사 활성에 이용하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 메틸영양 효모는 메틸아민으로부터의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Bellion, et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32, Editor(s): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK]). 마찬가지로, 다양한 종의 칸디다는 알라닌 또는 올레산을 대사시킬 것이다(문헌[Sulter, et al., Arch. Microbiol. 153:485-489, 1990]). 그러므로, 본 발명에 이용되는 탄소 공급원은 광범위한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있으며 유기체의 선택에 의해서만 한정되는 것으로 생각된다.
상기 언급한 탄소 기질 및 그의 혼합물 모두가 적합한 것으로 고려되지만, 일부 실시 형태에서, 탄소 기질은 글루코스, 프럭토스 및 수크로스, 또는 C5 당을 사용하도록 개질된 효모 세포를 위한 자일로스 및/또는 아라비노스와 같은 C5 당과 이들과의 혼합물이다. 수크로스는 재생가능한 당 공급원, 이를 테면 사탕수수, 사탕무, 카사바(cassava), 단 수수(sweet sorghum) 및 이들의 혼합물로부터 유래될 수 있다. 글루코스 및 덱스트로스는 옥수수, 밀, 호밀, 보리, 귀리 및 이들의 혼합물과 같은 곡물을 비롯한 전분 계의 공급원료의 당화를 통하여 재생가능한 곡물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 또한, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007/0031918 A1호에 기술된 바와 같이, 발효성 당은 전처리 및 당화의 공정을 통해 재생가능한 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 바이오매스로부터 유래될 수 있다. 적절한 탄소 공급원(수성 스트림(22)으로부터의)에 부가하여, 발효 브로스는 다이하이드록시산 탈수효소(DHAD: dihydroxyacid dehydratase)를 포함하는 효소적 경로의 촉진 및 배양물의 성장에 적합한, 당업자에게 공지된 적합한 미네랄, 염, 보조인자, 완충제, 및 다른 성분을 함유해야 한다.
생합성 경로를 통해 부탄올을 생산하는 재조합 미생물은 클로스트리디움(Clostridium), 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 시겔라(Shigella), 로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 알칼리게네스(Alcaligenes), 클렙시엘라, 파에니바실러스(Paenibacillus), 아스로박터(Arthrobacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia), 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 구성원을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 재조합 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 락토바실러스 플란타룸(Escherichia coli), 및 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, 재조합 미생물은 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 스키조사카로마이세스, 덱케라(Dekkera), 토룰롭시스(Torulopsis), 브레타노마이세스(Brettanomyces), 및 칸디다의 일부 종으로부터 선택된 크랩트리-양성(crabtree-positive) 효모이다. 크랩트리-양성 효모의 종은 사카로마이세스 세레비시아, 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 미키타(Saccharomyces mikitae), 사카로마이세스 파라독서스(Saccharomyces paradoxus), 자이고사카로마이세스 로우시(Zygosaccharomyces rouxii), 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 미생물을 사용하는 발효를 이용하는 부탄올의 생산과 더불어, 부탄올을 생산하는 미생물이, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2009/0305370호에 개시되고 공지되어 있다. 일부 실시 형태에서, 미생물은 부탄올 생합성 경로를 포함한다. 적합한 아이소부탄올 생합성 경로는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007/0092957호 참조). 일부 실시 형태에서는, 경로의 기질 대 산물 전환을 촉매하는 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 폴리펩티드가 미생물 내의 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 실시 형태에서는, 경로의 기질 대 산물 전환을 촉매하는 모든 폴리펩티드가 미생물 내의 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 실시 형태에서, 미생물은 피루베이트 탈탄산효소 활성의 감소 또는 제거를 포함한다. 피루베이트 탈탄산효소 활성이 실질적으로 없는 미생물은, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2009/0305363호에 기술되어 있다.
실시예에 사용된 것들을 포함하여, 소정의 균주의 작제를 본 명세서에 제공한다.
사카로마이세스 세레비시아 균주 BP1064 및 아이소부탄올로겐 BP1083(NGCI-070)의 작제
균주 BP1064는 CEN.PK 113-7D(CBS 8340; CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures) 진균류 생물다양성 센터, 네덜란드)로부터 유래하며, 하기의 유전자의 결실을 함유한다: URA3, HIS3, PDC1, PDC5, PDC6 및 GPD2. BP1064를 플라스미드 pYZ090(서열 번호 1, 그의 작제는 2009년 9월 29일자로 출원된, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제61/246,844호에 기술됨) 및 pLH468(서열 번호 2)로 형질전환시켜 아이소부탄올로겐 균주 NGCI-070(BP1083)을 생성시켰다.
전체 암호화 서열이 완전히 제거되는 결실을 형질전환체의 선택을 위한 G418 저항성 마커 또는 URA3 유전자 중 어느 하나, 및 표적 유전자의 상동성 업스트림 및 다운스트림의 영역을 함유하는 PCR 단편과의 상동성 재조합에 의해 생성하였다. loxP 부위가 플랭킹된 G418 저항성 마커를 Cre 재조합효소(recombinase)를 사용하여 제거하였다. 스카리스 결실을 생성시키기 위하여, URA3 유전자를 상동성 재조합에 의해 제거하거나, loxP 부위가 플랭킹된다면 Cre 재조합효소를 사용하여 제거하였다.
스카리스 결실 절차는 문헌[Akada, et al., Yeast 23:399-405, 2006]으로부터 채용하였다. 일반적으로, 각각의 스카리스 결실을 위한 PCR 카세트를 오버랩핑 PCR에 의하여 4개의 단편, 즉, A-B-U-C를 조합함으로써 만들었다. 프로모터(URA3 유전자의 250 bp 업스트림) 및 터미네이터(URA3 유전자의 150 bp 다운스트림)와 함께 고유 CEN.PK 113-7D URA3 유전자로 이루어진 PCR 카세트는 선택가능한/반대-선택가능한 마커, URA3(단편 U)을 함유하였다. 각각 500 bp 길이의 단편 A 및 C는 표적 유전자의 500 bp 인접 업스트림(단편 A) 및 표적 유전자의 3' 500 bp(단편 C)에 해당한다. 단편 A 및 C를 상동성 재조합에 의하여 염색체 내로의 카세트의 통합을 위하여 사용하였다. 단편 B(500 bp 길이)는 표적 유전자의 500 bp 인접 다운스트림에 해당하며, 단편 B에 해당하는 서열의 직접 반복이 염색체 내로의 카세트의 통합 시에 생성되었기 때문에, 상동성 재조합에 의한 염색체로부터의 URA3 마커 및 단편 C의 절제(excision)를 위해 사용하였다. PCR 산물 ABUC 카세트를 사용하여, URA3 마커를 먼저 상동성 재조합에 의하여 염색체 내로 통합시킨 다음, 염색체로부터 절제하였다. 초기의 통합에 의하여 3' 500 bp를 제외한 유전자가 결실되었다. 절제 시에, 유전자의 3' 500 bp 영역도 또한 결실되었다. 이러한 방법을 사용한 유전자의 통합을 위하여, 통합될 유전자는 단편 A 및 B 사이의 PCR 카세트에 포함시켰다.
URA3 결실
내인성 URA3 암호화 영역을 결실시키기 위하여, ura3::loxP-kanMX-loxP 카세트를 pLA54 주형 DNA(서열 번호 3)로부터 PCR 증폭시켰다. pLA54는 K. 락티스 TEF1 프로모터 및 kanMX 마커를 함유하며, loxP 부위가 플랭킹되어, Cre 재조합효소를 사용한 재조합 및 마커의 제거를 가능하게 한다. 퓨전(Phusion)(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England BioLabs Inc.), 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 BK505 및 BK506(서열 번호 4 및 5)을 사용하여 PCR을 실행하였다. 각 프라이머의 URA3 부분은 URA3 프로모터의 5' 영역 업스트림 및 암호화 영역의 3' 영역 다운스트림으로부터 유래되어, loxP-kanMX-loxP 마커의 통합이 URA3 암호화 영역의 대체를 야기하게 하였다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 PCR 산물을 CEN.PK 113-7D 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 30 ℃에서 G418(100 μg/mL)을 함유하는 YPD 상에서 선택하였다. 형질전환체를 스크리닝하여, 프라이머 LA468 및 LA492(각각 서열 번호 6 및 7)를 사용하는 PCR에 의해 정확한 통합을 확인하고 CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX로 명명하였다.
HIS3 결실
퓨전(등록상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(High Fidelity PCR Master Mix)(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재), 및 젠트라(Gentra)(등록상표) 퓨어진(Puregene)(등록상표) 이스트/백트, 키트(퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여 스카리스 HIS3 결실을 위한 PCR 카세트를 위한 4개의 단편을 증폭시켰다. 프라이머 oBP452(서열 번호 14) 및 HIS3 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일(tail)을 함유하는 프라이머 oBP453(서열 번호 15)로 HIS3 단편 A를 증폭시켰다. HIS3 단편 A의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP454(서열 번호 16), 및 HIS3 단편 U의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP455(서열 번호 17)로 HIS3 단편 B를 증폭시켰다. HIS3 단편 B의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP456(서열 번호 18), 및 HIS3 단편 C의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP457(서열 번호 19)로 HIS3 단편 U를 증폭시켰다. HIS3 단편 U의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP458(서열 번호 20), 및 프라이머 oBP459(서열 번호 21)로 HIS3 단편 C를 증폭시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다. HIS3 단편 A 및 HIS3 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP452(서열 번호 14) 및 oBP455(서열 번호 17)로 증폭시킴으로써, 오버랩핑 PCR에 의해 HIS3 단편 AB를 생성시켰다. HIS3 단편 U 및 HIS3 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP456(서열 번호 18) 및 oBP459(서열 번호 21)로 증폭함으로써, 오버랩핑 PCR에 의해 HIS3 단편 UC를 생성시켰다. 생성된 PCR 산물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(Gel Extraction kit)(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)에서 정제하였다. HIS3 단편 AB 및 HIS3 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP452(서열 번호 14) 및 oBP459(서열 번호 21)로 증폭함으로써, 오버랩핑 PCR에 의해 HIS3 ABUC 카세트를 생성시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX의 수용 세포를 만들고, 프로즌-EZ 이스트 트랜스포메이션 II(상표) 키트(자이모 리서치 코포레이션(Zymo Research Corporation), 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 HIS3 ABUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 30 ℃에서 2% 글루코스로 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해, 프라이머 oBP460(서열 번호 22) 및 oBP461(서열 번호 23)로 his3 녹아웃이 있는 형질전환체를 스크리닝 하였다. 정확한 형질전환체를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX Δhis3::URA3로서 선택하였다.
Δura3 부위로부터의 KanMX 마커 제거 및 Δhis3 부위로부터의 URA3 마커 제거
프로즌-EZ 이스트 트랜스포메이션 II(상표) 키트(자이모 리서치 코포레이션, 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX Δhis3::URA3을 pRS423::PGAL1-cre(서열 번호 66, 미국 가출원 제61/290,639호에 기술됨)로 형질전환시키고, 30℃에서 2% 글루코스로 보충되고 히스티딘 및 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 KanMX 마커를 제거하였다. 1% 갈락토스로 보충된 YP 중에 30℃에서 ~6 시간 동안 형질전환체를 성장시켜 Cre 재조합효소 및 KanMX 마커 절제를 유도하고 회수를 위해 30℃에서 YPD(2% 글루코스) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 분리주를 YPD 중에 밤새 성장시키고 30℃에서 5-플루오로-오로트산(5-FOA, 0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 플레이팅하여 URA3 마커를 상실한 분리주를 선택하였다. 5-FOA 내성 분리주를 성장시키고 YPD 상에 플레이팅하여 pRS423::PGAL1-cre 플라스미드를 제거하였다. YPD+G418 플레이트, 우라실이 결여된 합성 완전 배지 플레이트, 및 히스티딘이 결여된 합성 완전 배지 플레이트 상의 시험 성장(assaying growth)에 의해 KanMX 마커, URA3 마커, 및 pRS423::PGAL1-cre 플라스미드의 상실에 대하여 분리주를 확인하였다. G418에 대하여 감수성이며, 우라실 및 히스티딘에 대한 영양요구성인 정확한 분리주를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3로 선택하고, BP857로 명명하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, Δura3에 대한 프라이머 oBP450(서열 번호 24) 및 oBP451(서열 번호 25) 및 Δhis3에 대한 프라이머 oBP460(서열 번호 22) 및 oBP461(서열 번호 23)을 사용하는 서열분석 및 PCR에 의해, 결실 및 마커 제거를 확인하였다.
PDC6 결실
퓨전(등록상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여, 스카리스 PDC6 결실을 위한 PCR 카세트를 위한 4개의 단편을 증폭시켰다. 프라이머 oBP440(서열 번호 26), 및 PDC6 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP441(서열 번호 27)로 PDC6 단편 A를 증폭시켰다. PDC6 단편 A의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP442(서열 번호 28), 및 PDC6 단편 U의 5' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP443(서열 번호 29)으로 PDC6 단편 B를 증폭시켰다. PDC6 단편 B의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP444(서열 번호 30), 및 PDC6 단편 C의 5' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP445(서열 번호 31)로 PDC6 단편 U를 증폭시켰다. PDC6 단편 U의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP446(서열 번호 32), 및 프라이머 oBP447(서열 번호 33)로 PDC6 단편 C를 증폭시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다. PDC6 단편 A 및 PDC6 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP440(서열 번호 26) 및 oBP443(서열 번호 29)으로 증폭시킴으로써, 오버랩핑 PCR 에 의해 PDC6 단편 AB를 생성시켰다. PDC6 단편 U 및 PDC6 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP444(서열 번호 30) 및 oBP447(서열 번호 33)로 증폭시킴으로써, 오버랩핑 PCR에 의해 PDC6 단편 UC를 생성시켰다. 생성된 PCR 산물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)에서 정제하였다. PDC6 단편 AB 및 PDC6 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP440(서열 번호 26) 및 oBP447(서열 번호 33)로 증폭시킴으로써, 오버랩핑 PCR에 의해 PDC6 ABUC 카세트를 생성시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3의 수용 세포를 만들고, 프로즌-EZ 이스트 트랜스포메이션 II(상표) 키트(자이모 리서치 코포레이션, 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 PDC6 ABUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 30 ℃에서 2% 글루코스로 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 형질전환 혼합물을 플레이팅하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, 프라이머 oBP448(서열 번호 34) 및 oBP449(서열 번호 35)를 사용하는 PCR에 의해 pdc6 녹아웃이 있는 형질전환체를 스크리닝하였다. 정확한 형질전환체를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3으로 선택하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3을 YPD에서 밤새 성장시키고, 30℃에서 5-플루오로-오로트산(0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 플레이팅하여, URA3 마커를 상실한 분리주를 선택하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, 프라이머 oBP448(서열 번호 34) 및 oBP449(서열 번호 35)를 사용하는 서열 분석 및 PCR에 의해 결실 및 마커 제거를 확인하였다. PDC6의 코딩 서열, oBP554(서열 번호 36) 및 oBP555(서열 번호 37)에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 음성 PCR 결과에 의해 분리주로부터 PDC6 유전자의 부재가 입증되었다. 정확한 분리주를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6으로 선택하고, BP891로 명명하였다.
PDC1 결실 ilvDSm 통합
PDC1 유전자를 결실시키고, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC No. 700610으로부터의 ilvD 코딩 영역으로 대체하였다. A 단편에 이은, PDC1 결실-ilvDSm 통합을 위한 PCR 카세트를 위한 스트렙토코커스 뮤탄스로부터의 ilvD 코딩 영역을, 퓨전(등록상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재), 및 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 주형으로서의 NYLA83(본 명세서 및 미국 가출원 제61/246,709호에 기술됨) 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 oBP513(서열 번호 38) 및 PDC1 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP515(서열 번호 39)로 PDC1 단편 A-ilvDSm(서열 번호 138)을 증폭시켰다. 퓨전(등록상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재), 및 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여, PDC1 결실-ilvDSm 통합을 위한 PCR 카세트를 위한 B, U, 및 C 단편을 증폭시켰다. PDC1 단편 A-ilvDSm의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP516(서열 번호 40), 및 PDC1 단편 U의 5' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP517(서열 번호 41)로 PDC1 단편 B를 증폭시켰다. PDC1 단편 B의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP518(서열 번호 42), 및 PDC1 단편 C의 5' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP519(서열 번호 43)로 PDC1 단편 U를 증폭시켰다. PDC1 단편 U의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP520(서열 번호 44), 및 프라이머 oBP521(서열 번호 45)로 PDC1 단편 C를 증폭시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다. PDC1 단편 A-ilvDSm 및 PDC1 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP513(서열 번호 38) 및 oBP517(서열 번호 41)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 PDC1 단편 A-ilvDSm-B를 생성시켰다. PDC1 단편 U 및 PDC1 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP518(서열 번호 42) 및 oBP521(서열 번호 45)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 PDC1 단편 UC를 생성시켰다. 생성된 PCR 산물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)에서 정제하였다. PDC1 단편 A-ilvDSm-B 및 PDC1 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP513(서열 번호 38) 및 oBP521(서열 번호 45)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 PDC1 A-ilvDSm-BUC 카세트(서열 번호 139)를 생성시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6의 수용 세포를 만들고, 프로즌-EZ 이스트 트랜스포메이션 II(상표) 키트(자이모 리서치 코포레이션, 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 PDC1 A-ilvDSm-BUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 30 ℃에서 2% 글루코스로 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, 프라이머 oBP511(서열 번호 46) 및 oBP512(서열 번호 47)를 사용하는 PCR에 의해, pdc1 녹아웃 ilvDSm 통합을 가진 형질전환체를 스크리닝하였다. PDC1의 코딩 서열, oBP550(서열 번호 48) 및 oBP551(서열 번호 49)에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 음성 PCR 결과에 의해, 분리주로부터 PDC1 유전자의 부재가 입증되었다. 정확한 형질전환체를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3으로 선택하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3을 YPD에서 밤새 성장시키고, 30℃에서 5-플루오로-오로트산(0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 플레이팅하여, URA3 마커를 상실한 분리주를 선택하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, 프라이머 oBP511(서열 번호 46) 및 oBP512(서열 번호 47)를 사용하는 서열 분석 및 PCR에 의해 PDC1의 결실, ilvDSm의 통합, 및 마커 제거를 확인하였다. 정확한 분리주를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm으로 선택하고, BP907로 명명하였다.
PDC5 결실 sadB 통합
PDC5 유전자를 결실시키고, 아크로모박터 자일로속시단스(Achromobacter xylosoxidans)로부터의 sadB 암호화 영역으로 대체하였다. 먼저, PDC5 결실-sadB 통합을 위한 PCR 카세트의 세그먼트를 플라스미드 pUC19-URA3MCS 내로 클로닝하였다.
pUC19-URA3MCS는 pUC19를 기반으로 하며, 다중 클로닝 부위(MCS: multiple cloning site) 내에 위치한 사카로마이세스 세레비시아로부터의 URA3 유전자의 서열을 함유한다. pUC19는 에스케리키아 콜라이에서의 복제 및 선택을 위한 베타-락타마아제를 코딩하는 유전자 및 pMB1 레플리콘을 함유한다. URA3에 대한 암호화 서열 외에, 이러한 유전자의 업스트림 및 다운스트림으로부터의 서열을 효모에서의 URA3 유전자의 발현을 위해 포함시켰다. 벡터는 클로닝 목적을 위해 사용될 수 있으며, 효모 통합 벡터로서 사용될 수 있다.
퓨전(등록상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재)를 사용하여, 사카로마이세스 세레비시아 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA로부터의 URA3 코딩 영역의 250 bp 업스트림 및 150 bp 다운스트림과 함께 URA3 코딩 영역을 포함하는 DNA를, BamHI, AscI, PmeI, 및 FseI 제한 부위를 함유하는 프라이머 oBP438(서열 번호 12), 및 XbaI, PacI, 및 NotI 제한 부위를 함유하는 oBP439(서열 번호 13)로 증폭시켰다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 게놈 DNA를 제조하였다. PCR 산물 및 pUC19(서열 번호 140)를 BamHI 및 XbaI로 분해한 후에 T4 DNA 리가아제(ligase)로 라이게이션시켜, 벡터 pUC19-URA3MCS를 생성시켰다. 프라이머 oBP264(서열 번호 10) 및 oBP265(서열 번호 11)를 사용하는 서열 분석 및 PCR에 의해 벡터를 확인하였다.
sadB 및 PDC5 단편 B의 암호화 서열을 pUC19-URA3MCS 내로 클로닝하여, PDC5 A-sadB-BUC PCR 카세트의 sadB-BU 부분을 생성하였다. pLH468-sadB(서열 번호 67)를 주형으로서 사용하여 AscI 제한 부위를 함유하는 프라이머 oBP530(서열 번호 50), 및 PDC5 단편 B의 5' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP531(서열 번호 51)로 sadB의 코딩 서열을 증폭시켰다. sadB의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP532(서열 번호 52), 및 PmeI 제한 부위를 함유하는 프라이머 oBP533(서열 번호 53)으로 PDC5 단편 B를 증폭시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다. sadB 및 PDC5 단편 B PCR 산물을 혼합하고 프라이머 oBP530(서열 번호 50) 및 oBP533(서열 번호 53)으로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 sadB-PDC5 단편 B를 생성시켰다. 생성된 PCR 산물을 AscI 및 PmeI로 분해하고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 적절한 효소에 의한 분해 후에 pUC19-URA3MCS의 상응하는 부위 내로 라이게이션시켰다. 생성된 플라스미드를, PDC5 단편 C의 5' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP546(서열 번호 55) 및 oBP536(서열 번호 54)을 사용하는 sadB-단편 B-단편 U의 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. PDC5 sadB-단편 B-단편 U의 3' 말단에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP547(서열 번호 56), 및 프라이머 oBP539(서열 번호 57)로 PDC5 단편 C를 증폭시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다. PDC5 sadB-단편 B-단편 U 및 PDC5 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP536(서열 번호 54) 및 oBP539(서열 번호 57)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 PDC5 sadB-단편 B-단편 U-단편 C를 생성시켰다. 생성된 PCR 산물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)에서 정제하였다. 천연 PDC5 코딩 서열의 바로 업스트림의 50 뉴클레오티드에 대한 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP542(서열 번호 58), 및 oBP539(서열 번호 57)로 PDC5 sadB-단편 B-단편 U-단편 C를 증폭시킴으로써 PDC5 A-sadB-BUC 카세트(서열 번호 141)를 생성시켰다. PCR 정제 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 PCR 산물을 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm의 수용 세포를 만들고 프로즌-EZ 이스트 트랜스포메이션 II(상표) 키트(자이모 리서치 코포레이션, 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 PDC5 A-sadB-BUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 30 ℃에서 1% 에탄올로 보충되고(글루코스 없음) 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, 프라이머 oBP540(서열 번호 59) 및 oBP541(서열 번호 60)을 사용하는 PCR에 의해 pdc5 녹아웃 sadB 통합을 가진 형질전환체를 스크리닝하였다. PDC5의 코딩 서열, oBP552(서열 번호 61) 및 oBP553(서열 번호 62)에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 음성 PCR 결과에 의해 분리주로부터 PDC5 유전자의 부재가 입증되었다. 정확한 형질전환체를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3으로 선택하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3을 YPE(1% 에탄올)에서 밤새 성장시키고, 에탄올로 보충되고(글루코스 없음) 5-플루오로-오로트산(0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 30℃에서 플레이팅하여, URA3 마커를 상실한 분리주를 선택하였다. 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 이스트/백트. 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, 프라이머 oBP540(서열 번호 59) 및 oBP541(서열 번호 60)을 사용하는 PCR에 의해 PDC5의 결실, sadB의 통합, 및 마커 제거를 확인하였다. 정확한 분리주를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB로 선택하고, BP913으로 명명하였다.
GPD2 결실
내인성 GPD2 코딩 영역을 결실시키기 위하여, loxP-URA3-loxP(서열 번호 68)를 주형 DNA로서 사용하여 gpd2::loxP-URA3-loxP 카세트(서열 번호 142)를 PCR-증폭시켰다. loxP-URA3-loxP는 loxP 재조합효소 부위에 의해 플랭킹된 (ATCC No. 77107)로부터의 URA3 마커를 함유한다. 퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 LA512 및 LA513(서열 번호 8 및 9)을 사용하여 PCR을 실행하였다. 각 프라이머의 GPD2 부분은 GPD2 암호화 영역의 5' 영역 업스트림 및 암호화 영역의 3' 영역 다운스트림으로부터 유래되어, loxP-URA3-loxP 마커의 통합이 GPD2 암호화 영역의 대체를 야기하게 하였다. PCR 산물을 BP913 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 1% 에탄올로 보충되고(글루코스 없음) 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에서 선택하였다. 형질전환체를 스크리닝하여, 프라이머 oBP582 및 AA270(서열 번호 63 및 64)을 사용하는 PCR에 의해 정확한 통합을 확인하였다.
pRS423::PGAL1-cre(서열 번호 66)로 형질전환시키고 30℃에서 1% 에탄올로 보충되고 히스티딘이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 URA3 마커를 재사용하였다. 1% 에탄올로 보충되고, 5-플루오로-오로트산(0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 형질전환체를 스트리킹하고, 30 ℃에서 인큐베이션하여, URA3 마커를 상실한 분리주를 선택하였다. pRS423::PGAL1-cre 플라스미드의 제거를 위하여, 5-FOA 저항성 분리주를 YPE(1% 에탄올) 중에 성장시켰다. 프라이머 oBP582(서열 번호 63) 및 oBP591(서열 번호 65)을 사용하는 PCR에 의해 결실 및 마커 제거를 확인하였다. 정확한 분리주를 균주 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB Δgpd2::loxP로서 선택하고, PNY1503(BP1064)로 명명하였다.
BP1064를 플라스미드 pYZ090(서열 번호 1) 및 pLH468(서열 번호 2)로 형질전환시켜 균주 NGCI-070(BP1083; PNY1504)을 생성시켰다.
균주 NYLA74 및 NYLA83 의 작제
S. 세레비시아의 내인성 PDC1 및 PDC6 유전자의 삽입-불활성화. 피루베이트 탈탄산효소의 3개 주요 동위효소를 암호화하는 PDC1, PDC5, 및 PDC6 유전자를 하기와 같이 기술한다:
pRS425::GPM-sadB의 작제
아크로모박터 자일로속시단스로부터 부탄올 탈수소효소(서열 번호 70)를 암호화하는 DNA 단편(미국 특허 출원 공개 제2009/0269823호에 개시됨)을 클로닝하였다. 각각 순방향 및 역방향 프라이머 N473 및 N469(서열 번호 74 및 75)를 사용하여 그램 음성 유기체를 위한 권장 프로토콜에 따라 젠트라(등록상표) 퓨어진(등록상표) 키트(퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 제조된 A. 자일로속시단스 게놈 DNA로부터 표준 조건을 사용하여 2차 알코올 탈수소효소를 위한 sadB라고 불리는 이 유전자의 코딩 영역(서열 번호 69)을 증폭시켰다. PCR 산물을 pCR(등록상표)4 블런트(Blunt)(인비트로젠(Invitrogen)(상표), 캘리포니아주 칼스바드 소재) 내로 토포(TOPO)(등록상표)-블런트 클로닝하여 pCR4블런트::sadB를 생성시키고, 이를 E. 콜라이 매치-1 세포(Mach-1 cell) 내로 형질전환시켰다. 이어서, 플라스미드를 4개의 클론으로부터 단리하였고, 서열을 확인하였다.
sadB 코딩 영역을 pCR4Blunt::sadB로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 프라이머는 효모 GPM1 프로모터 및 ADH1 터미네이터(서열 번호 76 및 77로서 제공된 N583 및 N584)로 오버랩핑될 추가의 5' 서열을 함유하였다. 그 후에, 하기와 같이 사카로마이세스 세레비시아에 "간극 수복(gap repair)" 기법을 사용하여 PCR 산물을 클로닝하였다(문헌[Ma, et al., Gene 58:201-216, 1987]). GPM1 프로모터(서열 번호 72), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 kivD 코딩 영역(서열 번호 71), 및 ADH1 터미네이터(서열 번호 73)(미국 특허 출원 공개 제2007/0092957 A1호, 실시예 17에 기술됨)를 함유하는 효모-E. 콜라이 셔틀 벡터 pRS425::GPM::kivD::ADH를 BbvCI 및 PacI 제한 효소로 분해하여 kivD 코딩 영역을 유리시켰다. 대략 1 ㎍의 나머지 벡터 단편을 1 ㎍의 sadB PCR 산물과 함께 S. 세레비시아 균주 BY4741에 형질전환시켰다. 형질전환체를 류신이 결여된 합성 완전 배지에서 선별하였다. 프라이머 N142 및 N459(서열 번호 108 및 109)를 사용하는 PCR에 의해, pRS425::GPM-sadB(서열 번호 124)를 생성시키는 적절한 재조합 이벤트를 확인하였다.
pdc6:: P GPM1- sadB 통합 카세트의 작제 및 PDC6 결실
pRS425::GPM-sadB(서열 번호 78)로부터의 GPM-sadB-ADHt 세그먼트(서열 번호 79)를 pUC19-URA3r로부터의 URA3r 유전자에 연결함으로써, pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t-URA3r 통합 카세트를 제조하였다. 생체내 상동성 재조합 및 URA3 마커의 제거를 가능하게 하기 위하여, pUC19-URA3r(서열 번호80)은 75 bp 상동성 반복 서열에 의해 플랭킹된 pRS426(ATCC No. 77107)으로부터의 URA3 마커를 함유한다. 주형으로서 pRS425::GPM-sadB 및 pUC19-URA3r 플라스미드 DNA를 사용하여, 퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 114117-11A 내지 114117-11D(서열 번호 81, 82, 83, 및 84), 및 114117-13A 및 114117-13B(서열 번호 85 및 86)로 SOE PCR(문헌[Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989]에 기술된 바와 같음)에 의해 2개의 DNA 세그먼트를 연결하였다.
SOE PCR(114117-13A 및 114117-13B)을 위한 외부 프라이머에는 제각기 PDC6 프로모터 및 종결자의 업스트림 및 다운스트림 영역에 상동성인 5' 및 3'의 대략 50bp 영역이 들어 있었다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여, 완성된 카세트 PCR 단편을 BY4700(ATCC No. 200866) 내로 형질전환시키고 형질전환체를 우라실이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에 30℃에서 유지하였다. 프라이머 112590-34G 및 112590-34H(서열 번호 87 및 88), 및 112590-34F 및 112590-49E(서열 번호 89 및 90)를 사용하는 PCR에 의해 형질전환체를 스크리닝하여, PDC6 코딩 영역의 결실과 함께 PDC6 유전자좌에서의 통합을 확인하였다. URA3r 마커는 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA로 보충된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 재사용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패칭하여 성장의 부재를 확인함으로써 마커 제거를 확인하였다. 생성된 동정된 균주는 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t.
pdc1:: PPDC1-ilvD 통합 카세트의 작제 및 PDC1 결실
주형으로서 pLH468 및 pUC19-URA3r 플라스미드 DNA를 사용하여, 퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 114117-27A 내지 114117-27D(서열 번호 110, 111, 112, 및 113)로 SOE PCR(문헌[Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989]에 기술된 바와 같음)에 의해 pLH468(서열 번호 2)로부터의 ilvD-FBA1t 세그먼트(서열 번호 91)를 pUC19-URA3r로부터의 URA3r 유전자에 연결함으로써, pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t-URA3r 통합 카세트를 제조하였다.
SOE PCR(114117-27A 및 114117-27D)을 위한 외부 프라이머에는 PDC1 프로모터의 다운스트림 영역 및 PDC1 코딩 서열의 다운스트림 영역에 상동성인 5' 및 3'의 대략 50bp 영역이 들어 있었다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여, 완성된 카세트 PCR 단편을 BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t 내로 형질전환시키고 형질전환체를 우라실이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에 30℃에서 유지하였다. 프라이머 114117-36D 및 135(서열 번호 92 및 93), 및 프라이머 112590-49E 및 112590-30F(서열 번호 90 및 94)를 사용하는 PCR에 의해 형질전환체를 스크리닝하여, PDC1 코딩 서열의 결실과 함께 PDC1 유전자좌에서의 통합을 확인하였다. URA3r 마커는 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA로 보충된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 재사용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패칭하여 성장의 부재를 확인함으로써 마커 제거를 확인하였다. 생성된 동정된 균주 "NYLA67"은 하기의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t.
HIS3 결실
내인성 HIS3 코딩 영역을 결실시키기 위하여, his3::URA3r2 카세트를 URA3r2 주형 DNA(서열 번호 95)로부터 PCR-증폭시켰다. 생체내 상동성 재조합 및 URA3 마커의 제거를 가능하게 하기 위하여, URA3r2는 500 bp 상동성 반복 서열에 의해 플랭킹된 pRS426(ATCC No. 77107)으로부터의 URA3 마커를 함유한다. 퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 114117-45A 및 114117-45B(서열 번호 96 및 97)를 사용하여 PCR을 실행하였으며, 이는 ~2.3 kb PCR 산물을 생성시켰다. HIS3 프로모터의 업스트림의 5' 영역, 및 코딩 영역의 다운스트림의 3' 영역으로부터 각각의 프라이머의 HIS3 부분을 유도하여, URA3r2 마커의 통합으로 인해 HIS3 코딩 영역이 대체되도록 하였다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 PCR 산물을 NYLA67 내로 형질전환시켰으며, 30℃에서 우라실이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에서 형질전환체를 선택하였다. 30℃에서 히스티딘이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에서 형질전환체를 레플리카(replica) 플레이팅함으로써 형질전환체를 스크리닝하여, 정확한 통합을 확인하였다. 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA로 보충된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 URA3r 마커를 재사용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패칭하여 성장의 부재를 확인함으로써 마커 제거를 확인하였다. NYLA73이라고 부르는, 생성된 동정된 균주는 하기의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3.
pdc5::kanMX 통합 카세트의 작제 및 PDC5 결실
퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 PDC5::KanMXF 및 PDC5::KanMXR(서열 번호 98 및 99)을 사용하여 균주 YLR134W 염색체 DNA(ATCC No. 4034091)로부터 pdc5::kanMX4 카세트를 PCR-증폭시켜 ~2.2 kb PCR 산물을 생성시켰다. PDC5 프로모터의 업스트림의 5' 영역, 및 코딩 영역의 다운스트림의 3' 영역으로부터 각각의 프라이머의 PDC5 부분을 유도하여, kanMX4 마커의 통합으로 인해 PDC5 코딩 영역이 대체되도록 하였다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 PCR 산물을 NYLA73 내로 형질전환시키고, 1% 에탄올 및 제네티신(200 ㎍/mL)으로 보충된 YP 배지 상에서 30℃에서 형질전환체를 선택하였다. 프라이머 PDC5kofor 및 N175(서열 번호 100 및 101)를 사용하여 PCR에 의해 형질전환체를 스크리닝하여, PDC5 코딩 영역의 대체와 함께 PDC 유전자좌에서의 정확한 통합을 확인하였다. 동정된 정확한 형질전환체는 하기의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 pdc5::kanMX4. 균주를 NYLA74로 명명하였다.
HXK2(헥소키나아제 II)의 결실
퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 384 및 385(서열 번호 102 및 103)를 사용하여 URA3r2 주형(상기)으로부터 hxk2::URA3r 카세트를 PCR-증폭하여, ~2.3 kb PCR 산물을 생성시켰다. URA3r2 마커의 통합이 HXK2 코딩 영역의 대체를 유발하도록, HXK2 프로모터의 업스트림의 5' 영역, 및 코딩 영역의 다운스트림의 3' 영역으로부터 각각의 프라이머의 HXK2 부분을 유도하였다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 PCR 산물을 NYLA73 내로 형질전환시키고, 우라실이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에서 30℃에서 형질전환체를 선택하였다. 프라이머 N869 및 N871(서열 번호 104 및 105)를 사용하여 PCR에 의해 형질전환체를 스크리닝하여, HXK2 코딩 영역의 대체와 함께 HXK2 유전자좌에서의 정확한 통합을 확인하였다. 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA로 보충된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 URA3r2 마커를 재사용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패칭하여 성장의 부재를 확인하고, 프라이머 N946 및 N947(서열 번호 106 및 107)을 사용하여 PCR에 의해 정확한 마커 제거를 확인함으로써, 마커 제거를 확인하였다. NYLA83이라고 명명된 생성된 동정된 균주는 하기의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2.
NYLA93의 작제
S. 세레비시아의 내인성 PDC1, PDC5, 및 PDC6 유전자의 삽입-불활성화를 하기에 기술한다. PDC1, PDC5, 및 PDC6 유전자는 피루베이트 탈카르복실화효소의 3가지 주요 동위효소를 암호화한다. 생성된 PDC 불활성화 균주를 발현 벡터 pYZ067(서열 번호 129) 및 pYZ090(서열 번호 1)을 위한 숙주로서 사용하였으며, 그의 작제는 2009년 9월 29일자로 출원된, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 가출원 제61/246,844호에 기술되어 있다.
NAD-의존성 글리세롤 3-포스페이트 탈수소효소의 결실
퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 LA512 및 LA513(서열 번호 8 및 9)을 사용하여 pUC19::loxP-URA3-loxP 플라스미드 주형으로부터 gpd2::loxP-URA3-loxP 카세트를 PCR-증폭하여, ~1.6 kb PCR 산물을 생성시켰다. pUC19::loxP-URA3-loxP(서열 번호 130)는 loxP 재조합효소 부위에 의해 플랭킹된(ATCC No. 77107)로부터의 URA3 마커를 함유한다. loxP-URA3-loxP 마커의 통합이 GPD2 코딩 영역의 대체를 유발하도록, GPD2 프로모터의 업스트림의 5' 영역 및 코딩 영역의 다운스트림의 3' 영역으로부터 각각의 프라이머의 GPD2 부분을 유도하였다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 PCR 산물을 NYLA83 내로 형질전환시키고, 우라실이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에서 30℃에서 형질전환체를 선택하였다. 프라이머 LA516 및 N175(서열 번호 132 및 101)를 사용하여 PCR에 의해 형질전환체를 스크리닝하여, HXK2 코딩 영역의 대체와 함께 GPD2 유전자좌에서의 정확한 통합을 확인하였다. pRS423::PGAL1-cre(서열 번호 131)로 형질전환시키고, 히스티딘이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에 30℃에서 플레이팅함으로써, URA3 마커를 재사용한다. 콜로니를 YP(1% 갈락토스) 플레이트 상에 30℃에서 패칭하여 URA3 마커 절제를 유도하고, 회수를 위해 30℃에서 YPD 플레이트 상에 이전한다. YPD 플레이트로부터 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상으로 콜로니를 패칭하여 성장의 부재를 확인함으로써 URA3 마커의 제거를 확인한다. 동정된 정확한 클론은 하기의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 Δgpd2::loxP. 균주를 NYLA92로 명명하였다.
pdc5::loxP-kanMX-loxP 통합 카세트의 작제 및 PDC5 결실
퓨전(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드, 메사추세츠주 입스위치 소재) 및 프라이머 LA249 및 LA397(서열 번호 136 및 137)을 사용하여 플라스미드 pUC19::loxP-kanMX-loxP(서열 번호 135)로부터 pdc5::loxP-kanMX-loxP 카세트를 PCR-증폭하여, ~2.2 kb PCR 산물을 생성시켰다. pUC19::loxP-kanMX-loxP(서열 번호 135)는 loxP 재조합효소 부위에 의해 플랭킹된 K. 락티스 TEF1 프로모터 및 터미네이터 및 pFA6으로부터의 kanMX 유전자(문헌[Wach, et al., Yeast 10:1793-1808, 1994])를 함유한다. loxP-kanMX-loxP 마커의 통합이 PDC5 코딩 영역의 대체를 유발하도록, PDC5 프로모터의 업스트림의 5' 영역 및 코딩 영역의 다운스트림의 3' 영역으로부터 각각의 프라이머의 PDC5 부분을 유도하였다. 표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 PCR 산물을 NYLA92 내로 형질전환시키고, 1% 에탄올 및 제네티신(200 ㎍/ml)으로 보충된 YP 배지 상에서 30℃에서 형질전환체를 선택하였다. 프라이머 LA363 및 LA364(서열 번호 133 및 134)를 사용하여 PCR에 의해 형질전환체를 스크리닝하여, PDC5 코딩 영역의 대체와 함께 PDC5 유전자좌에서의 정확한 통합을 확인하였다. 동정된 정확한 형질전환체는 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1 -sadB-ADH1t pdc1::PPDC1 -ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 Δgpd2::loxP Δpdc5:loxP-kanMX-loxP. 균주를 NYLA93으로 명명하였다.
NYLA93(pYZ067/pYZ090)
표준 유전자 기술(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY])을 사용하여 플라스미드 벡터 pYZ067 및 pYZ090을 균주 NYLA93(BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 Δgpd2::loxP Δpdc5:loxP-kanMX-loxP) 내로 동시에 형질전환시키고, 생성된 균주(아이소부탄올로겐 NYLA93, NGCI-065라고도 지칭함)를 히스티딘 및 우라실이 결여되고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 30℃에서 유지하였다.
발현 벡터 pLH468
효모에서의 DHAD, 케토아이소발레레이트 탈탄산효소(KivD) 및 말 간 알코올 탈수소효소(HADH: horse liver alcohol dehydrogenase)의 발현을 위해 pLH468 플라스미드(서열 번호 2)를 작제하였다.
사카로마이세스 세레비시아에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 기반으로 하는 DNA2.0에 의해 락토코커스 락티스 케토아이소발레레이트 탈탄산효소(KivD) 및 말 간 알코올 탈수소효소(HADH)에 대한 코딩 영역을 합성하고(각각 서열 번호 71 및 117) 플라스미드 pKivDy-DNA2.0 및 pHadhy-DNA2.0 내에 제공하였다. 암호화된 단백질은 각각 서열 번호 116 및 118이다. KivD 및 HADH에 대한 개개의 발현 벡터를 작제하였다. pLH467(pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t)을 조립하기 위하여, 벡터 pNY8(서열 번호 120; pRS426.GPD-ald-GPDt라고도 명명되며, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2008/0182308호, 실시예 17에 기술됨)을 AscI 및 SfiI 효소로 분해함으로써, GPD 프로모터 및 ald 코딩 영역을 절제하였다. 5' 프라이머 OT1068 및 3' 프라이머 OT1067(서열 번호 122 및 123)을 사용하여 pNY8로부터의 TDH3 프로모터 단편(서열 번호 121)을 PCR 증폭하여, 5' 말단에 AscI 부위, 및 3' 말단에 SpeI 부위를 첨가하였다. AscI/SfiI로 분해된 pNY8 벡터 단편을 AscI 및 SpeI로 분해된 TDH3 프로모터 PCR 산물과 라이게이션하고, 코돈 최적화된 kivD 코딩 영역을 함유하는 SpeI-SfiI 단편을 벡터 pKivD-DNA2.0으로부터 단리하였다. 3중 라이게이션에 의해, 벡터 pLH467(pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t)이 생성되었다. 제한 효소 맵핑 및 서열 분석에 의해 pLH467을 확인하였다.
pLH435(pRS425::PGPM1-Hadhy-ADH1t)는, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 가출원 제61/058970호, 실시예 3에 기술된 벡터 pRS425::GPM-sadB(서열 번호 78)로부터 유도되었다. pRS425::GPM-sadB는 GPM1 프로모터(서열 번호 72), 아크로모박터 자일로속시단스의 부탄올 탈수소효소로부터의 코딩 영역(sadB; DNA 서열 번호 69; 단백질 서열 번호 70: 미국 특허 출원 공개 제2009/0269823호에 개시됨), 및 ADH1 터미네이터(서열 번호 73)를 함유하는 키메라 유전자를 가진 pRS425 벡터(ATCC No. 77106)이다. pRS425::GPMp-sadB는 sadB 코딩 영역의 5' 및 3' 말단에 각각 BbvI 및 PacI 부위를 함유한다. NheI 부위는 프라이머 OT1074 및 OT1075(서열 번호 125 및 126)를 사용하는 부위-지정 돌연변이에 의해 sadB 코딩 영역의 5' 말단에 첨가되어, 서열분석에 의해 입증된 벡터 pRS425-GPMp-sadB-NheI을 생성시켰다. pRS425::PGPM1-sadB-NheI을 NheI 및 PacI로 분해하여, sadB 코딩 영역을 드롭 아웃(drop out)시키고, 벡터 pHadhy-DNA2.0으로부터의 코돈 최적화된 HADH 코딩 영역을 함유하는 NheI-PacI 단편과 라이게이션하여 pLH435를 생성시켰다.
단일 벡터에서 KivD 및 HADH 발현 카세트를 조합하기 위하여, 효모 벡터 pRS411(ATCC No. 87474)을 SacI 및 NotI로 분해하고, 3중 라이게이션 반응으로, PGPM1-Hadhy-ADH1t 카세트를 함유하는 pLH435로부터의 SalI-NotI 단편과 함께, PTDH3-kivDy-TDH3t 카세트를 함유하는 pLH467로부터의 SacI-SalI 단편과 라이게이션시켰다. 이로써, 벡터 pRS411::PTDH3-kivDy-PGPM1-Hadhy(pLH441)를 수득하였으며, 이를 제한 효소 맵핑으로 확인하였다.
더 낮은 아이소부탄올 경로의 3개 유전자, ilvD, kivDy 및 Hadhy 모두에 대한 공-발현 벡터를 생성시키기 위하여, pRS423 FBA ilvD(Strep)(서열 번호 127)를 사용하였으며, 이는 미국 가출원 제61/100,792호에 IlvD 유전자의 공급원으로서 기술되어 있다. 이 셔틀 벡터에는 E. 콜라이에서의 유지를 위한 F1 복제 기원(nt 1423 내지 1879), 및 효모에서의 복제를 위한 2마이크론 기원(nt 8082 내지 9426)이 함유되어 있다. 벡터는 FBA1 프로모터(nt 2111 내지 3108; 서열 번호 119) 및 FBA 터미네이터(nt 4861 내지 5860; 서열 번호 128)를 갖는다. 또한, 이는 효모에서의 선별을 위한 His 마커(nt 504 내지 1163), 및 E. 콜라이에서의 선별을 위한 앰피실린 내성 마커(nt 7092 내지 7949)를 갖고 있다. 스트렙토코커스 뮤탄스 UA159(ATCC No. 700610)로부터의 ilvD 코딩 영역(nt 3116 내지 4828; 서열 번호 1154 단백질 서열 번호 115)은 FBA 프로모터와 FBA 터미네이터 사이에 존재하여 발현을 위한 키메라 유전자를 형성한다. 또한, ilvD 코딩 영역(nt 4829 내지 4849)에 융합되는 루미오 태그가 존재한다.
제1 단계는 pRS423 FBA ilvD(Strep)(pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(스트렙토코커스 뮤탄스)-Lumio라고도 함)를 SacI 및 SacII(T4 DNA 중합효소를 사용해 SacII 부위가 블런트 말단된 것)와 함께 선형화해서, 총 길이가 9,482 bp인 벡터를 제공하는 것이었다. 제2 단계는 SacI 및 KpnI(KpnI 부위는 T4 DNA 중합효소를 사용해 블런트 말단됨)로 pLH441로부터 kivDy-hADHy 카세트를 단리하여 6,063 bp 단편을 제공하는 것이었다. 이 분절을 pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(스트렙토코터스 뮤탄스)-Lumio 유래의 9,482 bp 벡터 분절과 연결하였다. 이는 벡터 pLH468(pRS423::PFBA1-ilvD(Strep)Lumio-FBA1t-PTDH3-kivDy--TDH3tPGPM1-hadhy-ADH1t)을 생성시켰고, 이를 제한 효소 맵핑 및 서열 분석에 의해 확인하였다.
pYZ090 및 pYZ067
아세토락테이트 신타아제(ALS: acetolactate synthase)의 발현을 위한, 효모 CUP1 프로모터(nt 2 내지 449) 및 이어지는 CYC1 터미네이터(nt 2181 내지 2430)로부터 발현되는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 alsS 유전자의 코딩 영역(nt 위치 457 내지 2172)을 갖는 키메라 유전자, 및 케토산 리덕토아이소머라아제(KARI: keto-acid reductoisomerase)의 발현을 위한, 효모 ILV5 프로모터(2433 내지 3626) 및 이어지는 ILV5 터미네이터(nt 4670 내지 5292)로부터 발현되는 락토코커스 락티스로부터의 ilvC 유전자의 코딩 영역(nt 3634 내지 4656)을 갖는 키메라 유전자를 함유하도록 pYZ090을 작제하였다.
하기의 키메라 유전자를 함유하도록 pYZ067을 작제하였다: 1) DHAD의 발현을 위한, 효모 FBA1 프로모터(nt 1161 내지 2250)에 이어서 FBA 터미네이터(nt 4005 내지 4317)로부터 발현되는 S. 뮤탄스 UA159로부터의 ilvD 유전자의 코딩 영역(nt 위치 2260 내지 3971), 2) 알코올 탈수소효소의 발현을 위한, 효모 GPM 프로모터(nt 5819 내지 6575)에 이어서 ADH1 터미네이터(nt 4356 내지 4671)로부터 발현되는 HADH를 위한 코딩 영역(nt 4680 내지 5807), 및 3) 케토아이소발레레이트 탈탄산효소의 발현을 위한, 효모 TDH3 프로모터(nt 8830 내지 9493)에 이어서 TDH3 터미네이터(nt 5682 내지 7161)로부터 발현되는 라크로코커스 락티스(Lacrococcus lactis)로부터의 KivD 유전자의 코딩 영역(nt 7175 내지 8821).
추가로, 본 발명의 다양한 실시 형태를 상기 기술하였으나, 그들은 단지 예로서 제공된 것일 뿐, 한정하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 사상 및 범주로부터 이탈하지 않으면서 그 안에서 형태 및 세부 사항을 다양하게 변경할 수 있음은, 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범주는 상기의 예시적 실시 형태 중 임의의 것에 의해 한정되어서는 안되고, 단지 특허청구범위 및 그의 균등물에 따라 정의되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 본 발명이 관련되는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 시사하며, 각각의 개별적인 공보, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 제시한 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예
하기의 비한정적인 실시예가 본 발명을 추가로 예시할 것이며, 여기에는 지방산 추출제의 부탄올에 대한 분배 계수가 입증된다. 상기의 화학적 전환 및 하기의 실시예는 지방산 추출제를 생산하기 위한 식물-유래의 오일로서 옥수수 오일을 포함하지만, 본 발명으로부터 이탈하지 않으면서 식물-유래의 오일과 같은 다른 천연 오일을 사용할 수 있음을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있으며 본 발명으로부터 이탈하지 않으면서 본 발명을 다양하게 변경하고 개질하여 다양한 용도 및 조건에 적합하게 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사용되는 약어의 의미는 하기와 같았다: "g"는 그램(들)을 의미하고, "kg"는 킬로그램(들)을 의미하며, "L"은 리터(들)를 의미하고, "mL"은 밀리리터(들)를 의미하며, "mL/L"은 리터당 밀리리터(들)를 의미하고, "mL/분"은 분당 밀리리터(들)를 의미하며, "㎕"은 마이크로리터(들)를 의미하고, "DI"는 탈이온화를 의미하며, "uM"은 마이크로미터(들)를 의미하고, "nM"은 나노미터(들)를 의미하며, "w/v"는 중량/부피를 의미하고, "GC"는 기체 크로마토그래프를 의미하며, "OD"는 광학 밀도를 의미하고, "OD600"은 600 nM의 파장에서의 광학 밀도를 의미하며, "dcw"는 건조 세포 중량을 의미하고, "rpm"은 분당 회전수를 의미하며, "℃"는 섭씨 도(들)를 의미하고, "℃/분"은 분당 섭씨 도를 의미하며, "slpm"은 분당 표준 리터(들)을 의미하고, "ppm"은 백만분율을 의미하며, "pdc"는 뒤에 효소 번호가 이어지는 피루베이트 탈탄산효소를 의미한다.
실시예 1 내지 6은 옥수수 오일을 하기의 지방산 추출제로 화학적으로 전환하는 예시적인 방법을 기술한다: 하이드록실화 트라이글리세라이드(실시예 1), 지방 아미드 및 지방산과의 혼합물(실시예 2), 지방 알코올(실시예 3), 지방산(실시예 4), 지방산 메틸 에스테르(실시예 5); 및 지방산 글리콜 에스테르(실시예 6). 실시예 7은 표 3 및 표 7 내지 10에 열거된 수-비혼화성 추출제를 사용하여 수행된 추출 발효 실험의 일련의 비교예를 제공하며, 이에 대한 성능 데이터는 표 11에 요약되어 있다.
실시예 1
옥수수 오일로부터의 하이드록실화 트라이글리세라이드
A. 옥수수 오일 하이드록실화(63% 하이드록실화)
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된 3-구 500 mL 플라스크에 옥수수 오일(50.0 g), 톨루엔(25.0 mL), 앰버라이트(Amberlyte) IR-120 수지(12.5 g), 및 빙초산(7.5 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 후, 과산화수소(물 중의 30% H2O2 41.8 g)를 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 2 시간 동안 교반하고, 그 시간에 반응 혼합물을 워크업하였다: 여과에 의해 수지를 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 mL)와 물(50 mL) 사이에 분배시켰다. 층을 분리한 후에, 유기 층을 포화 NaHCO3 수용액(50 mL), 및 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 48.9 g의 황색 오일을 얻었다. 조 반응 산물의 1H NMR 분석은 이중 결합의 63%가 에폭시화되었음을 나타냈다.
500 mL 둥근 바닥 플라스크에 에폭시화 옥수수 오일(20.0 g), 테트라하이드로퓨란(THF)(100.0 mL), 및 황산(50 mL의 1.7 M 수용액)을 첨가하였다. 혼탁한 혼합물을 2 시간 동안 50℃에서 교반한 후, 물(100 mL)과 에틸 아세테이트(200 mL) 사이에 분배시킴으로써 워크업하였다. 유기 층을 물(3x50 mL)로 세척한 후, 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 19.9 g의 암황색 오일(63% 하이드록실화 옥수수 오일)을 얻었다.
B. 옥수수 오일 하이드록실화(47% 하이드록실화)
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된 3-구 500 mL 플라스크에 옥수수 오일(50.0 g), 톨루엔(25.0 mL), 앰버라이트 IR-120 수지(12.5 g), 및 빙초산(7.5 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 후, 과산화수소(물 중의 30% H2O2 41.8 g)를 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 1 시간 동안 교반하고, 그 시간에 반응 혼합물을 워크업하였다: 여과에 의해 수지를 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 mL)와 물(50 mL) 사이에 분배시켰다. 층을 분리한 후에, 유기 층을 포화 NaHCO3 수용액(50 mL), 및 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 49.8 g의 황색 오일을 얻었다. 조 반응 산물의 1H NMR 분석은 이중 결합의 47%가 에폭시화되었음을 나타냈다.
500 mL 둥근 바닥 플라스크에 에폭시화 옥수수 오일(20.0 g), THF(100.0 mL), 및 황산(50 mL의 1.7 M 수용액)을 첨가하였다. 혼탁한 혼합물을 2 시간 동안 50℃에서 교반한 후, 물(100 mL)과 에틸 아세테이트(200 mL) 사이에 분배시킴으로써 워크업하였다. 유기 층을 물(3x50 mL)로 세척한 후, 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 19.2 g의 암황색 오일(47% 하이드록실화 옥수수 오일)을 얻었다.
C. 옥수수 오일 하이드록실화(28% 하이드록실화)
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된 3-구 500 mL 플라스크에 옥수수 오일(50.0 g), 톨루엔(25.0 mL), 앰버라이트 IR-120 수지(12.5 g), 및 빙초산(7.5 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 후, 과산화수소(물 중의 30% H2O2 41.8 g)를 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 2 시간 동안 교반하고, 그 시간에 반응 혼합물을 워크업하였다: 여과에 의해 수지를 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 mL)와 물(50 mL) 사이에 분배시켰다. 층을 분리한 후에, 유기 층을 포화 NaHCO3 수용액(50 mL), 및 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 47.2 g의 황색 오일을 얻었다. 조 반응 산물의 1H NMR 분석은 이중 결합의 28%가 에폭시화되었음을 나타냈다.
500 mL 둥근 바닥 플라스크에 에폭시화 옥수수 오일(20.0 g), THF(100.0 mL), 및 황산(50 mL의 1.7 M 수용액)을 첨가하였다. 혼탁한 혼합물을 2 시간 동안 50℃에서 교반한 후, 물(100 mL)과 에틸 아세테이트(200 mL) 사이에 분배시킴으로써 워크업하였다. 유기 층을 물(3x50 mL)로 세척한 후, 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 20.3 g의 암황색 오일(28% 하이드록실화 옥수수 오일)을 얻었다.
분배 계수 측정
5 mL 바이알에 0.910 g의 67% 하이드록실화 옥수수 오일, 및 0.910 mL의 3 중량% iBuOH 수용액을 첨가하였다. 보텍스 지니(Vortex Genie)(등록상표)를 사용하여 2상 혼합물을 10 분 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합되면, 피셔 사이언티픽 센트리픽 228(Fisher Scientific Centrific 228) 원심분리기를 사용하여(3300 rpm) 10 분 동안 혼합물을 원심분리함으로써 층의 분리를 보조하였다. 양자 모두의 층의 0.100 g을 취하였다. 유기, 상층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 톨루엔 용액(10.1 mg/mL)으로 1.00 mL까지 희석하고, 수층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 메탄올 용액(10.2 mg/mL)으로 1.00 mL까지 희석하였다. 보정된 기체 크로마토그래프(GC: gas chromatograph)를 사용하여 양자 모두의 상에서 i-BuOH의 농도를 측정하였다. 47% 및 28% 하이드록실화 옥수수 오일에 대하여 동일한 절차를 반복하였다. 이렇게 측정된 분배 계수는 67% 하이드록실화 옥수수 오일에 대하여 3.2였고, 47% 하이드록실화 옥수수 오일에 대하여 2.3이었으며, 28% 하이드록실화 옥수수 오일에 대하여 2.1이었다.
6% i-BuOH 수용액으로 상기 개요의 절차를 반복하였다. 67% -, 47% -, 및 28% -하이드록실화 옥수수 오일에 대한 분배 계수는 각각 2.9, 2.9, 및 2.0이었다.
실시예 2
옥수수 오일로부터의 순수한 지방 아미드, 및 지방 아미드 + 지방산
문헌[Roe, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 29:18-22, 1952]에 의해 기술된 것과 유사한 방식으로 옥수수 오일을 수성 암모늄 하이드록사이드와 반응시켰다. 마졸라(Mazola)(등록상표) 옥수수 오일(0.818 L, 755 g)을 1 갤런 스테인리스강 반응기에 넣고, 여기에 1.71 L(1540 g)의 수성 암모늄 하이드록사이드(NH3로서 28%)를 첨가하였다. 반응기를 교반하면서 160℃로 가열하고 그 온도에서 교반하면서 7 시간 동안 유지하였으며, 그 시간 동안 압력이 2.76 ㎪(400 psi)에 도달하였다. 반응기를 냉각시키고, 산물인 크림 같은 백색 고체를 수거하고, 반응기를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 산물을 5 L 에틸 아세테이트에 용해시켜 각각 500 mL의 물로 5회 세척하고, 이를 H2SO4로 중화시켰다. 그 후에 에틸 아세테이트를 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 회전식 증발기 상에서 용매를 제거하여, 담갈색 연성 고체가 남았다.
CDCl3중의 13C NMR은, 산물이 대략 2:1 비율의 지방 아미드 대 지방산을 함유하였으며 옥수수 오일의 산물로의 전환이 정량적이었음을 제시했다. 산물의 융점은 57 내지 58℃였으나, 물로 포화될 경우에는 약 11℃ 하락하였다.
문헌[Kohlhase, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 48:265-270, 1971]에 따라 촉매로서의 암모늄 아세테이트와 함께 무수 암모니아를 사용하여 옥수수 오일로부터 순수한 옥수수 오일 지방 아미드를 합성하였다.
400 mL 스테인리스강 진탕기 튜브에 3 그램의 암모늄 아세테이트를 넣고, 여기에 51.8 g의 옥수수 오일을 첨가하였다. 그 후에 무수 암모니아(89.7 g)를 첨가하고 반응기를 밀봉하여 125℃에서 7 시간 동안 가열하였으며, 이 시간 동안 압력이 8.96 MPa(1300 psi)에 도달하였다. 반응기를 냉각시키고, 밝은 색의 고체를 수거하고, 반응기를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 그 후에 에틸 아세테이트 중에 용해된 산물을 상기 지방 아미드/지방산 혼합물의 경우에서와 같이 워크업하였다.
하기 실시예 4에 기술된 바와 같이 NaOH를 사용하는 염기 가수분해에 의해 옥수수 오일로부터 지방산을 합성하였다.
하기의 3개 제형(preparation)을, 3% 수용액으로부터 아이소부탄올을 추출하는 그들의 능력에 대하여 모두 시험하였다: (1) 수성 암모니아로부터의 옥수수 오일 지방 아미드 및 옥수수 오일 지방산의 2:1 혼합물, (2) 순수한 옥수수 오일 지방 아미드:순수한 옥수수 오일 지방산의 2:1 혼합물, 및 (3) 순수한 옥수수 오일 지방 아미드:옥수수 오일 지방산의 1:2 혼합물. 700 밀리그램의 각 제형을 20 mL 신틸레이션 바이알 내에서 3% 아이소부탄올을 함유하는 2.1 mL의 물에 첨가하고 30℃에서 회전식 진탕기 상에 밤새 두었다. 3가지 경우 모두에서, 유기상은 이 온도에서 액체가 되었으며, 이는 아이소부탄올의 흡수로 융점이 추가로 낮아짐을 제시한다. GC 표준품으로서 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르(10.068 mg/mL)를 함유하는 200 ㎕의 톨루엔, 또는 동일한 농도의 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르를 함유하는 200 ㎕의 아이소프로판올로 50 마이크로리터의 윗상을 희석하였다. 동일한 농도의 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르를 함유하는 50 ㎕의 아이소프로판올 및 150 ㎕의 메탄올로 50 마이크로리터의 아랫상을 희석하였다. 보정된 GC를 사용하여 양자 모두의 상에서 아이소부탄올의 농도를 결정하였다. 측정된 분배 계수는 하기와 같다: (1)에 대하여 3.81, (2)에 대하여 4.31, 및 (3)에 대하여 3.58.
지방 아미드/지방산 수성 암모니아 제형(1), 및 순수한 옥수수 오일 지방산과 1:1 혼합된 제형(1)로 구성된 제형(1a)(1:2 지방 아미드:지방산과 균등함)을, 사카로마이세스 부탄올로겐 NGCI-070을 함유하는 발효 브로스를 가진 진탕 플라스크 내에서 3 부 브로스 대 1 부 아미드/산 혼합물의 비율로 인큐베이션하였다. 30℃에서 제형(1)은 연성 고체인 반면에, 제형(1a)은 액체였다. 8.35 g/L의 글루코스 농도에서 시작하여, 그 후에 진탕 플라스크를 25 시간 동안 인큐베이터 진탕기 상에서 인큐베이션하였으며, 시간의 함수로서 글루코스의 소비가 이어졌다. 표 1은, 양자 모두의 비율에서 지방 아미드/지방산 혼합물은 부탄올로겐에 대해 유독하지 않았으며, 심지어 올레일 알코올을 사용할 때보다 높은 글루코스 흡수 속도를 나타냈음을 제시한다.
Figure pct00007
실시예 3
옥수수 오일로부터의 지방 알코올
옥수수 오일로부터 지방 알코올을 생산하기 위한 상기 반응식 IV의 반응과 관련하여, 기계식 교반기, N2 공급원이 있는 환류 응축기, 첨가 깔때기, 내부 열전쌍, 및 고무 셉텀이 장착된 22 L 둥근 바닥 플라스크를 질소 하에 화염-건조(flame-dry)시켰다. 건조 상자 내에서 평량하여 고체 첨가 깔때기 내로 장입한 132 g(3.30 몰)의 95% 리튬 알루미늄 하이드라이드 분말을 플라스크에 투입하였다. 22 L 플라스크를 얼음조로 냉각시키고, 캐뉼라를 통해 반응기 내로 9.0 리터의 무수 THF를 첨가하였다. 생성된 슬러리를 0 내지 5℃로 냉각시키고, 반응 온도를 5 내지 20℃로 유지하는 가운데 1.00 리터의 무수 THF 중의 956 g(1.10 몰)의 웨슨(Wesson)Δ등록상표Δ 옥수수 오일의 용액을 2 내지 3 시간에 걸쳐 적가하였다. 옥수수 오일을 첨가한 후에, 슬러리를 주위 온도에서 밤새 교반하였다. TLC 크로마토그래피에 의해 확인되는 바와 같이, 반응이 완료되었을 때, 370 mL의 THF에 용해된 130 g의 물의 용액을 적가함으로써 이를 켄칭(quenching)하였다. 그 후에 130 g의 15% 수성 NaOH 용액을 첨가하고, 이어서 400 g의 물을 첨가하였다. 실온으로 가온하는 가운데 혼합물을 격렬하게 교반하여 백색 과립성 고체를 생성시켰다. 소결-유리 필터 깔때기를 사용하여 고체를 여과해내고 추가의 THF로 세척하였다. 회전식 증발기 상에서 THF를 제거하고 잔류물을 3.00 리터의 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 산물 용액을 2x 1.00 L의 물, 1 x 1.00 L의 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켜 여과하고, 진공 중에 농축하여 836 g(97%)의 지방 알코올을 황색 오일로서 수득하였다. 그 후에 조 지방 알코올 혼합물을 증류하고(1.05℃/Pascal(140℃/1 mmHg)), 하기의 분배 계수 실험에 사용하였다.
분배 계수 실험
5개의 5-mL 바이알 각각에 1 mL의 지방 알코올 혼합물, 및 1 mL의 3 중량% iBuOH 수용액을 첨가하였다. 보텍스 지니(등록상표)를 사용하여 2상 혼합물을 각각 10, 20, 30, 40, 및 60 분 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합되면, 피셔 사이언티픽 센트리픽 228 원심분리기를 사용하여(3300 rpm) 10 분 동안 혼합물을 원심분리함으로써 층의 분리를 보조하였다. 양자 모두의 층의 0.100 mL를 취하였다. 유기, 상층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 톨루엔 용액으로 1.00 mL까지 희석하고, 수층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 메탄올 용액으로 1.00 mL까지 희석하였다. 보정된 GC를 사용하여 양자 모두의 상에서 i-BuOH의 농도를 측정하였다. 이렇게 측정된 분배 계수는 2.70였다.
6 중량% i-BuOH 농도에 대하여 상기와 같이 동일한 분배 계수 측정을 실행하였다. 이렇게 측정된 분배 계수는 3.06이었다.
하기의 실시예 4 내지 6에서, 추출제의 분배 계수를 결정하기 위해 사용된 방법은 정지형 방법(quiescent method)이었다. 정지형 방법에 있어서, 5 mL의 3% 또는 6%(w/v) 아이소부탄올 수용액을 바이알에 넣고, 물리적 상들이 혼합되지 않도록 5 mL의 관심 대상 용매를 수용액 상단에 신중하게 첨가하였다. 제시된 기간의 시간 후에, 용매상 및 수성상의 맑은 부분의 샘플을 수거하고 GC에 의해 아이소부탄올 함량을 분석하였다. 이 분석에 있어서 임의의 유탁액 층은 무시하였다. GC 분석을 위하여, 100 uL의 샘플을 400 uL의 아이소프로판올에 첨가하였다. 500 uL의 다이에틸렌 글리콜 다이에틸 에테르(내부 표준품) 용액을 첨가하고, FID 검출기를 가진 카보왁스(Carbowax)(등록상표) 컬럼에 용액을 주입하여 아이소부탄올의 농도를 결정하였다.
본 발명에 따른 추출제의 분배 계수를 결정하기 위하여, 당업계에 공지된 다른 방법 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 진탕 방법을 사용할 수 있다. 진탕 방법의 예로서, 5 mL의 3% 또는 6%(w/v) 아이소부탄올 수용액을 5 mL의 관심 대상 용매와 함께 원심분리기 튜브에 첨가할 수 있다. 튜브를 1 분 동안 격렬하게 진탕할 수 있다. 그 후에 튜브를 대략 12500 G에서 15 분 동안 원심분리기 내에 회전시킬 수 있다. 맑은 용매 층 및 맑은 수성 층의 시료를 수거하여 상기 방법에 의해 아이소부탄올 함량을 분석할 수 있다.
실시예 4
옥수수 오일 지방산
둥근 바닥 플라스크(5 L)에 기계식 교반기, 열전쌍, 가열 맨틀, 응축기, 및 질소 티(nitrogen tee)를 장착하였다. 500 g의 식품 등급 옥수수 오일, 1 L의 물, 및 75 g의 소듐 하이드록사이드를 투입하였다. 혼합물을 90℃로 가열하고 3 시간 동안 유지하였으며, 이 시간 동안에 혼합물은 단일하고 진한 유탁액 같은 단일상이 되었다. 이 시간의 종료점에, TLC는 혼합물 내에 옥수수 오일이 남아있지 않음을 나타낸다. 그 후에 혼합물을 72℃로 냉각시키고 500 mL의 25% 황산을 첨가하여 혼합물을 산성화하였다. 그 후에 이를 실온으로 냉각시키고 2 L의 다이에틸 에테르를 첨가하였다. 에테르 층을 3x1 L의 1% 황산, 1x1 L의 포화 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켜 여과하였다. 회전식 증발기에 의해 에테르를 제거한 후, 오일을 질소로 밤새 퍼지하여, 밤새 부분적으로 결정화된 470 g의 황색 오일을 얻었다. AOCS 방법 Ca 5a-40을 통한 유리 지방산에 대한 적정은 올레산으로서 표시된 95%의 지방산 함량을 나타낸다. 1 mL의 건조 피리딘 중에서 104 mg을 100 uL의 N-메틸-N-(트라이메틸실릴)트라이플루오로아세트아미드와 반응시킴으로써 샘플을 실란화하였다. 실란화 산물의 기체 크로마토그래피-질량 분석법(GCMS: Gas chromatography-mass spectrometry) 분석은 16:0, 18:2, 18:1, 18:0, 및 20:0 산의 TMS 유도체의 존재를 나타낸다.
정지형 방법에 의해 결정된 바와 같이, 초기 6% I-BuOH 농도에서 168 시간 후에 COFA/물 시스템 중의 아이소부탄올의 분배 계수는 2.8이다.
실시예 5
옥수수 오일 지방산 메틸 에스테르(FAME)
둥근 바닥 플라스크(5 L)에 기계식 교반기, 열전쌍, 가열 맨틀, 응축기, 및 질소 티를 장착하였다. 1500 g의 식품 등급 옥수수 오일, 1500 g의 메탄올, 및 30 g의 진한 황산을 투입하였다. 혼합물을 24 시간 동안 환류시킨 후, 박층 크로마토그래피를 실행하였다. 그 후에 반응 혼합물을 냉각시키고 층을 분리하였다. 유기 층을 1x1 L의 물, 1x1 L의 포화 소듐 바이카르보네이트, 2x1 L의 물, 1x1 L의 포화 염수로 세척한 후, MgSO4 상에서 건조시켰다. 1416 g의 연황색 오일을 수득하였다. GCMS 분석은 산 16:0, 18:2, 18:1, 18:0, 20:1, 및 20:0의 메틸 에스테르의 존재를 나타낸다. AOCS 방법 Ca 5a-40을 통한 유리 지방산에 대한 적정은 올레산으로서 표시된 0.2%의 지방산 함량을 나타낸다.
정지형 방법에 의해 결정된 바와 같이, 초기 6% I-BuOH 농도에서 236 시간 후에 FAME/물 시스템 중의 아이소부탄올의 분배 계수는 1.06이다.
실시예 6
옥수수 오일 에틸렌 글리콜 에스테르(FAGE)
둥근 바닥 플라스크(3L)에 기계식 교반기, 열전쌍, 가열 맨틀, 딘-스타크 트랩, 응축기, 질소 퍼지, 및 질소 티를 장착하고; 1000 g의 옥수수 오일 지방산 메틸 에스테르(FAME) 및 1000 g의 에틸렌 글리콜을 투입하였다. 2 g의 깨끗한 소듐을 혼합물에 첨가하고, 이를 60℃로 가열한다. 90 분 후에, 온도를 100℃로 증가시키고, 반응 혼합물 내로 질소를 천천히 표면하 스파지 한다. 딘-스타크 트랩 내에 메탄올을 수집한다. 온도를 3 시간에 걸쳐 160℃로 천천히 증가시키고, 반응 혼합물로부터 메탄올을 계속 증류한다. 추가로 2 시간 후에, 총 100 mL의 메탄올이 수집되었다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 20 g의 25% 황산으로 중화시켰다. 층을 분리하고 상층을 4x200 ml의 10% 칼슘 클로라이드 용액으로 세척하였다. 유탁액이 형성되었으나 시간이 지나면 분리되었다. 유기 층을 250 mL의 포화 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하여 916 g의 맑은 황색 오일을 수득하였다. AOCS 방법 Ca 5a-40을 통한 유리 지방산에 대한 적정은 2.9%의 존재하는 산을 나타낸다(올레산으로서 표시). 1 ml의 건조 피리딘 중에서 109 mg을 100 uL의 N-메틸-N-(트라이메틸실릴)트라이플루오로아세트아미드와 반응시킴으로써 샘플을 실란화하였다. 실란화 산물의 GCMS 분석은 16:0, 18:2, 18:1, 및 18:0 에틸렌 글리콜 모노에스테르와 함께 16:0, 18:2, 및 18:1 산의 TMS 유도체의 존재를 나타낸다.
정지형 방법에 의해 결정된 바와 같이, 초기 6% I-BuOH 농도에서 192 시간 후에 FAGE/물 시스템 중의 아이소부탄올의 분배 계수는 2.3이다.
실시예 7
발효 비교예
표 2에 열거된 재료를 실시예 7의 비교예에 사용하였다. 모든 상업적 시약은 받은 대로 사용하였다. 옥수수 오일로부터 합성한 용매 또한 받은 대로 사용하였다.
Figure pct00008
일반 방법
아머샴 바이오사이언시즈 울트로스펙 2100 프로(Amersham Biosciences Ultrospec 2100 Pro) 분광광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 측정은 전형적으로 600 나노미터의 파장에서 실행하였다.
YSI 라이프 사이언시즈 2700 셀렉트 바이오케미스트리 어낼라이저(YSI Life Sciences 2700 Select Biochemistry Analyzer)를 사용하여 글루코스 농도를 측정하였다. 발효 샘플을 13,200 rpm에서 2 분 동안 1.7 mL 마이크로원심분리기 튜브 내에서 원심분리하고 수성 상등액을 글루코스 농도에 대하여 분석하였다.
발효 조건: 30% pO2; 온도: 30℃; pH 5.5(달리 언급하지 않는 한); 초기 회분 글루코스: 20 g/L, 생산 중에 유지됨.
각각 수성상 및 용매상 내의 아이소부탄올의 정량(quantization)을 위하여 HPLC 및 GC 분석 양자 모두를 사용하였다. 0.2 um 나일론 필터를 통해 여과한 후, 하기의 조건 하에 HPLC(애질런트(Agilent) 1100, 애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로 수성 중의 아이소부탄올을 측정하였다:
컬럼: 바이오-라드(Bio-Rad), 아미넥스(Aminex) HPX-87H, No. 125-0143
이동상: 0.01 M Na2HPO4, pH=8.0
주입 부피: 10 uL
유속: 0.6 mL/분
진행 시간: 22.5 분
컬럼 온도: 65℃
검출기: 굴절률
검출기 온도: 40℃
UV 검출: 210 nm, 4 nm 대역폭, 기준 360 nm, 100 nm 대역폭.
하기의 조건 하에 GC(HP6890, 애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로 용매상을 측정하였다:
컬럼: J&W 사이언티픽 DB 왁스터(J&W Scientific DB Waxter)(50 m X 0.32 mm ID, 1 um 필름)
기체 담체: 헬륨 4 mL/분
주입 부피: 2 uL
보충 유속: 40 mL/분
진행 시간: 29 분
오븐 온도: 5 분 동안 40℃, 40℃로부터 230℃까지 10℃/분으로,
5 분 230℃
주입기 분할: 250℃에서 1:5
화염 이온화 검출: 250℃
비교예: 옥수수 오일 유래의 추출제의 GLNOR635A-640A
및 그의 구성요소
표 3에 열거된 수-비혼화성 추출제를 사용하여 일련의 비교예를 수행하였다. 시간 0에 추출제를 발효기 브로스에 첨가하여 발효의 지속을 위해 배양물을 용매에 노출시켰다. 아이소부탄올 농도를 수성상 및 유기상 양자 모두에서 측정하여 추출 용매의 분배 계수를 계산하였다. 추출제에 대한 미생물의 생체적합성을 결정하기 위하여 글루코스 이용을 사용하였다.
Figure pct00009
균주 NGCI-065를 사용하여 기술한 바와 같이 발효를 실행하였다. 접종물을 2 단계로 제조하고 인큐베이터 진탕기(인노바(Innova) 4200, 뉴 브런스위크 사이언티픽(New Brunswick Scientific), 뉴저지주 에디슨 소재) 내에 30℃ 및 250 rpm에서 인큐베이션하였다. 제1 단계 또는 프리-시드(pre-seed)는 냉동 글리세롤 종균 스톡으로부터 접종하였으며, 30 mL의 여과 멸균된 프리-시드 배지(표 4)가 있는 250 mL 플라스크에 2개의 바이알을 넣고 24 시간 동안 대략 2의 OD까지 성장시켰다. 그 후에 제2 단계를 위해 270 mL의 여과 멸균된 종균 배지(표 5)가 있는 2 L 플라스크에 15 mL의 프리-시드를 이전하고, 이를 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에 30 mL의 여과 멸균된 10X YEP 및 300 mL의 여과 멸균된 90 내지 95% 올레일 알코올을 첨가하고, 종균 배양물의 수성상 내의 대략 5 내지 10의 최종 OD까지 추가로 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 실시예 GLNOR639 및 GLNOR640에 있어서, pH는 4.5였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
발효 용기(애플리콘 AD1010 생물반응기(Applikon AD1010 Bioreactor), 애플리콘 바이오테크놀로지(Applikon Biotechnology), 뉴저지주 도버 소재)를 탈이온 H2O로 30 분 동안 멸균하였다(암스코 르네상스 3033 레바스 스팀 스테릴라이저(Amsco Renaissance 3033 Revas Steam Sterilizer), 스테리스 코포레이션(Steris Corporation), 오하이오주 멘토 소재). 일단 고압멸균기 내에서 용기의 멸균이 완료되고 30℃로 냉각되면, 멸균 탈이온 H2O를 제거하고 여과 멸균된 발효 배지를 280 mL의 부피로 첨가하였다. 제2 단계 종균 플라스크로부터 70 mL의 수성상을 350 mL의 최종 수성 부피로 발효 용기에 첨가하였다. 접종 후 즉시, 대략 1:1의 최종 용매 대 브로스 비율을 위해 450 mL의 각각의 추출 용매와 더불어 100 mL의 10X YEP 배지 보충제를 첨가하였다. 발효 설정값 조건은 온도 30℃, pO2 30%, GLNOR635A-638A에서의 pH 5.5 및 GLNOR639A-640A에서의 pH 4.5였다. 접종 시간으로부터 대략 8 시간마다 발효를 샘플링하여, 글루코스 농도를 모니터하였으며, 50% w/w 글루코스 용액의 첨가를 통해 이를 5 내지 20 g/L로 유지하였고, 수성상 및 추출제상 양자 모두에서 아이소부탄올 축적을 분석하였다. 양자 모두의 상으로부터 샘플을 얻기 위하여 각각의 시점에 충분한 샘플 부피를 취한 후, 각각의 클린 컷(clean cut)을 보장하기 위하여 그들 샘플을 원심분리하였다.
Figure pct00012
비교예: 옥수수 오일 유래의 추출제의 GLNOR661A-666A 및 그의 구성요소
표 7에 열거된 수-비혼화성 추출제를 사용하여 비교예 GLNOR661A-666A를 수행하였다. 시간 0에서의 보충 첨가, pH, 및 균주를 제외하고는, 전기의 실시예 GLNOR635A-640A에서와 동일하게 이 세트의 실시예를 수행하였다. 이 일련의 실시예에서는 균주 NGCI-070을 사용하였고, pH 설정값은 5.5였으며, 100 mL 효모 추출물 펩톤 대신에 4 mL 니코틴산/ 티아민 배지 보충제를 첨가하였다.
Figure pct00013
비교예: 옥수수 오일 유래의 추출제의 GLNOR690A-695A 및 그의 구성요소
표 8에 열거된 수-비혼화성 추출제를 사용하여 비교예 GLNOR690A-695A를 수행하였다. 전기의 실시예 GLNOR661A-666A에서와 동일하게 이 세트의 실시예를 수행하였다. 균주 NGCI-070을 사용하였다.
Figure pct00014
옥수수 오일 유래의 추출제의 비교예 GLNOR721A-726A 및 그의 구성요소
표 9에 열거된 수-비혼화성 추출제를 사용하여 비교예 GLNOR721A-726A를 수행하였다. 전기의 실시예 GLNOR690A-695A에서와 동일하게 이 세트의 실시예를 수행하였다. 균주 NGCI-070을 사용하였다.
Figure pct00015
비교예: 옥수수 오일 유래의 추출제의 GLNOR749A-754A 및 그의 구성요소
표 10에 열거된 수-비혼화성 추출제를 사용하여 비교예 GLNOR749A-754A를 수행하였다. 전기의 실시예 GLNOR721A-726A에서와 동일하게 이 세트의 실시예를 수행하였다. 균주 NGCI-070을 사용하였다.
Figure pct00016
발효 실시예 GLNOR635A-640A, GLNOR661A-666A, GLNOR690A-695A, GLNOR721A-726A, GLNOR749A-754A에 대한 성능 데이터는 표 11에 요약되어 있으며, 이는 올레일 알코올 및 아이소폴(상표)의 관용적인 상업적 용매와 비교하여 예시적인 옥수수 오일 유래의 추출제 및 그의 구성요소에 대한 수성 아이소부탄올 농도(g/L), 용매 아이소부탄올 농도(g/L), 및 용매 분배 계수(Kp)를 제공한다.
Figure pct00017
실시예 8
지방 알코올 하이드록실화(65% 하이드록실화)
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된 3-구 250 mL 플라스크에 지방 알코올 혼합물(43 g, 0.16 mmol), 톨루엔(25.0 mL), 앰버라이트 IR-120 수지(12.5 g), 및 빙초산(7.5 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 후, 과산화수소(물 중의 30% H2O2 41.8 g)를 30 분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 2 시간 동안 교반하고, 그 시간에 반응 혼합물을 워크업하였다: 여과에 의해 수지를 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 mL)와 물(50 mL) 사이에 분배시켰다. 층을 분리한 후에, 유기 층을 포화 NaHCO3 수용액(50 mL), 및 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 50 g의 황색 오일을 얻었다. 조 반응 산물의 1H NMR 분석은 이중 결합의 65%가 에폭시화되었음을 나타냈다. 생성된 혼합물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
500 mL 둥근 바닥 플라스크에 에폭시화 지방 알코올(14.5 g), THF(200.0 mL), 및 황산(100 mL의 1.7 M 수용액)을 첨가하였다. 혼탁한 혼합물을 50℃에서 밤새 교반한 후, 물(100 mL)과 에틸 아세테이트(200 mL) 사이에 분배시킴으로써 워크업하였다. 유기 층을 물(2x100mL)로 세척한 후, 포화 NaHCO3 수용액(100 mL)에 이어서 염수(100 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에 농축하여 14.7 g의 진한 맑은 액체 및 백색 고체 혼합물을 얻었다.
분배 계수의 측정
3% i-BuOH 수용액의 1 mL 용액에 1 mL의 하이드록실화 지방 알코올 혼합물을 첨가하고, 생성된 2-상 혼합물을 10 분 동안 보텍스를 사용하여 격렬하게 교반하였다. 6% i-BuOH 용액에도 이중으로 실험을 실행하였다. 혼합 후에, 층을 분리하고, 양자 모두의 층으로부터 샘플을 취하여 GC를 사용하여 i-BuOH 농도를 측정하였다(표 12). 3.7의 분배 계수가 관찰되었다.
Figure pct00018
본 발명의 다양한 실시 형태를 상기 기술하였으나, 그들은 단지 예로서 제공된 것일 뿐 한정하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 사상 및 범주로부터 이탈하지 않으면서 그 안에서 형태 및 세부 사항을 다양하게 변경할 수 있음은, 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범주는 상기의 예시적 실시 형태 중 임의의 것에 의해 한정되어서는 안되고, 단지 하기의 특허청구범위 및 그의 균등물에 따라 정의되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 본 발명이 관련되는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 시사하며, 각각의 개별적인 공보, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 제시한 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Butamax(TM) Advanced Biofuels <120> EXTRACTION SOLVENTS DERIVED FROM OIL FOR ALCOHOL REMOVAL IN EXTRACTIVE FERMENTATION <130> CL5000USNA <150> US 61/356,290 <151> 2010-06-18 <150> US 61/368,451 <151> 2010-07-28 <150> US 61/368,436 <151> 2010-07-28 <150> US 61/368,444 <151> 2010-07-28 <150> US 61/368,429 <151> 2010-07-28 <150> US 61/379,546 <151> 2010-09-02 <150> US 61/440,034 <151> 2011-02-07 <150> US 13/160,766 <151> 2011-06-15 <160> 143 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11844 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Plasmid <400> 1 tcccattacc gacatttggg cgctatacgt gcatatgttc atgtatgtat ctgtatttaa 60 aacacttttg tattattttt cctcatatat gtgtataggt ttatacggat gatttaatta 120 ttacttcacc accctttatt tcaggctgat atcttagcct tgttactagt tagaaaaaga 180 catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc tagaagcaaa 240 aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca acgcaatatg 300 gattgtcaga atcatataaa agagaagcaa ataactcctt gtcttgtatc aattgcatta 360 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gcatgaacgc tgaaggtcct gtcatcatcg atgtcccggt tgactacagt 2100 gataacatta atttagcaag tgacaagctt ccgaaagaat tcggggaact catgaaaacg 2160 aaagctctct agttaattaa tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc 2220 ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat 2280 ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt 2340 ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt 2400 tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcgg gcggccgcac ctggtaaaac ctctagtgga 2460 gtagtagatg taatcaatga agcggaagcc aaaagaccag agtagaggcc tatagaagaa 2520 actgcgatac cttttgtgat ggctaaacaa acagacatct ttttatatgt ttttacttct 2580 gtatatcgtg aagtagtaag tgataagcga atttggctaa gaacgttgta agtgaacaag 2640 ggacctcttt tgcctttcaa aaaaggatta aatggagtta atcattgaga tttagttttc 2700 gttagattct gtatccctaa ataactccct tacccgacgg gaaggcacaa aagacttgaa 2760 taatagcaaa cggccagtag ccaagaccaa ataatactag agttaactga tggtcttaaa 2820 caggcattac gtggtgaact ccaagaccaa tatacaaaat atcgataagt tattcttgcc 2880 caccaattta aggagcctac atcaggacag tagtaccatt cctcagagaa gaggtataca 2940 taacaagaaa atcgcgtgaa caccttatat aacttagccc gttattgagc taaaaaacct 3000 tgcaaaattt cctatgaata agaatacttc agacgtgata aaaatttact ttctaactct 3060 tctcacgctg cccctatctg ttcttccgct ctaccgtgag aaataaagca tcgagtacgg 3120 cagttcgctg tcactgaact aaaacaataa ggctagttcg aatgatgaac ttgcttgctg 3180 tcaaacttct gagttgccgc tgatgtgaca ctgtgacaat aaattcaaac cggttatagc 3240 ggtctcctcc ggtaccggtt ctgccacctc caatagagct cagtaggagt cagaacctct 3300 gcggtggctg tcagtgactc atccgcgttt cgtaagttgt gcgcgtgcac atttcgcccg 3360 ttcccgctca tcttgcagca ggcggaaatt ttcatcacgc tgtaggacgc aaaaaaaaaa 3420 taattaatcg tacaagaatc ttggaaaaaa aattgaaaaa ttttgtataa aagggatgac 3480 ctaacttgac tcaatggctt ttacacccag tattttccct ttccttgttt gttacaatta 3540 tagaagcaag acaaaaacat atagacaacc tattcctagg agttatattt ttttacccta 3600 ccagcaatat aagtaaaaaa ctgtttaaac agtatggcag ttacaatgta ttatgaagat 3660 gatgtagaag tatcagcact tgctggaaag caaattgcag taatcggtta tggttcacaa 3720 ggacatgctc 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Primer <400> 27 aattcgtttg agtacactac taatggcttt gttggcaata tgtttttgc 49 <210> 28 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 28 atatagcaaa aacatattgc caacaaagcc attagtagtg tactcaaac 49 <210> 29 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 29 tatggaccct gaaaccacag ccacattctt gttatttata aaaagacac 49 <210> 30 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 30 ctcccgtgtc tttttataaa taacaagaat gtggctgtgg tttcagggt 49 <210> 31 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 31 taccgtaggc gtccttagga aagatagaag gccatgaagc tttttcttt 49 <210> 32 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 32 attggaaaga aaaagcttca tggccttcta tctttcctaa ggacgccta 49 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 33 ttattgtttg gcatttgtag c 21 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 34 ccaagcatct cataaaccta tg 22 <210> 35 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cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 14400 aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 14460 tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 14520 tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 14580 gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 14640 atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 14700 taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga acgaagcatc tgtgcttcat 14760 tttgtagaac aaaaatgcaa cgcgagagcg ctaatttttc aaacaaagaa tctgagctgc 14820 atttttacag aacagaaatg caacgcgaaa gcgctatttt accaacgaag aatctgtgct 14880 tcatttttgt aaaacaaaaa tgcaacgcga gagcgctaat ttttcaaaca aagaatctga 14940 gctgcatttt tacagaacag aaatgcaacg cgagagcgct attttaccaa caaagaatct 15000 atacttcttt tttgttctac aaaaatgcat cccgagagcg ctatttttct aacaaagcat 15060 cttagattac tttttttctc ctttgtgcgc tctataatgc agtctcttga taactttttg 15120 cactgtaggt ccgttaaggt tagaagaagg ctactttggt gtctattttc tcttccataa 15180 aaaaagcctg actccacttc ccgcgtttac tgattactag cgaagctgcg ggtgcatttt 15240 ttcaagataa aggcatcccc gattatattc tataccgatg tggattgcgc atactttgtg 15300 aacagaaagt gatagcgttg atgattcttc attggtcaga aaattatgaa cggtttcttc 15360 tattttgtct ctatatacta cgtataggaa atgtttacat tttcgtattg ttttcgattc 15420 actctatgaa tagttcttac tacaattttt ttgtct 15456 <210> 68 <211> 1559 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Template <400> 68 gcattgcgga ttacgtattc taatgttcag taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag 60 ttatgcagat tgtactgaga gtgcaccata ccaccttttc aattcatcat ttttttttta 120 ttcttttttt tgatttcggt ttccttgaaa tttttttgat tcggtaatct ccgaacagaa 180 ggaagaacga aggaaggagc acagacttag attggtatat atacgcatat gtagtgttga 240 agaaacatga aattgcccag tattcttaac ccaactgcac agaacaaaaa cctgcaggaa 300 acgaagataa atcatgtcga aagctacata taaggaacgt gctgctactc atcctagtcc 360 tgttgctgcc aagctattta atatcatgca cgaaaagcaa acaaacttgt gtgcttcatt 420 ggatgttcgt accaccaagg aattactgga gttagttgaa gcattaggtc ccaaaatttg 480 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ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt 1380 tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 1440 aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagataact 1500 tcgtataatg tatgctatac gaacggtacc agtgatgata caacgagtta gccaaggtg 1559 <210> 69 <211> 1047 <212> DNA <213> Achromobacter xylosoxidans <400> 69 atgaaagctc tggtttatca cggtgaccac aagatctcgc ttgaagacaa gcccaagccc 60 acccttcaaa agcccacgga tgtagtagta cgggttttga agaccacgat ctgcggcacg 120 gatctcggca tctacaaagg caagaatcca gaggtcgccg acgggcgcat cctgggccat 180 gaaggggtag gcgtcatcga ggaagtgggc gagagtgtca cgcagttcaa gaaaggcgac 240 aaggtcctga tttcctgcgt cacttcttgc ggctcgtgcg actactgcaa gaagcagctt 300 tactcccatt gccgcgacgg cgggtggatc ctgggttaca tgatcgatgg cgtgcaggcc 360 gaatacgtcc gcatcccgca tgccgacaac agcctctaca agatccccca gacaattgac 420 gacgaaatcg ccgtcctgct gagcgacatc ctgcccaccg gccacgaaat cggcgtccag 480 tatgggaatg tccagccggg cgatgcggtg gctattgtcg gcgcgggccc cgtcggcatg 540 tccgtactgt tgaccgccca gttctactcc ccctcgacca tcatcgtgat cgacatggac 600 gagaatcgcc tccagctcgc caaggagctc ggggcaacgc acaccatcaa ctccggcacg 660 gagaacgttg tcgaagccgt gcataggatt gcggcagagg gagtcgatgt tgcgatcgag 720 gcggtgggca taccggcgac ttgggacatc tgccaggaga tcgtcaagcc cggcgcgcac 780 atcgccaacg tcggcgtgca tggcgtcaag gttgacttcg agattcagaa gctctggatc 840 aagaacctga cgatcaccac gggactggtg aacacgaaca cgacgcccat gctgatgaag 900 gtcgcctcga ccgacaagct tccgttgaag aagatgatta cccatcgctt cgagctggcc 960 gagatcgagc acgcctatca ggtattcctc aatggcgcca aggagaaggc gatgaagatc 1020 atcctctcga acgcaggcgc tgcctga 1047 <210> 70 <211> 348 <212> PRT <213> Achromobacter xylosoxidans <400> 70 Met Lys Ala Leu Val Tyr His Gly Asp His Lys Ile Ser Leu Glu Asp 1 5 10 15 Lys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Lys Pro Thr Asp Val Val Val Arg Val 20 25 30 Leu Lys Thr Thr Ile Cys Gly Thr Asp Leu Gly Ile Tyr Lys Gly Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Val Ala Asp Gly Arg Ile Leu Gly His Glu Gly Val Gly 50 55 60 Val Ile Glu Glu Val Gly Glu Ser Val Thr Gln Phe Lys Lys Gly Asp 65 70 75 80 Lys Val Leu Ile Ser Cys Val Thr Ser Cys Gly Ser Cys Asp Tyr Cys 85 90 95 Lys Lys Gln Leu Tyr Ser His Cys Arg Asp Gly Gly Trp Ile Leu Gly 100 105 110 Tyr Met Ile Asp Gly Val Gln Ala Glu Tyr Val Arg Ile Pro His Ala 115 120 125 Asp Asn Ser Leu Tyr Lys Ile Pro Gln Thr Ile Asp Asp Glu Ile Ala 130 135 140 Val Leu Leu Ser Asp Ile Leu Pro Thr Gly His Glu Ile Gly Val Gln 145 150 155 160 Tyr Gly Asn Val Gln Pro Gly Asp Ala Val Ala Ile Val Gly Ala Gly 165 170 175 Pro Val Gly Met Ser Val Leu Leu Thr Ala Gln Phe Tyr Ser Pro Ser 180 185 190 Thr Ile Ile Val Ile Asp Met Asp Glu Asn Arg Leu Gln Leu Ala Lys 195 200 205 Glu Leu Gly Ala Thr His Thr Ile Asn Ser Gly Thr Glu Asn Val Val 210 215 220 Glu Ala Val His Arg Ile Ala Ala Glu Gly Val Asp Val Ala Ile Glu 225 230 235 240 Ala Val Gly Ile Pro Ala Thr Trp Asp Ile Cys Gln Glu Ile Val Lys 245 250 255 Pro Gly Ala His Ile Ala Asn Val Gly Val His Gly Val Lys Val Asp 260 265 270 Phe Glu Ile Gln Lys Leu Trp Ile Lys Asn Leu Thr Ile Thr Thr Gly 275 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aaagccggtt 480 tacatcaatt tacctgtaga tgtagctgcc gctaaggctg aaaaaccatc cttgcctctt 540 aagaaggaaa attccacgtc gaatacatct gatcaagaga ttctgaacaa aatacaggaa 600 agtctgaaga atgccaagaa accaattgta atcacaggcc atgaaattat atcgttcggc 660 ctagagaaga ctgttactca gtttatttca aagactaagt tacctattac tactttgaac 720 tttggtaaat catctgttga tgaagcattg ccctcatttt tggggattta caacggtact 780 ctgtcagagc caaacttgaa ggaatttgtg gaatctgctg attttattct tatgttgggt 840 gtaaagctta ccgattctag tacgggtgca tttactcacc atcttaatga aaataaaatg 900 atttccttga atatcgatga aggtaaaatt ttcaacgaaa gaatccaaaa tttcgacttc 960 gaatccctga tatcatctct tcttgacttg tccgaaattg aatataaagg caagtacata 1020 gataaaaagc aagaagattt tgtaccttct aacgcgctgt tgtcacaaga tagactgtgg 1080 caagctgtcg aaaatttgac ccaaagtaat gagacgatcg tggctgaaca aggcacttct 1140 ttcttcggtg cctcatctat atttctgaaa tcgaaatcac attttattgg tcaacccttg 1200 tggggatcta taggatacac tttccccgca gctctaggca gccaaattgc agataaagaa 1260 tctagacatt tattgtttat cggagatgga tcattgcaac tgactgtcca agaattagga 1320 ctagccatta gagagaagat aaacccaatc tgctttatca ttaataacga tggttacacg 1380 gttgagaggg aaattcatgg tccgaaccag agttataatg acattcctat gtggaattac 1440 tcaaaactgc cagaaagttt cggggcaacg gaagacagag ttgtgtccaa aattgtgaga 1500 acagaaaatg aattcgtatc cgtgatgaaa gaagctcaag cagatccaaa taggatgtat 1560 tggatagaac ttattctagc aaaggagggt gcacctaaag ttttgaaaaa gatgggtaag 1620 ttatttgcag aacaaaacaa gagc 1644 <210> 72 <211> 753 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 72 gcatgcttgc atttagtcgt gcaatgtatg actttaagat ttgtgagcag gaagaaaagg 60 gagaatcttc taacgataaa cccttgaaaa actgggtaga ctacgctatg ttgagttgct 120 acgcaggctg cacaattaca cgagaatgct cccgcctagg atttaaggct aagggacgtg 180 caatgcagac gacagatcta aatgaccgtg tcggtgaagt gttcgccaaa cttttcggtt 240 aacacatgca gtgatgcacg cgcgatggtg ctaagttaca tatatatata tatagccata 300 gtgatgtcta agtaaccttt atggtatatt tcttaatgtg gaaagatact agcgcgcgca 360 cccacacaca agcttcgtct tttcttgaag aaaagaggaa gctcgctaaa tgggattcca 420 ctttccgttc cctgccagct gatggaaaaa ggttagtgga acgatgaaga ataaaaagag 480 agatccactg aggtgaaatt tcagctgaca gcgagtttca tgatcgtgat gaacaatggt 540 aacgagttgt ggctgttgcc agggagggtg gttctcaact tttaatgtat ggccaaatcg 600 ctacttgggt ttgttatata acaaagaaga aataatgaac tgattctctt cctccttctt 660 gtcctttctt aattctgttg taattacctt cctttgtaat tttttttgta attattcttc 720 ttaataatcc aaacaaacac acatattaca ata 753 <210> 73 <211> 316 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 73 gagtaagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata 60 agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt 120 aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc tcttattgac 180 cacacctcta ccggcatgcc gagcaaatgc ctgcaaatcg ctccccattt cacccaattg 240 tagatatgct aactccagca atgagttgat gaatctcggt gtgtatttta tgtcctcaga 300 ggacaacacc tgtggt 316 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 74 ggaattcaca catgaaagct ctggtttatc 30 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 75 gcgtccaggg cgtcaaagat 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gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 540 cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 600 ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 660 tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 720 gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 780 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 840 gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 900 tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 960 ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 1020 agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 1080 gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 1140 attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 1200 agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 1260 atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 1320 cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 1380 ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 1440 agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 1500 tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 1560 gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 1620 caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 1680 ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 1740 gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 1800 tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 1860 tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 1920 cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 1980 cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 2040 gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 2100 atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 2160 agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 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gaaccacggc 540 gatatgacca aagaagaagt taaagctttg gaatgtaatg cttgtcccgg tcctggaggc 600 tgcggtggta tgtatactgc taacacaatg gcgacagcta ttgaagtttt gggacttagc 660 cttccgggtt catcttctca cccggctgaa tccgcagaaa agaaagcaga tattgaagaa 720 gctggtcgcg ctgttgtcaa aatgctcgaa atgggcttaa aaccttctga cattttaacg 780 cgtgaagctt ttgaagatgc tattactgta actatggctc tgggaggttc aaccaactca 840 acccttcacc tcttagctat tgcccatgct gctaatgtgg aattgacact tgatgatttc 900 aatactttcc aagaaaaagt tcctcatttg gctgatttga aaccttctgg tcaatatgta 960 ttccaagacc tttacaaggt cggaggggta ccagcagtta tgaaatatct ccttaaaaat 1020 ggcttccttc atggtgaccg tatcacttgt actggcaaaa cagtcgctga aaatttgaag 1080 gcttttgatg atttaacacc tggtcaaaag gttattatgc cgcttgaaaa tcctaaacgt 1140 gaagatggtc cgctcattat tctccatggt aacttggctc cagacggtgc cgttgccaaa 1200 gtttctggtg taaaagtgcg tcgtcatgtc ggtcctgcta aggtctttaa ttctgaagaa 1260 gaagccattg aagctgtctt gaatgatgat attgttgatg gtgatgttgt tgtcgtacgt 1320 tttgtaggac caaagggcgg tcctggtatg cctgaaatgc tttccctttc atcaatgatt 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ttttaacttg aatttattct ctagctcttc caaccaagcc tcattgctcc ttgatttact 2280 ggtgaaaagt gatacacttt gcgcgcaatc caggtcaaaa ctttcctgca aagaattcac 2340 caatttctcg acatcatagt acaatttgtt ttgttctccc atcacaattt aatatacctg 2400 atggattctt atgaagcgct gggtaatgga cgtgtcactc tacttcgcct ttttccctac 2460 tccttttagt acggaagaca atgctaataa ataagagggt aataataata ttattaatcg 2520 gcaaaaaaga ttaaacgcca agcgtttaat tatcagaaag caaacgtcgt accaatcctt 2580 gaatgcttcc caattgtata ttaagagtca tcacagcaac atattcttgt tattaaatta 2640 attattattg atttttgata ttgtataaaa aaaccaaata tgtataaaaa aagtgaataa 2700 aaaataccaa gtatggagaa atatattaga agtctatacg ttaaa 2745 <210> 92 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 92 gacttttgga agcctgaaga aactggc 27 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 93 cttggcagca acaggactag 20 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 94 ccaggccaat tcaacagact gtcggc 26 <210> 95 <211> 2347 <212> DNA <213> 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A-sadB-BUC cassette <400> 141 aaggaaataa agcaaataac aataacacca ttattttaat tttttttcta ttactgtcgc 60 taacacctgt atggttgcaa ccaggtgaga atccttctga tgcatacttt atgcgtttat 120 gcgttttgcg ccccttggaa aaaaattgat tctcatcgta aatgcatact acatgcgttt 180 atgggaaaag cctccatatc caaaggtcgc gtttctttta gaaaaactaa tacgtaaacc 240 tgcattaagg taagattata tcagaaaatg tgttgcaaga aatgcattat gcaatttttt 300 gattatgaca atctctcgaa agaaatttca tatgatgaga cttgaataat gcagcggcgc 360 ttgctaaaag aacttgtata taagagctgc cattctcgat caatatactg tagtaagtcc 420 tttcctctct ttcttattac acttatttca cataatcaat ctcaaagaga acaacacaat 480 acaataacaa gaagaacaaa atgaaagctc tggtttatca cggtgaccac aagatctcgc 540 ttgaagacaa gcccaagccc acccttcaaa agcccacgga tgtagtagta cgggttttga 600 agaccacgat ctgcggcacg gatctcggca tctacaaagg caagaatcca gaggtcgccg 660 acgggcgcat cctgggccat gaaggggtag gcgtcatcga ggaagtgggc gagagtgtca 720 cgcagttcaa gaaaggcgac aaggtcctga tttcctgcgt cacttcttgc ggctcgtgcg 780 actactgcaa gaagcagctt tactcccatt gccgcgacgg cgggtggatc 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gatgttagca 2520 gaattgtcat gcaagggctc cctagctact ggagaatata ctaagggtac tgttgacatt 2580 gcgaagagcg acaaagattt tgttatcggc tttattgctc aaagagacat gggtggaaga 2640 gatgaaggtt acgattggtt gattatgaca cccggtgtgg gtttagatga caagggagac 2700 gcattgggtc aacagtatag aaccgtggat gatgtggtct ctacaggatc tgacattatt 2760 attgttggaa gaggactatt tgcaaaggga agggatgcta aggtagaggg tgaacgttac 2820 agaaaagcag gctgggaagc atatttgaga agatgcggcc agcaaaacta aaaaactgta 2880 ttataagtaa atgcatgtat actaaactca caaattagag cttcaattta attatatcag 2940 ttattacccg ggaatctcgg tcgtaatgat ttctataatg acgaaaaaaa aaaaattgga 3000 aagaaaaagc ttcatggcct tctactttcc caacagatgt atacgctatc gtccaagtct 3060 tgtggggttc cattggtttc acagtcggcg ctctattggg tgctactatg gccgctgaag 3120 aacttgatcc aaagaagaga gttattttat tcattggtga cggttctcta caattgactg 3180 ttcaagaaat ctctaccatg attagatggg gtttgaagcc atacattttt gtcttgaata 3240 acaacggtta caccattgaa aaattgattc acggtcctca tgccgaatat aatgaaattc 3300 aaggttggga ccacttggcc ttattgccaa cttttggtgc tagaaactac 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Claims (38)

  1. 공급원료로부터 알코올을 생산할 수 있는 재조합 미생물;
    알코올; 및
    지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출제를 포함하며;
    여기서, 추출제는 공급원료로부터 생산되는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 추출제가 화학식 R(C=O)N(R')(R")의 하나 이상의 지방 아미드를 포함하며,
    여기서, R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R' 및 R"은 하나 이상의 하이드록실 기를 임의로 함유하는 C1 내지 C6 알킬 기 및 수소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 추출제가 화학식 R-(C=O)-OCHR'CHR"-OH의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며,
    여기서, R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R' 및 R"은 수소 및 C1 내지 C4 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 추출제가 화학식 R-(C=O)-OR'의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며,
    여기서, R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R'은 8개 탄소 이하의 알킬 기인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 추출제가 지방 아미드의 혼합물이고, 여기서, 지방 아미드의 혼합물은 리놀레아미드, 올레아미드, 팔미트아미드, 또는 스테아르아미드를 포함하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 추출제가 지방 아미드 및 지방산의 혼합물이고, 여기서, 지방 아미드 및 지방산의 혼합물은 리놀레아미드, 리놀레산, 올레아미드, 올레산, 팔미트아미드, 팔미트산, 스테아르아미드, 또는 스테아르산을 포함하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 추출제가 하이드록실화 트라이글리세라이드, 알콕실화 트라이글리세라이드, 하이드록실화 지방산, 알콕실화 지방산, 하이드록실화 지방 알코올, 및 알콕실화 지방 알코올로부터 선택되는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 추출제가 포화 지방산, 불포화 지방산, 포화 지방 알코올, 불포화 지방 알코올, 포화 지방 아미드, 불포화 지방 아미드, 포화 지방 에스테르, 불포화 지방 에스테르, 및 그의 혼합물로부터 선택되는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 알코올이 C1 내지 C8 알킬 알코올인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 공급원료가 호밀, 밀, 옥수수, 케인, 보리, 셀룰로스계 재료, 리그노셀룰로스계 재료, 또는 그의 혼합물을 포함하는 조성물.
  11. 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계;
    오일을 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 추출제로 화학적으로 전환할 수 있는 하나 이상의 물질과 오일을 접촉시킴으로써, 오일의 적어도 일부를 추출제로 전환하는 단계를 포함하는, 추출제의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 물질이 수성 암모늄 하이드록사이드, 무수 암모니아, 암모늄 아세테이트, 암모니아수, 과산화수소, 톨루엔, 빙초산, 리파아제, 및 양이온 교환 수지로부터 선택되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 산물 알코올에 대한 추출제의 분배 계수가, 오일이 추출제로 전환되기 전의 산물 알코올에 대한 오일의 분배 계수보다 큰 방법.
  14. 제12항에 있어서, 산물 알코올이 C1 내지 C8 알킬 알코올인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 오일을 하나 이상의 물질과 접촉시키기 전에 바이오매스로부터 오일을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 바이오매스가 옥수수 낟알, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 예를 들어, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보리짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스(switchgrass), 폐지, 사탕수수 버개스(bagasse), 수수, 사탕수수, 콩, 낟알의 제분으로부터 얻어지는 성분, 셀룰로스계 재료, 리그노셀룰로스계 재료, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 목재 조각, 톱밥, 관목 및 덤불, 야채, 과일, 꽃, 동물 퇴비, 또는 그의 혼합물을 포함하는 방법.
  17. (a) 올리고당류 및 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계;
    (b) 올리고당류를 단당류로 전환할 수 있는 당화 효소와 바이오매스를 접촉시키는 단계;
    (c) (a) 또는 (b)의 바이오매스로부터 오일을 분리하는 단계;
    (d) 분리된 오일을 하나 이상의 반응물 또는 용매와 접촉시켜 추출제를 형성시키는 단계;
    (e) 단당류를 산물 알코올로 전환할 수 있는 재조합 미생물을 포함하는 발효 브로스와 바이오매스를 접촉시킴으로써 산물 알코올을 생산하는 단계; 및
    (f) 산물 알코올을 추출제와 접촉시키는 단계를 포함하며,
    여기서, 추출제의 산물 알코올에 대한 분배 계수는 바이오매스의 오일의 산물 알코올에 대한 분배 계수보다 큰, 산물 알코올의 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서, 추출제가 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로부터 선택되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 추출제가 화학식 R(C=O)N(R')(R")의 하나 또는 지방 아미드를 포함하며,
    여기서, R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R' 및 R"은 하나 이상의 하이드록실 기를 임의로 함유하는 C1 내지 C6 알킬 기 및 수소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 추출제가 화학식 R-(C=O)-OCHR'CHR"-OH의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며,
    여기서, R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R' 및 R"은 수소 및 C1 내지 C4 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 추출제가 화학식 R-(C=O)-OR'의 하나 이상의 지방 에스테르를 포함하며,
    여기서, R은 하나 이상의 이중 결합이 임의로 개재된 C3 내지 C27 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R'은 8개 탄소 이하의 알킬 기인 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 추출제가 하이드록실화 트라이글리세라이드, 알콕실화 트라이글리세라이드, 하이드록실화 지방산, 알콕실화 지방산, 하이드록실화 지방 알코올, 및 알콕실화 지방 알코올로부터 선택되는 방법.
  23. 제17항에 있어서, 추출제가 포화 지방산, 불포화 지방산, 포화 지방 알코올, 불포화 지방 알코올, 포화 지방 아미드, 불포화 지방 아미드, 포화 지방 에스테르, 불포화 지방 에스테르, 및 그의 혼합물로부터 선택되는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 하나 이상의 반응물 또는 용매가 수성 암모늄 하이드록사이드, 무수 암모니아, 암모늄 아세테이트, 암모니아수, 과산화수소, 톨루엔, 빙초산, 리파아제, 및 양이온 교환 수지로부터 선택되는 방법.
  25. 제17항에 있어서, 산물 알코올이 C1 내지 C8 알킬 알코올인 방법.
  26. 제17항에 있어서, 오일이 탤로우 오일, 옥수수 오일, 카놀라 오일, 카프릭/카프릴릭 트라이글리세라이드, 피마자 오일, 코코넛 오일, 목화씨 오일, 어류 오일, 조조바 오일, 라드, 아마인 오일, 우각 오일, 오이티시카 오일, 팜 오일, 땅콩 오일, 유채씨 오일, 쌀 오일, 홍화 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 유동 오일, 자트로파 오일, 밀 오일, 호밀 오일, 보리 오일, 및 야채 오일 블렌드로부터 선택된 하나 이상의 오일을 포함하는 방법.
  27. (a) 발효 용기 내에서 산물 알코올을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 포함하는 발효 브로스를 제공함으로써 산물 알코올을 생산하는 단계;
    (b) 발효 브로스를 추출제와 접촉시켜 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성시키며, 여기서 산물 알코올 및 오일이 유기상 내로 분배됨으로써 유기상이 산물 알코올 및 오일을 포함하는 단계;
    (c) 수성상으로부터 유기상을 분리하는 단계;
    (d) 유기상으로부터 산물 알코올을 분리하는 단계를 포함하며;
    임의로 단계 (b) 및 (c)가 동시에 일어나는, 산물 알코올의 생산 방법.
  28. 제27항에 있어서, 추출제가 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로부터 선택되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 추출제가 하이드록실화 트라이글리세라이드, 알콕실화 트라이글리세라이드, 하이드록실화 지방산, 알콕실화 지방산, 하이드록실화 지방 알코올, 및 알콕실화 지방 알코올로부터 선택되는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 추출제가 포화 지방산, 불포화 지방산, 포화 지방 알코올, 불포화 지방 알코올, 포화 지방 아미드, 불포화 지방 아미드, 포화 지방 에스테르, 불포화 지방 에스테르, 및 그의 혼합물로부터 선택되는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 산물 알코올이 C1 내지 C8 알킬 알코올인 방법.
  32. 제27항에 있어서,
    공급원료 슬러리를 생산하는 단계;
    공급원료 슬러리를 분리하여 (i) 수성 층, (ii) 오일 층, 및 (iii) 고체 층을 생성시키는 단계; 및
    수성 층을 발효 용기에 공급하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제27항에 있어서,
    오일을 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 추출제로 화학적으로 전환할 수 있는 하나 이상의 물질과 오일 층의 오일을 접촉시킴으로써, 오일의 적어도 일부를 추출제로 전환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제27항에 있어서, 추출제의 산물 알코올에 대한 분배 계수가 오일 층의 오일의 산물 알코올에 대한 분배 계수보다 큰 방법.
  35. 제27항에 있어서, 산물 알코올이 C1 내지 C8 알킬 알코올인 방법.
  36. 제27항에 있어서, 오일이 탤로우 오일, 옥수수 오일, 카놀라 오일, 카프릭/카프릴릭 트라이글리세라이드, 피마자 오일, 코코넛 오일, 목화씨 오일, 어류 오일, 조조바 오일, 라드, 아마인 오일, 우각 오일, 오이티시카 오일, 팜 오일, 땅콩 오일, 유채씨 오일, 쌀 오일, 홍화 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 유동 오일, 자트로파 오일, 밀 오일, 호밀 오일, 보리 오일, 및 야채 오일 블렌드로부터 선택된 하나 이상의 오일을 포함하는 방법.
  37. 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계; 및
    오일의 적어도 일부를 지방산, 지방 알코올, 지방 아미드, 지방 에스테르, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 추출제로 전환하는 단계를 포함하는, 추출제의 생산 방법.
  38. 제37항에 있어서, 오일을 추출제로 전환하는 단계가, 테트라하이드로퓨란 및 리튬 알루미늄 하이드라이드의 존재 하에 오일을 인큐베이션하는 단계; 오일을 소듐 하이드록사이드와 함께 인큐베이션하는 단계; 오일을 황산 및 메탄올과 함께 인큐베이션하는 단계; 암모늄 아세테이트의 존재 하에 오일을 무수 암모니아와 함께 인큐베이션하는 단계; 오일을 암모니아수와 함께 인큐베이션하는 단계; 오일을 톨루엔, 양이온 교환 수지, 빙초산, 리파아제, 및 과산화수소와 접촉시키는 단계; 오일을 고온 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 또는 오일을 고압 조건 하에 인큐베이션하는 단계 중의 하나 이상을 포함하는 방법.
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