MX2012014683A

MX2012014683A - Solventes de extraccion derivados de aceite para eliminar alcohol en la fermentacion extractiva.

Info

Publication number: MX2012014683A
Application number: MX2012014683A
Authority: MX
Inventors: Douglas Robert Anton; Michael Charles Grady; Bruce A Diner; Jelena Cirakovic; Francis J Woerner
Original assignee: Butamax Tm Advanced Biofuels
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-02-11
Also published as: NZ603659A; AU2011268215A1; WO2011159998A2; CN102947457B; WO2011160030A3; KR20130045330A; WO2011159998A3; EP2582825A1; NZ603036A; AU2011268169A2; CA2800719A1; JP2013535956A; WO2011159991A1; KR20130032897A; MX2012014687A; BR112012032357A2; AU2011268244A1; JP2013533742A; KR20130087014A; CA2801498A1

Abstract

En un proceso de fermentación de alcohol el aceite derivado de biomasa se convierte químicamente en un extractante disponible para la sustracción in situ de un producto alcohólico, tal como butanol, de un caldo de fermentación. Los glicéridos en el aceite se pueden convertir químicamente en un producto de reacción, tal como ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos y triglicéridos hidroxilados y mezclas de estos, lo que forma un extractante del producto de fermentación que tiene un coeficiente de separación para un producto alcohólico mayor que un coeficiente de separación del aceite de la biomasa para el producto alcohólico. El aceite derivado de una materia prima de un proceso de fermentación de alcohol se puede convertir químicamente en el extractante del producto de fermentación. El aceite se puede separar de la materia prima antes de suministrar la materia prima en un recipiente de fermentación, y el aceite separado se puede convertir químicamente en un extractante del producto de fermentación, que, después, se puede poner en contacto con un producto de fermentación que comprende un producto alcohólico, con lo cual el producto alcohólico se separa del producto de fermentación.

Description

SOLVENTES DE EXTRACCION DERIVADOS DE ACEITE PARA ELIMINAR ALCOHOL EN LA FERMENTACION EXTRACTIVA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la producción de alcoholes fermentables, tales como butanol, y, particularmente, los solventes de ' extracción para fermentación extractiva y procesos para convertir aceite derivado de biomasa en los solventes de extracción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El butanol es una sustancia química industrial importante con una gran variedad de aplicaciones que incluyen el uso como aditivo para combustibles, como una materia prima química en la industria de los plásticos y como un extractante de grado alimenticio en la industria de alimentos y saborizantes . Por lo tanto, existe una gran demanda de butanol, así como de métodos de producción eficientes y que no dañen el medio ambiente.

La producción de butanol que usa la fermentación por microorganismos es un método de producción que no daña el medio ambiente. Algunos microorganismos que producen butanol eri altas cantidades tienen, además, umbrales bajos de toxicidad por butanol, de manera que es necesario retirar el butanol del recipiente de fermentación a medida que se REF. : 237273 produce. La sustracción in situ de producto (ISPR, por sus siglas en inglés) (denominada también fermentación extractiva) elimina el butanol del recipiente de fermentación a medida que se produce para permitir que el microorganismo produzca butanol en altas cantidades. Un método para la ISPR que se ha descrito en la técnica es la extracción líquido-líquido (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370) . Para que sea técnica y económicamente viable, la extracción líquido-líquido requiere, idealmente, un buen contacto entre el extractante y el caldo de fermentación para una transferencia de masa eficiente del producto alcohólico en el extractante; buena separación de fases del extractante del caldo de fermentación (durante y después de la fermentación) ; recuperación y repetición eficientes del ciclo del extractante; degradación mínima de la capacidad del extractante para extraer el producto alcohólico (por ejemplo, al evitar que reduzca el coeficiente de separación para el producto alcohólico en el extractante) y la contaminación del extractante por lípidos que reducen el coeficiente de separación con una operación a largo plazo.

Particularmente, el extractante se puede contaminar con lípido con el tiempo con cada repetición del ciclo, por ejemplo, por la acumulación de los lípidos presentes en la biomasa que se suministra en el recipiente de fermentación como materia prima de almidón hidrolizable. Como un ejemplo, una pasta líquida de maíz colocada en un recipiente de fermentación a 30 % en peso de sólidos de maíz seco puede producir un caldo de fermentación que contiene aproximadamente 1.2 % en peso de aceite de maíz durante la conversión de qlucosa en butanol por sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés) (en donde la sacarificación de la pasta líquida ocurre durante la fermentación mediante la adición de glucoamilasa para producir glucosa) . La disolución de los lípidos de aceite de maíz en alcohol oleílico (OA) que funciona como extractante durante la ISPR puede producir la acumulación de la concentración lipídica con cada repetición del ciclo de OA, lo que reduce el coeficiente de separación para el producto alcohólico en OA a medida que la concentración lipídica en OA incrementa con cada repetición del ciclo de OA.

Adicionalmente, la presencia de los sólidos no disueltos durante la fermentación extractiva puede afectar negativamente la eficacia de la producción de alcohol. Por ejemplo, la presencia de los sólidos no disueltos puede reducir el coeficiente de transferencia de masa dentro del recipiente de fermentación, impedir la separación de fases en el recipiente de fermentación, producir la acumulación de aceite de maíz de los sólidos no disueltos en el extractante, lo que reduce la eficiencia de extracción con el tiempo, incrementar la pérdida de solvente debido a que se queda atrapado en sólidos eliminados al final como granos secos del destilador con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés) , retardar la liberación de gotas de extractante del caldo de fe'rmentación y/o reducir la eficiencia de volumen del recipiente de fermentación.

Diversos métodos para reducir la degradación del coeficiente de separación del extractante usados en la fermentación extractiva han incluido molienda húmeda, fraccionamiento y eliminación de sólidos. La molienda húmeda es un proceso de múltiples etapas y costoso que separa una biomasa (por ejemplo, maíz) en todos sus componentes clave (germen, fibra del pericarpio, almidón y gluten) para capturar el valor de cada coproducto por separado. Este proceso produce una corriente de almidón purificado; sin embargo, es caro e incluye la separación de la biomasa en sus componentes que no son almidón, que es innecesaria para la producción de alcohol fermentable. El fraccionamiento elimina la fibra y el germen, que contiene la mayoría de lípidos presentes en maíz entero molido, lo que produce maíz con mayor contenido de almidón (endosperma) . El fraccionamiento en seco no separa el germen y la fibra y, por lo tanto, es menos costoso que la molienda húmeda. Sin embargo, el fraccionamiento no elimina la totalidad de la fibra o el germen y no produce la eliminación total de sólidos. Además, hay cierta pérdida de almidón en el fraccionamiento. La molienda húmeda de maíz es más costosa que el fraccionamiento en seco, pero el fraccionamiento en seco es más costoso que la molienda seca de maíz sin fraccionar. La eliminación de sólidos, que incluyen germen que contiene lipidos, de la pasta liquida antes de usar en la fermentación puede eliminar prácticamente los sólidos no disueltos, como se describe, por ejemplo, en la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 61/356,290, presentada el 18 de junio de 2010. Sin embargo, sería favorable si la degradación del coeficiente de separación del extractante se pudiera reducir incluso sin fraccionamiento o eliminación de los sólidos no disueltos. Por lo tanto, existe una necesidad continua de desarrollar métodos y sistemas más eficientes para producir productos alcohólicos, tales como butanol, a través de la fermentación extractiva, en donde se reduzca la degradación del coeficiente de separación del extractante.

Además, el extractante (por ejemplo, alcohol oleílico) se agrega, típicamente, al proceso, en vez de producirse en una etapa del proceso y, por lo tanto, el extractante es un gasto de materia prima. Debido a que el extractante se puede perder por la adsorción en sólidos no fermentables y se puede diluir con lipidos introducidos en el proceso, la economía del proceso de producción de alcohol puede estar afectada por la eficiencia de la recuperación y repetición del ciclo del extractante. Por lo tanto, existe una necesidad continua de extractantes alternos para la ISPR e puedan resultar en un proceso más económico mediante la ;ducción de capital y/o costos de operación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención cubre las necesidades mencionadas anteriormente al proporcionar métodos para producir productos alcohólicos, tales como butanol, en donde los lípidos en una biomasa se convierten en un extractante que se puede usar en la ISPR, y en donde se reduce la cantidad de lípidos que se suministran en el recipiente de fermentación con la materia prima y/o con la repetición del ciclo del extractante. La presente invención proporciona otras ventajas relacionadas, como serán evidentes mediante la descripción de las modalidades a continuación.

La conversión química de lípidos derivados de biomasa en extractantes que incluyen ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres de ácidos grasos, ásteres de glicol de ácidos grasos y triglicéridos y mezclas de estos (en conjunto llamados en la presente descripción "extractantes de ácidos grasos") puede reducir la cantidad de lípidos presentes en el extractante de ISPR. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados). No debería esperarse que los extractantes de ácidos grasos disminuyan el coeficiente de separación del producto alcohólico, tal como isobutanol, en la fase de extractante tanto como los lípidos. Además, los extractantes de ácidos grasos pueden usarse como el extractante de la ISPR. Los extractantes de ácidos grasos pueden derivarse de la biomasa que proporciona el carbono fermentable suministrado en el recipiente de fermentación. Por lo tanto, los extractantes de ácidos grasos se pueden producir en una etapa del proceso de producción de alcohol y se pueden usar en vez de, o adicionalmente a, un extractante exógeno de la ISPR suministrado que no se produce en el proceso (tal como alcohol oleilico suministrado externamente) para reducir o incluso eliminar el gasto de materia prima para el extractante de la ISPR.

Adicionalmente, los extractantes se pueden producir, además, mediante la conversión de aceite derivado de biomasa o materia prima en ácidos grasos con el uso de - condiciones de temperatura alta y/o de presión alta. Además, el aceite derivado de biomasa o materia prima se puede tratar con una o más lipasas para producir ácidos grasos o se puede someter a hidrogenación para producir alcoholes grasos.

La presente invención está dirigida a una composición que comprende un microorganismo recombinante con la capacidad de producir alcohol a partir de una materia prima; alcohol; y por lo menos un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster graso, triglicéridos y mezclas de- estos; en donde el extractante se produce a partir de la materia prima. En una modalidad el extractante es una mezcla de amidas grasas y en una modalidad adicional la mezcla de amidas grasas comprende linolamida, oleamida, palmitamida o estearamida. En otra modalidad el extractante es una mezcla de amidas grasas y ácidos grasos y en una modalidad adicional la mezcla de amidas grasas y ácidos grasos comprende linolamida, ácido linoleico, oleamida, ácido oleico, palmitamida, ácido palmitico, estearamida o ácido esteárico. En una modalidad el extractante se selecciona de triglicéridos hidroxilados , triglicéridos alcoxxlados, ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos alcoxilados, alcoholes grasos hidroxilados y alcoholes grasos alcoxilados. En una modalidad los triglicéridos pueden ser metoxilados o etoxilados. En otra modalidad el extractante se selecciona de ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcoholes grasos saturados, alcoholes grasos insaturados, amidas grasas saturadas, amidas grasas insaturadas, ésteres grasos saturados, ésteres grasos insaturados y mezclas de estos. En una modalidad el extractante puede ser un liquido o sólido. En una modalidad adicional el extractante puede estar en forma de microesferas . En una modalidad el alcohol es alcohol de alquilo de Ci a CQ. En otra modalidad la materia prima comprende centeno, trigo, maíz, caña, cebada, : material celulósico, material lignocelulósico o mezclas de estos.

En una modalidad el extractante comprende una o más amidas grasas de la fórmula R(C=0)N(R') (R") , en donde: R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de Ci-C6 que contienen, opcionalmente, uno o más grupos hidroxilo.

En otra modalidad el extractante comprende uno o más ésteres grasos de la fórmula R- (C=0) -OCHR' CHR"-OH, en donde: R se selecciona independientemente del 'grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de C1-C4.

En una modalidad el extractante comprende uno o más ésteres grasos de la fórmula R-(C=0)-OR', en donde: R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' es un grupo alquilo de 8 carbonos o menos.

La presente invención está dirigida a un método para producir un extractante; el método comprende proporcionar una biomasa que comprende aceite; poner el aceite en contacto con una o más sustancias con la capacidad de convertir químicamente el aceite en un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ásteres grasos, triglicéridos y mezclas de estos, con lo cual por lo menos una porción del aceite se convierte en el extractante. En una modalidad los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) . En una modalidad el extractante puede ser un líquido o sólido. En una modalidad adicional el extractante puede estar en forma de microesferas . En una modalidad el método comprende, además, la etapa de separar el aceite de la biomasa antes de poner el aceite en contacto con la sustancia o sustancias. En una modalidad la sustancia o sustancias se seleccionan de hidróxido de amonio acuoso, amoníaco anhidro, acetato amónico, amoníaco en agua, peróxido de hidrógeno, tolueno, ácido acético glacial, lipasa y resina de intercambio catiónico. En otra modalidad el extractante tiene un coeficiente de separación para un producto alcohólico mayor que el coeficiente de separación del aceite para el producto alcohólico antes de convertir el aceite en extractante. En una modalidad el producto alcohólico es alcohol de alquilo de Ci a Cg . En otra modalidad la biomasa comprende granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de granos de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, panizo de pradera, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raices, hojas, astillas de madera, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol o mezclas de estos .

La presente, invención se refiere, además, a un método para producir un producto alcohólico; el método comprende: (a) proporcionar una biomasa que comprende oligosacáridos y aceite; (b) poner la biomasa en contacto con una enzima de sacarificación con la capacidad de convertir oligosacáridos en monosacáridos; (c) separar el aceite de la biomasa de (a) o (b) ; (d) poner el aceite separado en contacto con uno o más reactantes o solventes para formar un extractante; (e) poner la biomasa en contacto con un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante con la capacidad de convertir los monosacáridos en un producto alcohólico para producir un producto alcohólico; y (f) y poner el producto alcohólico en contacto con el extractante, en donde el extractante tiene un coeficiente de separación para el producto alcohólico mayor que el coeficiente de separación del aceite de la biomasa para el producto alcohólico. En una modalidad el reactante o reactantes o solventes se seleccionan de hidróxido de amonio acuoso, amoníaco anhidro, acetato amónico, amoniaco en agua, peróxido de hidrógeno, tolueno, ácido acético glacial, lipasa y resina de intercambio catiónico. En una modalidad el extractante se selecciona de ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster graso, triglicéridos y mezclas de estos. En una modalidad el extractante se selecciona de triglicéridos hidroxilados, triglicéridos alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados), ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos alcoxilados, alcoholes grasos hidroxilados y alcoholes grasos alcoxilados. En otra modalidad el extractante se selecciona de ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcoholes grasos saturados, alcoholes grasos insaturados, amidas grasas saturadas, amidas grasas insaturadas, ésteres grasos saturados, ésteres grasos insaturados y mezclas de estos. En una modalidad el extractante puede ser un liquido o sólido. En una modalidad adicional el extractante puede estar en forma de microesferas . En una modalidad el alcohol es alcohol de alquilo de Cx a C8. En otra modalidad el aceite comprende uno o más aceites seleccionados de aceite de sebo, aceite de maíz, aceite de cañóla, triglicéridos cápricos/caprilicos, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de semilla de algodón, aceite de pescado, aceite de jojoba, manteca de cerdo, aceite de linaza, aceite de pata de buey, aceite de oiticica, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de semilla de colza, aceite de arroz, aceite de cártamo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de tung, aceite de jatropha, aceite de trigo, aceite de centeno, aceite de cebada y combinaciones de aceites vegetales.

En una modalidad el extractante comprende una o más amidas grasas de la fórmula R (C=0) (R' ) (R" ) , en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C2 , opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de C1-C6 que contienen, opcionalmente, uno o más grupos hidroxilo. En otra modalidad el extractante comprende uno o más ásteres grasos de la fórmula R- (C=0) -OCHR' CHR"-OH, en donde: R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de C1-C4.

En una modalidad el extractante comprende uno o más ásteres grasos de la fórmula R- (C=0) -0R' , en donde: R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' es un grupo alquilo de 8 carbonos o menos.

La presente invención está dirigida a un método para producir un producto alcohólico; el método comprende: (a) proporcionar un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante con la capacidad de producir un producto alcohólico en un recipiente de fermentación para producir un producto alcohólico; (b) poner el caldo de fermentación en contacto con un extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica, en donde el producto alcohólico y el aceite se dividen en la fase orgánica de manera que la fase orgánica comprenda el producto alcohólico y el aceite; (c) separar la fase orgánica de la fase acuosa; (d) separar el producto alcohólico de la fase orgánica; y las etapas (b) y (c) ocurren, opcionalmente , simultáneamente. En una modalidad el método comprende, además, la etapa de producir una suspensión de materia prima; separar la suspensión de materia prima para producir (i) una capa acuosa, (ii) una capa de aceite y (iii) una capa de sólidos; y suministrar la capa acuosa en el recipiente de fermentación. En otra modalidad el método comprende, además, la etapa de: poner el aceite de la capa de aceite en contacto con una o más sustancias con la capacidad de convertir químicamente el aceite en un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres grasos, triglicéridos y mezclas de estos, con lo cual por lo menos una porción del aceite se convierte en el extractante.

En una modalidad el extractante se selecciona de ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster graso, triglicéridos y mezclas de estos. En otra modalidad el extractante se selecciona de triglicéridos hidroxilados , triglicéridos alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) , ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos alcoxilados, alcoholes grasos hidroxilados y alcoholes grasos alcoxilados. En una modalidad el extractante se selecciona de ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcoholes grasos saturados, alcoholes grasos insaturados, amidas grasas saturadas, amidas grasas insaturadas, ésteres grasos saturados, ésteres grasos insaturados y mezclas de estos. En una modalidad el extractante puede ser un líquido o sólido. En una modalidad adicional el extractante puede estar en forma de microesferas . En una modalidad el producto alcohólico es alcohol de alquilo de Ci a C8. En otra modalidad el extractante tiene un coeficiente de separación para el producto alcohólico mayor que el coeficiente de separación del aceite de la capa de aceite para el producto alcohólico. En una modalidad el producto alcohólico es alcohol de alquilo de Ci a Cs . En otra modalidad el aceite comprende uno o más aceites seleccionados de aceite de sebo, aceite de maíz, aceite de cañóla, triglicéridos cápricos/caprílicos, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de semilla de algodón, aceite de pescado, aceite de jojoba, manteca de cerdo, aceite de linaza, aceite de pata de buey, aceite de oiticica, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de semilla de colza, aceite de arroz, aceite de cártamo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de tung, aceite de jatropha, aceite de trigo, aceite de centeno, aceite de cebada y combinaciones de aceites vegetales.

En algunas modalidades un método para eliminar el aceite derivado de biomasa a partir de un proceso de fermentación incluye: poner una corriente de biomasa que incluyen una cantidad de aceite en contacto con una o más sustancias con la capacidad de convertir químicamente el aceite en un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos, triglicéridos y mezclas de estos, con lo cual por lo menos una porción del aceite se convierte en el extractante. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) . El extractante tiene un coeficiente de separación para un alcohol fermentable mayor que el coeficiente de separación del aceite para el alcohol fermentable. En algunas modalidades la corriente de biomasa es maíz molido y el aceite es aceite de maíz. En algunas modalidades el método incluye, además, poner la corriente de biomasa que tiene el extractante en contacto con un caldo de fermentación, el caldo de fermentación incluye el alcohol fermentable, en donde el alcohol fermentable se divide en el extractante .

La presente invención está dirigida a un método para producir un extractante; el método comprende proporcionar una biomasa que comprende aceite; y convertir por lo menos una porción del aceite en un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres grasos, triglicéridos y mezclas de estos. En una modalidad la etapa de convertir el aceite en un extractante comprende una o más de las etapas de incubar el aceite en presencia de tetrahidrofurano e hidruro de litio y aluminio; incubar el aceite con hidróxido sódico; incubar el aceite con ácido sulfúrico y metanol; incubar el aceite con amoniaco anhidro en presencia de acetato amónico; incubar el aceite con amoniaco en agua; poner el aceite en contacto con tolueno, resina de intercambio catiónico, ácido acético glacial, lipasa y peróxido de hidrógeno; incubar el aceite con condiciones de temperatura alta o incubar el aceite con condiciones de presión alta.

En algunas modalidades un método in situ para producir un extractante para la sustracción in situ de un producto alcohólico incluye: (a) proporcionar una biomasa que incluye azúcares fermentables y aceite, en donde el aceité incluye triglicéridos; (b) separar el aceite de (a) de la biomasa; y (c) poner el aceite separado en contacto con uno o más reactantes o solventes con la capacidad de hacer reaccionar químicamente los triglicéridos para producir un producto de reacción seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, una mezcla de amidas grasas y ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos, triglicéridos y mezclas de estos, con lo cual los triglicéridos en el aceite se convierten en el producto de reacción. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) . El producto de reacción forma un extractante del producto de fermentación que tiene un coeficiente de separación para el producto alcohólico mayor que un coeficiente de separación del aceite de la biomasa para el producto alcohólico.

En algunas modalidades un método para producir butanol incluye: (a) proporcionar una biomasa que incluye oligosacáridos y aceite, en donde el aceite incluye glicéridos (b) poner la biomasa en contacto con una enzima de sacarificación con la capacidad de convertir oligosacáridos en monosacáridos ; (c) separar el aceite de la biomasa de (a) o (b) ; (d) poner el aceite separado en contacto con una composición que incluye uno o más reactantes o solventes, con lo cual los glicéridos en el aceite forman un extractante; (e) poner la biomasa en contacto con un microorganismo recombinante con la capacidad de convertir los monosacáridos en butanol, con lo cual se produce un producto de fermentación que comprende butanol; y (f) poner el producto de fermentación en contacto con el extractante de (d) , con lo cual el butanol se separa del producto de fermentación. El extractante tiene un coeficiente de separación para el butanol mayor que el coeficiente de' separación del aceite de la biomasa para el butanol. En algunas modalidades el extractante de la etapa (d) se selecciona del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, una mezcla de amidas grasas y ácidos grasos, esteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos, triglicéridos y mezclas de estos. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) .

En algunas modalidades un método incluye, en una etapa durante un proceso para producir un producto alcohólico a partir de una materia prima, convertir por lo menos una porción de un aceite de origen vegetal en un extractante que tiene un coeficiente de separación del extractante para el producto alcohólico mayor que un coeficiente de separación del aceite de origen vegetal para el producto alcohólico. En algunas modalidades el aceite de origen vegetal se deriva de la materia prima.

En algunas modalidades el producto alcohólico es isobutanol y el coeficiente de separación del extractante es por lo menos aproximadamente 0.28. En algunas modalidades el coeficiente de separación del extractante para isobutanol es por lo menos aproximadamente 1. En algunas modalidades el coeficiente de separación del extractante para isobutanol es por lo menos aproximadamente 2.

En algunas modalidades el proceso para producir un producto alcohólico a partir de una materia prima incluye (a) producir una suspensión de materia prima; (b) separar la suspensión de materia prima de (a) para producir un producto que incluye (i) una capa acuosa, (ii) una capa de aceite y (iii) una capa de sólidos; y (c) suministrar la capa acuosa de (b) en un recipiente de fermentación. En algunas modalidades la etapa de separar la suspensión de materia prima ocurre por centrifugación. En algunas modalidades la capa de aceite es una capa de aceite de origen vegetal. En algunas modalidades el proceso incluye, además, obtener por lo menos una porción del aceite de origen vegetal a partir de la capa de aceite de origen vegetal.

En algunas modalidades el proceso incluye, además, agregar el extractante en el recipiente de fermentación para formar una mezcla de dos fases que incluye una fase acuosa y una fase orgánica que contiene el producto alcohólico, con lo cual el producto alcohólico se divide en la fase orgánica que contiene el producto alcohólico.

En algunas modalidades el proceso incluye, además, fermentar azúcar de la fase acuosa para producir el producto alcohólico, con lo cual el producto alcohólico se divide en la fase orgánica que contiene el producto alcohólico.

En algunas modalidades un método para eliminar el aceite derivado de biomasa a partir de un proceso de fermentación incluye (a) proporcionar un caldo de fermentación que incluye un producto alcohólico y aceite derivado de biomasa, en donde el aceite incluye glicéridos; (b) poner el caldo de fermentación en contacto con un extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica, en donde el producto alcohólico y el aceite se dividen en la fase orgánica de manera que la fase orgánica comprenda el producto alcohólico y el aceite; (c) separar la fase orgánica de la fase acuosa; (d) separar el producto alcohólico de la fase orgánica; y (e) poner la fase orgánica en contacto con una composición que comprende uno o más reactantes o solventes, con lo cual los glicéridos en el aceite forman extractante adicional; y (f) repetir la etapa (b) al poner el caldo de fermentación en contacto con el extractante adicional de la etapa (e) .

En algunas modalidades el extractante adicional se selecciona del grupo que consiste en ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster metílico de ácidos grasos, éster de glicol de ácidos grasos, triglicérído y mezclas de estos. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) .

En algunas modalidades el producto alcohólico es butanol .

En algunas modalidades una composición formadora de extractante de fermentación in situ incluye (a) aceite derivado de biomasa; (b) una o más sustancias con la capacidad de convertir químicamente el aceite en uno o más productos seleccionados del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos y triglicéridos; y (c) el producto o productos, en donde el producto o productos están en una cantidad de aproximadamente 50 % en peso a aproximadamente 99 % en peso de la composición. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) .

En algunas modalidades una composición incluye un microorganismo recombinante con la capacidad de producir butanol, butanol y por lo menos un solvente seleccionado del grupo que consiste en ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster metílico de ácidos grasos, éster de glicol de ácidos grasos, triglicérido y mezclas de estos. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) .

En algunas modalidades una composición incluye un microorganismo recombinante con la capacidad de producir butanol, butanol y alcoholes grasos.

En algunas modalidades una composición incluye un microorganismo recombinante con la capacidad de producir butanol, butanol y una mezcla de amidas grasas, en donde la mezcla de amidas grasas comprende linolamida, oleamida, palmitamida y estearamida.

En algunas modalidades una composición incluye una composición que comprende un microorganismo recombinante con la capacidad de producir butanol, butanol y aceite de maiz, en donde el aceite de maiz es de aproximadamente 28 % a aproximadamente 67 % hidroxilado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras acompañantes, que se incorporan en la presente invención y que forman una parte de la descripción, ilustran la presente invención y, junto con la descripción, sirven, además, para explicar los principios de la invención y para permitir que un experto en la técnica pertinente elabore y use la presente invención.

La Figura 1 ilustra esquemáticamente un método y sistema ilustrativo de la presente invención, en donde los lipidos se eliminan de una biomasa liquida antes de la fermentación, y en donde los lipidos eliminados se convierten en un extractante y se suministran en el recipiente de fermentación.

La Figura 2 ilustra esquemáticamente un método y sistema ilustrativo de la presente invención, en donde los lipidos se eliminan de una biomasa liquida y sacarificada antes de la fermentación, y en donde los lipidos eliminados se convierten en un extractante y se suministran en un recipiente de fermentación .

La Figura 3 ilustra esquemáticamente un método y sistema ilustrativo de la presente invención, en donde los lipidos se eliminan de una biomasa y se convierten en un extractante que se suministra en un recipiente de fermentación.

La Figura 4 ilustra esquemáticamente un método y sistema ilustrativo de la presente invención, en donde los lipidos en una corriente de suministro de biomasa se convierten en un extractante y se suministran en un recipiente de fermentación .

La Figura 5 ilustra esquemáticamente un método y sistema ilustrativo de la presente invención, en donde los lipidos presentes en un primer extractante que sale de un recipiente de fermentación se separan del primer extractante y se convierten en un segundo extractante que se suministra en un recipiente de fermentación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos que se usan en la presente tienen el mismo significado como el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de disputa, prevalecerá la presente solicitud junto con las definiciones pertinentes. Además, a menos que el contexto lo requiera, los términos en singular incluyen pluralidades y los términos en plural incluyen el singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente descripción se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito .

Para definir adicionalmente la presente invención, se proporciona los siguientes términos y definiciones.

Como se usa en la presente descripción, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene" o cualquier variación de estos implican la inclusión de un entero o grupo de enteros indicado, mas no la exclusión de cualquier entero o grupo de enteros. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, un método, un articulo o un aparato que comprende una lista de elementos no necesariamente se limita únicamente a esos elementos, sino que puede incluir otros elementos que no están expresamente enumerados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, articulo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente en contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual), A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .

Además, los artículos indefinidos "un (a)" y "unos (as)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias, es decir, ocurrencias del elemento o componente. Por lo tanto, "un (a)" o "unos (as)" deben interpretarse para incluir uno o por lo menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente incluye, además, el plural, a menos que el número obviamente indique que es singular.

El término "invención" o "presente invención", tal como se usa en la presente descripción, es un término no 'limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la solicitud.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente", que modifica la cantidad de un ingrediente o reactante usado de la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos típicos de medición y manejo de líquidos usados para preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Ya sea modificadas o no por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico reportado, alternativamente, dentro del 5 % del valor numérico reportado.

"Biomasa", como se usa en la presente descripción, se refiere a un producto natural que contiene polisacáridos hidrolizables que proporcionan azúcares fermentables que incluyen cualquier azúcar y almidón derivado de fuentes naturales, tales como maíz, caña, trigo, material celulósico o material lignocelulósico y materiales que comprenden celulosa, hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos, disacáridos y/o monosacáridos y mezclas de estos. La biomasa puede comprender, además, componentes adicionales, tales como proteina y/o lipidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente. Por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del maíz, o una mezcla de pastos y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bionergéticos , residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación del papel, residuos ' orgánicos, residuos forestales y de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de granos de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, panizo de pradera, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol y mezclas de estos. Por ejemplo, se puede formar pasta, jugo, melaza o hidrolisato a partir de biomasa mediante cualquier procesamiento conocido en la técnica para procesar la biomasa para propósitos de fermentación, tal como por molienda, tratamiento y/o licuación, y comprende azúcar fermentable y puede comprender agua. Por ejemplo, la biomasa celulósica y/o la biomasa lignocelulosica se pueden procesar para obtener un hidrolisato que contiene azúcares fermentables mediante cualquier método conocido para una persona con experiencia en la técnica. La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918A1, que se incorpora en la presente descripción como referencia, describe un pretratamiento con contenido bajo de amoniaco. La sacarificación enzimática de biomasa celulósica y/o biomasa lignocelulósica usa, típicamente, una agrupación enzimática para la descomposición de celulosa y hemicelulosa para producir un hidrolisato que contiene azúcares que incluyen glucosa, xilosa y arabinosa. (Las enzimas de sacarificación adecuadas para la biomasa celulósica y/o lignocelulósica se revisan en Lynd, et al. (Microbiol . Mol. Biol . Rev. 66:506-577, 2002).

La pasta, jugo, melaza o hidrolisato pueden incluir materia prima 12 y suspensión de materia prima 16, tal como se describe en la presente descripción. Una corriente de alimentación acuosa puede derivarse o formarse de biomasa mediante cualquier procesamiento conocido en la técnica para el procesamiento de biomasa para propósitos de fermentación, tales como por molienda, tratamiento y/o licuación, y comprende sustrato de carbono fermentable (por ejemplo, azúcar) y puede comprender agua. Una corriente de alimentación acuosa puede incluir materia prima 12 y suspensión de materia prima 16, como se describe en la presente descripción.

"Materia prima", como se usa en la presente descripción, se refiere a un suministro en un proceso de fermentación, en donde el suministro contiene una fuente de carbono fermentable con o sin sólidos no disueltos, y donde sea pertinente, el suministro contiene la fuente de carbono fermentable antes o después de que la fuente de carbono fermentable se ha liberado del almidón u obtenido a partir de la descomposición de azúcares complejos por procesamiento adicional, tal como licuación, sacarificación u otro proceso. La materia prima incluye o se deriva de una biomasa. Las materias primas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, centeno, trigo, maiz, caña, cebada, material celulósico, material lignocelulósico o mezclas de estos. Cuando se hace referencia a "aceite de maiz", debe apreciarse que el término abarca el aceite producido a partir de una materia prima especifica en otras modalidades de la presente invención.

"Caldo de fermentación", como se usa en la presente descripción, se refiere a la mezcla de agua, azúcares, sólidos disueltos, opcionalmente, microorganismos que producen alcohol, producto alcohólico y todos los demás constituyentes del material en el recipiente de fermentación, en donde se elabora el producto alcohólico mediante la reacción de azúcares en alcohol, agua y dióxido de carbono (C02) por medio de los microorganismos presentes. Ocasionalmente, como se usan en la presente descripción, los términos "medio de fermentación" y "mezcla fermentada" pueden usarse como sinónimos de "caldo de fermentación".

"Fuente de carbono fermentable" o "sustrato de carbono fermentable", como se usa en la presente descripción, se' refiere a una fuente de carbono con la capacidad de metabolizarse por medio de los microorganismos descritos en la presente descripción para la producción de alcohol fermentable. Las fuentes de carbono fermentable adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tales como glucosa o fructosa; disacáridos, tales como lactosa o sacarosa; oligosacáridos; polisacáridos , tales como almidón o celulosa; un sustrato de carbono; y mezclas de estos.

"Azúcar fermentable", como se usa en la presente descripción, se refiere a azúcar con la capacidad de metabolizarse por medio de los microorganismos descritos en la presente descripción para la producción de alcohol fermentable .

"Recipiente de fermentación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el que se lleva a cabo la reacción de fermentación con la cual se obtiene el producto alcohólico, tal como butanol, a partir de azúcares.

"Recipiente de licuación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el que se lleva a cabo la licuación. La licuación es el proceso en el que se libera oligosacáridos a partir de la materia prima. En algunas modalidades en donde la materia prima es maíz, los oligosacáridos se liberan a partir del contenido de almidón de maíz durante la licuación.

"Recipiente de sacarificación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el que se lleva a cabo la sacarificación (es decir, la descomposición de oligosacáridos en monosacáridos) . Cuando la fermentación y la sacarificación ocurren simultáneamente, el recipiente de sacarificación y los recipientes de fermentación pueden ser el mismo recipiente.

"Azúcar", como se usa en la presente descripción, se refiere a oligosacáridos, disacáridos y/o monosacáridos.

Como se usa en la presente descripción, "enzima de sacarificación" se refiere a una o más enzimas con la capacidad de hidrolizar polisacáridos y/u oligosacáridos, por ejemplo, enlaces alfa-1 , -glucosídicos de glucógeno o almidón. Las enzimas de sacarificación pueden incluir, además, enzimas con la capacidad de hidrolizar material celulósico o material lignocelulósico .

"Sólidos no disueltos", como se usa en la presente descripción, se refiere a porciones no fermentables de materia prima, por ejemplo, germen, fibra y gluten.

"Producto alcohólico", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier alcohol que se puede producir por medio de un microorganismo en un proceso de fermentación que usa biomasa como una fuente de sustrato de carbono fermentable. Los productos alcohólicos incluyen, pero no se limitan a, alcoholes de alquilo de Ci a C8. En algunas modalidades los productos alcohólicos son alcoholes de alquilo de C2 a Cg. En otras modalidades los productos alcohólicos son alcoholes de alquilo de C2 a C5. Se apreciará que los alcoholes de alquilo de Ci a C8 incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, propanol, butanol y pentanol. Además, los alcoholes de alquilo de C2 a Ce incluyen, pero no se limitan a, etanol, propanol, butanol y pentanol. "Alcohol" se usa, además, en la presente descripción con referencia a un producto alcohólico.

"Butanol", como se usa en la presente descripción, se refiere con especificidad a los isómeros de butanol 1-butanol (1-BuOH), 2-butanol (2-BuOH) y/o isobutanol (iBuOH o I-BUOH, también denominado 2-metil-l-propanol ) , ya sea individualmente o como mezclas de estos.

"Propanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de propanol isopropanol o 1-própanol.

"Pentanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de pentanol 1-pentanol, 3-metil-l-butanol, 2-metil-l-butanol, 2 , 2-dimetil-l-propanol , 3-pentanol, 2-pentanol, 3-metil-2-butanol o 2-metil-2-butanol .

El término "equivalente de alcohol", como se usa en la presente descripción, se refiere al peso de alcohol que se obtendría por medio de la hidrólisis perfecta y la recuperación de una cantidad de éster de alcohol.

El término "título de la fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la concentración de un alcohol particular (por ejemplo, butanol) en el caldo de fermentación .

El término "titulo efectivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad total de un alcohol particular (por ejemplo, butanol) producido por fermentación o equivalente de alcohol del éster de alcohol producido por esterificación de alcohol por litro de medio de fermentación. Por ejemplo, el titulo efectivo de butanol en una unidad de volumen de una fermentación incluye: (i) la cantidad de butanol en el medio de fermentación; (ii) la cantidad de butanol recuperado del extractante orgánico; (iii) la cantidad' de butanol recuperada de la fase gaseosa, si se usa estabilización de gas, y (iv) el equivalente de alcohol del éster de butanol ya sea en la fase orgánica o en la fase acuosa .

"Sustracción in situ de producto (ISPR)", como se usa en la presente descripción, se refiere a la eliminación selectiva de un producto de fermentación especifico a partir de un proceso biológico, tal como fermentación, para controlar la concentración del producto en el proceso biológico a medida que el producto se produce.

"Extractante" o "extractante de ISPR", como se usa en la presente descripción, se refiere a un solvente orgánico usado para extraer cualquier producto alcohólico, tal como el isómero de butanol. El extractante puede ser un sólido o liquido a temperatura de fermentación. Ocasionalmente, como se usa en la presente descripción, el término "solvente" se puede usar como sinónimo de "extractante".

"Extractantes de ácidos grasos", como se usa en la presente descripción, se refiere a los extractantes derivados de aceite natural al hacer reaccionar químicamente los glicéridos en el aceite natural con uno o más solventes o reactantes para producir uno o más productos de reacción seleccionados del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ásteres metílicos de ácidos grasos, ásteres de glicol de ácidos grasos, triglicéridos y mezclas de estos. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados).

"Aceite natural", como se usa en la presente descripción, se refiere a lípidos obtenidos de plantas (por ejemplo, biomasa) o animales. "Aceite de origen vegetal", como se usa en la presente descripción, se refiere a lípidos obtenidos de plantas en particular. Ocasionalmente, "lípidos" se puede usar como sinónimo de "aceite" y "glicéridos". Los aceites naturales incluyen, pero no se limitan a, sebo, maíz, cañóla, triglicéridos cápricos/caprílicos, ricino, coco, semilla de algodón, pescado, jojoba, lardo, linaza, aceite de pata de buey, aceite de oiticica, palma, cacahuate, semilla de colza, arroz, cártamo, soja, girasol, tung, jatropha y combinaciones de aceites vegetales.

El término "ácido graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un ácido carboxilico (por ejemplo, ácido monocarboxilico alifático) que tiene átomos de carbono de C a C2e (con la máxima frecuencia, átomos de carbono de C a C2 ) , que es saturado o insaturado. Los ácidos grasos pueden ser, además, ramificados o no ramificados. Los ácidos grasos pueden derivarse de, o estar contenidos en forma esterificada , en una grasa, aceite o cera de origen animal o vegetal. Los ácidos grasos pueden ser de origen natural en forma de glicéridos en grasas y aceites grasos o pueden obtenerse por hidrólisis de grasas o por síntesis. El término ácido graso puede describir una sola especie química o una mezcla de ácidos grasos. Adicionalmente, el término ácido graso incluye, además, ácidos grasos libres.

El término "alcohol graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un alcohol que tiene una cadena alifática larga de átomos de carbono de C4 a C22, saturada o insaturada .

El término "aldehido graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un aldehido que tiene una cadena alifática larga de átomos de carbono de C4 a C22, saturada o insaturada .

El término "amida grasa", como se usa en la presente descripción, se refiere a una amida que tiene una cadena alifática larga de átomos de carbono de C4 a C2zi saturada o insaturada .

El término "éster graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un éster que tiene una cadena alifática larga de átomos de carbono de C4 a C22i saturada o insaturada .

El término "inmiscible en agua" se refiere a un componente químico, tal como un extractante o solvente, que no tiene la capacidad de mezclarse con una solución acuosa, tal como un caldo de fermentación, a manera de formar una fase liquida.

El término "fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase acuosa de una mezcla bifásica obtenida al poner un caldo de fermentación en contacto con un extractante orgánico inmiscible en agua. En una modalidad de un proceso descrito en la ; presente descripción que incluye extracción fermentativa, el término "caldo de fermentación" se refiere, específicamente, a la fase acuosa en la extracción fermentativa bifásica.

El término "fase orgánica", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida al poner un caldo de fermentación en contacto con un extractante orgánico inmiscible en agua.

El término "separación", como se usa en la presente descripción, es sinónimo de "recuperación" y se refiere a eliminar un compuesto químico de una mezcla inicial para obtener el compuesto con mayor pureza o a una concentración mayor que la pureza o concentración del compuesto en la mezcla inicial.

Como se usa en la presente descripción, "microorganismo recombinante" se refiere a los microorganismos, tales como bacterias o levadura, que se modifican con el uso de técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, mediante la modificación de una célula huésped para que comprenda una ruta biosintética, tal como una ruta biosintética para producir un alcohol, tal como butanol .

La presente invención proporciona extractantes obtenidos por la conversión química de aceite derivado de biomasa y métodos para producir los extractantes. Particularmente, los glicéridos en el aceite pueden convertirse químicamente en uno o más productos que incluyen ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos y triglicéridos y mezclas de estos, que en la presente descripción se llaman colectivamente extractantes de ácidos grasos. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) . Los extractantes de ácidos grasos pueden funcionar como extractantes para la sustracción in situ de un producto alcohólico, tal como butanol, de un caldo de fermentación. Por lo tanto, la presente invención proporciona, además, métodos para producir un producto alcohólico, tal como butanol, a través de la fermentación extractiva con el uso de los extractantes producidos a partir del aceite de biomasa. La presente invención proporciona, además, métodos para eliminar el aceite de un proceso de fermentación de alcohol al separar el aceite derivado de una materia prima. La materia prima se puede liquidificar para crear una suspensión antes de eliminar el aceite. Por lo tanto, la suspensión incluye una fuente de carbono fermentable, aceite y sólidos no disueltos. El aceite, y en algunas modalidades los sólidos no disueltos, pueden eliminarse de la suspensión antes de suministrar la suspensión en el recipiente de fermentación. La eliminación del aceite, y en algunas modalidades de los sólidos no disueltos, puede reducir la pérdida, la degradación del coeficiente de separación del extractante con el tiempo atribuible a la presencia del aceite (y en algunas modalidades los sólidos) en el recipiente de fermentación. Además, el aceite separado puede convertirse químicamente en un extractante de ácidos grasos que se puede suministrar en el recipiente de fermentación. El extractante de ácidos grasos puede tener un coeficiente de separación para un alcohol fermentable mayor que un coeficiente de separación del aceite para el alcohol fermentable. Además, el extractante de ácidos grasos puede usarse en vez de o adicionalmente a un extractante exógeno comercial, tal como alcohol oleílico, que no se . convirtió químicamente a- partir de la materia prima de conformidad con los métodos de la presente invención. Por lo tanto, los métodos de la presente invención pueden reducir el gasto de materia prima asociado con el extractante exógeno al producir un extractante en una etapa de un proceso de fermentación por medio de la conversión química de aceite derivado de una materia prima.

La presente invención se describirá haciendo referencia a las Figuras. La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo del proceso ilustrativo para producir alcohol fermentable de conformidad con una modalidad de la presente invención. Tal como se muestra, una materia prima 12 se puede introducir en una entrada en un recipiente de licuación 10 y licuar para producir una suspensión de materia prima 16. La materia prima 12 contiene almidón hidrolizable que proporciona una fuente de carbono fermentable (por ejemplo, azúcar fermentable, tal como glucosa) y puede ser una biomasa, tal como, pero sin limitarse a, centeno, trigo, maíz, caña, cebada, material celulósico, material lignocelulósico o mezclas de estos, o se puede derivar, de otro modo, de una biomasa. En algunas modalidades la materia prima 12 puede ser uno o más componentes de una biomasa fraccionada y en otras modalidades la materia prima 12 puede ser una biomasa molida sin fraccionar. En algunas modalidades la materia prima 12 puede ser maíz, como granos de maíz seco sin fraccionar molidos, y las partículas no disueltas pueden incluir germen, fibra y gluten. Los sólidos no disueltos son porciones no fermentables de materia prima 12. Para los propósitos de la presente descripción, con referencia a las modalidades que se muestran en las figuras, se describe, frecuentemente, que la materia prima 12 constituye maíz sin fraccionar molido, en donde los sólidos no disueltos se han separado de este. Sin embargo, se comprenderá que los métodos y sistemas ilustrativos descritos en la presente descripción pueden modificarse para las distintas materias primas, ya sean fraccionadas o no, como es evidente para un experto en la técnica. En algunas modalidades la materia prima 12 puede ser maíz altamente oleico, de manera que el aceite de maíz derivado de este es un aceite de maíz altamente oleico que tiene un contenido de ácido oleico de por lo menos aproximadamente 55 % en peso de ácido oleico. En algunas modalidades el contenido de ácido oleico en aceite de maíz altamente oleico puede ser de hasta aproximadamente 65 % en peso, en comparación con el contenido de ácido oleico en aceite de maíz normal que es de aproximadamente 24 %, en peso. El aceite altamente oleico puede proporcionar ciertas ventajas para usar en los métodos de la presente invención, dado que la hidrólisis del aceite puede proporcionar un extractante de ácidos grasos con un contenido alto de ácido oleico para poner en contacto con un caldo de fermentación. En algunas modalidades los ácidos grasos o mezclas de estos comprenden ácidos grasos insaturados. La presencia de ácidos grasos insaturados reduce el punto de fusión, con lo cual proporciona ventajas de manejo. De los ácidos grasos insaturados, los monoinsaturados, es decir, los que tienen un solo enlace doble carbono-carbono, pueden proporcionar ventajas con respecto al punto de fusión sin afectar la adecuada estabilidad térmica y oxidativa para las consideraciones del proceso.

El proceso de liquidificar la materia prima 12 incluye la hidrólisis de almidón en la materia prima 12 en azúcares que incluyen, por ejemplo, dextrinas y oligosacáridos , y es un proceso convencional. Es posible usar cualquier proceso de licuación, asi como el respectivo recipiente de licuación, que la industria usa normalmente; estos incluyen, pero no se limitan a, el proceso de ácidos, el proceso de ácidos-enzimas o el proceso de enzimas. Tales procesos se pueden usar solos o en conjunto. En algunas modalidades se puede usar el proceso de enzimas y una enzima adecuada 14, por ejemplo, alfa-amilasa, se introduce en una entrada en el recipiente de licuación 10. Además, se puede introducir agua en el recipiente de licuación 10.

La suspensión de materia prima 16 producida a partir de la licuación de materia prima 12 incluye azúcar, aceite y sólidos no disueltos derivados de la materia prima. La suspensión de materia prima 16 se puede descargar desde una salida del recipiente de licuación 10. En algunas modalidades la materia prima 12 es maiz o granos de maíz y, por lo tanto, la suspensión de materia prima 16 es una suspensión de pasta de maiz.

La suspensión de materia prima 16 se introduce en una entrada de un separador 20 que se configura para eliminar parte o, preferentemente, prácticamente todo el aceite presente en la suspensión de materia prima 16. El aceite eliminado se proporciona como una corriente 26 hasta un recipiente de reacción 40 y la materia prima restante que incluye el azúcar y agua se descarga como una corriente acuosa 22 en un recipiente de fermentación 30. La corriente acuosa 22 puede incluir los sólidos no disueltos de la suspensión 16, pero dado que el aceite 26 se eliminó por medio del separador 20, el caldo de fermentación en el recipiente de fermentación 30 aún tiene una cantidad reducida de aceite. La corriente de aceite 26 descargada del separador 20 tiene una cantidad de glicéridos, particularmente, triglicéridos, que se ponen en contacto con una o más sustancias 42 en el recipiente de reacción 40. Las sustancias 42 son reactantes o solventes con la capacidad de convertir químicamente por lo menos una porción de los glicéridos en aceite 26 en un extractante de ácidos grasos 28. Én algunas modalidades la cantidad de extractante de ácidos grasos 28 en el aceite a partir de la conversión química de los glicéridos por medio de sustancias 42 puede ser de por lo menos aproximadamente 17 % en peso, por lo menos aproximadamente 20 % en peso, por lo menos aproximadamente 30 % en peso, por lo menos aproximadamente 40 % en peso, por lo menos aproximadamente 50 % en peso, por lo menos aproximadamente 60 % en peso, por lo menos aproximadamente 65 % en peso, por lo menos aproximadamente 70 % en peso, por lo menos aproximadamente 75 % en peso, por lo menos aproximadamente 80 % en peso, por lo menos aproximadamente 85 % en peso, por lo menos aproximadamente 90 % en peso, por lo menos aproximadamente 95 % en peso o por lo menos aproximadamente 99 % en peso.

El separador 20 puede ser cualquiera de los separadores adecuados conocidos en la técnica para eliminar el aceite de una corriente de alimentación acuosa que incluyen, pero no se limitan a, sifonaje, aspiración, decantación, centrifugación, con el uso de sedimentación por gravedad, separación de fases asistida con membranas y similares. En algunas modalidades el separador 20 puede eliminar, además, los sólidos no disueltos en la suspensión de materia prima 16 y descargar los sólidos no disueltos como una fase sólida o una pasta húmeda 24. Por ejemplo, en algunas modalidades el separador 20 puede incluir una prensa de filtros, filtración al vacío o una centrifugadora para separar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16. Por ejemplo, en algunas modalidades el separador 20 incluye una centrifugadora tricanter 20 que agita o hace girar la suspensión de materia prima 16 para producir un producto centrifugado que comprende una capa acuosa que contiene el azúcar y agua (es decir, la corriente 22), una capa de sólidos que contiene los sólidos no disueltos (es decir, la pasta húmeda 24) y una capa de aceite (es decir, la corriente de aceite 26) . Cuando la suspensión 16 es una suspensión de pasta de maíz, entonces el aceite 26 es aceite de maiz libre. El término aceite de maíz libre, como se usa en la presente descripción, se refiere a aceite de maiz libre de germen de maiz. Para una suspensión de pasta de maiz como la suspensión de materia prima 16, la pasta húmeda 24 incluye por lo menos aproximadamente 50 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 55 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 60 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 65 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 70 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 75 % en peso de las partículas . no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 80 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 85 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 90 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, por lo menos aproximadamente 95 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima o aproximadamente 99 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima.

Cuando la pasta húmeda 24 se elimina por medio de una centrifugadora 20, en algunas modalidades una porción del aceite de la materia prima 12, tal como aceite de maíz cuando la materia prima es maíz, permanece como pasta húmeda 24. En tales casos, la pasta húmeda 24 incluye aceite de maíz en una cantidad menor que aproximadamente 20 % en peso del contenido de sólidos secos de pasta húmeda 24. La pasta húmeda 24 puede descargarse por una salida ubicada cerca de la parte inferior de la centrifugadora 20. La pasta húmeda 24 puede incluir, además, una porción del carbono fermentable y agua. La pasta húmeda 24 puede lavarse con agua adicional en la centrifugadora una vez que la solución acuosa 22 se ha descargado de la centrifugadora 20. Con el lavado de la pasta húmeda 24 se recupera el azúcar (por ejemplo, oligosacáridos) presente en la pasta húmeda y el azúcar recuperado y el agua pueden reciclarse hasta el recipiente de licuación 10. Después del lavado, la pasta húmeda 24 puede secarse para formar granos secos del destilador con solubles (DDGS) a través de cualquier proceso adecuado conocido. La formación de los DDGS a partir de la pasta húmeda 24 en la centrifugadora 20 tiene varios beneficios. Dado que los sólidos no disueltos no van hacia el recipiente de fermentación, los DDGS no tienen extractante y/o producto alcohólico, como butanol, atrapado, no se someten a las condiciones del recipiente de fermentación y no entran en contacto con los microorganismos presentes en el recipiente de fermentación. Estos beneficios facilitan el procesamiento y venta de DDGS, por ejemplo, como alimento para animales. Los métodos y sistemas para eliminar los sólidos no disueltos de la materia prima 16 por medio de centrifugación se describen en detalle en la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 61/356, 290, presentada el 18 de junio de 2010, que se incorpora en la presente descripción en su totalidad como referencia de esta.

En algunas modalidades el aceite 26 no se descarga por separado desde la pasta húmeda 24, más bien el aceite 26 se incluye como parte de la pasta húmeda 24 y, por último, se encuentra presente en los DDGS . En tales casos, el aceite se puede separar de los DDGS y se puede convertir en un extractante de ácidos grasos para uso posterior en el mismo proceso de fermentación de alcohol o en un proceso distinto. En cualquier caso, la eliminación del componente de aceite de la materia prima es favorable para la producción de alcohol, tal como de butanol, dado que el aceite presente en el recipiente de fermentación puede diluir el extractante de la ISPR y puede reducir el coeficiente de separación del alcohol fermentable en la fase orgánica. Además, el aceite puede descomponerse en ácidos grasos y glicerina, gue pueden acumularse en el agua y reducir la cantidad de agua disponible para el reciclado por todo el sistema. Por lo tanto, la eliminación del componente de aceite de la materia prima puede incrementar, además, la eficiencia en la producción del producto alcohólico al aumentar la cantidad de agua que puede reciclarse a través del sistema.

La corriente acuosa 22 y un microorganismo 32 se introducen en un recipiente de fermentación 30 para incluir en un caldo de fermentación que se mantiene en el recipiente de fermentación 30. El recipiente de fermentación 30 se configura para fermentar la corriente acuosa 22 para producir un producto alcohólico, tal como butanol. Particularmente, el microorganismo 32 metaboliza el azúcar fermentable en la suspensión 16 y excreta un producto alcohólico. El microorganismo 32 se selecciona del grupo de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras. En algunas modalidades el microorganismo 32 puede ser una bacteria, tal como E. coli. En algunas modalidades el microorganismo 32 puede ser un microorganismo recombinante fermentable. La solución acuosa 22 puede incluir el azúcar, por ejemplo, en forma de oligosacáridos, y agua y puede comprender menos de aproximadamente 20 g/1 de glucosa monomérica, con mayor preferencia, menos de aproximadamente 10 g/1 o menos de aproximadamente 5 g/1 de glucosa monomérica. La metodología adecuada para determinar la cantidad de glucosa monomérica se conoce bien en la técnica. Tales métodos adecuados conocidos en la técnica incluyen HPLC.

En algunas modalidades la corriente acuosa 22 se somete a un proceso de sacarificación para descomponer los azúcares complejos (por ejemplo, oligosacáridos) en la corriente 22 en monosacáridos que pueden metabolizarse fácilmente mediante un microorganismo 32. Es posible usar cualquiera de los procesos de sacarificación que la industria usa normalmente, estos incluyen, pero no se limitan a, el proceso de ácidos, el proceso de ácidos-enzimas o el proceso de enzimas. En algunas modalidades la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) puede ocurrir dentro del recipiente de fermentación 30. En algunas modalidades una enzima 38, tal como glucoamilasa, se puede introducir en una entrada en el recipiente de fermentación 30 para descomponer el almidón en glucosa que se puede metabolizar mediante un microorganismo 32.

Se puede usar la sustracción in si tu de producto (ISPR) para eliminar el producto alcohólico del recipiente de fermentación 30 a medida que el producto alcohólico se produce mediante el microorganismo 32. Para la fermentación extractiva, tal ISPR incluye la extracción liquido-líquido. La extracción líquido-líquido se puede llevar a cabo de conformidad con los procesos descritos en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370, cuya descripción se incorpora en la presente descripción en su totalidad. La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/030537 describe métodos para producir y recuperar butanol de un caldo de fermentación con el uso de la fermentación extractiva; los métodos comprenden la etapa de poner el caldo de fermentación en contacto con un extractante inmiscible en agua. Típicamente, el extractante puede ser un extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, una mezcla de amidas grasas y ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, aldehidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos, triglicéridos y mezclas de estos para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. Con referencia a la modalidad de la Figura 1, el recipiente de fermentación 30 tiene una o más entradas para recibir uno o más extractantes de ISPR inmiscibles en agua, que incluyen extractante de ácidos grasos 28 del recipiente 40. El extractante de ácidos grasos 28 entra en contacto con el caldo de fermentación y forma una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. El producto alcohólico presente en el caldo de fermentación se divide en la fase orgánica. La mezcla bifásica se puede eliminar del recipiente de fermentación 30 como una corriente 39 y se introduce en un recipiente 35, en donde se lleva a cabo la separación de la fase acuosa y la fase orgánica para producir una fase orgánica que contiene alcohol 36 y una fase acuosa 34. La fase orgánica que contiene alcohol 36 se separa de la fase acuosa 34 de la mezcla bifásica 39 con el uso de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, sifonaje, decantación, centrifugación, con el uso de la sedimentación por gravedad, la separación de fases asistida con membranas y similares. La totalidad o parte de la fase acuosa 34 se puede reciclar en .el recipiente de fermentación 30 como medio de fermentación (tal como se muestra) o se puede eliminar de cualquier otra forma y reemplazar con medio fresco o se puede tratar para eliminar cualquier producto alcohólico restante y, después, reciclar hasta el recipiente de fermentación 30. La fase orgánica que contiene alcohol 36 se trata para recuperar el producto alcohólico y, después, el extractante pobre en alcohol resultante se puede reciclar de regreso (no se muestra) hacia el recipiente de fermentación 30, usualmente, en combinación con extractante de constitución fresco 28 para la extracción adicional del producto alcohólico. Alternativamente, el extractante fresco 28 se puede agregar continuamente en el recipiente de fermentación para reemplazar el extractante eliminado en la corriente de mezcla bifásica 39.

En algunas modalidades uno o más extractantes de ISPR adicionales se pueden introducir en el recipiente de fermentación 30, tales como el extractante 29 ilustrado en las modalidades de las Figuras 3-5, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica, en donde el producto alcohólico se divide en la fase orgánica. Tales extractantes adicionales 29 pueden ser extractantes de ácidos grasos y/o extractantes orgánicos exógenos, tales como alcohol oleilico, alcohol behenilico, alcohol cetilico, alcohol laurilico, alcohol miristilico, alcohol estearilico, 1-undecanol, ácido oleico, ácido láurico, ácido miristico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, undecanal, aldehido láurico, 20-metilundecanal y mezclas de estos. En algunas modalidades el extractante de ISPR 29 puede ser un ácido carboxilico y en algunas modalidades el extractante de ISPR 29 puede ser un ácido graso libre. En algunas modalidades el ácido carboxilico o el ácido graso libre puede tener una cadena de 4 a 28 carbonos, de 4 a 22 carbonos en otras modalidades, de 8 a 22 carbonos en otras modalidades, de 10 a 28 carbonos en otras modalidades, de 7 a 22 carbonos en otras modalidades, de 12 a 22 carbonos en otras modalidades, de 4 a 18 carbonos en otras modalidades, de 12 a 22 carbonos en otras modalidades y de 12 a 18 carbonos en otras modalidades adicionales .

En algunas modalidades el extractante de ISPR 29 es uno o más de los siguientes ácidos grasos: azaleico, cáprico, caprilico, de ricino, de coco (por ejemplo, como una combinación de origen natural de ácidos grasos que incluyen láurico, mirisitico, palmitico, caprilico, cáprico, esteárico, caproico, araquidico, oleico y linoleico, por ejemplo), dimérico, isoesteárico, láurico, de linaza, miristico, oleico, de palma, palmitico, de palmiste, pelargónico, ricinoleico, sebácico, de soja, esteárico, de resina, sebo y esteárico hidroxi núm. 12. En algunas modalidades el extractante de ISPR 29 es uno o más de los diácidos, por ejemplo, ácido acelaico y ácido sebácico. Por lo tanto, en algunas modalidades el extractante de ISPR 29 puede ser una mezcla de dos o más ácidos grasos distintos. En algunas modalidades el extractante de ISPR 29 puede ser uno de los ácidos grasos libres producidos a partir de la hidrólisis enzimática de aceite natural, tal como lipidos de biomasa, como se describe, por ejemplo, en la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 61/368,444, presentada el 28 de julio de 2010. En tales modalidades los lipidos de biomasa para producir el extractante 29 pueden ser de una fuente de biomasa igual o distinta de donde se obtiene la materia prima 12. Por ejemplo, en algunas modalidades los lipidos de biomasa para producir el extractante 29 pueden derivarse de soja, mientras que la fuente de biomasa de materia prima 12 es maíz. Se puede usar cualquier combinación posible de las distintas fuentes de biomasa para el extractante 29 en oposición a la materia prima 12, como será evidente para un experto en la técnica.

En la modalidad de la Figura 1 el producto alcohólico se extrae del caldo de fermentación in sítu, en donde la separación de la mezcla bifásica 39 ocurre en un recipiente separado 35. La fermentación extractiva In situ se puede llevar a cabo en modo discontinuo o modo continuo en el recipiente de fermentación 30. Para la fermentación extractiva in situ, el extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación al inicio de la fermentación, lo que forma un medio bifásico de fermentación. Alternativamente, el agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación después de que el microorganismo ha alcanzado la cantidad deseada de crecimiento, que se puede determinar al medir la densidad óptica del cultivo. Además, el extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación en un momento en el cual el nivel del producto alcohólico en el medio de fermentación alcanza un nivel preseleccionado . En el caso de la producción de butanol, por ejemplo, el extractante de la ISPR puede entrar en contacto con el medio de fermentación en cierto momento antes de que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico. Después de poner en contacto el medio de fermentación con el extractante de ISPR, el producto de butanol se divide en el extractante y disminuye la concentración en la fase acuosa que contiene el microorganismo, lo que limita la exposición del microorganismo de producción al producto inhibidor de butanol .

El volumen del extractante de ISPR a usar depende de una cantidad de factores que incluyen el volumen del medio de fermentación, el tamaño del recipiente de fermentación, el coeficiente de separación del extractante para el producto de butanol y el modo de fermentación seleccionado, según se describe a continuación. El volumen del extractante puede ser de aproximadamente 3 % a aproximadamente 60 % del volumen de trabajo del recipiente de fermentación. Según la eficiencia de la extracción, el titulo de la fase acuosa de butanol en el medio de fermentación puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5 g/1 a aproximadamente 85 g/1, de aproximadamente 10 g/1 a aproximadamente 40 g/1, de aproximadamente 10 g/1 a aproximadamente 20 g/1, de aproximadamente 15 g/1 a aproximadamente 50 g/1 o de aproximadamente 20 g/1 a aproximadamente 60 g/1. Sin estar limitados a la teoría, se cree que se puede obtener un titulo de butanol mayor con el método de fermentación extractiva, en parte, a partir de la eliminación del producto de butanol tóxico del medio de fermentación, lo que mantiene el nivel por debajo del nivel tóxico para el microorganismo.

En un modo discontinuo de la fermentación extractiva in situ, se agrega un volumen de extractante orgánico en el recipiente de fermentación y el extractante no se elimina durante el proceso. Este modo requiere un volumen mayor de extractante orgánico para minimizar la concentración del producto inhibidor de butanol en el medio de fermentación. Por consiguiente, el volumen del medio de fermentación es menor y la cantidad de producto producida es menor que la obtenida al usar el modo continuo. Por ejemplo, el volumen del extractante en el modo discontinuo puede ser de 20 % a aproximadamente 60 % del volumen de trabajo del recipiente de fermentación en una modalidad y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 % en otra modalidad.

Se puede usar la estabilización de gases (no se muestra) simultáneamente con el extractante orgánico para eliminar el producto alcohólico del medio de fermentación.

En algunas modalidades la separación de la mezcla bifásica puede ocurrir en el recipiente de fermentación, tal como se muestra en las modalidades de las Figuras 4 y 5 descritas posteriormente. Particularmente, en un modo continuo de fermentación extractiva in situ, en una modalidad el extractante 28 se puede introducir en el recipiente de fermentación 30 para producir la mezcla bifásica en este, en donde la corriente de la fase orgánica que contiene alcohol 36 sale directamente del recipiente de fermentación 30. La corriente de la fase acuosa 34 puede salir, además, directamente del recipiente de fermentación 30, se puede tratar para eliminar cualquier producto alcohólico restante y se puede reciclar, o se puede descartar y reemplazar con medio fresco de fermentación. La extracción del producto alcohólico por medio del extractante de la ISPR se puede llevar a cabo con o sin eliminar el microorganismo 32 del caldo de fermentación. El microorganismo 32 se puede eliminar del caldo de fermentación mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, filtración o centrifugación. Por ejemplo, la corriente de la fase acuosa 34 puede incluir un microorganismo 32, tal como una levadura. El microorganismo 32 se puede separar' fácilmente de la corriente de la fase acuosa, por ejemplo, en una centrifugadora (no se muestra) . Después, el microorganismo 32 se puede reciclar hasta el recipiente de fermentación 30, lo que con el tiempo puede incrementar la velocidad de producción del producto alcohólico, lo que produce un incremento en la eficiencia de la producción de alcohol.

En un modo continuo de la fermentación extractiva in situ, el volumen del extractante puede ser de aproximadamente 3 ¾ a aproximadamente 50 % del volumen de trabajo del recipiente de fermentación en una modalidad, de aproximadamente 3 % a aproximadamente 30 % en otra modalidad, de 3 % a aproximadamente 20 % en otra modalidad; y de 3 % a aproximadamente 10 % en otra modalidad. Dado que el producto se elimina continuamente del reactor, se requiere un volumen menor de extractante, lo que posibilita un volumen mayor del medio de fermentación a usar.

Como una alternativa para la fermentación extractiva in situ, el producto alcohólico se puede extraer del caldo de fermentación corriente abajo del recipiente de fermentación 30. En este caso, el caldo de fermentación se puede eliminar del recipiente de fermentación 30 y se puede introducir en el recipiente 35. Después, el extractante 28 se puede introducir en el recipiente 35 y se puede poner en contacto con el caldo de fermentación para producir la mezcla bifásica 39 en el recipiente 35 que, después, se separa en la fase orgánica 36 y la fase acuosa 34. Alternativamente, el extractante 28 se puede agregar al caldo de fermentación en un recipiente separado (no se muestra) antes de la introducción en el recipiente 35.

El extractante de ácidos grasos 28 tiene un coeficiente de separación para el producto alcohólico mayor que el coeficiente de separación de aceite 26 para el producto alcohólico. Por ejemplo, en donde la materia prima 12 es maíz, el aceite de maíz 26, si está presente en el caldo de fermentación, puede tener un coeficiente de separación para el producto alcohólico menor que aproximadamente 0.28, mientras que el extractante de ácidos grasos 28 derivados del aceite de maiz 26 puede tener un coeficiente de separación de aproximadamente 0.28 y mayor. En una modalidad el extractante de ácidos grasos 28 tiene un coeficiente de separación para el producto alcohólico, tal como butanol, de por lo menos aproximadamente 1, por lo menos aproximadamente 2 en otra modalidad, por lo menos aproximadamente 2.5 en otra modalidad, por lo menos aproximadamente 2.75 en otra modalidad y por lo menos aproximadamente 3 en otra modalidad. Por lo tanto, la eliminación del componente de aceite de la materia prima incrementa la eficiencia en la producción del producto alcohólico en la fermentación extractiva no solo al reducir la amenaza de degradación del coeficiente de separación del extractante de la ISPR, sino, además, al funcionar como materia prima para la producción de un extractante de ácidos grasos que puede dividir el producto alcohólico de la fase acuosa más que el aceite en si. Además, el extractante de ácidos grasos 28 derivados del aceite 26 en la materia prima 12 se puede usar solo o en combinación con un extractante exógeno (por ejemplo, alcohol oleilico proporcionado externamente) , para reducir o eliminar el costo asociado con el extractante exógeno.

Además, en el caso que el extractante de ácidos grasos 28 incluya ácidos grasos libres, la velocidad del consumo de glucosa por el microorganismo 32 en el recipiente de fermentación 30 puede ser mayor en presencia de tales ácidos grasos libres que sin tales ácidos grasos libres. De este modo, en algunas modalidades de la presente invención el caldo de fermentación puede ponerse en contacto con un extractante de ácidos grasos que tiene ácidos grasos libres, con lo cual los ácidos grasos libres pueden incrementar la captación de glucosa por medio del microorganismo 32 en comparación con la captación de glucosa cuando se usa un extractante de ISPR sin ácidos grasos libres (por ejemplo, alcohol oleilico) en la fermentación extractiva. Por ejemplo, como se ilustra en la Tabla 1 del Ejemplo 2 que se describe a continuación, las mezclas de amidas grasas/ácidos grasos usadas como extractantes de ácidos grasos en la fermentación extractiva pueden proporcionar una velocidad mayor de captación de glucosa por un butanologen de Saccharomyces que con el uso de alcohol oleilico como un extractante. Los métodos para producir un producto alcohólico a partir de un proceso de fermentación en donde los ácidos grasos libres se producen en una etapa del proceso y se ponen en contacto con cultivos de microorganismos en un recipiente de fermentación para mejorar la velocidad de crecimiento de los microorganismos y de consumo de glucosa se describen en la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 61/368,451, presentada el 28 de julio de 2010, que se incorpora en la presente descripción en su totalidad como referencia de esta.

En algunas modalidades el sistema y los procesos de la Figura 1 pueden modificarse de manera que la sacarificación y fermentación simultáneas en el recipiente de fermentación 30 se reemplaza con un recipiente de sacarificación separado 60 entre el separador 20 y el recipiente de fermentación 30, como seria evidente para un experto en la técnica.

En otras modalidades adicionales, tal como se muestra, por ejemplo, en la modalidad de la Figura 2, la sacarificación puede ocurrir en un recipiente de sacarificación separado 60 ubicado entre el separador 20 y el recipiente de licuación 10. La Figura 2 es prácticamente idéntica a la Figura 1, excepto por la inclusión del recipiente de sacarificación separado 60 que recibe la enzima 38, en donde l corriente de aceite 26 se separa de una corriente de materia prima liquida y sacarificada 62. La suspensión de materia prima 16 se introduce en el recipiente de sacarificación 60 junto con la enzima 38, tal como glucoamilasa, con lo cual los azúcares en forma de oligosacáridos en la suspensión 16 se pueden descomponer en monosacáridos . Una corriente de materia prima liquida y sacarificada 62 sale del recipiente de sacarificación 60 y se introduce en el separador 20. La corriente de materia prima 62 incluye monosacáridos, aceite y sólidos no disueltos derivados de la materia prima. En el separador 20, la corriente de materia prima 62 se separa en la corriente de aceite 26 y una corriente prácticamente acuosa 23, que se suministra en el recipiente de fermentación 30. En la modalidad que se muestra la corriente acuosa 23 incluye sólidos no disueltos. Alternativamente, los sólidos pueden eliminarse en el separador 20 como una pasta húmeda 24, como se describe con referencia a la modalidad de la Figura 1. La corriente de aceite 26 descargada del separador 20 tiene una cantidad de glicéridos, particularmente, triglicéridos , que se ponen en contacto con una o más sustancias 42 en el recipiente de reacción 40. Las sustancias 42 convierten químicamente por lo menos una porción de los glicéridos del aceite 26 en extractante de ácidos grasos 28 que se suministra en el recipiente de fermentación 30. Las operaciones restantes del proceso de la modalidad de la Figura 2 son idénticas a la Figura 1 y, por lo tanto, ya no se describirán en detalle.

En algunas modalidades de la presente invención, tal como se muestra, por ejemplo, en la modalidad de la Figura 3, la fermentación extractiva puede usar un extractante de ácidos grasos 28' que se deriva de una fuente de biomasa igual o distinta a la fuente de biomasa de materia prima 12, pero que no se deriva del aceite real contenido en la materia prima 12. Por ejemplo, cuando la materia prima 12 es maíz, el extractante de ácidos grasos 28' puede derivarse de aceite de maíz, pero el aceite de maíz que produce extractante 28' no es el aceite de maíz contenido en la materia prima 12 y separado en el recipiente de reacción 40 como se proporciona en la modalidad de la Figura 1. Como otro ejemplo, el extractante de ácidos grasos 28' puede derivarse de frijoles de soja (o soja) como la fuente de biomasa, mientras que la fuente de biomasa de materia prima 12 es maíz. Se puede usar cualquier combinación posible de las distintas fuentes de biomasa para el extractante 28' en oposición con la materia prima 12, como debería ser evidente para un experto en la técnica .

En algunas modalidades el extractante de ácidos grasos 28' se deriva de cualquier aceite natural y, por lo tanto, puede derivarse ya sea de una fuente de biomasa o, alternativamente, de una fuente animal.

En la modalidad de la Figura 3, la corriente acuosa líquida 22 se suministra en el recipiente de fermentación 30 junto con la enzima de sacarificación 38 y el microorganismo 32, con lo cual se produce un producto alcohólico por sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) . En algunas modalidades la sacarificación puede ocurrir en un recipiente separado tal como se describe con referencia a la modalidad de la Figura 2, por ejemplo. En algunas modalidades por lo menos el aceite 26 se ha eliminado, preferentemente, de la corriente acuosa líquida 22 por medio del separador 20 (ver la Figura 1), y en algunas modalidades se han eliminado, además, los sólidos no disueltos como pasta húmeda 24 antes de la introducción en el recipiente de fermentación 30 (ver la Figura 1) . Un aceite natural, tal como un aceite de origen vegetal, se introduce en el recipiente de reacción 40 como la corriente 26' junto con la sustancia o sustancias 42 para convertir químicamente por lo menos una porción de aceite 26' en extractante de ácidos grasos 28'. La corriente de aceite 26' no es aceite 26 derivado de la suspensión de materia prima 16 corriente arriba (ver la Figura 1). Cualquier aceite de origen vegetal u otro aceite natural que puede convertirse químicamente en extractante de ácidos grasos 28' para la ISPR puede ser la fuente de corriente de aceite 26'. Después, el extractante de ácidos grasos 28' del recipiente de reacción 40 se introduce en el recipiente de fermentación 30, con lo cual el producto alcohólico se divide en el extractante de ácidos grasos 28' en mayor grado que el producto alcohólico se dividiría en aceite 26' si hay presente en el recipiente de fermentación.

Por lo tanto, en algunas modalidades el producto alcohólico se extrae con el uso de extractante de ácidos grasos 28' obtenido de aceite de origen vegetal 26' que no es el mismo aceite 26 introducido originalmente en el proceso por medio de la materia prima 12. Opcionalmente, se puede introducir uno o más extractantes 29 en el recipiente de fermentación 30 para dividir, preferentemente, el producto alcohólico de la fase acuosa. El extractante o extractantes adicionales 29 pueden ser extractantes exógenos, tales como alcohol oleílico proporcionado exógenamente, que no se produjeron en el proceso y/o pueden ser otros extractantes de ácidos grasos. En algunas modalidades tales extractantes de ácidos grasos adicionales 29 pueden producirse a partir de un aceite que se deriva de una fuente de biomasa igual o distinta a cualquiera de las fuentes de biomasa de la corriente de alimentación del recipiente de fermentación 22 y la corriente de aceite 26'.

Las operaciones restantes del proceso de la modalidad de la Figura 3 son idénticas a las de las Figuras 1 y 2, excepto que la fase acuosa 34 no se muestra como suministrada de vuelta al recipiente de fermentación 30 y, por lo tanto, no se describirá en detalle nuevamente. Sin embargo, se debe comprender que en cualquiera de las modalidades presentadas en la presente descripción toda o parte de la fase acuosa 34 se puede reciclar, descartar y/o tratar adicionalmente para eliminar el producto alcohólico como se describió anteriormente con referencia a la Figura 1.

En algunas modalidades de la presente invención el aceite derivado de materia prima 12 no se separa en el separador 20, más bien se convierte químicamente en un extractante de ácidos grasos in situ, por ejemplo, en la materia prima 12 ya sea antes o durante la licuación, en la suspensión 16 o en la corriente sacarificada 62 (ver la Figura 2) . Por ejemplo, en la modalidad de la Figura 4 la materia prima 12 se suministra en el recipiente de licuación 10 junto con la enzima adecuada 14, por ejemplo, alfa-amilasa, para hidrolizar el almidón en la materia prima 12 para producir una materia prima líquida. En el recipiente de licuación 10 se introduce, además, ya sea antes, durante o después de la licuación de materia prima 12, una o más sustancias 42 para convertir químicamente el aceite presente en la materia prima 12 en extractante de ácidos grasos 28. Las sustancias 42 pueden introducirse en el recipiente de licuación 10 ya sea antes o después de agregar la enzima 14, y el aceite en la materia prima 12 se puede convertir en extractante 28 ya sea antes, durante o después de la licuación de materia prima 12. En cualquier caso, el aceite en la materia prima 12 se convierte en extractante de ácidos grasos 28 de manera que una corriente bifásica 18 sale del recipiente de licuación 10. La corriente bifásica 18 incluye tanto extractante de ácidos grasos 28 así como el azúcar, agua y sólidos no disueltos que forman la fase acuosa liquida 22. En algunas modalidades en donde el extractante de ácidos grasos incluye ácidos grasos, la fase acuosa 22 de la corriente bifásica 18 puede incluir glicerol (glicerina) a partir de la conversión de los glicéridos en el aceite en ácidos grasos. En algunas modalidades el glicerol, si está presente, se puede eliminar de la corriente 18 antes de la introducción en el recipiente de fermentación 30.

Con referencia a la Figura 4, la corriente bifásica 18 (es decir, las corrientes 22, 28) se pone en contacto con el caldo de fermentación en el recipiente de fermentación 30 para formar una mezcla bifásica. En el recipiente de fermentación 30 el producto alcohólico producido por SSF se divide en una fase orgánica que incluye extractante de ácidos grasos 28. Alternativamente, en algunas modalidades el proceso se puede modificar para incluir un recipiente de sacarificación separado, tal como se describe con referencia a la Figura 2. La separación de la mezcla bifásica ocurre en el recipiente de fermentación 30, con lo cual la corriente de la fase orgánica que contiene alcohol 36 y la corriente de la fase acuosa 34 salen directamente del recipiente de fermentación 30. Alternativamente, la separación de la mezcla bifásica se puede llevar a cabo en un recipiente separado 35 como se proporciona en las modalidades de las Figuras 1-3. Opcionalmente, se puede introducir uno o más extractantes adicionales 29 en el recipiente de fermentación 30 para formar una fase orgánica que divide, preferentemente, el producto alcohólico de la fase acuosa. Las operaciones restantes del proceso de la modalidad de la Figura 4 son idénticas a las de las figuras descritas previamente y, por lo tanto, no se describirán en detalle nuevamente.

En algunas modalidades de la presente invención el aceite de biomasa presente en la materia prima 12 se puede separar de las corrientes del proceso en una etapa después de la fermentación alcohólica. Después, el aceite separado después de la fermentación se puede convertir en un extractante de ácidos grasos y se puede introducir como un extractante de ISPR en el recipiente de fermentación. Por ejemplo, en la modalidad de la Figura 5, la materia prima 12 se vuelve liquida para producir la suspensión de materia prima 16 que incluye aceite 26 derivado de la materia prima. La suspensión de materia prima 16 puede incluir, además, sólidos no disueltos a partir de la materia prima. Alternativamente, los sólidos no disueltos se pueden separar de la suspensión 16 por medio de un separador, tal como una centrifugadora (no se muestra) . La suspensión de materia prima 16 que contiene aceite 26 se introduce directamente en el recipiente de fermentación 30 .que contiene un caldo de fermentación que incluye la enzima de sacarificación 38 y el microorganismo 32. Un producto alcohólico se produce por SSF en el recipiente de fermentación 30. Alternativamente, en algunas modalidades el proceso se puede modificar para incluir un recipiente de sacarificación separado, tal como se describe con referencia a la Figura 2.

El extractante de ISPR 29 se introduce en el recipiente de fermentación 30 para formar una mezcla bifásica y el producto alcohólico se elimina al dividirlo en la fase orgánica del extractante de ISPR 29. El aceite 26 se divide, además, en la fase orgánica. El extractante de ISPR 29 puede ser uno o más extractantes de ácidos grasos y/o extractantes orgánicos exógenos no derivados de aceite natural (por ejemplo, alcohol oleilico) . Si el extractante 29 es un extractante de ácidos grasos, el extractante 29 puede ser un extractante de ácidos grasos 28' (ver la Figura 3) producido de un aceite natural, tal como un aceite de origen vegetal que no es el mismo aceite introducido originalmente en el proceso por medio de la materia prima 12.

La separación de la mezcla bifásica ocurre en el recipiente de fermentación 30, con lo cual la corriente de la fase orgánica que contiene alcohol 36 y la corriente de la fase acuosa 34 salen directamente del recipiente de fermentación 30. Alternativamente, la separación de la mezcla bifásica se puede llevar a cabo en un recipiente separado 35 como se proporciona en las modalidades de las Figuras 1-3. La corriente de la fase orgánica 36 que incluye aceite 26 se introduce en un separador 50 para recuperar producto alcohólico 54 del extractante 29. El extractante pobre en alcohol 27 resultante incluye extractante recuperado 29 y aceite 26. El extractante 27 que incluye aceite 26 se introduce en el recipiente de reacción 40 y se pone en contacto con una o más sustancias 42 (por ejemplo, reactantes y/o solventes) que convierten químicamente por lo menos una porción de aceite 26 en extractante de ácidos grasos 28.

Después, el extractante 27 que incluye en el extractante de ácidos grasos 28 se puede reciclar de regreso al recipiente de fermentación 30. Tal corriente de extractante reciclado 27 puede ser una corriente separada o una corriente combinada con una corriente fresca de extractante de constitución 29. La eliminación posterior de la fase orgánica que contiene alcohol 36 puede incluir extractante de ácidos grasos 28 y extractante de ISPR 29, adicionalmente al aceite 26 y el producto alcohólico. Después, la fase orgánica 36 se puede tratar para recuperar el producto alcohólico, hacer reaccionar el aceite para formar un extractante de ácidos grasos y se puede reciclar de regreso al recipiente de fermentación 30 como el extractante de ácidos grasos pobre en alcohol resultante 28 y el extractante pobre en alcohol 29. En algunas modalidades el uso de extractante 29 se puede reducir progresivamente a medida que el proceso de fermentación se opera con el tiempo, debido a que el proceso en sí puede producir una cantidad suficiente de extractante de ácidos grasos 28 para extraer el producto alcohólico. Por lo tanto, el extractante de la ISPR puede ser extractante reciclado 27 y extractante de ácidos grasos 28 como un extractante de ISPR de constitución por medio del recipiente de reacción 40.

Alternativamente, en algunas modalidades la corriente de la fase orgánica 36 que incluye aceite 26 se puede introducir en el recipiente de reacción 40 antes de la recuperación del producto alcohólico 54 en el separador 50. En tales modalidades la corriente de la fase orgánica 36 se puede introducir en el recipiente de reacción 50 y se puede poner en contacto con una o más sustancias 42 para producir extractante de ácidos grasos 28. Después, la corriente de la fase orgánica resultante 36 que incluye extractante de ácidos grasos 28 se puede introducir en el separador 50 para recuperar el producto alcohólico 54 y, después, el extractante pobre en alcohol resultante se puede reciclar de regreso al recipiente de fermentación 30 como la corriente de extractante 27 que incluye extractante de ácidos grasos 28. En otras modalidades adicionales el aceite 26 se puede separar de la corriente de la fase orgánica 36 o la corriente de extractante 27 antes de poner el aceite 26 en contacto con la sustancia o sustancias 42 para producir extractante de ácidos grasos 28. Después, el extractante de ácidos grasos 28 se puede usar como extractante de ISPR suministrado en el recipiente de fermentación 30, un recipiente de fermentación distinto (por ejemplo, al funcionar a la vez o en serie con el recipiente de fermentación 30 en una planta de fabricación de alcohol) o se puede almacenar para usar posteriormente.

Por lo tanto, las Figuras 1-5 proporcionan varias modalidades no limitantes de métodos y sistemas que incluyen procesos de fermentación y extractantes de ácidos grasos 28 producidos de aceite derivado de biomasa 26 y extractantes de ácidos grasos 28' producidos de aceite natural, como aceite de origen vegetal 26' que se pueden usar para eliminar el producto alcohólico en la fermentación extractiva. Estos extractantes de ácidos grasos 28 y 28' se pueden seleccionar del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres metílicos de ácidos grasos, ásteres de glicol de ácidos grasos, triglicéridos y mezclas de estos. Los triglicéridos pueden ser hidroxilados o alcoxilados (por ejemplo, metoxilados, etoxilados) . La conversión química de glicéridos a partir de aceite natural en los extractantes de ácidos grasos descritos en la presente descripción se puede llevar a cabo con el uso de cualquier esquema de reacción conocido en la técnica. Con referencia al aceite de origen vegetal, tal como el aceite de maiz, por ejemplo, en algunas modalidades los triglicéridos hidroxilados como un extractante de ácidos grasos 28 o 28' se pueden producir al poner el aceite de maiz como aceite 26 o 26' en contacto con varios reactantes y solventes 42 (ver el Ejemplo 1 a continuación para detalles) para lograr la hidroxilación que se muestra en la Ecuación I: (I) En algunas modalidades los triglicéridos de aceite de maiz como aceite 26 o 26' se pueden hacer reaccionar con hidróxido de amonio acuoso como reactante 42 para producir amida grasa y ácido graso, que en conjunto o por separado se pueden usar como extractantes de ácidos grasos 28 o 28', como se describe en Roe, et al., Ara. Oil Chem. Soc. 29:18-22, 1952, y como se muestra en la ecuación II, por ejemplo: (II) NH4OH acuoso triglicéridos de aceite de maíz ? amida grasa + ácido graso + glicerol 160 °C En algunas modalidades el hidróxido de amonio acuoso es aproximadamente 28 % en peso de amoniaco en agua. En algunas modalidades la mezcla de amidas grasas de aceite de maíz y ácidos grasos de aceite de maíz producida de conformidad con la ecuación (II) se puede usar para producir un solo extractante de ácidos grasos 28 o 28'. En algunas modalidades la mezcla de amidas grasas y ácidos grasos puede incluir linolamida, ácido linoleico, oleamida, ácido oleico, palmitamida, ácido palmitico, estearamida y ácido esteárico. En tales modalidades tal mezcla puede estar compuesta de aproximadamente 37 % en peso de linolamida, aproximadamente 18 % de ácido linoleico, aproximadamente 19 % en peso de oleamida, aproximadamente 9 % en peso de ácido oleico, aproximadamente 8.7 % en peso de palmitamida, aproximadamente 4.3 % en peso de ácido palmitico, aproximadamente 1.2 % en peso de estearamida y aproximadamente 0.7 I en peso de ácido esteárico. Debe comprenderse que otras cantidades de composición son posibles y pueden depender de las cantidades de origen natural de ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico y ácido esteárico en el aceite de maíz usado. Por ejemplo, se esperaría que el aceite de maíz altamente oleico como el aceite 26 o 26', que puede tener, por ejemplo, hasta aproximadamente 65 % en peso de contenido de ácido oleico produzca una mezcla con mayor contenido de oleamida y ácido oleico conforme a la reacción de la ecuación (II) que se produce con el uso de aceite de maíz normal que es aproximadamente 24 % en peso del contenido de ácido oleico. En algunas modalidades las amidas grasas de aceite de maíz y los ácidos grasos de aceite de maíz producidos de conformidad con la ecuación (II) pueden mezclarse con ácidos grasos para variar la relación de amida grasa y ácido graso en el extractante de ácidos grasos 28 o 28'. En algunas modalidades una mezcla de amida grasa y ácido graso puede tener una relación de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2.

En algunas modalidades las amidas grasas de aceite de maíz puro como el extractante de ácidos grasos 28 o 28' pueden sintetizarse a partir de aceite de maíz como aceite 26 o 26' usando como sustancias 42 amoníaco anhidro como reactante con acetato amónico como un catalizador, como se describe en Kohlhase, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 48:265-270, 1971, por ejemplo. En algunas modalidades las amidas grasas de aceite de maíz puro pueden incluir linolamida, oleamida, palmitamida y estearamida. En tales modalidades las amidas grasas de aceite de maíz puro pueden estar compuestas de aproximadamente 55 % en peso de linolamida, aproximadamente 28 % en peso de oleamida, aproximadamente 13 % en peso de palmitamida y aproximadamente 2 % en peso de estearamida. Como se mencionó anteriormente, debe comprenderse que otras cantidades de composición son posibles y pueden depender de las cantidades de origen natural de ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico y ácido esteárico en el aceite de maíz usado.

En algunas modalidades el extractante de ácidos grasos 28 o 28' puede incluir amida grasa de la fórmula R (C=0) N (R' ) (R") , en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27 interrumpidos, opcionalmente, con uno o más enlaces dobles, y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de Ci~ s que contienen, opcionalmente, uno o más grupos hidroxilo.

En algunas modalidades los ácidos grasos de aceite de maíz como un extractante de ácidos grasos 28 o 28' pueden sintetizarse de aceite de maíz como aceite 26 o 26' por hidrólisis de bases con el uso de NaOH y agua como sustancias 42 (ver, por ejemplo, el Ejemplo 4 a continuación) , de conformidad con la reacción de la ecuación III, por ejemplo: (III) En algunas modalidades las amidas grasas de aceite de maiz puro y los ácidos grasos de aceite de maíz puro pueden mezclarse para producir un solo extractante de ácidos grasos 28 o 28'. Tal mezcla de amida grasa y ácido graso puede ser una mezcla de 2:1 y de 1:2 en otras modalidades, por ejemplo.

En algunas modalidades los alcoholes grasos como extractante de ácidos grasos 28 o 28' pueden producirse a partir de aceite de maiz como aceite 26 o 26' mediante la reducción con el uso de tetrahidrofurano (THF) y LiAlH4 como sustancias 42 (ver, por ejemplo, el Ejemplo 3 a continuación) , de conformidad con la reacción de la ecuación IV, por ejemplo: (IV) 3 RCH2OH + HOCH2CHOHCH2OH En algunas modalidades el aceite de maiz como aceite 26 o 26' se puede poner en contacto con metanol y un catalizador ácido como sustancias 42 para producir ésteres de ácidos grasos como extractante de ácidos grasos 28 o 28'. Por ejemplo, el aceite de maíz se puede hacer reaccionar con un alcohol que incluye, pero no se limita a, un alcohol de ocho carbonos o menos, en presencia de ácido sulfúrico para obtener ésteres de ácidos grasos (ver, por ejemplo, el Ejemplo 4 a continuación), de conformidad con la reacción. de la ecuación V: (V) En algunas modalidades el aceite de maíz como aceite 26 o 26' se puede convertir en éster de etilenglicol de aceite de maíz (FAGE, por sus siglas en inglés) como extractante de ácidos grasos 28 o 28' al producir ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME, por sus siglas en inglés) (ver la ecuación V presentada anteriormente) y al hacer reaccionar adicionalmente los FAME con etilenglicol como una sustancia adicional 42 (ver, por ejemplo, el Ejemplo 5 a continuación) , de conformidad con la reacción de la ecuación VI, por ejemplo: (VI) R-(C=0)-OMe + HO-CH2CH2-OH R- (C=0) -0-CH2CH2-OH En algunas modalidades los alcoholes grasos pueden ser hidroxilados y pueden usarse como extractantes. Por ejemplo, los alcoholes grasos se pueden hacer reaccionar con ácido peracético y, después, con un ácido acuoso para hidroxilar los enlaces dobles a lo largo de la cadena (ver, por ejemplo, el Ejemplo 8), tal como se muestra en la ecuación VII: En algunas modalidades el extractante puede ser un liquido o sólido, tal como microesferas . Un extractante que estuviera disponible en una forma sólida, tal como microesferas, podría manejarse durante el proceso de elaboración. Adicionalmente, el producto alcohólico (por ejemplo, butanol) podría recuperarse de este extractante, por ejemplo, por estabilización de gas, disolución en otro solvente o cualquier otro método aplicable conocido para una persona con experiencia en la técnica.

En algunas modalidades que incluyen cualquiera de las modalidades descritas anteriormente con referencia a las Figuras 1-5, el caldo de fermentación en el recipiente de fermentación 30 incluye por lo menos un microorganismo recombinante 3'2 que se modifica genéticamente (es decir, se desarrolla mediante ingeniería genética) para producir butanol por medio de una ruta biosintética de por lo menos una fuente de carbono fermentable en butanol. Particularmente, los microorganismos recombinantes se pueden cultivar en un caldo de fermentación que contiene sustratos de carbono adecuados. Los sustratos de carbono adicionales pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos , tales como fructosa; oligosacáridos, tales como lactosa, maltosa o sacarosa; polisacáridos , tales como almidón o celulosa; O mezclas de estos y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como permeato de suero de queso, licor de maíz fermentado, melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir etanol, lactato, succinato o glicerol.

Además, el sustrato de carbono puede ser, además, un sustrato de un carbono, tal como dióxido de carbono o metanol, para los que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos clave. Además de los sustratos de uno y de dos carbonos, se conoce que también los organismos metilotróficos usan diversos compuestos adicionales que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y una gran variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que las levaduras metilotróficas usan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion, et al., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7.° (1993), 415-32, Editor (es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido) . Del mismo modo, diversas especies de Candida metabolizan alanina o ácido oleico (Sulter, et al., Arch. Microbiol. 153:485-489, 1990). Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono empleada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y sólo estará limitada por la elección del organismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados, en algunas modalidades los sustratos de carbono son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estos con azúcares de C5, tales como xilosa y/o arabinosa, para células de levaduras modificadas para usar azúcares de C5. La sacarosa puede derivarse de fuentes de azúcar renovables, tales como caña de azúcar, betabel azucarero, mandioca, sorgo dulce, y mezclas de estos. La glucosa y la dextrosa pueden derivarse de fuentes de granos renovables a través de la sacarificación de materias primas a base de almidón que incluyen granos, tales como maíz, trigo, centeno, cebada, avena, y mezclas de estos. Adicionalmente, los azúcares fermentables pueden derivarse de biomasa celulósica o lignocelulósica renovable a través de procesos de tratamiento previo y sacarificación, como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918 Al, que se incorpora en la presente descripción como referencia. Adicionalmente a una fuente de carbono adecuada (de la corriente acuosa 22) , el caldo de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes adecuados conocidos para aquellos con experiencia en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática que comprende una dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) .

Los microorganismos recombinantes para producir butanol por medio de una ruta biosintética pueden incluir un miembro de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Serratia , Erwinia, Klebsiella, Shigella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella , Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Candida, Hansenula o Saccharomyces . En una modalidad los microorganismos recombinantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae . En una modalidad el microorganismo recombinante es una levadura con efecto crabtree seleccionada de Saccharo yces, Zygosa echaromyees, Schizosaccharomyces, Dekkera, Torulopsis, Brettanomyces y algunas especies de Candida. Las especies de levadura con efecto crabtree incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces mikitae, Saccharomyces paradoxus, Zygosaccharomyces rouxii y Candida glabrata. Por ejemplo, la producción de butanol que usa fermentación con un microorganismo, asi como los microorganismos que producen butanol, se conoce y se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370, que se incorpora en la presente descripción como referencia. En algunas modalidades los microorganismos comprenden una ruta biosintética de butanol. Las vias biosintéticas de butanol adecuadas son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957, que se incorpora en la presente descripción como referencia) . En algunas modalidades por lo menos uno, por lo menos dos, por lo menos tres o por lo menos cuatro polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato en producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades todos los polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato en producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades el microorganismo comprende una reducción o eliminación de la actividad de la piruvato descarboxilasa. Los microorganismos prácticamente libres de la actividad de la piruvato descarboxilasa se describen en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

La construcción de ciertas cepas, que incluyen las usadas en los ejemplos, se proporciona en la presente descripción.

Construcción de la cepa BP1064 de Saccharomyces cerevisiae y BP1083 de isobutanologen (NGCI-070) La cepa BP1064 se derivó de CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos) y contiene deleciones de los siguientes genes: URA3, HIS3, PDC1, PDC5, PDC6 y GPD2. La cepa BP1064 se transformó con los plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1, cuya construcción se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/246,844, presentada el 29 de septiembre de 2009, que se incorpora en la presente descripción como referencia) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 de isobutanologen (BP1083) .

Las deleciones, que eliminaron completamente la secuencia codificante, se crearon por recombinación homologa S5 con fragmentos de PCR que contienen regiones de homología en dirección 5' y en dirección 3' del gen objetivo y ya sea un marcador de resistencia G418 o un gen URA3 para la selección de transformantes. El marcador de resistencia G418, flanqueado por los sitios loxP, se eliminó con el uso de la Cre recombinasa. El gen URA3 se eliminó por medio de recombinación homologa para crear una supresión sin cicatrices o si estaba flanqueado por sitios loxP, se eliminó con el uso de la Cre recombinasa.

El procedimiento de supresión sin cicatrices se adaptó de Akada, et al. , (Yeast 23:399-405, 2006). Generalmente, el cásete de PCR para cada supresión sin cicatrices se elaboró al combinar cuatro fragmentos, A-B-U-C, por superposición de PCR. El cásete de PCR contenía un marcador seleccionable/seleccionable inverso, URA3 (fragmento U) que consiste en el gen natural CEN . PK 113-7D URA3, junto con el promotor (250 pb en dirección 5' del gen URA3) y el terminador (150 pb en dirección 3' del gen URA3) . Los fragmentos A y C, cada uno de 500 pb de longitud, correspondían con las 500 pb inmediatamente en dirección 5' del gen objetivo (fragmento A) y con las 3' 500 pb del gen objetivo (fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma por recombinación homologa. El fragmento B (de 500 pb de longitud) correspondía con las 500 pb inmediatamente en dirección 3' del gen objetivo y se usó para la excisión del marcador URA3 y el fragmento C del cromosoma por recombinación homologa, como una repetición directa de la secuencia correspondiente al fragmento B se creó con la integración del cásete en el cromosoma. Con el uso del cásete ABUC del producto de PCR, el marcador URA3, primero, se integró y, después, se eliminó del cromosoma por recombinación homologa. La integración inicial eliminó el gen, sin incluir la 3' 500 pb. Con la excisión, se eliminó, además, la región de 3' 500 pb del gen. Para la integración de genes con el uso de este método, el gen a integrar se incluyó en el cásete de PCR entre los fragmentos A y B.

Supresión de URA3 Para eliminar la región codificante URA3 endógena, un cásete ura3 : : loxP-kanMX-loxP se amplificó por PCR a partir del ADN de plantilla de pLA54 (sec. con núm. de ident . : 3). pLA54 contiene el promotor TEF1 de K. lactís y el marcador kanMX, y está flanqueado por los sitios loxP para permitir la recombinación con la Cre recombinasa y la eliminación del marcador. La PCR se llevó a cabo con el uso de la ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, A) y los cebadores BK505 y BK506 (sec. con núms . de ident.: 4 y 5). La porción URA3 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor URA3 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante, de manera que la integración del marcador ????-kanMX.-loxP produjera el reemplazo de la región codificante URA3. El producto de PCR se transformó en CEN.PK 113-7D con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ^págs. 201-202) y los transformantes se seleccionaron en YPD con G418 (100 pg/ml) a 30 °C. Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta por PCR con el uso de los cebadores LA468 y LA492 (sec. con núms . de ident.: 6 y 7) y se denominaron CEN.PK 113-7D Aura3: : kanMX.

Supresión de HIS3 Los cuatro fragmentos para el cásete de PCR para la supresión de HIS3 sin cicatrices se amplificaron con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico CEN.PK 113-7D como plantilla, se prepararon con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de HIS3 se amplificó 'con el cebador oBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y el cebador oBP453 (sec. con núm. de ident.: 15) que contiene una cola 5' con homología hasta el extremo 5' del fragmento B de HIS3. El fragmento B de HIS3 se amplificó con el cebador OBP454 (sec. con núm. de ident.: 16) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento A de HIS3 y el cebador OBP455 (sec. con núm. de ident. : 17) que contiene una cola 5f con homología con el extremo 5' del fragmento U de HIS3. El fragmento ü de HIS3 se amplificó con el cebador oBP456 (sec. con núm. de ident . : 18) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento B de HIS3 y el cebador oBP457 (sec. con núm. de ident.: 19) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento C de HIS3. El fragmento C de HIS3 se amplificó con el cebador oBP458 (sec. con núm. de ident.: 20) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento U de HIS3 y el cebador oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21). Los productos dé PCR se purificaron con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento AB de HIS3 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento A de HIS3 y el fragmento B de HIS3 y al amplificar los cebadores oBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y ???455 (sec. con núm. de ident.: 17). El fragmento UC de HIS3 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento U de HIS3 y el fragmento C de HIS3 y al amplificar con los cebadores OBP456 (sec. con núm. de ident.: 18) y oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de HIS3 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento AB de HIS3 y el fragmento UC de HIS3 y al amplificar con los cebadores oBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::kanMX se produjeron y se transformaron con el cásete de PCR HIS3 ABUC con el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio completo sintético sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con un bloqueo his3 se analizaron por PCR con los cebadores oBP460 (sec. con núm. de ident . : 22) y oBP461 (sec. con núm. de ident.: 23) con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . Un transformante correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : kanMX Ahis3: :URA3.

Eliminación del marcador KanMX del sitio Aura3 y eliminación del marcador URA3 del sitio Ahis3 > El marcador KanMX se eliminó al transformar CEN.PK 113-7D Aura3::kanMX Ahis3::URA3 con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 66, que se describe en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/290,639) con el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research. Corporation, Irvine, CA) y al colocarlo en medio completo sintético sin histidina ni uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YP suplementado con galactosa al 1 % a 30 °C durante ~6 horas para inducir la Cre recombinasa y la excisión del marcador KanMX y se colocaron en placas con YPD (glucosa .al 2 %) a 30 °C durante la recuperación. Un aislado se cultivó durante la noche en YPD y se colocó en placas con medio completo sintético que contiene ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA, 0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se cultivaron y se colocaron en placas con YPD para eliminar el plásmido pRS423 : : PGALl-cre . Los aislados se analizaron para detectar la pérdida del marcador KanMX, del marcador URA3 y del plásmido pRS423 :: GALl-cre al evaluar el crecimiento en placas con YPD+G418, placas con medio completo sintético sin uracilo y placas con medio completo sintético sin histidina. Un aislado correcto que fue sensible a G418 y auxotrófico para uracilo e histidina se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 y se denominó BP857. Las deleciones y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciación con los cebadores oBP450 (sec. con núm. de ident.: 24) y oBP451 (sec. con núm. de ident . : 25) para Aura3 e cebadores OBP460 (sec. con núm. de ident.: 22) y oBP461 (sec. con núm. de ident.: 23) para Ahis3 con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) .

Supresión de PDC6 Los cuatro fragmentos para el cásete de PCR para la supresión de PDC6 sin cicatrices se amplificaron con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla se prepararon con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de PDC6 se amplificó con el cebador OBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y el cebador OBP441 (sec. con núm. de ident.: 27) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento B de PDC6. El fragmento B de PDC6 se amplificó con el cebador OBP442 (sec. con núm. de ident.: 28) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento A de PDC6 y el cebador oBP443 (sec. con núm. de ident.: 29) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento U de PDC6. El fragmento U de PDC6 se amplificó con el cebador oBP444 (sec. con núm. de ident.: 30) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento B de PDC6 y el cebador oBP445 (sec. con núm. de ident.: 31) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento C de PDC6. El fragmento C de PDC6 se amplificó con el cebador oBP446 (sec. con núm. de ident.: 32) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento U de PDC6 y el cebador oBP447 (sec. con núm. de ident. : 33) . Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento AB de PDC6 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento A de PDC6 y el fragmento B de PDC6 y amplificar con los cebadores OBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y OBP443 (sec. con núm. de ident.: 29). El fragmento UC de PDC6 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento U de PDC6 y el fragmento C de PDC6 y amplificar con los cebadores oBP444 (sec. con núm. de ident. : 30) y oBP447 (sec. con núm. de ident.: 33). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de PDC6 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento AB de PDC6 y el fragmento UC de PDC6 y amplificar con los cebadores oBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y OBP447 (sec. con núm. de ident.: 33). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CE . PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 se produjeron y se transformaron con el cásete de PCR PDC6 ABUC con el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio completo sintético sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con un bloqueo pdc6 se analizaron por PCR con los cebadores oBP448 (sec. con núm. de ident.: 34) y oBP449 (sec. con núm. de ident.: 35) con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . Un transformante correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 ñpdc6: : URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6::URA3 se cultivó durante la noche en YPD y se colocó en placas con medio completo sintético que contiene ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supresión y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciación con los cebadores OBP448 (sec. con núm. de ident.: 34) y oBP449 (sec. con núm. de ident.: 35) con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC6 del aislado se demostró por un resultado de PCR negativo con el uso de los cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC6, oBP554 (sec. con núm. de ident.: 36) y oBP555 (sec. con núm. de ident.: 37). El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 y se denominó BP891.

Supresión de PDC1 e integración de ilvDSm El gen PDC1 se eliminó y se reemplazó con la región codificante ilvD de Streptococcus mutans núm. de la ATCC 700610. El fragmento A seguido por la región codificante ilvD de Streptococcus mutans para el cásete de PCR para la supresión de PDCl-integración de ilvDSm se amplificó con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico de NYLA83 (que se describe en la presente descripción y en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/246,709) como plantilla, que se preparó con el kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A-ilvDSm de PDCl (sec. con núm. de ident . : 138) se amplificó con el cebador oBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y el cebador oBP515 (sec. con núm. de ident.: 39) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento B de PDCl. Los fragmentos B, U y C para el cásete de PCR para la supresión de PDCl-integración de ilvDSm se amplificaron con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, que se preparó con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento B de PDCl se amplificó con el cebador oBP516 (sec. con núm. de ident.: 40) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento A-ilvDSm de PDCl y el cebador oBP517 (sec. con núm. de ident.: 41) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento U de PDCl. El fragmento U de PDCl se amplificó con el cebador oBP518 (sec. con núm. de ident.: 42) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento B de PDCl y el cebador oBP519 (sec. con núm. de ident.: 43) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento C de PDCl. El fragmento C de PDC se amplificó con el cebador OBP520 (sec. con núm. de ident.: 44), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3 del fragmento U de PDC1 y el cebador OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A-ilvDSm-B de PDC1 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento A-ilvDSm de PDC1 y el fragmento B de PDC1 y amplificar con los cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y OBP517 (sec. con núm. de ident.: 41). El fragmento UC de PDC1 se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento U de PDCl y el fragmento C de PDC1 y amplificar con los cebadores oBP518 (sec. con núm. de ident.: 42) y OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete A-ilvDSm-BUC de PDCl (sec. con núm. de ident.: 139) se creó por superposición de PCR al mezclar el fragmento A-ilvDSm-B de PDCl y el fragmento UC de PDCl y al amplificar con los cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y oBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 se produjeron y se transformaron con el cásete de PCR A-ilvDSm-BUC de PDCl con el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) .

Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio completo sintético sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con un bloqueo pdcl e integración de ilvDSm se analizaron por PCR con los cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident. : 46) y oBP512 (sec. con núm. de ident.: 47) con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC1 del aislado se demostró por un resultado de PCR negativo con el uso de cebadores específicos para la secuencia codificante de PDCl, oBP550 (sec. con núm. de ident. : 48) y oBP551 (sec. con núm. de ident. : 49) . Un transformante correcto se seleccionó como la cepa CEN.P 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3 se cultivó durante la noche en YPD y se colocó en placas con medio completo sintético con ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supresión de PDCl, la integración de ilvDSm y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR y por secuenciación con los cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 46) y oBP512 (sec. con núm. de ident.: 47) con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 ñpdc6 ñpdcl :: ilvDSm y se denominó BP907.

Supresión de PDC5 e integración de sadB El gen PDC5 se eliminó y se reemplazó con la región codificante sadB de Achromobacter xylosoxidans . Un segmento del cásete de PCR para la supresión de PDC5-integración de sadB se clonó, primero, en el plásmido pUC19-URA3MCS . püC19-URA3MCS se basa en pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae que se ubica dentro de un sitio de clonación múltiple ( CS, por sus siglas en inglés) . El pUC19 contiene el replicón pMBl y un gen que codifica para la beta-lactamasa para la replicación y selección en Escherichia coli . Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3, las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' de este gen se incluyeron para la expresión del gen URA3 en levadura. El vector se puede usar para propósitos de clonación y como un vector de integración de levadura.

El ADN que incluye la región codificante de URA3 junto con 250 pb en dirección 5' y 150 pb en dirección 3' de la región codificante de URA3 del ADN genómico CEN.PK 113-7D de Saccharomyces cerevisiae se amplificó con los cebadores oBP438 (sec. con núm. de ident . : 12) que contienen los sitios de restricción BamHI, AscI, Pmel y Fsel, y oBP439 (sec. con núm. de ident.: 13) que contiene los sitios de restricción Xbal, Pací y Notl, con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) . El ADN genómico se preparó con el uso de un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El producto de PCR y püC19 (sec. con núm. de ident. : 140) se ligaron con la ADN ligasa de T4 después de la digestión con BamHI y Xbal para crear el vector pUC19-URA3 CS . El vector se confirmó por PCR y secuenciación con los cebadores oBP264 (sec. con núm. de ident.: 10) y oBP265 (sec. con núm. de ident.: 11).

La secuencia codificante de sadB y el fragmento B de PDC5 se clonaron en pUC19-URA3MCS para crear la porción sadB-BU del cásete de PCR PDC5 A-sadB-BUC. La secuencia codificante de sadB se amplificó con el uso de pLH468-sadB (sec. con núm. de ident. : 67) como plantilla con el cebador oBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) que contiene un sitio de restricción AscI y el cebador oBP531 (sec. con núm. de ident.: 51) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento B de PDC5. El fragmento B de PDC5 se amplificó con el cebador oBP532 (sec. con núm. de ident.: 52) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' de sadB y el cebador OBP533 (sec. con núm. de ident.: 53) que contiene un sitio de restricción Pmel . Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento B de sadB-PDC5 se creó por superposición de PCR al mezclar los productos de PCR sadB y el fragmento B de PDC5 y al amplificar con los cebadores OBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) y oBP533 (sec. con núm. de ident.: 53). El producto de PCR resultante se digirió con AscI y Pmel y se ligó con la ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas adecuadas. El plásmido resultante se usó como plantilla para la amplificación de sadB-fragmento B-fragmento U con el uso de los cebadores OBP536 (sec. con núm. de ident.: 54) y ???546 (sec. con núm. de ident . : 55) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento C de PDC5. El fragmento C de PDC5 se amplificó con el cebador OBP547 (sec. con núm. de ident.: 56) que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' de sadB-fragmento B-fragmento U de PDC5 y el cebador oBP539 (sec. con núm. de ident.: 57). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) . Se creó sadB-fragmento B-fragmento U-fragmento C de PDC5 por superposición de PCR al mezclar sadB-fragmento B-fragmento U de PDC5 y fragmento C de PDC5 y amplificar con los cebadores OBP536 (sec. con núm. de ident.: 54) y OBP539 (sec. con núm. de ident.: 57). El producto de PCR resultante se purificó en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete A-sadB-BUC de PDC5 (sec. con núm. de ident.: 141) se creó al amplificar sadB-fragmento B-fragmento U-fragmento C de PDC5 con los cebadores OBP542 (sec. con núm. de ident.: 58) que contiene una cola 5' con homología con los 50 nucleótidos inmediatamente en dirección 5' de la secuencia codificante de PDC5 natural, y OBP539 (sec. con núm. de ident.: 57). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación por PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm se produjeron y se transformaron con el cásete de PCR A-sadB-BUC de PDC5 con el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio completo sintético sin uracilo suplementado con etanol al 1 % (sin glucosa) a 30 °C. Los transformantes con un bloqueo pdc5 e integración de sadB se analizaron por PCR con los cebadores oBP540 (sec. con núm. de ident.: 59) y OBP541 (sec. con núm. de ident.: 60) con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC5 del aislado se demostró por medio de un resultado de PCR negativo con el uso de cebadores específicos ¦ para la secuencia codificante de PDC5, oBP552 (sec. con núm. de ident.: 61) y oBP553 (sec. con núm. de ident.: 62). Un transformante correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3 se cultivó durante la noche en YPE (etanol al 1 %) y se colocó en placas con medio completo sintético suplementado con etanol (sin glucosa) y con ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supresión de PDC5, la integración de sadB y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores OBP540 (sec. con núm. de ident.: 59) y oBP541 (sec. con núm. de ident . : 60) con el uso de ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 ñpdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB y se denominó BP913.

Supresión de GPD2 Para eliminar la región codificante GPD2 endógena, un cásete gpd2 : : loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident.: 142) se amplificó por PCR con el uso de loxP~URA3-loxP (sec. con núm. de ident. : 68) como ADN de plantilla. loxP-URA3-loxP contiene el marcador URA3 de (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por los sitios de recombinasa loxP. La PCR se llevó a cabo con el uso de ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores LA512 y LA513 (sec. con , núms . de ident.: 8 y 9) . La porción GPD2 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' de la región codificante GPD2 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante, de manera que la integración del marcador loxP-URA3-loxP produjera el reemplazo de la región codificante GPD2. El producto de PCR se transformó en BP913 y los transformantes se seleccionaron en medio completo sintético sin uracilo suplementado con etanol al 1 % (sin glucosa) . Los transformantes se analizaron para verificar la correcta integración por PCR con el uso de los cebadores OBP582 y AA270 (sec con núms . de ident.: 63 y 64).

El marcador URA3 se recicló por transformación con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 66) y se colocó en placas con medio completo sintético sin histidina suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Los transformantes se trasladaron a placas con medio completo sintético suplementado con etanol al 1 % y con ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) y se incubaron a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) para eliminar el plásmido pRS423 :: PGALl-cre . La supresión y eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores OBP582 (sec. con núm. de ident.: 63) y oBP591 (sec. con núm. de ident.: 65). El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB Agpd2 : : loxP y se denominó PNY1503 (BP1064) .

La cepa BP1064 se transformó con los plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083; PNY1504).

Construcción de las cepas NYLA74 y NYLA83 Inserción-inactivación de los genes endógenos PDC1 y PDC6 de S. cerevisiae. Los genes PDC1, PDC5 y PDC6 codifican las tres isozimas principales de piruvato descarboxilasa y se describen de la siguiente manera: Construcción de pRS425: :GPM-sadB Se clonó un fragmento de ADN que codifica una butanol deshidrogenasa (sec. con núm. de ident.: 70) de Achromobacter xylosoxidans (que se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823) . La región codificante de este gen denominada sadB para la alcohol deshidrogenasa secundaria (sec. con núm. de ident.: 69) se amplificó con el uso de condiciones estándar de ADN genómico de A. xylosoxidans, preparado con el uso de un I it Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) seguido por el protocolo recomendado para organismos gram negativo con el uso de los cebadores directo e inverso N473 y N469 (sec. con núms . de ident.: 74 y 75), respectivamente. El producto de PCR se clonó con T0P0®-Blunt en pCR®4 BLUNT ( Invitrogen™, Carlsbad, CA) para producir pCR4Blurit : : sadB, que se transformó en células Mach-1 de E. coli. Posteriormente, el plásmido se aisló de cuatro clones, y se verificó la secuencia.

La región codificante sadB se amplificó por PCR 1 a partir de pCR4Blunt : : sadB . Los cebadores de PCR contenían secuencias 5' adicionales para superponerse con el promotor GPM1 y el terminador ADHl de levadura (N583 y N584, como sec. con núms. de ident.: 76 y 77). Después, el producto de PCR se clonó con el uso de la metodología de "reparación de separación" en Saccharomyces cerevisiae (Ma, et al., Gene 58:201-216, 1987) como se describe a continuación. El vector transportador de levadura-E. coli pRS425 : : GPM : : kivD: : ADH que contiene el promotor GPM1 (sec. con núm. de ident . : 72), la región codificante kivD de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 71) y el terminador ADH1 (sec. con núm. de ident.: 73) (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957 Al, Ejemplo 17) se digirió con las enzimas de restricción BbvCI y Pací para liberar la región codificante kivD. Aproximadamente 1 g del fragmento del vector restante se transformó en la cepa BY4741 de S. cerevisiae junto con 1 µg del producto de PCR sadB. Se seleccionaron transformantes en medio sintético completo sin leucina. El evento de recombinación adecuado, que genera pRS425 : : GPM-sadB (sec. con núm. de ident.: 124), se confirmó por PCR con el uso de los cebadores N142 y N459 (:sec. con núms. de ident.: 108 y 109).

Construcción del cásete de integración pdc6 : : PGpMi~sadB y supresión de PDC6 Un cásete de integración pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt-URA3r se preparó al unir el segmento GP -sadB-ADHt (sec. con núm. de ident.: 79) de pRS425 :: GPM-sadB (sec. con núm. de ident.: 78) con el gen URA3r de pUCl9-URA3r. pUC19-URA3r (sec. con núm. de ident. :80) contiene el marcador URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias homologas de repetición de 75 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador URA3. Los dos segmentos de ADN se unieron por PCR de SOE (como lo describen Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989) con el uso del ADN de los plásmidos pRS425: :GPM-sadB y pUC19-URA3r como plantilla, con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores 114117-11A al 114117-11D (sec. con núms . de ident.: 81, 82, 83 y 84) y 114117-13A y 114117-13B (sec. con núms. de ident.: 85 y 86).

Los cebadores externos para la PCR SOE (114117-13A y 114117-13B) contenían regiones 5' y 3' de ~50 pb homologas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del promotor y terminador de PDC6, respectivamente. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 (núm. de la ATCC 200866) y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con glucosa al 2 % a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de cebadores 112590-34G y 112590-34H (sec. con núm. de ident.: 87 y 88) y 112590-34F y 112590-49E (sec. con núm. de ident.: 89 y 90) para verificar la integración en el locus PDC6 con supresión de la región codificante del PDC6. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos supleraentados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. La eliminación del marcador se confirmó al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt .

Construcción del cásete de integración pdcl : : PPDCl-ilvD y supresión de PDC1 Un cásete de integración pdcl : : PPDCl-ilvD-FBAlt-URA3r se preparó mediante la unión del segmento ilvD-FBAlt (sec. con núm. de ident . : 91) de pLH468 (sec. con núm. de ident . : 2) al gen URA3r de pUC19-URA3r por PCR de SOE (como lo describen Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989) con el uso del ADN de los plásmidos pLH468 y pUC19-URA3r como plantilla, con la ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores 114117-27A al 114117-27D (sec. con núms . de ident.: 110, 111, 112 y 113).

Los cebadores externos para la PCR SOE (114117-27A y 114117-27D) contenían las regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones en dirección 3' del promotor de PDC1 y en dirección 3' de la secuencia codificante de PDC1. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 pdc6: : PGPMl-sadB-ADHlt y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con glucosa al 2 % a 30 °C con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202). Los transformantes se analizaron por PCR mediante los cebadores 114117-36D y 135 (sec. con núms . de ident.: 92 y 93) y los cebadores 112590-49E y 112590-30F (sec. con núms. de ident.: 90 y 94) para verificar la integración en el locus del PDC1 con supresión de la secuencia codificante del PDC1. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementarios con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. La eliminación del marcador se confirmó al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa resultante identificada "NYLA67" tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGP l-sadB-ADHlt pdcl: : PPDCl-ilvD-FBAlt . i Supresión de HIS3 Para suprimir la región codificante del gen : endógeno HIS3, un cásete his3::URA3r2 se amplificó por PCR a partir de la plantilla de ADN URA3r2 (sec. con núm. de ident.: 95). El URA3r2 contiene el marcador URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias homologas de repetición de 500 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador URA3. La PCR se llevó a cabo con el uso de la ADN polimerasa Phusion® (New England BioLábs Inc., Ipswich, A) y los cebadores 114117-45A y 114117-45B (sec. con núms. de ident . : 96 y 97) que generó un producto PCR de ~2.3 kb. La porción de HIS3 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor de HIS3 y región 3' en dirección 3' de la región codificante para que la integración del marcador de URA3r2 produzca el reemplazo de la región codificante de HIS3. El producto de PCR se transformó en NYLA67 con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medio sintético completo sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se seleccionaron para verificar la integración correcta al colocarlos en placas de réplica de los transformantes en el medio sintético completo sin histidina y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. El marcador URA3r se recicló al colocarlo en una placa con medio sintético completo suplementado con glucosa al 2 % y 5-FOA a 30 C, según los protocolos estándar. La eliminación del marcador se confirmó al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, denominada NYLA73, tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGP l-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3.

Construcción del cásete de integración pdc5 : : kanMX y supresión de PDC5 Un cásete pdc5::kanMX4 se amplificó por PCR a partir del ADN cromosómico de la cepa YLR134W (núm. de la ATCC 4034091) con el uso de la ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores PDC5 : : Kan XF y PDC5::KanMXR (sec. con núms . de ident. : 98 y 99) que generó un producto PCR de ~2.2 kb. La porción de PDC5 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor de PDC5 y región 3' en dirección 3' de la región codificante para que la integración del marcador de kanMX4 produzca el reemplazo de la región codificante de PDC5. El producto de PCR se transformó en NYLA73 con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medios de YP suplementado con etanol al 1 % y geneticina (200 µg/ml) a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus PDC con reemplazo de la región codificante PDC5 con el uso de los cebadores PDC5kofor y N175 (sec. con núms. de ident.: 100 y 101) . Los transformantes correctos identificados tienen el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt pdcl : : PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 pdc5 : : kanMX4. La cepa se denominó NYLA74.

Supresión de HXK2 (hexocinasa II) Un cásete hxk2::URA3r se amplificó por PCR a partir de la plantilla URA3r2 (descrita anteriormente) con el uso de la ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores 384 y 385 (sec. con núms . de ident.: 102 y 103) que generó un producto PCR de ~2.3 kb. La porción HXK2 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor HXK2 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante para que la integración del marcador de URA3r2 produzca el reemplazo de la región codificante de HXK2. El producto de PCR se transformó en NYLA73 con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medio completo sintético sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus HXK2 con el reemplazo de la región codificante HXK2 con el uso de los cebadores N869 y N871 (sec. con núms. de ident.: 104 y 105). El marcador URA3r2 se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. La eliminación del marcador se confirmó al colocar parches de colonias de las placas 5-FOA en medio SD-URA para verificar la falta de crecimiento, y . por PCR para verificar la eliminación del marcador correcto con el uso de los cebadores N946 y N947 (sec. con núms. de ident.: 106 y 107). La cepa identificada resultante, denominada NYLA83, tiene el genotipo: BY4700 pdc6: : PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2.

Construcción de NYLA93 A continuación se describe la inserción-desactivación de los genes endógenos PDC1, PDC5 y PDC6 de S. cerevisiae . Los genes PDC1, PDC5 y PDC6 codifican las tres isoenzimas principales de piruvato decarboxilasa . La cepa de inactivación de PDC resultante se usó como un huésped para los vectores de expresión pYZ067 (sec. con núm. de ident.: 129) y pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1), cuya construcción se describe en la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos núm. 61/246,844, presentada el 29 de septiembre de 2009, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

Supresión de 3-fosfato deshidrogenasa de glicerol dependiente de NAD Un cásete gpd2 : loxP-t/i¾¾3-loxP se amplificó por PCR a partir de la plantilla del plásmido pUC19 : : loxP-URA3-loxP con el uso de la ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores LA512 y LA513 (sec. con núms. de ident.: 8 y 9) que generaron un producto de PCR de -1.6 kb. pUC19 : : loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident.: 130) contiene el marcador URA3 de (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por los sitios loxP recombinasa. La porción GPD2 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor GPD2 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante, de manera que la integración del marcador loxP-URA3-loxP produce el reemplazo de la región codificante GPD2. El producto de PCR se transformó en NYLA83 con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medio completo sintético sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus GPD2 con el reemplazo de la región codificante HXK2 con el uso de los cebadores LA516 y N175 (sec. con núm. de ident.: 132 y 101). El marcador URA3 se recicla por transformación con pRS423 :: PGALI-ere (sec. con num. de ident.: 131) y se coloca en placas con medio completo sintético sin histidina suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Las colonias se colocan en parches sobre placas con YP (galactosa al 1 %) a 30 °C para inducir la excisión del marcador URA3 y se trasladan a placas con YPD a 30 °C para la recuperación. La eliminación del marcador URA3 se confirma mediante la colocación de parches en las colonias desde las placas con YPD en medio completo sintético sin uracilo para verificar la ausencia de crecimiento. Los clones correctos identificados tienen el genotipo: BY4700 pdc6: : VGPM1-sadB-ADHlt pdcl: : PPDCi-ilvD-FBAlt ¿his3 Ahxk2 gpd2 : : loxP. La cepa se denominó NYLA92.

Construcción del cásete de integración pdc5 : : loxP-kanMX- loxP y supresión de PDC5 Un cásete pdc5: :loxP-kanMX-loxP se amplificó por PCR a partir del plásmido pUC19 : : loxP-kanMX-1oxP (sec. con núm. de ident.: 135) con el uso de la ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores LA249 y LA397 (sec. con núms . de ident.: 136 y 137) que generaron un producto de PCR de -2.2 kb. pUC19 : : loxP-kanMX-loxP (sec. con núm. de ident.: 135) contiene el gen kanMX de pFA6 (Wach, et al., Yeast 10:1793-1808, 1994) y el promotor TEF1 de K. lactis y el terminador flanqueado por los sitios loxP recombinasa. La porción PDC5 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor PDC5 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante de manera que la integración del marcador loxP-Jan -loxP produce el reemplazo de la región codificante PDC5. El producto de PCR se transformó en NYLA92 con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medio YP suplementado con etanol al 1' % y geneticina (200 µg/ml) a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus PDC5 con el reemplazo de la región codificante PDC5 con el uso de los cebadores LA363 y LA364 (sec. con núms . de ident . : 133 y 134) . Los transformantes correctos identificados tienen el genotipo: BY4700 pdc6: PCPm-sadB-ADHlt pdcl: :PPDCi-HvD-FBAlt &his3 Ahxk2 &gpd2::loxP Apdc5: loxP-kanMX-lox . La cepa se denominó NYLA93.

NYLA93 (pYZ067/pYZ090) Los vectores plasmidicos pYZ067 y pYZ090 se transformaron simultáneamente en la cepa NYLA93 (BY4700 pdc6:: PCPM1-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCi- HvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2 Agpd2 : : loxP Apdc5: loxP-kanMX-loxP) con el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y la cepa resultante (isobutanologen NYLA93, denominado también NGCI-065) se mantuvo en medio completo sintético sin histidina ni uracilo, y suplementado con etanol al 1 % a 30 °C.

Vector de expresión pLH468 El plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) se construyó para la expresión de DHAD, cetoisovalerato decarboxilasa (KivD) y alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HADH, por sus siglas en inglés) en levadura.

Las regiones codificantes para Lactococcus lactís cetoisovalerato decarboxilasa (KivD, por sus siglas en inglés) y la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HADH, por sus siglas en inglés) se sintetizaron por el ADN2.0 con base en codones que se optimizaron para expresión en Saccharomyces cerevisiae (sec. con núms. de ident.: 71 y 117, respectivamente) y proporcionados en los plásmidos pKivDy-DNA2.0 y pHadhy-DNA2.0. Las proteínas codificadas son las sec. con núms. de ident.: 116 y 118, respectivamente. Se construyeron los vectores de expresión individuales para KivD y HADH. Para unir pLH467 (pRS426 :: PTDH3-kivDy- TDH3t ) , el vector pNY8 (sec. con núm. de ident.: 120; denominado, además, pRS426. GPD-ald-GPDt , descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0182308, Ejemplo 17, que se incorpora en la presente descripción como referencia) se digirió con las enzimas AscI y Sfil, para eliminar el promotor GPD y la región codificante ald. Un fragmento del promotor TDH3 (sec. con núm. de ident.: 121) de pNY8 se amplificó por PCR para agregar un sitio AscI en el extremo 5' y un sitio Spel en el extremo 3' , con el uso del cebador 5' OT1068 y el cebador 3' OT1067 (sec. con núms. de ident.: 122 y 123). El fragmento del vector pNY8 digerido con Ascl/Sfil se unió con el producto de PCR del promotor TDH3 digerido con AscI y Spel y el fragmento Spel-Sfil que contiene la región codificante de kivD optimizada por codones aislada del vector pKivD-DNA2.0. La unión triple generó el vector pLH467 (pRS426: :PTDH3-kivDy-TDH3t) . El pLH467 se verificó por mapeo de restricción y secuenciación .

El pLH435 (pRS425: : PGPM1-Hadhy-ADHlt) se derivó del vector pRS425 : : GPM-sadB (sec. con núm. de ident . : 78) que se describe en la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos núm. 61/058970, Ejemplo 3, que se incorpora en la presente descripción como referencia. pRS425 :: GPM-sadB es el vector pRS425 (núm. de la ATCC 77106) con un gen quimérico que contiene el promotor GPMl (sec. con núm. de ident.: 72), la región codificante de una butanol deshidrogenasa de Achromobacter xylosoxidans (sadB; ADN sec. con núm. de ident.: 69; Proteina con la sec. con núm. de ident. 70: que se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823)' y el terminador ADH1 (sec. con núm. de ident.: 73). pRS425 : : GPMp-sadB contiene los sitios Bbvl y Pací en los extremos 5' y 3' de la región codificante sadB, respectivamente. Se agregó un sitio Nhel en el extremo 5' de la región codificante sadB mediante mutagénesis sitio dirigida con el uso de los cebadores OT1074 y OT1075 (sec. con núm. de ident.: 125 y 126) para generar el vector pRS425-GPMp-sadB-NheI, que se verificó por secuenciación. pRS425 : : PGmi-sadB-Nhel se digirió con Nhel y Pací para abandonar la región codificante sadB y se unió con el fragmento Nhel-Pací que contiene la región codificante NADH optimizada por codones del vector pHadhy-DNA2.0 para crear pLH435.

Para combinar los casetes de expresión de KivD y HADH en un solo vector, el vector de levaduras pRS411 (núm. de la ATCC 87474) se digirió con SacI y Notl y se unió con el fragmento Sacl-Sall de pLH467 que contiene el cásete PTDH3~ kivDy-TDH3t junto con el fragmento Sall-Notl de pLH435 que contiene el cásete PGPMI~Hadhy-ADHlt en una reacción de unión triple. Esto produjo el vector pRS 11 : : PTDH3-kivDy-PGPMi-Had y (pLH441) , que se verificó con mapeo de restricción.

Para generar un vector de coexpresión para los tres genes en la ruta del isobutanol inferior: se usó ilvD, kivDy y Hadhy, pRS423 FBA ilvD(Strep) (sec. con núm. de ident . : 127) que se describe en la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos núm. 61/100,792, como la fuente del gen IlvD. Este vector lanzadera contiene un origen de replicación Fl (nt 1423 a 1879) para mantenimiento en E. coli y un origen de 2 micrones (nt 8082 a 9426) para replicación en levadura. El vector tiene un promotor FBAl (nt 2111 al 3108; sec. con núm. de ident.: 119) y el terminador FBA (nt 4861 al 5860; sec. con núm. de ident.: 128). Adicionalmente, incluye el marcador His (nt 504 al 1163) para la selección en levaduras y el marcador de resistencia a la ampicilina (nt 7092 al 7949) para la selección en E. coli. La región codificante ilvD (nt 3116 a 4828; sec. con núm. de ident.: 1154 proteina sec. con núm. de ident.: 115) de UA159 de Streptococcus mutans (núm. de la ATCC 700610) está entre el promotor FBA y el terminador FBA y forma un gen quimérico para expresión. Además, una etiqueta Lumio está fusionada a la región codificante de ilvD (nt 4829-4849)..

La primera etapa fue linealizar pRS423 FBA ilvD(Strep) (también denominado pRS423-FBA (Spel) -IlvD (Streptococcus mutans) -Lumio) con SacI y SacII (con el sitio SacII generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , para dar un vector con una longitud total de 9,482 pb. La segunda etapa fue aislar el cásete kivDy-hADHy de pLH4 1 con SacI y Kpnl (con el sitio Kpnl generado con extremos romos con el uso de la ADN polimerasa de T ) que da un fragmento de 6,063 pb. Este fragmento se unió con el fragmento del vector de 9,482 bp de pRS423-FBA ( Spel ) -IlvD ( Streptococcus mutans) -Lumio. Este vector generado pLH468 (pRS423 : : PFBAI~ ilvD(Strep) Lumio-FBAlt-PTDH3-kivDy-TDH3t-PGPM1-hadhy-ADHlt ) se confirmó por mapas de restricción y secuenciación. pYZ090 y pYZ067 pYZ090 se construyó para contener un gen quimérico que tiene la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (nt en posición 457-2172) que se expresó del promotor CUP1 de levadura (nt 2-449) y seguido por el terminador CYC1 (nt 2181-2430) para la expresión de acetolactato sintasa (ALS) y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656) que se expresó del promotor ILV5 de levadura (2433-3626) y seguido por el terminador ILV5 (nt 4670-5292) para la expresión de la ceto-ácido reductoisomerasa (KARI) . pYZ067 se construyó para contener los siguientes genes quiméricos: 1) la región codificante del gen ilvD de UÁ159 de S. mutans (nt de posición 2260-3971) que se expresó del promotor FBA1 de levadura (nt 1161-2250) seguido por el terminador FBA (nt 4005-4317) para la expresión de DHAD, 2) la región codificante para HADH (nt 4680-5807) que se expresó del promotor GPM de levadura (nt 5819-6575) seguido por el terminador ADH1 (nt 4356-4671) para la expresión de la alcohol deshidrogenasa y 3) la región codificante del gen KivD de Lacrococcus lactis (nt 7175-8821) que se expresó del terminador TDH3 de levadura (nt 8830-9493) seguido por el terminador TDH3 (nt 5682-7161) para la expresión de cetoisovalerato decarboxilasa .

Además, si bien varias modalidades de la presente invención se han descrito anteriormente, se debe comprender que se han presentado en forma de ejemplo únicamente y no de manera limitante. Resultará evidente para los expertos en la técnica relevante que es posible realizar diversos cambios en forma y detalle sin apartase del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la cobertura y alcance de la presente invención no deben limitarse a ninguna de las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino deben definirse únicamente de conformidad con las reivindicaciones y sus equivalentes.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en la presente descripción son indicativos del nivel de experiencia de aquellos con experiencia en la técnica a la cual pertenece la presente invención, y se incorporan en la presente descripción como referencia de la misma forma como cada publicación, patente o solicitud de patente individual se indicó especifica e individualmente para incorporarse como referencia.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente la presente invención, en donde se demuestran los coeficientes de separación de los extractantes de ácidos grasos para butanol. Debe comprenderse que, si bien las conversiones químicas mencionadas anteriormente y los ejemplos a continuación incluyen aceite de maíz como el aceite de origen vegetal para producir extractantes de ácidos grasos, es posible usar otros aceites naturales, tales como aceites de origen vegetal, sin apartarse de la presente invención. A partir de la descripción precedente y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica puede determinar las características esenciales de la presente invención y puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones sin apartarse de la presente invención.

Como se usa en la presente descripción, los significados de las abreviaturas usadas son los siguientes: "g" significa gramo(s), "kg" significa kilogramo (s) , "1" significa litro (s), "mi" significa mililitro (s) , "ml/1" significa mililitro ( s ) por litro, "ml/min" significa mililitro (s) por min, "µ?" significa microlitro (s ) , "DI" significa desionizado, "uM" significa micrómetro ( s ) , "nM" significa nanómetro (s) , "w/v" significa peso/volumen, "GC" significa cromatógrafo de gases, "DO" significa densidad óptica, "DO600" significa densidad óptica en una longitud de onda de 600 nM, "dcw" significa peso seco celular, "rpm" significa revoluciones por minuto, "°C" significa grado (s) Celsius, "°C/min" significa grados Celsius por minuto, "slpm" significa litro (s) estándar por minuto, "ppm" significa parte por millón, "pdc" significa enzima piruvato descarboxilasa seguida por el número de enzima.

Los Ejemplos 1-6 describen los métodos ilustrativos para convertir químicamente aceite de maíz en los siguientes extractantes de ácidos grasos: triglicéridos hidroxilados (Ejemplo 1) , amidas grasas y mezclas con ácidos grasos (Ejemplo 2), alcoholes grasos (Ejemplo 3), ácidos grasos (Ejemplo 4), ésteres metílicos de ácidos grasos (Ejemplo 5) ; y ésteres de glicol de ácidos grasos (Ejemplo 6) . El Ejemplo 7 proporciona una serie de ejemplos comparativos de experimentos de fermentación extractiva que se llevaron a cabo con el uso de los extractantes inmiscibles en agua enumerados en las Tablas 3 y 7-10, para los cuales se resumen los datos de rendimiento en la Tabla 11.

Ejemplo 1 Triqlicéridos hidroxilados de aceite de maíz A. Hidroxilación de aceite de maiz (hidroxilación al 63 %) En un matraz de tres bocas de 500 mi equipado con un agitador mecánico y un embudo de adición se agregó aceite de maiz (50.0 g) , tolueno (25.0 mi), resina Amberlyte IR-120 (12.5 g) y ácido acético glacial (7.5 g) . La mezcla resultante sé calentó hasta 60 °C y, después, el peróxido de hidrógeno (41.8 g de H202 al 30 % en agua) se agregó gota a gota durante una hora. La mezcla se agitó a 60 °C durante dos horas, tiempo durante el cual la mezcla de reacción se separó: la resina se eliminó por filtración y el filtrado se dividió entre acetato de etilo (75 mi) y agua (50 mi) . Después de separar las capas, la capa orgánica se lavó con solución de NaHC03 acuosa saturada (50 mi) y salmuera (50 mi) . La capa orgánica se secó en Na2S04 anhidro y se concentró al vacio para producir 48.9 g de aceite amarillo. El análisis de 1H NMR del producto de reacción crudo mostró que 63 % de los enlaces dobles se epoxidaron.

En un matraz de fondo redondo de 500 mi se agregó aceite de maíz epoxidado (20.0 g) , tetrahidrofurano (THF) (100.0 mi) y ácido sulfúrico (50 mi de solución acuosa 1.7 M) . La mezcla turbia se agitó durante dos horas a 50 °C y, después, se separó al dividir entre agua (100 mi) y acetato de etilo (200 mi) . La capa orgánica se lavó con agua (3x50 mi) y, después, salmuera (50 mi) . La capa orgánica se secó en Na2S04 anhidro y se concentró al vacío para producir 19.9 g de aceite amarillo oscuro (aceite de maíz de hidroxilación al 63 %) .

B. Hidroxilación de aceite de maíz (hidroxilación al 47 %) En un matraz de tres bocas, de 500 mi, equipado con un agitador mecánico y un embudo de adición se agregó aceite de maíz (50.0 g) , tolueno (25.0 mi), resina Amberlyte IR-120 (12.5 g) y ácido acético glacial (7.5 g) . La mezcla resultante se calentó hasta 60 °C y, después, el peróxido de hidrógeno (41.8 g de H202 al 30 % en agua) se agregó gota a gota durante una hora. La mezcla se agitó a 60 °C durante una hora, tiempo durante el cual se separó la mezcla de reacción: la resina se eliminó por filtración y, después, el filtrado se dividió entre acetato de etilo (75 mi) y agua (50 mi) . Después de separar las capas, la capa orgánica se lavó con solución de NaHC03 acuosa saturada (50 mi) y salmuera (50 mi) . La capa orgánica se secó en Na2SC>4 anhidro y se concentró al vacío para producir 49.8 g de aceite amarillo. El análisis de 1H NMR del producto de reacción crudo mostró que 47 % de los enlaces dobles se epoxidaron.

En un matraz de fondo redondo de 500 mi se agregó aceite de maíz epoxidado (20.0 g) , THF (100.0 mi) y ácido sulfúrico (50 mi de solución acuosa 1.7 M). La mezcla turbia se agitó durante dos horas a 50 °C y, después, se separó al dividir entre agua (100 mi) y acetato de etilo (200 mi) . La capa orgánica se lavó con agua (3x50 mi) y, después, salmuera (50 mi) . La capa orgánica se secó en Na2SC>4 anhidro y se concentró al vacío para producir 19.2 g de aceite amarillo oscuro (aceite de maiz de hidroxilacion al 47 %).

C. Hidroxilacion de aceite de maíz (hidroxilacion al 28 %) En un matraz de tres bocas, de 500 mi, equipado con un agitador mecánico y un embudo de adición se agregó aceite de maiz (50.0 g) , tolueno (25.0 mi), resina Amberlyte IR-120 (12.5 g) y ácido acético glacial (7.5 g) . La mezcla resultante se calentó hasta 60 °C y, después, el peróxido de hidrógeno (41.8 g de H202 al 30 % en agua) se agregó gota a gota durante una hora. La mezcla se agitó a 60 °C durante dos horas, tiempo durante el cual la mezcla de reacción se separó: la resina se eliminó por filtración y, después, el filtrado se dividió entre acetato de etilo (75 mi) y agua (50 mi) . Después de separar las capas, la capa orgánica se lavó con solución de NaHC03 acuosa saturada (50 mi) y salmuera (50 mi) . La capa orgánica se secó en Na2S04 anhidro y se concentró al vacío para producir 47.2 g de aceite amarillo. El análisis de XH NMR del producto de reacción crudo mostró que 28 % de los enlaces dobles se epoxidaron.

En un matraz de fondo redondo de 500 mi se agregó aceite de maíz epoxidado (20.0 g) , THF (100.0 mi) y ácido sulfúrico (50 mi de solución acuosa 1.7 M). La mezcla turbia se agitó durante dos horas a 50 °C y, después, se separó al dividir entre agua (100 mi) y acetato de etilo (200 mi) . La capa orgánica se lavó con agua (3x50 mi) y, después, salmuera (50 mi) . La capa orgánica se secó en Na2S04 anhidro y se concentró al vacío para producir 20.3 g de aceite amarillo oscuro (aceite de maíz de hidroxilación al 28 %) .

Medición del coeficiente de separación En un vial de 5 mi se agregó 0.910 g del aceite de maíz hidroxilado al 67 % y 0.910 mi de 3 % en peso de solución acuosa de iBuOH. La mezcla bifásica se agitó vigorosamente con el uso de Vortex Genie® durante 10 minutos. Con el mezclado, la separación de capas se logró al centrifugar la mezcla con el uso de la centrifugadora Fisher Scientific Centrific 228 (3300 rpm) durante 10 minutos. Se tomó 0.100 g de ambas capas. La capa superior orgánica se diluyó hasta 1.00 mi con solución de tolueno de dietiléter de etilenglicol (10.1 mg/ml) , y la capa de agua se diluyó hasta 1.00 mi con solución de metanol de dietiléter de etilenglicol (10.2 mg/ml). Las concentraciones de i-BuOH en ambas fases se determinaron con el uso de un cromatógrafo de gases (GC matraz de fondo redondo) calibrado. El mismo procedimiento se repitió para aceite de maiz hidroxilado al 47 % y 28 %. El coeficiente de separación determinado asi fue de 3.2 para el aceite de maiz hidrolizado al 67 %, 2.3 para el aceite de maiz hidroxilado al 47 % y 2.1 para el aceite de maiz hidroxilado al 28 %.

El procedimiento descrito anteriormente se repitió con solución acuosa de i-BuOH al 6 %. Los coeficientes de separación para aceites de maiz hidroxilados al 67 %, 47 % y 28 % fueron de 2.9, 2.9 y 2.0, respectivamente.

Ejemplo 2 Amidas grasas más ácidos grasos y amidas grasas puras a partir de aceite de maiz El aceite de maiz se hizo reaccionar con hidróxido amónico acuoso de manera similar a la descrita por Roe, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 29:18-22, 1952. Se colocó aceite de maiz Mazóla® (0.818 1, 755 g) en un reactor de acero inoxidable de 1 galón y se agregó 1.71 1 (1540 g) de hidróxido amónico acuoso (28 % como NH3) . El reactor se calentó con agitación hasta 160 °C y se mantuvó a esa temperatura con agitación durante 7 h y durante ese tiempo la presión alcanzó 2.76 kPa (400 psi) . El reactor se enfrió y el producto, un sólido blanco cremoso, se extrajo y el reactor se enjuagó con acetato de etilo. El producto se disolvió en 5 1 de acetato de etilo y se lavó 5 veces, cada vez con 500 mi de agua neutralizada con H2S04. Después, el acetato de etilo se secó sobre a2S04 anhidro y el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio para producir un sólido blando marrón claro .

La NMR 13C en CDC13 indicó que el producto contenia una relación de aproximadamente 2:1 de amida grasa y ácido graso y que la conversión, del aceite de maíz en producto fue cuantitativa. El producto tuvo un punto de fusión de 57-58 °C, pero disminuyó hasta aproximadamente 11 °C cuando se saturó con agua.

La amida grasa de aceite de maíz puro se sintetizó a partir de aceite de maíz de conformidad con Kohlhase, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 48:265-270, 1971 con el uso de amoníaco anhidro con acetato amónico como catalizador.

Se colocó tres gramos de acetato amónico en un tubo agitador de acero inoxidable de 400 mi al que se agregó 51.8 g de aceite de maíz. Después, se agregó amoníaco anhidro (89.7 g) y el reactor se selló y se calentó durante 7 h a 125 °C y durante este tiempo la presión alcanzó 8.96 MPa (1300 psi) . El reactor se enfrió, el sólido de color claro se extrajo y el reactor se lavó con acetato de etilo. Después, el producto disuelto en acetato de etilo se separó como en el caso de la mezcla de amidas grasas/ácidos grasos mencionada anteriormente .

Los ácidos grasos se sintetizaron de aceite de maíz por hidrólisis de base con el uso de NaOH como se describe a continuación en el Ejemplo 4.

Tres preparaciones: (1) la mezcla 2:1 de amida grasa de aceite de maíz y ácido graso de aceite de maíz a partir de amoniaco acuoso, (2) una mezcla 2:1 de amida grasa de aceite de maiz puro: ácido graso de aceite de maiz puro y (3) una mezcla de 1:2 de amida grasa de aceite de maiz puro ¡ácido graso de aceite de maiz puro se analizaron para evaluar su capacidad para extraer isobutanol de una solución al 3 % en agua. Se agregó 700 miligramos de cada una hasta 2.1 mi de agua con isobutanol al 3 % en un vial de escintilación de 20 mi y se colocó en un agitador giratorio durante la noche a 30 °C. En los tres casos, la fase orgánica se volvió liquida a esta temperatura, lo que indica una reducción adicional del punto de fusión con la captación de isobutanol. Se diluyó 50 microlitros de la fase superior ya sea con 200 µ? de tolueno que contiene dietiléter de etilenglicol (10.068 mg/ml) como un estándar de CG o con 200 µ? de isopropanol que contiene la misma concentración de dietiléter de etilenglicol. Se diluyó 50 microlitros de la fase inferior con 150 µ? de metanol y 50 µ? de isopropanol que contiene la misma concentración de dietiléter de et ilenglicol . Las concentraciones de isobutanol en ambas fases se determinaron con el uso de un CG calibrado. Los coeficientes de separación determinados fueron los siguientes: 3.81 para (1), 4.31 para (2) y 3.58 para (3) .

La preparación de amoniaco acuoso de amidas grasas/ácidos grasos (1) y una preparación (la) constituida por la preparación (1) mezclada 1:1 con ácido graso de aceite de maíz puro (equivalente a 1:2 amida grasa:ácido graso) se incubaron en matraces de agitación con caldo de fermentación que contiene el butanologen NGCI-070 de Saccharomyces a una relación de 3 partes de caldo y 1 parte de mezcla de amidas/ácidos. La preparación (1) era un sólido blando, mientras que la preparación (la) era un liquido a 30 °C. Comenzando con una concentración de glucosa de 8.35 g/1, después, los matraces de agitación se incubaron durante 25 h en un incubador agitador y el consumo de glucosa ocurrió en función del tiempo. La Tabla 1 indica que las mezclas de amidas grasas/ácidos grasos en ambas relaciones no fueron tóxicas para el butanologen e, incluso, mostraron velocidades más altas de captación de glucosa en comparación con el alcohol oleilico.

Tabla 1 Ejemplo 3 Alcoholes grasos de aceite de maíz Con referencia a la reacción de la ecuación IV mencionada anteriormente para producir alcoholes grasos de aceite de maíz, un matraz de fondo redondo de 22 1 equipado con un agitador mecánico, condensador de reflujo con fuente de N2, embudo de adición, termopar interno y tabique de goma se secó al fuego en presencia de nitrógeno. En el matraz se colocó 132 g (3.30 moles) de polvo de hidruro de litio y aluminio al 95 % que se pesa en una caja seca y se introduce en un embudo de adición de sólidos. El matraz de 22 1 se enfrió con un baño de hielo y se agregó 9.0 litros de THF anhidro en el reactor por medio de una cánula. La suspensión resultante se enfrió hasta 0-5 °C y una solución de 956 g (1.10 moles) de aceite de maíz esson® en 1.00 litro de THF anhidro se agregó gota a gota durante 2-3 horas, mientras se mantenía la temperatura de la reacción a 5-20 °C. Después de agregar el aceite de maíz, la suspensión se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Cuando la reacción se llevó a cabo, según la cromatografía de TLC, se templó al agregar gota a gota una solución de 130 g de agua disuelta en 370 mi de THF. Después, se agregó 130 g de solución de NaOH acuoso al 15 % y, después, se agregó 400 g de agua. La mezcla se agitó vigorosamente mientras se calentaba hasta temperatura ambiente y se produjo un sólido granular blanco. Los sólidos se filtraron con el uso de un embudo con filtro de vidrio fritado y se lavaron con THF adicional. El THF se extrajo en un evaporador rotatorio y el residuo se tomó en 3.00 litros de acetato de etilo. La solución del producto se lavó con 2x 1.00 1 de agua, 1 x 1.00 1 de salmuera, se secó sobre Na2S04, se filtró y se concentró al vacio para producir 836 g (97 %) de alcoholes grasos como aceite amarillo. Después, la mezcla cruda de alcohol graso se destiló (1.05 °C/Pascal (140 °C/1 mmHg) ) y se usó en los siguientes experimentos de coeficientes de separación.

Experimentos de coeficientes de separación En cada uno de los cinco viales de 5 mi se agregó 1 mi de la mezcla de alcohol graso y 1 mi de solución acuosa de iBuOH al 3 % en peso. La mezcla bifásica se agitó vigorosamente con el uso del Vortex Genie® durante 10, 20, 30, 40 y 60 minutos, respectivamente. Con el mezclado, la separación de capas se logró al centrifugar la mezcla con el uso de la centrifugadora Fisher Scientific Centrific 228 (3300 rpm) durante 10 minutos. Se tomó- 0.100 mi de ambas capas. La capa superior orgánica se diluyó hasta 1.00 mi con solución de tolueno de dietiléter de etilenglicol , y la capa de agua se diluyó hasta 1.00 mi con solución de metanol de dietiléter de etilenglicol. Las concentraciones de i-BuOH en ambas fases se determinaron con el uso de un GC calibrado. El coeficiente de separación determinado de este modo fue de 2.70.

La misma medición del coeficiente de separación, que se describió anteriormente, se llevó a cabo para la concentración de i-BuOH al 6 % en peso. El coeficiente de separación determinado de este modo fue de 3.06.

En los siguientes Ejemplos 4-6, el método usado para determinar los coeficientes de separación de los extractantes era el método en reposo. Para el método en reposo, 5 mi de una solución de isobutanol en agua ya sea al 3 % o al 6 % (w/v) se colocaron en un vial y 5 mi del solvente de interés se agregaron cuidadosamente en la parte superior de la solución acuosa para no mezclar las fases físicas. Después del período de tiempo indicado, se eliminó una muestra de la porción clara de la fase solvente y de la fase acuosa y se analizaron por GC para evaluar el contenido de isobutanol.

Cualquier capa de emulsión se ignoró para este análisis. Para el análisis de GC, 100 ul de la muestra se agregaron a 400 ul de isopropanol. Se agregó 500 ul de una solución de dietilenglicol dietil éter (estándar interno) y la solución se disparó en una columna Carbowax® con un detector FID y se determinó la concentración de isobutanol.

Además, es posible usar otros métodos conocidos en la técnica para determinar los coeficientes de separación de extractantes de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, se puede usar el método de agitación. Como un ejemplo para el método de agitación, 5 mi de solución de isobutanol en agua ya sea al 3 % o al 6 % (w/v) se pueden agregar en un tubo de centrífuga junto con 5 mi del solvente de interés. El tubo se puede agitar vigorosamente durante 1 minuto. Después, el tubo se puede girar en una centrifugadora a aproximadamente 12500G durante 15 minutos. Se puede tomar muestras de la capa solvente clara y de la capa acuosa clara y se puede analizar su contenido de isobutanol mediante el método descrito anteriormente.

Ejemplo 4 Ácidos grasos de aceite de maíz El matraz de fondo redondo (5 1) estaba equipado con un agitador mecánico, un termopar, una manta térmica, un condensador y una te de nitrógeno. Cargado con 500 g de aceite de maíz de grado alimenticio, 1 1 de agua y 75 g de hidróxido sódico. La mezcla se calentó hasta 90 °C y se mantuvo durante tres horas y durante este tiempo se convirtió en una sola fase densa similar a una emulsión. Al finalizar este tiempo, el TLC no muestra aceite de maíz restante en la mezcla. Después, la mezcla se enfrió hasta 72 °C y se agregó 500 mi de ácido sulfúrico al 25 % para acidificar la mezcla. Después, se enfrió hasta temperatura ambiente y se agregó 2 1 de éter dietilico. La capa de éter se lavó 3x1 1 con ácido sulfúrico al 1 %, lxl 1 con salmuera saturada, se secó con MgS04 y se filtró. El éter se eliminó en el evaporador giratorio y, después, el aceite se depuró con nitrógeno durante la noche para producir 470 g de un aceite amarillo que se cristalizó parcialmente durante la noche. La valoración para los ácidos grasos libres por medio del método de AOCS Ca 5a-40 muestra un contenido de ácidos grasos de 95 % expresado como ácido oleico. Una muestra se silanizó al hacer reaccionar 104 mg con 100 ul de N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida en 1 mi de piridina seca. El análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masa (GC S, por sus siglas en inglés) del producto silanizado muestra la presencia de los derivados de T S de ácidos 16:0, 18:2, 18:1, 18:0 y 20:0.

El coeficiente de separación de isobutanol en el. sistema de COFA/agua a una concentración inicial de I-BuOH al 6 % después de 168 horas según el método en reposo es de 2.8.

Ejemplo 5 Ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) de aceite de maíz El matraz de fondo redondo (5 1) estaba equipado con un agitador mecánico, un termopar, una manta térmica, un condensador y una te de nitrógeno. Cargado con 1500 g de aceite de maíz de grado alimenticio, 1500 g de metanol y 30 g de ácido sulfúrico concentrado. La mezcla se refluyó durante 24 horas seguido por cromatografía de capa fina. Después, la reacción se enfrió y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó lxl 1 con agua, lxl 1 con bicarbonato sódico saturado, 2x1 1 con agua, lxl 1 con salmuera saturada y, después, se secó con MgS04. El producto fue 1416 g de un aceite amarillo pálido. El análisis de GCMS muestra la presencia de los ésteres de metilo de los ácidos 16:0, 18:2, 18:1, 18:0, .20:1 y 20:0. La valoración para los ácidos grasos libres por medio del método de- AOCS Ca 5a-40 muestra un contenido de ácidos grasos de 0.2 % expresado como ácido oleico.

El coeficiente de separación de isobutanol en el sistema de FAME/agua a una concentración inicial de I-BuOH al 6 % después de 236 horas según el método en reposo es de 1.06.

Ejemplo 6 Ester de etilenglicol (FAGE) de aceite de maiz El matraz de fondo redondo (3 1) estaba equipado con agitador mecánico, termopar, manta térmica, trampa de Dean-Stark, condensador, purga de nitrógeno y te de nitrógeno; y se cargó con 1000 g de éster metílico de ácidos grasos (FAME) de aceite de maíz y 1000 g de etilenglicol. Se agrega 2 g de sodio limpio a la mezcla y se calienta hasta 60 °C. Después de 90 minutos, la temperatura se incrementó hasta 100 °C y el nitrógeno se roció lentamente debajo de la superficie hacia la reacción. El metanol se recolectó en la trampa de Dean-Stark. La temperatura se aumenta lentamente hasta 160 °C durante 3 horas y el metanol continúa la destilación a partir de la reacción. Después de dos horas, se recolectó un total de 100 mi de metanol. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se neutralizó con 20 g de ácido sulfúrico al 25 %.

Las capas se separaron y la capa superior se lavó con 4x200 mi de solución de cloruro cálcico al 10 %. Hubo formación de emulsiones pero se separaron con el tiempo. La capa orgánica se lavó con 250 mi de salmuera saturada, se secó con MgSC>4 y se filtró para producir 916 g de un aceite amarillo claro. La valoración para los ácidos grasos libres por medio del método de AOCS Ca 5a-40 muestra 2.9 % de ácido presente, expresado como ácido oleico. Una muestra se silanizó al hacer reaccionar 109 mg con 100 ul de N-metil-N-( trimetilsilil) trifluoroacetamida en 1 mi de piridina seca.

El análisis de GCMS del producto silanizado muestra la presencia de los derivados de TMS de los ácidos 16:0, 18:2 y 18:1, junto con los monoésteres de etilenglicol 16:0, 18:2, 18:1 y 18:0.

El coeficiente de separación de isobutanol en el sistema de FAGE/agua a una concentración inicial de I-BuOH al 6 % después de 192 horas según el método en reposo es de 2.3.

Ejemplo 7 Ejemplos comparativos de fermentación Los materiales enumerados en la Tabla 2 se usaron en los ejemplos comparativos del Ejemplo 7. Todos los reactivos comerciales se usaron como se recibieron. Los solventes sintetizados a partir de aceite de maíz también se usaron como se recibieron.

Tabla 2 Matraz de siembra y componentes de los medios de fermentación Base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos, Becton Dickinson and Company (291920) Mezcla de los restos de levadura, Sigma Aldrich (Y2001) L-leucina, Sigma Aldrich (L8000) L-triptófano, Sigma Aldrich (T0254) ~ Etanol >99.5 %, Sigma Aldrich (459844) 50 % w/w de solución de glucosa Ergosterol, Fluka (45480) Tween 80, Sigma Aldrich (P8074) Extracto de levadura, Becton Dickinson and Company (212750) Peptona, Becton Dickinson and Company (211820) Ácido nicotinico, Alfa Aesar (núm. de inventario A12683 o L02659) Hidrocloruro de tiamina, Sigma Aldrich (T4562) Solventes comerciales Alcohol oleílico al 90-95 %, Cognis, lote núm. CE81210020 Ácido oleico, Sigma Aldrich (27728) Isofol™ 12, Sasol North America, lote núm. 65604 Solventes sintetizados (con el uso de los métodos de los Ejemplos 2-4 y 6 descritos anteriormente) Ácidos grasos de aceite de maíz Ester de etilenglicol de aceite de maíz Alcoholes grasos de aceite de maíz, Preparación A Alcoholes grasos de aceite de maíz, Preparación B Amidas grasas/ácidos de aceite de maíz Amidas grasas de aceite de maíz Éster metílico de ácidos grasos de aceite de maíz + 1, 2-propanodiol Soluciones base YEP 10X Se agrega 100 g/1 de extracto de levadura y 200 g/1 de peptona en 500 mi de diH20 templado (60 °C) . Se mantiene el calentamiento mientras la solución llega hasta un volumen final de 1 1, después, se esteriliza con filtro. Ergosterol al 1 % en 50:50 v/v de etanol:tween 80 Se agrega 10 g/1 de ergosterol en una solución templada (50 °C) de 50:50 de etanol : tween, se calienta hasta que el ergosterol se disuelve y se esteriliza con filtro. Ácido nicotínico 100X/hidrocloruro de tiamina Se agrega 10 g/1 de ácido nicotínico y 2 g/1 de tiamina al diH20, después, se esteriliza con filtro.

Cepas NGCI-065 NGCI-070 Métodos generales La densidad óptica se determinó con el uso de un espectrofotómetro Amersham Biosciences Ultrospec 2100 Pro. Las mediciones se llevaron a cabo, típicamente, a una longitud de onda de 600 nanometros.

Las concentraciones de glucosa se determinaron con el analizador bioquímico YSI Life Sciences 2700 Select. Las muestras de fermentación se centrifugaron a 13,200 rpm durante 2 minutos en un tubo de microcentrífuga de 1.7 mi y se analizó la concentración de glucosa del sobrenadante acuoso .

Condiciones de fermentación: p02 al 30 %; Temperatura: 30 °C; pH 5.5 (a menos que se indique de otra forma); glucosa de lote inicial: 20 g/1, que se mantuvo durante la producción .

Tanto el análisis de HPLC como el de GC se usaron para la valoración de isobutanol en la fase acuosa y en la fase solvente, respectivamente. El isobutanol en la fase acuosa se determinó después de la filtración a través de un filtro de nailon de 0.2 um con HPLC (Agilent 1100, Agilent, Santa Clara, CA) bajo las siguientes condiciones: Columna: Bio-Rad, Aminex HPX-87H, núm. 125-0143 Fase móvil: Na2HP04 0.01 , pH=8.0 Volumen de inyección: 10 ul Régimen de flujo: 0.6 ml/min Tiempo del ciclo: 22.5 minutos Temperatura de columna: 65 °C Detectores: índice de refracción Temperatura del detector: 40 °C Detección UV: 210 nm, ancho de banda de 4 nm, Ref 360 nm, ancho de banda de 100 nm.

La fase solvente se determinó con un GC (HP6890, Agilent, Santa Clara, CA) con las siguientes condiciones: Columna: J& Scientific DB Waxter (50 m X 0.32 mm ID, película de 1 u ) Portador de gas: Helio 4 ml/min Volumen de inyección: 2 ul Velocidad de flujo de constitución: 40 ml/min Tiempo del ciclo: 29 minutos Temperatura del horno: 40 °C durante 5 min, de 40 °C hasta 230 °C a 10 °C/min., 5 min 230 °C Separación del inyector: 1:5 a 250 °C Detección de ionización de llama: 250 °C Ejemplos comparativos: GLNOR635A-640A de extractantes derivados de aceite de maíz y sus constituyentes Una serie de ejemplos comparativos se llevaron a cabo con el uso de los extractantes inmiscibles en agua enumerados en la Tabla 3. Los extractantes se agregaron al caldo de agente fermentador en el tiempo cero para exponer el cultivo al solvente durante el transcurso de la fermentación. Se determinó las concentraciones de isobutanol tanto en la fase acuosa como en la fase orgánica para calcular el coeficiente de separación del solvente de extracción. Se usó glucosa para determinar la biocompatabilidad del microorganismo con el extractante .

Tabla 3 Composición de los extractantes usados para los ejemplos de fermentación GLNOR635-6403 Las fermentaciones se llevaron a cabo como se describe con la cepa NGCI-065. El inoculo se preparó en dos etapas y se incubó a 30 °C y 250 rpm en una incubadora con agitación (Innova 4200, New Brunswick Scientific, Edison, NJ) . La primera etapa o etapa pre-siembra se inoculó a partir de una reserva de siembra de glicerol congelada, dos viales se colocaron en un matraz de 250 mi con 30 mi de medio pre-siembra esterilizado con filtro (Tabla 4) y se cultivaron durante 24 horas hasta una DO de aproximadamente 2. Después, se colocó 15 mi de la reserva de pre-siembra en un matraz de 2 1 con 270 mi de medio de siembra esterilizado con filtro (Tabla 5) durante la segunda etapa que se incubó durante 24 horas. Después, se agregó 30 mi de YEP 10X esterilizado con filtro y 300 mi de alcohol oleilico al 90-95 % esterilizado con filtro y se incubaron durante 24 horas más hasta una DO final de aproximadamente 5-10 en la fase acuosa del cultivo de semillas. Para los ejemplos GLNOR639 y GLNOR640, el pH fue de 4.5.

Tabla 4 Composición del medio de pre-siembra/etapa 1 Tabla 5 Composición del medio de siembra/etapa 2 Los recipientes de fermentación (Applikon AD1010 Bioreactor, Applikon Biotechnology, Dover, NJ) se esterilizaron con diH20 durante 30 minutos (Arrisco Renaissance 3033 Revas Steam Sterilizer, Steris Corporation, Mentor, OH) . Una vez terminada la esterilización de los recipientes en el autoclave y después de enfriarlos hasta 30 °C, se eliminó el diH20 estéril y se agregó el medio de fermentación esterilizado con filtro hasta un volumen de 280 mi. Se agregó 70 mi de la fase acuosa de los matraces de siembra de la segunda etapa en el recipiente de fermentación para un volumen acuoso final de 350 mi. Inmediatamente después de la inoculación, se agregó 100 mi de suplementación del medio YEP 10X, asi como 450 mi del solvente de extracción correspondiente para una relación final de solvente y caldo de aproximadamente 1:1. Las condiciones determinadas de fermentación fueron temperatura de 30 °C, p02 30 %, pH de 5.5 para GLNOR635A-638A y pH de 4.5 para GLNOR639A-640A. Se tomó muestras de la fermentación aproximadamente cada 8 horas desde el momento de la inoculación para monitorear la concentración de glucosa, que se mantuvo entre 5 y 20 g/1 por medio de la adición de 50 % w/w de solución de glucosa y se analizó la acumulación de isobutanol tanto en la fase acuosa como en la fase de extractante. Se tomó un volumen suficiente de muestra en cada momento especifico para producir una muestra de ambas fases, después, esas muestras se centrifugaron para garantizar un corte limpio de cada una.

Tabla 6 Composición del medio de fermentación Ejemplos comparativos: GLNOR661A-666A de extractantes derivados de aceite de maiz y sus constituyentes Los Ejemplos comparativos GLNOR661A-666A se llevaron a cabo con el uso de los extractantes inmiscibles en agua enumerados en la Tabla 7. Los ejemplos en este grupo se llevaron a cabo al igual que los ejemplos anteriores GLNOR635A-640A, excepto por la cepa, el pH y la adición de suplementos en el tiempo cero. Se usó la cepa NGCI-070, el pH determinado fue de 5.5 y se agregó 4 mi de suplemento de medio de ácido nicotinico/tiamina en vez de 100 mi de extracto de levadura y peptona para esta serie de ejemplos.

Tabla 7 Composición de los extractantes usados para los ejemplos de fermentación GLNOR661-666a Ejemplos comparativos: GLNOR690A-695A de extractantes derivados de aceite de maiz y sus constituyentes Los Ejemplos comparativos GLNOR690A-695A se llevaron a cabo con el uso de los extractantes inmiscibles en agua enumerados en la Tabla 8. Los ejemplos en este grupo se llevaron a cabo al igual que los Ejemplos GLNOR661A-666A anteriores. Se usó la cepa NGCI-070.

Tabla 8 Composición de los extractantes usados para los Ejemplos de fermentación GLNOR690-695a * Alcoholes grasos sintetizados, Preparación A Ejemplos comparativos GLNOR721A-726A de los extractantes derivados de aceite de maíz y sus constituyentes Los Ejemplos comparativos GLNOR721A-726A se llevaron a cabo con el uso de los extractantes inmiscibles en agua enumerados en la Tabla 9. Los ejemplos en este grupo se llevaron a cabo al igual que los Ejemplos GLNOR690A-695A anteriores. Se usó la cepa NGCI-070.

Tabla 9 Composición de los extractantes usados para los Ejemplos de fermentación GLNOR721-726a * 2:1 Mezcla sintetizada de amidas grasas : ácidos grasos (Preparación (1)) del Ejemplo 2 ** Alcoholes grasos sintetizados, Preparación B Ejemplos compara ivos: GLNOR749A-754A de los extractantes derivados de aceite de maíz y sus constituyentes Los Ejemplos comparativos GLNOR749A-754A se llevaron a cabo con el uso de los extractantes inmiscibles en agua enumerados en la Tabla 10. Los ejemplos en este grupo se llevaron a cabo al igual que los Ejemplos GLNOR721A-726A anteriores. Se usó la cepa NGCI-070.

Tabla 10 Composición de los extractantes usados para los Ejemplos de fermentación GLNOR749-754 * 1:1 Mezcla sintetizada de amidas grasas y ácidos grasos : ácidos grasos puros (Preparación (la)) del Ejemplo 2 *¦* Isofol"1 12: 2-butil-l-octanol Los datos de rendimiento para los Ejemplos de fermentación GLNOR635A-6 0A, GLNOR661A-666A, GLNOR690A-695A, GLNOR721A-726A, GLNOR749A-754A se resumen en la Tabla 11, que proporciona las concentraciones de isobutanol acuoso (g/1) , concentraciones de isobutanol solvente (g/1) y los coeficientes de separación (Kp) del solvente para los extractantes ilustrativos derivados de aceite de maíz y sus constituyentes, en comparación con los solventes comerciales convencionales de alcohol oleilico e Isofol™.

Tabla 11 Ejemplo 8 Hidroxilación de alcohol graso (hidroxilación al 65 %) En un matraz de tres bocas, de 250 mi, equipado con un agitador mecánico y un embudo de adición se agregó una mezcla de alcohol graso (43 g, 0.16 mmol) , tolueno (25.0 mi), resina Amberlyte IR-120 (12.5 g) y ácido acético glacial (7.5 g) . La mezcla resultante se calentó hasta 60 °C y, después, el peróxido de hidrógeno (41.8 g de H202 al 30 % en agua) se agregó gota a gota durante 30 minutos. La mezcla se agitó a 60 °C durante dos horas, tiempo durante el cual la mezcla de reacción se separó: la resina se eliminó por filtración y, después, el filtrado se dividió entre .acetato de etilo (75 mi) y agua (50 mi) . Después de separar las capas, la capa orgánica se lavó con solución de NaHC03 acuosa saturada (50 mi) y salmuera (50 mi) . La capa orgánica se secó en Na2S04 anhidro y se concentró al vacío para producir 50 g de aceite amarillo. El análisis de 1H NMR del producto de reacción crudo mostró que 65 % de los enlaces dobles se epoxidaron. La mezcla resultante se llevó a la siguiente etapa sin purificación.

En un matraz de fondo redondo de 500 mi se agregó alcoholes grasos epoxidados (14.5 g) , THF (200.0 mi) y ácido sulfúrico (100 mi de solución acuosa 1.7M). La mezcla turbia se agitó a 50 °C durante la noche y, después, se separó al dividir entre agua (100 mi) y acetato de etilo (200 mi) . La capa orgánica se lavó con agua (2x100 mi), seguido por solución de NaHC03 acuosa saturada (100 mi) y, después, salmuera (100 mi). La capa orgánica se secó en Na2S04 anhidro y se concentró al vacío para producir 14.7 g de liguido denso claro y mezcla sólida blanca.

Medición del coeficiente de separación A una solución de 1 mi de solución de i-BuOH al 3 % en agua se agregó 1 mi de la mezcla hidroxilada de alcohol graso y la mezcla de dos fases resultante se agitó vigorosamente con el uso de un vórtice durante diez minutos. El experimento se llevó a cabo por duplicado, asi como en la solución de i-BuOH al 6 %. Después del mezclado, las capas se separaron y se tomaron las muestras de ambas capas para determinar la concentración de i-BuOH con el uso del GC (Tabla 12) . Se observó un coeficiente de separación de 3.7.

Tabla 12. Datos de las mediciones del coeficiente de separación para i-BuOH que se divide entre agua y alcoholes grasos hidroxilados Si bien varias modalidades de la presente invención se han descrito anteriormente, se debe comprender que se han presentado en forma de ejemplo únicamente y no de manera limitante. Resultará evidente para los expertos en la técnica relevante que es posible realizar diversos cambios en forma y detalle sin apartase del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la cobertura y alcance de la presente invención no deben limitarse a ninguna de las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino deben definirse únicamente de conformidad con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en la presente descripción son indicativos del nivel de experiencia de aquellos con experiencia en la técnica a la cual pertenece la presente invención, y se incorporan en la presente descripción como referencia de la misma forma como cada publicación, patente o solicitud de patente individual se indicó específica e individualmente para incorporarse como referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición caracterizada porque comprende: un microorganismo recombinante con la capacidad de producir alcohol a partir de una materia prima ; alcohol; y por lo menos un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster graso, triglicéridos y mezclas de estos; en donde el extractante se produce a partir de la materia prima .

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el extractante comprende una o más amidas grasas de la fórmula R (C=0) N (R' ) (R" ) , en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente , interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de Ci-C6 que contienen, opcionalmente, uno o más grupos hidroxilo.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el extractante comprende uno o más ésteres grasos de la fórmula R- (C=0) -OCHR'CHR"-OH, en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C2-7, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de C1-C4.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el extractante comprende uno o más ésteres grasos de la fórmula R-(C=0)-OR', en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' es un grupo alquilo de 8 carbonos o menos.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el extractante es una mezcla de amidas grasas, y en donde además la mezcla de amidas grasas comprende linolamida, oleamida, palmitamida o estearamida .

6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el extractante es una mezcla de amidas grasas y ácidos grasos, y en donde la mezcla de amidas grasas y ácidos grasos comprende linolamida, ácido linoleico, oleamida, ácido oleico, palmitamida, ácido palmitico, estearamida o ácido esteárico.

7. La composición de conformidad con la rei indicación 1, caracterizada porque el extractante se selecciona de triglicéridos hidroxilados , triglicéridos alcoxilados, ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos alcoxilados, alcoholes grasos hidroxilados y alcoholes grasos alcoxilados.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el extractante se selecciona de ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcoholes grasos saturados, alcoholes grasos insaturados, amidas grasas saturadas, amidas grasas insaturadas, ésteres grasos saturados, ésteres grasos insaturados y mezclas de estos.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el alcohol es un alcohol de alquilo de Ci a CQ.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la materia prima comprende centeno, trigo, maíz, caña, cebada, material celulósico, material lignocelulósico o mezclas de estos.

11. Un método para producir un extractante, caracterizado porque comprende: proporcionar una biomasa que comprende aceite; poner el aceite en contacto con una o más sustancias con la capacidad de convertir químicamente el aceite en un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ásteres grasos, triglicéridos y mezclas de estos, con lo cual por lo menos una porción del aceite se convierte en el extractante.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la sustancia o sustancias se seleccionan de hidróxido de amonio acuoso, amoníaco; anhidro, acetato amónico, amoníaco en agua, peróxido de hidrógeno, tolueno, ácido acético glacial, lipasa y resina de intercambio catiónico.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el extractante tiene un coeficiente de separación para un producto alcohólico mayor que el coeficiente de separación del aceite para el producto alcohólico antes de convertir el aceite en extractante.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el producto alcohólico es un alcohol de alquilo de Ci a Ce-

15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende, separar el aceite de la biomasa antes de poner el aceite en contacto con la sustancia o sustancias .

16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la biomasa comprende granos de maiz, mazorcas de maiz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de granos de maiz, rastrojos de maiz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, panizo de pradera, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raices, hojas, astillas de madera, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol o mezclas de estos.

17. Un método para producir un producto alcohólico, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una biomasa que comprende oligosacáridos y aceite; (b) poner la biomasa en contacto con una enzima de sacarificación con la capacidad de convertir oligosacáridos en monosacáridos; (c) separar el aceite de la biomasa de (a) o (b) ; (d) poner el aceite separado en contacto con uno o más reactantes o solventes para formar un extractante; (e) poner la biomasa en contacto con un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante con la capacidad de convertir los monosacáridos en un producto alcohólico para producir un producto alcohólico; y (f) poner el producto alcohólico en contacto con el extractante, en donde además el extractante tiene un coeficiente de separación para el producto alcohólico mayor que el coeficiente de separación del aceite de la biomasa para el producto alcohólico.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el extractante se selecciona de ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster graso, triglicéridos y mezclas de estos.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el extractante comprende una o más amidas grasas de la fórmula R(C=0)N(R') (R"), en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de C1-C6 que contienen, opcionalmente, uno o más grupos hidroxilo.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el extractante comprende uno o más ésteres grasos de la fórmula R- (C=0) -OCHR'CHR"-OH, en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27, opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo de C1-C4. -

21. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el extractante comprende uno o más ésteres grasos de la fórmula R-(C=0)-OR', en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo de C3 a C27r opcionalmente, interrumpidos con uno o más enlaces dobles y R' es un grupo alquilo de 8 carbonos o menos.

22. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el extractante se selecciona de triglicéridos hidroxilados, triglicéridos alcoxilados, ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos alcoxilados, alcoholes grasos hidroxilados y alcoholes grasos alcoxilados.

23. El método de conformidad- con la reivindicación 17, caracterizado porque el extractante se selecciona de ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcoholes grasos saturados, alcoholes grasos insaturados, amidas grasas saturadas, amidas grasas insaturadas, ésteres grasos saturados, ésteres grasos insaturados y mezclas de estos.

24. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el reactante o reactantes o solventes se seleccionan de hidróxido de amonio acuoso, amoniaco anhidro, acetato amónico, amoniaco en agua, peróxido de hidrógeno, tolueno, ácido acético glacial, lipasa y resina de intercambio catiónico.

25. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el producto alcohólico es un alcohol de alquilo de Ci a Ce.

26. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el aceite comprende uno o más aceites seleccionados de aceite de sebo, aceite de maíz, aceite de cañóla, triglicéridos cápricos/caprilicos, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de semilla de algodón, aceite de pescado, aceite de jojoba, manteca de cerdo, aceite de linaza, aceite de pata de buey, aceite de oiticica, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de semilla de colza, aceite de arroz, aceite de cártamo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de tung, aceite de jatropha, aceite de trigo, aceite de centeno, aceite de cebada y combinaciones de aceites vegetales.

27. Un método para producir un producto alcohólico, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante con la capacidad de producir un producto alcohólico en un recipiente de fermentación para producir un producto alcohólico; (b) poner el caldo de fermentación en contacto con un extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica, en donde el producto alcohólico y el aceite se dividen en la fase orgánica de manera que la fase orgánica comprenda el producto alcohólico y el aceite; (c) separar la fase orgánica de la fase acuosa; (d) separar el producto alcohólico de la fase orgánica; y las etapas (b) y (c) ocurren, opcionalmente, simultáneamente .

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el extractante se selecciona de ácido graso, alcohol graso, amida grasa, éster graso, triglicéridos y mezclas de estos.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el extractante se selecciona de triglicéridos hidroxilados , triglicéridos alcoxilados, ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos alcoxilados, alcoholes grasos hidroxilados y alcoholes grasos alcoxilados.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el extractante se selecciona de ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcoholes grasos saturados, alcoholes grasos insaturados, amidas grasas saturadas, amidas grasas insaturadas, ésteres grasos saturados, ésteres grasos insaturados y mezclas de estos.

31. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el producto alcohólico es un alcohol de alquilo de d a C8.

32. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque además comprende: producir una suspensión de materia prima; separar la suspensión de materia prima para producir (i) una capa acuosa, (ii) una capa de aceite y (iii) una capa de sólidos; y suministrar la capa acuosa en el recipiente de fermentación .

33. Método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque además comprende: poner el aceite de la capa de aceite en contacto con una o más sustancias con la capacidad de convertir químicamente el aceite en un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres grasos, triglicéridos y mezclas de estos, con lo cual por lo menos una porción del aceite se convierte en el extractante.

34. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el extractante tiene un coeficiente de separación para el producto alcohólico mayor que el coeficiente de separación del aceite de la capa de aceite para el producto alcohólico.

35. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el producto alcohólico es un alcohol de alquilo de Ci a C3.

36. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el aceite comprende uno o más aceites seleccionados de aceite de sebo, aceite de maiz, aceite de cañóla, triglicéridos cápricos/caprílicos, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de semilla de algodón, aceite de pescado, aceite de jojoba, manteca de cerdo, aceite de linaza, aceite de pata de buey, aceite de oiticica, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de semilla de colza, aceite de arroz, aceite de cártamo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de tung, aceite de jatropha, aceite de trigo, aceite de centeno, aceite de cebada y combinaciones de aceites vegetales.

37. Un método para producir un extractante, caracterizado porque comprende: proporcionar una biomasa que comprende aceite; y convertir por lo menos una porción del aceite en un extractante seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres grasos, triglicéridos y mezclas de estos.

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la conversión del aceite en un extractante comprende una o más de las etapas de incubar el aceite en presencia de tetrahidrofurano e hidruró de litio y aluminio; incubar el aceite con hidróxido sódico; incubar el aceite con ácido sulfúrico y metanol; incubar el aceite con amoniaco anhidro en presencia de acetato amónico; incubar el aceite con amoníaco en agua; poner el aceite en contacto con tolueno, resina de intercambio catiónico, ácido acético glacial, lipasa y peróxido de hidrógeno; incubar el aceite con condiciones de temperatura alta o incubar el aceite con condiciones de presión alta. RESXJMEN DE LA INVENCIÓN En un proceso de fermentación de alcohol el aceite derivado de biomasa se convierte químicamente en un extractante disponible para la sustracción in situ de un producto alcohólico, tal como butanol, de un caldo de fermentación. Los glicéridos en el aceite se pueden convertir químicamente en un producto de reacción, tal como ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de glicol de ácidos grasos y triglicéridos hidroxilados y mezclas de estos, lo que forma un extractante del producto de fermentación que tiene un coeficiente de separación para un producto alcohólico mayor que un coeficiente de separación del aceite de la biomasa para el producto alcohólico. El aceite derivado de una materia prima de un proceso de fermentación de alcohol se puede convertir químicamente en el extractante del producto de fermentación. El aceite se puede separar de la materia prima antes de suministrar la materia prima en un recipiente de fermentación, y el aceite separado se puede convertir químicamente en un extractante del producto de fermentación, que, después, se puede poner en contacto con un producto de fermentación que comprende un producto alcohólico, con lo cual el producto alcohólico se separa del producto de fermentación.