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JP2013531992A - アルコール生産性を向上するための脂肪酸の補充 - Google Patents

アルコール生産性を向上するための脂肪酸の補充 Download PDF

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Abstract

発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸を、生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵培地に加えることができる。脂肪酸の存在下での微生物の増殖速度および発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および発酵性炭素消費より高い。脂肪酸の添加により、グルコース消費を増加させることができ、微生物のバイオマス生成（細胞増殖／密度）および増殖速度を向上し、それによって、生成時間を短縮し、発酵プロセスの生産性を高めることができる。

Description

本出願は、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４５１号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４２９号；２０１０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，５４６号；および２０１１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，０３４号；２０１１年６月１５日に出願された米国特許出願第１３／１６０，７６６号の利益を主張するものであり；これらの内容全体が全て、参照により本明細書に援用される。
本出願に関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子書式で提出され、全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、ブタノールなどの発酵アルコールの生成、特に、組み換え微生物の発酵増殖が、発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸の存在下で行われる、向上したアルコール生産性を達成するためのアルコール発酵プロセスに関する。
アルコールには、飲料（すなわち、エタノール）、燃料、試薬、溶媒、および消毒剤などの、産業および科学における様々な用途がある。例えば、ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における原料化学物質として、ならびに食品および香料産業における食品グレードの抽出剤としての使用を含む様々な用途を有する重要な産業用化学物質であるアルコールである。したがって、ブタノールなどのアルコール、ならびに効率的でかつ環境に優しい生成方法に対する高い需要がある。
微生物による発酵を用いたブタノールなどのアルコールの生成は、１つの環境に優しい生成方法である。酵母などの微生物はアルコール生成物の生成に使用されており、その際、自然に生成されるピルビン酸塩がそれらの生合成経路における出発基質として使用される。ブタノールは、酵母発酵の副生成物として生物学的に生成することができるが、その収率は、通常、非常に低くなり得る。ブタノールなどの所望の生成物の生成を強化するために、酵母は、内因性生合成経路を変化させるかまたは新たな経路を導入する酵素を発現するように、および／または代謝産物の流れを変化させるように内因性酵素の発現を妨げることによって、改変されてきた。細胞のピルビン酸塩を基質として使用する導入される経路には、例えば、ブタノールの異性体を生成するための経路が含まれる。ピルビン酸デカルボキシラーゼの破壊は、ブタノールなどの所望の生成物を生成する経路のためのピルビン酸塩利用性を高めるのに使用されてきた。さらに、１−ブタノール生合成経路（特許文献１）、２−ブタノール生合成経路（特許文献２および３）、およびイソブタノール生合成経路（特許文献４）を発現する組み換え微生物生成宿主が、説明されている。
例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は、２つの主要なピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子における破壊突然変異によって代謝改変（ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒ）され得る。一般的にＰＤＣ１およびＰＤＣ５として言及されるこれらの遺伝子は、エタノール生成に直接関わる酵素を生成し、これらの遺伝子の破壊は、増殖に悪影響を与える。ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のノックアウトにより、より少ない脂肪酸を生成するように生合成経路が変化される。脂肪酸は、細胞壁形成に必要とされるため、細胞増殖に必要である。細胞増殖のための脂肪酸の重要性は、例えば、非特許文献１において実証されており、この文献には、脂肪酸合成の公知の阻害剤である抗生物質セルレニンの、細胞増殖に対する影響が記載されている。セルレニンがＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）培地に加えられて、増殖の阻害を生じたが、特定の飽和脂肪酸（特に、ミリスチン酸、パルミチン酸またはペンタデカン酸）とともにオレイン酸が加えられた場合、増殖が回復された。
酵母におけるグルコース代謝は、一般に、グルコースをピルビン酸塩へ、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡへと転化し、細胞集団へと続く経路をたどる。これに対応して、ピルビン酸塩からアセトアルデヒドへ、アセトアルデヒドからエタノールへの転化またはアセトアルデヒドからアセチル−ＣｏＡへ、アセチル−ＣｏＡから脂肪酸合成への転化があり得る。組み換え微生物に関して、１つのＰＤＣ欠失により、最大増殖が減少されるが、その程度ははるかに低い。１つのみのＰＤＣ遺伝子が破壊される場合、他のＰＤＣ遺伝子が、炭素を、アセトアルデヒドへと、次に、エタノールおよび酢酸塩へと流れさせるのに十分に活性である。しかしながら、ブタノール生成物が所望される場合、エタノール生成は、基質に対するブタノール生成物収率を低下させる。ＰＤＣ遺伝子は、ピルビン酸塩をアセトアルデヒドにするのに関与し、ＰＤＣ１およびＰＤＣ５の二重突然変異が、アセトアルデヒドの生成を防ぎ、脂肪酸生合成への経路を変化させ、それによって、細胞増殖を阻害する。
米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７号明細書 米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書
Ｏｔｏｇｕｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９：５２３−５２９，１９８１
したがって、微生物による脂肪酸生合成の減少または消失にもかかわらず微生物の増殖速度および／またはバイオマス生成が向上され得る、組み換え微生物を用いた発酵アルコール生成のための方法が依然として必要とされている。以下の実施形態の説明によって明らかになるように、本発明は、さらなる関連した利点を提供する。
本発明は、（ａ）発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供する工程であって、組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と；（ｂ）発酵ブロスを発酵性炭素源と接触させ、それによって、組み換え微生物が発酵性炭素源を消費し、生成物アルコールを生成する工程と；（ｃ）発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸と発酵ブロスを接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での組み換え微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法に関する。さらなる実施形態において、工程（ｂ）および（ｃ）はほぼ同時に行われる。一実施形態において、脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択され、別の実施形態において、バイオマスは、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する。さらなる実施形態において、発酵性炭素源はバイオマスに由来する。一実施形態において、生成物アルコールはブタノールであり、別の実施形態において、発酵ブロスは、エタノールをさらに含む。別の実施形態において、組み換え微生物は、１つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子欠失を有する。
本発明は、生成物アルコールを生成するための方法であって：（ａ）発酵性炭素源および油を含むバイオマスを提供する工程と；（ｂ）油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化して、脂肪酸を含むバイオマスを形成する工程と；（ｃ）発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスとバイオマスを接触させる工程であって、組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と；（ｄ）脂肪酸を発酵ブロスと接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での組み換え微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法にも関する。さらなる実施形態において、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程（ｂ）は、油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な１種以上の物質と油を接触させる工程を含む。一実施形態において、１種以上の物質は１種以上の酵素を含み、別の実施形態において、１種以上の酵素はリパーゼ酵素を含む。さらなる実施形態において、工程（ｃ）の前に、油の少なくとも一部が加水分解された後、１種以上の酵素が失活され得る。一実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のうちの１つ以上が発酵槽中で行われ、別の実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のうちの１つ以上がほぼ同時に行われる。一実施形態において、本方法は、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程（ｂ）の前に、バイオマスから油を分離する工程をさらに含む。別の実施形態において、本方法は、バイオマスを液化して、液化バイオマスを生成する工程であって、液化バイオマスがオリゴ糖を含む工程と；オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と液化バイオマスを接触させて、糖化されたバイオマスを形成する工程とをさらに含み、工程（ｃ）は、糖化されたバイオマスを、組み換え微生物を含む発酵ブロスと接触させる工程を含む。一実施形態において、脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択され、別の実施形態において、バイオマスは、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する。一実施形態において、本方法は、発酵性炭素源を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程をさらに含む。一実施形態において、生成物アルコールはブタノールであり、別の実施形態において、発酵ブロスは、エタノールをさらに含む。別の実施形態において、組み換え微生物は、１つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子欠失を有する。
本発明の別の方法は、生成物アルコールを生成するための方法であって：（ａ）原料を提供する工程と；（ｂ）前記原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と；（ｃ）原料スラリーを分離して、（ｉ）発酵性炭素源を含む水層、（ｉｉ）油層、および（ｉｉｉ）固体層を含む生成物を生成する工程と；（ｄ）油層から油を得て、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程と；（ｅ）（ｃ）の水層を、発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを含む発酵槽に供給する工程であって、組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と；（ｆ）水層の発酵性炭素源を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程と；（ｇ）発酵ブロスを脂肪酸と接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での組み換え微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法を含む。さらなる実施形態において、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程（ｄ）は、油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な１種以上の物質と油を接触させる工程を含む。一実施形態において、１種以上の物質は１種以上の酵素を含み、別の実施形態において、１種以上の酵素はリパーゼ酵素を含む。一実施形態において、脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択され、別の実施形態において、バイオマスは、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する。一実施形態において、生成物アルコールはブタノールである。別の実施形態において、組み換え微生物は、１つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子欠失を有する。
本発明は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む組み換え微生物と、脂肪酸とを含む組成物にも関する。
発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸（例えば、オレイン酸、パルミチン酸、およびそれらの混合物）を、生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵培地に加えることができる。微生物は、酵母または他のアルコール生成微生物であり得る。また、微生物は、１つ以上のＰＤＣ遺伝子欠失を有し、および／または減少または消失されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し得る。脂肪酸の添加により、グルコース消費を増加させることができ、微生物のバイオマス生成（細胞増殖）および増殖速度を向上することができる。増殖速度の向上により、生成時間を短縮し、それによって、アルコール発酵プロセスの生産性を高めることができる。
ある実施形態において、発酵プロセスにおいて生成物アルコールを生成するための方法が、（ａ）発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供する工程と；（ｂ）発酵ブロスを発酵性炭素源と接触させ、それによって、微生物が発酵性炭素源を消費し、生成物アルコールを生成する工程と；（ｃ）発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸と発酵ブロスを接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費より高い工程とを含む。
ある実施形態において、脂肪酸は遊離脂肪酸（ＦＦＡ）である。ある実施形態において、脂肪酸はオレイン酸を含む。ある実施形態において、脂肪酸は飽和脂肪酸を含む。ある実施形態において、脂肪酸はパルミチン酸を含む。ある実施形態において、脂肪酸はミリスチン酸を含む。
ある実施形態において、生成物アルコールはブタノールである。
ある実施形態において、発酵性炭素源はバイオマスに由来する。ある実施形態において、バイオマスはトウモロコシを含み、脂肪酸はトウモロコシ油脂肪酸である。
ある実施形態において、発酵ブロスは、エタノールをさらに含む。ある実施形態において、本方法は、発酵ブロスをエタノールと接触させる工程をさらに含む。
ある実施形態において、発酵ブロスを脂肪酸と接触させる工程は、バイオマスに由来するトリグリセリドを、トリグリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な１種以上の酵素と接触させ、それによって、トリグリセリドが遊離脂肪酸へと加水分解される工程と；発酵ブロスを遊離脂肪酸と接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合より高い工程とを含む。ある実施形態において、１種以上の酵素はリパーゼ酵素を含む。
ある実施形態において、組み換え微生物は、１つのピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子欠失を有する。ある実施形態において、組み換え微生物は、２つのＰＤＣ遺伝子欠失を有する。ある実施形態において、組み換え微生物は、減少または消失されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。
ある実施形態において、発酵ブロス中の脂肪酸の濃度は、約０．８ｇ／Ｌ以下である。
ある実施形態において、バイオマスの発酵から生成物アルコールを生成するための方法が、（ａ）水、発酵性炭素源、および所定の量の油を含む水性バイオマス原料流を提供する工程であって、発酵性炭素源および油が両方とも、前記バイオマスに由来する工程と；（ｂ）油の少なくとも一部を遊離脂肪酸へと加水分解して、遊離脂肪酸を含むバイオマス原料流を形成する工程と；（ｃ）発酵培地を、発酵槽中のバイオマス原料流と接触させる工程であって、発酵培地が、生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む工程と；（ｄ）発酵槽中の発酵性炭素源を発酵させて、前記生成物アルコールを生成する工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費より高い工程とを含む。
ある実施形態において、油の少なくとも一部を遊離脂肪酸へと加水分解する工程（ｂ）は、油の一部を遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な１種以上の酵素を含む組成物と油を接触させる工程を含む。ある実施形態において、本方法は、工程（ｃ）の前に、油の少なくとも一部が加水分解された後、１種以上の酵素を失活させる工程をさらに含む。
ある実施形態において、水性バイオマス原料流は、粉砕された、分画されていない穀類から形成される液化されたマッシュである。ある実施形態において、粉砕された、分画されていない穀類はトウモロコシであり、油はトウモロコシ油である。
ある実施形態において、生成物アルコールを生成する方法であって、（ａ）グルコースおよび所定の量のトリグリセリドを含む油を含むバイオマスを提供する工程と；（ｂ）トリグリセリドを遊離脂肪酸へと転化することが可能な１種以上の物質を含む組成物と油を接触させ、それによって、油中のトリグリセリドの少なくとも一部が遊離脂肪酸へと転化される工程と；（ｃ）グルコースを生成物アルコールに転化することが可能な微生物を含む発酵ブロスとバイオマスを接触させ、それによって、生成物アルコールが生成される工程と；（ｄ）遊離脂肪酸を発酵ブロスと接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）グルコース消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および／またはグルコース消費より高い工程とを含む。
ある実施形態において、本方法は、油を１種以上の物質と接触させる工程（ｂ）の前に、バイオマス由来の（ａ）の油を分離する工程をさらに含む。
ある実施形態において、１種以上の物質を含む組成物と油を接触させる工程（ｂ）は、トリグリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な１種以上の触媒と油を接触させる工程を含む。
ある実施形態において、１種以上の物質を含む組成物と油を接触させる工程（ｂ）は、トリグリセリドを化学的に反応させることが可能な１種以上の反応剤または溶媒と油を接触させて、遊離脂肪酸を含む反応生成物を得る工程を含む。
ある実施形態において、ブタノールを生成するための方法が、（ａ）でんぷんおよび油を含むバイオマスを提供する工程であって、油が、所定の量のグリセリドを含む工程と；（ｂ）バイオマスを液化して、液化バイオマスを生成する工程であって、液化バイオマスが、でんぷんから加水分解されるオリゴ糖を含む工程と；（ｃ）工程（ａ）のバイオマスまたは工程（ｂ）の液化バイオマスを、グリセリドを遊離脂肪酸へと転化することが可能な１種以上の酵素を含む組成物と接触させ、それによって、油中のグリセリドの少なくとも一部が、遊離脂肪酸へと転化される工程と；（ｄ）オリゴ糖を、モノマーグルコースを含む発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と液化バイオマスを接触させる工程と；（ｅ）液化バイオマスを、発酵性糖をブタノールに転化することが可能な組み換え微生物と接触させ、それによって、ブタノールが生成される工程と；（ｆ）遊離脂肪酸を組み換え微生物と接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での組み換え微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）グルコース消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および／またはグルコース消費より高い工程とを含む。
ある実施形態において、原料から生成物アルコールを生成する発酵プロセスは、（ａ）前記原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と；（ｂ）原料スラリーを遠心分離して、（ｉ）グルコースを含む水層、（ｉｉ）グリセリドを含む油層、および（ｉｉｉ）固体層を含む遠心分離生成物を生成する工程と；（ｃ）グリセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸へと加水分解する工程と；（ｄ）（ｂ）の水層を、グルコースから生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを含む発酵槽に供給する工程と；（ｅ）水層のグルコースを発酵させて、生成物アルコールを生成する工程と；（ｆ）発酵ブロスを遊離脂肪酸と接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）グルコース消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および／またはグルコース消費より高い工程とを含む。
ある実施形態において、原料から生成物アルコールを生成するための方法は、グリセリドを加水分解する工程の前に、グリセリドを発酵槽に供給する工程をさらに含む。
ある実施形態において、発酵プロセスは、（ａ）発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物、発酵性炭素源、生成物アルコール、およびバイオマスに由来する油を含む発酵ブロスを提供する工程であって、油がグリセリドを含む工程と；（ｂ）発酵ブロスを第１の抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程であって、生成物アルコールおよび油が、有機相中に分離して、生成物アルコール含有有機相を形成する工程と；（ｃ）生成物アルコール含有有機相を水相から分離する工程と；（ｄ）生成物アルコールを有機相から分離して、希薄な（ｌｅａｎ）有機相を生成する工程と；（ｅ）希薄な有機相を、グリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な１種以上の触媒を含む組成物と接触させて、第１の抽出剤の少なくとも一部および遊離脂肪酸を含む第２の抽出剤を生成する工程と；（ｆ）発酵ブロスを、工程（ｅ）の第２の抽出剤と接触させることによって工程（ｂ）を繰り返す工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費より高い工程とを含む。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付の図面は、本発明を例示し、さらに、本明細書とともに、本発明の原理を説明し、関連技術分野の当業者が本発明を行い、使用できるようにする働きを果たす。
液化バイオマスが、脂質加水分解のための１種以上の物質と接触され、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。 液化され、糖化されたバイオマスが、脂質加水分解のために１種以上の物質と接触され、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。 非溶解固体および脂質が、発酵の前に液化バイオマスから除去され、除去された脂質が、１種以上の物質を用いて遊離脂肪酸へと加水分解され、遊離脂肪酸が、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。 天然油に由来する脂質が、１種以上の物質を用いて遊離脂肪酸へと加水分解され、遊離脂肪酸が、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。 発酵槽を出る抽出剤中に存在するバイオマス脂質が、遊離脂肪酸へと転化され、それが、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。 発酵槽中の脂肪酸の存在が、ブタノロジェン（ｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）株ＮＧＣＩ−０４７についてのグルコース消費に与える影響を示すグラフである。 発酵槽中の脂肪酸の存在が、ブタノロジェン株ＮＧＣＩ−０４９についてのグルコース消費に与える影響を示すグラフである。 発酵槽中の脂肪酸の存在が、ブタノロジェン株ＮＹＬＡ８４についてのグルコース消費に与える影響を示すグラフである。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含めて本出願が優先するものとする。また、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および他の参照文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書において提供される。
本明細書において使用される際の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの任意の他の活用形は、記載される整数または整数の群を包含するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを意味することが理解されよう。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないかあるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、相反する明示的な記載がない限り、「または」は、排他的な「または」ではなく包括的な「または」を指す。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のうちの１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在する）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）かつＢが真である（または存在する）、ＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
また、本発明の要素または構成要素の前にある不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、事例の数、すなわち、要素または構成要素の出現の数に関して限定されないことが意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読まれるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数値が単数であることを明白に意味しない限り、複数も含む。
本明細書において使用される際の「発明」または「本発明」の用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の１つの実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される考えられる全ての実施形態を包含する。
本明細書において使用される際の、用いられる本発明の成分または反応剤の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作製するのに使用される典型的な測定および液体処理手順によって；これらの手順における不注意による誤りによって；組成物を作製するかまたは方法を行うのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差などによって起こり得る数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物のための平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、量に対する均等物を含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、あるいは報告される数値の５％以内を意味する。
本明細書において使用される際の「バイオマス」は、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、セルロース系またはリグノセルロース系材料ならびにセルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、オリゴ糖、二糖類および／または単糖類、およびそれらの混合物を含む材料などの天然資源に由来する任意の糖類およびでんぷんを含む発酵性糖を提供する加水分解性多糖類を含有する天然産物を指す。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは、１つの供給源に由来してもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含み得る。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、以下に限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙からの汚泥、庭ごみ、木くずおよび林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、以下に限定はされないが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物が、粉砕、処理、および／または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから形成され得、発酵性糖を含み、水を含み得る。例えば、セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスは、当業者に公知の任意の方法によって発酵性糖を含有する加水分解物を得るように処理され得る。低アンモニア前処理が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に開示されている。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、通常、セルロースおよびヘミセルロースを分解して、グルコース、キシロース、およびアラビノースを含む糖類を含有する加水分解物を生成するために酵素群（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）を利用する。（セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスに適した糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：５０６−５７７，２００２）に概説されている。
マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物は、本明細書に記載される原料１２および原料スラリー１６を含み得る。水性原料流が、粉砕、処理、および／または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから誘導または形成され得、発酵性炭素基質（例えば、糖）を含み、水を含み得る。水性原料流が、本明細書に記載される原料１２および原料スラリー１６を含み得る。
本明細書において使用される際の「バイオマス生成」は、微生物の発酵前の培養中または微生物の発酵増殖中などの微生物のバイオマス生成（すなわち、細胞バイオマス生成または細胞増殖）を指す。
本明細書において使用される際の「原料」は、発酵プロセスにおける原料であって、非溶解固体を含むかまたは含まずに発酵性炭素源を含有し、該当する場合、発酵性炭素源がでんぷんから遊離されたかあるいは液化、糖化、または他のプロセスなどによるさらなる処理によって複合糖類を分解することから得られる前または後に発酵性炭素源を含有する原料を意味する。原料は、バイオマスを含むかまたはバイオマスに由来する。好適な原料としては、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物が挙げられる。
本明細書において使用される際の「発酵ブロス」は、水と、糖類と、溶解固体と、任意にアルコールを生成する微生物と、生成物アルコールと、存在する微生物による、アルコール、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への糖類の反応によって生成物アルコールが作製される発酵槽中に保持される材料の全ての他の成分との混合物を意味する。場合により、本明細書において使用される際の「発酵培地」および「発酵された混合物」という用語は、「発酵ブロス」と同義に使用することができる。
本明細書において使用される際の「発酵性炭素源」または「発酵性炭素基質」は、発酵アルコールを生成するための、本明細書に開示される微生物によって代謝される（または「消費される」）ことが可能な炭素源を意味する。好適な発酵性炭素源としては、以下に限定はされないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類；ラクトースまたはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；キシロースおよびアラビノースなどのＣ５糖類；メタンを含む一炭素基質；およびそれらの混合物が挙げられる。本明細書において使用される際の「消費される」という用語は、化合物、例えば、グルコースなどの有機化合物が、細胞に由来する酵素の作用によって分解されることで、細胞によって使用され得るエネルギーが生成されるプロセスを含む。
本明細書において使用される際の「発酵性糖」は、発酵アルコールを生成するための、本明細書に開示される微生物によって代謝される（または「消費される」）ことが可能な１種以上の糖類を指す。
本明細書において使用される際の「発酵槽」は、発酵反応が行われ、それによって、ブタノールなどの生成物アルコールが糖類から作製される槽を意味する。
本明細書において使用される際の「液化槽」は、液化が行われる槽を意味する。液化は、オリゴ糖が原料から遊離されるプロセスである。原料がトウモロコシである、ある実施形態において、オリゴ糖は、液化中にトウモロコシでんぷん含有物から遊離される。
本明細書において使用される際の「糖化槽」は、糖化（すなわち、オリゴ糖の単糖類への分解）が行われる槽を意味する。発酵および糖化が同時に行われる場合、糖化槽および発酵槽は、同じ槽であってもよい。
本明細書において使用される際の「糖」は、オリゴ糖、二糖類、単糖類、および／またはそれらの混合物を指す。「糖」という用語は、でんぷん、デキストラン、グリコーゲン、セルロース、ペントサン、ならびに糖類を含む炭水化物も含む。
本明細書において使用される際の「糖化酵素」は、多糖類および／またはオリゴ糖、例えば、グリコーゲン、またはでんぷんのα−１，４−グルコシド結合を加水分解することが可能な１種以上の酵素を意味する。糖化酵素は、セルロース系またはリグノセルロース系材料を加水分解することが可能な酵素も含み得る。
本明細書において使用される際の「非溶解固体」は、原料の非発酵性部分、例えば、胚芽、繊維、およびグルテンを意味する。
本明細書において使用される際の「生成物アルコール」は、発酵性炭素基質の供給源としてバイオマスを用いる発酵プロセスにおいて微生物によって生成され得る任意のアルコールを指す。生成物アルコールとしては、以下に限定はされないが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールが挙げられる。ある実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ８のアルキルアルコールである。他の実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ５のアルキルアルコールである。Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられることが理解されよう。同様に、Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられる。「アルコール」はまた、生成物アルコールに関連して本明細書において使用される。
本明細書において使用される際の「ブタノール」は、特に、ブタノール異性体１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、ｔｅｒｔ−ブタノール、および／またはイソブタノール（ｉＢｕＯＨまたはｉ−ＢｕＯＨまたはＩ−ＢＵＯＨ、２−メチル−１−プロパノールとしても知られている）を、個々にまたはそれらの混合物として指す。場合により、ブタノールのエステルに言及される場合、「ブチルエステル」および「ブタノールエステル」という用語は、同義に使用することができる。
本明細書において使用される際の「プロパノール」は、プロパノール異性体イソプロパノールまたは１−プロパノールを指す。
本明細書において使用される際の「ペンタノール」は、ペンタノール異性体１−ペンタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、３−ペンタノール、２−ペンタノール、３−メチル−２−ブタノール、または２−メチル−２−ブタノールを指す。
本明細書において使用される際の「アルコール当量」という用語は、アルコールエステルの完全な加水分解および所定の量のアルコールエステルからのアルコールのその後の回収によって得られるであろうアルコールの重量を指す。
本明細書において使用される際の「水相力価」という用語は、発酵ブロス中の特定のアルコール（例えば、ブタノール）の濃度を指す。
本明細書において使用される際の「有効力価」という用語は、発酵によって生成される特定のアルコール（例えば、ブタノール）または発酵培地のリットル当たりの、アルコールエステル化によって生成されるアルコールエステルのアルコール当量の総量を指す。例えば、発酵の単位体積におけるブタノールの有効力価は：（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるブタノールの量；（ｉｉｉ）ガスストリッピングが使用される場合、気相から回収されるブタノールの量；および（ｉｖ）有機相または水相中のブチルエステルのアルコール当量を含む。
本明細書において使用される際の「原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）」は、生成物が生成される際に、生物学的プロセスにおける生成物濃度を制御するために、発酵などの生物学的プロセスから特定の発酵生成物を選択的に除去することを意味する。
本明細書において使用される際の「抽出剤」または「ＩＳＰＲ抽出剤」は、ブタノールなどの任意の生成物アルコールを抽出するのに使用され、または生成物アルコールおよびカルボン酸または脂質から触媒によって生成される任意の生成物アルコールエステルを抽出するのに使用される有機溶媒を意味する。場合により、本明細書において使用される際の「溶媒」という用語は、「抽出剤」と同義に使用することができる。本明細書に記載される方法では、抽出剤は水不混和性である。
「水不混和性」または「不溶性」という用語は、１つの液相を形成するように、発酵ブロスなどの水溶液と混合することができない抽出剤または溶媒などの化学成分を指す。
本明細書において使用される際の「水相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の水相を指す。発酵抽出を含む本明細書に記載されるプロセスの一実施形態において、「発酵ブロス」という用語は、この場合、二相性発酵抽出における水相を特に指す。
本明細書において使用される際の「有機相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の非水相を指す。
本明細書において使用される際の「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２８の炭素原子（最も一般的にはＣ１２〜Ｃ２４の炭素原子）を有するカルボン酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸）を指す。脂肪酸はまた、分枝鎖状または非分枝鎖状であってもよい。脂肪酸は、動物性または植物性脂肪、油、またはワックスに由来するか、あるいはそれらの中にエステル化された形態で含まれ得る。脂肪酸は、脂肪および脂肪油中のグリセリドの形態で天然に存在するものであってもよく、または脂肪の加水分解によってまたは合成によって得られる。脂肪酸という用語は、単一の化学種または脂肪酸の混合物を表し得る。さらに、脂肪酸という用語は、遊離脂肪酸も包含する。
本明細書において使用される際の「脂肪アルコール」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族鎖を有するアルコールを指す。
本明細書において使用される際の「脂肪アルデヒド」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族鎖を有するアルデヒドを指す。
本明細書において使用される際の「カルボン酸」という用語は、一般化学式−ＣＯＯＨ（式中、炭素原子が、カルボニル基（−Ｃ＝Ｏ）を構成するために二重結合によって酸素原子に結合され、単結合によってヒドロキシル基（−ＯＨ）に結合される）で表される任意の有機化合物を指す。カルボン酸は、プロトン化したカルボン酸の形態、カルボン酸の塩の形態（例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩）、またはプロトン化したカルボン酸とカルボン酸の塩との混合物としての形態であってもよい。カルボン酸という用語は、単一の化学種（例えば、オレイン酸）または例えば、バイオマス由来の脂肪酸エステルまたはトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質の加水分解によって生成され得るカルボン酸の混合物を表し得る。
本明細書において使用される際の「天然油」は、植物（例えば、バイオマス）または動物から得られる脂質を指す。本明細書において使用される際の「植物由来油」は、特に植物から得られる脂質を指す。場合により、「脂質」は、「油」および「アシルグリセリド」と同義に使用することができる。天然油としては、以下に限定はされないが、獣脂、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、および植物油ブレンドが挙げられる。
本明細書において使用される際の「分離」という用語は、「回収」と同義であり、初期混合物から化学化合物を除去して、初期混合物中の化合物の純度または濃度より高い純度またはより高い濃度の化合物を得ることを指す。
本明細書において使用される際の「組み換え微生物」は、例えば、ブタノールなどのアルコールを生成するための生合成経路などの生合成経路を含むように宿主細胞を改変することによる、組み換えＤＮＡ技術の使用によって改変される、細菌または酵母などの微生物を指す。
本発明は、発酵槽中のアルコール生成微生物が、発酵プロセス中の工程で、バイオマス脂質などの天然油から誘導された脂肪酸と接触される、生成物アルコール（例えば、発酵アルコール）を生成するための方法を提供する。微生物の発酵増殖中のこの脂肪酸の補充により、特に、減少または消失されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する組み換え微生物に関して、微生物の発酵性炭素消費、増殖速度、およびバイオマス生成を増加させることができる。
ある実施形態において、油中のグリセリドが、脂肪酸へと化学的に転化され得、それが、発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスと接触される。他の実施形態において、油中のグリセリドは、触媒により（例えば、酵素により）脂肪酸へと加水分解され得、それが、組み換え微生物を含む発酵ブロスと接触される。ある実施形態において、脂肪酸は、発酵のための発酵性炭素源を供給するバイオマス中に見られる脂質の加水分解から得ることができる。脂肪酸をＩＳＰＲ抽出剤として用いて、生成物アルコールを発酵ブロスから除去することもできる。
脂肪酸は、飽和、単不飽和、多価不飽和、およびそれらの混合物であり得る。例えば、パルミチン酸とオレイン酸との混合物を含む天然の脂肪酸組成物を有する油（例えば、トウモロコシ油）が加水分解されて、遊離オレイン酸と遊離パルミチン酸との混合物が生成され得、それが、発酵槽中の発酵ブロスと接触され得る。ある実施形態において、発酵槽中のカルボン酸（脂肪酸など）の濃度は、水相中の溶解限度を超え、有機相および水相を含む二相発酵混合物が生成される。ある実施形態において、発酵ブロス中のカルボン酸の濃度は、通常、約０．８ｇ／Ｌ以下であり、ブロス中のカルボン酸の溶解性によって制限される。
脂肪酸の存在下での微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費は、脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および発酵性炭素消費より高い。これに対応して、本発明の方法に係る脂肪酸の補充により、このような脂肪酸の補充がない場合に得られるであろうものより、増加した細胞濃度および増加したアルコール生成が得られる。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生成微生物または生存し、成長するために２−炭素基質、例えば、エタノールの補充を通常必要とする他の微生物であり得る。このような実施形態において、本発明の方法に係る脂肪酸の補充により、このような２−炭素に依存する微生物が、エタノールの補充がない場合に生存し、成長することが可能になり得る。ある実施形態において、微生物は、ピルビン酸塩からのアセチル−ＣｏＡの生成がないことがある。ある実施形態において、微生物は、１つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子における破壊突然変異によって、脂肪酸生合成への経路が改変されるように代謝改変される。ある実施形態において、微生物は、遺伝子ＰＤＣ１およびＰＤＣ５などの２つのＰＤＣ遺伝子における破壊突然変異によって、代謝改変され、脂肪酸生合成への経路が変化される。したがって、本発明の方法は、組み換え微生物の発酵増殖に最適な環境を与えることによって、向上したアルコール生産性を達成することができる。
本発明は、図を参照して説明される。図１は、本発明の一実施形態に係る発酵アルコールの生成のための例示的なプロセス流れ図を示す。図示されるように、原料１２は、液化槽１０の入口に導入され、液化されて、原料スラリー１６が生成され得る。原料１２は、発酵性炭素源（例えば、グルコースなどの発酵性糖）を供給する加水分解性でんぷんを含有し、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物などのバイオマスであり得、あるいはバイオマスに由来し得る。ある実施形態において、原料１２は、分画されたバイオマスの１つ以上の成分であり得、他の実施形態において、原料１２は、粉砕された、分画されていないバイオマスであり得る。ある実施形態において、原料１２は、乾式粉砕された、分画されていないトウモロコシの実などのトウモロコシであり得、非溶解固体は、胚芽、繊維、およびグルテンを含み得る。非溶解固体は、原料１２の非発酵性部分である。図に示される実施形態を参照した本明細書における説明のために、原料１２は、非溶解固体が分離されていない、粉砕された、分画されていないトウモロコシであるものとして説明されることが多い。しかしながら、当業者に明らかなように、本明細書に記載される例示的な方法およびシステムは、分画されるか否かにかかわらず様々な原料向けに変更することができることを理解されたい。ある実施形態において、原料１２は、高オレイン酸トウモロコシであり得るため、それに由来するトウモロコシ油は、少なくとも約５５重量％のオレイン酸のオレイン酸含量を有する高オレイン酸トウモロコシ油である。ある実施形態において、約２４重量％である通常のトウモロコシ油中のオレイン酸含量と比較して、高オレイン酸トウモロコシ油中のオレイン酸含量は、最大で約６５重量％であり得る。油の加水分解により、発酵ブロスと接触させるための高いオレイン酸含量を有する遊離脂肪酸が得られるため、高オレイン酸油は、本発明の方法に使用するのにいくつかの利点を提供し得る。ある実施形態において、脂肪酸またはその混合物は、不飽和脂肪酸を含む。不飽和脂肪酸の存在は、融点を低下させ、取り扱いの際の利点を提供する。不飽和脂肪酸のうち、単不飽和であるもの、すなわち、１つの炭素−炭素二重結合を有するものが、プロセス検討の際に好適な熱安定性および酸化安定性を犠牲にせずに融点に関する利点を提供し得る。
原料１２を液化するプロセスは、原料１２中の多糖を、例えば、デキストリンおよびオリゴ糖を含む糖類へと加水分解することを含み、従来のプロセスである。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の液化プロセス、ならびに対応する液化槽が使用され得る。このようなプロセスは、単独でまたは組み合わせて使用され得る。ある実施形態において、酵素プロセスを用いることができ、適切な酵素１４、例えば、α−アミラーゼが、液化槽１０の入口に導入される。水も液化槽１０に導入することができる。ある実施形態において、糖化酵素、例えば、グルコアミラーゼも、液化槽１０に導入され得る。さらなる実施形態において、油の１つ以上の成分の、遊離脂肪酸への転化を触媒するために、リパーゼも液化槽１０に導入され得る。
原料１２を液化することから生成される原料スラリー１６は、原料１２を形成するバイオマスに由来する、糖、油２６、および非溶解固体を含む。ある実施形態において、油は、発酵ブロスの組成の約０重量％〜少なくとも約２重量％の量である。ある実施形態において、油は、原料の少なくとも約０．５重量％の量である。原料スラリー１６は、液化槽１０の出口から排出され得る。ある実施形態において、原料１２は、トウモロコシまたはトウモロコシの実であるため、原料スラリー１６はトウモロコシマッシュスラリーである。
１種以上の物質４２が、原料スラリー１６に加えられ得る。物質４２は、油２６中のグリセリドを遊離脂肪酸（ＦＦＡ）２８に加水分解することができる。例えば、原料１２がトウモロコシである場合、油２６は、原料の成分であるトウモロコシ油であり、遊離脂肪酸２８はトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）である。したがって、物質４２を原料スラリー１６に接種した後、油２６中のグリセリドの少なくとも一部が、ＦＦＡ２８に加水分解され、ＦＦＡ２８を有する原料スラリー１８が得られる。
ある実施形態において、１種以上の物質４２は、油２６中のグリセリドを遊離脂肪酸２８（ＦＦＡ）に触媒により加水分解することが可能な１種以上の触媒４２である。したがって、触媒４２を原料スラリー１６に導入した後、油２６中のグリセリドの少なくとも一部が、ＦＦＡ２８に加水分解され、ＦＦＡ２８および触媒４２を有する原料スラリー１８が得られる。
加水分解油２６から得られた酸／油組成物は、通常、少なくとも約１７重量％のＦＦＡである。ある実施形態において、加水分解油２６から得られた酸／油組成物は、少なくとも約２０重量％のＦＦＡ、少なくとも約２５重量％のＦＦＡ、少なくとも約３０重量％のＦＦＡ、少なくとも約３５重量％のＦＦＡ、少なくとも約４０重量％のＦＦＡ、少なくとも約４５重量％のＦＦＡ、少なくとも約５０重量％のＦＦＡ、少なくとも約５５重量％のＦＦＡ、少なくとも約６０重量％のＦＦＡ、少なくとも約６５重量％のＦＦＡ、少なくとも約７０重量％のＦＦＡ、少なくとも約７５重量％のＦＦＡ、少なくとも約８０重量％のＦＦＡ、少なくとも約８５重量％のＦＦＡ、少なくとも約９０重量％のＦＦＡ、少なくとも約９５重量％のＦＦＡ、または少なくとも約９９重量％のＦＦＡである。
あるいは、ある実施形態において、物質４２は、代わりに、組み換え微生物３２と接触させるためのＦＦＡ２８に油２６を化学的に反応させることが可能な１種以上の反応剤または溶媒を構成し得る。２０１０年７月２８日に出願され、全体が参照により本明細書に援用される、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号明細書にさらに記載されるように、例えば、トウモロコシ油脂肪酸が、ＮａＯＨおよび水を物質４２として用いた塩基加水分解によって油２６としてのトウモロコシ油から合成され得る。また、全体が参照により本明細書に援用されるＲｏｅ，ｅｔ ａｌ．，（Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２９：１８−２２，１９５２）にさらに記載されるように、例えば、油２６としてのトウモロコシ油トリグリセリドが、反応剤４２としての水酸化アンモニウム水溶液と反応されて、脂肪酸（および脂肪アミド）が得られる。図に示される実施形態を参照した本明細書における説明のために、物質４２が、組み換え微生物３２の発酵増殖中に補充されるＦＦＡ２８にバイオマス脂質を加水分解するための物質４２としての１種以上の触媒を構成するものとして記載されることが多い。しかしながら、本明細書に記載される例示的な方法およびシステムは、物質４２が、バイオマス脂質をＦＦＡ２８へと化学的に転化することが可能な反応剤および／または溶媒であるように変更され得ることを理解されたい。
ある実施形態において、触媒４２は、１種以上の酵素、例えば、リパーゼ酵素などの加水分解酵素であり得る。使用されるリパーゼ酵素は、例えば、アブシディア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビューベリア属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、ブロコトリックス属（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロモバクター属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ハイホジーマ属（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イノシシ属（Ｓｕｓ）、スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、チアロスポレラ（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、および／またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の菌株を含む任意の供給原に由来し得る。好ましい態様において、リパーゼの供給源は、アブシディア・ブラケスレーナ（Ａｂｓｉｄｉａ ｂｌａｋｅｓｌｅｅｎａ）、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アクロモバクター・イオファガス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｉｏｐｈａｇｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アルタナリア・ブラシキコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｏｌａ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブロコトリクス・サーモソハタ（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｏｈａｔａ）、カンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）（カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ））、カンジダ・パラリポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、カンジダ・エルノビ（Ｃａｎｄｉｄａ ｅｒｎｏｂｉｉ）、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）、クロモバクター・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、ネナガヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｉｕｓ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ）、フザリウム・ロゼウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ゲオトリクム・ペニシラツム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｍ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）、フミコーラ・ブレビスポラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｂｒｅｖｉｓｐｏｒａ）、フミコーラ・ブレビス変種サーモイデア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｂｒｅｖｉｓ ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ラクトバチルス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・シクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）、ペニシリウム・クラストサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、ペニシリウム・エクスパンザム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）Ｉ、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＩＩ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）（バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）と同義）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ）、 シュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、シュードモナス・メフィティカ・リポリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｐｈｉｔｉｃａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プランタリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、およびシュードモナス・ウィスコンシネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾプス・ジャポニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス・ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ノドスス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｏｄｏｓｕｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロマイセス・シバタヌス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、サーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（以前はフミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））、チアロスポレラ・ファセオリナ（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。さらなる好ましい態様において、リパーゼは、サーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｃｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）リパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）リパーゼ、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）リパーゼ、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）リパーゼ、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）リパーゼ、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）リパーゼ、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）リパーゼ、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）リパーゼ、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）に由来するリパーゼＡおよびＢ、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）リパーゼ、ネクトリア・ハエマトコカ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）リパーゼ、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）リパーゼ、リゾプス・デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ、およびリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）リパーゼからなる群から選択される。酵素触媒４２として適した好適な市販のリパーゼ調製物としては、以下に限定はされないが、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能な、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００ Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）２０００Ｔ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＡ Ｌ、およびＰａｌａｔａｓｅ ２００００Ｌ、あるいはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから入手可能な、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ブタ膵臓、カンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来するリパーゼが挙げられる。
グリセリドの少なくとも一部が加水分解された後、ある実施形態において、触媒４２が、失活され得る。当該技術分野において公知の任意の方法を用いて、触媒４２を失活させることができる。例えば、ある実施形態において、触媒４２は、加熱によって、および／または反応塊（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍａｓｓ）のｐＨを、触媒４２が不可逆的に失活されるｐＨに調整することによって、および／または触媒活性を選択的に失活させることが可能な化学種または生化学種を加えることによって、失活され得る。図示されるように、例えば、図１の実施形態において、熱ｑが、原料スラリー１８に加えられ、それによって、触媒４２は失活する。熱ｑの適用は、原料スラリー１８が発酵槽３０に供給される前に、原料スラリー１８に加えられ得る。次に、熱処理された原料スラリー１８が（不活性な触媒４２とともに）、発酵槽３０中に保持される発酵ブロスに含まれるべき微生物３２とともに発酵槽３０に導入される。あるいは、原料スラリー１８は、微生物３２の発酵槽接種の前に、発酵槽３０に供給され、発酵槽中で熱ｑを加えられ得る。例えば、ある実施形態において、熱ｑを用いて、原料スラリー１８を、少なくとも約５分間にわたって少なくとも約７５℃、少なくとも約１０分間にわたって少なくとも約７５℃、少なくとも約１５分間にわたって少なくとも約７５℃、少なくとも約５分間にわたって少なくとも約８０℃、少なくとも約１０分間にわたって少なくとも約８０℃、少なくとも約１５分間にわたって少なくとも約８０℃、少なくとも約５分間にわたって少なくとも約８５℃、少なくとも約１０分間にわたって少なくとも約８５℃、または少なくとも約１５分間にわたって少なくとも約８５℃の温度まで加熱することによって、触媒失活処理を行うことができる。ある実施形態において、熱ｑを加えられた後、発酵槽３０に導入する前（または熱ｑの適用が発酵槽に行われる場合、発酵槽接種の前）に、原料スラリー１８が、発酵に適切な温度に冷却される。例えば、ある実施形態において、原料スラリー１８の温度は、発酵ブロスと接触させる前に約３０℃である。
触媒４２が、発酵槽中の脂肪酸２８とともにアルコールをエステル化するのを防ぐことが望ましい場合、触媒４２の失活が好ましい。全て全体が参照により本明細書に援用される、２０１０年７月２８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４２９号明細書；２０１０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，５４６号明細書；および、２０１１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，０３４号明細書にさらに説明されるように、ある実施形態において、有機酸（例えば、脂肪酸）および触媒（例えば、リパーゼ）を用いた発酵培地中の生成物アルコールのエステル化によるアルコールエステルの生成が望ましい。例えば、ブタノール生成では、（スラリー１８を介して導入される）発酵槽中の活性な触媒４２が、（スラリー１８を介して導入される）脂肪酸２８とともにブタノールのエステル化を触媒して、脂肪酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）を原位置で形成することができる。脂肪酸のアルコールエステルが望ましいこのような実施形態において、本明細書に記載される方法は、生成物アルコールを含む発酵ブロスを接触させる前の触媒４２の失活を除外するように変更され得る。したがって、図１〜５の例示的なプロセス流れ図を参照して、これらの代替的な実施形態が、触媒４２が発酵槽３０中の脂肪酸２８とともに生成物アルコールをエステル化するように、触媒４２を含有するプロセス流への熱ｑの適用を除外することによって達成され得る。さらに、ある実施形態において、図１〜５の例示的なプロセス流れ図は、触媒４２の代わりに１種以上の反応剤または溶媒を物質４２として用いた、ＦＦＡ２８への油２６の化学的転化が必要でない場合、熱ｑを除外するように変更され得る。
発酵槽３０は、スラリー１８を発酵させて、ブタノールなどの生成物アルコールを生成するように構成される。特に、微生物３２が、スラリー１８中の発酵性糖を代謝し、生成物アルコールを排出する。微生物３２は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される。ある実施形態において、微生物３２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌であり得る。ある実施形態において、微生物３２は、発酵性組み換え微生物であり得る。スラリーは、例えば、オリゴ糖の形態の糖、および水を含んでいてもよく、約２０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満または約５ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコースを含み得る。モノマーグルコースの量を決定するための好適な方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において公知のこのような好適な方法は、ＨＰＬＣを含む。
ある実施形態において、スラリー１８中の複合糖類（例えば、オリゴ糖）を、微生物３２によって容易に代謝され得る単糖類へと分解するために、スラリー１８が、糖化プロセスに供される。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。ある実施形態において、同時糖化発酵（ＳＳＦ）は、図１に示されるように、発酵槽３０の内部で行われ得る。ある実施形態において、でんぷんまたはオリゴ糖を、微生物３２によって代謝可能なグルコースに分解するために、グルコアミラーゼなどの酵素３８が、発酵槽３０の入口に導入され得る。
任意に、エタノール３３が、発酵ブロスに含まれるべく、発酵槽３０に供給され得る。ある実施形態において、ブタノール生合成経路を有する組み換え微生物が、ブタノール生成のための微生物３２として使用される場合、微生物３２は、生存し、成長するために２−炭素基質（例えば、エタノール）の補充を必要とし得る。したがって、ある実施形態において、エタノール３３が、発酵槽３０に供給され得る。
しかしながら、遊離脂肪酸（例えば、ＦＦＡ２８）が発酵槽中に存在する本発明の方法が、組み換え微生物の生命力を損なうことなく、所与の組み換え微生物に通常供給されるエタノール３３の量を減少させることができることが意外にも分かった。さらに、ある実施形態において、本発明の方法により、エタノールを補充しないアルコール（例えば、ブタノール）生成速度を、エタノール３３が補充される場合に実現され得る生成速度と同等にすることができる。以下の実施例１〜１４に示される比較例によってさらに示されるように、発酵槽中に脂肪酸はあるもののエタノールがない場合のブタノール生成速度は、発酵槽中に脂肪酸もエタノールもない場合のブタノール生成速度より高くなり得る。したがって、ある実施形態において、エタノール３３の補充の量が、従来のプロセスと比較して減少される。例えば、２−炭素基質の補充を必要とする微生物のために発酵槽に加えられるエタノールの通常の量は、約５ｇ／Ｌの無水エタノール（すなわち、発酵培地のリットル当たり５ｇの無水エタノール）である。ある実施形態において、発酵にエタノール３３が一切補充されない。後者の場合、エタノール３３の流れ全体が、発酵槽から除外される。したがって、本発明のある実施形態において、補充するエタノール３３に付随するコスト、ならびに大量のエタノール３３の貯蔵およびブタノール発酵中の発酵槽へのエタノールの供給に付随する不都合を低減するかまたはなくすことが可能である。さらに、エタノールの補充に関係なく、ある実施形態において、本発明の方法は、発酵中の脂肪酸の存在のために、微生物３２によるより高いグルコース取り込み率を提供することができる。本明細書に記載される方法にしたがって、脂肪酸は、ＦＦＡ２８として発酵槽３０に導入され、スラリー１６の原料油２６から加水分解され、あるいは発酵プロセス中の工程においてバイオマス脂質などの天然油から加水分解され得る。脂肪酸を、ＩＳＰＲ抽出剤２９として発酵槽に導入することもできる。
発酵槽３０中、アルコールが、微生物３２によって生成される。原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を用いて、生成物アルコールを発酵ブロスから除去することができる。ある実施形態において、ＩＳＰＲは液液抽出を含む。液液抽出は、開示内容の全体が、本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載される方法にしたがって行われ得る。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書には、液液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを生成し、回収するための方法が記載され、この方法は、発酵ブロスを水不混和性抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程を含む。通常、抽出剤は、飽和、単不飽和、多価不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得、これは、発酵ブロスと接触し、水相および有機相を含む二相混合物を形成する。抽出剤はまた、飽和、単不飽和、多価不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸のエステル、Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得、これは、発酵ブロスと接触し、水相および有機相を含む二相混合物を形成する。スラリー１８からの遊離脂肪酸２８は、ＩＳＰＲ抽出剤２８としても働き得る。例えば、遊離脂肪酸２８がトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）である場合、ＩＳＰＲ抽出剤２８はＣＯＦＡである。ＩＳＰＲ抽出剤（ＦＦＡ）２８は、発酵ブロスと接触し、水相３４および有機相を含む二相混合物を形成する。発酵ブロス中に存在する生成物アルコールは、優先的に有機相中に分離して、アルコール含有有機相３６が形成される。ある実施形態において、発酵槽３０は、生成物アルコールが有機相中に分離している状態で、水相および有機相を含む二相混合物を形成する１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９を受け入れるための１つ以上の入口を有する。
二相混合物は、流れ３９として発酵槽３０から除去され、槽３５に導入され得、その中で、アルコール含有有機相３６は、水相３４から分離される。アルコール含有有機相３６は、以下に限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、吸入、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離などを含む当該技術分野において公知の方法を用いて、二相流３９の水相３４から分離される。水相３４の全てまたは一部が、発酵培地（図示される）として発酵槽３０中に再利用されるか、あるいは廃棄され、新しい培地と交換されるか、または残っている生成物アルコールを除去するために処理され、次に発酵槽３０へと再利用され得る。次に、アルコール含有有機相３６は、生成物アルコール５４を回収するように分離器５０中で処理され、次に、得られたアルコール希薄抽出剤２７が、生成物アルコールのさらなる抽出のために、スラリー１８からの新鮮なＦＦＡ２８および／または新鮮な抽出剤２９と通常組み合わされて、発酵槽３０中に戻されて再利用され得る。あるいは、（スラリー１８からの）新鮮なＦＦＡ２８および／または抽出剤２９は、二相混合物流３９中で除去されたＩＳＰＲ抽出剤の代わりに発酵槽に連続して加えられ得る。
ある実施形態において、任意のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびそれらの混合物などの外部からの有機抽出剤であり得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、カルボン酸または遊離脂肪酸であり得、ある実施形態において、カルボン酸または遊離脂肪酸は、４〜２８個の炭素、他の実施形態において４〜２２個の、他の実施形態において８〜２２個の炭素、他の実施形態において１０〜２８個の炭素、他の実施形態において７〜２２個の炭素、他の実施形態において１２〜２２個の炭素、他の実施形態において４〜１８個の炭素、他の実施形態において１２〜２２個の炭素、さらに他の実施形態において１２〜１８個の炭素の鎖を有する。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、以下の脂肪酸：アゼライン酸、カプリン酸、カプリル酸、ヒマシ油、ヤシ油（すなわち、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、カプリル酸、カプリン酸、ステアリン酸、カプロン酸、アラキジン酸、オレイン酸、およびリノール酸を含む脂肪酸の天然に存在する組合せとして）、二量体酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、亜麻仁油、ミリスチン酸、オレイン酸、オリーブ油、パーム油、パルミチン酸、パーム核油、ピーナッツ油、ペラルゴン酸、リシノール酸、セバシン酸、大豆油、ステアリン酸、トール油、獣脂、＃１２ヒドロキシステアリン酸、または任意の種油のうちの１つ以上である。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、二酸、例えば、アゼライン酸およびセバシン酸のうちの１つ以上である。したがって、ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、２種以上の異なる遊離脂肪酸の混合物であり得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、天然油に由来するグリセリドの化学的または酵素加水分解から誘導される脂肪酸であり得る。例えば、ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、図４の実施形態を参照して後述されるバイオマス脂質などの天然油の酵素加水分解によって得られる遊離脂肪酸２８’であり得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、例えば、２０１０年７月２８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号明細書に記載されるバイオマス脂質などの天然油の化学的転化から得られる、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸の低級アルコールエステル、脂肪酸グリコールエステル、水酸化トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される脂肪酸抽出剤であり得る。このような実施形態において、抽出剤２９を生成するためのバイオマス脂質は、原料１２が得られる同じかまたは異なるバイオマス源に由来し得る。例えば、ある実施形態において、抽出剤２９を生成するためのバイオマス脂質が、大豆に由来し得るが、原料１２のバイオマス源はトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料１２に対する抽出剤２９のための異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。ある実施形態において、さらなるＩＳＰＲ抽出剤２９はＣＯＦＡを含む。
原位置抽出発酵は、発酵槽３０中でバッチモードまたは連続モードで行われ得る。原位置抽出発酵では、有機抽出剤を、発酵の開始時点で発酵培地と接触させ、二相発酵培地を形成することができる。あるいは、微生物が所望の量の増殖（培地の光学密度を測定することによって決定され得る）を達成した後、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。さらに、発酵培地中の生成物アルコールレベルが、予め選択したレベルに達した時点で、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。ブタノール生成の場合、例えば、ブタノール濃度が、微生物に対して有毒であろうレベルに達する前の時点で、ＩＳＰＲ抽出剤を発酵培地と接触させることができる。発酵培地をＩＳＰＲ抽出剤と接触させた後、ブタノール生成物が抽出剤中に分離し、微生物を含有する水相中の濃度が低下し、それによって、抑制性のブタノール生成物への生成微生物の曝露が抑えられる。
使用されるＩＳＰＲ抽出剤の体積は、後述されるように、発酵培地の体積、発酵槽のサイズ、ブタノール生成物のための抽出剤の分配係数、および選択される発酵モードを含むいくつかの要因に応じて決まる。抽出剤の体積は、発酵槽の使用体積の約３％〜約６０％であり得る。抽出の効率に応じて、発酵培地中のブタノールの水相力価は、例えば、約１ｇ／Ｌ〜約８５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌまたは約２０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌであり得る。ある実施形態において、アルコールエステル化の後に得られる発酵ブロスは、遊離（すなわち、非エステル化）アルコールを含み得、ある実施形態において、生成物アルコールがブタノールである場合、アルコールエステル化の後の発酵ブロス中の遊離アルコールの濃度は、１、３、６、１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、または６０ｇ／Ｌ以下であり、または生成物アルコールがエタノールである場合、アルコールエステル化の後の発酵ブロス中の遊離アルコールの濃度は、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｇ／Ｌ以下である。理論に制約されるものではないが、より高いブタノール力価は、抽出発酵方法を用いて、発酵培地から毒性ブタノール生成物を除去し、それによって、微生物に対して有毒なレベルより低いレベルを保つことから得られると考えられる。
原位置抽出発酵のバッチモードにおいて、所定の体積の有機抽出剤が発酵槽に加えられ、抽出剤は、プロセス中に除去されない。このモードは、発酵培地中の抑制性のブタノール生成物の濃度を最小限に抑えるために、より大きい体積の有機抽出剤を必要とする。その結果、発酵培地の体積は、より小さく、生成される生成物の量は、連続モードを用いて得られる量より少ない。例えば、バッチ式モードにおける抽出剤の体積は、一実施形態において発酵槽の使用体積の２０％〜約６０％であり、別の実施形態において約３０％〜約６０％であり得る。
ガスストリッピング（図示せず）を、ＩＳＰＲ抽出剤と同時に用いて、生成物アルコールを発酵培地から除去することができる。
図１の実施形態において、生成物アルコールは、発酵ブロスから原位置で抽出され、二相混合物３９の分離が、別個の槽３５で起こる。ある実施形態において、二相混合物３９の分離は、後述される図２および３の実施形態に示されるように、発酵槽で行うことができ、これらの図では、アルコール含有有機相流３６が発酵槽３０から直接出る。水相流３４も発酵槽３０から直接出ることができ、一切の残っている生成物アルコールを除去するように処理され、再利用され、または廃棄され、新しい発酵培地と交換され得る。有機抽出剤による生成物アルコールの抽出は、発酵ブロスからの微生物の除去を伴うかまたは伴わずに行うことができる。微生物は、以下に限定はされないが、ろ過または遠心分離を含む、当該技術分野において公知の手段によって、発酵ブロスから除去され得る。例えば、水相流３４は、酵母などの微生物３２を含み得る。微生物３２は、例えば、遠心分離機（図示せず）において、水相流から容易に分離され得る。その後、微生物３２は、発酵槽３０に再利用することができ、発酵槽３０は、時間の経過とともにアルコール生成の生成速度を上げ、それによって、アルコール生成の効率を高めることができる。
原位置抽出発酵の連続モードにおいて、抽出剤の体積は、一実施形態において発酵槽の使用体積の約３％〜約５０％であり、別の実施形態において約３％〜約３０％であり、別の実施形態において３％〜約２０％であり；別の実施形態において３％〜約１０％であり得る。生成物は、反応器から連続して除去されるため、より小さい体積の抽出剤が必要とされ、より大きい体積の発酵培地の使用が可能になる。
原位置抽出発酵の代わりとして、生成物アルコールは、発酵槽３０の下流の発酵ブロスから抽出され得る。このような場合、発酵ブロスは、発酵槽３０から除去され、ＩＳＰＲ抽出剤と接触させるために槽３５に導入されて、槽３５中で二相混合物３９が得られ、次に、これは、有機相３６と水相３４とに分離される。あるいは、ＩＳＰＲ抽出剤は、槽３５に導入される前に、別個の槽（図示せず）中で発酵ブロスに加えられ得る。
非限定的なデータの裏づけのない（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）実施例として、図１の実施形態を参照して、約４重量％のトウモロコシ油を通常含有し得る、磨砕された全粒トウモロコシ（原料１２としての）の水性懸濁液が、約８５℃〜１２０℃で３０分間〜２時間にわたって、アミラーゼ（液化酵素１４としての）で処理され得、得られた液化されたマッシュ１６が、６５℃〜３０℃に冷却され、ｐＨ４．５〜７．５（ある実施形態において、ｐＨ５．５〜６．５）で、脂質中の利用可能な脂肪酸含量の、遊離脂肪酸への転化率が少なくとも３０％から少なくとも９９％もの高さになるのに十分な時間にわたって、０．１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ（ある実施形態において、０．５ｐｐｍ〜１．０ｐｐｍ）のリパーゼ（触媒４２としての）で処理され得る。任意に、液化され、リパーゼ処理されたマッシュ１８は、発酵の前にリパーゼ４２を失活させるように加熱され得る。マッシュ１８は、（例えば、熱交換器を用いて）約３０℃に冷却され、約２５％〜３０重量％の乾燥トウモロコシ固体で発酵槽３０に充填され得る。グルコアミラーゼ（糖化酵素３８としての）の添加による発酵中の液化されたマッシュ１８の糖化により、グルコースが生成され得る。得られた発酵ブロスは、リパーゼ４２で処理されていない液化されたマッシュを用いて、発酵ブロス中に存在し得るトウモロコシ油（例えば、約１．２重量％のトウモロコシ油）の量よりかなり少ない量を含有し得る。特に、リパーゼ４２処理により、トウモロコシ油脂質２６（トリグリセリド（ＴＧ））を、ＦＦＡ２８としてＣＯＦＡ（およびいくらかのジグリセリド（ＤＧ）またはモノグリセリド（ＭＧ））に転化することができ、それが、発酵ブロスと接触する。ＣＯＦＡの存在下での発酵ブロス中の微生物の増殖速度および／またはグルコース消費は、脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および発酵性炭素消費より高くなり得る。例えば、実施例において後述されるように、図６〜８は、補充される脂肪酸の存在下でのブタノール生成微生物による増加されたグルコース消費を示す。
ある実施形態において、図１のシステムおよび方法は、原料スラリー１６（油２６を有する）および触媒４２が導入され、スラリー１８（ＦＦＡ２８を有する）を生成するように発酵槽３０中で接触されるように変更され得る。その際、発酵槽温度を上げて、触媒４２を熱により失活させることができる。その際、発酵槽温度を低下させることができ、発酵槽に微生物３２を接種することができ、それによって、スラリー１８の糖を発酵させて、生成物アルコールを生成することができる。
当業者に明らかであるはずであるように、ある実施形態において、図１のシステムおよび方法は、発酵槽３０中の同時糖化発酵（ＳＳＦ）が、発酵槽３０の前に別個の糖化槽６０（図２を参照）に置き換えられるように変更され得る。したがって、スラリー１８は、ＳＳＦプロセスにおいて発酵前または発酵中に糖化され得る。原料油２６の加水分解のための触媒４２が、糖化酵素３８の前、後、または同時に導入され得ることも明らかであるはずである。したがって、ある実施形態において、酵素３８および触媒４２の転化は段階的であり得（例えば、触媒４２、次に酵素３８、または逆の場合もある）またはほぼ同時（すなわち、人または機械が一回で添加を行うのにかかる時間と全く同じ時間で、あるいは人または機械が２回で添加を行うのにかかる時間と同じように１つの酵素／触媒の直後に他の触媒／酵素を添加する）であり得る。
例えば、図２の実施形態に示されるように、図１のシステムおよび方法は、発酵槽３０中の同時糖化発酵（ＳＳＦ）が、発酵槽３０の前に別個の糖化槽６０に置き換えられるように変更され得る。図２は、酵素３８を受け入れる別個の糖化槽６０を含み、触媒４２が、液化され、糖化された原料流６２に導入される以外は図１とほぼ同一である。原料スラリー１６が、グルコアミラーゼなどの酵素３８とともに糖化槽６０に導入され、それによって、スラリー１６中のオリゴ糖の形態の糖類が、単糖類へと分解され得る。液化され、糖化された原料流６２が、糖化槽６０を出て、それに触媒４２が導入される。原料流６２は、原料に由来する、単糖類、油２６、および非溶解固体を含む。油２６は、触媒４２の導入によって加水分解され、遊離脂肪酸２８および触媒４２を有する液化され、糖化された原料スラリー６４が得られる。
あるいは、ある実施形態において、触媒４２が、糖化酵素３８とともに加えられて、グルコースを生成するのと同時に、油脂質２６を遊離脂肪酸２８に加水分解することができる。酵素３８および触媒４２の転化は段階的であり得（例えば、触媒４２、次に酵素３８、または逆の場合もある）または同時であり得る。あるいは、ある実施形態において、スラリー６２が、発酵槽に導入され得、触媒４２が、発酵槽３０に直接加えられる。
図２の実施形態において、熱ｑが、原料スラリー６４に加えられ、それによって、触媒４２が失活し、次に、熱処理されたスラリー６４が、単糖類を代謝して生成物アルコール（例えば、ブタノール）を生成するアルコール生成微生物３２とともに発酵槽３０に導入される。あるいは、スラリー６４は、発酵槽３０に供給され、微生物３２の接種の前に、発酵槽中で熱ｑを加えられ得る。
図１を参照して上述したように、遊離脂肪酸２８は、水相から生成物アルコールを優先的に分離するためのＩＳＰＲ抽出剤として働くこともできる。ある実施形態において、１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９も、発酵槽３０に導入され得る。二相混合物の分離が、発酵槽３０中で行われ、それによって、アルコール含有有機相流３６および水相流３４が、発酵槽３０から直接出る。あるいは、二相混合物の分離は、図１の実施形態において提供されるように、別個の槽３５中で行われ得る。図２の実施形態の残りのプロセス作業は、図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
さらに他の実施形態において、ＦＦＡ２８を有する原料スラリー１８が液化槽１０から直接出て、発酵槽３０に供給され得るように、原料１２に由来する油２６が、液化の前または液化中のいずれかで、ＦＦＡ２８へと触媒により加水分解され得る。例えば、油２６を有する原料１２が、油２６中のグリセリドの少なくとも一部をＦＦＡ２８へと加水分解するための触媒４２とともに、液化槽１０に供給され得る。原料１２中のでんぷんを加水分解する酵素１４（例えば、α−アミラーゼ）も、液化された原料を生成するために槽１０に導入され得る。酵素１４および触媒４２の添加は、段階的または同時であり得る。例えば、油２６の少なくとも一部が加水分解された後、触媒４２が導入され得、次に、酵素１４が導入され得る。あるいは、酵素１４が導入され得、次に、触媒４２が導入され得る。液化プロセスは、熱ｑの適用を含み得る。このような実施形態において、プロセス温度が触媒４２を失活させる温度より低い場合、油２６が加水分解され得るように、触媒４２が液化の前または液化中に導入され得る。その後、熱ｑの適用は、失活が所望される場合、触媒４２の液化および失活の２つの目的を提供し得る。
図１〜３に関して上述した実施形態のいずれかを含むある実施形態において、非溶解固体が、発酵槽３０に導入される前に、原料スラリーから除去され得る。例えば、図４の実施形態に示されるように、原料スラリー１６が、非溶解固体を固相またはウェットケーキ２４として排出するように構成される分離器２０の入口に導入される。例えば、ある実施形態において、分離器２０は、原料スラリー１６から非溶解固体を分離するための、フィルタープレス、真空ろ過、または遠心分離機を含み得る。任意に、ある実施形態において、分離器２０はまた、原料スラリー１６中に存在する油２６の一部、または実質的に全てを除去するように構成され得る。このような実施形態において、分離器２０は、以下に限定はされないが、サイフォニング、吸入、デカンテーション、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離などを含む、水性原料流から油を除去するための、当該技術分野において公知の任意の好適な分離器であり得る。糖および水を含む残りの原料は、水流２２として発酵槽３０に排出される。
ある実施形態において、分離器２０は、油２６を除去するが、非溶解固体を除去しない。したがって、発酵槽３０に供給される水流２２は、非溶解固体を含む。ある実施形態において、分離器２０は、糖および水を含有する水層（すなわち、流れ２２）、非溶解固体を含有する固体層（すなわち、ウェットケーキ２４）、および油層（すなわち、油流２６）を含む遠心分離生成物を生成するように原料スラリー１６を撹拌または回転させるトリカンター（ｔｒｉｃａｎｔｅｒ）遠心分離機２０を含む。遠心分離によって原料スラリー１６から非溶解固体を除去するための方法およびシステムは、全体が参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書に詳細に記載されている。
いずれの場合も、図３に示されるように、触媒４２が、除去された油２６と接触されて、触媒４２を含むＦＦＡ２８の流れが生成され得る。次に、熱ｑが、ＦＦＡ２８の流れに加えられ得、それによって、触媒４２が失活する。次に、ＦＦＡ２８および不活性な触媒４２の流れは、流れ２２および微生物３２とともに、発酵槽３０に導入され得る。あるいは、ＦＦＡ２８および活性触媒４２は、槽４０から発酵槽３０に供給され得、その後、活性触媒４２は、微生物３２の接種の前に、熱ｑを加えられ、発酵槽中で失活され得る。
ＦＦＡ２８は、ＩＳＰＲ抽出剤２８として働くことができ、発酵槽３０中で二相混合物を形成する。ＳＳＦによって生成される生成物アルコールは、ＦＦＡ２８によって構成される有機相３６中に分離する。ある実施形態において、１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９も、発酵槽３０に導入され得る。したがって、油２６（例えば、原料に由来する）は、ＦＦＡ２８に触媒により加水分解され、それによって、ＩＳＰＲ抽出剤も生成しつつ、ＩＳＰＲ抽出剤中の脂質の蓄積の速度を低下させることができる。有機相３６は、槽３５において二相混合物３９の水相３４から分離され得る。ある実施形態において、二相混合物３９の分離は、図２および３に記載される実施形態に示されるように、発酵槽で行うことができ、これらの図では、アルコール含有有機相流３６は、発酵槽３０から直接出る。有機相３６は、図１に示されるように、生成物アルコール５４の回収および回収された抽出剤２７の任意選択の再利用のために、分離器５０に導入され得る。図３の実施形態の残りのプロセス作業は、図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
ウェットケーキ２４が、遠心分離機２０を介して除去されるとき、ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油などの原料１２からの油の一部が、ウェットケーキ２４中に残る。水溶液２２が遠心分離機２０から排出されてから、ウェットケーキ２４は、遠心分離機においてさらなる水で洗浄され得る。ウェットケーキ２４の洗浄により、ウェットケーキ中に存在する糖（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖および水は、液化槽１０に再利用され得る。洗浄後、ウェットケーキ２０は、任意の好適な公知の方法によって、乾燥されて、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）が形成され得る。遠心分離機２０において形成されるウェットケーキ２４からのＤＤＧＳの形成にはいくつかの利点がある。非溶解固体が発酵槽に送られないため、ＤＤＧＳは、抽出剤および／またはブタノールなどの生成物アルコールを捕捉せず、ＤＤＧＳは、発酵槽の条件に供されず、発酵槽中に存在する微生物と接触しない。全てのこれらの利点が、例えば、動物飼料としてのＤＤＧＳの処理および販売をより容易にする。ある実施形態において、油２６は、ウェットケーキ２４から別々に排出されず、油２６は、ウェットケーキ２４の一部として含まれ、最終的にＤＤＧＳ中に存在する。このような場合、油は、ＤＤＧＳから分離され、同じかまたは異なるアルコール発酵プロセスにおいてその後の使用のためにＩＳＰＲ抽出剤２９に転化され得る。遠心分離によって原料１６から非溶解固体を除去するための方法およびシステムは、全体が参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書に詳細に記載されている。
さらに他の実施形態（図示せず）において、当業者に明らかであるはずであるように、糖化が、分離器２０と液化槽１０との間に位置する別個の糖化槽６０（図２を参照）で行われ得る。
例えば、図４の実施形態に示されるさらに他の実施形態において、天然油２６’が、触媒４２も供給される槽４０に供給され、それによって、油２６’中のグリセリドの少なくとも一部が加水分解されて、ＦＦＡ２８’が形成される。その後、触媒４２が、熱ｑの適用などによって失活され得る。次に、ＦＦＡ２８’および不活性な触媒４２を含む槽４０からの生成物流が、原料油２６、およびある実施形態において、非溶解固体が、分離器２０（例えば、図３の実施形態を参照）によって予め除去された水性原料流２２とともに、発酵槽３０に導入される。糖化酵素３８および微生物３２も、発酵槽３０に導入され、それによって、生成物アルコールが、ＳＳＦによって生成される。
あるいは、油２６’および触媒４２は、発酵槽３０に直接供給され得、その中で、油２６’が、槽４０を用いずにＦＦＡ２８’に加水分解される。その後、活性触媒４２は、熱ｑを加えられ、微生物３２の接種の前に発酵槽中で失活され得る。あるいは、ＦＦＡ２８’および活性触媒４２は、槽４０から発酵槽３０に供給され得、活性触媒４２は、その後、熱ｑを加えられ、微生物３２の接種の前に発酵槽中で失活され得る。このような実施形態において、油２６が除去された流れ２２ではなく、油２６を含む原料スラリー１６が、発酵槽３０に供給され、活性触媒４２と接触され得る。したがって、活性触媒４２を用いて、油２６をＦＦＡ２８へと加水分解することができ、それによって、発酵槽中の油の存在に起因し得る、時間の経過に伴う抽出剤の損失および／または抽出剤の分配係数の低下を抑えることができる。
ある実施形態において、当業者に明らかであるはずであるように、図４のシステムおよび方法は、発酵槽３０中の同時糖化発酵が、発酵槽３０の前に別個の糖化槽６０と置き換えられるように変更され得る。
ある実施形態において、天然油２６’が、獣脂、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、植物油ブレンド、およびそれらの混合物であり得る。ある実施形態において、天然油２６’は、２種以上の天然油の混合物、例えば、パーム油と大豆油との混合物である。ある実施形態において、天然油２６’は植物由来油である。ある実施形態において、植物由来油は、必ずしもではないが、発酵プロセスに使用され得るバイオマスに由来し得る。バイオマスは、原料１２（流れ２２として図４に示される）が得られる同じかまたは異なる供給源であり得る。したがって、例えば、ある実施形態において、油２６’は、トウモロコシに由来し得るが、原料１２はサトウキビであり得る。例えば、ある実施形態において、油２６’は、トウモロコシに由来し得、原料１２のバイオマス源もトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料１２に対して油２６’の異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。図４の実施形態の残りのプロセス作業は、図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
本発明のある実施形態において、原料１２中に存在するバイオマス油は、アルコール発酵の後の工程においてＦＦＡ２８に転化され得る。次に、ＦＦＡ２８は、発酵槽に導入され、アルコール生成微生物の向上した増殖速度および／または発酵性炭素消費を達成するために発酵ブロスと接触され得る。ＦＦＡ２８は、ＩＳＰＲ抽出剤２８としても働き得る。例えば、図５の実施形態において、原料１２が液化されて、原料に由来する油２６を含む原料スラリー１６が生成される。原料スラリー１６は、原料に由来する非溶解固体も含み得る。あるいは、非溶解固体は、遠心分離機（図示せず）などの分離器によってスラリー１６から分離され得る。油２６を含有する原料スラリー１６は、糖化酵素３８および微生物３２を含む発酵ブロスを含む発酵槽３０に直接導入される。生成物アルコールが、発酵槽３０中のＳＳＦによって生成される。あるいは、ある実施形態において、プロセスは、図２に関連して説明されるように、別個の糖化槽を含むように変更され得る。
ＩＳＰＲ抽出剤２９が、発酵槽３０に導入されて、二相混合物が形成され、生成物アルコールは、ＩＳＰＲ抽出剤２９の有機相中に分離することによって除去される。油２６も有機相中に分離する。二相混合物の分離は発酵槽３０中で行われ、それによって、アルコール含有有機相流３６および水相流３４が、発酵槽３０から直接出る。あるいは、二相混合物の分離は、図１の実施形態において提供されるように、別個の槽３５に行われ得る。油２６を含む有機相流３６は、分離器５０に導入されて、抽出剤２９から生成物アルコール５４が回収される。得られるアルコール希薄抽出剤２７は、回収された抽出剤２９および油２６を含む。抽出剤２７は、触媒４２と接触され、それによって、油２６中のグリセリドの少なくとも一部が加水分解されて、ＦＦＡ２８が形成される。次に、発酵槽３０中に戻されて再利用される前に、触媒４２を失活させるために、ＦＦＡ２８を含む抽出剤２７に熱ｑを加えることができる。このような再利用される抽出剤流２７は、別個の流れまたは新鮮な、補給（ｍａｋｅ−ｕｐ）抽出剤流２９と組み合わされた流れであり得る。次に、発酵槽３０からのアルコール含有有機相３６の後の引き抜きは、新たに導入される原料スラリー１６からの生成物アルコールおよびさらなる油２６に加えて、ＦＦＡ２８およびＩＳＰＲ抽出剤２９（新鮮な抽出剤２９および再利用される抽出剤２７として）を含み得る。次に、有機相３６は、生成物アルコールを回収するように処理され、上述したのと同様に、さらなる油２６の加水分解のために触媒４２と接触させた後、発酵槽３０に戻されて再利用され得る。ある実施形態において、プロセス自体が生成物アルコールを抽出するための補給ＩＳＰＲ抽出剤としてＦＦＡ２８を生成し得るため、発酵プロセスが時間とともに運転されるにつれて、補給ＩＳＰＲ抽出剤２９の使用を段階的に停止することができる。したがって、ＩＳＰＲ抽出剤は、ＦＦＡ２８とともに再利用される抽出剤２７の流れであり得る。
したがって、図１〜５は、発酵プロセスを含む方法およびシステムの様々な非限定的な実施形態およびバイオマス由来の油２６の加水分解から生成されるＦＦＡ２８、および発酵増殖の際に微生物と接触させるのに使用され得る植物由来油などの天然油２６’の触媒加水分解から生成されるＦＦＡ２８’を提供し、それによって、微生物の増殖速度および／または発酵性炭素消費が、遊離脂肪酸の存在下でより高くなり、アルコール生産性の向上が可能になる。
上記の説明および実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明から逸脱せずに様々な用途および条件に適合させるように、本発明の様々な変形および変更を行うことができる。例えば、ある実施形態において、本発明に係る脂肪酸の補充は、発酵前、すなわち、発酵槽３０中の発酵の前の微生物３２のシード培養中に用いられ得る。当該技術分野において公知であるように、通常、酵母などの微生物３２は、採取され、発酵槽３０に接種される前に、所望の細胞濃度になるようにシード培地から増殖され得る。したがって、ある実施形態によれば、シード培地は、ＦＦＡ２８と接触され得、それによって、向上した増殖速度および微生物のバイオマス生成が達成され得、アルコール発酵プロセスのシード培養段階に関連する発酵前の時間が短縮され得る。したがって、本発明から逸脱せずに、プロセス効率全体を向上するために、本発明に係る脂肪酸の補充が、アルコール発酵プロセス中の様々な段階で、例えば、発酵前の培養および発酵中に用いられ得ることが明らかであるはずである。
図１〜５を参照して記載される上述した実施形態のいずれかを含むある実施形態において、発酵槽３０中の発酵ブロスは、少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールへの生合成経路を介してブタノールを生成するように遺伝子組み換え（すなわち、遺伝子操作）された少なくとも１種の組み換え微生物３２を含む。特に、組み換え微生物は、好適な炭素基質を含有する発酵ブロス中で増殖され得る。さらなる炭素基質としては、以下に限定はされないが、フルクトースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、またはスクロースなどのオリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能な原料からの精製されていない混合物が挙げられる。他の炭素基質としては、エタノール、乳酸塩、コハク酸塩、またはグリセロールが挙げられる。
さらに、炭素基質は、主要な生化学中間体への代謝的転化が示された、二酸化炭素またはメタノールなどの一炭素基質でもあり得る。一炭素基質および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかの他の炭素含有化合物を用いることも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を用いて、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３）、４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９，１９９０）。したがって、本発明に用いられる炭素の供給源が、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物の選択のみによって限定されると考えられる。
上記の炭素基質およびそれらの混合物の全てが好適であると考えられるが、ある実施形態において、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、あるいはこれらの基質と、Ｃ５糖類を使用するように改変された酵母のためのキシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびそれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀類を含むでんぷんベースの原料の糖化によって、再生可能な穀類源から誘導され得る。さらに、発酵性糖は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８ Ａ１号明細書に記載されるような、前処理および糖化のプロセスによって、再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスから誘導され得る。適切な炭素源（水流２２からの）に加えて、発酵ブロスは、培養物の成長およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）を含む酵素経路の促進に適した、当業者に公知の、好適な無機物、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有しなければならない。
生合成経路を介してブタノールを生成する組み換え微生物としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。一実施形態において、組み換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択され得る。一実施形態において、組み換え微生物は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種から選択されるクラブトリー陽性酵母である。クラブトリー陽性酵母の種としては、以下に限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。例えば、微生物による発酵を用いたブタノールの生成、ならびにブタノールを生成する微生物は公知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されている。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生合成経路を含む。好適なイソブタノール生合成経路は、当該技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書を参照）。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する全てのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まない微生物が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。ＧＰＤ２などのＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない微生物も、この文献に記載されている。
実施例に使用されるものを含む特定の株の構造が、本明細書に提供される。
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０８３（「ＮＧＣＩ−０７０」；ＰＮＹ１５０４）の作成
株ＢＰ１０６４は、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ（ＣＢＳ ８３４０；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、以下の遺伝子の欠失を含む：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２。ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１、米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号明細書に記載される）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３、ＰＮＹ１５０４）を生成した。
標的遺伝子および形質転換体の選択のためのＧ４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかの上流および下流の相同領域を含むＰＣＲ断片による相同的組み換えによって、全コード配列を完全に除去した欠失を作り出した。ｌｏｘＰ部位が側面にあるＧ４１８耐性マーカーを、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。ＵＲＡ３遺伝子を相同的組み換えによって除去して、無瘢痕（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失を作り出し、またはｌｏｘＰ部位が側面にある場合、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。
無瘢痕欠失の手順を、Ａｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ ２３：３９９−４０５，２００６）から適応させた。一般に、各無瘢痕欠失のためのＰＣＲカセットを、ＰＣＲを重複させることによって、４つの断片、Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることによって作製した。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流の２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流の１５０ｂｐ）とともに、天然ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能な／対抗選択可能な（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカー、ＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有していた。それぞれ長さ５００ｂｐの断片ＡおよびＣは、標的遺伝子のすぐ上流の５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応していた。断片ＡおよびＣを、相同的組み換えによる、染色体へのカセットの組み込みに使用した。断片Ｂに対応する配列の直接の繰り返しが、染色体へのカセットの組み込みの際に生成された際、断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに対応し、それを、相同的組み換えによる、染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除に使用した。ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、ＵＲＡ３マーカーを、相同的組み換えによって、まず染色体に組み込み、次に染色体から切除した。最初の組み込みにより、３’５００ｂｐを除いて、遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の３’５００ｂｐ領域も欠失させた。この方法を用いた遺伝子の組み込みでは、組み込まれる遺伝子が、断片ＡとＢとの間のＰＣＲカセットに含まれていた。
ＵＲＡ３の欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４鋳型ＤＮＡ（配列番号３）からＰＣＲで増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組み換えおよびマーカーの除去を可能にするｌｏｘＰ部位が側面にある。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号４および５）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＵＲＡ３部分を、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄへと形質転換し、３０℃でＧ４１８（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＹＰＤにおいて形質転換体を選択した。プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号６および７）ならびに指定されるＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸを用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
ＨＩＳ３の欠失
無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ、キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ａを、ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１５）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂを、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１６）、およびＨＩＳ３断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕを、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）、およびＨＩＳ３断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１９）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃを、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５８（配列番号２０）、およびプライマーｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＨＩＳ３断片ＡおよびＨＩＳ３断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＡＢを生成した。ＨＩＳ３断片ＵおよびＨＩＳ３断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢおよびＨＩＳ３断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３ ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＨＩＳ３ ＡＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養（ｐｌａｔｅ）した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲによって、ｈｉｓ３ノックアウトを有する形質転換体をスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカー除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカー除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される）でＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を形質転換し、３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地において平板培養することによって、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。形質転換体を、３０℃で約６時間にわたって１％のガラクトースが補充されたＹＰ中で増殖させて、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカー切除を誘発し、回収のために３０℃でＹＰＤ（２％のグルコース）プレートに平板培養した。分離株を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ、０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために、ＹＰＤにおいて増殖させ、平板培養した。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシル欠損合成完全培地のプレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地のプレートにおける増殖をアッセイすることによって、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの損失について分離株を調べた。Ｇ４１８に対して感受性であり、かつウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性であった正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７として表した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、Δｕｒａ３についてはプライマーｏＢＰ４５０（配列番号２４）およびｏＢＰ４５１（配列番号２５）、およびΔｈｉｓ３についてはプライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。
ＰＤＣ６の欠失
無瘢痕ＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ａを、ＰＤＣ６断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびプライマーｏＢＰ４４１（配列番号２７）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂを、ＰＤＣ６断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４２（配列番号２８）、およびＰＤＣ６断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕを、ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）、およびＰＤＣ６断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４５（配列番号３１）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｃを、ＰＤＣ６断片Ｕ３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４６（配列番号３２）、およびプライマーｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ６断片ＡおよびＰＤＣ６断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＡＢを生成した。ＰＤＣ６断片ＵおよびＰＤＣ６断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢおよびＰＤＣ６断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６ ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ６ ＡＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ６ノックアウトを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびｏＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。ＰＤＣ６、ｏＢＰ５５４（配列番号３６）およびｏＢＰ５５５（配列番号３７）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ６遺伝子がないことを実証した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１として表した。
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組み込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ Ｎｏ．７００６１０に由来するｉｌｖＤコード領域で置換した。Ａ断片、続いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤコード領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＮＹＬＡ８３（本明細書および米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書に記載される）ゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号１４１）を、ＰＤＣ１断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびプライマーｏＢＰ５１５（配列番号３９）を用いて増殖した。ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのＢ、Ｕ、およびＣ断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂを、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１６（配列番号４０）、およびＰＤＣ１断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕを、ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）、およびＰＤＣ１断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１９（配列番号４３）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｃを、ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５２０（配列番号４４）、およびプライマーｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを生成した。ＰＤＣ１断片ＵおよびＰＤＣ１断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢおよびＰＤＣ１断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１ Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号１４２）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ１ Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ１、ｏＢＰ５５０（配列番号４８）およびｏＢＰ５５１（配列番号４９）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ１遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７として表した。
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組み込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するｓａｄＢコード領域で置換した。ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組み込みのためのＰＣＲカセットのセグメントを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳは、ｐＵＣ１９をベースとしており、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に位置するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するＵＲＡ３遺伝子の配列を含む。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコンおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における複製および選択のためのβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。ＵＲＡ３のためのコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流の配列が、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために含まれていた。ベクターを、クローニングプロセスに使用することができ、酵母組み込みベクターとして使用することができる。
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡに由来するＵＲＡ３コード領域の上流の２５０ｂｐおよび下流の１５０ｂｐとともにＵＲＡ３コード領域を含むＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１２）、およびＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１３）を用いて増幅した。ゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９（配列番号１４４）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートして、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを生成した。プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１０）およびｏＢＰ２６５（配列番号１１）によるＰＣＲおよび配列決定によって、ベクターを確認した。
ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂのコード配列を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングして、ＰＤＣ５ Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ ＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を生成した。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）、およびＰＤＣ５断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３１（配列番号５１）とともに、鋳型としてｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号６７）を用いて、ｓａｄＢのコード配列を増幅した。ＰＤＣ５断片Ｂを、ｓａｄＢの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３２（配列番号５２）、およびＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂ ＰＣＲ産物を混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）およびｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅することによって、ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを生成した。得られたＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＰｍｅＩによって消化させ、適切な酵素による消化の後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドを、ＰＤＣ５断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５４６（配列番号５５）を用いて、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの増幅のための鋳型として使用した。ＰＤＣ５断片Ｃを、ＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４７（配列番号５６）、およびプライマーｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。天然のＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０ヌクレオチドに対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４２（配列番号５８）、およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いてＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを増幅することによって、ＰＤＣ５ Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号１４３）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ５ Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ５、ｏＢＰ５５２（配列番号６１）およびｏＢＰ５５３（配列番号６２）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ５遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３を、ＹＰＥ（１％のエタノール）中で一晩増殖させ、エタノール（グルコースではない）が補充され、かつ３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３として表した。
ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１４５）を、鋳型ＤＮＡとしてｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号６８）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位が側面にある（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（配列番号８および９）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＧＰＤ２部分を、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体を、１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において選択した。プライマーｏＢＰ５８２およびＡＡ２７０（配列番号６３および６４）を用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６）を用いた形質転換、および３０℃で１％のエタノールが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地における平板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再利用した。形質転換体を、１％のエタノールが補充され、かつ５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地においてストリークし（ｓｔｒｅａｋ）、３０℃で培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のためにＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させた。欠失およびマーカー除去を、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号６３）およびｏＢＰ５９１（配列番号６５）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）として表した。
ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３；ＰＮＹ１５０４）を生成した。
株ＮＹＬＡ７４、ＮＹＬＡ８３、およびＮＹＬＡ８４の作成
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内因性ＰＤＣ１およびＰＤＣ６遺伝子の挿入不活化。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、以下に記載されるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの主なアイソザイムをコードする：
ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢの作成
アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するブタノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（配列番号７０）（米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている）をクローニングした。第２級アルコールデヒドロゲナーゼのためのｓａｄＢと呼ばれるこの遺伝子のコード領域（配列番号６９）を、それぞれ順方向および逆方向プライマーＮ４７３およびＮ４６９（配列番号７４および７５）を用いてグラム陰性菌のために推奨されるプロトコルにしたがって、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製される、Ａ．キシロソキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ゲノムＤＮＡから、標準条件を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）４ ＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとＴＯＰＯ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔでクローニングを行って、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成し、それを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞へと形質転換した。次に、プラスミドを４つのクローンから単離し、配列を確認した。
ｓａｄＢコード領域を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマーは、酵母ＧＰＭ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７６および７７として提供されるＮ５８３およびＮ５８４）と重複し得る追加の５’配列を含んでいた。次に、ＰＣＲ産物を、以下のように、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における「ギャップ修復（ｇａｐ ｒｅｐａｉｒ）」方法を用いてクローニングした（Ｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５８：２０１−２１６，１９８７）。ＧＰＭ１プロモーター（配列番号７２）、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に由来するｋｉｖＤコード領域（配列番号７１）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７３）を含有する酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ：：ｋｉｖＤ：：ＡＤＨ（米国特許出願公開第２００７／００９２９５７ Ａ１号明細書の実施例１７に記載される）を、ＢｂｖＣＩおよびＰａｃＩ制限酵素で消化して、ｋｉｖＤコード領域を放出した。約１μｇの残っているベクター断片を、１μｇのｓａｄＢ ＰＣＲ産物とともに、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４１へと形質転換した。形質転換体を、ロイシン欠損合成完全培地において選択した。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢを生成する適切な組み換え事象を、プライマーＮ１４２およびＮ４５９（配列番号１０８および１０９）を用いたＰＣＲによって確認した。
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ６の欠失：
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号７８）に由来するＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号７９）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒに由来するＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合することによって作製した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号８０）は、インビボででの相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、７５ｂｐの相同反復配列が側面にあるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含む。２つのＤＮＡセグメントを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマー１１４１１７−１１Ａ〜１１４１１７−１１Ｄ（配列番号８１、８２、８３、および８４）、ならびに１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ（配列番号８５および８６）とともに、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８，１９８９に記載される）によって結合した。
ＳＯＥ ＰＣＲ（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）のための外部プライマーは、それぞれＰＤＣ６プロモーターおよびターミネーターの上流および下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、完成されたカセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２００８６６）へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号８７および８８）、ならびに１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号８９および９０）を用いたＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＤＣ６コード領域の欠失を有するＰＤＣ６遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、ＵＲＡ３ｒマーカーを、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーを、ＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有する。
ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ１の欠失：
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー１１４１１７−２７Ａ〜１１４１１７−２７Ｄ（配列番号１１１、１１２、１１３、および１１４）とともに、ｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８，１９８９によって記載される）によって、ｐＬＨ４６８（配列番号２）に由来するｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号９１）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒに由来するＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合することによって、ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを作製した。
ＳＯＥ ＰＣＲ（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）のための外部プライマーは、ＰＤＣ１プロモーターの下流およびＰＤＣ１コード配列の下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、完成されたカセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔへと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号９２および９３）、ならびにプライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号９０および９４）を用いたＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＤＣ１コード配列の欠失を有するＰＤＣ１遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、ＵＲＡ３ｒマーカーを、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有する。
ＨＩＳ３の欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットを、ＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡ（配列番号９５）からＰＣＲ増幅した。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボでの相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、５００ｂｐの相同反復配列が側面にあるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含む。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号９６および９７）を用いてＰＣＲを行い、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組み込みがＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ６７へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をスクリーニングして、３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地において形質転換体をレプリカ平板培養することによって、正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって、ＵＲＡ３ｒマーカーを再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。ＮＹＬＡ７３と呼ばれる得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３を有する。
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号９８および９９）を用いて株ＹＬＲ１３４Ｗ染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４０３４０９１）からＰＣＲ増幅し、約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｋａｎＭＸ４マーカーの組み込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ７３へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で１％のエタノールおよびジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（２００μｇ／ｍＬ）が補充されたＹＰ培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号１００および１０１）を用いたＰＤＣ５コード領域の置換によりＰＤＣ遺伝子座における正確な組み込みを確認した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。株はＮＹＬＡ７４と称された。
プラスミドベクターｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡおよびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ｂｕｄＣ＋ＧＰＭ−ｓａｄＢを、ＮＹＬＡ７４へと形質転換して、ブタンジオール生成株（ＮＧＣＩ−０４７）を生成した。
プラスミドベクターｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８（配列番号１４０）およびｐＬＨ４６８をＮＹＬＡ７４へと形質転換して、イソブタノール生成株（ＮＧＣＩ−０４９）を生成した。
ＨＸＫ２（ヘキソキナーゼＩＩ）の欠失：
ｈｘｋ２：：ＵＲＡ３ｒカセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー３８４および３８５（配列番号１０２および１０３）を用いてＵＲＡ３ｒ２鋳型（上記）からＰＣＲ増幅し、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＸＫ２部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組み込みがＨＸＫ２コード領域の置換をもたらすように、ＨＸＫ２プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ７３へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＮ８６９およびＮ８７１（配列番号１０４および１０５）を用いたＨＸＫ２コード領域の置換によりＨＸＫ２遺伝子座における正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって、ＵＲＡ３ｒ２マーカーを再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、およびＰＣＲによって、プライマーＮ９４６およびＮ９４７（配列番号１０６および１０７）を用いて正確なマーカーの除去を確認することによって、マーカーの除去を確認した。ＮＹＬＡ８３と称される、得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ Δｈｘｋ２を有する。
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、上述したようにＰＣＲ増幅した。上述したように、ＰＣＲ断片をＮＹＬＡ８３へと形質転換し、形質転換体を選択し、スクリーニングした。ＮＹＬＡ８４と称される、同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ Δｈｘｋ２ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。
標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用いて、プラスミドベクターｐＬＨ４６８およびｐＬＨ５３２を、株ＮＹＬＡ８４（ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ Δｈｘｋ２ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４）へと同時に形質転換し、得られた「ブタノロジェンＮＹＬＡ８４」を、３０℃で１％のエタノールが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地上で維持した。
発現ベクターｐＬＨ４６８
ｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号２）を、酵母中のＤＨＡＤ、ＫｉｖＤ、およびＨＡＤＨの発現のために作成し、これは、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。ＤＨＡＤの発現のために、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ ２１０９〜３１０５）、続いてＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ ４８５８〜５８５７）から発現されるミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置３３１３〜４８４９）を有するキメラ遺伝子；ＡＤＨの発現のために、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＭ１プロモーター（ｎｔ ７４２５〜８１８１）、続いてＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ ５９６２〜６２７７）から発現されるコドン最適化されたウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼのコード領域（ｎｔ ６２８６〜７４１３）を有するキメラ遺伝子；およびＫｉｖＤの発現のために、ＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ １０８９６〜１１９１８）、続いてＴＤＨ３ターミネーター（ｎｔ ８２３７〜９２３５）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に由来するコドン最適化されたｋｉｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ ９２４９〜１０８９５）を有するキメラ遺伝子を含むようにｐＬＨ４８６を作成した。
乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）のためのコード領域（それぞれ配列番号７１および１１８）を、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドンに基づいて、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって合成し、プラスミドｐＫｉｖＤｙ−ＤＮＡ２．０およびｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０において提供した。コードされるタンパク質は、それぞれ配列番号１１７および１１９である。ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨのための個々の発現ベクターを作成した。ｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）を構築するために、ベクターｐＮＹ８（配列番号１２１；ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔとも称され、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書の実施例１７に記載されている）を、ＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ酵素で消化し、それによって、ＧＰＤプロモーターおよびａｌｄコード領域を切断した。５’プライマーＯＴ１０６８および３’プライマーＯＴ１０６７（配列番号１２３および１２４）を用いて、５’末端にＡｓｃＩ部位および３’末端にＳｐｅＩ部位を付加するために、ｐＮＹ８に由来するＴＤＨ３プロモーター断片（配列番号１２２）をＰＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ／ＳｆｉＩで消化されたｐＮＹ８ベクター断片を、ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩで消化されたＴＤＨ３プロモーターＰＣＲ産物とライゲートし、コドン最適化されたｋｉｖＤコード領域を含むＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片を、ベクターｐＫｉｖＤ−ＤＮＡ２．０から単離した。３通りのライゲーションにより、ベクターｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）が生成された。ｐＬＨ４６７を、制限マッピング（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ）および配列決定によって確認した。
ｐＬＨ４３５（ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）は、参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６１／０５８，９７０号明細書の実施例３に記載されるベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号７８）から得られた。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢは、ＧＰＭ１プロモーター（配列番号７２）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼに由来するコード領域（ｓａｄＢ；ＤＮＡ配列番号６９；タンパク質配列番号７０：米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７３）を含むキメラ遺伝子を有するｐＲＳ４２５ベクター（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７７１０６）である。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢは、ｓａｄＢコード領域の５’および３’末端においてそれぞれＢｂｖＩおよびＰａｃＩ部位を含む。プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号１２６および１２７）を用いた部位特異的突然変異誘発法によって、ＮｈｅＩ部位をｓａｄＢコード領域の５’末端に付加して、ベクターｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩを生成し、それを配列決定によって確認した。ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩをＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化して、ｓａｄＢコード領域を除外し、ベクターｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０に由来するコドン最適化されたＨＡＤＨコード領域を含むＮｈｅＩ−ＰａｃＩ断片とライゲートして、ｐＬＨ４３５を生成した。
単一のベクター中でＫｉｖＤおよびＨＡＤＨ発現カセットを組み合わせるために、酵母ベクターｐＲＳ４１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．８７４７４）を、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、３通りのライゲーション反応において、ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔカセットを含むｐＬＨ４３５に由来するＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片とともに、ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔカセットを含むｐＬＨ４６７に由来するＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片とライゲートした。これにより、ベクターｐＲＳ４１１：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ（ｐＬＨ４４１）が生成され、それを制限マッピングによって確認した。
低級イソブタノール経路における全ての３つの遺伝子：ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤｙ、およびＨａｄｈｙのための同時発現ベクターを生成するために、ＩｌｖＤ遺伝子の供給源として、米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書に記載されるｐＲＳ４２３ ＦＢＡ ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号１２８）を使用した。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のためのＦ１複製起点（ｎｔ １４２３〜１８７９）および酵母における複製のための２ミクロンの起点（ｎｔ ８０８２〜９４２６）を含む。ベクターは、ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ ２１１１〜３１０８；配列番号１２０）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ ４８６１〜５８６０；配列番号１２９）を有する。さらに、ベクターは、酵母における選択のためのＨｉｓマーカー（ｎｔ ５０４〜１１６３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ ７０９２〜７９４９）を有する。ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７００６１０）に由来するｉｌｖＤコード領域（ｎｔ ３１１６〜４８２８；配列番号１１５；タンパク質配列番号１１６）は、ＦＢＡプロモーターとＦＢＡターミネーターとの間にあり、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。さらに、ｉｌｖＤコード領域（ｎｔ ４８２９〜４８４９）に融合されたｌｕｍｉｏタグがある。
第１の工程は、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（ＳａｃＩＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化された）を用いて、ｐＲＳ４２３ ＦＢＡ ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏとも呼ばれる）を線状化して、９，４８２ｂｐの全長を有するベクターを得ることであった。第２の工程は、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（ＫｐｎＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化された）を用いて、ｋｉｖＤｙ−ｈＡＤＨｙカセットをｐＬＨ４４１から単離し、６，０６３ｂｐの断片を得ることであった。この断片を、ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏに由来する９，４８２ｂｐのベクター断片とライゲートした。これにより、ベクターｐＬＨ４６８（ｐＲＳ４２３：：ＰＦＢＡ１−ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）Ｌｕｍｉｏ−ＦＢＡ１ｔ−ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ−ＰＧＰＭ１−ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）が生成され、それを、制限マッピングおよび配列決定によって確認した。
ｐＬＨ５３２の作成
ｐＬＨ５３２プラスミド（配列番号１３０）を、酵母中のＡＬＳおよびＫＡＲＩの発現のために作成した。ｐＬＨ５３２は、以下のキメラ遺伝子：１）ＣＵＰ１プロモーター（配列番号１３９）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するアセト乳酸シンターゼコード領域（ＡｌｓＳ；配列番号１３７；タンパク質配列番号１３８）およびＣＹＣ１ターミネーター２（配列番号１３３）；２）ＩＬＶ５プロモーター（配列番号１３４）、Ｐｆ５．ＩｌｖＣコード領域（配列番号１３２）およびＩＬＶ５ターミネーター（配列番号１３５）；ならびに３）ＦＢＡ１プロモーター（配列番号１３６）、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩコード領域（ＩＬＶ５；配列番号１３１）；およびＣＹＣ１ターミネーターを含むｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ Ｎｏ．８７５４１）である。
Ｐｆ５．ＩｌｖＣコード領域は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０１６３３７６号明細書に記載された、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に由来するＫＡＲＩをコードする配列である。
Ｐｆ５．ＩｌｖＣコード領域を、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドンに基づいて、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ；配列番号１３２）によって合成した。
ｐＹＺ０９０の作成
ｐＹＺ０９０（配列番号１）は、ｐＨＲ８１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．８７５４１）骨格をベースとし、ＡＬＳの発現のために、酵母ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ ２〜４４９）、続いてＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ ２１８１〜２４３０）から発現される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するａｌｓＳ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置４５７〜２１７２）を有するキメラ遺伝子、およびＫＡＲＩの発現のために、酵母ＩＬＶ５プロモーター（２４３３〜３６２６）、続いてＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ ４６８２〜５３０４）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に由来するｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（ｎｔ ３６３４〜４６５６）を有するキメラ遺伝子を含むように作成される。
ｐＹＺ０６７の作成
ｐＹＺ０６７を、以下のキメラ遺伝子：１）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）の発現のために、酵母ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ １１６１〜２２５０）、続いてＦＢＡターミネーター（ｎｔ ４００５〜４３１７）から発現されるミュータンス連鎖球菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９に由来するｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置２２６０〜３９７１）、２）アルコールデヒドロゲナーゼの発現のために、酵母ＧＰＭプロモーター（ｎｔ ５８１９〜６５７５）、続いてＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ ４３５６〜４６７１）から発現されるウマ肝臓ＡＤＨのためのコード領域（ｎｔ ４６８０〜５８０７）、および３）ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現のために、酵母ＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ ８８３０〜９４９３）、続いてＴＤＨ３ターミネーター（ｎｔ ５６８２〜７１６１）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に由来するＫｉｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ ７１７５〜８８２１）を含むように作成した。
ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡおよびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ｂｕｄＣ＋ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８の作成
ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡおよびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ｂｕｄＣ＋ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８の作成が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示する。以下の実施例は、原料としてのトウモロコシおよびトウモロコシ脂質の酵素加水分解から得られるＩＳＰＲ抽出剤としてのＣＯＦＡを含むが、本発明から逸脱せずに、他のバイオマス源を、原料およびバイオマス油の酵素加水分解に使用することができることを理解されたい。
本明細書において使用される際、使用される略語の意味は以下のとおりであった：「ｇ」はグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ／Ｌ」はミリリットル／リットルを意味し、「ｍＬ／分」はミリリットル／分を意味し、「ＤＩ」は脱イオン化されていることを意味し、「ｕＭ」はマイクロメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／体積を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎＭの波長における光学密度を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥菌体重量を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「℃／分」は摂氏温度／分を意味し、「ｓｌｐｍ」は標準リットル／分を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ｐｄｃ」はピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素を意味し、後ろに酵素番号が付く。
一般的な方法
シードフラスコ増殖（Ｓｅｅｄ Ｆｌａｓｋ Ｇｒｏｗｔｈ）
ｐｄｃ１が欠損した、ｐｄｃ５が欠損した、およびｐｄｃ６が欠損した、炭水化物源からイソブタノールを生成するように改変されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、凍結された培地からのシードフラスコ中で０．５５〜１．１ｇ／Ｌ ｄｃｗ（ＯＤ６００ １．３〜２．６−Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｌｉｏｓ α Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）まで増殖させた。培地を、３００ｒｐｍで回転する培養器中、２６℃で増殖させた。凍結した培地を−８０℃で予め貯蔵した。第１のシードフラスコ培地の組成は以下のとおりであった：
３．０ｇ／Ｌのデキストロース
３．０ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）。
第１のシードフラスコ培地からの１２ミリリットルを、２Ｌのフラスコに移し、３００ｒｐｍで回転する培養器中、３０℃で増殖させた。第２のシードフラスコは、２２０ｍＬの以下の培地を有する：
３０．０ｇ／Ｌのデキストロース
５．０ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）
ｐＨ５．５〜６．０に滴定された０．２ＭのＭＥＳ緩衝液。
培地を、０．５５〜１．１ｇ／Ｌ ｄｃｗ（ＯＤ６００ １．３〜２．６）で増殖させた。２００ｇ／Ｌのペプトンおよび１００ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有するさらなる３０ｍＬの溶液を、この細胞濃縮物に加えた。次に、さらなる３００ｍＬの０．２ｕＭのろ過滅菌されたＣｏｇｎｉｓ、９０〜９５％のオレイルアルコールをフラスコに加えた。４ｇ／Ｌ ｄｃｗ超（ＯＤ６００＞１０）まで培地を増殖させ続けてから、採取し、発酵に加えた。
発酵の調製
初期の発酵槽の調製
ガラスの被覆された２Ｌの発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、家庭用水を、６６％の液化重量になるまで投入した。ｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｅａｓｙｆｅｒｍ Ｐｌｕｓ Ｋ８、部品番号：２３８６２７、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＤＣＵ−３ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｗｅｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎメニューによって較正した。ｐＨ＝７でゼロ較正を行った。ｐＨ＝４でスパン較正を行った。次に、プローブを、ステンレス鋼のヘッドプレートを通して発酵槽に入れた。溶解された酸素プローブ（ｐＯ２プローブ）も、ヘッドプレートを通して発酵槽に入れた。栄養、シード培地、抽出溶媒、および基剤を送達するのに使用される管をヘッドプレートに取り付け、端部に箔を被せた（ｆｏｉｌ）。発酵槽全体をＳｔｅｒｉｓ（Ｓｔｅｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）オートクレーブに入れ、液体サイクル中で３０分間滅菌した。
発酵槽をオートクレーブから取り出し、ロードセル上に設置した。ジャケット水供給および戻り配管を、それぞれ家庭用水および排水管（ｃｌｅａｎ ｄｒａｉｎ）に連結した。流入水および流出水の配管を冷却する凝縮器を、７℃で運転される６Ｌの再循環温度浴に連結した。発酵槽からのガスを移送する通気管路を、Ｔｈｅｒｍｏ質量分析計（Ｐｒｉｍａ ｄＢ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に連結された移送管路に連結した。スパージャ管路をガス供給管路に連結した。栄養、抽出溶媒、シード培地、および基剤を加えるための管を、ポンプを通して配管し（ｐｌｕｍｂ）、またはしっかりと固定した。
発酵槽温度を、熱電対および家庭用水循環ループを用いて５５℃に制御した。湿潤したトウモロコシの実（＃２イエローデント）を、１．０ｍｍのふるいを備えたハンマーミルを用いて磨砕し、次に、得られた、磨砕された全粒トウモロコシの実を、２９〜３０％（乾燥トウモロコシ固体重量）の液化反応塊の投入量で発酵槽に加えた。
液化前のリパーゼ処理
リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が１０ｐｐｍになるように発酵槽に加えた。発酵槽を、５５℃、３００ｒｐｍ、および０．３ｓｌｐｍのＮ２重層（ｏｖｅｒｌａｙ）で６時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、後述されるように液化を行った（液化）。
液化
滅菌した家庭用Ｎ２をスパージャによって０．３ｓｌｐｍで加えつつ、発酵槽を３００〜１２００ｒｐｍで混合しながら、α−アミラーゼを、その仕様書どおりに発酵槽に加えた。温度設定点を、５５℃から８５℃に変化させた。温度が８０℃を超える場合、液化調理時間を開始し、液化サイクルを、９０〜１２０分間８０℃超に保持した。液化サイクルが完了した後、発酵槽温度設定点を、３０℃の発酵温度に設定した。化学的消泡剤を加えずに発泡を防ぐために、Ｎ２をスパージャからヘッドスペースへと向け直した。
液化後のリパーゼ処理
液化サイクルが完了した後（液化）、発酵槽温度を３０℃の代わりに５５℃に設定した。必要に応じて酸または塩基のボーラス添加を行うことによって、ｐＨをｐＨ＝５．８に手作業で制御した。リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が１０ｐｐｍになるように発酵槽に加えた。発酵槽を、５５℃、３００ｒｐｍ、および０．３ｓｌｐｍのＮ２重層で６時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、発酵槽温度を３０℃に設定した。
リパーゼの熱による失活処理（加熱殺菌処理方法）
発酵槽温度を、１５分間より長く８０℃超に保持して、リパーゼを失活させた。熱による失活処理が完了した後、発酵槽温度を３０℃に設定した。
接種の前の栄養添加
接種の直前にエタノール（６．３６ｍＬ／Ｌ、接種後の体積、２００プルーフ、無水）を発酵槽に加えた。最終濃度が２０ｍｇ／Ｌになるようにチアミンを加え、接種の直前に１００ｍｇ／Ｌのニコチン酸も加えた。
接種の前のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸の添加
接種の直後に１Ｌ／Ｌ（接種後の体積）のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸を加えた。
発酵槽の接種
Ｎ２を発酵槽に加えながら、発酵槽ｐＯ２プローブをゼロに較正した。発酵槽ｐＯ２プローブを、３００ｒｐｍにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。第２のシードフラスコが４ｇ／Ｌ ｄｃｗ超になった後、発酵槽に接種した。振とうフラスコを培養器／振とう器から５分間取り出して、オレイルアルコール相と水相との相分離を可能にした。水相（１１０ｍＬ）を滅菌した接種ボトルに移した。接種材料を、蠕動ポンプを通して発酵槽に注入した。
発酵槽の運転条件
発酵槽を、増殖および生成段階全体について３０℃で運転した。ｐＨを、酸を全く加えずに５．７〜５．９のｐＨから５．２の制御設定点まで低下させた。増殖および生成段階の残りでは、水酸化アンモニウムを用いて、ｐＨをｐＨ＝５．２に制御した。増殖および生成段階の残りでは、無菌の空気を、スパージャを介して、０．３ｓｌｐｍで発酵槽に加えた。ＤＣＵ−３ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂｏｘ ＰＩＤ制御ループによって、撹拌制御のみを用いて、撹拌器を最小で３００ｒｐｍに設定し、最大で２０００ｒｐｍに設定して、ｐＯ２を、３．０％に制御されるように設定した。a−アミラーゼ（グルコアミラーゼ）を加えることによって、液化トウモロコシマッシュの同時糖化発酵によってグルコースを供給した。でんぷんが糖化に利用できる限り、グルコースを過剰（１〜５０ｇ／Ｌ）に保った。
分析
ガスの分析
処理空気を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｉｍａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）質量分析計で分析した。これは、滅菌してから各発酵槽に加えたのと同じ処理空気であった。各発酵槽のオフガスを、同じ質量分析計で分析した。このＴｈｅｒｍｏ Ｐｒｉｍａ ｄＢは、毎週月曜の午前６：００に較正チェックを実行する機能を有する。較正チェックを、質量分析計に関連するＧａｓ Ｗｏｒｋｓ ｖ１．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）ソフトウェアによってスケジューリングした。較正されるガスは以下のとおりであった：
Figure 2013531992
二酸化炭素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて、較正サイクル中５％および１５％でチェックした。酸素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて１５％でチェックした。各発酵槽のオフガスの分析に基づいて、ストリッピングされたイソブタノール、消費された酸素、およびオフガスに吸入された二酸化炭素の量を、質量分析計のモル分率分析および発酵槽に入るガス流量（質量流制御装置）を用いて測定した。１時間当たりのガス速度を計算し、次に、発酵の間のその速度を積分した。
バイオマスの測定
０．０８％のＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ溶液を、１×ＰＢＳによる、ＮａＣｌ（ＶＷＲ ＢＤＨ８７２１−０）中の０．４％のＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅの１：５の希釈液から調製した。１．０ｍＬの試料を、発酵槽から引き抜き、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機管に入れ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，５４１５において、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離の後、上部の溶媒層を、２０〜２００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ２００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて除去した。溶媒と水層との間の層を除去しないように注意した。溶媒層を除去してから、試料を、２７００ｒｐｍに設定されたＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて再懸濁した。
血球計計数のための理想的な濃度を準備するために、一連の希釈が必要とされた。ＯＤが１０であった場合、理想的な量（２０〜３０）の細胞が平方当たり計数されるようにし得る０．５のＯＤを得るために、１：２０の希釈を行い得る。トウモロコシの固体による、希釈の不正確性を低下させるために、カットされた１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を用いた複数回の希釈が必要とされた。先端が詰まるのを防いで開口を広げるために、約１ｃｍを先端からカットした。１：２０の最終的な希釈の場合、発酵試料および０．９％のＮａＣｌ溶液の初期の１：１の希釈液を調製した。次に、前の溶液の１：１の希釈液（すなわち、初期の１：１の希釈液）および０．９％のＮａＣｌ溶液（第２の希釈液）を生成した後、第２の希釈液およびＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ溶液の１：５の希釈液を生成した。試料を各希釈の間にボルテックスし、カットされた先端を０．９％のＮａＣｌおよびＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ溶液に入れてすすいだ。
カバースリップを、血球計（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｌｉｎｅ １４９２）の上部に注意深く入れた。２〜２０μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ２０ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、アリコート（１０μＬ）を、最終的なＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ希釈液から抜き取り、血球計に注入した。血球計を４０倍の倍率のＺｅｉｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ４０顕微鏡に設置した。中央の４分の１（ｃｅｎｔｅｒ ｑｕａｄｒａｎｔ）を２５個の方形に分割し、次に、両方のチャンバーにおける４隅および中央の方形（ｃｅｎｔｅｒ ｓｑｕａｒｅ）を計数し、記録した。両方のチャンバーを計数した後、平均値を取り、希釈係数（２０）を乗算し、次に血球計における中央の４分の１における方形の数の２５を乗算し、次に計数された４分の１の体積である０．０００１ｍＬで除算した。この計算の合計は、ｍＬ当たりの細胞の数である。
水相中の発酵生成物のＬＣ分析
試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、冷蔵から取り出して、室温にした（約１時間）。約３００μＬの試料を、１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ１０００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、０．２ｕｍの遠心分離機フィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標）ＭＦの改造されたナイロン遠心分離機フィルター）に移し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ，５４１５Ｃを用いて、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。約２００μＬのろ過された試料を、ポリマーフィート（ｆｅｅｔ）とともに２５０μＬのガラス容器挿入部（ｉｎｓｅｒｔ）を備えた１．８オートサンプラー容器に移した。ＰＴＦＥ隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をしてから、２７００ｒｐｍに設定されたＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて試料をボルテックスした。
次に、試料を、バイナリアイソクラティックポンプ、真空脱気装置、加熱されたカラム区画、サンプラー冷却システム、ＵＶ ＤＡＤ検出器およびＲＩ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＬＣで実験した。使用されたカラムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｈリフィル、３０Ｘ４．６ガードカラムを備えたＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ，３００ Ｘ ７．８であった。カラム温度は、０．０１Ｎの硫酸の移動相を用いて、０．６ｍＬ／分の流量で４０分間、４０℃であった。結果を表１に示す。
Figure 2013531992
試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、冷蔵から取り出して、室温にした（約１時間）。約１５０μＬの試料を、１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ１０００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、ポリマーフィートとともに２５０μＬのガラス容器挿入部を備えた１．８オートサンプラー容器に移した。ＰＴＦＥ隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をした。
次に、試料を、７６８３Ｂ注入器およびＧ２６１４Ａオートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣで実験した。カラムは、ＨＰ−ＩｎｎｏＷａｘカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍの内径（ＩＤ）、０．２５μｍのフィルム）であった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて４５℃で測定される１．５ｍＬ／分の流量でヘリウムであり；注入器スプリットは、２２５℃で１：５０であり；オーブン温度は、１．５分間４５℃、１０℃／分で０分間、４５℃〜１６０℃、次に２９分間の実行時間について、３５℃／分で１４分間、２３０℃であった。炎イオン化検出を、４０ｍＬ／分のヘリウムメイクアップガスを用いて２６０℃で使用した。結果を表２に示す。
Figure 2013531992
脂肪酸ブチルエステルについて分析される試料を、７６８３Ｂ注入器およびＧ２６１４Ａオートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣで実験した。カラムは、ＨＰ−ＤＢ−ＦＦＡＰカラム（１５メートル×０．５３ｍｍの内径（Ｍｅｇａｂｏｒｅ）、１−ミクロンのフィルム厚さのカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍの内径、０．２５μｍのフィルム）であった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて４５℃で測定される３．７ｍＬ／分の流量でヘリウムであり；注入器スプリットは、２２５℃で１：５０であり；オーブン温度は、２．０分間１００℃、１０℃／分で１００℃〜２５０℃、次に、２６分間の実行時間について、９分間２５０℃であった。炎イオン化検出を、４０ｍＬ／分のヘリウムメイクアップガスを用いて３００℃で使用した。以下のＧＣ標準（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ；Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を用いて、脂肪酸イソブチルエステル生成物：パルミチン酸イソ−ブチル、ステアリン酸イソ−ブチル、オレイン酸イソ−ブチル、リノール酸イソ−ブチル、リノレン酸イソ−ブチル、アラキドン酸イソ−ブチルの属性を確認した。
実施例１〜１４は、権利請求される方法に使用され得る様々な発酵条件を説明する。例として、液化前のリパーゼ処理を行う発酵もあれば、液化後のリパーゼ処理を行う発酵もあった。他の実施例では、発酵に熱による失活処理を行った。発酵の後、有効イソブタノール力価（有効イソ力価）、すなわち、水性体積のリットル当たり生成されるイソブタノールの合計グラムを測定した。結果を表３に示す。
実施例１−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０１４は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例２
実験識別子２０１０Ｙ０１５は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例３
実験識別子２０１０Ｙ０１６は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、エタノールの除外を除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例４
実験識別子２０１０Ｙ０１７は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後の加熱殺菌処理方法、エタノールの除外を除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例５
実験識別子２０１０Ｙ０１８は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後に７．２ｐｐｍのリパーゼを加えたことのみを除いた液化後のリパーゼ処理方法、液化後の加熱殺菌処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例６−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０１９は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後の加熱殺菌処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例７−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０２１は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例８
実験識別子２０１０Ｙ０２２は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例９
実験識別子２０１０Ｙ０２３は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例１０
実験識別子２０１０Ｙ０２４は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例１１
実験識別子２０１０Ｙ０２９は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例１２
実験識別子２０１０Ｙ０３０は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例１３−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０３１は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
実施例１４
実験識別子２０１０Ｙ０３２は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
Figure 2013531992
実施例１５
実験識別子はＧＬＮＯＲ４３２Ａであった。ＮＧＣＩ−０４７（ブタンジオール生成株）を、冷凍した容器からの２５０ｍＬのフラスコ中の２５ｍＬの培地中で、約１のＯＤになるまで増殖させた。プレシード培地を２Ｌのフラスコに移し、１．７〜１．８のＯＤになるまで増殖させた。両方のフラスコのための培地は以下のとおりであった：
３．０ｇ／Ｌのデキストロース
３．０ｇ／Ｌの無水エタノール
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｎｏ．２９１９２０）
１．４ｇ／ＬのＹｅａｓｔ Ｄｒｏｐｏｕｔ Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ Ｙ２００１）
１０ｍＬ／Ｌの１％ ｗ／ｖのＬ−ロイシン原液
２ｍＬ／Ｌの１％ ｗ／ｖのＬ−トリプトファン原液。
１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ発酵槽に、６０ｍＬのシードフラスコを接種した。発酵槽は、７００ｍＬの以下の滅菌培地を含有していた：
２０．０ｇ／Ｌのデキストロース
８．０ｍＬ／Ｌの無水エタノール
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｎｏ．２９１９２０）
２．８ｇ／ＬのＹｅａｓｔ Ｄｒｏｐｏｕｔ Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ Ｙ２００１）
２０ｍＬ／Ｌの１％ ｗ／ｖのＬ−ロイシン原液
４ｍＬ／Ｌの１％ ｗ／ｖのＬ−トリプトファン原液
０．５ｍＬのＳｉｇｍａ ２０４ Ａｎｔｉｆｏａｍ
１：１：：Ｔｗｅｅｎ ８０：エタノール中の０．８ｍＬ／Ｌの１％ ｗ／ｖのＥｒｇｅｓｔｅｒｏｌ溶液。
残りのグルコースを、５０％ ｗ／ｗのグルコース溶液を用いて過剰に保った。発酵槽の溶解酸素濃度を、撹拌制御によって３０％に制御した。ｐＨをｐＨ＝５．５に制御した。発酵槽を、０．３ｓｌｐｍの滅菌した家庭用水でスパージした。温度を３０℃に制御した。
実施例１６
実験識別子はＧＬＮＯＲ４３４Ａであった。この実施例は、接種の前の３ｇのオレイン酸の添加および３ｇのパルミチン酸の添加を除いて実施例１５と同じであった。ＮＧＣＩ−０４７（ブタンジオール生成株）が生体触媒であった。
図６は、脂肪酸を受け入れた発酵槽中で、消費されるグルコースのリットル当たりのグラムがより多かったことを示す。四角形は、オレイン酸およびパルミチン酸を受け入れた発酵槽を表す。丸形は、追加の脂肪酸を全く受け入れなかった発酵槽を表す。
実施例１７
実験識別子はＧＬＮＯＲ４３５Ａであった。この実施例は、ＮＧＣＩ−０４９（イソブタノール生成株）を接種したことを除いて実施例１５と同じであった。
実施例１８
実験識別子はＧＬＮＯＲ４３７Ａであった。この実施例は、ＮＧＣＩ−０４９（イソブタノール生成株）を接種したことを除いて実施例１６と同じであった。
図７は、脂肪酸を受け入れた発酵槽中で、消費されるグルコースのリットル当たりのグラムがより多かったことを示す。四角形は、オレイン酸およびパルミチン酸を受け入れた発酵槽を表す。丸形は、追加の脂肪酸を全く受け入れなかった発酵槽を表す。
実施例１９
実験識別子は０９０４２０＿３２１２であった。この実施例を、ブタノロジェンＮＹＬＡ８４（イソブタノール生成株）を接種したことを除いて実施例１５と同様に実行した。この発酵を、１ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ発酵槽中で実行した。
実施例２０
実験識別子は２００９Ｙ０４７であった。この実施例を、ブタノロジェンＮＹＬＡ８４（イソブタノール生成株）を接種したことを除いて実施例１６と同様に実行した。この発酵を、１ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ発酵において実行した。
図８は、脂肪酸を受け入れた発酵槽中で、消費されるグルコースのリットル当たりのグラムがより多かったことを示す。四角形は、オレイン酸およびパルミチン酸を受け入れた発酵槽を表す。丸形は、追加の脂肪酸を全く受け入れなかった発酵槽を表す。実施例１５〜２０の結果を表４に示し、表４は、脂肪酸の添加の有無、最大光学密度、および消費されるグルコース（ｇ／Ｌ）を示す。
Figure 2013531992
実施例２１
オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のための液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理
実施例１、２、および３において上述したように実行された発酵から取られたブロスおよびオレイルアルコールの試料を、Ｅ．Ｇ．ＢｌｉｇｈおよびＷ．Ｊ．Ｄｙｅｒ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３７：９１１−１７，１９５９、以後、参照文献１）によって記載される方法にしたがって、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析した。３つの発酵のそれぞれについて調製された液化トウモロコシマッシュも、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００ Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（３０重量％の磨砕されたトウモロコシの実を含有する液化反応塊のｋｇ当たり１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質（ＢＣＡタンパク質分析、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））による処理の後、脂質の重量％およびＦＦＡの重量％について分析した。実施例１（対照）の液化トウモロコシマッシュにリパーゼを加えず、リパーゼ（リパーゼの熱による失活なし）で処理された、液化トウモロコシマッシュを含有する実施例２および３に記載される発酵は、エタノールを実施例３に記載される発酵に加えなかったことを除いて同一であった。
実施例２および３に記載されるように実行された発酵のために調製された、リパーゼ処理された液化トウモロコシマッシュのＦＦＡの％は、リパーゼ処理しなかった場合（実施例１）の３１％と比較して、それぞれ８８％および８９％であった。７０時間（実行終了（ＥＯＲ））の時点で、実施例２および３（活性リパーゼを含有する）に記載されるように実行された発酵のＯＡ相中のＦＦＡの濃度は、それぞれ１４％および２０％であり、対応する脂質の増加（トウモロコシ油脂肪酸メチルエステル誘導体として測定される）は、ＧＣ／ＭＳによって、ＯＡによるＣＯＦＡのリパーゼ触媒エステル化に起因することが分かり、その際、液化トウモロコシマッシュ中のトウモロコシ油のリパーゼ触媒加水分解によってＣＯＦＡがまず生成される。結果を表５に示す。
Figure 2013531992
実施例２２
トウモロコシ油遊離脂肪酸のオレイルアルコールエステルの生成を制限するための、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼの熱による失活
水道水（９１８．４ｇ）を、被覆された２Ｌの樹脂ケトルに加え、次に、４７４．６ｇの湿重量（４１７．６ｇの乾燥重量）の磨砕された全粒トウモロコシの実（ハンマーミルにおける１．０ｍｍのふるい）を撹拌しながら加えた。混合物を、３００ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、２Ｎの硫酸を用いてｐＨを５．８に調整した。混合物に０．６７２ｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）−ＦＲＥＤ Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有する１４．０ｇの水溶液を加え、混合物の温度を、６００ｒｐｍで撹拌しながらおよびｐＨ５．８で、８５℃まで上昇させた。８５℃で１２０分後、混合物を５０℃に冷却し、得られた液化トウモロコシマッシュの４５．０ｍＬのアリコートを、５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離機管に移し、−８０℃で冷凍貯蔵した。
第１の反応において、上述したように調製された５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００ Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と、５５℃で６時間混合し、８５℃で１時間のリパーゼの失活を行わず、混合物を３０℃に冷却した。第２の反応において、５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）と、５５℃で６時間混合し、次に１時間にわたって８５℃まで加熱し（リパーゼの失活）、次に３０℃に冷却した。第３の反応において、リパーゼを加えない５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、５５℃で６時間混合し、８５℃で１時間の加熱を行わず、混合物を３０℃に冷却し、３８ｇのオレイルアルコールを加え、得られた混合物を３０℃で７３時間撹拌した。第４の反応において、リパーゼを加えない５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、５５℃で６時間混合し、次に１時間にわたって８５℃まで加熱し、次に３０℃に冷却した。４つの反応混合物のそれぞれを、６時間の時点で採取し、次に、３８ｇのオレイルアルコールを加え、得られた混合物を３０℃で撹拌し、２５時間および７３時間の時点で採取した。参照文献１によって記載される方法にしたがって、試料（液化されたマッシュおよびオレイルアルコール（ＯＡ）の両方）を、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析した。
ＯＡ添加の前にリパーゼの熱による失活を伴って実行された第２の反応のＯＡ相中のＦＦＡの％は、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼを熱により失活させなかった場合（第１の反応）の、２５時間および７３時間の時点におけるわずか４０％のＦＦＡおよび２１％のＦＦＡと比較して、２５時間で９９％および７３時間で９５％であった。リパーゼを加えない２つの対照反応においてＦＦＡの％の大きな変化は観察されなかった。結果を表６に示す。
Figure 2013531992
実施例２３
オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のためのリパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼの熱による失活
３つの発酵を、実施例４、５、および６において上述したように実行した。実施例４および６の液化トウモロコシマッシュには、発酵前にリパーゼを加えず、実施例５に記載される発酵における液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理（７．２ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質を用いて）の直後に、熱による失活処理（リパーゼを完全に失活させるため）を行い、その後、接種の前の栄養添加および発酵を行った。実施例４および６に記載されるように実行された発酵のためにリパーゼ処理なしで調製された液化トウモロコシマッシュのＦＦＡの％は、リパーゼ処理を伴う場合（実施例５）の８９％と比較して、それぞれ３１％および３４％であった。表１０に列挙される発酵の間、ＯＡ相中のＦＦＡの濃度は、熱により失活したリパーゼを含有するものを含む３つの発酵のいずれにおいても低下しなかった。実施例５（発酵前にリパーゼの熱による失活を伴う）にしたがって実行された発酵のＯＡ相中のＦＦＡの％は、液化トウモロコシマッシュをリパーゼで処理しなかった残りの２つの発酵（実施例４および６）についてのわずか３３％のＦＦＡと比較して、７０時間（実行終了（ＥＯＲ））の時点で９５％であった。結果を表７に示す。
Figure 2013531992
実施例２４
液化の前の磨砕された全粒トウモロコシの実のリパーゼ処理
水道水（１３７７．６ｇ）を、２つの被覆された２Ｌの樹脂ケトルのそれぞれに加え、次に、７１１．９ｇの湿重量（６２５．８ｇの乾燥重量）の磨砕された全粒トウモロコシの実（ハンマーミルにおける１．０ｍｍのふるい）を、撹拌しながら各ケトルに加えた。各混合物を、３００ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、２Ｎの硫酸を用いてｐＨを５．８に調整した。各混合物に、１．００８ｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）−ＦＲＥＤ Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有する２１．０ｇの水溶液を加えた。次に、１つの混合物に、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ溶液（２１ｍｇの全可溶性タンパク質、１０ｐｐｍのリパーゼ最終濃度）の１０．５ｍＬの水溶液を加え、第２の混合物に、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ溶液（２．１ｍｇの全可溶性タンパク質、１．０ｐｐｍのリパーゼ最終濃度）の１．０５ｍＬの水溶液を加えた。５５℃で１時間、２時間、４時間および６時間の時点で試料を各反応混合物から抜き取り、次に、混合物の温度を、６００ｒｐｍで撹拌しながら、ｐＨ５．８で８５℃まで上昇させ、混合物が最初に８５℃に達したときに試料を採取した。８５℃で１２０時間後、試料を採取し、混合物を５０℃に冷却し、得られた液化トウモロコシマッシュの最終的な試料を５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離機管に移し；全ての試料を−８０℃で冷凍貯蔵した。
２つの別個の反応において、上述したように調製された、１０ｐｐｍのリパーゼで処理される液化トウモロコシマッシュの５０ｇの試料または１．０ｐｐｍのリパーゼで処理される液化トウモロコシマッシュの５５ｇの試料を、オレイルアルコール（ＯＡ）（３８ｇ）と、３０℃で２０時間混合し、次に、各反応混合物中の液化されたマッシュおよびＯＡを遠心分離によって分離し、参照文献１によって記載される方法にしたがって、各相を、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析した。液化中の１０ｐｐｍのリパーゼの熱による失活を用いて調製された、液化されたマッシュ／ＯＡ混合物のＯＡ相中のＦＦＡの％は、液化中の１．０ｐｐｍのリパーゼの熱による失活を用いて調製された、液化されたマッシュ／ＯＡ混合物のＯＡ相中のわずか６２％のＦＦＡと比較して、２０時間で９８％であった。結果を表８に示す。
Figure 2013531992
実施例２５
液化の前の磨砕された全粒トウモロコシの実の処理のためのリパーゼのスクリーニング
ｐＨ５．８で水道水（６７．９ｇ）および磨砕された全粒トウモロコシの実（３５．１ｇの湿重量、ハンマーミルを用いて１．０ｍｍのふるいで磨砕されたもの）を含有する７つの反応混合物を、栓をしたフラスコ中で５５℃で撹拌した。３ｍＬの試料（ｔ＝０時間）を、各フラスコから取り出し、試料をドライアイスですぐに凍結させ、次に、以下のリパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）：Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００ Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）２０００Ｔ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＡ Ｌ、およびＰａｌａｔａｓｅ ２００００Ｌのうちの１つの１ｍｇの全可溶性タンパク質（反応混合物中１０ｐｐｍの最終濃度）を含有する約０．５ｍＬの１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を、各フラスコのうちの１つに加え；７つ目のフラスコにはリパーゼを加えなかった。得られた混合物を、栓をしたフラスコ中で５５℃で撹拌し、３ｍＬの試料を、１時間、２時間、４時間および６時間の時点で各反応混合物から引き抜き、参照文献１によって記載される方法にしたがって、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析するまで、ドライアイスですぐに凍結させ、遊離脂肪酸含量のパーセントを、脂質および遊離脂肪酸を合わせた全濃度に対して計算し、各試料について測定した。結果を表９に示す。
Figure 2013531992
実施例２６
オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵の前の磨砕された全粒トウモロコシの実のリパーゼ処理
３つの発酵を、実施例７、８、および１０に上述したように実行した。実施例７および１０に記載されるように実行された発酵では、リパーゼ（１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質）を、磨砕トウモロコシの懸濁液に加え、液化の前に５５℃で６時間加熱して、熱により失活したリパーゼを含有する液化トウモロコシマッシュを生成した。実施例８に記載される発酵のための液化トウモロコシマッシュを調製するのに使用される磨砕トウモロコシの懸濁液にはリパーゼを加えなかったが、この懸濁液に、液化の前に５５℃における同じ加熱工程を行った。実施例７および１０に記載されるように実行された発酵のために調製された、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のＦＦＡの％は、リパーゼ処理を行わない場合（実施例８）の４１％と比較して、それぞれ８３％および８６％であった。発酵の間、ＦＦＡの濃度は、熱により失活したリパーゼを含有するものを含む発酵のいずれにおいても低下しなかった。実施例７および１０（発酵の前にリパーゼの熱による失活を伴う）にしたがって実行された発酵のＯＡ相中のＦＦＡの％は、磨砕された全粒トウモロコシの実を液化の前にリパーゼで処理しなかった実施例８にしたがって実行された発酵についてのわずか４９％のＦＦＡと比較して、７０時間（実行終了（ＥＯＲ））の時点で９７％であった。結果を表１０に示す。
Figure 2013531992
実施例２７
トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）を用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のための磨砕された全粒トウモロコシの実または液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理
５つの発酵を、実施例９、１１、１２、１３、および１４に上述したように実行した。実施例９、１３、および１４に記載されるように実行された発酵では、リパーゼ（１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質）を液化後に加え、リパーゼの熱による失活は行わなかった。実施例９および１４に記載されるように実行された発酵には、接種の前に５ｇ／Ｌのエタノールが加えられた一方、実施例１３に記載されるように実行された発酵にはエタノールが加えられなかった。実施例１１および１２に記載されるように実行された発酵は、液化の前の磨砕トウモロコシの懸濁液への１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質の添加を用いて、液化中にリパーゼを熱により失活させた。実施例１１に記載されるように実行された発酵には、接種の前に５ｇ／Ｌのエタノールが加えられた一方、実施例１２に記載されるように実行された発酵には、エタノールが加えられなかった。活性リパーゼを含有する発酵のＣＯＦＡ相中に存在するイソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）の最終的な合計グラムは、不活性なリパーゼを含有する発酵のＣＯＦＡ相中に存在するｉ−ＢｕＯＨの最終的な合計グラムよりかなり多かった。活性リパーゼを含有する発酵ブロス中に存在するイソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）の最終的な合計グラムは、不活性なリパーゼを含有する発酵ブロス中に存在するｉ−ＢｕＯＨの最終的な合計グラムより若干少なく、それによって、ｉ−ＢｕＯＨ（遊離ｉ−ＢｕＯＨおよびＣＯＦＡのイソブチルエステル（ＦＡＢＥ）の組合せとして）の全体の生成が、熱により失活したリパーゼの存在下で得られるものと比較して、活性リパーゼの存在下でかなり多かった。結果を表１１および１２に示す。
Figure 2013531992
Figure 2013531992
本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。

Claims (32)

  1. （ａ）発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供する工程であって、前記組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と；
    （ｂ）前記発酵ブロスを発酵性炭素源と接触させ、それによって、前記組み換え微生物が前記発酵性炭素源を消費し、前記生成物アルコールを生成する工程と；
    （ｃ）前記発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸と前記発酵ブロスを接触させる工程であって、前記脂肪酸の存在下での前記組み換え微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、前記脂肪酸がない場合の前記組み換え微生物の前記増殖速度および／または前記発酵性炭素消費より高い工程と
    を含む方法。
  2. 前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. バイオマスが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生成物アルコールがブタノールである、請求項１に記載の方法。
  5. 工程（ｂ）および（ｃ）がほぼ同時に行われる、請求項１に記載の方法。
  6. 前記発酵性炭素源が前記バイオマスに由来する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記発酵ブロスが、エタノールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記組み換え微生物が、１つまたはそれ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子欠失を有する、請求項１に記載の方法。
  9. 生成物アルコールを生成するための方法であって：
    （ａ）発酵性炭素源および油を含むバイオマスを提供する工程と；
    （ｂ）前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化して、前記脂肪酸を含むバイオマスを形成する工程と；
    （ｃ）発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスと前記バイオマスを接触させる工程であって、前記組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と；
    （ｄ）前記脂肪酸を前記発酵ブロスと接触させる工程であって、前記脂肪酸の存在下での前記組み換え微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、前記脂肪酸がない場合の前記組み換え微生物の前記増殖速度および／または前記発酵性炭素消費より高い工程と
    を含む方法。
  10. 前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する前記工程（ｂ）が、前記油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な１種またはそれ以上の物質と前記油を接触させる工程を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記１種またはそれ以上の物質が１種またはそれ以上の酵素を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記１種またはそれ以上の酵素がリパーゼ酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 工程（ｃ）の前に、前記油の少なくとも一部が加水分解された後、前記１種またはそれ以上の酵素を不活化させる工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 工程（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のうちの１つまたはそれ以上が前記発酵槽中で行われる、請求項９に記載の方法。
  15. 工程（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のうちの１つまたはそれ以上がほぼ同時に行われる、請求項９に記載の方法。
  16. バイオマスが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する、請求項９に記載の方法。
  17. 前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択される、請求項９に記載の方法。
  18. 前記発酵性炭素源を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  19. 前記生成物アルコールがブタノールである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記発酵ブロスが、エタノールをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  21. 前記組み換え微生物が、１つまたはそれ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子欠失を有する、請求項９に記載の方法。
  22. 前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する前記工程（ｂ）の前に、前記バイオマスから前記油を分離する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  23. 前記バイオマスを液化して、液化バイオマスを生成する工程であって、前記液化バイオマスがオリゴ糖を含む工程と；
    オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と前記液化バイオマスを接触させて、糖化されたバイオマスを形成する工程とをさらに含み、
    工程（ｃ）が、前記糖化されたバイオマスを、組み換え微生物を含む前記発酵ブロスと接触させる工程を含む、請求項９に記載の方法。
  24. 生成物アルコールを生成するための方法であって：
    （ａ）原料を提供する工程と；
    （ｂ）前記原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と；
    （ｃ）前記原料スラリーを分離して、（ｉ）発酵性炭素源を含む水層、（ｉｉ）油層、および（ｉｉｉ）固体層を含む生成物を生成する工程と；
    （ｄ）前記油層から油を得て、前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程と；
    （ｅ）（ｃ）の前記水層を、発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを含む発酵槽に供給する工程であって、前記組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と；
    （ｆ）前記水層の前記発酵性炭素源を発酵させて、前記生成物アルコールを生成する工程と；
    （ｇ）前記発酵ブロスを前記脂肪酸と接触させる工程であって、前記脂肪酸の存在下での前記組み換え微生物の（ｉ）増殖速度および（ｉｉ）発酵性炭素消費の少なくとも一方が、前記脂肪酸がない場合の前記組み換え微生物の前記増殖速度および／または前記発酵性炭素消費より高い工程と
    を含む方法。
  25. 前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する前記工程（ｄ）が、前記油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な１種またはそれ以上の物質と前記油を接触させる工程を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記１種またはそれ以上の物質が１種またはそれ以上の酵素を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記１種またはそれ以上の酵素がリパーゼ酵素を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 原料が、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する１種またはそれ以上の発酵性糖を含む、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択される、請求項２４に記載の方法。
  30. 前記生成物アルコールがブタノールである、請求項１８に記載の方法。
  31. 前記組み換え微生物が、１つまたはそれ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子欠失を有する、請求項２４に記載の方法。
  32. ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む組み換え微生物と、脂肪酸とを含む組成物。
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