MX2012014551A

MX2012014551A - Suplementacion de acidos grasos para mejorar la productividad de alcohol.

Info

Publication number: MX2012014551A
Application number: MX2012014551A
Authority: MX
Inventors: Robert Dicosimo; Michael Charles Grady; Ranjan Patnaik; Keith H Burlew
Original assignee: Butamax Tm Advanced Biofuels
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-02-07
Also published as: WO2011159991A1; PH12012502488A1; AU2011268169A2; WO2011160030A2; NZ603659A; BR112012032166A2; EP2582826A2; WO2011159998A3; CA2801498A1; CA2801209A1; CN102947456A; NZ603467A; AU2011268169A1; JP2013533742A; EP2582827A2; MX2012014683A; AU2011268201A1; CN103003436A; BR112012032352A2; KR20130087014A

Abstract

Los ácidos grasos derivados de biomasa en una etapa de un proceso de fermentación pueden añadirse a un medio de fermentación que comprende un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol. Al menos uno de estos factores, el índice de crecimiento o el consumo de carbono fermentable del microorganismo, es mayor en presencia de los ácidos grasos que el índice de crecimiento y el consumo de carbono fermentable del microorganismo en ausencia de los ácidos grasos. La adición de ácidos grasos puede aumentar el consumo de glucosa y mejorar la producción de biomasa (crecimiento celular/densidad) y el índice de crecimiento del microorganismo, a fin de reducir el tiempo de producción y aumentar la productividad del proceso de fermentación.

Description

SUPLEMENTACION DE ACIDOS GRASOS PARA MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD DE ALCOHOL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la producción de alcoholes fermentativos, tal como butanol y, particularmente, con los procesos de fermentación de alcohol para lograr una productividad mejorada de alcohol, en donde el crecimiento fermentativo de los microorganismos recombinantes ocurre en presencia de ácidos grasos derivados de biomasa en una etapa del proceso de fermentación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los alcoholes tienen diversas aplicaciones en la industria y la ciencia, tales como bebidas (es decir, -etanol) , combustibles, reactivos, solventes y antisépticos. Por ejemplo, el butanol es un alcohol que es una sustancia química industrial importante con una variedad · de aplicaciones, que incluyen el uso como aditivo para combustible, como . sustancia química usada como materia prima en la industria de plásticos y como agente extractante de grado alimenticio en la industria de alimentos y saborizantes . Consecuentemente, existe una alta demanda de alcoholes, tal como butanol, así como de métodos de producción más eficientes y que no dañen el medioambiente .

REF. : 237084 La producción de alcohol, tal como butanol, mediante la fermentación por microorganismos es un método de producción que no daña el medio ambiente. Los microorganismos, tales como las levaduras, se han usado para la producción de productos de alcohol, en donde se usa piruvato producido naturalmente como sustrato inicial en las rutas biosintéticas. El butanol puede producirse biológicamente como un subproducto de la fermentación de la levadura, pero el rendimiento es, típicamente, muy bajo. A fin de mejorar la producción de los productos deseados, tal como butanol, las levaduras han sido modificadas para expresar enzimas que alteran las rutas biosintéticas endógenas o introducir nuevas rutas, y/o interrumpir la expresión de enzimas endógenas para alterar el flujo de metabolitos. Las rutas introducidas que usan piruvato celular como ^sustrato incluyen rutas, por ejemplo, para la producción de isómeros de butanol. La interrupción de piruvato descarboxilasa se ha usado para aumentar la disponibilidad de piruvato para las rutas que producen los productos deseados, tal como butanol. Adicionalmente, se han descrito los huéspedes de producción microbiana recombinantes que expresan una ruta biosintética de 1-butanol (publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2008/0182308A1) , una ruta biosintética de 2-butanol (publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núms. 2007/0259410A1 y 2007/0292927) y una ruta biosintética de isobutanol (publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0092957) .

Por ejemplo, la levadura Saccharomyces cerevisiae puede modificarse metabólicamente con mutaciones interruptoras en los dos genes primarios de la piruvato descarboxilasa (PDC, por sus siglas en inglés) . Estos genes, comúnmente denominados PDC1 y PDC5, producen enzimas que están directamente relacionadas con la producción de etanol y la interrupción de estos genes tiene un impacto negativo en el crecimiento. La eliminación de la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa (ADH, por sus siglas en inglés) altera la ruta biosintética, lo que ocasiona una menor producción de ácidos grasos. Los ácidos grasos son necesarios para la formación de la pared celular y, por lo tanto, para el crecimiento celular. La importancia de los ácidos grasos para el crecimiento celular se demuestra, por ejemplo, en Otoguro, et al., (J. Biochem. 89:523-529, 1981), que describe el efecto del antibiótico cerulenina, un conocido inhibidor de la síntesis de ácidos grasos, en el crecimiento celular. Se añadió cerulenina a un cultivo de S. cerevisiae que provocó la inhibición del crecimiento, pero este se restableció al añadir ácido oleico con ciertos ácidos grasos saturados (específicamente, ácido mirístico, ácido palmítico o ácido pentadecanoico) .

El metabolismo de la glucosa en la levadura sigue, generalmente, una ruta de conversión de la glucosa en piruvato, en acetil-CoA, en masa celular. Consecuentemente, puede existir la conversión del piruvato en acetaldehido, en etanol, o una conversión de acetaldehido en acetil-CoA, en la síntesis de ácidos grasos. Respecto de los microorganismos recombinantes, una única supresión de PDC reduce el crecimiento máximo pero en una medida mucho menor. Cuando solo se interrumpe un gen PDC, el otro gen PDC está lo suficientemente activo para permitir el flujo de carbono a acetaldehido y, posteriormente, etanol y acetato. Sin embargo, cuando se desea un producto de butanol, la producción de etanol reduce el rendimiento del producto de butanol en el sustrato. Los genes PDC son responsables de convertir el piruvato en acetaldehido, y la mutación doble de PDCl y PDC5 evita la producción de acetaldehido, para alterar así la ruta a la biosíntesis de ácidos grasos y, por lo tanto, inhibir el crecimiento celular.

Por lo tanto, existe una necesidad continua de métodos para la producción de alcoholes fermentativos mediante el uso de microorganismos recombinantes, en donde el índice de crecimiento y/o la producción de biomasa de los microorganismos puedan mejorarse a pesar de la reducción o eliminación de la biosíntesis de ácidos grasos por el microorganismo. La presente invención proporciona otras ventajas relacionadas, como resultará evidente en la descripción de las modalidades que se incluyen a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método que comprende: (a) proporcionar un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable, en donde el microorganismo recombinante comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa; (b) poner en contacto el caldo de fermentación con una fuente de carbono fermentable, para que el microorganismo recombinante consuma la fuente de carbono fermentable y produzca el producto de alcohol; y (c) poner en contacto el caldo de fermentación con ácidos grasos derivados de biomasa en una etapa del proceso de fermentación, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento o (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante es mayor en presencia de los ácidos grasos que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante en ausencia de los ácidos grasos. En una modalidad adicional, las etapas (b) y (c) ocurren, prácticamente, simultáneamente. En una modalidad, los ácidos grasos se seleccionan de ácido oleico, ácido palmítico, ácido mirístico y mezclas de estos y, en otra modalidad, la biomasa se deriva de granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivo, tales como hojas de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto aguja, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, aserrín, matorrales y arbustos, vegetales, frutos, flores, estiércol, y mezclas de estos. En otra modalidad, la fuente de carbono fermentable se deriva de biomasa. En una modalidad, el producto de alcohol es butanol y, en otra modalidad, el caldo de fermentación comprende, además, etanol. En otra modalidad, el microorganismo recombinante tiene una o más supresiones del gen de piruvato descarboxilasa (PDC, por sus siglas en inglés) .

La presente invención se relaciona, además, con un método para producir un producto de alcohol; el método comprende: (a) proporcionar biomasa que comprende una fuente de carbono fermentable y aceite; (b) convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos para formar una biomasa que comprende los ácidos grasos; (c) poner en contacto la biomasa con un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante capaz de producir un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable, y en donde el microorganismo recombinante comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa; (d) poner en contacto los ácidos grasos con el caldo de fermentación, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante es mayor en presencia de los ácidos grasos que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante en ausencia de los ácidos grasos. En otra modalidad, la etapa (b) de convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos comprende poner en contacto el aceite con una o más sustancias capaces de hidrolizar la porción de aceite en ácidos grasos. En una modalidad, la o las sustancias comprenden una o más enzimas y, en otra modalidad, la o las enzimas comprenden enzimas lipasa. En una modalidad adicional, antes de la etapa (c) , la o las enzimas pueden ser inactivadas después de que se hidrolice al menos una porción del aceite. En una modalidad, una o más de las etapas (b) , (c) y (d) ocurren en el recipiente de fermentación y, en otra modalidad, una o más de las etapas (b) , (c) y (d) ocurren, prácticamente, simultáneamente. En una modalidad, el método comprende, además, la etapa de separar el aceite de la biomasa antes de la etapa (b) de convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos. En otra modalidad, el método comprende, además: licuar la biomasa para producir una biomasa licuada, en donde la biomasa licuada comprende oligosacáridos; y poner en contacto la biomasa licuada con una enzima de sacarificación capaz de convertir los oligosacáridos en azúcar fermentable para formar una biomasa sacarificada, y en donde la etapa (c) comprende poner en contacto la biomasa sacarificada con el caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante . En una modalidad, los ácidos grasos se seleccionan de ácido oleico, ácido palmitico, ácido miristico y mezclas de estos y, en otra modalidad, la biomasa se deriva de granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivo, tales como hojas de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto aguja, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, aserrín, matorrales y arbustos, vegetales, frutos, flores, estiércol, y mezclas de estos. En una modalidad, el método comprende, además, la etapa de fermentar una fuente de carbono fermentable para producir el producto de alcohol . En una modalidad, el producto de alcohol es butanol y, en otra modalidad, el caldo de fermentación comprende, además, etanol. En otra modalidad, el microorganismo recombinante tiene una o más supresiones del gen de piruvato descarboxilasa (PDC, por sus siglas en inglés) .

Otro método de la presente invención incluye un método para producir un producto de alcohol; el método comprende: (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima; (c) separar la suspensión de materia prima para producir un producto que comprende (i) una capa acuosa que comprende una fuente de carbono fermentable, (ii) una capa oleosa y (iii) una capa de sólidos; (d) obtener un aceite de la capa oleosa y convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos; (e) introducir la capa acuosa de (c) en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante capaz de producir un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable, en donde el microorganismo recombinante comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa; (f) fermentar la fuente de carbono fermentable de la capa acuosa para producir el producto de alcohol; y (g) poner en contacto el caldo de fermentación con los ácidos grasos, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante es mayor en presencia de ácidos grasos que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante en ausencia de ácidos grasos. En otra modalidad, la etapa (d) de convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos comprende poner en contacto el aceite con una o más sustancias capaces de hidrolizar la porción de aceite en ácidos grasos. En una modalidad, la o las sustancias comprenden una o más enzimas y, en otra modalidad, la o las enzimas comprenden enzimas lipasa. En una modalidad, los ácidos grasos se seleccionan de ácido oleico, ácido palmitico, ácido miristico y mezclas de estos y, en otra modalidad, la biomasa se deriva de granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivo, tales como hojas de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto aguja, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raices, hojas, astillas de madera, aserrín, matorrales y arbustos, vegetales, frutos, flores, estiércol, y mezclas de estos. En una modalidad, el producto de alcohol es butanol. En otra modalidad, el microorganismo recombinante tiene una o más supresiones del gen de piruvato descarboxilasa (PDC, por sus siglas en inglés) .

La presente invención se relaciona, además, con una composición que comprende un microorganismo recombinante, que comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa y ácidos grasos.

Los ácidos grasos (por ejemplo, ácido oleico, ácido palmitico y mezclas de estos) derivados de biomasa en una etapa del proceso de fermentación pueden añadirse en un medio de fermentación que comprende un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol. El microorganismo puede ser levadura u otro microorganismo productor de alcohol. Además, el microorganismo puede tener una o más supresiones del gen PDC y/o una actividad piruvato descarboxilasa reducida o eliminada. La adición de ácidos grasos puede aumentar el consumo de glucosa y mejorar la producción de biomasa (crecimiento celular) y el índice de crecimiento del microorganismo. La mejora en el índice de crecimiento puede reducir el tiempo de producción y, asi, aumentar la productividad del proceso de fermentación de alcohol.

En algunas modalidades, un método para producir un producto de alcohol en un proceso de fermentación incluye (a) proporcionar un caldo de fermentación que incluye un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable; (b) poner en contacto el caldo de fermentación con una fuente de carbono fermentable para que el microorganismo consuma la fuente de carbono fermentable y produzca el producto de alcohol; y (c) poner en contacto el caldo de fermentación con ácidos grasos derivados de biomasa en una etapa del proceso de fermentación, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo sea mayor en presencia de ácidos grasos que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo en ausencia de ácidos grasos.

En algunas modalidades, los ácidos grasos son ácidos grasos libres (FFA, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, los ácidos grasos incluyen ácido oleico. En algunas modalidades, los ácidos grasos incluyen ácidos grasos saturados. En algunas modalidades, los ácidos grasos incluyen ácido palmitico. En algunas modalidades, los ácidos grasos incluyen ácido mirístico.

En algunas modalidades, el producto de alcohol es butanol .

En algunas modalidades, la fuente de carbono fermentable se deriva de biomasa. En algunas modalidades, la biomasa incluye maíz y los ácidos grasos son ácidos grasos de aceite de maíz.

En algunas modalidades, el caldo de fermentación incluye, además, etanol. En algunas modalidades, el método incluye, además, poner en contacto el caldo de fermentación con etanol.

En algunas modalidades, la etapa de poner en contacto el caldo de fermentación con ácidos grasos incluye poner en contacto triglicéridos derivados de biomasa con una o más enzimas capaces de hidrolizar triglicéridos en ácidos grasos libres, para que los triglicéridos se hidrolicen en ácidos grasos libres; y poner en contacto el caldo de' fermentación con los ácidos grasos libres, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo sea mayor en presencia de los ácidos grasos libres que en ausencia de estos. En algunas modalidades, la o las enzimas incluyen enzimas lipasa.

En algunas modalidades, el microorganismo recombinante presenta una sola supresión del gen de piruvato descarboxilasa (PDC, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, el microorganismo recombinante presenta una supresión doble del gen PDC. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante tiene una actividad piruvato descarboxilasa reducida o eliminada.

En algunas modalidades, la concentración de ácidos grasos en el caldo de fermentación no es mayor que aproximadamente 0.8 g/1.

En algunas modalidades, un método para producir un producto de alcohol a partir de la biomasa de fermentación incluye: (a) proporcionar una corriente de alimentación de biomasa acuosa que incluye agua, fuente de carbono fermentable y una cantidad de aceite, en donde la fuente de carbono fermentable y el aceite se derivan de la biomasa; (b) hidrolizar al menos una porción del aceite en ácidos grasos libres para formar una corriente de alimentación de biomasa que incluye los ácidos grasos libres; (c) poner en contacto el medio de fermentación con la corriente de alimentación de biomasa en un recipiente de fermentación; el medio de fermentación incluye un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol; y (d) fermentar la fuente de carbono fermentable en el recipiente de fermentación para producir el producto de alcohol, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo sea mayor en presencia de los ácidos grasos libres que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo en ausencia de los ácidos grasos libres.

En algunas modalidades, la etapa (b) de hidrolizar al menos una porción del aceite en ácidos grasos libres incluye poner en contacto el aceite con una composición que incluye una o más enzimas capaces de hidrolizar la porción de aceite en ácidos grasos libres. En algunas modalidades, el método comprende, además, antes de la etapa (c) , inactivar la o las enzimas después de hidrolizar al menos una porción del aceite .

En algunas modalidades, la corriente de alimentación de biomasa acuosa es una pasta licuada formada a partir de un grano molido no fraccionado. En algunas modalidades, el grano molido no fraccionado es maíz y el aceite es aceite de maíz.

En algunas modalidades, un método para producir un producto de alcohol incluye (a) proporcionar biomasa que incluye glucosa y aceite, que incluye una cantidad de triglicéridos ; (b) poner en contacto el aceite con una composición que incluye una o más sustancias capaces de convertir los triglicéridos en ácidos grasos libres, para que al menos una porción de los triglicéridos en el aceite se conviertan en ácidos grasos libres; (c) poner en contacto la biomasa con un caldo de fermentación que incluye un microorganismo capaz de convertir la glucosa en un producto de alcohol, para producir un producto de alcohol; y (d) poner en contacto los ácidos grasos libres con el caldo de fermentación, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de glucosa del microorganismo es mayor en presencia de los ácidos grasos libres que el índice de crecimiento y/o el consumo de glucosa del microorganismo en ausencia de los ácidos grasos libres.

En algunas modalidades, el método comprende, además, separar el aceite de (a) de la biomasa antes de la etapa (b) de poner en contacto el aceite con una o más sustancias.

En algunas modalidades, la etapa (b) de poner en contacto el aceite con una composición que incluye una o más sustancias incluye poner en contacto el aceite con uno o más catalizadores capaces de hidrolizar triglicéridos en ácidos grasos libres.

En algunas modalidades, la etapa (b) de poner en contacto el aceite con una composición que incluye una o más sustancias incluye poner en contacto el aceite con uno o más reactantes o solventes capaces de hacer reaccionar químicamente los triglicéridos para obtener un producto de reacción que incluye los ácidos grasos libres.

En algunas modalidades, un método para producir butanol incluye (a) proporcionar biomasa, que incluye almidón y aceite, en donde el aceite incluye una cantidad de glicéridos; (b) licuar la biomasa para producir una biomasa licuada, en donde la biomasa licuada incluye oligosacáridos hidrolizados a partir de almidón; (c) poner en contacto la biomasa de la etapa (a) o la biomasa licuada de la etapa (b) con una composición que incluye una o más enzimas capaces de convertir los glicéridos en ácidos grasos libres, para que al menos una porción de los glicéridos en el aceite se conviertan en ácidos grasos libres; (d) poner en contacto la biomasa licuada con una enzima de sacarificación capaz de convertir los oligosacáridos en azúcar fermentable, que incluye glucosa monomérica; (e) poner en contacto la biomasa licuada con un microorganismo recombinante capaz de convertir el azúcar fermentable en butanol para producir butanol; y (f) poner en contacto los ácidos grasos libres con el microorganismo recombinante, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de glucosa del microorganismo recombinante es mayor en presencia de los ácidos grasos libres que el índice de crecimiento y/o el consumo de glucosa del microorganismo recombinante en ausencia de los ácidos grasos libres.

En algunas modalidades, un proceso de fermentación para producir un producto de alcohol a partir de materia prima incluye: (a) licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima; (b) centrifugar la suspensión de materia prima para producir un producto de centrifugado que incluye (i) una capa acuosa que incluye glucosa, (ii) una capa oleosa que incluye glicéridos y (iii) una capa de sólidos; (c) hidrolizar al menos una porción de los glicéridos en ácidos grasos libres; (d) introducir la capa acuosa de (b) en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación que incluye un microorganismo recombinante capaz de producir un producto de alcohol a partir de glucosa; (e) fermentar la glucosa de la capa acuosa para producir el producto de alcohol; y (f) poner en contacto el caldo de fermentación con los ácidos grasos libres, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de glucosa del microorganismo es mayor en presencia de los ácidos grasos libres que el índice de crecimiento y/o el consumo de glucosa del microorganismo en ausencia de los ácidos grasos libres.

En algunas modalidades, el proceso para producir un producto de alcohol a partir de una materia prima incluye, antes de la etapa de hidrolizar los glicéridos, introducir los glicéridos en el recipiente de fermentación.

En algunas modalidades, un proceso de fermentación incluye (a) proporcionar un caldo de fermentación que incluye un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable, una fuente de carbono fermentable, un producto de alcohol y aceite derivado de biomasa, en donde el aceite incluye glicéridos; (b) poner en contacto el caldo de fermentación con un primer agente extractante para formar una mezcla de dos fases, que incluye una fase acuosa y una fase orgánica, en donde el producto de alcohol y el aceite se dividen en la fase orgánica para formar una fase orgánica que contiene el producto de alcohol; (c) separar la fase orgánica que contiene el producto de alcohol de la fase acuosa; (d) separar el producto de alcohol de la fase orgánica para producir una fase orgánica pobre; (e) poner en contacto la fase orgánica pobre con una composición que incluye uno o más catalizadores capaces de hidrolizar los glicéridos en ácidos grasos libres para producir un segundo agente extractante que incluye al menos una porción del primer agente extractante y ácidos grasos libres; y (f) repetir la etapa (b) al poner en contacto el caldo de fermentación con el segundo agente extractante de la etapa (e) , en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo es mayor en presencia de los ácidos grasos libres que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo en ausencia de los ácidos grasos libres.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras adjuntas, que se incorporan en la presente invención y forman parte de la descripción, ilustran la presente invención y, junto con la descripción, sirven, además, para explicar los principios de esta y para permitir que una persona con experiencia en la técnica pertinente realice y use la invención.

La Figura 1 ilustra esquemáticamente un método y un sistema ilustrativos de la presente invención, en donde una biomasa licuada entra en contacto con una o más sustancias para la hidrólisis de lipidos y se introduce en un recipiente de fermentación.

La Figura 2 ilustra esquemáticamente un método y un sistema ilustrativos de la presente invención, en donde una biomasa licuada y sacarificada entra en contacto con una o más sustancias para la hidrólisis de lipidos y se introduce en un recipiente de fermentación.

La Figura 3 ilustra esquemáticamente un método y un sistema ilustrativos de la presente invención, en donde los sólidos y lipidos no disueltos se extraen de una biomasa licuada antes de la fermentación, y en donde los lipidos extraídos se hidrolizan en ácidos grasos libres mediante el uso de una o más sustancias, y los ácidos grasos libres se introducen en un recipiente de fermentación.

La Figura 4 ilustra esquemáticamente un método y un sistema ilustrativos de la presente invención, en donde los lipidos derivados del aceite nativo se hidrolizan en ácidos grasos libres mediante el uso de una o más sustancias, y los ácidos grasos libres se introducen en un recipiente de fermentación .

La Figura 5 ilustra esquemáticamente un método y un sistema ilustrativos de la presente invención, en donde los lipidos de biomasa presentes en un agente extractante que sale de un .recipiente de fermentación se convierten en ácidos grasos libres que se introducen en un recipiente de fermentación .

La Figura 6 es un gráfico que ilustra el efecto que la presencia de ácidos grasos en un recipiente de fermentación tiene en el consumo de glucosa para la cepa de butanologen NGCI-047.

La Figura 7 es un gráfico que ilustra el efecto que la presencia de ácidos grasos en un recipiente de fermentación tiene en el consumo de glucosa para la cepa de butanologen NGCI-049.

La Figura 8 es un gráfico que ilustra el efecto que la presencia de ácidos grasos en un recipiente de fermentación tiene en el consumo de glucosa para la cepa de butanologen NYLA84.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos que se usan en la presente invención tienen el mismo significado como el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de disputa, prevalecerá la presente solicitud junto con las definiciones pertinentes. Además, a menos que se requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Todas las publicaciones, patentes y demás referencias mencionadas en la presente descripción se incorporan totalmente como referencia para todo propósito.

Para definir esta invención aún más, se proporcionan los siguientes términos y definiciones.

Como se usa en la presente descripción, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene" o cualquier variación de estos, implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros mencionados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, un método, un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no se limita, necesariamente, solo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a la composición, mezcla, proceso, método, articulo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente lo contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por. ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual), A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual), y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .

Además, los artículos indefinidos "un (a)" y "unos (as)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias, es decir, ocurrencias del elemento o componente. Por consiguiente," un (a)" o "unos (as) " deben interpretarse para incluir uno o al menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente incluye, además, el plural, a menos que el número, obviamente, indique que es singular.

El término "invención" o "presente invención", tal como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no pretende referirse a cualquier modalidad individual de la invención particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la solicitud.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente", que modifica la cantidad de un ingrediente o reactante empleados en la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos de manejo de líquidos y de medición típicos usados para preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad, el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico informado, alternativamente, dentro del 5 % del valor numérico informado.

"Biomasa", como se usa en la presente descripción, se refiere al producto natural que contiene polisacáridos hidrolizables que proporcionan azúcares fermentables, que incluyen cualquier azúcar y almidón derivado de recursos naturales tales como maíz, caña, trigo, material celulósico o lignocelulósico, y materiales que comprenden celulosa, hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos, disacáridos y/o monosacáridos , y mezclas de estos. La biomasa puede comprender, además, otros componentes tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente. Por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del maíz, o una mezcla de pastos y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita af cultivos bionergéticos , residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación del papel, residuos orgánicos, residuos forestales y de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos, tales como hojas de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, caña de azúcar, paja de arroz, pasto aguja, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, aserrín, matorrales y arbustos, vegetales, frutos, flores, estiércol y mezclas de estos. Por ejemplo, se puede formar pasta, jugo, melazas o hidrolizado a partir de biomasa mediante cualquier proceso conocido en la técnica para procesar la biomasa con fines de fermentación, tales como mediante molienda, tratamiento y/o licuación, y comprende azúcar fermentable y puede comprender agua. Por ejemplo, la biomasa celulósica y/o lignocelulósica puede procesarse para obtener un hidrolizado que contiene azúcares fermentables mediante cualquier método conocido por una persona con experiencia en la técnica. Un pretratamiento con bajo nivel de amoniaco se describe en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0031918A1, que se incorpora como referencia en la presente descripción. La sacarificación enzimática de la biomasa celulósica y/o lignocelulósica típicamente usa un conjunto de enzimas para descomponer la celulosa y la hemicelulosa a fin de producir un hidrolizado que contiene azúcares, que incluyen glucosa, xilosa, y arabinosa. (Las enzimas de sacarificación adecuadas para la biomasa celulósica y/o lignocelulósica se analizan en Lynd, et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:506-577, 2002).

La pasta, el jugo, las melazas o el hidrolizado pueden incluir la materia prima 12 y la suspensión de materia prima 16, tal como se describe en la presente invención. La corriente de alimentación acuosa puede derivarse o formarse a partir de biomasa mediante cualquier proceso conocido en la técnica para procesar la biomasa con fines de fermentación, tales como mediante molienda, tratamiento y/o licuación, y comprende sustrato de carbono fermentable (por ejemplo, azúcar) y puede comprender agua. Una corriente de alimentación acuosa puede incluir materia prima 12 y suspensión de materia prima 16, tal como se describe en la presente invención.

"Froducción de biomasa", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a la producción de biomasa del microorganismo (es decir, producción de biomasa celular o crecimiento celular) , tal como ocurre durante el cultivo de microorganismos antes de la fermentación o durante el crecimiento fermentativo de los microorganismos.

"Materia prima", tal como se usa en la presente descripción, hace referencia a un suministro en un proceso de fermentación; el suministro contiene una fuente de carbono fermentable con o sin sólidos no disueltos y, cuando corresponda, el suministro contiene la fuente de carbono fermentable antes o después de que la fuente de carbono fermentable haya sido liberada del almidón u obtenida de la descomposición de azúcares complejos mediante procesamiento adicional, tales como mediante licuación, sacarificación u otro proceso. La materia prima incluye o se deriva de biomasa. Las materias <primas incluyen, pero no se limitan a, centeno, trigo, maíz, caña, cebada, material celulósico, material lignocelulosico o mezclas de estos.

"Caldo de fermentación", tal como se usa en la presente descripción, significa la mezcla de agua, azúcares, sólidos disueltos, opcionalmente microorganismos gue producen alcohol, producto de alcohol y todos los demás constituyentes del material incluido en el recipiente de fermentación en donde se elabora el producto de alcohol mediante la reacción de azúcares con alcohol, agua y dióxido de carbono (C02) por medio de los microorganismos presentes. Ocasionalmente, como se usa en la presente descripción, el término "medio de fermentación" y "mezcla fermentada" pueden usarse como sinónimos de "caldo de fermentación".

"Fuente de carbono fermentable" o "sustrato de carbono fermentable" , como se usan en la presente descripción, se refieren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada (o "consumida") por los microorganismos descritos en la presente descripción para la producción de alcohol fermentativo. Las fuentes de carbono fermentables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tales como glucosa o fructosa; disacáridos, tales como lactosa o sacarosa; oligosacáridos; polisacáridos, tales como almidón o celulosa; azúcares de C5, tales como xilosa y arabinosa; sustratos de un solo carbono, que incluye metano; y mezclas de estos. El término "consumido (a) ", como se usa en la presente descripción, incluye procesos mediante los cuales los compuestos, por ejemplo, compuestos orgánicos, tal como glucosa, se descomponen por acción de las enzimas de una célula, lo que resulta en la producción de energía que la célula puede usar.

"Azúcar fermentable", como se usa en la presente descripción, se refiere a uno o más azúcares capaces de ser metabolizados (o "consumidos") por los microorganismos descritos en la presente descripción para la producción de alcohol fermentativo.

"Recipiente de fermentación", como se usa en la presente descripción, significa el recipiente en el que se realiza la reacción de fermentación, mediante el cual se elabora el producto de alcohol, tal como butanol, a partir de azúcares.

"Recipiente de licuación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el que se realiza la licuación. La licuación es el proceso en el que los oligosacáridos se liberan de la materia prima. En algunas modalidades en las que la materia prima es maíz, los oligosacáridos se liberan del contenido de almidón de maíz durante la licuación.

"Recipiente de sacarificación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el que se realiza la sacarificación (es decir, la descomposición de oligosacáridos en monosacáridos). En los casos en que la fermentación y la sacarificación ocurren simultáneamente, el recipiente de sacarificación y el recipiente de fermentación pueden ser el mismo.

"Azúcar", como se usa en la presente descripción, se refiere a oligosacáridos, disacáridos, monosacáridos y/o mezclas de estos. El término "sacárido" incluye, además, carbohidratos, que incluyen almidones, dextranos, glucógenos, celulosa, pentosanos, al igual que azúcares.

Como se usa en la presente descripción, "enzima de sacarificación" significa una o más enzimas capaces de hidrolizar polisacáridos y/o oligosacáridos, por ejemplo, enlaces alfa-1, 4-glucosidicos de glucógeno o almidón. Además, las enzimas de sacarificación pueden incluir enzimas capaces de hidrolizar materiales celulósicos o lignocelulósicos .

"Sólidos no disueltos", como se usa en la presente descripción, significa porciones no fermentables de materia prima, por ejemplo, germen, fibra y gluten.

"Producto de alcohol", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier alcohol que puede ser producido por un microorganismo en un proceso de fermentación que usa biomasa como una fuente de sustrato de carbono fermentable. Los productos de alcohol incluyen, pero no se limitan a, alcoholes de alquilo de Ci a C8. En algunas modalidades, los productos de alcohol son alcoholes de alquilo de C2 a C8. En otras modalidades, los productos de alcohol son alcoholes de alquilo de C2 a C5. Se prefiere que los alcoholes de alquilo de Ci a Ce incluyan, pero no se limiten a, metanol, etanol, propanol, butanol y pentanol. Además, los alcoholes de alquilo de C2 a C8 incluyen, pero no se limitan a, etanol, propanol, butanol y pentanol. Además, "alcohol" se usa en la presente descripción con referencia al producto de alcohol.

"Butanol", como se usa en la presente descripción, se refiere específicamente a los isómeros de butanol 1-butanol (1-BuOH), 2-butanol (2-BuOH) , terc-butanol y/o isobutanol (iBuOH O i-BuOH o I-BUOH, también conocido como 2-metil-l-propanol) , individualmente o como mezclas de estos. Ocasionalmente, con referencia a los ésteres de butanol, pueden usarse indistintamente los términos "ésteres de butilo" y "ésteres de butanol".

"Propanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de propanol isopropanol o 1-propanol.

"Pentanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de pentanol 1-pentanol, 3-metil-l-butanol, 2-metil-l-butanol, 2 , 2-dimetil-l-propanol , 3-pentanol, 2-pentanol, 3-metil-2-butanol o 2-metil-2-butanol .

El término "equivalente de alcohol", como se usa en la presente descripción, se refiere al peso del alcohol que se obtendría mediante una hidrólisis perfecta de un éster de alcohol y la posterior recuperación del alcohol de una cantidad de éster de alcohol.

El término "título en fase acuosa", como se usa en presente descripción, se refiere a la concentración de un alcohol particular (por ejemplo, butanol) en el caldo de fermentación .

El término "título efectivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad total de un alcohol particular (por ejemplo, butanol) producido mediante fermentación o equivalente de alcohol del éster de alcohol producido mediante la esterificación del alcohol por litro de medio de fermentación. Por ejemplo, el titulo efectivo del butanol en una unidad de volumen de una fermentación incluye: (i) la cantidad de butanol en el medio de fermentación; (ii) la cantidad de butanol recuperada del agente extractante orgánico; (iii) la cantidad de butanol recuperada de la fase gaseosa, si se usa desgasificación; y (iv) el equivalente de alcohol del éster de butilo en la fase orgánica o en la fase acuosa .

"Extracción de producto in situ (ISPR, por sus siglas en inglés)", como se usa en la presente descripción, significa la extracción selectiva de un producto de fermentación especifico de un proceso biológico, tal como la fermentación, para controlar la concentración del producto en el proceso biológico a medida que se elabora el producto.

"Agente extractante" o "agente extractante ISPR", como se usa en la presente descripción, se refiere a un solvente orgánico usado para extraer cualquier producto de alcohol, tal como butanol, o usado para extraer cualquier éster de producto de alcohol producido por un catalizador a partir de un producto de alcohol y un ácido carboxilico o lipido. Ocasionalmente, como se usa en la presente descripción, el término "solvente" puede usarse como sinónimo de "agente extractante". Para los procesos que se describen en la presente invención, los agentes extractantes son inmiscibles en agua.

Los términos "inmiscible en agua" o "insoluble" se refieren a un componente químico, tal como un agente extractante o solvente, que es incapaz de mezclarse con una solución acuosa, tal como un caldo de fermentación, para formar una sola fase líquida.

El término "fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase acuosa de una mezcla bifásica obtenida al poner en contacto el caldo de fermentación con un agente extractante orgánico inmiscible en agua. En una modalidad de un proceso descrito en la presente invención que incluye extracción por fermentación, el término "caldo de fermentación" se refiere específicamente a la fase acuosa en la extracción por fermentación bifásica.

El término "fase orgánica", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida al poner en contacto un caldo de fermentación con un agente extractante orgánico inmiscible en agua .

El término "ácido graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un ácido carboxílico (por ejemplo, ácido monocarboxílico alifático) con C4 a C2e átomos de carbono (más comúnmente, de C12 a C24 átomos de carbono) , saturados o insaturados. Además, los ácidos grasos pueden ser ramificados o no ramificados. Los ácidos grasos pueden derivarse o estar incluidos en forma esterificada en grasa, aceite o cera animal o vegetal. Los ácidos grasos pueden ocurrir naturalmente en forma de glicéridos en grasas y aceites grasos, o pueden obtenerse mediante hidrólisis de grasas o síntesis. El término "ácido graso" puede describir una única especie química o una mezcla de ácidos grasos. Además, el término "ácido graso" abarca los ácidos grasos libres .

El término "alcohol graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un alcohol con una cadena alifática de C4 a C22 átomos de carbono, saturada o insaturada.

El término "aldehido graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un aldehido con una cadena alifática de C4 a C22 átomos de carbono, saturada o insaturada .

El término "ácido carboxílico", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier compuesto orgánico con la fórmula química general -COOH, en donde un átomo de carbono está unido a un átomo de oxígeno mediante un enlace doble para formar un grupo carbonilo (-C=0) y a un grupo hidroxilo (-0H) mediante un solo enlace. El ácido carboxilico puede estar en forma de un ácido carboxílico protonado, en forma de una sal de un ácido carboxílico (por ejemplo, sal de amonio, sodio o potasio), o como una mezcla de ácido carboxílico protonado y sal de un ácido carboxílico. El término "ácido carboxílico" puede describir una única especie química (por ejemplo, ácido oleico) o una mezcla de ácidos carboxílicos que puede producirse, por ejemplo, mediante la hidrólisis de ésteres de ácidos grasos derivados de biomasa o triglicéridos , diglicéridos , monoglicéridos y fosfolípidos .

"Aceite nativo", como se usa en la presente descripción, se refiere a los lípidos obtenidos de plantas (por ejemplo, biomasa) o animales. "Aceite de origen vegetal", como se usa en la presente descripción, se refiere a los lípidos obtenidos particularmente de plantas. Ocasionalmente, "lípidos" puede usarse como sinónimo de "aceite" y "acilglicéridos" . Los aceites nativos incluyen, pero no se limitan a, sebo, maíz, cañóla, triglicéridos cápricos/caprílicos , ricino, coco, semilla de algodón, pescado, jojoba, lardo, lino, pata de buey, oiticica, palma, cacahuate, colza, arroz, cártamo, soja, girasol, tung, jatrofa y mezclas de aceites vegetales.

El término "separación", como se usa en la presente descripción, es sinónimo de "recuperación" y se refiere a la extracción de un compuesto químico de una mezcla inicial para obtener el compuesto en una mayor pureza o concentración que la pureza o concentración del compuesto en la mezcla inicial.

Como se usa en la presente descripción, "microorganismo recombinante" se refiere a microorganismos tales como bacterias o levadura, que se modifican mediante técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, al modificar una célula huésped para que comprenda una ruta biosintética, tal como una ruta biosintética para producir un alcohol, tal como butanol .

La presente invención proporciona métodos para producir un producto de alcohol (por ejemplo, alcohol fermentativo) en donde los microorganismos productores de alcohol en un recipiente de fermentación se ponen en contacto con ácidos grasos derivados de aceite nativo, tales como lipidos de biomasa, en una etapa del proceso de fermentación. Esta suplementación de ácidos grasos durante el crecimiento fermentativo del microorganismo puede aumentar el consumo de carbono fermentable de los microorganismos, el índice de crecimiento y la producción de biomasa, particularmente en relación con los microorganismos recombinantes en los que se ha reducido o eliminado la actividad piruvato descarboxilasa.

En algunas modalidades, los glicéridos en el aceite pueden convertirse químicamente en ácidos grasos que se ponen en contacto con un caldo de fermentación, que incluye un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable. En otras modalidades, los glicéridos en el aceite pueden hidrolizarse catalíticamente (por ejemplo, enzimáticamente) en ácidos grasos que se ponen en contacto con un caldo de fermentación que incluye un microorganismo recombinante; En algunas modalidades, los ácidos grasos pueden obtenerse de la hidrólisis de lipidos presentes en la biomasa, que proporciona la fuente de carbono fermentable para la fermentación. Los ácidos grasos pueden usarse, además, como un agente extractante ISPR para extraer el producto de alcohol del caldo de fermentación.

Los ácidos grasos pueden ser saturados, monoinsaturados, poliinsaturados, y mezclas de estos. Por ejemplo, el aceite con una composición de ácidos grasos presente naturalmente que incluye una mezcla de ácido palmitico y ácido oleico (por ejemplo, aceite de maíz) puede hidrolizarse para producir una mezcla de ácido oleico libre y ácido palmitico libre, la cual puede ponerse en contacto con un caldo de fermentación en un recipiente de fermentación. En algunas modalidades, la concentración de ácido carboxilico (tal como ácido graso) en el recipiente de fermentación excede el limite de solubilidad en la fase acuosa y resulta en la producción de una mezcla de fermentación de dos fases que comprende una fase orgánica y una fase acuosa. En algunas modalidades, la concentración de ácidos carboxilicos en el caldo de fermentación es, típicamente, menor que aproximadamente 0.8 g/1 y está limitada por la solubilidad del ácido carboxilico en el caldo .

El índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo es mayor en presencia de ácidos grasos que el índice de crecimiento y el consumo de carbono fermentable del microorganismo en ausencia de ácidos grasos. Consecuentemente, la suplementación de ácidos grados de conformidad con los métodos de la presente invención puede lograr una mayor concentración celular y una mayor producción de alcohol de la que se lograría sin la suplementación de ácidos grasos. En algunas modalidades, el microorganismo puede ser un microorganismo productor de butanol u otro microorganismo que requiere, típicamente, suplementación de un sustrato de 2 carbonos, por ejemplo, etanol, para sobrevivir y crecer. En las modalidades, la suplementación de ácidos grasos de conformidad con los métodos de la presente invención puede permitir que los microorganismos dependientes de 2 carbonos sobrevivan y crezcan sin la suplementación de etanol. En algunas modalidades, los microorganismos pueden ser deficientes en cuanto a la producción de acetil-CoA a partir de piruvato. En algunas modalidades, el microorganismo está modificado metabolicamente con mutaciones disruptivas en uno o más genes de piruvato descarboxilasa (PDC, por sus siglas en inglés) , para que se modifica la ruta a la biosíntesis de ácidos grasos. En algunas modalidades, el microorganismo está modificado metabolicamente con mutaciones disruptivas en dos genes PDC, tales como PDC1 y PDC5, lo que resulta en la alteración de la ruta a las biosíntesis de ácidos grasos. Por lo tanto, los métodos de la presente invención pueden lograr una mayor productividad de alcohol al proporcionar un ambiente óptimo para el crecimiento fermentativo de los microorganismos recombinantes .

La presente invención será descrita con referencia a las figuras. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de procesos ilustrativo para la producción de alcohol fermentativo de conformidad con una modalidad de la presente invención. Como se muestra, se puede introducir una materia prima 12 en una entrada de un recipiente de licuación 10 y licuarse para producir una suspensión de materia prima 16. La materia prima 12 contiene almidón hidrolizable que proporciona una fuente de carbono fermentable (por ejemplo, azúcar fermentable tal como glucosa) , y puede ser una biomasa tales como, pero sin limitarse a, centeno, trigo, maiz, caña, cebada, material celulósico, material lignocelulósico, o mezclas de estos, o bien puede derivarse de una biomasa. En algunas modalidades, la materia prima 12 puede ser uno o más componentes de una biomasa fraccionada y, en otras modalidades, la materia prima 12 puede ser una biomasa molida no fraccionada. En algunas modalidades, la materia prima 12 puede ser maiz, tales como granos de maiz secos molidos no fraccionados, y los sólidos no disueltos pueden incluir germen, fibra y gluten. Los sólidos no disueltos son porciones no fermentables de la materia prima 12. Para los fines del análisis de la presente invención en relación con las modalidades que se muestran en las figuras, la materia prima 12 se describirá, frecuentemente, como maíz molido no fraccionado, en donde los sólidos no disueltos no han sido separados de esta. No obstante, debe comprenderse que los métodos y sistemas ilustrativos descritos en la presente descripción pueden modificarse para las distintas materias primas, ya sean fraccionadas o no, como resulta evidente para una persona con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, la materia prima 12 puede ser maiz alto oleico, para que el aceite de maíz derivado de este sea un aceite de maíz alto oleico con un contenido de ácido oleico de al menos aproximadamente 55 % en peso de ácido oleico. En algunas modalidades, el contenido de ácido oleico en el aceite de maíz alto oleico puede ser de hasta 65 % en peso respecto del contenido de ácido oleico en el aceite de maíz convencional, que es de aproximadamente 24 % en peso. El aceite alto oleico puede proporcionar algunas ventajas para usarse en los métodos de la presente invención, ya que la hidrólisis del aceite proporciona ácidos grasos libres con un alto contenido de ácido oleico para poner en contacto con un caldo de fermentación. En algunas modalidades, los ácidos grasos o mezclas de estos comprenden ácidos grasos insaturados. La presencia de ácidos grasos insaturados reduce la temperatura de fusión, lo que proporciona ventajas para la manipulación. De los ácidos grasos insaturados, aquellos que son monoinsaturados , es decir, que poseen un enlace doble de carbono-carbono, pueden proporcionar ventajas respecto de la temperatura de fusión sin afectar la estabilidad térmica y oxidativa adecuada conforme a las consideraciones del proceso.

El proceso de licuar la materia prima 12 implica la hidrólisis de los polisacáridos en la materia prima 12 en azúcares, que incluyen, por ejemplo, dextrinas y oligosacáridos, y es un proceso convencional. Puede usarse cualquier proceso de licuación conocido, asi como el recipiente de licuación correspondiente normalmente usados en la industria que incluyen, pero no se limitan a, proceso ácido, proceso ácido-enzimático o proceso enzimático. Estos procesos pueden usarse individualmente o combinados. En algunas modalidades, puede usarse el proceso enzimático y se introduce una enzima 14 adecuada, por ejemplo, alfa-amilasa, en una entrada del recipiente de licuación 10. Además, puede introducirse agua en el recipiente de licuación 10. En algunas modalidades, puede introducirse, además, una enzima de sacarificación, por ejemplo, glucoamilasa, en el recipiente de licuación 10. En modalidades adicionales, puede introducirse, además, una lipasa en el recipiente de licuación 10 para catalizar la conversión de uno o más componentes del aceite en ácidos grasos libres.

La suspensión de materia prima 16 producida a partir de la licuación de la materia prima 12 incluye azúcar, aceite 26 y sólidos no disueltos derivados de la biomasa a partir de la cual se formó la materia prima 12. En algunas modalidades, el aceite se encuentra en una cantidad de aproximadamente 0 % en peso a al menos aproximadamente 2 % en peso de la composición del caldo de fermentación. En algunas modalidades, el aceite se encuentra en una cantidad de al menos aproximadamente 0.5 % en peso de la materia prima. La suspensión de materia prima 16 puede descargarse desde una salida del recipiente de licuación 10. En algunas modalidades, la materia prima 12 es maíz o granos de maíz y, por lo tanto, la suspensión de materia prima 16 es una suspensión de pasta de maíz.

Una o más sustancias 42 pueden añadirse a la suspensión de materia prima 16. Las sustancias 42 son capaces de hidrolizar glicéridos en el aceite 26 en ácidos grasos libres (FFA, por sus siglas en inglés) 28. Por ejemplo, cuando la materia prima 12 es maíz, el aceite 26 es el aceite de maíz constituyente de la materia prima y los ácidos grasos libres 28 son ácidos grasos de aceite de maíz (COFA, por sus siglas en inglés) . Por lo tanto, después de introducir las sustancias 42 en la suspensión de materia prima 16, al menos una porción de los glicéridos en el aceite 26 se hidrolizan en FFA 28, lo que produce una suspensión de materia prima 18 con FFA 28.

En algunas modalidades, una o más sustancias 42 son uno o más catalizadores 42 capaces de hidrolizar catalíticamente los glicéridos en el aceite 26 en ácidos grasos libres (FFA, por sus siglas en inglés) 28. Por lo tanto, después de introducir el catalizador 42 en la suspensión de materia prima 16, al menos una porción de los glicéridos en el aceite 26 se hidrolizan en FFA 28, lo que produce una suspensión de materia prima 18 con FFA 28 y catalizador 42.

La composición de ácido/aceite resultante de la hidrólisis del aceite 26 es, típicamente, de al menos aproximadamente 17 % en peso de FFA. En algunas modalidades, la composición de ácido/aceite resultante de la hidrólisis del aceite 26 es de al menos aproximadamente 20 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 25 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 30 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 35 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 40 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 45 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 50 % en peso FFA, al menos aproximadamente 55 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 60 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 65 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 70 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 75 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 80 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 85 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 90 % en peso de FFA, al menos aproximadamente 95 % en peso de FFA, o al menos aproximadamente 99 % en peso de FFA.

Alternativamente, en algunas modalidades, la o las sustancias 42 pueden constituir uno o más reactantes o solventes capaces de hacer reaccionar químicamente el aceite 26 en FFA 28 para ponerlo en contacto con el microorganismo recombinante 32. Por ejemplo, los ácidos grados de aceite de maíz pueden sintetizarse a partir de aceite de maíz como aceite 26 mediante hidrólisis de base con NaOH y agua como sustancias 42, como se describe adicionalmente en la solicitud provisional de Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada, con núm. de serie 61/368,436, presentada el 28 de julio de 2010, e incorporada totalmente como referencia en la presente descripción. Además, por ejemplo, los triglicéridos de aceite de maíz como aceite 26 pueden reaccionarse con hidróxido amónico acuoso como reactante 42 para obtener ácidos grasos (y amida grasa) como se describe adicionalmente en Roe, et al., (Am. Oil Chem. Soc. 29:18-22, 1952), incorporada totalmente como referencia en la presente descripción. Para los fines del análisis de la presente invención en relación con las modalidades que se muestran en las figuras, la o las sustancias 42 se describirán, frecuentemente, como uno o más catalizadores como sustancias 42 para la hidrólisis de lípidos de biomasa en FFA 28 suplementadas durante el crecimiento fermentativo del microorganismo recombinante 32. Sin embargo, debe comprenderse que los métodos y sistemas ilustrativos descritos en la presente descripción pueden modificarse para que las sustancias 42 sean reactantes y/o solventes capaces de convertir químicamente los lipidos de biomasa en FFA 28.

En algunas modalidades, el catalizador 42 puede ser una o más enzimas, por ejemplo, enzimas hidrolasa, tales como enzimas lipasa. Las enzimas lipasa usadas pueden derivarse de cualquier fuente que incluye, por ejemplo, Absidia, Achromobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Alternaría, Aspergillus, Achromobacter, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria , Brochothrix, Candida, Chromobacter, Coprinus, Fusarium, Geotricum, Hansenula , Humicola, Hyphozyma, Lactobacillus, Metarhizium, Mucor, Nectria, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Pseudomonas, Rhizoctonia, Rhízomucor, Rhizopus, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sus, Sporobolomyces, Thermomyces, Thiarosporella, Trichoderma, Verticillium, y/o una cepa de Yarrowia . En un aspecto preferido, la fuente de lipasa se selecciona del grupo que consiste en Absidia blakesleena, Absidia corymbifera, Achromobacter iophagus, Alcaligenes sp., Alternarla brassiciola , Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, Bacillus pumilus, Bacillus strearothermophilus, Bacillus subtilis, Brochothrix thermosohata , Candida cylindracea (Candida rugosa), Candida paralipolytica , lipasa A de Candida Antárctica, lipasa B de Candida antartica, Candida ernobii, Candida deformans, Chromobacter viscosum, Coprinus cinerius, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium solani pisi, Fusariu roseum culmorum, Geotricum penicillatum, Hansenula anómala, Humicola brevispora, Humicola brevis var. thermoidea, . Humicola insolens, Lactobacillus curvatus, Rhizopus oryzae, Penicillium cyclopium, Penicillium crustosum, Penicillium expansum, Penicillium sp. I, Penicillium sp. II, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas cepacia (syn. Burkholderia cepacia) , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas maltophilia , Pseudomonas mendocina, Pseudomonas mephitica lipolytica, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas plantar! , Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri y Pseudomonas wisconsinensis, Rhizoctonia solani, Rhizomucor miehei, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nodosus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Sporobolomyces shibatanus, Sus scrofa, Thermomyces lanuginosus {anteriormente Humicola lanuginose) , Thiarosporella phaseolina , Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei y Yarrowia lipolytica. En otro aspecto preferido, la lipasa se selecciona del grupo que consiste en Thermomcyces lanuginosus, lipasa de Aspergillus sp., lipasa de Aspergillus niger, lipasa B de Candida antartica, lipasa de Pseudomonas sp., lipasa de Penicillium roqueforti , lipasa de Penicillium camembertii , lipasa de Mucor javanicus, lipasa de Burkholderia cepacia, lipasa de Alcaligenes sp., lipasa de Candida rugosa, lipasa de Candida parapsilosis, lipasa de Candida deformans, lipasas A y B de Geotrichum candidum, lipasa de Neurospora crassa, lipasa de Nectria haematococca, lipasa de Fusarium heterosporum, lipasa de Rhizopus delemar, lipasa de Rhizomucor miehei, lipasa de Rhizopus arrhizus y lipasa de Rhizopus oryzae. Las preparaciones de lipasa comerciales adecuadas como catalizador de enzimas 42 incluyen, pero no se limitan a, Lipolase® 100 L, Lipex® 100L, Lipoclean® 2000T, Lipozyme® CALB L, Novozym® CALA L y Palatase 20000L, disponibles de Novozymes, o de Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Mucor miehei, páncreas porcino, Candida cylindracea, Rhizopus niveus, Candida antárctica , Rhizopus arrhizus o Aspergillus disponibles de SigmaAldrich.

Después de hidrolizar al menos una porción de los glicéridos, en algunas modalidades, puede inactivarse el catalizador 42. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para volver inactivo el catalizador 42. Por ejemplo, en algunas modalidades, el catalizador 42 puede inactivarse mediante la aplicación de calor y/o al ajustar el pH de la masa de reacción a un pH en el que el catalizador 42 se inactive de manera irreversible, y/o al añadir una especie química o bioquímica capaz de inactivar selectivamente la actividad del catalizador. Como se muestra, por ejemplo, en la modalidad de la Figura 1, se aplica calor q a la suspensión de materia prima 18 para que el catalizador 42 se vuelva inactivo. La aplicación de calor q puede realizarse en la suspensión de materia prima 18 antes de que esta se introduzca en el recipiente de fermentación 30. La suspensión de materia prima 18 tratada con calor (con el catalizador 42 inactivo) se introduce después en un recipiente de fermentación 30 junto con el microorganismo 32 para incluirse en un caldo de fermentación que se encuentra en el recipiente de fermentación 30. Alternativamente, la suspensión de materia prima 18 puede introducirse en el recipiente de fermentación 30 y someterse a calor q mientras se encuentra en el recipiente de fermentación, antes de la inoculación del recipiente de fermentación del microorganismo 32. Por ejemplo, en algunas modalidades, el tratamiento de inactivación del catalizador puede realizarse al calentar la suspensión de materia prima 18 con calor g a una temperatura de al menos aproximadamente 75 °C durante al menos aproximadamente 5 minutos, al menos aproximadamente 75 °C durante al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 75 °C durante al menos aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 80 °C durante al menos aproximadamente 5 minutos, al menos aproximadamente 80 °C durante al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 80 °C durante al menos aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 85 °C durante al menos aproximadamente 5 minutos, al menos aproximadamente 85 °C durante al menos aproximadamente 10 minutos, o al menos aproximadamente 85 °C durante al menos aproximadamente 15 minutos. En algunas modalidades, después de someterse al calor q, la suspensión de materia prima 18 se enfria a una temperatura adecuada para la fermentación antes de introducirse en el recipiente de fermentación 30 (o antes de la inoculación del recipiente de fermentación en caso de que la aplicación de calor q se realice en el recipiente de fermentación) . Por ejemplo, en algunas modalidades, la temperatura de la suspensión de materia prima 18 es de aproximadamente 30 °C antes de entrar en contacto con el caldo de fermentación.

Se prefiere la inactivación del catalizador 42 cuando se busca evitar que el catalizador 42 esterifique el alcohol con ácidos grasos 28 en el recipiente de fermentación. En algunas modalidades, se prefiere la producción de éster de alcohol mediante la esterificación del producto de alcohol en un medio de fermentación con un ácido orgánico (por ejemplo, ácido graso) y un catalizador (por ejemplo, lipasa) , como se describe adicionalmente en la solicitud provisional de Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada, núm. de serie 61/368,429, presentada el 28 de julio de 2010; la solicitud provisional de Estados Unidos núm. de serie 61/379,546, presentada el 2 de septiembre de 2010; y la solicitud provisional de Estados Unidos núm. de serie 61/440,034, presentada el 7 de febrero de 2011; incorporadas totalmente como referencia en la presente descripción. Por ejemplo, para la producción de butanol, el catalizador 42 activo en el recipiente de fermentación (introducido mediante la suspensión 18) puede catalizar la esterificación del butanol con ácidos grasos 28 (introducidos mediante la suspensión 18) para formar ásteres de butilo de ácidos grasos (FABE, por sus siglas en inglés) in situ. En las modalidades donde se prefieren los ásteres de alcohol de ácidos grasos, los métodos descritos en la presente descripción pueden modificarse para omitir la inactivación del catalizador 42 antes de poner en contacto un caldo de fermentación que incluye el producto de alcohol. Por lo tanto, con referencia a los diagramas de flujo de procesos ilustrativos de las Figuras 1-5, estas modalidades alternativas pueden realizarse al omitir la aplicación de calor q en la corriente de proceso que contiene el catalizador 42, para que el catalizador 42 esterifique el producto de alcohol con los ácidos grasos 28 en el recipiente de fermentación 30. Además, en algunas modalidades, los diagramas de flujo de procesos ilustrativos de las Figuras 1-5 pueden modificarse para omitir el calor q si no es necesario para la conversión química del aceite 26 en FFA 28 mediante el uso de uno o más reactantes o solventes como las sustancias 42, en lugar de catalizadores 42.

El recipiente de fermentación 30 está configurado para fermentar la suspensión 18 a fin de producir un producto de alcohol, tal como butanol. Particularmente, el microorganismo 32 metaboliza el azúcar fermentable en la suspensión 18 y excreta un producto de alcohol. El microorganismo 32 se selecciona del grupo de bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levadura. En algunas modalidades, el microorganismo 32 puede ser una bacteria, tal como E. coli. En algunas modalidades, el microorganismo 32 puede ser un microorganismo recombinante fermentativo. La suspensión puede incluir azúcar, por ejemplo, en forma de oligosacáridos y agua, y puede comprender menos de aproximadamente 20 g/1 de glucosa monomérica, con mayor preferencia, menos de aproximadamente 10 g/1 o menos de aproximadamente 5 g/1 de glucosa monomérica. La metodología- adecuada para determinar la cantidad de glucosa monomérica es ampliamente conocida en la técnica. Los métodos adecuados conocidos en la técnica incluyen cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) .

En algunas modalidades, la suspensión 18 se somete a un proceso de sacarificación a fin de descomponer los azúcares complejos (por ejemplo, oligosacáridos) en la suspensión 18 en monosacáridos que pueden ser metabolizados fácilmente por el microorganismo 32. Puede usarse cualquier proceso de sacarificación que se usa rutinariamente en la industria, que incluyen, pero no se limita a, proceso ácido, proceso ácido-enzimático o el proceso enzimático. En algunas modalidades, la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés) pueden ocurrir dentro del recipiente de fermentación 30, como se muestra en la Figura 1. En algunas modalidades, una enzima 38, tal como glucoamilasa, puede introducirse en una entrada del recipiente de fermentación 30 para descomponer el almidón o los oligosacáridos en glucosa capaz de ser metabolizada por el microorganismo 32.

Opcionalmente, puede proporcionarse etanol 33 en el recipiente de fermentación 30 para incluirse en el caldo de fermentación. En algunas modalidades, cuando se usa un microorganismo recombinante con una ruta biosintética de butanol como el microorganismo 32 para la producción de butanol, el microorganismo 32 puede requerir la suplementación de un sustrato de dos carbonos (por ejemplo, etanol) para sobrevivir y crecer. Por lo tanto, en algunas modalidades, puede suministrarse etanol 33 en el recipiente de fermentación 30.

Sin embargo, se ha determinado que, sorprendentemente, los métodos de la presente invención, en donde hay ácidos grasos libres (por ejemplo, FFA 28) en el recipiente de fermentación, pueden permitir la reducción de la cantidad de etanol 33 típicamente suministrada por un microorganismo recombinante determinado sin afectar negativamente la vitalidad del microorganismo recombinante. Adicionalmente, en algunas modalidades, los métodos de la presente invención demuestran que el índice de producción de alcohol (por ejemplo, butanol) sin suplementación de etanol es comparable con el índice de producción que puede lograrse cuando se suplementa con etanol 33. Como se demuestra adicionalmente en los ejemplos comparativos presentados en los Ejemplos 1-14 más abajo, el índice de producción de butanol, cuando hay ácido graso pero no etanol en el recipiente de fermentación, puede ser mayor que el índice de producción de butanol cuando no hay ácido graso ni etanol en el recipiente de fermentación. Por lo tanto, en algunas modalidades, la cantidad de suplementación de etanol 33 se reduce en comparación con los procesos convencionales. Por ejemplo, una cantidad típica de etanol añadida en un recipiente de fermentación para microorganismos que requieren suplementación de un sustrato de dos carbonos es de aproximadamente 5 g/1 de etanol anhidro (es decir, 5 g de etanol anhidro por litro de medio de fermentación) . En algunas modalidades, la fermentación no se suplementa con etanol 33. En este último caso, la corriente de etanol 33 se omite por completo del recipiente de fermentación. Por lo tanto, en algunas modalidades de la presente invención, es posible reducir o eliminar el costo asociado con el etanol suplementario 33, al igual que la incomodidad asociada con almacenar las cubas de etanol 33 y suministrarlo en el recipiente de fermentación durante la fermentación del butanol. Además, independientemente de la suplementación de etanol, en algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden proporcionar un mayor índice de consumo de glucosa por parte del microorganismo 32 en virtud de la presencia de ácidos grasos durante la fermentación. De conformidad con los métodos descritos en la presente descripción, pueden introducirse ácidos grasos en el recipiente de fermentación 30 como FFA 28, hidrolizarse de aceite de materia prima 26 de la suspensión 16, o bien hidrolizarse de aceite nativo, tales como lipidos de biomasa, en una etapa del proceso de fermentación. Además, los ácidos grasos pueden introducirse en el recipiente de fermentación como un agente extractante ISPR 29.

En el recipiente de fermentación 30, el microorganismo 32 produce alcohol. La extracción de producto in situ (ISPR, por sus siglas en inglés) puede usarse para extraer el producto de alcohol del caldo de fermentación. En algunas modalidades, ISPR incluye la extracción líquido-líquido. La extracción líquido-líquido puede realizarse de conformidad con los procesos descritos en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0305370, cuya descripción se incorpora totalmente en la presente descripción. La publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0305370 describe métodos para producir y recuperar butanol de un caldo de fermentación mediante el uso de la extracción liquido-líquido; los métodos comprenden la etapa de poner en contacto el caldo de fermentación con un agente extractante inmiscible en agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. Típicamente, el agente extractante puede ser un agente extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos saturados, monoinsaturados o poliinsaturados (y mezclas de estos) de Ci2 a C2z, ácidos grasos de C12 a C22f ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22 , y mezclas de estos, que entran en contacto con un caldo de fermentación y forman una mezcla de dos fases, que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. Además, el agente extractante puede ser un agente extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados (y mezclas de estos) de C4 a C22Í ácidos grasos de C4 a C2s, ésteres de ácidos grasos de C4 a C2e, aldehidos grasos de C a C22, y mezclas de estos, que entran en contacto con un caldo de fermentación y forman una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. Los ácidos grasos libres 28 de la suspensión 18 pueden actuar, además, como un agente extractante ISPR 28. Por ejemplo, cuando los ácidos grasos libres 28 son ácidos grasos de aceite de maíz (COFA, por sus siglas en inglés) , el agente extractante ISPR 28 es COFA. El agente extractante ISPR (FFA, por sus siglas en inglés) 28 entra en contacto con el caldo de fermentación y forma una mezcla de dos fases, que comprende una fase acuosa 34 y una fase orgánica. El producto de alcohol presente en el caldo de fermentación se divide, preferentemente, en la fase orgánica para formar una fase orgánica que contiene alcohol 36. En algunas modalidades, el recipiente de fermentación 30 tiene una o más entradas para recibir uno o más agentes extractantes ISPR 29 adicionales, que forman una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica, y el producto de alcohol se divide en la fase orgánica.

La mezcla bifásica puede extraerse del recipiente de fermentación 30 como la corriente 39 e introducirse en el recipiente 35, en donde la fase orgánica que contiene alcohol 36 se separa de la fase acuosa 34. La fase orgánica que contiene alcohol 36 se separa de la fase acuosa 34 de la corriente bifásica 39 mediante los métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, sifonado, decantación, aspiración, centrifugación, mediante el uso de un sedimentador por gravedad, separación de fases asistida por membrana, y similares. La totalidad o parte de la fase acuosa 34 puede reciclarse en el recipiente de fermentación 30 como el medio de fermentación (como se muestra) , o bien desecharse y reemplazarse por un medio nuevo o tratarse para la extracción de todo producto de alcohol restante y, después, reciclarse en él recipiente de fermentación 30. Después, la fase orgánica que contiene alcohol 36 se trata en un separador 50 para recuperar el producto de alcohol 54, y el agente extractante pobre de alcohol 27 puede volver a reciclarse en el recipiente de fermentación 30, generalmente combinado con FFA 28 nuevo de la suspensión 18 y/o con agente extractante 29 nuevo, para una extracción adicional del producto de alcohol. Alternativamente, el nuevo FFA 28 (de la suspensión 18) y/o el agente extractante 29 pueden añadirse continuamente en el recipiente de fermentación para reemplazar los agentes extractantes ISPR extraídos de la. corriente de la mezcla bifásica 39.

En algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 adicional puede ser un agente extractante orgánico exógeno tal como alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearilico, 1-undecanol, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, undecanal, aldehido láurico, 20-metilundecanal, y mezclas de estos. En algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 puede ser un ácido carboxilico o ácido graso libre y, en algunas modalidades, el ácido carboxilico o ácido graso libre tiene una cadena de 4 a 28 carbonos, de 4 a 22 carbonos en otras modalidades, de 8 a 22 carbonos en otras modalidades, de 10 a 28 carbonos en otras modalidades, de 7 a 22 carbonos en otras modalidades, de 12 a 22 carbonos en otras modalidades, de 4 a 18 carbonos en otras modalidades, de 12 a 22 carbonos en otras modalidades, y de 12 a 18 carbonos incluso en otras modalidades. En algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 es uno o más de los siguientes ácidos grasos: azaléico, cáprico, caprilico, ricino, coco (es decir, una combinación de ácidos grasos naturales que incluyen ácido láurico, miristico, palmitico, caprilico, cáprico, esteárico, caproico, araquidico, oleico y linoleico) , dímero, isoesteárico, láurico, lino, miristico, oleico, oliva, aceite de palma, palmitico, grano de palma, cacahuate, pelargónico, ricinoleico, sebácico, soja, ácido esteárico, aceite de resina, sebo, 12 hidroxi esteárico o cualquier aceite de semilla. En algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 es uno o más diácidos, por ejemplo, ácido acelaico y ácido sebácico. Por lo tanto, en algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 puede ser una mezcla de dos o más ácidos grasos diferentes. En algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 puede ser un ácido graso libre derivado de la hidrólisis química o enzimática de glicéridos derivados de aceite nativo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 puede ser ácidos grasos libres 28' obtenidos por hidrólisis enzimática del aceite nativo, tales como lípidos de biomasa, como se describe más adelante con referencia a la modalidad de la Figura 4. En algunas modalidades, el agente extractante ISPR 29 puede ser un agente extractante de ácidos grasos seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres de metilo de ácidos grasos, ésteres de bajo alcohol de ácidos grasos, glicol ésteres de ácidos grasos, triglicéridos hidroxilados y mezclas de estos, obtenidos de la conversión química del aceite nativo, tales como lípidos de biomasa, como se describe, por ejemplo, en la solicitud provisional de Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada, núm. de serie 61/368,436, presentada el 28 de julio de 2010. En algunas modalidades, los lípidos de biomasa para producir el agente extractante 29 pueden obtenerse de la misma fuente de biomasa o una diferente de la que se obtiene la materia prima 12. Por ejemplo, en algunas modalidades, los lípidos de biomasa para producir el agente extractante 29 pueden derivarse de soja, mientras que la fuente de biomasa de la materia prima 12 es maíz. Puede usarse cualquier combinación posible de fuentes de biomasa diferentes para el agente extractante 29 respecto de la materia prima 12, como será evidente para una persona con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, los agentes extractantes ISPR 29 adicionales incluyen COFA.

La fermentación extractiva in situ puede realizarse en lotes o en modo continuo en el recipiente de fermentación 30.

Para la fermentación extractiva in situ, el agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación al inicio de la fermentación y formar un medio de fermentación bifásico. Alternativamente, el agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación después de que el microorganismo ha alcanzado la cantidad deseada de crecimiento, que puede determinarse al medir la densidad óptica del cultivo. Adicionalmente, el agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación en el momento en que el nivel de producto de alcohol en el medio de fermentación alcanza un nivel seleccionado previamente. En el caso de la producción de butanol, por ejemplo, el agente extractante ISPR puede entrar en contacto con el medio de fermentación antes de que la concentración de butanol alcance un nivel que podría ser tóxico para el microorganismo. Después de poner en contacto el medio de fermentación con el agente extractante ISPR, el producto de butanol se divide en el agente extractante y disminuye la concentración en la fase acuosa que contiene el microorganismo, lo que limita la exposición del microorganismo de producción al producto inhibitorio de butanol .

El volumen del agente extractante ISPR que se usará depende de varios factores que incluyen el volumen del medio de fermentación, el tamaño del recipiente de fermentación, el coeficiente de partición del agente extractante para el producto de butanol y el modo de fermentación seleccionado, según se describe más adelante. El volumen del agente extractante puede ser de aproximadamente 3 % a aproximadamente 60 % del volumen operativo del recipiente de fermentación. Según la eficiencia de la extracción, el titulo en fase acuosa del butanol en el medio de fermentación puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 g/1 a aproximadamente 85 g/1, de aproximadamente 10 g/1 a aproximadamente 40 g/1, de aproximadamente 10 g/1 a aproximadamente 20 g/1, de aproximadamente 15 g/1 a aproximadamente 50 g/1 o de aproximadamente 20 g/1 a aproximadamente 60 g/1. En algunas modalidades, el caldo de fermentación resultante después de la esterificación del alcohol puede comprender alcohol libre (es decir, no esterificado) y, en algunas modalidades, la concentración de alcohol libre en el caldo de fermentación después de la esterificación del alcohol no es mayor que 1, 3, 6, 10, 15, 20, 25, 30 25, 40, 45, 50, 55 o 60 g/1 cuando el producto de alcohol es butanol, o cuando el producto de alcohol es etanol, la concentración de alcohol libre en el caldo de fermentación después de la esterificación del alcohol no es mayor que 15, 20, 25, 30 25, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 g/1. Sin respaldo teórico, se considera que puede obtenerse un título de butanol más alto con el método de fermentación extractiva, en parte, de la extracción del producto tóxico de butanol del medio de fermentación, por lo que el nivel se mantiene por debajo del nivel tóxico para el microorganismo.

En un modo por lotes de la fermentación extractiva in situ, se añade un volumen de agente extractante orgánico en el recipiente de fermentación y el agente extractante no se extrae durante el proceso. Este modo requiere un mayor volumen de agente extractante orgánico para minimizar la concentración del producto inhibitorio de butanol en el medio de fermentación. Por consiguiente, el volumen del medio de fermentación es menor y la cantidad de producto producida es menor que la obtenida al usar el modo continuo. Por ejemplo, el volumen del agente extractante en el modo por lotes puede ser de 20 % a aproximadamente 60 % del volumen operativo del recipiente de fermentación en una modalidad, y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 % en otra modalidad.

La desgasificación (no se muestra) puede usarse conjuntamente con el agente extractante ISPR para extraer el producto de alcohol del medio de fermentación.

En la modalidad de la Figura 1, el producto de alcohol se extrae del caldo de fermentación in situ, y la separación de la mezcla bifásica 39 ocurre en un recipiente separado 35. En algunas modalidades, la separación de la mezcla bifásica 39 puede ocurrir en el recipiente de fermentación, como se muestra en las modalidades de las Figuras 2 y 3 descritas posteriormente, en donde la corriente de la fase orgánica que contiene alcohol 36 sale directamente del recipiente de fermentación 30. Además, la corriente de la fase acuosa 34 puede salir directamente del recipiente de fermentación 30, tratarse para la extracción de todo producto de alcohol restante y reciclarse, o desecharse y reemplazarse con un medio de fermentación nuevo. La extracción del producto de alcohol mediante los agentes extractantes orgánicos puede realizarse con o sin la extracción del microorganismo del caldo de fermentación. El microorganismo puede extraerse del caldo de fermentación con métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, filtración o centrifugación. Por ejemplo, la corriente de la fase acuosa 34 puede incluir el microorganismo 32, tal como levadura. El microorganismo 32 puede separarse fácilmente de la corriente de la fase acuosa, por ejemplo, en una centrifuga (no se muestra). Después, el microorganismo 32 puede reciclarse en el recipiente de fermentación 30 que, con el tiempo, puede aumentar el índice de producción de alcohol, lo que resulta en un aumento de la eficiencia de la producción de alcohol.

En un modo continuo de la fermentación extractiva in situ, el volumen del agente extractante puede ser de aproximadamente 3 % a aproximadamente 50 % del volumen operativo del recipiente de fermentación en una modalidad, de aproximadamente 3 % a aproximadamente 30 % en otra modalidad, de 3 % a aproximadamente 20 % en otra modalidad; y de 3 % a aproximadamente 10 % en otra modalidad. Debido a que el producto se elimina continuamente del reactor, se requiere un menor volumen de agente extractante, lo que posibilita un mayor volumen del medio de fermentación que se usará.

Como alternativa a la fermentación extractiva in situ, el producto de alcohol puede extraerse del caldo de fermentación corriente abajo del recipiente de fermentación 30. En ese caso, el caldo de fermentación puede extraerse del recipiente de fermentación 30 e introducirse en el recipiente 35 para entrar en contacto con el agente extractante ISPR a fin de obtener la mezcla bifásica 39 en el recipiente 35, que después se separa en las fases orgánica 36 y acuosa 34. Alternativamente, el agente extractante ISPR puede añadirse en el caldo de fermentación en un recipiente separado (no se muestra) antes de la introducción en el recipiente 35.

En un ejemplo intuitivo no limitante, en relación con la modalidad de la Figura 1, una suspensión acuosa de maíz entero molido (como materia prima 12) que puede contener nominalmente aproximadamente 4 % en peso de aceite de maíz, puede tratarse con amilasa (como la enzima de licuación 14) a una temperatura de aproximadamente 85 °C a 120 °C durante 30 minutos a 2 horas, y la pasta licuada resultante 16 puede enfriarse a una temperatura de entre 65 °C y 30 °C y tratarse con 0.1 ppm a 10 ppm (en algunas modalidades, de 0.5 ppm a 1.0 ppm) de lipasa (como catalizador 42) a un pH de 4.5 a 7.5 (en algunas modalidades, a un pH de entre 5.5 y 6.5) durante un tiempo suficiente para producir al menos 30 % hasta al menos 99 % de la conversión del contenido de ácidos grasos disponible en los lipidos en ácidos grasos libres. Opcionalmente, la pasta licuada y tratada con lipasa 18 puede calentarse para inactivar la lipasa 42 antes de la fermentación. La pasta 18 puede enfriarse a aproximadamente 30 °C (por ejemplo, con un intercambiador de calor) y cargarse en el recipiente de fermentación 30 a aproximadamente 25 % a 30 % en peso de sólidos de maiz seco. La sacarificación de la pasta licuada 18 durante la fermentación por medio de la adición de glucoamilasa (como la enzima de sacarificación 38) puede resultar en la producción de glucosa. El caldo de fermentación resultante puede contener una cantidad significativamente menor del aceite de maiz (por ejemplo, aproximadamente 1.2 % en peso de aceite de maiz) que puede estar presente en el caldo de fermentación con una pasta licuada que no ha sido tratada con lipasa 42. Particularmente, el tratamiento con lipasa 42 puede resultar en la conversión de los lipidos de aceite de maiz 26 (triglicéridos (TG) ) en COFA como FFA 28 (y algunos diglicéridos (DG) o monoglicéridos (MG) ) que entran en contacto con el caldo de fermentación. El índice de crecimiento y/o el consumo de glucosa del microorganismo en el caldo de fermentación puede ser mayor en presencia de COFA que el índice de crecimiento y el consumo de carbono fermentable del microorganismo en ausencia de ácidos grasos. Por ejemplo, como se describe posteriormente en los ejemplos, las Figuras 6-8 ilustran un mayor consumo de glucosa por parte de los microorganismos productores de butanol en presencia de ácidos grasos suplementados .

En algunas modalidades, el sistema y los procesos de la Figura 1 pueden modificarse para que la suspensión de materia prima 16 (que contiene aceite 26) y el catalizador 42 se introduzcan y entren en contacto en el recipiente de fermentación 30 a fin de producir la suspensión 18 (que contiene FFA 28). Después, la temperatura del recipiente de fermentación puede aumentarse para inactivar por calor el catalizador 42. Posteriormente, la temperatura del recipiente de fermentación puede reducirse y el recipiente de fermentación puede inocularse con el microorganismo 32, para que los azúcares de la suspensión 18 se fermenten y produzcan un producto de alcohol.

En algunas modalidades, el sistema y los procesos de la Figura 1 pueden modificarse para que la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el recipiente de fermentación 30 sea reemplazada por un recipiente de sacarificación separado 60 (ver la Figura 2) antes del recipiente de fermentación 30, como resultará evidente para una persona con experiencia en la técnica. Por lo tanto, la suspensión 18 puede sacarificarse antes o durante la fermentación en un proceso de SSF. Además resultará evidente que el catalizador 42 para la hidrólisis del aceite de materia prima 26 puede introducirse antes, después o al mismo tiempo con la enzima de sacarificación 38. Por lo tanto, en algunas modalidades, la adición de la enzima 38 y el catalizador 42 puede realizarse por etapas (por ejemplo, el catalizador 42, después la enzima 38 o viceversa) , o prác icamente en simultáneo (es decir, exactamente al mismo tiempo en que le toma a una persona o máquina realizar la adición de una sola vez, o una enzima/catalizador inmediatamente después del otro catalizador/enzima según el tiempo que le toma a una persona o máquina realizar la adición en dos etapas) .

Por ejemplo, como se muestra en la modalidad de la Figura 2, el sistema y los procesos de la Figura 1 pueden modificarse para que la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el recipiente de fermentación 30 sea reemplazada por un recipiente de sacarificación 60 separado antes del recipiente de fermentación 30. La Figura 2 es prácticamente igual a la Figura 1, excepto por la inclusión de un recipiente de sacarificación separado 60 que recibe la enzima 38, en donde se introduce el catalizador 42 en una corriente de materia prima sacarificada y licuada 62. La suspensión de materia prima 16 se introduce en el recipiente de sacarificación 60 junto con la enzima 38, tal como glucoamilasa, para que los azúcares en forma de oligosacáridos en la suspensión 16 puedan descomponerse en monosacáridos . Una corriente de materia prima licuada sacarificada 62 sale del recipiente de sacarificación 60 en el cual se introduce el catalizador 42. La corriente de materia prima 62 incluye monosacáridos, aceite 26 y sólidos no disueltos derivados de la materia prima. El aceite 26 se hidroliza con la introducción del catalizador 42, lo que resulta en una suspensión de materia prima sacarificada y licuada 64 con ácidos grasos libres 28 y el catalizador 42.

Alternativamente, en algunas modalidades, el catalizador 42 puede añadirse con la enzima de sacarificación 38 para producir simultáneamente glucosa e hidrolizar los lipidos del aceite 26 en ácidos grasos libres 28. La adición de la enzima 38 y el catalizador 42 puede ser por etapas (por ejemplo, el catalizador 42 y después la enzima 38, o viceversa) o simultánea. Alternativamente, en algunas modalidades, la suspensión 62 puede introducirse en un recipiente de fermentación, en el cual se añade directamente el catalizador 42 en el recipiente de fermentación 30.

En la modalidad de la Figura 2, se aplica calor q en la suspensión de materia prima 64, para que el catalizador 42 se vuelva inactivo, y la suspensión tratada con calor 64 se introduce después en el recipiente de fermentación 30 junto con el microorganismo productor de alcohol 32, que metaboliza los monosacáridos para producir un producto de alcohol (por ejemplo, butanol) . Alternativamente, la suspensión 64 puede introducirse en el recipiente de fermentación 30 y someterse a calor q mientras se encuentra en el recipiente de fermentación, antes de la inoculación del microorganismo 32.

Como se describió anteriormente con referencia a la Figura 1, los ácidos grasos libres 28 pueden actuar, además, como agente extractante ISPR para, preferentemente, separar el producto de alcohol de la fase acuosa. En algunas modalidades, pueden introducirse, además, uno o más agentes extractantes ISPR 29 adicionales en el recipiente de fermentación 30. La separación de la mezcla bifásica ocurre en el recipiente de fermentación 30, para que la corriente de la fase orgánica que contiene alcohol 36 y la corriente de la fase acuosa 34 salen directamente del recipiente de fermentación 30. Alternativamente, la separación de la mezcla bifásica puede realizarse en un recipiente separado 35, como se proporciona en las modalidades de la Figura 1. Las operaciones del proceso restantes de la modalidad de la Figura 2 son idénticas a las de la Figura 1 y, por lo tanto, no serán descritas en detalle nuevamente.

Incluso en otras modalidades, el aceite 26 derivado de la materia prima 12 puede hidrolizarse catalíticamente en FFA 28 antes o durante la licuación, para que la suspensión de materia prima- 18 que contiene FFA 28 salga directamente del recipiente de licuación 10 y pueda introducirse en el recipiente de fermentación 30. Por ejemplo, la materia prima 12 que contiene aceite 26 puede introducirse en el recipiente de licuación 10 junto con el catalizador 42 para la hidrólisis de al menos una porción de los glicéridos en el aceite 26 en FFA 28. La enzima 14 (por ejemplo, alfa-amilasa) que hidroliza el almidón en la materia prima 12 puede introducirse, además, en el recipiente 10 para producir una materia prima licuada. La adición de la enzima 14 y el catalizador 42 puede realizarse por etapas o simultáneamente. Por ejemplo, puede introducirse el catalizador 42 y, después, puede introducirse la enzima 14 después de que al menos una porción del aceite 26 ha sido hidrolizada. Alternativamente, puede introducirse la enzima 14 y, después, puede introducirse el catalizador 42. El proceso de licuación puede incluir la aplicación de calor q. En algunas modalidades, puede introducirse el catalizador 42 antes o durante la licuación cuando la temperatura del proceso es menor que la temperatura que inactiva el catalizador 42, para que el aceite 26 pueda hidrolizarse. Posteriormente, la aplicación de calor q puede proporcionar un propósito doble de licuación e inactivación del catalizador '42, si se prefiere la inactivación .

En algunas modalidades que incluyen cualquiera de las modalidades descritas anteriormente en relación con las Figuras 1 y 2, los sólidos no disueltos pueden extraerse de la suspensión de materia prima antes de introducirla en el recipiente de fermentación 30. Por ejemplo, como se muestra en la modalidad de la Figura 3, la suspensión de materia prima 16 se introduce en una entrada de un separador 20 que está configurado para descargar los sólidos no disueltos como una fase sólida o pasta húmeda 24. Por ejemplo, en algunas modalidades, el separador 20 puede incluir un filtro prensa, filtración al vacio o una centrifuga para separar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16. Opcionalmente, en algunas modalidades, el separador 20 puede estar configurado, además, para extraer parte o prácticamente todo el aceite 26 presente en la suspensión de materia prima 16. En las modalidades, el separador 20 puede ser cualquier separador adecuado conocido en la técnica para extraer el aceite de una corriente de alimentación acuosa que incluyen, pero no se limitan a, sifonado, aspiración, decantación, centrifugación, sedimentación por gravedad, separación de fases asistida por membrana, y similares. La materia prima restante, que incluye azúcar y agua, se descarga como una corriente acuosa 22 en el recipiente de fermentación 30.

En algunas modalidades, el separador 20 extrae el aceite 26 pero no los sólidos no disueltos. Por lo tanto, la corriente acuosa 22 que se introduce en el recipiente de fermentación 30 incluye sólidos no disueltos. En algunas modalidades, el separador 20 incluye una centrifuga tricanter 20 que agita o revuelve la suspensión de materia prima 15 para producir un producto de centrifugado que comprende una capa acuosa que contiene azúcar y agua (es decir, la corriente 22), una capa de sólidos que contiene los sólidos no disueltos (es decir, la pasta húmeda 24) y una capa oleosa (es decir, corriente de aceite 26) . Los métodos y sistemas para extraer los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16 mediante centrifugación se describen detalladamente en la solicitud provisional de Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada, núm. de serie 61/356,290, presentada el 18 de junio de 2010, que se incorpora totalmente como referencia en la presente descripción .

En cualquier caso, el catalizador 42 puede ponerse en contacto con el aceite 26 extraído para producir una corriente de FFA 28 que incluye el catalizador 42, como se muestra en la Figura 3. Después, puede aplicarse calor q en la corriente de FFA 28, para que el catalizador 42 se vuelva inactivo. La corriente de FFA 28 y el catalizador 42 inactivo pueden introducirse, después, en el recipiente de fermentación 30 junto con la corriente 22 y el microorganismo 32. Alternativamente, se pueden introducir FFA 28 y el catalizador 42 activo en el recipiente de fermentación 30 desde el recipiente 40, y el catalizador 42 activo puede someterse, posteriormente, al calor q e inactivarse mientras se encuentra en el recipiente de fermentación antes de la inoculación del microorganismo 32.

FFA 28 puede actuar como agente extractante ISPR 28 y formar una mezcla bifásica en el recipiente de fermentación 30. El producto de alcohol obtenido mediante .SSF se divide en la fase orgánica 36 constituida por FFA 28. En algunas modalidades, pueden introducirse, además, uno o más agentes extractantes ISPR 29 adicionales en el recipiente de fermentación 30. Por lo tanto, el aceite 26 (por ejemplo, de la materia prima) puede hidrolizarse catalíticamente en FFA 28, para reducir el índice de acumulación de lípidos en un agente extractante ISPR y, al mismo tiempo, producir un agente extractante ISPR. La fase orgánica 36 puede separarse de la fase acuosa 34 de la mezcla bifásica 39 en el recipiente 35. En algunas modalidades, la separación de la mezcla bifásica 39 puede ocurrir en el recipiente de fermentación, como se muestra en las modalidades descritas en las Figuras 2 y 3, en donde la corriente de la fase orgánica que contiene alcohol 36 sale directamente del recipiente de fermentación 30. La fase orgánica 36 puede introducirse en el separador 50 para la recuperación del producto de alcohol 54 y reciclar opcionalmente el agente extractante recuperado 27, como se muestra en la Figura 1. Las operaciones del proceso restantes de la modalidad de la Figura 3 son idénticas a las de la Figura 1 y, por lo tanto, no serán descritas en detalle nuevamente.

Cuando la pasta húmeda 24 se extrae mediante la centrifuga 20, en algunas modalidades, una porción del aceite de la materia prima 12, tal como el aceite de maíz cuando la materia prima es maiz, permanece en la pasta húmeda 24. La pasta húmeda 24 puede lavarse con agua adicional en la centrífuga una vez que se ha descargado la solución acuosa 22 de la centrifuga 20. La pasta húmeda de lavado 24 recuperará el azúcar (por ejemplo, oligosacáridos ) presente en la pasta húmeda, y el azúcar y el agua recuperados pueden reciclarse en el recipiente de licuación 10. Después del lavado, la pasta húmeda 20 puede secarse para formar granos secos de destilería con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés) mediante cualquier proceso conocido adecuado. La formación de los DDGS a partir de la pasta húmeda 24 formada en la centrífuga 20 tiene varios beneficios. Como los sólidos no disueltos no pasan al recipiente de fermentación, los DDGS no tienen agente extractante atrapado y/o producto de alcohol, tal como butanol, no están sujetos a la condiciones del recipiente de fermentación y no entran en contacto con los microorganismos presentes en el recipiente de fermentación.

Todos estos beneficios facilitan el proceso y la venta de DDGS, por ejemplo, como alimento para animales. En algunas modalidades, el aceite 26 no se descarga por separado de la pasta húmeda 24, sino que el aceite 26 se incluye como parte de la pasta húmeda 24 y, finalmente, está presente en los DDGS. En estos casos, puede separarse el aceite de los DDGS y convertirse en un agente extractante ISPR 29 para uso posterior en el mismo proceso de fermentación de alcohol o en uno diferente. Los métodos y sistemas para extraer sólidos disueltos de la materia prima 16 mediante centrifugación se describen detalladamente en la solicitud de patente de Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 61/356,290, presentada el 18 de junio de 2010, que se incorpora totalmente como referencia en la presente descripción .

Incluso en otras modalidades (no se muestran) , la sacarificación puede ocurrir en un recipiente de sacarificación 60 separado (ver la Figura 2) ubicado entre el separador 20 y el recipiente de licuación 10, como resultará evidente para una persona con experiencia en la técnica.

Incluso en otras modalidades que se muestran, por ejemplo, en la modalidad de la Figura 4, una aceite nativo 26' se suministra a un recipiente 40 al que también se suministra un catalizador 42, para que al menos una porción de los glicéridos en el aceite 26' se hidrolicen para formar FFA 28'. Posteriormente, el catalizador 42 puede inactivarse, por ejemplo, mediante la aplicación de calor q. Después, se introduce una corriente de producto del recipiente 40 que contiene FFA 28' y catalizador inactivo 42 en el recipiente de fermentación 30, junto con la corriente de materia prima acuosa 22 en la cual el aceite de materia prima 26 y, en algunas modalidades, los sólidos no disueltos, han sido extraídos previamente por medio de un separador 20 (ver, por ejemplo, la modalidad de la Figura 3) . Además, la enzima de sacarificación 38 y el microorganismo 32 se introducen en el recipiente de fermentación 30, para que se produzca el producto de alcohol mediante SSF.

Alternativamente, el aceite 26' y el catalizador 42 pueden introducirse directamente en el recipiente de fermentación 30, en donde el aceite 26' se hidroliza en FFA 28', en lugar de usar el recipiente 40. Posteriormente, el catalizador 42 activo puede someterse a calor q e inactivarse mientras se encuentra en el recipiente de fermentación antes de la inoculación del microorganismo 32. Alternativamente, se pueden introducir FFA 28' y el catalizador 42 activo en el recipiente de fermentación 30 desde el recipiente 40, y el catalizador 42 activo puede someterse, posteriormente, a calor q e inactivarse mientras se encuentra en el recipiente de fermentación antes de la inoculación del microorganismo 32. En algunas modalidades, la suspensión de materia prima 16 que incluye aceite 26, en lugar de la corriente 22, en donde el aceite 26 fue extraído, puede introducirse en el recipiente de fermentación 30 y ponerse en contacto con el catalizador 42 activo. El catalizador 42 activo puede, por lo tanto, usarse para hidrolizar el aceite 26 en FFA 28, para reducir la pérdida y/o degradación del coeficiente de partición del agente extractante con el tiempo, lo que se atribuye a la presencia del aceite en el recipiente de fermentación .

En algunas modalidades, el sistema y los procesos de la Figura 4 pueden modificarse para que se reemplace la sacarificación y fermentación simultáneas en el recipiente de fermentación 30 por un recipiente de fermentación separado 60 antes del recipiente de fermentación 30, como resultará evidente para una persona con experiencia en la técnica.

En algunas modalidades, el aceite nativo 26' puede ser sebo, maíz, cañóla, triglicéridos cápricos/caprílicos, ricino, coco, semilla de algodón, pescado, jojoba, lardo, lino, pata de buey, oiticica, palma, cacahuate, colza, arroz, cártamo, soja, girasol, tung, jatrofa, mezclas de aceites vegetales, y mezclas de estos. En algunas modalidades, el aceite nativo 26' es una mezcla de dos o más aceites nativos, por ejemplo, una mezcla de aceites de palma y soja. En algunas modalidades, el aceite nativo 26' es un aceite vegetal. En algunas modalidades, el aceite vegetal, aunque no necesariamente, puede derivarse de biomasa que puede usarse en un proceso de fermentación. La biomasa puede ser la misma fuente o una diferente de la que se obtiene la materia prima 12 (que se muestra en la Figura 4 como corriente- 22) . Por lo tanto, en algunas modalidades, por ejemplo, el aceite 26' puede derivarse de maíz, mientras que la materia prima 12 puede ser caña. Por ejemplo, en algunas modalidades, el aceite 26' puede derivarse de maíz y la fuente de biomasa de la materia prima 12 puede ser también maíz. Puede usarse cualquier combinación posible de fuentes de biomasa diferentes para el aceite 26' respecto de la materia prima 12, como resultará evidente para una persona con experiencia en la técnica. Las operaciones del proceso restantes de la modalidad de la Figura 4 son idénticas a las de la Figura 1 y, por lo tanto, no serán descritas en detalle nuevamente.

En algunas modalidades de la presente invención, el aceite de biomasa presente en la materia prima 12 puede convertirse en FFA 28 en una etapa posterior a la fermentación alcohólica. Después, puede introducirse FFA 28 en el recipiente de fermentación y ponerse en contacto con el caldo de fermentación para lograr un índice de crecimiento y/o un consumo de carbono fermentable mejorados del microorganismo productor de alcohol. FFA 28 puede actuar, además, como agente extractante ISPR 28. Por ejemplo, en la modalidad de la Figura 5, la materia prima 12 se licúa para producir la suspensión de materia prima 16 que incluye el aceite 26 derivado de la materia prima. La suspensión de materia prima 16 puede incluir, además, sólidos no disueltos de la materia prima. Alternativamente, los sólidos no disueltos pueden separarse de la suspensión 16 mediante un separador, tal como una centrífuga (no se muestra) . La suspensión de materia prima 16 que contiene el aceite 26 se introduce directamente en el recipiente de fermentación 30 que contiene un caldo de fermentación que incluye la enzima de sacarificación 38 y el microorganismo 32. Se produce un producto de alcohol mediante SSF en el recipiente de fermentación 30. Alternativamente, en algunas modalidades, el proceso puede modificarse para incluir un recipiente de sacarificación separado, como se analiza en relación con la Figura 2.

El agente extractante ISPR 29 se introduce en el recipiente de fermentación 30 par formar una mezcla bifásica, y el producto de alcohol se extrae por partición en la fase orgánica del agente extractante ISPR 29. Además, el aceite 26 se separa en la fase orgánica. La separación de la mezcla bifásica ocurre en el recipiente de fermentación 30, para que la corriente de la fase orgánica que contiene alcohol 36 y la corriente de la fase acuosa 34 salen directamente del recipiente de fermentación 30. Alternativamente, la separación de la mezcla bifásica puede realizarse en un recipiente separado 35, como se proporciona en las modalidades de la Figura 1. La corriente de la fase orgánica 36 que incluye aceite 26 se introduce en el separador 50 para recuperar el producto de alcohol 54 del agente extractante 29. El agente extractante pobre de alcohol 27 resultante incluye el agente extractante recuperado 29 y el aceite 26. El agente extractante 27 se pone en contacto con el catalizador 42, para que al menos una porción de los glicéridos en el aceite 26 se hidrolicen para formar FFA 28. Después, puede aplicarse calor q al agente extractante 27 que incluye FFA 28 para inactivar el catalizador 42 antes de reciclarse nuevamente en el recipiente de fermentación 30. La corriente de agente extractante reciclado 27 puede ser una corriente separada o una corriente combinada con una corriente nueva de agente extractante auxiliar 29. La posterior extracción de la fase orgánica que contiene alcohol 36 del recipiente de fermentación 30 puede incluir FFA 28 y agente extractante ISPR 29 (como agente extractante nuevo 29 y agente extractante reciclado 27), además, del producto de alcohol y el aceite adicional 26 de la suspensión de materia prima 16 recientemente introducida. Después, la fase orgánica 36 puede tratarse para recuperar el producto de alcohol, y reciclarse nuevamente en el recipiente de fermentación 30 después de entrar en contacto con el catalizador 42 para la hidrólisis del aceite 26 adicional, del mismo modo en que se describió anteriormente. En algunas modalidades, el uso del agente extractante ISPR auxiliar 29 puede eliminarse gradualmente a medida que se realiza el proceso de fermentación en el tiempo debido a que el proceso en si mismo puede producir FFA 28 como agente extractante ISPR auxiliar para extraer el producto de alcohol. Por lo tanto, el agente extractante ISPR puede ser la corriente del agente extractante reciclado 27 con FFA 28.

De este modo, las Figuras 1-5 proporcionan las diversas modalidades no limitantes de métodos y sistemas relacionados con los procesos de fermentación y FFA 28 producidos mediante la hidrólisis de biomasa derivada de aceite 26, y los FFA 28' producidos de la hidrólisis catalítica del aceite nativo 26', tal como aceite vegetal, que puede usarse para entrar en contacto con un microorganismo durante el crecimiento fermentativo, para que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo sea mayor en presencia de los ácidos grasos libres, lo que resulta en una productividad de alcohol mejorada.

De la descripción precedente y de los ejemplos, una persona con experiencia en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse de ella, introducir diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones. Por ejemplo, en algunas modalidades, la suplementación de ácidos grasos de conformidad con la presente invención puede realizarse antes de la fermentación, es decir, durante el cultivo de semilla de los microorganismos 32 antes de la fermentación en el recipiente de fermentación 30. Típicamente, los microorganismos 32, tal como levadura, pueden cultivarse en un cultivo de semilla hasta la concentración celular deseada antes de recolectarse e inocularse en el recipiente de fermentación 30, como se conoce en la técnica. Por lo tanto, de conformidad con algunas modalidades, el medio de cultivo de semilla puede ponerse en contacto con FFA 28 para que se obtengan Indices de crecimiento y producción de biomasa del microorganismo mejoradas, gue pueden reducir el tiempo previo a la fermentación asociado con la fase de cultivo de semilla en un proceso de fermentación de alcohol. De este modo, resultará evidente que la suplementación de ácidos grasos de conformidad con la presente invención puede realizarse en varias etapas en un proceso de fermentación de alcohol, por ejemplo, durante el cultivo previo a la fermentación y la fermentación, para mejorar la eficiencia general del proceso sin apartarse de la presente invención.

En algunas modalidades, que incluyen cualquiera de las modalidades mencionadas anteriormente descritas con referencia a las Figuras 1-5, el caldo de fermentación en el recipiente de fermentación 30 incluye al menos un microorganismo recombinante 32 que está genéticamente modificado para producir butanol mediante una ruta biosintética de al menos una fuente de carbono fermentable a butanol. Particularmente, los microorganismos recombinantes pueden cultivarse en un caldo de fermentación que contiene sustratos de carbono adecuados. Los sustratos de carbono adicionales pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos, tal como fructosa; oligosacáridos, tales como lactosa, maltosa y sacarosa; polisacáridos , tales como almidón o celulosa; o mezclas de estos y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como permeato de suero de queso, licor de maíz fermentado, melazas de betabel azucarero y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir etanol, lactato, succinato o glicerol.

Adicionalmente, los sustratos de carbono pueden ser sustratos de un solo carbono, tal como dióxido de carbono o metanol, para los que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos clave. Además de los sustratos de uno y de dos carbonos, se conoce que los organismos metilotróficos usan diversos compuestos adicionales que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y diversos aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilotróficas son conocidas por usar el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion, et al., Microb. Growth Cl Compd. , [Int. Symp.], 7.° (1993), 415-32, Editor (es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido de Gran Bretaña) . Además, diversas especies de Candida metabolizarán alanina o ácido oleico (Sulter, et al., Arch. Microbiol. 153:485-489, 1990) . Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono empleada en la presente invención puede abarcar una variedad amplia de sustratos que contienen carbono y solo estará limitada por la elección del organismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados, en algunas modalidades, los sustratos de carbono son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estos con azúcares de C5, tales como xilosa y/o arabinosa para la levadura modificada para usar azúcares de C5. La sacarosa puede derivarse de fuentes de azúcar renovables, tales como caña de azúcar, betabel azucarero, mandioca, sorgo dulce, y mezclas de estos. La glucosa y la dextrosa pueden derivarse de fuentes de granos renovables a través de la sacarificación de materias primas a base de almidón que incluyen granos, tales como maíz, trigo, centeno, cebada, avena, y mezclas de estos. Además, los azúcares fermentables pueden derivarse de biomasa celulósica o lignocelulósica renovable a través de procesos de pretratamiento y sacarificación, tal como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0031918 Al, que se incorpora como referencia en la presente descripción. Además de la fuente de carbono adecuada (de la corriente acuosa 22) , el caldo de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores, soluciones tampón y otros componentes apropiados conocidos para las personas con experiencia en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática que comprende dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD) .

Los microorganismos recombinantes que producen butanol mediante una ruta biosintética pueden incluir un miembro del género Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Sal onella, Serratia, Erwinia, Klebsiella, Shigella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthro&acter, Corynejbacterium, Brevibacterium, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Candida, Hansenula o Saccharomyces . En una modalidad, los microorganismos recombinantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae . En una modalidad, el microorganismo recombinante es una levadura crabtree positivo seleccionada de Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Dekkera, Torulopsis, Brettanomyces y algunas especies de Candida. Las especies de levadura crabtree positivo incluyen, pero no se limitan a, Saccharo yces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Sc izosaccharomyces pombe, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces mikitae, Saccharomyces paradoxus, Zygosaccharomyces rouxii y Candida glabrata . Por ejemplo, la producción de butanol mediante la fermentación por un microorganismo, al igual que los microorganismos que producen butanol, son conocidos y se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0305370, incorporada como referencia en la presente descripción. En algunas modalidades, los microorganismos comprenden una ruta biosintética de butanol. Las rutas biosintéticas de isobutanol adecuadas son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0092957, incorporada como referencia en la presente descripción) . En algunas modalidades, al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro polipéptidos catalizadores de conversiones de sustrato en producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades, todos los polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato en producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades, el microorganismo comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa . Los. microorganismos prácticamente libres de actividad piruvato descarboxilasa se describen en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0305363, incorporada como referencia en la presente descripción .

En la presente invención se proporciona la construcción de ciertas cepas, que incluyen aquellas usadas en los ejemplos .

Construcción de la cepa BP1083 de Saccharomyces cerevisiae ("NGCI-070") La cepa BP1064 se derivó de CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Cent aalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos) y contiene supresiones de los siguientes genes: URA3, HIS3, PDC1, PDC5, PDC6 y GPD2. BP1064 se transformó con plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1, descrito en la solicitud provisional de Estados Unidos núm. de serie 61/246,844) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083, PNY1504).

Las supresiones, que eliminaron completamente la secuencia codificante, se crearon mediante la recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología en dirección 5' y en dirección 3'del gen objetivo e incluso un marcador de resistencia G418 o gen URA3 para la selección de transformantes. El marcador de resistencia G418, flanqueado por sitios loxP, se eliminó por medio del uso de Cre recombinasa. El gen URA3 se eliminó mediante recombinación homologa para crear una supresión sin cicatriz o, si estaba flanqueado por sitios loxP, se eliminó por medio del uso de Cre recombinasa.

El procedimiento de supresión sin cicatriz se adaptó en función de Akada, et al., (Yeast 23:399-405, 2006). Generalmente, el cásete PCR para cada supresión sin cicatriz se elaboró al combinar cuatro fragmentos, A-B-U-C, mediante PCR superpuesta. El cásete PCR contenia un marcador seleccionable/contra-seleccionable, URA3 (Fragmento U) , que consistía en el gen nativo CEN.PK 113-7D URA3, junto con el promotor (250 pb en dirección 5' del gen URA3) y el terminador (150 pb en dirección 3' del gen URA3) . Los fragmentos A y C, cada uno de 500 pb de longitud, correspondían a los 500 pb inmediatamente en dirección 5' del gen objetivo (Fragmento A) y 500 pb de 3' del gen objetivo (Fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para integrar el cásete en el cromosoma mediante recombinación homologa. El Fragmento B (500 pb de longitud) correspondía a los 500 pb inmediatamente en dirección 3' del gen objetivo y se usó para la escisión del marcador URA3 y el Fragmento C del cromosoma mediante recombinación homologa, a medida que se creó una repetición directa de la secuencia correspondiente al Fragmento B con la integración del cásete en el cromosoma. Mediante el uso del cásete ABUC del producto de PCR, primero se integró el marcador URA3 y después se escindió del cromosoma por recombinación homologa. La integración inicial eliminó el gen, excepto los 500 pb de 3' . Después de la escisión, los 500 pb de la región 3' del gen también se eliminaron. Para la integración de genes con este método, el gen que se deseaba integrar se incluyó en el cásete PCR entre los Fragmentos A y B.

Supresión de URA3 Para eliminar la región codificante de URA3 endógeno, un cásete ura3 : : loxP-kanMX-loxP se amplificó por PCR a partir de la plantilla de ADN pLA54 (sec. con núm. de ident.: 3). pLA54 contiene el promotor TEF1 de K. lactis y el marcador kanMX, y está flanqueado por sitios loxP para permitir la recombinación con Cre recombinasa y la eliminación del marcador. Se realizó la PCR mediante el uso de ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los iniciadores BK505 y BK506 (sec. con núms . de ident.: 4 y 5) . La porción URA3 de cada iniciador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor URA3 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante para que la integración del marcador loxP-kanMX-loxP produjera el reemplazo de la región codificante de URA3. El producto de PCR se transformó en CEN.PK 113-7D mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202) y se seleccionaron transformantes en YPD que contenia G418 (100 µ?/p??) a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta mediante el uso de iniciadores LA468 y LA492 (sec. con núms . de ident . : 6 y 7) y se designó CEN.PK 113-7D Aura3 : : kanMX .

Supresión de HIS3 Los cuatro fragmentos para el cásete PCR para la supresión sin cicatriz de HIS3 se amplificaron mediante el uso de la mezcla maestra para PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc. , Ipswich, MA) y ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . El Fragmento A de HIS3 se amplificó con el iniciador oBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y el iniciador oBP453 (sec. con núm. de ident.: 15) que contenia una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento B de HIS3. El Fragmento B de HIS3 se amplificó con el iniciador oBP454 (sec. con núm. de ident.: 16) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento A de HIS3, y el iniciador oBP455 (sec. con núm. de ident.: 17) que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento U de HIS3. El Fragmento U de HIS3 se amplificó con el iniciador ???456 (sec. con núm. de ident.: 18) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento B de HIS3, y el iniciador oBP457 (sec. con núm. de ident.: 19) que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento C de HIS3. El Fragmento C de HIS3 se amplificó con el iniciador OBP458 (sec. con núm. de ident . : 20) que contenia una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento U de HIS3, y el iniciador oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El Fragmento AB de HIS3 se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento A y el Fragmento B de HIS3 y amplificar con iniciadores ???452 (sec. con núm. de ident.: 14) y oBP455 (sec. con núm. de ident.: 17). El Fragmento UC de HIS3 se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento U y el Fragmento C de HIS3 y amplificar con iniciadores OBP456 (sec. con núm. de ident.: 18) y oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21) . Los productos de PCR resultantes se purificaron en gel de agarosa seguido del uso de un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de HIS3 resultante se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento AB y el Fragmento UC de HIS3 y amplificar con iniciadores oBP452 (sec. con núm. de ident. : 14) y oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21) . El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::kanMX se elaboraron y transformaron con el cásete PCR ABUC de HIS3 mediante el uso del kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementadas con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con eliminación de his3 se analizaron por PCR con iniciadores oBP460 (sec. con núm. de ident.: 22) y oBP461 (sec. con núm. de ident.: 23) mediante el uso de ADN genómico preparado con un kit de levadura/bact. de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::kanMX Ahis3::URA3.

Extracción del marcador KanMX del sitio Aura3 y extracción del marcador URA3 del sitio Ahis3 Se extrajo el marcador KanMX al transformar CEN.PK 113-7D Aura3::kan X Ahis3::URA3 con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 66, descrito en la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 61/290,639) mediante el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se cultivó en placas en un medio sintético completo sin histidina y uracilo suplementado con 2 % de glucosa a 30 °C. Se cultivaron los transformantes en YP suplementado con 1 % de galactosa a 30 °C durante aproximadamente 6 horas para inducir la escisión de Cre recombinasa y el marcador KanMX, y se colocaron en placas de YPD (2 % de glucosa) a 30 °C para la recuperación. Se cultivó una cepa aislada durante la noche en YPD y se colocó en un medio sintético completo que contenia ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA, 0.1 %) a 30 °C para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador URA3. Se cultivaron las cepas aisladas resistentes a 5-FOA y se colocaron en placas en YPD para la extracción del plásmido pRS423 : : PGALl-cre . Se analizaron las cepas aisladas para determinar la pérdida del marcador KanMX, el marcador URA3 y el plásmido pRS423 :: PGALl-cre al examinar el crecimiento en las placas de YPD+G418, las placas de medio sintético completo sin uracilo, y las placas de medio sintético completo sin histidina. La cepa aislada correcta que era sensible a G418 y auxotrófica para uracilo e histidina se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 y se designó BP857. Las supresiones y la extracción de marcadores se confirmaron por PCR y secuenciación con los iniciadores oBP450 (sec. con núm. de ident.: 24) y oBP451 (sec. con núm. de ident . : 25) para Aura3 y los iniciadores oBP460 (sec. con núm. de ident.: 22) y oBP461 (sec. con núm. de ident.: 23) para ???e3 mediante el uso de ADN genómico preparado con un kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) .

Supresión de PDC6 Los cuatro fragmentos para el cásete PCR para la supresión sin cicatriz de PDC6 se amplificaron mediante el uso de la mezcla maestra para PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un kit de levadura/bact. de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) .

El Fragmento A de PDC6 se amplificó con el iniciador oBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y el iniciador 0BP441 (sec. con núm. de ident.: 27) gue contenia una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento B de PDC6. El Fragmento B de PDC6 se amplificó con el iniciador oBP442 (sec. con núm. de ident.: 28), que contenia una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento A de PDC6, y el iniciador OBP443 (sec. con núm. de ident.: 29) que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento U de PDC6. El Fragmento U de PDC6 se amplificó con el iniciador oBP444 (sec. con núm. de ident.: 30) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento B de PDC6, y el iniciador OBP445 (sec. con núm. de ident.: 31) que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento C de PDC6. El Fragmento C de PDC6 se amplificó con el iniciador OBP446 (sec. con núm. de ident.: 32) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de PDC6, y el iniciador ???447 (sec. con núm. de ident.: 33). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El Fragmento AB de PDC6 se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento A y el Fragmento B de PDC6 y amplificar con iniciadores oBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y oBP443 (sec. con núm. de ident.: 29). El Fragmento UC de PDC6 se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento U y el Fragmento C de PDC6 y amplificar con iniciadores OBP444 (sec. con núm. de ident.: 30) y oBP447 (sec. con núm. de ident.: 33) . Los productos de PCR resultantes se purificaron en gel de agarosa seguido del uso de un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de PDC6 se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento AB y el Fragmento UC de PDC6 y amplificar con iniciadores oBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y ???447 (sec. con núm. de ident.: 33). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 se elaboraron y transformaron con el cásete PCR ABUC de PDC6 mediante el uso del kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementadas con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con eliminación de pdc6 se analizaron por PCR con iniciadores oBP448 (sec. con núm. de ident.: 34) y oBP449 (sec. con núm. de ident.: 35) mediante el uso de ADN genómico preparado con un kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó un transformante correcto como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6: :URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6::URA3 se cultivó durante la noche en YPD y se colocó en placas en un medio sintético completo que contenia ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador URA3. La supresión y la extracción del marcador se confirmó por PCR y secuenciación con iniciadores oBP448 (sec. con núm. de ident.: 34) y oBP449 (sec. con núm. de ident.: 35) mediante el uso de ADN genómico preparado con un kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC6 de la cepa aislada se demostró mediante el resultado negativo de la PCR mediante el uso de iniciadores específicos para la secuencia codificante de PDC6, oBP554 (sec. con núm. de ident.: 36) y OBP555 (sec. con núm. de ident.: 37) . Se seleccionó la cepa aislada correcta como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 y se designó BP891.

Supresión de PDCl e integración de ilvDSm Se eliminó el gen PDCl y se lo reemplazó por la región codificante de ilvD de Streptococcus utans (ATCC núm. 700610) . El Fragmento A seguido de la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans para el cásete PCR para la supresión de PDCl-integración de ilvDSm se amplificó mediante el uso de la mezcla maestra para PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico de NYLA83 (descrito en la presente invención y en la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 61/246,709) como plantilla, preparado con un kit de levadura/bact. de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . El Fragmento A-ilvDSm de PDCl (sec. con núm. de ident.: 141) se amplificó con el iniciador OBP513 (sec. con núm. de ident. : 38) y el iniciador OBP515 (sec. con núm. de ident.: 39) que contenia una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento B de PDCl. Los Fragmentos B, U y C del cásete PCR para la supresión de PDC1-integración de ilvDSm se amplificaron con la mezcla maestra para PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . El Fragmento B de PDCl se amplificó con el iniciador OBP516 (sec. con núm. de ident.: 40) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento A-ilvDSm de PDCl, y el iniciador oBP517 (sec. con núm. de ident.: 41) que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento U de PDCl. El Fragmento U de PDCl se amplificó con el iniciador OBP518 (sec. con núm. de ident.: 42) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento B de PDCl, y el iniciador oBP519 (sec. con núm. de ident.: 43) que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento C de PDCl. El Fragmento C de PDCl se amplificó con el iniciador OBP520 (sec. con núm. de ident.: 44), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento U de PDCl, y el iniciador OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45) . Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El Fragmento A-ilvDSm-B de PDCl se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento A-ilvDSm y el Fragmento B de PDCl y amplificar con los iniciadores oBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y oBP517 (sec. con núm. de ident.: 41). El Fragmento UC de PDCl se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento U y el Fragmento C de PDCl y amplificar con los iniciadores OBP518 (sec. con núm. de ident.: 42) y OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45) . Los productos de PCR resultantes se purificaron en gel de agarosa seguido del uso de un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete A-ilvDSm-BUC de PDCl (sec. con núm. de ident. : 142) se creó por PCR superpuesta al mezclar el Fragmento A-ilvDSm-B y el Fragmento UC de PDCl y amplificar con iniciadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 se elaboraron y transformaron con el cásete PCR A-ilvDSm-BUC de PDCl mediante el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementadas con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con eliminación de pdcl e integración de ilvDSm se analizaron por PCR con iniciadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 46) y 0BP512 (sec con núm. de ident.: 47) mediante el uso de ADN genómico preparado con el kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC1 de la cepa aislada se demostró mediante un resultado negativo de la PCR mediante el uso de iniciadores específicos para la secuencia codificante de PDC1, OBP550 (sec. con núm. de ident. : 48) y 0BP551 (sec. con núm. de ident.: 49). Se seleccionó un transformante correcto como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl :: ilvDSm-URA3 se cultivó durante la noche en YPD y se colocó en placas en un medio sintético completo que contenia ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador URA3. La supresión de PDC1, la integración de ilvDSm y la extracción del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con iniciadores 0BP511 (sec. con núm. de ident.: 46) y OBP512 (sec. con núm. de ident.: 47) mediante el uso de ADN genómico preparado con el kit de levadura/bact. de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó la cepa aislada correcta como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl :: ilvDSm y se designó BP907.

Supresión de PDC5 e integración de sadB Se eliminó el gen PDC5 y se reemplazó por la región codificante de sadB de Achromobacter xylosoxidans . Un segmento del cásete PCR para la supresión de PDC5-integración de sadB se clonó primero en plásmido pUC19-URA3MCS . pUC19-URA3MCS está basado en pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de Saccaromyces cerevisiae situada en un sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés) . pUC19 contiene el replicón pMBl y un gen codificante para beta-lactamasa para la replicación y selección en Escherichia coli. Además de la secuencia codificante para URA3, las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' de este gen se incluyeron para la expresión del gen URA3 en la levadura. Puede usarse el vector con fines de clonación y como un vector de integración de levadura.

El ADN que comprende la región codificante de URA3 junto con 250 pb en dirección 5' y 150 pb en dirección 3' de la región codificante de URA3 del ADN genómico de Saccaromyces cerevisiae CEN.PK 113-7D se amplificó con iniciadores oBP438 (sec. con núm. de ident.: 12) que contenían los sitios de restricción BamHI, AscI, Pmel y Fsel y oBP439 (sec. con núm. de ident.: 13) que contenían los sitios de restricción Xbal, Pací y Notl, mediante el uso de la mezcla maestra para PCR de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) . Se preparó el ADN genómico mediante el uso del kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . El producto de PCR y pUC19 (sec. con núm. de ident.: 144) se ligaron con ADN ligasa de T4 después de la digestión con BamHI y Xbal para crear el vector pUC19-URA3MCS . Se confirmó el vector por PCR y secuenciación con iniciadores OBP264 (sec. con núm. de ident. : 10) y OBP265 (sec. con núm. de ident . : 11) .

La secuencia codificante de sadB y el Fragmento B de PDC5 se clonaron en pUCl9-URA3MCS para crear la porción sadB-BU del cásete PCR A-sadB-BUC de PDC5. La secuencia codificante de sadB se amplificó mediante el uso de pLH468-sadB (sec. con núm. de ident.: 67) como plantilla con el iniciador oBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) que contenia un sitio de restricción AscI, y el iniciador oBP531 (sec. con núm. de ident.: 51) que contenia una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento B de PDC5. El Fragmento B de PDC5 se amplificó con el iniciador oBP532 (sec. con núm. de ident.: 52) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' de sadB,. y el iniciador oBP533 (sec. con núm. de ident.: 53) que contenía un sitio de restricción Pmel. Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El Fragmento B de sadB-PDC5 se creó por PCR superpuesta al mezclar los productos de PCR de sadB y el Fragmento B de PDC5 y amplificar con iniciadores OBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) y oBP533 (sec. con núm. de ident.: 53) . El producto de PCR resultante se digirió con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas adecuadas. El plásmido resultante se usó como plantilla para la amplificación de sadB-Fragmento B-Fragmento U mediante el uso de los iniciadores OBP536 (sec. con núm. de ident . : 54) y OBP546 (sec. con núm. de ident.: 55) que contenia una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento C de PDC5. El Fragmento C de PDC5 se amplificó con el iniciador OBP547 (sec. con núm. de ident.: 56) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' de sadB-Fragmento B-Fragmento U de PDC5, y el iniciador oBP539 (sec. con núm. de ident.: 57). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . Se creó sadB-Fragmento B-Fragmento U-Fragmento C de PDC5 por PCR superpuesta al mezclar sadB-Fragmento B-Fragmento U y el Fragmento C de PDC5 y amplificar con iniciadores oBP536 (sec. con núm. de ident.: 54) y oBP539 (sec. con núm. de ident.: 57) . El producto de PCR resultante se purificó en gel de agarosa seguido del uso de un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete A-sadB-BUC de PDC5 (sec. con núm. de ident.: 143) se creó al amplificar sadB-Fragmento B-Fragmento U-Fragmento C de PDC5 con iniciadores OBP542 (sec. con núm. de ident.: 58) que contenían una cola 5' con homología a los 50 nucleótidos inmediatamente en dirección 5' de la secuencia codificante de PDC5 nativa, y oBP539 (sec. con núm. de ident. : 57) . El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Las células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm se elaboraron y transformaron con el cásete PCR A-sadB-BUC de PDC5 mediante el uso de un kit Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol (no glucosa) a 30 °C. Los transformantes con eliminación de pdc5 e integración de sadB se analizaron por PCR con iniciadores oBP540 (sec. con núm. de ident.: 59) y OBP541 (sec. con núm. de ident.: 60) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC5 de la cepa aislada se demostró mediante un resultado negativo de la PCR mediante el uso de iniciadores específicos para la secuencia codificante de PDC5, oBP552 (sec. con núm. de ident.: 61) y oBP553 (sec. con núm. de ident.: 62). Se seleccionó un transformante correcto como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3 se cultivó durante la noche en YPE (1 % de etanol) y se colocó en placas en un medio sintético completo suplementado con etanol (no glucosa) y que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador URA3. La supresión de PDC5, la integración de sadB y la extracción del marcador se confirmaron por PCR con los iniciadores OBP540 (sec. con núm. de ident.: 59) y OBP541 (sec. con núm. de ident.: 60) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bact . de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó la cepa aislada correcta como la cepa CEN . PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB y se designó BP913.

Supresión de GPD2 Para eliminar la región codificante de GPD2 endógeno, un cásete gpd2 : : loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident.: 145) se amplificó por PCR mediante el uso de loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident.: 68) como plantilla de ADN. loxP-URA3-loxP contiene el marcador URA3 de (ATCC núm. 77107) flanqueado por sitios loxP recombinasa. Se realizó la PCR mediante el uso de ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los iniciadores LA512 y LA513 (sec. con núms . de ident.: 8 y 9) . La porción GPD2 de cada iniciador se derivó de la región 5' en dirección 5' de la región codificante GPD2 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante, para que la integración del marcador loxP-URA3-loxP produjera el reemplazo de la región codificante de GPD2. El producto de PCR se transformó en BP913 y los transformantes se seleccionaron en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol (no glucosa) . Los transformantes se analizaron por PCR para verificar su correcta integración mediante el uso de los iniciadores OBP582 y AA270 (sec. con núms . de ident . : 63 y 64).

El marcador URA3 se recicló por transformación con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 66) y se colocó en placas en medios sintéticos completos sin histidina suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes se cultivaron según el método de estrías en un medio sintético completo suplementado con 1 % de etanol y que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %), y se incubaron a 30 °C para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador URA3. Las cepas aisladas resistentes a 5-FOA se cultivaron en YPE (1 % de etanol) para la extracción del plásmido pRS423 :: PGALl-cre . La supresión y la extracción del marcador se confirmaron por PCR con los iniciadores OBP582 (sec. con núm. de ident.: 63) y oBP591 (sec. con núm. de ident.: 65) . Se seleccionó la cepa aislada correcta como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB Agpd2 : : loxP y se designó PNY1503 (BP1064).

BP1064 se transformó con plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083; PNY1504) .

Construcción de las cepas NYLA74, NYLA83 y NYLA84 Inserción-inactivación de los genes endógenos PDC1 y PDC6 de S. cerevisiae. Los genes PDC1, PDC5 y PDC6 codifican las tres principales isoenzimas de piruvato descarboxilasa, tal como se describe a continuación: Construcción de pRS425 : : GPM-sadB Se clonó un fragmento de ADN que codifica una butanol deshidrogenasa (sec. con núm. de ident . : 70) de Achromobacter xylosoxidans (descrita en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0269823) . La región codificante de este gen, denominada sadB, para alcohol deshidrogenasa secundaria (sec. con núm. de ident.: 69) se amplificó mediante el uso de condiciones estándares del ADN genómico de A. xylosoxidans, preparado con el kit de Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo recomendado para los organismos gram negativos con iniciadores directos e inversos N473 y N469 (sec. con núms . de ident.: 74 y 75), respectivamente. El producto de PCR se clonó con TOPO®-Blunt en pCR®4 BLUNT ( Invitrogen™, Carlsbad, CA) para producir pCR4Blunt : : sadB, que se transformó en células E. coli Mach-1. Posteriormente, el plásmido se aisló de cuatro clones, y se verificó la secuencia.

La región codificante sadB se amplificó por PCR a partir de pCR4Blunt : : sadB . Los iniciadores de PCR contenían secuencias 5' adicionales que se superpondrían con el promotor GP 1 de levadura y el terminador ADH1 (N583 y N584, presentados como sec. con núms. de ident.: 76 y 77) . Después, el producto de PCR se clonó mediante el uso de la metodología de "reparación por recombinación" en Saccharomyces cerevisiae ( a, et al., Gene 58:201-216, 1987) de la siguiente manera. El vector lanzadera de levadura-E. coli pRS425: :GPM: : kivD: :ADH que contiene el promotor GPM1 (sec. con núm. de ident.: 72), la región codificante kivD de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 71) y el terminador ADH1 (sec. con núm. de ident.: 73) (descrito en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0092957 Al, Ejemplo 17) se digirió con las enzimas de restricción BbvCI y Pací para liberar la región codificante kivD. Aproximadamente 1 ]iq del fragmento restante del vector se transformó en la cepa BY4741 de S. cerevisiae junto con 1 µg del producto de PCR sadB. Se seleccionaron transformantes en medio sintético completo sin leucina. El evento de recombinación adecuado, que generó pRS425::GPM-sadB, se confirmó por PCR mediante el uso de los iniciadores N142 y N459 (sec. con núms . de ident.: 108 y 109).

Construcción del cásete de integración PGPMl-sadB y supresión de PDC6: Se preparó un cásete de integración pdc6 : : PGPMl-sadB- ADHlt-URA3r al unir el segmento GPM-sadB-ADHt (sec. con núm. de ident.: 79) de pRS425 : : GPM-sadB (sec. con núm. de ident.: 78) con el gen URA3r de pUC19-URA3r. pUC19-URA3r (sec. con núm. de ident.: 80) que contiene el marcador URA3 de pRS426 (ATCC núm. 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 75 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la extracción del marcador URA3. Los dos segmentos de ADN se unieron mediante PCR SOE (como se describe en Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989) por medio del uso de como plantilla los ADN plasmidicos pRS425 :: GPM-sadB y pUC19-URA3r, con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e iniciadores de 114117-11A a 114117-11D (sec. con núms. de ident . : 81, 82, 83 y 84), y 114117-13A y 114117-13B (sec. con núms. de ident.: 85 y 86).

Los iniciadores externos para la PCR SOE (114117-13A y 114117-13B) contenían regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del promotor y terminador de PDC6, respectivamente. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 (ATCC núm. 200866) y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de iniciadores 112590-34G y 112590-34H (sec. con núm. de ident.: 87 y 88) y 112590-34F y 112590-49E (sec. con núm. de ident.: 89 y 90) para verificar la integración en el locus PDC6 con supresión de la región codificante del PDC6. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementarios con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt .

Construcción del pdcl:: cásete de integración PPDCl-ilvD y supresión de PDC1: Un cásete de integración PPDCl-ilvD-FBAlt-URA3r se preparó mediante la unión del segmento ilvD-FBAlt (sec. con núm. de ident . : 91) de pLH468 (sec. con núm. de ident . : 2) con el gen URA3r de pUC19-URA3r por PCR SOE (como se describe en Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989) por medio del uso de los ADN plasmidicos de pLH468 y pUC19-URA3r como plantilla, con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, A) e iniciadores de 114117-27A a 114117-27D (sec. con núms. de ident.: 111, 112, 113 y 114).

Los iniciadores externos para la PCR SOE (114117-27A y 114117-27D) contenían las regiones 5' y 3' de ~50 pb homologas a las regiones en dirección 3' del promotor de PDC1 y en dirección 3' de la secuencia codificante de PDC1. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 pdc6 :: PGPMl-sadB-ADHlt y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring fiarbor Laboratgry Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de iniciadores 114117-36D y 135 (sec. con núms . de ident.: 92 y 93) e iniciadores 112590-49E y 112590-30F (sec. con núms. de ident.: 90 y 94) para verificar la integración en el locus del PDC1 con supresión de la secuencia codificante del PDC1. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa resultante identificada "NYLA67" tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt .

Supresión de HIS3 Para suprimir la región codificante del gen endógeno HIS3, un cásete his3::URA3r2 se amplificó por PCR a partir de la plantilla de ADN URA3r2 (sec. con núm. de ident.: 95). URA3r2 contiene el marcador URA3 de pRS426 (ATCC núm. 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 500 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador ÜRA3. Se realizó la PCR mediante el uso de ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e iniciadores 114117-45A y 114117-45B (sec. con núms . de ident. : 96 y 97) que generó un producto de PCR ~2.3 kb. La porción de HIS3 de cada iniciador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor de HIS3 y región 3' en dirección 3' de la región codificante para que la integración del marcador de URA3r2 produzca el reemplazo de la región codificante de HIS3. El producto de PCR se transformó en NYLA67 mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medios sintéticos completos sin uracilo y se suplementaron con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta por réplica de cultivo en placa de transformantes en medios sintéticos completos sin histidina y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. El marcador URA3r se recicló por cultivo en placas en medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con los protocolos estándares. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, denominada NYLA73, tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3.

Construcción del cásete de integración pdc5::kanMX y supresión de PDC5: Se amplificó por PCR un cásete pdc5 : : kan X4 de ADN cromosómico de la cepa YLR134W (ATCC núm. 4034091) con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los iniciadores PDC5 : : KanMXF y PDC5::KanMXR (sec. con núms . de ident.: 98 y 99) que generó un producto de PCR ~2.2 kb. La porción de PDC5 de cada iniciador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor de PDC5 y región 3' en dirección 3' de la región codificante para que la integración del marcador de kanMX4 produzca el reemplazo de la región codificante de PDC5. El producto de PCR se transformó en NYLA73 mediante el uso de las técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron sobre medios YP suplementados con 1 % de etanol y geneticina (200 yg/ml) a 30 °C. Los transformantes se> analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus PDC con reemplazo de la región codificante de PDC5 mediante el uso de iniciadores PDC5kofor y N175 (sec. con núms. de ident.: 100 y 101) . Los transformantes correctos identificados tienen el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 pdc5 : : kanMX . La cepa se denominó NYLA74.

Los vectores plasmidicos pRS423 : : CÜPl-alsS+FBA-budA y pRS426 : : FBA-budC+GPM-sadB se transformaron en NYLA74 para crear una cepa productora de butanodiol (NGCI-047) .

Los vectores plasmidicos pLH475-Z4B8 (sec. con núm. de ident. : 140) y pLH468 se transformaron en NYLA74 para crear una cepa productora de isobutanol (NGCI-049).

Supresión de HXK2 (hexocinasa II) : Se amplificó por PCR un cásete hxk2::URA3r a partir de la plantilla URA3r2 (descrita anteriormente) con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, A) e iniciadores 384 y 385 (sec. con núms . de ident.: 102 y 103) que generó un producto de PCR -2.3 kb. La porción de HXK2 de cada iniciador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor de HXK2 y región 3' en dirección 3' de la región codificante para que la integración del marcador URA3r2 produzca el reemplazo de la región codificante de HXK2. El producto de PCR se transformó en NYLA73 mediante el uso de las técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus HXK2 con reemplazo de la región codificante de HXK2 mediante el uso de iniciadores N869 y N871 (sec. con núms. de ident.: 104 y 105). El marcador URA3r2 se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándares. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas de 5-FOA sobre los medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento, y por PCR para verificar la eliminación del marcador correcto por medio del uso de iniciadores N946 y N947 (sec. con núms. de ident.: 106 y 107) . La cepa identificada resultante, denominada NYLA83, tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2.

Construcción del cásete de integración pdc5::kanMX y supresión de PDC5 : Un cásete A pdc5::kanMX4 se amplificó por PCR como se describió anteriormente. El fragmento PCR se transformó en NYLA83 y los transformantes se seleccionaron y se analizaron como se describió anteriormente. Los transformantes correctos identificados denominados NYLA84 tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2 pdc5 : : kanMX .

Los vectores plasmidicos pLH468 y pLH532 se transformaron simultáneamente en la cepa NYLA84 (BY4700 pdc6: : PGPMl-sadB-ADHlt pdcl :: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2 pdc5 : : kanMX4 ) mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y el "butanologen NYLA84" resultante se mantuvo en medios sintéticos completos sin histidina y uracilo, suplementados con 1 % de etanol a 30 °C.

Vector de expresión pLH468 Se construyó el plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para la expresión de DHAD, KivD y HADH en levadura, según se describe en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0305363, incorporada como referencia en la presente descripción. pLH486 se construyó para contener: un gen quimérico con la región codificante del gen ilvD de Streptococcus mutans (posición nt 3313-4849) expresado del promotor FBA1 de S. cerevisiae (nt 2109 - 3105) seguido por el terminador FBA1 (nt 4858 - 5857) para la expresión de DHAD; un gen quimérico con la región codificante de alcohol deshidrogenasa de higado de caballo optimizada por codones (nt 6286-7413) expresada del promotor GP 1 de S. cerevisiae (nt 7425-8181) seguido por el terminador ADH1 (nt 5962-6277) para la expresión de ADH; y un gen quimérico con la región codificante del gen kivD optimizado por codones de Lactococcus lactis (nt 9249-10895) expresado del promotor TDH3 (nt 10896-11918) seguido del terminador TDH3 (nt 8237-9235) para la expresión de KivD.

Las regiones codificantes para cetoisovalerato descarboxilasa (KivD) de Lactococcus lactis y alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HADH) se sintetizaron mediante DNA2.0, Inc. (Menlo Park, CA) con base en los codones que se optimizaron para expresión en Saccharomyces cerevisiae (sec. con núm. de ident . : 71 y 118, respectivamente) y proporcionados en los plásmidos pKivDy-DNA2.0 y pHadhy-DNA2.0. Las proteínas codificadas son sec. con núms . de ident.: 117 y 119, respectivamente. Se construyeron los vectores de expresión individuales para KivD y HADH. Para unir pLH467 (pRS426: : PTDH3-kivDy-TDH3t ) , el vector pNY8 (sec. con núm. de ident.: 121; denominado, además, pRS426. GPD-ald-GPDt , descrito en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2008/0182308, Ejemplo 17, que se incorpora como referencia en la presente descripción) se procesó por digestión con las enzimas AscI y Sfil, eliminando así el promotor GPD y la región codificante ald. Un fragmento del promotor TDH3 (sec. con núm. de ident.: 122) de pNY8 se amplificó por PCR para añadir un sitio AscI al extremo 5' y un sitio Spel al extremo 3' , mediante el uso del iniciador de 5' OT1068 y el iniciador de 3' OT1067 (sec. con núms. de ident.: 123 y 124). El fragmento del vector pNY8 digerido con Ascl/Sfil se unió con el producto de PCR del promotor TDH3 digerido con AscI y Spel y el fragmento Spel-Sfil que contiene la región codificante de kivD optimizada por codones aislada del vector pKivD-DNA2.0. La triple unión generó el vector pLH467 (pRS426 : : PTDH3-kivDy-TDH3t ) . Se verificó pLH467 para determinar el mapeo de restricción y la secuenciación . pLH435 (pRS425: : PGPMl-Hadhy-ADHlt) se derivó del vector pRS425 : : GPM-sadB (sec. con núm. de ident.: 78) que se describe en la solicitud provisional de Estados Unidos núm. de serie 61/058,970, Ejemplo 3, que se incorpora como referencia en la presente descripción. pRS425 :: GPM-sadB es el vector pRS425 (ATCC núm. 77106) con un gen quimérico que contiene el promotor GPM1 (sec. con núm. de ident.: 72), la región codificante de una butanol deshidrogenasa de Achromobacter xylosoxidans (sadB; ADN con la sec. con núm. de ident.: 69; proteina con la sec. con núm. de ident.: 70: que se describe en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0269823), y el terminador ADH1 (sec. con núm. de ident.: 73). pRS425 : : GPMp-sadB contiene los sitios Bbvl y Pací en los extremos 5' y 3' de la región codificante sadB, respectivamente. Se agregó un sitio Nhel en el extremo 5' de la región codificante sadB mediante la mutagénesis de sitio dirigido al usar iniciadores OT1074 y OT1075 (sec. con núms . de ident.: 126 y 127) para generar el vector pRS425-GPMp-sadB-NheI , el cual se verificó mediante secuenciación . pRS425 : : PGPMl-sadB-Nhel se procesó por digestión con Nhel y Pací para abandonar la región codificante sadB, y se unió con el fragmento Nhel-PacI que contiene la región codificante HADH optimizado por codones del vector pHadhy-DNA2.0 para crear pLH435.

Para combinar los casetes de expresión KivD y HADH en un solo vector, el vector de levadura pRS411 (ATCC núm. 87474) se digirió con SacI y Notl, y se unió con el fragmento Sacl-Sall de pLH467 que contiene el cásete PTDH3-kivDy-TDH3t junto con el fragmento Sall-Notl de pLH435 que contiene el cásete PGPMl-Hadhy-ADHlt en una reacción de unión triple. Esto produjo el vector pRS411 : : PTDH3-kivDy-PGPMl-Hadhy (pLH441) que se verificó con mapeo de restricción.

Para generar un vector de coexpresión para los tres genes en la ruta del isobutanol inferior: se usaron ilvD, kivDy y Hadhy, pRS423 FBA ilvD(Strep) (sec. con núm. de ident.: 128) que se describe en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2010/0081154 como la fuente del gen IlvD. Este vector lanzadera contiene un origen de replicación Fl (nt 1423 a 1879) para mantenimiento en E. coli y un origen de 2 micrones (nt 8082 a 9426) para replicación en levadura. El vector tiene un promotor FBA1 (nt 2111 a 3108; sec. con núm. de ident.: 120) y un terminador FBA (nt 4861 a 5860; sec. con núm. de ident.: 129). Además, incluye el marcador His (nt 504 a 1163) para selección en levadura y el marcador de resistencia a la ampicilina (nt 7092 a 7949) para selección en E. coli. La región codificante ilvD (nt 3116 a 4828; sec. con núm. de ident. : 115; Proteína con la sec. con núm. de ident. 116) de Streptococcus mutans UA159 (ATCC núm. 700610) está entre el promotor FBA y el terminador FBA y forma un gen quimérico para expresión. Además, una etiqueta Lumio está fusionada a la región codificante ilvD (nt 4829-4849) .

La primera etapa fue linealizar pRS423 FBA ilvD(Strep) (también denominado pRS423-FBA ( Spel ) -IlvD {Streptococcus mutans) -Lumio) con SacI y SacII (con el sitio SacII generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , para dar un vector con una longitud total de 9, 482 pb. La segunda etapa fue aislar el cásete kivDy-hADHy de pLH441 con SacI y Kpnl (con el sitio Kpnl generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , que da un fragmento de 6, 063 pb. Este fragmento se unió con el fragmento del vector de 9,482 pb de pRS423-FBA ( Spel ) -IlvD ( Streptococcus mutans) -Lumio . Este vector generado pLH468 (pRS423 : : PFBA1-ilvD (Strep) Lumio-FBAlt-PTDH3-kivDy-TDH3t-PGPMl-hadhy-ADHlt ) se confirmó con mapeo de restricción y secuenciación .

Construcción de pLH532 El pLH532 plásmido (sec. con núm. de ident. : 130) se construyó para expresión de ALS y KARI en levadura. pLH532 es un vector pHR81 (ATCC núm. 87541) que contiene los siguientes genes quiméricos: 1) el promotor CUPl (sec con núm'. de ident: 139) , región codificante de la acetolactato sintasa de Bacillus subtilis (AlsS; sec. con núm. de ident.: 137; Proteína con la sec. con núm. de ident. 138) y terminador CYC1 2 (sec. con núm. de ident.: 133); 2) una región promotora ILV5 (sec. con núm. de ident.: 134), región codificante Pf5.IlvC (sec. con núm. de ident.: 132) y terminador ILV5 (sec. con núm. de ident.: 135); y 3) la región promotora FBA1 (sec. con núm. de ident.: 136), región codificante KARI de S. cerevisiae (ILV5; sec. con núm. de ident.: 131); y el terminador CYC1.

La región codificante Pf5.IlvC es una secuencia que codifica KARI derivado de Pseudomonas fluorescens, según se describió en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0163376, que se incorpora como referencia en la presente descripción.

La región codificante Pf5.IlvC se sintetizó mediante DNA2.0, Inc. (Menlo Park, CA; sec. con núm. de ident.: 132) con base en los codones que se optimizaron para expresión en Saccharomyces cerevisiae .

Construcción de pYZ090 pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1) se basa en la cadena principal de pHR81 (ATCC núm. 87541) y se construyó para contener un gen quimérico con la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (nt posición 457-2172) expresado del promotor CUPl de levadura (nt 2-449) y seguido por el terminador CYC1 (nt 2181-2430) para la expresión de ALS, y un gen quimérico con la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656) expresado del promotor ILV5 de levadura (2433-3626) y seguido por el terminador ILV5 (nt 4682-5304) para la expresión de KARI.

Construcción de pYZ067 pYZ067 se construyó para contener los siguientes genes quiméricos: 1) la región codificante del gen ilvD de S. mutans UA159 (nt posición 2260-3971) expresado del promotor FBA1 de levadura (nt 1161-2250) seguido por el terminador FBA (nt 4005-4317) para la expresión de dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD) , 2) la región codificante para ADH de hígado de caballo (nt 4680-5807) expresado del promotor GPM de levadura (nt 5819-6575) seguido por el terminador ADH1 (nt 4356-4671) para la expresión de alcohol deshidrogenasa, y 3) la región codificante del gen KivD de Lacrococcus lactis (nt 7175-8821) expresado del promotor TDH3 de levadura (nt 8830-9493) seguido por el terminador TDH3 (nt 5682-7161) para la expresión de cetoisovalerato descarboxilasa .

Construcción de pRS423 : : CUPl-alsS+FBA-budA y pRS426::FBA-budC+GPM-sadB y pLH475-Z4B8 La construcción de pRS423 :: CUPl-alsS+FBA-budA y pRS426 : : FBA-budC+GPM-sadB y pLH475-Z4B8 se describe en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0305363, incorporada como referencia en la presente descripción.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes ilustrarán más detalladamente la invención. Debe interpretarse que, si bien los siguientes ejemplos implican el uso de maíz como materia prima y COFA como agente extractante ISPR obtenido a partir de la hidrólisis de lípidos de maíz, pueden usarse otras fuentes de biomasa como materia prima y para la hidrólisis enzimática de aceite de biomasa, sin apartarse de la presente invención.

Como se usa en la presente descripción, él significado de las abreviaturas usadas es el siguiente: "g" significa gramo (s), "kg" significa kilogramo ( s ) , "1" significa litro (s), "mi" significa mililitro ( s ) , "µ?" significa microlitro ( s ) , "ml/1" significa mililitro ( s ) por litro, "ml/min" significa mililit o ( s ) por minuto, "DI" significa desionizado, "uM" significa micrómetro ( s ) , "nm" significa nanómetro ( s ) , "p/v" significa peso/volumen, "DO" significa densidad óptica, "??e??" significa una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nM, "psc" significa peso seco celular, "rpm" significa revoluciones por minuto, "°C" significa grados Celsius, "°C/min" significa grados Celsius por minuto, "lepm" significa litros estándar por minuto, "ppm" significa parte por millón, "pdc" significa enzima de piruvato descarboxilasa seguido por el número de enzima.

Métodos generales Cultivo en matraz de siembra Una cepa de Saccharomyces cerevisiae que se modificó para producir isobutanol a partir de una fuente de hidrato de carbono, con supresión de pdcl, pdc5 y pdc6, se cultivó en 0.55-1.1 g/1 de psc (DO600 1.3-2.6 - Thermo Helios OÍ Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) en matraces de semilla a partir de un cultivo congelado. El cultivo se realizó a 26 °C en un incubador que giraba a 300 rpm. El cultivo congelado se almacenó previamente a - 80 °C. La composición del medio del primer matraz de siembra fue: 3.0 g/1 de dextrosa 3.0 g/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de medio minimo completo de aminoácido ForMedium™ (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base nitrogenada sin aminoácidos Difco (núm. 291920) Se transfirieron 12 mililitros del cultivo del primer matraz de siembra a un matraz de 2 litros y se cultivó a 30 °C en un incubador que giraba a 300 rpm. El segundo matraz de siembra tiene 220 mi del siguiente medio: 30.0 g/1 de dextrosa 5.0 g/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de medio minimo completo de aminoácido ForMedium™ (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos Difco (núm. 291920) 0.2 M de solución tampón MES titulada a un pH de 5.5-6.0 El cultivo se realizó a 0.55-1.1 g/1 de psc (??ß?? 1.3-2.6). Se realizó una adición de 30 mi de una solución que contenia 200 g/1 de peptona y 100 g/1 de extracto de levadura a esta concentración celular. Después, se realizó una adición de 300 mi de 0.2 uM de Cognis esterilizado con filtro, y se añadió 90-95 % de alcohol oleilico en el matraz. Se dejó crecer el cultivo a > 4 g/1 de psc (D060o > 10) antes de recolectarse y añadirse a la fermentación.

Preparación de la fermentación Preparación inicial del recipiente de fermentación Se cargó un recipiente de fermentación encamisado de vidrio de 2 litros (Sartorius AG, Goettingen, Alemania) con agua interna al 66 % del peso de licuación. Una sonda de pH (Hamilton Easyferm Plus K8, núm. de pieza: 238627, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Suiza) se calibró mediante el menú de calibración de torre de control Sartorius DCU-3. El cero se calibró a un pH=7. La amplitud se calibró a un pH=4. Después, se colocó la sonda en un recipiente de fermentación a través de la placa de cabeza de acero inoxidable. Se colocó, además, una sonda de oxigeno disuelto (sonda p02) en el recipiente de fermentación a través de la placa de cabeza. Se fijaron tubos usados para suministrar nutrientes, el cultivo de semilla, el solvente de extracción y la base en la placa de cabeza y se laminaron los extremos. Se colocó el recipiente de fermentación completo en una autoclave Steris (Steris Corporation, Mentor, Ohio) y se esterilizó en un ciclo liquido durante 30 minutos.

Se extrajo el recipiente de fermentación de la autoclave y se lo colocó en una célula de carga. El suministro de agua de enfriamiento y la linea de retorno se conectaron al agua interna y se drenaron, respectivamente. Las lineas de agua de enfriamiento de entrada y salida del condensador se conectaron a un baño de temperatura de recirculación 6-L a 7 °C. La linea de ventilación que transfiere el gas del recipiente de fermentación se conectó a una linea de paso que estaba conectada a un espectrómetro de' masas Thermo (Prima dB, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts ) . La linea del tubo rociador se conectó a la linea de suministro de gas. Los tubos para añadir nutrientes, solvente de extracción, el cultivo de semilla y la base se conectaron a través de bombas o se cerraron con abrazaderas.

Se controló la temperatura del recipiente de fermentación a 55 °C con un termopar y un circuito de circulación de. agua interna. Los granos de maíz húmedos (muesca amarilla núm. 2) se molieron mediante el uso de un molino triturador con un tamiz de 1.0 mm, y los granos de maiz enteros molidos resultantes se añadieron posteriormente en el recipiente de fermentación a una carga de 29 a 30 % (peso de sólidos del maiz seco) de la masa de reacción de licuación .

Tratamiento con lipasa previo a la licuación Se añadió una materia prima de enzima lipasa en el recipiente de fermentación hasta una concentración final de lipasa de 10 ppm. Se mantuvo el recipiente de fermentación a 55 °C, 300 rpm y 0.3 lepm de N2 superpuesto durante >6 horas. Una vez finalizado el tratamiento con lipasa, se realizó la licuación como se describe a continuación (Licuación) .

Licuación Se añadió una alfa-amilasa en el recipiente de fermentación según su hoja de especificaciones mientras el recipiente de fermentación realizaba la mezcla a 300-1200 rpm, con la adición de N2 interno estéril a 0.3 lepm a través del tubo rociador. Se cambió el valor determinado de temperatura de 55 °C a 85 °C. Cuando la temperatura fue de > 80 °C, se inició el tiempo de cocción de licuación y el ciclo de licuación se mantuvo a > 80 °C durante 90-120 minutos. El valor determinado de temperatura del recipiente de fermentación se estableció a la temperatura de fermentación de 30 °C una vez finalizado el ciclo de licuación. Se redirigió N2 del tubo rociador al espacio de cabeza para evitar la formación de espuma sin la adición de un agente guimico antiespumante .

Tratamiento con lipasa posterior a la licuación La temperatura del recipiente de fermentación se estableció a 55 °C en lugar de 30 °C una vez completado el ciclo de licuación (Licuación) . Se controló el pH manualmente a pH=5.8 al añadir bolos de ácido o base según fue necesario. Se añadió una materia prima de enzima lipasa en el recipiente de fermentación hasta una concentración final de lipasa de 10 ppm. Se mantuvo el recipiente de fermentación a 55 °C, 300 rpm y 0.3 lepm de N2 superpuesto durante >6 horas. Una vez finalizado el tratamiento con lipasa, se estableció la temperatura del recipiente de fermentación en 30 °C.

Tratamiento de inactivación por calor de la lipasa (método de tratamiento de muerte por calor) Se mantuvo la temperatura del recipiente de fermentación a > 80 °C durante > 15 minutos para inactivar la lipasa. Después del tratamiento de inactivación por calor, se estableció la temperatura del recipiente de fermentación a 30 °C.

Adición de nutrientes previa a la inoculación Se añadió etanol (6.36 ml/1, volumen posterior a la inoculación, 200 de graduación, anhidro) en el recipiente de fermentación justo antes de la inoculación. Se añadió tiamina a la concentración final de 20 mg/1 y, además, se añadió 100 mg/1 de ácido nicotínico justo antes de la inoculación.

Adición de alcohol oleilico o ácidos grasos de aceite de maíz previa a la inoculación Se añadió 1 1/1 (volumen posterior a la inoculación) de alcohol oleilico o ácidos grasos de aceite de maíz inmediatamente después de la inoculación.

Inoculación del recipiente de fermentación La sonda p02 de los recipientes de fermentación se calibró en cero mientras que se añadía N2 en el recipiente de fermentación. La sonda p02 de los recipientes de fermentación se . calibró a su amplitud con depurado de agua estéril a 300 rpm. Se inoculó el recipiente de fermentación después del segundo matraz de siembra con > 4 g/l de psc. El matraz de agitación se extrajo del incubador/agitador durante 5 minutos para permitir la separación de fases de la fase de alcohol oleilico y la fase acuosa. La fase acuosa (110 mi) se transfirió a una botella de inoculación estéril. Se bombeó el inoculo en el recipiente de fermentación a través de una bomba peristáltica.

Condiciones operativas del recipiente de fermentación Se operó el recipiente de fermentación a 30 °C durante las etapas de crecimiento y producción completas. Se dejó caer el pH de un pH entre 5.7-5.9 a un valor determinado de control de 5.2 sin añadir ácido. Se controló el pH durante el resto de las etapas de crecimiento y producción a un pH=5.2 con hidróxido amónico. Se añadió aire estéril en el recipiente de fermentación a través del tubo rociador, a 0.3 lepm durante el resto de las etapas de crecimiento y producción. Se estableció p02 para controlarse a 3.0 % mediante el circuito de control PID de la caja de control Sartorius DCU-3, mediante el uso del control de agitación solamente, y se estableció un mínimo de 300 rpm y un máximo de 2000 rpm para el agitador. Se suministró glucosa a través de la sacarificación y fermentación simultáneas de la pasta de maíz licuada al añadir a-amilasa (glucoamilasa) . Se mantuvo un exceso de glucosa (1-50 g/1) durante el tiempo en que el almidón estuvo disponible para la sacarificación.

Método analítico Análisis de gas El aire del proceso se analizó en un espectrómetro de masas Thermo Prima (Thermo Fisher Scientific Inc., altham, assachusetts) . Se trataba del mismo aire de proceso que se esterilizó y, después, se añadió en cada recipiente de fermentación. El efluente gaseoso de cada recipiente de fermentación se analizó en el mismo espectrómetro de masas. Se realizó una verificación de la calibración del Thermo Prima dB todos los lunes a las 6:00 a.m. La verificación de calibración se programó a través del software Gas Works vl.O (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) asociado con el espectrómetro de masas. El gas calibrado era: GAS % en moles de concentración Frecuencia de de calibración calibración Nitrógeno 78 % semanalmente Oxigeno 21 % semanalmente Isobutanol 0.2 % anualmente Argón 1 % semanalmente Dióxido de 0.03 % semanalmente carbono Se verificó el dióxido de carbono al 5 % y 15 % durante el ciclo de calibración con otros gases envasados conocidos. El oxigeno se verificó al 15 % con otros gases envasados conocidos. Con base en el análisis del efluente gaseoso de cada recipiente de fermentación, la cantidad de isobutanol despojado, oxigeno consumido y dióxido de carbono respirado en los efluentes gaseosos se midió mediante el uso de un análisis de fracción molar del espectrómetro de masas e índices de flujo gaseoso (controlador de flujo de masa) en el recipiente de fermentación. Se calculó el índice de gasificación por hora y después se integró ese índice con la duración de la fermentación.

Medición de biomasa Se preparó una solución de azul de tripano al 0.08 % a partir de una dilución 1:5 de azul de tripano al 0.4 % en NaCl (VWR BDH8721-0) con IX PBS . Se extrajo una muestra de 1.0 mi de un recipiente de fermentación y se colocó en un tubo centrifugo Eppendorf de 1.5 mi y se centrifugó en un Eppendorf, 5415C a 14,000 rpm durante 5 minutos. Después de la centrifugación, la capa superior de solvente se extrajo con una pipeta de canal variable de m200 BioHit con punta de pipeta de 20-200 µ? BioHit. Se puso especial atención en no extraer la capa entre el solvente y las capas acuosas. Después de extraer la capa de solvente, se resuspendió la muestra mediante el uso de un conjunto Vortex-Genie® a 2700 rpm.

Se requirieron una serie de diluciones para preparar la concentración ideal para los recuentos del hemocitómetro. Si la DO era de 10, se realizó una dilución 1:20 para lograr 0.5 de DO, que proporcionaría la cantidad ideal de células para el recuento por cuadrado, 20-30. Para reducir las imprecisiones en la dilución debido a los sólidos de maíz, se requirieron varias diluciones con puntas de pipeta de 100-1000 µ? BioHit recortadas. Se cortó aproximadamente 1 cm.de las puntas para aumentar la abertura y evitar que la punta se obstruyera. Para una dilución final de 1:20, se preparó una dilución 1:1 de la muestra de fermentación y solución de NaCI al 0.9 %. Después, se generó una dilución 1:1 de la solución anterior (es decir, la dilución inicial 1:1) y la solución de NaCI al 0.9 % (la segunda dilución) seguida de una dilución 1:5 de la segunda dilución y la solución de azul de tripano. Las muestras se agitaron entre cada dilución y las puntas cortadas se enjuagaron en soluciones de NaCl al 0.9 % y azul de tripano.

Se colocó el cubreobjetos cuidadosamente sobre el hemoci tóme t ro (Hausser Scientific Bright-Line 1492) . Se extrajo una alícuota (10 µ?) de la dilución final de azul de tripano con una pipeta de canal variable m20 BioHit con puntas de pipeta de 2-20 µ? BioHit y se inyectó en el hemocitómet ro . Se colocó el hemocitómet ro en el microscopio Zeis Axioskop 40 a una magnificación de 40x. El cuadrante central se dividió en 25 cuadrados y se realizó el recuento y el registro de los cuatro cuadrados de los ángulos y del centro en ambas cámaras. Después del recuento de las cámaras, se obtuvo el promedio y se multiplicó por el factor de dilución (20) , después por 25 para el número de cuadrados en el cuadrante en el hemocitómet ro , y se dividió posteriormente por 0.0001 mi, que es el volumen del cuadrante que se contabilizó. La suma de este cálculo es la cantidad de células por mi.

Análisis de cromatografía líquida (LC) de productos de fermentación en la fase acuosa Se refrigeraron las muestras hasta que estuvieran listas para el procesamiento. Se extrajeron las muestras de la refrigeración y se permitió que alcanzaran temperatura ambiente (aproximadamente una hora) . Aproximadamente 300 µ? de la muestra se transfirió con una pipeta de canal variable mlOOO BioHit con puntas de pipeta de 100-1000 µ? BioHit a un filtro centrifugo de 0.2 um (filtro centrifugo de nilón Nanosep® MF modificado) y, después, se centrifugó con Eppendorf, 5415C durante cinco minutos a 14,000 rpm. Aproximadamente 200 µ? de la muestra filtrada se transfirió a un vial de automuestreo 1.8 con un vial de vidrio de 250 µ? inserto con soporte de polímero. Se usó una tapa roscada con tabique PT FE para tapar el vial antes de agitar la muestra con un conjunto Vort ex-Genie® a 2700 rpm.

Después, se sometió la muestra en un LC de serie 1200 de Agilent equipado con bombas binarias ísocráticas , desga s i f i cador de vacío, compartimento de columna calentada, sistema de enfriamiento de muestreo, detector de UV DAD y detector de RI . La columna usada fue Aminex HPX-87H, 300 X 7.8 con un relleno de catión H Bio-Rad, precolumna 30X4.6. La temperatura de la columna fue de 40 °C, con una fase móvil de 0.01 N de ácido sulfúrico a una velocidad de flujo de 0.6 ml/min durante 40 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Tiempos de retención de los productos de fermentación en fase acuosa Análisis de cromatografía de gases (GC) de los productos de fermentación en la fase solvente Se refrigeraron las muestras hasta que estuvieran listas para el procesamiento. Se extrajeron las muestras de la refrigeración y se permitió que alcanzaran temperatura ambiente (aproximadamente una hora) . Aproximadamente 150 µ? de la muestra se transfirió mediante el uso de una pipeta de canal variable de mlOOO BioHit con puntas de pipeta de 100-1000 µ? BioHit a un vial de automuestreo 1.8 con un vial de vidrio de 250 µ? inserto con soporte de polímero. Se usó una tapa roscada con tabique PTFE para tapar el vial.

Se sometió la muestra al cromatógrafo de gases Agilent 7890A con un inyector 7683B y un automuestreador G2614A. La columna fue una columna HP-InnoWax (30 m x 0.32 mm de DI, 0.25 µ?? de película). El gas portador fue helio a una velocidad de flujo de 1.5 ml/min medida a 45 °C con una presión de cabeza constante; la división del inyector fue de 1:50 a 225 °C; la temperatura del horno fue de 45 °C durante 1.5 minutos, de 45 °C a 160 °C a 10 °C/min durante 0 minutos, después de 230 °C a 35 "C/min durante 14 minutos por un tiempo de ejecución de 29 minutos. La detección de ionización de llama se usó a 260 °C con gas auxiliar de helio de 40 ml/min. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Tiempos de retención de productos de fermentación en la fase solvente Las muestras analizadas para detectar ésteres de butilo de ácidos grasos se sometieron a un cromatógrafo de gases Agilent 6890 con un inyector 7683B y un automuestreador G2614A. La columna era una columna HP-DB-FFAP (15 metros x 0.53 mm de DI (Megabore) , columna de espesor de película de 1 micrón (30 m x 0.32 mm de DI, 0.25 µp\ de película). El gas portador fue helio a una velocidad de flujo de 3.7 mi/min medida a 45 °C con una presión de cabeza constante; la división del inyector fue de 1:50 a 225 °C; la temperatura de horno fue de 100 °C durante 2.0 minutos, de 100 °C a 250 °C a 10 °C/min, después de 250 °C durante 9 minutos por un tiempo de ejecución de 26 minutos. Se usó detección de ionización de llama a 300 °C con gas auxiliar de helio de 40 ml/min. Se usaron los siguientes estándares de GC (Nu-Chek Prep; Elysian, MN) para confirmar la identidad de los productos de éster de isobutilo de ácidos grasos: isobutil palmitato, isobutil estearato, isobutil oleato, isobutil linoleato, isobutil linolenato, isobutil araquidato.

Los Ejemplos 1 a 14 describen diversas condiciones de fermentación que pueden usarse para los métodos reivindicados. Como ejemplo, algunas fermentaciones fueron sometidas a tratamiento con lipasa previo a la licuación y otras a tratamiento con lipasa posterior a la licuación. En otros ejemplos, la fermentación se sometió al tratamiento de inactivación por calor. Después de la fermentación, se midió la titulación efectiva de isobutanol (tit. ef. de iso) , es decir, los gramos totales de isobutanol producidos por litro en volumen acuoso. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ejemplo 1 (control) El identificador experimental 2010Y014 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 2 El identificador experimental 2010Y015 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de tratamiento con lipasa posterior a la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 3 El identificador experimental 2010Y016 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de tratamiento con lipasa posterior a la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación salvo por la exclusión de etanol, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleilico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 4 El identificador experimental 2010Y017 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de tratamiento de muerte por calor posterior a la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación salvo por la exclusión de etanol, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleilico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 5 El identificador experimental 2010Y018 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de tratamiento con lipasa posterior a la licuación salvo por la adición de 7.2 ppm de lipasa después de la licuación, método de tratamiento de muerte por calor posterior a la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 6 (control) El identificador experimental 2010Y019 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de tratamiento de muerte por calor posterior a la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 7 (control) El identificador experimental 2010Y021 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de tratamiento con lipasa previo a la licuación, método de tratamiento de muerte por calor durante la licuación, método de adición de nutrientes posterior a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleilico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 8 El identificador experimental 2010Y022 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleilico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 9 El identificador experimental 2010Y023 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de tratamiento con l-ipasa posterior a la licuación, sin tratamiento de muerte por calor, método de adición de nutrientes posterior a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron los ácidos grasos de aceite de maíz elaborados de aceite de maíz crudo en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 10 El identificador experimental 2010Y024 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de tratamiento con lipasa previo a la licuación, método de licuación, tratamiento de muerte con calor durante la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación salvo que no hay adición de etanol, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 11 El identificador experimental 2010Y029 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de tratamiento con lipasa previo a la licuación, método de licuación, tratamiento de muerte con calor durante la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron los ácidos grasos de aceite de maíz elaborados de aceite de maíz crudo en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 12 El identificador experimental 2010Y030 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de tratamiento con lipasa previo a la licuación, método de licuación, tratamiento de muerte con calor durante la licuación, método de adición de nutrientes previa a la inoculación salvo que no hay adición de etanol, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron los ácidos grasos de aceite de maíz elaborados de aceite de maíz crudo en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 13 - (control) El identificador experimental 2010Y031 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de tratamiento con lipasa posterior a la licuación, sin tratamiento de muerte con calor, método de adición de nutrientes previa a la inoculación salvo que no hay adición de etanol, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron los ácidos grasos de aceite de maíz elaborados de aceite de maíz crudo en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Ejemplo 14 El identificador experimental 2010Y032 incluyó: Método de crecimiento en matraz de siembra, método de preparación inicial del recipiente de fermentación, método de licuación, método de tratamiento con lipasa posterior a la licuación, sin tratamiento de muerte por calor, método de adición de nutrientes posterior a la inoculación, método de inoculación del recipiente de fermentación, método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron los ácidos grasos de aceite de maíz elaborados de aceite de maíz crudo en un solo grupo entre 0.1- 1.0 hora después de la inoculación. El butanologen fue NGCI-070.

Tabla 3. Condiciones de fermentación para los ejemplos 1-14 5 5 15 * La "tit. ef. de iso en g/1" = gramos totales de isobutanol producidos por litro en volumen acuoso Ejemplo 15 El identificador experimental fue GLNOR432A. Se cultivó NGCI-047 (productor de butanodiol) en un medio de 25 mi en un matraz de 250 mi de un vial congelado a ~ 1 de DO. El cultivo previo de semillas se transfirió a un matraz de 2 litros y se cultivó a 1.7-1.8 de DO. El medio para ambos matraces fue: 3.0 g/1 de dextrosa 3.0 g/1 de etanol, anhidro 6.7 g/1 de base nitrogenada sin aminoácidos Difco (núm. 291920) 1.4 g/1 de mezcla deficiente en levadura (Sigma Y2001) 10 ml/1 de 1 % de p/v de materia prima de L-Leucina 2 ml/1 de 1 % de p/v de materia prima de L-triptófano Un recipiente de fermentación de 1 litro Applikon se inoculó con 60 mi del matraz de siembra. El recipiente de fermentación contenia 700 mi del siguiente medio estéril: 20.0 g/1 de dextrosa 8.0 ml/1 de etanol, anhidro 6.7 g/1 de base nitrogenada sin aminoácidos Difco (núm. 291920) 2.8 g/1 de mezcla deficiente en levadura (Sigma Y2001) 20 ml/1 de 1 % p/v de materia prima de L-leucina 4 ml/1 de 1 % p/v de materia prima de L-triptófano 0.5 mi de antiespumante Sigma 204 0.8 ml/1 de 1 % p/v de solución Ergesterol en l:l::Tween 80:Etanol La glucosa residual se mantuvo en exceso con una solución de glucosa de 50 % en peso. La concentración de oxigeno disuelto del recipiente de fermentación se controló a 30 % bajo control de agitación. Se controló el pH a pH=5.5. El recipiente de fermentación se depuró con 0.3 lepm de aire interno estéril. La temperatura se controló a 30 °C.

Ejemplo 16 El identificador experimental fue GLNOR434A. Este ejemplo es igual al Ejemplo 15 excepto por la adición de 3 g de ácido oleico y la adición de 3 g de ácido palmitico antes de la inoculación. NGCI-047 (productor de butanodiol) fue el catalizador biológico.

La Figura 6 muestra que había más gramos por litro de glucosa consumida en el recipiente de fermentación que recibió los ácidos grasos. Los cuadrados representan el recipiente de fermentación que recibió ácido oleico y ácido palmitico. Los círculos representan el recipiente de fermentación que no recibió ácidos grasos adicionales.

Ejemplo 17 El identificador experimental fue GLNOR435A. Este ejemplo es igual al Ejemplo 15 salvo que se inoculó con NGCI-049 (productor de isobutanol) .

Ejemplo 18 El identificador experimental fue GLNOR437A. Este ejemplo es igual al Ejemplo 16 salvo que se inoculó con NGCI-049 (productor de isobutanol) .

La Figura 7 muestra que habla más gramos por litro de glucosa consumida en el recipiente de fermentación que recibió los ácidos grasos. Los cuadrados- representan el recipiente de fermentación que recibió ácido oleico y ácido palmitico. Los circuios representan el recipiente de fermentación que no recibió ácidos grasos adicionales.

Ejemplo 19 El identificador experimental fue 090420_3212. Este ejemplo se realizó de manera similar al Ejemplo 15 salvo que se inoculó con butanologen NYLA84 (productor de isobutanol) . Esta fermentación se llevó a cabo en un recipiente de fermentación Sartorius de 1 litro.

Ejemplo 20 El identificador experimental fue 2009Y047. Este ejemplo se realizó de manera similar al Ejemplo 16 salvo que se inoculó con el butanologen NYLA84 (productor de isobutanol) . Esta fermentación se llevó a cabo con un recipiente de fermentación Sartorius de 1 litro.

La Figura 8 muestra que hubo más gramos por litro de glucosa consumida en el recipiente de fermentación que recibió los ácidos grasos. Los cuadrados representan el recipiente de fermentación que recibió ácido oleico y ácido palmitico. Los circuios representan el recipiente de fermentación que no recibió ácidos grasos adicionales . Los resultados de los Ejemplos 15 a 20 se muestran en la Tabla 4, que ilustra la adición de ± ácidos grasos, la densidad óptica máxima y la glucosa consumida en g/1.

Tabla 4 Ejemplo 21 Tratamiento con lipasa de pasta de maíz licuada para sacarificación y fermentación simultáneas con extracción del producto in situ mediante el uso de alcohol oleilico Las muestras de caldo y alcohol oleilico se tomaron de las fermentaciones realizadas como se describe en los Ejemplos 1, 2 y 3 y se analizaron para determinar el porcentaje en peso de lipidos (derivados como ésteres de metilo de ácidos grasos, FAME) y el porcentaje en peso de ácidos grasos libres (FFA, ésteres de metilo de ácidos grasos, FAME) de conformidad con el método descrito en E. G. Bligh y W. J. Dyer (Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 37:911-17, 1959, en adelante, Referencia 1). La pasta de maiz licuada que se preparó para cada una de las tres fermentaciones se analizó, además, para determinar el porcentaje en peso de lipidos y FFA después del tratamiento con Lipolase® 100 L (Novozymes) (10 ppm de proteina soluble total Lipolase® (análisis de proteínas BCA, Sigma Aldrich) ) por kg de masa de reacción de licuación que contenía 30 % en peso de granos de maíz molidos) . No se añadió lipasa a la pasta de maíz licuada en el Ejemplo 1 (control) , y las fermentaciones descritas en los Ejemplos 2 y 3 que contenían pasta de maíz licuada tratada con lipasa (sin inactivación por calor de lipasa) fueron idénticas salvo que no se añadió etanol en la fermentación descrita en el Ejemplo 3.

El porcentaje de FFA en la pasta de maíz licuada tratada con lipasa preparada para las fermentaciones que se realizaron como se describe en los Ejemplos 2 y 3 fue de 88 % y 89 %, respectivamente, en comparación con el 31 % sin el tratamiento con lipasa (Ejemplo 1) . A las 70 horas (fin de ejecución (EOR) ) , la concentración de FFA en la fase OA de las fermentaciones realizadas según se describe en los Ejemplos 2 y 3 (que contenían lipasa activa) fue de 14 % y 20 %, respectivamente, y se determinó por GC/MS que el aumento correspondiente en lípidos (medidos como derivados de éster metílico de ácidos grasos de aceite de maíz) se debía a la e.sterificación catalizada por lipasa de COFA por OA, en donde COFA se produjo primero mediante hidrólisis catalizada por lipasa del aceite de maíz en la pasta de maíz licuada. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Contenido de lípidos y ácidos grasos libres de las fermentaciones que contienen alcohol oleílico como solvente ISPR y lipasa activa Fermentación Lipasa Tiempo Lipidos FFA Lípidos FFA lípidos % de (h) , (% en (% en (g) (g) + FFA muestra peso) peso) FFA (g) Ejemplo 1 Ninguno Pasta 0.61 0.28 573 274 7.7 31 licuada Ejemplo 1 Ninguno 0.8 h, 0.49 0.22 5.5 2.5 8.0 31 caldo Fermentación Lipasa Tiempo Lipidos FFA Lipidos FFA lipidos % de (h) , (% en (% en (g) (g) + FFA muestra peso) peso) FFA (g) Ejemplo 1 Ninguno 31 h, 0.19 0.03 2.1 0.3 2.4 13 caldo Ejemplo 1 Ninguno 31 h, 0.36 0.21 3.4 2.0 5.3 37 OA Ejemplo 1 Ninguno 70 h, 0.15 0.03 1.7 0.3 2.0 15 caldo Ejemplo 1 Ninguno 70 h, 0.57 0.25 5.3 2.3 7.7 31 OA Ejemplo 2 10 ppm Pasta 0.13 0.97 1.1 8.5 9.6 88 licuada Ejemplo 2 10 ppm 0.8 h, 0.15 0.62 1.7 7.0 8.7 81 caldo Ejemplo 2 10 ppm 31 h, 0.16 0.05 1.8 0.5 2.3 23 caldo Ejemplo 2 10 ppm 31 h, 0.37 0.23 3.5 2.2 5.7 38 OA Ejemplo 2 10 ppm 70 h, 0.17 0.02 1.9 0.3 2.2 13 caldo Ejemplo 2 10 ppm 70 h, 0.60 0.10 5.7 1.0 6.7 14 OA Ejemplo 3 10 ppm Pasta 0.12 0.97 1.0 8.5 9.5 89 licuada Fermentación Lipasa Tiempo Lipidos FFA Lipidos FFA lipidos % de (h) , (% en (% en (g) (g) + FFA muestra peso) peso) FFA (g) Ejemplo 3 10 ppm 0.8 h, 0.32 0.40 3.6 4.5 8.1 56 caldo Ejemplo 3 10 ppm 31 h, 0.17 0.05 1.9 0.6 2.5 24 caldo Ejemplo 3 10 ppm 31 h, 0.38 0.22 3.6 2.1 5.7 37 OA Ejemplo 3 10 ppm 70 h, 0.15 0.02 1.7 0.2 1.9 13 caldo Ejemplo 3 10 ppm 70 h, 0.46 0.12 4.4 1.1 5.6 20 OA Ejemplo 22 Inactivación por calor de la lipasa en pasta de maíz licuada tratada con lipasa para limitar la producción de ésteres de alcohol oleilico de los ácidos grasos libres de aceite de maiz Se añadió agua de grifo (918.4 g) en un hervidor encamisado de 2 litros de resina; posteriormente, se añadió 474.6 g de peso en húmedo (417.6 g en peso seco) de granos de maiz enteros molidos (tamiz de 1.0 mm en molino triturador) bajo agitación. Se calentó la mezcla a 55 °C bajo agitación a 300 rpm y se ajustó el pH a 5.8 con 2 N de ácido sulfúrico. A la mezcla se añadió 14.0 g de una solución acuosa que contenia 0.672 g de Spezyme®-FRED L (Genencor®, Palo Alto, CA) , y se aumentó la temperatura de la muestra a 85 °C bajo agitación a 600 rpm y a un pH de 5.8. Después de 120 minutos a 85 °C, se enfrió la mezcla a 50 °C y se transfirieron alícuotas de 45.0 mi de la pasta de maíz licuada resultante a tubos centrífugos de polipropileno de 50 mi, que se almacenaron congelados a -80 °C.

En una primera reacción, se mezcló 50 g de la pasta de maíz licuada preparada como se describió anteriormente con 10 ppm de Lipolase® 100 L (Novozymes) durante 6 h a 55 °C y sin inactivación de lipasa a 85 °C durante 1 h; la mezcla se enfrió a 30 °C. En una segunda reacción, se mezcló 50 g de pasta de maíz licuada con 10 ppm de Lipolase® durante 6 h a 55 °C, después, se calentó a 85 °C durante 1 h (inactivación de lipasa) y, posteriormente, se enfrió a 30 °C. En una tercera reacción, se mezcló 50 g de pasta de maíz licuada sin lipasa añadida durante 6 h a 55 °C, y sin calentar a 85 °C durante 1 h, la mezcla se enfrió a 30 °C, se añadió 38 g de alcohol oleílico y se agitó la mezcla resultante durante 73 h a 30 °C. En una cuarta reacción, se mezcló 50 g de pasta de maíz licuada sin lipasa añadida durante 6 h a 55 °C, después, se calentó a 85 °C durante 1 h y, posteriormente, se enfrió a 30 °C. Se tomó una muestra de cada una de las mezclas de reacción a las 6 horas, después, se añadieron 38 g de alcohol oleílico y se agitaron las mezclas resultantes a 30 °C y se tomaron muestras a las 25 y 73 horas. Las muestras (tanto la pasta licuada como el alcohol oleílico (OA, por sus siglas en inglés) ) se analizaron para determinar el porcentaje en peso de lípidos (derivatizados como ésteres de metilo de ácidos grasos, FAME) y el porcentaje en peso de ácidos grasos libres (FFA, derivatizados como ésteres de metilo de ácidos grasos, FAME) de conformidad con el método descrito en la Referencia 1.

El porcentaje de FFA en la fase OA de la segunda reacción que se realizó con inactivación por calor de lipasa antes de la adición de OA fue de 99 % a las 25 horas y de 95 % a las 73 horas, en comparación con solo el 40 % de FFA y el 21 % de FFA a-las 25 horas y las 73 horas, respectivamente, cuando la lipasa en la pasta de maíz licuada tratada con lipasa no se inactivo por calor (primera reacción) . No se observaron cambios significativos en el porcentaje de FFA en las dos reacciones de control sin lipasa añadida. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Contenido de lipidos y ácidos grasos libres de una mezcla de pasta de maíz licuada y alcohol oleilico en presencia o ausencia de lipasa activa o inactivada por calor Condiciones de Tiempo Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos+ % de reacción (h) , (% en (% en (mg) (mg) FFA (mg) FFA muestra peso) peso) 10 ppm de 6 h, pasta 0.08 0.71 41 345 386 89 lipasa activa, licuada sin tratamiento 25 h, 0.22 0.06 105 27 132 20 por calor a pasta 85 °C licuada Condiciones de Tiempo Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos+ % de reacción (h) , (% en (% en (mg) (mg) FFA (mg) FFA muestra peso) peso) tratamiento pasta por calor a licuada 85 °C 25 h, OA 0.58 39 212 143 355 40 73 h, 0.25 05 121 22 143 18 pasta licuada 73 h, OA 0.91 0.24 333 88 420 21 10 ppra de 6 h, pasta 0.06 0.45 28 224 252 89 lipasa licuada inactiva, Tratamiento 25 h, 0.10 0.11 49 54 103 53 por calor a pasta 85 °C licuada 25 h, OA 0.02 0.96 8 366 374 99 73 h, 0.24 0.15 117 72 189 62 pasta licuada 73 h, OA 0.06 1.11 23 424 447 95 Condiciones de Tiempo Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos+ % de reacción (h) , (% en (% en (mg) (mg) FFA (mg) FFA muestra peso) peso) sin lipasa, 6 h, pasta 0.80 0.40 401 199 599 33 licuada sin 25 h, ' 0.30 0.05 147 25 173 15 tratamiento pasta por calor a licuada 85 °C 25 h, OA 0.55 0.36 212 139 351 40 73 h, 0.23 0.05 117 26 143 23 pasta licuada 73 h, OA 0.79 0.42 305 162 467 34 sin lipasa, 6 h, pasta 0.36 370 183 553 33 licuada tratamiento 25 h, 0.31 0.05 156 27 183 15 por calor a pasta 85 °C licuada 25 h, OA 0.60 0.35 233 136 369 37 73 h, 0.20 0.05 99 23 121 23 pasta licuada 73 h, OA 0.84 0.41 326 159 486 33 Ejemplo 23 Inactivación por calor de la lipasa en pasta de maíz licuada tratada con lipasa para sacarificación y fermentación simultáneas con extracción de producto in situ mediante el uso de alcohol oleílico Se realizaron tres fermentaciones tal como se describió en los Ejemplos 4, 5 y 6. No se añadió lipasa en la pasta de maíz licuada en los Ejemplos 4 y 6 antes de la fermentación, y el tratamiento con lipasa de la pasta de maíz licuada en la fermentación descrita en el Ejemplo 5 (con 7.2 ppm de proteina soluble total Lipolase®) fue seguido inmediatamente por el tratamiento de inactivación por calor (para inactivar completamente la lipasa) y, posteriormente, por la adición de nutrientes previa a la inoculación y fermentación. El porcentaje de FFA en la pasta de maíz licuada preparada sin el tratamiento con lipasa para las fermentaciones que se realizaron como se describió en los Ejemplos 4 y 6 fue de 31 % y 34 %, respectivamente, respecto del 89 % con el tratamiento con lipasa (Ejemplo 5) . En el transcurso de las fermentaciones enumeradas en la Tabla 10, la concentración de FFA en la fase OA no se redujo en ninguna de las tres fermentaciones, incluida aquella que contenía la lipasa inactivada por calor. El porcentaje de FFA en la fase OA de la fermentación realizada de conformidad con el Ejemplo 5 (con la inactivación por calor de la lipasa antes de la fermentación) fue de 95 % a las 70 horas (fin de ejecución (EOR) ) , en comparación con solo el 33 % de FFA para las otras dos fermentaciones (Ejemplos 4 y 6) , en donde la pasta de maíz licuada no fue tratada con lipasa. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Contenido de lípidos y ácidos grasos libres de las fermentaciones que contienen alcohol oleilico como solvente ISPR y lipasa inactivada por calor (después Fermentación Lipasa Tiempo (h) , Lípidos FFA Lípidos FFA Lípidos + % de muestra (% en peso) (% en peso) (g) (g) FFA (g) FFA Ejemplo 4 Ninguno Pasta licuada 0.65 0.30 7.2 3.3 10.4 31 Ejemplo 4 Ninguno 0.2 h, caldo 0.56 0.28 6.6 3.3 9.9 33 Ejemplo 4 Ninguno 4.3 h, caldo 0.28 0.09 3.3 1.0 4.4 24 Ejemplo 4 Ninguno 4.3 h, OA 0.45 0.27 4.0 2.4 6.4 37 Ejemplo 4 Ninguno 30 h, caldo 0.17 0.05 2.0 0.6 2.7 24 Ejemplo 4 Ninguno 30 h, OA 0.63 0.29 5.7 2.6 8.3 32 Ejemplo 4 Ninguno 53 h, caldo 0.13 0.04 1.5 0.5 2.0 23 Ejemplo 4 Ninguno 53 h, OA 0.67 0.32 6.0 2.9 8.9 32 Ejemplo 4 Ninguno 70 h, caldo 0.13 0.04 1.5 0.4 1.9 23 Ejemplo 4 Ninguno 70 h, OA 0.64 0.31 5.8 2.8 8.5 33 Ejemplo 5 7.2 ppm Pasta licuada 0.11 0.89 1.3 9.9 11.2 89 Fermentación Lipasa Tiempo ( ) , Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos + % de muestra (% en peso) en peso) (g) (g) FFA (g) FFA Ejemplo 5 7.2 ppm 0.2 h, caldo 0.25 0.83 2.9 9.8 12.8 77 Ej emplo 5 7.2 ppm 4.3 h, caldo 0.14 0.17 1.6 2.1 3.7 56 5 Ejemplo 5 7.2 ppm 4.3 h, ?? 0.02 0.84 0.2 7.9 8.1 97 Ej emplo 5 7.2 ppm 30 h, caldo 0.08 0.18 1.0 -2.1 3.1 68 Ejemplo 5 7.2 ppm 30 h, OA 0.04 0.92 0.3 8.6 8.9 96 Ejemplo 5 7.2 ppm 53 h, caldo 0.07 0.11 0.9 1.3 2.2 61 Ejemplo 5 7.2 ppm 53 h, OA 0.08 0.95 0.7 8.9 9.6 93 10 Ejemplo 5 7.2 ppm 70 h, caldo 0.08 0.10 0.9 1.2 2.1 55 Ejemplo 5 7.2 ppm 70 h, OA 0.05 0.94 0.4 8.8 9.2 95 Ejemplo 6 Ninguno Pasta licuada 0.66 0.34 7.3 3.8 11.1 34 Ejemplo 6 Ninguno 0.2 h, caldo 0.63 0.34 7.6 4.0 11.6 34 15 Ejemplo 6 Ninguno 4.3 h, caldo 0.33 0.10 3.9 1.2 5.1 23 Ejemplo 6 Ninguno 4.3 h, OA 0.45 0.27 4.0 2.4 6.4 38 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos + % de mues ra (% en peso) en peso) (g) (g) FFA (g) FFA Ejemplo 6 Ninguno 30 , caldo 0.17 0.06 2.1 0.8 2.8 26 Ejemplo 6 Ninguno 30 , OA 0.69 0.33 6.2 3.0 9.1 32 5 Ejemplo 6 Ninguno 53 , caldo 0.14 0.05 1.6 0.5 2.2 25 Ejemplo 6 Ninguno 53 h, OA 0.72 0.35 6.4 3.1 9.5 33 Ejemplo 6 Ninguno 70 h, caldo 0.15 0.05 1.8 0.6 2.4 25 Ejemplo 6 Ninguno 70 h, OA 0.70 0.34 6.2 3.0 9.2 33 10 Ejemplo 24 Tratamiento con lipasa de ' los granos de maíz enteros molidos antes de la licuación Se añadió agua de grifo (1377.6 g) en cada uno de los hervidores . encamisados de resina de 2 litros, después se añadió 711.9 g de peso en húmedo (625.8 g en peso seco) de granos de maíz enteros molidos (tamiz de 1.0 mm en el molino triturador) en cada hervidor bajo agitación. Se calentó cada mezcla a 55 °C bajo agitación a 300 rpm y se ajustó el pH a 5.8 con 2 N de ácido sulfúrico. A cada mezcla se añadió 21.0 g de una solución acuosa que contenía 1.008 g de Spezyme®-FRED L (Genencor®, Palo Alto, CA) . Después, a una mezcla se añadió 10.5 mi de solución acuosa de Lipolase® 100L (21 mg de proteína soluble total, 10 ppm de concentración final de lipasa) y a la segunda mezcla se añadió 1.05 mi de solución acuosa de Lipolase® 100L (2.1 mg de proteína soluble total, 1.0 ppm de concentración final de lipasa) . Se tomaron muestras de cada mezcla de reacción luego de 1 hora y a las 2, 4 y 6 horas a 55 °C posteriormente, se aumentó la temperatura de la mezcla a 85 °C bajo agitación a 600 rpm y un pH de 5.8, y se tomó una muestra cuando la mezcla alcanzó 85 °C por primera vez. Después de 120 minutos a 85 °C se tomó una muestra, se enfriaron las mezclas a 50 °C y se transfirieron las muestras finales de la pasta de maíz licuada resultante a tubos centrífugos de polipropileno de 50 mi; todas las muestras se almacenaron congeladas a -80 °C.

En dos reacciones distintas, se mezcló una muestra de 50 g de la pasta de maíz licuada tratada con 10 ppm de lipasa o una muestra de 55 g de la pasta de maíz licuada tratada con 1.0 ppm de lipasa, preparada como describió anteriormente, con alcohol oleilico (OA) (38 g) a 30 CC durante 20 horas; posteriormente, la pasta licuada y el OA en cada mezcla de reacción se separaron por centrifugación y se analizó cada fase para determinar el porcentaje en peso de lipidos (derivatizados como ásteres de metilo de ácidos grasos, FAME) y el porcentaje en peso de ácidos grasos libres (FFA, ésteres de metilo de ácidos grasos, FAME) de conformidad con el método que se describe en la Referencia 1. El porcentaje de FFA en la fase OA de la mezcla de pasta licuada/OA preparada por inactivación por calor de 10 ppm de lipasa durante la licuación fue de 98 % a las 20 horas, en comparación con solo el 62 % de FFA en la fase OA de la mezcla de pasta licuada/OA preparada por inactivación por calor de 1.0 ppm de lipasa durante la licuación. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Contenido de lipidos y ácidos grasos libres de una mezcla de pasta de maiz licuada y alcohol oleilico mediante el uso del tratamiento con lipasa de la suspensión de maíz molido antes de la licuación (inactivación por calor de la lipasa durante la licuación) Condiciones Tiempo (h) , Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos+ % de de reacción muestra (% en (% en (mg) (mg) FFA (mg) FFA peso) peso) 10 ppm de 1 h, antes 0 .226 0. 627 112 311 424 74 lipasa de la licuación a 55 °C 2 h, antes 0 .199 0. .650 99 323 422 77 antes de de la licuación licuación a 4 h, antes 0 .151 0, , 673 75 334 410 82 dé la licuación 85 °C, 6 h, antes 0 .101 0. .700 50 348 398 87 mezclada de la con licuación OA durante 0 h, 85 °C, 0 .129 0. .764 64 380 444 86 20 h pasta licuada Condiciones Tiempo (h) , Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos+ % de de reacción muestra (% en (% en (mg) (mg) FFA (mg) FFA peso) peso) 2 h, 85 °C, 0.129 0.751 64 373 437 85 pasta licuada 20 , 30 °C, 0.074 0.068 37 34 71 48 pasta licuada 20 h, 30 °C, 0.015 1.035 5.7 394 400 98 OA 1.0 ppm de 1 h, antes 0.408 0.480 226 266 492 54 lipasa de la licuación a 55 °C 2 h, antes 0.401 0.424 222 235 457 51 antes de de la licuación licuación a 4 h, antes 0.299 0.433 165 240 405 58 de la licuación 85 °C, 6 h, antes 0.346 0.453 192 251 442 57 mezclada de la con licuación Condiciones Tiempo (h) , Lipidos FFA Lípidos FFA Lípidos+ % de de reacción muestra (% en (% en (mg) (mg) FFA (mg) FFA peso) peso) OA durante 0 h, 85 °C, 0.421 0.407 233 225 458 49 20 h pasta licuada 2 h, 85 °C, 0.424 0.429 235 237 472 50 pasta licuada 20 h, 30 °C, 0.219 0.054 121 30 151 20 pasta licuada 20 h, 30 °C, 0.344 0.573 140 233 373 62 OA Ejemplo 25 Análisis de lipasa para el tratamiento de granos de maíz enteros molidos antes de la licuación Siete mezclas de reacción que contenían agua de grifo (67.9 g) y granos de maíz enteros molidos (35.1 g de peso en húmedo, molidos con un tamiz de 1.0 mm por medio del uso de un molino triturador) a un pH de 5.8 se agitaron a 55 °C en matraces tapados. Se tomó una muestra de 3 mi (t = 0 h) de cada matraz y se la congeló inmediatamente en hielo seco, después, se añadió 0.5 mi de solución tampón de fosfato sódico de 10 mm (pH de 7.0) que contenia 1 mg de proteina soluble total (10 ppm de la concentración final en la mezcla de reacción) de una de las siguientes lipasas (Novozymes) a cada matraz: Lipolase® 100 L, Lipex® 100L, Lipoclean® 2000T, Lipozyme® CALB L, Novozyme® CALA L y Palatase 20000L; no se añadió lipasa en el séptimo matraz . Se agitaron las muestras resultantes a 55 °C en matraces tapados, y se tomaron muestras de 3 mi de cada mezcla de reacción a la hora y a las 2, 4 y 6 horas, y se congelaron inmediatamente en hielo seco hasta que se analizó el porcentaje en peso de lipidos (derivat izados como ésteres de metilo de ácidos grasos, EAME) y el porcentaje en peso de ácidos grasos libres (FFA, derivatizados como ésteres de metilo de ácidos grasos, EAME) de conformidad con el método descrito en la Referencia 1, y se calculó el contenido porcentual de ácidos grasos libres en relación con las concentraciones totales combinadas de lipidos y ácidos grasos libres para cada muestra. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 . Contenido porcentual de ácidos grasos libres ( % de FFA) de una mezcla de granos de maí z enteros molidos mediante tratamiento con lipasa a 55 °C antes de la licuación % de FFA Tiempo 0 h 1 h 2 h 4 h 6 h Lipolase® 100L 33 56 74 76 79 Lipex® 100L 34 66 81 83 83 Lipoclean® 2000T 38 55 73 69 65 Lipozyme® CALB L 39 38 37 43 41 Novozyme® CALA L 37 40 44 44 45 Palatase® 20000L 37 49 59 62 66 Sin enzimas 38 33 37 41 42 E j emplo 26 Tratamiento con lipasa de granos de maíz enteros molidos antes de la sacarificación y fermentación simultáneas con extracción de producto in sítu por medio del uso de alcohol oleilico Se realizaron tres fermentaciones como se describió en los Ejemplos 7, 8 y 10. Para las fermentaciones realizadas en los Ejemplos 7 y 10, se añadió lipasa (10 ppm de proteína soluble total Lipolase®) a la suspensión de maíz molido y se calentó a 55 °C durante 6 h antes de la licuación para producir una pasta de maíz licuada que contenía lipasa inactivada por calor. No se añadió lipasa a la suspensión de maíz molido usada para preparar la pasta de maíz licuada para la fermentación descrita en el Ejemplo 8, pero se sometió la suspensión a la misma etapa de calentamiento a 55 °C antes de la licuación. El porcentaje de FFA en la pasta de maíz licuada tratada con lipasa preparada para las fermentaciones realizadas como se describió en los Ejemplos 7 y 10 fue de 83 % y 86 %, espectivamente, comparado con el 41 % sin el tratamiento con lipasa (Ejemplo 8) . En el transcurso de las fermentaciones, la concentración de FFA no se redujo en ninguna de las fermentaciones, incluida aquella que contenía la lipasa inactivada por calor. El porcentaje de FFA en la fase OA de la fermentación realizada de conformidad con los Ejemplos 7 y 10 (con inactivación por calor de lipasa antes de la fermentación) fue de 97 % a las 70 horas (fin de ejecución (EOR) ) , comparado con solo el 49 % de FFA para la fermentación realizada de conformidad con el Ejemplo 8, en donde los granos de maíz enteros molidos no hablan sido tratados con lipasa antes de la licuación. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10. Contenido de lípidos y ácidos grasos libres de las fermentaciones que contienen alcohol oleilico como solvente ISPR y lipasa inactivada por calor (tratamiento con lipasa de la suspensión de maíz molido antes de la licuación) Fermentación Lipasa Tiempo (h) , Lipidos FFA Lípidos FFA Lipidos + % de muestra (% en peso) (% en peso) (g) (g) FFA (g) FFÍ Ejemplo 7 10 ppm Antes del trat. 0. 65 0. 22 7.1 2.4 9. 4 25 con lipasa/antes de la licuac.

Ejemplo 7 10 ppm Después del trat. 0. 22 0. 65 2.4 7.0 9. 5 74 con lipasa/antes de la licuac.

Ejemplo 7 10 ppm Pasta licuada 0. 17 0. 79 1.8 8.5 10 .3 83 Ejemplo 7 10 ppm 0.3 h, caldo 0. 16 0. 79 1.8 8.9 10 .7 83 Ejemplo 7 10 ppm 4.8 h, caldo 0. 14 0. 31 1.6 3.5 5. 1 69 E emplo 7 10 ppm 4.8 h, OA 0. 04 0. 68 0.3 5.4 5. 6 95 Ejemplo 7 10 ppm 29 h, caldo 0. 10 0. 12 1.2 1.3 2. 5 53 Ejemplo 7 10 ppm 29 h, OA 0. 03 1. 05 0.2 8.2 8. 4 98 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , Lipidos FFA Lípidos FFA Lipidos + % de muéstra ; en peso) (% en peso) (g) (g) FFA (g) FFA Ejemplo 7 10 ppm 53 h, caldo Ejemplo 7 10 ppm 53 h, OA 0.07 1.14 0.5 9.0 9.5 95 ^ Ejemplo 7 10 ppm 70 h, caldo 0.11 0.07 1.2 0.8 2.0 39 Ejemplo 7 10 ppm 70 h, OA 0.03 1.10 0.2 8.7 8.9 97 Ejemplo 8 Ninguno Antes del trat. 0.62 0.23 6.7 2.5 9.2 27 con lipasa/antes de la licuac. 10 Ej emplo 8 Ninguno Después del trat. 0.57 0.26 6.2 2.8 9.0 31 con lipasa/antes de la licuac.

Ejemplo 8 Ninguno Pasta licuada 0.52 0.36 5.6 4.0 9.6 41 Ejemplo 8 Ninguno 0.3 h, caldo 0.50 0.33 5.7 3.8 9.4 40 15 Ejemplo 8 Ninguno 4.8 h, caldo 0.47 0.14 5.3 1.6 6.9 24 Ejemplo 8 Ninguno 4.8 h, OA 0.12 0.32 1.0 2.9 3.9 73 Ejemplo 8 Ninguno 29 h, caldo 0.30 0.05 3.4 0.6 4.0 16 E emplo 8 Ninguno 29 h, OA 0.31 0.46 2.7 4.1 6.9 60 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos + % de muestra % en peso) (% en peso) (g) (g) FFA (g) FFA Ejemplo 8 Ninguno 53 h, caldo Ejemplo 8 Ninguno 53 h, OA 0. 47 0.50 4.2 4. ,4 8.6 51 Ejemplo 8 Ninguno 70 h, caldo 0. 22 0.04 2.5 0. .5 3.0 17 5 Ejemplo 8 Ninguno 70 h, OA 0. ,40 0.39 3.6 3. .5 7.0 49 Ejemplo 10 10 ppm Antes del trat. 0. , 67 0.23 7.4 2. ,5 9.9 25 con lipasa/antes de la licuac.

Ejemplo 10 10 ppm Después del trat. 0. ,19 0.69 2.1 7. .6 9.7 78 con lipasa/antes de la licuac.

Ejemplo 10 10 ppm Pasta licuada 0.14 0.85 1.6 9.4 11.0 86 Ejemplo 10 10 ppm 0.3 h, caldo 0.13 0.82 1.5 9.4 10.9 86 Ejemplo 10 10 ppm 4.8 h, caldo 0.11 0.29 1.3 3.3 4.6 72 15 Ejemplo 10 10 ppm 4.8 h, OA 0.04 0.60 0.3 5.2 5.6 94 Ejemplo 10 10 ppm 29 h, caldo 0.09 0.14 1.0 1.6 2.6 61 Ejemplo 10 10 ppm 29 h, OA 0.01 0.96 0.1 8.4 8.5 99 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , Lipidos FFA Lipidos FFA Lipidos + % de muestra % en peso) (% en peso) (g) (g) FFA (g) FFA Ejemplo 10 10 ppm 53 h, caldo Ejemplo 10 10 ppm 53 h, OA 0.02 0.95 0.2 8. .3 8.4 98 Ejemplo 10 10 ppm 70 h, caldo 0.09 0.08 1.1 0. .9 1.9 45 Ejemplo 10 10 ppm 70 h, OA 0.03 0.99 0.3 8. .7 9.0 97 10 Ejemplo 27 Tratamiento con lipasa de granos de maíz enteros molidos o pasta de maíz licuada para sacarificación y fermentación simultáneas con extracción de producto in situ por medio del uso de ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Se realizaron cinco fermentaciones tal como se describió anteriormente en los Ejemplos 9, 11, 12, 13 y 14. Para las fermentaciones realizadas como se describió en los Ejemplos 9, 13 y 14, se añadió lipasa (10 ppm de proteína soluble total Lipolase®) después de la licuación y no hubo inactivación por calor de la lipasa. En las fermentaciones realizadas como se describió en los Ejemplos 9 y 14, se añadió 5 g/1 de etanol antes de la inoculación, mientras que en la fermentación realizada según el Ejemplo 13 no se añadió etanol. Las fermentaciones realizadas como se describió en los Ejemplos 11 y 12 implementaron la adición de 10 ppm de proteína soluble total Lipolase® en la suspensión de maíz molido antes de la licuación, lo que provocó la inactivación por calor de la lipasa durante la licuación. En la fermentación realizada como se describió en el Ejemplo 11, se añadió 5 g/1 de etanol antes de la inoculación, mientras que en la fermentación realizada como se describió en el Ejemplo 12 no se añadió etanol. Los gramos finales totales de isobutanol (i-BuOH) presente en la fase de COFA de las fermentaciones que contenían lipasa activa fueron significativamente mayores que los gramos finales totales de i-BuOH presentes en la fase de COFA de las fermentaciones que contenían lipasa inactiva. Los gramos finales totales de isobutanol (i-BuOH) presente en los caldos de fermentación que contenían lipasa activa fueron solo ligeramente menores que los gramos finales totales de i-BuOH presente en los caldos de fermentación que contenían lipasa inactiva, para que la producción total de i-BuOH (como una combinación de i-BuOH libre y ésteres de isobutilo de COFA (FABE) ) fue significativamente mayor en presencia de lipasa activa en comparación con la producción obtenida en presencia de lipasa inactivada por calor. Los resultados se muestran en las Tablas 11 y 12. libre y ésteres de isobutilo de COFA (FABE) en las fermentaciones que contienen ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) como solvente ISPR en presencia (Ejemplos 9, 13 y 14) o ausencia (Ejemplos 11 y 12) de lipasa (análisis de la fase de COFA) Fermentación g de g de g de Total en i-BuOH/ FABE/ i-BuOH g de de FABE/ i-BuOH/ Fermentación Tiempo (h) kg de kg de kg de kg de COFA COFA COFA COFA Ejemplo 9 4.5 2.4 0.0 0 2.4 Fermentación g de g de g de Total ( i-BuOH/ FABE/ i-BuOH g de de FABE/ i-BuOR Ejemplo 9 28.8 5.4 70.9 16.5 22.0 Ejemplo 9 52.4 8.9 199.0 46.4 55.3 Ejemplo 9 69.3 4.9 230.9 53.9 69.3 Ejemplo 11 6.6 2.3 0.0 0.0 2.3 Ejemplo 11 53.5 25.1 2.9 0.6 25.7 Ejemplo 11 71.1 24.4 6.3 1.4 25.8 E emplo 12 6.6 2.3 0.0 0.0 2.3 Ejemplo 12 53.5 12.8 1.6 0.4 13.2 Ejemplo 12 71.1 12.8 3.0 0.7 13.5 Ejemplo 13 6.6 2.3 0.0 0.0 2.3 Ejemplo 13 53.5 4.9 72.1 16.0 20.9 Ejemplo 13 71.1 4.6 91.4 20.3 24.9 Ejemplo 14 6.6 2.1 0.0 0.0 2.1 Ejemplo 14 53.5 9.8 197.2 43.8 53.6 Ejemplo 14 71.1 4.9 244.5 54.3 59.2 Tabla 12. Dependencia de la producción de isobutanol (i-BuOH) libre y ésteres de isobutilo de COFA (FABE) en fermentaciones que contienen ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) como solvente ISPR en presencia (Ejemplos 9, 13 y 14) o ausencia (Ejemplos 11 y 12) de lipasa activa- (análisis del caldo de fermentación) Fermentación g de g de g de Total en i-BuOH/ FABE/ i-BuOH de g de FABE/ i-BuOH/ Muestra Tiempo (h) kg de kg de kg de kg de caldo caldo caldo caldo Ejemplo 9 4.5 0.0 0.0 0 0 Ejemplo 9 28.8 0.0 12.6 2.9 2.9 Ejemplo 9 52.4 0.0 30.3 7.1 7.1 Ejemplo 9 69.3 0.0 24.7 5.8 5.8 Ejemplo 11 6.6 0.0 0.0 0 0.0 Ejemplo 11 53.5 9.8 0.0 0 9.8 Ejemplo 11 71.1 9.5 0.0 0 9.5 Ejemplo 12 6.6 0.0 0.0 0 0 Ejemplo 12 53.5 3.8 0.0 0.0 3.8 Ejemplo 12 71.1 5.1 0.0 0.0 5.1 Ej emplo 13 6.6 0.0 0.0 0 0 Ej emplo 13 53.5 2.1 3.0 0.7 2.8 Ej emplo 13 71.1 2.1 7.4 1.6 3.7 Ejemplo 14 6.6 0.0 0.0 0 0.0 Fermentación g de g de g de Total en i-BuOH/ FftBE/ i-BuOH de g de FABE/ i-BuOH/ Ejemplo 14 53.5 2.9 22.4 5.0 7.9 Ejemplo 14 71.1 3.3 19.3 4.3 7.6 Si bien se han descrito anteriormente diversas modalidades de la presente invención, debe interpretarse que han sido presentadas a modo de ejemplo solamente y no de forma limitante. Resultará evidente para las personas con experiencia en la técnica que pueden realizarse diversos cambios en la forma y los detalles sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no deben verse limitados por las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino que deben definirse solo de conformidad con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación indican el nivel de conocimiento de las personas con experiencia en la técnica a las que les pertenecen, y se incorporan como referencia en la presente descripción en la misma medida en que si cada publicación, patente o solicitud de patente se hubiera indicado específica e individualmente para ser incorporada como referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REI INDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante que produce un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable, en donde el microorganismo recombinante comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxxlasa; (b) poner en contacto el caldo de fermentación con una fuente de carbono fermentable, para que el microorganismo recombinante consuma la fuente de carbono fermentable y produzca el producto de alcohol; y (c) poner en contacto el caldo de fermentación con ácidos grasos derivados de biomasa en una etapa del proceso de fermentación, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo es mayor en presencia de ácidos grasos que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante en ausencia de ácidos grasos.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los ácidos grasos se seleccionan de ácido oleico, ácido palmitico, ácido miristico, y mezclas de estos .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa se deriva de granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivo tales como hojas de maíz, rastrojos de maiz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto aguja, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, arboles, ramas, raices, hojas, astillas de madera, aserrín, matorrales y arbustos, vegetales, frutos, flores, estiércol, y mezclas de estos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el producto de alcohol es butanol.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas (b) y (c) ocurren, prácticamente, simultáneamente.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de carbono fermentable se deriva de biomasa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el caldo de fermentación comprende, además, etanol.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo recombinante tiene una o más supresiones del gen de piruvato descarboxilasa (PDC) .

9. Un método para producir un producto de alcohol, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar biomasa que comprende una fuente de carbono fermentable y aceite; (b) convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos para formar una biomasa que comprende los ácidos grasos; (c) poner en contacto la biomasa con un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante capaz de producir un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable, y en donde el microorganismo recombinante comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa; (d) poner en contacto los ácidos grasos con el caldo de fermentación, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante es mayor en presencia de ácidos grasos que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo en ausencia de ácidos grasos.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa (b) de convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos comprende poner en contacto el aceite con una o más sustancias capaces de hidrolizar la porción de aceite en ácidos grasos.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la o las sustancias comprenden una o más enzimas.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la o las enzimas comprenden enzimas lipasa .

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende: antes de la etapa (c) , inactivar la o las enzimas después de hidrolizar al menos una porción del aceite.

14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las etapas (b) , (c) y (d) ocurren en el recipiente de fermentación.

15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las etapas (b) , (c) y (d) ocurren, prácticamente, simultáneamente.

16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la biomasa se deriva de granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivo tales como hojas de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto aguja, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raices, hojas, astillas de madera, aserrín, matorrales y arbustos, vegetales, frutos, flores, estiércol y mezclas de estos.

17. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los ácidos grasos se seleccionan de ácido oleico, ácido palmítico, ácido mirístico y mezclas de estos .

18. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende: fermentar la fuente de carbono fermentable para producir un producto de alcohol.

19 El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el producto de alcohol es butanol.

20. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el caldo de fermentación comprende, además, etanol.

21. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el microorganismo recombinante tiene una o más supresiones del gen de piruvato descarboxilasa (PDC) .

22. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende: separar el aceite de la biomasa antes de la etapa (b) de convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos.

23. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende: licuar la biomasa para producir una biomasa licuada, en donde la biomasa licuada comprende oligosacáridos ; y poner en contacto la biomasa licuada con una enzima de sacarificación capaz de convertir los oligosacáridos en azúcar fermentable para formar una biomasa sacarificada, y en donde la etapa (c) comprende poner en contacto la biomasa sacarificada con el caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante .

24. Un método para producir un producto de alcohol, caracterizado porque comprende: proporcionar una materia prima; licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima; separar la suspensión de materia prima para producir un producto que comprende (i) una capa acuosa que comprende una fuente de carbono fermentable, (ii) una capa oleosa y (iii) una capa de sólidos; obtener un aceite de la capa oleosa y convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos ; introducir la capa acuosa de (c) en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación que comprende un microorganismo recombinante capaz de producir un producto de alcohol a partir de una fuente de carbono fermentable, en donde el microorganismo recombinante comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa ; fermentar la fuente de carbono fermentable de la capa acuosa para producir el producto de alcohol; y poner en contacto el caldo de fermentación con los ácidos grasos, en donde al menos uno de (i) el índice de crecimiento y (ii) el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante es mayor en presencia de los ácidos grasos que el índice de crecimiento y/o el consumo de carbono fermentable del microorganismo recombinante en ausencia de los ácidos grasos.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la etapa (d) de convertir al menos una porción del aceite en ácidos grasos comprende poner en contacto el aceite con una o más sustancias capaces de hidrolizar la porción de aceite en ácidos grasos.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la o las sustancias comprenden una o más enzimas.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la o las enzimas comprenden enzimas lipasa .

28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la materia prima comprende uno o más azúcares fermentables derivados de granos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivo tales como hojas de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto aguja, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raices, hojas, astillas de madera, aserrín, matorrales y arbustos, vegetales, frutos, flores, estiércol y mezclas de estos .

29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los ácidos grasos se seleccionan de ácido oleico, ácido palmítico, ácido mirístico, y mezclas de estos .

30. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el producto de alcohol es butanol .

31. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el microorganismo recombinante tiene una o más supresiones del gen de piruvato descarboxilasa (PDC) .

32. Una composición caracterizada porque comprende un microorganismo recombinante que comprende una reducción o eliminación de la actividad piruvato descarboxilasa y ácidos grasos .