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JP5840364B2 - タンパク質製剤及びその製造方法 - Google Patents

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Description

（関連出願）
本願は、２００７年１１月３０日に出願された米国仮出願６１／００４９９２号の優先権の利益を主張する。優先出願の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
（発明の背景）
医薬タンパク質製剤の基本原則は、ある種の不安定性を克服しなければならないことである。タンパク質の分解経路は２つの異なるクラスに分けることが可能であり、化学的不安定性と物理的不安定性が含まれる。化学的不安定性は、結合形成又は切断を通じて、タンパク質の修飾をもたらす。化学的不安定性の問題の例には、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、β脱離及びジスルフィド交換が含まれる。他方、物理的不安定性は、タンパク質中の共有的変化をもたらさない。むしろ、物理的不安定性は、タンパク質の高次構造（二次及びそれ以上）の変化を伴う。これらには、変性、表面への吸着、凝集及び沈降が含まれる（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６，９０３（１９８９）。
医薬タンパク質製剤の商業的実現性及び効果に対して多大な影響を与え得るこれらの不安定性は、製剤中に追加分子を含めることによって克服できることが一般に認められている。タンパク質の安定性は、タンパク質を安定に、可溶性に及び凝集しないように保つために、溶液中のタンパク質と相互作用する賦形剤を含めることによって改善することができる。例えば、塩化合物及び他のイオン性の種は、タンパク質製剤への極めて一般的な添加物である。これらは、非特異的な様式でタンパク質に結合し、熱的安定性を増加させることによって、タンパク質の変性と戦う上での補助を行う。塩化合物（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）は、凝集及び沈殿と戦うために、市販のインシュリン調製物中で首尾よく使用されてきた（既出、９１１）。アミノ酸（例えば、ヒスチジン、アルギニン）は、製剤添加物として使用したときに、タンパク質の二次構造の変化を低減することが示されている（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３５５，２０（２００７））。一般的に使用される添加物の他の例には、グリセロール及び糖などのポリアルコール材料並びに洗浄剤などの界面活性剤（非イオン性（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）及び陰イオン性（ドデシル硫酸ナトリウム）の両方）が含まれる。全ての市販の液体タンパク質製剤中にほぼ一貫して添加物が存在することは、このような化合物を持たないタンパク質溶液が不安定性に起因する分解に伴う問題に遭遇し得ることを示唆している。
タンパク質製剤の第一の最終目標は、医薬タンパク質薬の許容可能な保存寿命を保証するために、医薬的に活性な原型状態の形態にある所定のタンパク質の安定性を長期間にわたって維持することである。しかしながら、溶液中のタンパク質の安定性及び溶解性を維持することは、添加物が治療薬の中に含められている医薬製剤においては特に困難である。現在のところ、生物製剤は、タンパク質の安定性を維持するために、追加の賦形剤を必要とする。典型的には、液体医薬製剤は、安定性のために複数の添加物を含有する。例えば、ヒト成長ホルモンであるＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎＳｉｍｐｌｅＸｘ（Ｒ）の患者による自己投与用の液体製剤は、このホルモンを安定化させるために、添加物マニトール（糖アルコール）、ヒスチジン及びポロキサマー１８８（界面活性剤）を含有する。
医薬添加物は、可溶性で、無毒である必要があり、特定の治療用タンパク質に対して安定化効果を付与する特定の濃度で使用する必要がある。添加物の安定化効果はタンパク質及び濃度依存性であるので、医薬製剤中での使用が検討されている各添加物が不安定性を引き起こさず、又は製剤の化学的若しくは物理的構成に対して他の有害な効果を有さないことを確保するために、各添加物は慎重に検査しなければならない。タンパク質を安定化させるために使用される成分は、時間とともにタンパク質の安定性に伴う問題又は保存中の環境の変化に際するタンパク質の安定性に伴う問題を引き起こし得る。
典型的には、長い保存寿命は、（例えば、−８０℃で）凍結された形態でタンパク質を保存することによって、又はタンパク質を凍結乾燥プロセスに供することによって、すなわち、凍結乾燥された形態でタンパク質を保存することによって達成され、使用直前に再構成工程を必要とするので、患者の利便性に関して著しい欠点をもたらす。しかしながら、保存のためにタンパク質製剤を凍結させることは、タンパク質及び添加物の局所的高濃度をもたらし得、これは、製剤内のｐＨ、分解及びタンパク質凝集の局所的な極端な状態を作出し得る。さらに、凍結及び融解のプロセスは、しばしば、タンパク質の安定性に影響を与えることが当業者に周知であり、凍結形態での医薬タンパク質の保存でさえ、凍結及び融解工程に起因する安定性の喪失が伴い得ることを意味する。また、凍結乾燥の第一のプロセス工程には、タンパク質の安定性に対して悪影響を及ぼし得る凍結が伴う。産業状況では、薬物物質製造の間（保持工程、保存、薬物製品充填仕上げにおけるタイミング及びバッチサイズの柔軟性を増大させるための再凍結及び再融解）及びその後の薬物製品充填仕上げ（凍結乾燥）の間の反復凍結融解処理に、医薬タンパク質を供し得る。タンパク質の不安定性現象に遭遇するリスクは、医薬タンパク質が遭遇する凍結融解サイクルの数が増加するにつれて増加することが周知であるので、反復された凍結融解処理にわたってタンパク質の安定性を維持する製剤条件を達成することは、困難な作業である。製剤中に望ましくない特性、特に、ｐＨ、浸透圧、密度又はタンパク質若しくは賦形剤濃度の勾配をもたらすことなく凍結及び融解することができる製剤に対する要望が生物医薬産業に存在する。
しばしば、タンパク質を基礎とする医薬製品は、治療効果のために、高い濃度で製剤化する必要がある。より小容量での投薬を可能とし、患者の不快感を制限し、より経済的に梱包及び保存することを可能とするので、高度に濃縮されたタンパク質製剤は治療用途のために望ましい。しかしながら、高いタンパク質濃度の製剤の開発は、製造、安定性、分析、並びに、特に、治療用タンパク質に関して送達の困難性など多くの課題を提起する。例えば、タンパク質の凝集、不溶性及び分解に伴う困難さは、製剤中のタンパク質濃度が上昇するにつれて一般に増加する（概説として、Ｓｈｉｒｅ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３，１３９０（２００４）参照）。添加物又はタンパク質のより低い濃度では、有益な効果を与えた添加物によって、以前には見られなかった有害な効果が引き起こされ得る。高濃度タンパク質製剤の製造は、乳白色、凝集及び沈殿に伴う顕著な問題をもたらし得る。非固有状態のタンパク質凝集及び粒状物形成の可能性に加えて、増大した粘度又は注射による送達を困難にする他の特性をもたらし得る可逆的な自己会合が起こり得る。高い粘度は、ろ過アプローチによる高いタンパク質濃度の製造も困難にし得る。
従って、一切の有害な副作用を限定させながら、タンパク質の安定性及び治療的な必要性を強化するために、医薬タンパク質製剤は、通例、成分及び濃度を慎重に釣り合わせる。生物製剤は、治療上の問題の可能性、保存の問題及び全体的な費用を低減させる賦形剤の特定量とともに、高い濃度でさえ安定なタンパク質を含むべきである。
薬物分子として、タンパク質及び他の生物巨大分子が増大する関心を集めるにつれて、このような分子を送達するための製剤は、重要な問題となりつつある。治療用タンパク質の大規模製造における革命的な進歩にも関わらず、体内でのこれらの因子の効果的で便利な送達は、生物膜を通じた乏しい浸透性、巨大な分子サイズ、短い血漿半減期、自己会合、物理的及び化学的不安定性、凝集、吸着並びに免疫原性など、これらの因子に内在する物理化学的及び生物学的特性のために、大きな課題であり続けている。
Ｍａｎｎｉｎｇ他、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６，９０３、１９８９年 Ｔｉａｎ他、Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３５５，２０、２００７年 Ｓｈｉｒｅ，Ｓ．Ｊ．他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３，１３９０、２００４年
（発明の要旨）
本発明は、長期の液体保存又は凍結／融解及び凍結乾燥などの他の処理工程の間に、高い濃度においてさえ、水の中に製剤化されたタンパク質が溶解度及び安定性を維持するという驚くべき発見に向けられる。
本発明は、水及びタンパク質（該タンパク質は、さらなる因子の必要なしに安定である。）を含む水性タンパク質製剤のための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明の方法及び組成物は、透析ろ過溶媒として水を用いて、目的のタンパク質を含有する第１の溶液が透析ろ過される透析ろ過プロセスを基礎とする。このプロセスは、例えば、少なくとも所定容量の水との交換（例えば、５倍容量の交換）が存在するように行われる。本発明の方法を実施することによって、得られた水性製剤は、当初タンパク質溶液と比べて、賦形剤の総パーセントの著しい減少を有する。例えば、最初のタンパク質溶液と比べて、９５から９９％少ない賦形剤が水性製剤中に見出される。賦形剤の減少に関わらず、タンパク質は、高い濃度においてさえ、なお可溶性であり、その生物活性を保持する。一態様において、本発明の方法は、イオン性賦形剤などの追加成分を減少させながら、タンパク質の濃度の増加を含む組成物をもたらす。従って、水性製剤中のタンパク質の水力学的直径は、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）などの標準的な緩衝溶液中の同じタンパク質と比べてより小さい。
本発明の製剤は、標準的な緩衝化された製剤に対して多くの利点を有する。一態様において、水性製剤は、高いタンパク質濃度（例えば、５０から２００ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上）を含む。増大した濃度でさえ、あらゆるサイズのタンパク質を本発明の製剤中に含めることができる。タンパク質の高い濃度に関わらず、製剤は最小限の凝集を有し、高タンパク質製剤に予想され得る有害な効果なしに、様々な方法及び形態（例えば凍結）を用いて保存することができる。本発明の製剤は、溶液中のタンパク質を安定化させるために伝統的な製剤中で使用されている、例えば、界面活性剤及び緩衝系などの賦形剤を必要としない。イオン性賦形剤の低いレベルの結果、本発明の水性製剤は、低い伝導度、例えば、２ｍＳ／ｃｍ未満を有する。本発明の方法及び組成物は、低い浸透圧、例えば、３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下を有する水性タンパク質製剤も提供する。さらに、本明細書に記載されている製剤は、タンパク質の安定化のために必要とされる追加因子の欠如のために減少した免疫原性を有するので、標準的な製剤より好ましい。
本発明の方法及び組成物は、水及び目的のタンパク質のあらゆる種類を含む水性製剤を提供するために使用され得る。一態様において、本発明の方法及び組成物は、４７ｋＤａ未満であるタンパク質を含む巨大タンパク質に対して使用される。抗体及びその断片（インビボ及びインビトロ目的のために使用されるものを含む。）は、本発明の方法及び組成物中で使用され得るタンパク質の別の例である。
さらに、タンパク質及びペプチド製剤を調製するために必要な複数工程の精製及び濃縮プロセスは、製剤の正確な組成がロットごとに変動し得るように、しばしば組成物中に変動を導入する。連邦規則は、製造の場所又はロット番号に関わらず、薬物組成物がその製剤中で高度に一貫していることを要求する。本発明の方法は、正確な量で緩衝液及び賦形剤が添加し直される水中に製剤化されたタンパク質の溶液を作製するために使用することができ、緩衝液及び／又は賦形剤の正確な濃度を有するタンパク質製剤の作製を可能にする。
一実施形態において、本発明は、タンパク質及び水を含む水性製剤（該製剤は、低い伝導度（例えば、約２．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度）、少なくとも約１０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度、約３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下の浸透圧などの（但し、これらに限定されない。）ある種の特徴を有し、及び／又はタンパク質は約４７ｋＤａ超の分子量（Ｍｗ）を有する。）を提供する。一実施形態において、本発明の製剤は、長期間（例えば、少なくとも約３ヶ月又は少なくとも約１２ヶ月）にわたる液体形態での安定性又は少なくとも１つの凍結／融解サイクル（より多くの凍結／融解サイクルでなければ）を通じた安定性などの（但し、これらに限定されない。）改善された安定性を有する。一実施形態において、製剤は、凍結、凍結乾燥又は噴霧乾燥からなる群から選択される形態で、少なくとも３ヶ月間安定である。
一実施形態において、本発明の製剤中に含まれるタンパク質は、例えば、約４７ｋＤａ超の分子量、約５７ｋＤａ超の分子量、約１００ｋＤａ超の分子量、約１５０ｋＤａ超の分子量、約２００ｋＤａ超の分子量又は約２５０ｋＤａ超の分子量などの最小サイズを有し得る。
一実施形態において、本発明の製剤は、例えば、約２．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度、約２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度、約１．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度、約１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度又は約０．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度などの低い伝導度を有する。
一実施形態において、本発明の製剤中に含まれるタンパク質は、例えば、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬ又は約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度など、所定の濃度を有する。
一実施形態において、本発明の製剤は、約１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下の浸透圧を有する。
一実施形態において、本発明は、水及びタンパク質（該タンパク質は、所定の濃度の緩衝化された溶液中にタンパク質のＤｈより少なくとも約５０％小さい水力学的直径（Ｄｈ）を有する。）の所定濃度を含む水性製剤を提供する。一実施形態において、タンパク質のＤｈは、所定の濃度のリン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）中のタンパク質のＤｈより少なくとも約５０％小さく、タンパク質のＤｈは、所定の濃度のＰＢＳ中のタンパク質のＤｈより少なくとも約６０％小さい。タンパク質のＤｈは、所定の濃度のＰＢＳ中のタンパク質のＤｈより少なくとも約７０％小さい。
一実施形態において、本発明は、約５μｍ未満の水力学的直径（Ｄｈ）を有するタンパク質（抗体又は抗原結合断片など（但し、これらに限定されない。））を含む水性製剤を提供する。一実施形態において、タンパク質は、約３μｍ未満のＤｈを有する。
本発明の方法及び組成物において、あらゆるタンパク質が使用され得る。一実施形態において、製剤は治療用タンパク質を含む。一実施形態において、製剤は、抗体又はその抗原結合断片を含む。本発明の方法及び組成物中に含まれ得る抗体又は抗原結合タンパク質の種類には、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、アダリムマブ又はゴリムマブなどの（但し、これらに限定されない。）抗ＴＮＦａ又はＪ６９５などの（但し、これらに限定されない。）抗ＩＬ−１２抗体である。さらに、本発明の製剤は、タンパク質の少なくとも２つの異なる種類（例えば、アダリムマブ及びＪ６９５）も含み得る。
本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、非イオン化可能な賦形剤をさらに含み得る。非イオン化可能な賦形剤の例には、糖アルコール若しくはポリオール（例えば、マニトール又はソルビトール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０）及び／又は糖（例えば、ショ糖）が含まるが、これらに限定されない。本発明の製剤中にさらに含まれ得る非イオン化可能な賦形剤の他の非限定的な例には、非トレハロース、ラフィノース及びマルトースが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、製剤は、浸透圧修飾剤、安定化剤、界面活性剤、抗酸化剤、凍結保護剤、充填剤、凍結乾燥保護剤、塩基性成分及び酸性成分からなる群から選択される因子を含まない。
本発明の製剤は、インビトロ及びインビボでの使用の両方を含むあらゆる使用に適し得る。一実施形態において、本発明の製剤は、皮下、静脈内、吸入、皮内、経皮、腹腔内及び筋肉内投与などの（但し、これらに限定されない。）投与の様式を介して対象に投与するのに適している。本発明の製剤は、対象中の疾患の治療において使用され得る。
本発明の製剤を送達するために使用され得る装置も本発明に含まれる。このような装置の例には、シリンジ、ペン、インプラント、無針注射装置、吸入装置及びパッチが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の製剤は、医薬製剤である。
本発明は、第１の溶液中にタンパク質を与えること、及び水との少なくとも５倍容量交換が達成されるまで、透析ろ過溶媒として水を使用する透析ろ過に前記第１の溶液を供することにより水性製剤を調製することを含む、タンパク質及び水を含む水性製剤を調製する方法も提供する。一実施形態において、得られた製剤中のタンパク質は、その生物活性を保持する。
本発明は、第１の溶液中にタンパク質を与えること、水との少なくとも５倍容量交換が達成されるまで、透析ろ過溶媒として水を使用する透析ろ過に第１の溶液を供することにより透析ろ過されたタンパク質溶液を調製すること、及び透析ろ過されたタンパク質溶液を濃縮し、これにより、タンパク質の水性製剤を調製することを含む、タンパク質の水性製剤を調製する方法をさらに提供する。一実施形態において、得られた製剤中のタンパク質は、その生物活性を保持する。
一実施形態において、透析ろ過されたタンパク質溶液の濃縮は、遠心を介して達成される。
一実施形態において、透析ろ過溶媒は水からなる。
一実施形態において、５倍容量交換を上回る容量交換が達成されるまで、第１の溶液が水との透析ろ過に供される。一実施形態において、少なくとも約６倍の容積交換が達成されるまで、第１の溶液が水との透析ろ過に供される。一実施形態において、少なくとも約７倍の容積交換が達成されるまで、第１の溶液が水との透析ろ過に供される。
一実施形態において、水性製剤は、第１の溶液より少なくとも約９５％低い賦形剤の最終濃度を有する。
一実施形態において、水性製剤は、第１の溶液より少なくとも約９９％低い賦形剤の最終濃度を有する。
一実施形態において、最初のタンパク質溶液は、哺乳動物の細胞発現系から得られ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去するために精製される。
一実施形態において、本発明の方法は、水性製剤に賦形剤を添加することをさらに含む。
図１は、アダリムマブ参照標準ＡＦＰ０４Ｃ（下の線）、アダリムマブＤＳ（ＤＦ／ＵＦ処理前（中央の線）及び後（上の線）の薬物物質）のＳＥＣクロマトグラムを示す。 図２は、ＤＦ／ＵＦ処理されたアダリムマブ単量体への賦形剤化合物を添加した際の、アダリムマブ単量体の水力学的直径（Ｄｈ）に対するソルビトール（非イオン化可能な賦形剤）及びＮａＣｌ（イオン化可能な賦形剤）濃度の影響を示す。 図３は、Ｊ６９５参照標準（下のグラフ）及びｐＨ４．４になるようにｐＨ調整されたＪ６９５ＤＳ（上のグラフ）のＩＥＣ特性を示す。 図４は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、ｐＨ４．７を用いたＤＦ／ＵＦ後のＪ６９５（上のグラフ）及びｐＨ４．４になるようにｐＨ調整された、ＤＦ／ＵＦ前のＪ６９５（下の曲線）のＩＥＣ特性を示す。 図５は、水力学的直径（ｚ−平均）及び（ＷＦＩ中に溶解された）アダリムマブの濃度の相関をグラフで図示する。Ｘ：仮定される試料粘度として１．１ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。ｙ：仮定される試料粘度として１．９ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。 図６は、水力学的直径（ピーク単量体）及び（ＷＦＩ中に溶解された）アダリムマブの濃度の相関をグラフで図示する。Ｘ：仮定される試料粘度として１．１ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。ｙ：仮定される試料粘度として１．９ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。 図７は、水力学的直径（ｚ−平均）及び（ＷＦＩ中に溶解された）Ｊ６９５の濃度の相関をグラフで図示する。Ｘ：仮定される試料粘度として１．１ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。：仮定される試料粘度として１．９ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。 図８は、水力学的直径（ピーク単量体）及び（ＷＦＩ中に溶解された）Ｊ６９５の濃度の相関をグラフで図示する。Ｘ：仮定される試料粘度として１．１ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。ｙ：仮定される試料粘度として１．９ｍＰａｓを用いるＳＯＰを用いて測定。 図９は、注射用水中のアダリムマブ濃度に依存するアダリムマブのリジン０、１及び２の合計［％］を示す。 図１０は、注射用水中のＪ６９５濃度に依存するＪ６９５のピーク１から７の合計［％］を示す。 図１１は、注射用水中のＪ６９５濃度に依存するＪ６９５の酸性ピークの合計［％］を示す。 図１２は、注射用水（ＷＦＩ）中のＪ６９５濃度に依存するＪ６９５の塩基性ピークの合計［％］を示す。 図１３は、製剤の浸透圧及び伝導度に必要な成分の低下に関する、実施例１２において行われた透析の効率を示す（ＢＤＳ、７４ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ試料容積、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ７ＭＷＣＯ１０ｋ）。 図１４は、透析されたアダリムマブバルク溶液中のｐＨレベルの安定性を示す。脱イオン水に対する透析（１：１，０００，０００）前及び後のｐＨレベルが示されている。（ＢＤＳ、７４ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ試料容積、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ７ＭＷＣＯ１０ｋ）。 図１５は、凍結融解後の２５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬの低イオン性アダリムマブ溶液に対するボトルマッピング密度データを示す。 図１６は、凍結融解後の２５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬの低イオン性アダリムマブ溶液に対するボトルマッピングｐＨデータを示す。 図１７は、凍結融解後の２５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬの低イオン性アダリムマブ溶液に対するボトルマッピング濃度データを示す。 図１８は、凍結融解後の２５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬの低イオン性アダリムマブ溶液に対するボトルマッピング浸透圧データを示す。 図１９は、凍結融解後の２５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬの低イオン性アダリムマブ溶液に対するボトルマッピング伝導度データを示す。 図２０は、ＤＦ／ＵＦ後に、２から８℃で８．５ヶ月保存された（下の曲線）又はＤＦ／ＵＦ後に、−８０℃で４．５ヶ月保存された（上の曲線）低イオン性アダリムマブ（図２０では、Ｄ２Ｅ７と称される。）溶液のＳＥＣ分析を示す。 図２１は、凍結融解操作（Ｔ０）前及び４回の凍結融解の各々の後（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４）に、様々な溶液中及び水中に製剤化されたモノクローナル抗体１Ｄ４．７の安定性を示す。 図２２は、凍結融解操作（Ｔ０）前及び４回の凍結融解の各々の後（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４）に、水中に及び様々な緩衝液とともに製剤化されたモノクローナル抗体１３Ｃ５．５の安定性を示す。ブランク＝ＷＦＩ対照試料。 図２３は、凍結融解操作前（Ｔ０）及び４回の凍結融解の各々の後（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４）に、水中に及び添加された様々な賦形剤とともに製剤化されたモノクローナル抗体１３Ｃ５．５の安定性を示す。ブランク＝ＷＦＩ対照試料。 図２４は、溶液粘度に対するアダリムマブ（ＷＦＩ製剤）の濃度及び溶液ｐＨの影響を示す。 図２５は、様々な濃度及びｐＨ値のアダリムマブ溶液（ＷＦＩ製剤）に対する濁度データを示す。 図２６は、様々なｐＨ値及び濃度のアダリムマブ溶液（ＷＦＩ製剤）に対する水力学的直径（Ｄｈ）データを示す。 図２７は、様々な濃度の水溶液、ｐＨ５中のアダリムマブに対する強度グラフ（Ｄｈ測定）によるサイズ分布を示す。 図２８は、様々なｐＨレベルの水中のアダリムマブ１００ｍｇ／ｍＬに対する強度によるサイズ分布を示している。 図２９も、様々なｐＨレベルの水中のアダリムマブ１００ｍｇ／ｍＬに対する強度によるサイズ分布を示している。 図３０は、水中のアダリムマブに対する単量体含量（ＳＥＣ）を示す。 図３１は、水中のアダリムマブに対する凝集物含量（ＳＥＣ）を示す。 図３２は、溶液温度の関数としての２つのＪ６９５溶液（ＷＦＩ製剤）の粘度を示す。 図３３は、多数の異なる製剤に対する反復された凍結／融解（ｆ／ｔ）サイクル間の目に見えない粒子（＞１μｍ）によって測定されたＩＤ４．７抗体の安定性をグラフ的に図示する。 図３４は、多数の異なる製剤に対する反復された凍結／融解（ｆ／ｔ）サイクル間の目に見えない粒子（＞１０μｍ）によって測定されたＩ３Ｃ５．５抗体の安定性をグラフ的に図示する。 図３５は、多数の異なる製剤に対する反復された凍結／融解（ｆ／ｔ）サイクル間の目に見えない粒子（＞１μｍ）によって測定された１３Ｃ５．５抗体の安定性をグラフ的に図示する。 図３６は、多数の異なる製剤に対する反復された凍結／融解（ｆ／ｔ）サイクル間の目に見えない粒子（＞１μｍ）によって測定された７Ｃ６抗体の安定性をグラフ的に図示する。
（発明の詳細な記述）
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解できるようにするために、まず、ある種の用語を定義する。
本明細書において使用される「酸性成分」という用語は、酸性ｐＨ（すなわち、７．０未満）を有する溶液を含む因子を表す。酸性成分の例には、リン酸、塩酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、グリコール酸及びフマル酸が含まれる。一実施形態において、本発明の水性製剤は、酸性成分を含まない。
本明細書において使用される「抗酸化剤」という用語は、酸化を阻害し、従って、酸化的プロセスによる調製物の崩壊を防ぐために使用される因子を意味するものとする。このような化合物には、例として、限定なしに、アセトン、銃亜硫酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、クエン酸、ブチル化されたヒドロキシアニソール、ブチル化されたヒドロキシトルエン、ヒドロリン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、メチオニン、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ナトリウムホルムアルデヒド、スルホキシラート、チオグリコール酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ（エデタート）、ペンテタート及び当業者に公知の他の化合物が含まれる。
「水性製剤」という用語は、溶媒が水である溶液を表す。
本明細書において使用される「塩基性成分」という用語は、アルカリ（すなわち、７．０より大きなｐＨ）である因子を表す。塩基性成分の例には、水酸化カリウム（ＫＯＨ）及び水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が含まれる。
本明細書において使用される「充填剤」という用語は、再構成可能な固体にバルクを添加するために、及び／又は調製の間の製剤の特性の調節を補助するために使用される化合物を意味するものとする。このような化合物には、例として、限定なしに、デキストラン、トレハロース、ショ糖、ポリビニルピロリドン、乳糖、イノシトール、ソルビトール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルブミン、ラクトビオン酸カルシウム及び当業者に公知の他の化合物が含まれる。
本明細書において使用される「伝導度」という用語は、２つの電極間に電流を伝導させる水溶液の能力を表す。一般に、電気伝導度又は比伝導度は、物質が電流を伝導する能力の指標である。溶液では、電流はイオンの輸送によって流れる。従って、水溶液中に存在するイオンの量が増加するに連れて、溶液はより高い伝導度を有する。伝導度に対する測定の単位は、ｍｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、例えば、Ｏｒｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって販売される伝導度メータを用いて測定することができる。溶液の伝導度は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変化され得る。例えば、溶液中のイオン性賦形剤の濃度は、所望の伝導度を達成するために変化され得る。
本明細書において使用される「凍結保護剤」という用語には、凍結によって誘導されたストレスからタンパク質に安定性を与える因子が一般に含まれる。凍結保護剤の例には、例えば、マニトールなどのポリオールが含まれ、並びに、例えば、ショ糖などの糖質及び例えば、ポリソルベート、ポロキソマー又はポリエチレングリコールなどの界面活性剤などが含まれる。凍結保護剤は、製剤の浸透圧にも寄与する。
本明細書において使用される、「限外ろ過」又は「ＵＦ」という用語は、溶媒及び小さな溶質分子の通過を可能とさせながら、溶液又は懸濁液が高分子を保持する半透膜に供されるあらゆる技術を表す。限外ろ過は、溶液又は懸濁液中の高分子の濃度を増加させるために使用され得る。好ましい実施形態において、限外ろ過は、水中のタンパク質の濃度を増加させるために使用される。
本明細書において使用される「透析ろ過」又は「ＤＦ」という用語は、可溶性浸透物質成分の濃度を低下させるために、保持物質が溶媒によって希釈され、再度ろ過されるろ過の特殊なクラスを意味するために使用される。透析ろ過は、例えば、タンパク質などの保持された成分の濃度の増加をもたらす場合があり得、又はもたらさない場合があり得る。例えば、連続的透析ろ過では、ろ液が生成されるのと同じ速度で、溶媒が保持物質に連続的に添加される。この場合には、保持物質の容量及び保持された成分の濃度はプロセスの間に変化しない。他方、非連続的又は逐次希釈透析ろ過では、限外ろ過工程の後に保持物質側への溶媒の添加が続く。保持液側に添加される溶媒の容量が生成されるろ液の容量と等しくなく又は生成されるろ液の容量より多い場合には、保持される成分は高い濃度を有する。透析ろ過は、ｐＨ、イオン強度、塩組成、緩衝液組成又は高分子の溶液若しくは懸濁液の他の特性を変化させるために使用され得る。
本明細書において使用される「透析ろ過／限外ろ過」又は「ＤＦ／ＵＦ」という用語は、逐次に又は同時に限外ろ過及び／又は透析ろ過を達成するあらゆる方法、技術又は技術の組み合わせを表す。
本明細書において使用される「透析ろ過工程」という用語は、透析ろ過のプロセスの間の全容量交換を表す。
「賦形剤」という用語は、安定性を向上させるために及び／又は浸透圧を調整するために、所望の浸透圧を与える（例えば、バルク特性を変化させる）ために製剤に添加され得る因子を表す。一般的に使用される賦形剤の例には、糖、ポリオール、アミノ酸、界面活性剤及びポリマーが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において互換的に使用される「イオン性賦形剤」又は「イオン化可能な賦形剤」という用語は、正味の電荷を有する因子を表す。一実施形態において、イオン性賦形剤は、ｐＨなどのある製剤条件下で正味の電荷を有する。イオン性賦形剤の例には、ヒスチジン、アルギニン及び塩化ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において互換的に使用される「非イオン性賦形剤」又は「イオン化不可能な賦形剤」という用語は、正味の電荷を有さない因子を表す。一実施形態において、非イオン性賦形剤は、ｐＨなどのある種の製剤条件下で正味の電荷を有さない。非イオン性賦形剤の例には、糖（例えば、ショ糖）、糖アルコール（例えば、マニトール）及び非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「最初のタンパク質溶液」又は「第１の溶液」という用語は、本発明の方法において使用される当初タンパク質溶液又は初発材料、すなわち、水の中に透析ろ過された当初タンパク質溶液を表す。一実施形態において、最初のタンパク質溶液は、イオン性賦形剤、非イオン性賦形剤及び／又は緩衝系を含む。
粒子の「水力学的直径」又は「Ｄｈ」という用語は、水の密度及び前記粒子と同じ速度を有する球体の直径を表す。従って、本明細書において使用される「タンパク質の水力学的直径」という用語は、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いる溶液中のタンパク質に対するサイズ測定を表す。ＤＬＳ測定装置は、固定された散乱角度で溶液中のタンパク質から散乱される光の強度の時間依存性振動を測定する。タンパク質のＤｈは、時間依存的な強度の振動の強度自己相関関数から測定される。散乱強度データは、散乱分子、すなわちタンパク質試料の水力学的直径及びサイズ分布に対する値を測定するためのＤＬＳ装置ソフトウェアを用いて処理される。
本明細書において使用される「凍結乾燥保護剤」という用語には、例えば、タンパク質の適切な立体構造を維持することによって、乾燥又は凍結乾燥プロセスの間の水の除去の間に、タンパク質に対して安定性を付与する因子が含まれる。凍結乾燥保護剤の例には、糖質、特に、二糖又は三糖が含まれる。凍結保護剤は、凍結乾燥保護効果も提供し得る。
組成物、例えば水性製剤に関して本明細書で使用される「医薬」という用語は、疾病又は疾患を治療するのに有用である。
「タンパク質」という用語は、二次及び／又は三次及び／又は四次構造のより高次のレベルを生成するのに、鎖長が十分であるアミノ酸の配列を含むものとする。これは、このような構造を持たない「ペプチド」又は他の小分子量薬物から区別されるべきである。一実施形態において、本明細書において使用されるタンパク質は、少なくとも約４７ｋＤの分子量を有する。本明細書において使用される定義に包含されるタンパク質の例には、治療用タンパク質が含まれる。「治療活性を有するタンパク質」又は「治療用タンパク質」は、治療目的のために、すなわち、対象中の疾患を治療するために使用され得るタンパク質を表す。治療用タンパク質は治療目的のために使用され得るが、前記タンパク質はインビトロ研究のためにも使用され得るので、本発明はこのような用途に限定されるものではないことを銘記すべきである。好ましい実施形態において、治療用タンパク質は、融合タンパク質又は抗体若しくはその抗原結合部分である。一実施形態において、本発明の方法及び組成物は、異なるアミノ酸配列を有する２つのタンパク質として定義される少なくとも２つの異なるタンパク質を含む。追加の異なるタンパク質は、タンパク質の分解産物を含まない。
本明細書において使用される「タンパク質が水中に溶解されている」という用語は、ＤＦ／ＵＦ処理プロセスによって、小分子（例えば、緩衝液、賦形剤、塩、界面活性剤）の量が低下されている水溶液中にタンパク質が溶解されているタンパク質の製剤を表す。ＤＦ／ＵＦ処理プロセスによって、絶対的な意味で、小分子の完全な除去が達成され得ないとしても、ＤＦ／ＵＦを適用することによって達成可能な賦形剤の理論的な低減は、専ら実質的に水の中にタンパク質の製剤を作製するのに十分に大きい。例えば、連続様式のＤＦ／ＵＦプロトコールで６容量の交換を用いると、賦形剤の理論低減率は、約９９．８％（ｃｉ＝ｅ−ｘ）（ｃｉは当初の賦形剤濃度であり、及びｘは容量交換の回数である。）である。
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性を有効とし得る形態であり、従って、治療用途のために対象に投与され得る調製物を表す。
「安定な」製剤とは、保存時に、その中のタンパク質が、その物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を実質的に保持する製剤である。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術が本分野において利用可能であり、例えば、「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）」及び「Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）」に概説されている。一実施形態において、タンパク質の安定性は、溶液中の単量体タンパク質のパーセントに従って測定され、分解された（例えば、断片化された）及び／又は凝集されたタンパク質の低いパーセントを有する。例えば、安定なタンパク質を含む水性製剤は、少なくとも９５％の単量体タンパク質を含み得る。あるいは、本発明の水性製剤は、５％以下の凝集物及び／又は分解されたタンパク質を含み得る。
「安定化剤」という用語は、安定性を向上させ又はその他強化する賦形剤を表す。安定化剤には、α−リポ酸、α−トコフェロール、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ビオチン、亜硫酸水素塩、ホウ素、ブチル化されたヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化されたヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸及びそのエステル、カロテノイド、クエン酸カルシウム、アセチル−Ｌ−カルニチン（ｃａｍｉｔｉｎｅ）、キレート剤、コンドロイチン、クロム、クエン酸、補酵素Ｑ−１０、システイン、システイン塩酸塩、３−デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸；エデト酸二ナトリウム）、硫酸第一鉄、葉酸、フマル酸、没食子酸アルキル、ニンニク、グルコサミン、ブドウ種子抽出物、ググル（ｇｕｇｕｌ）、マグネシウム、リンゴ酸、メタ重亜硫酸塩、Ｎ−アセチルシステイン、ナイアシン、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎｏｍｉｄｅ）、イラクサの根、オルニチン、没食子酸プロピル、ピクノゲノール、ノコギリヤシ、セレン、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、酒石酸、チオサルファート、チオグリセロール、チオソルビトール、トコフェロール及びそのエステル、例えば、酢酸トコフェラール、コハク酸トコフェロール、トコトリエナール、ｄ−α−トコフェロールアセタート、ビタミンＡ及びそのエステル、ビタミンＢ及びそのエステル、ビタミンＣ及びそのエステル、ビタミンＤ及びそのエステル、ビタミンＥ及びそのエステル、例えば、ビタミンＥアセタート、亜鉛並びにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
「界面活性剤」という用語には、空気／溶液界面によって誘導されるストレス及び溶液／表面によって誘導されるストレスからタンパク質を保護する因子が一般に含まれる。例えば、界面活性剤は、タンパク質を凝集から保護し得る。適切な界面活性剤には、例えば、ポリソルベート、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）などのポリオキシエチレンアルキルエーテル又はＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０若しくはポロキサマー１８８などのポロキサマーが含まれ得る。好ましい洗浄剤には、ポロキサマー、例えば、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＡ２５、ＳｙｍｐａｔｅｎｓＡＬＭ／２３０；並びにポリソルベート／Ｔｗｅｅｎ、例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０及びＰｏｌｏｘａｍｅｒ、例えば、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８及びＴｗｅｅｎ、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０が含まれ得る。
本明細書において使用される「浸透圧修飾物質」という用語は、液体製剤の浸透圧を調整するために使用することができる一又は複数の化合物を意味するものとする。適切な浸透圧修飾物質には、グリセリン、ラクトース、マニトール、デキストロース、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、ラフィノース、マルトース及び当業者に公知の他の浸透圧修飾物質が含まれる。一実施形態において、液体製剤の浸透圧は、血液又は血漿の浸透圧とほぼ同じである。
「水」という用語は、通常蒸留又は逆浸透によってきょう雑物を除去するために精製された水を意味するものとし、本明細書において、「純水」とも称される。好ましい実施形態において、本発明の方法及び組成物において使用される水は、賦形剤を含まない。一実施形態において、水は、対象への投与に適した滅菌水を含む。別の実施形態において、水は、注射用水（ＷＦＩ）を含むものとする。一実施形態において、水は、蒸留水又はインビトロアッセイでの使用に適した水を表す。好ましい実施形態において、透析ろ過は、透析ろ過溶媒として水のみを用いて、本発明の方法に従って行われる。
本明細書において使用される「抗体」という用語には、完全な抗体及びあらゆるその抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又は一本鎖が含まれる。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合タンパク質を表す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される。）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される。）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。）に介在された超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。）へさらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。重及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）など、宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」（又は、単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１２）へ特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上の断片を表す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ及びＶＨが対合して一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。）として２つのドメインＶＬ及びＶＨを作製することを可能にする合成リンカーによって、組み換え法を用いて連結することができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３参照）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に公知の慣用技術を用いて取得され、完全状態の抗体と同じ様式で使用可能性に関して断片がスクリーニングされる。本発明の一実施形態において、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｄ’、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖａ及びドメイン抗体（ｄＡｂ）からなる群から選択される。
さらに、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分の１つ又はそれ以上のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有会合によって形成されるより大きな免疫接着分子の一部であり得る。これらの他のタンパク質又はペプチドは、抗体若しくはその抗原結合部分の精製を可能にする又は互いに若しくは他の分子との会合を可能にする官能性を有し得る。従って、このような免疫接着分子の例には、四量体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３−１０１）及び二価の及びビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ、完全抗体のパパイン又はペプシン消化などの慣用技術を用いて、完全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて取得することができる。
同属の対若しくは群を形成する構造のファミリーに属し、又はこのようなファミリーに由来し、及びこの特徴を保持する場合に、２つの抗体ドメインは、「相補的」である。例えば、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインは相補的である。２つのＶＨドメインは相補的でなく、及び２つのＶＬドメインは相補的でない。相補的ドメインは、Ｔ細胞受容体のＶα及びＶβ（又はγ及びδ）ドメインなど、免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバー中に見出され得る。
「ドメイン」という用語は、タンパク質の残部とは独立に、その四次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を表す。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能特性に必要とされ、多くの事例で、タンパク質の及び／又はドメインの残部の機能を失わせることなく、他のタンパク質に付加され、除去され、又は転移され得る。単一の抗体可変ドメインは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。従って、単一の抗体可変ドメインには、完全な抗体可変ドメイン並びに例えば、抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって１つ若しくはそれ以上のループが置換されている修飾された可変ドメイン、又は末端切断されている若しくはＮ末端若しくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン及び完全長ドメインの結合活性及び特異性を少なくとも部分的に保持する可変ドメインの折り畳まれた断片が含まれる。
本発明の可変ドメインは、ドメインの群を形成するために組み合わされ得る。例えば、相補性ドメインが組み合わされ得る（ＶＨドメインと組み合わされているＶＬドメインなど）。非相補的ドメインも組み合わされ得る。ドメインは共有又は非共有的手段によるドメインの連結など、多数の方法で組み合わされ得る。
「ｄＡｂ」又は「ドメイン抗体」は、抗原を特異的に結合する単一の抗体可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）ポリペプチドを表す。
本明細書において使用される「抗原結合領域」又は「抗原結合部位」用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗体の特異性及び親和性を抗体に付与するアミノ酸残基を含有する、抗体分子の一部又はその抗原結合部分を表す。
「エピトープ」という用語は、抗体の抗原結合領域の１つ又はそれ以上において、抗体によって認識され得、及び抗体によって結合され得るあらゆる分子の部分を表すものとする。本発明において、第一及び第二の「エピトープ」は、同一でなく及び単一の一重特異的抗体又はその抗原結合部分によって結合されないエピトープであると理解される。
「組換え抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子導入された動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）又は他のＤＮＡ配列への特定の免疫グロブリン遺伝子配列（ヒト免疫グロブリン遺伝子配列など）のスプライシングを含むあらゆる他の手段によって調製され、発現され、作製され、又は単離された抗体など、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、又は単離された抗体を表す。組換え抗体の例には、キメラ、ＣＤＲ移植され及びヒト化抗体が含まれる。
「ヒト抗体」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ他（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）によって記載されているように、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応し又は由来する可変及び定常領域を有する抗体を表す。しかしながら、本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ中に、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロで無作為若しくは部位特異的突然変異導入による又はインビボで体細胞変異による変異）を含み得る。
本発明の組換えヒト抗体は、可変領域を有し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域も含み得る（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２参照）。しかしながら、ある種の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対して遺伝子導入された動物を使用する場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され、従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関連するが、インビボにおいて、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しない場合があり得る配列である。ある実施形態において、しかしながら、このような組換え抗体は、選択的突然変異誘発又は逆変異又は両者の結果である。
「逆変異」という用語は、ヒト抗体の体細胞的に変異されたアミノ酸の幾つか又は全部を相同な生殖系列抗体配列由来の対応する生殖系列残基で置換する方法である。本発明のヒト抗体の重及び軽鎖配列は、最高の相同性を有する配列を同定するために、ＶＢＡＳＥデータベース中の生殖系列配列と別個に並置される。このような異なるアミノ酸をコードする所定のヌクレオチド位置を変異させることによって、本発明のヒト抗体中の差は生殖系列配列に復帰される。このようにして逆変異のための候補として同定された各アミノ酸の役割は、抗原結合における直接又は間接的役割に関して調査されるべきであり、ヒト抗体のあらゆる望ましい特徴に影響を与えることが変異後に見出された何れのアミノ酸も、最終のヒト抗体中に含まれるべきでない。逆変異に供されるアミノ酸の数を最小限に抑えるために、第二の生殖系列配列が同一であり、問題のアミノ酸の両側で少なくとも１０個、好ましくは１２個のアミノ酸に関して本発明のヒト抗体の配列と同一及び同一直線上である限り、最も近い生殖系列配列と異なるが、第二の生殖系列配列中の対応するアミノ酸と同一であることが明らかとなったアミノ酸位置は残存することができる。逆変異は、抗体最適化のあらゆる段階において行われ得る。
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種から得られる重及び軽鎖可変領域並びに別の種から得られる定常領域配列を含む抗体を表す。
「ＣＤＲ移植抗体」という用語は、マウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）の１つ又はそれ以上がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上の配列が別の種のＣＤＲ配列で置換されている抗体を表す。
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の種（例えば、マウス）由来の重及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に改変されている、すなわち、ヒト生殖系列可変配列により類似している抗体を表す。ヒト化抗体の１つの種類は、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ配列中に導入されているＣＤＲ移植抗体である。
本発明の様々な態様が、以下の節において、さらに詳しく記載されている。
ＩＩ．本発明の方法
一般に、透析ろ過は、タンパク質、ペプチド、核酸及びその他の生物分子を含有する溶液から塩又は溶媒を除去し、置換し、又はこれらの濃度を低下させるために膜を使用する技術である。タンパク質作製操作は、タンパク質の発現に起因する不純物（例えば、宿主細胞のタンパク質）からタンパク質が精製されたら、製剤緩衝液中へのタンパク質溶液の最終透析ろ過をしばしば伴う。本明細書に記載されている発明は、透析ろ過溶液として水のみを使用する透析ろ過にタンパク質溶液を供することによって、水性製剤を得るための手段を提供する。従って、本発明の製剤は、透析ろ過プロセスの間の製剤溶媒として水を使用することに基づき、最終製剤中のタンパク質を可溶化及び／又は安定化するために使用される賦形剤（界面活性剤など）を含む伝統的な製剤溶媒に依拠しない。本発明は、安定な製剤中で使用するためにタンパク質（該タンパク質は溶液中に残存し、その安定性を維持するために他の因子を使用せずに、高いレベルで濃縮することができる。）を純水に移すための方法を提供する。
本明細書の教示に従う透析ろ過又はＤＦ／ＵＦの前に、前記方法は、第１の溶液中に、まずタンパク質を提供することを含む。タンパク質は、合成技術（例えば、組換え技術、ペプチド合成又はこれらの組み合わせ）などの本分野において十分に確立されている技術を用いた製剤など、あらゆる第１の溶液中に製剤化され得る。あるいは、本発明の方法及び組成物中に使用されるタンパク質は、タンパク質の内因性の源から単離される。最初のタンパク質溶液は、タンパク質の不均質な混合物からタンパク質を精製する精製法を用いて取得され得る。一実施形態において、本発明において使用される最初のタンパク質溶液は、タンパク質溶液から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去する多数のクロマトグラフィー工程に、哺乳動物発現系中に発現されたタンパク質（抗体など）が供される精製法から取得される。一実施形態において、最初のタンパク質溶液は、哺乳動物の細胞発現系から取得され、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去するために精製されている。精製の方法の例は、米国特許出願１１／７３２，９１８号（ＵＳ２００７０２９２４４２）（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。本発明の方法において最初のタンパク質溶液の特殊な調製は必要とされないことを銘記すべきである。
本発明の組成物及び方法において使用され得るタンパク質は、あらゆるサイズ、すなわち、分子量（Ｍｗ）であり得る。例えば、タンパク質は、約１ｋＤａ以上の分子量、約１０ｋＤａ以上の分子量、約４７ｋＤａ以上の分子量、約５７ｋＤａ以上の分子量、約１００ｋＤａ以上の分子量、約１５０ｋＤａ以上の分子量、約２００ｋＤａ以上の分子量又は約２５０ｋＤａ以上の分子量を有し得る。上に明記されている分子量の中間の数字、例えば、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１３４、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０など並びに本明細書中に明記されている全ての他の数字も、本発明の一部であるものとする。上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いた値の範囲は、本発明の範囲に含まれるものとする。例えば、本発明において使用されるタンパク質は、５７ｋＤａから２５０ｋＤａまで、５６ｋＤａから２４２ｋＤａまで、６０ｋＤａから２７０ｋＤａまでなどのサイズの範囲であり得る。
本発明の方法は、少なくとも２つの異なるタンパク質を含む最初のタンパク質溶液の透析ろ過も含む。例えば、タンパク質溶液は、異なる分子又は同じ分子の異なるエピトープに対して誘導された抗体の２つ又はそれ以上の種類を含有し得る。
一実施形態において、溶液中のタンパク質は、融合タンパク質及び酵素などの（但し、これらに限定されない。）治療用タンパク質である。治療用タンパク質の例には、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（ドルナーゼα）、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（ベカプレルミン）、Ａｃｔｉｖａｓｅ（アルテプラーゼ）、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（ラロニダーゼ）、Ａｍｅｖｉｖｅ（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）、Ａｒａｎｅｓｐ（ダルベポエチンα）、Ｂｅｃａｐｌｅｒｍｉｎ濃縮物、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（インターフェロンβ−１ｂ）、ＢＯＴＯＸ（ボツリヌス毒素Ａ型）、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｅｌｓｐａｒ（アスパラギナゼーゼ）、Ｅｐｏｇｅｎ（エポエチンα）、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（アガルシダーゼβ）、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（インターフェロンαｃｏｎ−１）、ＩｎｔｒｏｎＡ（インターフェロンα−２ａ）、Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ａｎａｋｉｎｒａ）、ＭＹＯＢＬＯＣ（ボツリヌス毒素Ｂ型）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ、Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｏｐｒｅｌｖｅｋｉｎ）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、Ｏｎｔａｋ（Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｐｅｇインターフェロンα−２ａ）、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（ドルナーゼα）、Ｒｅｂｉｆ（インターフェロンβ−１ａ）、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（Ｂｅｃａｐｌｅｒｍｉｎ）、Ｒｅｔａｖａｓｅ（Ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンα−２）、ＴＮＫａｓｅ（Ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ）及びＸｉｇｒｉｓ（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎα）、Ａｒｃａｌｙｓｔ（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）、ＮＰｌａｔｅ（Ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ）、Ｍｉｒｃｅｒａ（メトキシポリエチレングリコール−エポエチンβ）、Ｃｉｎｒｙｚｅ（Ｃ１エステラーゼ阻害剤）、Ｅｌａｐｒａｓｅ（イズロン酸硫酸化酵素）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（アルグルコシダーゼα）、Ｏｒｅｎｃｉａ（ａｂａｔａｃｅｐｔ）、Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（ガルスルファーゼ）、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（ｐａｌｉｆｅｒｍｉｎ）及びＡｃｔｉｍｍｕｎｅ（インターフェロンγ−１ｂ）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明において使用されるタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片でもあり得る。本発明において使用され得る抗体の例には、キメラ抗体、非ヒト抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれる。一実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、抗ＴＮＦα及び／又は抗ＩＬ−１２抗体である（例えば、抗体又はその抗原結合断片は、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体であり得る。）。本発明の方法及び組成物において使用され得る抗体又はその抗原結合断片の他の例には、１Ｄ４．７（抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３抗体；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２．５（Ｅ）ｍｇ１（抗ＩＬ−１８；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１３Ｃ５．５（抗ＩＬ−１３抗体；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｊ６９５（抗ＩＬ−１２；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ（Ｆａｂ２抗ＴＮＦ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｈｕｍｉｒａ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｃａｍｐａｔｈ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ（ｆａｂ断片）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、Ｍｙｏｓｃｉｎｔ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ Ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（Ｃａｐｒｏｍａｂ Ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ＲｅｏＰｒｏ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、Ｘｏｌａｉｒ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ Ｔｉｕｘｅｔａｎ）、ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＯＫＴ３（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、Ｐａｎｏｒｅｘ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ｇｏｌｉｍｕｍａｂ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、Ｃｉｍｚｉａ（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、Ｓｏｌｉｒｉｓ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、ＣＮＴＯ１２７５（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、Ｂｅｘｘａｒ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ及びＩ１３１ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、国際出願ＷＯ２００７／１４９０３２に記載されているような抗ＩＬ−１７抗体であるＡｎｔｉｂｏｄｙ７（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（その内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）、抗ＩＬ−１３抗体であるＣＡＴ−３５４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ヒトＣＤ４抗体であるＣＥ９ｙ４ＰＥ（ＩＤＥＣ−１５１，ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ／Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、抗ヒトＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ ＣＥ９．１／ＳＢ−２１０３９６（ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ）、抗ヒトＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ−１１４（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ）、抗狂犬病ウイルスタンパク質抗体であるＣＲ４０９８（ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、及び抗ヒトＴＮＦ−関連アポトーシス誘導リガンド受容体２（ＴＲＡＩＬ−２）抗体であるＨＧＳ−ＥＴＲ２（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）及びＡｖａｓｔｉｎ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）が含まれるが、これらに限定されない。
抗体を作製するための技術は、以下に提供されている。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、ある抗原に対して特異的であるが、前記抗原上の異なるエピトープに結合する抗体の混合物を一般に表す。ポリクローナル抗体は、関連する抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって動物内で一般に産生される。二官能性剤又は誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じた連結）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ１ＮＣＮＲ（Ｒ及びＲ１は、異なるアルキル基である。）を用いて、免疫化されるべき種内において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシン阻害剤）へ関連抗原を連結するのに有用であり得る。ポリクローナル抗体を作製するための方法は本分野において公知であり、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ（１９８８）」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
モノクローナル抗体
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマに由来する抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎハイブリドーマ法などのハイブリドーマ技術によって調製されたハイブリドーマによって分泌される抗体）を表すものとする。例えば、モノクローナル抗体は、「Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）」によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。従って、本発明のハイブリドーマ由来二重特異性抗体は単一の抗原より多くの抗原に対して抗原特異性を有するが、なおモノクローナル抗体と称される。
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体（すなわち、集団を構成する各抗体は、微量に存在する可能性がある天然の変異を除き同一である。）の集団から得られる。従って、「モノクローナル」という修飾語は、異なる抗体の混合物でないという抗体の特徴を示す。
さらなる実施形態において、抗体は、「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）」に記載されている技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。「Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）」及び「Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）」は、それぞれ、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記載する。その後の刊行物は、極めて巨大なファージライブラリーを構築するための戦略として、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））並びにコンビナトリアル感染及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替技術である。
抗体及び抗体断片は、米国特許第６，４２３，５３８号；６，６９６，２５１号；６，６９９，６５８号；６，３００，０６５号；６，３９９，７６３号及び６，１１４，１４７号に記載されているように、発現ライブラリーを用いて、酵母及びその他の真核細胞からも単離され得る。真核細胞は、細胞表面上に提示するために、コンビナトリアル抗体ライブラリーから得られるものなどのライブラリータンパク質を発現するように改変され得、標的分子を選択するための親和性を有する抗体に関して、ライブラリークローンを含有する特定の細胞を選択することが可能となる。単離された細胞からの回収後に、目的の抗体をコードするライブラリークローンは、適切な哺乳動物細胞株から高レベルで発現され得る。
目的の抗体を開発するためのさらなる方法には、米国特許第７，１９５，８８０；同第６，９５１，７２５号；同第７，０７８，１９７号；同第７，０２２，４７９号、同第６，５１８，０１８号；同第７，１２５，６６９号；同第６，８４６，６５５号；同第６，２８１，３４４号；同第６，２０７，４４６号；同第６，２１４，５５３号；同第６，２５８，５５８号；同第６，２６１，８０４号；同第６，４２９，３００号；同第６，４８９，１１６号；同第６，４３６，６６５号；同第６，５３７，７４９号；同第６，６０２，６８５号；同第６，６２３，９２６号；同第６，４１６，９５０号；同第６，６６０，４７３号；同第６，３１２，９２７号；同第５，９２２，５４５号；及び同第６，３４８，３１５号に記載されているように、核酸ディスプレイ技術を用いた無細胞スクリーニングが含まれる。これらの方法は、タンパク質が由来する核酸にタンパク質が物理的に会合又は結合されるように、核酸からインビトロでタンパク質を転写するために使用することができる。標的分子を有する発現されたタンパク質に関して選択することによって、タンパク質をコードする核酸も選択される。無細胞スクリーニング技術に対する一つの変法において、抗体の多様性を増大させるために、免疫系細胞から単離された抗体配列を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発技術を部分的に無作為化することができる。次いで、これらの部分的に無作為化された抗体遺伝子は、無細胞系内で発現され、核酸と抗体の間に同時の物理的会合が作出される。
ＤＮＡは、例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重および軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって、（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、又は非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによっても修飾され得る。
抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製するために、典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに対して置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換される。
キメラ又はハイブリッド抗体は、架橋剤を用いるものなど、合成タンパク質化学における公知の方法を用いて、インビトロでも調製され得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミダートが含まれる。
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、本分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源からその中に導入された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「輸入」可変ドメインから通例採取される「輸入」残基としばしば称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に対する非ヒト（例えば、げっ歯類）ＣＤＲ又はＣＤＲ配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）の方法に従って本質的に実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の対応する配列によって、完全状態より大幅に少ないヒト可変ドメインが置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、通例、幾つかのＣＤＲ残基及びおそらくは幾つかのフレームワーク（ＦＲ）残基がげっ歯類抗体中の同等の部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化プロセスを記載するさらなる参考文献には、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）が含まれる。
ヒト抗体
あるいは、免疫化時に、内在の免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを作製可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウス中の抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は内在の抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異体マウス中へのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の導入は、抗原攻撃誘発時に、ヒト抗体の作製をもたらす。例えば、「Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）」を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１））。
一実施形態において、本発明の製剤は、例えば、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ、アダリムマブ又はＤ２Ｅ７とも称される。Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）など、ヒトＴＮＦαを結合する抗体又はその抗原結合部分を含む。一実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、１×１０−８Ｍ又はそれ以下のＫｄ及び１×１０−３ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆ速度定数（何れも、表面プラズモン共鳴によって測定される。）で、ヒトＴＮＦαから解離し、１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＩＣ５０で、標準的なインビトロＬ９２９アッセイ中でヒトＴＮＦα細胞毒性を中和する。ヒトＴＮＦαに対して高い親和性を有するヒト中和抗体の例及び作製方法（この抗体の配列を含む。）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０９０，３８２号（Ｄ２Ｅ７と称される。）に記載されている。
一実施形態において、本発明の製剤は、例えば、抗体Ｊ６９５（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＡＢＴ−８７４とも称される。）（米国特許第６，９１４，１２８号）など、ヒトＩＬ−１２を結合する抗体又はその抗原結合部分を含む。Ｊ６９５は、インターロイキン−１２及びインターロイキン−２３を標的とし、これらを中和するように設計された完全なヒトモノクローナル抗体である。一実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、以下の特徴を有する。抗体又はその抗原結合断片は、３×１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＩＬ−１αから解離し、５×１０−５Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＩＬ−１βから解離し、マウスＩＬ−１α又はマウスＩＬ−１βを結合しない。ヒトＩＬ−１２に対して高い親和性を有するヒト中和抗体の例及び作製方法（この抗体の配列を含む。）が、米国特許第６，９１４，１２８号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
一実施形態において、本発明の製剤は、例えば、抗体２．５（Ｅ）ｍｇ１（Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ；ＡＢＴ−３２５とも称される。）など、ヒトＩＬ−１８を結合する抗体又はその抗原結合部分を含む（米国特許出願２００５／０１４７６１０参照（参照により、本明細書に組み込まれる。））。
一実施形態において、本発明の製剤は、抗体１Ｄ４．７（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＡＢＴ−１４７とも称される。）である抗ＩＬ−１２／抗ＩＬ−２３抗体又はその抗原結合部分を含む（２００７年１月１１日に公開されたＷＯ２００７／００５６０８Ａ２参照。参照により、本明細書に組み込まれる。）。
一実施形態において、本発明の製剤は、抗体１３Ｃ５．５（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＡＢＴ−３０８とも称される。）である抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分を含む（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／１９６６０（ＷＯ０８／１２７２７１）参照。参照により、本明細書に組み込まれる。）。
一実施形態において、本発明の製剤は、抗体７Ｃ６（抗アミロイドβ抗体）である抗体又はその抗原結合分を含む（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＰＣＴ公開ＷＯ０７／０６２８５２参照。参照により、本明細書に組み込まれる。）。
二重特異的抗体
二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異性を有する抗体である。このような抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）に由来し得る。
二重特異的抗体を作製するための方法は、本分野において公知である。完全長二重特異的抗体の伝統的な作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（２つの鎖は異なる特異性を有する。）の同時発現を基礎としている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重及び軽鎖の無作為仕分けのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子（そのうち一つのみが正しい二重特異的構造を有する。）を含む可能性を有する混合物を産生する。通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる正しい分子の精製はかなり骨が折れ、産物の収率は低い。類似の操作が、ＷＯ９３／０８８２９及び「Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）」に開示されている。
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。
好ましくは、融合は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを用いて行われる。融合物の少なくとも１つの中に存在する軽鎖結合のために必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター中に挿入され、適切な宿主生物中へ同時形質移入される。これにより、構築に使用される３つのポリペプチドの鎖の等しくない比率が最適な収率を与える実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する上で大幅な柔軟性が得られる。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合に、又は比率がまったく重要でない場合に、１つの発現ベクター中に、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖に対するコード配列を挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異的抗体は、一方のアーム中の第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖及び他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を与える。）から構成される。二重特異的分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することによって、容易な分離法が与えられるので、この非対称的な構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異的化合物の分離を容易にすることが見出された。このアプローチは、１９９４年３月３日に公開されたＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異的の作製に関するさらなる詳細については、例えば、「Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）」を参照されたい。
二重特異的抗体には、架橋された又は「ヘテロ連結」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ連結中の抗体の１つはアビジンに、他方はビオチンに結合させることが可能である。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的誘導することが提案され（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）が提案されている。ヘテロ連結抗体は、あらゆる都合のよい架橋法を用いて作製され得る。適切な架橋剤は本分野において周知であり、多数の架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異的抗体を作製するための技術も、この文献中に記載されている。二価の抗体断片（必ずしも二重特異的でない。）を作製するために、以下の技術を使用することもできる。例えば、二価抗体を形成するために、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から回収されたＦａｂ’断片をインビトロで化学的に結合することができる。「Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）」を参照されたい。
組換え細胞培養から直接得られた二価抗体断片を作製及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを用いて、二価のヘテロ二量体が作製されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。単量体を形成するために、ヒンジ領域において、抗体ホモ二量体が還元され、次いで、抗体ヘテロ二量体を形成するために再酸化した。「Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）」によって記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異的／二価抗体断片を作製するための別の機序を与えた。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合が不可能であるほど極めて短いリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対合され、これにより、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異的／二価抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。「Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）」を参照されたい。
一実施形態において、本発明の製剤は、ＩＬ−１（ＩＬ−１α及びＩＬ−１βを含む。）に対して二重特異的である抗体を含む。二重特異的ＩＬ−１抗体を作製するための例及び方法は、２００６年１２月２９日に出願された米国仮特許出願６０／８７８１６５号に見出すことができる。
透析ろ過／限外ろ過（本明細書において、ＤＦ／ＵＦとも一般に称される。）は、成分の分子サイズに基づいて、溶液及び懸濁液の成分を分離するために、透過性（多孔性）膜フィルターを選択的に使用する。膜は、膜の孔より大きな分子を保持するのに対して、塩、溶媒及び水など、透過性のより小さな分子は膜を自由に通過する。膜によって保持された溶液は、濃縮物質又は保持物質として知られる。膜を通過する溶液は、ろ液又は浸透物として知られる。濃縮のための膜を選択するための１つのパラメータは、濃縮されるべき試料に対するその保持特性である。一般則として、膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、保持されるべき分子の分子量の１／３から１／６とすべきである。これは、完全な保持を確保するためである。ＭＷＣＯが試料のＭＷＣＯに近づくほど、濃縮の間の幾らかの小産物の喪失のリスクが大きくなる。本発明の方法ととともに使用することができる膜の例には、ＯｍｅｇａＴＭＰＥＳ膜（３０ｋＤａＭＷＣＯ、すなわち、３０ｋＤａより大きな分子が膜によって保持され、３０ｋＤａ未満の分子は膜のろ液側に通過することができる（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｘ（Ｒ）−ＧＶ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｄｒｉｖｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ，ＰＶＤＦ０．２２μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）；Ｍｉｌｌｅｘ（Ｒ）−ＧＶ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｄｒｉｖｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ，ＰＥＳ０．２２μｍ；Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（Ｒ）０．２２μｍＦｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）；及びＶｉｖａｓｐｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（ＭＷＣＯ１０ｋＤａ，ＰＥＳ；ＭＷＣＯ３ｋＤａ，ＰＥＳ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ）。本発明の低イオン性タンパク質製剤を調製するために、タンパク質溶液（緩衝化された製剤中に可溶化され得る。）は、ＤＦ／ＵＦ溶媒として水が使用されるＤＦ／ＵＦプロセスに供される。好ましい実施形態において、ＤＦ／ＵＦ溶媒は水からなり、他の何れの賦形剤も含まない。
本発明のＤＦ／ＵＦプロセスにおいてあらゆる水を使用することができるが、好ましい水は、精製された又は脱イオン化された水である。本発明の実施において使用され得る本分野で公知の水の種類には、注射用水（ＷＦＩ）（例えば、ＨｙＰｕｒｅＷＦＩ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｗａｔｅｒ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＡＱＵＡ−ＮＯＶＡ（Ｒ）ＷＦＩ（Ａｑｕａ Ｎｏｖａ））、ＵｌｔｒａＰｕｒｅＴＭＷａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれる。
非連続様式のＤＦ／ＵＦ及び連続様式のＤＦ／ＵＦを含むＤＦ／ＵＦの２つの形態が存在する。本発明の方法は、何れの様式に従っても実施され得る。
連続的ＤＦ／ＵＦ（定容積ＤＦ／ＵＦとも称される。）は、ろ液が生成されるのと同じ速度で、水又は新しい緩衝液を保持物質に添加することによって、保持物質（試料又は最初のタンパク質溶液）中の元の緩衝液塩（又は他の低分子量種）を洗浄除去することを含む。その結果、保持物質の容積及び産物濃度は、ＤＦ／ＵＦプロセスの間に変化しない。除去される塩の量は、保持物質容積と比較した生成されるろ液容積に関連する。生成されるろ液容積は、「透析ろ過容積」という用語で通常表される。単一の透析ろ過容積（ＤＶ）は、透析ろ過が開始された時点の保持物質の容積である。連続的透析ろ過に関しては、液体は、ろ液が生成されるのと同じ速度で添加される。収集されたろ液の容積が最初の保持物質容積と等しいときに、１ＤＶが処理される。
非連続的ＤＦ／ＵＦ（その例は、実施例の部で以下に記載されている。）には、２つの異なる方法、非連続的逐次ＤＦ／ＵＦ及び容積低下非連続的ＤＦ／ＵＦが含まれる。逐次希釈による非連続的ＤＦ／ＵＦは、水を用いて、試料（又は最初のタンパク質溶液）を所定の容量まで、まず希釈することを含む。次いで、希釈された試料は、ＵＦによって、その元の容積まで再度濃縮される。容積低下による非連続的ＤＦ／ＵＦは、まず、試料を所定の容積まで濃縮し、次いで、水又は交換緩衝液を用いて、試料をその元の容積まで再度希釈することを含む。連続的ＤＦ／ＵＦと同様、望ましくない溶質（例えば、イオン性賦形剤）のレベルが除去されるまで、このプロセスは繰り返される。
ＤＦ／ＵＦは、ＤＦ／ＵＦ溶媒として、水（例えば、ＷＦＩ）を用いて、本分野で公知の慣用技術に従って実施され得る（例えば、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｂｅａｔｏｎ ＆ Ｋｌｉｎｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｓｅｐａｒ．Ｐｒｏｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，４（２）１−１０（１９８３））。ＤＦ／ＵＦを実施するための市販の装置の例には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＬＶ ＣｅｎｔｒａｍａｔｅＴＭＬａｂ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＵｎｉＦｌｕｘ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が含まれる。
例えば、好ましい実施形態において、透析ろ過された抗体溶液を作製するために本発明の方法を実施するために、５００ｍＬの貯蔵容器を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭＴａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＴＦＦ）システムが使用される。ＤＦ／ＵＦ操作は、水の中に高濃度抗体製剤を作製するために使用される１４のプロセス工程とともに、非連続的様式で実施される。本発明の具体的な実施形態のさらなる典型的な装置、溶液及び水の容積、プロセス工程の数及び他のパラメータに関しては、以下の実施例の部を参照されたい。
本発明に従って、水の中に、タンパク質が再製剤化される緩衝液交換のための透析ろ過に対する別の方法には、透析及びゲルろ過（何れの技術も、本分野において公知の技術である。）が含まれる。透析には、透析袋（所定の多孔性の膜ケース）を充填すること、袋を縛ること、及び袋を水槽中に配置することが必要とされる。拡散を通じて、袋の中の塩の濃度は、槽の中の塩の濃度と平衡化し、巨大分子、例えば、袋を通じて拡散することができないタンパク質は袋の中に残存する。袋の中の試料容積に比べて槽の容積が大きくなるほど、到達され得る平衡濃度はより低くなる。一般に、塩の全てを完全に除去するために、槽の水の置換が必要とされる。ゲルろ過は、分子サイズに基づいて分子を分離する非吸着性クロマトグラフィー技術である。ゲルろ過では、大きな分子（例えば、タンパク質）は、サイズ排除によって、より小さな分子（例えば、塩）から分離され得る。
本発明の好ましい実施形態において、実質的に水とタンパク質である水性製剤が達成されるように、第一のタンパク質溶液は、水との容積交換に繰り返し供される。透析ろ過工程は、溶液中のタンパク質に応じて、あらゆる回数実施され得、１つの透析ろ過工程は１つの全容積交換に等しい。一実施形態において、透析ろ過プロセスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又はタンパク質が水の中に実質的に溶解されるように、第一のタンパク質溶液から賦形剤（例えば、塩）を除去するのに必要と考えられる最大の回数まで実施される。タンパク質溶液の最初の容積に等しい水の容積が保持物質側に添加されたときに、透析ろ過の一回のラウンド又は工程が達成される。
一実施形態において、タンパク質溶液は、少なくとも２回の透析ろ過工程に供される。一実施形態において、水との透析ろ過工程又は容積交換は、少なくとも４回反復され、好ましくは、少なくとも５回反復され得る。一実施形態において、少なくとも６倍の容積交換が達成されるまで、最初のタンパク質溶液が水との透析ろ過に供される。別の実施形態において、少なくとも７倍の容積交換が達成されるまで、最初のタンパク質溶液が水との透析ろ過に供される。上に明記されている数字、例えば、４から６又は５から７の中間の範囲も、本発明の一部であることが意図される。例えば、上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れの組み合わせを用いた値の範囲も、含まれるもとする。
好ましい実施形態において、限外ろ過膜のろ液側へのタンパク質の喪失は最小限に抑えられるべきである。ある膜のろ液側へのタンパク質喪失のリスクは、膜の孔サイズに対するタンパク質のサイズ及びタンパク質の濃度に関連して変動する。タンパク質濃度の増加とともに、ろ液へのタンパク質喪失のリスクは増加する。ある膜孔サイズに関して、タンパク質喪失のリスクは、より大きなタンパク質より、膜のＭＷＣＯとサイズが近いより小さなタンパク質に関してより大きい。従って、より小さなタンパク質に対してＤＦ／ＵＦを実施する場合、許容できないタンパク質喪失を招くことなく、同じ膜を用いて、より大きなタンパク質に対してＤＦ／ＵＦを行う場合と比べて、同じ容積の低下を達成することは不可能であり得る。換言すれば、同じ装置及び膜を用いるより小さなタンパク質の溶液の限外ろ過と比べて、より大きなタンパク質の溶液はより小さな容積まで限外ろ過することができ、同時に、溶液中のタンパク質の濃度はより高くなる。ある孔サイズの膜を使用するＤＦ／ＵＦ操作は、より大きなタンパク質と比べて、より小さなタンパク質に対してより多くのプロセス工程を必要とし得る。より大きなタンパク質に対して容積の低下及び濃縮がより大きくなることによって、より多くの水の容量を添加し直すことが可能となり、その各プロセス工程に対して、タンパク質溶液中の残存する緩衝液又は賦形剤成分の希釈がより大きくなる。従って、より小さなタンパク質に比べて、より大きなタンパク質に対して溶質のある低下を達成するために、より少ないプロセス工程が必要とされ得る。タンパク質のサイズ及び操作において使用される限外ろ過装置の孔サイズが与えられれば、当業者は、各プロセス工程を用いて可能な濃縮の量及び溶質のある低下を達成するために必要とされる総プロセス工程の数を計算することができる。
本発明の透析ろ過法の結果、最初のタンパク質溶液中の溶質の濃度は、実質的に水及びタンパク質を含む最終水性製剤中において、著しく低下される。例えば、水性製剤は、最初のタンパク質溶液の少なくとも９５％低い、好ましくは、最初のタンパク質溶液の少なくとも９９％低い賦形剤の最終濃度を有し得る。例えば、一実施形態において、ＷＦＩ中にタンパク質を溶解することは、理論的な最終賦形剤濃度を与えるプロセスであり、Ｃｉｅ−５＝０．００６７４（すなわち、約９９．３％の最大賦形剤低下）に等しい又はほぼ等しい５つの透析ろ過容積を用いる一定容積の透析ろ過によって達成される。一実施形態において、当業者は、一定容積の透析ろ過を用いる市販のＤＦ／ＵＦの最後の工程の間に、６つの容積交換を実施し得る（すなわち、Ｃｉは、Ｃｉｅ−６＝０．００２５である。）。これは、約９９．７５％の最大理論的賦形剤低下率を与える。別の実施形態において、当業者は、理論的な約９９．９％の最大賦形剤減少率を得るために、８つの透析ろ過容積交換を使用し得る。
「賦形剤なし」又は「賦形剤を含まない」という用語は、製剤が、実質的に賦形剤を含まないことを示す。一実施形態において、賦形剤なしとは、緩衝液なし、塩なし、糖なし、アミノ酸なし、界面活性剤なし及び／又はポリオールなしを示す。一実施形態において、「実質的に賦形剤を含まない」という用語は、溶液又は製剤が賦形剤の少なくとも９９％を含まないことを示す。しかしながら、ある種の実施形態において、製剤は、ある種の特定の非イオン性賦形剤（例えば、ショ糖又はマニトール）を含み得るが、製剤は、それ以外、賦形剤を含まないことに注目すべきである。例えば、製剤は、水、タンパク質及びマニトールを含み得、製剤は、それ以外の賦形剤を含まない。別の例において、製剤は、水、タンパク質及びポリソルベート８０を含み得、製剤は、それ以外の賦形剤を含まない。さらに別の例において、製剤は、水、タンパク質、ソルビトール及びポリソルベート８０を含み得、製剤は、それ以外の賦形剤を含まない。
本明細書に記載されている方法に従って最初のタンパク質溶液を透析ろ過するために水が使用される場合、イオン性賦形剤は洗浄除去され、その結果、透析ろ過された水性製剤の伝導度は、最初のタンパク質溶液より低い。水溶液が電気を伝えれば、イオン性賦形剤を用いた場合に見出されるように、水はイオンを含有するはずである。従って、低い伝導度の測定は、本発明の水性製剤が著しく低下した賦形剤（イオン性賦形剤を含む。）を有することを示唆する。
溶液の伝導度は、本分野で公知の方法に従って測定される。水性製剤の伝導を測定するために、伝導度メータ及びセルを使用することができ、伝導度メータ及びセルは、使用前に、標準溶液に対して較正すべきである。本分野において利用可能な伝導度メータの例には、ＭＹＲＯＮ Ｌ Ｄｉｇｉｔａｌ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ（Ｒ））、Ｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｅｔｒｏｈｕｍ ＡＧ）及びＳｅｒｉｅｓ３１０５／３１１５Ｉｎｔｅｒｇａｔｅｄ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Ｋｅｍｏｔｒｏｎ）が含まれる。一実施形態において、水性製剤は、３ｍＳ／ｍｃ未満の伝導度を有する。別の実施形態において、水性製剤は、２ｍＳ／ｍｃ未満の伝導度を有する。さらに別の実施形態において、水性製剤は、１ｍＳ／ｍｃ未満の伝導度を有する。本発明の一態様において、水性製剤は、０．５ｍＳ／ｍｃ未満の伝導度を有する。上に明記されている数値の中間の範囲（例えば、１から３ｍＳ／ｃｍ）も、本発明によって包含されるものとする。例えば、上限及び／又は下限として、上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いた値の範囲が含まれるものとする。さらに、明記されている数値の中に属する値、例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０なども、本発明に含まれる。
本発明の重要な態様は、透析ろ過されたタンパク質溶液（最初のタンパク質溶液の透析ろ過プロセス後に得られた溶液）を濃縮できるということである。このプロセスに従うことによって、タンパク質の高い濃度が水の中で安定的であることが発見された。透析ろ過後の濃縮は、水及び最初のタンパク質溶液に比べて増加したタンパク質濃度を含有する水性製剤をもたらす。従って、本発明は、透析ろ過溶媒として水を用いてタンパク質溶液を透析ろ過すること及び続いて、得られた水溶液を濃縮することも含む。透析ろ過されたタンパク質溶液の濃縮は、遠心などの本分野で公知の手段を通じて達成され得る。例えば、透析ろ過に続いて、水を基礎とする透析ろ過されたタンパク質溶液は、水を基礎とする溶液を維持しながら、高濃度製剤中への限外ろ過を介してタンパク質を濃縮する役割を果たす遠心プロセスに供される。限外ろ過膜及び／又は装置を用いた遠心を介して、例えば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏｒｐ．Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ）を用いて溶液を濃縮するための手段が、本分野において公知である。
本発明の方法は、さらなる安定化剤の必要なしに、水の中に極めて高いレベルでタンパク質を濃縮する手段を提供する。本発明の方法を用いて得られた水性製剤中のタンパク質の濃度は、所望の濃度に従うあらゆる量であり得る。例えば、本明細書中の方法に従って作製された水溶液中のタンパク質の濃度は、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｍｇ／ｍＬ又は約３００ｍｇ／ｍＬ超である。上に明記されている濃度の中間の範囲、例えば、少なくとも約１１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２１４ｍｇ／ｍＬ及び少なくとも約３００ｍｇ／ｍＬも、本発明によって包含されるものとする。さらに、上限及び／又は下限として上に明記されている値（又は上に記載されている範囲の間の値）の何れかの組み合わせを用いた値の範囲、例えば、１００から１２５ｍｇ／ｍＬ、１１３から１２５ｍｇ／ｍＬ及び１２６から２００ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上が含まれるものとする。
本発明の方法は、水性タンパク質製剤の高い濃度に関わらず、得られた製剤がタンパク質凝集物の低いパーセントを有するという利点を提供する。一実施形態において、水及びタンパク質（例えば、抗体）の高い濃度を含む水性製剤は、界面活性剤又は賦形剤の他の種類の不存在下でさえ、約５％未満のタンパク質凝集物を含有する。一実施形態において、製剤は、約７．３％以下の凝集物タンパク質を含み、製剤は、約５％以下の凝集物タンパク質を含み、製剤は、約４％以下の凝集物タンパク質を含み、製剤は、約３％以下の凝集物タンパク質を含み、製剤は、約２％以下の凝集物タンパク質を含み、又は、製剤は約１％以下の凝集物タンパク質を含む。一実施形態において、製剤は、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の単量体タンパク質を含む。上に明記されている濃度の中間の範囲、例えば、少なくとも約９８．６％、約４．２％以下も、本発明の一部であるものとする。さらに、上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いる値の範囲が含まれるものとする。
タンパク質を基礎とする多くの医薬製品は、高い濃度で製剤化される必要がある。適切な効力を達成するために、及び最大約１ｍＬの注射容積の典型的な患者による使用要件を充足させるために、例えば、抗体を基礎とする製品は、医薬品（ＤＰ；Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ）製剤中で１００ｍｇ／ｍＬを超える傾向が増大している。従って、タンパク質濃度を増加させるために、最終製剤緩衝液中への透析ろ過又は限外ろ過などの下流処理工程も、より高い濃度で行われる。
古典的な熱力学は、とりわけ、より高いタンパク質濃度で、分子間相互作用が透析膜を横切る小さな溶質の分配に影響を与え得ること、並びに非理想的な透析平衡化を記載するモデル及び分子間相互作用の効果が利用可能であることを予想する（Ｔａｎｄｏｒｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．１８２，１９６１；Ｔｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌｌ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３ｒｄｅｄ．Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ，ＮＬ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，１９９７）。モデルのこれらの種類を適用するために必要とされる、プロセス開発環境において詳細な熱力学的データが利用不能である際には、商業的なＤＦ／ＵＦ操作の設計の間に、分子間相互作用が考慮されることは稀である。その結果、ＤＰ賦形剤濃度は、表示された濃度とは著しく異なり得る。市販の及び開発中の製品におけるこの相違の幾つかの例、例えば、ＩＬ−１受容体アンタゴニストにおける表示より最大３０％少ない塩化物、ＰＥＧ−ｓＴＮＦ受容体における表示より４０％少ないヒスチジン及び融合連結物タンパク質における表示より最大２００％高いアセタートが公表されている（Ｓｔｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３，２３３２−２３４２（２００４））。Ｄｏｎｎａｎ効果（Ｔｏｍｂｓ ａｎｄ Ｐｅａｃｏｃｋｅ（１９７４）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、非特異的相互作用（Ａｒａｋａｗａ ａｎｄ Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２２４，１６９−７７（１９８３）；Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２２，６７−９７（１９９３）及び容積排除効果など、実際のＤＰが、タンパク質がその中に透析ろ過される緩衝液の組成と異なり得る幾つかの理由が存在する。多くのタンパク質部分的特異的容積を含む容積排除は、０．７と０．８ｍＬ／ｇの間である５。従って、１００ｍｇ／ｍＬの球状タンパク質に関して、タンパク質分子は総溶液容積の約７．５％を占める。著しい分子間相互作用が存在しないと仮定すれば、これは、膜の浸透物質側のモル濃度の９２．５％である膜の保持物質側の溶質モル濃度に相当する。これは、基本的に全てのタンパク質溶液組成が限外ろ過処理の間に必ず変化するかを説明する。例えば、４０ｍｇ／ｍＬにおいて、タンパク質分子は総溶液容積の約３％を占め、１５０ｍｇ／ｍＬまで濃度を増加させる限外ろ過工程は、（１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質は総溶液容積の１１％超に相当するので）８％を超える変化になるようにモル賦形剤濃度を必ず誘導する。上に明記されているパーセントの中間の範囲も、本発明の一部であるものとする。さらに、上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いた値の範囲が含まれるものとする。
本発明の方法及び組成物に従えば、ＤＦ／ＵＦ操作の間の緩衝液組成の変化は、透析ろ過溶媒として純水を使用することによって回避することができる。最終のＢｕｌｋＤＳ中に所望される濃度より約２０％高くタンパク質を濃縮することによって、その後、例えば、高度に濃縮された賦形剤原溶液を介して、賦形剤が添加され得る。次いで、賦形剤濃度及び溶液のｐＨは、表示と同じになることが保証され得る。
本発明の水性製剤は賦形剤を実質的に含有しないので、出発材料として利点を与える。水中での透析ろ過後に製剤に添加されるあらゆる賦形剤は正確に計算することができる。すなわち、賦形剤の予め存在する濃度は、計算を妨害しない。医薬として許容される賦形剤の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。従って、本発明の別の態様は、賦形剤（非イオン性賦形剤又はイオン性賦形剤を含む。）の公知の濃度を有する製剤、特に医薬製剤を調製するために、本明細書に記載されている方法を通じて得られた水性製剤を使用することを含む。本発明の一態様は、水及びタンパク質を含む水性製剤に賦形剤を添加する追加の工程を含む。従って、本発明の方法は、賦形剤を実質的に含まず、水、タンパク質及び賦形剤の特定の濃度を含む製剤を調製するための出発材料として使用され得る水性製剤を提供する。
一実施形態において、本発明の方法は、特徴（例えば、タンパク質濃度、タンパク質の水力学的直径、伝導度など）を変化させずに、非イオン性賦形剤（例えば、糖）又は非イオン性界面活性剤（ポリソルベート及びポロキサマーなど）を製剤に添加するために使用され得る。
上の方法を用いて得られた水性製剤のさらなる特徴及び利点は、以下のＩＩＩ節に記載されている。本発明の方法を実施するための典型的なプロトコールも、以下の実施例に記載されている。
ＩＩＩ．本発明の製剤
本発明は、追加の賦形剤が不要な水中でのタンパク質の安定性、タンパク質の溶解度を維持するための追加の賦形剤が不要なタンパク質の増大した濃度及び低い浸透圧など、本分野における旧来の製剤に比べて多数の利点を有する、タンパク質及び水を含む水性製剤を提供する。製剤中のタンパク質は、高いタンパク質濃度及び凍結／融解処理工程の繰り返しでさえ、保存（例えば、７℃で３ヶ月を超えて液体形態として又は凍結／融解条件として保存される）の間に安定な状態を保つので、本発明の製剤は、有利な保存特性も有する。一実施形態において、本発明の製剤は、水性製剤が著しい乳白光、凝集又は沈降を示さないように、タンパク質の高い濃度を含む。
本発明の水性製剤は、標準的な賦形剤、例えば、浸透圧修飾剤、安定化剤、界面活性剤、抗酸化剤、凍結保護剤、充填剤、凍結乾燥保護剤、塩基性成分及び酸性成分に依存しない。本発明の他の実施形態において、製剤は、水、１つ又はそれ以上のタンパク質を含有し、及びイオン性賦形剤（例えば、塩、遊離のアミノ酸）を含まない。
ある種の実施形態において、本発明の水性製剤は、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び水を含み、製剤は、３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下の浸透圧を有する。水性製剤の浸透圧のより低い限度も、本発明によって包含される。一実施形態において、水性製剤の浸透圧は、１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下である。本発明の水性製剤は、３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ未満の浸透圧を有し得、高いタンパク質濃度も有する。例えば、タンパク質の濃度は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬであり、最大２００ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上であり得る。上に明記されている濃度及び浸透圧単位の中間の範囲も、本発明の一部であるものとする。さらに、上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いる値の範囲が含まれるものとする。
本発明の水性製剤の濃度は、タンパク質のサイズによって限定されず、製剤は、タンパク質のあらゆるサイズ範囲を含み得る。タンパク質の少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ及び最大２００ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上（５ｋＤａから１５０ｋＤａ又はそれ以上のサイズ範囲であり得る。）を含む水性製剤が、本発明の範囲に含まれる。一実施形態において、本発明の製剤中のタンパク質は、少なくとも約１５ｋＤのサイズ、少なくとも約２０ｋＤのサイズ、少なくとも約４７ｋＤのサイズ、少なくとも約６０ｋＤのサイズ、少なくとも約８０ｋＤのサイズ、少なくとも約１００ｋＤのサイズ、少なくとも約１２０ｋＤのサイズ、少なくとも約１４０ｋＤのサイズ、少なくとも約１６０ｋＤのサイズ又は約１６０ｋＤを上回るサイズである。上に明記されているサイズの中間の範囲も、本発明の一部であるものとする。さらに、上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いる値の範囲が含まれるものとする。
本発明の水性製剤は、溶液中のタンパク質の水力学的直径（Ｄｈ）によって特徴付けられ得る。溶液中のタンパク質の水力学的直径は、タンパク質のＤｈを測定するための確立された分析法である動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて測定され得る。モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ）に対する典型的な値は、約１０ｎｍである。本明細書に記載されているもののような低イオン性製剤は、イオン性賦形剤を含むタンパク質製剤より、タンパク質のＤｈが顕著に低いことを特徴とし得る。交換溶媒として純水を使用するＤＦ／ＵＦプロセスを用いて作製された水性製剤中の抗体のＤｈ値は、タンパク質濃度と独立して、慣用の製剤中の抗体のＤｈより顕著に低い。一実施形態において、本発明の水性製剤中の抗体は、４ｎｍ未満又は３ｎｍ未満のＤｈを有する。
一実施形態において、水性製剤中のタンパク質のＤｈは、タンパク質濃度と無関係に、緩衝化された溶液中の同じタンパク質のＤｈと比べてより小さい。したがって、ある実施形態において、本明細書に記載されている方法に従って作製された水性製剤中のタンパク質は、同じ所定濃度の緩衝化された溶液中のタンパク質のＤｈより少なくとも２５％小さいＤｈを有する。緩衝化された溶液の例には、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明の水性製剤中のタンパク質は、所定の濃度のＰＢＳ中のタンパク質のＤｈより少なくとも５０％小さい、所定の濃度のＰＢＳ中のタンパク質のＤｈより少なくとも６０％小さい、所定の濃度のＰＢＳ中のタンパク質のＤｈより少なくとも７０％小さい、又は所定の濃度のＰＢＳ中のタンパク質のＤｈより少なくとも７０％超小さいＤｈを有する。上に明記されているパーセントの中間の範囲、例えば、５５％、５６％、５７％、６４％、６８％なども、本発明の一部であるものとする。さらに、上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いる値の範囲、例えば、５０％から８０％が含まれるものとする。
タンパク質の凝集は、タンパク質溶液に共通する問題であり、タンパク質の増加した濃度からしばしば生じる。本発明は、高濃度低タンパク質凝集製剤を達成するための手段を提供する。本発明の製剤は、タンパク質を製剤中に可溶性に保ち、凝集しないようにするために、緩衝系及び界面活性剤などの賦形剤に依存しない。本発明の製剤は、タンパク質濃度が高く、水を基礎としており、溶液中において高い安定なタンパク質濃度を達成するための他の因子に依存しないので、治療目的のために有利であり得る。
生物的産物（抗体など）の大半は、溶液中での非酵素的反応にしばしば起因する数多くの分解過程に供せられる。これらの反応は、産物の安定性、安全性及び有効性に対して長期の影響を有し得る。これらの不安定性は、ゼロを下回る温度で産物を保存することによって、消失されないまでも、遅延させることができ、したがって、産物のライフサイクルにわたる供給物の柔軟性及び利用可能性に関して、製造者に対する多大な利点が得られる。多くの場合、凍結は、生物的産物保存の最も安全で、最も信頼できる方法であるが、固有のリスクを有する。凍結は、氷−液体界面を導入することによって、及び水が結晶化するときに溶質の凍結濃縮（凍結濃縮）によって、冷変性を通じて、タンパク質中にストレスを誘導し得る。
凍結濃縮は、溶質分子（ショ糖、塩などの小分子、及びタンパク質製剤中で典型的に使用される他の賦形剤又はタンパク質などの高分子）を排除する、制御されずに移動する平坦な氷の前面が凍結の間に形成され、局所的なｐＨ又は極端なイオン濃度をもたらす可能性を秘めた濃度の他の溶質の存在下において、タンパク質が相対的に高い濃度で見出され得るゾーンをもたらす過程である。多くのタンパク質において、これらの条件は変性をもたらすことができ、幾つかの事例では、タンパク質及び溶質の沈降をもたらすことができる。緩衝液塩及び他の溶質も、このような条件下で濃縮されるので、これらの成分は、凍結塊内のゾーン中にｐＨ及び／又は酸化還元変化をもたらすのに十分高い濃度に達し得る。凍結の間に、溶液中での緩衝液塩の結晶化（例えば、リン酸塩）の結果として観察されるｐＨシフトは、数ｐＨ単位にわたり得、これは、タンパク質の安定性に影響を及ぼし得る。
濃縮された溶質は、溶質が全く凍結され得ず、これらの有害な条件下でタンパク質が溶液内に存在する程度まで、凝固点の低下ももたらし得る。これらの望ましくない条件にタンパク質が曝露される期間を短縮させるために、しばしば、急速な冷却が適用され得る。しかしながら、急速な凍結は、巨大な面積の氷−水界面を誘導し得るのに対して、遅い冷却はより小さな界面領域を誘導する。例えば、１つの凍結／融解工程の間に、６つのモデルタンパク質を急速冷却することによって、遅い冷却の１０サイクルを上回る変性効果をもたらすことが示され、氷表面によって誘導された疎水性変性の大規模な不安定化の可能性を示す。
本発明の水性製剤は、有利な安定性及び保存特性を有する。水性製剤の安定性は保存の形態に依存せず、凍結され、凍結乾燥され又は噴霧乾燥された製剤が含まれるが、これらに限定されない。安定性は、選択された期間、選択された温度で測定することができる。本発明の一態様において、水性製剤中のタンパク質は、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、液体形態で安定である。上に明記されている期間の中間の範囲、例えば、９ヶ月なども、本発明の一部であるものとする。さらに、上限及び／又は下限として上に明記されている値の何れかの組み合わせを用いる値の範囲が含まれるものとする。好ましくは、製剤は、室温（約３０℃）で又は４０℃で少なくとも１ヶ月安定であり、及び／又は約２から８℃で少なくとも１年間安定であり、又はより好ましくは、約２から８℃で少なくとも２年間安定である。さらに、好ましくは、製剤は、製剤の凍結（例えば、−８０℃への）及び融解（以下、「凍結／融解サイクル」と称される。）後に安定である。
タンパク質の安定性は、生物学的に活性な状態を保つ能力としても定義することができる。対象に投与したときに、医薬製剤中のタンパク質が生物学的に活性を有すれば、タンパク質は、医薬製剤中で「その生物活性を保持する」。例えば、（例えば、抗原結合アッセイにおいて測定された場合に）医薬製剤中の抗体の生物活性が、医薬製剤が調製された時点で示された生物活性の（アッセイの誤差内で）約３０％、約２０％又は約１０％以内であれば、抗体の生物活性が保持されている。
水性製剤中のタンパク質の安定性は、製剤中のタンパク質の単量体、凝集物若しくは断片又はこれらの組み合わせのパーセントとしても定義され得る。色及び／又は透明性の視覚的検査に際して、又は紫外線光散乱によって若しくはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定された場合に凝集、沈殿及び／又は変性の兆候を実質的に示さなければ、タンパク質は、製剤中で、「その物理的安定性を保持する」。本発明の一態様において、安定な水性製剤は、製剤中に凝集物として存在しているタンパク質の約１０％未満、好ましくは約５％未満を有する製剤である。
本発明の水性製剤の別の特徴は、幾つかの事例において、水を用いたタンパク質の透析ろ過は、最初のタンパク質溶液と比べて改善された粘度特性（すなわち、透析ろ過されたタンパク質溶液の粘度は、最初のタンパク質溶液と比べて低下している。）を有す水性製剤をもたらす。当業者は、本発明の様々な実施形態での製剤の調製において、粘度を測定するための複数の方法を使用できることを認識する。例えば、運動学的な粘度データ（ｃＳｔ）は、毛細管を用いて作成され得る。他の実施形態において、動的粘度データは、単独で又は他の粘度データとともに表示される。動的粘度データは、運動学的な粘度データに密度を乗ずることによって作成され得る。
一実施形態において、本発明は、他の所望の特徴（非乳白光など）を変化させずに、マニトールなどの非イオン性賦形剤を添加することによって、高タンパク質濃度−水溶液において所望されるように、浸透圧及び／又は粘度などのある種の特徴を調整する方法も提供する。従って、水を基礎とし、タンパク質の高い濃度を有し、タンパク質を水に移す間若しくは移した後に、又は透析ろ過の間に、例えば、製剤の浸透圧又は粘度特徴を改善する賦形剤が添加されている製剤が本発明の範囲に含まれる。従って、タンパク質を最終の低イオン性製剤中に移す過程の間に、このような非イオン性賦形剤を添加することができることも本発明の範囲に属する。製剤の所望される特徴を変化させるために本発明の水性製剤に添加され得る非イオン化可能な賦形剤の例には、マニトール、ソルビトール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０又はポリソルベート８０）、ショ糖、トレハロース、ラフィノース及びマルトースが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書の製剤は、２以上のタンパク質も含有し得る。医薬製剤に関して、治療されている具体的な適応症に対する必要に応じて、さらなる別個のタンパク質、好ましくは、他のタンパク質に悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを添加し得る。例えば、ＴＮＦ又はＩＬ−１２に結合する２つ又はそれ以上の抗体を単一の製剤中に与えることが望ましい場合があり得る。さらに、抗ＴＮＦ又は抗ＩＬ１２抗体を１つの製剤中に組み合わせ得る。このようなタンパク質は、意図される予定に対して有効である量で組み合わせて好適に存在する。
水性製剤中に含められ得るタンパク質の例には、抗体又はその抗原結合断片が含まれる。本発明において使用され得る抗体又はその抗原結合断片の異なる種類の例には、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の方法及び組成物において使用される抗体は、抗ＴＮＦα抗体若しくはその抗原結合部分又は抗ＩＬ−１２抗体若しくはその抗原結合部分である。本発明において使用され得る抗体又はその抗原結合断片の別の例には、１Ｄ４．７（抗ＩＬ−１２／抗ＩＬ−２３；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２．５（Ｅ）ｍｇ１（抗ＩＬ−１８；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１３Ｃ５．５（抗ＩＬ−１３；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｊ６９５（抗ＩＬ−１２；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ（Ｆａｂ２抗ＴＮＦ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ（Ｄ２Ｅ７）；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｃａｍｐａｔｈ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ（ｆａｂ断片）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、Ｍｙｏｓｃｉｎｔ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ Ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（Ｃａｐｒｏｍａｂ Ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ＲｅｏＰｒｏ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、Ｘｏｌａｉｒ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ Ｔｉｕｘｅｔａｎ）、ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＯＫＴ３（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、Ｐａｎｏｒｅｘ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）及びＭｙｌｏｔａｒｇ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）ｇｏｌｉｍｕｍａｂ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、Ｃｉｍｚｉａ（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、Ｓｏｌｉｒｉｓ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、ＣＮＴＯ１２７５（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、Ｂｅｘｘａｒ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ及びＩ１３１ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）及びＡｖａｓｔｉｎ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）が含まれるが、これらに限定されない。
１つの別例において、タンパク質は、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（ドルナーゼα）、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（ベカプレルミン）、Ａｃｔｉｖａｓｅ（アルテプラーゼ）、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（ラロニダーゼ）、Ａｍｅｖｉｖｅ（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）、Ａｒａｎｅｓｐ（ダルベポエチンα）、Ｂｅｃａｐｌｅｒｍｉｎ濃縮物、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（インターフェロンβ−１ｂ）、ＢＯＴＯＸ（ボツリヌス毒素Ａ型）、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｅｌｓｐａｒ（アスパラギナゼーゼ）、Ｅｐｏｇｅｎ（エポエチンα）、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（アガルシダーゼβ）、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（インターフェロンαｃｏｎ−１）、ＩｎｔｒｏｎＡ（インターフェロンα−２ａ）、Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ａｎａｋｉｎｒａ）、ＭＹＯＢＬＯＣ（ボツリヌス毒素Ｂ型）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ、Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｏｐｒｅｌｖｅｋｉｎ）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、Ｏｎｔａｋ（Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα−２ａ）、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（ドルナーゼα）、Ｒｅｂｉｆ（インターフェロンβ−１ａ）、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（Ｂｅｃａｐｌｅｒｍｉｎ）、Ｒｅｔａｖａｓｅ（Ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンα−２）、ＴＮＫａｓｅ（Ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ）及びＸｉｇｒｉｓ（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎα）、Ａｒｃａｌｙｓｔ（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）、ＮＰｌａｔｅ（Ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ）、Ｍｉｒｃｅｒａ（メトキシポリエチレングリコール−エポエチンβ）、Ｃｉｎｒｙｚｅ（Ｃ１エステラーゼ阻害剤）、Ｅｌａｐｒａｓｅ（イズロン酸硫酸化酵素）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（アルグルコシダーゼα）、Ｏｒｅｎｃｉａ（ａｂａｔａｃｅｐｔ）、Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（ガルスルファーゼ）、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（ｐａｌｉｆｅｒｍｉｎ）及びＡｃｔｉｍｍｕｎｅ（インターフェロンγ−１ｂ）などの（但し、これらに限定されない。）治療用タンパク質である。
本明細書に記載されている方法及び組成物中に含められ得るタンパク質の他の例には、例えば、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む。）、成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子；第ＩＸ因子；組織因子及びフォン・ビルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボムバジン；トロンビン；腫瘍壊死因子−α及び−βエンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮性成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子に対する受容体；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４−、−５−若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５又はＮＴ−６）又はＮＧＦ−βなどの神経成長因子などの神経栄養因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの繊維芽成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦα及びＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５など）などの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；骨誘導性因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β及び−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドディスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳ外被の一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；制御タンパク質；免疫接着物質；抗体及び上に列記されているポリペプチドの何れかの生物学的に活性な断片又は変形物などの哺乳動物タンパク質（その組換えタンパク質を含む。）が含まれる。
ＩＶ．本発明の使用
本発明の製剤は、治療的に（すなわち、インビボで）又はインビトロ若しくはインサイチュ用の試薬として使用され得る。
治療的使用
本発明の方法は、治療的使用に有利な特徴を有する水を基礎とする製剤を作製するためにも使用され得る。水性製剤は、対象中の疾患を治療するための医薬製剤として使用され得る。
本発明の製剤は、治療用タンパク質が治療に適しているあらゆる疾患を治療するために使用され得る。「疾患」は、タンパク質を用いた治療が有益であるあらゆる症状である。これには、問題の疾患に対して哺乳動物が素因を有するようにする病的症状を含む、慢性及び急性疾患又は疾病が含まれる。抗ＴＮＦα抗体の場合には、抗体の治療的有効量は、関節リウマチなどの自己免疫疾患、クローン病などの腸疾患、強直性脊椎炎などの脊椎関節症又は乾癬などの皮膚疾患を治療するために投与され得る。抗ＩＬ−１２抗体の場合には、多発性硬化症などの神経疾患又は乾癬などの皮膚疾患を治療するために、抗体の治療的有効量が使用され得る。治療のために本発明の製剤を使用し得る疾患の他の例には、乳癌、白血病、リンパ腫及び大腸癌などの癌が含まれる。
「対象」という用語は、生物（例えば、原核生物及び真核生物）が含まれるものとする。対象の例には、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。本発明の特定の実施形態において、対象はヒトである。
「治療」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の何れをも表す。治療が必要なものには、疾患を既に有するものの他に、疾患を予防すべきものが含まれる。
水性製剤は、投与の公知の方法に従って、治療を必要としている哺乳動物（ヒトを含む。）に投与され得る。投与の方法の例には、大量瞬時投与又はある期間にわたる継続的注入によるなどの静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、皮内、経皮、経口、局所又は吸入投与が含まれる。
一実施形態において、水性製剤は、皮下投与によって、哺乳動物に投与される。このような目的のために、製剤は、注射器及び注射装置（例えば、Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ及びＧｅｎｊｅｃｔ装置）、注射用ペン（ＧｅｎＰｅｎなど）、無針装置（例えば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ及びＢｉｏｊｅｃｔｏｒｒ２０００）及び皮下パッチ送達系などのその他の装置を用いて注射され得る。一実施形態において、装置、例えば、注射器、自動注射用ペンは、２５Ｇ又はそれ以下の直径のサイズ範囲のゲージを有する針を含有する。一実施形態において、針のゲージは、２５Ｇから３３Ｇ（これらの中間の範囲、例えば、２５ｓＧ、２６、２６ｓＧ、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ、３２Ｇ及び３３Ｇを含む。）のサイズの範囲である。好ましい実施形態において、最小の針の直径及び適切な長さは、製剤の粘度特性及び本発明の製剤を送達するために使用される装置に従って選択される。
本発明の方法／組成物の１つの利点は、無針装置を用いてタンパク質を対象に投与するのに理想的であり得る溶液中のタンパク質の高い濃度を与えることである。このような装置は、針による注射の必要なしに、対象の組織全体を通じたタンパク質の分散を可能とする。無針装置の例には、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒｒ２０００（Ｂｉｏｊｅｃｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃｏｏｌ．Ｃｌｉｃｋ（Ｂｉｏｊｅｃｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｉｊｅｃｔ（Ｂｉｏｊｅｃｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｖｉｔａｊｅｔ ３，（Ｂｉｏｊｅｃｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｍｈｉ５００（Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｏｕｓｅ ＰＬＣ）、Ｉｎｊｅｘ３０（ＩＮＪＥＸ−Ｅｑｕｉｄｙｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｉｎｊｅｘ ５０（ＩＮＪＥＸ −Ｅｑｕｉｄｙｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｉｎｊｅｘ １００（ＩＮＪＥＸ−Ｅｑｕｉｄｙｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｊｅｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ（ＩＮＪＥＸ −Ｅｑｕｉｄｙｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｊｅｔｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｊ−Ｔｉｐ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔｏｒ ＶＩＳＩＯＮ（Ａｎｔａｒｅｓ Ｐｈａｒｍａ）、ＭＥＤ−ＪＥＴ（ＭＩＴ Ｃａｎａｄａ， Ｉｎｃ．）、ＤｅｒｍｏＪｅｔ（Ａｋｒａ Ｄｅｒｍｏｊｅｔ）、Ｓｏｎｏｐｒｅｐ（Ｓｏｎｔｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）、ＰｅｎＪｅｔ（ＰｅｎＪｅｔ Ｃｏｒｐ．）、ＭｉｃｒｏＰｏｒ（Ａｌｔｅａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｚｅｎｅｏ（Ｃｒｏｓｓｊｅｃｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｍｉｎｉ−Ｊｅｃｔ（Ｖａｌｅｒｉｔａｓ Ｉｎｃ．）、ＩｍｐｌａＪｅｃｔ（Ｃａｒｅｔｅｋ Ｍｅｄｉｃａｌ ＬＴＤ）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（Ａｒａｄｉｇｍ）及びＳｅｒｏｊｅｔ（Ｂｉｏｊｅｃｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
水性製剤を収容する送達装置も、本発明に含まれる。このような装置の例には、注射器、ペン（自動注射用ペンなど）、インプラント、吸入装置、無針装置及びパッチが含まれるが、これらに限定されない。自動注射用ペンの例は、２００７年６月２９日に出願された米国特許出願１１／８２４５１６号に記載されている。
本発明は、吸入によって本発明の製剤を送達する方法及びこのような送達のために前記前記製剤を含有する吸入装置も含む。一実施形態において、水性製剤は、噴霧器又は液体吸入装置を用いて、吸入を介して対象に投与される。一般に、噴霧器は、吸入のために湿潤エアロゾル又はミストとして医薬を送達するために、圧縮空気を使用し、従って、薬物を水の中に溶解させることが必要である。噴霧器の種類には、ジェット噴霧器（エアジェット噴霧器及び液体ジェット噴霧器）及び超音波噴霧器が含まれる。
噴霧器の例には、ＡｋｉｔａＴＭ（Ａｃｔｉｖａｅｒｏ ＧｍｂＨ）（ＵＳ２００１０３７８０６、ＥＰ１２５８２６４参照）が含まれる。ＡｋｉｔａＴＭは、患者の呼吸パターンを完全に制御するＰａｒｉのＬＣ Ｓｔａｒを基礎とする卓上式噴霧器吸入システム（重量：７．５ｋｇ、ＢｘＷｘＨ：２６０×１７０×２７０）である。装置は、肺及び肺末梢部への極めて高い送達率で、１０分未満に、溶液中の最大５００ｍｇの薬物を送達することができる。噴霧化された粒子の６５％は５ミクロン未満であり、質量中央空力学的直径（ＭＭＡＤ）は、１．８バールで３．８ミクロンである。最小充填容積は２ｍＬであり、最大容積は８ｍＬである。吸入流量（２００ｍＬ／秒）及び噴霧器の圧力（０．３から１．８バール）は、スマートカードによって設定される。装置は、肺機能検査に基づいて、各患者に対して個別に調節され得る。
本発明の組成物とともに使用され得る噴霧器の別の例には、Ａｅｒｏｎｅｂ（Ｒ）Ｇｏ／Ｐｒｏ／Ｌａｂ噴霧器（ＡｅｒｏＧｅｎ）が含まれる。Ａｅｒｏｎｅｂ（Ｒ）噴霧器は、ＯｎＱＴＭ技術、すなわち、振動要素によって囲まれた、正確に形成された１０００超の先細形状の穴を含有する独特のドーム形状の有孔プレートから構成される電気式ミクロポンプ（直径３／８インチ及びウェハーの薄さ）を基礎とする。Ａｅｒｏｎｅｂ（Ｒ）Ｇｏは、家庭用の携帯式ユニットであるのに対して、Ａｅｒｏｎｅｂ（Ｒ）Ｐｒｏは、病院及び救急医療施設で使用するための再使用可能及び加熱滅菌可能な装置であり、Ａｅｒｏｎｅｂ（Ｒ）Ｌａｂは、前臨床エアロゾル研究及び吸入試験で使用するための装置である。システムの特徴には、エアロゾルの液滴の大きさの最適化及びカスタマイズ；正確に調節された液滴サイズを有する低速のエアロゾル送達；呼吸系内での標的化された薬物送達の補助；投薬の柔軟性；溶液若しくは懸濁液中に薬物の一定容量を含有する特注の単回投薬アンプルの収容又は汎用噴霧器において使用するための市販の溶液；連続的、呼吸活性化された又はプログラム可能；並びに小児及び高齢者を含む幅広い患者の要望に適合させることが可能；単一又は複数患者の使用が含まれる。
ＡｅｒｏｃｕｒｒｅｎｔＴＭ（ＡｅｒｏｖｅｒｔＲｘ ｃｏｒｐ）も、本発明の組成物とともに使用され得る（ＷＯ２００６００６９６３参照）。この噴霧器は、使い捨て可能な、予め充填される又は使用者によって充填される薬物カートリッジを特徴とする携帯式の振動メッシュ噴霧器である。
ＳｔａｃｃａｔｏＴＭ（Ａｌｅｘｚａ Ｐｈａｒｍ）も、本発明の組成物とともに使用することができる（ＷＯ０３０９５０１２参照）。ＳｔａｃｃａｔｏＴＭ技術の中心的特徴は、熱分解なしに薬物を蒸発させることであり、これは、薬物の薄いフィルムを急速に加熱することによって達成される。１／２秒未満で、固体の薬物フィルムを蒸気に転化させるのに十分な温度まで薬物が加熱される。吸入装置は、加熱基材、基材の上に被覆された薬物の薄いフィルム及び患者が吸入する気道という３つの中心的成分からなる。吸入装置は、呼吸によって作動され、送達される最大用量は２０から２５ｍｇ、ＭＭＡＤは１から２ミクロンの範囲である。
ＡＥＲｘ（Ｒ）（Ａｒａｄｉｇｍ）も、本発明の組成物とともに使用することができる（ＷＯ９８４８８７３、ＵＳ５４６９７５０、ＵＳ５５０９４０４、ＵＳ５５２２３８５、ＵＳ５６９４９１９、ＵＳ５７３５２６３、ＵＳ５８５５５６４参照）。ＡＥＲｘ（Ｒ）は、ＡＥＲｘ（Ｒ）Ｓｔｒｉｐから製剤を排出するためにピストン機構を使用するバッテリー駆動式の携帯式装置である。この装置は、患者の吸入気流をモニターし、最適な呼吸パターンが達成されたときにのみ駆動する。この装置は、用量の約６０％を放出用量として送達し、放出用量の５０から７０％を肺深部に送達し、対象間の変動性は２５％未満である。
本発明の組成物とともに使用され得る噴霧器装置の別の例には、Ｒｅｓｐｉｍａｔ（Ｒ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が含まれる。Ｒｅｓｐｉｍａｔ（Ｒ）は、装置基部をねじれさせ、これにより、バネを圧縮し、製剤の計量された容積を薬物カートリッジから投薬チャンバーに移すことによって開始される複数回投薬のリザーバシステムである。装置が作動されると、バネが緩和され、バネの緩和が微小ピストンを投薬チャンバー中に強制的に移動させ、単一ブロックを通じて溶液を押す。ユニブロックは、２つの微細な排出ノズルチャンネルを有するフィルター構造からなる。Ｒｅｓｐｉｍａｔ（Ｒ）によって作製されたＭＭＡＤは２μｍであり、この装置は、呼吸疾患を治療するために伝統的に使用される低用量薬物に適している。
本発明の組成物は、膜の上に堆積された薬物から構成される噴霧器システムであるＣｏｌｌｅｇｉｕｍ ＮｅｂｕｌｉｚｅｒＴＭ（Ｃｏｌｌｅｇｉｕｍ Ｐｈａｒｍａ）を用いて送達することもできる。剤形は、再構成溶媒を用いた再構成の後に、Ｃｏｌｌｅｇｉｕｍ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒを用いた経口又は経鼻吸入を通じて患者に投与される。
同じく本発明の組成物とともに使用され得る噴霧器装置の別の例には、Ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ（Ｒ）６２６（Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）が含まれる。６２６は、コンプレッサを基礎とする自宅介護用噴霧器である。６２６は、０．５から５ミクロンの間の粒子サイズを送達する。
本発明の組成物とともに使用することができる噴霧器には、患者の年齢、大きさ又は呼吸パターンの変動に関わらず、正確で再現性のある吸入薬用量をこのような患者へ送達するＡｄａｐｔｉｖｅ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｒ）技術（Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）が含まれ得る。ＡＡＤ（Ｒ）システムは、吸気及び呼気の間の圧力変化を検出することによって、患者の呼吸パターンを監視するためのハンドピース内電子装置及びセンサーを取り込んでいる。センサーは、吸気の最初の部分の間に、医薬のエアロゾル送達を何時拍動させるかを決定する。治療を通じて、センサーは、先行する３つの呼吸を監視し、患者の吸気及び呼気パターンに対して適合する。ＡＡＤ（Ｒ）システムは、患者がマウスピースを通じて呼吸しているときに、医薬を送達するに過ぎないので、これらの装置によって、患者は、医薬を無駄にせずに、治療において休憩を取ることができる。ＡＡＤ（Ｒ）システム噴霧器の例には、ＨａｌｏＬｉｔｅ（Ｒ）ＡＡＤ（Ｒ）、ＰｒｏＤｏｓｅ（Ｒ）ＡＡＤ（Ｒ）及びＩ−Ｎｅｂ（Ｒ）ＡＡＤ（Ｒ）が含まれる。
ＨａｌｏＬｉｔｅ（Ｒ）Ａｄａｐｔｉｖｅ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ＡＡＤ）（Ｒ）（Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）は、携帯型コンプレッサによって駆動される気圧式エアロゾル化システムである。ＡＡＤ（Ｒ）技術は、患者の呼吸パターンを（典型的には、１０ミリ秒ごとに）モニターし、使用されているシステムに応じて、吸入の特異的部分へエアロゾル化された薬物のパルスを放出させ、又は「常置されたエアロゾル雲（ｓｔａｎｄｉｎｇ ａｅｒｏｓｏｌ ｃｌｏｕｄ）」からの吸入の間に吸引された用量を計算する（ＥＰ０９１０４２１（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照）。
ＰｒｏＤｏｓＡＡＤ（Ｒ）（Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）は「ＰｒｏＤｏｓｅＤｉｓｃＴＭ」システム（Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）によって調節される噴霧システムである。ＰｒｏＤｏＡＡＤ（Ｒ）は、携帯式コンプレッサによって駆動される気圧式エアロゾルシステムであり、送達されるべき用量は、とりわけ、送達する用量についてシステムに指示を与えるシステム中に挿入されたマイクロチップ含有ディスクによって調節される。ＰｒｏＤｏｓｅＤｉｓｃＴＭは、ＰｒｏＤｏｓｅＡＡＤ（Ｒ）Ｓｙｓｔｅｍ中に挿入され、送達する量、投薬の回数についての指示（ドラッグバッチコード及び有効期限などの様々な管理データと一緒に送達され得る。）を与えるマイクロチップを含有するプラスチックディスクである（ＥＰ１２４５２４４（参照により、本明細書に組み込まれる。）参照）。Ｐｒｏｍｉｘｉｎ（Ｒ）は、シュードモナス・アエルギノサ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）肺感染症、特に、嚢胞性繊維症の管理のために、ＰｒｏｄｏｓｅＡＡＤ（Ｒ）を介して送達することができる。Ｐｒｏｍｉｘｉｎ（Ｒ）は、使用前に再構成される噴霧用粉末として供給される。
Ｉ−ｎｅｂＡＡＤ（Ｒ）は、別個のコンプレッサ（「Ｉ−Ｎｅｂ」）の必要なしに、患者の呼吸パターン中に、正確で再現性のある薬物用量を送達する携帯式ＡＡＤ（Ｒ）システムである。Ｉ−ｎｅｂＡＡＤ（Ｒ）は、メッシュを基礎とする電気式のエアロゾル化技術（Ｏｍｒｏｎ）と患者の呼吸パターンへの投薬を調節するためのＡＡＤ（Ｒ）技術の組み合わせに基づく小型化されたＡＡＤ（Ｒ）吸入装置である。システムは、概ね、携帯電話の大きさであり、８オンス未満の重量である。Ｉ−ｎｅｂＡＡＤ（Ｒ）は、Ｖｅｎｔａｖｉｓ（Ｒ）（イロプロスト）（ＣｏＴｈｅｒｉｘ／ＳｃｈｅｒｉｎｇＡＧ）の送達のために使用されてきた。本発明の組成物とともに使用され得る噴霧器の別の例は、ＡｒｉａＴＭ（Ｃｈｒｙｓａｌｉｓ）である。Ａｒｉａは、毛細管エアロゾル生成系を基礎としている。エアロゾルは、電気的に加熱された小さな毛細管を通じて薬物製剤を拍動させることによって形成される。毛細管を出ると、製剤は、周囲の空気によって急速に冷却されて、０．５から２．０μｍの範囲のＭＭＡＤを有するエアロゾルを生成する。
さらに、本発明の組成物を送達するために、ＴｏｕｃｈＳｐｒａｙＴＭ噴霧器（Ｏｄｅｍ）を使用し得る。ＴｏｕｃｈＳｐｒａｙＴＭ噴霧器は、リザーバの流体と接触して、超音波周波数で振動してエアロゾル雲を生成する有孔膜を使用する携帯式装置である。振動作用は、膜内の穴を通じて、液体のジェットを吸引し、ジェットを分裂して薬物の雲とする。液滴の大きさは、穴の形状／サイズ並びに表面の化学及び薬物溶液の組成によって調節される。この装置は、計量された用量の８３％を深部肺に送達すると報告されている。ＴｏｕｃｈＳｐｒａｙＴＭ噴霧器の詳細は、米国特許第６，６５９，３６４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
本発明の組成物とともに使用され得るさらなる噴霧器には、２つの一方向バルブを用いて患者の吸気時にエアロゾル出力を最大化し、患者の呼気時にエアロゾル出力を最小化する携帯式ユニットである噴霧器が含まれる（ＰＡＲＩ噴霧器（ＰＡＲＩＧｍｂＨ）参照）。隔壁によって、最適なサイズの粒子が噴霧器から排出されることが可能となる。その結果、呼吸可能な範囲中の粒子のパーセントが高くなり、肺への改善された薬物送達がもたらされる。このような噴霧器は、特定の患者集団向けに設計され得る（３歳未満の患者（ＰＡＲＩＢＡＢＹＴＭ）及び高齢患者用の噴霧器（ＰＡＲＩＬＣＰＬＵＳ（Ｒ）及びＰＡＲＩＬＣＳＴＡＲ（Ｒ））。
本発明の組成物とともに使用され得るさらなる噴霧器は、薬物溶液及び懸濁益又はコロイド状分散液をエアロゾル化させるために膜技術を振動させることを使用するｅ−Ｆｌｏｗ（Ｒ）噴霧器（ＰＡＲＩ ＧｍｂＨ）である（，ＴｏｕｃｈＳｏａｒｔＴＭ；ＯＤＥＭ（イギリス））。ｅ−Ｆｌｏｗ（Ｒ）噴霧器は、０．５ｍＬから５ｍＬまでの流体容積を取り扱うことが可能であり、活性薬物の極めて高い密度、正確に規定された液滴サイズ及び可能な限り短い時間で送達される呼吸可能な液滴の高い割合を有する液滴を生成することができる。ｅ−Ｆｌｏｗ（Ｒ）噴霧器を用いて送達されてきた薬物には、アズトレオナム及びリドカインが含まれる。ｅ−Ｆｌｏｗ（Ｒ）噴霧器に関するさらなる詳細は、参照により、本明細書に組み込まれる米国特許第６，９６２，１５１号に記載されている。
本発明の組成物とともに使用され得るさらなる噴霧器には、Ｍｉｃｒｏａｉｒ（Ｒ）電気式噴霧器（Ｏｍｒｏｎ）及びＭｙｓｔｉｃＴＭ噴霧器（Ｖｅｎｔａｉｒａ）が含まれる。Ｍｉｃｒｏａｉｒ（Ｒ）噴霧器は極めて小型であり、溶液医薬を効率的に送達するためにＶｉｂｒａｔｉｎｇ Ｍｅｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用する。Ｍｉｃｒｏａｉｒ装置は、７ｍＬの収容量を有し、約５ミクロンの薬物粒子ＭＭＡＤサイズを生成する。Ｍｉｃｒｏａｉｒ（Ｒ）噴霧器に関するさらなる詳細については、米国特許公開２００４０２４５５４７（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ＭｙｓｔｉｃＴＭ噴霧器は、ほぼ単分散された帯電粒子のスプレーへ液体を分裂させるために強い電場を使用する。ＭｙｓｔｉｃＴＭシステムは、封じ込めユニット、用量計測システム、エアロゾル生成ノズル及び共同して、複数用量又は単位用量送達の選択肢を与える電圧変換装置を含む。ＭｙｓｔｉｃＴＭ装置は呼吸によって活性化され、Ｃｏｒｕｓ１０３０ＴＭ（塩酸リドカイン）、Ｒｅｓｍｙｃｉｎ（Ｒ）（塩酸ドキソルビシン）、Ａｃｕａｉｒ（プロピオン酸フルチカゾン）、ＶｉｒｏＰｈａｒｍのＮＣＥ及びＰｆｉｚｅｒのＮＣＥとともに使用されてきた。ＭｙｓｔｉｃＴＭ噴霧器に関するさらなる詳細は、米国特許第６，３９７，８３８号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に見出され得る。
本発明の製剤を経肺送達するためのさらなる方法は、米国特許出願１２／２１７，９７２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に提供されている。
タンパク質の適切な投薬量（「治療的有効量」）は、例えば、治療されるべき症状、症状の重度及び期間、タンパク質が予防目的又は治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の既往歴及び当該タンパク質に対する応答、使用されるタンパク質の種類並びに担当医の裁量に依存する。タンパク質は、一回で又は一連の治療にわたって患者に適切に投与され、診断開始から任意の時点で患者に投与され得る。タンパク質は、単一の治療として、又は問題の症状を治療する上で有用な他の薬物若しくは治療と組み合わせて投与され得る。
本発明の製剤は、タンパク質の高い濃度にしばしば伴うタンパク質凝集という一般的な問題を克服し、従って、治療用タンパク質の高いレベルを患者に投与し得る新たな手段を提供する。本発明の高濃度製剤は、投薬において利点を与え、標準的な治療のための製剤と等しい又は下回る容量を用いて、より高い用量が対象に投与され得る。治療用タンパク質に対する標準的治療は、タンパク質の製造業者によって提供されるラベルの上に記載される。例えば、製造業者によって提供されるラベルに従って、インフリキシマブは、１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように凍結乾燥されたタンパク質を再構成することによって、関節リウマチの治療のために投与される。本発明の製剤は、インフリキシマブの高い濃度を含み得、高い濃度には、標準的な１０ｍｇ／ｍＬより高い濃度が含まれる。別の例において、製造業者によって提供されるラベルに従って、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）は、１２５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように凍結乾燥されたタンパク質を再構成することによって、喘息の治療のために投与される。この例では、本発明の高濃度製剤は、標準的な１２５ｍｇ／ｍＬを上回る抗体オマリズマブの濃度を含む。
従って、一実施形態において、本発明の製剤は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３５０％、少なくとも約３７５％、少なくとも約４００％など、公知の標準的製剤中の治療用タンパク質の濃度を上回る高い濃度を含む。
別の実施形態において、本発明の製剤は、公知の標準的製剤中の治療用タンパク質の濃度より少なくとも約２倍大きい、少なくとも約３倍大きい、少なくとも約４倍大きい、少なくとも約５倍大きい、少なくとも約６倍大きい、少なくとも約７倍大きい、少なくとも約８倍大きい、少なくとも約９倍大きい、少なくとも約１０倍大きいなど、高い濃度を含む。
水性製剤の特徴は、治療的使用のために改善され得る。例えば、抗体製剤の粘度は、透析ろ過溶媒として、賦形剤を加えない水を用いる透析ろ過に抗体タンパク質溶液を供することによって改善され得る。ＩＩ節に上述されているとおり、賦形剤の最終濃度が知られ、製剤の特異的な特徴が指定された使用に関して改善されるように、粘度を改善する賦形剤などの賦形剤を水性製剤へ添加し直し得る。例えば、当業者は、医薬製剤の所望される粘度が製剤を送達する様式（例えば、注射、吸入、皮膚吸収など）に依存することを認識する。しばしば、所望の粘度は、製剤を服用する際の対象の快適性と治療効果を有するために必要とされる製剤中のタンパク質の用量のバランスを採る。例えば、注射されている製剤に対する粘度の一般に許容されるレベルは、約１００ｍＰａｓ未満の粘度レベル、好ましくは７５ｍＰａｓ未満、さらに好ましくは５０ｍＰａｓ未満である。従って、水性製剤の粘度は、治療的使用に関して許容可能であり得、又は所望の特徴を改善するために賦形剤を添加する必要があり得る。
一実施形態において、本発明は、水及びヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含む水性製剤を提供し、該製剤は賦形剤を含まず、該製剤は治療としての使用を有利とする粘度（例えば、タンパク質濃度が約１７５ｍｇ／ｍＬであるときに、８℃で４０ｃＰ未満及び２５℃で２５ｃＰ未満の低い粘度）を有する。一実施形態において、改善された粘度を有する製剤中の抗体又はその抗原結合部分の濃度は、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬである。一実施形態において、本発明の製剤は、約１と約２ｍＰａｓの間の範囲の粘度を有する。
非治療的使用
本発明の水性製剤は、非治療的使用、すなわち、インビトロ目的のためにも使用され得る。
本明細書に記載されている水性製剤は、ゲノミクス、プロテオミクス、バイオインフォマティクス、細胞培養、植物生物学及び細胞生物学における使用など（但し、これらに限定されない。）、医薬及びバイオテクノロジーにおける診断又は実験法のために使用され得る。例えば、本明細書に記載されている水性製剤は、標識及び検出法における分子プローブとして必要とされるタンパク質を提供するために使用され得る。本明細書に記載されている製剤に対するさらなる使用は、製造目的のための細胞増殖及びタンパク質産生など、細胞培養試薬用の補充物を提供することである。
本明細書に記載されている水性製剤は、製剤中の賦形剤が実験環境とどのようにして反応し得るか、例えば、プロトコールにおいて使用されている別の試薬をどのようにして妨害するかに関する懸念を軽減させて、プロトコールにおいて使用され得る。別の例において、タンパク質の高い濃度を含有する水性製剤を、研究室用の試薬として使用し得る。タンパク質のこのような高度に濃縮された形態は、研究室実験の現時の限界を拡張する。
本発明の製剤に対する別の用途は、食品への添加物を提供することである。本発明の水性製剤は実質的に水とタンパク質からなるので、製剤は、栄養補助食品などの所望されるタンパク質の高い濃度を食品に送達するために使用され得る。本発明の水性製剤は、ヒトによる摂取に好適でない場合があり得る安定性／可溶性のために必要とされる賦形剤に対する懸念なしに、水の中にタンパク質の高い濃度を与える。例えば、乳漿及び大豆由来タンパク質は、脂肪の口当たりと触感を模倣することができるので、食物に対して多用途性を与える。従って、乳漿及び大豆由来タンパク質は、満足を犠牲にせずに、全体的な脂肪含量を減少させるために、食物に添加され得る。従って、食品を補完するために、乳漿及び大豆由来タンパク質の適切な量を含む水性製剤を製剤化し、使用し得る。
製品
本発明の別の実施形態において、本発明の水性製剤を含有し、その使用に関する指示書を提供する製品が提供される。製品は、容器を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル（例えば、二重チャンバーのバイアル）、注射器（二重チャンバーの注射器など）、注射器を含有する自動注射用ペン及び試験管が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック又はポリカーボネートなどの様々な材料から形成され得る。容器は水性製剤を保持し、容器上のラベル又は容器に添付されたラベルは、使用上の指示を表示し得る。例えば、ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、又は皮下投与用であることを示し得る。製剤を保持する容器は複数回使用のバイアルであり得、水性製剤の反復投与（例えば、２から６回の投与）が可能となる。製品は、第二の容器をさらに含み得る。製品は、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、注射器及び使用のための指示を有する同封物など、商業的な見地及び使用者の見地から望ましい他の物品をさらに含み得る。
本願を通じて引用されている全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、以下の実施例を限定的なものと解釈すべきではない。
次の実施例は、溶液媒体として水を含む水性製剤に関する実験を記載する。場合によっては、少数位は欧州１０進表記法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｄｅｃｉｍａｌ ｎｏｔａｔｉｏｎ）を用いて示されることに注意されたい。例えば、表３１において、「０，２９６」という数字は、「０．２９６」と同義である。
（実施例１）
アダリムマブ及びＪ６９５での透析ろ過／限外ろ過
材料及び方法
純水を用いてアダリムマブ及びＪ６９５を透析ろ過処理した。純水で少なくとも５倍体積の交換を行った後、少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬの最終目標濃度までタンパク質溶液を限外ろ過した。ＤＦ／ＵＦ処理中のタンパク質の状態を監視するために、浸透圧、目視及びタンパク質濃度測定（ＯＤ２８０）を行った。
出発製剤、例えば、製剤原料（ＤＳ）出発物質及びタンパク質標準物質と比較する際、各最終ＤＦ／ＵＦ産物におけるタンパク質安定性の特徴を調べるために、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを使用した。製剤原料又は「ＤＳ」は、活性医薬成分を表し、一般には、通常のバルク溶液における治療用タンパク質を指す。
・アダリムマブ製剤原料、（アダリムマブ吸光係数２８０ｎｍ：１．３９ｍＬ／ｍｇ ｃｍ）。製剤原料はポリソルベート８０を含有しなかった。ＤＳ組成物：５．５７ｍＭリン酸一ナトリウム、８．６９ｍＭリン酸二ナトリウム、１０６．６９ｍＭ塩化ナトリウム、１．０７ｍＭクエン酸ナトリウム、６．４５ｍＭクエン酸、６６．６８ｍＭマニトール。
・動的光散乱（ＤＬＳ）測定に対して使用されるアダリムマブ溶液：それぞれ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及び賦形剤原溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で溶解した賦形剤）でアダリムマブ溶液を希釈することによって、交換媒体として純水を用いて透析ろ過処理したアダリムマブ溶液を１ｍｇ／ｍＬ濃度に調整した。
・Ｊ６９５製剤原料、（Ｊ６９５吸光係数２８０ｎｍ：１．４２ｍＬ／ｍｇ ｃｍ）。ＤＳ組成物：ヒスチジン、メチオニン、マニトール、ｐＨ５．８及びポリソルベート８０。
・５００ｍＬリザーバーを備えるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（タンジェンシャルフロー濾過）（ＴＦＦ）システム。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ操作説明書に従い、周囲温度で不連続モードでＬａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦシステムを操作した。撹拌速度をおよそ１．５に設定し、ポンプ速度をおよそ３に設定した。標的とするインレット及びアウトレット圧は、それぞれ１５ｍｍ ｐｓｉｇ、およそ５０ｍｍ ｐｓｉｇであった。
・ＯｍｅｇａＴＭＰＥＳ膜、３０ｋＤａカットオフを備えるＭｉｎｉｍａｔｅＴＭＴａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（タンジェンシャルフロー濾過）カプセル。０．１Ｎ ＮａＯＨで３０分間及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水でさらに３０分間、このカプセルをすすいだ。
・緩衝較正液ＶＷＲ、ｐＨ４．００緩衝溶液赤色、カタログ番号３４１７０−１２７及びｐＨ７．００緩衝溶液黄色、カタログ番号３４１７０−１３０で較正したｐＨプローブＰｔ１０００、Ｎｏ．６．０２５８．０１０を備える７８０ｐＨメーター、Ｍｅｔｒｏｈｍ。
・タンパク質濃度測定（２８０ｎｍ波長）のために、固定されたＣａｒｙ５０セル付きのＶａｒｉａｎ ５０ Ｂｉｏ ＵＶ可視分光光度計、ＡＩ９６５５を使用した。ＤＦ／ＵＦ後の全てのＪ６９５試料及びアダリムマブ溶液のタンパク質濃度測定のために、５０．００ｍＬの最終体積まで、水（ＨＰＬＣ用のＭｉｌｌｉ−Ｑ水）で１００μＬタンパク質試料を希釈した。１９６０μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で４０μＬ試料溶液を希釈することによって、全てのその他のアダリムマブ試料の濃度を監視した。濃度測定のために、使い捨てＵＶキュベット、１．５ｍＬ、セミミクロ、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）を使用し、ＯＤ２８０ブランクとしてＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用した。
・ＤＦ／ＵＦ媒体としてＨＰＬＣグレード用のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用した。
・ＤＬＳ測定のために、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、機器番号ＡＩ９４９４を使用した。
・ＤＬＳ測定のために、Ｈｅｌｌｍａ精密セル、ｓｕｐｒａｓｉｌ、型番１０５．２５１−ＱＳ、光路３ｍｍ、中央８．５を使用した（７５μＬ試料、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、商品番号ＡＩ９４９４を充填）。
・浸透圧測定のために、Ｋｎａｕｅｒ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ、機器番号８３９６３、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙを使用した（４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ ＮａＣｌ較正溶液、商品番号Ｙ１２４１、Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｋｎａｕｅｒ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙで較正）。
・ＤＦ／ＵＦ操作後のタンパク質溶液の保存のために、２５０ｍＬ Ｃｏｒｎｉｎｇ細胞培養フラスコ、７５ｃｍ２、ポリスチレン、滅菌、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡを使用した。
・塩化ナトリウム：２Ｍ ＮａＣｌ原溶液を調製するために、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒを使用した。様々なＮａＣｌ濃度（１０、２０、３０及び５０ｍＭ）の純水中の１ｍｇ／ｍＬアダリムマブ溶液を調製するために、この原溶液を使用した。
・２００ｍｇ／ｍＬソルビトール原溶液を調製するために、Ｄ−ソルビトール、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ６３１７８を使用した。様々なソルビトール濃度（１０、２０、３０及び４０ｍｇ／ｍＬ）の純水中の１ｍｇ／ｍＬアダリムマブ溶液を調製するために、この原溶液を使用した。
ＨＰＬＣ法
・アダリムマブ、ＳＥＣ分析：Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ カタログ番号１７５１７５−０１、Ｓ／Ｎ０５０４０５７）。移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．５ｍＬ／分流速、周囲温度、検出ＵＶ２１４ｎｍ及び２８０ｎｍ。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で各試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈、試料注入処理量５０μｇ（２回注入）。
・アダリムマブ、ＩＥＣ分析：対応するガードカラム（ｐ／ｎ０５４９９４）付きのＤｉｏｎｅｘ、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ−１０カラム（ｐ／ｎ０５４９９３）。分離条件：移動相Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；移動相Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５。１．０ｍＬ／分流速、周囲温度。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１．０ｍｇ／ｍＬに各試料を希釈、試料注入処理量１００μｇ（２回注入）。
・Ｊ６９５、ＳＥＣ分析：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｇ３０００ｓｗｘｌ、７．８ｍｍ ｘ ３０ｃｍ、５μｍ（カタログ番号０８５４１）。移動相：２１１ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４／９２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０。０．３ｍＬ／分流速、周囲温度、検出ＵＶ２１４ｎｍ及び２８０ｎｍ。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２．５ｍｇ／ｍＬに各試料を希釈、試料注入処理量５０μｇ（２回注入）。
・Ｊ６９５、ＩＥＣ分析：対応するガードカラム（ｐ／ｎ０５４９９４）付きのＤｉｏｎｅｘ、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ−１０カラム（ｐ／ｎ０５４９９３）。分離条件：移動相Ａ：１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．０；移動相Ｂ：１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０。１．０ｍＬ／分流速、３５℃温度。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で各試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈、試料注入処理量１００μｇ。Ｊ６９５参照基準物質２９００１ＢＦを比較として３回流し、分析試験成績書からの濃度に基づき、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
タンパク質濃度の計算
計算式：
Figure 0005840364
 ε−吸光係数
ｃ−濃度
ｄ−光が通過しなければならないキュベットの長さ
Ｅ−吸光度
Ｉ０−最初の光強度
Ｉ−試料を通過した後の光強度
Figure 0005840364
１．１：アダリムマブのＤＦ／ＵＦ処理
ＤＦ／ＵＦ装置製造者の標準的な操作手順に従い、ＤＦ／ＵＦ実験を行う。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭＴＦＦシステムには５００ｍＬリザーバーが備えられており、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ操作説明書に従い、周囲温度にて不連続モードでシステムを操作した。撹拌速度はおよそ１．５に設定し、ポンプ速度はおよそ３に設定した。標的インレット及びアウトレット圧は、それぞれ、１５ｍｍｐｓｉｇ及びおよそ５０ｍｍｐｓｉｇであり、標的圧力を超過しないように、標的圧力を監視した。
ＯｍｅｇａＴＭＰＥＳ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）、３０ｋＤａカットオフを備えるＭｉｎｉｍａｔｅＴＭＴａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（タンジェンシャルフロー濾過）カプセルを使用した。使用前に、０．１Ｎ ＮａＯＨで３０分間及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水でさらに３０分間、このカプセルをすすいだ。
アダリムマブ溶液およそ５００ｍＬをＴＦＦリザーバーに入れ、ＤＦ／ＵＦ処理を不連続モードで開始した。表１は、ＤＦ／ＵＦプロセスの特徴を示すＩｎ−Ｐｒｏｃｅｓｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＩＰＣ）データでの詳細を提供する。
表１：アダリムマブＤＦ／ＵＦ処理における概要
Figure 0005840364
およそ５倍体積交換後（１体積交換はおよそ２５０ｍＬ透析ろ過溶液に相当）、ＤＦ／ＵＦ処理を停止した。望ましい１００％の賦形剤の膜透過性を仮定すると、適用される実験パラメータにより得られる理論的最終賦形剤濃度は、Ｃｉ（２５０／５００）５＝０．０３１２５＊Ｃｉ（Ｃｉは初期濃度である。）である。従って、最大の賦形剤減少率は、９６．８７５％であった（定容透析ろ過を使用した場合、５透析ろ過体積での理論的な賦形剤減少率は、Ｃｉｅ−５＝０．００６７４、即ちおよそ９９．３％の最大賦形剤減少率であった。）。アダリムマブ溶液がＴＦＦシステムから２５０ｍＬ細胞培養フラスコに排出された（少量のＷＦＩでＴＦＦシステムを濯ぎ、濃度は１７５．０５ｍｇ／ｍＬとなり；濯ぎなしでは、保持液濃度は２１３．８７ｍｇ／ｍＬとなった。）。ｐＨ、浸透圧及びアダリムマブ濃度を調べるために試料を採取した。さらに、ＳＥＣ及びＩＥＣにより特徴を調べるために、試料を採取した。ＤＦ／ＵＦ処理前後のアダリムマブ溶液の特徴的パラメータはそれぞれ表２で挙げる。
表２：アダリムマブ溶液におけるＤＦ／ＵＦ処理の影響
Figure 0005840364
ＤＦ／ＵＦ処理の過程で、アダリムマブ濃度は２１０ｍｇ／ｍＬを超えた。実験を通じて、タンパク質溶液は透明なままであり、溶液の濁度又はタンパク質沈殿（アダリムマブ溶解性限界を示している。）は観察されなかった。元のアダリムマブＤＳ溶液（約５５ｍｇ／ｍＬ）と比較して、ＤＦ／ＵＦ交換媒体として純水を使用することにより透析ろ過処理したアダリムマブ溶液は、タンパク質濃度が３倍を超えて上昇したにもかかわらず（約１７５ｍｇ／ｍＬ）、乳白光がより低いことが分かった。
１．２：クロマトグラフィーを介したアダリムマブ特性
図１は、ＤＦ／ＵＦ処理手順前（中央の行）後（最上行）のアダリムマブ薬物標準物質溶液と比較したアダリムマブ参照基準物質（アダリムマブ標準物質（最下行））のＳＥＣクロマトグラムを示す。分析前に−８０℃で全試料を凍結させたことに注意。
表３もまた、ＩＥＣクロマトグラムデータを含有する（分析前に−８０℃で全試料を凍結させたことに注意。）。
表３：様々なアダリムマブ試料のＩＥＣデータ
Figure 0005840364
１．３：アダリムマブ流体力学直径（Ｄｈ）における賦形剤の影響
純水中にＪ６９５を処方した場合、動的光散乱（ＤＬＳ）測定により測定したときのＪ６９５の流体力学直径が顕著に縮小したことが既に分かっている。ＷＦＩ中のＪ６９５のＤｈは約３ｎｍであり、免疫グロブリンに対して予想される値をはるかに下回る。イオン化ＮａＣｌの少量を添加した際、Ｄｈ値は、〜１０ｎｍに上昇した（ＮａＣｌ濃度と独立）。非イオン化マニトールの添加により、Ｊ６９５溶液浸透圧が上昇したが、Ｊ６９５Ｄｈには影響しなかった。
上記のＤＦ／ＵＦ手順に従い処理されたアダリムマブの流体力学直径における賦形剤の影響を評価するために、ＤＦ／ＵＦ実験からのアダリムマブ溶液を使用して、それぞれ純水（しかし、ＮａＣｌ（０−５０ｍＭ）及びソルビトール（０−４０ｍｇ／ｍＬ）のレベルは様々）中でアダリムマブ溶液を処方した。アダリムマブ単量体のＤｈにおけるソルビトール（非イオン化賦形剤）及びＮａＣｌ（イオン化賦形剤）濃度の影響を図２で示す。
純水におけるアダリムマブ単量体の流体力学直径は２．６５ｎｍであった。塩及び非イオン性賦形剤に対するアダリムマブＤｈ反応は、以前に見られたＪ６９５反応と同一であった。アダリムマブＤｈは、実質的には、ソルビトールの存在により影響を受けなかった。低濃度のＮａＣｌにより、〜１１ｎｍの予想レベルへの単量体流体力学直径の拡大が誘発された。これらの所見から、動的光散乱により測定した場合、タンパク質流体力学直径がイオン化賦形剤の存在によって大きな影響を受けることが分かる。イオン化賦形剤がないことはまた、溶液粘度とも関連する。
これらの所見は、高度濃縮タンパク質溶液に影響がある：流体力学直径が小さいほど、タンパク質が占有する空間体積は小さくなる。高濃度の状況において、ＤＦ／ＵＦ交換媒体として水を使用することによって調製されるタンパク質溶液の粘度は、実質的に、多量のイオン化緩衝賦形剤を含有する伝統的なタンパク質製剤の粘度よりも低くなる。これは、ｐＨに依存して（例えば、ｐＨ４、ｐＨ５及びｐＨ６）注射用水中の２００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ溶液の粘度が５０ｍＰａｓを優に下回ったことが分かったので、アダリムマブデータから確認された。下記実施例１７で、ＤｈにおけるｐＨの影響に対するより多くのデータが見出され得る。
全体的に、これらの所見は、高濃度タンパク質製剤活性において有用であり、粘度に関連する製造及び投与／送達の問題点は周知である。さらに、これらの所見は、それぞれタンパク質Ｄｈ及び溶液粘度の上昇を誘発することなく、必要に応じて、最終的薬物製品の浸透圧値が、それぞれ糖又は糖アルコールなどの非イオン化賦形剤で調整され得ることを示す。
１．４：Ｊ６９５のＤＦ／ＵＦ処理（抗−ＩＬ１２抗体）
１Ｍリン酸でＪ６９５溶液およそ２００ｍＬをｐＨ４．４に調整し、ＴＦＦリザーバーに満たした（Ｊ６９５単量体のゼータ電位が確実に正になるようにｐＨ調整を行い、このようにして、データに対する非荷電タンパク質単量体の潜在的効果を回避する。）。次いで、ＴＦＦリザーバーにＭｉｌｌｉ−Ｑ水３００ｍＬを添加し、不連続モードでＤＦ／ＵＦ処理を開始した。２５０ｍＬリザーバー体積、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水２５０ｍＬを添加し、ＤＦ／ＵＦ処理を再び開始した。全部で５体積交換段階を行った後、ＤＦ／ＵＦ処理を停止した（１体積交換はおよそ２５０ｍＬに相当）。
理想的な１００％の賦形剤の膜透過性を仮定すると、適用される実験パラメータにより得られる理論的最終賦形剤濃度は、Ｃｉ（２５０／５００）５＝０．０３１２５＊Ｃｉ（Ｃｉは初期濃度である。）である。従って、最大賦形剤減少は、９６．８７５％であった（定容透析ろ過を使用した場合、５透析ろ過体積での理論的な賦形剤の減少率は、Ｃｉ ｅ−５＝０．００６７４、即ちおよそ９９．３％の最大賦形剤減少率であった。）。Ｊ６９５溶液をＴＦＦシステムから２５０ｍＬ細胞培養フラスコに排出させた（ＴＦＦシステムの濯ぎを行わなかった。）。ｐＨ、浸透圧及びＪ６９５濃度を調べるために試料を採取した。さらに、ＳＥＣ及びＩＥＣにより特徴を調べるために、試料を採取した。それぞれＤＦ／ＵＦ処理前後のＪ６９５溶液の特徴的パラメータを表４で挙げる。
表４：Ｊ６９５溶液におけるＤＦ／ＵＦ処理の影響
Figure 0005840364
アダリムマブと同様に、Ｊ６９５におけるＤＦ／ＵＦ実験から、ＤＦ／ＵＦ操作での交換媒体として純水を使用することにより、Ｊ６９５を処理し処方する第一の可能性が実証される。ＳＥＣ及びＩＥＣデータの両方から、透析ろ過媒体としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて周囲温度で全部で１．５日間にわたり（処理を一晩中断）、ＤＦ／ＵＦ処理中のＪ６９５安定性に対する実質的な影響は示されない。実験を通じて、タンパク質溶液は透明なままであり、このことから、潜在的なＪ６９５溶解度制限は示されなかった。
１．５：Ｊ６９５の特徴
表５は、ＳＥＣクロマトグラムにより測定した場合の、３種類の溶液に対する、凝集体、単量体及び断片含量に対する％を示す。
表５：ＳＥＣクロマトグラムからのデータ
Figure 0005840364
図３は、Ｊ６９５参照基準（一番下のグラフ）及びｐＨ４．４にｐＨ調整されたＪ６９５ＤＳのＩＥＣプロファイル（一番上のグラフ）を示す。
ＤＦ／ＵＦ処理後にＪ６９５試料においてごく少量の凝集体含量の上昇が観察された。
図４は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、ｐＨ４．７でのＤＦ／ＵＦ後のＪ６９５（一番上のグラフ）及びｐＨ４．４にｐＨ調整されたＤＦ／ＵＦ前のＪ６９５ＤＳ（一番下の曲線）のＩＥＣプロファイルを示す。図４で示されるように、ＩＥＣにより監視した場合、ＤＦ／ＵＦ段階は、Ｊ６９５安定性に顕著な影響はなかった。２種類のＪ６９５参照基準（図３参照）の間の相違は、３０００Ｌ及び６０００Ｌ ＤＳ期間中の製造過程の相違に起因し得る。表６は、ＩＥＣデータにおいて詳細を強調する。
表６：様々なＪ６９５試料のＩＥＣデータ
Figure 0005840364
１．６：結論
上記の実施例は、モノクローナル抗体アダリムマブ及びＪ６９５に対する透析ろ過媒体として水（ＨＰＬＣ用のＭｉｌｌｉ−Ｑ水）を使用した、透析ろ過／限外ろ過（ＤＦ／ＵＦ）実験を提供する。
ＤＦ／ＵＦ交換媒体として純水を使用することによりアダリムマブをＤＦ／ＵＦ処理に供し、溶液混濁、顕著な乳白光又は濁度の発生を誘導することなく、高濃度（＞２００ｍｇ／ｍＬ）でｐＨ５．２にて処方した。続く１回の凍結／融解段階で、ＳＥＣ及びＩＥＣデータから、ＤＦ／ＵＦ処理を介して水中で処方されたアダリムマブ溶液と元のアダリムマブＤＳとの間で顕著な相違は示されなかった。
Ｊ６９５もまた、ＤＦ／ＵＦ交換媒体として純水を用いることによりＤＦ／ＵＦ処理に供し、Ｊ６９５安定性（目視、ＳＥＣ、ＩＥＣ）に影響を与えることなく、ｐＨ４．７で処方した。
このようなＤＦ／ＵＦ処理を用いて処方される場合、アダリムマブ単量体の流体力学直径（Ｄｈ）はおよそ２．６５ｎｍであった。４０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のソルビトールなどの非イオン性賦形剤が存在しても、Ｄｈデータには影響がないことが示されたが、一方で、ＮａＣｌなどのイオン性賦形剤は既に低濃度でアダリムマブ単量体Ｄｈのおよそ１１ｎｍへの上昇を誘導することが示された（このようなＤｈデータは一般的にＩｇＧに対して観察される。）。Ｊ６９５に対して同様の所見が既にあった。
結論として、ＤＦ／ＵＦ交換媒体として純水を用いたタンパク質の処理及び処方は、実現可能である。理想的な１００％の賦形剤の膜透過性を仮定すると、５透析ろ過体積を用いた定容透析ろ過により得られる理論的な最終賦形剤濃度は、Ｃｉ ｅ−５＝０．００６７４、即ちおよそ９９．３％の最大賦形剤減少率である。６透析ろ過体積交換を用いると、結果は、〜９９．９８％の理論的最大賦形剤減少率となる。
実施例２から５は、水性製剤中に濃縮された３種類の異なるタンパク質に関する実験遂行を記載し、実施例６から１１は、水性製剤のそれぞれの分析を記載する。
実施例２−１１に対する材料及び方法
・注射用水中のアダリムマブタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）、タンパク質製剤原料（ＤＳ）物質（４９．６８ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳは、Ｔｗｅｅｎ８０、アダリムマブ、アダリムマブ製品（ＤＰ）（４０ｍｇ、注射用の溶液、市販製品からのろ過済み溶液）を含有する。タンパク質吸収係数２８０ｎｍ：１．３９。
・注射用水中のＪ６９５タンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）、タンパク質製剤原料（ＤＳ）（５４ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳはＴｗｅｅｎ８０を含有する。吸収係数２８０ｎｍ：１．４２。
・注射用水中のＨＳＡタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｔｗｅｅｎ８０なしのＤＰ、Ｇｒｉｆｏｌｓヒト血清アルブミン Ｇｒｉｆｏｌｓ（Ｒ）、２０％、５０ｍＬ。吸収係数２８０ｎｍ：１．０４２
・６Ｒバイアル及び１０Ｒバイアル
・バイアルの準備：バイアルを洗浄し、加圧滅菌処理
・停止液、１９ｍｍ、Ｗｅｓｔ、４１１０／４０／グレイ
・試料容器（例えば、エッペンドルフ試料容器、Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ又は単純なスナップ式、１−２ｍＬ）
・使い捨てシリンジ、滅菌、２０ｍＬ；ＮｏｒｍＪｅｃｔ、１０ｍＬ
・使い捨てフィルターユニット（フィルターＭｉｌｌｅｘ（Ｒ）−ＧＶ、Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｄｒｉｖｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ、ＰＶＤＦ０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｅｘ（Ｒ）−ＧＰ、Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｄｒｉｖｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ、ＰＥＳ ０．２２μｍ、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（Ｒ）０．２２μｍフィルターユニット）
・Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（カットオフ１０ｋＤａ、ＰＥＳ；カットオフ３ｋＤａ、ＰＥＳ）
・ピペット（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ｍａｘ．：１０００μＬ）
・注射用水
・遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）及びＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｎｏ．１（温度制御）
・透析ろ過装置：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭＴＦＦシステム、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ透析ろ過膜：アダリムマブ：ポリエーテルスルホン；Ｊ６９５：ポリエーテルスルホン；ＨＳＡ：再生セルロース
・ｐＨプローブ（Ｍｅｔｒｏｈｍ ｐＨメーター、タンパク質に適切なプローブ、ｂｉｏｔｒｏｄｅ ４６）
・Ｌａｍｉｎａｒ−Ａｉｒ−Ｆｌｏｗ（層流）ベンチ、Ｓｔｅａｇ ＬＦ−Ｗｅｒｋｂａｎｋ、Ｍｐ．−Ｎｏ．１２．５
・ＮａＣｌ；マニトール
・Ｇｅｍｉｎｉ １５０ ペルチェプレートレオメーター、Ｍａｌｖｅｒｎ
・レオメーターＭＣＲ３０１［温度制御Ｐ−ＰＴＤ２００（ペルチェ・テンパーリング（Ｐｅｌｔｉｅｒｔｅｍｐｅｒｉｎｇ）付きプレート）］及びコーン／プレート測定系ＣＰ５０／０．５°ＴｉならびにＣＰ５０／１°（ステンレス鋼）；Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ
・毛細管粘度計、Ｓｃｈｏｔｔ、毛細管：タイプ５３７ ２０、タイプ５３７ １０、タイプ５３７ １３
・１Ｍ塩酸（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）
分析
・ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計（ＯＤ２８０ｎｍ）；光子相関分光法（ＰＣＳ）：およそ１０ｍｇ／ｍＬ及びおよそ２０ｍｇ／ｍＬに対して：１．１ｍＰａｓ、３回操作、３０ｓ、１回測定、２５℃、およそ３０ｍｇ／ｍＬ以上：１．９ｍＰａｓ、３０ｓ、３回操作、１回測定、２５℃
・下記記載のとおりの、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
・粘度測定：個別及び異なる設定の様々な粘度計を使用
タンパク質濃度の計算
計算式：
Figure 0005840364
 ε−吸光係数
ｃ−濃度
ｄ−光が通過しなければならないキュベットの長さ
Ｅ−吸光度
Ｉ０−最初の光強度
Ｉ−試料を通過した後の光強度
Figure 0005840364
 アダリムマブに対する粘度データ及び計算
アダリムマブ市販製剤（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）密度：
ρ＝１．０５４７５ｇ／ｃｍ３
アダリムマブ市販製剤（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）動粘性率：
Ｋ−毛細管の定数
ｔ−毛細管を通過するために溶液が必要とする時間［ｓ］
ｖ−動粘性率
ｖ＝Ｋ×ｔ＝０．０３１５９ｍｍ２／ｓ２×２７９．３６ｓ＝８．８２５ｍｍ２／ｓ
アダリムマブ市販製剤（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）動的粘度：
η−動的粘度
ｐ−密度
Figure 0005840364
 ヒト血清アルブミンに対する粘度データ及び計算
ＨＳＡ市販製剤（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）密度：
Figure 0005840364
 ＨＳＡ市販製剤（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）動粘性率：
Ｋ−毛細管の定数
ｔ−毛細管を通過するために溶液が必要とする時間［ｓ］
ｖ−動粘性率
Figure 0005840364
 ＨＳＡ市販製剤（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）動的粘度：
η−動的粘度
ｐ−密度
Figure 0005840364
 ＷＦＩ中のＨＳＡ（およそ１８０ｍｇ／ｍＬ）密度：
Figure 0005840364
 ＷＦＩ中のＨＳＡ（およそ１８０ｍｇ／ｍＬ）動粘性率：
Ｋ−毛細管の定数
ｔ−毛細管を通過するために溶液が必要とする時間［ｓ］
ｖ−動粘性率
Figure 0005840364
 ＷＦＩ中のＨＳＡ（およそ１８０ｍｇ／ｍＬ）動的粘度：
η−動的粘度
ｐ−密度
Figure 0005840364
 高濃度製剤に到達するための一般的実験の遂行
一般に、高濃度の、塩不含、タンパク質製剤に到達するための本発明のプロセスには、最初の製剤原料の透析ろ過とそれに続く、溶液中で製剤原料の濃度を上昇させるための手順が含まれる。これは、個別の手順で行われ得るか又は同じ手順中で個別にもしくは同じ段階で行われ得る。
透析ろ過
製剤原料（ＤＳ）材料の十分量（ＤＳのタンパク質濃度に依存）を透析ろ過に供した。透析ろ過前に、注射用水でＤＳ材料を約１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。この実験に対して全部で１０ｍｇ／ｍＬ溶液およそ５４０ｍＬが必要とされたことに注意。
透析ろ過媒体として注射用水を使用した。行われる透析ろ過段階の数は５から７であった（１回の透析ろ過段階は、１回の総体積交換と同等である。）。透析ろ過段階前後にプロセス内対照（ＩＰＣ）試料を採取した（浸透圧に対して２００μＬ、ＳＥＣに対して１２０μＬ）。
次のパラメータを適用することによりＴＦＦ装置で透析ろ過を行う：
撹拌機：ポジション２
ポンプ：ポジション２
圧力 上流／インレット：最大２０−３０ｐｓｉ
圧力 下流／アウトレット：最大１０ｐｓｉ
（この実験で使用されるパラメータは製造者の推奨からのものであった。特定のタンパク質又は、装置、処方、粘度及びその他の可変要素の相違を調節するために、当業者は、装置作動のパラメータを変更することができる。）。
透析ろ過後、ＯＤ２８０によってタンパク質濃度を評価した。タンパク質濃度が＞１０ｍｇ／ｍＬである場合、注射用水で溶液を適切に希釈することによって、タンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
濃度
透析ろ過処理されたタンパク質溶液（例えば、アダリムマブ、Ｊ６９５、ＨＳＡ）２０ｍＬをＶｉｖａｓｐｉｎ ２０濃縮装置に添加した。濃縮装置を閉じ、遠心機に入れた。タンパク質溶液を最大速度（５０００ｒｐｍ）で遠心した。
試料採取
１０ｍｇ／ｍＬで及び次いで１０ｍｇ／ｍＬごとに（２０、３０、４０ｍｇ／ｍＬなど）又はタンパク質の凝集体が視覚的に見られるまで、濃縮溶液の試料を採取し、試料を次のように分析した。
−Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置中でタンパク質溶液を均質化し、適切なバイアルに充填した。
−バイアルにおいて目視で外観を直接調べた。
−ＵＶ分光法に対して３００μＬ、ＰＣＳに対して１６０μＬ、ＳＥＣに対して１２０μＬ及びＩＥＸに対して３００μＬを使用した。
−ＳＥＣ及びＩＥＸに対する試料を−８０℃で保存した。
動的光散乱（ＤＬＳ）プロトコール
そのままでタンパク質試料を用いて、Ｈｅｌｌｍａ精密セル（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）、ｓｕｐｒａｓｉｌクウォーツ、型番１０５．２５１−ＱＳ、光路３ｍｍ、中央Ｚ８．５ｍｍ（少なくとも６０μＬ試料充填）を備え、測定セルに直接置かれた、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を用い、動的光散乱を行った。測定前に、ＤＬＳ測定に影響を及ぼし得る気泡又は粒子／塵／その他の夾雑物が溶液中にないことを確認するために、セルの窓部を調べた。標準的な操作手順下で測定を行った（「汎用」モード、２５℃、屈折率は１．４５に設定し、測定モードは「手動」に設定し、各測定あたり１回作動、それぞれ３０秒ごとに３回測定、測定タイプを「サイズ」に設定）。データを分析するために、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン４．１０ｂ１、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓを使用した。流体力学直径（Ｄｈ）の分析のために、試料溶液約７０μＬを精密セルに充填した。初期設定試料粘度は、低濃縮タンパク質溶液（例えば＜５ｍｇ／ｍＬ）に対して１．１ｍＰａｓに設定した。基本的な測定原理から、測定しようとする試料溶液の実際の粘度値と初期設定粘度の使用の間の僅かな差異はＤＬＳデータ読み取りに実質的に影響を与えないと結論付けられた。低タンパク質濃度溶液（＜５ｍｇ／ｍＬ）のＤＬＳ測定を行うことにより、これを確認した（溶液粘度を測定し、続くＤＬＳ測定の際に考慮に入れる。）。より高いタンパク質濃度の全ての試料に対して、粘度を測定し、ＤＬＳ測定中に考慮に入れた。
（実施例２）
高ＴＮＦα抗体濃度を含む製剤
２．１：透析ろ過
透析ろ過前に、アダリムマブ（４９．６８ｍｇ／ｍＬ）を注射用水でおよそ１５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。従って、１４０．８ｍＬアダリムマブ溶液（４９．６８ｍｇ／ｍＬ）を５００ｍＬ容量フラスコに入れた。このフラスコに較正目盛まで注射用水を入れた。この容量フラスコを閉じ、溶液を均質化するために穏やかに振盪した。ＴＦＦ Ｌａｂｓｃａｌｅシステムを水で洗い流した。次に、膜（ＰＥＳ）を適合させ、これも１Ｌの蒸留水で洗い流した。次に、ＴＦＦ Ｌａｂｓｃａｌｅシステム及び膜を注射用水およそ３００ｍＬで洗い流した。次に、希釈したアダリムマブ溶液をＴＦＦのリザーバーに入れた。浸透圧測定（３００μＬ）、ＵＶ分光光度計（５００μＬ）用の試料及びＳＥＣ分析（１２０μＬ）用の試料を採取した。このシステムを閉じ、透析ろ過を開始した。５体積交換の後、及び３ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧値に到達した後、ＤＦ／ＵＦ（透析ろ過／限外ろ過）を終了した。透析ろ過後のアダリムマブ溶液のｐＨ値はｐＨ５．２５であった。
次のパラメータを適用することによって、ＴＦＦ装置での透析ろ過を行った。
−撹拌機：ポジション２
−ポンプ：ポジション２
−圧力 上流／インレット：最大２０−３０ｐｓｉ
−圧力 下流／アウトレット：最大１０ｐｓｉ
透析ろ過後、ＯＤ２８０によりタンパク質濃度を評価した。濃度を測定したところ、１３．２９ｍｇ／ｍＬであった。
アダリムマブ溶液をろ過滅菌した。
ＴＦＦ及び膜をおよそ１Ｌの蒸留水で、次いで５００ｍＬの０．１Ｎ ＮａＯＨで洗い流した。この膜を０．１Ｍ ＮａＯＨ中で保存し、およそ５００ｍＬの蒸留水でＴＦＦを再び洗い流した。
２．２：タンパク質濃度
抗体を濃縮する前に、ＯＤ２８０によりタンパク質濃度を再び評価した。アダリムマブ濃度を測定したところ、１３．３ｍｇ／ｍＬであった。次に、アダリムマブ溶液を１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。アダリムマブ溶液（１３．３ｍｇ／ｍＬ）３７５．９４ｍＬを５００ｍＬ容量フラスコに入れ、フラスコに較正目盛まで注射用水（ＷＦＩ）を入れた。アダリムマブ溶液（１３．３ｍｇ／ｍＬ）７５．１９ｍＬもまた１００ｍＬ容量フラスコに入れ、較正目盛まで純水、即ち注射用水（ＷＦＩ）を入れた。均質化するために両フラスコを穏やかに振盪した。両フラスコからの溶液を１Ｌ ＰＥＴＧボトルに入れた。均質化するためにこのボトルを穏やかに振盪した。
４個のＶｉｖａｓｐｉｎ ２０濃縮装置（１０ｋＤａ）を使用した。３個のＶｉｖａｓｐｉｎに、アダリムマブ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）２０ｍＬを（それぞれ）入れた。４個目のＶｉｖａｓｐｉｎ装置には、遠心中の平衡錘として水を入れた。濃縮装置を閉じ、遠心機に入れた。４５００ｘｇの遠心力をかけて（スイングアウト型ローター中で）アダリムマブ溶液を遠心した。
２．３：試料採取
濃縮アダリムマブ溶液の濃度が１０ｍｇ／ｍＬに到達した際及びそれぞれ続いて１０ｍｇ／ｍＬ濃度ずつ上昇した際に（２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬなど、およそ２００ｍｇ／ｍＬまで）、この試料を採取した。４０分間隔で、濃縮装置を遠心機から取り出し、溶液を均質化し、溶液及び遠心アダプターをおよそ１０分間氷中で冷却した。１０ｍｇ／ｍＬずつ濃度が上昇した後ごとに、、濃縮装置中の溶液を均質化し、視覚的な様相を調べ、ＵＶ（３００μＬ）、ＰＣＳ（１６０μＬ）、ＳＥＣ（１２０μＬ）及びＩＥＣ（３００μＬ）による分析のために試料を採取した。試料採取後、濃縮装置におよそ２０ｍＬまでアダリムマブ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を入れた。
溶液中のアダリムマブタンパク質（即ちアイソフォーム）の溶解限度を調べるために、タンパク質沈殿の目視及びＰＣＳ分析を用いた。
およそ８０ｍｇ／ｍＬの濃度において、アダリムマブ溶液はもはや乳白光がないことが明らかになった（乳白光は、大量の断片があるアダリムマブ溶液の既知の特徴である。）。従って、実験遂行中に断片化が起こり得た疑いがあった。さらなる分析のために、ＳＥＣによってアダリムマブ溶液（およそ８０ｍｇ／ｍＬ）の試料を分析した。各Ｖｉｖａｓｐｉｎ中の溶液の残り、ならびにアダリムマブ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）の残りを取り出し、５０ｍＬファルコンチューブに移し、−８０℃で保存した。ＳＥＣ分析から、９９．６％の単量体の純度が示された。
この溶液を２５℃の水浴中で融解し、ろ過滅菌した。その後、３本のファルコンチューブからの溶液を各Ｖｉｖａｓｐｉｎに入れた。濃縮装置におよそ２０ｍＬまで入れ、濃縮を続けた。およそ２００ｍｇ／ｍＬの濃度に到達したところでこの実験を終了した。
さらなる分析まで、全てのＳＥＣ及びＩＥＣ試料を−８０℃で保存した。試料採取後、ＵＶ及びＰＣＳを直接測定した。濃縮アダリムマブ溶液の残りをエッペンドルフ容器に入れ、−８０℃で保存した。
下記で示される表７は、アダリムマブ溶液を濃縮する間に濃縮装置に再充填すべきタンパク質溶液の体積の計算を記載する。どの程度の体積の試料を採取すべきかを決定するために、実験遂行前にスキームを計算した。遠心の持続時間は表８で示す。
表７：遠心スキーム
Figure 0005840364
Figure 0005840364
アダリムマブの濃縮からの結果はまた下記表１２で示す。
２．４：粘度測定
ＷＦＩ中の５０ｍｇ／ｍＬ又はＷＦＩ中の２００ｍｇ／ｍＬの何れかを含むアダリムマブ溶液の粘度を測定した。Ｇｅｍｉｎｉ １５０ ペルチェ・プレートレオメーター、Ｍａｌｖｅｒｎを用いてＷＦＩ中の５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬを測定し、ＷＦＩ溶液中の２００ｍｇ／ｍＬはまた、レオメーターＭＣＲ３０１［温度制御Ｐ−ＰＴＤ２００（ペルチェ・テンパーリング（Ｐｅｌｔｉｅｒ ｔｅｍｐｅｒｉｎｇ）付きプレート）］及びコーン／プレート測定系ＣＰ５０／１（ステンレス鋼）；Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ）でも測定した。
保存チューブ中のアダリムマブ溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を融解し、６Ｒバイアル中で均質化した。（５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ溶液に対する）希釈溶液を得るために、１ｍＬアダリムマブ（２００ｍｇ／ｍＬ）を３ｍＬ ＷＦＩで希釈した。
レオメーターＧｅｍｉｎｉ １５０の場合、およそ２ｍＬを必要とし、ＭＣＲ３０１の場合、測定に必要であるのは１ｍＬ未満であった。
Ｖｉｖａｓｐｉｎチューブを用いることにより、市販製剤中のアダリムマブ（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）を得た。このチューブに市販緩衝液中のアダリムマブ溶液を入れ、１９４ｍｇ／ｍＬの濃度に到達するまで遠心した。毛細管粘度計Ｓｃｈｏｔｔにより粘度を測定した。
２．５：要約
まとめると、４本の異なるチューブ中のＶｉｖａｓｐｉｎ ２０チューブで５０ｍｇ／ｍＬからおよそ１９４ｍｇ／ｍＬまでアダリムマブを濃縮した。初めに、アダリムマブ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）２０ｍＬが各チューブ（４本）に入っていた。濃縮終了時に、アダリムマブ溶液（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬが各チューブに入っていた。５０００ｒｐｍ（およそ４５００ｇ）でこの濃縮段階を行った。１時間ごとに、楕円ビーカー及びＶｉｖａｓｐｉｎチューブ中のタンパク質溶液を砕いた氷の中でおよそ１０から１５分間冷却した。密度測定装置ＤＭＡ４５００、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒで密度を測定した。高アダリムマブ濃度製剤のさらなる分析は実施例５から１１で与える。
（実施例３）
高濃度ＩＬ−１２抗体を含む製剤
３．１：透析ろ過
透析ろ過前に、およそ１５ｍｇ／ｍＬの濃度まで、ＩＬ−１２抗体Ｊ６９５（５４ｍｇ／ｍＬ）を注射用水で希釈した。５００ｍＬ容量フラスコ中に１５０ｍＬのＪ６９５溶液（５４ｍｇ／ｍＬ）を入れ、注射用水を較正目盛までフラスコに入れることによって、この希釈を行った。容量フラスコを閉じ、溶液の均質化のために振盪した。ＴＦＦ Ｌａｂｓｃａｌｅシステムを水で洗い流した。次に、ポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳ）を付け、また蒸留水１Ｌで洗い流した。その後、ＴＦＦ Ｌａｂｓｃａｌｅシステム及び膜を注射用水およそ３００ｍＬで洗い流した。次に、希釈したＪ６９５溶液をＴＦＦのリザーバーに入れた。浸透圧測定のための試料（３００μＬ）、ＵＶ分光光度計（５００μＬ）及びＳＥＣ分析のための試料（１２０μＬ）を採取した。このシステムを閉じ、透析ろ過を開始した。ＤＦ体積２００ｍＬを処理した後、透析ろ過を停止し、ＵＶ測定のための別の試料を採取した。１８００ｍＬ透析ろ過体積（およそ係数（ｆａｃｔｏｒ）３．５体積交換）後、ＤＦ／ＵＦを停止し、浸透圧値は４ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの値に到達した。透析ろ過後のＪ６９５溶液のｐＨ値はｐＨ６．４８であった。
次のパラメータを適用することにより、ＴＦＦ装置での透析ろ過を行った。
−撹拌機：ポジション２
−ポンプ：ポジション２
−圧力 上流／インレット：最大２０−３０ｐｓｉ
−圧力 下流／アウトレット：最大１０ｐｓｉ
透析ろ過後、ＯＤ２８０によりタンパク質濃度を評価した。
濃度を測定したところ、１６．６３ｍｇ／ｍＬであった。
Ｊ６９５溶液をろ過滅菌した。
ＴＦＦ機器及び膜を、蒸留水およそ１Ｌ、次いで５００ｍＬの０．１Ｍ ＮａＯＨで洗い流した。０．１Ｍ ＮａＯＨ中で膜を保存し、ＴＦＦを再び蒸留水およそ５００ｍＬで洗い流した。
３．２：濃縮
濃縮前に、Ｊ６９５溶液を１０ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｊ６９５溶液（１６．６３ｍｇ／ｍＬ）３１６ｍＬを５００ｍＬ容量フラスコに入れ、このフラスコに較正目盛まで注射用水（ＷＦＩ）を入れた。さらに、Ｊ６９５溶液（１６．６３ｍＬ）６４ｍＬを１００ｍＬ容量フラスコに入れ、ＷＦＩを較正目盛まで入れた。均質化のために両フラスコを穏やかに振盪した。両フラスコからの溶液を１Ｌ ＰＥＴＧボトルに入れた。均質化のためにこのボトルを穏やかに振盪した。
４個のＶｉｖａｓｐｉｎ ２０濃縮装置（１０ｋＤａカットオフ）を使用した。３個の各Ｖｉｖａｓｐｉｎに、Ｊ６９５溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を入れた。４個目のＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置には、遠心中の平衡錘として水を入れた。濃縮装置を閉じ、遠心機に入れた。４５００ｘｇ遠心力をかけて（スイングアウト型ローター中で）Ｊ６９５溶液を遠心した。
３．３：試料採取
濃縮Ｊ６９５溶液の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ濃度に到達した際及びそれぞれ続く１０ｍｇ／ｍＬ濃度ずつ上昇した際に（２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬなど、２００ｍｇ／ｍＬまで）、この試料を採取した。４０分間隔で、濃縮装置を遠心機から取り出し、溶液を均質化し、溶液及び遠心アダプターをおよそ１０分間氷中で冷却した。１０ｍｇ／ｍＬずつ濃度が上昇した後ごとに、濃縮装置中の溶液を均質化し、視覚的な様相を調べ、ＵＶ（３００μＬ）、ＰＣＳ（１６０μＬ）、ＳＥＣ（１２０μＬ）及びＩＥＣ分析（３００μＬ）に対して試料を採取した。試料採取後、濃縮装置におよそ２０ｍＬまでＪ６９５溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を入れた。
Ｊ６９５の、溶解度（即ち、潜在的な沈殿を調べるために）及び安定性を調べるために、目視及びＰＣＳ分析を使用した。
実験の終了時、およそ２００ｍｇ／ｍＬの濃度に到達した。
さらなる分析（下記参照）のために、全てのＳＥＣ及びＩＥＣ試料を−８０℃で保存した。各試料採取後、ＵＶ分光光度法及びＰＣＳ測定を直接行った。濃縮Ｊ６９５溶液の残りをエッペンドルフ容器に入れ、−８０℃で保存した。
遠心スキームに関する詳細は上記表７で与える。Ｊ６９５遠心の持続時間は表９で与える。
表９：Ｊ６９５溶液を濃縮するために使用される遠心時間
Figure 0005840364
３．４：Ｊ６９５の流体力学直径における賦形剤の影響
この実験において、Ｊ６９５の流体力学直径における塩化ナトリウム及びマニトールの影響を個別に分析した。このために、塩化ナトリウム（１２ｍｇ／ｍＬ）及びマニトール（１２０ｍｇ／ｍＬ）の原溶液を調製した。ビーカー中で１．２ｇのＮａＣｌを秤量した。これにＷＦＩおよそ７０ｍＬを入れ、ビーカー中でマニトール１２．００２ｇを秤量し、このビーカーにＷＦＩおよそ７０ｍＬを入れた。均質化するためにこの２種類の溶液を撹拌した。各溶液を容量フラスコに入れ、較正目盛までＷＦＩを入れた。均質化するためにこのフラスコを穏やかに振盪した。
Ｊ６９５溶液（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）およそ８ｍＬを３７℃で融解した。この溶液を１０Ｒバイアルに入れて均質化した。７本の２Ｒバイアルにそれぞれ５００μＬ Ｊ６９５溶液（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）を入れた。下記表１０で充填スキームを述べる。
表１０：ＮａＣｌ又はマニトールの様々な濃度を含有するＪ６９５溶液の調製のための充填スキーム
Figure 0005840364
２Ｒバイアルを振盪により穏やかに均質化した。その後、様々なＪ６９５溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）の、ＰＣＳ及び浸透圧測定を行った。
ＰＣＳ分析用の試料を調製するために、キュベットを最初に試料５０μＬで洗い流した。次に、試料１００μＬを用いて測定を行った。
実施例５から１１において、Ｊ６９５高濃度製剤のさらなる分析を提供する。
（実施例４）
高濃度ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）製剤
４．１：透析ろ過
透析ろ過前に、１５．２９ｍｇ／ｍＬの濃度まで、ＨＳＡ溶液（２００ｍｇ／ｍＬ、市販製剤）を注射用水で希釈した。これを行うために、３８ｍＬ ＨＳＡ（２００ｍｇ／ｍＬ）を５００ｍＬ容量フラスコに入れた。このフラスコに較正目盛まで注射用水を入れた。この容量フラスコを閉じ、溶液の均質化のために穏やかに振盪した。ＴＦＦ Ｌａｂｓｃａｌｅシステムを水で洗い流した。次に、膜（再生セルロース）を付け、これをまた蒸留水１Ｌで洗い流した。その後、ＴＦＦ Ｌａｂｓｃａｌｅシステム及び膜をおよそ３００ｍＬの注射用水で洗い流した。次に、希釈したＨＳＡ溶液をＴＦＦのリザーバーに入れた。浸透圧測定用の試料（３００μＬ）、ＵＶ分光光度計（５００μＬ）及びＳＥＣ分析（１２０μＬ）用の試料を採取した。このシステムを閉じ、透析ろ過を開始した。体積およそ３００ｍＬの透析ろ過後、透過液のＵＶ測定を行った。透過液から２．７４ｍｇ／ｍＬの濃度が明らかとなり、このことから、タンパク質が膜を通過していたことが示された。ＤＦおよそ５００ｍＬ後に透析ろ過を停止し、ＵＶ測定用の別の試料を採取した（ＨＳＡ濃度１１．０３ｍｇ／ｍＬ）。透析ろ過体積９５０ｍＬ（およそ２体積交換）後及び浸透圧値が４ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇに達した後、ＤＦ／ＵＦを終了した。透析ろ過後のＨＳＡ溶液のｐＨ値はｐＨ７．１３であった。
透過液のＵＶ分光光度計測定を３回行った（ｎ＝３）。
次のパラメータを適用することにより、ＴＦＦ装置による透析ろ過を行った。
−撹拌機：ポジション２
−ポンプ：ポジション２
−圧力 上流／インレット：最大２０−３０ｐｓｉ
−圧力 下流／アウトレット：最大１０ｐｓｉ
透析ろ過後、ＯＤ２８０によりタンパク質濃度を評価した。濃度を測定したところ、９．４１ｍｇ／ｍＬであった。
ＨＳＡ溶液をろ過滅菌した。ＴＦＦ及び膜を蒸留水およそ１Ｌで洗い流した。その後、完全性試験を行った（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭＴＦＦシステム、ｐ．５−３から５−５、１９９７参照）。体積流量は１．２ｍＬ／分であり、従って、完全性試験を通過した（許容可能な最大限度３ｍＬ／分）。膜をもう１度蒸留水５００ｍＬで洗い流し、次いで０．０５Ｍ ＮａＯＨ ５００ｍＬで洗い流した。０．０５Ｍ ＮａＯＨ中で膜を保存し、ＴＦＦを蒸留水およそ５００ｍＬで再び洗い流した。
４．２：濃縮プロセス
ＨＳＡタンパク質溶液を濃縮する前に、ＯＤ２８０により濃度を評価し、測定したところ、９．５２ｍｇ／ｍＬであった。４本のＶｉｖａｓｐｉｎ ２０濃縮装置（１０ｋＤａ）を使用した。ＨＳＡ溶液（９．５２ｍｇ／ｍＬ）２０ｍＬを３本のＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置のそれぞれに入れた。４個目のＶｉｖａｓｐｉｎ装置に、遠心中の平衡錘として水を入れた。濃縮装置を閉じ、遠心機に入れた。４５００ｘｇ遠心力をかけて（スイングアウト型ローター中で）ＨＳＡ溶液を遠心した。
４．３：試料採取
濃縮ＨＳＡ溶液の濃度が１０ｍｇ／ｍＬに到達した際及びそれぞれ続き１０ｍｇ／ｍＬ濃度ずつ上昇した際に（２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬなど、およそ１８０ｍｇ／ｍＬまで）、この試料を採取した。４０分間隔で、濃縮装置を遠心機から取り出し、溶液を均質化し、溶液及び遠心アダプターをおよそ１０分間氷中で冷却した。１０ｍｇ／ｍＬずつ濃度が上昇した後ごとに、濃縮装置中の溶液を均質化し、視覚的な様相を調べ、ＵＶ（３００μＬ）、ＰＣＳ（１６０μＬ）、ＳＥＣ（１２０μＬ）及びＩＥＣ（３００μＬ）による分析のために試料を採取した。試料採取後、濃縮装置におよそ２０ｍＬまでＨＳＡ溶液（９．５２ｍｇ／ｍＬ）を添加した。
濃縮装置中のＨＳＡ溶液に対する予測濃度がおよそ２０ｍｇ／ｍＬに到達した際に、ＯＤ２８０により透過液を測定し、０．５９６４ｍｇ／ｍＬの濃度であることが分かった。ＨＳＡ溶液の濃度はわずか１５．９９ｍｇ／ｍＬであり、これは予想よりも低かった。断片化の可能性について調べるために、ＳＥＣによりＷＦＩ中の濃縮ＨＳＡの試料（１０ｍｇ／ｍＬ）を分析した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ中のＨＳＡ溶液（１５．９９ｍｇ／ｍＬ）をファルコンチューブに入れ、−８０℃で保存した。濃縮装置を満たすために使用した元のＨＳＡ溶液（９．５２ｍｇ／ｍＬ）の残りもまた−８０℃で保存した。
膜を通過し得る小さな断片を生じるＨＳＡタンパク質の分解が起こるか否かを調べるために、ＳＥＣ分析を行った。しかし、ＳＥＣ分析から、実質的に断片はなく、ＷＦＩ中の１０ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡに対して９２．４５％の単量体量であることが分かった。
−８０℃で保存された溶液を２５℃で融解し、ろ過滅菌した。ファルコンチューブ中の溶液を１個のＶｉｖａｓｐｉｎ ２０濃縮容器（３ｋＤａカットオフ）にそれぞれ移した。ＶｉｖａｓｐｉｎにＨＳＡ溶液（９．５２ｍｇ／ｍＬ）を入れ、遠心した（上述の３．２濃縮プロセス参照）。
ＨＳＡの溶解限度を調べるために、目視及びＰＣＳ分析を使用した。
実験終了時に、およそ１８０ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡの濃度に到達した。
さらなる分析まで、全てのＳＥＣ及びＩＥＣ試料を−８０℃で保存した。試料採取後、ＵＶ及びＰＣＳ測定を直接行った。濃縮ＨＳＡ溶液の残りをエッペンドルフ容器に入れ、−８０℃で保存した。
遠心スキームの概略は上記表７で述べる。ＨＳＡを濃縮するために使用される遠心持続時間は表１１で述べる。
表１１：ＨＳＡ溶液を濃縮するために必要な遠心時間
Figure 0005840364
４．４：ＨＳＡの流体力学直径におけるｐＨ値の影響
タンパク質がＷＦＩ中で溶解される場合の、ＨＳＡの流体力学直径におけるｐＨの潜在的影響を評価するために、実験の次の部分を行った。４個の６Ｒバイアルに５．０９ｍＬのＨＳＡ溶液（９．８３ｍｇ／ｍＬ）を入れ、１Ｍ ＨＣｌで３から６のｐＨ値に設定した（実際のｐＨ：３．０４、３．９９、５．０５、６．０１）。別個の１０ｍＬ容量フラスコにこれらの溶液をそれぞれ移した。次にこれらのフラスコを較正目盛まで満たし、均質化のために穏やかに振盪した。
１０ＲバイアルにＨＣｌ溶液を入れ、ＰＣＳにより分析した。この溶液をろ過滅菌し、ＰＣＳにより再び測定した。また、５．０９ｍＬのＨＳＡ溶液（９．８３ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＬ容量フラスコに移し、これに較正目盛までＷＦＩを入れた。均質化のためにこのフラスコを穏やかに振盪し、次いで溶液をろ過滅菌し、ＰＣＳにより測定した。
ＰＣＳ測定のための試料調製：
キュベットを試料５０μＬで洗い流した。試料体積１００μＬを用いて測定を行った。
４．５：粘度測定
市販製剤中のＨＳＡ（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して及びＷＦＩ中のＨＳＡ（およそ１８０ｍｇ／ｍＬ）に対して、毛細管粘度計（Ｓｃｈｏｔｔ、ＭＰ−Ｎｏ．３３．２）で粘度を測定した。
市販製剤のＨＳＡの５０ｍＬボトルから１５ｍＬアリコートを採取した。ＷＦＩ中のＨＳＡをおよそ２０℃で融解し、およそ９ｍＬをファルコンチューブに分注した。密度測定装置ＤＭＡ４５００、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒで密度を測定した。
実施例５から１１において高ＨＳＡ濃度製剤のさらなる分析を示す。
（実施例５）
高タンパク質製剤の分析−視覚的な様相
市販製剤中のアダリムマブとは対照的に、ＷＦＩ中のアダリムマブは、乳白光が見られなかった。Ｊ６９５もまた、ＷＦＩ中で溶解された場合、何ら乳光現象は見られなかった。アダリムマブのタンパク質濃度がＷＦＩ中で８０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬであったという事実にもかかわらず、実際に乳白光は観察されなかった。一方、５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブを含む市販製剤から、市販製剤において顕著な乳白光が見られた。従って、溶解媒体としての純水即ちＷＦＩの使用は、タンパク質溶液の乳白光に好ましい効果があった。
（このような高タンパク質濃度で可溶性であることに加えて）ＷＦＩ中のアダリムマブは、２００ｍｇ／ｍＬなどのより高い濃度でも低粘度であると思われることは驚くべき観察であった。
濃度に依存して、ＨＳＡ溶液の光学的特性／色は、透明で僅かに黄色（ＷＦＩ中１０ｍｇ／ｍＬ）から透明で黄色に変化した（ＷＦＩ中およそ１８０ｍｇ／ｍＬ）。
濃縮プロセス中、アダリムマブ溶液及びＨＳＡ溶液に対して沈殿は観察されなかった。沈殿は溶解限度に対する指標となろう。実験が終了するまで、この溶液は透明なままであった。潜在的な溶解限度が近づいたので実験を終了したのではなく、濃縮装置中に残存する溶液体積が濃縮を進めるのに十分ではなかったので、この実験を終了した（即ち材料不足）ことを強調したい。アダリムマブ、Ｊ６９５及びＨＳＡの溶解限度が２２０ｍｇ／ｍＬをはるかに上回る可能性が非常に高いと思われる。
Ｊ６９５溶液において、濃縮装置中で高濃度溶液を一晩２−８℃で保存した場合（およそ１２０ｍｇ／ｍＬ）、沈殿様の結晶が観察された。沈殿のような結晶は、溶液を周囲温度で保存した場合、およそ３−５分後に再溶解した。従って、純水中で高濃度のＪ６９５を溶解することによって生じる環境により、単なる温度サイクル（例えば、周囲温度から２−８℃）によってタンパク質結晶化が起こり得る状態がもたらされる。
（実施例６）
高タンパク質製剤の分析−タンパク質濃度
タンパク質濃度の計算は、上記材料及び方法セクションで示す。
純水、高タンパク質製剤へのアダリムマブ、Ｊ６９５及びＨＳＡの濃縮のまとめは下記表１２−１４で示す。
表１２：濃縮プロセス中にＯＤ２８０により評価した場合のアダリムマブの濃度
Figure 0005840364
Figure 0005840364
Figure 0005840364
Figure 0005840364
Figure 0005840364
表１４ａ及び１４ｂ：濃縮プロセス中にＯＤ２８０により評価した場合のＨＳＡの濃度
Figure 0005840364
Figure 0005840364
評価した３種類のタンパク質は全て、評価される濃度範囲（即ちアダリムマブ及びＪ６９５に対して＞２００ｍｇ／ｍＬ、ＨＳＡに対して＞１７５ｍｇ／ｍＬ）で可溶性のままであった。不溶性の兆候（例えば、溶液中で混濁現象又は沈殿などが生じること）は観察されなかった。アダリムマブの場合、この結果から、評価した濃度範囲にわたり、沈殿は全く生じなかったので、全てのアダリムマブのアイソフォーム（即ちリジン変異体）は可溶性のままであったことが示された。この観察は、実施例１１（これは、アダリムマブ濃度に関わらず、リジン変異体の集合体（ｓｕｍ）が実質的に一貫したままであったことを記載する。）で記載される、イオン交換クロマトグラフィーデータとも一致する。
（実施例７）
高タンパク質製剤の分析−粘度
７．１：アダリムマブ粘度
注射用水中のアダリムマブ（およそ５０ｍｇ／ｍＬ）の粘度を調べたところ、１．５−２ｍＰａｓ前後であった。ＷＦＩ中のアダリムマブ（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、２種類の値を調べた。Ｍａｌｖｅｒｎ（Ｇｅｍｉｎｉ１５０）からのコーン／プーレートレオメーターで測定した一方の値はおよそ６−６．５ｍＰａｓであり、他方の値（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、ＭＣＲ３０１からのコーン／プレートレオメーターで測定）はおよそ１２ｍＰａｓであった。
アダリムマブ市販製剤（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）粘度：
Ｋ−毛細管の定数
ｔ−毛細管を通過するために溶液が必要とする時間［ｓ］
ｖ−動粘性率
η−動的粘度
ｐ−密度
Figure 0005840364
ＷＦＩ中のアダリムマブの粘度（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）を測定したところ、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒからの粘度計でおよそ１２ｍＰａｓであり、Ｍａｌｖｅｒｎからの粘度計で測定するとおよそ６ｍＰａｓであった。一方、市販製剤中のアダリムマブ（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）の粘度はより高く、９．３０８ｍＰａｓであった（Ｓｃｈｏｔｔからの毛細管粘度計で測定）。
７．２：ヒト血清アルブミン粘度
ＨＳＡ市販製剤（およそ２００ｍｇ／ｍＬ）粘度：
Ｋ−毛細管の定数
ｔ−毛細管を通過するために溶液が必要とする時間［ｓ］
ｖ−動粘性率
η−動的粘度
ｐ−密度
Figure 0005840364
ＷＦＩ中のＨＳＡ（およそ１８０ｍｇ／ｍＬ）粘度：
Ｋ−毛細管の定数
ｔ−毛細管を通過するために溶液が必要とする時間［ｓ］
ｖ−動粘性率
η−動的粘度
ｐ−密度
Figure 0005840364
ＷＦＩ中のＨＳＡ（およそ１８０ｍｇ／ｍＬ）の粘度を測定したところ、およそ１９．１２１ｍＰａｓであった。市販製剤中のＨＳＡ（およそ１９４ｍｇ／ｍＬ）の粘度を測定したところ、９．３０８ｍＰａｓ（Ｓｃｈｏｔｔからの毛細管粘度計で測定）であった。
７．３：アダリムマブ及びＨＳＡの粘度の分析
ＷＦＩ中のアダリムマブ５０ｍｇ／ｍＬの動的粘度は、それぞれＷＦＩ中及び市販緩衝液中のアダリムマブ２００ｍｇ／ｍＬの粘度よりも低い。ＨＳＡの場合、ＷＦＩ中の１８０ｍｇ／ｍＬの濃度に対する動的粘度は、市販緩衝液中の２００ｍｇ／ｍＬの濃度に対するものよりも約６倍高い。従って、溶解媒体としての純水によりもたらされる影響による粘度変化の強度（即ちそれぞれ上昇及び低下）は、個々のタンパク質に依存し得ると思われる。
（実施例８）
高タンパク質製剤の流体力学直径の分析−光子相関分光法（ＰＣＳ）
次の実施例は、本発明のＤＦ／ＵＦ法を用いて得られる水性製剤中の様々なタンパク質の流体力学直径（Ｄｈ）（平均流体力学的分子直径のｚ−平均）の分析を提供する。
８．１：アダリムマブ流体力学直径
図５及び６で示されるように、アダリムマブ濃度の上昇とともに流体力学直径（Ｄｈ）が拡大するという傾向が観察され得る。図５は、ＷＦＩ中のアダリムマブの流体力学直径（ｚ−平均）と濃度との間の相関を示す。図６は、ＷＦＩ中のアダリムマブの流体力学直径（ピーク単量体）と濃度との間の相関を示す。
流体力学直径測定に対する標準実施要領（ＳＯＰ）においてなされた仮定のために、３４．２０ｍｇ／ｍＬの試料と比較して２３．２７ｍｇ／ｍＬの試料から測定されたＤｈの間に差が存在する。≦２３．２７ｍｇ／ｍＬの濃度のアダリムマブ試料に対して、試料の粘度に対して１．１ｍＰａｓの値を仮定するＳＯＰを用いてＰＣＳ測定を行った。≧３４．２０ｍＰａｓのアダリムマブ試料に対して、１．９ｍＰａｓ試料粘度を仮定するＳＯＰを使用した。ＰＣＳデータは試料検体の不規則なブラウン運動（試料粘度により影響を受ける。）に基づくので、ＰＣＳデータは、試料溶液のある一定の粘度により強い影響を受けることが知られている。従って、タンパク質濃度上昇に伴い流体力学直径が増大することは、タンパク質濃度の上昇により溶液の粘度が上昇する（粘度が高くなると、ブラウン運動が低下し、Ｄｈデータ計算値が大きくなる。）というように説明され得る。タンパク質分子の不規則なブラウン運動が低下し、従って、ある一定の粘度に対して試料検体の流体力学直径を計算すると高くなる。全体的に、ｚ−平均に基づくＤｈ値及び単量体のＤｈ値はよく一致する。さらに、濃度の上昇とともに、タンパク質不溶性を示唆するＤｈの拡大は観察されない（即ち高分子量凝集体及び沈殿（あるならば）により、実質的なＤｈの拡大が誘導される。）。
８．２：Ｊ６９５流体力学直径
図７及び８は、Ｊ６９５の流体力学直径が、１１４．５２ｍｇ／ｍＬ濃度に到達するまで、タンパク質濃度とは比較的独立であったことを示す。１１４．５２ｍｇ／ｍＬから１３３．２５ｍｇ／ｍＬにＪ６９５濃度が上昇することによって、Ｄｈの急速な拡大が誘導された。２１７．５３ｍｇ／ｍＬの濃度での流体力学直径は、１１４．５２ｍｇ／ｍＬでの流体力学直径よりも大きかった。この所見は、実際にタンパク質濃度が上昇するにつれて粘度が上昇した場合、同じＳＯＰ（１．９ｍＰａｓの同じ粘度を仮定）を用いて両方のタンパク質溶液を測定したので、驚くことではなかった。従って、１１４．５２ｍｇ／ｍＬから１３３．２５ｍｇ／ｍＬへの大幅な上昇は、アーチファクトと説明され得る。
８．３：ヒト血清アルブミン流体力学直径
９．８８ｍｇ／ｍＬから１１２．７４ｍｇ／ｍＬに濃度が上昇した場合、ＷＦＩ中のＨＳＡの流体力学直径が縮小することが分かった。しかし、１１２．７４ｍｇ／ｍＬから１７７．６９ｍｇ／ｍＬまでは、流体力学直径が拡大することが分かった。
ＨＳＡは、基本的な理論的原理と一致してタンパク質濃度が上昇するにつれて、流体力学直径（ピーク単量体）が拡大するという全般的な傾向を示した。９．８８ｍｇ／ｍＬから２２．８９ｍｇ／ｍＬでのＤｈの縮小は、測定ＳＯＰの変更（１．１ｍＰａｓの仮定粘度から１．９ｍＰａｓの仮定粘度に変更）によるものである。
上記を示す数値データは付録Ａで示す。
（実施例９）
Ｊ６９５：流体力学直径の賦形剤の影響
純水中で高濃度でタンパク質が溶解され得るという驚くべき結果が分かったので、流体力学直径における、非経口製剤で通常使用されるイオン化及び非イオン化賦形剤の影響を評価した。モデルタンパク質としてＪ６９５を使用した。
表１５は、溶液浸透圧が塩化ナトリウム濃度に対して正比例することを示す。タンパク質溶液における浸透圧は、ＮａＣｌ濃度とともに上昇する（殆ど線形相関）。興味深いことに、Ｊ６９５タンパク質の流体力学直径は、塩濃度上昇とともに拡大した。ＮａＣｌは、イオン性賦形剤であり、正荷電ナトリウムイオン及び、タンパク質表面に吸着し得る負荷電塩素イオンに解離する。塩が存在しない場合、Ｊ６９５の流体力学直径は、Ｊ６９５に対して通常予想されるものよりも劇的に小さかった（通常、１０ｎｍ前後の値が測定される。）。
表１５で示されるように、浸透圧は、タンパク質溶液中のマニトール濃度の上昇とともに直線的に上昇した。一方、流体力学直径は、マニトール濃度への依存は示さなかった。マニトールは、非イオン性の糖アルコール／ポリオールである。マニトール又はポリオールは、非経口製剤開発中及び最終的処方中に安定化剤として使用される。マニトールは、選択的排除により、タンパク質を安定化する。その他の浸透圧調節物質として、マニトールは選択的にタンパク質表面から排除され、タンパク質の水和殻（ｈｙｄｒａｔｅ ｓｈｅｌｌ）の外側にある。従って、表面がより大きい非折り畳み状態は熱力学的にあまり好ましくなくなるので、タンパク質の折り畳み状態が安定化される（Ｆｏｓｔｅｒ、Ｔ．Ｍ．、Ｔｈｅｒｍａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＩＩＩ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｔｓ、ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ Ｔｗｅｅｎ８０、１３４ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １９３（１９９６）；Ｓｉｎｇｈ、Ｓ．及びＳｉｎｇｈ、Ｊ．、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｍｏｄｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｓｏｚｙｍｅ、４ ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ、Ａｒｔｉｃｌｅ ４２（２００３））。しかし、浸透圧は、タンパク質のＤｈに影響を与えることなく、必要に応じて基本的に調整され得ることは興味深く、これは、本明細書中に記載のタンパク質の所見の重要な特徴である。これらの所見は、高濃度タンパク質製剤において有用であり得、マニトールでの浸透圧調整にはタンパク質Ｄｈの拡大が反映されないので（平均粘度は一定のままであると予想される。）、粘度に関連する製造及び投与の問題が存在し得る。
Figure 0005840364
（実施例１０）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）での高タンパク質製剤の分析
ＳＥＣ分析の場合、注入前にアダリムマブ、Ｊ６９５及びＨＳＡの試料を２ｍｇ／ｍＬに希釈した。アダリムマブに対する注入体積は２０μＬであった。Ｊ６９５及びＨＳＡの場合、１０μＬの注入体積を使用した。
１０．１：アダリムマブのＳＥＣ分析
９．３５ｍｇ／ｍＬから２０６．６３ｍｇ／ｍＬに濃縮される一方で、アダリムマブ単量体の量は、９９．４％から９８．８％に僅かに減少する傾向がある。この単量体の減少には、それぞれ、２３．２７ｍｇ／ｍＬから２０６．６２ｍｇ／ｍＬへの濃縮の一方で０．４％から１．１％のアダリムマブ溶液の凝集体量の増加が付随する。
断片の量は、タンパク質濃度と独立して、０．１％で一定のままであった（付録Ｂの表参照）。従って、アダリムマブはＷＦＩ中で安定であった。
全体的に、タンパク質濃度の上昇を伴うタンパク質凝集の増加は、ごく僅かとみなされる。何れかのタンパク質が緩衝系中で処方された場合及びさらに界面活性剤が添加される場合、単量体減少の同様の傾向が予想される。アダリムマブタンパク質は、純水中で処方される場合、驚くべきことに安定的であると思われる。
１０．２：Ｊ６９５のＳＥＣ分析
Ｊ６９５単量体の量は、９．９９ｍｇ／ｍＬから２１７．５３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の上昇に伴い、９９．４％から９８．６％に僅かに減少した。単量体の減少には、タンパク質濃度が９．９９ｍｇ／ｍＬから２１７．５３ｍｇ／ｍＬに上昇する一方で、約０．４％から約１．２％の凝集の増加が付随した。タンパク質濃度と独立して、断片の量は、タンパク質濃度が９．９９ｍｇ／ｍＬから２１７．５３ｍｇ／ｍＬに上昇する一方で、０．１７％から０．２３％と殆ど一定であった。
全体的に、タンパク質濃度上昇に伴うタンパク質凝集の増加は、ごく僅かであると見なされた。タンパク質が緩衝系で処方される場合及びさらなる界面活性剤が添加される場合、単量体減少の同様の傾向が予想される。従って、Ｊ６９５タンパク質は、純水中で処方される場合、驚くべきことに安定的であると思われる。
１０．３：ＨＳＡのＳＥＣ分析
単量体ＨＳＡの量は、９．８８ｍｇ／ｍＬから１１２．１ｍｇ／ｍＬへの濃縮と同時に、９５．９％から９２．７５％に減少した。１７７．６９ｍｇ／ｍＬの試料の場合、最大で９４．５％単量体が増加することが分かった。単量体量の減少には、９．８８ｍｇ／ｍＬから１１２．７４ｍｇ／ｍＬへの濃縮の一方で、４．１％から７．２５％のタンパク質凝集体の増加が付随する。従って、ＨＳＡタンパク質もまた、純水中で処方される場合、安定であると思われる。
上述のＳＥＣ実験を示す数値データは付録Ｂで与える。
（実施例１１）
高タンパク質製剤の分析−イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
ＩＥＣ分析の場合、注入前に、アダリムマブ、Ｊ６９５及びＨＳＡの試料を１ｍｇ／ｍＬに希釈した。全てのタンパク質に対する注入体積は１００μＬであった。
１１．１：アダリムマブのＩＥＣ分析
図９で示されるように、アダリムマブはＷＦＩ中で安定であった。図９は、ＷＦＩ中のアダリムマブ濃度上昇に伴い、リジン変異体の集合体（リジン０、１及び２）が減少することを示すように解釈され得る僅かな傾向を示す。しかし、全体的に、リジン変異体の％の変動は０．２５％未満であった。
１１．２：Ｊ６９５のＩＥＣ分析
図１０は、Ｊ６９５濃度の上昇とともに、Ｊ６９５ピーク１から７の合計が僅かに低下することを示す。ピーク１−７の低下とともに、酸性及び塩基性ピークの合計は僅かに上昇し、酸性ピークの上昇は僅かにより顕著である（図１１及び１２参照）。それぞれ、酸性ピークの合計はおよそ１０．２％から１０．６％に僅かに上昇し、塩基性ピークの合計は０．５２％から０．５９％に上昇する。
全体的に、純水中のＪ６９５製剤の主要な不安定効果又は不溶性効果はＩＥＣにより観察されなかったと言える。
上記のＩＥＣ実験を示す数的データは付録Ｃで提供される。
実施例２−１１の所見のまとめ
最初、抗体などのタンパク質をＷＦＩに移すことによって、純水中のその溶解限度を超えるタンパク質を濃縮することによるタンパク質沈殿が誘導されるようであると考えられた。上記研究から、抗体を含むタンパク質は、何ら沈殿現象及び溶解制限を起こすことなくより低濃度で純粋なＷＦＩに移され得るだけでなく、驚くべきことに、アダリムマブ（ならびにその他の２種類の試験タンパク質）が、ＵＦ／ＤＦ及び遠心技術（例えば、ＴＦＦ装置、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置）を用いて２００ｍｇ／ｍＬを超える超高濃度まで、純水中で濃縮され得ることが示される。さらに、タンパク質がＷＦＩ中で処方された場合、予想外にアダリムマブ乳白光が実質的に低下することが分かった。アダリムマブ緩衝液が純粋な塩不含水（即ちＷＦＩ）により完全に変換されたことを確認するために、浸透圧を監視した。さらに、分析のための試料調製中に凍結融解処理を行い、実質的には、ＳＥＣ及びＩＥＣ分析により不安定現象は観察されなかった。
ＷＦＩ中の高濃度での、例えばアダリムマブなどのタンパク質を処方する方法から、粘性現象（高タンパク質濃度で直接的な製剤開発を妨げることが多い。）を減弱させる可能性が明らかになった。
最後に、アダリムマブの流体力学直径（光子相関分光法、ＰＣＳを介して測定）は、市販緩衝液中よりもＷＦＩ中で顕著に小さいことが分かった（低粘性傾性の指標）。
全体的に、例えば、
−高濃縮タンパク質製剤の乳白光を低下させることにより、
−高濃縮タンパク質製剤の粘度を低下させることにより、
−粘度及び非乳白光性などの特性を変化させることなくマニトールなどの非イオン性賦形剤を添加することによってタンパク質−ＷＦＩ溶液で所望されるように浸透圧を調整することができることにより（Ｊ６９５に対して、マニトールが添加された場合、流体力学直径及び乳白光性は変化しなかったが、ＮａＣｌを添加した場合、劇的に上昇したことが示された。）、
−タンパク質が、実質的な安定性への影響なく、超高濃度になるようにＷＦＩ中でタンパク質を濃縮するためのＤＦ／ＵＦなどの操作及び凍結及び融解に共され得ることが示されたので、製剤原料処方及び処理における新しいパラダイムを提供することにより、
抗体及び球状モデルタンパク質ＨＳＡが超高濃度で純水中で可溶性であるという所見が、基本的なタンパク質計画への新しい識見を提供し、タンパク質薬物処方及び製造における新しいアプローチを潜在的に与える可能性があるというように結論付けられた。ＤＦ／ＵＦ中に、タンパク質製剤の組成物が、特に高濃度への処理中に、必ず変化することが周知であるという背景を仮定すると（Ｓｔｏｎｅｒ、Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｏｌｕｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ、９３ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２３３２（２００４））、これらの新しい所見は、純水中でのタンパク質のＤＦ／ＵＦにより製剤原料濃度を調整し、続いて高ＤＳ濃度で賦形剤を添加することによって、（これが、プロセス単位の操作中のＤＳ製剤の変化のリスクを回避することにより）有利に適用され得る。あるいは、製剤最終製品化（ｆｉｌｌ ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）中に、製剤原料に賦形剤が添加され得る。
（実施例１２）
水溶液製剤中のアダリムマブの調製
次の実施例は、ＤＦ／ＵＦ手順の拡大を示すが、この結果として水中のアダリムマブの大規模製造が可能となる。
１２．１：プロセスパラメータの評価
その他の賦形剤、例えば、マニトール及び塩化ナトリウムを含有するリン酸／クエン酸緩衝系中で処方されるバルクアダリムマブ薬物溶液の透析に対する適切なパラメータを定めるために、実験室規模で透析プロセス評価実験を行った（図１３及び１４）。
タンパク質溶液における伝導性分析に適切な何らかの市販の伝導度メーター、例えば、広いｐＨ範囲に対して拡大能力がある伝導度メーターＭｏｄｅｌ Ｓｅｖｅｎｍｕｌｔｉ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、伝導性測定を行い得る。製造者の説明書に従い、この装置を操作する（例えば、伝導度センサがＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ装置に変更される場合、各センサは異なるセル定数を有するので、較正を再び行わなければならない；Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｌ ＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉ伝導度メーターを参照）。説明書に従う場合、試料溶液に測定プローブを直接浸すことにより伝導度測定を行い得る。
図１３は、７４ｍｇ／ｍＬでアダリムマブを含有する製剤の浸透圧及び伝導度に関与する成分の減少に関して、透析手順の効率を示す。１００の係数による抗体溶液中の溶質の換算後、浸透圧及び伝導度測定は、市販製剤由来のこれらのパラメータの元の測定よりもはるかに低いレベルで非常によく安定した。
図１４は、透析されたアダリムマブバルク溶液中のｐＨの安定性を示す。最初のｐＨ読み取りが多岐にわたるアダリムマブ溶液に対して、脱イオン水に対する透析前後（１：１，０００，０００）のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルは、透析前後で保持液中でほぼ同じままであった。
１２．２：バルク薬物水溶液中の高濃縮アダリムマブの調製
第一段階で、処方されたバルク薬物溶液（その他の賦形剤、例えば、マニトール及び塩化ナトリウムを含有するリン酸／クエン酸緩衝系）を限外ろ過／透析ろ過により、およそ１００ｍｇ／ｍＬ（１２Ｌスケール、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ａ ＭＷＣＯ１０ｋカラム）の濃度まで濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）した。第二段階において、濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）溶液を脱イオン水に対して透析した（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ７ ＭＷＣＯ１０ｋ、希釈係数 １：１００，０００）。第三段階として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ａ ＭＷＣＯ１０ｋカラムを用いて、およそ２５０ｍｇ／ｍＬの濃度まで、透析済み溶液を限外ろ過／透析ろ過により濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）した。
表１６ａは、本手順の段階３後の水中の高濃縮アダリムマブ（ＤＦ／ＵＦ処理済）バルク薬物溶液の分析の結果を示す。
Figure 0005840364
１２．３：製造条件を想定する凍結／融解（Ｆ／Ｔ）手順
−５０℃以下、通常は−７０℃から−８０℃の温度で、凍結しようとする液体４７ｋｇの製造規模処理量で、超低温冷凍庫（Ｒｅｖｃｏ Ｕｌｔｉｍａ ＩＩ、２０ｃｕ．ｆｔ．）を用いて凍結を行った。１．６ｋｇの充填重量（例えば、Ｎａｌｇｅｎｅ ２Ｌ ＰＥＴＧ ｓｑｕａｒｅ ｍｅｄｉａ）の個々のボトルに液体を入れた。４８時間後、凍結を完了した。物質が完全に融解するまで、２０℃から４０℃の間の温度、通常は３０℃で、２４ｋｇの製造規模処理量で循環水浴（例えば、Ｌｉｎｄｅｒｇｈ／Ｂｌｕｅ）中で融解を行った。
１２．４：凍結及び融解中のボトルマッピング（ｂｏｔｔｌｅ−ｍａｐｐｉｎｇ）
ボトル容積中の個別の水平な溶液層を単離し、分析した。２５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度では、図１５から１９で見られるように、アダリムマブ水溶液中でごく僅かな勾配形成しか検出されなかった。しかし、２５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬで処方されたアダリムマブ溶液（その他の賦形剤、例えば、マニトール及び塩化ナトリウムを含有するリン酸／クエン酸緩衝系入りの溶液）の凍結及び融解により、ボトルの底部に沈殿が形成された。
１２．５：アダリムマブの市販及び低イオン性製剤における勾配形成
アダリムマブの市販及び低イオン性（水）製剤における凍結融解手順による勾配形成を比較した。表１６ｂは、ｆ／ｔ段階後の様々な濃度の市販アダリムマブ溶液の目視の結果を示す。沈殿の形成から、ｆ／ｔ手順により溶液において不安定性が生じたことが示される。１００ｍｇ／ｍＬ以上で、顕著な沈殿形成が観察された。表１７は、凍結融解実験前の２種類の５０ｍｇ／ｍＬ溶液及び１種類の１００ｍｇ／ｍＬ低イオン性製剤の分析データを示す。
Figure 0005840364
Figure 0005840364
各製剤約１６００ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬ溶液）又は８００ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬ溶液）をＰＥＴＧボトルに入れ、従来からの凍結（−８０℃）融解（２３℃、水浴）手順に供した。次に、ＰＥＴＧボトルの最上部、中央及び底部から試料を採取し、ｐＨ、密度、浸透圧及びタンパク質濃度について分析した。分析結果を表１８で示す。
表１８：凍結／融解溶液からのボトル−マップ（ｂｏｔｔｌｅ−ｍａｐｐｅｄ）層の分析
Figure 0005840364
アダリムマブの市販製剤から、密度（タンパク質及び賦形剤の不均一性／勾配を示唆）、浸透圧（賦形剤勾配を示唆）及びタンパク質含量に関して、凍結／融解において顕著な勾配が明らかになった。一方、凍結／融解において、５０ｍｇ／ｍＬ低イオン性アダリムマブ製剤では勾配は見られなかった。
より高いタンパク質濃度では、時に勾配形成が悪化すると予想されることがあり得る。しかし、ｐＨ、密度、浸透圧及びタンパク質濃度に関して、凍結／融解時に、１００ｍｇ／ｍＬ低イオン性アダリムマブ製剤において勾配は見られなかった。
（実施例１３）
ＤＦ／ＵＦ後のＪ６９５の安定性
次の実施例は、本発明の方法に従うＤＦ／ＵＦ処理後のＪ６９５の安定性におけるデータを与える。
ｐＨ調整後又は透析ろ過後の何れかに、通常のＤＳ緩衝液中のＪ６９５からのタンパク質試料を分析した。０．１Ｍリン酸、タンパク質濃度１１２ｍｇ／ｍＬでｐＨをｐＨ４．４に調整した。ＷＦＩ中の濃縮試料の場合、３０ｋＤａ ＲＣ膜を備えたＴＦＦを用いて、周囲温度で、およそ１．５日間にわたり、タンパク質試料を水に対して透析ろ過処理（ＤＦ／ＵＦ）した。ＤＦ／ＵＦ後のタンパク質濃度を調べたところ、およそ１９２ｍｇ／ｍＬであった。ｐＨ４．７。
１３．１：サイズ排除分析（ＳＥＣ）実験手順
Ｊ６９５の純度評価のために、サイズ排除法を開発した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、分子量に従い巨大分子を分離する。レジンは、ふるい剤として働き、より小さい分子はレジンの孔に保持され、より大きな分子はカラムを通過できる。保持時間及び分解能は、選択されるレジンの孔サイズの関数である。
定められた濃度に基づき、各試料を純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。各試料５０μｇをカラムに注入した（各２回ずつ）。Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｇ３０００ｓｗｘｌ、７．８ｍｍ ｘ ３０ｃｍ、５μｍ（カタログ番号０８５４１）ＳＥＣカラムを分離のために使用する。緩衝液Ａの場合、２１１ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４／９２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０を使用した。２８０ｎｍ及び２１４ｎｍで検出を行った。室温にて０．３ｍＬ／分の流速でカラムを維持した。
このクロマトグラフィーは、５０分間の継続時間にわたり、１００％移動相Ａ溶媒での定組成勾配を使用した。
１３．２：ＳＥＣデータ
表１９は、サイズ排除クロマトグラフィー実験からのデータを記す。
Figure 0005840364
１３．３：ＳＥＣ分析の結論
表１９におけるデータは、Ｊ６９５（ＤＳ ＰＦＳ、ｐＨ＝４．４）の市販製剤がＪ６９５参照基準と同程度の断片及び凝集体レベルを有することを示す。市販製剤Ｊ６９５対照と、水中（Ｈ２Ｏ中ＤＳ、ｐＨ＝４．７、１９２ｍｇ／ｍＬ）でＤＦ／ＵＦを行ったＪ６９５と、の間で、凝集体量の差があることが示され：０．４％から０．７％への凝集の増加が見られた。これは有意な増加ではなく、ＵＦ／ＤＦ中、室温で時間を費やしたことによるものであり得る。断片については変化はない。
１３．４：ＩＥＣ（ＷＣＸ−１０）実験手順
Ｄｉｏｎｅｘ ＷＣＸ−１０カラムを用いて、Ｊ６９５の不均一性の評価のために、陽イオン交換法を開発した。一般に、陽イオン交換クロマトグラフィーは、見かけのｐＩ及びレジンとの表面電荷相互作用に従い、タンパク質アイソフォームを分離する。関心のあるタンパク質を特異的な低塩出発条件下でカラムに結合させ、勾配を通じて塩濃度を上昇させることによりカラムから溶出させる。見かけのｐＩが低いタンパク質ほど、陽イオン交換カラムへの結合は弱く、最初に溶出され、見かけのｐＩが高いタンパク質ほど、強く結合し、最後に溶出される。
ロットリリースアッセイとして、クオリティーコントロールにおいて、ＷＣＸ−１０を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを使用した。既知のＪ６９５アイソフォームの分離を改善するために、アッセイ条件を変更した。
試料を純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。比較として参照基準を３回測定にかけ、純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
分離のために、対応するガードカラム（ｐ／ｎ０５４９９４）とともに、Ｄｉｏｎｅｘ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０カラム（ｐ／ｎ０５４９９３）を使用した。この手順で使用される緩衝液には、緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝６．０）及び緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝６．０）が含まれた。カラム温度を３５℃に維持し、カラム流速は１ｍＬ／分であった。注入体積は１００μｇ処理量に対して１００μＬであり、２８０ｎｍで検出を行った。一連のクロマトグラフィー分離にわたる緩衝液勾配は表２０で与える。
Figure 0005840364
１３．５：ＩＥＣデータ
表２１は、市販緩衝液（ＤＳ ｐＨ＝４．４）中のＪ６９５とＪ６９５参照基準を比較する実験からの結果ならびにＤＦ／ＵＦ（ＤＦ／ＵＦ Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝４．７）後のＪ６９５と市販緩衝液製剤の比較を与える。
Figure 0005840364
１３．６：ＩＥＣ分析の結論
Ｊ６９５参照基準と市販製剤（ＤＳ、ｐＨ４．４）との間である程度の差が示された。これらの差は、ＤＳ作業稼動試料の最初の稼動で顕著であり、３０００Ｌと６０００Ｌキャンペーンとの間の製造プロセスにおける差が原因である。ＤＳ、ｐＨ４．４対照とＨ２Ｏ ｐＨ＝４．７中のＪ６９５、１９２ｍｇ／ｍＬ試料との間に顕著な差はなかった。
（実施例１４）
ＤＦ／ＵＦ及び２−８℃での長期保存後のアダリムマブの安定性
次の実施例は、２−８℃での２２．５ヶ月間の保存後の、本発明の方法に従う、水性製剤中のアダリムマブの安定性を示すデータを与える。
ＳＥＣ及びＷＣＸ−１０分析用のアダリムマブ試料を水に対して透析ろ過処理し、約１７７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。試料を保存し、安定性について様々な時点で分析した。
水中で濃縮溶液を生成させるために、出発物質として、市販Ｈｕｍｉｒａ緩衝液中の標準的アダリムマブ溶液（ＤＳ、およそｐＨ５．２）を使用した。３０ｋＤａ ＲＣ膜を備えるＴＦＦを用いて、周囲温度で、およそ１．５日間にわたり、タンパク質溶液試料を水に対して透析ろ過処理（ＤＦ／ＵＦ）した。
ＤＦ／ＵＦ後のタンパク質濃度を測定したところ、およそ１７７ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．２であった。分析前に２２．５ヶ月間、２−８℃で試料を保存した。
１４．１：ＳＥＣ実験手順
抗体断片及び凝集体の存在について調べるために、既にサイズ排除法を開発した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、分子量に従い巨大分子を分離する。レジンは、ふるい剤として働き、より小さい分子はレジンの孔に保持され、より大きな分子はカラムを通過できる。保持時間及び分解能は、選択されるレジンの孔サイズの関数である。
各試料を純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、各試料５０μｇをカラムに注入した。ＳＥ−ＨＰＬＣの場合、Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ カタログ番号１７５１７５−０１、Ｓ／Ｎ０５０４０５７）又はＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（カタログ番号０８５４１；２２．５ヶ月試料の分析用）を使用した。カラムの移動相は、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５を含んだ。２８０ｎｍ及び２１４ｎｍで検出を行った。カラムを周囲温度で維持し、流速は０．５ｍＬ／分（Ｓｅｐｈａｄｅｘ カラム）又は０．３ｍＬ／分（ＴＳＫカラム）であった。
１４．２：ＳＥＣデータ
図２０及び表２２は、−８０℃で保存された同じ低イオン性アダリムマブ溶液と比較した、２−８℃で８．５ヶ月間液体として保存された低イオン性アダリムマブ溶液の分析の結果を含有する。表２３は、アダリムマブの参照基準試料と比較した、２−８℃で２２．５ヶ月間保存された低イオン性アダリムマブ溶液に対する分析データを含有する。
Figure 0005840364
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表２２で見られ得るように、ＳＥＣ分析から、２−８℃で９ヶ月又は−８０℃で４．５ヶ月後でさえも、％凝集体（％ＨＭＷ）及び％断片（％ＬＭＷ）が長期にわたり僅かだったので、水中のアダリムマブが安定であったことが明らかになった。
１４．３：ＳＥＣ分析の結論
２−８℃での８．５ヶ月間にわたる保存後、アダリムマブ溶液（水に対してＤＦ／ＵＦ）において、ごく僅かな高分子量（ＨＭＷ）種（０．２％）及びごく僅かな断片（０．３％）が見られた。−８０℃での４．５ヶ月間にわたる保存及び続く融解（水浴、２３℃）は、アダリムマブ安定性に影響を与えなかった（０．１％凝集体、０．３％断片）。
２−８℃で２２．５ヶ月間保存された試料の分析からも、アダリムマブ参照基準と同等の断片含量が示される（表２３）。しかし、２２．５ヶ月間の安定試料で検出された凝集体レベル（１．６６％）は、参照基準中で検出された凝集体レベルよりも幾分高い。
抗体の自己会合が抗体濃度に高く依存すること、即ち、非共有凝集体及び会合複合体の形成が高タンパク質濃度で最も顕著であることが知られている。この自己会合は可逆的であり、緩衝溶液での希釈の結果、自己会合傾向は低下する（Ｌｉｕ、Ｊ．ら、９４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９２８（２００４））。
従って、アダリムマブ溶液希釈（１７７ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬ）とＳＥＣによる続く試料分析との間の試料調製の違い及び遅延時間が異なることが、８．５ヶ月及び９ヶ月の安定試料の凝集体含量の差に対する理由であると思われる。
１４．４：ＩＥＣ実験手順
陽イオン交換法は、ＤｉｏｎｅｘＷＣＸ−１０カラムを用いて抗体電荷不均一性の評価のために開発された。陽イオン交換クロマトグラフィーは、見かけのｐＩ及びレジンとの表面電荷相互作用に従いタンパク質アイソフォームを分離する。関心のあるタンパク質を特異的な低塩出発条件下でカラムに結合させ、勾配を通じて塩濃度を上昇させることによりカラムから溶出させる。見かけのｐＩが低いタンパク質ほど、陽イオン交換カラムへの結合は弱く、最初に溶出され、見かけのｐＩが高いタンパク質ほど強く結合し、最後に溶出される。
手順前に、ミリＱ水で試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。分離のために、対応するガードカラム（ｐ／ｎ０５４９９４）とともに、Ｄｉｏｎｅｘ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０カラム（ｐ／ｎ０５４９９３）を使用した。２種類の移動相緩衝液、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）及び１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５（緩衝液Ｂ）を調製した。カラムを周囲温度で維持し、流速は１．０ｍＬ／分であった。注入体積は１００μｇ処理量に対して１００μＬであり、２８０ｎｍで検出を行った。一連のクロマトグラフィー分離にわたる緩衝液勾配は表２４で与える。
Figure 0005840364
１４．５：イオン交換データ
表２５は、保存前の、アダリムマブ参照基準、市販製剤（１５０ｍｇ／ｍＬ）及びＤＦ／ＵＦ後の低イオン性溶液に対するイオン交換クロマトグラフィーデータを示す。表２６は、２−８℃で２２．５ヶ月間保存した後の低イオン性溶液と比較した参照基準に対するデータを示す。
Figure 0005840364
Figure 0005840364
１４．６：イオン交換分析の結論
Ｔ０試料の場合、データから、参照基準アダリムマブ、市販製剤アダリムマブ（ＤＦ／ＵＦにより水中でアダリムマブを処方するためのＤＳとして使用）と、水に対して透析ろ過処理され、１７７ｍｇ／ｍＬに濃縮されたアダリムマブとの間の酸性領域１、２、０Ｌｙｓ、１Ｌｙｓ又は２Ｌｙｓの％の有意差（即ち電荷不均一性）は示されない（表２５）。
また、水中の１７７ｍｇ／ｍＬアダリムマブ試料を２２．５ヶ月間保存した後、アダリムマブ参照基準と比較した場合、０Ｌｙｓ、１Ｌｙｓ及び２Ｌｙｓ断片の僅かな差しか見られ得ない。まとめると、ＤＦ／ＵＦ処理によりアダリムマブが水中で処方され、１７７ｍｇ／ｍＬの濃度で２−８℃で２２．５ヶ月間保存される場合、有意な化学的不安定性傾向は観察されない。
（実施例１５）
低イオン性１Ｄ４．７溶液の凍結／融解安定性
透析により水中で１Ｄ４．７タンパク質（免疫グロブリンＧ１）抗−ＩＬ１２／抗−ＩＬ２３を処方し（製造者、Ｐｉｅｒｃｅ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬの操作説明書に従い使用される、ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセットを使用）、２ｍｇ／ｍＬの濃度、ｐＨ６で反復凍結／融解（Ｆ／Ｔ）処理（−８０℃／２５℃水浴）中に安定であることが分かった。通常の製剤（２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６）とデータを比較し、水中で処方される１Ｄ４．７の安定性は、日常的にスクリーニングされる緩衝液系（例えば２０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭグリシン、１０ｍＭリン酸、１０ｍＭクエン酸）中で処方される１Ｄ４．７の安定性を上回り、タンパク質製剤中で一般に使用される様々な賦形剤、例えば１０ｍｇ／ｍＬマニトール、１０ｍｇ／ｍＬソルビトール、１０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０１％ポリソルベート８０、２０ｍＭ ＮａＣｌ入りの、ユニバーサル緩衝液（１０ｍＭリン酸、１０ｍＭクエン酸）に基づく１Ｄ４．７の安定性さえも上回ることが分かった。
タンパク質安定性を監視するためにＳＥＣ、ＤＬＳ及び粒子計数を行い、１−２００μｍ測定範囲の粒子計数システム（例えば粒子計数モデルシリンジ、Ｍａｒｋｕｓ Ｋｌｏｔｚ ＧｍｂＨ、Ｂａｄ Ｌｉｅｂｅｎｚｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することにより粒子計数を行った。実験の詳細は次のとおりである。
−水中で処方された１Ｄ４．７を上記で列挙される製剤と比較
−４回の凍結／融解サイクル適用
−３０ｍＬ ＰＥＴＧ容器、約２５ｍＬ充填、２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６
−Ｔ０、Ｔ１（即ち１回のｆ／ｔ段階後）、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４で試料採取
−分析法：目視、ＳＥＣ、ＤＬＳ、肉眼で見えない粒子の測定
図２１は、肉眼で見えない粒子＞１μｍの形成により反映される、反復ｆ／ｔサイクル（−８０℃／２５℃）中の１Ｄ４．７の安定性を示す。ユニバーサル緩衝液（１０ｍＭクエン酸、１０ｍＭリン酸）中で１Ｄ４．７を処方し、次いで、次の様々な賦形剤：ソルビトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、マニトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びポリソルベート８０（０．０１％）を試験した。賦形剤を全く添加せずに、（透析により）水中で１Ｄ４．７をまた処方した。粒子負荷における、物質操作、ｆ／ｔ及び試料採取の潜在的な影響を評価するために、注射用水をまたｆ／ｔサイクル及び肉眼では見えない粒子の試験に供した。
ｆ／ｔにおける、水中で処方される１Ｄ４．７の安定性は、タンパク質製剤で通常使用される賦形剤とともに処方される１Ｄ４．７溶液の安定性を上回った。マニトール、スクロース及びソルビトールは、溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）及び／又は凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として作用することが知られており、ポリソルベート８０は、それぞれ、空気−水及び氷−水などの疎水性−親水性界面への曝露時に、タンパク質の物理学的安定性を向上させることが広く知られている非イオン性賦形剤である。従って、水中で処方される１Ｄ４．７溶液は、適用されるその他の方法（例えばＳＥＣ、目視など）で分析される場合、安定的であると思われる。
（実施例１６）
低イオン性１３Ｃ５．５抗体溶液の凍結／融解安定性
水中で処方される１３Ｃ５．５抗ＩＬ−１３タンパク質は、２ｍｇ／ｍＬ濃度、ｐＨ６で、反復凍結／融解処理（−８０℃／２５℃水浴）中に安定であることが示された。通常の製剤（２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６）とデータを比較し、水中で処方された１３Ｃ５．５の安定性が、日常的にスクリーニングされる緩衝液系（例えば２０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭグリシン、１０ｍＭリン酸、１０ｍＭクエン酸）中で処方される１３Ｃ５．５の安定性を上回り、タンパク質製剤において一般に使用される様々な賦形剤（例えば１０ｍｇ／ｍＬマニトール、１０ｍｇ／ｍＬソルビトール、１０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０１％ポリソルベート８０、２０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ）を含むユニバーサル緩衝液（１０ｍＭリン酸、１０ｍＭクエン酸）に基づく１３Ｃ５．５製剤の安定性さえも上回ることが分かった。
１Ｄ４．７に対して実施例１５で概説したものと同じように、試料調製、実験処理、試料採取及び試料分析を行った。
−水中で処方された１３Ｃ５．５を上記で列挙した製剤と比較
−４回の凍結／融解サイクル適用
−３０ｍＬ ＰＥＴＧ容器
−２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６
−Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４で試料採取
−分析法：目視、ＳＥＣ、ＤＬＳ、肉眼で見えない粒子の測定
図２２は、肉眼で見えない＞１０μｍの形成により反映される、反復ｆ／ｔサイクル（−８０℃／２５℃）中の１３Ｃ５．５の安定性を示す。１０ｍＭリン酸緩衝液、１０ｍＭクエン酸緩衝液、２０ｍＭグリシン緩衝液及び２０ｍＭヒスチジン緩衝液の何れかの中で１３Ｃ５．５を処方した。賦形剤を全く添加せずに、水中で（透析により）１３Ｃ５．５をまた処方した。粒子負荷での、物質操作、ｆ／ｔ及び試料採取の潜在的な影響を評価するために、注射用水もｆ／ｔサイクル及び肉眼で見えない粒子の試験に供した（ブランク）。
ｆ／ｔにおける、水中で処方された１３Ｃ５．５の安定性は、タンパク質製剤において一般に使用される緩衝液中で処方された１３Ｃ５．５溶液の安定性を上回った。適用されるその他の分析法（例えばＳＥＣ、目視など）により、水中で処方された１３Ｃ５．５溶液の不安定性は観察されなかった。
図２３は、肉眼で見えない粒子＞１μｍの形成により反映される、反復ｆ／ｔサイクル（−８０℃／２５℃）中の１３Ｃ５．５の安定性を示す。ユニバーサル緩衝液（１０ｍＭクエン酸、１０ｍＭリン酸）中で１３Ｃ５．５を処方し、次いで次の様々な賦形剤：ソルビトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、マニトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＮａＣｌ（２００ｍＭ）、ＮａＣｌ（２０ｍＭ）及びポリソルベート８０（０．０１％）を試験した。比較のために、賦形剤を全く添加せずに（透析により）水中で１３Ｃ５．５をまた処方した（純水）。粒子負荷での、物質操作、ｆ／ｔ及び試料採取の潜在的な影響を評価するために、注射用水もｆ／ｔサイクル及び肉眼で見えない断片の試験に供した。
水中で処方された１３Ｃ５．５のｆ／ｔにおける安定性は、タンパク質製剤において一般に使用される賦形剤とともに処方された１３Ｃ５．５溶液の安定性を上回った。マニトール、スクロース及びソルビトールは、溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）及び／又は凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として作用することが知られており、ポリソルベート８０は、それぞれ、空気−水及び氷−水などの疎水性−親水性界面への曝露時に、タンパク質の物理学的安定性を向上させることが広く知られている、非イオン性賦形剤である。
適用されるその他の分析法（例えばＳＥＣ、目視など）により、水中で処方された１３Ｃ５．５溶液の不安定性は観察されなかった。
上述のように、ｆ／ｔ手順後の１３Ｃ５．５溶液のＤＬＳ分析を行った。０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０入りの１３Ｃ５．５溶液は、１回だけｆ／ｔ段階を行った後に顕著な高分子量（ＨＭＷ）凝集型を含有し、一方で水中の１３Ｃ５．５は、３回のｆ／ｔ段階後でもＨＭＷ凝集型を含有しなかった。
（実施例１７）
ＷＦＩ中のアダリムマブにおける溶液ｐＨの影響
ＷＦＩ中で処方された高度濃縮アダリムマブの物理化学的特性における溶液ｐＨの影響を調べるために、次の実験を行った。次の濃度を試験した：２ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ及び２５０ｍｇ／ｍＬ。
材料
・アダリムマブ製剤原料（ＤＳ）、市販材料
・融解のために使用される２５℃水浴（循環）
・透析ろ過装置：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ、膜：ＰＥＳ ５０ｋＤ、１０００ｃｍ２
・透析ろ過装置：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭＴＦＦシステム、膜：ＰＬＣＴＫ ３０ｋＤ、再生セルロース、サイズ：５０ｃｍ２
・エッペンドルフ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８１０Ｒ
・遠心用のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５容器、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０ｋ、再生セルロース３０，０００ＭＷＣＯ
・Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍ、試料のろ過滅菌用のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ
・試料容器（エッペンドルフ試料容器１．５ｍＬ、Ｒｏｔｈ凍結バイアル５ｍＬ、ＰＥＴＧボトル １２５ｍＬ）
分析：
・Ｂｉｏｔｈｒｏｄｅを用いたｐＨ測定
・密度測定
・浸透圧測定
・タンパク質濃度測定のためのＵＶ／ＶＩＳ分光光度計
・光子相関分光法（ＰＣＳ）
・粘度測定
・濁度測定
・サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
・フーリエ変換中赤外分光法（ＦＴ−Ｍ−ＩＲ）
１７．１アダリムマブ市販製剤のＤＦ／ＵＦのための調製の概要
アダリムマブＤＳ溶液（１２０ｍｇ／ｍＬ）を７つに分け、それぞれ０．２５Ｎ ＮａＯＨ及び０．２５Ｎ ＨＣｌでそれらをｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９に調整した。次に、個々のｐＨのアダリムマブ緩衝液で試料を１００ｍｇ／ｍＬに希釈した。この溶液は、僅かに濁度があり、これはろ過滅菌後に消失した（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ滅菌フィルター）。希釈後、ｐＨ値を再び監視した（下記表２７参照）。
１００ｍｇ／ｍＬ溶液の次の試料を各溶液から採取した：
・濁度及び続くゼータ電位測定に対して４ｍＬ
・粘度測定に対して１ｍＬ（落下球粘度計を使用）
・浸透圧測定に対して０．１５ｍＬ
・密度測定に対して２ｍＬ
・ＰＣＳに対して０．１５ｍＬ（測定に対して試料粘度を考慮）
・ＦＴ−Ｍ−ＩＲに対して１ｍＬ
・粘度及び静的光散乱法測定に対して２ｍＬ
ゼータ電位、粘度及び静的光散乱測定のための試料を凍結した（−８０℃）。交換媒体として注射用水を用いて、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７及びｐＨ８溶液の残存体積を連続モードの透析ろ過に共した。最初に試料を−８０℃に凍結した。ＤＦ／ＵＦ前に、２５℃でＪｕｌａｂｏ水浴中で試料を融解した。
１７．２ ＤＦ／ＵＦ及び濃縮手順
１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、４、５、６、７及び８のｐＨレベルの市販製剤中のアダリムマブ溶液をＤＦ／ＵＦ処理に供し、遠心におけるＵＦでの濃縮プロセスにさらに共した。このセクションは、例として、ｐＨ６のアダリムマブ溶液の処理を記す。同様にしてその他の溶液に対する処理を行った。
アダリムマブ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６）を水浴中で２５℃にて溶解し、次に均質化した。次に、次のパラメータを適用することにより、ＴＦＦ装置Ｍ．Ｐ．３３．４での、交換媒体として注射用水を用いた透析ろ過に、この溶液を供した。
・撹拌機：スピード２
・ポンプ：スピード１
・圧 上流／インレット：２−２．４ｂａｒ
・圧 下流／アウトレット：０．６−０．８ｂａｒ
・膜：再生セルロース、カットオフ３０ｋＤ
・連続モードＤＦ／ＵＦ
・ＤＦ／ＵＦ操作中に約６倍体積の交換を適用
６体積交換段階を行った後、ＯＤ２８０、光度計Ｍ．Ｐ．９．７によりアダリムマブの濃度を調べた。透過液及び保持液の浸透圧を調べた。
濃度：１２５．１ｍｇ／ｍＬ
浸透圧 透過液：５７ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ
浸透圧 保持液：１２ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ
ＤＦ後の水中のアダリムマブ溶液を注射用水で１００ｍｇ／ｍＬに希釈し、ろ過滅菌した。ＤＦ／ＵＦプロセス後、１００ｍｇ／ｍＬ溶液から次の試料を採取した：
・濁度及び続くゼータ電位測定に対して４ｍＬ
・粘度測定に対して１ｍＬ
・浸透圧測定に対して０．１５ｍＬ
・密度測定に対して２ｍＬ
・ＰＣＳに対して０．１５ｍＬ（測定に粘度を考慮）
・ＳＥＣに対して０．１５ｍＬ
・ｐＨ−測定
・ＦＴ−Ｍ−ＩＲに対して１ｍＬ
・粘度及び静的光散乱測定に対して２ｍＬ
５０ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製するために、１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ溶液の一部を注射用水で希釈した。両溶液から次の試料を採取した。
・濁度及び続くゼータ電位測定に対して４ｍＬ
・粘度測定に対して２ｍＬ
・浸透圧測定に対して０．１５ｍＬ
・密度測定に対して２ｍＬ
・ＰＣＳに対して０．１５ｍＬ（粘度を考慮）
・ｐＨ−測定
遠心を用いて、水中のアダリムマブ溶液（ｐＨ６、１００ｍｇ／ｍＬ）を濃縮実験に供した。エッペンドルフＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（５８１０Ｒ Ｍ．Ｐ．３３．５７）を用いて遠心を行った。４０００ｒｐｍで１５分間にわたり、各遠心段階を行った。その後、溶液を均質化し、それにより膜に直接隣接する領域でゲルが形成されるのを回避するために、穏やかに転倒撹拌することによって、遠心濃縮装置での試料溶液の均質化を行った。濃縮中の温度は１５℃であった。約２５０ｍｇ／ｍＬになるように遠心を行った。ＯＤ２８０（光度計Ｍ．Ｐ．９．７）を測定することにより、濃度を調べた。次に、２５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ及び１５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにアダリムマブ溶液を希釈した。
濃縮手順後及び希釈の各個々の段階後、次の試料を採取した。２５０ｍｇ／ｍＬ及び１５０ｍｇ／ｍＬ溶液から採取した試料体積は次のとおりであった。
・粘度−測定に対して２ｍＬ
・ＰＣＳに対して０．１５ｍＬ（粘度を考慮）
・浸透圧測定に対して０．１５ｍＬ
・ＳＥＣに対して０．１５ｍＬ
・ｐＨ−測定
２００ｍｇ／ｍＬ溶液から採取された試料体積は、次のとおりであった。
・濁度及び続くゼータ電位測定に対して４ｍＬ
・粘度測定に対して１ｍＬ
・浸透圧測定に対して０．１５ｍＬ
・密度測定に対して２ｍＬ
・ＰＣＳに対して０．１５ｍＬ（粘度を考慮）
・ＳＥＣに対して０．１５ｍＬ
・ｐＨ−測定
・ＡＢＣにおいて行われるべき分析実験に対して２ｍＬ（粘度及び静的光散乱測定）
より高い濃度の、特にｐＩに近いｐＨ（アダリムマブの場合約ｐＨ８．５）での、水中のアダリムマブ溶液の粘度が劇的に上昇したので（ゲル形成に接近する粘度）、水中でのアダリムマブ溶液の濃縮処理を各ｐＨ値においておよそ２５０ｍｇ／ｍＬで停止した。
１７．３アダリムマブ溶液の目視
ＤＦ／ＵＦ及び２５０ｍｇ／ｍＬまでの濃縮後、様々なｐＨの水中のアダリムマブ溶液は、緩衝液中のアダリムマブ溶液（市販製剤）よりも乳白光が少ないようであった。水中のアダリムマブ溶液は全て、各ｐＨ値で透明な溶液に見えた。アダリムマブ溶液で、希釈後に乳白光は見られなかった。全体的に、濃縮及び希釈手順中、水中のアダリムマブ溶液において沈殿は観察されなかった。
１７．４ 粘度
個々の各濃度でのｐＨ５アダリムマブ溶液の密度を考慮して、粘度測定を行った。落下球粘度計を使用した。２００ｍＰａ＊ｓより高い粘度は毛細管粘度計を用いて測定した。
図２４は、様々な濃度（５０ｍｇ／ｍＬ濃度間隔で２ｍｇ／ｍＬから２５０ｍｇ／ｍＬ、）の４から８のｐＨ範囲の水中のアダリムマブ溶液の粘度データの概要を与える。溶液ｐＨ、濃度及び粘度との間には明らかな相関がある。粘度は、タンパク質濃度の上昇に伴い上昇し、溶液ｐＨとは独立である。アダリムマブのｐＩに近い溶液ｐＨ値において（即ちｐＨ７及びｐＨ８）、特により高いタンパク質濃度（即ち２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ）で、溶液粘度の上昇は最も顕著であった。
１７．５ 濁度
図２５で見られるように、濁度データに対して同じ傾向が見出された（即ち、濁度は、濃度の上昇及びｐＨの上昇に伴い上昇した。）。濁度測定前に全試料をろ過滅菌（０．２２μｍ）した。
１７．６ 流体力学直径（ＰＣＳ）
各濃度及び各ｐＨ値で、各試料に対する粘度を考慮に入れて、ＰＣＳ測定を行った。２００ｍｇ／ｍＬ及び２５０ｍｇ／ｍＬの溶液を測定したが、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒナノシリーズ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）装置の試験パラメータの範囲外であり、それ故に、これらの測定からのデータは分析しなかった。
流体力学直径（Ｄｈ）は、アダリムマブが水中で処方された場合（５０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５でＤｈ 約２ｎｍ）、市販製剤中に処方されたアダリムマブ（Ｄｈ約７ｎｍ）と比較して、顕著に縮小することが分かった。図２６は、ＰＣＳデータ（表３９でも見出される。）を示す。対応するデータ表は、下記の１７．１１の部分で示される。
図２６で示されるように、４、５及び６のｐＨ値の溶液に対して、アダリムマブ単量体のＤｈは、タンパク質濃度の上昇に伴い一定して縮小した。一方、アダリムマブのｐＩに近いｐＨ値（即ち、ｐＨ７及びｐＨ８）の溶液は、２ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬまで濃度が上昇した際にＤｈの顕著な拡大を示した。しかし、ｐＨ７及び８溶液で５０ｍｇ／ｍＬを超えて濃度が上昇したとき、Ｄｈは縮小した。１５０ｍｇ／ｍＬの濃度において、溶液は全て、２ｍｇ／ｍＬの対応するｐＨ溶液よりもＤｈ値が小さかった。図２７は、様々な濃度のｐＨ５溶液に対するＤｈサイズ分布を示す。図２８は、水中で処方された５種類のアダリムマブ溶液（それぞれ、１００ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度であり、様々なｐＨ値である。）に対するＤｈサイズ分布を示す。図２９は、５種類のアダリムマブ溶液が緩衝液中で処方されたことを除き、図２８のデータと同様のデータを示す。
１７．７ ｐＨ測定
水を用いたＤＦ／ＵＦ前後に、１００ｍｇ／ｍＬで溶液ｐＨの測定を行った（即ち、それぞれ緩衝液中及び水中で処方されたアダリムマブにおいて行った。）。表２７は、結果を示す。ＤＦ／ＵＦ前後で、ｐＨ値はｐＨ５、ｐＨ６及びｐＨ７では一定のままである。媒体交換なので溶液ｐＨは変化しない。水を用いたＤＦ／ＵＦ後に、ｐＨ４のｐＨ値は僅かに上昇し、ｐＨ８では僅かに低下した。
Figure 0005840364
１７．８ 浸透圧測定
１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下の値に浸透圧を低下させるために５倍体積交換が十分であるか否かを調べるため、ｐＨ５溶液試料のＤＦ／ＵＦ中に、各体積交換段階後に溶液浸透圧を測定した（即ち、１００ｍＬ透過、２００ｍＬ透過後など）。表２８は結果を示す。
Figure 0005840364
ｐＨ４、ｐＨ６、ｐＨ７及びｐＨ８において、ＤＦ／ＵＦプロセスの終了時にのみ浸透圧を測定した。表２９は各ｐＨに対する浸透圧の結果（ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ単位）を示す。
Figure 0005840364
凝固点粘度計により浸透圧測定を行った。
１７．９ 断片化（ＳＥＣ）
ＳＥＣデータは、濃度範囲全体（１００−２５０ｍｇ／ｍＬ）にわたり、ｐＨ４の溶液でのタンパク質の比較的顕著な断片化を示し、一方で、同じ濃度範囲で、５から８のｐＨ範囲では断片化が殆ど検出されなかった。結果として、ｐＨ４溶液の単量体含量はこれに応じて減少した（図３０）。凝集体の値は、ｐＨ値の上昇（ｐＨ４からｐＨ８）に伴い上昇し、濃度とは独立していた（図３１）。
１７．１０ 結論
ＤＦ／ＵＦ処理により水中で処方されたアダリムマブ溶液の粘度及びＤｈ（流体力学直径）における溶液ｐＨ及びタンパク質濃度の影響を調べるために、この実験を計画した。このような溶液は低イオン性溶液と呼ばれる。４−８のｐＨ範囲を評価し、試験したタンパク質濃度は、２から２５０ｍｇ／ｍＬの間の範囲であった。
粘度に関して（セクション１７．４）、低イオン性アダリムマブ溶液が、イオン（即ち有機緩衝成分又は塩などのイオン性賦形剤）存在下で処方されたアダリムマブ溶液と同じ特性を有することが分かった。
−タンパク質濃度が高いほど溶液粘度が高くなる。この濃度−粘度相関は、アダリムマブｐＩと近いｐＨ値（即ち、ｐＨ７及びｐＨ８）の溶液の場合により顕著であった。逆に、一定濃度の溶液の場合、粘度は、溶液のｐＨ値とアダリムマブｐＩとの近さに相関した。
ＤＬＳデータに関して（セクション１７．６）、次の結論が導かれ得る。
−低イオン性アダリムマブ溶液のＤＬＳにより測定されたアダリムマブＤｈ値は、特に非常に低い溶液ｐＨにおいて、アダリムマブ市販製剤中で測定されたＤｈ値よりも小さいことが分かった。
−溶液ｐＨが低いほど、ＤＬＳにより測定されるＤｈ値が小さくなった。
−タンパク質濃度が高いほど、所定のｐＨの低イオン性アダリムマブ溶液においてＤｈ値が小さくなった。
この挙動に対する説明は、タンパク質溶液中のイオン強度（即ちイオン及びイオン化賦形剤の存在）がタンパク質−タンパク質相互作用の強さに対して重要であるということである。特により低い溶液ｐＨにおいて、低イオン性アダリムマブ溶液中での電荷−電荷反発作用がより顕著である。ＤＦ／ＵＦ処理において交換媒体として水を用いることによってタンパク質が水中で処方される場合、ヘルムホルツ層及びグイ−チャップマン層の両方を構成し得る、存在しているイオン化対イオンの量が、顕著に低下する。その結果として、（タンパク質の表面に存在するアミノ酸残基の電荷による）分子間電荷−電荷相互作用は、イオン化対イオン（例えばイオン化賦形剤）が豊富で、タンパク質単量体間の電荷−電荷反発作用（電荷−電荷反発作用の場合、分子運動をもたらす。）及び不規則なブラウン運動が、ＤＬＳにより測定されるタンパク質分子の運動性／運動に関与する環境におけるものよりも顕著であり得る。ＤＬＳ実験において、分子運動性が大きいほど、分子拡散係数が大きくなる（大きな分子拡散係数は、通常、ストークス−アインシュタインの式を使用することにより、流体力学的サイズがより小さい分子に割り当てられる。）。これにより、低イオン性製剤中でタンパク質の流体力学直径が小さくなる理由が説明され得る。
抗体分子間の電荷−電荷相互作用は、（より低い溶液ｐＨで）反発性及び誘引性であり得る（タンパク質のｐＩに近い、より高い溶液ｐＨにおいて）。
１７．１１ データ表
Figure 0005840364
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（実施例１８）
Ｊ６９５粘度におけるｐＨの影響
交換媒体として水を用いたＤＦ／ＵＦ処理後にＪ６９５に対して粘度データを作成した。少なくとも５回のＤＦ／ＵＦ段階を使用して、Ｊ６９５ＤＳ（実施例１参照）を水に対して透析ろ過処理した。次に、プレート−プレート粘度計、１００ｒｐｍせん断速度、１５０μｍ ｇａｐ、６０ｍｍプレート直径（装置：Ｂｏｈｌｉｎ Ｇｅｍｉｎｉｍ粘度計（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）、評価温度範囲８−２５℃）を用いて、様々な温度で粘度を測定した。
図３２で見られるように、それぞれ１７９ｍｇ／ｍＬ及び１９２ｍｇ／ｍＬの濃度で、Ｊ６９５溶液の粘度は、１２℃で７０ｃＰ以下であり、２０℃で４０ｃＰ以下であり、２５℃で３０ｃＰ以下であった。
（実施例１９）
純水中の抗体の薬物動態（ＰＫ）
この研究の目的は、アフェリモマブでの皮下（ｓ．ｃ．）投与後の局所的忍容性及びＰＫにおける、製剤パラメータの潜在的な影響を評価すること（即ち、緩衝液及び塩などのイオン性賦形剤を用いた従来のタンパク質製剤に対する、水を含有する低イオン性タンパク質製剤）である。さらに、この製剤の全身的毒性及びトキシコキネティクスデータを調べた。使用したタンパク質濃度は５０ｍｇ／ｍＬから２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、イオン強度は３ｍＯｓｍ／ｋｇから３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であった。
５０及び２００ｍｇ／ｋｇの液体製剤のｓ．ｃ．投与後のラットにおけるアフェリモマブの局所的忍容性及び毒性を評価するために、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、アフェリモマブを用いて、単回（ｓ．ｃ．）投与の試行実験を行った（ＭＡＫ１９５Ｆ−マウス抗ヒトＴＮＦ Ｆ（ａｂ’）２（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））。単回のｓ．ｃ．投与の後、観察／回復期が続いた。循環アフェリモマブレベルを測定し、吸収及び半減期を評価するために、限定血液試料採取（ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｉｎｇ）を行った。投与された用量体積は１ｍＬ／ｋｇ体重であった。実験群には、次のものが含まれた。
実験群
０１ 対照（ビヒクル）
０２ ５０ｍｇ／ｍＬアフェリモマブ、液体、標準的製剤
０７ ２００ｍｇ／ｍＬ アフェリモマブ、液体、水溶液製剤
Ａ群 観察期間２日間
Ｂ群 観察期間７日間
Ｃ群 観察期間１４日間
群分け及びラット識別（１群あたりＮ＝１）
Figure 0005840364
第１日、投与後１５分、１、３、５及び２４時間及び、その後少なくとも１日に１回、臨床兆候及び死亡について動物を繰り返し観察した。投与日（第１日）及び解剖日（それぞれ第３日、第１５日又は第２１日）及び妥当な場合は週に２回、体重を測定した。薬物分析用の血液試料を第１日（投与後４時間）及び妥当な場合は第２、３、５、８及び１５日に回収した。解剖前に、採血し、血液学的及び臨床化学的パラメータを評価した。解剖前に、各動物の血液塗抹標本を調製した。解剖時、体腔の肉眼検査を行った。
肝臓、腎臓、胸腺、脾臓及びリンパ節において器官重量測定を行った。注射部位において及び肝臓、腎臓、胸腺、脾臓及びリンパ節において、予備的な組織病理学検査を行った。
計画された解剖まで、全動物がこの実験に対して生存した。水溶液製剤を投与されたラットでは、第１４日から第１５日に、頸部に痂皮が見られた。体重における試験項目関連の影響は観察されなかった。血液学的及び臨床化学的値は変動しやすかった。血液学又は臨床化学において、明らかに試験項目に関連する変化は識別されなかった。尿分析において試験項目に関連する変化は指摘されなかった。器官重量の測定の結果、器官重量は変動性が大きく、明らかに試験項目に関連する変化はなかった。
総括的観察において、第３日に、水溶液製剤を受容したラットにおいて、注射領域の皮下の発赤が指摘された。その他の変化は全て、この血統及び齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで一般に見られる一連の自然な所見に属するものであった。
顕微鏡的所見はつぎのとおりであった。
・０１、０２群では所見なし
・０７群において僅かな広汎性の皮下炎症
・病巣の皮下出血は、０７群の全体的な病変における発赤と相関（第３日）（投与関連であると思われる。）
・局所反応における、ｐａｎ−Ｔ、サプレッサー／細胞毒性Ｔ細胞／ナチュラルキラー細胞、ｐａｎ−Ｂ細胞及びｐａｎ−マクロファージマーカーの予備的な免疫組織化学の結果から、主にマクロファージ及びナチュラルキラー細胞が皮下炎症／浸潤に関与したことが示される。従って、今までのところ、使用される製剤に対する局所的免疫原性反応に対する兆候はない。
その他の変化は全て、この血統及び齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで一般に見られる一連の自然な所見に属するものであった。
皮下投与後、アフェリモマブ吸収は速く、注射から０．２−３日後に最大血清レベルに到達すると思われる。試験した全ての試料におけるアフェリモマブの絶対的レベルは低かった。試料間で大きな変動が観察されたが、これは、試料採取頻度が限定され、使用した動物数が少なかったためであろう。殆どの試料において、５−８日後に、血清中でアフェリモマブは検出できなかった。この血清レベルの低下は、おそらく、Ｆ（ａｂ’）２の高クリアランスによるものである。殆どの試料に対して観察されたＴ１／２は、以前の観察と同じく、１−２日の範囲であった。低イオン性製剤の半減期が長い（７．８日）ということは、試料の持続的吸収を意味し得る。データを表４１及び４２で示す。
Figure 0005840364
アフェリモマブ又は対象物質の何れでも、液体に対して凝集状態の所見はなかった。
低イオン強度の製剤の場合、僅かなびまん性のｓ．ｃ．注射部位の炎症が見られた。高タンパク質濃度（それぞれ５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬ）で、極微量から微量又は微量から中程度の何れかの炎症が見られた。幾分の局所的なｓ．ｃ．出血が見られたが、これは、総体的な病変における発赤と相関し；これは、注射中の血管穿刺の結果であると思われた。水溶液製剤に対して、第３日に、注射部位における皮下発赤が幾分観察されたが、有害であるとは見なされなかった。全体的に、本製剤は、局所的に忍容性であった。
下記表４２において、水溶液製剤に対する従来の液体製剤のＰＫデータを示す。
Figure 0005840364
表４２で見られるように、低イオン性製剤（即ち水中で処方されたアフェリモマブ）によって、検出可能な血清レベルの期間の延長が見られた。
この実験において、低イオン性溶液（水）中のＭＡＫ１９５Ｆの絶対的観察レベルから、従来のＭＡＫ１９５Ｆ液体製剤中よりも、曝露性が良好となり、検出可能な血清レベル及び「半減期」が長くなった。
Ｆ（ａｂ’）２分子に対する以前の観察と同じく、標準的製剤中で、アフェリモマブ半減期は１−２日の範囲であった。しかし、低イオン性製剤に対して一見長い半減期が観察された（７．８ｄ）。従って、この製剤におけるＭＡＫ１９５Ｆの平均滞留時間は、試験された標準的製剤と比較してより長いようであった。
（実施例２０）
２．５（Ｅ）ｍｇｌ（抗ＩＬ−１８抗体）のＤＦ／ＵＦ
注射用水（以後、「水」と呼ぶ。）を用いた約４倍体積交換を利用して、２．５（Ｅ）ｍｇｌバルク溶液（５９．６ｍｇ／ｍＬ）の透析ろ過／限外ろ過（連続モード）を行った。保持液の、濁度、タンパク質濃度（ＯＤ２８０）、ｐＨ及び浸透圧を監視すること及びＤＬＳ測定によって、ＤＦ／ＵＦ操作を調節した。２．５（Ｅ）ｍｇｌバルク溶液の賦形剤の減少を調節するために、ＤＦ／ＵＦ中に、透過液の浸透圧も監視した。
材料及び方法
−２．５（Ｅ）ｍｇｌバルク製剤原料（メチオニン、ヒスチジン、ポリソルベート８０は不含）（Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）：全部で５８９．１２ｇ、溶液濃度５９．６ｍｇ／ｍＬの溶液が入った２本のＰＥＴＧボトル。
−Ａｍｐｕｗａ（注射用水）（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。
−２ｘＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬフィルターカセット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＰＬＣＴＫ ３０ｋＤａ膜、再生セルロースを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ ＤＦ／ＵＦユニット
−ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計、Ｓｐｅｃｏｒｄ５０、２８０ｎｍ波長
−Ｂｉｏｔｒｏｄｅプローブ番号５７付きの、Ｍｅｔｒｏｈｍ ｐＨメーター、タイプ７４４
−浸透圧計：Ｋｎａｕｅｒ、Ｋ−７４００
−Ｐａａｒの装置、ＤＭＡ４１００を用いた密度測定
−層流ボックスＨｅｒｅａｕｓ
−濁度測定：Ｈａｃｈ、２１００ＡＮ
−粘度計：Ｐａａｒ、ＡＭＶｎ
−重量計：Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、ＡＴ２６１及び３３．４５
−フィルター：Ｍｉｌｌｅｘ ＡＰ２０（グラスファイバー）及びＭｉｎｉｓａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｅｒ（酢酸セルロース）、０．２０μｍ孔サイズ。
２０．１実験手順
２．５（Ｅ）ｍｇｌ ＤＳ試料の融解：２３℃で循環水浴を用いて２時間以内に、凍結ＤＳを含有する２Ｌ ＰＥＴＧボトルを融解した。融解したＤＳは透明で、僅かに乳白色であり、目に見える粒子はなかった。
ＤＦ／ＵＦによるＤＳの濃縮：５３０ｍＬのＤＦ／ＵＦユニットリザーバー体積限界のため、２．５（Ｅ）ｍｇｌＤＳを５２５ｍＬの最終体積に濃縮した。
水を用いたＤＦ／ＵＦ（緩衝液交換）：４倍体積交換を利用して、ＤＳ（メチオニン、ヒスチジン、２．５（Ｅ）ｍｇｌ）をＤＦ／ＵＦに供した。表４３は、実験を通じて使用された水の量を与え、表４４は、実験パラメータを与える。
Figure 0005840364
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処理透過液約２００ｍＬごとに透過液の浸透圧測定を行った。
水に対するＤＦ／ＵＦ後、２．５（Ｅ）ｍｇｌ溶液の体積は４５０ｍＬであり、タンパク質濃度は７６．６ｍｇ／ｍＬであった。次に、基本的に水中で溶解された２．５（Ｅ）ｍｇｌを含有するこの溶液を濃縮した。
表４５：溶液濃縮に対するＤＦ／ＵＦプロセスパラメータ
Figure 0005840364
濃縮溶液（約１３０ｍｇ／ｍＬ）を０．２μｍろ過に供した。この溶液を２−８℃に冷却し、次いで−８０℃で保存した。
２０．２ ２．５（Ｅ）ｍｇｌのＤＦ／ＵＦ中に回収したデータ
Figure 0005840364
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Figure 0005840364
２０．３考察
２．５（Ｅ）ｍｇｌ（メチオニン、ヒスチジン中で緩衝化）がより高い濃度で基本的に水中で処方され得ることが実験から分かった（１３０ｍｇ／ｍＬで溶解限度は観察されず。）。水を用いた３体積交換後、透過液及び保持液の浸透圧は１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下であり、このことから、緩衝賦形剤が効果的に減少したことが分かった。２．５（Ｅ）ｍｇｌ溶液の乳白光は、水を用いたＤＦ／ＵＦ中で減少し（最適な外観）、これは濁度値の低下にも反映された（ＤＳ出発溶液の比濁分析の濁度単位（ＮＴＵ）１４．５、３倍体積交換後６．５５、４倍体積交換後１０．５）。
その他の抗体により見られるように、ＤＬＳにより測定した場合の流体力学直径は、賦形剤減少により縮小した（不規則なブラウン運動に加えて分子間電荷−電荷反発作用、その結果、分子の運動性がより高くなり、Ｄｈ値の計算値の低下につながる。）。２．５（Ｅ）ｍｇｌ溶液のｐＨは、基本的にＤＦ／ＵＦ操作前（ｐＨ５．９４）後（ｐＨ５．９９）で同じであった。
ＤＬＳ監視により示されるように、２．５（Ｅ）ｍｇｌは、ＤＦ／ＵＦ操作中、安定なままであった。高分子量試料の実質的な増加は検出されなかった。
（実施例２１）
水の中に製剤化されたアダリムマブの調製及びその安定性研究
以下の実施例は、上記実施例に記載されているプロセスから得られたアダリムマブを含む製剤の安定性について記載する。すなわち、アダリムマブは、水の中に首尾よく透析された。
材料及び方法
純水を用いて、アダリムマブ溶液３３２３．６ｇ（７１．３ｍｇ／ｍＬ）を透析ろ過した。純水での７倍容積交換後（理論的賦形剤減少率、９９．９％）、それぞれ、２２０及び６３ｍｇ／ｍＬの最終標的濃度になるように、タンパク質溶液を希釈／限外ろ過した。ＤＦ／ＵＦ処理プロセス後のタンパク質の状態を監視するために、ｐＨ、浸透圧、粘度、伝導度、ＰＣＳ、視覚的検査及びタンパク質濃度の測定（ＯＤ２８０）を行った。
ＤＦ／ＵＦ処理プロセス後に、タンパク質溶液を滅菌ろ過し（０．２２μｍＭｉｌｌｉｐａｋ−６０及びＭｉｌｌｉｐａｋ−２００膜フィルター）、その後、２７．５ＧＲＮＡ針及び無菌ＢＤＨｙＰａｋＢＳＣＦ４４３２／５０停止装置が装着されたＢＤ ＨｙＰａｋ ＳＣＦＴＭ１ｍＬ長注射器の中に充填した。充填容積は、約０．８２５ｍＬ／注射器であった。
充填後、それぞれ、２から８℃、２５℃及び４０℃で注射器を保存し、以下に図示されている試料吸引スキームに記されているように分析した。
・アダリムマブ薬物物質（アダリムマブ吸光係数２８０ｎｍ：１．３９ｍＬｍｇ・ｃｍ）：薬物物質は、ポリソルベート８０を含有しなかった。ＤＳ緩衝液、ｐＨ５．３８。
・ＵｌｔｒａｓｅｒｔＰＥＳ膜カセット（５０ｋＤａ及び３０ｋＤａカットオフ）が装着されたＳｏｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ透析ろ過システム。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅシステムは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従って、周囲温度で連続モードにて作動させた。
・ｐＨ電極
・タンパク質濃度測定（２８０ｎｍ波長）のために、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＵＶ可視光分光光度計Ｌａｍｂｄａ３５を使用した。濃度測定のために、使い捨てＵＶキュベット、１．５ｍＬ、セミミクロ、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）を使用した。
・ＤＦ／ＵＦ溶媒として、注射用無菌水Ｐｈ．Ｅｕｒ．／ＵＳＰを使用した。
・浸透圧測定のために（４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇＮａＣｌ較正溶液、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｙ１２４１、Ｈｅｒｂｅｒｔ ＫｎａｕｅｒＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙを用いて較正）、Ｖｏｇｅｌ ＯｓｍｏｍｅｔｅｒＯＭ８１５を使用した。
・Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓに従い、タンパク質溶液の粘度測定のために、Ａｎｔｏｎ ＰａａｒＭｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ、タイプＡＷＶｎを使用した。粘度は、２０℃で評価した。
・２５℃に対して標準化された伝導度測定のために、ＩｎｏＬａｂ Ｃｏｎｄ Ｌｅｖｅｌ２ＷＴＷを使用した。
・標準的な方法を適用して、Ｚ−平均値の測定のために、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳを使用した。球形粘度測定器（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｍｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ、ｔｙｐｅＡＷＶｎ、２５℃）を落とすことによって得られた粘度データを用いて、２５℃で測定を行った。
ＨＰＬＣ法
・アダリムマブ、ＳＥＣ分析：Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ カタログ番号１７５１７５−０１）。移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．５ｍＬ／分流速、周囲温度、検出ＵＶ２１４ｎｍ及び２８０ｎｍ。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で各試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈、試料注入量５０μｇ（２回注入）。
・アダリムマブ、ＩＥＣ分析：対応するガードカラム（ｐ／ｎ０５４９９４）付きのＤｉｏｎｅｘ、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ−１０カラム（ｐ／ｎ０５４９９３）。分離条件：移動相Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；移動相Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５。１．０ｍＬ／分の流速、周囲温度。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１．０ｍｇ／ｍＬに各試料を希釈、試料注入量１００μｇ、２回注入。
タンパク質濃度の計算
計算式：
Figure 0005840364
 ε−吸光係数
ｃ−濃度
ｄ−光が通過しなければならないキュベットの長さ
Ｅ−吸光度
Ｉ０−最初の光強度
Ｉ−試料を通過した後の光強度
Figure 0005840364
試料吸引スキーム
調製された溶液の試料を以下に列記されている温度で保存し、試験開始後の表記時点で吸引（ｘ）した。
Figure 0005840364
Figure 0005840364
アダリムマブのＤＦ／ＵＦ処理
表５１は、透析ろ過後のアダリムマブ特性を記載する。
Figure 0005840364
異なる温度での、透明性及び乳白光、液体の発色の度合い、ＳＥＣなど、保存時のアダリムマブの特性が、付表Ｄに記載されている。
結論
上記実施例は、モノクローナル抗体アダリムマブに対する透析ろ過溶媒として、水（無菌注射用水Ｐｈ．Ｅｕｒ．／ＵＳＰ）を使用した透析ろ過／限外ろ過（ＤＦ／ＵＦ）実験を提供する。
ＤＦ／ＵＦ交換溶媒として純水を使用することによって、アダリムマブをＤＦ／ＵＦ処理プロセスに供し、溶液の混濁、著しい乳白光又は濁度形成を誘導せずに、ｐＨ５．５７にて高い濃度（２２０ｍｇ／ｍＬ）で、及びｐＨ５．４４にてより低い濃度（６３ｍｇ／ｍＬ）で製剤化した。
２から８℃、２５℃及び４０℃で３ヶ月間、ＤＦ／ＵＦ実験から得られたアダリムマブをＳＣＦ注射器中に保存した。得られたデータは、タンパク質の好ましい全体的な安定性を示している。
結論的には、ＤＦ／ＵＦ交換溶媒として純水を使用してタンパク質を処理及び製剤化することは実行可能である。理想的な１００％の賦形剤膜透過率を仮定すると、約９９．９％の最大賦形剤減少率を推定することができる。
（実施例２２）
非イオン性賦形剤を用いた、水の中に製剤化されたアダリムマブの安定性研究
以下の実施例は、さらなる非イオン性賦形剤を加えた水の中に抗体、すなわちアダリムマブを含有する製剤の安定性研究について記載する。
材料及び方法
アダリムマブ材料は、実施例２１（ＤＦ／ＵＦ処理プロセス）のものと同じであった。ＤＦ／ＵＦ処理プロセス後に、表５２に表記されているように、タンパク質溶液を製剤化した。マニトール、ソルビトールなどの糖アルコールの群から得られる例として、マニトールを選択した。ショ糖、トレハロース、ラフィノース、マルトースなどの糖の群から得られる例として、ショ糖を選択した。ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＦ８６などのような非イオン性界面活性剤の群から得られる例として、ポリソルベート８０を選択した。何れの製剤に対しても、約１０．７ｍＬを調製した。調製後、あらゆる製剤に対して、浸透圧、粘度及びＰＣＳ測定を行った。
Figure 0005840364
調製物を滅菌ろ過し（ＭｉｌｌｅｘＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．２２μｍ、φ３３ｍｍ、Ａｒｔ．ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）、続いて、２７．５ＧＲＮＡ針及び無菌ＢＤＨｙＰａｋＢＳＣＦ４４３２／５０停止装置が装着されたＢＤ ＨｙＰａｋ ＳＣＦＴＭ１ｍＬ長注射器の中に充填した。充填容積は、約０．６ｍＬ／注射器であった。
充填後、それぞれ、２から８℃、２５℃及び４０℃で注射器を保存し、以下に図示されている試料吸引スキームに記されているように分析した。
・アダリムマブ薬物物質（アダリムマブ吸光係数２８０ｎｍ：１．３９ｍＬｍｇ・ｃｍ）：薬物物質は、ポリソルベート８０を含有しなかった。ＤＳ緩衝液、ｐＨ５．３８。
・ｐＨ電極
・ＤＦ／ＵＦ溶媒として、注射用無菌水Ｐｈ．Ｅｕｒ．／ＵＳＰを使用した。
・マニトール、ポリソルベート８０及びショ糖（全て、Ｐｈ．Ｅｕｒ．品質に合致する。）
・浸透圧測定のために（４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇＮａＣｌ較正溶液、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｙ１２４１、Ｈｅｒｂｅｒｔ ＫｎａｕｅｒＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙを用いて較正）、Ｖｏｇｅｌ ＯｓｍｏｍｅｔｅｒＯＭ８１５を使用した。
・Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従い、タンパク質溶液の粘度測定のために、Ａｎｔｏｎ ＰａａｒＭｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ、タイプＡＷＶｎを使用した。粘度は、２０℃で評価した。
・Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ（ウェルプレート中、３４４ｎｍでの吸収測定、濁度の評価）
・標準的な方法を適用して、Ｚ−平均値の測定のために、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳを使用した。球形粘度測定器（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｍｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ、ｔｙｐｅＡＷＶｎ、２５℃）を落とすことによって得られた粘度データを用いて、２５℃で測定を行った。
ＨＰＬＣ法
・アダリムマブ、ＳＥＣ分析：Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ カタログ番号１７５１７５−０１）。移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．５ｍＬ／分の流速、周囲温度、検出ＵＶ２１４ｎｍ及び２８０ｎｍ。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で各試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈、試料注入量５０μｇ（２回注入）。
・アダリムマブ、ＩＥＣ分析：対応するガードカラム付きのＤｉｏｎｅｘ、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ−１０カラム。分離条件：移動相Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；移動相Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５。１．０ｍＬ／分の流速、周囲温度。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１．０ｍｇ／ｍＬに各試料を希釈、試料注入量１００μｇ、２回注入。
試料吸引スキーム
調製された溶液の試料を５℃、２５℃及び４０℃で保存し、研究開始から１分後に（５℃及び４０℃）又はＴ０及び１分後（２５℃）に吸引した。試験パラメータは、適切な方法に従って測定した。例えば、色は視覚的に測定し、３４４ｎｍの吸収で濁度を測定した。
当初製剤の性質決定
表５３は、最初の製剤の浸透圧及び粘度を記載した。
Figure 0005840364
１つの濃度の全製剤は、等しい粘度を示した。ショ糖を含有する製剤の粘度は僅かに高かった。水中に高度に濃縮された製剤（例Ａ、粘度２７．９ｃＰ）と比べて、高度に濃縮された製剤の粘度が低いことは、ポリソルベート８０原溶液又は普通の水を用いた試料の希釈によって説明される（実施例２１における２２０ｍｇ／ｍＬと比べて、約２１５ｍｇ／ｍＬの最終濃度をもたらす。）。
表５４は、各試料に対して測定されたＰＣＳデータを記載する。
Figure 0005840364
表５４に提供されているデータは、ｚ−平均値が非イオン性賦形剤を含まない系（６３ｍｇ／ｍＬ、１．８５ｄ．ｎｍ、２２０ｍｇ／ｍＬ、０．３４ｄ．ｎｍ、実施例２１）におけるアダリムマブ溶液から得られた値と有意に異ならないことを示している。
保存時のアダリムマブの性質決定
付表Ｅは、保存時のアダリムマブ安定性に関するデータを提供する。
プラセボ溶液の伝導度
表５５は、様々なアダリムマブ製剤の伝導度に対する非イオン性賦形剤の影響を記載する。全てのプラセボ溶液は、無菌注射用水Ｐｈ．Ｅｕｒ．／ＵＳＰを用いて調製された。
Figure 0005840364
結論
２から８℃、２５℃及び４０℃で１ヶ月間、調製物をＳＣＦ注射器中に保存した。保存研究から得られたデータは、検査した全ての製剤中でタンパク質の全体的な安定性が存在することを示した。安定性データは、実施例２１から得られた試料の安定性と同等であった。非イオン性賦形剤を含有するプラセボ溶液の伝導度の測定は、幾つかの賦形剤に対して、数μＳ／ｃｍの範囲の伝導度の僅かな増加を示す。ＰＣＳ測定は、非イオン性賦形剤を含まない系と比べて、水力学的直径の有意な増加を示さない。
結論として、ＤＦ／ＵＦ交換溶媒として純水を用いたタンパク質を処理すること及び非イオン性賦形剤を加えた製剤は、実行可能である。以下の組成の緩衝液中でも、ＰＣＳによってアダリムマブを評価した。１０ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭクエン酸緩衝液、１２ｍｇ／ｍＬマニトール、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．２。アダリムマブ濃度は、それぞれ、５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬであった。ｚ平均値は、それぞれ、５０ｍｇ／ｍＬ製剤に対して１１．９ｄ．ｎｍであり、２００ｍｇ／ｍＬ製剤に対して１．０１ｄ．ｎｍであった。従って、あるタンパク質濃度での水力学的直径がイオン強度に依存することが明確に示された（塩含有緩衝液中で、明確に直径が大きい）。
（実施例２３）
非イオン性賦形剤を加えない水の中に製剤化されたＪ６９５の調製
以下の実施例は、さらなる非イオン性賦形剤を加えた水の中での抗体（すなわち、アダリムマブ）を含有する製剤の調製について記載する。本実施例は、さらなる非イオン性賦形剤を加えた水の中に製剤化されたＪ６９５の安定性（例えば、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＩＥＣによって測定される。）についても記載する。
材料及び方法
純水を用い、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットを適用して、異なるｐＨの２×３０ｍＬＪ６９５溶液（約１２５ｍｇ／ｍＬ）を透析した。それぞれ、３Ｌの純水に対して、試料の透析を３回行った（理論的な賦形剤減少率、１：１，０００，０００）。Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮装置を使用することによって、２００ｍｇ／ｍＬの最終標的濃度になるように、タンパク質溶液を限外ろ過した。処理プロセスの間及び後のタンパク質の状態を監視するために、ｐＨ、浸透圧、粘度、伝導度、ＰＣＳ、視覚的検査、ＨＰＬＣ及びタンパク質濃度の測定（ＯＤ２８０）を行った。
処理プロセス後、以下に表記されているように、タンパク質溶液を製剤化した。マニトール、ソルビトールなどの糖アルコールの群から得られる使用の例として、マニトールを選択した。ショ糖、トレハロース、ラフィノース、マルトースなどの糖の群から得られる使用の例として、ショ糖を選択した。ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＦ８６などのような非イオン性界面活性剤の群から得られる使用の例として、ポリソルベート８０を選択した。これらの製剤の各々に対して、０．５ｍＬの容量を調製した。試料調製後のタンパク質の状態を監視するために、ｐＨ、浸透圧、視覚的検査及びＨＰＬＣ分析を行った。
Figure 0005840364
 ・Ｊ６９５薬物物質（Ｊ６９５吸光係数２８０ｎｍ：１．４２ｍＬ／ｍｇ・ｃｍ）：薬物物質は、ポリソルベート８０を含有しなかった。ＤＳ緩衝液、ｐＨ６．２９。
・ｐＨ電極
・透析溶媒として、無機物が除去され及び滅菌ろ過された水を使用した。
・マニトール、ポリソルベート８０及びショ糖、全てＰｈ．Ｅｕｒ．品質に合致する
・浸透圧測定のために（４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇＮａＣｌ較正溶液、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｙ１２４１、Ｈｅｒｂｅｒｔ ＫｎａｕｅｒＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙを用いて較正）、Ｖｏｇｅｌ ＯｓｍｏｍｅｔｅｒＯＭ８１５を使用した。
・Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従い、タンパク質溶液の粘度測定のために、Ａｎｔｏｎ ＰａａｒＭｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ、タイプＡＷＶｎを使用した。粘度は、２０℃で評価した。
・Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ（ウェルプレート中、３４４ｎｍでの吸収測定、濁度の評価）
・Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１０Ｒ
・Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｔ Ｎｏ６６８３０）
・標準的なＯｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従って、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮装置、１０ＫＤａ ＰＥＳ膜（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｒｏｄｕｃｔ番号ＶＳ２００１）を使用した
・タンパク質濃度測定（２８０ｎｍ波長）のために、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＵＶ可視光分光光度計Ｌａｍｂｄａ３５を使用した。濃度測定のために、使い捨てＵＶキュベット、１．５ｍＬ、セミミクロ、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）を使用した。
・２５℃に対して標準化された伝導度測定のために、ＩｎｏＬａｂ Ｃｏｎｄ Ｌｅｖｅｌ２ＷＴＷ装置を使用した。
・標準的な方法を適用して、Ｚ−平均値の測定のために、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳを使用した。球形粘度測定器（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｍｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ、ｔｙｐｅＡＷＶｎ、２５℃）を落とすことによって得られた粘度データを用いて、２５℃で測定を行った。
ＨＰＬＣ法
・Ｊ６９５、ＳＥＣ分析：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｇ３０００ｓｗｘｌカラム、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍ（カタログ番号０８５４１）。移動相：２１１ｍＭＮａ２ＳＯ４／９２ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０。０．２５ｍＬ／分の流速、周囲温度、検出ＵＶ２１４ｎｍ及び２８０ｎｍ。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で各試料を２．０ｍｇ／ｍＬに希釈、試料注入量２０μｇ（２回注入）。
・Ｊ６９５、ＩＥＣ分析：対応するガードカラム（ｐ／ｎ０５４９９４）付きのＤｉｏｎｅｘ、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ−１０カラム（ｐ／ｎ０５４９９３）。分離条件：移動相Ａ：１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．０；移動相Ｂ：１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０。１．０ｍＬ／分の流速、３５℃温度。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１．０ｍｇ／ｍＬに各試料を希釈、試料注入量１００μｇ。
タンパク質濃度の計算
計算式：
Figure 0005840364
 ε−吸光係数
ｃ−濃度
ｄ−光が通過しなければならないキュベットの長さ
Ｅ−吸光度
Ｉ０−最初の光強度
Ｉ−試料を通過した後の光強度
Figure 0005840364
Ｊ６９５の処理プロセス
何れかの非イオン性賦形剤を添加する前に、水中のＪ６９５を性質決定した。表５７は、透析／限外ろ過の間のＪ６９５の性質決定の詳細を与える。
Figure 0005840364
非イオン性賦形剤を有する製剤の性質決定
Ｊ６９５製剤に様々な非イオン性賦形剤を添加した後（表５６中の記述参照）、各製剤を分析した。浸透圧及び視覚的検査から得られた結果及びｐＨが、下表５８に記載されている。
Figure 0005840364
ＨＰＬＣデータ
非イオン性賦形剤含有Ｊ６９５製剤の各々も、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＩＥＸを用いて調べた。これらの分析から得られたデータが表５９及び６０に提供されており、処理プロセス及び製剤の間のＪ６９５安定性の概要を与える。
Figure 0005840364
Figure 0005840364
Figure 0005840364
Figure 0005840364
結論
上記実施例は、モノクローナル抗体Ｊ６９５に対する透析溶媒として水（無機物が除去され及び滅菌ろ過された水）が使用された実験を提供する。
交換溶媒として純水を使用することによって、Ｊ６９５が透析及び濃縮処理プロセスに供され、溶液の混濁、著しい乳白光又は濁度形成を誘導せずに、ｐＨ５．４０及び６．４６にて、高い濃度（それぞれ、２０６及び１８２ｍｇ／ｍＬ）で製剤化した。
処理プロセス実験から得られたＪ６９５を性質決定し、様々な非イオン性賦形剤とともに製剤化した。得られたデータは、検査された製剤中でのタンパク質の好ましい全体的な安定性を示している。
結論的には、交換溶媒として純水を使用してタンパク質を処理すること及び非イオン性賦形剤との製剤化は実行可能である。理想的な１００％の賦形剤膜透過率を仮定すると、約９９．９％の最大賦形剤減少率を推定することができる。
（実施例２４）
水の中に製剤化されたアダリムマブの注射可能性
実施例２１から得られた製剤（６３及び２２０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ）を、シリンジを空にする際の力の測定に供した。それぞれ、２００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ及び１００ｍｇ／ｍＬになるようにアダリムマブの２２０ｍｇ／ｍＬ試料を希釈し、同じく評価した。８０ｍｍ／分の一定の供給速度でＺｗｉｃｋＺ２．５／ＴＮ１Ｓを使用した。最後に、２０℃で、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｍｉｃｒｏｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ、タイプＡＷＶｎを用いて、製剤の粘度データを評価した。以下のデータ群は、注射器を空にする際の滑り力に対して、針及び注射器の直径の両者が著しい影響を有することを示唆する。驚くべきことに、６３ｍｇ／ｍＬのより低濃縮製剤（２０℃で粘度１．８ｃＰ）と等しい枯渇力を加えることによって、２２０ｍｇ／ｍＬで高度に濃縮された溶液（２０℃で粘度２７．９ｃＰ）を送達することができる。
Figure 0005840364
上記は、タンパク質の高い濃度を用いた場合でさえ、このような製剤が、注射器を用いた投与（例えば、皮下）に資することを示唆する。
実施例２５から２８
実施例２５から２８は、水の中に製剤化された抗体を含有する様々な抗体製剤（実施例２６から２８において、低イオン強度タンパク質製剤と称される。）の凍結／融解安定性実験を記載する。凍結状態と液体状態の間に最大４回、様々なタンパク質製剤を行き来させることによって、多数の抗体の凍結融解挙動を評価した。凍結は、温度制御された−８０℃凍結装置を用いて行い、融解は、２５℃の温度制御された水槽を用いて行った。これらの実験の系列に対して、それぞれ抗体溶液約２５ｍＬを３０ｍＬのＰＥＴＧ貯蔵庫中に充填した。
目に見えない粒子の形成は、医薬タンパク質製剤における主要な安全上の関心事である。目に見えないタンパク質粒子は、製品の性質決定及び品質確保プログラムの一環として評価及び定量される可溶性凝集物及び化学的に修飾された種などの他の分解産物と同等又はより大きな程度まで、臨床成績に悪影響を与える可能性を有すると考えられる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、ＪＦ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ：Ｏｖｅｒｌｏｏｋｉｎｇ ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ｂａｐｓ ｔｈａｔ ｍａｙ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｑｕａｌｉｔｙ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２００８）。以下に列記されている実施例に示されているように、本発明の製剤中で製剤化されたときに、驚くべきことに、とりわけ、目に見えない粒子の形成に関して、多数の抗体が安定であった。
（実施例２５）
水の中に及び非イオン性賦形剤とともに製剤化されたアダリムマブの凍結／融解安定性
以下の実施例は、水製剤中及びその中に非イオン性賦形剤が添加された水製剤中の抗体（例えば、アダリムマブ）の安定性を記載する。実施例２１及び２２から得られた試料のアリコートを凍結／融解実験に供し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。以下の組成の緩衝液中でアダリムマブを使用する凍結／融解実験から得られたＳＥ−ＨＰＬＣの結果とデータを比較した。１０ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭクエン酸緩衝液、１２ｍｇ／ｍＬマニトール、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．２。この後者の緩衝液中のアダリムマブ濃度は、それぞれ、５０ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬであった。−８０℃まで凍結し、凍結装置中に８時間保存し、室温で１時間融解し、その後、試料を吸引することによって、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆキャップ中で凍結／融解サイクルを行った。各製剤を５サイクル（すなわち、以下の表に記載されているサイクル０、１、２、３、４及び５）に供した。
ＨＰＬＣ法
アダリムマブ、ＳＥＣ分析：Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ カタログ番号１７５１７５−０１）。移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．５ｍＬ／分の流速、周囲温度、検出ＵＶ２１４ｎｍ及び２８０ｎｍ。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で各試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈、試料注入量５０μｇ（２回注入）。
凍結／融解サイクルの際のアダリムマブの性質決定
表６２は、凍結／融解実験の間のアダリムマブの純度を記載する。試料の組成に関しては、実施例２１及び２２を参照されたい。
Figure 0005840364
Figure 0005840364
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結論
上記実施例は、水（無菌注射用水Ｐｈ．Ｅｕｒ．／ＵＳＰ）中にＤＦ／ＵＦ処理され、様々な非イオン性賦形剤とともに製剤化されたアダリムマブを凍結／融解サイクルに供した実験を提供する。（表６２に記載されている）得られたデータは、検査した全ての製剤中でタンパク質の好ましい全体的な安定性を示す。全ての製剤は、サイクルが継続するにつれて、凝集物又は断片の最小限の量とともに、９８．５％を超える単量体種を５回の凍結／融解サイクル後に含有していた。
（実施例２６）
低イオン性１Ｄ４．７溶液の凍結／融解安定性
透析（ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセットを使用、製造業者Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の使用説明書に従って使用）によって、１Ｄ４．７タンパク質（抗ＩＬ１２／抗ＩＬ２３ＩｇＧ１）を水の中に製剤化し、２ｍｇ／ｍＬ濃度、ｐＨ６での反復凍結／融解（ｆ／ｔ）処理（−８０℃／２５℃の水槽）の間に安定であることが示された。非経口タンパク質製剤の開発において一般に使用される緩衝液及び賦形剤を用いて、データを様々な製剤（２ｍｇ／ｍＬタンパク質、ｐＨ６）のデータと比較した。水の中に製剤化された１Ｄ４．７の安定性は確立された緩衝液系（例えば、２０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭグリシン、１０ｍＭホスファート又は１０ｍＭシトラート）中に製剤化された１Ｄ４．７の安定性を上回り、タンパク質製剤を安定化させるために一般的に使用される様々な賦形剤、例えば、１０ｍｇ／ｍＬマニトール、１０ｍｇ／ｍＬソルビトール、１０ｍｇ／ｍＬショ糖、０．０１％ポリソルベート８０又は２０ｍＭＮａＣｌと組み合わされた普遍的緩衝液（１０ｍＭホスファート、１０ｍＭシトラート）を基礎とする１Ｄ４．７製剤の安定性さえ上回ることが見出された。
タンパク質の安定性を監視するために、ＳＥＣ、ＤＬＳ及び粒子計数分析を適用し、１から２００μｍの測定範囲を有する粒子計数システム（粒子カウンターＭｏｄｅｌ Ｓｙｒｉｎｇｅ，Ｍａｒｋｕｓ Ｋｌｏｔｚ ＧｍｂＨ，Ｂａｄ Ｌｉｅｂｅｎｚｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、粒子計数を行った。実験の詳細は、以下のとおりである。
−上に列記されている製剤と比較される、水の中に製剤化された１Ｄ４．７
−４凍結／融解サイクルを適用
−３０ｍＬのＰＥＴＧ貯蔵庫、約２０ｍＬ充填、２ｍｇ／ｍＬタンパク質、ｐＨ６
−Ｔ０、Ｔ１（すなわち、１回のｆ／ｔ工程後）、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４での試料採取
−分析：視覚的検査、ＳＥＣ、ＤＬＳ、目に見えない粒子の測定
図３３は、１μｍを超える目に見えない粒子の形成によって反映される、反復ｆ／ｔサイクル（−８０℃／２５℃）の間の１Ｄ４．７の安定性を示す。普遍的緩衝液（１０ｍＭシトラート、１０ｍＭホスファート）中に、１Ｄ４．７を製剤化し、次いで、以下の様々な賦形剤を検査した。ソルビトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、マニトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、ショ糖（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びポリソルベート８０（０．０１％）。１Ｄ４．７は、（透析によって）賦形剤が全く添加されていない水の中にも製剤化した（図３３の「水」）。材料の取り扱い、ｆ／ｔ及び試料の吸引が粒子の搭載に対して及ぼし得る影響を調べるために、注射用水は、ｆ／ｔサイクル及び目に見えない粒子の検査にも供した。
ｆ／ｔの際の水中に製剤化された１Ｄ４．７の安定性は、タンパク質製剤中に典型的に使用される賦形剤とともに製剤化された１Ｄ４．７溶液の安定性を上回った。マニトール、ショ糖及びソルビトールは、凍結乾燥保護剤及び／又は凍結保護剤として作用することが知られており、ポリソルベート８０は、それぞれ、空気−水及び氷−水などの疎水性−親水性界面への曝露に際してタンパク質の物理的安定性を増加させることが広く知られている非イオン性賦形剤である。
まとめると、驚くべきことに、水の中に製剤化された１Ｄ４．７溶液は、凍結融解プロセスの際の医薬タンパク質の安定性を監視するために典型的に適用される様々な分析法（例えば、ＳＥＣ、視覚的検査、動的光散乱、特に、光掩蔽（ｌｉｇｈｔ ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ））、を用いて分析すると、安定であるように見受けられた。
（実施例２７）
低イオン性１３Ｃ５．５溶液の凍結／融解安定性
水の中に製剤化された１３Ｃ５．５（抗ＩＬ−１３ＩｇＧ１）は、２ｍｇ／ｍＬの濃度、ｐＨ６で、反復凍結／融解処理プロセス（−８０℃／２５℃水槽）の間に安定であることが示された。データを他の製剤（２ｍｇ／ｍＬタンパク質、ｐＨ６）と比較し、水中に製剤化された１３Ｃ５．５の安定性が非経口タンパク質製剤中でしばしば使用される緩衝液系（例えば、２０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭグリシン、１０ｍＭホスファート又は１０ｍＭシトラート）中に製剤化された１３Ｃ５．５の安定性を上回り、タンパク質製剤中で一般的に使用される様々な賦形剤（例えば、１０ｍｇ／ｍＬマニトール、１０ｍｇ／ｍＬソルビトール、１０ｍｇ／ｍＬショ糖、０．０１％ポリソルベート８０、２０ｍＭＮａＣｌ、２００ｍＭＮａＣｌ）と組み合わされた普遍的緩衝液（１０ｍＭホスファート、１０ｍＭシトラート）を基礎とする１３Ｃ５．５製剤の安定性さえ上回ることが見出された。
試料の調製、実験の処理プロセス、試料吸引及び試料の分析は、上の実施例に概説されているのと同様に行った。
−上に列記されている製剤と比較される、水の中に製剤化された１３Ｃ５．５
−４凍結／融解サイクルを適用
−３０ｍＬのＰＥＴＧ貯蔵庫
−２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６
−Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４での試料採取
−分析：視覚的検査、ＳＥＣ、ＤＬＳ、目に見えない粒子の測定
図３４は、＞１０μｍを超える目に見えない粒子の形成によって反映される、反復ｆ／ｔサイクル（−８０℃／２５℃）の間の１３Ｃ５．５の安定性を示す。１０ｍＭリン酸緩衝液、１０ｍＭクエン酸緩衝液、２０ｍＭグリシン緩衝液及び２０ｍＭヒスチジン緩衝液の何れかの中に、１３Ｃ５．５を製剤化した。（透析によって）賦形剤が全く添加されていない本発明の製剤中にも、１３Ｃ５．５を製剤化した。材料の取り扱い、ｆ／ｔ及び試料の吸引が粒子の搭載に対して及ぼし得る影響を評価するために、注射用水は、ｆ／ｔサイクル及び目に見えない粒子の検査にも供した（ブランクと称する。）。
ｆ／ｔの際の水中に製剤化された１３Ｃ５．５の安定性は、タンパク質製剤中に典型的に使用される緩衝液中に製剤化された１３Ｃ５．５溶液の安定性を上回った。適用した他の分析法（例えば、ＳＥＣ、視覚的検査など）でも、水の中に製剤化された１３Ｃ５．５溶液の不安定性は観察されなかった。
図３５は、＞１μｍを超える目に見えない粒子の形成によって反映される、反復ｆ／ｔサイクル（−８０℃／２５℃）の間の１３Ｃ５．５の安定性を示す。普遍的緩衝液（１０ｍＭシトラート、１０ｍＭホスファート）中に及び以下の様々な賦形剤（ソルビトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、マニトール（１０ｍｇ／ｍＬ）、ショ糖（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＮａＣｌ（２００ｍＭ）、ＮａＣｌ（２０ｍＭ）及びポリソルベート８０（０．０１％））と組み合わされた普遍的緩衝液中に１３Ｃ５．５を製剤化した。１３Ｃ５．５は、比較のために（透析によって）賦形剤が全く添加されていない水（純水）の中にも製剤化された。材料の取り扱い、ｆ／ｔ及び試料の吸引が粒子の搭載に対して及ぼし得る影響を評価するために、注射用水は、ｆ／ｔサイクル及び目に見えない粒子の検査にも供した。
ｆ／ｔの際の水中に製剤化された１３Ｃ５．５の安定性は、タンパク質製剤中に典型的に使用される賦形剤とともに製剤化された１３Ｃ５．５溶液の安定性を上回った。マニトール、ショ糖及びソルビトールは、凍結乾燥保護剤及び／又は凍結保護剤として作用することが知られており、ポリソルベート８０は、それぞれ、空気−水及び氷−水などの疎水性−親水性界面への曝露に際してタンパク質の物理的安定性を増加させることが広く知られている非イオン性賦形剤である。本発明の製剤中に製剤化された１３Ｃ５．５試料中の目に見えない粒子の少ない数は、驚くほど低いレベルであることが見出され、このような製剤の高い安全性及び安定性の可能性を示している。
適用した他の分析法（例えば、ＳＥＣ、視覚的検査など）でも、水の中に製剤化された１３Ｃ５．５溶液の不安定性は観察されなかった。
ｆ／ｔ操作後の１３Ｃ５．５溶液のＤＬＳ分析は、上述のように行った。ＤＬＳ分析から得られた結果は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０を加えた１３Ｃ５．５溶液が、ただ１回のｆ／ｔ工程後に、著しい高分子量（ＨＭＷ）凝集物形態を含有するのに対して、３回のｆ／ｔ工程の適用後にさえ、水中の１３Ｃ５．５はＨＭＷ凝集体形態を含有していなかった。
まとめると、驚くべきことに、水の中に製剤化された１３Ｃ５．５溶液は、凍結融解処理プロセスの際の医薬タンパク質の安定性を監視するために典型的に適用される様々な分析法（例えば、ＳＥＣ、視覚的検査、動的光散乱、特に、光掩蔽）、を用いて分析すると、安定であるように見受けられた。
（実施例２８）
低イオン性７Ｃ６溶液の凍結／融解安定性
水の中に製剤化された７Ｃ６（抗アミロイドβＩｇＧ１）は、２ｍｇ／ｍＬの濃度、ｐＨ６で、反復凍結／融解処理プロセス（−８０℃／３０℃水槽）の間に安定であることが示された。データを他の製剤（２ｍｇ／ｍＬタンパク質、ｐＨ６）と比較し、水中に製剤化された７Ｃ６の安定性が非経口タンパク質製剤中でしばしば使用される緩衝液系中に製剤化された７Ｃ６の安定性を上回り、タンパク質製剤中で一般的に使用される様々な賦形剤と組み合わされた普遍的緩衝液（１０ｍＭホスファート、１０ｍＭシトラート）を基礎とする７Ｃ６製剤の安定性さえ上回ることが見出された。
凍結／融解実験の間に７Ｃ６の物理的安定性を維持する能力に関して、以下の容積組成を調べた。
−ホスファート緩衝液、１５ｍＭ
−シトラート緩衝液、１５ｍＭ
−スクシナート緩衝液、１５ｍＭ
−ヒスチジン緩衝液、１５ｍＭ
−アルギニン緩衝液、１５ｍＭ
−低イオン性タンパク質製剤、賦形剤添加せず
−普遍的緩衝液、ソルビトール（１０ｍｇ／ｍＬ）
−普遍的緩衝液、マニトール（１０ｍｇ／ｍＬ）
−普遍的緩衝液、ショ糖（１０ｍｇ／ｍＬ）
−普遍的緩衝液、トレハロース（１０ｍｇ／ｍＬ）
−普遍的緩衝液、０．０１％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０
試料の調製、実験の処理プロセス、試料の吸引及び試料の分析は、実施例２６及び２７に概説されているのと極めて似た方法で行った。
−上に列記されている製剤と比較される、水の中に製剤化された７Ｃ６
−４凍結／融解サイクルを適用
−３０ｍＬのＰＥＴＧ貯蔵庫、約２０ｍＬ充填
−２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６
−Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４での試料採取
−分析：以下の方法によって、Ａβ抗体の安定性を評価した。
−タンパク質溶液の視覚的検査は、光掩蔽測定のために試料が充填されたポリプロピレン丸底管の中で行った。混濁、濁度及び粒子形成など、タンパク質の物理的不安定性を示唆する兆候に関して、黒及び白の両背景に対してタンパク質溶液を注意深く検査した。
−動的光散乱（ｅＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＡＩ９４９４；Ｈｅｌｌｍａ精度セルを搭載、ｓｕｐｒａｓｉｌ石英、タイプ１０５．２５１−ＱＳ、光路３ｍｍ、センターＺ８．５ｍｍ、少なくとも６０μＬ試料充填、ＰＰ丸底管での光掩蔽測定からの残存試料をＤＬＳ測定のために使用した。）。自動化された測定（１測定／試料）を行った。
−光掩蔽分析。層気流条件下で、５ｍＬの丸底管の中に試料３．５ｍＬを充填し、最初の０．８ｍＬの濯ぎの後、ｎ＝３モード（０．８ｍＬ／一回の測定）で、測定を行った。
−ＵＶ２１４／ＵＶ２８０及び多角光散乱と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー。移動相：１００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／２００ｍＭＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．０（無水リン酸水素二ナトリウム４９．６８ｇ及び無水硫酸ナトリウム９９．４４ｇを、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水の約３３００ｍＬ中に溶かし、１Ｍリン酸を用いて、７．０になるようにｐＨを調整し、３５００ｍＬの容積になるようにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を充填し、膜フィルターを通じて、溶液をろ過した。）。ＳＥＣカラム、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（カタログ番号０８５４１）、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、ＴＳＫゲルガード（カタログ番号０８５４３）と組み合わされた５μｍ６．０ｍｍ×４．０ｃｍ、７μｍ。流量０．３ｍＬ／分、注入容量２０μＬ（２０μｇの試料と等しい）、カラム温度室温、自動試料採取装置の温度２から８℃、実行時間５０分、グラジエントイソクラティック、１０％イソプロピルアルコールによるピストンの濯ぎ、紫外線吸収を介した検出、ダイオードアレイ検出装置：波長２１４ｎｍ、ピーク幅＞０．１分、バンド幅：８ｎｍ、参照波長３６０ｎｍ、バンド幅１００ｎｍ。
図３６は、１μｍを超える目に見えない粒子の形成によって反映される、反復ｆ／ｔサイクル（−８０℃／２５℃）の間の７Ｃ６の安定性を示す。多くの製剤に関して、ｆ／ｔの際の水中に製剤化された７Ｃ６の安定性は、タンパク質製剤中に典型的に使用される緩衝液中に製剤化された７Ｃ６溶液の安定性を上回った。適用された他の分析法（例えば、ＳＥＣ、視覚的検査、動的光散乱）を用いて、水の中に製剤化された７Ｃ６溶液の不安定性は観察されなかった。
驚くべきことに、ｆ／ｔの際の水中に製剤化された７Ｃ６の安定性は、タンパク質製剤中で典型的に使用される賦形剤とともに製剤化された７Ｃ６の安定性を上回った。マニトール、ショ糖及びソルビトールは、凍結乾燥保護剤及び／又は凍結保護剤として作用することが知られており、ポリソルベート８０は、それぞれ、空気−水及び氷−水などの疎水性−親水性界面への曝露に際してタンパク質の物理的安定性を増加させることが広く知られている非イオン性賦形剤である。本発明の製剤中に製剤化された７Ｃ６試料中の目に見えない粒子の少ない数は、驚くほど低いレベルであることが見出され、このような製剤の高い安全性及び安定性の可能性を示している。
まとめると、驚くべきことに、水の中に製剤化された７Ｃ６溶液は、凍結融解処理プロセスの際の医薬タンパク質の安定性を監視するために典型的に適用される様々な分析法（例えば、ＳＥＣ、視覚的検査、動的光散乱、特に、光掩蔽）、を用いて分析すると、安定であるように見受けられた。
（実施例２９）
水の中に製剤化されたＪ６９５の調製及びその安定性研究
材料及び方法
精製された水を用いて、Ｊ６９５の４２７．１ｇ（８０ｍｇ／ｍＬ）を４０ｍｇ／ｍＬに希釈した。精製された水での５倍容積交換後（理論的賦形剤減少率、９９．３％）、１００ｍｇ／ｍＬの標的濃度になるように、タンパク質溶液を限外ろ過した。ＤＦ／ＵＦ処理プロセス後のタンパク質の状態を監視するために、ｐＨ、浸透圧、密度、視覚的検査及びタンパク質濃度の測定（ＯＤ２８０）を行った。
ＤＦ／ＵＦ処理プロセス後に、６０ｍＬのＰＥＴＧ瓶（Ｎａｌｇｅｎｅ）の中にタンパク質溶液を滅菌ろ過し（０．２２μｍＳｔｅｒｉｖｅｘＧＶ膜フィルター）、その後、−８０℃で３ヶ月間保存した。
３７℃での融解後、溶液を滅菌ろ過し（０．２２μｍＳｔｅｒｉｖｅｘＧＶ膜フィルター）、無菌ＢＤ ＨｙＰａｋ Ｐｈｙｓｉｏｌｉｓ ＳＣＦＴＭ１ｍＬ長注射器２９Ｇ、１／２インチ、５ベベル角度、ＲＮＳ ＴＰＥの中に充填し、無菌ＢＤ Ｈｙｐａｋ ＳＣＦＴＭ１ｍＬＷ４０２３／５０Ｆｌｕｒ Ｄａｉｋｙｏストッパーで閉鎖した。充填容量は、１，０００ｍＬ／注射器であった。
充填後、それぞれ、２から８℃及び４０℃で注射器を保存し、以下に図示されている試料吸引スキームに記されているように分析した。
・Ｊ６９５薬物物質（２８０ｎｍでの吸光係数：１．４２ｍＬｍｇ・ｃｍ）：薬物物質、ｐＨ６．０は、ポリソルベート８０を含有しなかった。
・ＵｌｔｒａｓｅｒｔＰＥＳ膜カセット（５０ｋＤａカットオフ）が装着されたＳｏｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ透析ろ過システム。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅシステムは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従って、周囲温度で連続モードにて作動させた。
・ｐＨ電極
・タンパク質濃度測定（２８０ｎｍ波長）のために、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＵＶ可視光分光光度計Ｌａｍｂｄａ２５を使用した。濃度測定のために、使い捨てＵＶキュベット、１．５ｍＬ、セミミクロを使用した。
・ＤＦ／ＵＦ溶媒として、０．２２μｍろ過された精製水を使用した。
・密度測定のために、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｅｔｅｒ ＤＭＡ４１００を使用した
・浸透圧測定のために（４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇＮａＣｌ較正溶液、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｙ１２４１、Ｈｅｒｂｅｒｔ ＫｎａｕｅｒＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙを用いて較正）、Ｋｎａｕｅｒ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ Ｔｙｐｅ ＭＬを使用した。
分析法
・Ｊ６９５、ＳＥＣ分析：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。移動相：９２ｍＭリン酸水素二ナトリウム、２１１ｍＭ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．７５ｍＬ／分の流速、周囲温度、検出ＵＶ２１４ｎｍ。移動相で各試料を２．０ｍｇ／ｍＬに希釈、試料注入量２０μｇ（２回注入）。
・Ｊ６９５、ＩＥＣ分析：対応するガードカラム付きのＤｉｏｎｅｘ、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ−１０カラム。分離条件：移動相Ａ：２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム及び２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０；移動相Ｂ：２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０。１．０ｍＬ／分の流速、周囲温度。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１．０ｍｇ／ｍＬに各試料を希釈、試料注入量１００μｇ、２回注入。
・Ｊ６９５、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：Ｎｏｖｅｘアクリルアミドスラブゲル（非還元条件に対して８から１６％、還元条件に対して１２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。１０倍原溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から作製されたＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液を用いて、還元（β−メルカプトエタノール）及び非還元条件下で分離。
・Ｊ６９５、緩衝液成分の定量
・マニトール：ＲｅｐｒｏＧｅｌＣａカラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による分離及びＲＩ検出、移動相：脱イオン水、０．６ｍＬ／分の流速、２０μＬの試料注入。外部較正標準曲線を用いて、定量を行った。
・ヒスチジン及びメチオニン：ＯＰＡ（オルト−フタル酸アルデヒド）でのアミノ酸の蛍光標識及びＲｅｐｒｏＳｉｌＯＤＳ−３カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によるＨＰＬＣ分離及び４２０ｎｍでの蛍光検出（３３０ｎｍでの吸光）、移動相Ａ：７０％クエン酸（１０．５１ｇ／Ｌ）緩衝液、ｐＨ６．５、３０％メタノール、移動相Ｂ：メタノール、１．０ｍＬ／分の流速、２０μＬの試料注入。外部較正標準曲線を用いて、定量を行った。
・Ｊ６９５、ＰＣＳ分析：４．３８７５ｍＰａｓの溶液粘度、１．４５０のタンパク質の屈折率及び１．３３５の緩衝溶液の屈折率を仮定し、１７３°の角度で、Ａ Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳを用いて、２５℃で、使い捨てのプラスチックキュベット中において、１００ｍｇ／ｍＬで希釈せずに行った。それぞれ、２０スキャン、２０秒の平均結果が報告されている。
タンパク質濃度の計算
計算式：
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 ε−吸光係数
ｃ−濃度
ｄ−光が通過しなければならないキュベットの長さ
Ｅ−吸光度
Ｉ０−最初の光強度
Ｉ−試料を通過した後の光強度
Figure 0005840364
試料吸引スキーム
調製された溶液の試料を以下に列記されている温度で保存し、試験開始後の表記時点で吸引（ｘ）した（表６３）。検査パラメータ及び方法は、表６４に記載されている。
Figure 0005840364
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Ｊ６９５のＤＦ／ＵＦ処理プロセス
表６５は、透析ろ過後のＪ６９５の状態を提供する。
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ＤＦ／ＵＦ後に、ＤＦの有効性を評価するために当初の緩衝液成分の濃度を定量的に監視した。全ての結果は、対応する分析法の実際の検出限界を下回る（表６６参照）ことが見出された（マニトールに対して、ＲＩを有するＨＰＬＣ並びに、それぞれ、ＯＰＡ標識後のメチオニン及びヒスチジンに対して、蛍光検出）。
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結論
上記実施例は、モノクローナル抗体Ｊ６９５に対する透析ろ過溶媒として、水（０．２２μｍろ過された精製水）が使用された透析ろ過／限外ろ過（ＤＦ／ＵＦ）実験を提供する。
Ｊ６９５は、ＤＦ／ＵＦ交換溶媒として純水を用いるＤＦ／ＵＦ処理プロセスに供され、溶液の混濁、著しい乳白光又は濁度形成を誘導せずに、約ｐＨ６．４にて、高い濃度（１００ｍｇ／ｍＬ）で製剤化した。
ＤＦ／ＵＦ実験から得られたＪ６９５を、最長６ヶ月間、２から８℃及び４０℃で、ＳＣＦ注射器中に保存された。得られたデータは、タンパク質の好ましい全体的な安定性を示している。
結論的には、ＤＦ／ＵＦ交換溶媒として純水を使用してタンパク質を処理し及び製剤化することは実行可能である。理想的な１００％の賦形剤膜透過率を仮定すると、約９９．３％の最大賦形剤減少率を推定することができる。ＤＦ／ＵＦ後に、賦形剤濃度は実際的な検出限界を下回るという証拠が、特定の方法によって与えられる。
（実施例３０）
高濃度アダリムマブ水溶液の凍結融解特性及び安定性検査−均一性及び物理的安定性
低イオン性アダリムマブ溶液の調製
２ＬのＰＥＴＧ瓶中の薬物物質（ＤＳ）材料１．６Ｌを、水槽中において、２５℃で融解し、均質化し、透析ろ過交換溶媒として注射用水を用いるＤＦ／ＵＦに供した。以下のパラメータを適用することによって、Ｓａｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ装置を用いた連続モードで、透析ろ過を行った。
−ポンプ出力：８％
−圧力注入口：最大１バール（０．８バール）
−膜：２×ＰＥＳ、カットオフ５０ｋＤ
透析ろ過の間、浸透圧を８ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇまで低下させるのに、５倍容量交換が十分であった。
透析ろ過後の前（ＳＥＣ、ＯＤ２８０によるタンパク質濃度、ｐＨ、浸透圧及び密度）及び透析ろ過の後（ＯＤ２８０によるタンパク質濃度、ｐＨ、浸透圧及び密度）に、イン−プロセス−対照（ＩＰＣ）試料を吸引した。ＩＰＣ試料は、無菌でなかった。
透析ろ過後に、水の中に製剤化された約７０ｍｇ／ｍＬアダリムマブを、注射用水で５０ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、５．２になるように、ｐＨ値を調整した。
水ｐＨ５．２の中に製剤化されたアダリムマブ５０ｍｇ／ｍＬの１．６Ｌを２ＬのＰＥＴＧ瓶中に再充填した。１００ｍｇ／ｍＬになるように濃度を増加させるために、アダリムマブ溶液の残りの容積をＤＦ／ＵＦに供した。
水ｐＨ５．３の中に製剤化されたアダリムマブ１００ｍｇ／ｍＬを滅菌ろ過し、そのうち０．８ｍＬを１ＬのＰＥＴＧ瓶の中に充填した。
分析
−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
−ｐＨ−測定
−浸透圧測定
−密度測定
−ＯＤ２８０によるタンパク質濃度
−光学的外観
−イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
アダリムマブ１Ｌ容器の凍結／融解実験
１ＬのＰＥＴＧ溶液中で水の中に製剤化されたアダリムマブ１００°ｍｇ／ｍＬを２から８℃になるように予め冷却し、次いで、−８０℃で凍結し、１２時間を越える凍結サイクル。水槽中において、２５℃で、１ＬのＰＥＴＧ瓶中の凍結された試料を連続的に融解した。融解の間、凍結された溶液の瓶を、最大液体レベルまで水槽中に浸した。均質化せずに、並びに１５及び３０回、上下を逆さまにすることによる均質化後に、融解直後に以下の試料を吸引した。
Figure 0005840364
アダリムマブ溶液の性質決定
水の中に製剤化されたアダリムマブ５０ｍｇ／ｍＬ及び１００°ｍｇ／ｍＬは、毎回透明で、淡黄色、非乳白光で、緩やかな動きの後に波状パターンがないように見受けられた。
また、凍結及び融解した後、水中に製剤化されたアダリムマブは、（融解直後に並びに１５及び３０回上下を逆さまにした後に）外観を変化させなかった。
融解直後に、及び融解直後の試料吸引の間、溶液中に針を浸した直後に、瓶を緩やかな動きの後に、僅かな波状パターンが見られた。
市販の緩衝液中のアダリムマブを用いた類似の実験とは異なり、水中のアダリムマブ溶液５０ｍｇ／ｍＬは、タンパク質濃度、密度及び浸透圧の勾配を一切示さなかった。
アダリムマブ溶液１００ｍｇ／ｍＬも、タンパク質濃度、密度、浸透圧の勾配を一切示さなかった。
安定性は、それぞれ、−３０℃及び−８０℃での６ヶ月の保存後に評価した。
以下では、各分析データが概説されている。
Figure 0005840364
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結論
凍結／融解処理プロセス後及び最長６ヶ月間の−３０℃又は−８０℃の保存後に、５０及び１００ｍｇ／ｍＬで水の中に製剤化されたアダリムマブの顕著な不安定性は、適用された分析法を用いて観察されなかった。
（実施例３１）
低イオン性製剤中でのアダリムマブの凍結及び融解プロセス−タンパク質含量を含むプロセス設計空間
溶液の調製
２３℃の循環する水槽中で、アダリムマブＢＤＳ（バルク薬物物質）を融解した。限外ろ過／透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）法（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ「Ｍｉｎｉ」２）を使用して、容量を低下させる目的で、１００ｍｇ／ｍＬの標的濃度になるように、溶液を上方濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）した。Ｂｉｏｍａｘ１０Ｋポリエーテルスルホンを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２接線流ミニカセットの２つのカセットを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ユニット中に取り付けた。プロセスの開始時に、流速は６０ｍＬ／分で測定され、供給圧力は２１ｐｓｉであった。プロセスは、１１１．３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で停止された。
透析のために、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ分子多孔性膜チューブを使用した（直径４８ｍｍ、１８ｍＬ／ｃｍ容積、７５ｃｍ長）。ｐＨ５．２のアダリムマブ１００ｍｇ／ｍＬの８Ｌの容積を、８つの透析管に移した。各管に、アダリムマブ１００ｍｇ／ｍＬの１Ｌを充填した。溶液４Ｌに等しい４つの管を、注射用水３６Ｌを加えた容器中に配置した。すなわち、１：１０の溶液交換倍数が達成された。新鮮な注射用水に対して容量が交換される前に、溶液を平衡に達成させた。１：１００，０００の総溶液交換倍数に到達するまで、溶液交換を５回繰り返した。
透析によって溶液を完全に交換した後、第二のＵＦ／ＤＦ工程によって上方濃縮した。第二のＵＦ／ＤＦ工程は、第一の工程と同様に実施した。低イオン性製剤中の２４７．５ｍｇ／ｍＬアダリムマブの最終濃度が達成された。ＵＦ／ＤＦは、ポリソルベート８０を既に含有する出発材料を用いて行った。最終タンパク質溶液中に蓄積されるポリソルベート８０は、０．１％より高いポリソルベート含量をもたらすと予測することができた。
必要に応じて、タンパク質濃度レベルを低下させるために、２４７．５ｍｇ／ｍＬアダリムマブの上方濃縮されたバルク溶液をＷＦＩで希釈した。２００ｍｇ／ｍｌ、１７５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ及び２５ｍｇ／ｍｌ。瓶の充填容量は、全ての実験に対して１６００ｍＬであった。
凍結操作
この評価では、一連の増加する凍結速度を使用した。超低温凍結装置下部棚＜超低温凍結装置中央棚＜超低温凍結装置上部棚＜＜ドライアイス。
−７０℃未満の凍結装置を実験のために使用した（収容容量２０．２立方フィート（５７２リットル）。３つの棚を使用した。各々に、９つの２リットルＰＥＴＧ瓶を配置した。瓶は、凍結装置中に配置する前に、室温で保存した。凍結は、少なくとも４８時間継続する。設計空間評価のために、増大する凍結速度を有する３つの位置を選択した。最も遅い凍結速度のために、下部棚の前方位置を使用した。中央棚上の中心位置で、より早い凍結速度を達成した。凍結装置設定中で最も早い凍結速度は、上部棚の後方／右位置で行われた。
ドライアイスによる凍結において、少なくとも８時間、ドライアイスによって、１つの瓶を完全に囲んだ。Ｓｔｙｒｏｆｏａｍボックスでは、ドライアイスの層（約３から５ｃｍ厚）で底を覆った。ドライアイス層の上部に立てて、１つの瓶を配置した。その結果、瓶とｓｔｙｒｏｆｏａｍボックスの内壁との間の空間は、蓋を除く全ての表面が被覆されるまで、ドライアイスで満たされた。凍結時間の後、瓶を取り出し、直ちに融解し、又は保存のために、−７０℃の凍結装置中に配置した。
融解操作
この評価では、一連の融解速度を使用した。４℃の冷却された空気＜＜水槽２３℃＜水槽３７℃。
分析
試料を性質決定するために、以下の分析を行った。
・浸透圧
・伝導度
・ｐＨ
・密度
・直接のＵＶ（２８０ｎｍ）によるタンパク質濃度
濃縮試験のために、１．２未満の吸光度が達成されるまで、水で試料を希釈した。１．３９の２８０ｎｍでのアダリムマブ分子に対する吸光係数を使用した。
アダリムマブ溶液の性質決定
ボトルマッピング研究によって、瓶容積中で勾配形成に対する僅かな傾向が明らかになった。特に、より遅い凍結及び融解速度に関して、瓶の底近くに、より高いタンパク質濃度が検出された。この現象は、伝導度、密度及び浸透圧データ中でも反映された。ｐＨは、全ての検査条件において、実質的に一定であるように見受けられる。
超低温凍結装置中での瓶を基礎とする系に対する凍結及び融解の設計空間に関する以前の調査において、沈降の外見は、可能な稼動域の境界を決定する主な不具合の様式であることが見出された。この研究では、この境界は観察されなかったが、調査された設計空間は極めて幅広い範囲にわたっていた。この産物の独特の挙動は、この凍結及び融解プロセスの間に濃度勾配を形成する傾向が極めて低いことにも反映されている。以前の研究では、産物及びプロセスに固有の勾配形成が、あるプロセス条件下での沈殿の出現の原因であると結論付けられた。その結果、プロセスの見地から、この系は、最大２４７．５ｍｇ／ｍＬのバルク薬物物質濃度まで、低イオン性製剤ｐＨ５中のアダリムマブに対して実行可能であることが決定された。驚くべきことに、調査されたアダリムマブ水製剤は、検査された他のアダリムマブ製剤と比べて、優れた性能を示した。
表７３：低イオン性製剤を含有する瓶中での融解直後（２３℃水槽）の１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブにおけるタンパク質濃度、伝導度、浸透圧、密度及びｐＨの分布
Figure 0005840364
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表７４：低イオン性製剤を含有する瓶中での融解直後（２３℃水槽）の１４０ｍｇ／ｍＬアダリムマブにおけるタンパク質濃度、伝導度、浸透圧、密度及びｐＨの分布
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表７５：低イオン性製剤を含有する瓶中での融解直後（３７℃水槽）の２００ｍｇ／ｍＬアダリムマブにおけるタンパク質濃度、伝導度、浸透圧、密度及びｐＨの分布
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表７６：低イオン性製剤を含有する瓶中での融解直後（２３℃水槽）の２４７．５ｍｇ／ｍＬアダリムマブにおけるタンパク質濃度、伝導度、浸透圧、密度及びｐＨの分布
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表７７：ドライアイス凍結後の低イオン性製剤を含有する瓶中での融解直後（２３℃水槽）の２４７．５ｍｇ／ｍＬアダリムマブにおけるタンパク質濃度、伝導度、浸透圧、密度及びｐＨの分布
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均等物
当業者は、定型的な実験操作のみを用いて、本明細書に記載されている発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。本願を通じて引用されている特許及び公開された特許出願は、参照により、本明細書に組み込まれる。

Claims (88)

  1. アダリムマブ及び水を含む水性製剤であって、前記製剤は２．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有し、かつ前記アダリムマブの濃度は少なくとも３０ｍｇ／ｍＬである水性製剤。
  2. 製剤が２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する、請求項１の製剤。
  3. 製剤が１．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する、請求項１の製剤。
  4. 製剤が１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する、請求項１の製剤。
  5. 製剤が０．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する、請求項１の製剤。
  6. アダリムマブの濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１の製剤。
  7. アダリムマブの濃度が５０ｍｇ／ｍＬである請求項１の製剤。
  8. アダリムマブの濃度が少なくとも１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１の製剤。
  9. アダリムマブの濃度が１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１の製剤。
  10. アダリムマブの濃度が少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１の製剤。
  11. アダリムマブの濃度が１５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１の製剤。
  12. アダリムマブの濃度が少なくとも２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１の製剤。
  13. アダリムマブの濃度が２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１の製剤。
  14. アダリムマブの濃度が２００ｍｇ／ｍＬより大きい、請求項１の製剤。
  15. 少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度のアダリムマブ及び水を含む水性製剤であって、前記製剤は、３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下の浸透圧を有する水性製剤。
  16. 製剤の浸透圧が１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下である、請求項１５の製剤。
  17. アダリムマブの濃度は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１５の製剤。
  18. アダリムマブの濃度が５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１５の製剤。
  19. アダリムマブの濃度が１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１５の製剤。
  20. アダリムマブの濃度が少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１５の製剤。
  21. アダリムマブの濃度が１５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１５の製剤。
  22. アダリムマブの濃度が少なくとも２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１５の製剤。
  23. アダリムマブの濃度が２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１５の製剤。
  24. アダリムマブの濃度が２００ｍｇ／ｍＬより大きい、請求項１５の製剤。
  25. 水及び少なくとも２０ｍｇ／ｍＬのアダリムマブを含む水性製剤であって、前記抗体アダリムマブの水力学的直径（Ｄｈ）は、緩衝化された溶液中のアダリムマブのＤｈより少なくとも５０％小さく、緩衝化された溶液中のアダリムマブの濃度は、水性製剤中のアダリムマブの濃度と同じである、水性製剤。
  26. アダリムマブのＤｈが、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）中のアダリムマブのＤｈより少なくとも５０％小さい、請求項２５の製剤。
  27. アダリムマブのＤｈが、ＰＢＳ中のアダリムマブのＤｈより少なくとも６０％小さい、請求項２６の製剤。
  28. アダリムマブのＤｈが、ＰＢＳ中の前記アダリムマブのＤｈより少なくとも７０％小さい、請求項２６の製剤。
  29. 少なくとも２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアダリムマブ及び水を含み、前記アダリムマブが４ｎｍ未満の水力学的直径（Ｄｈ）を有する、水性製剤。
  30. アダリムマブが３ｎｍ未満のＤｈを有する、請求項２９の製剤。
  31. 非イオン性の賦形剤をさらに含む、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  32. 非イオン性の賦形剤がポリオール、非イオン性界面活性剤、ショ糖、トレハロース、ラフィノース及びマルトースからなる群から選択される、請求項３１の製剤。
  33. 非イオン性界面活性剤がポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０又はポリソルベート８０である、請求項３２の製剤。
  34. 製剤が液体形態で少なくとも３ヶ月間安定である、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  35. 製剤が液体形態で少なくとも１２ヶ月間安定である、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  36. 製剤が、凍結、凍結乾燥又は噴霧乾燥からなる群から選択される形態で、少なくとも３ヶ月間安定である、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  37. 製剤が浸透圧修飾剤、安定化剤、界面活性剤、抗酸化剤、凍結保護剤、充填剤、凍結乾燥保護剤、塩基性成分及び酸性成分からなる群から選択される因子を含まない、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  38. 少なくとも１つのさらなる別個のタンパク質をさらに含む、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  39. インビトロでの使用に適している、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  40. インビボでの使用に適している、請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  41. 皮下、静脈内、吸入、皮内、経皮、腹腔内及び筋肉内投与からなる群から選択される投与の様式を介して、対象に投与するのに適している、請求項４０の製剤。
  42. 請求項１から３０の何れか一項の製剤を含む装置。
  43. 注射器、ペン、インプラント、無針注入装置、吸入装置及びパッチからなる群から選択される、請求項４２の装置。
  44. 請求項１から３０の何れか一項の製剤を含む製品。
  45. ａ）アダリムマブを含む、透析ろ過に供される第１の溶液を準備すること、及び
    ｂ）アダリムマブの水性製剤を調製するために、少なくとも５倍の容積の水との交換が達成されるまで、透析ろ過溶媒として水を使用する透析ろ過に前記第１の溶液を供すること、
    を含む、アダリムマブ及び水を含む水性製剤を調製する方法。
  46. ａ）アダリムマブを含む、透析ろ過に供される第１の溶液を準備すること；
    ｂ）透析ろ過されたアダリムマブ溶液を調製するために、少なくとも５倍の容積の水との交換が達成されるまで、透析ろ過溶媒として水を使用する透析ろ過に前記第１の溶液を供すること、及び
    ｃ）アダリムマブの水性製剤を調製するために、透析ろ過されたアダリムマブ溶液を濃縮すること、
    を含む、アダリムマブの水性製剤を調製する方法。
  47. 透析ろ過されたアダリムマブ溶液の濃縮が遠心を介して達成される、請求項４６の方法。
  48. 透析ろ過溶媒が水からなる、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  49. 少なくとも６倍の容積交換が達成されるまで、第１の溶液が水との透析ろ過に供される、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  50. 少なくとも７倍の容積交換が達成されるまで、第１の溶液が水との透析ろ過に供される、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  51. 水性製剤が、第１の溶液より少なくとも９５％低い賦形剤の最終濃度を有する、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  52. 水性製剤が、第１の溶液より少なくとも９９％低い賦形剤の最終濃度を有する、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  53. 最初のアダリムマブ溶液が、哺乳動物の細胞発現系から得られ、及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去するために精製されている、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  54. 賦形剤を水性製剤に添加することをさらに含む、請求項４５から４７の何れか一項の方法であって、該水性製剤の伝導度が２．５ｍＳ／ｃｍ未満である、方法。
  55. 水性製剤が医薬製剤である、請求項５４の方法。
  56. 水性製剤が医薬製剤である、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  57. 水性製剤を対象に投与するのに適した装置中に水性製剤を搭載することをさらに含む、請求項５６の方法。
  58. 装置が注射器、ペン、インプラント及び皮膚パッチからなる群から選択される、請求項５７の方法。
  59. 水性製剤が少なくとも２つの異なるタンパク質を含む、請求項４５から４７の何れか一項の方法。
  60. 非イオン性の賦形剤がポリオールである、請求項３１の製剤。
  61. ポリオールがマンニトール又はソルビトールである請求項６０の製剤。
  62. ポリオールがマンニトールである請求項６１の製剤。
  63. 非イオン性の賦形剤が、非イオン性界面活性剤である請求項３１の製剤。
  64. 非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である請求項６３の製剤。
  65. 非イオン性の賦形剤が、ショ糖である請求項３１の製剤。
  66. マンニトール及びポリソルベート８０をさらに含む請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  67. ショ糖及びポリソルベート８０をさらに含む請求項１から３０の何れか一項の製剤。
  68. マンニトール、ポリソルベート８０、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアダリムマブ、及び水を含む水性製剤であって、２．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する水性製剤。
  69. １．０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する請求項６８の製剤。
  70. ０．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する請求項６８の製剤。
  71. 抗体の濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍＬである請求項６８の製剤。
  72. アダリムマブの濃度が５０ｍｇ／ｍＬである請求項６８の製剤。
  73. アダリムマブの濃度が１００ｍｇ／ｍＬである請求項６８の製剤。
  74. マンニトール、ポリソルベート８０、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアダリムマブ、及び水を含む水性製剤であって、該アダリムマブの水力学的直径（Ｄｈ）は、緩衝化された溶液中におけるアダリムマブのＤｈより少なくとも５０％小さい水力学的直径（Ｄｈ）を有する製剤であって、緩衝化された溶液中のアダリムマブの濃度は、水性製剤に含まれるアダリムマブの濃度と同じである、水性製剤。
  75. アダリムマブのＤｈが、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）溶液中におけるアダリムマブのＤｈより少なくとも５０％小さい水力学的直径（Ｄｈ）を有する請求項７４の製剤。
  76. アダリムマブのＤｈが、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）溶液中におけるアダリムマブのＤｈより少なくとも６０％小さい水力学的直径（Ｄｈ）を有する請求項７５の製剤。
  77. アダリムマブのＤｈが、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）溶液中におけるアダリムマブのＤｈより少なくとも７０％小さい水力学的直径（Ｄｈ）を有する請求項７６に記載の製剤。
  78. 製剤及び緩衝化された溶液におけるアダリムマブの濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍＬである請求項７４の製剤。
  79. 製剤及び緩衝化された溶液におけるアダリムマブの濃度が５０ｍｇ／ｍＬである請求項７４の製剤。
  80. 製剤及び緩衝化された溶液におけるアダリムマブの濃度が１００ｍｇ／ｍＬである請求項７４の製剤。
  81. マンニトール、ポリソルベート８０、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアダリムマブ、及び水を含む水性製剤であって、アダリムマブの水力学的直径（Ｄｈ）が４ｎｍより小さい製剤。
  82. アダリムマブの水力学的直径（Ｄｈ）が３ｎｍより小さい請求項８１の製剤。
  83. 抗体の濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍＬである請求項８１の製剤。
  84. アダリムマブの濃度が５０ｍｇ／ｍＬである請求項８１の製剤。
  85. 抗体の濃度が少なくとも１００ｍｇ／ｍＬである請求項８１の製剤。
  86. アダリムマブの濃度が１００ｍｇ／ｍＬである請求項８１の製剤。
  87. 請求項６８、７４及び８１のいずれか一つの製剤を含む装置。
  88. 請求項６８、７４及び８１のいずれか一つの製剤を含む製品。
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