TW200938221A

TW200938221A - Protein formulations and methods of making same

Info

Publication number: TW200938221A
Application number: TW097146498A
Authority: TW
Inventors: Wolfgang Fraunhofer; Annika Bartl; Hans-Juergen Krause; Markus Tschoepe; Katharina Kaleta
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2009-09-16
Also published as: KR20150080038A; IL229886B; WO2009073569A3; JP2018080202A; IL229886A0; RU2012147070A; TWI629064B; IL256465A; CN104740632A; SG10201604258YA; JP5840364B2; MX354100B; KR20100103543A; RU2659431C2; TW201336511A; AU2008334099A1; NZ622583A; NZ602498A; BRPI0819714A2; TW201609142A

Description

200938221 九、發明說明：相關申請案本申請案係主張關於2007年11月30日提出申請之美國臨時申請案號61/004992之優先權益。此優先權申請案之内容係據此併入供參考。【先前技術】醫藥蛋白質調配物之基本原理為某些不安定性必須被克服。蛋白質之降解途徑可被分隔成涉及化學不安定性與物響理不安定性之兩個不同種類。化學不安定性會經過鍵結形成或分裂而導致蛋白質之改質。化學不安定性問題之實例包括脫醯胺作用、消旋作用、水解作用、氧化作用、方脫除及二硫化物交換。另一方面，物理不安定性不會導致蛋白質中之共價改變。而是，其係涉及在蛋白質之高序結構 (二級及以上）上之改變。其包括變性作用、吸附至表面、聚集及沉澱作用（Manning等人，Pkm. 6, 903 (1989》。 ❹-般所接受的是’此等不安定性，其可具有對於醫藥蛋白質調配物之商業生存能力與功效之大影響，可藉由在調配物中加入其他分子而被克服。蛋白質安定性可藉由在溶液中加入會與蛋白質交互作用之賦形劑而被改良，以保持蛋白質安定、可溶性及未經聚集。例如，鹽化合物及其他離子物種為對蛋白質調配物之極常用添加劑。其會藉由以非專-性方式結合至蛋白質，而幫助戰鬥蛋白質之變性作用及θ加熱安疋性。鹽化合物（例如邮、卿已被成功地使用於市售胰島雜财，㈣鬥聚集與沉料用（同前 136383 200938221 $處，在911處）。胺基酸（例如組胺酸、精胺酸）已被註實當作為調配物添加劑使用時，會降低在蛋白質二級結構上之變更（Tian等人，加7 乂洲織扮，2〇 (2〇〇7))。常肖添加劑之其他實例包括多元醇物質，譬如甘油與糖類，及界面活性劑言如^潔劑，非離子性（例如Tween、Pluronic)與陰離子性（十二基硫酸納）兩者。添加劑之幾乎一般性普及於所有液體市售蛋白質調配物中，係顯示未具有此種化合物之蛋 ❹白質溶液可能遭遇由於不安定性所致降解之挑戰。蛋白質調配物之主要目標係為保持特定蛋白質在其原本醫藥活性形式上之安定性，歷經長時期，以保註醫藥蛋白 f藥物之可接受存放期。但是，保持蛋白質於溶液中之安疋1·生與命解度，在其十添加劑係被加入治療劑中之醫藥調配物上係特別具挑戰性。迄今，生物學調配物係需要其他賦1知！則呆持蛋白質安定性。典型上，液體醫藥調配物 :、3有夕種供安疋性用之添加劑。例如，用於人類生長激 ❹1之病患自行投藥之液體調配物，Norditropin SimpleXx®，係 3有添加劑甘露醇（糖醇）、組胺酸及聚氧體加^i88 (界面活性劑）’以使激素安定化。醫藥添加劑必須為可溶性、無毒性，及在會提供對特定治2白質之安定化作用之特定濃度下使用。由於添加劑之女疋化作用為蛋白質·與濃度依賴性，故被考慮用於醫藥勿中之各添加劑必須小心地經測試，以確保其不會造成不安疋1·生’或具有對於調配物之化學或物理組成之其他負面作用。用以使蛋白質安定化之成份可造成關於隨著時 136383 200938221 間之蛋白質安定性，或在儲存期間於改變之環境中之蛋白質安定性之問題。典型上，長存放期係以下述方式達<，儲存呈冷束之蛋白質（例如在鐵下），或經由使蛋白質接受冷束乾燥方法二意即藉由儲存呈珠乾形式之蛋白質，使得在即將使用之前需要重配步驟，且因此產生關於病患方便性之顯著缺點。但是，使蛋白質調配物冷凌以供儲存可導致蛋白質 ©與添加劍之局部高濃度，其可造成在調配物内之PH、降解及蛋白質聚集上之局部極端。此外，熟諸此藝者習知冷柬與解滚過程經常會衝擊蛋白質安定性，意謂即使儲存呈冷，東=之醫藥蛋白質亦可伴隨著由於冷凌與解象步驟所致、—A 而且’冷康乾燥之第—個處理步驟係涉及冷凌，其可負面地衝擊蛋白質安定性。於工業環境令，可使醫藥蛋白質在藥物製造（保持步驟'儲存、再冷滚及再解凉，以增加在藥物產物充填最後處理上之時機與批次大小〇 ^性）期間，及在後續藥物充填最後處理（冷;束乾燥）期間接又重複冷來·解滚處理。由於習知遭遇蛋白質不安定性現象之危險係隨著增加醫藥蛋白質所遭遇到之冷㈣束循環之次數而增加，故達成會保持蛋白質安定性歷經重複冷 H束過程之調配條件為一項具挑戰性之工作。在生物醫樂工業中’有需要可被冷;東與解凌，而不會在調配物中產生不^要性質之調配物，該性質尤其是PH、體積滲莫濃度、推度或蛋白質或賦形劑濃度之梯度。以蛋白質為基礎之醫筚姦ϋ破私樂產物左常必須被調配在高濃度 136383 200938221 下’以達治療功效。高度濃縮之蛋白質調配物係為治療用 ^所想要’因為其允許具有較小體積之劑量，限制病患不舒服性，且係錄經濟地包裝與儲存。但是，高蛋白質渡度調配物之發展係提出許多挑戰，包括製造、安定性 '分析及尤其是對於治療蛋白質為傳輸挑戰。例如，當在調：物中之蛋白質濃度被提升時，關於蛋白f之聚集、不溶性及降解之困難通常會增加（關於回顧，可參閱黯⑴等人

又我93,1390 _))。先前未見及之負面作用可因添加劑而造成，其在較低濃度之添加劑或蛋白質下會提供有利作用。高濃度蛋白質調配物之生產可導致關於乳白色、聚集及沉澱作用之重要問題。除了非自然蛋白質聚集與微粒子形成之可能性以外，可能發生可逆自體結合，其可造成增加之黏度或會使藉由注射之傳輸複雜化之其他性質。高黏度亦可因過濾途徑而使製造高蛋白f濃度複雜化。

因此，醫藥蛋白質調配物典型上會小心地使成份與濃度平衡’以增強蛋白質安定性與治療要求條件，同時限制：何負面之副作用。生物學調配物應包含安定蛋白質，即使在高濃度下亦然，使用特定量之賦形劑降低可能之治療併發症 '儲存問題及整體成本。因蛋白質及其他生物高分子係獲得作為藥物分子之增加興趣，故關於傳輸此種分子之調配物正變成一項重要問題。儘管在大規模製造供治療使用之蛋白質上之革命性發展，° 此等藥劑於身體中之有效與合宜傳輪仍然為主要挑戰，此係由於其固有物理化學與生物學性質所致，包括經過生物 136383 200938221 膜之不良渗透、大的分子大小、短血料生期、自體結合、物理與化學不安^：性、聚集、吸附及致免疫性。【發明内容】本發月係針對以下令人驚訝之發現，經調配於水中之蛋白質曰於長期液體儲存或其他處理步驟期間，譬如冷凍/ 解束與冷康乾燥，保持溶解度以及安定性，即使在高濃度下亦然，〇、本發明係關於包含水與蛋白質之含水蛋白質調配物之方 ^ 〇物纟中蛋白質為安定的’而無需其他藥劑。明確。之I發明之方法與組合物係以渗滤方法為基礎，其中3有σ人感興趣蛋白質之第—種溶液係使用水作為渗滤媒質而被滲遽。進行此方法，以致與水有至少經測定之體、'' w如五倍體積交換。藉由進行本發明之方法，在與最初蛋白質溶液比較下，所形成之含水調配物在賦形劑之整體百分比上具有顯著降低。例如，在與最初蛋白質溶 ❹液比較下’95-99%較少之賦形劑係被發現於含水調配物中。 t管在賦形劑上之降低’蛋白質㈣保持可溶性，且保有其生物學活性，即使在高濃度下於 =會造成組合物包含增加濃度之蛋白質，同時降低其 =伤：譬如離子性賦形劑。因此，在含水調配物中之蛋白質之流體動力學直梅知 ^於標準緩衝溶液譬如磷酸鹽緩衝鹽水_)中之相同蛋白質係為較小。本發明之調配物具有哞之 11夕勝過標準緩衝調配物之優點。於一方面，含水調配物包含高蛋白質濃度’例如50至毫 136383 200938221 克/毫升或更多。所有大小之蛋白質均可被加入本發明調配物中，即使在增加之濃度下亦然。儘管高濃度之蛋白質，該調配物仍具有最低聚集，且可使用各種方法與形式餘存，例如冷凍’未具有預期伴隨著高蛋白質調配物之有害作用。本發明之調配物並不需要賦形劑，例如界面活性劑盘緩衝系統，其係被使用於傳統調配物中，以使溶液中之蛋白質安定化。由於低含量離子性賦形劑之結果，故本發明之含 ❹水冑配物具有低導電率，例如低於2ms/公分。本發明之方法與組合物亦提供具有低渗透度之含水蛋白質調配物，例

如不大於30毫滲透度/公斤。+ L ^ A斤此外，本文中所述之調配物係優於標準調配物，因其具有降低之致免疫性，此係由於缺少蛋白質安定化作用所需要之其他藥劑所致。、本發明之方法與組合物可用以提供包含水與吾人感興趣之任何類型蛋白質之含水調配物。於一方面，本發明之方，與組合物係用於大蛋白質，包括大於47 kDa之蛋白質。 U抗體及其片段，包括用於活體内與活體外目的者，係為可用於本發明方法與組合物中之蛋白質之另一項實例。‘ 再者$製備蛋白質與肽調配物所必須之多步驟純化與濃縮方法，係經常於組合物中引進變異性，以致調配物之精確組成可隨著批料而改變。聯邦條例係需要藥物組合物在其調配物上應為古痒碼馮阿度地一致，而不管製造位置或批號為〇本發月之方法可用以產生蛋白質被調配於水中之溶液’緩衝劑與職形劑係以精確量被加回其中，允許產生具有精確'辰度之緩衝劑及/或賦形劑之蛋白質調配物。 136383 -11 - 200938221 於-項具體實施例中，本發明係提供包含蛋白之㈡=中調配物具有某些特徵，譬如但不限於低導电革，例如導電率低於約2,5威公分，蛋約職克/毫升，渗透度不超過約30毫渗透度又: :白:發具:分子量(―於-項具二呈液二:配物具有經改良之安定性，譬如但不限於 =形式，歷經長期時間（例如至少约3個㈣至少約12 ❹ (奸非^^性，或經過至少—個冷;東/解;東循環之安定性右非更夕個冷凌/解凌循環時）。於一項具體實施例中，調 -物係為安定的，歷經至少約3個月，呈選自包括冷滚、經凉乾或噴霧乾燥之形式。。於—項具體實施例中，被加人本發明調配物中之蛋白質 :八有最小之大小’包括例如Mw大於約47咖，^大於約取’ Mw大於約1〇〇k〇a，Μ*大於約i5_，I大於約· 3或Mw大於約250 。蛋白質之濃縮物亦可使用。於—項具體實施例中’本發明之調配物具有低導電率， =括例如導電率低於約25 mS/公分，導電率低於約2 _公分’導電率低於約UmS/公分，導電率低於約ims/公分，或導電率低於約0.5 mS/公分。 '項具體實施例中，被加入本發明調配物中之蛋白質 f -有特疋濃度’包括例如$農度為至少約丄毫克/毫升，至少約10毫克/毫升，至少約50毫克/毫升，至少約腦毫克/ 毫升至少約150毫克/毫升，至少約200毫克/毫升，或大於約200毫克/毫升。 136383 -12- 200938221 於一項具體實施例中，過約15毫滲透度/公斤。本發明之調配物具有滲透度本發明係提供包含水與特定濃度

質之Dh係至少約70%小於PBS中特定濃度下之蛋白質之Dh。於一項具體實施例中，蛋白質之含水調配物，. 於一項具體實施例中’本發明係提供包含蛋白質譬如但不限於抗體或抗原結合片段之含水調配物，其中蛋白質具有流體動力學直徑（Dh)小於約5微米。於一項具體實施例中’蛋白質具有Dh小於約3微米。任何蛋白質可被使用於本發明之方法與組合物中。於一 0 項具體實施例中’調配物係包含治療蛋白質。於一項具體實施例中’調配物係包含抗體或其抗原結合片段。可被加入本發明方法與組合物中之抗體或抗原結合片段之類型，包括但不限於嵌合抗體、人類抗體、人化抗體及功能部位抗體（dAd)。於一項具體實施例中，抗體或其抗原結合片段為抗-TNFa，譬如但不限於阿達利母馬（adalimumab)或古利馬伯（golimumab)，或抗_il-12抗體，譬如但不限於J695。此外，本發明之調配物亦可包含至少兩種不同類型之蛋白質。於本發明之又另一項具體實施例中，調配物可進一步包 136383 -13- 200938221 含不可離子化之賦形劑。不可離子化賦形劑之實例包括但不限於糖醇或多元醇（例如甘露醇或花楸醇）、非離子性界面活性劑(例如聚花楸酸酯80、聚花楸酸酯2〇、聚花楸酸酯、聚花楸酸酯60)、糖（例如蔗糖）。可進一步被加入本發明調配物中之不可離子化賦形劑之其他非限制性實例，包括非海藻糖、植物蜜糖及麥芽糖。

於-項具體實施例中，調配物不包含選自包括滲透性改變劑安疋劑、界面活性劑、抗氧化劑、低溫保護劑、膨鬆劑、純保護齊卜驗性成份及酸性成份之作用劑。本發明之調配物可適用於任何用途，包括活體外與活體内兩種用途。於一項具體實施例中，本發明之調配物係適 σ A由投藥模式投予病患，包括但不限於皮下、靜脈内、吸入、皮内、經皮、腹膜腔内及肌内。本發明之調配物可用於治療病患中之病症。亦被I3纟本發明中者為可用以傳冑本發明調配物之裝 ❹置此種裝置之實例包括但不限於注射器、筆、植入物、無針頭注射裝置、吸入裝置及貼藥。於一項具體實施例中，本發明之調配物為醫藥調配物。土月亦提供種製備包含蛋白質與水之含水調配物之方法，此方法包括在第一種溶液中提供蛋白質，及使該第一種溶液接受滲濾’使用水作為滲濾媒質，直到與水之至 '、""體積乂換已被達成為止，於是製備含水調配物。於一項具體實施例中’在所形成調配物中之蛋白質係保有其生物學活性。〃 136383 • 14- 200938221 本發明係進__ 、 ^ 7故供—種製備蛋白質之含水調配物之方、&方法包括在第-種溶液中提供蛋白質；使該第-種溶液接^參遽，使用水作為滲遽媒質，直到與水之至少五么體積乂換6被達成為止，於是製備經滲滤之蛋白質溶液，及濃縮經渗滅之茂_么μ % 蛋白貝洛液，於是製備蛋白質之含水調配物。於一項具體者丹體只細例中，在所形成調配物中之蛋白質係保有.其生物學活性。〇於-項具體實施例中，經錢、蛋白質溶液之濃縮係經由離心分離達成。於一項具體實施例中，滲濾媒質包括水。於一項具體實施財，係使第―種溶液接受以水之渗濾，直到達成至少約六倍體積交換為止。、於一項具體實施例中，係使第—種溶液接受以水之渗濾，直到達成至少約七倍體積交換為止。

於-項具體實施例中，含水調配物係具有賦形劑之最後濃度為至少約95%低於第一種溶液。於-項具體實施例中，含水調配物係具有賦形劑之最後濃度為至少約99%低於第一種溶液。自哺乳動胞蛋白質於一項具體實施例中，第一種蛋白質溶液係得物細胞表現系統，且已被純化，以移除 ’、1自王細 (HCP)。於一項具體實施例中賦形劑至含水調配物中本發明之方法係進— 步·包括添加發明詳述 136383 •15- 200938221 ι.定義為使本發明可更容易地被明瞭，係首先定義某些術語。於本文中使用之”酸性成份” 一詞係指一種作用劑，包括具有酸性pH ’意即小於7.0之溶液。酸性成份之實例包括碟酸、鹽酸、醋酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、蘋果酸、乙醇酸及反丁烯二酸。於一項具體實施例中，本發明之含水調配物不包含酸性成份。於本文中使用之”抗氧化劑”一詞係意指一種作用劑，其會抑制氧化作用’且因此係用以防止製劑因氧化過程之變質。此種化合物’舉例g之’包括而不限於丙嗣、酸性硫酸鈉、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、檸檬酸、丁基化經基甲苯醚、丁基化羥基甲苯、氫亞磷酸、單硫基甘油、沒食子酸丙酯、甲硫胺酸、抗壞血酸鈉、檸檬酸鈉、硫化納、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、曱搭次硫酸鈉、硫基乙醇酸、偏亞硫酸氫鈉、EDTA(乙底酸鹽）、戊烯酸鹽及一般熟諳此藝者所已知之其他化合物。 •’含水調‘配物” 一詞係指其中溶劑為水之溶液。於本文中使用之"驗性成份"一詞係指一種作用劑，其係為驗性’意即pH值大於7.0。驗性成份之實例包括氫氧化卸 (KOH)與氫氧化鈉（NaOH) 〇於本文中使用之"膨鬆劑"一詞係意指用以對可重配固體添加膨鬆度，及/或在製備期間幫助控制調配物性質之化合物。此種化合物，舉例言之，包括而不限於葡聚醣、海藻糖、蔗糖、聚乙烯基四氫P比洛酮、乳糖、肌醇、花楸醇、 136383 •16- 200938221 一甲亞颯、甘油、白蛋白、乳糖醛酸鈣及一般熟諳此藝者所已知之其他化合物。於本文中使用之"導電率"一詞係指水溶液傳導兩個電極間之電流之能力。一般而言，導電率或比導電率係為物質傳導電流能力之-種度量方式。在溶液中，電流係藉由離子輸送流動。因此，隨著漸増量之離子存在於水溶液中，溶液將具有較高導電率。關於導電率之度量單位為_。8 φ (mS/么为）’且可使用例如由0rion研究公司（Beverly，MA)所銷售之電導率計度量。溶液之導電率可藉由改變其中離子之 ?農度而被變更。例如，離不祕时、/ J 離子性賦形劑在溶液中之濃度可被變更，以達成所要之導電率。於本文中使用之”低溫保護劑"一詞一般係包括會對蛋白質提供安定性而免於冷;東所引致壓力之作用劑。低溫保護劑之實例包括多元醇’例如甘露醇，且包括醣，例如蔗糖，以及包括界面活性劑，例如聚花楸酸醋、聚氧體(_又而） ❹或聚乙二醇等。低溫保護劑亦有助於調配物之滲透性。於本文中使用之’’超過、、者 (0慮或UF術語係指其中係使溶液或懸浮液接受半渗透性？產胺+ v 注溥膜之任何技術，該薄膜會保留巨分子’同時允許溶劑與小、玄m 冷貝刀子通過。超過濾可用以增加巨分子在溶液或懸浮液中 T之濃度。於一項較佳具體實施例中’超過濾係用以增加日加蛋白質在水中之濃度。於本文中使用之”滲滹” ^ 恩或DF術語係用以意謂特殊化種類之過濾’其中留存物係 — 糸以》谷劑稀釋，並再過濾，以降低可溶滲透成份之濃度。炎、请夕，慮可以或可以不導致增加所保留 136383 *17· 200938221 成份（包括例如蛋白質劑係在與產生心^ 在連續滲遽中，溶中。於此情況；：率下被持續地添加至留存物留存物體積與所保留成份濃度此過程期間改變。另—古二+ 风伪之/辰厪不會在招a ·南止面’在不連續或相繼稀釋滲廣超過慮步驟係接著為添加愿中存物侧之、'容杳,]_藉存物側，若被添加至留保= 等"Μ所產生濾、液之體積，則所保留成份將具有高濃度。

懸浮液之PH、離子強产：Λ以變更巨分子之溶液或又I，，且成、緩衝劑組成或其他性質。 :本文中使用之，.渗據/超過遽"或"着，術語盖論疋相繼或同時地達成超 …、或技術組合。成超以及/或渗滤之任何方法、技術於本文中使用之”滲濾步驟總體積交換。一詞係指在滲濾方法期間之、Υ賦形劑"-詞係指-種作用劑，其可被添加至調配物中，以提供所要之稠度（例如變更膨鬆性質），改良安定性，及/ 0或調整滲透度。常用賦形劑之實例包括但不限於糖類、多讀、胺基酸類、界面活性劑及聚合體。”離子性賦形劑” 或”可離子化賦形劑"術語’當可交換地使用於本文中時，係指一種具有淨電荷之作用劑。於一項具體實施例中離子性賦形劑在某些調配條件（譬如ρΗ)下具有淨電荷。離子性賦形劑之實例包括但不限於組胺酸、精胺酸及氣化鈉。 ”非離子性賦形劑"或"不可離子化賦形劑，，術語，當可交換地使用於本文中時，係指一種未具有淨電荷之作用劑。於一項具體實施例中，非離子性賦形劑在某些調配條件（譬如 136383 -18- 200938221 pH)下未具有淨電荷。非千陡賦形劑之實例包括但不限於糖類（例如庶糖）、糖醇類（ ^ 畔頰（例如甘露醇）及非離子性界面活性劑（例如聚花楸酸酯8〇)。於本文中使用之”第—锸 ^ ^ , t 貝溶液”或"第一種溶液，' 4 用之最初蛋白質溶液或起始物質，意即被滲濾至水中 ^ ..皆之最初蛋白質溶液。於一項具體 ^ ^ , 為合液包含離子性賦形劑、非離子 ❺ ❹ 性賦形劑及/或緩衝系統。粒子之"流體動力學直徑" ，, 或Dh術語係指具有水密度及與該粒子相同速度之純栌 “哲★又之球體之直技。因此，於本文中使用之” 蛋白質之體動力學直徑"一 °司係指對溶液中之蛋白質你用動態光散射(DLS)之大小❹ητ 丫贫白質使定㈣h ,、、、 LS_度量儀11係度量在固性浊動。M政耵之先線強度中之時間依賴 r生友動。蛋白質Dh係測 X中之時間依賴性波動之強度自相關功能。散射強择 m 射強度數據係使用DLS儀器軟體處理，以測疋關於流體動力學直質試樣）之大小分佈。數值與散射分子（意即蛋白於：文中使用之。東乾保護劑"一詞包你田杰，粟乾無方法期間’對蛋白質提供安定性之實例包括靡，特別是1 一1备構形。束乾保護劑之保護作用。、n低溫賴㈣可提供康乾於本文中II於組合物’例如含水調配物，所 -詞’其可用於治療疾病或病症。醫樂 136383 •19- 200938221 "蛋白質詞係意謂包括脸基酸之順序，鏈長對其以產生較高程度之二級及/或三級及/或四級結構。此係為區別”肽，.或未具有此種結構之其他小分子量藥物。具體實施例中，在本文中使用之蛋白質係具有分子量為至少約47 kD。被涵蓋於本文中使用定義内之蛋白質之實例包括治療蛋白質。”具治療活性之蛋白質，，或，，治療蛋白質"传指可用於治療目的之蛋白f，意即在病患中用於治療病症。、〇應注意的是，雖然治療蛋白質可用於治療目的，但本發明並不限於此種用途，因該蛋白質亦可用於活體外研究。於 -項較佳具體實施例中，治療蛋白f為融合蛋白質或抗體或其抗原結合部份。於一項具體實施例中，本發明之方法與組合物包含至少兩種不同蛋白質，其係被定義為具有不同胺基酸順序之兩種蛋白質。其他不同蛋白質不包括蛋白質之降解產物。於本文中使用之”蛋白質係被溶於水中”措辭係指其中蛋〇自質係被溶於水溶液令之蛋白質調配物，其中小分子(例如緩衝劑、賦形劑、鹽、界面活性劑)之量已藉由DP·處理而被降低。即使小分子之完全脫除，於絕對意義上，不能藉由卿F處理而達成，但可藉由應肋卿達成之賦形^ 之理論降低，係足夠大以產生基本上只在水中之蛋白質調配物。例如，在連續模式DF/UF擬案中使用6次體積交換，賦形劑之理論降低為〜顏（ci = e-x，其中以為最初賦形劑濃度，而X為體積交換之次數）。 ’’醫藥調配物"一詞係指製劑，其係呈此種形式，以致允 136383 •20· 200938221 許活性成份之生物學活性為有效，因此可被投予病患，供治療使用。 ”安定”調配物係為於其中之蛋白質在儲存時基本上係保有其物理安定性及/或化學安定性及/或生物學活性者。關於度量蛋白質安定性之各種分析技術可於此項技藝中取得，且係被回顧於例如肽與蛋白質藥物傳輸，247 3〇1，Vincent Lee 編著，Marcd Dekker 公司，New Y〇rk，Ν γ，柯沅(1991)與 j_, A. Adv. Dmg Delivery Rev. 10 : 29_9〇 (1993)中。於—項具體實施例中，蛋白質之安定性係根據單體蛋白質在溶液中之百分比測定，具有低百分比之經降解（例如斷裂）及/或聚集之蛋白質例如，包含女疋蛋白質之含水調配物可包含至少95% 單體蛋白質。或者，本發明之含水調配物可包含不超過5% 聚集體及/或經降解之蛋白質。 "安定劑"一詞係指會改良或以其他方式増強安定性之賦形劑。安定劑包括但不限於①硫辛酸、母育酚、棕櫚酸抗壞血酸酯、苄醇、生物素、酸性亞硫酸鹽、硼、丁基化羥基甲苯醚（ΒΗΑ)、丁基化羥基甲苯（ΒΗΤ)、抗壞血酸及其酯類、類胡蘿蔔素、檸檬酸鈣、乙醯基心卡米汀（camitine)、螯合劑、軟骨素、鉻、檸檬酸、輔酶Q_1〇、半胱胺酸、半胱胺酸鹽酸鹽、3-脫氫莽草酸(DHS)、EDTA (乙二胺四醋酸；乙底酸二鈉）、硫酸亞鐵 '葉酸 '反丁烯二酸、沒食子酸烷 8曰：大杯、葡萄糖胺、葡萄籽萃取物、古果（gugul)、鎂、蘋果酸、偏亞硫酸氫鹽、N_乙醯半胱胺酸、菸鹼酸、菸鹼醯胺、寻蔴根部、鳥胺酸、沒食子酸丙酯、碧蘿芷、鑛棕櫚、 136383 •21- 200938221 石西 '亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫納、亞硫酸鈉、亞硫酸钟、酒石酸、硫代硫酸鹽、硫基甘油、硫基花楸醇，母育酚及其酯類，例如醋酸母育酚酯、琥珀酸母育酚酯、母育酚三烯醛、d-α-醋酸母育酚酯，維生素A及其酯類、維生素B及其酯類、維生素C及其酯類、維生素D及其酯類，維生素E 及其1旨類，例如維生素E醋酸醋，鋅，及其組合。 π界面活性劑’'一詞一般係包括會保護蛋白質免於空氣/ 溶液界面所引致壓力及溶液/表面所引致壓力之作用劑。例如，界面活性劑可保護蛋白質免於聚集。適當界面活性劑可包括例如聚花楸酸酯，聚氧化乙烯烷基醚類，譬如Brij 35.RTM.，或聚氧體（poloxamer)，譬如 Tween 20、Tween 80 或聚氧體（poloxamer) 188。較佳清潔劑為聚氧體類，例如Poloxamer 188、Poloxamer 407 ;聚氧化乙烯烷基醚類，例如Brij 35.RTM.、克雷莫弗（Cremophor) A25、Sympatens ALM/230 ;以及聚花楸酸酯/Tween，例如聚花楸酸酯20、聚花楸酸酯80，與聚氧體 (Poloxamer)，例如 Poloxamer 188，及 Tween，例如 Tween 20 與 Tween 80。於本文中使用之”滲透性改變劑”一詞係意指可用以調整液體調配物滲透性之一或多種化合物。適當滲透性改變劑包括甘油、乳糖、甘露醇、右旋糖、氣化鈉、硫酸鎂、氣化鎂、硫酸鈉、花楸醇、海藻糖、蔗糖、植物蜜糖、麥芽糖及一般熟諳此藝者所已知之其他化合物。於一項具體實施例中，液體調配物之滲透性係約等於血液或血漿之滲透性。 136383 -22- 200938221 一岡係意指已被純化以移除污染物之水，餾或逆渗透，於本文中亦稱為"純水"。於一項較佳具體= 施例中，在本發明方法與組合物中所使用之水係不含賦形劑。於-項具體實施例中，水包括適合投予病患之無菌水。於另-項具體實施例中，水係意謂包括注射用水陶。於 -項具體實施例中’水係指蒸财或適用於活體、水。於一項較佳具體實施例中，渗滤係根據本發明之方法， ^ 使用單獨水作為滲濾媒質而進行。杬體凋，§於本文中指稱時，係包括整個抗體及其任何抗原結合片段（意即"抗原結合部份”）或單鏈。”抗體係知包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重（H)鏈與兩個輕①）鍵之糖蛋白，或其抗原結合部份。各重鍵係包含重鍵可變區（於本文中縮寫成vH)與重鍵恒定區域。重鍵恒定區域包含三個功能部位CHI、Cm及CH3。各輕鏈係包含輕鏈可變區（於本文中縮寫成Vl)與輕鏈恒定區域。輕鏈恒定區域包〇含一個功能部位CL。VH與vL區域可進一步再分成高可變性之區域，稱為互補性決定區域(CDR)，散佈著更保守之區域，稱為骨架區域（FR)。各％與八係由三個(：1^與四個报所組成，以下列順序從胺基末端排列至羧基末端：FRi、、 FR2、CDK2、FR3、CDR3、FR4。重與輕鏈之可變區域含有會與抗原交互作用之結合功能部位。抗體之恒定區域可媒 "免疫.球蛋白之轉合至宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞（例如效應子細胞）舆古典補體系統之第一種成份 (Clq) 〇 136383 •23- 200938221 於本文中使用之抗體之''抗原結合部份''一詞（或簡稱為·’ 抗體部份”），係指保有專一性地結合至抗原（例如TNFa、 IL-12)能力之抗體之一或多種片段。已証實抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段進行。被涵蓋在抗體之"抗原結合部份"術語内之結合片段，其實例包括（i) Fab片段，一種包含VL、VH、CL及CH1功能部位之單價片段；⑻F(ab')2片段，一種包含在鉸鍵區域上藉由二硫化物橋基連結之兩個

Fab片段之二價片段；（iii)Fd片段，包含VH與CH1功能部位； ^ (iv) Fv片段，包含抗體之單臂之VL與VH功能部位，⑺dAd 片段（Ward 等人，（1989) Nature 341 : 544-546)，其包含 VH 或 VL 功能部位；及（vi)經單離之互補性決定區域（CDR)。再者，雖然Fv片段之兩個功能部位乂^與VH係被個別基因編碼，但其可使用重組方法，藉由合成鏈結接合，該鏈結係使得彼等能夠被製成單一蛋白質鏈，其中VL與VH區域係成對，以形成單價分子（稱為單鏈Fv (scFv);參閱，例如Bird等人（1988)

^ Science 242 : 423-426 ;與 Huston 等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ❹ 85 : 5879-5883)。此種單鏈抗體亦意欲被涵蓋在抗體之”抗原結合部份”之術語内。此等抗體片段係使用熟諳此藝者已知之習用技術獲得，且片段係以與完整抗體相同之方式針對利用性經篩檢。於本發明之一項具體實施例中，抗體片段係選自包括Fab、Fd、Fd'、單鏈Fv (scFv)、scFva及功能部位抗體（dAd)。又再者，抗體或其抗原結合部份可為較大免疫黏連分子之一部份，藉由抗體或抗體部份與一或多種其他蛋白質或 136383 -24- 200938221 肽之共價或非共價鍵締合所形成。此等其他蛋白質或肽可具有官能基’其係允許抗體或其抗原結合部份之純化，或允許其彼此結合或與其他分子結合。因此，此種免疫黏連分子之實例包括使用鏈霉胺基酸核心區域，以製造四聚體單鏈可變片段（scFv)分子（Kipriyanov等人（1995) 乂癀戎邀典# 禮瘤6: 93-101)，與使用半胱胺酸殘基、標記物肽及c末端多組胺酸標§己，以製造二價且生物素化之scFv分子

等人（1994) MW· 31 : 1047-1058)。抗體部份，譬如 Fab 與F(ab )2片段，可使用習用技術製自整個抗體，譬如整個抗體之個別木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。再者，抗體、抗體部份及免疫黏連分子可使用標準重-DNA技術獲得。在兩個抗體功能部位歸屬⑨會形成同源對或組群之結構族群，或係衍生自此種族群，且財㈣徵之情況下，其係為”互補”。例如，抗體之紐功能部位與vl功能部位係為互補；兩個VH功能部位不為互補，且兩個凡功能部位 :為互補。互補功能部位可在免疫球蛋白超族群之其他成員中發現，譬如Τ'細胞受體之να_ (或…)功能部位。功能部位"一詞係指經拼義夕疋i你一 θ、，丄折疊之蛋白質結構，其係保有其二級結構’與蛋白質之直铨八餘邛伤無關。一般而言，功能部位係負責蛋白質之分立功能性皙月b &質’而在許多情況中可被添加、移除或轉移至其他蛋白皙， ^u 貧白W而不會失去蛋白質其餘部切及/或功能部位之功能。田 , 斤。月早一抗體可變功能部位係意守曰包含抗體可變功能部位之 <项序特徵之經折疊多肽功能部 136383 -25· 200938221 位。因此，其包括完全抗體可變功能部位與經修改之可變功能部位’例如其中一或多個圈環已被不為抗體可變功能部位特徵之順序取代，或已被截頭之抗體可變功能部位，或包括N-或c-末端延伸，以及保有全長功能部位之至少部份結合活性與專一性之可變功能部位經折疊片段。本發明之可變功能部位可被合併，以形成一組功能部位；例如’互補功能部位可被合併，譬如VL功能部位係與vh φ 功能部位合併。非互補功能部位亦可被合併。功能部位可以夕種涉及功能部位藉由共價或非共價方式連結之方式合併。 dAd或功此部位抗體"係指會專一性地結合抗原之單一抗體可變功能部位（vH或Vl)多肽。於本文中使用之”抗原結合區域，，或，，抗原結合位置，，術語係指抗體分子之部份或其抗原結合部份，其含有會與抗原乂互作用且會在彳几體上賦予其對抗原之專一性與親和 Q 力之胺基酸殘基。 ’’抗原決定部位”一詞係意欲指稱能夠在一或多個抗體之抗原結合區域上藉由抗體辨識，且藉由其結合之任何分子之邛伤。就本發明而論，應明瞭第一個與第二個抗原決定部位，，為不相同且未藉由單一單專一抗體或其抗原結合部份結合之抗原決定部位。 ”重組抗體"措辭係指藉由單離之抗體，譬如使用經轉體所表現之抗體、單離自重重組方式製備、表現、產生或染至宿主細胞中之重組表現載組結合抗體庫之抗體、單離自 136383 •26- 200938221 對人類免疫球蛋白基因為轉基因之動物（例如老鼠）之抗體 (參閱，例如 Taylor 等人（1992) Nud. Acids Res. 20 : 6287_6295)或藉涉及特定免疫球蛋白基因順序（譬如人類免疫球蛋白基因順序）對其他DNA順序之疊接之任何其他方式所製備、表現、產生或單離之抗體。重組抗體之實例包括嵌合、cdr_ 移植及人化之抗體。人顙抗體一詞係指具有相應於或衍生自人類胚細胞系〇免疫球蛋白順序之可變與恒定區域之抗體，如藉由例如 Kabat等人所述者（參閱Kabat等人（1991)具免疫學重要性之蛋白質順序，第五版，美國健康與人類服務部門，NIH公報案號91-3242)。但是，本發明之人類抗體可包含未被人類胚細胞系免疫球蛋白順序編碼之胺基酸殘基（例如在活體外藉由任意或位置專一性致突變或在活體内藉由體細胞突變所引進之突變型），例如在CDR，且特別是CDR3中。本發明之重組人類抗體係具有可變區域，且亦可包含衍〇生自人類胚細胞系免疫球蛋白順序之恒定區域（參閱Kabat 等人（1991)具免疫學重要性之蛋白質順序，第五版，美國健康與人類服務部門，NIH公報案號91-3242)。但是，在某些具體實施例中，使此種重組人類抗體接受活體外致突變（或當使用對人類Ig順序為轉基因之動物時，為活艟内體細胞致突變），且因此，重組抗體之區域之胺基酸順序係為雖然衍生自且相關於人類胚細胞系VH與VL順序，但在活體内可不天然地存在於人類抗體胚細胞系存庫内之順序。但是，在某些具體實施例中，此種重組抗體為選擇性 136383 -27- 200938221 致突變或回復突變或兩者之結果。回復大變一 sS]係指一種過程’其中人類抗體之一部份或全部體細胞上突變胺基酸係被得自類同胚細胞系抗體順序之相應胚細胞系殘基置換。本發明人類抗體之重與輕鏈順序係個別地以VBASE資料庫中之胚細胞系順序對準，以確認具有最高類同性之順序。在本發明人類抗體上之差異係經由使此種不同胺基酸編碼之經界定核甞酸位置突變，而回復至胚細胞系順序。經如此破認為回復突變候選者之各胺基酸之角色，應針對在抗原結合中之直接或間接角色進行研究，且在影響人類抗體任何所想要特徵之突變後所發現之任何胺基酸，不應被包含在最後人類抗體中。為使接爻回復突變之胺基酸數目降至最低，經發現不同於最接近胚細胞系順序，但與第二種胚細胞系順序中之相應胺基酸相同之胺基酸位置可仍然保持，其條件是第二種胚細胞系順序係與本發明人類抗體之順序相同且共線性，達至少 10個，較佳為12個胺基酸’在討論中胺基酸之兩侧上。回復犬變可發生在抗體最佳化之任何階段下。嵌合抗體一詞係指包含得自一個物種之重與輕鏈可變區域順序及得自另一個物種之恒定區域順序之抗體，譬如，具有經連結至人類恒定區域之老鼠重與輕鏈可變區域之抗體。 CDR-移植之抗體"一詞係指包含得自一個物種之重與輕鏈可變區域順序，但其中VH及/或VL之一或多個CDR區域順序係被另一個物種之CDR順序置換之抗體，譬如具有老 136383 -28 - 200938221 鼠重與輕鏈可變區域，其中一或多個老鼠CDR (例如CDR3) 已被人類CDR順序置換之抗體。人化抗體阔係指包含得自非人類物種（例如老鼠）之重與輕鏈可變區域順序，但其中VH&/4VL順序之至少一部伤已被變更為較"像人類”，t即較類似人類胚細胞系可變順序之抗體。一種類型之人化抗體為CDR_移植之抗體，其中人類CDR順序係被引進非人類vh^vl順序巾，以置換其相應之非人類CDR順序。本發明之各種方面係更詳細地描述於下文分項中。 II.本發明之方法一般而言’滲濾係為一種技術，其係使用薄膜，以自含有蛋白質、肽、核酸及其他生質分子之溶液移除、置換鹽或洛劑’或降低其濃度。一旦蛋白質已被純化自因其表現所形成之不純物，例如宿主細胞蛋白質，蛋白質生產操作即I *涉及蛋白質溶液之最後渗滤至調配物緩衝液中。本 ❹文中所述之本發明係提供一種獲得含水調配物之方法，其方^是使蛋白質溶液接受渗遽，使用單獨水作為滲攄溶液、。因此，本發明之調配物係以在渗遽方法期間使用水作為調配媒質為基礎，且不倚賴傳統調配媒質，其包含賦形劑，譬如用則吏最後調配物中之蛋白質溶解及/或安定化之界面活性劑。本發明係提供一種將蛋白質轉移至純水中，供使用於安定調配物之方法，其中蛋白質仍然留在溶液中，且能夠在高含量下被濃縮，而未使用其他作用劑以保持其安定性。 ' 136383 -29- 200938221 根據本文之陳述内容，在滲濾或df/uf之前，此方法係包括首先在第-種溶液中提供蛋白質。蛋白質可被調配在任可第種溶液中，包括使用此項技藝中經良好建立之技術入調配物，譬如合成技術（例如重組技術、肽合成或其組 T)。或者，於本發明方法與組合物中所使用之蛋白質係被離自蛋白質之内源來源。最初蛋白質溶液可使用純化方法獲得，而其中蛋白質係純化自蛋白質之非均質混合物。 ❹於/項具體實施例中，在本發明中所使用之最初蛋白質溶液係得自純化方法，而其中係使被表現於哺乳動物表現系統中之蛋白質’包括抗體’接受許多層析步驟，其會自蛋白質溶液移除宿主細胞蛋白質(HCP)。於一項具體實施例中：第-種蛋白質溶液係得自喷乳動物細胞表現系統，且已被純化，以移除宿主細胞蛋白質（HCP)。純化方法之實例係描述於美國專利申請案號贿32,918 (us 20070292442)中，其係併於本文供參考。應注意的是，沒有根據本發明方法所〇需要之第一種蛋白質溶液之特殊製備。可用於本發明組合物與方法中之蛋白質可為任何大小，意即分子量（Mw)。例如，蛋白質可具有^等於或大於約工恤’ Mw等於或大於約1〇kDa ’ κ等於或大於約伽&、等於或大於約57kDa ’ Mw等於或大於約1〇〇必，I等於或大於約BOkDa’Mw等於或大於約2〇〇kDa，或Μ*等於或大於勺50 kDa上文所列舉Mw之中間數目，例如*入你，49, ％ & 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 71 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,? 9/ 136383 -30- 200938221 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101，102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111，112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121，122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131，132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141，142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151，153, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170等等，以及本文所述之所有其他數目，亦意欲成為本發明之一部份。使用任何上文所列舉數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在本發明範圍内。例如，於本發明中所使用之蛋白質於大小上可涵蓋範圍從57 kDa 至 250 kDa，56 kDa 至 242 kDa，60 kDa 至 270 kDa 等等。本發明方法亦包括含有至少兩種不同蛋白質之第一種蛋白質溶液之渗滤。例如，蛋白質溶液可含有針對不同分子或相同分子之不同抗原決定部位之兩種或多種類型抗體。於一項具體實施例中，在溶液中之蛋白質為治療蛋白質，包括但不限於融合蛋白質與酵素。治療蛋白質之實例包括但不限於普莫吉美（Pulmozyme)(鏈道酶alfa)、瑞革蘭尼 (Regranex) (Becaplermin)、亞克提維斯（Activase)(阿帖普酶 (Alteplase))、阿度拉酶（Aldurazyme) (Laronidase)、阿美威維 (Amevive)(阿列發謝特（Alefacept))、阿拉内普（Aranesp)(達貝艾波亭（Darbepoetin) alfa)、貝卡列明（Becaplermin)濃縮物、貝他色隆(Betaseron)(干擾素々-lb)、玻拓克斯（BOTOX)(肉毒毒素A 型）、Elitek (來斯布利酶(Rasburicase))、約爾史巴（elspar)(天冬醯胺酶）、Epogen (艾波亭（Epoetin) alfa)、恩布瑞爾（Enbrel)(恩塔臬西伯（Etanercept))、Fabrazyme (Agalsidase 、干擾原（Infergen) 136383 200938221 (干擾素 alfacon-l)、因特隆（Intron) A (干擾素 a-2a)、Kineret (安那金拉（Anakinfa))、MYOBLOC (肉毒毒素B型）、紐拉斯塔 (Neulasta)(佩非葛拉亭（Pegfilgrastim))、Neumega (歐普瑞維金 (Oprelvekin))、紐波真（Neupogen)(非葛拉亭（Filgrastim))、歐塔克 (Ontak)(丹尼白血球素待弗提托斯（Denileukin diftitox))、 PEGASYS (PEG干擾素-2a)、前白血球素（阿迪斯白血球素 (Aldesleukin))、普莫吉美（Pulmozyme)(鏈道酶 alfa)、Rebif (干擾素/5-la)、瑞革蘭尼（Regranex)(貝卡列明（Becaplermin))、瑞塔威斯（Retavase)(瑞替普酶（Reteplase))、Roferon-A (干擾素 α-2)、 TNKase (腱激酶）與 Xigris (Drotrecogin alfa)、Arcalyst (Rilonacept)、 NPlate (Romiplostim)、Mircera (曱氧基聚乙二醇-艾波亭（epoetin) 点）、Cinryze (Cl S旨酶抑制劑）、Elaprase (idursulfase)、Myozyme (阿葡萄糖誓酶（alglucosidase) alfa)、歐偷西亞（Orencia)(阿巴塔謝特（abatacept))、Naglazyme (galsulfase)、克比凡斯（Kepivance)(巴利弗明（palifermin))及 Actimmune (干擾素 7*-lb)。於本發明中所使用之蛋白質亦可為抗體或其抗原結合片段。可使用於本發明中之抗體實例包括嵌合抗體、非人類抗體、人類抗體、人化抗體及功能部位抗體（dAb)。於一項具體實施例中，抗體或其抗原結合片段為抗-TNFo:及/或抗 -IL-12抗體（例如其可為雙可變功能部位（DVD)抗體）。可使用於本發明方法與組合物中之抗體或其抗原結合片段之其他實例，包括但不限於1D4.7 (抗-IL-12/IL-23抗體；Abbott實驗室）、2.5(E)mgl (抗-IL-18 ; Abbott 實驗室）、13C5.5 (抗-IL-13 抗體；Abbott 實驗室）、J695 (抗-IL-12; Abbott 實驗室）、Afelimomab 136383 -32· 200938221 (Fab 2 抗-TNF; Abbott 實驗室）、Humira (阿達利母馬（adalimumab)) Abbott實驗室）、肯巴斯（Campath)(阿連圖馬伯（Alemtuzumab))、 CEA-掃描Arcitumomab (fab片段）、部比圖斯（Erbitux)(些圖西馬伯（Cetuximab))、贺西伯亭（Herceptin)(搓史圖諸馬伯 (Trastuzumab))、Myoscint (Imciromab Pentetate)、ProstaScint (卡普洛馬伯片迪肽（Capromab Pendetide))、瑞米卡得（Remicade)(因弗利西馬（Infliximab))、ReoPro (亞伯西瑪伯（Abciximab))、利圖散 (Rituxan)(利圖西馬伯（Rituximab))、Simulect (巴西利馬伯 (Basiliximab))、Synagis (柏利維充諸馬（Palivizumab))、Verluma (諾非圖莫伯（Nofetumomab))、Xolair (歐馬利祖馬（Omalizumab))、 Zenapax (達可利諸伯（Daclizumab))、吉維林（Zevalin)(衣利圖莫伯提克西坦（Ibritumomab Tiuxetan))、Orthoclone OKT3 (目洛蒙那伯（Muromonab)-CD3)、Panorex (艾卓可羅伯（Edrecolomab))、米若塔革（Mylotarg)(堅圖住馬伯歐坐加霉素（Gemtuzumab ozogamicin))、古利馬伯（golimumab) (Centocor)、Cimzia (Certolizumab pegol)、Soliris (也苦利馬伯（Eculizumab))、CNTO 1275 (ustekinumab) 、Vectibix (片尼圖努馬伯（panitumumab))、貝克薩（Bexxar)(托西圖莫伯（tositumomab)與 I13 1 托西圖莫伯（tositumomab))，抗-IL-17 抗體7，如在國際申請案WO 2007/149032 (Cambridge抗體技術）中所述者，其全部内容係併於本文供參考，抗-IL-13抗體 CAT-354 (Cambridge 抗體技術）、抗人類 CD4 抗體 CE9y4PE (IDEC-151、clenoliximab) (Biogen IDEC/Glaxo Smith Kline)、抗人類 CD4 抗體 IDEC CE9.1/SB-210396 (keliximab) (Biogen IDEC)、抗人類 CD80 抗體 IDEC-114 (galiximab) (Biogen IDEC)、抗-狂犬病病毒蛋 136383 -33- 200938221 白λ抗體CR4098 (f〇ravimmab)及抗人類TNF相關之細胞凋零_ 引致配位體受體2 (TRAIL-2)抗體HGS_ETR2 (lex_umab)(人類基因組科學公司）以及阿威斯汀（Avastin)(貝發西馬伯 (bevacizumab)) ° 關於抗體生產之技術係提供於下文。多株抗體多株杬體一般係指對某一抗原為專一，但會結合至該抗 ❹原上之不同抗原決定部位之抗體混合物。多株抗體通常係在動物中藉由有關聯抗原與佐劑之多次皮下（sc)或腹膜腔内（ip)注射而引起。其可用以使有關聯抗原共輛至在欲被免疫物種中為免疫原之蛋白質，例如鍵孔青貝血藍質、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，使用雙官能性或衍化劑，例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基磺酸基琥珀醯亞胺酯（經過半胱胺酸殘基之共軛作用）、羥基琥珀醯亞胺（經過離胺酸殘基）、戊二醛、琥珀酐、s〇cl2或 O RlNCNR，其中尺與心為不同烷基。製造多株抗體之方法係為此項技藝中已知，且係被描述於例如抗體：實驗室手冊， Lane與Harlow (1988)中，其係併於本文供參考。單株抗體於本文中使用之”單株抗體”係意欲指稱雜種瘤衍生之抗體（例如藉由雜種瘤分泌之抗體，該雜種瘤係藉由雜種瘤技術，譬如標準Kohler與Milstein雜種瘤操作法製成）。例如，單株抗體可使用最初由Kohler等人，Nature，256 : 495 (1975)所述之雜種瘤方法製成，或可藉由重組DNA方法（美國專利 136383 -34- 200938221 4,816,567)製成。因此，本發明之雜種瘤衍生之雙專一性抗體仍然被稱為單株抗體’惟其具有對超過單一抗原之抗原專一性。單株抗體係得自實質上均質抗體之個體群，意即包含該個體群之個別抗體係為相同，惟可以少量存在之可能天然生成之突變型除外。因此，修飾用語"單株"係表示抗體之特性為非分立抗體之混合物。於進一步具體實施例中，抗體可被單離自使用McCafferty 等人，Nature, 348 : 552-554 (1990)中所述技術產生之抗體噬菌體庫。Clackson 等人，Nature, 352 : 624-628 (1991)與 Marks 等人，J.

Mol. Biol.，222 : 581-597 (1991)係描述個別使用噬菌體庫之老鼠與人類抗體之單離。後續刊物係描述高親和力（nM範圍）人類抗體藉由鏈滑移（Marks 等人，Bio/Technology，10 : 779-783 (1992))，以及結合感染與活體内重組之生產，作為關於建構極大嗤菌體庫之策略（Waterhouse等人，Acids. Res.，21 : _ 2265-2266 (1993))。因此，此等技術為關於單株抗體單離之傳〇統單株抗體雜種瘤技術之可實行替代方式^ 抗體與抗體片段亦可利用表現庫而被單離自酵母及其他真核細胞，如在美國專利 6,423,538 ; 6,696,251 ; 6,699,658 ; 6,300,065 ; 6,399,763 ;及6，114，147中所述者。真核細胞可經設計，以表現庫蛋白質，包括得自結合抗體庫，供顯示於細胞表面上，允許選擇含有對於具親和力抗體之基因庫無性繁殖系之特定細胞，以選擇標的分子。自經單離細胞回收後，對吾人感興趣之抗體進行編碼之基因庫無性繁殖系可 136383 -35- 200938221 在高含量下表現自適當哺乳動物細胞系。關於發展吾人感興趣抗體之其他方法包括不含細胞之筛檢，使用核酸顯示技術’如在美國專利7，195,88〇; 6,9517仏 7,078,197 , 7,022,479 , 6,518,018 ； 7,125,669 ； 6,846,655 ； 6 281 344 ' 6,207,446 ； 6,214,553 ； 6,258,558 ； 6,261,804 ； 6,429,300 ； 6,489,116 ； 6,436,665 ； 6,537,749 ； 6,602,685 ； 6,623,926 ； 6,416,950 ; 6,660,473 ； 6,312,927，5,922,545 ;及6,348,315中所述者。此等方法可用以〇在活體外自核酸轉錄蛋白質，其方式係致使蛋白質以物理方式締合或結合至其所源自之核酸。藉由選擇具有標的分子之經表現蛋白質，亦選擇會對蛋白質進行編碼之核酸。在一種關於不含細胞篩檢技術之變型中，單離自免疫系統細胞之抗體順序可被單離，且部份隨機化之聚合酶連鎖反應致突變技術係增加抗體多樣性。然後，此等經部份隨機化之抗體基因係被表現於不含細胞之系統中，其中同時物理締合作用係在核酸與抗體之間產生。 ❹ DNA亦可經改質，例如藉由取代關於人類重與輕鏈恒定功能部位之編碼順序，替代同系老鼠順序（美國專利 4,816,567 ’ Morrison 等人，proc. Natl Acad Sci USA 81 : 6851 (1984)) ’或藉由以共價方式接合至免疫球蛋白編碼順序，關於非免疫球蛋白多肽之編碼順序之全部或部份。典型上，此種非免疫球蛋白多肽係用以取代抗體之恒定功舱部位’或其係用以取代抗體之一個抗原組合位置之可變功能部位，以產生嵌合雙價抗體，其包含一個具有對抗原之專一性之抗原組合位置與另一個具有對不同抗原之專 136383 -36· 200938221 一性之抗原組合位置。嵌合或雜種抗體亦可在活體外，使用合成蛋白質化學中之已知方法製成，包括涉及交聯劑者。例如，免疫毒素可使用二硫化物-交換反應，或藉由形成硫醚鍵建構。供此項目的使用之適當試劑之實例包括亞胺基硫醇化物與4-酼基丁醢亞胺酸曱醋。人化抗體使非人類抗體人化之方法係為此項技藝中所習知。一般〇而言，人化抗體係具有一或多個自非人類來源被引進其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基係經常被稱為"輸入" 殘基，其典型上係取自"輸入"可變功能部位。人化作用可基本上按照Winter與共同研究者之方法（Jones等人，Nature, 321 : 522-525 (1986) ; Riechmann 等人，Nature, 332 : 323-327 (1988); Verhoeyen 等人，Science，239 : 1534-1536 (1988))，經由以非人類 (例如齧齒動物）CDR或CDR順序取代其相應之人類抗體順 ^ 序而進行。因此，此種"人化"抗體為嵌合抗體（美國專利 4,816,567)，其中實質上小於完整人類可變功能部位已被得自非人類物種之相應順序取代。實際上，人化抗體典型上為人類抗體，其中一些CDR殘基與可能一些骨架殘基（FR) 係被得自齧齒動物抗體中之類似位置之殘基取代。描述人化作用方法之其他參考資料包括Sims等人，J. Immunol., 151 : 2296 (1993) ; Chothia 等人，J. Mol. Biol., 196 : 901 (1987) ; Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 : 4285 (1992) ; Presta 等人，J. Immunol.，151 : 2623 (1993)，其每一項均併於本文供參考。 136383 •37· 200938221 人類抗體或者，目前可產生轉基因動物（例如老鼠），其係能夠在免疫作用時，於内源免疫球蛋白生產不存在下，產生人類抗體之全滿存庫。例如，已經描述在嵌合與胚細胞系突變老鼠中抗體重鏈接合區域（½)基因之同合子缺失會造成内源抗體生產之完全抑制。人類胚細胞系免疫球蛋白基因陣列在此種胚細胞系突變老鼠中之轉移將會造成人類抗體在抗原激發時產生。參閱，例如Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90 : 2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature，362 : 255-258 (1993) ; Bruggermann 等人，Year in Immuno.，7 : 33 (1993)。人類抗體亦可衍生自嗤菌體-顯示庫（Hoogenboom等人，J. Mol. Biol., 227 : 381 (1991) ; J. Mol. Biol·，222 : 581-597 (1991))。於一項具體實施例中，本發明之調配物包含抗體或其抗原結合部份，其會結合人類TNFa，包括例如阿達利母馬 (adalimumab)(亦被稱為 Humira、阿達利母馬（adalimumab)或 _ D2E7 ; Abbott實驗室）。於一項具體實施例中，抗體或其抗 Φ 原結合片段係解離自人類TNFa，具有Kd為1 X 10_8M或較低，與K。^速率常數為1 X lO^s—1或較低，兩者均藉由表面電漿激元共振測得，且在標準活體外L929檢測中使人類TNFa細胞毒性中和，具有IC5〇為1 X 1(Γ7Μ或較低。製造具有對於人類TNFa之高親和力之人類中和抗體（包括抗體順序）之實例與方法，係描述於美國專利6,090,382中（稱為D2E7)，併入本文供參考。於一項具體實施例中，本發明之調配物包含抗體或其抗 136383 -38- 200938221 原結合部份，其會結合人類IL-12，包括例如抗體J695 (Abbott 實驗室）（美國專利6,914，128)。J695為經設計以將間白血球活素-12與間白血球活素-23作為標的且使其中和之完全人類單株抗體。於一項具體實施例中，抗體或其抗原結合片段係具有下述特徵：其會解離自人類IL-1 α’具有KD為3 X 1(Τ7Μ 或較低；解離自人類IL-1沒，具有KD為5 X 1〇-5 Μ或較低；及不會結合老IL IL-1 α或老氣IL-1石。製造具有對於人類IL-12 之高親和力之人類中和抗體（包括抗體順序）之實例與方法，係描述於美國專利6,914，128中，併入本文供參考。於一項具體實施例中，本發明之調配物包含抗體或其抗原結合部份，其會結合人類IL-18，包括例如抗體2.5(E)mgl (Abbott Bioresearch)(參閱美國專利申請案號2005/0147610 ’併入本文供參考）。於一項具體實施例中，本發明之調配物包含抗-IL-12 /抗 -IL-23抗體或其抗原結合部份，其係為抗體1D4.7 (Abbott實驗室）（參閱20〇7年1月11曰公告之W0 2007/005608 A2 ’併入本文供參考）。於一項具體實施例中，本發明之調配物包含抗-IL-13抗體或其抗原結合部份，其係為抗體13C5.5 (Abbott實驗室）（參閱 PCT/US2007/19660 (WO 08/127271)，併入本文供參考）。於一項具體實施例中，本發明之調配物包含抗體或其抗原結合部份，其係為抗體7C6、抗-澱粉狀蛋白0抗體（Abbott 實驗室；參閱PCT公報WO 07/062852，併入本文供參考）。雙專一性抗體 136383 •39- 200938221 雙專一性抗體（BsAb)係為具有對於至少兩種不同抗原決定部位之結合專一性之抗體。此種抗體可衍生自全長抗體或抗體片段（例如F(ab')2雙專一性抗體）。製造雙專一性抗體之方法係為此項技藝中已知。全長雙專一性抗體之傳統製造，係以兩種免疫球蛋白重鏈_輕鏈對之共表現為基礎，其中此兩種鏈具有不同專一性(Millstein等人，Nature，305 : 537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重與輕鏈之 ❹隨機揀選’故此等雜種瘤（四重瘤）會產生10種不同抗體分子之可能混合物，其中只有一種具有正確雙專一性結構。正確分子之純化，其經常藉由親和層析步驟達成，是頗為麻煩的，且產物產率很低。類似程序係揭示於w〇 93/〇8829 與 Traunecker 等人，EMBO J.，1〇 : 3655-3659 (1991)中。根據不同途徑，具有所要結合專一性之抗體可變功能部位（抗體-抗原組合位置）係經融合至免疫球蛋白恒定功能部位順序。〇融合物較佳係具有免疫球蛋白重鏈恒定功能部位，包含鉸鏈、CH2及CH3區域之至少一部份。較佳係具有含輕鏈結合所必要位置之第一個重鏈恒定區域（CH1)，存在於至少一種融合物中。使免疫球蛋白重鏈融合物編碼之dna及若需要時之免疫球蛋白輕鏈係被插入個別表現載體中，且被共轉染至適當宿主生物體中。在構造中所使用不相等比例之三個多肽鏈提供最適宜產率時之具體實施例中，這係於調整相互比例之三種多肽片段上提供大的靈活性。但是，'^ 在-種表現載體中插入兩個或全部三個多肤鍵之編碼順 136383 -40· 200938221 序，當呈相等比例之至少兩個多肽鏈之表現會造成高產率時’或當該比例未具有特定意義時。

於此途徑之一項較佳具體實施例中，雙專一性抗體係由在一臂中具有第一個結合專一性之雜種免疫球蛋白重鏈，與在另一臂中之雜種免疫球蛋白重鏈輕鏈對（提供第二個結合專一性）所組成。已發現此不對稱結構有助於所要雙專 f生化合物自不想要之免疫球蛋白鏈組合中分離，因免疫球蛋白輕鏈存在於只有一半之雙專一性分子中，係提供一種簡易分離方法。此途徑係揭示於1994年3月3日公告之w〇 94/04690中。關於產生雙專一性抗體之進一步細節，可參閱例如Suresh等人，酶學方法，⑵：21〇 (1986)。雙專一性抗體包括交聯或"雜共輛”抗體。例如，在雜共軛物中之抗體之一可被偶合至抗生物素蛋白，另一個至生物素。例如，此種抗體已被提出將免疫系統細胞對不想要細胞瞄靶（美國專利4,676,98〇)，及用於治療ffiv感染（w〇 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。雜共軛抗體可使用任何合宜交聯作用方法製成。適當交聯劑係為此項技藝中所習知，且係揭示於美國專利4,676,98〇中，伴隨著多種交聯作用技術。自抗體片#又產生雙專一性抗體之技術亦已被描述於文獻中。下述技術亦可用於生產未必為雙專一性之雙價抗體片段。例如，回收自大腸桿菌之Fab，片段可以化學方式於活體外偶合，以形成二價抗體。參閱Shalaby等人，j Εχρ Med，175 : 217-225 (1992) ° 136383 -41 - 200938221 自重組細胞培養物直接地製造與單離雙價抗體片段之各種技術亦已被描述。例如，二價異種二聚體已使用白胺酸拉鍊對被製成。Kostelny 等人，J. Immunol.，148(5) : 1547-1553 (1992)。得自Fos與Jun蛋白質之白胺酸拉鍊肽係藉由基因融合連結至兩種不同抗體之FaW部份。抗體同種二聚體係在鉸鏈區域上被還原，以形成單體，然後再氧化，以形成抗體異種二聚體。由 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 6444-6448 (1993)所描述之’’雙抗體”技術已提供關於製造雙專一性/雙價抗體片段之替代機制。該片段包含藉由鏈結連接至輕鏈可變功能部位（VJ之重鏈可變功能部位（VH)，該鏈結係太短以致不允許在相同鏈上之兩個功能部位之間配對。因此，一個片段之VH與VL功能部位係被迫與另一個片段之互補VL與VH功能部位成對，於是形成兩個抗原結合位置。關於利用單鏈Fv (sFv)二聚體製造雙專一性/雙價抗體片段之另一種策略亦已被報告過。參閱Gruber等人，J. ❹ Immunol” 152 : 5368 (1994)。於一項具體實施例中，本發明之調配物包含對IL-1 (包括 IL-1 與IL-1 /5)為雙專一之抗體。製造雙專一性IL-1抗體之實例與方法可參閱2006年12月29日提出申請之美國臨時申請案號 60/878165。滲濾/超過濾（於本文中亦一般性地稱為DF/UF)係選擇性地利用可透過（多孔性）薄膜濾器，以其分子大小為基礎分離溶液與懸浮液之成份。薄膜會保留大於薄膜孔隙之分子，然而可透過之較小分子，譬如鹽、溶劑及水，會自由地通 136383 -42- 200938221 過薄膜。被薄膜所保留之溶液係被稱為濃縮液或留存物。通過薄膜之溶液係被稱為濾液或滲透液。關於選擇薄膜以供濃縮之一種參數係為欲被濃縮試樣之保留特徵。一般規則是，薄膜之分子量截止值（MWCO)應為1/3至1/6欲被保留分子之分子量。此係為確保完全留存。MWCO愈接近試樣，關於在濃縮期間之一些小產物損失之風險愈大。可與本發明方法一起使用之薄膜實例包括OmegaTMPES薄膜（30 kDa MWCO，意即大於30 kDa之分子係被薄膜保留，而小於30 kDa 之分子係被允許通過至細胞膜之濾液侧）（Pall公司，Port mshington，NY) ; Millex®-GV 注射器驅動滤器單元，PVDF 0.22 微米（Millipore 公司，Billerica，MA) ; Millex®-GP 注射器驅動濾器單元，PES 0.22微米；Sterivex® 0.22微米濾器單元(Millipore公司， Billerica, MA);及 Vivaspin 濃縮器（MWCO 10 kDa，PES ; MWCO 3 kDa, PES) (Sartorius 公司，Edgewood，NY)。為製備本發明之低-離子性蛋白質調配物，係使蛋白質溶液（其可被溶解於經緩衝之調配物中）接受DF/UF方法，而其中水係作為DF/UF媒質使用。於一項較佳具體實施例中，DF/UF媒質包含水，且不包含任何其他賦形劑。任何水可用於本發明之DF/UF方法中，惟較佳水為經純化或去離子水。可使用於本發明實施中之此項技藝中已知之水類型，包括注射用水（WFI)(例如HyPure WFI品質水 (HyClone)、AQUA-NOVA® WFI (Aqua Nova))、UltraPui^TM 水 (Invitrogen)及蒸德水（invitrogen ; Sigma-Aldrich)。有兩種形式之DF/UF，包括呈不連續模式之DF/UF與呈連 136383 -43· 200938221 續模式之DF/UF。本發明之方法可根據任—種模式進行。連續DF/UF (亦被稱為恒定體積脈JF)係涉及洗除在留存式樣或第一種蛋白質溶液)中之最初緩衝劑鹽(或其他低刀子ϊ物種），其方式是在與滤液正被產生之相同速率下’添加水或新緩衝劑至留存物中。因此，留存物體積盥產物農度不會在D卿方法期間改變。所移除鹽之量係與所產生之濾液體積有關，相對於留存物體積。所產生之渡液〇體積係、經常以”滲濾體積，，為觀點指稱。單—渗遽體積(Dv) 為開始渗遽時之留存物體積。對於連續渗遽，液體係在與產生遽液之相同速率下添加。當所收集之滤液體積等於開始留存物體積時，1 DV已被處理。不連續DF/UF (其實例係被提供於下文實例段落中）包括兩種不同方法，不連續之相繼DF/UF與趙積減少不連續 DF/UF。藉由相繼稀釋之不連續df/uf係涉及首先將試樣（或第一種蛋白質溶液）以水稀釋至預定體積。然後，使經稀釋〇之試樣藉由UF濃縮回至其原先體積。藉由體積減少之不連續DF/UF係涉及首先使試樣濃縮至預定體積，然後將試樣以水或替補緩衝劑稀釋回至其原先體積。與連續DF/UF一樣，係重複此方法，直到不想要溶質例如離子性賦形劑之含量被移除為止。 DF/UF可根據此項技藝中已知之習用技術，使用水例如 WFI作為DF/UF媒質進行（例如滲濾方法之工業超過濾設計與應用，Beaton & Klinkowski，J. Separ. Proc. Technol” 4(2) l_i〇 (1983))。關於進行DF/UF之市購可得設備之實例包括1^邱〇& 136383 200938221

LabscaleT M TFF 系統(Millipore)、LV CentramateT M 實驗室切線流動系統（Pall公司）及UniFlux系統（GE保健）。例如，於一項較佳具體實施例中，具有5〇〇毫升儲器之 Millipore LabscaleTM切線流動過濾（TFF)系統係用以進行本發明之方法，以產生經滲濾之抗體溶液。DF/UF程序係以不連續方式進行，其中14個處理步驟係用以產生在水中之高濃度抗體調配物。關於本發明特定具體實施例之其他舉例設備、溶液與水體積、處理步驟之數目及其他參數，可參閲下文實例段落。關於緩衝劑交換之滲濾之替代方法，其中蛋白質係根據本發明再被調配至水中，係包括滲析與凝膠過濾，此兩者均為此項技藝中者已知之技術。渗析係需要充填渗析氣$ (經界定孔隙度之薄膜罩殼）、將氣袋打結及將氣袋放置在水浴中。經過擴散，鹽在氣袋中之濃度將與浴液中之漠度 ❹ 達成平衡’其中不能夠經過氣袋擴散之大分子例如蛋二仍然留在氣袋中。浴液體積大，可達成之平《度愈低子樣雜積愈也^ 知而s ’冷液水之置換禆為元全移除所有鹽所需要。凝膠 …、其係以分子大小為基礎分離分子析技術，例如蛋白皙可基士在凝膠過濾中，大分子在本寸排阻而與較小分子例如鹽分離。故㈣佳具體實施例中，係使第一種蛋白質岭液接受與水之重複體積交換，以 ^蛋白質白質之含水調配物。滲遽 ▲:、、水與蛋之蛋白質而定，其中一 c任何次數，依溶液中個凑遽步驟係等於一次總體積交 136383 45 200938221 換。於一項具體實施例中，滲濾方法係進行1，2,3,4,5,6,7 8 9或至高多達被認為自第-種蛋白質溶液移除賦形劑（例如鹽）所必狀讀’錄使蛋自f係基本±被轉於水中。當-體積之水已被添加至等於蛋白質溶液開始體積之留存物側中時，係達成滲濾之單一回合或步驟。子

於—項具體實施例中，係使蛋白質溶液接受至少2次渗遽步驟。於—項具體實_中’滲❹驟或與水之體積/交 =重複至少四次，且較佳為至少五次。於—項具體實施例中，係使第-種蛋白f溶液接受以水之料，直到達成至少六倍體積交換為止。於另—項具时施财，係使第一種蛋白質溶液接受以水之料，直到達成至少七倍體積父換為止。上文所列舉數目之中間範圍，例如4至6或5至意欲成為本發明之—部份。例如，使用任何上文所列 :數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在之：一…具體實施例中，蛋白質之損失至超過滤薄膜 2液側應被降至最低°蛋自質損失料定薄狀滤液側之風險會改變，盥番白暂+丄 /、質之大小相對於薄膜孔隙大小及蛋

白質浪度有關聯。隨著在I 蛋白質濃度上之增加，蛋白質損天至濾液之風險係增加。斟 i〇 ^ 對於特定薄臈孔隙大小，蛋白質才貝失之風險對於在大小上上接近溥膜MWCO之較小蛋白質，係大於對較大蛋白質。因杏

b备在較小蛋白質上進行DF/UF 呀’不可能達成在體痛 μ ^ 之相同減少，當與使用相同薄膜，在較大蛋白質上進行作屮七戌較時’不會招致無法令人接受之 136383 -46 - 200938221 蛋白質損失。換言《’當與使㈣目同設備與薄膜之較小蛋白質溶液之超過渡比較時，較大蛋白質之溶液可被超過滤至較小體積’具有-致較大濃度之蛋白質在溶液中。使用特定孔隙大小薄膜之聊F程序對較小蛋白質係比對較大蛋白質可能需要更多處理步驟；對於較大蛋白質之較大體積減少與濃度係允許加回較大體積之水，導致在蛋白質溶液中之殘留緩衝劑或賦形劑成份之較大稀釋，對該個別處理步驟而言。因此，對較大蛋白質係比對較小者可能需要較少處理步驟，以達成在溶質上之特定降低。熟諸此藝者係能夠計算以各處理步驟所可能之濃縮量，上特定降低所需要之整個處理步驟之數目’在欲被使用於程序中之蛋白質大小與超過遽裝置之孔隙大小下。吏用於發明渗遽方法之結果，„在第—種蛋白質溶液於基本上包含水與蛋白質之最後含水調配物中 ❹ =地降低。例如，含水調配物可具有賦形劑之最後濃 ^^95%低於第_種蛋白f溶液，且較佳為至少低；種蛋白質溶液。例如，於一項具體奋絲/丨士白質溶於_中，係為一最^歹，，使蛋法，1係藉$生理-最後賦形劑濃度之方等於轉’以五份㈣體積達成，其係低。於、，於cie5=a〇0674，意即大約".3%最高賦形劑降 :步:7具體實施例中，熟諳此藝者可在市售_之: z驟期間’以恒定體積渗滤 α一_。此係提供大約二低。於另-項具體實施例中，熟諳此藝者可:理用:=降 w百J刊用8次滲濾體 136383 •47- 200938221 積交換，以獲得理論〜99,9%最高賦形劑降低。

’’不含賦形劑"或”無g形齊丨”術語係表示調配物基本上不含赋形劑。於-項具體實施例中，不含賦形劑係表示不含緩衝劑、不含鹽、不含糖、不含胺基酸、不含界面活性劑·及/或不含多元醇。於一項具體實施例中，"基本上不含賦形劑·，—詞係表示溶液或調配物為至少99%不含賦形劑。但是’應注意的是，在某些具體實施例中，調配物可包含某-特定非離子性賦形劑，例如絲或甘露醇，而該調配物在其他情況下仍為不含賦形劑。例如，調配物可包含水、蛋白質及甘露醇，其中調配物在其他情況下係不含賦形劑。在另—項實例中，調配物可包含水、蛋白質及聚花楸酸，纟中調配物在其他情況下係不含賦形劑。於又另 -項實例中配物可包含水、蛋白f、花楸醇及聚花揪酸S曰80纟中調酉己物在其他情況下係不含賦开多劑。當根據本文中所述之方法將水用於滲濾第一種蛋白質溶液時，離子性賦形劑將被洗除，且因此經滲濾含水調配物之導電率係低於第一種蛋白質溶液。若水溶液會傳導電力，則其必須含有離子，正如以離子性賦形劑所發現者。因此，低導電率度量值係表示本發明之含水調配物具有顯著地降低之賦形劑，包括離子性賦形劑。命液之導電率係根據此項技藝中已知之方法度量。導電率儀錶與元件可用以測定含水調配物之導電率，且應在使用之刖對標準溶液進行校準。可用於此項技藝中之導電率儀錶之實例包括MYR0N L數值計（c〇le panne产）、電導計 136383 -48- 200938221 (Metrohm AG)及系列3105/3115整人莫番安八， σ ▼电平分析器（Kemotron)。於一項具體實施例中’含水調配物且古道+ 巧I初具有導電率低於3 mS/公分。於另-項具體實施例中’含水調配物具有導電率低於2 mS/公分。於又另-項具體實施例中，含水調配物具有導電 W公分。於本發明之—方面’含水調配物具有導電率低於0.5 mS/公分。上文所列舉數目之中間範圍例如i 至3mS/公分’亦意欲被本發明所涵蓋。例如，使用任何上

文所列舉數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在内。此外’落在所列舉數目内之數值亦被包含在本發明中’例如 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.〇, U，12, ！ 3, ！ 4, i 5, i 6, i 7, 1.8’ 1·9, 2.0, 2.1’ 2.2, 2.3, 2.4’ 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0 等等。本發明之重要方面為經滲濾之蛋白質溶液（按照第一種蛋白質溶液之滲濾方法所獲得之溶液）可被濃縮。藉由按照此方法，已發現高濃度之蛋白質在水中係為安定的。在滲濾後之濃縮會造成含有水與增加之蛋白質濃度之含水調配物，相對於第一種蛋白質溶液。因此，本發明亦包括使用水作為滲濾媒質以滲濾蛋白質溶液，及接著濃縮所形成之水溶液。經滲濾蛋白質溶液之濃縮可經過此項技藝中已知之方式達成，包括離心分離。例如，在滲濾之後，使水為基礎之經滲濾蛋白質溶液接受離心分離方法，其係經由超過濾' 用以使蛋白質濃縮成高濃度調配物，同時保持水為基礎之溶液。經由離心分離，以超過濾薄膜及/或裝置使溶液濃縮之方式係為此項技藝中已知，例如以Yjvaspin離心濃縮器（Sartorius 公司，Edgewood，NY)。 136383 -49· 200938221 本發明之方法係提供一種在極高含量下，於水中濃縮蛋白質之方式’而無需其他安定劑。蛋白質在使用本發明方法所獲得之含水調配物中之濃度可為根據所要濃度之任何量。例如，蛋白質在根據本文方法製成之水溶液中之濃度為至少約ίο微克/毫升；至少約1毫克/毫升；至少約1〇毫2 /毫升；至少約20毫克/毫升；至少約5〇毫克/毫升；至少約 75毫克/毫升，至少約1〇〇毫克/毫升；至少約125毫克/毫升. 至少約150毫克/毫升，·至少約175毫克/毫升；至少約2〇〇毫克/毫升；至少約220毫克/毫升；至少約25〇毫克/毫升；至少約300毫克/毫升；或大於約300毫克/毫升。上文所列舉濃度之申間範圍，例如至少約113毫克/毫升，至少約214毫克/毫升，及至少約300毫克/毫升，亦意欲被本發明所涵蓋。此外，使用任何上文所列舉數值（或在上述範圍間之數值）之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在内，例如 100至125毫克/毫升，113至125毫克/毫升，及126至細毫克 /毫升或更多。本發明之方法係提供所形成調配物具有低百分比之蛋白質聚集體之優點，而不管高濃度之含水蛋白質調配物。於一項具體實施例中，包含水與高濃度蛋白質例如抗體之含水調配物係含有低於約5%蛋白質聚集體，即使於界面活性劑或其他類型賦形劑不存在下亦然。於一項具體實施例中，調配物包含不超過約7.3%聚集蛋白質；調配物包含不超過約5%聚集蛋白質；調配物包含不超過約4%聚集蛋白質；調配物包含不超過約3%聚集蛋白質；調配物包含不超過約2% 136383 -50- 200938221 聚集蛋白質；或調配物包含不超過約1%聚集蛋白質。於一項具體實施例中，調配物包含至少約92%，至少約93%，至少約94%，至少約95%，至少約96%，至少約97%，至少約 98%，或至少約99%單體蛋白質。上文所列舉濃度之中間範圍，例如至少約98.6%，不超過約4.2%，亦意欲成為本發明之一部份。此外，使用任何上文所列舉數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在内。許多蛋白質為基礎之醫藥產物需要在高濃度下調配。例如，抗體為基礎之產物在其藥物產物（DP)調配物中係逐漸地傾向於超過100毫克/毫升，以達成適當功效，且符合最高~1毫升注射體積之典型病患可用性要求條件。因此，下游處理步驟，譬如滲濾至最後調配物缓衝液中或超過濾以增加蛋白質濃度，亦在較高濃度下進行。古典熱力學係預測分子間交互作用可影響小溶質橫越滲析膜之分配作用，尤其是在較高蛋白質濃度下，且可採用描述分子間交互作用之非理想滲析平衡與作用之模型 (Tanford 教理 /6 學或互分子.New York, John Wiley & Sons 公司，第 182 頁，1961; Tester 與 Modell,斜力#!其應居，第 3 版，Upper Saddle River，NL, Prentice-Hall, 1997)。於此方法發展環境中，在詳細熱力學數據之可取用性不存在下，其係為應用此等類型之模型所必須，分子間交互作用在商用DF/UF操作之設計期間極少被納入考量。因此，DP賦形劑濃度可顯著地不同於所標識之濃度。在市售與發展產物上之此差異之數項實例係經發表，例如氯化物係至高30%低於IL-1受體拮抗劑中 136383 -51 - 200938221 所標識者，組胺酸係40%低於PEG-sTNF受體中所標識者，及醋酸鹽係至高200%高於融合共扼蛋白質中所標識者（Stoner 等人，·/. Sa·.，93, 2332-2342 (2004))。實際 DP 為何可與蛋白質被滲濾至其中之缓衝劑組成不同，有數個原因，包括 Donnan 作用（Tombs 與 Peacocke (1974) Oxford ; Clarendon 出版社）、非專一性交互作用（Arakawa 與 Timasheff，Arc/i.历历 224, 169-77 (1983) ί Timasheff, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22, 67-97 (1993))及體積排阻作用。體積排阻包括大部份蛋白質部份比容係在0.7與0.8毫升/克之間。5因此，對於在100毫克/毫升下之球狀蛋白質，蛋白質分子係佔據總溶液體積之約7.5%。假定無顯著分子間交互作用，這會轉化成在薄膜留存物側上之溶質莫耳濃度，其係為在薄膜滲透液側上之莫耳濃度之92.5%。此係解釋為何基本上所有蛋白質溶液組成會在超過濾處理期間必然改變。例如，在40毫克/毫升下’ 蛋白質分子係佔據總溶液體積之約3% ’且增加濃度至150 毫克/毫升之超過濾步驟將必然引致莫耳賦形劑濃度改變達超過8% (因在150毫克/毫升下之蛋白質係構成總溶液體積之大於11%)。上文所列舉百分比之中間範圍亦意欲成為本發明之一部份。此外，使用任何上文所列舉數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在内。根據本發明之方法與組合物，在DF/UF操作期間之緩衝劑組成改變可利用純水作為滲濾媒質而避開。藉由濃縮蛋白質〜20%大於最後整體DS中所要之濃度，可接著例如經由高度濃縮之賦形劑儲備溶液添加賦形劑。然後，賦形劑濃度 136383 -52- 200938221 與溶液pH可被保証與所標識者相同。本發明之含水調配物係提供一項作為起始物質之優點，因其基本上未含有賦形劑。在水中滲濾之後被添加至調配物中之任何賦形劑可經正確地計算，意即職形劑之先前存在濃度不會干擾此計算。藥學上可接受賦形劑之實例係被描述於Remington氏醫藥科學第16版，〇s〇1，A.編著（198〇)中，併

入本文供參考。m發明之另—方面包括使用經過本文中所述方法獲得之含水調配物，以製備調配物，特別是具有已知賦形劑濃度之醫藥調配物，包括非離子性賦形劑或離子性賦形劑。本發明之—方面包括另_個步驟，其中賦形劑係被添加至包含水與蛋白質之含水調配物中。因此，本發明之方㈣提供—種含水調配物，其係基本上不含賦形劑’且可作為起始物質使用，以製備包含水、蛋白特定賦形劑濃度之調配物。於一項具體實施财，本發明之方法可心將非離子性 :形劑，例如糖類’或非離子性界面活性劑，譬如聚花楸 =氧:(一)，添加至調配物中，而不會改變其 ::。例如蛋白質濃度、蛋白質之流體動力學直徑、導電述==Γ之含水調配物之其他特徵與優點係描述於=:::。關於進行本發明方法之— m·本發明之調配物本發明係提供包含蛋白質與水之含水調配物，其具有許 136383 -53- 200938221 夕勝過此項技藝中之習用調配物之優點，包括蛋白質在水中之安疋！生，而不需要其他賦形劑，增加之蛋白質濃度，而無需其他賦形劑以保持蛋白質之溶解度’及低滲透度。本發明之調配物亦具有有利之儲存性質，因在調配物中之蛋白質會在儲存期間保持安定，例如在7。。或冷凍，解凍條件下’以液體形式儲存超過3個月，即使在高蛋白質濃度與重複之冷;東/解;東處理步驟下亦然。於一項具體實施例中，〇本發明之調配物包含高濃度之蛋白質，以致含水調配物不會顯示顯著乳白色、聚集或沉澱作用。本發明之含水調配物並不倚賴標準賦形劑，例如滲透性改變劑、安定劑、界面活性劑、抗氧化劑、低溫保護劑、膨鬆劑、柬乾保護劑、驗性成份及酸性成份。在本發明之其他具體實施例中’調配物含有水、一或多種蛋白質，而無離子性賦形劑（例如鹽、自由態胺基酸類）。 *在某些具體實施例中，本發明之含水調配物包含蛋白質 φ /辰度為至>50毫克/毫升，與水，其中調配物具有滲透度為不超過30毫滲透度/公斤。含水調配物之滲透度之下限亦被本發月所涵蓋。於一項具體實施例中，含水調配物之渗透度為不超過15毫滲透度/公斤。本發明之含水調配物可具有渗透度低於30毫滲透度/公斤i亦具有高蛋白質濃度，例如蛋白質之濃度為至少100毫克/毫升，及可為多達200毫克/ 毫升或較大。上文所列舉濃度與滲透度單位之中間範圍亦意欲成為本發明之一部份。此外，使用任何上文所列舉數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在内。 136383 -54- 200938221 士本發明含水調配物之濃度並未被蛋白質大小所限制，且调配物可包含任何大小範圍之蛋白質。被包含在本發明範圍内者為包含至少5G毫克/毫升及多達2⑻毫克/毫升或更多之蛋白質之含水調配物，其在大小上可涵蓋範圍從卿 k〇a或更大。在一項具體實施例中，於本發明調配物中之蛋白質在大小上為至少約⑽，在大小上為至少約2〇 I在大小上為至少約47奶·在大小上為至少⑽奶；在

大小上為至少約8()kD;在大小上為至少約⑽奶；在大小上為至少約12〇此在大小上為至少約l4QkD;在大小上為至少約160 kD;或在大小上大於約16〇奶。上文所列舉大小之中間範圍亦意欲成為本發明之一部份。此外，使用任何上文所列舉數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在内。本發明之含水調配物可藉由溶液中蛋白f之流體動力學直徑（Dh)作特徵。在溶液中蛋白f之流體動力學直徑 ❹可使用動態光散射(DLS)度量，其係為測定蛋白質q之已建立刀析方法。關於單株抗體例如IgG之典型值為約毫微米。低-離子性調配物，例如本文中所述者，可經特徵鑒定，因蛋白質之Dh係特別地低於包含離子性賦形劑之蛋白質調配物。已發現在使用刪F方法，使用純水作為交換媒質; 製成之含水調配物中之抗體Dh值，係特別地低於在習用調配物中之抗體Dh，與蛋白質濃度無關。於—項具體實施例中’在本發明含水調配物中之抗體係具有Dh小於4毫微米J 或小於3毫微米。 136383 -55- 200938221 "具體實施例中，在含水調配相對於在緩衝溶液中之相同：白質之％，蛋白質濃度。因此，於某些具體實：：為較小，無關於所述方法製成之含水 w令，在根據本文中，、於緩衝溶液中相同特定濃度下之蛋白=為至：溶液之實例包括但不限於鱗酸鹽緩衝之越水h於=衝 Ο 0 具體實施例t，在本發明含水調配物中之蛋白質係且= 為至少50%小於PBS令特定濃度下之 h 小於PBS中特定濃度之Dh，至少60% 特定濃度下之蛋白質之卜^之^至少观小於哪中下之蛋白質之D卜％小於舰中特定濃度為本發明之一二I S列舉百分比之中間範圍亦意欲成外枯 Μ ’例如55%，篇，取_，68% #等。此值範圍係欲被包含在内，例如鄉至2。上及/或下限之數 =質聚集為蛋白質溶液中之常見問題，且經常由於增低蛋白Γ濃度所造成。本發明係提供一種達成高濃度、衝2聚集調配物之方式。本發明之調配物並不倚賴緩 ^先與賦形劑，包括界面活性劑，而保持調配物中之蛋可岭性及免於聚集。本發明之調配物對治療目的可為藥^因其在蛋白質濃度上很高’且為水系，不倚賴其他以達成蛋白質在溶液中之高安定濃度。大部份生物學產物（包括抗體）係易遭受到許多降解過經常源自於溶液中之非酵素反應。此等反應對於匆t定性、安全性及功效可具有長期衝擊。此等不安定 136383 •56- 200938221 性可藉由產物在低於零溫度下之儲存而被阻滯（若未被消除時），因此以供應之彈性與有效性歷經產物壽命期觀之， ;製4者係獲致非常大之利益。雖然冷來經常為生物製劑產物儲存之最安全且最可信賴方法’但其具有固有風險。當水結晶時，冷凍可藉由引進冰-液體界面，及藉由溶質之冷凍辰縮（低溫濃縮（cryoconcentrati〇n))，而經用，在蛋白質中引致應^ 〇低溫濃縮為一種方法，其中平坦未經控制之移動冰正面係在冷凍期間形成，其會排除溶質分子（小分子，譬如蔗糖、鹽及典型上於蛋白質調配物中所使用之其他賦形劑，或，分子’譬如蛋白質），導致區帶，其中蛋白質可在相對較高濃度下，於其他溶質存在下，在可潛在地導致局部阳或離子濃度極端之濃度下被發現。對於大部份蛋白質，此等條件可導致變性作用，而在一些情況中，為蛋白質與溶質沉澱作用。由於緩衝鹽及其他溶質亦在此種條件下被濃〇縮，故此等成份可達到足夠高而在經冷凍團塊内之區帶中導致pH及/或氧化還原作用變化之濃度。由於在冷凍期間，於溶液中之緩衝鹽結晶化作用（例如磷酸鹽）結果所發現之 PH轉變，可跨越數個pH單位，其可衝擊蛋白質安定性。經濃縮溶質亦可導致凝固點之降低至其中溶質可完全不被冷凍之程度，且蛋白質將在此等不利條件下存在於溶液内。可經常應用快速冷卻，以降低蛋白質曝露至此等不期望條件之時期。但是，快速冷凍可引致大面積冰水界面，然而緩慢冷卻會引致較小界面區域。例如，在一個冷凍/ 136383 •57· 200938221 解凍步驟期間，六種模式蛋白質之快速冷卻，係顯示發現變性作用大於ίο次緩慢冷卻循環，証實疏水性冰表面所引致變性作用之大去安定化作用可能性。本發明之含水調配物係具有有利之安定性與儲存性質。含水調配物之安定性並不依賴儲存之形式，且包括但不限於經冷凍、凍乾或喷霧乾燥之調配物。安定性可在所選定之溫度下度量，經歷所選定之時期。於本發明之一方面， ❹在3水調配物中之蛋白質係為安定的，呈液體形式，歷經至少3個月；至少4個月；至少5個月；至少6個月；至少12 個月。上文所列舉時期之中間範圍亦意欲成為本發明之一部份，例如9個月等等。此外，使用任何上文所列舉數值之組合作為上及/或下限之數值範圍係欲被包含在内。調配物較佳係在室溫（約3(TC)下，或在贼下為安定的，歷經至少 1個月，及/或在約2-8t下為安定的，歷經至少4，或更佳係在約2-8。(：下為安定的，歷經至少2年。再者，調配物〇較佳係在調配物之冷;東（至例如鐵）與解純為安定的，於後文稱為"冷康/解束循環，I。蛋白質之安定性亦可被定義為仍然保持生物活性之能力。若於醫藥調配物中之蛋白質在投予病患時為生物活性，則蛋白質於醫藥調配物中係"保有其生物學活性”。例如，若於醫藥調配物中之抗體之生物學活性係在製備醫藥調配物之時間下所顯示生物學活性之約鄕，約20%，或約靡内（在檢測之誤差内）（例如#在抗原結合檢測中測定時），則抗體之生物學活性係被保留。 136383 -58- 200938221 在含水調配物中之蛋白質安定性，亦可被定義為在調配物中之蛋白質之單體、聚集體或片段或其組合之百分比。若蛋白質於目視檢查顏色及/或透明性時，或當藉由uv光散射或藉由尺寸排阻層析度量時，實質上未顯示聚集、沉殿作用及/或變性作用之跡象，則其在調配物中係，保有其物理女疋性。於本發明之一方面，安定含水調配物為一種

調配物，具有小於約祕，且較佳為小於約5%之蛋白質以聚集體存在於調配物中。本發明含水調配物之另一特徵係為於一些情況中，在與第-種蛋白質溶液比較下，使用水滲濾蛋白質會造成具有經改良黏度特徵之含水調配物（意即在與第一種蛋白質溶 =比較下’經滲濾蛋白質溶液之黏度係被降低卜熟諳此藝㈣瞭的是’度量黏度之多種方法可在本發明之不同具 ::施例中用於製備調配物。例如，動黏度數綱可使生。在其他具體實施例中，動態黏度數據係無由^: 他黏度數據—起陳述。動態黏度數據可經由將動黏度數據乘以密度而產生。之=項Γ實施例中，本發明亦提供-種調整某-特徵 :::參透度及/或黏度，按需要而定，在高蛋白質醇二：液中，其方式是添加非離子性職形劑，譬醇而不會改變其他所要之特徵，譬如非乳包含為水系且具有高濃度蛋白質蛋白質轉移至水期間或其後，或在=物:其中無論是在改良例如調配物之滲透度或#度：:=間；添加會 ^做之賦形劑，係在本發 136383 -59- 200938221 明之範圍内。因此’亦在本發明之範圍内者為此種非離子性賦形劑可在蛋白質轉移至最後低離子性調配物中之過程期間添加可被添加至本發明之含水調配物中，以變更所要調配物特徵之不可離子化賦形劑之實例，包括但不限於甘露醇^楸醇、非離子性界面活性劑(例如聚花楸酸酯聚花楸酸知40、聚花楸酸酉旨6〇或聚花揪酸酉旨⑽u、海藻糖、植物蜜糖及麥芽糖。本文之調配物亦可含有—種以上之蛋白f。關於醫藥調配$ ’可⑽另—種不同蛋白質，按被治療之特㈣應徵所需要而定，較佳為具有不會不利地影響其他蛋白質之互補活性者。例如’一般可能期望在單一調配物中提供兩種或多種會結合至丁\17或11^12之抗體。再者，抗_WF或抗孔Η 抗體可在-種調配物中合併。此種蛋白質係適當地以對於所意欲目的有效之量存在於組合中。可被加入含水調配物中之蛋白質之實例包括抗體或其抗原結合片段。可使用於本發明中之不同類型抗體或其抗原結合片段之實例，包括但不限於嵌合抗體、人類抗體、人化抗體及功能部位抗體（dAd)。於一項具體實施例中，在本發明方法與組合物中所使用之抗體為抗_TNFa抗體或其抗原結合部份，或抗-IL-12抗體或其抗原結合部份。可使用於本發明中之抗體或其抗原結合片段之其他實例，包括但不限於 1D4.7 (抗-IL-12 / 抗-IL-23 ; Abbott 實驗室）、2.5(E)mgl (抗 -IL-18 ; Abbott 實驗室）、i3C5 5 (抗 _IL_13 ; Abb〇tt 實驗室）、J695 (抗-IL-12 ; Abbott 實驗室）、Afeiimomab (Fab 2 抗-TNF ; Abbott 136383 •60· 200938221 實驗室）、Humira (阿達利母馬（adalimumab) (D2E7) ; Abbott 實驗室）、肯巴斯（Campath)(阿連圖馬伯（Alemtuzumab))、CEA-掃描 Arcitumomab (fab片段）、鄂比圖斯（Erbitux)(些圖西馬伯 (Cetuximab))、贺西伯亭（Herceptin)(搓史圖諸馬伯（Trastuzumab))、 Myoscint (Imciromab Pentetate)、ProstaScint (卡普洛馬伯片迪肽 (Capromab Pendetide))、瑞米卡得（Remicade)(因弗利西馬 (Infliximab))、ReoPro (亞伯西瑪伯（Abciximab))、利圖散（Rituxan) (利圖西馬伯（Rituximab))、Simulect (巴西利馬伯（Basiliximab))、 Synagis (柏利維充諸馬（Palivizumab))、Verluma (諾非圖莫伯 (Nofetumomab))、Xolair (歐馬利祖馬（OmaUzumab))、Zenapax (達可利諸伯（Daclizumab))、吉維林（Zevalin)(衣利圖莫伯提克西坦（Ibritumomab Tiuxetan))、Orthoclone OKT3 (目洛蒙那伯 (Muromonab)-CD3)、Panorex (艾卓可羅伯（Edrecolomab))與米若塔革（Mylotarg)(堅圖住馬伯歐坐加霉素（Gemtuzumab ozogamicin))、古利馬伯（golimumab) (Centocor)、Cimzia (Certolizumab pegol)、Soliris

(也苦利馬伯（Eculizumab))、CNTO 1275 (ustekinumab)、Vectibix (片尼圖努馬伯（panitumumab))、貝克薩（Bexxar)(托西圖莫伯 (tositumomab)與 I131 托西圖莫伯（tositumomab))及阿威斯 ί丁 (Avastin)(貝發西馬伯（bevacizumab)) 〇在一種替代方式中，蛋白質為治療蛋白質，包括但不限於普莫吉美（Pulmozyme)(鏈道酶alia)、瑞革蘭尼（Regranex)(貝卡列明（Becaplermin))、亞克提維斯（Activase)(阿帖普酶 (Alteplase))、阿度拉酶（Aldurazyme) (Laronidase)、阿美威維 (Amevive)(阿列發謝特（Alefacept))、阿拉内普（Aranesp)(達貝艾 136383 -61- 200938221 波亭（Darbepoetin) alfa)、貝卡列明（Becaplermin)濃縮物、貝他色隆(Betaseron)(干擾素/S-lb)、玻拓克斯（BOTOX)(肉毒毒素A 型）、Elitek (來斯布利酶（Rasburicase))、約爾史巴（elspar)(天冬醯胺酶）、Epogen (艾波亭（Epoetin) alfa)、恩布瑞爾（Enbrel)(恩塔臬西伯（Etanercept))、Fabrazyme (Agalsidase /5)、干擾原（Infergen) (干擾素 alfacon-1)、因特隆（Intron) A (干擾素 a-2a)、Kineret (安那金拉（Anakinra))、MYOBLOC (肉毒毒素B型）、紐拉斯塔 (Neulasta)(佩非葛拉亭（Pegftlgrastim))、Neumega (歐普瑞維金 (Oprelvekin))、紐波真（Neupogen)(非葛拉亭（Filgrastim))、歐塔克 (Ontak)(丹尼白血球素待弗提托斯（Denileukin diftitox))、 PEGASYS (PEG干擾素a-2a)、前白血球素（阿迪斯白jk球素 (Aldesleukin))、普莫吉美（Pulmozyme)(鏈道酶 alfa)、Rebif (干擾素yS-la)、瑞革蘭尼（Regranex)(貝卡列明（Becaplermin))、瑞塔威斯（Retavase)(瑞替普酶（Reteplase))、Roferon-A (干擾素 α-2)、 TNKase (腱激酶）與 Xigris (Drotrecogin alfa)、Arcalyst (Rilonacept)、 NPlate (Romiplostim)、Mircera (曱氧基聚乙二醇 _艾波亭（epoetin) /3)、Cinryze (Cl S旨酶抑制劑）、Elaprase (idursulfase)、Myozyme (阿葡萄糖嘗酶（alglucosidase) alfa)、歐倫西亞（Orencia)(阿巴塔謝特（abatacept))、Naglazyme (galsulfase)、克比凡斯（Kepivance)(巴利弗明（palifermin))及 Actimmune (干擾素 7_lb)。可被加入本文中所述方法與組合物中之蛋白質之其他實例，包括哺乳動物蛋白質，包括其重組蛋白質，譬如生長激素，包括人類生長激素與牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-l-抗胰蛋白 136383 -62- 200938221

酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡成熟激素；降血鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；塊凝因子，譬如因子VIIIC、因子IX、組織因子及von Willebrands因子；抗凝血因子，譬如蛋白質C ;心房利鈉尿因子；肺部界面活性劑；血纖維蛋白溶酶原活化劑，譬如尿激酶或組織型jk 纖維蛋白溶酶原活化劑（t-PA);彭巴17井（bombazine);凝血酶；腫瘤壞死因子-α與腦啡肽酶；RANTES (於正常T-細胞表現與分泌之活化作用上調節）；人類巨噬細胞炎性蛋白質 (MIP-1- α);血清白蛋白，譬如人類血清白蛋白；目勒氏抑制物質；弛緩素Α-鏈；弛缓素Β-鏈；弛緩素原；老鼠促性腺激素有關聯肽；DNase ;抑制素；活性素；血管内皮生長因子（VEGF);激素或生長因子之受體；整合素；蛋白質A或D; 風濕性因子；神經營養因子，譬如骨頭衍生之神經營養因子（BDNF)、神經營養素-3, -4, -5 或-6 (NT-3, NT4, NT-5 或 NT-6)，或神經生長因子，譬如NGF- yS ;血小板所衍生之生長因子 (PDGF);成纖維細胞生長因子，譬如aFGF與bFGF ;表皮生長因子（EGF);轉變生長因子（TGF)，譬如TGFa與TGF-iS，包括 TGF-冷 1、TGF-冷 2、TGF-yS 3、TGF-/3 4或 TGF-yS 5;似胰島素生長因子-I 與-II (IGF-I 與 IGF-II) ; des(l-3)-IGF-I (腦部 IGF-I); 似胰島素生長因子結合蛋白質；CD蛋白質，譬如CD3、 CD4、CD8、CD19及CD20 ;促紅血球生成素（EPO);血栓造血素（TPO);骨誘發因子；免疫毒素；骨頭形態發生蛋白質 (BMP);干擾素，譬如干擾素-a，-/3及-τ;菌落刺激因子 (CSF)，例如 M-CSF、GM-CSF 及 G-CSF ;間白血球活素（IL)， 136383 -63- 200938221 例如IL-1至IL-10，超氧化歧化酶；τ-細胞受體；表面膜蛋白質，衰變加速因子（DAF);病毒抗原，例如AIDs包膜之—部份；輸送蛋白質；導航受體；選址素；調節蛋白質；免疫黏連素；抗體；及任何上文列示多肽之生物活性片段或變種。 IV·本發明之用途本發明之調配物可於治療上使用，意即活體内，或作為試劑用於活體外或原位目的。 Ο >'台療用途本發明之方法亦可用以製造具有對於治療用途有利之特徵之水系調配物。此含水調配物可作為醫藥調配物，用以治療病患中之病症。本發明之調配物可用以治療該治療蛋白質係適合對其治療之任何病症。"病症”為將得利於以蛋白質治療之任何症狀。這包括慢性與急性病症或疾病，包括使哺乳動物易羅〇患討論中病症之病理學症狀。在抗-TNFa抗體之情況中，可投予治療上有效量之抗體，以治療自身免疫疾病，譬如風濕性關節炎，腸病症，譬如克隆氏病，脊椎關節病，譬如關節黏連脊椎炎，或皮膚病症，譬如牛皮癬。在抗_il_12 抗體之情況中，可投予治療上有效量之抗體，以治療神經病症，譬如多發性硬化，或皮膚病症，譬如牛皮癖。其中本發明調配物可用以治療之病症之其他實例包括癌症了包括礼癌、白金病、淋巴瘤及結腸癌。 ’’病患”-詞係意欲包括有生命生物體’例如原核生物與 136383 -64- 200938221 真核生物。病患之實例包括哺乳動牛、馬、豬、絲羊、山羊人類、狗、礼老乳、兔子、大备鐘基因非人類動物。在本發明自执及轉人類。不發月之特殊具體貫施例中，病患為治療” 一詞係指治療處理與 v . ^ ^ 凡丨且止手段兩者。需要治療者包括已患有病症者， ’、中病症係欲被預防者。含水調配物可根據已知投藥铷4k,. 成仅丁而要治療之哺乳動 G i類。投_方法之實例包括靜脈内投藥，孽如大 =:!藉由連續灌注歷經一段時間，肌内、腹膜腔内、飞内、皮下、關節内、滑膜内、鞘内、皮内、經皮、口服、局部或吸入投藥。於一項具體實施例中，含水調配物係藉皮下投藥投予哺乳動物。對於此種目的，調配物可使用注射器，以及其他裝置，包括注射裝置（例如Injectease與Genject裝置）；注射筆 («=如 GenPen)，無針裝置（例如 MediJect〇r 與 Bi__ 2_);及 ❹皮下貼藥傳輸系統注射。於一項具體實施例中，装置，例 /主射器自動注射器筆，係含有具在大小上範圍為MG 之規格或較小直徑之針頭。於一項具體實施例中，針頭規格於大小上範圍為加至加（包括其中間範圍，例如Μ， 26, 26^ 27Q 28G’ 29Q 30G，31G，32G 及 33G)。於一項較佳具體實施例中，最小針頭直徑與適當長度係根據調配物之黏度特徵及用以傳輪本發明調配物之裝置作選擇。本發明方法/組合物之一項優點為其係在溶液中提供大漢度之蛋白質’其對於使用無針裝置投予蛋白質至病患可 136383 -65- 200938221

為理想的。此種裝置係允許蛋白質分散於整個病患組織中，而無需藉由針頭注射。無針裝置之實例包括但不限於 Biojectorr 2000 (Bioject 醫學技術）、Cool.Click (Bioject 醫學技術）、 Iject (Bioject 醫學技術）、Vitajet 3 (Bioject 醫學技術）、MM500 (醫學家庭 PLC)、Injex 30 (INJEX - Equidyne 系統）、Injex 50 (INJEX -Equidyne 系統）、Injex 100 (INJEX - Equidyne 系統）、喷射注射器 (INJEX - Equidyne 系統）、Jetinjector (Becton-Dickinson)、J-Tip (國家醫療裝置公司）、Medi-Jector VISION (Antares Pharma)、MED-JET o (MIT Canada 公司）、DermoJet (Akra Dermojet)、Sonoprep (Sontra 醫療公司）、PenJet (PenJet 公司）、MicroPor (Altea Therapeutics)、Zeneo (Crossject 醫學技術）、Mini-Ject (Valeritas 公司）、ImplaJect (Caretek 醫療公司）、Intraject (Aradigm)及 Serojet (Bioject 醫學技術）。亦被包含在本發明中者為收容含水調配物之傳輸裝置。此種裝置之實例包括但不限於注射器、筆（譬如自動注射筆）、植入物、吸入裝置、無針裝置及貼藥。自動注射筆之 ❿ 實例係描述於2007年6月29曰提出申請之美國專利申請案號 11/824516 中。本發明亦包括藉吸入傳輸本發明調配物之方法，與含有該調配物供此種傳輸之吸入裝置。於一項具體實施例中，含水調配物係經由吸入，使用霧化罐或液體吸入器投予病患。一般而言，霧化罐係使用壓縮空氣以傳輸醫藥，作成供吸入用之濕氣溶膠或霧氣，因此需要藥物可溶於水中。霧化罐之類型包括噴射霧化罐（空氣噴射霧化罐與液體喷射霧化罐）與超音波霧化罐。 136383 -66- 200938221 霧化罐之實例包括AkitaTM(Activaero GmbH)(參閱 US2001037806、EP1258264)。AkitaTM為桌上霧化罐吸入系統（重量：7.5 公斤，BxWxH : 260 X 170 X 270)，以 Pari 之 LC Star 為基礎，其係提供涵蓋病患呼吸型式之完全控制。此裝置可在小於10分鐘内，以極高傳輸速率將多達500毫克在溶液中之藥物傳輸至肺臟與肺臟末梢。65%之霧化粒子係低於5微米，且質量中間值氣體動力直徑（MMAD)在1.8巴下為3.8微米。最小充填體積為2毫升，而最大體積為8毫升。吸氣流量（200毫升/秒）與霧化罐壓力（0.3-1.8巴）係藉由智慧型卡片設定。此裝置可以肺功能試驗為基礎，個別地對每一病患作調整。可與本發明組合物一起使用之霧化罐之另一項實例包括 Aeroneb®Go/Pro/Lab 霧化罐（AeroGen)。Aeroneb® 霧化罐係以 0nQTM技術為基礎，意即包含獨特圓頂形孔口板之電子微型泵（3/8英吋直徑與薄晶圓），其含有超過1，000個被振動元件所圍繞之精密成形推拔狀孔洞。Aeroneb®Go為供家庭使用之可攜帶單元，然而Aeroneb®Pro為供使用於醫院與移動性診所之可再使用與可熱壓處理裝置，及Aeroneb®Lab為供使用於臨床前氣溶膠研究與吸入研究之裝置。此等系統之特徵包括氣溶膠液滴大小之最佳化與定製性；以精密地控制之液滴大小之低-速度氣溶膠傳輸，幫助呼吸道系統内之標的藥物傳輸；服藥之彈性；含有固定體積藥物在溶液或懸浮液中之定製單一劑量安瓿瓶，或供使用於一般目的霧化罐之市購可得溶液之調整；連續呼吸促動或可程式化；及 136383 -67- 200938221 可配合寬廣範圍病患之需求作調整，包括兒童與年長者；單一或多病患使用。

AerocurrentT M (Aero vertRx公司）亦可與本發明之組合物一起使用（參閱W02006006963)。此霧化罐為可攜帶振動網片霧化罐，其特徵為用後即棄、預充填或使用者充填之藥筒。

Staccato"1 M (Alexza Pharma)亦可與本發明之組合物一起使用 (參閱W003095012)。關於StaccatoTM技術之關鍵為藥物之汽化，而不會熱降解，其係藉由快速地加熱藥物之薄膜而達成。在不到半秒内，藥物係被加熱至足以使固體藥物薄膜轉化成蒸氣之溫度。吸入器包括三種核心組件：加熱受質、經塗覆於受質上之藥物薄膜及病患經過其間吸入之導氣管。吸入器係經呼吸引動，具有所傳輸之最大劑量為20-25 毫克，及在1-2微米範圍内之MMAD。 AERx® (Aradigm)亦可與本發明之組合物一起使用（參閱 W09848873、US5469750、US5509404、US5522385、US5694919、 _ US5735263、US5855564)。AERx®為手握式電池組操作之裝置，其係利用活塞機制，以將調配物自AERx®片條逐出。此裝置係監測病患吸入空氣流量，及只在達成最適宜呼吸型式時才發射。此裝置可傳輸約60%之劑量作為排放劑量，及 50-70%之排放劑量進入肺臟深層中，具有<25%病患間變異性。亦可與本發明組合物一起使用之霧化罐裝置之另一項實例包括Respimat® (Boehringer)。Respimat®為多劑量儲器系統，其係藉由扭轉裝置底座而被引動，其係藉由彈簧壓縮，且自 136383 -68- 200938221 樂筒轉移經計量體積之調配物至服藥室。當裝置被引動時，彈簧係被釋放，其會迫使微活塞進入服藥室中，經過單一板塊推送溶液；單一板塊包括具有兩個微細出口喷嘴通道之滤器結構。藉由Respimat®產生之MMAD^m 此裝置係適用於傳統上被採用以治療呼吸道病症之低劑量藥物。本發明之組合物亦可使用collegium Ne_zefTM_e_ ❹Pharma)傳輸，其係為包括經沉積在薄媒上之藥物之霧化罐系統。在以重配溶劑重配後，劑型係經過口腔或鼻吸入，使用Collegium霧化罐投予病患。亦可與本發明組合物一起使用之霧化罐裝置之另一項實例包括Inspiration® 626 (Respir〇nics)。626為一種壓縮機為基礎之霧化罐’供家庭護理用。626會傳輸在〇5至5微米間之粒子大小。可與本發明組合物一起使用之霧化罐可包括Μ物^ 〇 Aer〇S〇1 Dellvery®技術（ResPironics)，其會傳輸精確且可再現性之吸入藥物劑量至病患，而不管此種病患之年齡、大小或呼吸型式上之變異性。AAD®系統係在手機内併入電子系統與感測器，以藉由偵測吸氣與呼氣期間之壓力變化，而龄控病患之呼吸型式。感測器係測定在吸氣之第一部份期間何時脈衝藥物之氣溶膠傳輸。在整個治療中，感測器係監控前三次呼吸，且配合病患之吸氣與呼氣型式作調整。由於AAD®系統僅在病患正經過吹管嘴呼吸時傳輪藥物，故此等裝置係允許病患在治療中暫停，而不會有藥物浪費。 136383 -69- 200938221 AAD®系統霧化罐之實例包括HaloLite® AAD®、ProDose® AAD® 及 I-Neb®AAD® 〇

HaloLite® Adaptive Aerosol Delivery (AAD)® (Respironics)為藉由可攜帶壓縮機供給動力之氣動氣溶膠化系統。AAD®技術係監控病患之呼吸型式（典型上為每十毫秒），且依被使用之系統而定，無論是釋出氣溶膠化藥物之脈衝至吸入之特定部份或計算在吸入期間自”停滯氣溶膠雲霧”所抽取之劑量 (參閱EP 0910421，併入本文供參考）。

ProDos AAD®(Respironics)為藉由"ProDose DiscTM"系統 (Respironics)所控制之霧化系統。ProDos AAD®為藉由可攜帶壓縮機供給動力之氣動氣溶膠系統，其中欲被傳輸之劑量係藉由被插入系統中之含微晶片圓盤所控制，其特別是會指示系統關於傳輸之劑量。ProDose DiscTM為含有微晶片之塑膠圓盤，其係被插入ProDose AAD®系統中，並指示其關於傳輸何種劑量、劑量之數目，其可與各種控制數據一起傳送，包括藥物批次代碼與到期日（參閱EP1245244，併入本文供參考）。Promixin®可經由Prodose AAD®傳輸，用於處理銅綠假單胞菌肺臟感染，特別是膽囊纖維變性。Promixin®係以供霧化作用之粉末供應，其係在使用之前重配。 I-neb AAD®為手握式AAD®系統，其會傳輸精確且可再現性之藥物劑量至病患之呼吸型式中，無需另一個壓縮機 (，，I-Nebn)。I-neb AAD®為小型化AAD®吸入器，以電子網片為基礎之氣溶膠化技術（Omron)與AAD®技術之組合為基礎，以控制用藥至病患之呼吸型式中。此系統為大約可移動電話 136383 -70- 200938221 之大小，且重量小於8盎司。I-neb AAD®已被使用於傳輸 Ventavis® (衣洛普斯特（iloprost)) (CoTherix / Schering AG) 〇可與本發明組合物一起使用之霧化罐之另一項實例為 AriaT M (Chrysalis)。Aria係以毛細管氣溶膠產生系統為基礎。氣溶膠係藉由泵送藥物調配物經過小的電加熱毛細管而形成。於離開毛細管時，調配物會快速地藉由環境空氣冷卻，以產生氣溶膠，具有0.5-2.0微米範圍之MMAD。此外，TouchSprayTM霧化罐（Odem)可用以傳輸本發明之組合物。TouchSprayTM霧化罐為使用穿孔薄膜之手握式裝置，該薄膜會在超音波頻率下振動，與儲器流體接觸，以產生氣溶膠雲霧。振動作用會經過薄膜中之孔洞抽取流體之喷射，使此喷射破碎成藥物雲霧。液滴之大小係被孔洞之形狀/大小，以及藥物溶液之表面化學與組成所控制。此裝置已經報告會傳輸83%經計量之劑量至肺臟深層。 TouchSprayTM霧化罐之細節係描述於美國專利6659364中，併入本文供參考。

可與本發明組合物一起使用之其他霧化罐包括為可攜帶單元之霧化罐，當病患吸入時，其會使氣溶膠輸出達到最大程度，及當病患使用兩個單向閥（參閱PARI霧化罐（PARI GmbH)呼出時，會使氣溶膠輸出降至最低。折流板係允許最適宜大小之粒子離開霧化罐。其結果是在可吸入範圍内之高百分比粒子，其會導致經改良之藥物傳輸至肺臟。此種霧化罐可針對特定病患個體群設計，譬如小於三歲之病患（PARI BABYTM)，及供較年長病患用之霧化罐（PARI LC 136383 -71 - 200938221 PLUS® 與 PARI LC STAR®) 〇可與本發明組合物一起使用之另一種霧化罐為e-Fl〇w®霧化罐（PARI GmbH)，其係使用振動薄膜技術，以使藥物溶液以及懸浮液或膠態分散液（TouchSprayTM ; ODEM (United Kingdom))氣溶膠化。e-Flow®霧化罐係能夠處理0.5毫升至5毫升之流體體積，且可產生以最短可能時間量所傳輸之具有極高密度之活性藥物、精確地界定之液滴大小及高比例之可呼吸液滴之氣溶膠。已使用e-Flow®霧化罐所傳輸之藥物包括阿姿瑞那（aztreonam)與利多卡因。關於e-Flow®霧化罐之其他細節係描述於US 6962151中，併入本文供參考。可與本發明組合物一起使用之其他霧化罐包括Microair® 電子霧化罐（Omron)與MysticT M霧化罐（Ventaira)❶Microair®霧化罐為極端地小，且係使用振動網片技術，以有效地傳輸溶液藥物。Microair裝置具有7毫升容量，且會產生約5微米之藥物粒子MMAD大小。關於Microair®霧化罐之其他細節，可 Q 參閱美國專利公報案號2004045547，併入本文供參考。 MysticTM霧化罐係使用強電場，以使液體破碎成幾乎單分散荷電粒子之喷霧。MysticTM系統包括圍堵單元、劑量計量系統、氣溶膠產生喷嘴及電壓轉換器，其係一起提供多劑量或單位劑量傳輸選項。MysticTM裝置係經呼吸啟動，且已與 Corns 1030TM(利多卡因HC1)、Resmycin® (多克索紅菌素鹽酸鹽）、Acuair (丙酸福路替卡松（fluticasone propionate))、NCE 與 ViroPharm及NCE與Pfizer—起被使用。關於化罐之其他細節可參閱美國專利6397838，併入本文供參考。 136383 -72- 200938221 關於肺傳輪本發明調配物之其他方法係提供於美國專利申凊案號12/217,972中，併入本文供參考。蛋白質之適當劑量（”治療上有效量”）係依例如欲被治療之症狀、症狀之嚴重性與期間、蛋白質是因預防或者治療的被投予 '先力療法、病患之臨床病歷及對蛋白質之回應、所使用蛋白質之類型及負責醫師之判斷而定。蛋白質係適田地次投予病患或歷經一系列治療，且可在從診斷〇起之任何時間下投予病患。蛋白質可以單獨治療或搭配可用於治療討論中症狀之其他藥物或療法一起投予。本發明調配物係克服經常與高濃度蛋白質有關聯之蛋白質聚集之常見問題，因此提供一種高含量治療蛋白質可藉其投予病患之新方式。本發明之高濃度調配物在服藥上係提供一項優點，其巾較高劑量可使用#於或低於標準治療之調配物之體積投予病患。關於治療蛋白質之標準治療係被描述於由蛋白質製造者所提供之標籤上。例如，根據由〇製造者所提供之標籤，因弗利西馬（infliximab)係藉由重配經凍乾蛋白質至濃度為1〇毫克/毫升而投予，用於治療風濕性關節炎。本發明之調配物可包含高濃度之因弗利西馬 (infliximab)，其中高濃度包括高於標準1〇毫克/毫升之濃度。在另一項實例中，根據由製造者所提供之標籤，Xolair (歐馬利祖馬（omalizmnab))係藉由重配經凍乾蛋白質至濃度為 125毫克/毫升而投予，用於治療氣喘。在此情況中，本發明之高濃度調配物包含大於標準125毫克/毫升之濃度之抗體歐馬利祖馬（omalizumab)。 136383 -73- 200938221 因此於一項具體實施例中，本發明之調配物包含高濃度，其係至少約1〇% ’至少約20%，至少約30% ’至少約40%，至八勺50%，至少約6〇%，至少約，至少约獅，至少約90%至j約1〇〇%，至少約⑽％，至少約，至少約 130% i》約14G%，至少約1篤，至少約ΐ75%，至少約 200%，至少約225%，i少約2篤，至少約，至少約 ❹ Ο ★ 至夕、力325%，至少約350%，至少約375%，至少約400% 等等大於已知標準調配物中之治療蛋白質濃度。於另$具體實施例中’本發明之調配物包含高濃度，其係至少約2倍大於’至少約3倍大於，至少約4倍大於，至少約5倍大於’至少約6倍大於，至少約7倍大於，至少約8七大於’至少約9倍大於’至少約10倍等等大於已知標準調配物中之治療蛋白質濃度。含水調配物之特徽可奴< # ή 行做了經改良，以供治療用途。例如，抗體調配物之黏度可經改良’其方式是使抗體蛋白質溶液接丈渗滤，使用未具有賦形劑之水作為渗濾媒f ^如上文段落Π中所述’賦形劑，譬如會改良黏度者，可被加回含水調配物中，以致賦形劑之最後濃度為已知，且調配物之特定特徵係經改良’以供所指定之用途。例如，熟諸此藐者將明瞭的是’所要之醫藥調配物黏度係視調配物正藉其傳輸之模式而定’例如注射、吸入、皮膚吸收等等。所要之黏度經常會平衡，病患在#受調配物時之舒以生，及為具有 =作用所需要之調配物中之蛋白質劑量。例如，關ς被注射調配物之一般可接受之黏度程度為點度程度低於約 136383 -74- 200938221 lOOmPas，較佳係低於75mPas，又更較佳係低於5〇她助。因此，含水調配物之黏度可為治#用途所接受，《可能需要添加賦形劑，以改良所要之特徵。於-項具體實施財’本發明係提供—種含水調配物，其包含水與人類TNM抗體或其抗原結合部份，其中調配物係不含賦形劑，其中調配物係具有使得其有利於作為治療劑使用之黏度，例如當蛋白質濃度為約175毫克/毫升時，〇在8°C下低於40cp，及在25°C下低於25CP之低黏度。於一項具體實施例中，抗體或其抗原結合部份在具有經改良黏度之調配物中之濃度為至少約50毫克/毫升。於一項具體實施例中，本發明之調配物係具有範圍為約i與約2灿狀間之黏度。非治療用途本發明之含水調配物亦可用於非治療用途，意即活體外目的。〇本文中所述之含水調配物可在醫藥與生物技術中用於診斷或實驗方法，包括但不限於使用於基因組、蛋白質組、生物資訊、細胞培養、植物生物學及細胞生物學。例如，本文中所述之含水調配物可用以提供在標識與偵測方法中作為分子探測物所需要之蛋白質。關於本文中所述調配物之另一種用途，係為對細胞培養試劑提供補充物，包括針對製造目的之細胞生長與蛋白質生產。本文中所述之含水調配物可被使用於具有減少關切之擬案中，關於調配物中之賦形劑如何可與實驗環境反應，例 136383 -75- 200938221 ”於擬案中之另一種試劑。在另—項實例中， =有南濃度蛋自質之含水調配物可作為針對實驗室用途之試劑使用。蛋白質之此種高度濃縮形式會擴大實驗之目前範圍。 |敏 ❹ ❹ 關於本發明調配物之另—種替代用途係、為對食品產物提供添加劑。由於本發明之含水調配物係基本上包含水與蛋白質，故調配物可用以傳輸高濃度之所要蛋白質’學養補充物，至食品項目。本發明之含水調配物係提供^ 又之蛋白質於水中，而無需顧慮安定性，溶解度所需要之賦形劑，其可能不適合人類消耗。例如，乳清與大豆衍生之蛋白質會對食品增添多變性，因為此等蛋白質脂肪口感與質地之能力。因此，乳清_與大豆_衍生之蛋白質可被添加至食品中，以降低整體脂肪含量，而不會犧牲滿足感。因此，包含適當量之乳清-與大豆-衍生蛋白質之含水調配物可經調配’及用以補充食品產物。製造物件 ;本發明之另-項具體實施例中，係提供—種製造物件’其含有本發明之含水調配物，聽供其制之說明書。製：物件包含容器。適當容器包括例如瓶子、小玻瓶(例如雙至小玻瓶)、注射器(譬如雙室注射器）、含有注射器之自動注射筆及試管。容器可製自多種材料，譬如玻璃、塑膠或聚碳酸6旨。容11係容納含水調配物，且在容n上或盥t 結合之標籤可顯示使用指示。例如，標籤可顯示調配物可用於或欲t、皮下投藥。容納此調配物之容器可為多次使用 136383 -76 - 200938221 之小玻瓶，其係允許含水調配物之重複投藥（例如26次投藥）。製造物件可進-步包含第二個容器。製造物件可進一步包含從商業與使用者觀點為所期望之其他物料，包㈣他缓衝劑、稀釋劑m頭、注射ϋ及具有使用說明書之包裝插圖。料、專利及已公告在整個本申請案中引用之所有參考資之專利申請案之内容均併於本文供參考

本發明係藉下述實例進一【實施方式】實例步說明，其不應被解釋為限制。下述實例係描述關於包含水作為溶液媒質之含水調配物之實驗々。應注意的是，在一些情況中，十進位置係使用歐 /州十進符號表示法表示。例如，在表31中，數目，，〇,296,，係與”0.296”同義。實例1使用阿達利母馬（Adalimumab)與鄕之渗 ❹ 物料與方法肺_ M _imumab)與聰❹純水滲濾。與純水之至W積交換後’將蛋白f溶液超過滤到至少15〇毫克/ 毫升之最後標的濃度。進行涞读夕透度、目視檢查及蛋白質濃度度量（OD280)，以在df/UF處理细叫& 处理期間監控蛋白質之狀態。尺寸排阻層析與離子交換層換層析法係用以特徵鑒定各最後 DF/UF產物中之蛋白質安定性，冬 ^ 虽與起始調配物比較時，例如藥物（DS)起始物質與蛋白皙玄白質h準物。藥物或” Ds” 一般係才曰在常用整體溶液中之治療蛋白質。 136383 -77- 200938221 阿達利母馬（Adalimumab)藥物（阿達利母馬消光係數 280毫微米：1.39毫升/毫克公分）。藥物未含有聚花楸酸酯80。DS組合物：5.57 mM單鹽基性磷酸鈉，8.69 mM二鹽基性鱗酸鈉，106.69 mM氯化納，1.07 mM檸檬酸鈉，6.45 mM檸檬酸，66.68 mM甘露醇。阿達利母馬溶液，用於動態光散射（DLS)度量：將使用純水作為交換媒質所滲濾之阿達利母馬溶液調整至1毫克/毫升濃度，其方式是將阿達利母馬溶液個 ❹ 別以Milli-Q水與賦形劑儲備溶液（已溶於Milli-Q水中之賦形劑）稀釋。 J695藥物（J695消光係數280毫微米：1.42毫升/毫克公分）。DS組合物：組胺酸，甲硫胺酸，甘露醇，pH 5.8 及聚花楸酸酯80。

Millipore LabscaleTM切線流動過濾（TFF)系統，裝有500 毫升儲器。Labscale TFF系統係在環境溫度下，根據 _ Millipore操作說明書，以不連續模式操作。攪拌器速度係被設定為約1.5，且泵送速度係被設定為大約 3。標的入口與出口壓力個別為15毫米psig、大約50 毫米psig。

MinimateTM切線流動過渡膠囊，裝有OmegaTMPES薄膜，30 kDa截止值。將膠囊以0.1N NaOH沖洗30分鐘，並以Milli-Q水歷經另外30分鐘。 780 pH計，Metrohm，裝有pH探測物PtlOOO，編號 6.0258Ό10，以緩衝劑校準溶液VWR校準，pH 4.00緩衝 136383 -78- 200938221 溶液紅色，目錄編號34170-127，及pH 7.00緩衝溶液黃色，目錄編號34170-130。

Varian 50 Bio UV可見分光光度計，AI 9655，其中經固定Cary 50細胞係用於蛋白質濃度度量（280毫微米波長）。將100微升蛋白質試樣以水（供HPLC用之Milli-Q 水）稀釋至最後體積為50.00毫升，供DF/UF後之所有 J695試樣與阿達利母馬溶液之蛋白質濃度度量。經由將40微升試樣溶液以1960微升Milli-Q水稀釋，監測所有其他阿達利母馬試樣之濃度。用後即棄之UV比色杯，1.5毫升，半微量分析，聚（甲基丙烯酸甲酯） (PMMA)，係用於濃度度量，Milli-Q水係作為OD 280 空白試驗使用。 HPLC級之Milli-Q水係作為DF/UF媒質使用。

Malvern Zetasizer Nano ZS，儀器編號 AI 9494，係用於 DLS 度量。

Hellma 精密元件，suprasil，型號 105.251-QS，光路徑 3 毫米，中心8.5，係用於DLS度量（充填75微升試樣， Malvern Mastersizer Nano ZS，項目編號 AI9494) 〇 _ Knauer自動渗透壓計，儀器編號83963 (Berlin, Germany)，係用於滲透度度量（以400毫滲透度/公斤NaCl校準溶液校準，物件編號 Y1241，Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany) ° 250毫升Coming細胞培養燒瓶，75平方公分，聚苯乙烯，無菌，Coming, NY，USA，係用於DF/UF操作後之 136383 -79- 200938221 蛋白質溶液儲存。氣化鈉：J.T. Baker係用於製備2M NaCl儲備溶液。儲備溶液係用以在純水中，以不同濃度之NaCl (10、20、 30及50 mM)製備1毫克/毫升阿達利母馬溶液。 D-花楸醇，Sigma化學公司，St. Louis，MO 63178，係用於製備200毫克/毫升花楸醇儲備溶液。儲備溶液係用以在純水中，以不同濃度之花楸醇（10、20、30及 40毫克/毫升）製備1毫克/毫升阿達利母馬溶液。 ❹ HPLC方法阿達利母馬（Adalimumab)，SEC分析：交聯葡聚糖 (Sephadex) 200 管柱（Pharmacia 目錄編號 175175-01，S/N 0504057)。流動相20 mM磷酸鈉，150 mM氯化鈉，pH 7.5，0.5毫升/分鐘流率，環境溫度，偵測UV 214毫微米與280毫微米。將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/ 毫升，注射試樣裝填量50微克（重複注射）。 ❹ 阿達利母馬（Adalimumab)，IEC 分析：Dionex，Propac WCX-10管柱（p/n 054993)，伴隨著相應之防護管柱（p/n 054994)。分離條件：流動相A : 10 mM磷酸鈉，pH 7.5 ; 流動相B 10 mM磷酸鈉，500 mM氯化鈉，pH 5.5。1.0毫升/分鐘流率，環境溫度。將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/毫升，注射試樣裝填量100微克，重複注射。

J695，SEC 分析：Tosoh Bioscience G3000swxl，7.8 毫米 X 30 公分，5微米（目錄編號08541)。流動相211 mM 136383 -80- 200938221

Na2S04/92 mM Na2HP04, pH 7.0。0.3 毫升 / 分鐘流率，環境溫度，偵測UV 214毫微米與280毫微米。將各試樣以Milli-Q水稀釋至2.5毫克/毫升，注射試樣裝填量50 微克（重複注射）。 J695，IEC 分析：Dionex，Propac WCX-10 管柱（p/n 054993)，伴隨著相應之防護管柱（p/n 054994)。分離條件：流動相 A : 10 mM Na2HP04，pH 6.0 ;流動相 B 10 mM Na2HP04， 500 mM NaCl, pH 6.0。1.0 毫升 / 分鐘流率，35°C 溫度。〇將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/毫升，注射試樣裝填量100微克。J695參考標準29001BF係以一式三份操作，作為比較，並以Milli-Q水稀釋至1毫克/毫升，以得自分析證明書之濃度為基礎。蛋白質濃度之計算計算式： / τ \ E = -lg[j v〇 ^ Ε -=€，c.d —> c =- J £Xd ε - 吸收係數 c - 濃度 d - 光線必須通過之比色杯長度 Ε - 吸光率 ι〇 - 最相光強度 I - 通過試樣後之光強度毫升 ε阿達利母馬 U9 (Adalimumab) 毫克乂公分 SJ695 = 1 ^ 毫升 4m 毫免乂公分 8HSA=L〇42ii^ 136383 -81 - 200938221 1·1 :阿達利母馬（Adalimumab)之DF/UF處理 DF/UF實驗係按照DF/UF設備製造者之標準操作程序進行。例如，Millipore LabscaleTMTFF系統係裝有5〇〇毫升儲器，且系統係於環境溫度下，根據Millipore操作說明書，以不連續模式操作。攪拌器速度係被設定為大約15，且泉送速度係被設定為大約3。標的入口與出口壓力個別為15毫米psig 與大約50毫米psig ’並監控標的壓力，以確保其未被超過。使用裝有〇megaTMPES 薄膜（Pall 公司，Port Washington, NY) 30 kDa MWCO之MinimateTM切線流動過濾膠囊。在使用之前，將膠囊以0.1 N NaOH沖洗30分鐘，並以Milli-Q水歷經另外30 分鐘。將大約500毫升阿達利母馬溶液置入TFF儲器中，且DF/UF 處理係以不連續模式開始。表1係提供關於表現DF/UF方法特徵之進行中控制（IPC)數據之細節。表1:關於阿達利母馬DF/UF處理之概論處理步驟所添加Milli-Q 水之體積(毫升） :在留存物中之阿達利母馬溶液之大約瀣積 (毫升) 留存物之阿達利母馬濃度 (毫克/毫升) 滲砗度 (毫滲透度/ 公斤) 滲透液之阿達利母馬濃度 (毫克/毫升) 1 500 54.66 305 - 2 400 68.33 297 3.15 3 300 - - 4 250 550 43.73 169 1,39 5 300 4.45 6 250 550 47.27 93 2.58 136383 -82 - 200938221 7 250 - - - 8 250 500 - - - 9 250 - - - 10 250 500 - - - 11 250 - - - 12 250 500 52.24 9 1.24 13 300 90.27 7.5 - 14 130 213.87 - 4.08 填上之區域表示在該步驟下未抽取IPC試樣。

DF/UF處理係於大約5-倍體積交換後停止（1次體積交換構成約250毫升滲濾媒質）。假定理想100%賦形劑薄膜滲透性，藉由所應用實驗參數達成之理論最後賦形劑濃度為 Q (250/500)5= 0.03125*Ci，其中Ci為起始濃度。因此，最高賦形劑降低為96.875% (若恒定體積滲濾已被使用，則使用5個滲濾體積之理論賦形劑降低係為0.00674，意即大約 99.3%最高賦形劑降低）。將阿達利母馬溶液自TFF系統排放至250毫升細胞培養燒瓶（TFF系統之低體積沖洗係使用WFI 進行，產生175.05毫克/毫升濃度；未沖洗之情況下，留存物濃度為213.87毫克/毫升）。抽取試樣，以供pH、滲透度及阿達利母馬濃度之測定。此外，抽取試樣，以藉由SEC與IEC 作特徵鑒定。於DF/UF處理前後之阿達利母馬溶液之特徵參數係個別列示於表2中。表2 : DF/UF處理對於阿達利母馬溶液之衝擊參數 DF/UF前之溶液 DF/UF後之溶液 PH 5.19 5.22 136383 -83- 200938221 濃度(毫克/毫升） 54.66 175.05 滲透度(毫滲透度/公斤） 305 24 *SEC數據(％聚集體， 0.26 00.50 單體， 99.74 99.50 片段） 0.00 0.00 *正C數據(酸性區域 13.89 14.07 lysO， 62.05 61.97 lys 1， 19.14 18.51 lys 2, %) 4.83 4.73 *在經由SEC與IEC分析之前，使試樣接受一個冷凍/解凍步驟(-80°C/25°C)

在DF/UF處理之過程中，阿達利母馬濃度係超過210毫克/ 毫升。在整個實驗中，蛋白質溶液仍然保持透明，且未發現溶液混濁或蛋白質沉澱作用，其係表示阿達利母馬溶解度限制。與最初阿達利母馬DS溶液（〜55毫克/毫升）比較.，利用純水作為DF/UF交換媒質所滲濾之阿達利母馬溶液係顯現出較低乳白色，儘管在蛋白質濃度上超過3-倍增加 (~175毫克/毫升）。 ® 1.2:經由層析之阿達利母馬特徵鑒定圖1顯示阿達利母馬參考標準物之SEC層析圖（阿達利母馬標準物（底線)），與DF/UF處理程序之前（中線）及之後（頂線）之阿達利母馬藥物標準溶液比較。應注意的是，在分析之前，將所有試樣於-80°C下冷凍。表3亦含有IEC層析圖數據（注意在分析之前，將所有試樣於-80°C下冷凍）。 136383 -84- 200938221 表3 :各種阿達利母馬試樣之IEC數據試樣名稱 %酸性區域1 %酸性區域2 % 0 Lys % 1 Lys % 2 Lys 參考標準物 2.69 11.66 60.77 19.42 5.40 阿達利母馬DS 2.51 11.38 62.05 19.14 4.83 阿達利母馬，於DF/UF之後 2.26 11.81 61.97 18.51 4.73 1.3 :賦形劑對於阿達利母馬流體動力學直徑（Dh)之衝擊先前已測定出當將J695調配至純水中時，J695之流體動力〇學直徑會顯著地降低，當藉動態光散射（DLS)度量測定時。在WFI中之J695具有Dh為〜3毫微米，遠低於對免疫球蛋白所預期之數值。在添加低量之可離子化NaCl時，Dh值會增加至~10毫微米（與NaCl濃度無關）。添加不可離子化之甘露醇會增加J695溶液滲透度，但對J695 Dh無作用。為評估賦形劑對於已根據上述DF/UF程序被處理之阿達利母馬流體動力學直徑之衝擊，係使用得自DF/UF實驗之阿達利母馬溶液，以將阿達利母馬溶液調配於純水中，但個 © 別使用不同含量之NaCl (0-50 mM)與花楸醇（0-40毫克/毫升）。花楸醇（不可離子化之賦形劑）與NaCl (可離子化之賦形劑）濃度對於阿達利母馬單體之Dh之衝擊係顯示於圖2中。在純水中之阿達利母馬單體之流體動力學直徑為2.65毫微米。對鹽與非離子性賦形劑之阿達利母馬Dh回應係與先前所觀察之J695回應相同。阿達利母馬Dh實質上並不受花楸醇之存在所衝擊。低濃度之NaCl會引致單體流體動力學直徑增加至~11毫微米之預期含量。此等發現証實當藉由動 136383 -85- 200938221 態光散射度量時’蛋白質流體動力學直徑係決定性地受可離子化賦形劑之存在所衝擊。可離子化賦形劑之不存在亦被連結至溶液黏度。此等發現具有關於高濃縮蛋白質溶液之關聯性：流體動力學直徑愈低，蛋白質佔據之空間體積愈低。在高濃度情節中，利用水作為DF/UF交換媒質所製成蛋白質溶液之黏度係貫質上低於含有相當大量可離子化緩衝劑賦形劑之傳統蛋白質調配物之黏度。阿達利母馬數據係確認此情況，因發現在注射用水中之200毫克/毫升阿達利母馬溶液之黏度係遠低於50 mPas，與pH (例如PH 4、pH 5及pH 6)無關。關於 pH對於Dh作用之更多數據可參閱下文實例17。整體而言’此等發現可用於高濃度蛋白質調配物活性中，其中黏度相關之製造與服藥/傳輸問題係為習知。再者，此等發現顯示最後藥物產物之渗透度值可以不可離子化之賦形劑調整，譬如糖類或糖醇類，按需要而定，而不會個別地引致蛋白質Dh與溶液黏度上之增加。 1.4: J695(抗-IL12 抗體）之 DF/UF 處理將大約200毫升J695溶液以1 Μ磷酸調整至PH 4.4，並填入 TFF儲器中（施行pH值調整以確保J695單體之正：_電位，且因此避免未荷電蛋白質單體對於數據之可能衝擊）。然後，將300毫升Milli-Q水添加至TFF儲器中，且DF/UF處理係以不連續模式開始。於250毫升儲器體積中添加250毫升水’並再一次開始DF/UF處理。DF/UF處理係於進行總共5 個體積交換步驟之後停止（1次體積交換構成約250毫升）。 136383 -86- 200938221 假定理想100%賦形劑薄膜滲透性，藉由所應用實驗參數達成之理論最後賦形劑濃度為α (250/500)5 = 0.03125*Ci，其中Ci為起始濃度。因此，最高賦形劑降低為96.875% (若恒定體積滲濾已被使用，則使用5個滲濾體積之理論賦形劑降低為Ci e-5 = 0.00674，意即約99.3%最高賦形劑降低）。將J695溶液自TFF系統排放至250毫升細胞培養燒瓶（未進行TFF系統之沖洗）。抽取試樣，以供pH、滲透度及J695濃度之測定。此外，抽取試樣，以藉由SEC與IEC作特徵鑒定。於DF/UF 處理前後之J695溶液之特徵參數係個別列示於表4中。表4 : DF/UF處理對於：[695溶液之衝擊參數在DF/UF前之溶液在DF/UF後之溶液 PH 4.40 4.70 濃度(毫克/毫升） 122.9 192.8 滲透度(毫滲透度/公斤） 265 40 SEC數據(％聚集體， 0.41 0.69 單體， 98.42 98.11 片段） 1.18 1.21 IEC數據(異構重組物， 92.00 92.11 酸性物種， 5.17 5.30 鹼性物種之總和，％) 2.83 2.59 與阿達利母馬一樣，在J695上之DF/UF實驗証實在DF/UF 操作中，利用純水作為交換媒質處理與調配J695之主要可能性。當在環境溫度下，使用Milli-Q水作為滲濾媒質，DF/UF 處理，歷經整個1.5天之期間時（程序中斷過夜），SEC與IEC 數據兩者均指出對於J695安定性無實質上衝擊。在整個實 136383 •87- 200938221 驗中，蛋白質溶液仍然保持透明，表示無潛在之J695溶解度限制。 1.5: J695特徵鑒定表5係描述當藉SEC層析圖測定時，關於三種溶液之聚集體、單體及片段含量之百分比。表5 :得自SEC層析圖之數據試樣名稱 %聚集體含量 %單體含量 %片段含量參考標準物 0.45 98.00 1.56 DF/UF 前之 J695 0.41 98.42 1.18 DF/UF 後之 J695 0.69 98.11 1.21 圖3顯示J695參考標準物（下圖）與J695 DS (pH經調整至pH 4.4)(上圖）之IEC分佈形態。在DF/UF處理後之J695試樣中，僅發現聚集體含量上之小增加。圖4顯示使用Milli-Q水之DF/UF後之J695 (pH 4.7)(上圖），與 DF/UF前之J695 DS (pH經調整至pH 4.4)(底部曲線）之IEC分佈形態。如圖4中所描繪，當藉由IEC監測時，DF/UF步驟對於J695安定性無顯著衝擊。在兩種J695參考標準物間之差異 (參考圖3)可歸因於3000升與6000升DS活動間之製程上之差異。表6係醒目顯示關於IEC數據之更多細節。表6 :各種J695試樣之IEC數據試樣名稱 Oglu⑴ 其他異構重組物酸性鹼性參考標準物 43.57 50.06 4.47 1.90 J695 35.74 56.26 5.17 2.83 DF/UF 後之 J695 36.59 55.52 5.30 2.59 136383 -88- 200938221 1.6 :結論上文實例係提供滲濾/超過濾（DF/UF)實驗，其中水（供 HPLC用之Milli-Q水）係作為單株抗體阿達利母馬（Adalimumab) 與J695之滲濾媒質使用。使阿達利母馬接受DF/UF處理，利用純水作為DF/UF交換媒質，並在pH 5.2下，於高濃度（>200毫克/毫升）下調配，而不會引致溶液混濁、嚴重乳白色或混濁度形成。於一個後續冷凍/解凍步驟後，SEC與IEC數據指出在經由DF/UF處理而被調配於水中之阿達利母馬溶液與最初阿達利母馬DS 之間並無顯著差異。亦使J695接受DF/UF處理，利用純水作為DF/UF交換媒質，並在pH 4.7下調配，而不會衝擊J695安定性（目視檢查， SEC，IEC)。當使用此種DF/UF處理調配時，阿達利母馬單體之流體動力學直徑（Dh)為約2.65毫微米。非離子性賦形劑譬如花楸醇 ^ 以至高40毫克/毫升濃度之存在，係顯示對於Dh數據未具有衝擊，然而已經呈低濃度之離子性賦形劑譬如NaCl係証實會引致阿達利母馬單體Dh增加至約11毫微米（此種Dh數據一般係針對IgG作監測）。早期關於J695有類似發現。總而言之，使用純水作為DF/UF交換媒質處理與調配蛋白質係為可行。假定理想100%賦形劑薄膜滲透性，藉由恒定體積滲濾，以5個滲濾體積達成之理論最後賦形劑濃度為 Ci e-5 = 0.00674，意即約99.3%最高賦形劑降低。使用6次滲濾體積交換，會造成理論〜99.98%最高賦形劑降低。 136383 -89- 200938221 實例2至5係描述關於被濃縮至含水調配物中之三種不同蛋白質之實驗實施例，而實例6至11係描述各含水調配物之分析。關於實例2-U之物料與方法在注射用水中之阿達利母馬（Adalimumab)蛋白質溶液 (10毫克/毫升），蛋白質藥物（DS)物質（49.68毫克/毫升），DS含有Tween 80、阿達利母馬、阿達利母馬藥物產物（DP) (40毫克，注射用溶液，得自商業化生產之經過濾溶液）。蛋白質吸收係數280毫微米：1.39。在注射用水中之J695蛋白質溶液（10毫克/毫升），蛋白質藥物（DS) (54毫克/毫升），DS含有Tween 80。吸收係數280毫微米：1.42 在注射用水中之HSA蛋白質溶液（10毫克/毫升），未具有Tween 80之DP，Grifols人類血清白蛋白Grifols®， 20%，50毫升。吸收係數280毫微米：1.042 _ 6R小玻瓶與10R小玻瓶小玻瓶製備：將小玻瓶洗滌，並熱壓處理塞子，19毫米，West，4110/40/灰色試樣容器（例如Eppendorf試樣容器，安全鎖或簡易按扣接合，1-2毫升） _ 單次使用注射器，無菌20毫升；NormJect，10毫升單次使用濾器單元（濾器Millex®-GV，注射器驅動濾器單元，PVDF0.22微米；Millex®-GP，注射器驅動濾器單元，PES 0.22微米，Sterivex® 0.22微米濾器單元） 136383 -90- 200938221

Vivaspin 濃縮器（截止值 10 kDa，PES;截止值 3 kDa，PES) 吸量管（例如Eppendorf，最大：1000微升）注射用水離心機（Eppendorf)及離心機編號1 (經溫度控制）渗濾、設備：Millipore LabscaleTMTFF 系統，Millipore 渗遽薄膜：阿達利母馬（Adalimumab):聚醚楓；J695 :聚醚颯；HSA:再生纖維素 pH探測物（Metrohm pH計，蛋白質適當探測物，biotrode 46) 層狀空氣流動工作台，Steag LF-Werkbank，Mp.-編號12,5 NaCl ;甘露醇 Gemini 150 Peltier 板流變計，Malvern 流變計MCR 301 [溫度控制之P-PTD 200 (具有 Peltiertempering之板）]與圓錐體/板度量系統CP50/0.5。Ti ，以及 CP50/。（不錄鋼）；Anton Paar 毛細管黏度計，Schott，毛細管：類型537 20，類型537 10，類型 537 13 1 Μ 鹽酸(J.T. Baker) ❹ 分析

UV/VIS分光光度測定法(OD 280毫微米）；光子相關光譜學（PCS):對大約10毫克/毫升與大約20毫克/毫升： 1.1 mPas，3次操作，30秒，一次度量，25。。，從大約 30毫克/毫升及以上：1.9mPas，30秒，3次操作，一次度量，25°C 136383 -91 - 200938221 尺寸排阻層析（SEC)與離子交換層析法（IEC)，如下文所述。 _ 黏度度量：使用具有個別與不同設定之不同黏度計蛋白質濃度之計算

(Adalimumab) ej695 — 1 ·42 計算式： E = -\g M , E — £'C'd c =- εχά 8 - 吸收係數 C - 濃度 d - 光線必須通過之比色杯長度 E - 吸光率 ι〇 - 最相光強度 I - 通過試樣後之光強度 1.39 毫升老尤x公分毫升 bhsa= 1.042 毫升毫克乂公分關於阿達利母馬之黏度數據與計算〇阿達利母馬市售調配物（大約194毫克/毫升）密度： p = 1,05475—^— 立才么、分阿達利母馬市售調配物（大約194毫克/毫升）動黏度： K -毛細管之常數 t -溶液通過毛細管所必須之時間[s] >動黏度 ν = /：χ/ = 0,03159 手才2老$ X279,36·? = 8,825 平方主也

S S 136383 -92- 200938221 阿達利母馬市售調配物（大約194毫克/毫升）動態黏度： 7?-動態黏度 P-密度 η = νχρ = 8,825 #才衫 χ 1,05475 —— = 9,30SmPas s 立才公分 -- 關於人類血清白蛋白之黏度數據與計算 HSA市售調配物（大約200毫克/毫升）密度： p = 1,05833 —^— ❹ 立才公分 HSA市售調配物（大約200毫克/毫升）動黏度： K -毛細管之常數 t -溶液通過毛細管所必須之時間[s] 動黏度 v = Kxt = 0,01024x337,69^ = 3,46-贫考， s s HSA市售調配物（大約200毫克/毫升）動態黏度： ® 動態黏度 /〇密度 77 = νχρ = 3,46上《米 X 1,05833 —^—= 3,662mPas s 卫才公分 - 在WFI中之HSA (大約180毫克/毫升）密度： p = 1,07905—^― 卜立才公分在WFI中之HSA (大約180毫克/毫升）動黏度： K -毛細管之常數 136383 -93- 200938221 t -溶液通過毛細管所必須之時間[s] >動黏度 V = Λ： X ί = 0,09573-^^ X185,3^ = Y]：J2±~方毫米 s _s 在WH中之HSA(大約180毫克/毫升）動態黏度： t動態黏度密度 0 77 = V X /> = Y]J2^毫米 X 1,07905 —^—=\9,\2\mPas 这 J5：才公分 - 關於達到高濃度調配物之一般實驗實施例一般而s ’關於達到高濃度、不含鹽之蛋白質調配物之本發明方法’係包括最初藥物物質之滲濾，接著為增加藥物在溶液中濃度之程序。這可以個別程序達成，或可在相同程序内以個別或一致步驟達成。渗濾、 ^ 使足量之藥物（DS)物質（依DS之蛋白質濃度而定）接受滲濾。在滲濾之前，將DS物質以注射用水稀釋〜1()毫克/毫升。應注意的是’對於實驗係需要總計大約54〇毫升之1〇毫克/ 毫升溶液。注射用水係作為滲濾媒質使用。所進行之渗濾步驟數目為5至7 ( —次滲濾步驟等於一次總體積交換）。在滲濾之前與滲慮步驟之後抽取進行中控制（PC)試樣（對於滲透度為 200微升，對於SEC為120微升）。使用TFF設備之滲濾係藉由應用下列參數進行： 136383 94· 200938221 - 攪拌器：位置2 - 系：位置2 -壓力上游/入口：最大20-30 psi -塵力下游/出口：最大1〇 psi (於此實驗中所使用之參數係導自於製造者之建議。孰諸此藝者係能夠變更設備操作之參數，以順應特定蛋白質或在設備、調配物、黏度及其他變數上之變異）。〇在滲濾之後，蛋白質濃度係利用OD280評估。若蛋白質濃度為>10毫克/毫升’則將蛋白質濃度藉由以注射用水適當地稀釋該溶液而調整至10毫克/毫升。濃縮將20毫升經滲濾之蛋白質溶液（例如阿達利母馬、兄95、 HSA)放入VivaSpin20濃縮器中。將濃縮器閉合，並放入離心機中。使蛋白負溶液在最高速度（5000 !pm)下離心。試樣抽取 ❾ 經濃縮溶液之試樣係在以下抽取：10毫克/毫升，然後每 10毫克/毫升（20、30、40毫克/毫升等），或直到蛋白質可見及地聚集’且試樣係按下述分析： - 使蛋白質溶液在Vivaspin濃縮器中均化，並充填於適當小玻瓶中。 - 光學外觀係在小玻瓶中直接檢查。 -300微升係用於uv光譜學，16〇微升用於PCS，120微升用於SEC，及300微升用於IEX。 - 將SEC與IEX之試樣儲存於-80°C下。 136383 •95- 200938221 動態光散射(DLS)擬案進行動態光散射，使用裝有Hellma精密元件（Plainview, NY) 之 Zetasizer Nano ZS (Malvern 儀器，Southborough，ΜΑ)，suprasil 石英，類型105.251-QS，光路徑3毫米，中心Z8.5毫米，使用至少60微升試樣充填，以本身使用蛋白質試樣，並直接地放置在度量元件中。在度量之前，檢查元件窗口，以確認溶液不含可能衝擊DLS度量之氣泡或粒子/灰塵/其他污染物。度量值係在標準操作程序下取得一般目的"模式，25°C，折射率設定為1.45，度量模式設定為”手動”，每度量1次操作，各包括各30秒之3次度量，度量之類型設定為”大小”）。使用分散液技術軟體，4.10bl版，Malvern儀器，以分析數據。將約70微升試樣溶液充填在精密元件中，供流體動力學直徑（Dh)之分析。預設試樣黏度對於低濃縮蛋白質溶液（例如 <5毫克/毫升）係被設定為1.1 mPas。從屬度量原理之結論是在欲被度量試樣溶液之實際黏度值與預設黏度之使用間之最小差異，不會實質上衝擊DLS數據示值讀數。此係藉由進行低蛋白質濃度溶液（<5毫克/毫升）之DLS度量而被確認，其中係測得溶液黏度，且納入後續DLS度量中之考量。對於具有較高蛋白質濃度之所有試樣，在DLS度量期間係測得黏度，且納入考量。實例2:包含高TNFa抗體濃度之調配物 2.1 ·渗滤在滲濾之前，將阿達利母馬（49.68毫克/毫升）以注射用水稀釋至大約15毫克/毫升之濃度。因此，將140.8毫升阿達利 136383 -96- 200938221 母馬溶液(49.68毫克/毫升）充填在5〇〇毫升量瓶中。將燒瓶以注射用水充填達到校準記號.將量瓶閉合，並溫和振盪，以供溶液之均化。將TFF實驗室規模系統以水沖洗。然後，修改薄膜（PES)，並亦以丄升蒸餾水沖洗。接著，將實驗至規模系統與薄膜以大約3〇〇毫升注射用水沖洗。然後，將經稀釋之阿達利母馬溶液充填在TFF之儲器中。抽取供滲透度度置（300微升）、uv分光光度測定法（5〇〇微升）之試樣， Q 及供SEC分析之試樣（12〇微升）。將系統閉合，並開始滲濾。 DF/UF (滲濾/超過濾）係在$次體積交換之後，及在達到滲透度值為3毫滲透度/公斤之後完成。滲濾後之阿達利母馬溶液之pH-值為pH 5.25。使用TFF設備之滲濾係藉由應用下列參數進行： - 攪拌器：位置2 ' 泵：位置2 - 壓力上游/入口：最大20-30 psi ❹ -壓力下游/出口：最大1〇 psi 在滲濾之後’蛋白質濃度係利用OD28〇評估。測得濃度為 13.29毫克/毫升。將ft達利母馬溶液殺菌過滤。將TFF與薄臈以大約1升蒸餾水，然後以5〇〇毫升〇 m Na0H沖洗。將薄膜儲存於0.1M NaOH中，將TFF以大約500 晕升蒸德水再一次沖洗。 2·2:蛋白質濃縮在濃縮抗體之前’蛋白質濃度係利用OD280再一次評估。 136383 -97- 200938221 測得阿達利母馬濃度為13.3毫克/毫升。然後，將阿達利母馬溶液稀釋至10毫克/毫升。將375.94毫升阿達利母馬溶液 (13.3毫克/毫升）充填在5〇〇毫升量瓶中，並將燒瓶以注射用水(WFI)充填達到校準記號。亦將75.19毫升阿達利母馬溶液 (13.3毫克/毫升）充填在100毫升量瓶中，並以純水，意即注射用水(WFI)，充填達到校準記號。使兩個燒瓶溫和振盈，以供均化。將得自兩個燒瓶之溶液放置在1升PETG瓶中。使瓶子溫和振盪，以供均化。 ❹ 使用四個Vivaspin 20濃縮器（10 kDa)。在三個vivaspins中，充填20毫升阿達利母馬溶液（10毫克/毫升）（於各個中）。在第四個Vivaspin裝置中，充填水，作為當離心時之平衡重量。將濃縮器閉合，並放入離心機中。使阿達利母馬溶液離心，施加4500x克離心分離力（在向外擺動旋轉機中）。 2.3:試樣抽取抽取經濃縮阿達利母馬溶液之試樣，當其達到濃度為1〇〇毫克/毫升時，及在各後續10毫克/毫升濃度增量增加下（在 20毫克/毫升，30毫克/毫升，40毫克/毫升等下，直到大約 200毫克/毫升為止）。於40分鐘間隔下，將濃縮器取出離心機，使溶液均化，並使溶液與離心機接頭在冰上冷卻大約 10分鐘。於各1〇毫克/毫升濃縮增量後，使濃縮器中之溶液均化，檢查光學外觀，並抽取試樣，以經由Uv (3〇〇微升）、 PCS(160微升）、SEC(12〇微升）及IEC(3〇〇微升）分析。於試樣抽取後，將濃縮器以阿達利母馬溶液（1〇毫克/毫升）充填至高達大約20毫升。蛋白質沉澱作用之目視檢查與PCS分析 136383 -98- 200938221 係用以測定阿達利母馬蛋白質（意即異構重組物）在溶液中之溶解度極限。在大約80毫克/毫升之濃度下，變得顯而易見的是阿達利母馬溶液不再為乳白色，乳白色為具有高量片段之阿達利母馬溶液之已知特徵。因此，懷疑斷裂或許已在實驗實施期間發生。關於進一步分析，阿達利母馬溶液（大約8〇毫克 /毫升）之试樣係藉由SEC分析。將各Vivaspin中之溶液之其餘部份’以及阿達利母馬溶液（1〇毫克/毫升）之其餘部份移除至50毫升falcon管件，並儲存於_8(rc下。SEC分析顯示純度為99.6%單體。使溶液於25°C下，在水浴中解凍，並殺菌過濾。然後，將得自3個falcon管件之溶液放置在各Vivaspinf。將濃縮器充填至大約20毫升，並持續濃縮。當達到大約2〇〇毫克/毫升之濃度時，實驗係完成。將所有SEC與IEC試樣儲存於_8〇°c下，直到進一步分析為止。UV與PCS係在試樣抽取後直接度量。將經濃縮之阿達淨J母馬/谷液之其餘部份放置在Eppend〇rf容器中，並儲存於 -80°C 下。下文所不之表7係描述欲被再充填至濃縮器中而同時使阿達利母馬溶液濃縮之蛋白質溶液體積之計算。此綱要係在實驗實靶之前計算，以界定必須被抽取試樣之體積。離心分離之延續時間係示於表8中。 136383 -99- 200938221

表7 :離心分離綱要步驟體積丨毫升J 濃度 [毫克/毫升] 體積 10毫克/毫升蛋白質溶液 0 20 10 濃縮 1 10 20 取樣 2 9 20 充填 3 20 14.5 11 濃縮 4 9.66 30 取樣 5 8.66 30 充填 6 20 18.66 11.34 濃縮 7 9.33 40 取樣 8 8.33 40 充填 9 20 22.49 11.67 濃縮 10 8.99 50 取樣 11 7.99 50 充填 12 20 25.98 12.01 濃縮 13 8.66 60 取樣 14 7.66 60 充填 15 20 29.15 12.34 濃縮 16 8.32 70 取樣 17 7.32 70 充填 18 20 31.96 12.68 濃縮 19 7.99 80 取樣 20 6.99 80 充填 21 20 34.46 13.01 濃縮 22 7.65 90 取樣 23 6.65 90 充填 24 20 36.6 13.35 濃縮 25 7.32 100 取樣 26 6.32 100 充填 27 20 38.44 13.68 濃縮 28 6.98 110 取樣 29 5.98 110 充填 30 20 39.9 14.02 濃縮 31 6.65 120 136383 -100- 200938221 取樣 32 5.65 120 充填 33 20 41.07 14.35 濃縮 34 6.31 130 取樣 35 5.31 130 充填 36 20 41.86 14.69 >農縮 37 5.98 140 取樣 38 4.98 140 濃縮 39 4.64 150 154.14 174.14 表8 :使阿達利母馬溶液濃縮所需濃度[從->至][毫克/毫升] 時間[分鐘] 10 至 20 15 20 至 30 20 30 至 40 27 40 至 50 30 50 至 60 40 60 至 70 50 70 至 80 60 80 至 90 67 90 至 100 80 100至110 100 110 至 200 206 表8 :使阿達利母馬溶液濃縮所需要之離心分離時間 ❹ 濃度[從->至][毫克/毫升] 時間[分鐘] 110 至 200 206 得自阿達利母馬濃縮之結果亦示於下表12中。 2.4:黏度度量包含無論是在WFI中之50毫克/毫升或在WFI中之200毫克/毫升之阿達利母馬溶液係經度量關於黏度。在WFI中之 50毫克/毫升與200毫克/毫升係使用Gemini 150 Peltier板流變計，Malvern度量，而在WFI溶液中之200毫克/毫升亦經由流變計MCR 301 [溫度控制之P-PTD 200 (具有Peltier回火之板）] 136383 -101 - 200938221 與錐/板度量系統CP50/1(不銹鋼）；如她以的度量。使容器管件中之阿達利母馬溶液(200毫克/毫升）解康，並在6R小玻瓶中均化。將升阿達利母馬（2〇〇毫克/井:'、’ 3毫升WFI稀釋，以獲得經稀釋之溶對於5 、達利母馬溶液）。毫升阿

而對於MCR 對於流變計Gemini 150，係需要大約2毫升 3〇1 ’係需要小於1毫升以供度量。 ❹ 在市售調配物中之阿達利母馬（大約194毫克/亳升）係利用V—in管件獲得。將#件以市售緩衝财之阿達利母馬溶液充填，並施加冑心分離，直到達成㈣克/毫升濃度為止。黏度係以毛細管黏度計Sch〇tt度量。 '又 2·5 ·摘述總而言之，使阿達利母馬在Vivaspin20管件中，於四個不同管件中從50毫克/毫升濃縮至大約194毫克/毫升。在開始時，20毫升阿達利母馬溶液(5〇毫克/毫升）係在每個管件 Ο (四個管件）中。在濃縮結束時，5毫升阿達利母馬溶液（大約194毫克/氅升）係在每個管件中。濃縮步驟係在5〇〇〇 (大約4500克）下進行。於每小時後，使Vivaspin管件中之長圓形燒杯與蛋白質溶液，在碎冰中冷卻大約1〇至15分鐘。密度係以密度度量裝置DMA4500，Ant〇nPaar度量。高阿達利母馬濃度調配物之進一步分析係被提供於實例5至u中。實例3 :包含高濃度ιι_ 12抗鱧之調配物 3·1:滲濾在滲濾之前’將IL-12抗體J695 (54毫克/毫升）以注射用水 136383 -102- 200938221 稀釋至大約15毫克/毫升之濃度。此係藉由將150毫升J695 溶液（54毫克/毫升）放置在500毫升量瓶中，並將燒瓶以注射用水充填至校準記號而達成。將量瓶閉合，並溫和振遷，以供溶液之均化。將TFF實驗室規模系統以水沖洗。接著，修改聚醚砜薄膜（PES)，並亦以1升蒸餾水沖洗。然後，將 TFF實驗室規模系統與薄膜以大約3〇〇毫升注射用水沖洗。接著，將經稀釋之J695溶液放置在TFF之儲器中。抽取供滲〇透度度量（300微升）、uv分光光度測定法（500微升）之試樣’ 及供SEC分析之試樣（120微升）。將系統閉合，並開始滲濾。在處理DF體積200毫升之後，停止滲濾，並抽取供uv度量之另一份試樣。在18〇〇毫升滲濾體積（大約為因數3 5體積交換）達到滲透度值為4毫滲透度/公斤之後，停止df/up。滲濾後之J695溶液之pH_值為pH 6 48。使用TFF設備之滲濾係藉由應用下列參數進行： • 攪拌器：位置2 q 泵：位置2 -壓力上游/入口：最大20-30 psi -壓力下游/出口：最大i〇psi 在滲遽之後，蛋白質;農度係利用OD280評估。測得濃度為 16.63毫克/毫升。將J695溶液殺菌過遽。

將㈣儀器與薄膜以大約1升蒸館水，然後以500毫升0.1M Ν&〇Η沖洗。將薄膜館存於〇. 1M NaOH中，並將TFF以大約5〇〇毫升蒸餾水再一次沖洗。 136383 200938221 3.2 :濃縮在濃縮之前，將J695溶液稀釋至10毫克/毫升：將316毫升 J695溶液（16.63毫克/毫升）放置在500毫升量瓶中，並將燒瓶以注射用水（WFI)充填至校準記號。此外，將64毫升J695溶液（16.63毫升）放置在100毫升量瓶中，並以WFI充填至校準記號。使兩個燒瓶溫和振盪，以供均化。將得自兩個燒瓶之溶液放置在1升PETG瓶中。使瓶子溫和振盪，以供均化。使用四個Vivaspin 20濃縮器（10 kDa截止值）。將20毫升J695 溶液（10毫克/毫升）放置在三個Vivaspins之每一個中。在第四個Vivaspin濃縮器裝置中，充填水，作為當離心時之平衡重量。將濃縮器閉合，並放入離心機中。使J695溶液離心，施加4500 X克離心分離力（在向外擺動旋轉機中）。 3.3 :試樣抽取抽取經濃縮J695溶液之試樣，當其達到濃度為10毫克/毫升時，及在各後續10毫克/毫升濃度增量增加下（在20毫克/ 毫升，30毫克/毫升，40毫克/毫升等下，直到200毫克/毫升為止）。於每40分鐘後，將濃縮器取出離心機，使溶液均化，並使溶液與離心機接頭在冰上冷卻大約10分it。於每 10毫克/毫升濃度增加後，使濃縮器中之溶液均化，檢查光學外觀，並抽取試樣，以供UV (300微升）、PCS (160微升）、 SEC (120微升）及IEC (300微升）分析。於試樣抽取之後，將濃縮器以J695溶液（10毫克/毫升）充填至高達大約20毫升。目視檢查與PCS分析係用以測定J695之溶解度（意即檢查可能之沉澱作用）與安定性。 136383 -104- 200938221 在實驗結束時，達到大約200毫克/毫升之濃度。將所有SEC與IEC試樣儲存於-80°C下，供進一步分析（參閱下文）。UV分光光度測定法與PCS度量值係於各試樣抽取後直接取得。將經濃縮J695溶液之其餘部份放置在Eppendorf 容器中，並儲存於-80°C下。關於離心分離綱要之細節係提供於上表7中。J695離心分離之延續時間係提供於表9中。表9 :用以使J695溶液濃縮之離心分離時間濃度[從->至几毫克/毫升] 時間[分鐘] 10 至 20 13 20 至 30 22 30 至 40 27 40 至 50 38 50 至 60 45 60 至 70 80 70 至 80 90 80 至 90 105 90 至 100 165 100至200 270 3.4:賦形劑對於J695之流體動力學直徑之衝擊在此實驗中，氯化鈉與甘露醇個別地對於J695之流體動力學直徑之衝擊係經分析。對此項目的而言，係製備氯化鈉（12毫克/毫升）與甘露醇（120毫克/毫升）之儲備溶液。將 1.2克NaCl在燒杯中稱量，將其以大約70毫升WFI充填，並將12.002克甘露醇在燒杯中稱量，將其以大約70毫升WFI充填。將兩種溶液攪拌，以供均化。將各溶液放置在量瓶中， 136383 -105- 200938221 將其以WFI充填至校準記號。使燒瓶溫和振盪，以供均化。使大約8毫升J695溶液（大約200毫克/毫升）在37°C下解凍。將溶液充填於10R小玻瓶中，並均化。將七個2R小玻瓶各以500微升J695溶液（大約200毫克/毫升）充填。充填綱要係描述於下表10中。表10:關於製備含有不同濃度NaCl或甘露醇之J695溶液之充填綱要賦形劑濃度賦形劑體積 ABT-874 (200毫克/毫升） [微升] 體積NaCl 儲備溶液 (12毫克/毫升） [微升] 體積甘露醇儲備溶液 (12毫克/毫升） [微升] 體積WFI [微升] - - 500 - - 500 NaCl 2毫克/毫升 500 167 - 333 NaCl 4毫克/毫升 500 333 - 167 NaCl 6毫克/毫升 500 500 - - 甘露醇 20毫克/毫升 500 - 167 333 甘露醇 40毫克/毫升 500 - 333 167 甘露醇 60毫克/毫升 500 - 500 - 使2R小玻瓶經由振盪溫和地均化。然後，取得不同J695 溶液（100毫克/毫升）之PCS與滲透度度量值。' 為製備PCS分析之試樣，首先將比色杯以50微升試樣沖洗。接著，度量值係使用100微升試樣取得。高J695濃度調配物之進一步分析係提供於實例5至11中。實例4 :高濃度人類血清白.蛋白（HSA)調配物 4.1:滲濾在滲濾之前，將HSA溶液（200毫克/毫升，市售調配物）以注射用水稀釋至15.29毫克/毫升之濃度。為達成此情況， 136383 -106- 200938221 係將38毫升HSA (200毫克/毫升）充填在500毫升量瓶中。將燒瓶以注射用水充填至校準記號。將量瓶閉合，並溫和振盪，以供溶液之均化。將TFF實驗室規模系統以水沖洗。接著’修改薄膜（再生纖維素），且亦以1升蒸餾水沖洗。然後，將TFF實驗室規模系統與薄膜以大約300毫升注射用水沖洗。接著’將經稀釋之HSA溶液充填在τρρ之儲器中。抽取供滲透度度量（300微升）、uv分光光度測定法（5〇〇微升）之 ❹試樣，及供SEC分析之試樣（12〇微升）。將系統閉合，並開始滲濾。於大約3〇〇毫升體積之滲濾後，取得滲透液2Uv 度量值。滲透液係顯現出274毫克/毫升之濃度，表示蛋白質通過薄膜。在大約500毫升DF之後，停止滲濾，並抽取么、UV度置之另一份5式樣（HSA濃度11.03毫克/毫升）。df/uf 係在950毫升滲濾體積（大約2次體積交換）之後，及在達到滲透度值為4毫滲透度/公斤之後完成。滲濾後之HSA溶液之 PH-值為 PH 7.13。 Ο 滲透液之1^分光光度測定度量係進行三次（n=3)。使用TFF設備之滲濾係藉由應用下列參數進行： ~ 攪拌器：位置2 - 泵：位置2 - 壓力上游/入口：最大20-30 psi ' 壓力下游/出口：最大10 psi 在滲遽之後’蛋白質濃度係利用◦咖評估。測得濃度為 9·41毫克/毫升。將HSA溶液殺菌過濾。將τρρ與薄膜以大約丨升蒸餾水沖 136383 -107- 200938221 洗。然後，進行完整性試驗（參閱操作說明書LabscaleTMTFF 系統，第5-3至5-5頁，1997)。體積流量為1.2毫升/分鐘，因此通過完整性試驗（可接受之最大極限3毫升/分鐘）。將薄膜以500毫升蒸餾水，接著以500毫升0.05M NaOH再一次沖洗。將薄膜儲存於0.05M NaOH中，將TFF以大約500毫升蒸館水再一次沖洗。 4.2 :濃縮程序在使HSA蛋白質溶液濃縮之前，濃度係利用OD280評估，且測得為9.52毫克/毫升。使用四個Vivaspin 20濃縮器（10 kDa) 。將20毫升HSA溶液（9.52毫克/毫升）放置在3個Vivaspin濃縮器之每一個中。在第四個Vivaspin中，充填水，作為當離心時之平衡重量。將濃縮器閉合，並放入離心機中。使HSA 溶液離心，施加4500 X克離心分離力（在向外擺動旋轉機中）。 4.3 :試樣抽取抽取經濃縮HSA溶液之試樣，當濃度達到10毫克/毫升時，及接著在每10毫克/毫升濃度增量增加後（在20毫克/毫升，30毫克/毫升，40毫克/毫升等下，直到大約180毫克/ 毫升為止）。每40分鐘，將濃縮器取出離心機，使溶液均化，並將溶液與離心機接頭在冰上冷卻大約10分鐘。於每10毫克/毫升濃度增量增加後，使濃縮器中之溶液均化，檢查光學外觀，並抽取試樣，以經由UV (300微升）、PCS (160微升）、 SEC (120微升）及IEC (300微升）分析。於試樣抽取後，將HSA 溶液（9.52毫克/毫升）添加至濃縮器中，至高達大約20毫升。 136383 -108- 200938221 當濃縮器中之HSA溶液之投射濃度達到大約20毫克/毫升時，滲透液係經由OD280度量，顯現出0.5964毫克/毫升之濃度。HSA溶液之濃度僅為15.99毫克/毫升，其係低於所預期。在WFI中之經濃縮HSA之試樣（10毫克/毫升）係經由SEC 分析，以細查可能之斷裂。將Vivaspins中之HSA溶液（15.99 毫克/毫升）放置在falcon管件中，並儲存於-80°C下。將用以充填濃縮器之最初HSA溶液（9.52毫克/毫升）之其餘部份亦儲存於-80°C下。進行SEC分析，以測定HSA蛋白質是否經歷降解，產生可通過薄膜之小片段。但是，對於10毫克/毫升在WFI中之 HSA，SEC分析係顯現出單體量為92.45%，實質上無片段。使儲存於-80°C下之溶液在25°C下解凍，並殺菌過濾。將於falcon管件中之溶液各轉移在一個Vivaspin 20濃縮器中（3 kDa截止值）。將Vivaspins以HSA溶液（9.52毫克/毫升）充填，並離心（參考上述3.2濃縮程序）。目視檢查與PCS分析係用以測定HSA之溶解度極限。在實驗完成時，達到大約180毫克/毫升HSA之濃度。使所有SEC與IEC試樣儲存於-8(TC下，直到進一步分析為止。UV與PCS度量係在試樣抽取後直接進行。將經濃縮HSA 溶液之其餘部份放置在Eppendorf容器中，並儲存於-80°C下。離心分離綱要之概論係描述於上表7中。用以使HSA濃縮之離心分離之延續時間係描述於表11中。 136383 -109- 200938221 表11 :使HSA溶液濃縮所必須之離心分離時間濃度[從-> 至][毫克/毫升] 時間[分鐘] 10 至 20 9 20 至 30 30 30 至 40 40 40 至 50 50 50 至 60 80 60 至 70 90 70 至 80 110 80 至 90 130 90 至 100 170 100至180 360 4.4: pH值對於HSA之流體動力學直徑之衝擊進行下述實驗部份，以評估當蛋白質被溶於WFI中時，pH 對於HSA之流體動力學直徑之可能衝擊。將四個6R小玻瓶以5.09毫升HSA溶液（9.83毫克/毫升）充填，且從3至6之pH 值係以 1M HC1 設立（實際 pH : 3.04、3.99、5.05、6.01)。將此等溶液各轉移至個別10毫升量瓶。然後，將燒瓶充填至校〇準記號，並溫和振盪，以供均化。將HC1溶液放置在10R小玻瓶中，並經由PCS分析。將溶液殺菌過濾，並經由PCS再一次度量。亦將5.09毫升HSA溶液(9.83毫克/毫升）轉移在10毫升量瓶中，並將其以WFI充填至校準記號。使燒瓶溫和振盪，以供均化，接著將溶液殺菌過濾，並經由PCS度量。. 供PCS度量之試樣製備：將比色杯以50微升試樣沖洗。度量係以100微升試樣體積 136383 -110- 200938221 進行。 4.5:黏度度量對於在市售調配物中之HSA (200毫克/毫升）及對於在wFI 中之HSA (大約180毫克/毫升）’黏度係以毛細管黏度計 (Schott，MR-編號 33.2)度量。 15毫升液份係抽取自市售調配物hsa之50毫升瓶子。使 WFI中之HSA在大約20°C下解凍，並取得大約9毫升之液份 SFalcon管件中。密度係以密度度量裝置DMA4500，Ant〇nPaar 度量。高HSA濃縮調配物之進一步分析係提供於實例5至11中。實例5:高蛋白質調配物之分析-光學外觀與市售調配物中之阿達利母馬成對比，在胃中之阿達利母馬不會顯現出乳白色。當被溶於WFI中時，j695亦不會顯現出任何乳白色現象。儘管阿達利母馬之蛋白質濃度在胃中為80毫克/毫升與2〇〇毫克/毫升之事實，實質上仍無 ❹乳白色被發現。對照上而言，包含5〇亳克/毫升阿達利母馬之市售調配物係在市售調配物中顯現出顯著乳白色。因此，使用純水意即WFI作為溶解媒質係具有對於蛋白質溶液乳白色之正面作用。、令人驚訝之發現是（除了在此種高蛋白質濃度下完全為可溶性以外）於刪中之阿達利母馬係顯示具有低黏度，即使在較咼濃度譬如200毫克/毫升下亦然。依農度而定’ HSA溶液之光學特徵/顏色係自透明與微黃色（10毫克/毫升，在贿中）改變成透明與黃色（大約180毫 136383 -111- 200938221 克/毫升，在WFI中）。在濃縮程序期間，關於阿達利母馬溶液與HSA溶液未發現沉澱作用。沉澱作用已為溶解度限制之指標。溶液係保持透明，直到完成實驗為止。應強調的是，實驗並未完成，因接近可能溶解度極限及沉澱作用發生，但因留在濃縮器中之溶液體積不足以進行濃縮而被完成（意即缺少物質）。顯示極可能情況是阿達利母馬、J695及HSA之溶解度極限係遠超過220毫克/毫升。當將高濃縮溶液在2-8°C下，於濃縮器中儲存過夜時（大約 120毫克/毫升），在J695溶液中發現晶體狀沉澱物。當將溶液儲存於環境溫度下時，晶體狀沉澱物會於大約3-5分鐘後再溶解。因此，經由使J695在高濃度下溶解於純水中所產生之環境，係提供其中蛋白質結晶化作用可藉單單溫度循環而進行之條件（例如自環境溫度至2-8°C )。實例6 :高蛋白質調配物之分析蛋白質濃度蛋白質濃度之計算係被提供於上文物料與方法段落中。阿達利母馬、J695及HSA之濃縮至純水、高蛋白質調配物中之概論係提供於下表12-14中：表12:當在濃縮程序期間經由OD280評估時之阿達利母馬之濃度試樣名稱吸光率平均值稀釋濃度在WFI中之阿達利母馬10毫克/毫升 0.680 0.650 20 9.35 0.695 0.575 136383 -112- 200938221

試樣名稱吸光率平均值稀釋濃度在wn中之阿達利母馬20毫克/毫升1 1.064 0.813 40 23.40 0.688 0.687 在中之阿達利母馬20毫克/毫升2 0.781 0.788 40 22.68 0.793 0.791 在WFI中之阿達利母馬20毫克/毫升3 0.870 0.824 40 23.71 0.883 0.719 在WFI中之阿達利母馬30毫克/毫升1 0.817 0.807 60 34.84 0.812 0.793 在WFI中之阿達利母馬30毫克/毫升2 0.839 0.827 60 35.69 0.813 0.829 在WFI中之阿達利母馬30毫克/毫升3 0.770 0.744 60 32.10 0.729 0.732 在WFI中之阿達利母馬40毫克/毫升1 0.494 0.491 100 35.35 0.493 0.488 在WH[中之阿達利母馬40毫克/毫升2 0.499 0.501 100 36.06 0.516 0.489 在WPI中之阿達利母馬40毫克/毫升3 0.495 0.512 100 36.81 0.523 0.517 在WFI中之阿達利母馬50毫克/毫升1 0.574 0.585 100 42.11 0.579 0.603 136383 -113- 200938221

試樣名稱吸光率平均值稀釋濃度在wn中之阿達利母馬50毫克/毫升2 0.671 0.634 100 45.63 0.630 0.601 在WFI中之阿達利母馬50毫克/毫升3 0.579 0.574 100 41.27 0.574 0.568 在WFI中之阿達利母馬60毫克/毫升1 0.838 0.837 100 60.21 0.833 0.840 在WFI中之阿達利母馬60毫克/毫升2 0.793 0.777 100 55.89 0.767 0.770 在WFI中之阿達利母馬60毫克/毫升3 0.802 0.780 100 56.10 0.759 0.779 在WH中之阿達利母馬70毫克/毫升1 0.911 0.878 100 63.15 0.866 0.857 在WH中之阿達利母馬70毫克/毫升2 1.012 0.996 100 71.68 0.976 1.001 在WFI中之阿達利母馬70毫克/毫升3 0.879 0.871 100 62.66 0.874 0.861 在WFI中之阿達利母馬80毫克/毫升1 0.512 0.510 200 73.45 0.489 0.531 在WFI中之阿達利母馬80毫克/毫升2 0.542 0.526 200 75.64 0.519 0.517 136383 -114- 200938221

試樣名稱吸光率平均值稀釋濃度在WE[中之阿達利母馬80毫克/毫升3 0.551 0.531 200 76.42 0.511 0.531 在WFI中之阿達利母馬90毫克/毫升1 0.550 0.547 200 78.64 0.550 0.539 在WH中之阿達利母馬90毫克/毫升2 0.549 0.548 200 78.80 0.551 0.543 在WFI中之阿達利母馬90毫克/毫升3 0.532 0.534 200 76.81 0.533 0.537 在WFI中之阿達利母馬100毫克/毫升1 0.640 0.628 200 90.36 0.621 0.623 在WFI中之阿達利母馬100毫克/毫升2 0.748 0.747 200 107.41 0.735 0.757 在WFI中之阿達利母馬100毫克/毫升3 0.625 0.621 200 89.39 0.616 0.623 在WFI中之阿達利母馬110毫克/毫升1 0.674 0.669 200 96.19 0.671 0.660 在WFI中之阿達利母馬110毫克/毫升2 0.693 0.668 200 96.05 0.690 0.620 在WFI中之阿達利母馬110毫克/毫升3 0.604 0.640 200 92.05 0.664 0.652 136383 -115- 200938221 試樣名稱吸光率平均值稀釋濃度在WFI中之阿達利母馬200毫克/毫升1 0.863 0.698 400 201.00 0.612 0.621 在WFI中之阿達利母馬200毫克/毫升2 1.055 0.791 400 227.53 0.658 0.659 在WFI中之阿達利母馬200毫克/毫升3 0.732 0.665 400 191.44 0.648 0.615 〇表13 :當在濃縮程序期間經由OD280評估時之J695濃度試樣名稱吸光率平均值稀釋濃度在WFI中之ΑΒΤ-874 10毫克/毫升 0.715 0.703 20 9.90 0.708 0.705 在中之ΑΒΤ-874 20毫克/毫升1 0.686 - 40 19.31 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 20毫克/毫升2 0.684 - 40 19.26 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 20毫克/毫升3 0.685 - 40 19.29 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 30毫克/毫升1 0.700 - 60 29.59 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 30毫克/毫升2 0.703 - 60 29.70 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 30毫克/毫升3 0.684 - 60 28.91 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 40毫克/毫升1 0.539 - 100 37.97 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 40毫克/毫升2 0.540 - 100 38.02 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 40毫克/毫升3 0.520 - 100 36.65 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 50毫克/毫升1 0.698 - 100 49.15 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 50毫克/毫升2 0.653 - 100 45.95 在WH中之ΑΒΤ-874 50毫克/毫升3 0.623 - 100 43.87 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 60毫克/毫升1 0.834 - 100 58.75 在 WFI 中之 ΑΒΤ-874 60毫克/毫升2 0.781 - 100 55.02 在WH中之ΑΒΤ-874 60毫克/毫升3 0.778 - 100 54.76 136383 -116- 200938221 在WFI中之ABT-874 70毫克/毫升1 1.103 - 100 77.69 在WFI中之ABT-874 70毫克/毫升2 1.102 - 100 77.62 在WFI中之ABT-874 70毫克/毫升3 1.110 - 100 78.13 在WFI中之ABT-874 80毫克/毫升1 0.671 - 200 94.45 在WFI中之ABT-874 80毫克/毫升2 0.746 - 200 105.06 在WFI中之ABT-874 80毫克/毫升3 0.664 - 200 93.45 在WFI中之ABT-874 90毫克/毫升1 0.826 - 200 116.37 在WFI中之ABT-874 90毫克/毫升2 0.809 - 200 113.92 在WFI中之ABT-874 90毫克/毫升3 0.804 - 200 113.27 在WFI中之ABT-874 100毫克/毫升1 0.861 - 200 121.21 在WFI中之ABT-874 100毫克/毫升2 0.993 - 200 139.80 在WFI中之ABT-874 100毫克/毫升3 0.985 - 200 138.73 在WFI中之ABT-874 200毫克/毫升1 0.681 0.805 400 226.67 0.864 0.869 在WFI中之ABT-874 200毫克/毫升2 0.690 0.767 400 216.10 0.828 0.784 在WFI中之ABT-874 200毫克/毫升3 0.708 0.745 400 209.83 0.789 0.738

表14a與14b :當在濃縮程序期間經由OD280評估時之HSA濃度表 14a· 試樣名稱吸光率稀釋濃度在WFI中之HAS 10毫克/毫升 0.515 20 9.88 在WFI中之HSA 30毫克/毫升1 0.398 60 22.94 在Wn中之HSA 30毫克/毫升2 0.395 60 22.73 在WFI中之HAS 30毫克/毫升3 0.400 60 23.00 在WFI中之HSA 40毫克/毫升1 0.383 100 36.78 在WFI中之HSA 40毫克/毫升2 0.389 100 37.33 136383 -117- 200938221

表 14b. 試樣名稱吸光率平均值稀釋濃度在WH中之HSA 180毫克/毫升1 0.946 0.952 200 182.79 0.950 0.961 在WFI中之HSA 180毫克/毫升2 0.994 0.929 200 178.24 0.906 0.886 在WFI中之HSA 180毫克/毫升3 0.843 0.896 200 172.05 0.963 0.884 在WFI中之HSA 40毫克/毫升3 0.368 100 35.29 在WFI中之HAS 50毫克/毫升1 0.479 100 45.97 在WFI中之HAS 50毫克/毫升2 0.496 100 47.61 在WH中之HAS 50毫克/毫升3 0.465 100 44.61 在WFI中之HAS 60毫克/毫升1 0.609 100 58.47 在WFI中之HAS 60毫克/毫升2 0.653 100 62.69 在WFI中之HAS 60毫克/毫升3 0.568 100 54.52 在WFI中之HAS 70毫克/毫升1 0.645 100 61.89 在WFI中之HAS 70毫克/毫升2 0.623 100 59.76 在WFI中之HAS 70毫克/毫升3 0.618 100 59.28 在WFI中之HAS 80毫克/毫升1 0.393 200 75.37 在WFI中之HAS 80毫克/毫升2 0.436 200 83.69 在WFI中之HAS 80毫克/毫升3 0.363 200 69.67 在WFI中之HAS 90毫克/毫升1 0.484 200 92.90 在WFI甲之HAS 90毫克/毫升2 0.439 200 84.22 在WFI中之HAS 90毫克/毫升3 0.419 200 80.50 在WFI中之HSA 100毫克/毫升1 0.604 200 115.93 在WFI中之HAS 100毫克/毫升2 0.573 200 110.00 在WFI中之HAS 100毫克/毫升3 0.585 200 112.30 136383 200938221 所自平估之全部：r錄疋 ^ 種蛋白質在所評估之濃度範圍内仍缺# 持可溶性（意即對於行a u 門彳乃然保 p對於阿達利母馬與；695為>2〇〇毫於HSA為>175毫券/墓也、笔开對鼋克/毫升）。未發現不溶性之指徵在溶液中之渾濁翊务々，』如發生士 _ 見象或沉澱作用。對於阿達利母馬，此等結果表不’涵蓋所評估之濃度範圍，所有阿達利母馬異構重組物(意即離胺酸變種)仍然保持可溶性因完全未發生 >儿澱作用4觀察亦與實例U中所述之離子交換層析法數 Ο

據致其係描述離胺酸變種之總和係保持實質上一致，而不管阿達利母馬濃度為何。實例7:高蛋白質調配物之分析黏度 7·1 :阿達利母馬黏度 /貝J知阿達利母馬（大約毫克/毫升）在注射用水中之黏度為約1.5-2 mPas。對於胃中之阿達利母馬（大約200毫克/ 毫升）’係測得兩種數值。以得自Malvem (Gemini 15〇)之錐/ 板流變計所測得之一種數值為大約6-6.5 mPas，然而另一種數值（以得自Anton Paar, MCR 301之錐/板流變計度量）為大約 12 mPas ° 阿達利母馬市售調配物（大約194毫克/毫升）黏度： K -毛細管之常數 t -溶液通過毛細管所必須之時間[s] ^ -動黏度 β -動態黏度 Ρ -密度 136383 -119- 200938221 時間[S] K [平方毫米/平方粆] P [平方毫米/秒] ι〇 [克/立方公分] η [mPas] 279.36 0.03159 8.825 1.05475 9.31 以得自Anton Paar之黏度計測得阿達利母馬在WFI (大約 200毫克/毫升）中之黏度為大約12 mPas，及以得自Malvern之黏度計測得為大約6 mPas。對照上而言，阿達利母馬在市售調配物（大約194毫克/毫升）中之黏度為較高，在9.308 mPas下（以得自Schott之毛細管黏度計度量）。 7.2:人類血清白蛋白黏度 0 HSA市售調配物（大約200毫克/毫升）黏度： K -毛細管之常數 t -為穿過毛細管溶液需要之時間[s] V -動黏度 7/ -動態黏度 P -密度時間[s] K [平方毫米/平方秒] ν [平方毫米/秒] Ρ [克/立方公分] η [mPas] 337.69 0.01024 3.46 1.05475 3.66_ HSA在WFI(大約180毫克/毫升）中黏度： K -毛細管之常數 t -為穿過毛細管溶液需要之時間[s] V -動黏度 7/ -動態黏度 <0 -密度時間[s] K [平方毫米/平方秒] ρ [平方毫米/秒] Ρ [克/立方公分] η [mPas] 185.3 0.09573 17.72 1.07905 19.12 測得HSA在WFI (大約ι8〇毫克/毫升）中之黏度為大約 136383 •120· 200938221 19.121 mPas。測得HSA在市售調配物（大約194毫克/毫升）中之黏度為9.308 mPas (以得自Schott之毛細管黏度計度量）。 7.3:阿達利母馬與HSA之黏度分析阿達利母馬50毫克/毫升在WFI中之動態黏度係個別低於阿達利母馬200毫克/毫升在WFI中及在市購緩衝劑中之黏度。對於HSA ’在WFI中之濃度180毫克/毫升之動態黏度係約六倍高於在市購緩衝劑中之濃度2⑻毫克/毫升。因此，似乎是由於藉純水作為溶解媒質所傳達之作用所致之黏度改變之強度（意即個別增加及減少）可依個別蛋白質而定。實例8:高蛋白質調配物之流體動力學直徑之分析·光子相關光譜學（PCS) 下述實例係提供在使用本發明DF/UF方法所獲得含水調配物中之各種蛋白質流體動力學直徑（Dh)(平均流體動力學分子直徑之1平均）之分析。 8.1 :阿達利母馬流體動力學直徑 Q 如圖5與6中所示，可發現其中流體動力學直徑（Dh)係隨著漸杧阿達利母馬濃度而增加之趨勢。圖5顯示在从啊中之阿達利母馬之流體動力學直徑（z_平均）與濃度間之關聯性。圖6顯示在wn中之阿達利母馬之流體動力學直徑（吸收峰單體）與濃度間之關聯性。自3.27毫克/耄升試樣所測得之a，與34.20毫克/毫升試樣較其間之差異係存在，因為在關於流體動力學直徑度量之標準操作程序（S〇P)中所作之假設。對於具有$23.27 毫克/亳升濃度之阿達利母馬試樣，pcs度量係以假定關於 136383 -121 - 200938221 試樣黏度之1.1 mPas值之s〇p進行。對於具有2 342〇城沾之阿達利母馬試樣，係使用假定丨9地批試樣黏度之s〇p。已知pcs數據係強烈地被試樣溶液之特定黏度所影響，因數據係以試樣之隨機布朗運動為基礎，其係受試樣黏度所衝擊。因此，可解釋隨著漸增蛋白質濃度之流體動力學直徑上之增加，因漸增蛋白質濃度會提升溶液之黏度（較高黏度會導致較低布朗運動與較高所計算之仏數據）。蛋白質分 φ 子係經歷較低隨機布朗運動，且因此對於特定黏度，試樣之流體動力學直徑係經計算為較高。整體而言，z平均為基礎之Dh值與單體之1^值係良好地符合。此外，隨著漸增濃度，未發現關於蛋白質不溶性之Dh指標上之增加（意即高分子量聚集體與沉澱物（若存在時）會引致實質增加。 8·2 · J695流體動力學直捏圖7與8顯示J695之流體動力學直徑係相對地與蛋白質濃度無關，直到達成114.52毫克/毫升濃度為止。將J695濃度自 ❾ n4.52毫克/毫升增加至133.25毫克/毫升，係引致Dh上之快速增加。在217.53毫克/毫升濃度下之流體動力學直徑係高於在114.52毫克/毫升下。此項發現並不令人驚訝，因兩種蛋白質溶液係使用相同SOP (假定1>9灿狀之相同黏度）度量，事實上，當蛋白質濃度增加時，黏度係增加。因此，自114.52毫克/毫升之強增加至133 25毫克/毫升可被解釋為人為產物。 8.3 :人類血清白蛋白流體動力學直徑已發現當濃度自9.88毫克/毫升上升至112.74毫克/毫升 136383 •122· 200938221 時’在WFI中之HSA之流體動力學直徑會降低。但是，自 112.74毫克/毫升至17769毫克/毫升，發現流體動力學直徑會增加。 HSA顯示隨著漸增蛋白質濃度而增加流體動力學直徑 (吸收峰單體）之一般傾向，其係與從屬之理論原理一致。自9.88毫克/毫升至2289毫克/毫升之Dh降低係因度量s〇p

〇上之改變所造成（從假定黏度L1 mPas轉換至假定黏度J 9 mPas) ° 描述上文之數字資料係提供於附錄A中。實例9 · J695 :流體動力學直徑之賦形劑衝擊已毛現以下令人驚背之結果，蛋白質可以高濃度被溶於純K中典型上使用於非經腸調配物中之可離子化與不可離子化賦形劑對於流體動力學直捏之衝擊係經評估、。聰係作為模式蛋白質使用。衣顯示溶液滲透度係直接正比於氯化鈉之濃度。在蛋白質溶液中之滲透度係伴隨著騎濃度上升（幾乎線性相關）。令人感興趣的是’ j695蛋白質之流體動力學直秤係隨 ^漸增鹽濃度而增加。NaC1為離子性賦形劑，且被^成 ::電荷納離子與帶負電荷氣離子’其可在蛋白質之表面 :。無鹽存在之情況下’廳之流體動力學直徑係顯 ::低於正常情況下關於聰所預期者(經常測得微米之數值）。白質溶液中之動力學直徑並如表15中所示，滲透度係隨著甘露醇在蛋農度増加而線性地增加。對照上而言，流 136383 • 123· 200938221

未顯示對於甘露醇濃度之依賴性。甘露醇為非離子性糠醇/ 多元醇。甘露醇或多元醇係在非經腸調配物發展期間及在最後調配物中作為安定劑使用。甘露醇係藉由優先排阻而使蛋白質安定化。作為其他滲透劑，甘露醇係優先地自蛋白質表面排除，且其係在蛋白質之水合物殼層之外側。因此，蛋白質之經折疊狀態係被安定化，因為具有較大表面之未折疊狀態會變得熱力學上較不有利（Forster, T.M.,愈分子量尿激酶在熱處理期間之熱不安定性.m.鹽，糖類及 TWen邠之#居，134國際製藥學期刊193 (1996) ; Singh, S.與 Singh, V，多元醇對於模式蛋白質溶菌酶之構形安定性與生游荸活艋之作摩，4 AAPS PharmSciTech,論文42 (2003))。但是，令人感興趣的是，滲透度可基本上按需要而調整-其係為本文中所述蛋白質發現之一項重要特徵-不會衝擊蛋白質之 Dh。此等發現可用於高濃度蛋白質調配物中，其中可能存在黏度相關之製造與服藥問題，因以甘露醇之滲透度調整並未藉由蛋白質Dh上之增加反映出（意謂預期黏度仍然保持恒定）。表15 :賦形劑對於J695滲透度與Z-平均之衝擊

NaCl濃度 [毫克/毫升] 滲透度 [毫滲透度/公斤] Z-平均 [毫微米] 0 16 4.19 2 92 12.2 4 158 16.2 6 230 17 136383 -124- 200938221 甘露酵濃度 [毫W毫升] 滲透度 [毫滲透度/公斤] z-平均 [毫微米] 0 16 4.19 20 148 5.49 40 276 3.22 60 432 3.54 實例ίο:高蛋白質調配物以尺寸排阻層析（SEC)之分析關於SEC分析，係在注射之前，將阿達利母馬、J695及HSA 之試樣稀釋至2毫克/毫升，關於阿達利母馬之注射體積為 © 20微升。關於湖5與HAS，係使用1〇微升注射體積。 10.1 :阿達利母馬之SEC分析阿達利母馬之單體量係傾向於稍微地自99.4%減少至 98.8% ’同時自9.35毫克/毫升濃縮至2〇6 63毫克/毫升。該單體減少係個別與0.4%iU%之阿達利#馬溶液中聚集體量上之增加有關聯，同時自助毫克/毫升濃縮至鳩2毫克/ 毫升。片段量仍然保持恒定在〇.1%下，與蛋白質濃度無關 (參閱附錄B中之表）。因此，阿達利母馬在職中係為安定的。整體而言，隨著漸增蛋白質濃度之蛋白質聚集上之增加係被認為僅只是少許。當任一種蛋白質經調配在緩衝系統中時’及當另外添加界面活性劑時，預期在單體減少上之類似趨勢。當經調配在純水中時，阿達利母馬蛋白質顯示令人驚訝地安定。 10.2: J695 之 SEC 分析 J695單體之量係隨著9.99毫克/毫升至Μ?.%毫克/毫升之 136383 •125· 200938221 漸增蛋白質濃度而稍微地自99.4%減少至98.6%。單體之減少係與約0.4%至約1.2%之聚集體增加有關聯，伴隨著9.99毫克 /毫升至217.53毫克/毫升之漸增蛋白質濃度。與蛋白質濃度無關，片段量係隨著9.99毫克/毫升至217.53毫克/毫升之漸增蛋白質濃度，而幾乎為恒定具有0.17%至0.23%。整體而言，隨著漸增蛋白質濃度之蛋白質聚集上之增加係被認為僅只是少許。當蛋白質經調配在緩衝系統中時，及當添加其他界面活性劑時，預期在單體減少上之類似趨勢。因此’當經調配在純水中時，J695蛋白質顯示令人驚評地安定。 10.3 : HSA 之 SEC 分析單體HSA之量係自95.9%減少至92.75%，同時自9.88毫克/

毫升?辰縮至112/74毫克/毫升。對於具有17769毫克/毫升之試樣别得單體上之增加至高達94.5% ^單體量之減少係伴隨著4.1%至7.25%之蛋白質聚集體上之增加’同時自9.88毫克毫升濃縮至112.74毫克/毫升。因此，當經調配在純水中時’ HSA蛋白質亦顯示為安定。描述上文所提及SEC實驗之數字資料係提供於附錄B中。實例高蛋白質調配物之分析.離子交換層析(iec) 關於IEC分析，係在注射之前，將阿達利母馬、廳及脱稀釋至1毫克/毫升。關於所有蛋白質之注射體積均為100微升。 U π π馬之分析如圖9中所示，阿仃達利母馬在_中係為安定的。圖9顯 136383 -126- 200938221 示一種輕微趨勢，其可被解釋為表示離胺酸變種（離胺酸 0、1及2)之總和係隨著阿達利母馬在wn中之濃度增加而降低。但是，整體而言，離胺酸變種之百分比係改變低於 0.25%。 11.2 : J695 之 IEC 分析圖10顯示J695吸收峰1至7之總和係隨著漸增J695濃度而稍微地降低。隨著吸收蜂1_7上之降低，酸性與鹼性吸收峰 ❹ 之總和係稍微地增加，其中酸性吸收峰上之增加係稍微較顯著（參閱圖11與12)。個別地，酸性吸收峰之總和係稍微地自大約10.2%增加至10.6%，而驗性吸收峰之總和自〇 52% 增加至0.59%。整體而言，可述及的是，經由IEC未發現在純水中之J695 調配物之主要不安定性作用或不溶性作用。描述上文IEC實驗之數字資料係提供於附錄^中。在實例2-11中之發現之摘述〇首先認為將蛋白質譬如抗體轉移至WFI中可能會因使蛋白質濃縮超過其在純水中之溶解度極限而引致蛋白質沉澱作用。上述研究証實蛋白質，包括抗體，不僅可在較低濃度下被轉移至純WF!中，而不會遭遇任何沉澱現象與溶解度限制，而且令人驚訝的是，阿達利母馬（以及另兩種試驗蛋白質）可使用UF/DF與離心分離技術（例如TFF設備、 Vivaspm裝置），在純水中濃縮至超過2⑻毫克/毫升之超高濃度此外，令人意外地發現，當蛋白質經調配在WFI中時，阿達利母馬乳白色會實質上降低。滲透度係經監測，以確 136383 •127- 200938221 保阿達利母馬緩衝劑媒質完全被純、不合魄+」卜3鹽之水（意即^工) 交換。再者’冷涑-解柬處理係在試樣製備期間進行，以供分析，且以SEC與IEC分析實質上未發現不安定性現象。八在高濃度下，於WFI中調配蛋白質例如阿達利母馬之途徑’係顯示降低黏度現象之可能性’其係經常在高蛋白質濃度下阻礙直接藥物產物發展。

❹ 最後，發現阿達利母馬之流體動力學直徑（經由光子相關光譜學PCS所測得）在WH中係比在市售緩衝劑中顯著地較低（較低黏度傾向之指標）。整體而言，結論是抗體與球形模式蛋白質hsa可以超高濃度溶於純水中之發現，具有提供新洞察基本蛋白質服= 法，及潛在地在蛋白質藥物調配與製造中提供新穎途徑之潛力’例如以下述方式： - 降低高濃縮蛋白質調配物之乳白色 " 降低高濃縮蛋白質調配物之黏度 -使得能夠按需要調整蛋白質-WFI溶液中之滲透度，其方式是添加非離子性賦形劑，譬如甘露醇，而不會改變譬如黏度與非乳白色之特徵（已証實對於 J695，當添加甘露醇時，流體動力學直徑與乳白色不會改變，但當添加NaCl時，會急驟地增加） -在藥物調配與處理中提供新範例，因已証實可使蛋白質接受操作，譬如DF/UF，以濃縮胃中之蛋白質至超高濃度，及冷凍與解凍，而無實質安定性關聯性。在習知於DF/UF期間，蛋白質調配物之組成，尤 136383 -128- 200938221 其是在處理至高濃度期間，必然會改變（Stoner, Μ.等 k、蛋白質-溶質交互作用會影響超過濾/滲濾操作之·结肩，93 J. Pharm. Sci. 2332 (2004))之背景下，此等新發現可以下述方式有利地應用，無論是藉由在純水中之蛋白質之DF/UF調整藥物濃度，並接著在高DS 濃度下添加賦形劑（藉此避免在製程單元操作期間 DS調配物改變之風險）。或者，賦形劑可在最後藥物產物充填完工期間被添加至藥物中。實例12 :在水調配物中之阿達利母馬之製備下述實例係說明按比例擴大DF/UF程序，造成阿達利母馬在水中之大規模生產。 12.1 :製程參數之評估滲析製程評估研究係在實驗室規模下進行，以界定關於整體阿達利母馬藥物溶液滲析之適當參數，該溶液係經調配在含有其他賦形劑例如甘露醇與氯化鈉之磷酸鹽/檸檬酸鹽緩衝系統中（圖13與14)。導電率度量值可以適合蛋白質溶液中之導電率分析之任何市購可得電導率計取得，例如電導率計SevenMulti型，具有寬廣pH範圍之擴大容量（Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)。此儀器係根據製造者說明書操作（例如若電導感測器在Mettler Toledo儀器中改變，則必須再一次進行校準，因各感測器具有不同元件常數；參考SevenMulti型電導率計之操作說明書）。若按照說明書，則導電率度量值可經由將度量探測物直接浸沒至試樣溶液中而取得。 136383 •129- 200938221 圖13顯示滲析程序之效率，以負責含有74毫克/毫升下阿達利母馬之調配物滲透度與導電率之成份降低為觀點。在降低抗體溶液中之溶質達100之因數後，滲透度與導電率度量主要係在遠低於得自市售調配物之此等參數之最初度量值之程度下被安定化。圖14顯示在經滲析阿達利母馬整體溶液中之pH安定性。對著去離子水滲析（1:1,000,000)前後之pH程度係顯示關於具有不同最初pH讀數範圍之阿達利母馬溶液。於滲析前後， pH程度在留存物中仍然保持幾乎相同。 12.2 :在水整體藥物溶液中之高濃縮阿達利母馬之生產在第一個步驟中，係使經調配之整體藥物溶液（含有其他賦形劑例如甘露醇與氯化鈉之磷酸鹽/檸檬酸鹽缓衝系統）藉由超過濾/滲濾向上濃縮至大約100毫克/毫升之濃度（12 升規模，Millipore Pellicon 2 Mini Bio-A MWCO 10k 管柱）。在第二個步驟中，使經向上濃縮之溶液對著去離子水滲析 (SpectraPor7 MWCOlOk，稀釋因子1:100,000)。作為第三個步驟，係使經滲析之溶液使用 Millipore Pellicon 2 Mini Bio-A MWCO 10k 管柱，藉由超過濾/滲濾向上濃縮至大約250毫克/毫升之濃度。表16a顯示在程序步驟3後於水（經DF/UF處理）整體藥物溶液中之高度濃縮阿達利母馬之分析結果。表16a :關於DF/UF整體-處理之阿達利母馬之滲透度與導電率數據 136383 -130- 200938221 滲透度毫滲透度/公斤導電率 mS/公分 PH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/毫升 62 0.95 5.28 1.0764 277.8 12·3:模擬製造條件之冷象/解凍(f/t)程序冷珠係使用超低溫度冷康庫（Revco Ultima II，20立方叹）進行’具有製造規模負載47公斤之欲在低於_5〇。〇 (典型上為_7〇 °C至-80°C )之溫度下被冷凍之液體。將液體包裝在i 6公斤填充重量之個別瓶子中（例如Nalgene 2升PETG方形媒質）。〇冷凍係於48小時後完成。解凍係在循環水浴（例如Lindergh/ 藍色）中進行，具有製造規模負載24公斤，在2〇<t與恥艽間之溫度下，典型上為30〇C，直到此物質完全解凍為止。 12.4 :在冷凍與解凍期間之瓶子定圖譜單離與分析在瓶子體積中之個別水平溶液層。在25〇毫克 /毫升與200毫克/毫升之蛋白質漠度下，於阿達利母馬水溶液中僅檢出最低梯度液形成，如在圖15至19中所見及者。但是’在〇配之阿達利母馬溶液（具有含其他賦形劑例如甘露醇與氣化鈉之磷酸鹽/檸檬酸鹽緩衝系統之溶液）會導致㈣物之形成於瓶子之底部上。 12.5:在阿達利母馬之市售與低離子性調配物中之梯度液形成比較梯度液在阿達利母馬之市售與低離子性（水）調配物中藉由冷;東解;東程序之形成。表16b顯示步驟後之不同濃度市售阿達利母馬溶液之目視檢查結果。沉澱物之形成顯不不女疋性係在溶液中藉由f/t程序產生。高於⑽毫克/ 136383 -131- 200938221 毫升，發現顯著沉澱物形成。表17顯示冷凍-解凍實驗前之兩種50毫克/毫升溶液與一種100毫克/毫升低-離子性調配物之分析數據。表16b :在F/T之後，於市售阿達利母馬溶液中所發現之沉澱作用 250毫克/ 毫升 220毫克/ 毫升 200毫克/ 毫升 150毫克/ 毫升 120毫克/ 毫升 100毫克/ 毫升 60毫克/ 毫升市售冷凍方法在超低溫度冷凍庫中： -70〇C/23〇C 沉澱物沉澱物沉澱物沉澱物部份沉澱物透明透明表17 :在冷凍-解凍前之溶液分析數據調配物 pH 密度 (克/立方公分）渗透度 (毫滲透度/公斤）蛋白質濃度 (毫克/毫升） E167 130 01 CL 50毫克/毫升在水中低-離子性 5.18 1.0121 5 49.3 E167 140 01 CL 50毫克/毫升在缓衝劑中市售調配物 5.20 1.0224 280 48.7 100毫克/毫升在水中低-離子性 5.32 1.0262 12 99.8 將約1600毫升（50毫克/毫升溶液）或800毫升（100毫克/毫升溶液）之各調配物置入PETG瓶中，並使其接受習用冷凍 (-80°C )解凍（23°C，水浴）程序。然後，自PETG瓶之頂部、中央及底部抽取試樣，並分析關於pH、密度、滲透度及蛋白質濃度。分析結果係示於表18中。 136383 -132- 200938221 表18·得自冷凍/解凍溶液之瓶子-定圖譜層之分析試樣 pH 密度克/立方公分滲透度毫滲透度/公斤蛋白質含量 (體積計量） ί毫克/毫升 50毫兑/毫升在水中 -- ------- 頂部 5.20 1.0119 6 48.72 中間 5.19 1.0120 8 49.35 底部 5.17 1.0120 6 49.76 市售調配物頂部 5.16 1.0165 236 37.9 中間 5.13 1.0221 306 45.58 55.48 底部 5.12 1.0257 368 100毫克/毫升在水中頂部 5.29 1.0259 13 98.7 中間 5.3 1.0262 16 99.9 底部 5.28 1.0262 14 101.2 Ο ❹ 阿達利母馬之市售調配物在冷凍/解凍時係顯現出顯著梯度液’關於密度（表示蛋白質與賦形劑之非均質性/梯度液）、滲透度（表示賦形劑梯度液）及蛋白質含量。對照上而言，在冷凍/解凍時，於50毫克/毫升低離子性阿達利母馬調配物中未發現梯度液。在較高蛋白質濃度下，有時可預期梯度液形成會變得較差。但是，在冷凍/解凍時，於100毫克/毫升低離子性阿達利母馬調配物中未發現梯度液，關於ρΗ、密度、滲透度及蛋白質濃度。實例13: DF/UF後之J695之安定性下述實例係提供關於根據本發明方法，在DF/UF處理後之 J695安定性之數據。 136383 •133- 200938221 得自正常DS缓衝劑中之J695之蛋白質試樣係經分析，無論是在pH值調整後或在滲濾後。將pH值以0.1M磷酸調整至 pH 4.4，蛋白質濃度112毫克/毫升。對於在WFI中之經濃縮試樣，使蛋白質試樣於環境溫度下對著水滲濾（DF/UF)，歷經大約1.5天，使用裝有30 kDa RC薄膜之TFF。測得DF/UF後之蛋白質濃度為約192毫克/毫升pH 4.7。 13.1:尺寸排阻分析(SEC)實驗程序尺寸排阻方法係針對J695之純度評估而發展。尺寸排阻 ^ 層析（SEC)係根據分子量分離巨分子。樹脂係充作篩選劑，保留較小分子在樹脂之孔隙中，及允許較大分子通過管柱。滯留時間與解析度為經選擇樹脂之孔隙大小之函數。將各試樣以純水（Milli-Q)稀釋至2.5毫克/毫升，以所述濃度為基礎。將50微克各試樣重複注射在管柱上。Tosoh Bioscience G3000swxl，7.8 毫米 X 30 公分，5 微米（目錄 #08541) SEC管柱係用於分離。關於缓衝劑A，係使用211 mM Na2S04/ 92 mM Na2HP04，pH 7.0。偵測係在280毫微米與214毫微米下 ❹ 進行。管柱係被保持在室溫下，使用0.3毫升/分鐘之流率。此層析係利用恒定組成梯度液，使用100%流動相A溶劑，歷經50分鐘延續時間。 13.2 : SEC 數據表19係描述得自尺寸排阻層析實驗之數據。 136383 -134- 200938221

表19 :關於J695參考標準物、DS及DF/UF後（在水中）之SEC 分析數據 ΑΒΤ-874 負載 HM 單體片段 BF參考標準物 50u 0.49 97.9 1.28 0.26 BF參考標準物重複 50u 0.41 98.0 1.29 0.27 BF參考標準物平均 0.45 98.0 1.29 0.27 標準物 0.06 0.05 0.01 0.01 %RS 12.5 0.05 0.55 2.67 在緩衝劑中之DS pH 4.4 50u 0.42 98.3 1.04 0.16 在緩衝劑中之DS pH 4.4重複 50u 0.40 98.4 1.01 0.13 在緩衝劑中之DS pH 4.4平均 0.41 98.4 1.03 0.15 標準物 0.01 0.06 0.02 0.02 %RS 3.45 0.06 2.07 14.6 在水中之DS UF/DF pH 4.7 50u 0.69 98.1 1.04 0.14 在水中之UF/DF pH 4.7重複 50u 0.69 98.0 1.07 0.16 在水中之DS UF/DF pH 4.7平均 0.69 98.1 1.06 0.15 標準物 0.00 0.04 0.02 0.01 %RS 0.00 0.04 2.01 9.43 13.3 : SEC分析結論

在表19中之數據顯示J695之市售調配物（DS PFS，pH = 4.4) 具有如J695參考標準物之可比較含量之片段與聚集體。在市售調配物J695對照組與在水中已進行DF/UF之J695 (在 H20中之DS，ρΗ=4·7，192毫克/毫升）間之聚集體量中發現 136383 -135- 200938221 有差異：見及在聚集上之0.4%至0.7%之增加。這並非顯著之增加，且可歸因於UF/DF期間，在室溫下所消耗之時間。對於片段沒有改變。 13.4 : IEC (WCX-10)實驗程序陽離子交換方法係針對J695之異質性之評估而發展，使用Dionex WCX-10管柱。一般而言，陽離子交換層析係根據表觀pi及與樹脂之表面電荷交互作用分離蛋白質異構重組物。吾人感興趣之蛋白質係在特定低鹽開始條件下結合至管柱，並藉由經過梯度液增加鹽濃度而自管柱溶離。具有較低表觀pi之蛋白質係較不緊密地結合至陽離子交換管柱，並為溶離之第一種，而具有較高表觀pi之蛋白質係較緊密結合，並為溶離之最後一種。使用WCX-10之陽離子交換層析係用於品質控制上，作為批料釋出檢測。檢測條件係經修改，以改良已知J695異構重組物之分離。 0 將試樣以純水(Milli-Q)稀釋至1.0毫克/毫升。參考標準物係以一式三份操作，作為比較，並在純水(Milli-Q)中稀釋至 1毫克/毫升。

Dionex Propac WCX-10管柱（p/n 054993)，伴隨著相應之防護管柱（p/n 054994)，係用於分離。於程序中所使用之缓衝劑包括缓衝劑 A (10 mM Na2HP04, pH=6.0)與缓衝劑 B (10 mM Na2HP04，500 mM NaCl, pH=6.0) 〇柱溫係被保持在 35°C 下’且管柱流率為1毫升/分鐘。對於100微克裝填量，注射體積為 100微升，且偵測係在280毫微米下進行。歷經層析分離過 136383 -136- 200938221 程之緩衝劑梯度液係提供於表20中。表20 :於J695之IEC分析中所使用之緩衝劑梯度液時間(分鐘） %ΜΡΑ %ΜΡΒ 0 75 25 3 60 40 33 40 60 36 0 100 41 0 100 43 75 25 48 75 .25 ❾ 13.5: ffiC數據表21係提供得自將J695參考標準物與市售缓衝劑中之 J695 (DS pH=4.4)比較之實驗結果，以及市售緩衝劑調配物與 DF/UF 後之 J695 (DF/UF H2 0, ρΗ=4·7)之比較。表21 ·•關於J695參考標準物、市售調配物（DS)及DF/UF後（在水中）之IEC數據 0 glu (1) Oglu (2+2a) 1 glu (3) 1 glu ⑷ 1 glu ⑸ +(5a) 2 glu (6) 2 glu (7) 酸性鹼性參考標準物 43.77 7.55 8.00 21.87 4.28 4.82 3.75 4.05 1.92 參考標準物重複 43.49 7.49 7.98 21.70 4,26 4.81 3.75 4.61 1.90 參考標準物重複 43.44 7.49 8.00 21.65 4.24 4.81 3.74 4.75 1.89 參考標準物平均 43.57 7.51 7.99 21.74 4.26 4.81 3.75 4.47 1.90 SD 0.20 0.04 0.01 0.12 0.01 0.01 0.00 0.40 0.01 %RSD 0.45 0.56 0.18 0.55 0.33 0.15 0.00 8.86 0.74 〇 0 glu (1) Oglu (2+2a) 1 glu ⑶ 1 glu ⑷ 1 glu ⑸ +(5a) 2 glu ⑹ 2 glu (7) 酸性鹼性 ABT-874 DS pH=4.4 35.65 14.74 7.26 18.06 6.76 5.32 3.98 5.55 2.70 ABT-874 DS ρΗ=4·4重複 35.82 14.73 7.29 18.14 6.82 5.39 4.06 4.79 2.95 ABT-874 DS pH=4.4平均 35.74 14.74 7.28 18.10 6.79 5.36 4.02 5.17 2.83 -137- 136383 200938221 SD 0.12 0.01 0.02 0.06 0.04 0.05 0.06 0.54 0.18 %RSD 0.34 0.05 0.29 0.31 0.62 0.92 1.41 10.39 6.26 〇glu(l) Oglu (2+2a) 1 glu (3) 1 glu (4) 1 glu (5) +(5a) 2 glu ⑹ 2 glu (7) 酸性鹼性 ABT-874 DF/UF H20pH=4.7 36.57 14.51 7.26 18.09 6.57 5.22 3.91 5.28 2.61 ABT-874 DF/UF H20 ρΗ=4·7 重複 36.60 14.43 7.25 18.02 6.66 S.18 4.00 5.31 2.56 ABT-874 DF/tJF H20 pH=4.7 36.59 14.47 7.26 18.06 6.62 5.20 3.96 5.30 2.59 SD 0·02 0.06 0.01 0.05 0.06 0.03 0.06 0.02 0.04 %RSD 0.06 0.39 0.10 0·27 0.96 0.54 1.61 0.40 1.37 0 13.6 : IEC分析結論在J695參考標準物與市售調配物(DS，ρΗ 4·4)之間發現有一些差異。此等差異係在DS工程操作試樣之最初操作中發現，且係歸因於3000升與6000升活動間之製程上差異。在 DS，pH 4.4對照組與AO中之j695 ΡΗ=4·7, 192毫克/毫升試樣之間無顯著差異。實例14:在DF/UF後及長期儲存於2.8t下之阿達利母馬之安定性〇下述實例係提供數據，顯示在根據本發明方法之含水調配物中，於2-8。(：下22.5個月儲存後，阿達利母馬之安定性。使關於SEC與WCX-10分析之阿達利母馬試樣對著水滲濾，並濃縮至約177毫克/毫升。儲存試樣，並在不同時/間點下分析關於安定性。在市售Humira緩衝劑中之標準阿達利母馬溶液⑽，阳約 5.2)係作為於水中產生違縮溶液之起始物質使用。使蛋白質溶液試樣於環境溫度下對著水渗滤(麵F)大約Μ天，使用 136383 • 138 - 200938221 裝有30 kDa RC薄膜之TFF。測得DF/UF後之蛋白質濃度為大約177毫克/毫升，pH 5.2。在分析之前，將試樣於2 下儲存22.5個月。 14.1: SEC實驗程序尺寸排阻方法係於先前經發展，以檢查抗體片段與聚集體之存在。尺寸排阻層析（SEC)係根據分子量分離巨分子。樹脂係充作篩選劑，保留較小分子在樹脂之孔隙中，及允許較大分子通過管柱。滯留時間與解析度為經選擇樹脂之孔隙大小之函數。將各試樣以milliQ水稀釋至1,〇毫克/毫升，並將5〇微克各試樣注射至管柱上。對於SE_HPLC，係使用交聯葡聚糖 (Sephadex) 200 管柱（Pharmacia 目錄 #175175-01，S/N 0504057)或 TSK凝膠G3000SW (目錄#08541 ;用於22.5個月試樣之分析）。管柱之流動相包含20 mM磷酸鈉與150 mM氣化鈉，PH 7,5。 4貞測係在280毫微米與214毫微米下進行。管柱係被保持在 ❾ 環境溫度下，且流率為0.5毫升/分鐘（Sephadex管柱）或〇.3毫升/分鐘（TSK管柱）。 14.2: SEC 數據圖20與表22含有在2-8°C下以液體儲存8.5個月之低-離子性阿達利母馬溶液與在_80°C下儲存之相同溶液比較之分析結果。表23含有在2-8。(：下儲存22.5個月之低-離子性阿達利母馬溶液與阿達利母馬之參考標準試樣比較之分析數據。 136383 -139· 200938221 表22 :比較得自冷凍儲存之阿達利母馬對得自長期冷凍儲存之阿達利母馬之SEC分析數據試樣負載 %HMW :%單體 %LMW DF/UF對著水，177毫克/毫升， 4.5個月，在-8(TC下 50微克 0.1 99.6 0.3 DF/UF對著水，177毫克/毫升,9 個月，在2-8°C下 50微克 0.2 99.5 0.3 表23 :比較阿達利母馬參考標準物對著得自長期冷凍儲存 .之阿達利母馬之SEC分析數據試樣負載 %HMW %單體 %LMW 參考標準物阿達利母馬 50微克 0.31 98.85 0.84 DF/UF對著水，177毫克/毫升， 22.5個月，在2-8〇C下 50微克 1.42 97.59 0.98 正如在表22中可見及者，SEC分析顯示在水中之阿達利母馬為安定的，即使是在2-8°C下9個月或在-80°C下歷經4.5 個月之後，因百分比聚集體（％HMW)與百分比片段（％LMW) 隨著時間為最低。 14.3 : SEC分析結論〇在2-8°C下8.5個月儲存後，阿達利母馬溶液(DF/UF對著水）顯現出一小部份高分子量（HMW)物種（0.2%)與一小部份片段(0.3%)。在-8CTC下儲存4.5個月，與後續解凍（水浴，23°C )，不會衝擊阿達利母馬安定性（0.1%聚集體，0.3%片段）。在2-8°C下儲存22.5個月之試樣分析亦顯示對阿達利母馬參考標準物之可比較片段含量（表23)。但是，在22.5個月安定性試樣中檢出之聚集體含量（1.66%)係稍微高於參考標準物中檢出之聚集體含量。 136383 -140- 200938221 價二自體締合係高度地依賴抗體濃度，·意即非共 :聚=缔合複合物之形成在高蛋白質濃度下係為最顯自體蹄入/缔合為可逆’且以緩衝溶液稀釋會造成降低之产與户，<^冬尺、可逆自體缔合會增加濃縮單株大/合漩户之淼彦，94醫藥科學期刊HU (2⑻4))。 ❾ 因此’可能情況是，在試樣製備中之差異及在阿達利母馬溶液稀釋（自177毫克/毫升至i毫克/毫升）與藉由弧之後續试樣分析間之不同落後時間，為85個月與9個月安定性試樣之聚集體含量上差異之原因。 14.4 : IEC實驗程序陽離子交換方法係針對抗體裝料異質性之評估而發展，使用Dionex WCX_ K) B。陽離子錢層㈣根據表觀讲及與樹脂之表面電荷交互作用分離蛋白質異構重組物。吾人感興趣之蛋白質係在特定低鹽開始條件下結合至管柱，並藉由經過梯度液增加鹽濃度而自管柱溶離。具有較低表觀 Q pI之蛋白質係較不緊密地結合至陽離子交換管柱，並為溶離之第一種，而具有較高表觀pi之蛋白質係較緊密結合，並為溶離之最後一種。在程序之前，係將試樣以milli Q水稀釋至1.〇毫克/毫升。

Dionex Propac WCX-10管柱(p/n 054993)，伴隨著相應之防護管柱(p/n 05499)，係用於分離。製備兩種流動相緩衝劑，1〇 ^

磷酸鈉，pH 7.5 (緩衝劑A)與10 mM磷酸鈉，500 mM氯化鈉，pH 5.5 (緩衝劑B)。管柱係被保持在環境溫度下，且流率為lo 毫升/分鐘。對於微克裝填量，注射體積為100微升，且 136383 -141 - 200938221 偵測係在280毫微米下進行。歷經層析分離過程之緩衝劑梯度液係提供於表24中。表24 :於阿達利母馬之IEC分析中所使用之缓衝劑梯度液時間(分鐘） %MPA %MPB 0.05 94 6 20 84 16 22 0 100 26 0 100 28 94 6 34 94 6 35 94 6

14.5:離子交換數據表25顯示關於儲存前之阿達利母馬參考標準物、市售調配物（150毫克/毫升）及DF/UF後低-離子性溶液之離子交換層析數據。表26顯示關於參考標準物與在2-8°C下22.5個月儲存後之低-離子性溶液比較之數據。表25 :阿達利母馬參考標準物、DS/市售調配物及DF/UF後 (在水中）之IEC分析數據試樣名稱 %酸性區域1 %酸性區域2 % 0 Lys % 1 Lys % 2 Lys 阿達利母馬參考標準物 2.69 11.66 60.77 19.42 5.40 阿達利母馬DS 150 毫克/毫升 2.51 11.38 62.05 19.14 4.83 阿達利母馬對著水滲濾，177毫克/毫升 2.26 11.81 61.97 18.51 4.73 136383 •142· 200938221 表26比較參考才示準物與得自長期冷東儲存之现聊試樣之 rec分析數據試樣名稱~~ %酸性區域1 %酸性ίίΓ % 0 Lys % 1 Lys % 2 Lys 阿達利母馬參考標準物 2.1 10.9 63.8 18.4 4.6 阿達利母馬DF/UF 對著水，177毫克/ 毫升,22.5個月，在 2-8〇C 下 2.7 13.4 62 16.7 4.1 14.6 :離子交換分析結論 Ό 關於Τ〇試樣，數據顯示在參考標準物阿達利母馬、市售調配物阿達利母馬（作為DS使用，以藉由DF/UF將阿達利母馬調配至水中）及對著水滲濾且濃縮至177毫克/毫升之阿達利母馬間之酸性區域^!、0Lys、i Lys*2Lys之百分比上無顯著差異（意即裝料異質性）（表25)。而且’在水中之177毫克/毫升阿達利母馬試樣之22 5個月儲存後’ ^與阿達利母馬參考標準物比較時，僅可見及在〇 Lys、1 Lys及2 Lys離份上之細微差異。概略言之，當阿達利母馬藉由DF/UF處理被調配至水中，並在177毫克/毫升之濃度下，於2-8°C下儲存22,5個月時，未發現顯著化學不安定性傾向。實例15 :低-離子性1D4.7溶液之冷珠/解象安定性 ΠΧ7蛋白質（免疫球蛋白G1)抗-IL 12/抗-IL 23係藉由滲析 (使用slide-a-lyzer卡匣，根據製造者Pierce，Rockford，IL之操作說明書使用）而被調配在水中，証實於2毫克/毫升濃度，pH 6下’在重複冷凍/解凍（f/t)處理（-8(TC /25°C水浴）期間為安定 136383 •143- 200938221 的。將數據與例行調配物（2毫克/毫升，pH 6)比較，並發現經調配在水中之1D4.7安定性係超過經調配在例行性地經篩濾緩衝系統（例如20 mM組胺酸、20 mM甘胺酸、10 mM磷酸鹽、10 mM檸檬酸鹽）中之1D47安定性，且甚至超過具有多種常用於蛋白質調配物中之賦形劑，例如1〇毫克/毫升甘露醇、毫克/毫升花楸醇、10毫克/毫升蔗糖、〇〇1%聚花楸酸酿80、20 mM NaCl，以一般性緩衝劑（10 磷酸鹽、10 _ 擰檬酸鹽）為基礎之1D4.7調配物之安定性。進行SEC、DLS及粒子計數，以監測蛋白質安定性，且粒子計數係利用具有1_2〇〇微米度量範圍之粒子計數系統（例如粒子 a十數器注射器型，Markus Klotz GmbH，Bad Liebenzell， Germany)進行。實驗細節如下： -將經調配在水中之1D4.7與上文列示之調配物比較 - 應用4次冷凍/解凍循環 -30毫升PETG容器，約25毫升充填，2毫克/毫升，pH 6 - 在TO、T1 (意即一個f/t步驟之後）、Τ2、T3及T4下取樣 - 分析：目視檢查、SEC、DLS、亞可見粒子度量圖21顯示在重複f/t循環（_80〇c /25。〇）期間之m4 7安定性，藉由>1微米之亞可見粒子之形成反映出。1D4.7係被調配在一般性緩衝劑（10 mM檸檬酸鹽、1〇 mM磷酸鹽）中，然後測試下列賦形劑變異：花楸醇（10毫克/毫升）、甘露醇（1〇毫克 /毫升）、蔗糖（10毫克/毫升）、NaCl (100 mM)及聚花楸酸酯80 (0.01%)。1D4/7亦被經調配在水中（藉由滲析），完全未添加賦形劑。亦使注射用水接受f/t循環與亞可見粒子測試，以 136383 -144- 200938221 評估物質處理、f/t及試樣抽取對於粒子負載之可能衝擊。於_經調配在水中之1D4.7安定性係超過以典型上使用於蛋白㈣配物中之賦形劑所調配之购溶液安定丨已知甘路醇、絲及4楸醇係充作;東乾保護劑及/或低溫保護劑’且聚花楸酸賴為普遍地已知會在個別曝露至疏水性-親水性界面譬如空氣_水與冰_水時增加蛋白質之物理安定性之非離子性賦形劑。 ❹

當以所應用之其他操作法（例如SEC、目錄查等）分析時，經調配在水中之104.7溶液係顯示為安定的。實例16:低-離子性13CS.5抗體溶液之冷凍/解凍安定性已証實經調配在水中之^^乃抗^蛋白質於2毫克7毫升濃度，pH6下，在重複冷凍/解凍處理（8(rc/25<>CAs^j 間為安定的。將數據與例行調配物（2毫克/毫升，pH 6)比較，並發現經調配在水中之13C5.5安定性係超過經調配在例行性地經篩濾緩衝系統（例如2〇 ^組胺酸、2〇 ^甘胺酸、 10 mM填酸鹽、1〇 mM檸檬酸鹽）中之13C5.5安定性，且甚至超過具有多種常用於蛋白質調配物中之賦形劑（例如1〇毫克/毫升甘露醇、10毫克/毫升花楸醇、10毫克/毫升蔗糖、 0.01% 聚花楸酸醋 80、20 mM NaCl、200 mM NaCl)，以一般性缓衝劑（10 mM磷酸鹽、1〇 ^檸檬酸鹽）為基礎之13C5 5調配物之安定性。試樣製備、實驗處理、試樣抽取及試樣分析係以如實例 15中關於1D4.7之相同方式進行。 - 將經调配在水中之13C5.5與上文列示之調配物比較 136383 •145· 200938221 - 應用4次冷凍/解凍循環 -30毫升PETG容器 -2毫克/毫升，PH 6 - 在ΤΟ、ΤΙ、T2、T3及T4下取樣 - 分析：目視檢查、SEC、DLS、亞可見粒子度量圖22顯示在重複f/t循環（-801 /25°c )期間之13C5.5安定性，藉由>10微米之亞可見粒子之形成反映出。UC5.5係被調配在無論是10 mM磷酸鹽緩衝劑、1〇 mM擰檬酸鹽緩衝劑、2〇 mM甘胺酸緩衝劑及2〇 mM組胺酸緩衝劑中^ 13C5.5亦被調配在水中（藉由渗析）’完全未添加賦形劑。亦使注射用水接受仇循環與亞可見粒子測試，以評估物質處理、f/t及試樣抽取對於粒子負載之可能衝擊（空白試驗）。於f/t時經調配在水中之13C5.5安定性係超過經調配在典型上使用於蛋白質調配物之緩衝劑中之13C5 5溶液安定性。以所應用之其他分析操作法（例如SEC、目視檢查等），尚未發現經調配在水中之13C5.5溶液之不安定性。圖23顯示在重複f/t循環（_8(rc /25〇c )期間之13C5 5安定性，藉由>ι微米之亞可見粒子之形成反映出。13C55係被調配在一般性緩衝劑（10 mM檸檬酸鹽、1〇 ^磷酸鹽）中，然後測試下列賦形劑變異：花楸醇（10毫克/毫升）、甘露醇（1〇毫克 / 毫升）、嚴糖（10 毫克 / 毫升）、NaCl (200 mM)、NaCl C20 mM) 及聚花楸酸酯80 (〇.〇l%)。13C5.5亦被調配在水中（藉由滲析），完全未添加賦形劑，以供比較（純水）。亦使注射用水接受f/t循環與亞可見粒子測試，以評估物質處理、仿及試 136383 -146- 200938221 樣抽取對於粒子負載之可能衝擊。於f/t時經調配在水中之13C5.5安定性係超過以典型上使用於蛋白質調配物中之赋形劑所調配之13C5.5溶液安定性。已知甘露醇、蔗糖及花楸醇係充作凍乾保護劑及/或低溫保護劑，且聚花楸酸酯80為普遍地已知會在個別曝露至疏水性-親水性界面譬如空氣-水與冰-水時增加蛋白質之物理安定性之非離子性賦形劑。以所應用之其他分析操作法（例如SEC、目視檢查等）， Ο W 尚未發現經調配在水中之13C5.5溶液之不安定性。於f/t程序後之13C5.5溶液之DLS分析係按上述進行。在只有1個f/t步驟後，具有0.01% Tween-80之13C5.5溶液含有顯著高分子量（HMW)聚集體形式，然而在水中之13C5.5未含有 HMW聚集體形式，即使在3個f/t步驟後亦然。實例Π :溶液pH對於WFI中之阿達利母馬之衝擊進行下述實驗，以測定溶液pH對於經調配在WFI中之高 _ 度濃縮阿達利母馬之物理-化學特徵之衝擊。測試下列濃 ❹ 度：2毫克/毫升，50毫克/毫升，100毫克/毫升，150毫克/ 毫升，200毫克/毫升，及250毫克/毫升。物料 • 阿達利母馬藥物（DS)，市售物質 • 用於解凍之25°C水浴（循環） •渗遽設備：Sartorius Sartocon Slice，薄膜：PES 50 kD， 1000平方公分

•滲濾設備：MilliporeLabscaleTMTFF系統，薄膜：PLCTK 136383 •147- 200938221 30 kD，再生纖維素，大小：50平方公分

• Eppendorf 離心機 5810 R

• Amicon Ultra-15 容器，用於離心分離，Ultracel-30k，再生纖維素30,000 MWCO • Millex GV 0.22微米，Millipore，用於試樣之無菌過濾 • 試樣容器（Eppendorf試樣容器1.5毫升，Roth低溫小玻瓶5毫升，PETG瓶子125毫升）分析： • pH 度量，使用 Biothrode • 密度度量 • 渗透度度量 • UV/VIS分光光度計，供蛋白質濃度度量 • 光子相關光譜學（PCS) • 黏度度量 • 混濁度度量 •尺寸排阻層析（SEC) • Fourier變換中紅外線光譜學（FT-M-IR) 17.1關於阿達利母馬市售調配物之DF/UF製備之概論將阿達利母馬DS溶液（120毫克/毫升）區分成7個體積部份，將其個別以0.25N NaOH與0.25N HC1調整至pH3、pH4、 pH5、pH6、pH7、pH8、ρΗ9。然後，將試樣以個別pH之阿達利母馬缓衝劑稀釋至100毫克/毫升。溶液顯現出會於無菌過濾（0.22微米，PVDF無菌濾器）後消失之輕微混濁。於稀釋後，再一次監測pH值（參閱下表27)。 136383 -148- 200938221 自各溶液抽取下列100毫克/毫升溶液之試樣： • 4毫升，用於混濁度與後續f電位度量 • 1毫升，用於黏度度量（使用落球黏度計） • 0.15毫升，用於滲透度度量 • 2毫升，用於密度度量 • 0.15毫升，用於PCS (將試樣黏度納入考量’用於度量）

• 1毫升，用於FT-M-IR • 2毫升’用於黏度與靜態光散射度量〇使關於Γ電位、黏度及靜態光散射度量之試樣冷凍（_80 C )。使pH 4、pH 5、pH 6、pH 7及pH 8溶液之其餘體積接受連續模式滲濾’使用注射用水作為交換媒質。首先使試樣在-80°C下冷凍。在DF/UF前’使試樣於25°c下，在Julab〇水浴中解凍。 17·2 DF/UF與濃縮程序使在市售調配物中之阿達利母馬溶液，其具有1〇〇毫克/

φ 毫升之浪度’具有4、5、6、7及8之pH程度，接受DF/UF 處理’及進一步接受在離心機中使用UF之濃縮程序。此段落係描述pH 6阿達利母馬溶液之處理，作為一項實例。關於其他溶液之處理係以類似方式達成。使阿達利母馬溶液（100毫克/毫升，pH 6)於25。〇下，在水 >合中解凍，然後均化。接著，使溶液接受滲濾，使用注射用水作為交換媒質，以TFF設備M.p 334，藉由應用下列參數： • 攪拌器：速度2 136383 -149- 200938221 • 泵：速度1 • 壓力上游/入口： 2-2.4巴 *壓力下游/出口： 0.6-0.8巴

•薄膜：再生纖維素，截止值30 kD

• 連續模式DF/UF •在DF/UF操作期間施加約6_倍體積交換於應用6體積交換步驟後，阿達利母 ’之濃度係利用 OD280、光度計M.P. 9.7測定。檢查滲透液與留存物之滲透产。濃度：125.1毫克/毫升滲透液之滲透度：57毫滲透度/公斤留存物之滲透度：12毫滲透度/公斤將DF後在水中之阿達利母馬溶液以注射用水稀釋至ι〇〇毫克/毫升，並殺菌過濾。自DF/UF方法後之1〇〇毫克/毫升溶液抽取下列試樣： • 4毫升’用於混濁度與後續（電位度量 • 1毫升，用於黏度度量 • 0.15毫升，用於滲透度度量 • 2毫升，用於密度度量 • 0·15毫升’用於PCS (在度量期間將黏度納入考量）

• 0.15毫升，用於SEC • pH-度量

• 1毫升，用於FT-M-IR • 2毫升，用於黏度與靜態光散射度量將100毫克/毫升阿達利母馬溶液之一部份以注射用水稀 136383 -150- 200938221 釋，以產生50毫克/毫升與2毫克/毫升溶液。自兩種溶液抽取下列試樣： • 4毫升，用於混濁度與後續t電位度量 • 2毫升，用於黏度度量 • 0.15毫升，用於滲透度度量 • 2毫升，用於密度度量 • 0.15毫升’用於PCS (將黏度納入考量） • PH-度量使在水中之阿達利母馬溶液(pH 6，1〇〇毫克/毫升）接受使用離心分離之濃度實驗。離心分離係以Eppend〇rf離心機 (5810R M.P. 33.57)進行。各離心步驟均在4〇〇〇 φιη下應用，歷經15分鐘。然後，試樣溶液在離心機濃縮裝置中之均化係藉由溫和倒置旋轉進行，以使溶液均化，藉以避免在緊鄰薄膜之區域中之凝膠形成。於濃縮期間之溫度為15。〇。進行離心分離至約250毫克/毫升。濃度係利用度量〇D28〇、光 ❹ 度计M.P. 9.7測定。接著，將阿達利母馬溶液稀釋至25〇毫克 /毫升、200毫克/毫升及15〇毫克/毫升之濃度。於濃縮程序後及於稀釋之各個別步驟後，抽取下列試樣。自250毫克/毫升與15〇毫克/毫升溶液抽取之試樣體積為： • 2毫升，用於黏度_度量 • 0.15毫升，用於pCS (將黏度納入考量） • 0.15毫升，用於滲透度度量

• 0.15毫升，用於SEC 136383 -151 - 200938221 • pH-度量自200毫克/毫升溶液抽取之試樣體積為： • 4毫升’用於混濁度與後績Γ電位度量 • 1毫升’用於黏度度量 • 0.15毫升，用於滲透度度量 • 2毫升，用於密度度量 • 0.15毫升，用於PCS(將黏度納入考量） • 0.15毫升，用於sec • pH-度量 • 2毫升’用於欲在abc下進行之分析工作（黏度與靜態光散射度量）在水中之阿達利母馬溶液之濃縮處理係在各pH值下於大約250毫克/毫升下停止，因為阿達利母馬溶液在水中之黏度’於較尚濃度下，且尤其是在接近？1之pH值下（對於阿達利母馬為約pH 8.5) ’係急驟地增加（接近凝膠形成之黏度）。 173阿達利母馬溶液之目視檢查在DF/UF與濃縮至250毫克/毫升後，於不同pH下，在水中之阿達利舞馬溶液係顯示比在緩衝劑中之阿達利母馬溶液 (市售調配物）較不乳白色。所有在水中之阿達利母馬溶液均顯示如在各pH值下之透明溶液。於稀釋後，阿達利母馬溶液均未顯現出乳白色。整體而言，在濃縮與稀釋程序期間’於水中之阿達利母馬溶液内未發現沉澱作用。 17·4黏度 136383 -152- 200938221 黏度度量係在各個別濃度下進行，將pH 5阿達利母馬溶液之饴度，、，内入考量。使用落球黏度計。高於2〇〇之黏度係使用毛細管黏度計度量。圖2顿、提供在水中之阿達利母馬溶液之黏度數據概論，具有範圍為4至8之pH，於不同濃度（2毫克/毫升至25〇毫克/ 毫升於50毫克/毫升漠縮步驟中）τ。在溶液pH、濃度及黏度之間有清楚關聯性。黏度係隨著蛋白質濃度之增加而 0 增加，與溶液阳無關。在接近阿達利母馬pi之溶液pH值（意即PH7與pH8)下，於溶液黏度上之增加為最顯著，尤其是在較高蛋白質濃度（意即2〇〇毫克/毫升，25〇毫克/毫升）下。 17.5混濁度正如在圖25中所見及者，關於混濁度數據已發現相同趨勢（思即混濁度係隨著漸增濃度及隨著漸增pH而增加）。於混濁度度量前，將所有試樣殺菌過濾（〇 22微米）。 17·6流體動力學直徑(pcs) 〇 PCS度量係在各濃度下，及在各pH值下進行，將關於各試樣之黏度納入考量。度量在2〇〇毫克/毫升與25〇毫克/毫升下之溶液’但在Zetasizer nan〇系列（Malvem儀器）設備之測試參數範圍外，且因此得自此等度量之數據未經分析。在與被調配至市售調配物中之阿達利母馬（Dh約7毫微米）比較下，已發現當阿達利母馬被調配在水中時（Dh約2 毫微米’在50毫克/毫升下，pH 5)，流體動力學直徑（Dh)會顯著地降低。圖26係說明PCS數據（亦參閱表39)。相應之數據表係示於下文部份Hu中。 136383 •153- 200938221 如圖26中所示，對於在4、5及6之pH值下之溶液，阿達利母馬單體之Dh會不斷地隨著增加之蛋白質濃度而降低。對照上而言，當濃度自2毫克/毫升增加至50毫克/毫升時，具有更接近阿達利母馬pi之pH值（意即在pH 7與pH 8下）之溶液，係顯示在Dh上之相當可觀增加。但是，當在pH 7與 8溶液中濃度上升超過50毫克/毫升時，Dh係降低。在150 毫克/毫升之濃度下，所有溶液均具有比在2毫克/毫升下之相應pH溶液較低之Dh值。圖27顯示關於不同濃度之pH 5溶液之Dh大小分佈。圖28顯示關於被調配在水中之五種阿達利母馬溶液之Dh大小分佈，各具有100毫克/毫升蛋白質濃度與不同pH值。圖29顯示類似圖28中數據之數據，惟該五種阿達利母馬溶液係被調配在緩衝劑中。 17.7 pH-度量於使用水之DF/UF前後，溶液pH之度量係在100毫克/毫升下進行（意即個別在經調配於緩衝劑與水中之阿達利母馬上進行）。表27係顯示其結果。於DF/UF前後，pH值係保持恒定在pH 5、pH 6及pH 7下。溶液pH不會因為媒質改變而改變。於使用水之DF/UF後，在pH 4下之pH值會稍微地增加，而在pH 8下會猶微地降低。表27 :於使用水之DF/UF前後之pH值 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 在緩衝劑中之阿達利母馬100毫克/毫升 4.00 4.99 6.00. 7.03 8.00 在水中之阿達利母馬100毫克/毫升 4.29 4.98 5.98 7.02 7.67 17.8滲透度度量 136383 -154- 200938221 於pH 5溶液試樣之DF/UF期間，溶液滲透度係在各體積交換步驟後（意即在100毫升滲透液、200毫升滲透液等之後）度量，以檢查5倍體積交換是否足以降低滲透度至低於15 毫滲透度/公斤之值。表28係顯示其結果。表28 :在使用水之DF/UF期間之滲透度改變，pH 5溶液體積交換步驟，留存物滲透液以毫升表示毫滲透度/公斤毫滲透度/公斤 100 96 166 200 28 115 300 29 89 400 12 67 500 15 49 於pH 4、pH 6、pH 7及pH 8下，滲透度僅在DF/UF方法結束時度量。表29顯示各pH之滲透度結果（以毫滲透度/公斤單位表示）。表29 :在使用水之DF/UF前後之不同pH值下之滲透度 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 在緩衝劑中之阿達利母馬100毫克/毫升 287 298 297 286 279 在水中之阿達利母馬100毫克/毫升 40 13 11 5 5 滲透度度量係以凝固點黏度計進行。 17.9 斷裂（SEC) SEC數據顯示在pH 4溶液中之蛋白質之相對顯著斷裂，涵蓋全部濃度範圍（100-?50毫克/毫升），然而在範圍為5至8之 pH下，涵蓋相同濃度範圍，幾乎未檢出斷裂。因此，pH 4 溶液之單體含量係據此減少（圖30)。已發現聚集值會隨著漸增pH值（自pH 4至pH 8)而增加，與濃度無關（圖31)。 136383 -155- 200938221 17.10結論此實驗係經設計，以檢驗溶液pH與蛋白質濃度對於藉由 DF/UF處理經調配在水中之阿達利母馬溶液之黏度與Dh (流體動力學直徑）之衝擊。此種溶液係被稱為低_離子性溶液。4-8之pH值範圍係經評估，且所測試之蛋白質濃度係在 2與250毫克/毫升間之範圍内。關於黏度（段落17.4)，已發現低-離子性阿達利母馬溶液 ^ 具有如於離子（意即離子性賦形劑，譬如有機緩衝劑成份或鹽）存在下經調配之阿達利母馬溶液之相同特徵： -蛋白質濃度愈高，溶液黏度愈高。此濃度-黏度關聯性對於具有接近阿達利母馬抖之阳值（意即pH 7與阳幻之溶液係為較顯著。反之，對於在恒定濃度下之溶液，黏度係與溶液pH值之接近阿達利母馬洱有關聯。關於DLS數據（段落17.6)，可得出下述結論： •已發現藉由低離子性阿達利母馬溶液之DLS所測得〇 ^阿達利母馬Dh值，係低於㈣料馬市f靠物中所度畺之Dh值，尤其是在極低溶液pH下。 •溶液阳愈低，藉由DLS所測得之阢值愈低。 '蛋白f濃度愈高’在特定PH之低-離子性阿達利母馬溶液中之Dh值愈低。關於此行為之解料在蛋白f溶液中之料強度（意即離子與可離子化賦形劑之存在）對於蛋白質蛋白質交互作排度係具決疋性。尤其是在較低溶液PH下，電荷電荷排斥在低離子性阿達利母馬溶液中係㈣著。當蛋白質在 136383 -156- 200938221 DF/UF處理中利用水作為交換媒質被調配在水中時，可組成 Helmholtz層與Gouy-Chapman層兩者之所存在可離子化抗衡離子之量係顯著地被降低。因此，分子間電荷-電荷交互作用 (由於存在於蛋白質表面上之胺基酸殘基之電荷所致}可比在其中可離子化抗衡離子（例如可離子化賦形劑）為很多之環境中更顯著，且在蛋白質單體間之電荷-電荷排斥（在電荷-電荷排斥之情況下會導致分子運動）與隨機布朗運動係有助於藉由DLS所度量蛋白質分子之移動性/運動。在DLS ^ 實驗中，較大分子移動性係被轉化成較大分子擴散係數，其係通常經由使用史托克斯-愛因斯坦方程式而被指定至具有較小流體動力學大小之分子。這可解釋蛋白質之流體動力學直徑為何在低-離子性調配物中被降低。在抗體分子間之電荷-電荷交互作用可為排斥性（在較低溶液pH下）與吸引性（在接近蛋白質pi之較高溶液PH下）。 17.11數據表表30 : 在DF前於緩衝劑中之阿達利母馬1〇〇毫克/毫升對水 pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 混濁度(NTU) 9.9 15.4 28.5 36.3 45.0 48.4 46.5 黏度(mPa〃s) 2.5197 2.7935 3.2062 3.1512 3.5116 3.5494 3.5844 黏度(平方毫米/秒） 2.4366 2.6991 3.0969 3.0444 3.3893 3.4261 3.4589 密度(克/立方公分） 1.0341 1.0350 1.0353 1.0351 1.0361 1.0360 1.0363 滲透度(毫滲透度/公斤） 293 287 298 297 286 279 285 Z_Ave d (毫微米）PCS 4.3 4.3 6.0 7.3 7.7 8.0 7.8 pH 4.00 4.99 6.00 7.03 8.00 9.03 136383 -157- 200938221 表31 : 在DF後之阿達利母馬對水，在濃縮，以水稀釋至以下之前混濁度(NTU) 黏度(mPa*s) Ο 〇 pH4 2毫克/毫升 pH4 5〇毫克/毫升 0.296 PH4 3.30 黏度(平方毫米/秒) 密度(克/立方公分）

4.29 滲透度(毫滲透度/公斤) Z-Aved (毫微米）PCS 3.37

在浪縮严以水稀釋至以下後之阿遠南丨件啊滲透度(毫滲透度/公斤) Z-Ave d (毫微米）PCS

ρΗ5 2毫克/毫升混濁度(Ντυ) 0.02 ρΗ5 5〇毫克/毫升 1.66 黏度(mPa*s) f度(平方毫米/秒） | 1.0576 密度(克/立方公分）滲透度(毫滲透度/公斤） Z-Ave d (毫微米)pcs PH~ pH5 97.5毫克/毫升 3.54 1.0563 1.6664 2.8661

136383 -158- 200938221 在濃縮及以稀釋至以下後之阿達利母馬 ρΗ5 150.7毫克/毫升 ρΗ5 200.2毫克/毫升 ρΗ5 253.0毫克/亳升混濁度(NTU) 7.24 黏度(mPa*s) 7.0866 19.539 79.272 黏度(平方毫米/秒） 6.8102 18.525 74.26 ^ 密度(克/立方公分） 1.0406 1.0547 1.0675 滲透度(毫滲透度/公斤） 78 -------- 80 -------_ 96 Z-Ave d (毫微米）pcs 0.727 0.335 0.255 —'~~' 5.03 — ~ΐ〇5 ' 1^08~~ ~~~~·

表32 :

在DF後之阿達利母f對水，在浪縮，以 pH6 2毫克/毫升 pH6 5〇毫克/毫升黏度(mPa*s) 黏度(平方毫米/秒）密度(克/立方公分）—0.9989 ϋίϊ滲透度/公^

混濁度(NTU) 0.458 1.0696 1.0708 2.24 ρΗ6 1〇0毫_升 2.95 - Z-Aved (毫微米）pcs

表33 : pH6 146.6毫克/毫升 201.8蒡吞 / 混濁度(NTU) 9.29 ~~s· 1Ϊ352 黏度(mPa*s) ^0193 ~ 黏度(平方毫米/秒） 8.6775 ' 30 709 〜、~~~~ 密度(克/立方公分） 1.0394 ^ 05λ5"— 滲透度(毫滲透度/公斤） 37 — ~5S ^- Z- Ave d (毫微米）pCs 0.989 0.355 pH — — 5.92 6.05^^^

pH6 126.0? 118.〇f T〇677~ 95 0.108 6.03 136383 -159- 200938221 Ο Ο 表34 : 在DF後之阿達利母馬對水，在濃縮，以水稀釋^ pH7 2毫克/毫升 ΐτ—— 50毫克/毫升 ρΗ7 103.2毫克/臺混濁度(NTU) — -- 0.1 7.13 '~~ 14.9 --- 4.2257〜^ 黏度(mPa*s) 1.1252 1.6898~~~ 黏度(平方毫米/秒） 1.1268 1 -------- 1.6688 4.1146 密度(克/立方公分） 0.9986 1.0126 1.027 、滲透度(毫滲透度/公斤） 0 ------ 2 ~~ 5〜〜- Z-Aved (毫微米）PCS 3.31 -_ 4.16 2.89 ' pH 6.63 6.93 7.02 — 表35 : 在/農縮及以水稀釋至以下後之阿達利母$ -— pH7 143.0毫克/毫升 ρΗ7 203.4毫克/毫升 ρΗ7 251.7毫克/毫升混濁度(NTU) 19.3 黏度(mPa*s) 14.024 74.987 343.881 黏度(平方毫米/秒） 13.492 70.928 321.144 密度(克/立方公分） 1.0571 1.0708 滲透度(毫滲透度/公斤） 65 106 160 Z-Ave d (毫微米）PCS 1.27 0.346 0.0876 pH 6.9 7.01 7.2 表36 #DF後之阿達利母馬對水，在濃縮，以水稀釋至以下之前 pH8 2毫克/毫升 ρΗ8 5〇毫克/毫升 ρΗ8 96.1毫克/毫升混濁度(NTU) 0.41 12.10 28.300 黏度(mPa*s) 1.261 1.8444 4.3486 黏度(平方毫米/秒） 1.2625 1.8224 4.2368 密度(克/立方公分）毫滲透度/公斤） 5 △Aved (毫微米）pcs 5.59 5.62 4.28 pH 7.67 136383 -160- 200938221 表37 : 在濃縮及以水稀釋至以下後之阿達利母馬 pH8 148.5毫克/毫升 pH8 200.6毫克/毫升 pH8 230.7毫克/毫升混濁度(NTU) 32.5 黏度(mPa*s) 20.102 85.5 233.14 黏度(平方毫米/秒） 19.318 81.066 218.04 密度(克/立方公分）滲透度(毫滲透度/公斤） Z-Aved(毫微米）PCS 1.42 0.398 0.168 pH 7.6

表38 :

PCS數據：在緩衝劑中之阿達利母馬 Z-Ave d.毫微米 PDI Pkl d.毫微米 Pkl 面積％ Pk2 d.毫微米 Pk2 面積％ Pk3 d.毫微米 Pk3 面積％ pH 3 100毫克/毫升 4.23 0.283 4.43 86.4 54.1 13.6 0 0 pH 4 100毫克/毫升 4.3 0.101 4.81 100 0 0 0 0 pH 5 100毫克/毫升 6.01 0.065 6.5 100 0 0 0 0 pH 6 100毫克/毫升 7.25 0.063 7.82 100 0 0 0 0 pH 7 100毫克/毫升 7.64 0.094 8.53 100 0 0 0 0 pH 8 100毫克/毫升 7.95 0.099 8.88 100 0 0 0 0 pH 9 100毫克/毫升 7.7 0.133 8.98 100 0 0 0 0 表39 : PCS數據 :在水中之阿達利母馬 Z-Ave d.毫微米 PDI Pkl d.亳微米 Pkl 面積％ Pk2 d.毫微米 Pk2 面積％ Pk3 d.毫微米 Pk3 面積％ pH 4 2毫克/毫升 3.37 0.219 3.39 88.8 73.3 11.2 0 0 pH 4 50毫克/毫升 2.24 0.194 2.65 97.7 3300 2.3 0 0 pH 4 100.5毫克/毫升 1.81 0.172 2.02 97.4 3390 2.6 0 0 pH4 150.5毫克/毫升 1.32 0.181 1.64 100 0 0 0 0 pH 4 219.0毫克/毫升 0.458 0.217 4070 62 0.621 38 0 0 pH 4 251.8毫克/毫升 0.162 0.263 0 0 0 0 0 0 136383 •161 · 200938221

pH 5 2毫克/毫升 157 0.468 1.88 84.3 181 10.7 17 5 pH 5 50毫克/毫升 32.4 0.17 1.6 87.7 15.5 4.8 186 4.7 pH 5 97.4毫克/毫升 1.32 0.183 1.52 97.4 3290 2.6 0 0 pH 5 150.7毫克/毫升 0.931 0.209 1.36 98.7 3710 1.3 0 0 pH 5 200.2毫克/毫升 0.335 0.203 0 0 0 0 0 0 pH 5 253.0毫克/毫升 0.107 0.255 0 0 0 0 0 0 pH 6 2毫克/毫升 30.8 0.382 2.78 60.9 273 30.2 5070 5 pH 6 50毫克/毫升 2.78 0.247 2.68 86.4 1600 7.8 114 5.8 pH 6 100毫克/毫升 2.01 0.171 2.48 100 0 0 0 0 pH 6 146.6毫克/毫升 0.989 0.219 1.32 96.9 3770 301 0 0 pH 6 201.8毫克/毫升 0.355 0.231 0 0 0 0 0 0 pH 6 248.5毫克/毫升 0.108 0.301 0 0 0 0 0 0 pH 7 2毫克/毫升 3.31 0.211 3.58 93.9 1250 6.1 0 0 pH 7 50毫克/毫升 4.16 0.132 4.84 100 0 0 0 0 pH 7 103.2毫克/毫升 2.89 0.141 3.39 100 0 0 0 0 pH 7 143.3毫克/毫升 1.27 0.212 1.68 100 0 0 0 0 pH 7 203.4毫克/毫升 0.346 0.306 0 0 0 0 0 0 pH 7 251.7毫克/毫升 0.0876 0.497 0 0 0 0 0 0 pH 8 2毫克/毫升 5.59 0.365 3.15 67.4 244 30.2 26.5 2.4 pH 8 50毫克/毫升 5.62 0.174 7 100 0 0 0 0 pH 8 96.1毫克/毫升 4.28 0.192 4.81 96.9 3640 3.1 0 0 pH 8 148.5毫克/毫升 1.43 0.253 1.68 93.9 2910 6.1 0 0 pH 8 200.6毫克/毫升 0.398 0.246 4920 100 0 0 0 0 pH 8 230.7毫克/毫升 0.168 0.3 0 0 0 0 0 0 表40 : SEC數據 pH 濃度毫克/毫升 %聚集體 %單體 %片段面積(mVs) 4 100 0.28 67.95 31.76 45195.348 4 150 0.26 66.07 33.68 44492.803 4 200 0.30 64.59 35.11 52558.050 4 250 0.29 64.40 35.31 48491.299 5 100 1.46 98.44 0.11 48127.249 5 150 1.33 98.56 0.11 43226.397 136383 -162- 200938221 5 200 1.39 98.50 0.11 43634.282 5 250 1.38 98.52 0.11 41643.062 6 100 2.00 97.90 0.10 44338.373 6 150 2.52 97.37 0.11 41899.182 6 200 2.52 97.37 0.11 43869.183 6 250 2.39 97.50 0.11 34969.456 7 100 2.78 97.12 0.10 46194.824 7 150 4.24 95.65 0.11 47443.014 7 200 3.61 96.29 0.10 41916.220 7 250 3.39 96.50 0.11 38185.208 8 100 3.24 96.65 0.12 42334.491 8 150 3.64 96.18 0.18 40305.890 8 200 3.63 96.25 0.13 40280.342 8 250 3.76 96.05 0.19 32067.297 實例18: pH對於J695黏度之衝擊

黏度數據係對J695在使用水作為交換媒質之DF/UF處理後產生。使J695 DS (參閱實例1)對著水滲濾，應用至少5個 DF/UF步驟。然後，黏度係在不同溫度下，使用平板-平板黏度計，100 rpm剪切速率，150微米間隙，60毫米板直徑（設備·· Bohlin Geminim 黏度計（Malvern 儀器 Southborough, MA)，評〇估之溫度範圍8-25°C )測定。正如在圖32中所見及者，個別在179毫克/毫升與192毫克 /毫升之濃度下，J695溶液黏度在12°C下係低於70 cP，在20 °C下低於40 cP，及在25°C下低於30 cP。實例19 :在純水中之抗體之藥物動力學（PK) 此項研究之目標係為評估調配物參數（意即含有水之低離子性蛋白質調配物對使用離子性賦形劑譬如緩衝劑與鹽之習用蛋白質調配物）對於皮下（s.c)服用阿非利莫馬 136383 -163- 200938221 (Afelimomab)後之局部耐藥性與PK之可能衝擊。此外，調配物之系統毒性與毒性動力學數據係經研究。所使用之蛋白質濃度範圍為50毫克/毫升至200毫克/毫升，且離子強度範圍為3 mOsm/公斤至300 mOsm/公斤。單一（s.c)劑量可行性研究係在雄性史泊格多利 (Sprague-Dawley)大白鼠中，以阿非利莫馬（Afelimomab)(MAK195F-老鼠抗人類TNF F(ab')2 (Abbott實驗室））進行，以在皮下投予 50與200毫克/公斤下之液體調配物後之大白鼠中評估阿非利莫馬（Afelimomab)之局部财藥性與毒性。單一皮下劑量係接著為觀察/恢復期。進行有限血液取樣，以度量循環之阿非利莫馬含量，且評估吸收與半生期。所投予之劑量體積為1毫升/公斤體重。實驗組包括下列：實驗組 01 對照組（媒劑） 02 50毫克/毫升阿非利莫馬，液體，標準調配物 07 200毫克/毫升阿非利莫馬，液體，LOS-調配物組群A 觀察期2天組群B 觀察期7天組群C 觀察期14天分類與大白鼠確認（每組N=l) 組群動物數目組群A 組群B 組群C 01 1 2 3 02 4 5 6 07 19 20 21 136383 -164- 200938221 在第1天’於投藥過後15分鐘、1，3, 5及24小時下，及然後每日至少一次重複觀察動物關於臨床跡象與死亡率。體重係在服藥（第1天）與檢驗屍體（個別在第3、15或21天）之曰子及每週兩次度量’若可應用時。供藥物分析之血液試樣係在第1天（投藥過後4小時），以及在第2、3、5、8及15 天收集’按可應用情況而定。於檢驗屍體之前，收集血液，並評估血液學與臨床化學參數。於檢驗屍體之前，製備每 ❹ 隻動物之血液塗片。在檢驗屍體時’進行體腔之大體檢杳。器官重量度量係在肝臟、腎臟、胸腺、脾臟及淋巴節上進行。初步組織病理學係在注射位置上，以及在肝臟、腎臟、胸腺、脾臟及淋巴節上進行。全部動物均存活於研究中’直到預定之檢驗屍體為止。被投予水調配物之大白鼠於第14至15天顯示在頸區域中之結硬疤。未發現對於體重之試驗項目相關之作用。血液學與臨床化學值為可改變。無明顯地試驗項目相關之改變在 ❹ 血液學或臨床化學中被確認。在尿分析法中未發現試驗項目相關之改變。器官重量之度量會造成器官重量中之高變異性，及無明顯地試驗項目相關之改變。於總體觀察時，在注射區域上之皮下組織紅腫係於第3 天，在接受水調配物之大白鼠中發現。所有其他改變均歸屬於此品種與年齡之史泊格多利（Sprague-Dawley)大白鼠中一般所見及之自然發現之範圍。微觀發現如下述： • 在組群01、02中沒有發現 136383 -165- 200938221 •在組群〇7中之最低擴散皮下發炎 • 在組群07中，關於總病理學，與紅腫有關聯之病灶皮下出血（第3天），被認為是投藥相關 • 泛-T、抑制劑/細胞毒性τ細胞/天然殺傷細胞、泛-B 細胞及泛-巨噬細胞標記物對於局部反應之初步免疫組織化學結果主要顯示巨噬細胞與天然殺傷細胞涉及皮下發炎/浸潤。因此，至目前為止，對於所使 ❹ 用調配物之局部致免疫回應沒有暗示。所有其他改變均歸屬於此品種與年齡之史泊格多利 (Sprague-Dawley)大白鼠中一般所見及之自然發現之範圍。在皮下投予阿非利莫馬（Afelimomab)之後，吸收顯示為快速，其中於注射後0.2-3天達到最高血清含量。在所測試全部試樣中，阿非利莫馬（Afelimonmb)之絕對含量很低。於試樣之間發現大變異性，可能是因有限取樣頻率與所使用之低動物數。在大部份試樣中，於5_8天後，無阿非利莫馬〇 (Afelimomab)可在血清中檢出。於血清含量上之此降低可能是由於_，)2之高清除率所致。關於大部份試樣所發現之 T1/2係在K天之範圍内，與先前觀察一致。低_離子性調配物之較長半生期（7.8天）可反映話、样+ ;J夂映忒樣之延長吸收。數據係於表41與42中提出。 136383 200938221 表41 : MAK195F之血漿曝露含量 Ο LLOQ=低於定量極限 200亳克/公斤水調配物

度(微克/毫升）平均 (微克/毫升） STD 大白鼠20 J------ 大白鼠21 3.01 3.17 2.48 1.05 1.57 1.53 1.09 0.80 1.54 1.56 1.55 0.02 0.64 0.66 0.65 0.02 0.40 0.37 0.38 0.02 0.25 0.25 0.00 50毫克/公斤液體標準調配物

時間(天）濃度(微克/毫升）大白鼠4大白鼠5大白鼠6 平均 (微克/毫升) 0.167 1.40 1.17 U8 1.32 2 °'76 °·97 0.66 0.80 3 045 〇·67 0.47 0.53 5 lloq lloq LLOQ 8 15 lloq lloq _______ lloq LLOQ LLOQ STD — 一 0.13 0.16 0.12 關於液體沒有聚集狀態發現，既非阿非利莫馬亦非對照組物質。

、對於低、離子強度調配物，發現最低擴散皮下注射位置發 : 炎無論疋表低至輕微，或輕微至中等，係被發現伴隨著増加之蛋白質濃度（個別為50毫克/毫升與200毫克/ 毫升）。發現—些局部皮下出血，與總病理學上之紅腫有關聯，此係被認為是在注射期間血·管穿刺之結果。關於水調配物在第3天發現於注射位置上之一些皮下紅腫，但不被認為是有害。整體而言，該調配物於局部上為容許的。在下表42中，提出習用液體調配物對水調配物之ρΚ數 136383 -167- 200938221 據。表42 :在不同調配物中，於皮下服藥後之MAK 195F之藥物動力學參數劑量 (毫克/ 公斤）調配物半生期 (天） Tmax (天） Cmax (微克/ 毫升） AUC (天*微克/ 毫升）平均滯留時間 (天）最後可偵測濃度之時間(天）最後可偵測之濃度 (微克/毫升） 50 液體 0.5 0.2 1.32 3.3 1.5 3 0.53 200 水調配物 5.9 0.2 2.48 11.8 7.5 15 0.25 以低離子性調配物（意即經調配在水中之阿非利莫馬 © (Afelimomab))見及可偵測血清含量於延續時間上之增加，如在表42中所見及者。於此項研究中，在低離子性溶液（水）中之MAK195F之所發現絕對含量係提供較佳曝露、較長可偵測血清含量及” 半生期”，勝過在習用MAK 195F液體調配物中。阿非利莫馬半生期於標準調配物中係在1-2天之範圍内，與關於F(ab')2分子之先前觀察一致。但是，關於低-離子性調配物發現表面上較長半生期（7.8天）。因此，與所測試 ® 之標準調配物比較，在此調配物中之MAK 195F之平均滯留時間顯示為較長。

實例 20 : 2.5(E)mgl (抗 IL-18 抗體）之 DF/UF 進行2.5(E)mgl整體溶液（59.6毫克/毫升）之滲濾/超過濾 (連續模式），應用約4-倍體積交換，使用注射用水（於下文中稱為”水"）。DF/UF操作係藉由監測留存物之混濁度、蛋白質濃度（OD280)、pH及溶質度與DLS度量而加以控制。在 DF/Uf期間，滲透液溶質度亦經監測，以控制2.5(E)mgl整體 136383 -168- 200938221 溶液之賦形劑降低。物料與方法 -2.5(E)mgl整體藥物（甲硫胺酸、組胺酸、不含聚花楸酸酉旨 80) (Abbott Bioresearch Center, Worcester MA):具有總共 589.12 克溶液之2個PETG瓶，溶液濃度59.6毫克/毫升。 -Ampuwa (注射用水）（Fresenius 醫療照顧，Waltham, MA)。 -Millipore 實驗室規模 TFF DF/UF 單元，包括 2 X Pellicon XL 過濾卡匣，Millipore，PLCTK 30 kDa薄膜，再生纖維素〇 W - UV/VIS分光光度計，Specord 50，使用280毫微米波長 -Metrohm pH計，類型744，具有Biotrode探測物編號57 -滲透壓計：Knauer，K-7400 -密度度量，使用Paar之設備，DMA 4100 -層狀空氣流動箱Hereaus -混濁度度量：Hach，2100AN _ 黏度計：Paar，AMVn -規模：Mettler Toledo、AT261 及 33.45 ❹ -濾器：MiU'ex AP 20 (玻璃纖維）與Minisart高流動性濾器（纖維素醋酸酯），0.20微米孔隙大小。 20.1實驗程序 2.5(E)mgl DS試樣之解凍：使含有冷凍DS之2升PETG瓶於 23°C下，使用循環水浴，在2小時内解凍。經解凍之DS為透明、微乳白色及不含可見粒子。 DS藉由DF/UF之濃縮：由於530毫升之DF/UF單元儲器體積限制’故使2.5(E)mgl DS濃縮至最後體積為525毫升。 136383 -169- 200938221 使用水之DF/UF (緩衝劑交換）：使DS (甲硫胺酸、組胺酸、 2.5(E)mgl)接受DF/UF，應用4-倍體積交換。表43係給予在整個實驗中使用之水量，而表44係提供實驗參數。表43 : DF/UF水體積交換體積交換所使用水之體積 (累積） 1-倍 576毫升 2-倍 1152毫升 3-倍 1728毫升 4-倍(實驗結束） 2304毫升表44 : DF/UF程序參數實驗室規模TFFDF 設定泵送速度 1.5-2 泵送壓力 20-30 psi 攪拌速度〜3 實驗延續時間 8小時滲透液之溶質度度量係在所處理之約每200毫升滲透液下進行。 © 在對著水之DF/UF後，2.5(E)mgl溶液之體積為450毫升，且蛋白質濃度為76.6毫克/毫升。然後，使含有基本上溶解於水中之2.5(E)mgl之此溶液濃縮。表45 :關於溶液濃縮之DF/UF製程參數實驗室規模TFFUF 設定泵送速度 1.5-2 泵送壓力最大30 psi 攪拌速度 ~3 實驗延續時間 51分鐘溶液之最後重量： 257.83 克 136383 •170- 200938221 使經濃縮之溶液（~130毫克/毫升）接受0.2微米過濾。使溶液冷卻至2-8°C，然後儲存於-80°C下。 20.2在2.5(E)mgl之DF/UF期間所收集之數據表46 :進行中對照組數據 DF步驟體積 [毫升] 時間溫度溶液/ 室溫[°C] 混濁度 [NTU] PH 滲透度 [毫滲透度/ 公斤] 濃度 [毫克/ 毫升] 2.5(E)mgl 14.5 5.91 150 59.6 01 0 08:00 19.0/24.1 N/A 5.91 125 65.2 1 575 10:02 24.4/24.4 10.1 5.92 50 70.1 2 1150 11:50 24.3/24.7 6.67 5.94 16 72.8 3 1730 13:50 25.0/24.8 6.55 5.97 6 74.6 約4 2200 15:35 25.8/25.5 10.1 5.97 5 76.7

表47 :滲透液之滲透度（在處理期間分級分離與度量）試樣編號時間溫度溶液/ 室溫[°C] 滲透液 [毫升] 累積滲透液 [毫升] DF/UF 步驟之數目滲透度 [毫滲透度/ 公斤] 03 07:35 N/A 90 N/A N/A 125 1 08:00 19.0/24.1 200 200 0.3 124 2 08:50 23.0/24.1 200 400 0.7 82 3 09:27 24.0/24.2 200 600 1.0 53 4 10:12 24.4/24.4 200 800 1.4 37 5 10:50 24.5/24.3 200 1000 1.7 25 6 11:25 24.6/24.3 200 1200 2.1 16 7 12:10 24.7/24.3 230 1430 2.5 7 8 12:55 24.7/24.4 170 1600 2.8 4 9 13:25 24.8/24.4 200 1800 3.1 2 10 14:15 25.1/24.8 200 2000 3.5 0 11 14:55 25.8/25.5 200 2200 3.8 1 136383 -171 - 200938221 表48 :在緩衝劑交換後之2.5(E)mgl溶液之濃度時間溶液溫度 rci 在儲器中之體積 (意即留存物)[毫升] pH 15:54 25.9 450 5.94 16:02 26.1 400 5.96 16:07 26.1 375 5.96 16:20 26.2 350 5.96 16:28 26.3 300 5.98 16:35 26.5 275 5.98 16:45 26.5 250 5.99 0 表49:經濃縮2.5(E)mgl溶液（0.2微米過濾前後）之分析特徵鑒定：參數批料在過濾前在過濾後混濁度[NTU] 15.4 9.58 滲透度[毫滲透度/公斤] 6 N/A 密度[克/毫升] 1.0346 N/A PH 5.99 N/A 動態黏度(25°C) [mPas] N/A 7.9998 表50 :在DF/UF期間之動態光散射數據（存在於溶液中之所

有試樣之單體Dh與Dh=Dh之z-平均值之測定） DLS數據試樣抽取 DV 1-倍 DV 2-倍 DV 3-倍 DV 4-倍在濃縮後在過濾後吸收峰1 4.32 3.68 3.54 3.48 2.03 2.13 直徑單體 100.0 100.0 100.0 89.6 87.0 100.0 強度[%] 3.95 3.28 3.20 3.53 2.12 1.89 Z-平均[毫微米]Pdl 0.077 0.106 0.094 0.245 0.287 0.113 吸收峰2 直徑[毫微米] N/A N/A N/A 984 411 N/A 強度[%] 10.4 11.8 吸收峰3 直徑[毫微米] N/A N/A N/A N/A 4260 N/A 強度[%] 1.2 136383 -172- 200938221 2〇·3討論實驗証實2.5(E)mgl (在甲硫胺酸、組胺酸中經緩衝）可基本上於較高濃度下被調配在水中（於130毫克/毫升下未發現溶解度限制）。使用水3次體積交換後，滲透液與留存物之滲透度係低於10毫滲透度/公斤，証實緩衝劑賦形劑已被有效地降低。2.5(E)mgl溶液之乳白色係在使用水之DF/UF期間被降低（最適宜外觀），亦藉由DS起始溶液14.5、3-倍體積〇交換之後6.55、4-倍體積交換之後10.5之降低混濁度值（濁度測定混濁度單位（NTU)反映出。如以其他抗體所見及，當藉DLS測定時，流體動力學直徑係降低，此係由於賦形劑降低所致（分子間電荷_電荷排斥增加至隨機布朗運動，而造成較高分子移動性，係轉化成所計算之較低Dh值）。2 5(E)mgl溶液之pH值基本上係與 DF/UF操作之前（PH 5.94)與之後(PH 5.99)相同。如藉由DLS監測所証實，2.5(E)mgl在DF/UF操作期間仍然〇保持安定。未檢出在高分子量試樣上之實質增加。實例21:經調配在水中之阿達利母馬之製備及其安定性研究下述實例係描述包含源自上文實例中所述方法之阿達利母馬之調配物安定性，意即阿達利母馬係成功地被渗析至水中。物料與方法使3323.6克阿達利母馬溶液（71·3毫克/毫升）使用純水渗濾ί、’屯尺7倍體積交換後（理論賦形劑降低，99 9%)，將蛋白質命液個別稀釋/超過滤至22〇與63毫克/毫升之最後 136383 -173- 200938221 標的濃度。進行PH、滲透度、黏度、導電率、PCS、目視檢查及蛋白質濃度度量（OD280)，以監測DF/UF處理後之蛋白質狀態。於DF/UF處理後，將蛋白質溶液殺菌過濾（0.22微米 Millipak-60與Millipak-200薄膜滤器），並接著填入裝有27.5G RNS 針頭與無菌 BD HyPak BSCF 4432/50 塞子之 BD HyPak SCFTM 1毫升長注射器中。充填體積為每注射器約0.825毫升。於充填後，將注射器個別儲存於2-8°C、25°C及40°C下，並按下文描述之試樣抽取綱要中所指示進行分析。阿達利母馬藥物（阿達利母馬消光係數280毫微米： 1.39毫升/毫克公分）：藥物未含有聚花楸酸酯80。DS 缓衝劑，pH 5.38。

Sortorius Sartocon Slice 滲渡系統，裝有 Ultrasert PES 薄膜卡匣（50 kDa與30 kDa截止值）。Sartocon Slice系統係根據Sartorius操作說明書，於環境溫度下，以連續模式操作。 pH電極

PerkinElmer UV可見分光光度計，λ35，係用於蛋白質濃度度量（280毫微米波長）。用後即棄UV比色杯，1.5 毫升，半微量分析，聚（甲基丙烯酸曱酯）（ΡΜΜΑ)，係用於濃度度量。經滅菌之注射用水歐洲藥典/美國藥典係作為DF/UF 媒質使用。 136383 -174- 200938221

Vogel滲透壓計OM815係用於滲透度度量（以400毫滲透度/公斤NaCl校準溶液校準，物件編號Y1241，Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany)。

Anton Paar微黏度計，類型AWVn，係根據Anton Paar操作說明書，用於蛋白質溶液之黏度評估。黏度係於 20°C下評估。 _ InoLab Cond Level2 WTW裝置係用於經正規化至25°C之導電率度量。 _ Malvern儀器Zetasizer nano ZS係應用標準方法，用於測定Z-平均值。度量係於25°C下，使用藉由落球黏度測定法（Anton Paar微黏度計，類型AWVn，於25 °C下）所獲得之黏度數據進行。 HPLC方法阿達利母馬，SEC分析：交聯葡聚糖（Sephadex) 200管柱（Pharmacia目錄編號175175-01)。流動相20 mM磷酸鈉， 150 mM氣化鈉，pH 7.5，0.5毫升/分鐘流率，環境溫度，偵測UV 214毫微米與280毫微米。將各試樣以 Milli-Q水稀釋至1.0毫克/毫升，注射試樣裝填量50微克（重複注射）。阿達利母馬，IEC 分析：Dionex，Propac WCX-10 管柱（p/n 054993)，伴隨著相應之防護管柱（p/n 054994)。分離條件：流動相A : 10 mM磷酸鈉，pH 7·5 ;流動相B 10 mM 磷酸鈉，500 mM氣化鈉，pH 5.5。1.0毫升/分鐘流率，環境溫度。將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/毫 136383 -175- 200938221 升，注射試樣裝填量100微克，重複注射。蛋白質濃度之計算計算式： E = -lg ί 0 , Ε =ε. c, d —> c 二- Wo J £Xd ε - 吸收係數 c - 濃度 d - 光線必須通過之比色杯長度 Ε - 吸光率 I〇 - 最初光強度 I - ε阿達利母馬= 通過試樣後之光強度 1.39 -毫升 (Adalimumab)

試樣抽取綱要將所製成溶液之試樣儲存於下文列示之溫度下，並在研究開始之後，於所指示之時間點下抽取⑴。

溫度 TO 1 m 3 m 5°C - X X 25〇C X X X 40°C - X X 試驗參數試驗方法可見粒子類似DAC (EA4.43) 亞可見粒子類似歐洲藥典/美國藥典EA 4.44 混濁度類似歐洲藥典(EA 4.42) 顏色(目視）歐洲藥典(EA 4.50) pH 歐洲藥典(EA 4.24) 尺寸排阻HPLC 描述於上述内文中陽離子交換HPLC 描述於上述内文中 136383 -176- 200938221 阿達利母馬之DFnJF處理表51係描述滲濾後之阿達利母馬特徵。表51 試樣蛋白質濃度 [毫克/毫升] pH 滲透度 [毫滲透度/ 公斤] 黏度 [cP] 目視檢查導電率 [IUS/ 公分] PCS [Z-平均/ d.毫微米] 兩濃度 220 5.57 26 27.9 微乳白色，基本上不含可見粒子 1167 0.34 低濃度 63 5.44 5 1.8 微乳白色，基本上不含可見粒子 522 1.85 在不同溫度程度下，於儲存時之阿達利母馬特徵鑒定，包括透明性與乳白色、液體之顯色程度、SEC，係描述於附錄D中。、结論上文實例係提供滲濾/超過濾（DF/UF)實驗，其中水（經滅菌之注射用水歐洲藥典/美國藥典）係作為單株抗體阿達利母馬之滲濾媒質使用。使阿達利母馬接受DF/UF處理，利用純水作為DF/UF交換媒質，並在pH 5.57下，於高濃度（220毫克/毫升）下，及在pH 5.44下，於較低濃度（63毫克/毫升）下調配，而不會引致溶液混濁、嚴重乳白色或混濁度形成。將得自DF/UF實驗之阿達利母馬在2-8°C、25°C及40°C下，於SCF注射器中儲存3個月。所獲得之數據係指向蛋白質之有利整體安定性。總而言之，使用純水作為DF/UF交換媒質處理與調配蛋白 136383 -177- 200938221 質係為可行。假定理想100%賦形劑薄膜滲透性，約99.9%最高賦形劑降低可經估計。實例22 :使用非離子性賦形劑之經調配在水中之阿達利母馬之安定性研究下述實例係描述調配物之安定性研究，該調配物含有抗體，意即阿達利母馬，在水中，伴隨著其他非離子性賦形劑。物料與方法

阿達利母馬物質係與實例21 (DF/UF處理）中相同。於 DF/UF處理後，蛋白質溶液係按表52中所表示經調配。甘露醇係選自糖醇類之組群，例如甘露醇、花楸醇等作為實例。蔗糖係選自糖類之組群，例如蔗糖、海藻糖、植物蜜糖、麥芽糖等作為實例。聚花楸酸酯80係選自非離子性界面活性劑之組群，例如聚花楸酸酯80、聚花楸酸酯20、普洛尼克（pluronic) F68等，作為實例。對於任何調配物，係製備〜10.7 毫升。在製備後，對任何調配物進行滲透度、黏度及PCS 度量。表52 最後蛋白質濃度甘露醇 (毫克/毫升）嚴糖(毫克/毫升）聚花楸酸酯80 (% w/w) 試樣名稱 50毫克/毫升 50 — LI50/01 50毫克/毫升一_ 80 … LI50/02 50毫克/毫升 50 — 0.01 LI50/03 50毫克/毫升一_ 80 0.01 LI50/04 50毫克/毫升 50 — 0.1 LI50/05 50毫克/毫升 80 0.1 LI50/06 136383 -178- 200938221

50毫克/毫升 0.01 LI50/07 50毫克/毫升 … --- 0.1 LI50/08 200毫克/毫升 50 — LI200/01 200毫克/毫升 … 80 … LI200/02 200毫克/毫升 50 — 0.01 LI200/03 200毫克/毫升 — 80 0.01 LI200/04 200毫克/毫升 50 … 0.1 LI200/05 200毫克/毫升 --- 80 0.1 LI200/06 200毫克/毫升 -一 0.01 LI200/07 200毫克/毫升一 0.1 LI200/08 在注射用無菌水中之聚花楸酸酯80儲備溶液0.5%與5% :以1:50比例添加（210微升對10.5毫升阿達利母馬溶液，添加210微升注射用水至經調配而未使用界面活性劑之試樣中，以確保在所有試樣中之相等蛋白質濃度）以固體形式添加甘露醇/蔗糖(個別為525毫克/840毫克）。將製劑殺菌過濾（Millex GV，Millipore，0.22微米，033毫米，物件SLGV033RS)，並接著填入裝有27.5G RNS針頭與無菌 BD HyPak BSCF 4432/50 塞子之 BD HyPak SCFTM 1 毫升長注射器申。充填體積為每注射器約0.6毫升。於充填後，將注射器個別儲存於2-8°C、25°C及40°C下，並按下文描述之試樣抽取綱要中所指示進行分析。 • 阿達利母馬藥物（阿達利母馬消光係數280毫微米： 1.39毫升/毫克公分）：藥物未含有聚花楸酸酯80。DS 緩衝劑，pH 5.38。 • pH電極 • 經滅菌之注射用水歐洲藥典/美國藥典係作為DF/UF 媒質使用。 • 甘露醇、聚花楸酸酯80及蔗糖，全部均符合歐洲藥 136383 -179- 200938221 典品質 • Vogel滲透壓計OM815係用於滲透度度量（以400毫滲透度/公斤NaCl校準溶液校準，物件編號Y1241， Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany) ° • Anton Paar微黏度計，類型AWVn，係根據Anton Paar操作說明書，用於蛋白質溶液之黏度評估。黏度係於 20°C下評估。 • Fluostar Optima，BMG Labtech (吸收度量，在 344 毫微米下，於井板中，混濁度之評估） • Malvern儀器Zetasizer nano ZS係應用標準方法，用於測定Z-平均值。度量係於25°C下，使用藉由落球黏度測定法（Anton Paar微黏度計，類型AWVn，於25°C下）所獲得之黏度數據進行。 HPLC方法 • 阿達利母馬，SEC分析：交聯葡聚糖（Sephadex) 200管柱（Pharmacia目錄編號175175-01)。流動相20 mM填酸鈉， 150 mM氣化鈉，pH 7.5，0.5毫升/分鐘流率，環境溫度，偵測UV 214毫微米與280毫微米。將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/毫升，注射試樣裝填量50微克（重複注射）。 • 阿達利母馬，IEC分析：Dionex，Propac WCX-10管柱，伴隨著相應之防護管柱。分離條件：流動相A: 10 mM 磷酸鈉，pH 7.5 ;流動相B 10 mM磷酸鈉，500 mM氣化鈉，pH5.5。1.0毫升/分鐘流率，環境溫度。將各試樣 136383 -180- 200938221 以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/毫升，注射試樣裝填量100 微克，重複注射_。試樣抽取綱要將所製成溶液之試樣儲存於5°C、25°C及40°c下，並在研究開始之後，於無論是1分鐘（5°C與40°C )下，或於T0與1分鐘（25°C )下抽取。試驗參數係根據適當方法度量，例如顏色係以目視方式測定，混濁度係在344毫微米之吸收下測定。最初調配物特徵鑒定表53係描述最初調配物滲透度與黏度。表53 批號化合物溶質度 [毫滲透度] 黏度 [mPas] LI50/01 50毫克/毫升甘露醇 309 1.9796 LI50 / 02 80毫克/毫升蔗糖 272 2.1284 LI50 / 03 50毫克/毫升甘露醇；0.01% Tween 80 307 1.9843 LI50 / 04 80毫克/毫升蔗糖；0.01% Tween 80 269 2.1194 LI50 / 05 50毫克/毫升甘露醇；0.1% Tween 80 307 1.9980 LI50 / 06 80毫克/毫升蔗糖；0.1% Tween 80 272 2.1235 LI50 / 07 0.01% Tween 80 8 1.7335 LI50 / 08 0.1% Tween 80 8 1.8162 LI200 / 01 50毫克/毫升甘露醇 396 21.395 LI 200 / 02 80毫克/毫升蔗糖 351 21.744 LI 200 / 03 50毫克/毫升甘露醇；0.01% Tween 80 387 21.233 LI200 / 04 80毫克/毫升蔗糖；0.01% Tween 80 350 21.701 LI200 / 05 50毫克/毫升甘露醇；0.1% Tween 80 387 21.592 LI200 / 06 80毫克/毫升蔗糖；0.1% Tween 80 355 21.943 LI200 / 07 0.01% Tween 80 27 21.296 LI200 / 08 0.1% Tween 80 28 21.889

136383 200938221 一種濃度之所有調配物均展現相等黏度。此等含有蔗糖之調配物係稍微較高。在與水中之高度濃縮調配物（實例 A，黏度27.9cP)比較下，高度濃縮調配物之降低黏度係藉由以聚花楸酸酯80儲備溶液或未加糖水之試樣稀釋解釋，導致在實例21中之最後濃度為~215毫克/毫升對220毫克/毫升。表54係描述關於各試樣所測得之PCS數據。表54

試樣 PCS [Z-平均/d.毫微米] LI50/01 2.58 LI50/02 2.22 LI50/03 2.13 LI50/04 2.22 LI50/05 2.25 LI50/06 2.55 LI50/07 2.87 LI50/08 1.94 LI200/01 0.50 LI200/02 0.43 LI200/03 0.36 LI200/04 0.38 LI200/05 0.37 LI200/06 0.41 LI200/07 0.35 LI200/08 0.36 在表54中所提供之數據係顯示z-平均值不會顯著地與得自不含非離子性賦形劑系統中之阿達利母馬溶液之數值 (63毫克/毫升，1.85 d.毫微米，220毫克/毫升，0.34 d.毫微米， 136383 -182- 200938221 實例21)不同。於儲存時之阿達利母馬特徵鑒定附錄E係提供關於儲存時之阿達利母馬安定性之數據。安慰劑溶液之導電率表55係描述非離子性賦形劑對於各種阿達利母馬調配物之導電率之影響。所有安慰劑溶液均使用經滅菌之注射用水歐洲藥典/美國藥典製備。甘露醇(毫克/毫升） ———— 蔗糖(毫克/毫升) 聚花相:酸酯80 (% w/w) 導電率 (//S/公分) ------ 50 ----—__ ΞΓ -1 __ . 1.1 " L2 — 80 2.2 50 — 0.01 2.3 — 80 0.01 1.4 50 --- 0.1 2.6 ----- 「80 0.1 3.6 ~ — — 0.01 1.2 _____z_____J --- 0.1 2.6 ~ 將製劑在2-8 C、25。(：及40°C下，於SCF注射器中儲存1個月得自儲存研究之數據係顯示在所測試全部調配物中有蛋白質之整體安定性。安定性數據可與得自實例21之試樣安定性比較。含有非離子性賦形劑之安慰劑溶液之導電率度量’係証實關於一些賦形劑之導電率之最低限度增加，在某於/公分之範圍内。PCS度量係証實在與不含非離子性賦形劑之系統比較下，於流體動力學直徑上無顯著增加。 136383 -183- 200938221 總而言之，使用純水作為DF/UF交換媒質處理蛋白質，及以非離子性賦形劑調配係為可行。阿達利母馬亦在下列組成之緩衝劑中，藉由PCS評估：10_4酸鹽緩衝劑，i〇〇mM 氣化鈉，10mM擰檬酸鹽緩衝劑，12毫克/毫升甘露醇〇1% 聚花楸酸醋80，PH5.2。阿達利母馬濃度個別為50毫克/毫升與200毫克/毫升。z•平均值個別對於5G毫克/毫升調配物為 11.9d.毫微#，及對於毫克/毫升調配物為i〇id毫微米。 ❹目此，明顯地註實在特定蛋白質漠度下之流體動力學直徑係依賴離子強度（在含有鹽之緩衝劑中之明顯較高直徑）。實例23:以非離子性賦形劑之經調配在水中之』跳之製備下述實例係描述一種調配物之製備，該調配物含有在水 :之抗體’意即阿達利母馬，伴隨著其他非離子性賦形劑。實例亦描述以其他非離子性賦形劑，經調配在水中之兄％之安定性（當例如藉由SE_HPLC與ffic度量時）。物料與方法〇使在不同阳下之30毫升J695溶液（~125毫克/毫升）使用$水’應用Slide-a-Lyzer滲析卡£渗析。試樣之參析係個別對著3升純水進行3次（理論賦形劑降低，υ οοο，〇〇⑺。將蛋白質溶液利用Vivaspin 20濃縮器超過濾至2〇〇毫克/毫升之最後標的濃度。進行PH、滲透度、黏度、導電率、pcs、目視檢查、HPLC及蛋白質濃度度量（〇D28〇),以監測在處理期間與其後之蛋白質狀態。於處理後’蛋白質溶液係按下文中所表示進行調配。甘露醇係選自糖醇類之組群’例如甘露醇、花楸醇等，作為 136383 -184- 200938221 使用之實例。蔗糖係選自糖類之組群，例如蔗糖、海藻糖、植物蜜糖、麥芽糖等，作為使用之實例。聚花楸酸酯80係選自非離子性界面活性劑之組群，例如聚花楸酸酯80、聚 1匕楸酸酯20、普洛尼克(piuronic) F68等’作為使用之實例。對於各此等調配物，係製備0.5毫升之體積。進行ph、滲透度 '目視檢查及HPLC分析，以監測試樣製備後之蛋白質狀態。表56 :各種J695調配物之描述 1— 最後蛋白質濃度 ------- 甘露醇 (毫克/毫升）蔗糖 (毫W毫升）聚花楸鞔酯80 (% w/w) 試樣名稱* 200毫克/毫升 50 … — LI200/01/5 200毫克/毫升 80 ——— LI200/02/5 200毫克/毫升 50 —- 0.01 LI200/03/5 2〇〇毫克/毫升 — 80 0.01 LI200/04/5 200毫克/毫升 200毫克/毫升一· 一 50 — 0.1 LI200/05/5 --- 80 0.1 LI200/06/5 LI200/07/5 200毫克/毫升 200毫克/毫升 — — 0.01 — — 0.1 LI200/08/5 200毫克/毫升 50 — —一— 1 LI200/01/6 200毫克/毫升 --- 80 — LI200/02/6 2〇〇毫克— 50 — 0.01 LI200/03/6 200毫克/毫升 80 0.01 LI200/04/6 LI200/05/6 2〇〇毫克~~ 50 — 0.1 200毫克/毫升 — 80 0.1 LI200/06/6 LI200/07/6 200毫克/毫升 — —-- 0.01 200毫克/毫升 — 每·— 0.1 LI200/08/6 * 75"或/6"術語係被加至任何試樣名稱中，以區分。在pH5與6下之試樣之間加以 ❹ ❹ 136383 •185· 200938221 劑之經調配試樣中，以確保所有試樣中之相等蛋白質濃度） - 以固體形式添加甘露醇/蔗糖(個別為25毫克/40毫克）。 J695藥物（J695消光係數280毫微米：1.42毫升/毫克公分）：藥物未含有聚花楸酸酯80。DS緩衝劑，pH 6.29。 pH電極經脫礦質與殺菌過濾之水係作為滲析媒質使用。甘露酵、聚花楸酸酯80及蔗糖，全部均符合歐洲藥典品質 ❹ Vogel滲透壓計OM815係用於滲透度度量（以400毫滲透度/公斤NaCl校準溶液校準，物件編號Y1241，Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany) °

Anton Paar微黏度計，類型AWVn，係根據Anton Paar操作說明書，用於蛋白質溶液之黏度評估。黏度係於20°C 下評估。 _ Fluostar Optima，BMG Labtech (吸收度量，在 344 毫微米下，於井板中，混濁度之評估）

Q Eppendorf 離心機 5810 R

Slide-a-Lyzer滲析卡匣，Pierce生物技術（目錄編號66830)

Vivaspin 20 濃縮器，10 KDa PES 薄膜（Vivascience，產物編號 VS2001)，係根據標準操作說明書使用

PerkinElmer UV可見分光光度計，λ35，係用於蛋白質濃度度量（280毫微米波長）。用後即棄UV比色杯，1.5毫升，半微量分析，聚（甲基丙烯酸曱酯）（ΡΜΜΑ)，係用於濃度度量。 136383 -186- 200938221

InoLab Cond Level2 WTW裝置係用於經正規化至25°C之導電率度量。

Malvern儀器Zetasizer nano ZS係應用標準方法，用於測定 Z-平均值。度量係於25°C下，使用藉由落球黏度測定法（Anton Paar微黏度計，類型AWVn，於25°C下）所獲得之黏度數據進行。 HPLC方法 _ J695，SEC 分析：Tosoh Bioscience G3000swxl，7.8 毫米 X 30 公分，5微米（目錄編號08541)。流動相211 mM Na2S04/92 mM Na2HP04, pH 7.0。0.25毫升/分鐘流率，環境溫度，偵測UV 214毫微米與280毫微米。將各試樣以Milli-Q水稀釋至2.0毫克/毫升，注射試樣裝填量20微克（重複注射）。 J695，IEC 分析：Dionex，Propac WCX-10 管柱（p/n 054993)，伴隨著相應之防護管柱(p/n 054994)。分離條件：流動相 A: 10 mM Na2HP04，pH 6.0;流動相 B 10 mM Na2HP04，500 mM NaCl，pH 6.0。1.0毫升/分鐘流率，35°C溫度。將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/毫升，注射試樣裝填量1〇〇微克。蛋白質濃度之計算計算式 E = -lg ε * c · d

E c =- £Xd ε - 吸收係數 ^ 濃度 136383 -187- 200938221 J695之處理在水中之J695係在添加任何非離子性賦形劑之前作特徵鑒定。表57係提供在滲析/超過濾期間之J695特徵鑒定之細即。

表57 試樣蛋白質濃度 [毫克/毫升] PH 滲透度 [毫滲透度/ 公斤] 黏度[cP] 目視檢查導電率 US/公分] PCS [Z·平均/ d.毫微米] 起始物質 -125 毫克/毫升 6.29 (關於低pH試樣, 係以0.01M鹽酸調整至4.77) N/A N/A 微乳白色，基本上不含可見粒子 N/A N/A 在參析後，低pH 42.5 毫克/毫升 5.21 7 1.60 微乳白色，基本上不含可見粒子 602 1.5 在滲析後，高pH 56.9 毫克/毫升 6.30 6 2.11 微乳白色，基本上不含可見粒子 500 2.7 在濃縮後，低pH 206 毫克/毫升 5.40 50 39.35 微乳白色，基本上不含可見粒子 1676 0.21 在濃縮後，高pH 182 毫克/毫升 6.46 39 47.76 微乳白色，基本上不含可見粒子 1088 0.21

d - 光線必須通過之比色杯長度 e - 吸光率 I〇 - 最初光強度 I - 通過試樣後之光強度 ε阿達利母馬== (Adalimumab) 毫升 :1.42 老尤X公分具有非離子性賦形劑之調配物之特徵鑒定於添加各種非離子性賦形劑至ABT-847調配物（參閱在表 56中之描述）中之後，分析各調配物。得自滲透度與目視檢查及pH之結果係描述於下表58中。 -188 - 136383 200938221 表58 試樣 pH 滲透度 [毫滲透度/公斤] 目視檢查 LI200/01/5 5.39 473 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/02/5 5.38 402 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/03/5 5.37 466 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/04/5 5.37 397 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/05/5 5.37 458 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/06/5 5.37 396 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/07/5 5.36 50 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/08/5 5.36 48 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/01/6 6.43 428 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/02/6 6.42 405 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/03/6 6.43 348 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/04/6 6.43 383 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/05/6 6.42 432 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/06/6 6.42 402 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/07/6 6.43 38 微乳白色，基本上不含可見粒子 LI200/08/6 6.43 39 微乳白色，基本上不含可見粒子

HPLC數據〇含有非離子性賦形劑之各J695調配物亦使用SE-HPLC與 IEX檢視。得自此等分析之數據係提供於表59與60中，且提供在處理與調配期間之J695安定性之概論。表59 :各種J695調配物之SE-HPLC結果總和聚集體單體總和片段試樣名稱 [%] [%] [%] pH 5 125毫克/毫升起始物質 0.608 98.619 0.773 0.619 98.598 0.783 0.614 98.608 0.778 pH 6 125毫克/毫升起始物質 0.427 98.809 0.764 0.392 99.005 0.603 0.409 98.907 0.683 136383 -189- 200938221

pH 5 42.5毫克/毫升於滲析後 0.654 98.604 0.742 0.677 98.560 0.763 0.666 98.582 0.753 pH 6 56.9毫克/毫升於滲析後 0.748 98.541 0.711 0.739 98.597 0.665 0.743 98.569 0.688 pH 5 206毫克/毫升在水中 0.913 98.416 0.671 0.923 98.356 0.721 0.918 98.386 0.696 pH 5 50毫克/毫升甘露醇 LI200/01/5 0.928 98.312 0.760 0.926 98.339 0.736 0.927 98.325 0.748 pH 5 80毫克/毫升蔗糖 LI200/02/5 0.925 98.319 0.755 0.929 98.332 0.738 0.927 98.326 0.747 pH 5, 50毫克甘露醇 0.01% Tween 80 LI 200/03/5 0.942 98.326 0.732 0.942 98.300 0.758 0.942 98.313 0.745 pH 5, 80毫克蔗糖 0.01% Tween 80 LI 200/04/5 0.944 98.315 0.741 0.944 98.339 0.717 0.944 98.327 0.729 pH 5, 50毫克甘露醇 0.1% Tween 80 LI 200/05/5 0.941 98.348 0.711 0.967 98.299 0.734 0.954 98.323 0.722 pH 5, 50毫克甘露醇 0.1% Tween 80 LI 200/06/5 0.944 98.346 0.710 0.948 98.340 0.712 0.946 98.343 0.711 pH 5, 50毫克甘露醇 0.1% Tween 80 LI 200/07/5 0.946 98.348 0.706 0.953 98.328 0.719 0.949 98.338 0.713 pH 5, 50毫克甘露醇 0.1% Tween 80 LI 200/08/5 0.987 98.313 0.701 0.994 98.283 0.723 0.991 98.298 0.712 pH 6 182毫克/毫升在水中 1.091 98.169 0.739 1.075 98.221 0.703 1.083 98.195 0.721 pH 6 50毫克/毫升甘露醇 LI 200/01/6 0.998 98.350 0.652 1.002 98.364 0.634 1.000 98.357 0.643 pH 6 80毫克/毫升蔗糖 LI200/02/6 1.028 98.243 0.729 0.983 98.355 0.662 1.006 98.299 0.695 pH 6, 50毫克甘露醇 0.01% Tween 80 LI 200/03/6 1.005 98.322 0.673 1.008 98.317 0.676 1.006 98.319 0.674 pH 6, 80毫克蔗糖 0.01% Tween 80 LI 200/04/6 0.987 98.363 0.649 0.987 98.321 0.692 0.987 98.342 0.671 136383 190· 200938221 表60 :各種J695調配物之IEX結果

總和酸性吸收峰總和麩醯胺總和驗性吸收峰試樣名稱 [%] [%] [%] pH 5 125毫克/毫升起始物質 4.598 3.303 4.599 3.177 4.599 92.162 3.240 pH 6 125毫克/毫升起始物質 4.597 3.159 4.629 3.156 4.613 92.229 3.168 pH 5 42.5毫克/毫升於滲析後 4.706 3.177 4.725 3.205 4.715 92.094 3.191 pH 6 56.9毫克/毫升於滲析後 4.739 3.182 4.752 3.167 4.746 92.080 3.174 pH 5 206毫克/毫升在水中 4.655 3.167 4.676 3.210 4.666 92.146 3.189 pH 5 50毫克/毫升甘露醇 LI200/01/5 4.721 3.321 4.733 3.356 4.727 91.936 3.338 pH 5 80毫克/毫升蔗糖 LI200/02/5 4.715 3.299 4.687 3.338 4.701 91.981 3.318 pH 5, 50毫克甘露醇 0.01% Tween 80 LI200/03/5 4.767 3.246 4.736 3.253 4.752 91.999 3.250 pH 5, 80毫克蔗糖 0.01% Tween 80 LI 200/04/5 4.751 3.257 4.742 3.229 4.746 92.011 3.243 pH 5, 50毫克甘露醇 0.1% Tween 80 LI 200/05/5 4.780 3.420 4.720 3.394 4.750 91.843 3.407 pH 5, 80毫克蔗糖 0.1% Tween 80 LI 200/06/5 4.756 3.421 4.894 3.375 4.826 91.777 3.398 pH 6, 50毫克甘露醇 0.1% Tween 80 LI 200/05/6 0.996 98.326 0.678 0.996 98.338 0.666 0.996 98.332 0.672 pH 6, 80毫克蔗糖 01% Tween 80 LI 200/06/6 0.998 98.305 0.697 0.984 98.345 0.671 0.991 98.325 0.684 pH 6 001% Tween 80 LI 200/07/6 1.000 98.325 0.675 0.994 98.347 0.659 0.997 98.336 0.667 pH 6 0.01% Tween 80 LI 200/08/6 1.003 98.314 0.682 0.998 98.338 0.664 1.001 98.326 0.673 136383 - 191 - 200938221 pH 5 0.01% Tween 80 LI 200/07/5 4.813 3.425 4.757 3.413 4.785 91.796 3.419 pH 5 0.1% Tween 80 LI 200/08/5 4.769 3.361 4.842 3.335 4.806 91.846 3.348 pH 6 182毫克/毫升在水中 4.882 3.452 4.886 3.451 4.884 91.664 3.451 pH 6 50毫克/毫升甘露醇 LI 200/01/6 4.843 3.456 4.833 3.393 4.838 91.737 3,425 pH 6 80毫克/毫升蔗糖 LI200/02/6 4.923 3.407 4.896 3.491 4.909 91.642 3.449 pH 6, 50毫克甘露醇 0.01% Tween 80 LI 200/03/6 4.864 3.423 4.899 3.392 4.882 91.711 3,408 pH 6, 80毫克蔗糖 0.01% Tween 80 LI 200/04/6 4.870 3.320 4.928 3.369 4.899 91.766 3.345 pH 6, 50毫克甘露醇 0.1% Tween 80 LI 200/05/6 4.905 3.385 4.922 3.489 4.914 91.649 3.437 pH 6, 80毫克蔗糖 0.1% Tween 80 LI 200/06/6 4.973 3.443 4.962 3.335 4.968 91.644 3.389 pH 6 0.01% Tween 80 LI 200/07/6 4.934 3.413 4.899 3.392 4.916 91.681 3.402 pH 6 0.1% Tween 80 LI 200/08/6 4.884 3.410 4.934 3.366 4.909 91.703 3.388

結論上文實例係提供一種實驗，其中水（經脫礦質與殺菌過濾之水）係作為單株抗體J695之滲析媒質使用。使J695接受滲析與濃縮處理，利用純水作為交換媒質，並在pH 5.40以及6.46下，於高濃度（個別為206與182毫克/毫升）下調配，而不會引致溶液混濁、嚴重乳白色或混濁度形成。得自處理實驗之J695係經特徵鑒定，並以各種非離子性 -192- 136383 200938221 賦形劑調配。所獲得之數據係之古Μ妨批 θ向所測試調配物中蛋白質之有利整體安定性。 X㈡冥總而言之，使用純水作為 q 乂換媒質處理蛋白質，及離子性賦形劑調配係為可行。— 、叙疋理想100%賦形劑薄骐滲透性，可估計約99.9%最高賦形劑降低。實例24:經調配在水中之阿達利母馬之可注射性 Ο Ο 使得自實例21之調配物（63與22〇毫克/毫升阿達利母馬）於注射器排空時接受力度量。將220毫克/毫升之阿達利母馬試樣個別稀釋至200毫克/毫升、150毫克/毫升及1〇〇毫克/ 亳升，且亦經評估。Zwick Z2.5/TN1S係在8〇毫米/分鐘之恒定進料下使用。最後，調配物之黏度數據係使用Paar微霉占度計，類型AWVn，於20°C下評估。下述數據收集係指出針頭與注射器直徑兩者於注射器排空時，均具有對於滑動力之顯著作用。令人驚訝的是，在220毫克/毫升下之高度 ;農縮溶液（黏度27.9 cP，於20°C下）可藉由施加與在63毫克/ 亳升下之較低濃縮調配物（黏度1.8 cP ’於20°C下）一樣之相等排空力傳輸。 136383 -193 - 200938221 表61 :關於在不同包裝系統中之阿達利母馬溶液所獲得之滑動力值

阿達利母馬濃度(黏度） BD HyPak SGF™ 1毫升長注射器，裝有 27.5G RNS 針頭BD HyPak BSCF 4432/50 塞子 D HyPak SC T™)毫升長注射器裝有 1毫升 Soft-Jeet® Tuberkulin 注射器(ttBD HyPak注射器較小直桎)，裝有27Gx 1/2"針頭 (Sterican) 25G x5/8" 針頭(Sterican) BD HyPak BSCF 4432/50 塞子 26Gx 1/21' 針頭(Sterican): BD HyPak BSCF 4432/50 塞子 27G x 1/2" 針頭(Sterican) BD HyPak BSCF 4432/50 塞子 63毫克/毫升 (1.8 cP) 3.9 N - - - - 1〇〇毫克/毫升 (2.9 cP) 3.30 N 1.02 N 1.33 N 1.69 N 1.00 N 150毫克/毫升 (7.4 cP) 4.63 N 1.16N 1.58 N 2.93 N 1.33 N 200毫克/毫升 (15.7 7.25 N 2.16 N 3.24 N 6.25 N 2.55 N 220毫克/毫升 (27.9 CP) 14.5 N 2.99 N 3.97 N 9.96 N 3.16 N 上文指出即使具有高濃度之蛋白質，此種調配物亦有助於使用注射器之投藥，例如皮下。 0 實例實例25-28係描述含有經調配在水中之抗體之各種抗體調配1物（於實例26-28中稱為低-離子強度蛋白質調配物）之冷 1/解决安定性實驗。許多抗體之冷凍解凍行為係藉由在冷凉狀態與液態之間循環各種蛋白質調配物至高4次而進行 5平估。冷凍係利用溫度控制之_8(rc冷凍庫進行，而解凍係利用25°C溫度控制之水浴進行。將約25毫升抗體溶液各充填在30毫升PETG容器中，供此等實驗系列用。亞可見粒子之形成係在醫藥蛋白質調配物中提出一項主 136383 -194- 200938221 要t全性顧慮。亞可見蛋白質粒子係被認為是具有負面地衝擊臨床性能至比其他降解產物同樣或較大程度之可能性’該其他降解產物譬如可溶性聚集體及以化學方式改質之物種’其係經評估與定量作為產物特徵鑒定與品質保証計劃之一部份（Carpenter，JF等人評論：俯視治療蛋白質產物中之亞可見粒子：可危害到產物品質之baps 乂 2008)。如下文列示之實例中所証實，許多抗體為令人驚訝地安定-尤其是關於亞可見粒子形成_當經調配在本發明之調配物中時。實例25 .經調配在水中且具有非離子性賦形劑之阿達利母馬之冷凍/解凍安定性下述實例係描述在水調配物中及在其中非離子性賦形劑已被添加之水調配物中之抗體（例如阿達利母馬）之安定性。使得自實例21與22之試樣之液份接受冷凍/解凍實驗疋並藉由SE-HPLC分析。將數據與衍生自冷凍/解凍實驗之 SE-HPLC結果比較，使用在下列組成之緩衝劑中之阿達利母馬：lOmM磷酸鹽緩衝劑，100mM氯化鈉，1〇mM檸檬酸鹽緩

衝劑，12毫克/毫升甘露醇，〇.1%聚花楸酸醋8〇，阳5.2。於此後述緩衝劑中之阿達利母馬係個別在5G毫克/毫升與毫克/毫升下被使用。冷凍/解凍循環係在Eppend〇rf罩蓋中進行，其方式是冷;東至航，並在冷涞庫中儲存8小時，接著於室溫下解凍1小時，及後續試樣抽取 5次循環，意即下表中所述之循環〇、i，使各調配物接受 2、3、4及 5。 HPLC方法 136383 -195- 200938221 阿達利母馬，SEC分析：交聯葡聚糖（Sephadex) 200管柱 (Pharmacia 目錄編號 175175-01) 〇流動相 20 mM 磷酸鈉，150 mM 氯化鈉，pH 7.5，0.5毫升/分鐘流率，環境溫度，偵測UV 214 毫微米與280毫微米。將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/ 毫升，注射試樣裝填量50微克（重複注射）。於冷凍/解凍循環時之阿達利母馬特徵鑒定表62係描述在冷凍/解凍實驗期間之阿達利母馬純度。關於試樣組成，參考實例21與22。

表62 : 冷珠/解凍-低離子性阿達利母馬-50毫克/毫升循環單《分率[%] LI50/01 LI50/02 LI50/03 LI50/04 LI50/05 LI50/06 LI50/07 LI 50/08 0 99.605 99.629 99.632 99.626 99.619 99.626 99.653 99.655 1 99.743 99.768 99.739 99.759 99.731 99.725 99.686 99.669 2 99.715 99.726 99.571 99.661 99.721 99.721 99.601 99.619 4 99.668 99.689 99.632 99.678 99.523 99.724 99.491 99.542 5 99.627 99.771 99.539 99.772 99.525 99.773 99.357 99.445 循環聚集《分率[%] LI50/01 LI50/02 LI50/03 LI 50/04 LI50/05 LI50/06 LI 50 / 07 LI 50/08 0 0.106 0.104 0.119 0.136 0.139 0.145 0.158 0.159 1 0.149 0.134 0.153 0.150 0.149 0.166 0.206 0.201 2 0.192 0.178 0.320 0.242 0.178 0.184 0.319 0.261 4 0.213 0.185 0.239 0.187 0.357 0.170 0.393 0.353 5 0.301 0.151 0.384 0.150 0.398 0.150 0.568 0.484 循環片段分率[%] LI50/01 LI50/02 LI50/03 LI50/04 LI50/05 LI50/06 LI50/07 LI 50 / 08 0 0.289 0.267 0.249 0.238 0.242 0.229 0.189 0.186 1 0.108 0.098 0.108 0.091 0.120 0.108 0.107 0.130 2 0.093 0.097 0.108 0.097 0.100 0.094 0.080 0.119 4 0.119 0.126 0.130 0.135 0.120 0.106 0.116 0.105 5 0.072 0.078 0.078 0.078 0.077 0.077 0.075 0.071 -196 136383 200938221 冷谏/解凍-低離子性阿達利母馬-200毫克/毫升循環單《分率[%] LI200/01 LI200/02 LI200/03 LI200/04 LI200/05 LI200/06 LI200/07 LI200/08 0 99.294 99.296 99.348 99.333 99.313 99.349 99.320 99.290 1 99.286 99.267 99.259 99.256 99.120 99.254 98.999 99.126 2 99.305 99.311 99.249 99.214 99.296 99.288 99.149 99.128 4 99.303 99.272 99.261 99.301 99.296 99.283 99.004 99.061 5 99.320 99.322 99.330 99.331 99.327 99.333 98.939 98.949 循環聚集《分率[%】 LI200/01 LI200/02 LI200 / 03 LI200 / 04 LI200 / 05 LI200/06 U 200/07 LI200/08 0 0.489 0.509 0.491 0.484 0.492 0.488 0.515 0.575 1 0.590 0.574 0.584 0.586 0.680 0.582 0.785 0.718 2 0.604 0.604 0.616 0.630 0.607 0.607 0.731 0.736 4 0.591 0.592 0.612 0.581 0.604 0.596 0.868 0.836 5 0.593 0.586 0.583 0.596 0.597 0.589 0.985 0.981 循環片段分率[%] LI200/01 LI200/02 LI200/03 LI 200/04 LI200/05 LI200/06 LI200/07 LI200/08 0 0.218 0.196 0.161 0.183 0.195 0.163 0.165 0.135 1 0.124 0.159 0.157 0.159 0.200 0.164 0.216 0.157 2 0.091 0.085 0.135 0.156 0.097 0.105 0.120 0.136 4 0.106 0.136 0.127 0.118 0.100 0.121 0.128 0.103 5 0.087 0.092 0.087 0.073 0.075 0.078 0.076 0.070 冷床/解束-市售及在水中之阿達利母馬循環單《分率[%] 得自實例A,低濃度得自實例A，高濃度標準物，50毫克/毫升標準物,200毫克/毫升 0 99.733 99.286 99.374 99.227 1 99.689 99.212 99.375 99.215 2 99.614 99.130 99.370 99.218 4 99.489 99.029 99.361 99.196 5 99.430 98.945 99.362 99.177 循環單《分率[%] 得自實例A，低濃度得自實例A，高濃度標準物,50毫克/毫升標準物，200毫克/毫升 0 0.186 0.635 0.358 0.502 1 0.226 0.706 0.359 0.516 2 0-304 0.780 0.364 0.513 4 0.428 0.888 0.372 0.535 5 0.485 0.971 0.373 0.553

-197- 136383 200938221 循環 ο 1 2 得自實例Α，低濃度 0.080 0.085 0.082 0.083 0.085 單《分率[%] 得自實例Α，高濃度標準物，50毫克/毫升標準物，200毫克/毫升 0.079 0.268 0.272 0.083 0.266 0.269 0.090 0.266 0.269 0.083 0.267 0.270 0.085 0.265 0.269 結論上文實例係提供其中使經DF/UP處理至水（經滅菌之注射用水歐洲藥典/美國藥典）中，並以各種非離子性賦形劑調配之阿達利母馬接受冷凍/解凍循環之實驗。所獲得之數據 (被描述於表62中）係顯示在所測試全部調配物中之蛋白質之有利整體安定性。於5次冷凍/解凍循環後，所有調配物均含有高於98.5%單體性物種，當循環持續時，具有最少量之聚集體或片段。實例26 ·低-離子性1D4.7溶液之冷凍/解凍安定性 1D4.7蛋白質（抗_IL 12/抗孔23 IgG1)係藉由滲析（使用 ❹ sllde-a-lyzer卡匣，根據製造者Pierce，Rockford，IL之操作說明書使用）而被調配在水中，且証實於2毫克/毫升濃度，pH6下，在重複冷凍/解凍(f/t)處理（-8〇t /25t水洛）期間為安定的。將數據與各種調配物（2毫克/毫升蛋白質，pH 6)之數據比較，使用常用於非經腸蛋白質調配物發展中之緩衝劑與賦形劑。已發現經調配在水中之1]04.7安定性係超過經調配在所建立缓衝系統（例如20 mM組胺酸、20 mM甘胺酸、1〇 ^ 磷酸鹽或10mM擰檬酸鹽）中之1D47安定性，且甚至超過與多種常用以使蛋白質調配物安定化之賦形劑合併，例如1〇 136383 •198· 200938221 毫克/毫升甘露醇、10毫克/毫升花楸醇、1〇毫克/毫升蔗糖、 0-01%聚花楸酸醋8〇或20mM NaC1，以一般性緩衝劑（1〇福磷酸鹽、lOmM檸檬酸鹽）為基礎之1£>4.7調配物之安定性。應用SEC、DLS及粒子計數分析，以監測蛋白質安定性，且粒子計數係使用具有1-200微米度量範圍之粒子計數系統 (粒子計數器注射器型，Markus Klotz GmbH，Bad Uebenze& Germany)進行。實驗細節如下：〇 -將經調配在水中之1D4.7與上文列示之調配物比較 - 應用4次冷凍/解凍循環 -3〇毫升PETG容器，約20毫升充填，2毫克/毫升蛋白質，pH 6 - 在TO、T1 (意即一個f/t步驟之後）、T2、T3及T4下取樣 - 分析：目視檢查、SEC、DLS、亞可見粒子度量圖33顯示在重複f/t循環（-8〇°C /25。(：）期間之1D4.7安定性， q 藉由>1微米之亞可見粒子之形成反映出。1D4.7係被調配在一般性緩衝劑（10 mM檸檬酸鹽、10 mM磷酸鹽）中，然後測試下列賦形劑變型：花楸醇（10毫克/毫升）、甘露醇（10毫克 /毫升）、蔗糖（10毫克/毫升）、NaCl (100 mM)及聚花楸酸酯80 (0.01%)。1D4.7亦被調配在水中（藉由滲析），完全未添加賦形劑（在圖33中之’’水”）。亦使注射用水接受仇循環與亞可見粒子測試，以評估物質處理、f/t及試樣抽取對於粒子負載之可能衝擊。於f/t時經調配在水中之1D4.7安定性係超過以典型上使 136383 -199- 200938221 之1D4.7溶液安定性。

定性之非離子性賦形劑。用於蛋白質調配物中之賦形劑所調配已知甘露醇、蔗糖及花楸醇係充作凍; 護劑，且聚花楸酴酯80麁幕冶& ”，

測i藥蛋白質安定性之各種分析操作法（例如SEc、目視檢 0 查、動態光散射及尤其是光昏暗）分析時，經調配在水中之 1D4.7溶液係顯示為令人驚舒地安定。實例27:低.離子性13CS.S溶液之冷凍/解凍安定性已证實經調配在水中之13C5.5 (抗IL-13 IgGl)於2毫克/毫升濃度，pH 6下，在重複冷凍/解凍處理（_8〇〇c /25〇c水浴）期間為安定的。將數據與其他調配物（2毫克/毫升蛋白質，pH 6)比較，並發現經調配在水中之13C5 5安定性係超過經調配在經4使用於非經腸蛋白質調配物之緩衝系統（例如2〇 Q 組胺酸、20 ^甘胺酸、10 mM磷酸鹽或10 mM檸檬酸鹽）中之13C5.5安定性，且甚至超過已與多種常用於蛋白質調配物中之賦形劑（例如1〇毫克/毫升甘露醇、1〇毫克/毫升花楸醇、1〇毫克/毫升蔗糖、0.01%聚花楸酸酯80、20 mM NaCl、 200 mMNaCl)合併，以一般性緩衝劑（lOmM磷酸鹽、10mM 檸檬酸鹽）為基礎之13C5.5調配物之安定性。試樣製備、實驗處理、試樣抽取及試樣分析係以如上文實例中所概述之相同方式進行。 - 將經調配在水中之13C5.5與上文列示之調配物比較 136383 -200- 200938221 - 應用4次冷涞/解來循環 -30毫升PETG容器 -2毫克/毫升，pH 6 - 在T0、T1、T2、T3及T4下取樣 - 分析：目視檢查、SEC、DLS、亞可見粒子度量圖34顯示在重複f/t循環（_80°c /25。(：）期間之13C5.5安定性，藉由>10微米之亞可見粒子之形成反映出。13C5.5係被調配 ❾ 在無論是1〇 mM填酸鹽緩衝劑、1〇 mM #檬酸鹽緩衝劑、20 mM甘胺酸緩衝劑及20 mM組胺酸缓衝劑中。13C5.5亦被調配在本發明調配物中（藉由滲析），完全未添加賦形劑。亦使注射用水接受f/t循環與亞可見粒子測試，以評估物質處理、f/t及試樣抽取對於粒子負載之可能衝擊（被稱為空白試驗）。於f/t時經調配在水中之13C5.5安定性係超過經調配在典型上使用於蛋白質調配物之緩衝劑中之13C5.5溶液安定 Q 性。以所應用之其他分析操作法（例如SEC、目視檢查等），尚未發現經調配在水中之13C5.5溶液之不安定性。圖35顯示在重複f/t循環（-80〇c /25。〇)期間之13C5 5安定性，藉由>1微米之亞可見粒子之形成反映出。13C5.5係被調配在一般性緩衝劑（1〇 mM檸檬酸鹽、10 mM磷酸鹽）中，及在與下列賦形劑變型合併之一般性緩衝劑中：花楸醇（1〇毫克/ 毫升）、甘露醇（1〇毫克/毫升）、嚴糖（10毫克/毫升）、NaC1 (2〇〇 mM)、NaCl (20 mM)及聚花楸酸酯80 (0.01%)。13C5.5亦被調配在水中（藉由渗析）’完全未添加賦形劑，以供比較（純水）。 136383 -201- 200938221 亦使注射用水接受价循環與亞可見粒子測試，以評估物質處理、f/t及試樣抽取對於粒子負載之可能衝擊。於f/t時經調配在水中之13C55安定性係超過以典型上使用於蛋白質調配物中之賦形劑所調配之i3c5 5溶液安定性。已知甘露醇、蔗糖及花楸醇係充作凍乾保護劑及/或低溫保護劑，且聚花楸酸醋80為普遍地已知會在個別曝露至疏水性-親水性界面譬如空氣-水與冰_水時增加蛋白質之物理安 ❹定性之非離子性賦形劑。已發現在被調配成本發明調配物之13C5.5試樣中亞可見粒子之低數目係在令人驚評地低程度下，s正貫此種調配物之高安全性與安定性潛力。以所應用之其他分析操作法（例如SEC、目視檢查等），尚未發現經調配在水中之13C5.5溶液之不安定性。於f/t程序後之13C5.5溶液之DLS分析係按上述進行。得自 DLS分析之結果顯示在只有1個仇步驟後，具有⑽㈣ Tween-80之13C5.5溶液含有顯著高分子量（hmw)聚集體形 Q 式，然而在水中之13C5.5未含有HMW聚集體形式，即使在所應用之3個f/t步驟後亦然。概略言之，當以典型上所應用，以在冷凍解凍處理時監測醫藥蛋白質安定性之各種分析操作法（例如SEC、目視檢查、動態光散射及尤其是光昏暗）分析時，經調配在水中之 13C5.5溶液係顯示為令人驚評地安定。實例28 :低-離子性7C6溶液之冷凍/解凍安定性已証實經調配在水中之7C6 (抗澱粉狀蛋白頌§(}1)於2毫克/耄升?辰度，？^16下，在重複冷涞/解束處理（_8〇<^/3〇。〇水 136383 •202- 200938221 浴）期間為安定的。將數據與其他調配物（2毫克/毫升蛋白質’ pH 6)比較，並發現經調配在水中之7C6安定性係超過經調配在經常使用於非經腸蛋白質調配物之緩衝系統中之 7C6安定性’且甚至超過已與多種常用於蛋白質調配物中之賦形劑合併’以—般性緩衝劑（10 mM填酸鹽、1〇 mM檸檬酸鹽）為基礎之7C6調配物之安定性。下列溶液組成係經評估關於其在冷凍/解凍實驗期間保持7C6物理安定性之潛力：

- 磷酸鹽緩衝劑，15 mM

- 檸檬酸鹽緩衝劑，15 mM

- 琥珀酸鹽緩衝劑，15 mM

- 組胺酸緩衝劑，15 mM

' 精胺酸緩衝劑，15 mM - 低離子性蛋白質調配物，未添加賦形劑 -一般性緩衝劑’花楸醇（10毫克/毫升） -一般性緩衝劑，甘露醇（10毫克/毫升） -一般性緩衝劑，蔗糖（1〇毫克/毫升） -一般性緩衝劑’海藻糖（10毫克/毫升） -一般性緩衝劑’ 0.01% (W/W)聚花楸酸酯80 試樣製備、實驗處理、試樣抽取及試樣分析係以如實例 26與27中所概述之極類似方式進行。 - 將經調配在水中之7C6與上文列示之調配物比較 - 應用4次冷凍/解凍循環 -30毫升PETG容器，約2〇毫升充填 136383 -203- 200938221 -2毫克/毫升，pH 6 - 在TO、ΤΙ、T2、T3及T4下取樣 ' 分析：Α尽抗體安定性係藉由下述方法評估：蛋白谷液之目視檢查係在聚丙稀圓底管件中進行，於其中充填試樣，以供光昏暗度量。其係小心地對著黑色與白色背景兩者檢查關於顯示蛋白質物理不安定性之跡象，譬如混濁性、混濁度及粒子形成。 ' 動態光散射（eZetasizer Nano ZS，Malvern 儀器，AI9494 ; 裝有Hellma精密元件，suprasil石英，類型i〇5.251-QS ’光路徑 3毫米，中心Z8.5毫米，至少60微升試樣充填，自光昏暗度量而留在PP圓底管件中之蛋白質試樣係用於DLS度量）。進行自動化度量（每試樣1次度量）。 - 光昏暗分析。將3.5毫升試樣在層狀空氣流動條件下，充填於5毫升圓底管件中’在最初08毫升沖洗後，度量係以n=3模式進行（每單一度量〇·8毫升）。 " 尺寸排阻層析’與UV214/UV280及多角度光散射合併。流動相：100 mM Na2HP04 / 200 mM Na2S04, pH 7.0 (使 49.68 克無水磷酸氫二鈉與99.44克無水硫酸鈉溶於約3300毫升 Milli-Q水中，將pH值使用1M磷酸調整至7.0，以Milli-Q水充填至體積為3500毫升，並使溶液經過膜濾器過濾）。SEc管柱，TSK凝膠G3000SW (目錄編號08541) 7.8毫米X 30公分，5 微米，與TSK凝膠防護器（目錄編號08543) 6.0毫米X 4.0公分，7微米合併。流量〇.3毫升/分鐘，注射體積20微升（相當於20微克試樣），柱溫室溫，自動取樣器溫度2至8。(：，操 136383 -204- 200938221 作時間50分鐘’恒定組成梯度液，以1〇%異丙醇沖洗活塞，經由uv吸光率偵測，二極體陣列偵測器：波長214毫微米，峰寬>0.1分鐘，譜帶寬度：8毫微米，參考波長36〇毫微米，譜帶寬度100毫微米。圖36顯示在重複f/t循環（_8〇t/25t)期間之7C6安定性，藉由>1微米之亞可見粒子之形成反映出。對於許多調配物，於仇時經調配在水中之7(：6安定性係超過經調配在典型上〇使用於蛋白質調配物之緩衝劑中之7C6溶液安定性。以所應用之其他分析操作法（例如SEC、目視檢查、動態光散射），尚未發現經調配在水中之7C6溶液之不安定性。、令人驚舒的是，於f/t時經調配在纟中之7C6安定性係超過以：：上使用於蛋白質調配物令之賦形劑所調配之7⑽ — 已夫#露醇、蔗糖及花楸醇係充作凌乾保護劑及/或低溫保護劑’且聚花楸酸醋8〇為普遍地已知會在個別曝露至疏水性—親水性界面譬如空氣-水與冰-水時增加蛋白〇 =理安定性之非離子性賦形劑。已發現在被調配成本發明調配物之7C6試樣中亞可見粒子之低數目係在

訝地低程度下，証實此籀钥 M 概略-… 兩安全性與安定性潛力。概略§之，當以典型上測醫藥冷凌·解凌處理時監、女定性之各種分析操作法（例如SEC、目；^ & 一動態先散射及尤其是光昏暗）分析時，經調 7C6溶液係顯示為令人驚訝地安定。之 !=調配在水中·之製備及其安定性研究 136383 -205- 200938221 將427.1克（80毫克/毫升）J695稀釋至40毫克/毫升，並使用純水滲濾。與純水5-倍體積交換後（理論賦形劑降低’ 99.3%)，將蛋白質溶液超過濾至100毫克/毫升之標的濃度。進行PH、滲透度、密度、目視檢查及蛋白質濃度度量（OD280) ，以監測DF/UF處理後之蛋白質狀態。於DF/UF處理後，將蛋白質溶液殺菌過濾（0.22微米Sterivex GV膜濾器）至60毫升PETG瓶（Nalgene)中，且接著在-80°C下儲存3個月。於37°C下解凍後，將溶液殺菌過濾（0.22微米Sterivex GV膜濾器），並填入無菌BD HyPak Physiolis SCFTM 1毫升長注射器 29G，1/2 英吋，5-斜角，RNS TPE 中，並以無菌 BD HyPak SCFTM1 毫升W4023/50 Flur Daikyo塞子閉合》充填體積為每注射器 1.000毫升。於充填後，將注射器個別儲存於2-8°C與40°C下，並按下文描述之試樣抽取綱要中所指示進行分析。 J695藥物（消光係數，在280毫微米下：1.42毫升/毫克公分）：藥物，pH 6.0未含有聚花楸酸酯80。

Sartorius Sartocon Slice 滲滤系統，裝有 Ultrasert PES 薄膜卡匣（50kDa截止值）。Sartocon Slice系統係根據Sartorius 操作說明書，於環境溫度下，以連續模式操作。 pH電極

Perkin Elmer UV/ViS分光光度計，λ25，係用於蛋白質濃度度量（280毫微米波長）。用後即棄UV比色杯’ 1.5毫升，半微量分析，係用於濃度度量。 136383 -206- 200938221 經0.22微米過濾之純水係作為DF/UF媒質使用。

Anton Paar密度計DMA 4100係用於密度度量

Knauer滲透壓計類型ML係用於滲透度度量（以400毫滲透度/公斤NaCl校準溶液校準，物件編號Y1241， Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany) ° 分析方法 J695，SEC 分析：Superdex 200 管柱（Pharmacia)。流動相 92 mM二-磷酸氫鈉，211 mM硫酸鈉，pH 7.0，0.75毫升/ 分鐘流率，環境溫度，偵測UV 214毫微米。將各試樣以流動相稀釋至2.0毫克/毫升，注射試樣裝填量20 微克（重複注射）。 J695，IEC分析：Dionex，PropacWCX-ΙΟ管柱，伴隨著相應之防護管柱。分離條件：流動相A : 20 mM二-磷酸氫鈉與20 mM醋酸鈉，pH 7.0 ;流動相B 20 mM二-填酸氫鈉，400 mM氣化納，pH 5.0。1.0毫升/分鐘流率，環境溫度。將各試樣以Milli-Q水稀釋至1.0毫克/ 毫升，注射試樣裝填量100微克（重複注射）。 J695，SDS-PAGE分析：Novex丙烯醯胺平板凝膠（對於非還原條件為8-16%，對於還原條件為12%，Invitrogen) ，柯麥西（Coomassie)染色（Invitrogen)。在還原（沒-疏基乙醇）與非還原條件下分離，使用由10x儲備溶液製成之Tris-甘胺酸緩衝劑（Invitrogen)。 J695，緩衝劑成份之定量：。甘露醇：經由 ReproGel Ca 管柱（Dr. Maisch， 136383 -207- 200938221

Germany)分離，與RI伯測，流動相：去離子水， 0.6毫升/分鐘流率，20微升注射試樣。定量係使用外部校準用標準曲線進行。。組胺酸與曱硫胺酸：胺基酸以OPA (鄰苯二醛）

之螢光標識，與經由ReproSil ODS-3管柱（Dr. Maisch，Germany)之HPLC分離，及在420毫微米下之螢光偵測（在330毫微米下之消光），流動相A : 70%檸檬酸（10.51克/升）緩衝劑，pH 6.5， 30%曱醇，流動相B:曱醇，1.0毫升/分鐘流率， 20微升注射試樣。定量係使用外部校準用標準曲線進行。 J695，PCS分析：未經稀釋，在100毫克/毫升下進行，於單次使用塑膠比色杯中，在25°C下，使用Malvern 儀器Zetasizer nano ZS，於173°角度下，假定溶液黏度為4.3875 mPas，蛋白質之折射率為1.450，及緩衝溶液之折射率為1.335。20次掃描，各20秒之平均結果係經報告。蛋白質濃度之計算計算式：

f / ) E E = —lg ——=£^c-d c -- \h) ε乂d ε - 吸收係數 c - 濃度 d - 光線必須通過之比色杯長度 e - 吸光率 1〇 - 最初光強度 I - 通過試樣後之光強度 136383 -208- 200938221 SJ695 ~ 1 -42 毫升老龙X公分試樣抽取綱要將所製成溶液之試樣儲存於下文列示之溫度下，並在研究開始之後，於所指示之時間點下抽取⑻（表63)。試驗參數與方法係描述於表64中。表63

溫度 TO lm 3 m 6 m 5°C X X X X 40°C X X X

表64 試驗參數試驗方法外觀目視檢查可見粒子類似 DAC(EA4.43) 次可見粒子類似歐洲藥典/美國藥典EA 4.44 透明性歐洲藥典(EA 4.42) 顏色（目視）歐洲藥典(EA 4.50) pH 歐洲藥典(EA 4.24) 尺寸排阻HPLC 參閱上文陽離子交換HPLC 參閱上文 SDS-PAGE 參閱上文 PCS 參閱上文 J695之DF/UF處理表65係提供滲濾後之J695狀態。表65 試樣蛋白質濃度 [毫克/毫升] PH 滲透度 [毫滲透度/公斤] 目視檢查在DF/UF後 107 6.4 10 微乳白色，微黃色，基本上不含可見粒子 136383 -209- 200938221 在DF/UF後，開始缓衝劑成份之濃度係以定量方式監測，以評估DF有效性。已發現所有結果均低於其相應分析方法 (HPLC，個別使用RI對於甘露醇，及螢光偵測對於曱硫胺酸與組胺酸，於OPA標識之後）之實際偵測極限（參閱表66)。表66

試樣曱硫胺酸 [毫克/毫升] 組胺酸丨[毫克/毫费] 甘露醇人[毫克/毫升] 在DF/UF前 0.669 0.586 18.36 在DMJF後 <0.13 <0.14 <3.20 於鍺存#之/砂5#徵#定下表67係支持於儲存時，在 100毫克/毫升下之J695 DF/UF之安定性。試驗標準詳細說明測試之延續時間[月] 儲存條件[°C/%RH] +5 +40/75 外觀溶液最初 | 順應 1 | 順應順應 3 順應順應 6 順應順應透明性報告結果，與參考懸浮液比較根據歐洲藥典最初 | SRSII 1 I - - 3 | ^RSn ^RSH 6 ^RSn SRsm 微粒子污染可見粒子報告結果，目視評分 (所測試之試樣數）最初 2.0(1) 1 2.0(1) 3.0(1) 3 1.6(5) 1.0 (5) 6 u⑼ 1.6⑼ 微粒子污染亞可見粒子 210徵米：每容器$6000 個粒子 225微米：每容器S600 個粒子最初 210微米 2 25微米 290 16 1 g 10微米 2 25微米 - - 3 210微米 2 25微米 - 6 210微米 2 25微米 124 1 54 3 136383 -210· 200938221

試驗標準詳細說明測試之延續時間[月] 儲存條件[°(：/%1«1] +5 +40/75 尺寸排阻HPLC 報告結果(％),關於聚集最初 (\ 〇體(A)單體(M)片段(F) A 98.9 Μ 0.2 F I 0. 8 2.3 99.0 97.1 M F 0.1 0.6 3 A 0. 0 3.4 A 98.8 95.1 M F 0.1 1.4 6 A 0. 4 5.5 A Χ/Γ 98.4 85.6 M F 0.1 8.9 SDS-PAGE 主要形成帶狀型式可與參最初順應 (非還原條件）考標準物比較順應順應 3 順應順應 6 順應順應 SDS-PAGE 主要形成帶狀型式可與參最初順應 (還原條件）考標準物比較 1 順應順應 3 順應順應 6 順應順應 PCS 關於Z-平均[毫微米]與 η 0 PDI之報告結果最初 0.23 0. 9 0. 0 0.23 0.23 Q 0. 9 0. 1 D 0.23 0.24 0. 9 0. 3 0 0.23 0.29 136383 211 - 200938221 試驗標準詳細說明測試之延續時間[月] +5 +40/75

陽離子交換HPLC 關於酸性物種(A) 主要異構重組物(Μ) 鹼性物種(Β) 之報告結果(％) 初最

A MB

A M B 6 Ό 4 l?-· 9-55 2 9 ·6·95 10980· Α Μ Β ·7 92.2. .4.06 14850. ο Α Μ Β ο·63 6·512· .6.40 9 9 1· 2 6 1 結論上文實例係提供滲濾/超過濾（DF/UF)實驗，其中水（經0.22 微米過濾之純水）係作為單株抗體J695之滲濾媒質使用。使J695接受DF/UF處理，使用純水作為DF/UF交換媒質，並在約pH 6.4下，於高濃度（100毫克/毫升）下調配，而不會引致溶液混濁、嚴重乳白色或混濁度形成。將得自DF/UF實驗之J695在2-8°C與40°C下，於SCF注射器中儲存至高6個月。所獲得之數據係指向蛋白質之有利整體安定性。總而言之，使用純水作為DF/UF交換媒質處理與調配蛋白質係為可行。假定理想100%賦形劑薄膜滲透性，可估計約 99.3%最高賦形劑降低。藉由特定方法所獲得之証據指出，在DF/UF後賦形劑濃度係低於實際偵測極限。實例30 :高濃度阿達利母馬水溶液之冷凍/解凍特徵及安定性測試-均一性與物理安定性 136383 -212- 200938221 低-離子性阿達利母馬溶液之製備使2升PETG瓶中之1.6升藥物（DS)物質於25°c下，在水浴中解凍，均化，並使其接受DF/UF，使用注射用水作為滲濾交換媒質。渗濾、係以連續模式，使用Sartorius Sartocon Slice設備，藉由應用下列參數進行： ~ 栗送輸出：8% - 壓力入口：最大1巴（0.8巴）

" 薄膜.2 X PES，截止值50 kD © 在滲濾期間，5-倍體積交換係足以降低滲透度至8毫滲透度/公斤。在滲濾之前（SEC、利用OD280之蛋白質濃度、pH、滲透度及密度）與滲濾之後（利用〇D280之蛋白質濃度、pH、滲透度及密度），抽取進行中控制（IPC)試樣。IPC_試樣不為無菌。於滲濾後，將經調配在水中之〜70毫克/毫升阿達利母馬 Q 以注射用水稀釋至50毫克/毫升，並將pH值調整至5.2。將經調配在水pH 5.2中之1.6升阿達利母馬5〇毫克/毫升再充填於2升PETG瓶中》使阿達利母馬溶液之其餘體積接受 DF/UF，以增加濃度至1〇〇毫克/毫升。將經調配在水pH 5.3中之阿達利母馬ι〇〇毫克/毫升殺菌過濾、’並將其中之0.8升充填於1升petg瓶中。分析 - 尺寸排阻層析（SEC) -pH-度量 136383 •213- 200938221 - 滲透度度量 - 密度度量 - 利用OD280之蛋白質濃度 - 光學外觀 - 離子交換層析法（IEC) 阿達利母馬之冷凍/解凍實驗1升容器使1升PETG容器中之經調配在水中之阿達利母馬100毫克/毫升預冷卻至2-8°C，然後在-80°C下冷凍，冷凍循環> 12 小時。使在1升PETG瓶中之冷凍試樣於25°C下，在水浴中連續地解凍。於解凍期間，將冷凍溶液之瓶子浸泡在水浴中達到液位。就在解;東，未均化之後，及在均化之後，藉由 15與30次上下翻轉抽取下列試樣。表68 :試樣抽取綱要：各瓶子之翻轉數試樣分析試驗 1 0 5毫升頂部蛋白質含量、滲透度、pH、密度、SEC 2 0 5毫升中間 3 0 5毫升底部 4 15 5毫升頂部蛋白質含量、渗透度、pH、密度、SEC 5 15 5毫升中間 6 15 5毫升底部 7 30 5毫升頂部蛋白質含量、滲透度、pH、密度、SEC及亞可見粒子 8 30 5毫升中間 9 30 5毫升底部阿達利母馬溶液之特徵鑒定於溫和移動後，經調配在水中之阿達利母馬50毫克/毫升與100毫克/毫升係每次顯現明顯淡黃色，非乳白色，及未 136383 -214- 200938221 具有波狀圖案。而且，於冷凍與解凍後，經調配在水中之阿達利母馬並未改變外觀（就在解凍後以及在15與30次上下翻轉後）。輕微波狀圖案係於瓶子之溫和移動後見及，正好在將針頭解凍與浸泡至溶液中之後，於試樣抽取期間，就在解凍後。與使用市售緩衝劑中之阿達利母馬之類似實驗成對比，在水中之阿達利母馬溶液50毫克/毫升並未顯示蛋白質濃度、密度及滲透度之任何梯度液。阿達利母馬溶液100毫克/毫升亦未顯示蛋白質濃度、密度、滲透度之任何梯度液。安定性係個別於-30°C與-80°C下6個月儲存後評估。在下文中，概述個別分析數據：表69 :阿達利母馬50與100毫克/毫升，於冷凍/解凍處理前 PH 密度克/立方公分渗透度毫滲透度/ 公斤蛋白質含量 (重量分析）毫克/毫升亞可見粒子 1毫升 >=1微米 1毫升 >=10微米 1毫升 >=25微米在水中之 50毫克/毫升 5.18 1.0121 5 49.3 7953 5 0 在水中之100 毫克/毫升 5.32 1.0262 12 99.8 154 4 2 136383 215- 200938221 表70 :經調配在水中之阿達利母馬50毫克/毫升，pH 5.2，於冷凍/解凍處理後亞可見粒子翻轉試樣 PH 密度克/立方公分滲透度毫滲透度/ 公斤蛋白質含量毫克/ 毫升純度 (SEC) % 1毫升 >=1微米 1毫升 >=10微米 1毫升 >=25微米 0 頂部 5.20 1.0119 6 48.7 99.597 - - - 0 中間 5.19 1.0120 8 49.4 99.576 - - - 0 底部 5.17 1.0120 6 49.8 99.649 - - - 15 頂部 5.20 1.0120 4 49.7 99.649 - - - 15 中間 5.18 1.0120 5 49.2 99.678 - - - 15 底部 5.17 1.0120 4 49.1 99.637 - - - 30 頂部 5.19 1.0120 5 49.7 99.647 1280 4 0 30 中間 5.17 1.0120 3 50.4 99.637 2055 13 0 30 底部 5.18 1.0120 6 48.9 99.611 3889 37 11 表71 :經調配在水中之阿達利母馬100毫克/毫升，pH 5.2，於冷凍/解凍處理後亞可見粒子翻轉試樣 PH 密度滲透度蛋白質純度 1毫升 1毫升 1毫升克/ 毫滲透度含量 (SEC) >=1微 >=1〇微米 >=25微米立方 /公斤毫克/ % 米公分毫升 0 頂部 5.29 1.0259 13 98.7 99.424 - - - 0 中間 5.3 1.0262 16 99.9 99.468 - - - 0 底部 5.28 1.0262 14 101.2 99.48 - - - 15 頂部 5.27 1.0261 13 98.9 99.511 - - - 15 中間 5.27 1.0261 16 97.7 99.466 - - - - 底部 5.28 1.0261 15 97.0 99.483 - - - -216- 136383 200938221 30 頂部 5.29 1.0261 16 96.6 99.439 231 58 49 30 中間 5.28 1.0261 16 97.0 99.467 169 21 9 30 底部 5.28 1.0261 16 99.3 99.476 131 3 1 表72 :經調配在水中之阿達利母馬100毫克/毫升，pH 5.2，於儲存後之安定性亞可見粒子(1毫升）測試時間點 SEC聚集體單體片段離胺酸異構重組物之IEC總和目視外觀 >=1微米 >=10微米 >=25微米 T0 0.55 99.40 0.05 85.523 透明，無特定物質 155 3 1 T6個月， -80°C 0.47 99.39 0.14 82.124 透明，無特定物質 210 8 5 T6個月， -30。。 1.28 98.58 0.14 81.61 透明，無特定物質 171 71 51 結論以所應用之分析操作法，尚未發現在50與100毫克/毫升下，於冷凍/解凍處理後，及於-30°C或-80°C下儲存至高6個月後，經調配在水中之阿達利母馬之顯著不安定性。實例31 :在低-離子性調配物中之阿達利母馬之冷凍與解凍方法-包括蛋白質含量之製程設計空間溶液之製備使阿達利母馬BDS (整體藥物）在23°C循環水浴中解凍。使用超過濾/滲濾（UF/DF)方法（Pellicon ”小型” 2)，使溶液向上濃縮至100毫克/毫升之標的濃度，以達成體積減少之目的。將具有Biomax 10K聚醚ί風之Millipore Pellicon 2切線流動小型卡匣之兩個卡匣安裝在Pellicon 2單元中。於方法開始時，流率係在60毫升/分鐘下度量，且進料壓力為21 psi。此方 136383 -217- 200938221 法係在m.3毫克/毫升蛋白質濃度下停止。

Spectral分子多孔性薄膜膜管件侧於滲析（直㈣毫米，18毫升/公分體積，75公分長度）。將在阳52下之阿達利母馬100毫克/毫升之8升體積轉移至8個渗析管件。將各 g件以1升阿逹利母馬100毫克/毫升充帛。將等於4升溶液之四個g件放置在具有36升注射用水之容器中，意即達成二 10之溶液交換因子。在體積對著新鮮注射用水交換之 ©前’使溶液達到平衡。溶液交換係重複5次，直到達成 1:100,000之總溶液交換因子為止。於溶液藉由滲析被完全交換後，使其藉由第二個UF/DF 步驟向上濃縮。進行第二個UF/DF步驟，就像第—個步驟一樣。達成在低-離子性調配物中之247·5毫克/毫升阿達利母馬之最後濃度。UF/DF係以已含有聚花楸酸酯8〇之起始物質進行。可預期在最後蛋白質溶液中所累積之聚花揪酸醋8〇會造成較高聚花楸酸酯含量超過0.1%。〇使經向上濃縮之247.5毫克/毫升阿達利母馬之整體溶液以WFI稀釋至較低蛋白質濃度含量，按需要而定_2〇〇毫克/ 毫升，175毫克/毫升，150毫克/毫升，14〇毫克/毫升，13〇毫克/毫升，120毫克/毫升，1〇〇毫克/毫升，8〇毫克/毫升， 5〇毫克/毫升’ 40毫克/毫升，及25毫克/毫升。對於所有實驗，瓶子充填體積為1600毫升。冷凍程序一系列漸增冷束速率係用於此評估中：超低溫度冷束庫底部貯架 < 超低溫度冷凍庫中間貯架 < 超低溫度冷束庫頂 136383 -218- 200938221 部貯架 << 乾冰。 < -70C冷滚庫係用於實驗 # 1… 貫驗中（容量· 2〇·2立方吸（572升）。使用二個貯架。將每一個存於妹、、九個2升PETG瓶。將瓶子儲 4在冷;東庫中°冷料、持續至少則、 .、'4 m評估’㈣擇具有漸增冷位置。在底部貯架上之前方位置係用於最慢冷料率:較快速冷; 東速率係在中間貯架上之中央位置處達成。在冷减 ❹ 庫中之最快速冷柬速率係在頂部貯架上之後方/右邊位置處進行。關於藉由乾冰冷東’—個瓶子係、被乾冰完全地圍繞，歷 v 8小時。於苯乙稀泡棉箱巾’將底部以一層乾冰（約 3至5公分厚）覆蓋。將一個瓶子放置站立於上方乾冰層上。因此，將瓶子與苯乙烯泡棉箱内壁間之空間以乾冰充填，直到全部表面，除蓋子之外，均被覆蓋為止。於冷凍時間後，將瓶子移除，並立即解凍，或放置在_7〇〇c冷凍庫 ❹ 中，供儲存。解凍程序一系列解凍速率係用於此評估中：於4。(：下之冷卻空氣<< 水浴23°C <水浴37°C。分析進行下列分析，以特徵鑒定試樣： • 滲透度 • 導電率

• pH 136383 -219- 200938221 • 密度 •藉由直接UV (280毫微米）之蛋白質濃度、關於漠度試驗’將試樣以水稀釋，直到達成吸^率< η 為止。使用1.39之在280毫微米下之阿達利母馬分子之吸光率係數。阿達利母馬溶液之特徵雲定瓶子足圖4研九係顯不在瓶子體積中朝向梯度液形成之 ❹ #微彳貝向。尤其是對於較緩慢冷;東與解;東速率，較高蛋白質濃度係在接近瓶子底部處檢出，此現象亦反映在導電率、密度及渗透度數據中。pH顯現實際上恒定於所有測試條件中。在超低溫度冷凍庫中，關於以瓶子為基礎系統之冷凍與解凍設計空間之先前研究中，已發現沉降作用之出現係為測定可容許操作範圍邊界之主要破壞模式。在此項研究中，未發現此邊界，惟經研究之設計空間係涵蓋極寬廣範圍。 Q 此產物之獨特行為亦被反映在此冷凍與解凍方法期間形成農度梯度液之極低傾向中。在先前之研究中，結論是產物與製程固有梯度液形成係為在某些處理條件下沉澱物出現之原因。因此’從製程觀點，測得此系統可適用於低_離子性調配物pH 5中之阿達利母馬達到247.5毫克/毫升之整體藥物濃度。在與其他所測試之阿達利母馬調配物比較下，所研究之阿達利母馬水調配物係令人驚訝地展現優越性 136383 -220- 200938221 表73 :在含有低離子性調配物之瓶子中，於剛解凍（23°C水浴）100毫克/毫升阿達利母馬中之蛋白質濃度、導電率、溶質度、密度及pH之分佈冷凍與解凍條件：-7〇°C頂部/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 40 11 0.61 5.43 1.021 78.0 2 210 14 0.67 5.43 1.024 92.2 3 225 15 0.70 5.43 1.0253 98.1 4 200 17 0.72 5.46 1.0259 103.9 5 175 18 0.73 5.43 1.0268 100.2 6 180 18 0.74 5.43 1.0275 100.9 7 230 20 0.80 5.46 1.0284 109.1 8 180 22 0.81 5.45 1.0294 111.2 9 150 21 0.82 5.44 1.0307 118.0

冷凍與解凍條件：-7〇°C中間/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率· mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 30 8 0.54 5.43 1.0174 65.3 2 175 18 0.68 5.44 1.0235 91.3 3 200 17 0.70 5.44 1.0245 92.1 4 185 17 0.72 5.44 1.0249 102.9 5 200 18 0.71 5.43 1.0248 95.6 6 200 20 0.73 5.44 1.0262 96.6 7 175 20 0.74 5.44 1.0283 107.5 8 180 20 0.77 5.45 1.0306 116.1 9 200 26 0.82 5.44 1.0346 131.1 136383 -221 - 200938221 冷凍與解凍條件：-70°C底部/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 35 9 0.60 5.41 1.0195 73.2 2 200 13 0.68 5.41 1.0231 89.6 3 225 16 0.70 5.41 1.0241 93.2 4 180 15 0.71 5.41 1.0246 96.8 5 200 15 0.72 5.40 1.0249 95.7 6 200 19 0.73 5.41 1.0259 96.4 7 185 21 0.75 5.42 1.0272 102.6 8 200 26 0.79 5.41 1.0309 116.8 9 175 31 0.85 5.42 1.0372 141.5

表74 :在含有低離子性調配物之瓶子中，於剛解凍（23°C水浴）140毫克/毫升阿達利母馬中之蛋白質濃度、導電率、溶質度、密度及pH之分佈冷凍與解凍條件：-70°C頂部/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿連利母馬濃度毫克/ 毫升 1 50 36 0.87 5.43 1.0338 130.0 2 215 42 0.90 5.43 1.0354 139.9 3 170 54 0.91 5.43 1.0362 144.9 4 210 41 0.84 5.44 1.0365 141.5 5 200 40 0.93 5.43 1.0364 157.7 6 200 41 0.92 5.43 1.0364 140.0 7 190 41 0.92 5.43 1.0363 143.4 8 180 44 0.82 5.43 1.037 150.1 9 140 45 0.95 5.41 1.038 148.3 136383 -222- 200938221

冷凍與解凍條件：-7〇°C中間/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 25 32 0.81 5.45 1.0284 112.0 2 175 34 0.84 5.44 1.0307 122.4 3 175 36 0.88 5.44 1.033 133.9 4 200 40 0.90 5.43 1.0342 134.6 5 220 40 0.92 5.43 1.0351 140.9 6 185 45 0.94 5.43 1.0369 143.6 7 210 47 0.97 5.43 1.0384 149.8 8 175 47 0.99 5.43 1.0399 160.3 9 190 48 1.01 5.43 1.0435 168.3 冷凍與解凍條件：-70°C底部/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 75 28 0.75 5.45 1.0257 88.7 2 180 34 0.82 5.46 1.029 111.6 3 175 34 0.84 5.44 1.0313 123.5 4 220 37 0.86 5.44 1.0322 118.8 5 165 38 0.89 5.45 1.0337 126.3 6 215 44 0.95 5.45 1.0374 137.6 7 210 49 1.00 5.45 1.0407 149.6 8 150 53 1.03 5.43 1.0429 154.9 9 180 60 1.06 5.44 1.0501 183.2 136383 223- 200938221 表75 :在含有低離子性調配物之瓶子中，於剛解凍（37°C水浴）200毫克/毫升阿達利母馬中之蛋白質濃度、導電率、溶質度、密度及pH之分佈冷凍與解凍條件：-70°C頂部/ 37°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 40 37 0.89 5.26 1.0573 197.5 2 210 35 0.96 5.24 1.0573 195.3 3 175 34 0.96 5.22 1.0578 200.3 4 210 36 0.88 5.27 1.0579 193.9 5 210 39 0.89 5.24 1.058 210.6 6 190 39 0.84 5.27 1.058 213.8 7 200 41 0.88 5.27 1.058 206.7 8 170 41 0.88 5.24 1.0581 196.6 9 160 39 0.89 5.29 1.0595 201.9

冷凍與解凍條件·· -70°C中央/ 37°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 10 31 0.85 5.29 1.0485 170.2 2 185 35 0.89 5.31 1.0505 189.3 3 215 37 0.90 5.33 1.0518 191.7 4 185 38 0.89 5.27 1.0519 191.8 5 200 36 0.90 5.32 1.0528 196.3 6 200 48 0.90 5.28 1.0533 189.3 7 170 37 0.90 5.23 1.0536 193.1 8 215 39 0.91 5.33 1.0552 202.1 9 180 48 0.92 5.31 1.0613 225.5 136383 -224- 200938221 冷凍與解凍條件：-7〇°C底部/ 37°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 50 22 0.96 5.27 1.0361 107.1 2 185 29 0.83 5.26 1.0422 163.0 3 180 38 0.88 5.27 1.0522 201.2 4 185 41 0.90 5.24 1.0535 198.9 5 180 44 0.92 5.28 1.0552 201.4 6 195 40 0.91 5.32 1.0558 201.7 7 180 40 0.91 5.32 1.0560 199.6 8 175 41 0.85 5.26 1.0568 206.2 9 190 48 0.91 5.3 1.0619 229.3

表76 :在含有低離子性調配物之瓶子中，於剛解凍（23°C水浴）247.5毫克/毫升阿達利母馬中之蛋白質濃度、導電率、溶質度、密度及pH之分佈冷凍與解凍條件：-7〇°C頂部/23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 PH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 65 46 0.98 5.28 1.0755 260.9 2 190 72 0.97 5.28 1.0751 270.8 3 190 56 0.97 5.28 1.0751 314.7 4 200 49 0.96 5.27 1.0751 274.8 5 200 58 0.96 5.27 1.0752 278.4 6 210 57 0.97 5.28 1.0752 275.0 7 210 76 0.96 5.28 1.0748 276.5 8 175 75 0.96 5.27 1.0754 274.5 9 150 62 0.97 5.28 1.0763 276.3 136383 -225- 200938221

冷凍與解凍條件：-70°C中間/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 80 37 0.95 5.29 1.0671 250.0 2 200 59 0.95 5.32 1.0704 251.3 3 175 51 0.97 5.31 1.0722 262.7 4 215 56 0.98 5.31 1.073 327.1 5 200 48 0.99 5.31 1.0739 267.7 6 200 67 0.98 5.31 1.0744 270.6 7 230 59 0.95 5.32 1.0753 273.2 8 175 70 0.96 5.32 1.0771 273.3 9 175 83 0.96 5.32 1.0825 289.6 冷凍與解凍條件：-7〇°C底部/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 50 32 0.92 5.24 1.0632 215.3 2 220 59 0.95 5.27 1.069 221.7 3 175 72 0.96 5.27 1.0708 268.1 4 180 58 0.06 5.27 1.0725 260.7 5 210 63 0.96 5.27 1.0729 266.8 6 150 69 0.96 5.28 1.0744 280.3 7 225 50 0.96 5.29 1.0762 280.3 8 200 68 0.95 5.28 1.0789 288.6 9 180 70 0.95 5.29 1.0846 293.0 136383 226- 200938221 表77 :於乾冰冷凍後，在含有低離子性調配物之瓶子中，於剛解凍（23°C水浴）247.5毫克/毫升阿達利母馬中之蛋白質濃度、導電率、溶質度、密度及pH之分佈冷凍與解凍條件：乾冰冷凍/ 23°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 50 51 0.94 5.28 1.0643 258.9 2 210 68 0.94 5.29 1.0683 261.9 3 180 50 0.95 5.29 1.0702 251.7 4 190 69 0.95 5.29 1.0732 262.2 5 210 72 0.96 5.31 1.0738 274.4 6 225 63 0.95 5.3 1.0746 265.7 7 160 57 0.95 5.3 1.0747 261.9 8 190 63 0.95 5.31 1.0749 270.9 9 200 50 0.95 5.31 1.075 271.4

冷凍與解凍條件：乾冰冷凍/ 2-8°C解凍試樣名稱體積毫升溶質度毫溶質度/ 公斤導電率 mS/公分 pH 密度克/立方公分阿達利母馬濃度毫克/ 毫升 1 50 44 0.96 5.29 1.0665 263.1 2 190 53 0.96 5.31 1.0684 258.1 3 200 56 0.96 5.30 1.0691 247.6 4 200 58 0.96 5.30 1.0693 262.2 5 190 64 0.95 5.31 1.0695 243.2 6 200 61 0.95 5.3 1.0695 266.8 7 175 49 0.96 5.32 1.0697 256.2 8 200 50 0.95 5.31 1.0697 261.2 9 175 48 0.96 5.32 1.0704 247.1 136383 -227- 200938221 附錄A : PCS數據阿達利母馬

濃度 [毫克/毫升] 濃度 [毫克/毫升] 平均值 Z-平均 [毫微米] Z-平均平均值 [毫微米] 吸收峰單體 [毫微米] 吸收峰單體平均值 [毫微米] 9.35 9.35 2.08 2.08 2.55 2.55 23.40 23.27 2.30 2.47 2.81 2.87 22.70 2.77 3.01 23.70 2.36 2.78 34.80 34.20 1.56 1.55 1.85 1.87 35.70 1.54 1.82 32.10 1.56 1.93 35.40 36.10 1.61 1.63 1.92 1.92 36.10 1.64 1.93 36.80 1.63 1.92 42.10 43.00 1.75 1.75 2.12 2.12 45.60 1.78 2.15 41.30 1.74 2.10 60.20 57.40 2.06 2.02 2.27 2.37 55.90 2Ό4 2.45 56.10 1.98 2.39 63.20 65.87 2.11 2.24 2.52 2.67 71.70 2.49 2.89 62.70 2.13 2.61 73.40 75.13 2.38 2.41 2.83 2.89 75.60 2.51 3.01 76.40 2.35 2.82 78.60 78.07 2.53 2.55 2.99 2.99 78.80 2.62 3.01 76.80 2.50 2.96 90.40 95.73 2.80 2.85 3.35 3.41 107.40 2.99 3.55 89.40 2.76 3.33 96.20 94.77 2.88 2.86 3.50 3.50 96.00 2.91 3.61 92.10 2.80 3.38 201.00 206.63 4.52 4.82 5.22 5.74 227.50 5.04 6.12 191.40 4.89 5.89 136383 -228- 200938221 J695

濃度 [毫克/毫升] 濃度 [毫克/毫升] 平均值 z-平均 [毫微米] Z-平均平均值 [毫微米] 吸收峰單體 [毫微来] 吸收峰單體平均值 [毫微米] 9.99 9.99 2.28 2.28 1.66 1.66 19.31 19.29 2.05 2.12 1.81 1.81 19.26 2.30 1.79 19.29 2.02 1.84 29.59 29.40 1.78 1.62 1.10 1.16 29.7 1.51 1.15 28.91 1.56 1.22 37.97 37.55 1.51 1.56 1.22 1.23 38.02 1.67 1.22 36.65 1.49 1.24 49.15 46.32 1.64 1.58 1.31 1.29 45.95 1.57 1.30 43.87 1.53 1.26 58.75 56.18 1.60 1.61 1.49 1.47 55.02 1.71 1.38 54.76 1.53 1.53 77.69 77.81 2.64 2.43 2.73 2.61 77.62 2.31 2.57 78.13 2.35 2.52 94.45 97.65 2.11 2.07 2.05 2.05 105.06 2.14 2.05 93.45 1.97 2.04 116.37 114.52 3.69 2.69 1.95 2.00 113.92 2.25 2.06 113.27 2.13 1.99 121.21 133.25 9.78 9.49 11.50 11.00 139.8 9.63 11.10 138.73 9.06 10.40 226.67 217.53 4.94 5.34 4.72 4.84 216.1 6.01 5.25 209.83 5.06 4.55 136383 229- 200938221 人類血清白蛋白濃度 [毫克/毫升] 濃度 [毫克/毫升] 平均值 Z-平均 [毫微米] Z-平均平均值 [毫微米] 吸收峰單體 [毫微米] 吸收峰單體平均值 [毫微米] 9.88 9.88 14.90 14.90 2.32 2.32 22.94 22.89 8.26 8.29 1.2 1.18 22.73 8.28 1.18 23.00 8.33 1.17 36.78 36.47 7.40 7.44 1.22 1.23 37.33 7.80 1.24 35.29 7.12 1.22 45.97 46.06 7.09 6.92 1.27 1.25 47.61 6.54 1.24 44.61 7.13 1.25 58.47 58.56 5.94 6.13 1.3 1.31 62.69 6.04 131 54.52 6.41 1.32 61.89 60.31 5.83 6.14 1.33 1.32 59.76 6.57 1.34 59.28 6.01 1.29 75.37 76.24 5.58 5.46 1.4 1.40 83.69 5.14 1.45 69.67 5.67 1.36 92.90 85.87 5.30 5.14 1.49 1.47 84.22 5.05 1.49 80.50 5.08 1.43 115.93 112.74 4.78 4.94 1.68 1.61 110.00 5.04 1.58 112.30 4.99 1.57 182.79 177.69 9.85 9.13 2.27 2.19 178.24 9.29 2.21 172.05 8.26 2.08

230- 136383 200938221 附錄B : SEC數據阿達利母馬

濃度 [毫克/毫升] 平均濃度 [毫克/毫升] 單鱧[%] 平均單艟 m 聚集《[%] 平均聚集艟 [%] 片段[%] 平均片段 [%] 9.35 9.35 99.40 99.40 0.50 0.50 0.10 0.10 23.40 23.27 99.60 99.57 0.40 0.40 0.10 0.10 22.70 99.50 0.40 0.10 23.70 99.60 0.40 0.10 34.80 34.20 99.50 99.47 0.50 0.47 0.10 0.10 35.70 99.40 0.50 0.10 32,10 99.50 0.40 0.10 35.40 36.10 99.40 99.40 0.60 0.53 0.10 0.10 36.10 99*40 0.50 0.10 36.80 99.40 0.50 0.10 42.10 43.00 99.40 99.33 0.50 0.57 0.10 0.10 45.60 99.30 0.60 0.10 41.30 99.30 0.60 0.10 60.20 57.40 99.30 99.30 0.60 0.60 0.10 0.10 55.90 99.30 0.60 0.10 56.10 99.30 0.60 0.10 63.20 65.87 99.30 99.27 0.60 0.67 0.10 0.10 71.70 99.20 0.70 0.10 62.70 99.30 0.70 0.10 73.40 75.13 99.20 99.23 0.70 0.70 0.10 0.10 75.60 99.20 0.70 0.10 76.40 99.30 0.70 0.10 78.60 78.07 99.30 99.30 0.60 0.60 0.10 0.10 78.80 99.30 0.60 0.10 76.80 99.30 0.60 0.10 90.40 95.73 99.20 99.13 0.80 0.80 0.10 0.10 107.40 99.10 0.80 0.10 89.40 99.10 0.80 0.10 96.20 94.77 99.10 99.03 0.80 0.87 0.10 0.10 96.00 99.00 0.90 0.10 92.10 99.00 0.90 0.10 201.00 206.63 98.80 98.80 1.10 1.10 0.10 0.10 227.50 98.80 1.10 0.10 191.40 98.80 1.10 0.10 136383 -231 · 200938221 J695

濃度 [毫克/毫升] 平均濃度 [毫克/毫升] 單體[%] 平均單體 [%] 聚集體[%] 平均聚集體 [%] 片段[%] 平均片段 [%] 9.99 9.99 99.39 99.39 0.44 0.44 0.17 0.17 19.31 19.29 99.38 99.38 0.44 0.44 0.18 0.19 19.26 99.37 0.44 0.20 19.29 99.38 0.44 0.18 29.59 29.40 99.31 99.33 0.51 0.50 0.18 0.18 29.70 99.32 0.50 0.18 28.91 99.35 0.48 0.Γ7 37.97 37.55 99.31 99.29 0.52 0.52 0.17 0.19 38.02 99.27 0.52 0.21 36.65 99.30 0.51 0.19 49.15 46.32 99.19 99.20 0.60 0.60 0.21 0.20 45.95 99.20 0.60 0.20 43.87 99.20 0.61 0.19 58.75 56.18 99.16 99.16 0.64 0.64 0.21 0.21 55.02 99.17 0*64 0.20 54.76 99.15 0.63 0.22 77.69 77.81 99.11 99.10 0.70 0.70 0.19 0.20 77.62 99.09 0.69 0.22 78.13 99.10 0.70 0.20 94.45 97.65 99.05 99.06 0J2 0.71 0.23 0.22 105.06 99.06 0,72 0.21 93.45 99.07 0.70 0.23 116.37 114.52 98.94 98.91 0.85 0.88 0.21 0.22 113.92 98.91 0.88 0.22 113.27 98.89 0.90 0.22 121.21 133.25 98.87 98.89 0.91 0.90 0.22 0.22 139.80 98.89 0.89 0.22 138.73 98.90 0.89 0.21 226.67 217.53 98.58 98.57 1.19 1.21 0.24 0.23 216.10 98.58 1.18 0.24 209.83 98.54 1.25 0.21 136383 232- 200938221 人類血清白蛋白吸收峰1 吸收峰2 吸收峰3 吸收峰4 (HSA) 試樣面積面積面積面積面積面積面積面積 [mVs] [%] [mVs] [%] [mVs] [%] [mVs] m 試樣1 c=9.88毫克/毫升 59.710 2.312 2.975 0.115 43.159 1.671 2477.282 95.902 試樣2 c= 22.94毫克/毫升 102.785 2.685 7.859 0.205 73.588 1.923 3643.350 95.187 試樣3 c= 22.73毫克/毫升 124.226 3.071 11.038 0.273 83.310 2.059 3826.908 94.597 試樣4 c= 23.00毫克/毫升 138.353 3.266 14.525 0.343 88.429 2.087 3994.990 94.304 試樣5 c= 36.78毫克/毫升 147.465 3.459 14.537 0.341 91.304 2,141 4010.385 94.059 試樣6 c= 37.33毫克/毫升 153.956 3.552 14.707 0.339 94.093 2.171 4071.680 93.938 試樣7 c= 35.29毫克/毫升 171.478 3.608 16.064 0.338 105.244 2.214 4459.830 93.839 試樣8 c= 45.97毫克/毫升 180.027 3.675 17.392 0.355 109.717 2.239 4592.102 93.731 試樣9 c= 47.61毫克/毫升 193.325 3.719 . 19.206 0.370 116.474 2.241 4868.705 93.670 試樣10 c= 44.61毫克/毫升 191.512 3.799 19.167 0.380 112.261 2.227 4718.554 93.594 試樣11 c= 58.47毫克/毫升 215.044 4.026 17.870 0.335 118.481 2.218 4989.978 93.421 試樣12 c= 62.69毫克/亳升 218.072 4.037 20.088 0.372 122.251 2.263 5041.542 93.328 試樣13 c= 54.52毫克/毫升 228.014 4.053 19.957 0.355 126.583 2.250 5251.513 93.343 試樣14 c= 61.89毫克/毫升 231.235 4.085 22.518 0.398 127.330 2.250 5279.038 93.267 試樣15 c= 59.76毫克/毫升 237.894 4.100 22.939 0.395 130.352 2.246 5411.384 93.258 試樣16 c= 59.28毫克/毫升 202.103 4.139 17.178 0.352 108.780 2.228 4554.912 93.282 試樣17 c= 75.37毫克/毫升 230.552 4.196 18.565 0.338 123.207 2.242 5122.467 93.224 試樣18 c= 83.69毫克/毫升 215.365 4.162 18.136 0.351 110.152 2.129 4830.372 93.358

❹ 吸收峰1 吸收峰2 吸收峰3 吸收峰4 (HSA) 試樣面積面積面積面積面積面積面積面積 [mVs] m [mVs] [%] [mVs] [%] [mVs] m 試樣21 c= 84.22毫克/毫升 233.866 4.316 21.951 0.405 116.325 2.147 5046.183 93.132 試樣22 c= 80.50毫克/毫升 221.816 4.461 18.940 0.381 111.006 2.232 4620.655 92.926 試樣23 c= 115.93毫克/毫升 223.187 4.783 16.684 0.358 104.116 2.231 4322.732 92.629 試樣24 c= 110.00毫克/毫升 209.281 4.718 18.745 0.423 96.430 2.174 4111.363 92.686 試樣25 c= 112.30毫克/毫升 172.657 4.537 15.457 0.406 80.850 2.125 3536.192 92.932 試樣26 c= 182.79毫克/毫升 178.208 4.950 15.254 0.424 80.906 2.247 3325.648 92.379 試樣27 c= 178.24毫克/毫升 194.516 4.814 17.323 0.429 90.433 2.238 3738.717 95.520 試樣28 c= 172.05毫克/毫升 79.605 2.103 12.876 0.340 74.965 1.981 3617.238 95.576 -233 - 136383 200938221 附錄C : IEC數據阿達利母馬

濃度 [毫克/毫升] 平均濃度 [毫克/毫升] 總和離胺酸 [%] 平均總和 [%] 9.35 9.35 86.09 86.09 23.40 23.27 86.15 86.13 22.70 86.12 23.70 86.13 34.80 34.20 86.15 86.11 35.70 86.11 32.10 86.06 35.40 36.10 86.03 86.04 36.10 86.06 36.80 86.03 42.10 43.00 85.98 85.96 45.60 85.95 41.30 85.95 60.20 57.40 85.97 85.96 55.90 85.94 56.10 85.97 63.20 65.87 85.96 85.94 71.70 85.97 62.70 85.90 73.40 75.13 85.99 85.97 75.60 85.98 76.40 85.95 78.60 78.07 86.00 85.97 78.80 85.97 76.80 85.94 90.40 95.73 85.96 85.92 107.40 85.97 89.40 85.83 96.20 94.77 85.93 85.88 96.00 85.87 92.10 85.84 201.00 206.63 85.88 85.90 227.50 85.97 191.40 85.84 136383 -234- 200938221 J695

濃度 [毫克/毫升] 平均濃度 [毫克/毫升] 總和吸收峰 1-7 [%] 平均總和吸收峰 1-7 [%] 總和酸性吸收峰[%] 平均總和酸性吸收峰 [%] 總和鹼性吸收峰[%] 平均總和鹼性吸收峰 [%] 9.99 9.99 89.24 89.24 10.24 10.24 0.52 0.52 19.31 19.29 89.32 89.28 10.19 10.21 0.50 0.51 19.26 89.23 10.26 0.52 19.29 89.30 10.19 0.51 29.59 29.40 89.33 89.30 10.14 10.17 0.54 0.53 29.70 89.26 10.20 0.54 28.91 8932 10.16 0.52 37.97 37.55 89.32 89.30 10.13 10.15 0.56 0.55 38.02 89.27 10.18 0.55 36.65 89.31 10.15 0.55 49.15 46.32 89.07 89.10 10.40 10.37 0.53 0.53 45.95 89.12 10.34 0.54 43.87 89.12 10.36 0.53 58.75 56.18 89.13 89.17 1036 10.31 0.52 0.53 55.02 89.21 10.27 0.52 54.76 89.18 10.29 0.54 77.69 77.81 89.22 89.Π 10.25 10.29 0.53 0.54 77.62 89.09 10.36 • 0.55 78.13 89.20 10.26 0.55 94.45 97.65 89.20 89.16 10.28 10.30 0.52 0.54 105.06 89,12 10.33 0.55 93.45 89,16 10.29 0.55 116.37 114.52 89.03 89.08 10.41 10.36 0.56 0.55 113.92 89.15 10.31 0.54 113.27 89.06 10.37 0.56 121.21 133.25 89.26 89.13 10.20 10.33 0.54 0.55 139.80 89.07 10.38 0.56 138.73 89.05 10.40 0.55 226.67 217.53 88.72 88.78 10.69 10.63 0.59 0.59 216.10 88.82 10.60 0.58 209.83 88.81 10.60 0.59 136383 235- 200938221

附錄D

試驗項目成份測試之延續時間 63毫克/毫升 220毫克/毫升 5°C 5°C 透明性與乳白色混濁度最初 3.6 8.0 1個月 3.5 8.0 3個月 3.5 7.4 液體之顯色程度 B尺度最初 <B9 =B9 1個月 <B9 <B8 3個月 <B9 <B7 pH 單一值最初 5.3 5.4 1個月 5.3 5.4 3個月 5.3 5.4 微粒子污染：可見粒子目視評分最初 2.2 0.2 1個月 2.2 0.4 3個月 2.1 0.2 微粒子污染：亞可見粒子粒子>=10微:米 [/容器] 最初 181 357 1個月 423 290 3個月 216 1762 粒子>=25微米 [/容器] 最初 15 3 1個月 11 18 3個月 2 50 尺寸排阻層析(SE-HPLC) 主要吸收峰 (聚集體）[%] 最初 0.2 0.5 1個月 0.2 0.6 3個月 0.2 0.7 主要吸收峰 (單體）[%] 最初 99.8 99.4 1個月 99.7 99.3 3個月 99.7 99.2 主要吸收峰 (片段)[%] 最初 0.1 0.1 1個月 0.1 0.1 3個月 0.0 0.0 陽離子交換 HPLC (CEX-HPLC) 第1個酸性區域 [%] 最初 2.2 2.2 1個月 2.2 2.2 3個月 2.1 2.0 第2個酸性區域 [%] 最初 10.4 10.3 1個月 10.2 10.0 3個月 10.4 10.2 離胺酸變型之總和[%] 最初 86.0 86.1 1個月 85.9 85.9 3個月 86.2 86.1 在離胺酸1與離胺酸2間之吸收峰[%] 最相 0.8 0.8 1個月 1.0 .1.0 3個月 0.8 0.8 在離胺酸2後之吸收峰[%] 最初 0.5 0.6 1個月 0.7 0.9 3個月 0.5 0.8 136383 -236- 200938221

試驗項目成份測試之延續時間 63毫克/毫升 220毫克/毫升 25〇C/ 60% R.H. 25〇C/60% R.H. 透明性與乳白色混濁度最初 - - 1個月 3.51 8.55 3個月 3.70 7.56 液體之顯色程度 B尺度最初 - - 1個月 <B9 <B8 3個月 <B9 <B7 PH 單一值最初 - - 1個月 5.4 5.4 3個月 5.3 5.4 微粒子污染：可見粒子目視評分最初 - - 1個月 2.5 0.7 3個月 3.4 0.0 微粒子污染：亞可見粒子粒子>=10微米 [/容器] 最相 - - 1個月 412 490 3個月 277 4516 粒子>=25微米 [/容器] 最初 - - 1個月 10 14 3個月 7 128 尺寸排阻層析(SE-HPLC) 主要吸收峰 (聚集體）[%] 最初 - - 1個月 0.3 0.8 3個月 0.4 1.1 主要吸收峰 (單體）[%] 最初 - - 1個月 99.6 99.0 3個月 99.4 98.6 主要吸收峰 (片段)[%] 最初 - - 1個月 0.2 0.2 3個月 0.2 0.2 陽離子交換 HPLC (CEX-HPLC) 第1個酸性區域 [%] 最初 - - 1個月 2.5 2.4 3個月 3.4 3.2 第2個酸性區域 [%] 最初 - - 1個月 11.7 11.4 3個月 15.3 14.9 離胺酸變型之總和[%] 最初 - - 1個月 83.6 83.8 3個月 79.2 79.2 在離胺酸1 與離胺酸2間之吸收峰[%] 最初 - - 1個月 1.2 1.3 3個月 1.3 1.3 在離胺酸2後之吸收峰[%] 最初 - - 1個月 0.9 1.1 3個月 0.8 1.4 136383 - 237- 200938221

試驗項目成份測試之延續時間 63毫克/毫升 220毫克/毫升 40〇C/75% R.H. 40〇C/75% R.H. 透明性與乳白色混濁度最相 - - 1個月 3.93 7.80 3個月 3.70 8.10 液體之顯色程度 B尺度最初 - - 1個月 =B9 =B8 3個月 <B8 <B7 PH 單一值最初 - - 1個月 5.3 5.4 3個月 5.3 5.4 微粒子污染：可見粒子目視評分最初 - - 1個月 6.7 0.5 3個月 17.5 0.4 微粒子污染：亞可見粒子粒子>=10微米 [/容器] 最初 - - 1個月 1088 518 3個月 166 612 粒子>=25微米 [/容器] 最初 - - 1個月 16 14 3個月 11 30 尺寸排阻層析(SE-HPLC) 主要吸收峰 (聚集體）[%] 最初 - - 1個月 0.4 1.4 3個月 0.8 2.5 主要吸收峰 (單體）[%] 最初 - - 1個月 99.0 98.0 3個月 97.8 96.0 主要吸收峰 (片段）[%] 最初 - - 1個月 0.6 0.6 3個月 1.4 1.5 陽離子交換 HPLC (CEX-HPLC) 第1個酸性區域 [%] 最初 - - 1個月 6.7 6.8 3個月 17.5 17.4 第2個酸性區域 [%] 最相 - - 1個月 25.1 23.6 3個月 40.9 38.6 離胺酸變型之總和[%] 最初 - - 1個月 64.5 62.0 3個月 36.0 36.0 在離胺酸1 與離胺酸2間之吸收峰[%] 最初 - - 1個月 2.2 2.5 3個月 2.9 3.1 在離胺酸2後之吸收峰[%] 最初 - - 1個月 1.5 5.2 3個月 1.7 4.8 136383 -238- 200938221 oooo-z LI 200 os7 1 :S 3 〇 η 〇 CD D r»- 〇 o 〇> 〇> CN 密 ο CSJ Ο x> cn ί s s ί s s 1 g g l l I I 1 ! 1 1 1 DO CO 1 0丨 § 〇 LI 200 07α 5 〇 to l〇 «Λ· n r<4 s tM Ο CSl P^. CM* vn «0 «η <〇 00 oq (Ο ο ο 00 U200 06** & S 5 tn >η in tr> m 0' cq 9 ! ! I I I I I I I rg OJ r>- CN tf> CO 5 〇. oq Γ— ο S 卜〇 U200 OS'* 1 I I I I I I I I 1 I I I I I I I I <0 4g Μ (D ι» (O W) 0 to rsi OJ 0 O) ri in ro "i uv σ> 0 <0 CO eq αο S· U200 04*2 (D in »h kO 0 <q rsi 04 v> «»» o 0» cd 00 flO CO r^. 0 U200 os'2 <D tn tn 40 tn 〇 <£> 01 <SI 0 <0 (O m c> I 00 σ> <0 CO CO <〇 CO Ο Ν· U200 021 <〇 10 <D in m 〇 <p 0 C4 〇 CN| CO «0 I— «Μ ο »*· (D 0〇 oq CD Ο 卜 '〇 LI 200 011 «ύ 碡 to 10 CD i〇 in «0 〇 CM 0 卜 ri f ， CO <0 QO CO (Ο CO 0 i卜· !° LI 50 08*2 S 10 in 01 CNj CNI 01 0 eo ri 5 CM Ο 〇 a> αο (Ο |°~ ΙΟ Li 50 or*2 2 m tn Oi P-_ 〇 CM 〇 00 «0 ra CM σ> i 2 cq (D Ο ν> 1¾ 2- 5 0 〇 CD 密 si 厂 3 C4 cn ci «η CO 〇 OJ 03 CO z Oi in 00 CO eq CO U> Lt50 05, 5 i〇 vi 5 5 CD 密 h- CNI Ol « 5 5 «Η 〇> 3 0 00 <s «Ο (0 。 to LI50 04** δ 〇 § 〇 «- 5 〇 5 <〇 §i 卜 s eg tsl 卜丨 CO »n 0 esi σ> η' S 5 00 s oq ID 10 〇 LI SO 03^ %〇 8 〇 «5 8 〇 5 in <n ci 〇 <〇 si s <x> OJ Γ4 Γ- ΓΟ i i esi 〇> i 0 <0 fl〇 CO «0 <£3 in U 50 02*2 § σ S 〇 10 (〇 id s 〇 to O) σ> r· σ> σ> cq ca O CH O) CM 2 (d 00 «0 «Ο «0 u> LI 50 0112 涿 σ S 〇 v tn 5 0 (D 密卜〇> σ> ri ra «0 fO ^1 σ> ο OJ of CD s 0 <d «0 cn 03 <0 <q 测試之 1«. 1個月吞 MB 1個_月— 1個月 •8 嗶 OC 1個月 •运蝌 1個月 •s <« 1個月 •8 dc 1個月〇： 5 成分吸收(340毫微米）目祝 l «ί- 主要吸收峰主要吸收峰；8.4»\(βΛ1 主要吸收峰第1個酸性菡域似1 第2個酸性运域 r%i 離胺酸變型之總和 r〇zi esi 粜镰s? 5Ϊ ：^s 會隹试驢對象透明性與乳6色顯色程度尺寸排阻層析 (SE-HPLC) 隋離子交換 HPLC (CEX-HPLC) 136383 -239- 200938221

3¾ 3 ° S 5 5 4] 磉〇t w «D Vtk «4 珀 in U) m ο S I II I i II 11 11 I II II IB i 11 ο' <Μ ο CO CM· ο V R sl 11 11 11 I II 11 11 «〇 CO *〇_ αι 3 ° J I <〇 tn « *n tn SJ 3 (Μ s V « ϋ η <q a» o σ> St* 3 s ! s σ «〇 m* m « β〇 «Ν ο 气 ηρ Ν» CM· ; ， <〇, eq OD <〇_ α» ο 1¾ 1 8 CNl (O U3 (O in « αα tN οι ο 〇> ri ο yf U) α> ο a r^ i〇 o α· or* =3 d II II II II II II II II II II to ui vi v> βα rj C4 ο (O V V ο 卜 ο «> 卜 o h- o α>. LI 200 LI 200 02*3 03^ to to <〇 in u> o Β〇 Μ <Μ ο to CO 5 βα σ» r- σ <q CD <q α> ο (O in <〇 in in CO ίΝ| ο «0 CO Ο V CM ο 卜 ο » 00 <〇 (η Ώ ° to in U) tn V) o «Ο 04 04 卜 CO ο V 令 ο to ο t η op (D ◦· <〇 Φ S-co 二〇 5 2 eg o C4 CM· Ν ο CNI Γ4 Φ CO CN <Ν Ο 二 (Ο t W «0 ao o' 〇 <D ID J 〇 s· S ΓΊ o rg ο «0 CO ;· <0 Ο Ο "«r t η s CO O). <D ο 1¾ S 5 o 卜 W 卜 a> r> 04 Ο Ο «〇 s 口- «0 eo o' ®· to «Ε> 1¾ 1¾ 以 Zj 〇 S 5 o Ν Ο Ν CNJ 卜 ri CM ，· ο ο 臂 s «0 «0 CO 〇 <D S 5 τ- Ο Γ4 Ν ο <Ν K Λ ν> ο 0» ο « t « <〇 « 0» 〇· CD 卜· 5 U) o CM σ <〇 <0 CM. eg ϊΐ V V 會 ο ο s CO w to CO o to r*- ο 3 〇 II S «η o CS ο <0 〇> 〇> (D s η ο CN ο rs. <*> ΟΙ V ts. Ο α» ο t ，r C*) cp CO tt <n <0 a <D s 二 3 〇 II 令 (〇 to o <Μ ο <〇 s α> 珐 ΙΟ C4 «0 <ri V φ ο α> ο «0 m 00 CO CO CO 〇> o to o 卜 Ο Sv •g e: 9 .s β: -孩 «：華 -£ β： m 皭 β： •S 單 •s β：單存 β： m •S e; 早 «*： m 莽單 u ο δ 5 BD \ »* 争2 起s 砵s Λίί IS 5¾ U Hi 5 ti 單 -H 械g ¢1 頃 <Μ -- S达 CM p s# 隹爹, 鍰w 却E ♦ ¥ Cvj 粜 t $v 典 5ί «&3 φ «r w _ 一 ώ ΰ 5¾ V ώ ^ 52. 连〇 <K a! lis 136383 -240- 200938221 ο ο aol 1¾ I I I I I I I I I I I I I I I I <N i CVJ o' (O 0 8 5 vn 另 o' 1 Ξ* i CM o’ 3 〇» n s- 1 <〇 o* y— 5 E 5 a> s 〇" o 5 8 5 Μΰ 礫 b) 7 «f «} 破 Μ 7 s « 3 «> U) o El u> Is] CM s Ξ & i O ο «ο Γ*ί 5 c*> CM σ» cs «Α s 气 S α> 〇 <〇 Ο § ^ Ζί ° ΐδ ΙΑ ΰ to U) o' s a C9 s Si s' 娶 o 3 ο CO to ΙΟ 〇> c«< r> s WY αο 〇 <q 5 1¾ S ΙΟ £ «> s o !· σ> 3 s i & s o S 〇 ϊϊ (D vi to a> <〇 s <〇· Φ CD 5 CD cn |s ΰ (Ο 1〇· 窆 o rt CO s s 00 & 娶 o ΓΜ Ο ο» η w to* m 〇> <〇 <D s 〇 C4 <〇 «0 ο CS1 OI (D 〇> 氓 kri ΰ «ο i o t— r> § s o S ο V) V <〇 ΙΑ 5 Γ ΟΟ CM 09 ύ 0D οο ο S 卜· ο». 莒8 kO S tn ? o 5 货 VI «0 & 妄 o 邑 Ο <〇 ο" Ο tf) eo 〇 iO CD CM CM £ 〇 eg* <〇 C0 CM ri (D 〇〇. 1 rs 这 ΙΑ »η s in CO 芩 r— CM s Φ CD s i o ε ο οο ο <〇 tn CM o 9 S «* S 卜· S «0 5 <〇· σ>· I 二 3 ° !η ΙΟ ϋί σ> 5 O s «*9 s CM s s α> CD o Ρ ο Γ-» « « •ο 令 o (O a 〇 «Μ* (0 *〇· ο «Ί (Μ (D 〇> τ- 1¾ 5 苳 Ui S O 5 o 馆 CD s r- s s o η «0 «ο u> ΙΟ evt o 卜 8 (D W) S C0 ο 5 ID 气 Is uj 苳 ν> 3 O o s <〇 s u> 3 S' s 5 1 €0 Γϊ 膂 (Ο o o cs R ·«*· s 〇>· S «ο :- IO 气 1¾ 5 to l*> vi tn o 〇» o s <D i s a ίο 卜 ο 〇> «0 βο •ο o GO 03 40 2 〇>· S αο «Η CM o eo 1¾ 關驪l__i腿_i關關關 r3 ο ui i i 5 u> iillll- C0 U) U) o 卜〇l <M CO 2 οβ V σ> CM Μ· cq «Ο 3¾ m iiilii va ΙΑ o r- S t W βο <〇 οί ID CO· 1¾ % \〇 ¢0 ΙΟ 卜 o 00 〇> «Μ C4 2 〇. Φ «*> <0 <〇 rt τ· Is 鼴__圓鼴調醐 W6汝 •s «：單 «C m m 1 翠 & m «ζ 單 π 單 «：單 r* ej 9 τ~ « βζ m 9 来 M o 5 ff m 1 »(- 争- t — 皙 ϋ) ii 壤單 % m CQ — Mr苎 W 斟 w 雄3 鎳艺详嫌 « i % 鬌 ϊ s # «ί 5ί 珀¥ <0 % 尺寸排阻層析 (SE-HPLC) 蜻離子交換 HPLC (CEX-HPLC) 136383 •241 - 200938221 等效事物熟諳此藝者將明瞭，或能夠使用不超過例行實驗術，以確定對本文中所述之本發明特殊具體實施例之許多等效事物。此種等效事物係意欲被下述請求項所涵蓋。在整個本申請案中引用之所有參考資料、專利及已公告之專利申請案均併於本文供參考。【圖式簡單說明】

0 鐵7顯示阿達利母馬參考標準物AFP04C(底線），於DF/UF 處理如（中線）與後（頂線）之阿達利母馬DS藥物之SEC層析圖。嚴2顯示在添加賦形劑化合物至經處理之阿達利母馬單體中時’花楸醇（不可離子化之賦形劑）與NaC1 (可離子化之賦形劑）濃度對於阿達利母馬單體之流體動力學直控（Dh)之衝擊。顯示J695參考標準物（下圖）與j695 ds (pH經調整至PH Ο 4·4)(上圖）之IEC分佈形態。屬^顯示使用Milli-Q水之DF/UF後之J695 (pH 4.7)(上圖），與 DF/UF前之J695 DS (pH經調整至pH 4.4)(底部曲線）之IEC分佈形態。 # 5係以圖形方式描繪阿達利母馬（已溶於wpj中）之流體動力學直徑（z-平均）與濃度之關聯性。X :以使用u砂站作為假定試樣黏度之S〇p所測得。y :以使用L9 mpas作為假定試樣黏度之SOP所測得。嚴6係以圖形方式描繪阿達利母馬（已溶於WFI中）之流 136383 • 242- 200938221 ，置曹>妇· 力千直徑（吸收峰單體）與濃度之關聯性。X:以使用L1 作為假定試樣黏度之SOP所測得。y :以使用1.9 mpas作為饭疋甙樣黏度之SOP所測得。鐵7係以圖形方式描繪j695 (已溶於WFI中）之流體動力學直徑（Z平均）與濃度之關聯性。X :以使用1.1 mPas作為假定忒樣黏度之sop所測得。y:以使用1.9mPas作為假定試樣黏度之SOP所測得。 ❹鐵§係以圖形方式描繪J695 (已溶於wh中）之流體動力學直(吸收峰單體）與濃度之關聯性。X :以使用1.1 mPas作為假定試樣黏度之SOP所測得。y :以使用1.9 mPas作為假定試樣黏度之SOP所測得。嚴9顯示阿達利母馬之離胺酸〇、1及2之總和[%]係依賴在注射用水中之阿達利母馬濃度。嚴仏顯示J695之吸收峰1至7之總和[%]係依賴在注射用水中之J695濃度。 Q 羼"顯示J695之酸性吸收峰之總和[%]係依賴在注射用水中之J695濃度。琢i2顯示J695之鹼性吸收峰之總和[%]係依賴在注射用水中之J695濃度。屬73顯示在實例12中所進行滲析之效率，以負責調配物之滲透度與導電率之成份降低為觀點（BDS，74毫克/毫升， 10 毫升試樣體積，SpectraPor7 MWCOlOk)。鏍^顯示在經滲析阿達利母馬整體溶液中之pH程度安定性。顯示對著去離子水滲析（1:1，000,000)前後之pH程度 136383 -243- 200938221 (BDS 74毫克/毫升，10毫升試樣體積，SpectraPor7 MWCOlOk) 羼75顯不在冷凍解凍後，關於250毫克/毫升與200毫克/ 毫升低離子性阿達利母馬溶液之瓶子定圖讀密度數據。羼76顯不在冷凍解凍後，關於250毫克/毫升與200毫克/ 毫升低離子性阿達利母馬溶液之瓶子定圖譜阳數據。屬^7顯不在冷凍解凍後，關於25〇毫克/毫升與2⑻毫克/ 毫升低-離子性阿達利母馬溶液之瓶子定圖譜濃度數據。 φ 羼Μ顯不在冷凍解凍後，關於250毫克/毫升與200毫克/ 毫升低離子性阿達利母馬溶液之瓶子定圖譜滲透度數據。羼作顯示在冷凍解凍後，關於250毫克/毫升與200毫克/ 毫升低-離子性阿達利母馬溶液之瓶子定圖譜導電率數據。屬"20顯示低-離子性阿達利母馬（於圖2〇中被稱為d2e7)溶液之SEC分析，其無論是在DF/UF後於2-8。(：下儲存8.5個月 (底部曲線），或在DF/UF後於_8(rc下儲存4 5個月（頂部曲線）。〇羼27顯示於冷凍-解凍程序之前（το)及於各四次冷凍_解凍之後（ΤΙ、T2、T3及T4)，經調配在各種溶液中及在水中之單株抗體1D4.7之安定性。嚴22顯示於冷凍-解凍程序之前（T0)及於各四次冷;東_解凍之後（ΤΙ、T2、T3及T4)經調配在水中及以各種緩衝劑調配之單株抗體13C5.5之安定性。空白試驗=WFI對照試樣。羼23顯示於冷凍-解凍程序之前（τ〇)及於各四次冷束解凍之後（ΤΙ ' Τ2、Τ3及Τ4)，經調配在水中及以各種所添加賦形劑調配之單株抗體13C5.5之安定性。空白試驗=…^對 136383 -244- 200938221 照試樣。羼以顯示阿達利母馬（WFI調配物）之濃度與溶液pH對於溶液黏度之衝擊。羼25顯示關於不同濃度與pH值之阿達利母馬溶液調配物）之混濁度數據。 # 2(5顯示關於在不同pH值與濃度下之阿達利母馬溶液 (WFI調配物）之流體動力學直徑（Dh)數據。嚴27顯示關於在不同濃度下，於水溶液pH 5中之阿達利 © 母馬，藉由強度之大小分佈圖表（Dh度量）。羼Μ顯示關於在不同pH程度下，於水中之1〇〇毫克/毫升阿達利母馬’藉由強度之大小分佈。屬7 29亦顯示關於在不同pH程度下，於水中之1〇〇毫克/毫升阿達利母馬’藉由強度大小之分佈。 #如顯示關於在水中之阿達利母馬之單體含量（SEC)。羼顯示關於在水中之阿達利母馬之聚集體含量（SEC)。廢％顯示兩種J695溶液（WFI調配物）之黏度作為溶液溫 Ό 度之函數。屬33係以圖形方式描繪當藉由亞可見粒子（>1微米）度量時，在重複冷凍/解凍(f/t)循環期間，對於許多不同調配物之1D4.7抗體安定性。羼別係以圖形方式描繪當藉由亞可見粒子（> 1〇微米）度量時’在重複冷凍/解凍(f/t)循環期間，對於許多不同調配物之13C5.5抗體安定性。蘑35係以圖形方式描繪當藉由亞可見粒子（>;1微米）度量 136383 -245· 200938221 時，在重複冷凍/解凍（f/t)循環期間，對於許多不同調配物之13C5.5抗體安定性。屬^6係以圖形方式描繪當藉由亞可見粒子（>1微米）度量時，在重複冷凍/解凍（f/t)循環期間，對於許多不同調配物之7C6抗體安定性。

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Claims

200938221 十、申請專利範圍：一種含水調配物，其包含蛋白質與水，其中調配物具有導電率低於約2.5 mS/公分，且蛋白質具有分子量（Μ*)大於約 47 kDa ° 2. 3. 4. 5. 6. 7. 如請求項1之調配物，其中蛋白質具有Mw大於約57kDa。如請求項工之調配物，其中蛋白質具有Mw大於約1〇〇kDa。如請求項1之調配物，其中蛋白質具有Mw大於約i5〇kDa。 ❹ 如响求項1之調配物，其中蛋白質具有Mw大於約2〇〇。如明求項1之調配物，其中蛋白質具有Mw大於約25〇。如請求項1之調配物，其中調配物具有導電率低於約2mS/ 公分。 8. 如清求項i之調配物，其中調配物具有導電率低於約】$ mS/公分。 9. 如請求項1之調配物，其中調配物具有導電率低於約lmS/ 公分。士求項1之調配物，其中調配物具有導電率低於約〇.5 mS/公分。 11·種含水調配物’其包含在至少約1〇微克/毫升濃度下之蛋白質與水，其中調配物具有導電率低於約2 ms/公分。 12. 如請求項11之調配物，其中蛋白質之濃度為至少約1毫克/ 毫升。 13. 如請求項11之調配物，其中蛋白質之濃度為至少約10毫克 /毫升。 14. 如請求項η之調配物，其中蛋白質之濃度為至少約5〇毫克 136383 200938221 /毫升。 15. 如請求項u之調配物’其中蛋白質之濃度為至少約ι〇〇毫克/毫升。 16. 如請求項11之調配物，其中蛋白質之濃度為至少約150毫克/毫升。 17. 如請求項u之調配物’其中蛋白質之濃度為至少約2〇〇毫克/毫升。 ❹18.如請求項11之調配物，其中蛋白質之濃度係大於約200毫克/宅升。 19.如請求項u之調配物，其中調配物具有導電率低於約1 mS/ 公分。 2〇·如請求項u之調配物，其中調配物具有導電率低於約〇 5 mS/公分。 21. —種含水調配物，其包含在至少約5〇毫克/毫升濃度下之蛋白質與水’其中調配物具有滲透度為不超過約3〇毫滲透 ❿ 度/公斤。 22. 如凊求項21之調配物，其中調配物之滲透度為不超過約15 毫滲透度/公斤。 23. 如請求項21之調配物，其中蛋白質之濃度為至少約1〇〇毫克/毫升。 24. 如請求項21之調配物，其中蛋白質之濃度為至少約15〇毫克/毫升。 25. 如請求項21之調配物，其中蛋白質之濃度為至少約2〇〇毫克/毫升。 136383 200938221 26. 如請求項21之調配物，其中蛋白質之濃度係大於約200毫克/毫升。 27. —種含水調配物，其包含水與特定濃度之蛋白質，其中蛋白質具有流體動力學直徑（Dh)，其至少約50%小於緩衝溶液中特定濃度下之蛋白質之Dh。 28. 如請求項27之調配物，其中蛋白質之Dh為至少約50%小於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中特定濃度下之蛋白質之Dh。 29. 如請求項28之調配物，其中蛋白質之Dh為至少約60%小於 PBS中特定濃度下之蛋白質之Dh。 30. 如請求項28之調配物，其中蛋白質之Dh為至少約70%小於 PBS中特定濃度下之蛋白質之Dh。 31. 如請求項1-30中任一項之調配物，其中蛋白質為抗體或其抗原結合片段。 32. 如請求項31之調配物，其中抗體或其抗原結合片段係選自包括嵌合抗體、人類抗體、人化抗體及功能部位抗體（dAb)。 0 33.如請求項31之調配物，其中抗體或其抗原結合片段為抗 -TNFa或抗-IL-12抗體。 34.如請求項31之調配物，其中抗體或其抗原結合片段係選自包括Humira (阿達利母馬（Adalimumab))、肯巴斯（Campath)(阿連圖馬伯（Alemtuzumab))、CEA-Scan Arcitumomab (fab 片段）、部比圖斯（Erbitux)(些圖西馬伯（Cetuximab))、贺西伯亭（Herceptin) (搓史圖諸馬伯（Trastuzumab))、Myoscint (Imciromab Pentetate)、前列腺閃爍體（卡普洛馬伯片迪肽(Capromab Pendetide))、瑞米卡得（Remicade)(因弗利西馬（Infliximab))、ReoPro (亞伯西瑪 136383 200938221 伯（Abciximab))、利圖散（Rituxan)(利圖西馬伯（Rituximab))、 Simulect (巴西利馬伯（Basiliximab))、Synagis (柏利維充諸馬 (Palivizumab))、Verluma (諾非圖莫伯（Nofetumomab))、Xolair (歐馬利祖馬（Omalizumab))、Zenapax (達可利諸伯（Daclizumab))、吉維林（Zevalin)(衣利圖莫伯提克西坦（Ibritumomab Tiuxetan))、Orthoclone OKT3 (目洛蒙那伯（Muromonab)-CD3)、 Panorex (艾卓可羅伯（Edrecolomab))、米若塔革（Mylotarg)(堅圖住馬伯歐坐加霉素（Gemtuzumab ozogamicin))、古利馬伯 ❹ (golimumab) (Centocor)、Cimzia (Certolizumab pegol)、Soliris (也苦利馬伯（Eculizumab))、CNTO 1275 (ustekinumab)、Vectibix (片尼圖努馬伯（panitumumab))、貝克薩（Bexxar)(托西圖莫伯 (tositumomab)與I131托西圖莫伯（tositumomab))及阿威斯汀 (Avastin)(貝發西馬伯（bevacizumab)) 〇 35.如請求項1-30中任一項之調配物，其中蛋白質為治療蛋白質。 @ 36.如請求項35之調配物，其中治療蛋白質係選自包括普莫吉美（Pulmozyme)(鏈道酶 alfa)、Rebif、瑞革蘭尼（Regranex)(貝卡列明（Becaplermin))、亞克提維斯（Activase)(阿帖普酶（Alteplase)) 、阿度拉酶（Aldurazyme) (Laronidase)、阿美威維（Amevive)(阿列發謝特（Alefacept))、阿拉内普（Aranesp)(達貝艾波亭 (Darbepoetin) alfa)、貝卡列明（Becaplermin)浪縮物、貝他色隆 (Betaseron)(干擾素点-lb)、玻拓克斯（BOTOX)(肉毒毒素A 型）、Elitek (來斯布利酶（Rasburicase))、約爾史巴（elspar)(天冬醯胺酶）、Epogen (艾波亭（Epoetin) alfa)、恩布瑞爾（Enbrel)(恩 136383 200938221 塔臬西伯（Etanercept))、Fabrazyme (Agalsidase 約、干擾原（Infergen) (干擾素 alfacon-1)、因特隆（Intron) A (干擾素 o:-2a)、Kineret (安那金拉（Anakinra))、MYOBLOC (肉毒毒素B型）、紐拉斯塔 (Neulasta)(佩非葛拉亭（Pegfilgrastim)) 、Neumega (歐普瑞維金 (Oprelvekin))、紐波真（Neupogen)(非葛拉亭（Filgrastim))、歐塔克（Ontak)(丹尼白血球素待弗提托斯（Denileukin diftitox))、 PEGASYS (PEG干擾素a-2a)、前白血球素（阿迪斯白血球素 (Aldesleukin))、普莫吉美（Pulmozyme)(鏈道酶 alfa)、Rebif (干擾素尽la)、瑞革蘭尼（Regranex)(貝卡列明（Becaplermin))、瑞塔威斯（Retavase)(瑞替普酶(Reteplase))、Roferon-A (干擾素 cz-2)、 TNKase (腱激酶）、Xigris (Drotrecogin alfa)、Arcalyst (Rilonacept)、 NPlate (Romiplostim)、Mircera (甲氧基聚乙二醇-艾波亭（epoetin) 功、Cinryze (Cl 醋酶抑制劑）、Elaprase (idursulfase)、Myozyme (阿葡萄糖菩酶（alglucosidase) alfa)、歐倫西亞（Orencia)(阿巴塔謝特（abatacept))、Naglazyme (galsulfase)、克比凡斯（Kepivance)(巴利弗明（palifermin))及 Actimmune (干擾素 ylb)。 37. —種含水調配物，其包含在至少約10毫克/毫升濃度下之抗體或抗原結合片段，與水，其中抗體或抗原結合片段具有流體動力學直徑（Dh)小於約5微米。 38. 如請求項37之調配物，其中抗體具有Dh小於約3微米。 39. 如請求項37或38之調配物，其中抗體或其抗原結合片段係選自包括嵌合抗體、人類抗體、人化抗體及功能部位抗體 (dAb) ° 40. 如請求項37或38之調配物，其中抗體或其抗原結合片段為 136383 200938221 抗-TNFa或抗-IL-12抗體。 41. 如請求項37或38之調配物，其中抗體或其抗原結合片段係選自包括Humira (阿達利母馬（Adalimumab))、肯巴斯（Campath) (阿連圖馬伯（Alemtuzumab))、CEA-Scan Arcitumomab (fab 片段）、部比圖斯（Erbitux)(些圖西馬伯（Cetuximab))、賀西伯亭 (Herceptin)(搓史圖諸馬伯（Trastuzumab))、Myoscint (Imciromab Pentetate)、前列腺閃爍體（卡普洛馬伯片迪肽（Capromab Pendetide))、瑞米卡得（Remicade)(因弗利西馬（Infliximab))、 ❹ ReoPro (亞伯西瑪伯（Abciximab))、利圖散（Rituxan)(利圖西馬伯（Rituximab)) ' Simulect (巴西利馬伯（Basiliximab))、Synagis (柏利維充諸馬（Palivizumab))、Verluma (諾非圖莫伯（Nofetumomab)) 、Xolair (歐馬利祖馬（Omalizumab))、Zenapax (達可利諸伯 (Daclizumab))、吉維林（Zevalin)(衣利圖莫伯提克西坦 (Ibritumomab Tiuxetan)) 、Orthoclone OKT3 (目洛蒙那伯 (Muromonab)-CD3)、Panorex (艾卓可羅伯（Edrecolomab))與米若 ❹ 塔革（Mylotarg)(堅圖住馬伯歐坐加霉素（Gemtuzumab ozogamicin))、古利馬伯（golimumab) (Centocor) 、 Cimzia (Certolizumab pegol)、Soliris (也苦利馬伯（Eculizumab))、CNTO 1275 (ustekinumab)、Vectibix (片尼圖努馬伯（panitumumab))、貝克薩（Bexxar)(托西圖莫伯（tositumomab)與I13 1托西圖莫伯 (tositumomab))及阿威斯 ίτ (Avastin)(貝發西馬伯（bevacizumab))。 42. 如請求項1-30或37中任一項之調配物，其係進一步包含不可離子化之賦形劑。 43. 如請求項42之調配物，其中不可離子化之賦形劑係選自包 136383 200938221 括糖醇類與多元醇，譬如甘露醇或花揪醇，非離子性界面活!·生劑、蔗糖、海藻糖、植物蜜糖及麥芽糖。 44. 如请求項43之調配物，其中非離子性界面活性劑為聚花楸 20、聚花楸酸酯4〇、聚花楸酸酯6〇或聚花楸酸酯8Q。 45. 如印求項μ30或37中任—項之調配物，其中調配物係為安疋的，呈液體形式，歷經至少約3個月。 46. 如印求項υο或37中任—項之調配物，其中調配物係為安 ❹疋的，呈液體形式，歷經至少約12個月。 47. 如凊求項1_3〇或37中任—項之調配物，其中調配物係為安定的，歷經至少約3個月，呈選自包括經冷凍、凍乾或喷霧乾燥之形式。 48. 如吻求項1_3〇或37中任—項之調配物，其中調配物不包含作用劑，選自包括滲透性改變劑、安定劑、界面活性劑、抗氧化劑、低溫保護劑、膨鬆劑、凍乾保護劑、鹼性成份及酸性成份。 φ 49.如明求項丨_3〇或37中任一項之調配物，其係進一步包含至少約一種其他不同蛋白質。 5〇·如請求項1-3〇或37中任一項之調配物，其中調配物係適用於活體外用途。 51·如請求項1-30或37中任一項之調配物，其中調配物係適用於活體内用途。 52.如凊求項51之調配物其中調配物係適用於經由一種投藥模式投予病患，選自包括皮下、靜脈内、吸入、皮内、經皮、腹膜腔内及肌内。 136383 200938221 53. —種如请求項51之調配物於藥劑製造上之用途，該藥劑係在病患中用於治療病症。 · 54. 一種裝置’其包含如請求項“ο或37中任一項之調配物。 55. 如請求項54之裝置，其中裝置係、選自包括注射器、筆、植入物、無針頭注射裝置、吸入裝置及貼藥。 56. 種製造物件’其包含如請求们或π中任一項之調配物。〇種製備包含蛋白質與水之含水調配物之方法，此方法包括：裡洛敬中提供蛋白質 °·) 仕弟 w 只, b) 使該第一種溶液中接受渗渡，使用水作為渗渡媒直到與水之至少五倍體積交換已被達成為止，於是製備含水調配物。 %· —種製備蛋白質含 3水調配物之方法，此方法包括： Ο ^在第一種溶液中提供蛋白質；二使該第—種溶液中接受渗遽，使用水作為滲濾媒質直到與水之至少五彳立I*籍i " 體積父換已被達成為止，於是製備、士滲濾之蛋白質溶液；及 c) 濃縮經渗滴$ I A Μ 調配物。4之蛋白質溶液’於是製備蛋白質之含水 59. 如請求項58之方離心分離達成。慮蛋白質溶液之濃縮係經由 60. 如請求項57_59中任— 61. 如請求項57_59中、、’其中滲濾媒質包括水。任—項之方法，其中係使第一種溶液接受 136383 200938221 以水之滲渡，直到達成至少約六倍體積交換為止。 62. 如請求項57_59中任—項之方法，其巾係使第—種溶液接受以水之滲滤，直到達成至少約七倍體積交換為止。 63. 如請求項57-59中任一項之方法，其中含水調配物係具有職形劑之最後濃度為至少約95%低於第__種溶液。 64. 如請求項57-59中任一 j盲之古員之方法，其中含水調配物係具有賦形劑之最後濃度為至少約99%低於第一種溶液。 ❿ ❹ 65♦如清求項57-59中任一頂夕女、+斗丄 ^… 項之方法，其中第一種蛋白質溶液係付自哺乳動物細胞表現系絲㈣現系統’且已被純化，以移除宿主細胞蛋白質（HCP)。其中蛋白質具有Mw大於其中蛋白質具有厘*大於其中蛋白質具有！^大於其中蛋白質具有Mw大於其中蛋白質具有MW大於其中蛋白質具有Mw大於 66. 如晴求項57-59中任一項之方法約 1 kDa。 67. 如s青求項57-59中任一項之方法約 10 kDa。 68·如睛求項57-59中任一項之方法約 47 kDa。 69. 如凊求項57-59中任一項之方法約 57 kDa。 70. 如請求項57-59中任一項之方法約 100 kDa。 71. 如請求項57-59中任一項之方法約 150 kDa。 72·如請求項㈣中任一項之方約200 kDa。、Y蛋白質具有Mw大 136383 200938221 73. 如請求項57-59中任一項之方法，其中蛋白質具有Mw大於約 250 kDa。 74. 如請求項57-59中任一項之方法，其係進一步包括添加賦形劑至含水調配物中。 75. 如請求項74之方法，其中含水調配物為醫藥調配物。 76. 如請求項57-59中任一項之方法，其中含水調配物為醫藥調配物。 77. 如請求項76之方法，其係進一步包括將含水調配物裝填至適合對病患投予含水調配物之裝置中。 78. 如請求項77之方法，其中裝置係選自包括注射器、筆、植入物及皮膚貼藥。 79. 如請求項57-59中任一項之方法，其中蛋白質為抗體或其抗原結合片段。 80. 如請求項79之方法，其中抗體或其抗原結合片段係選自包括嵌合抗體、人類抗體、人化抗體及功能部位抗體（dAb)。 81. 如請求項79之方法，其中抗體或其抗原結合片段為抗-TNF α或抗-IL-12抗體。 82. 如請求項79之方法，其中抗體或其抗原結合片段係選自包括Humira (阿達利母馬（Adalimumab))、肯巴斯（Campath)(阿連圖馬伯（Alemtuzumab))、CEA-Scan Arcitumomab (fab 片段）、部比圖斯（Erbitux)(些圖西馬伯（Cetuximab))、贺西伯亭（Herceptin) (搓史圖諸馬伯（Trastuzumab))、Myoscint (Imciromab Pentetate)、前列腺閃爍體（卡普洛馬伯片迪肽(Capromab Pendetide))、瑞米卡得（Remicade)(因弗利西馬（infliximab)) ' ReoPro (亞伯西瑪 136383 -10- 200938221 伯（Abciximab))、利圖散（Rituxan)(利圖西馬伯（Rituximab))、 Simulect (巴西利馬伯（Basiliximab))、Synagis (柏利維充諸馬 (Palivizumab))、Verluma (諾非圖莫伯（Nofetumomab))、Xolair (歐馬利祖馬（Omalizumab))、Zenapax (達可利諸伯（Daclizumab))、吉維林(Zevalin)(衣利圖莫伯提克西坦（Ibritumomab Tiuxetan))、 Orthoclone OKT3 (目洛蒙那伯（Muromonab)-CD3)、Panorex (艾卓可羅伯（Edrecolomab))、米若塔革（Mylotarg)(堅圖住馬伯歐坐加霉素（Gemtuzumab ozogamicin))、古利馬伯（golimumab) (Centocor)、Cimzia (Certolizumab pegol)、Soliris (也苦利馬伯 (Eculizumab))、CNTO 1275 (ustekinumab)、Vectibix (片尼圖努馬伯（panitumumab))、貝克薩（Bexxar)(托西圖莫伯（tositumomab)與 I131托西圖莫伯（tositumomab))及阿威斯汀（Avastin)(貝發西馬伯（bevacizumab)) 〇 83. 如請求項57-59中任一項之方法，其中蛋白質為治療蛋白質。 84. 如請求項83之方法，其中治療蛋白質係選自包括普莫吉美 (Pulmozyme)(鏈道酶 alfa)、Rebif、瑞革蘭尼（Regranex)(貝卡列明（Becaplermin))、亞克提維斯（Activase)(阿帖普酶（Alteplase))、阿度拉酶（Aldurazyme) (Laronidase)、阿美威維（Amevive)(阿列發謝特（Alefacept))、阿拉内普（Aranesp)(達貝艾波亭 (Darbepoetin) alfa)、貝卡列明（Becaplermin)濃縮物、貝他色隆 (Betaseron)(干擾素/3-lb)、玻拓克斯（BOTOX)(肉毒毒素A 型）、Elitek (來斯布利酶(Rasburicase))、約爾史巴（elspar)(天冬醯胺酶）、Epogen (艾波亭（Epoetin) alfa)、恩布瑞爾（Enbrel)(恩 136383 -11 - 200938221 塔臬西伯（Etanercept))、Fabrazyme (Agalsidase /5)、干擾原（Infergen) (干擾素 alfacon-1)、因特隆(Intron) A (干擾素 a-2a)、Kineret (安那金拉（Anakinra))、MYOBLOC (肉毒毒素B型）、紐拉斯塔 (Neulasta)(佩非葛拉亭（Pegfilgrastim))、Neumega (歐普瑞維金 (Oprelvekin))、紐波真（Neupogen)(非葛拉亭（Filgrastim))、歐塔克（Ontak)(丹尼白血球素待弗提托斯（Denileukin diftitox))、 PEGASYS (PEG干擾素a-2a)、前白血球素（阿迪斯白血球素 (Aldesleukin))、普莫吉美（Pulmozyme)(鏈道酶 alfa)、Rebif (干擾素yS-la)、瑞革蘭尼（Regranex)(貝卡列明（Becaplermin))、瑞塔威斯（Retavase)(瑞替普酶（Reteplase))、Roferon-A (干擾素 α-2)、 TNKase (腱激酶）及 Xigris (Drotrecogin alfa)、Arcalyst (Rilonacept)、 NPlate (Romiplostim)、Mircera (甲氧基聚乙二醇-艾波亭（epoetin) /3)、Cinryze (Cl 酯酶抑制劑）、Elaprase (idursulfase)、Myozyme (阿葡萄糖誓酶（alglucosidase) alfa)、歐倫西亞（Orencia)(阿巴塔謝特（abatacept))、Naglazyme (galsulfase)、克比凡斯（Kepivance)(巴利弗明（palifermin))及 Actimmune (干擾素 T_lb)。 85. 如請求項57-59中任一項之方法，其中含水調配物包含至少約兩種不同蛋白質。 86. —種含水調配物，其係根據如請求項57-59中任一項之方法製成。 87. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度為至少約1〇微克/毫升。 88. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度為至少約1毫克/毫升。 -12- 136383 200938221 89. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度為至少約ι〇毫克/毫升。 90. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度為至少約5〇宅克/毫升。 91. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度為至少約毫克/毫升。 92. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度為至少約毫克/毫升。〇 93. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度為至少約2〇〇毫克/毫升。 94. 如請求項86之調配物，其中蛋白質具有濃度大於約2〇〇毫克/毫升。 95. 如請求項86之調配物，其具有導電率低於約2ms/公分。 96. 如請求項86之調配物，其具有導電率低於約ims/公分。 97. 如請求項86之調配物，其具有導電率低於約〇 5 mS/公分。 ❹98.如請求項86之調配物’其係進一步包含賦形劑。 99. 如請求項98之調配物，其中賦形劑為非離子性賦形劑或離子性賦形劑。 100. 如請求項86之調配物，其中蛋白質係保有其生物學活性。 101. 如請求項35之調配物，其係為醫藥調配物。 136383 -13-