CN107949397A

CN107949397A - 免疫治疗疫苗和抗体组合治疗

Info

Publication number: CN107949397A
Application number: CN201680021530.1A
Authority: CN
Inventors: P·斯洛斯; J·奥特拉诺; K·里特纳; X·普雷维莱
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2018-04-20
Also published as: WO2016128542A1; EP4523756A3; ES3011733T3; TWI823828B; CA2975432A1; EP3256156B1; US20180028626A1; US20240024437A1; EP4523756A2; EP3256156A1; EP3256156C0; TW201634059A

Abstract

本发明涉及包含至少(i)治疗疫苗和(ii)一种或多种免疫检查点调节剂的组合产品、组合物和部分试剂盒。本发明还涉及用于治疗增殖性疾病或传染病的方法，以及用于引发或刺激和/或重定向免疫应答的方法，其中所述方法包括向有此需要的对象施用所述组合产品或所述组合物。

Description

免疫治疗疫苗和抗体组合治疗

技术领域

本发明一般涉及包含一种或多种免疫检查点调节剂和至少一种治疗疫苗(更具体而言，编码抗原的载体化疫苗)的新型组合。实施方案还包括包含这些组分的组合物和试剂盒，以及用于治疗、预防或抑制增殖性疾病和传染病的方法。本发明在免疫治疗领域是非常特别有利的，特别是用于增强宿主的免疫应答，且特别是用于破坏免疫耐受性。

背景技术

使用宿主的免疫系统来根除持续的传染性生物和恶性细胞是一种有希望的方法。这种特定类型的疫苗策略一般被称为免疫治疗。在传统疫苗接种中广泛使用的，免疫治疗已在治疗严重、慢性和危及生命的疾病的疗法中显示一些有希望的结果。

众多研究组已将免疫治疗作为治疗癌症的潜在方式进行研究，试图刺激免疫系统，并且因此排斥和破坏肿瘤。几十年来在文献中已描述了大量的免疫治疗处理，使用各种方法例如癌细胞、细胞的部分、纯化的抗原和载体化的抗原。细胞疫苗一般由癌细胞组成，所述癌细胞已在手术期间从患者中取出并且在实验室中改变，以使得它们在再次引入患者内之前更顺应被患者的免疫系统攻击。可替代地，可以使用从患者的血液中获得的免疫细胞，所述免疫细胞已暴露于癌细胞或相关抗原，在趋化因子的存在下进行培养，所述趋化因子将其转化成树突状细胞，然后通过静脉输注给还患者，以便帮助其他免疫系统细胞攻击癌细胞。基于树突状细胞的疫苗(sipuleucel-T)在晚期临床试验中进行测试，以治疗晚期前列腺癌，并且于2010年获得FDA批准。然而，这种基于细胞的疫苗需要为每个患者个别制备，并且用于生产它们的过程因此是复杂和昂贵的。

抗原疫苗由对于某种类型的癌症或病原体特定性的仅一种或几种蛋白质或肽抗原构成。一旦施用，它们就能够诱导针对这些抗原的特异性免疫应答并且增强患者的免疫系统。几种候选肽疫苗达到临床开发。例如，脂质体疫苗掺入由普通癌症广泛表达的粘蛋白1(MUC1)糖蛋白生成的脂肽。尽管在临床试验中并未提供患有晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的患者中的总体存活的显著改善，但在一些患者亚组中仍可见效应。

基于载体的疫苗显示巨大的前景，并且在新的治疗策略的开发中起重要作用。载体用于将靶向的抗原递送到体内。通常，载体源于病毒、细菌、酵母细胞或其他结构，其已被改变以使其不再对患者有害(例如灭活的、减毒的等)。理想的病毒载体应该是安全的，并且使得所编码抗原能够有效抗原呈递给免疫系统。此外，载体系统必须符合使得其能够在大规模基础上生产的标准。活的病毒载体出于其表达来自各种病原体和肿瘤组织抗原，且促进通过内源途径的抗原呈递两方面的能力而言是有吸引力的，所述抗原呈递已显示对于细胞免疫应答的有效诱导是重要的(Reyes-Sandoval,2007,Immunology 121(2):158-65)。因此迄今为止已出现了几种病毒载体，所有这些病毒载体都具有相对优点和局限性，取决于所提出的应用(参见例如Harrop和Carroll，2006,Front Biosci.,11,804-817；Inchauspé等人，2009,Int Rev Immunol 28(1):7-19；Torresi等人，2011,J.Hepatol.54(6):1273-85)。还已采取了大量研究努力，以开发抗原编码DNA质粒和相关的递送装置，以刺激保护性免疫应答(例如参见Reyes-Sandoval和Ertl，2001,Curr Mol Med 1(2):217-43)。

例如，复制缺陷型腺病毒(Ad)载体已广泛使用，因为Ad感染复制和非复制细胞，具有广泛的组织向性，在合适的包装细胞系中有效传播，并且生产过程具有可扩大性和可承受性(Boukhebza等人，2014,Vaccine 32(26):3256-63)。减毒的非复制性牛痘病毒Ankara毒株(MVA)也是有吸引力的候选者，因为它已显示在癌症和传染病领域两者中诱导具有极佳安全性特征的强细胞免疫应答(Boukhebza等人，2012,Hum Vaccin Immunother 8(12):1746-57；Habersetzer等人，2011,Gastroenterology 141(3):890-99；Fournillier等人，2007,Vaccine 25(42):7339-53；Drexler等人，2004,Curr Opin Biotechnol 15(6):506-12)。MVA已通过在鸡胚成纤维细胞中的超过570次传代进行减毒，导致其基因组的15％的损失。因此，MVA不能在大多数哺乳动物细胞中产生成熟的病毒粒子，这导致传播的风险降低，以及由于几种抗免疫防御基因的丧失而增加的免疫原性(Sutter等人，1994,Vaccine12(11):1032-40)。

然而，免疫系统对抗慢性传染病和癌症的能力有限。有时，免疫系统无法将癌症或受感染细胞检测为外来的，因为细胞与正常细胞没有充分不同。在其他情况下，应答可能不足够强到能破坏患病细胞，尤其是在免疫受损的患者中。最后，由于患病细胞已进化出逃避免疫系统的不同方式的事实，免疫系统可能无效。

免疫抑制的主要机制之一是称为“T细胞耗尽”的过程，其起因于对抗原的长期暴露，并且特征在于抑制性受体的上调。这些抑制性受体充当免疫检查点，以便预防不受控制的免疫反应。文献中已描述了在T细胞免疫的不同水平上起作用的各种免疫检查点，包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、B和T淋巴细胞减弱剂、T细胞免疫球蛋白、含粘蛋白结构域的蛋白3(TIM-3)和T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)。还已报道了PD-1与其配体PDL-1和PDL-2的相互作用在T细胞耗尽中起关键作用(Maier等人，2007,J.Immunol.178:2714-20；Tzeng等人，2012,PLoSOne 7:e39179)。

无论作用机制如何，这些免疫检查点都可以抑制有效免疫应答的发展。对阻断这种免疫检查点作为抑制免疫系统耐受的手段，并且因此挽救耗尽的T细胞的兴趣渐增(Leach等人，1996,Science 271:1734-6)。在过去十年期间已开发了大量的拮抗性抗体(例如抗LAG3、-PD-L1、-CTLA-4、-PD1等)，并且三种已被销售。进入市场的第一种是单克隆CTLA-4特异性抗体伊匹单抗(Yervoy商品名，Bristol-Myers Squibb(BMS))，其已被批准用于不能切除的或转移性黑素瘤。BMS报告从1861年用伊匹单抗治疗的黑色素瘤患者22％和17％分别在3年和7年后仍然存活。抗PD1纳武单抗抗体(Opdivo商品名，BMS)于2014年7月在日本被批准用于恶性黑素瘤。中间II期数据显示预处理的转移性黑色素瘤中32％的响应率，其高级别不良事件低于伊匹单抗。抗PD-1派姆单抗(Keytruda商品名，Merck)获得加速FDA批准用于治疗不能切除的或转移性黑素瘤。市售的抗体也处于其他适应症包括NSCLC(非小细胞肺癌)，以及靶向PD-1(例如pidilizumab，CureTech)、CTLA-4(例如曲美木单抗(AstraZeneca)、PD-L1(例如MPDL3280A，Roche)、KIR(lirilumab，BMS)、IDO1(例如indoximod，NewLink genetics)及其他的各种其他免疫检查点抑制剂的临床试验中。

关于拮抗性抗体的临床前研究也在传染病领域中进行(参见例如Barber等人，2006,Nature 439:682-7；Cecchinato等人，2008,J.Immunol 180:5439-47)，并且设想了与不同载体平台(DNA、MVA、慢病毒、牛痘等)的组合。特别地，PD-L1阻断与表达LMCV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic Chronomeningitis Virus))表位的牛痘病毒的组合显示在持续性病毒感染期间改善表位特异性CD8+T细胞的功能(Ha等人，2008,JEM 205:543-55)。在首次用于实验的猕猴中施用抗PD-1抗体连同SIV gag腺病毒载体引起Gag特异性T细胞中的增加(Finnefrock等人，2009,J.Immunol.182:980-7)。WO2004/058801涉及使用重组MVA载体的癌症治疗，所述重组MVA载体编码与抗CTLA4抗体和CpG寡脱氧核苷酸免疫调节剂组合的p53致癌多肽。

可能期望癌症和传染病将继续是多年的严重全球健康威胁。尽管抗生素和疫苗的可用性，传染病每年仍在世界各地造成100,000例死亡(数据WHO 2002)。另一方面，恶性且尤其是转移性肿瘤通常抵抗常规疗法，解释了某些癌症的显著发病率。上文描述清楚地举例说明了由于通过宿主的机体建立的逃避免疫效应细胞的众多机制，设计有效疗法是一项艰巨任务。

发明内容

在本发明的上下文中，本发明人鉴定了能增强患者的免疫应答和/或恢复耗尽的T细胞介导的免疫的组合产品。这种组合产品的基本要素是治疗疫苗和免疫检查点抑制剂。本发明人惊奇地发现，与抗CTLA4或抗PD-1抗体组合的编码模型抗原(βGal)MVA载体的施用令人惊讶地有效减少人癌症动物模型中植入的肿瘤的体积，并且增加这些动物的存活率。这种组合提供抗肿瘤效应的能力是本发明可以用于治疗针对人对象各种疾病且尤其是传染病和增殖性疾病的良好指示。

在第一个方面，本发明提供了包含至少治疗疫苗和一种或多种免疫检查点调节剂的组合产品。优选地，治疗疫苗包含病毒载体，且更优选编码抗原多肽的重组病毒载体。优选地，免疫检查点调节剂是能够至少部分地拮抗免疫检查点如CTLA-4或PD-1的活性的单克隆抗体。

本发明还提供了包含治疗疫苗和一种或多种免疫检查点调节剂的组合物，以及使用这种组合物或组合尤其用于治疗传染病和增殖性疾病如癌症的用途或治疗方法。

根据本发明的目前优选实施方案的下述描述，本发明的其他和进一步的方面、特征和优点将是清楚的。给出这些实施方案用于公开的目的。

具体实施方式

如上所述，本发明人鉴定了包含至少(i)治疗疫苗和(ii)一种或多种免疫检查点调节剂的组合产品。

在整个申请自始至终使用的术语“一个”和“一种”以下述含义使用：它们意指“至少一个/种”、“至少第一个/种”、“一个或多个/一种或多种”或“多个/种”所提及的组分或步骤，除非上下文另有明确规定。例如，术语“治疗疫苗”包括多种治疗疫苗，包括其混合物。

术语“一个或多个/一种或多种”指一个/种或超过一个/种的数字(例如2、3、4、5等)。

无论在本文何处使用时，术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其他组合”的含义。

如本文使用的，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的10％内，优选在8％内，且更优选在5％内。

如本文使用的，当用于定义产品、组合物和方法时，术语“包含”(以及任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(以及任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括”(以及任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(以及任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是开放式，且不排除另外的、未叙述的元素或方法步骤。因此，当氨基酸序列可能是多肽的最终氨基酸序列的部分时，多肽“包含”氨基酸序列。“基本上由……组成”意指排除具有任何重大意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所述组分组成的组合物将不排除痕量污染物和药学可接受的载体。当这种氨基酸序列与任选仅少量另外的氨基酸残基一起存在时，多肽“基本上由氨基酸序列组成”。“由……组成”意指排除多于其他组分或步骤的痕量元素。例如，当多肽不包含任何氨基酸而是所述的氨基酸序列时，多肽“由氨基酸序列组成”。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指包含经由肽键键合的至少9个或更多个氨基酸的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性的、分支的或环状的，并且可以包含天然存在的和/或氨基酸的类似物，并且它可以被非氨基酸中断。作为一般指示，如果氨基酸聚合物多于50个氨基酸残基，则它优选被称为多肽或蛋白质，而如果它长度为50个氨基酸或更短，则它被称为“肽”。

在本发明的上下文中，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，并且定义任何长度的聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA、基因组DNA、质粒、载体、病毒基因组、分离的DNA、探针、引物及其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)(例如mRNA、反义RNA、SiRNA)或混合的聚核糖核苷酸-聚脱氧核糖核苷酸的聚合物。它们涵盖单链或双链、线性或环状、天然或合成、修饰或未修饰的多核苷酸。此外，多核苷酸可以包含非天然存在的核苷酸并且可被非核苷酸组分中断。

如本文使用的，术语“类似物”、“突变体”或“变体”指就其天然配对物而言显示出一种或多种修饰的组分(多肽或核酸)。可以设想任何修饰，包括一个或多个核苷酸/氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。当考虑到几个突变时，它们可以涉及连续残基和/或非连续残基。可以通过本领域技术人员已知的多种方式生成突变，例如定点诱变(例如使用Amersham的Sculptor(TM)体外诱变系统，Les Ullis，法国)、PCR诱变、DNA改组和通过化学合成技术(例如导致合成的核酸分子)。优选的是与天然配对物的序列保留至少80％的序列相同性程度，优选至少85％，更优选至少90％，且甚至更优选至少98％的相同性的类似物。

以一般方式，术语“相同性”指两个多肽或核酸序列之间的氨基酸与氨基酸或核苷酸与核苷酸对应。两个序列之间的相同性百分比是由序列共享的相同位置数目的函数，考虑到需要引入用于最佳总体比对的缺口数目和每个间隙的长度。各种计算机程序和数学算法在本领域中是可用的，以确定氨基酸序列之间的相同性百分比，例如Needleman etWunsch.J.Mol.Biol.48,443-453,1970的算法，在Atlas of Protein Sequence andStructure中在NCBI或ALIGN处可获得的Blast程序(Dayhoffed,1981,Suppl.,3:482-9)，或在名称《Align》下从ebi.ac.uk world wide可获得的针软件(needlesoftware)。用于确定核苷酸序列相同性的程序也可在专门的数据库(例如Genbank、Wisconsin SequenceAnalysis Package、BESTFIT、FASTA和GAP程序)中获得。为了举例说明性目的，“至少80％相同性”意指80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

如本文使用的，术语“分离的”指从其天然环境中取出(即从与其天然结合或在自然界中发现至少一种其他组分中分离)的组分(例如多肽、肽、多核苷酸、载体等)。分离的组分指维持在异源背景下或纯化(部分或基本上)的组分。例如，当它与自然界中通常与其结合的序列分开(例如从染色体或基因组解离)时，核酸分子是分离的，但它可以与异源序列相结合(例如在重组载体内)。

术语“得自”、“源于(originating)”或“源于(originate)”用于鉴定组分(例如多肽、肽、多核苷酸、载体等)的原始来源，但并不意味着限制通过其制备组分的方法，所述方法可以例如通过化学合成或重组手段。

如本文使用的，术语“组合”指两个或多个实体(例如至少治疗疫苗和本文所述的一种或多种免疫检查点调节剂)可能的任何排列。

如本文使用的，“治疗疫苗”指任何物质(例如多肽、多糖、核酸等)，包括复合物质(例如细胞、细胞混合物、活生物或死生物如细菌、病毒和其他微生物等)、其部分(例如免疫原性片段、表位、细胞壁、鞭毛等)或其类似物，其能够是免疫应答的靶。该术语涵盖“抗原”(即天然抗原以及其片段和类似物)。

术语“免疫检查点调节剂”指能够以阳性或阴性方式(特别是抗原呈递细胞(APC)和免疫T效应细胞之间的相互作用)调节免疫检查点蛋白的功能的分子。

术语“对象”一般指对于其本发明的任何产品和方法是需要的或可能是有益的生物。通常，生物是哺乳动物，特别是选自驯养动物、农场动物、运动动物和灵长类动物的哺乳动物。优选地，对象是已被诊断为具有病理状态或处于具有病理状态的风险中的人，所述病理状态例如由致病性生物引起或与致病性生物相关的传染病或者增殖性疾病如癌症。术语“对象”和“患者”在提及人生物时可以互换使用，并且涵盖男性和女性。待治疗的对象可以是新生儿、婴儿、年轻人或成年人。

本发明的详细描述

在第一个方面，本发明提供了包含至少(i)治疗疫苗和(ii)一种或多种免疫检查点调节剂的组合产品。

组合产品

在本发明的上下文中，这种布置包括各个实体(例如单一组合物)的混合物，这意味着构成组合的各个实体在施用于对象之前被一起放置在共同的容器中。相比之下，不同的组合指其中各个实体不混合在一起的情况，意味着它们在分开的容器内(例如不同的组合物)，用于伴随地、序贯地或以间隔的方式彼此结合施用。

示例性组合包括但不限于多肽组合(例如基于肽或蛋白质的治疗疫苗和以重组多肽形式的一种或多种免疫检查点调节剂)、或核酸分子的组合(例如载体化治疗疫苗和改造用于编码和表达免疫检查点调节剂的一种或多种载体)、以及多肽和核酸分子的组合(例如载体化治疗疫苗和一种或多种重组免疫检查点调节剂多肽)。为了举例说明性目的，单一组合物可以是下述形式：a)治疗疫苗与一种或多种免疫检查点调节剂多肽的混合物；b)治疗疫苗与编码一种或多种免疫检查点调节剂的载体的混合物，或c)特定设计(例如治疗疫苗编码治疗目的多肽和一种或多种免疫检查点调节剂)。本发明涵盖包含等摩尔浓度的每个实体的组合以及具有非常不同浓度的不同实体的组合。应了解组合的每个实体的最佳浓度可以由本领域技术人员确定。优选地，组合是协同的，提供比单独的每个实体更高的功效(例如增加的存活)。

在本发明的上下文中，本发明的组合产品可以用于预防(例如降低具有给定疾病或病理状态的风险)和/或治疗(例如在诊断为具有给定疾病或病理状态的对象中)。治疗用途是优选的。

治疗疫苗

在一个实施方案中，如本文使用的，“治疗疫苗”是设计为通过目的多肽的存在或表达来引发或增加对特定靶(例如癌性或受感染细胞等)的免疫的生物产物，当适当地施用于对象时，所述目的多肽预期对疾病或病理状态的病程或症状造成有益的作用。

可以在本发明的上下文中使用几种类型的治疗疫苗，包括但不限于基于细胞的疫苗、基于肽或多肽的疫苗和基于载体的疫苗。

基于细胞的疫苗的代表性实例可以得自例如

●干细胞(例如由Stemline Therapeutics开发用于治疗胶质母细胞瘤的SL-701)；

●专门细胞，例如在体外重编程以攻击癌细胞的免疫细胞(例如靶向涉及胶质母细胞瘤的六种肿瘤相关抗原(TAA)的由Immunocellular Therapeutics开发的树突状细胞疫苗和批准用于治疗晚期前列腺癌的)Provenge疫苗)；

●在实验室中改变的患者的癌细胞，以使得其更易受到患者免疫系统的攻击；或

●通过使其毒力性质失效和任选用于表达目的多肽，已改造为无毒或减毒的微生物。这些微生物的众所周知的实例包括但不限于细菌(例如分枝杆菌属(Mycobacterium)；乳杆菌属(Lactobacillus)(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))；李斯特菌属(Listeria)(例如单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes))、沙门氏菌属(Salmonella)和假单胞菌属(Pseudomona))、以及酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))。细菌和酵母治疗疫苗的代表性实例包括由表达一种或多种疾病相关抗原的遗传修饰的酵母制备的，由GlobImmune开发的牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)BCG和Tarmogens^R。

通常，肽或多肽疫苗包括任选地混合到佐剂中的抗原肽/多肽。可以引用由Galena和Genentech为乳腺癌开发的Newax E75用于举例说明性目的。

基于载体的疫苗在本发明的上下文中是优选的。如本文使用的，术语“载体”指媒介物，优选核酸分子或病毒颗粒，其含有允许生物分子在宿主细胞或对象内递送、繁殖和/或表达所必需的元件。为了本发明的目的，载体可以具有天然存在的遗传来源，是合成的或人造的，或是天然和人造遗传元件的某些组合。该术语涵盖染色体外载体(例如保留在细胞溶质或核中)和整合载体(例如设计为整合到细胞基因组内)以及克隆和表达载体。

在一个实施方案中，治疗疫苗包含重组质粒或病毒载体。如本文使用的，“质粒载体”指可复制的DNA构建体。通常，质粒载体含有可选择标记物基因，其允许携带质粒载体的宿主细胞在相应的选择性药物的存在下被选择或反对。各种阳性和阴性可选择标记物基因是本领域已知的。作为举例说明，抗生素抗性基因可以用作阳性可选择标记物基因，其允许在相应抗生素的存在下选择含有质粒的细胞。合适的质粒载体包括但不限于pREP4、pCEP4(Invitrogene)、pCI(Promega)、pCDM8(Seed,1987,Nature 329:840)、pMT2PC(Kaufman等人，1987,EMBO J.6:187-95)、pVAX(Invitrogen)和pgWiz(Gene Therapy System Inc；Himoudi等人，2002,J.Virol.76:12735-46)。

如本文使用的，术语“病毒载体”或“病毒”或“病毒粒子”或“治疗性病毒”指包括病毒基因组的至少一个元件的核酸载体，所述至少一个元件允许包装成病毒颗粒。在本发明的上下文中，这些术语必须广泛地被理解为包括核酸载体(例如载体DNA)以及由其生成的病毒颗粒，且尤其是感染性病毒颗粒。术语“感染性”指病毒载体感染并进入宿主细胞或对象内的能力。

病毒载体可以是有复制能力的或选择性的(例如改造为在特异性宿主细胞中更好地或选择性地复制)，或者可以在遗传上丧失能力，以便是复制缺陷或复制受损的。在一个优选实施方案中，包含在本发明组合中的治疗疫苗是复制缺陷或复制受损的病毒载体，这意指它不能在正常细胞中，尤其是在正常人细胞中以任何显著的程度复制。可以通过常规手段，例如通过测量在非容许细胞中的DNA合成和/或病毒滴度，来评估复制功能的受损或缺陷。病毒载体可以通过对病毒复制关键的区域的部分或完全缺失或失活而致使复制缺陷。这种复制缺陷或受损的病毒载体通常需要引起或补充缺失/受损功能的繁殖、容许细胞系。

病毒载体可以从各种病毒，且特别是由腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、甲病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、微小RNA病毒、辛迪病毒等)组成的病毒组进行改造。可以使用亲本毒株及其衍生物(即，与所述病毒的亲本毒株相比进行修饰的病毒，例如通过截短、缺失、取代和/或插入连续的或不在病毒基因组内的一个或多个核苷酸)。修饰可以在内源性病毒基因(例如编码和/或调节序列)内和/或在基因间区域内。此外，修饰可以是沉默或非沉默的(例如导致经修饰的病毒基因产物)。可以使用常规分子生物学技术以本领域技术人员已知的多种方式进行修饰。

优选地，与不含这种修饰的病毒相比，由本发明所涵盖的修饰影响例如病毒的毒力、毒性或致病性，但不完全抑制新病毒至少在容许细胞中的感染和产生。所述修饰优选导致缺陷蛋白的合成(或缺乏合成)，以致于不能确保通过未修饰的基因在正常条件下产生的蛋白质的活性。在文献中公开了示例性修饰，其中特别优选改变涉及DNA代谢、宿主毒力和IFN途径的病毒基因的那些修饰(参见例如Guse等人，2011,Expert Opinion Biol.Ther.11(5):595-608)。其他合适的修饰包括插入外源基因(例如目的核酸分子)，如本文下文所述。

从痘病毒获得在本文使用的治疗疫苗中包含的特别合适的病毒载体。如本文使用的，术语“痘病毒”指属于痘病毒科(Poxviridae)的病毒，其中优选针对脊椎动物宿主的脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)，其包括几个属例如正痘病毒属(Orthopoxvirus)、山羊痘病毒属(Capripoxvirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、副痘病毒属(Parapoxvirus)、兔病毒属(Leporipoxvirus)和猪痘病毒属(Suipoxvirus)。在本发明的上下文中优选的是正痘病毒属以及禽痘病毒属，包括金丝雀痘病毒(例如ALVAC)和鸡痘病毒(例如FP9载体)。

在一个优选实施方案中，治疗疫苗包含属于正痘病毒属，且甚至更优选属于牛痘病毒(VV)物种的痘病毒载体。牛痘病毒是具有长度大约200kb的线性双链DNA基因组的大的、复杂的、有包膜病毒，其编码使得病毒能够不依赖于宿主细胞机制而复制的众多病毒酶和因子。存在两种不同的感染性病毒颗粒，保留在受感染细胞的细胞溶质中直到裂解的被单个脂质包膜包围细胞内IMV(对于细胞内成熟病毒粒子)，以及从受感染细胞中出芽的双重包膜的EEV(对于细胞外有包膜病毒粒子)。任何牛痘病毒株均可以用于本发明的上下文中，包括但不限于Western Reserve(WR)、Copenhagen(Cop)、Lister、LIVP、Wyeth、Tashkent、Tian Tan、Brighton、Ankara、MVA(修饰的牛痘病毒Ankara)、LC16M8、LC16M0毒株等及其任何衍生物。

改造的痘病毒可以与修饰一起使用，所述修饰旨在改善所得到的病毒的安全(例如增加的减毒)和/或功效(例如对于癌细胞改善的选择性和/或降低健康细胞中的毒性)。可以更特别地列举在胸苷激酶(J2R；参见Weir和Moss，1983，Genbank登录号AAA48082)、脱氧尿苷三磷酸酶(F2L)、病毒血凝素(A56R)；核糖核苷酸还原酶的小(F4L)和/或大(I4L)亚基，丝氨酸蛋白酶抑制剂(B13R/B14R)和补体4b结合蛋白(C3L)内的缺陷修饰。用于本发明中的合适VV的代表性实例包括NYVAC(US 5,494,807)以及TK缺陷型、TK-和F2L-缺陷型(WO2009/065547)、以及TK-和I4L-缺陷型VV(WO2009/065546)。本文使用的基因命名法是Copenhagen牛痘菌株的那种。除非另有说明，否则它在本文中还用于其他痘病毒科的同源基因。然而，基因命名法根据痘毒株可能不同，但Copenhagen与其他牛痘毒株之间的对应一般在文献中可用。

各种痘病毒科的基因组序列在本领域中在专门的数据库如Genebank中可获得。例如，牛痘病毒株Western Reserve、Copenhagen、牛痘病毒和金丝雀痘病毒基因组分别可以在登录号NC_006998、M35027、NC_003663、NC_005309下在Genbank中获得。在本发明的上下文中特别合适的病毒载体是MVA，由于其高度减毒的表型(Mayr等人，1975,Infection 3:6-14；Sutter和Moss,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10847-51)，与非减毒载体相比在感染时生成的更显著的IFN-1型应答，以及其基因组序列在文献(Antoine等人，1998,Virol.244:365-96)和Genbank(在登录号U94848下)中的可用性。

在本发明的上下文中合适的其他病毒载体是可以从副粘病毒科(paramyxoviridae)获得的麻疹病毒属，其中特别优选麻疹病毒。各种减毒株是本领域可获得的(Brandler等人，2008,CIMID,31:271；Singh等人，1999,J.Virol.73(6):4823)，例如且不限于EdmonstonA和B毒株(Griffin等人，2001,Field’s in Virology,1401-1441)、Schwarz菌株(Schwarz A,1962,Am J Dis Child,103:216)、S-191或C-47毒株(Zhang等人，2009,J Med Virol.81(8):1477)。还可以使用重组新城疫病毒(NDV)(Bukreyev和Collins，2008,Curr OpinMol Ther 10:46-55)，其中特别优选其减毒株，例如已经在癌症患者中使用的MTH-68(Csatary等人，1999,Anti Cancer Res 19:635-8)，以及在胶质母细胞瘤患者中显示有希望的结果的NDV-HUJ(isracast.com2006年3月1日)。

用于本发明中的另一种合适的病毒载体是腺病毒载体。它可以衍生自各种人或动物腺病毒(例如犬、羊、猿猴等)，并且可以采用任何血清型。它也可以是嵌合腺病毒(WO2005/001103)。技术人员将认识到，来自多种血清型的元件可以组合在单个腺病毒中。

期望地，腺病毒载体源于人Ad，包括稀有血清型的那些，或源于灵长类动物(例如黑猩猩、大猩猩)。人腺病毒的代表性实例包括亚属C(例如Ad2、Ad5和Ad6)、亚属B(例如Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad34、Ad35和Ad50)、亚属D(例如Ad19、Ad24、Ad26、Ad48和Ad49)和亚属E(Ad4)。黑猩猩Ad的代表性实例包括但不限于AdCh3(Peruzzi等人，2009,Vaccine 27:1293-300)和AdCh63(Dudareva等人，2009,Vaccine 27:3501-4)和本领域中描述的那些中的任一种(参见例如WO2010/086189；WO2009/105084；WO2009/073104；WO2009/073103；WO2005/071093；和WO03/046124)。许多腺病毒目前在遗传和生物化学上都得到充分表征(Hoffmann等人，2007,Human Gene Ther.18:51-62)。人腺病毒5型(Ad5)的示例性基因组序列在GenBank登录号M73260和Chroboczek等人(1992,Virol.186:280-5)中发现。

优选地，本发明中采用的腺病毒通过E1区的全部或部分删除是复制缺陷型的。通过参考GenBank中在登录号M 73260下公开的Ad5序列，适当的E1缺失从大约位置459延伸到3510。优选地，病毒保留功能性病毒pIX基因。腺病毒基因组可以包含另外的修饰(例如如WO94/28152；Lusky等人，1998,J.Virol 72:2022中所述的其他必需的E2和/或E4区的全部或部分缺失)。此外，非必需E3区也可以被突变或缺失。

更优选地，包含在本发明的治疗疫苗中的腺病毒是血清型5(Ad5)的人腺病毒，其是E1和/或E3功能缺陷的，并且包含在E1区中插入的目的核酸分子。

本发明还涵盖与脂质或聚合物(例如聚乙二醇)复合以形成微粒结构如脂质体、脂质复合物或纳米颗粒的载体或病毒颗粒，以及被修饰以允许优先靶向特定宿主细胞的载体或病毒颗粒。靶向载体的特征性特点是在其表面处能够识别和结合细胞和表面暴露组分的配体的存在。合适配体的实例包括针对细胞特异性、组织特异性和病原体相关标记物的抗体或其片段。靶向可以通过将配体遗传插入存在于病毒表面上存在的多肽(例如在腺病毒纤维中或在痘病毒p14IMV暴露的多肽等中)内，或通过化学修饰病毒表面包膜而进行。此外，当使用基于病毒的治疗疫苗时，所述病毒可以是活的、减毒的、灭活的或杀死的。

目的多肽

在本发明的组合产品中包含的治疗疫苗优选含有或编码治疗目的一种或多种多肽，其可以补偿病理症状，例如通过毒性效应发挥作用来限制或去除来自机体的有害细胞，通过改善免疫力或通过逆转免疫耗尽机制。这样的多肽可以通过天然基因或从后续合成序列修饰得到的基因编码。在本发明的上下文中，目的多肽可以具有哺乳动物起源(例如人)或不具有哺乳动物起源(例如具有细菌或病毒起源)。

有利地，在本发明中使用的治疗疫苗包含或编码选自自杀基因产物、免疫刺激多肽和抗原多肽的一种或多种多肽。用于本文的优选的抗原多肽是肿瘤相关抗原和病原生物的抗原。优选地，目的多肽不是致癌转录因子如p53。

自杀基因

术语“自杀基因”指编码能够将药物前体转换成细胞毒性化合物的蛋白质(例如酶)的核酸分子。用于本发明的合适的自杀基因与相应的前药(或药物前体)和活性(细胞毒性)药物一起公开于下表中。

表1

期望地，治疗疫苗包含或编码具有至少胞嘧啶脱氨酶(CDase)活性的多肽。CDase编码核酸分子可以得自任何原核生物和低等真核生物，如酿酒酵母(FCY1基因)、白色假丝酵母(FCA1基因)和大肠杆菌(Escherichia coli)(codA基因)。

可替代地或组合地，治疗疫苗包含或编码具有尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRTase)活性的多肽。UPRT酶编码核酸分子可以得自大肠杆菌(Andersen等人，1992,European J.Biochem.204:51-56)、乳酸乳球菌(Martinussen等人，1994,J.Bacteriol.176:6457-63)、牛分枝杆菌(Kim等人，1997,Biochem.Mol.Biol.Internat.41:1117-24)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Martinussen等人，1995,J.Bacteriol.177:271-4)和酵母(例如由Kern等人，1990,Gene88:149-57公开的酿酒酵母FUR1)。

这种CDase和UPRTase编码核酸分子的核苷酸序列和所编码酶的氨基酸在专门的数据库(SWISSPROT EMBL、Genbank、Medline等等)中可获得。还可以使用功能类似物。这种类似物优选具有与天然多肽具有至少70％，有利地至少80％，优选至少90％，且最优选至少95％的相同性程度的氨基酸序列。根据公开的数据改造类似物，并且根据常规技术测试在无细胞或细胞系统中的酶促活性，这在技术人员的范围内(参见例如EP998568)。为了举例说明性目的，合适的功能类似物包含EP998568中描述的N-末端截短的FUR1突变体(具有天然蛋白质中的前35个残基直到位置36处存在的第二个Met残基的缺失)，其显示出比天然酶以及FCY1::FUR1融合物(命名为FCU1，WO2009/065546的序列标识符SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列)和FCU1-8(WO96/16183、EP998568和WO2005/07857中所述)更高的UPRTase活性。

免疫刺激多肽

如本文使用的，术语“免疫刺激多肽”指具有以特异性或非特异性方式刺激免疫系统的能力的多肽。本领域已知大量的蛋白质具有发挥免疫刺激效应的能力。在本发明的上下文中合适的免疫刺激蛋白的实例包括但不限于细胞因子，其中特别优选白细胞介素(例如IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-24)、趋化因子(例如CXCL10、CXCL9、CXCL11)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(例如GM-CSF、C-CSF、M-CSF……)、APC(抗原呈递细胞)暴露的蛋白质(例如B7.1、B7.2等等)、生长因子(转化生长因子TGF、成纤维细胞生长因子FGF、血管内皮生长因子VEGF等等)、I或II类的主要组织相容性复合物(MHC)抗原、细胞凋亡诱导剂或抑制剂(例如Bax、Bcl2、BcIX……)和免疫毒素。优选地，免疫刺激蛋白是白细胞介素或集落刺激因子(例如GM-CSF)。

抗原多肽

在一个实施方案中，治疗疫苗含有或编码与待治疗疾病结合的抗原。术语“抗原”指引发或刺激免疫应答(例如细胞介导的免疫和/或体液免疫)的能力。抗原刺激机体的免疫系统以将靶识别为外来的，以便免疫系统在以后遇到时可以更容易识别和破坏它。本发明涵盖如本文所述的天然抗原多肽(存在于活的或死的生物或细胞中/上)，以及其修饰形式(类似物、片段)及其组合。

在本发明的上下文中，治疗疫苗中包含或由治疗疫苗编码的优选抗原是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原(即肿瘤相关抗原)，以及来自致病生物例如病毒、细菌、寄生虫等等的抗原以及过敏原。

病毒抗原多肽包括例如来自下述的抗原：肝炎病毒A、B、C、D和E，免疫缺陷病毒(例如HIV)，疱疹病毒，巨细胞病毒，水痘带状疱疹，乳头状瘤病毒，EB病毒，流感病毒，副流感病毒，腺病毒，柯萨奇病毒，微小RNA病毒，轮状病毒，呼吸道合胞病毒，痘病毒，鼻病毒，风疹病毒，乳多泡病毒(papovirus)，腮腺炎病毒，麻疹病毒。HIV抗原的一些非限制性实例包括gp120gp40、gp160、p24、gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef tat、nef。人疱疹病毒抗原的一些非限制性实例包括gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或即刻早期蛋白(immediateearly protein)，例如来自HSV1或HSV2的ICP27、ICP47、ICP4、ICP36。巨细胞病毒抗原的一些非限制性实例包括gB。衍生自EB病毒(EBV)的一些非限制性实例包括gp350。水痘带状疱疹病毒抗原的一些非限制性例子包括gp1、11、111和IE63。丙型肝炎病毒抗原的一些非限制性实例包括env E1或E2蛋白、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、p7。人乳头状瘤病毒(HPV)抗原的一些非限制性实例包括L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7。衍生自其他病毒病原体例如呼吸道合胞体病毒(例如F和G蛋白)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、黄病毒属(例如黄热病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)和流感病毒细胞(例如HA、NP、NA或M蛋白)的抗原也可以根据本发明使用。

细菌抗原多肽包括例如来自下述的抗原：引起TB和麻风病的分枝杆菌、肺炎球菌(pneumocci)、需氧革兰氏阴性杆菌、支原体、葡萄球菌(staphyloccocus)、链球菌、沙门氏菌、衣原体、奈瑟氏菌等等。

寄生虫抗原多肽包括例如来自疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形虫病、血吸虫病和丝虫病的抗原。

变应原多肽指在易感对象中可以诱导过敏或哮喘应答的任何物质。变应原包括花粉、昆虫毒液、动物毛屑粉尘、真菌孢子和药物(例如青霉素)。

肿瘤相关抗原多肽(TAA)包括各种类型的抗原，例如在正常细胞中通常沉默(即未表达)的那些，仅以低水平或在某些分化阶段表达的那些，以及瞬时表达的那些例如胚胎和胎儿抗原，以及起因于细胞基因例如致癌基因(例如活化的ras癌基因)、原癌基因(例如ErbB家族)突变或起因于染色体易位的蛋白质的那些。这样的肿瘤相关抗原还涵盖由致病生物表达的抗原，所述致病生物能够在对象(特别是慢性感染的对象)中诱导恶性状况，例如RNA和DNA肿瘤病毒(例如HPV、HCV、EBV等)和细菌(例如幽门螺杆菌(Helicobacterpilori))。肿瘤相关抗原的一些非限制性实例包括但不限于MART-1/Melan-A，gp100，二肽基肽酶IV(DPPIV)，腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)，亲环蛋白b，结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733，癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2，etv6，aml1，前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，T细胞受体/CD3-ζ链，MAGE-肿瘤抗原家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)，GAGE-肿瘤抗原家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)，BAGE，RAGE，LAGE-1，NAG，GnT-V，MUM-1，CDK4，酪氨酸酶，p53，MUC家族(例如MUC1、MUC16等；参见例如US6,054,438；WO98/04727；或WO98/37095)，HER2/neu，p21ras，RCAS1，甲胎蛋白，E-钙粘蛋白，α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白，p120ctn，gp100.sup.Pmel117，PRAME，NY-ESO-1，cdc27，腺瘤性息肉蛋白(APC)，胞衬蛋白，连接蛋白37，Ig-独特型，p15，gp75，GM2和GD2神经节苷脂，Smad肿瘤抗原家族，脑糖原磷酸化酶，SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7，以及c-erbB-2和病毒抗原例如HPV-16和HPV-18E6和E7抗原，以及EBV编码核抗原(EBNA)-1以及标记物(β-半乳糖苷酶、荧光素酶……)。

本发明还涵盖如上所述的包含/表达两种或更多目的多肽的治疗疫苗，例如至少两种抗原、至少一种抗原和一种免疫刺激多肽、至少两种抗原和一种免疫刺激多肽等。

在本发明的组合产品中包含的优选的治疗疫苗包含或编码选自下述的一种或多种目的多肽：

●MUC-1抗原

●HPV E6和E7抗原，特别是其非致癌变体；

●人IL-2

●人GM-CSF；

●FCU-1自杀基因；

●HBV抗原，特别是HBV pol、HBsAg和/或核心；

●分枝杆菌(例如MtB或牛分枝杆菌(M bovis))抗原，特别是选自RpfB、RpfD、Ag85A、Ag85B、ESAT6、CFP10、TB10.4、Rv0111、Rv0287、Rv0569、Rv1733、Rv1813、Rv2029、Rv2626、Rv3407、Rv3477、Rv3478中的一种或多种，以及

●HCV NS抗原(例如NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b)。

本发明涵盖目的天然多肽及其类似物(例如其片段，例如肽；和修饰的那种)的使用/表达，尤其是当天然多肽发挥不希望有的性质(例如致癌或转化性质、细胞毒性等)。例如，为了规避HPV E6和E7多肽的致癌性，可以使用或表达分别展示结合p53和Rb的能力降低的非致癌类似物。这样的非致癌类似物例如在Munger等人(1989,EMBO J.8:4099-105)；Crook等人(1991,Cell 67:547-56)；Heck等人(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4442-6)；Munger等人(1991,J.Virol.65:3943-8)；Phelps等人(1992,J.Virol.66,2418-27)和WO99/03885中描述。适合于本发明目的的非致癌性HPV-16E6变体缺失位于大约位置118至大约位置122(+1代表天然HPV-16E6多肽的第一个甲硫氨酸残基)的一个或多个氨基酸残基，其中特别优选残基118至122(CPEEK)的完全缺失。适合于本发明目的的非致癌性HPV-16E7变体缺失位于大约位置21至大约位置26(+1代表天然HPV-16E7多肽的第一个氨基酸)的一个或多个氨基酸残基，其中特别优选残基21至26(DLYCYE)的完全缺失。在一个实施方案中，目的多肽修饰或包括另外特点可能是有利的，以便改善其免疫原性活性和/或治疗活性。例如，在相同的治疗疫苗(特别是基于载体的治疗疫苗)中结合(例如通过混合物、融合物或独立表达)可能是有用的：

●编码抗原(例如，如先前所述的TAA或来自致病生物的抗原)的核苷酸序列，以及

●编码免疫刺激多肽例如细胞因子或白细胞介素(例如IL-2；肿瘤坏死因子(TNF)；干扰素(IFN)；集落刺激因子(CSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的核苷酸序列。

还可以使用或表达与目的多肽一起的能够增强免疫原性的一种或多种肽或多肽。这样的肽或多肽已在文献中进行描述，并且包括但不限于钙网蛋白(Cheng等人，2001,J.Clin.Invest.108:669-78)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)热休克蛋白70(HSP70)(Chen等人，2000,Cancer Res.60:1035-42)、泛素(Rodriguez等人，1997,J.Virol.71:8497-503)、细菌毒素例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的易位结构域(ETA(dIII))(Hung等人，2001Cancer Res.61:3698-703)以及T_H Pan-Dr表位(Sidney等人，1994,Immunity 1:751)、pstS1GCG表位(Vordermeier等人，1992,Eur.J.Immunol.22:2631)、破伤风类毒素P2TT(Panina-Bordignon等人，1989,Eur.J.Immunol.19:2237)和P30TT(Demotz等人，1993,Eur.J.Immunol.23:425)肽、以及流感表位(Lamb等人，1982,Nature 300:66；Rothbard等人，1989,Int.Immunol.1:479)。

其他合适的结构特点是对目的多肽的合成、加工、稳定性和溶解性有益的结构特点，所述目的多肽在本发明的治疗疫苗中使用或由本发明的治疗疫苗表达；例如旨在修饰潜在的切割位点、潜在的糖基化位点和/或膜锚定的结构特点，以便改善MHC I类和/或MHCII类呈递。如果天然多肽缺乏膜锚定序列和分泌序列，则可以通过在目的多肽中掺入膜锚定序列和分泌序列(即，信号肽)来实现膜呈递。简言之，信号肽通常包含15至35个基本上疏水的氨基酸，其然后通过特异性ER(内质网)定位的内肽酶去除，以得到成熟多肽。跨膜肽在性质中也是高度疏水的，并且作用于在细胞膜内锚定多肽。可以在本发明的上下文中使用的跨膜肽和/或信号肽的选择是多种的。它们可以从细胞或病毒多肽获得，例如免疫球蛋白、组织型纤溶酶原激活物、胰岛素、狂犬病糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白的多肽，或者可以是合成的。优选地，分泌序列插入在密码子下游的多肽N-末端处，用于翻译起始，并且膜锚定序列在C-末端处插入，优选紧邻终止密码子的上游。

重组载体

在一个优选实施方案中，治疗疫苗包含改造为表达至少一种核酸分子的重组载体，所述核酸分子编码如本文所述的目的多肽。它可以通过本领域技术人员已知的众多方式(例如克隆、PCR扩增、DNA改组)容易地生成。例如，这样的核酸分子可以独立地从任何可用的来源(例如本领域所述的生物材料、cDNA和基因组文库、病毒基因组或已知包括其的任何现有技术的载体)中分离，使用本领域技术人员可获得的序列数据和本文提供的序列信息，然后通过常规分子生物学技术适当地克隆。可替代地，它们也可以通过自动化过程中的化学合成生成(例如由重叠的合成寡核苷酸或合成基因装配)。优选地，这种目的核酸分子从cDNA获得，并且不包含内含子序列。可以通过本领域技术人员已知的众多方式生成修饰，例如化学合成、定点诱变、PCR诱变等。

另外，用于本发明中的核酸分子可以进行优化，以在特定的宿主细胞或对象中提供高水平的表达。事实上已观察到生物的密码子使用模式是高度非随机的，并且密码子的使用在不同宿主之间可能显著不同。因为治疗基因可能来自原核生物(例如细菌或病毒抗原)或低等真核生物(例如自杀基因)起源，因此它可能具有用于在高等真核细胞(例如人)中有效表达的不适当的密码子使用模式。通常，通过将对应于不频繁使用的密码子的一个或多个“天然”密码子替换为编码相同氨基酸的一个或多个密码子(该密码子在治疗对象中更频繁地使用)来执行密码子优化。因为增加的表达甚至可以用部分替换来实现，所以不需要替换对应于不频繁使用的密码子的所有天然密码子。

除了密码子使用的优化之外，还可以通过核苷酸序列的另外修饰来改善表达。例如，可以修饰核酸序列，以便防止存在于浓缩区域中的罕见的非最佳密码子的聚簇，和/或抑制或改变预期负面影响表达水平的“阴性”序列元件。这些阴性序列元件包括但不限于具有非常高(>80％)或非常低(<30％)的GC含量的区域；富含AT或富含GC的序列段；不稳定的直接或反向重复序列；R A二级结构；和/或内部隐蔽调节元件，例如内部TATA盒、chi-位点、核糖体进入位点和/或剪接供体/受体位点。

此外，当待表达同源核酸分子时，这种同源序列可以在全长核酸分子或其部分上简并，以便降低序列同源性。使显示高度序列相同性的核酸序列部分简并事实上是合理的(例如从给定病毒的各种血清型获得的相同抗原如HPV-16和HPV-18E6和/或E7抗原；重叠抗原如HBV抗原)，以便避免在生产过程期间的同源重组问题，并且技术人员能够通过序列比对鉴定这些部分。

编码目的多肽的核酸分子可以插入载体中，例如在病毒基因内、在基因间区域中、在非必需基因或区域中、或代替病毒序列。用于构建和产生重组痘病毒的一般条件是本领域众所周知的(参见例如WO2010/130753；WO03/008533；US 6,998,252；US 5,972,597和US6,440,422)。目的核酸分子优选插入非必需基因座中的痘病毒基因组内。胸苷激酶基因特别适合于插入Copenhagen牛痘载体和缺失II或III用于插入MVA载体中(WO97/02355；Meyer等人，1991,J.Gen.Virol.72:1031-8)。用于构建和产生重组麻疹病毒的一般条件是本领域众所周知的。在P和M基因之间或在H和L基因之间插入目的核酸分子是特别合适的。用于构建和产生重组腺病毒的一般条件是本领域众所周知的(参见例如Chartier等人，1996,J.Virol.70:4805-10和WO96/17070)。E1或E3区是待表达的核酸分子的插入的优选位点，其可以定位于相对于所讨论区域的天然转录方向的有义或反义方向。

在一个特别优选的实施方案中，治疗疫苗选自：

●如由WO92/07000、US5,861,381和Limacher和Quoix(2012,OncoImmunology 1(5):791-2)中描述的TG4010表示的，编码MUC-1TAA和人IL-2的MVA病毒；

●编码NS3和NS4HCV抗原和NS5b抗原的融合物的MVA病毒(如由WO2004/111082中描述的TG4040表示的)；

●如由WO99/03885中描述的TG4001表示的，编码膜锚定的HPV-16非致癌E6和E7抗原以及人IL-2的MVA病毒；

●如由TG4023(WO99/54481)表示的，编码FCU1基因的MVA病毒；和

●编码TB抗原组合的MVA病毒(如WO2014/009438中所述)。

编码目的多肽的核酸分子的表达

根据本发明，由用于本发明中的治疗疫苗表达的核酸分子可操作地连接到合适的调节元件，用于在所需宿主细胞或对象中表达。

如本文使用的，术语“调节元件”或“调节序列”指允许、促成或调节给定宿主细胞或对象中的核酸分子表达的任何元件，包括核酸或其衍生物(即mRNA)的复制、重复、转录、剪接、翻译、稳定和/或转运。如本文使用的，“可操作地连接的”意指被连接的元件被布置成使得它们一致地作用，用于其预期目的。例如，如果启动子在容许宿主细胞中影响从所述核酸分子的转录起始到终止子的转录，则启动子可操作地连接到核酸分子。

本领域技术人员应了解，调节序列的选择可以取决于诸如核酸分子本身、其表达源自的载体、所需表达水平等因素。启动子是特别重要的。在本发明的上下文中，它可以组成性地指导在许多类型的细胞中或者对于某些类型的细胞或组织特异性的核酸分子的表达，或者响应于特定事件或外源因子(例如通过温度、营养添加剂、激素等)或根据病毒循环的阶段(例如晚期或早期)进行调节。还可以使用在生产步骤期间响应于特定事件或外源因素被抑制的启动子，以便优化治疗疫苗的产生并且避免所表达的多肽的潜在毒性。

用于在重组腺病毒和质粒载体中表达的合适的组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子(US 5,168,062)、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子(Adra等人，1987,Gene 60:65-74)、单纯疱疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)启动子和T7聚合酶启动子(WO98/10088)。牛痘病毒启动子特别适于在重组痘病毒中表达。代表性实例包括但不限于牛痘7.5K、H5R、11K7.5(Erbs等人，2008,Cancer GeneTher.15(1):18-28)、TK、pB2R、p28、p11和K1L启动子，以及合成启动子，例如在Chakrabarti等人(1997,Biotechniques 23:1094-7；Hammond等人，1997,J.Virol Methods 66:135-8；以及Kumar和Boyle,1990,Virology 179:151-8)中所述的那些，以及早期/晚期嵌合启动子。适合于麻疹病毒的启动子包括但不限于指导麻疹转录单位表达的任何启动子(Brandler和Tangy，2008,CIMID 31:271)。

本领域技术人员应了解，控制目的核酸分子的表达的调节元件可进一步包含另外的元件，用于转录的适当启动、调节和/或终止(例如聚A转录终止序列)、mRNA转运(例如核定位信号序列)、加工(例如剪接信号)和稳定(例如内含子以及非编码5'和3'序列)、翻译(例如起始子Met、三联前导序列、IRES核糖体结合位点、信号肽等)和纯化步骤(例如标签)。在一个优选实施方案中，用于本发明中的治疗疫苗包含MVA载体，其含有插入其基因组内(优选在缺失II中)的编码肿瘤-相关抗原如MUC-1(优选在早期/晚期牛痘蛋白pH5R启动子的转录控制下)的核酸分子、以及编码免疫刺激多肽如人IL-2(优选在早期/晚期牛痘p7.5启动子的转录控制下)的核酸分子。更优选地，编码的MUC1抗原包含与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。甚至更优选地，MUC1抗原由与SEQ ID NO:2至少80％相同的核苷酸序列编码。

基于病毒的治疗疫苗的生产

在一个优选实施方案中，存在于本发明的组合产品中的治疗疫苗是病毒载体。通常，使用常规技术将病毒载体产生到合适的宿主细胞系内，所述常规技术包括a)制备生产者(例如容许的)宿主细胞，b)转染或感染所制备的生产者宿主细胞，c)在合适的条件下培养转染或感染的宿主细胞，以便允许产生载体(例如感染性病毒颗粒)，d)从所述细胞的培养物中回收产生的载体，并且任选地e)纯化所述回收的载体。

如本文使用的，术语“宿主细胞”应当广泛地理解，而不限于组织、器官或分离的细胞中的特定组构。这样的细胞可以是独特类型的细胞或一组不同类型的细胞，例如培养的细胞系、原代细胞和分裂细胞。在本发明的上下文中，术语“宿主细胞”包括原核细胞、低等真核细胞如酵母、以及其他真核细胞如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如人或非人)细胞、以及能够产生用于本发明中的基于质粒或病毒的治疗疫苗和/或免疫检查点调节剂的生产者细胞。该术语还包括可以是或已经是本文所述的组合产品的受体的细胞以及这种细胞的后代。

在步骤a)中，合适的生产者细胞依赖于待扩增的病毒载体的类型。复制缺陷型重组腺病毒通常在细胞中繁殖并产生，所述细胞反式供应由那些基因编码的腺病毒蛋白质，所述基因已在复制缺陷型腺病毒中被缺失或失活，因此允许病毒在细胞中复制。用于补充E1缺失的腺病毒的合适细胞系包括HEK-293细胞(Graham等人，1997,J.Gen.Virol.36:59-72)以及HER-96和PER-C6细胞(例如Fallaux等人，1998,Human Gene Ther.9:1909-1917；WO97/00326)和E1A549(Imler等人，1996,Gene Ther.3:75-84)或这些细胞系的任何衍生物。但本领域中描述的任何其他细胞系也可用于本发明的上下文中，尤其是批准用于生产用于人使用的产物的细胞系。感染性腺病毒颗粒可以从培养上清液和/或裂解后的细胞中回收。它们可以根据标准技术进一步纯化(如例如WO96/27677、WO98/00524、WO98/22588、WO98/26048、WO00/40702、EP1016711和WO00/50573中描述的在氯化铯梯度中超离心、色谱等)。

MVA是严格宿主限制性的，并且通常在禽类细胞上扩增，所述禽类细胞或为原代禽类细胞(例如由得自受精卵的鸡胚制备的鸡胚成纤维细胞(CEF))，或为永生化禽类细胞系且特别是用鸭TERT基因永生化的疣鼻栖鸭(Cairina moschata)细胞系(参见例如WO2010/130756和WO2012/001075)；根据WO2007/077256或WO2009/004016中描述的方法生产的禽类细胞系；用病毒和/或细胞基因的组合永生化的禽类细胞系(参见例如WO2005/042728)；自发永生化细胞(例如US5,879,924中公开的鸡DF1细胞系)；或通过从生长因子和饲养层逐步断绝而衍生自胚胎细胞的永生化细胞(例如WO2005/007840和WO2008/129058中公开的Ebx鸡细胞系)。

对于其他牛痘病毒或其他痘病毒菌株，除禽类原代细胞(例如CEF)和禽类细胞系之外，许多其他非禽类细胞系可用于生产，包括人细胞系如HeLa(ATCC-CRM-CCL-2^TM或ATCC-CCL-2.2^TM)、MRC-5、HEK-293；仓鼠细胞系如BHK-21ATCC-CCL-2.2^TM和Vero细胞。在一个优选实施方案中，除MVA外的牛痘病毒在HeLa细胞中进行扩增(参见例如WO2010/130753)。

生产者细胞优选在不含动物或人衍生产物的培养基中培养，使用不含动物或人起源的产物的化学成分确定的培养基。特别地，当生长因子可能存在时，它们优选重组产生，而不是从动物材料中纯化。取决于所选择的生产者细胞，本领域技术人员可以容易地选择适当的无动物培养基。这种培养基是商购可得的。特别地，当CEF用作生产者细胞时，它们可以在VP-SFM细胞培养基(Invitrogen)中进行培养。生产者细胞优选在+30℃至+38℃之间的温度下(更优选在约+37℃下)培养1至8天(优选对于CEF1至5天，并且对于永生化细胞2至7天)。如果需要，则可以进行1至8天的几次传代，以便增加细胞的总数目。

在步骤b)中，生产者细胞在适当的条件下(特别是使用适当的感染复数(MOI))被病毒载体感染，以允许生产者细胞的生产性感染。特别地，当治疗疫苗基于MVA并且使用CEF扩增时，它可以以优选包含在0.001至0.1之间(更优选约0.05)的MOI接种在含有CEF的细胞培养容器中。感染步骤还优选在不含动物或人衍生产物的培养基(其可以与用于培养生产者细胞的培养基相同或不同)中执行，使用不含动物或人起源的产物的化学成分确定的培养基。

在步骤c)中，然后在本领域技术人员众所周知的适当条件下培养受感染的生产者细胞，直到产生后代病毒载体(例如感染性病毒颗粒)。受感染的生产者细胞的培养也优选在不含动物或人衍生的产物的培养基(其可以与用于培养生产者细胞和/或用于感染步骤的培养基相同或不同)中(使用不含动物或人起源的产物的化学成分确定的培养基)，在+30℃至+37℃之间的温度下执行1至5天。

在步骤d)中，从培养上清液和/或生产者细胞中收集步骤c)中产生的病毒载体。从生产者细胞(以及任选地从培养上清液)中的回收可能需要允许生产者细胞膜破坏以允许从生产者细胞中释放载体的步骤。生产者细胞膜的破坏可以通过本领域技术人员众所周知的各种技术来诱导，包括但不限于：冻/融、低渗裂解、超声处理、微流化或高速匀浆。

然后可以使用本领域众所周知的纯化步骤进一步纯化病毒载体。可以设想各种纯化步骤，包括澄清、酶促处理(例如内切核酸酶、蛋白酶等)、色谱和过滤步骤。适当的方法在本领域中得到描述(例如WO2007/147528；WO2008/138533、WO2009/100521、WO2010/130753、WO2013/022764)。

免疫检查点调节剂

免疫检查点及其调节剂以及使用这些化合物的方法在文献中得到描述。“免疫检查点”蛋白质直接或间接涉及免疫途径，在正常生理条件下，所述免疫途径对于预防不受控制的免疫反应以及维持自我耐受和/或组织保护至关重要。但在病理状态下，它们在T细胞耗尽中起关键作用。

本文使用的一种或多种免疫检查点调节剂可以独立地在T细胞介导的免疫的任何步骤处起作用，包括抗原特异性细胞的克隆选择、T细胞活化、增殖、运输到抗原和炎症部位、通过细胞因子和膜配体执行直接效应子功能和信号传导。这些步骤各自通过平衡细调应答的刺激和抑制信号来调节。在本发明的上下文中，该术语涵盖(i)能够至少部分地下调抑制性免疫检查点的功能的免疫检查点调节剂(例如通过直接结合或抑制与所述靶向免疫检查点结合的配体)，以便发挥拮抗剂功能，并且因此拮抗免疫检查点介导的抑制信号，以及(ii)能够至少部分地上调刺激性免疫检查点的功能的免疫检查点调节剂，以便发挥激动剂功能，并且因此扩增免疫检查点介导的刺激信号。

本文使用的一种或多种免疫检查点调节剂可以独立地是多肽或核酸分子；其中特别优选肽配体、天然受体的可溶性结构域、RNAi、反义分子、抗体和蛋白质支架。

在一个优选实施方案中，免疫检查点调节剂是抗体。在本发明的上下文中，“抗体”("Ab")以最广泛的含义使用，并且涵盖天然存在的和由人改造的，以及全长抗体或者其能够结合靶免疫检查点或表位(因此保留靶结合部分)的功能片段或类似物。本发明中使用的抗体可以具有任何起源，例如人、人源化、动物(例如啮齿动物或骆驼科抗体)或嵌合的。它可以具有任何同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM等)。另外，它可以是糖基化的或非糖基化的。术语抗体还包括双特异性或多特异性抗体，只要它们显示出本文所述的结合特异性。

为了举例说明性目的，全长抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻链(L)链的糖蛋白。每条重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区，所述重链恒定区由三个CH1、CH2和CH3结构域制备(任选地具有在CH1和CH2之间的铰链)。每条轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区，所述轻链恒定区包含一个CL结构域。VH和VL区包含高变区，称为互补决定区(CDR)，并且被称为构架区(FR)的更保守的区域间隔。每个VH和VL按下述次序包括三个CDR和四个FR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的CDR区对于结合特异性是决定性的。

如本文使用的，“人源化抗体”指其蛋白质序列已被修饰以增加其与人抗体(即在人体中天然产生的)的相似性的非人(例如鼠、骆驼、大鼠等)抗体。人源化过程是本领域众所周知的(参见例如Pestra等人，1997,Cancer Res.57(20):4593-9；US 5,225,539；US 5,530,101；US 6,180,370；WO2012/110360)。例如，开发用于人使用的单克隆抗体可以通过取代FR区的一个或多个残基来人源化，以看起来像人免疫球蛋白序列，而可变区(尤其是CDR)的绝大多数残基不被修饰并且对应于非人免疫球蛋白的那些。对于一般指导，FR区中的这些氨基酸取代的数目在每个可变区VH或VL中通常不超过20。

如本文使用的，“嵌合抗体”指包含一个物种的一种或多种元件和另一个物种的一种或多种元件的抗体，例如包含人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分的非人抗体。

抗体片段可以改造用于本发明的组合中。代表性实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、dAb、Fd、Fv、scFv、di-scFv、双抗体和任何其他人工抗体。更具体而言：

(i)Fab片段由单价片段表示，所述单价片段由VL、VH、CL和CH1结构域组成；

(ii)F(ab')2片段由二价片段表示，所述二价片段包含通过在铰链区处的至少一个二硫桥连接的两个Fab片段；

(iii)Fd片段由VH和CH1结构域组成；

(iv)Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成，

(v)dAb片段由单个可变结构域片段(VH或VL结构域)组成；

(vi)单链Fv(scFv)包含Fv片段的两个结构域，VL和VH，其任选用接头融合在一起，以制备单条蛋白质链(参见例如Bird等人，1988,Science 242:423-6；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-83；US 4,946,778；US 5,258,498)；和

(vii)任何其他人工抗体。

用于制备抗体、其片段和类似物的方法是本领域已知的(参见例如Harlow和Lane，1988,Antibodies–Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor NY)。在一个实施方案中，可以用靶向免疫检查点调节剂在宿主动物中生成这样的抗体。可替代地，它可以由杂交瘤(参见例如Kohler和Milstein，1975,Nature 256:495-7；Cote等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-30；Cole等人于Monoclonalantibodies and Cancer Therapy；AlanLiss第77-96页中)、重组技术(例如使用噬菌体展示法)、肽合成和酶促切割产生。抗体片段可以通过如本文所述的重组技术产生。它们也可以通过蛋白水解切割来产生，使用酶例如木瓜蛋白酶以产生Fab片段或胃蛋白酶以产生如文献中所述的F(ab')2片段(参见例如Wahl等人，1983,J.Nucl.Med.24:316-25)。类似物(或其片段)可以通过常规分子生物学方法(PCR，诱变技术)生成。如果需要，则可以以与完整抗体相同的方式筛选此类片段和类似物的功能(例如通过标准ELISA测定)。

在一个优选实施方案中，用于本发明中的一种或多种免疫检查点调节剂中的至少一种是单克隆抗体，其中特别优选人抗体(其中两个构架区均衍生自人种系免疫球蛋白序列)或根据众所周知的人源化过程的人源化抗体。

期望地，本发明中使用的一种或多种免疫检查点调节剂至少部分地(例如超过50％)拮抗抑制性免疫检查点的活性，特别是由下述任一种介导的那些：PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA、SLAM、2B4、CD160、KLRG-1和CTLA4，其中特别优选与这些靶蛋白中的任一种结合的人或人源化单克隆抗体。术语“特异性结合”指即使在其他蛋白质和生物制品的异质群体的存在下，对特定靶或表位的结合特异性和亲和力的能力。因此，在指定的测定条件下，本发明中使用的抗体优先与其靶结合，并且不以显著量与测试样品或对象中存在的其他组分结合。优选地，这样的抗体显示与其靶的高亲和力结合，其平衡解离常数等于或低于1x10^-6M(例如至少0.5x10^-6、1x10^-7、1x10^-8、1x10^-9、1x10^-10等)。可替代地，本发明中使用的一种或多种免疫检查点调节剂在它能够刺激或加强刺激信号的意义上发挥激动剂功能，特别是由CD28介导的那些，其中特别优选ICOS、CD137(4-1BB)、OX40、CD27、CD40和GITR免疫检查点中的任一种。评估抗体针对免疫检查点的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定例如通过Biacore分析进行评价。

在一个优选实施方案中，用于本发明中的一种或多种检查点调节剂中的至少一种是能够至少部分地拮抗蛋白质程序性死亡1(PD-1)的抗体，且尤其是特异性结合人PD-1的抗体。PD-1是免疫球蛋白(Ig)基因超家族的部分和CD28家族的成员。它是在抗原经历的细胞(例如活化B细胞、T细胞和骨髓细胞)上表达的55kDa 1型跨膜蛋白(Agata等人，1996,Int.Immunol.8:765-72；Okazaki等人，2002,Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett等人，2003,J.Immunol 170:711-8)。在正常背景下，它通过在炎性反应时限制T细胞的活性起作用，从而保护正常组织免于破坏(Topalian,2012,Curr.Opin.Immunol.24:207-12)。已鉴定了PD-1的两种配体，分别为PD-L1(程序性死亡配体1)和PD-L2(程序性死亡配体2)(Freeman等人，2000,J.Exp.Med.192:1027-34；Carter等人，2002,Eur.J.Immunol.32:634-43)。在20-50％的人癌症中鉴定出PD-L1(Dong等人，2002,Nat.Med.8:787-9)。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞的减少，T细胞受体介导的增殖减少和通过癌性细胞的免疫逃避(Dong等人，2003,J.MoI.Med.81:281-7；Blank等人，2005,CancerImmunol.Immunother.54:307-314)。完整的核苷酸和氨基酸PD-1序列可以在GenBank登录号U64863和NP_005009.2下找到。许多抗PD1抗体是本领域可获得的(参见例如WO2004/004771；WO2004/056875；WO2006/121168；WO2008/156712；WO2009/014708；WO2009/114335；WO2013/043569；和WO2014/047350中所述的那些)。在本发明的上下文中优选的抗PD-1抗体是FDA批准的或处于晚期临床开发中，并且可以特别使用选自Nivolumab(也称为BMS-936558，由Bristol Myer Squibb开发)、Lanbrolizumab(也称为MK-3475，由Merck开发)和Pidilizumab(也称为CT-011，由CureTech开发)的抗PD-1抗体。

免疫检查点调节剂的另一个优选实例由能够至少部分地拮抗称为PD-L1的PD-1配体的调节剂表示，且尤其是识别人PD-L1的抗体。许多抗PD-L1抗体是本领域可获得的(参见例如在EP1907000中描述的那些)。优选的抗PD-L1抗体是FDA批准的或处于晚期临床开发中(例如由Genentech/Roche开发的MPDL3280A和由Bristol Myer Squibb开发的BMS-936559)。

免疫检查点调节剂的另外一个优选实例由能够至少部分地拮抗CTLA-4蛋白的调节剂表示，且尤其是识别人CTLA-4的抗体。CTLA4(关于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)也称为CD152在1987年得到鉴定(Brunet等人，1987,Nature 328:267-70)，并且由CTLA4基因编码(Dariavach等人，Eur.J.Immunol.18:1901–5)。它在T细胞的表面上表达，在其中它主要调节T细胞活化的早期阶段的幅度。近期工作已表明，CTLA-4可能通过从抗原呈递细胞的膜中捕获和去除B7-1和B7-2而在体内发挥功能，因此使得这些不能用于触发CD28(Qureshi等人，Science,2011,332:600-3)。完整的CTLA-4核酸序列可以在GenBank登录号L1 5006下找到。许多抗CTLA-4抗体是本领域可获得的(参见例如US 8,491,895中描述的那些)。在本发明的上下文中优选的抗CTLA-4抗体是FDA批准的或处于晚期临床开发中。可以更具体地列举由Bristol Myer Squibb作为Yervoy销售的伊匹单抗(参见例如US 6,984,720；US 8,017,114)、由Pfizer开发的曲美木单抗(参见例如US 7,109,003和US 8,143,379)、以及单链抗CTLA4抗体(参见例如WO97/20574和WO2007/123737)。

用于拮抗TIM3受体的免疫检查点调节剂也可以用于本发明的组合产品中(参见例如Ngiow等人，2011,Cancer Res.71:3540-51；US2012-0189617)。

用于拮抗LAG3受体的另一种免疫检查点调节剂也可以用于本发明的组合中(参见例如Toni-Jun等人，2011,2014,ACCR poster LB266；Woo等人,2012,Cancer Res.72:917-27)。

免疫检查点调节剂的另外一个实例由OX40激动剂例如OX40的激动剂配体(OX40L)(参见例如US 5,457,035，US 7,622,444；WO03/082919)或针对OX40受体的抗体(参见例如US 7,291,331和WO03/106498)表示。

免疫检查点调节剂的其他实例由靶向由CD8+T细胞和NK细胞具有的抑制性受体的抗KIR或抗CD96抗体表示。

本发明涵盖包含多于一种免疫检查点调节剂的组合。优选的实例包括但不限于使用抗CTLA-4抗体与抗-PD-L1或与本文所述的治疗疫苗组合的抗PD-1抗体。

使用本领域可获得的序列数据和本文提供的信息，通过标准分子生物学技术，可以获得编码所需免疫检查点调节剂的相关部分的核酸分子。例如，可以从生产杂交瘤、免疫球蛋白基因文库或任何可用的来源分离编码抗体轻链和重链或其CDR的cDNA。

在一个实施方案中，用于本发明中的一种或多种免疫检查点调节剂可以包含在本文所述的治疗疫苗中。例如，可以将编码核酸分子插入基于载体的治疗疫苗中(例如编码抗原的病毒载体中)。在该上下文中，编码目的多肽和免疫检查点调节剂的核酸分子优选用不同的调节元件独立地表达。可替代地，用于本发明中的一种或多种免疫检查点调节剂可以由独立的载体系统表达，例如与治疗疫苗结合的本文所述那些之一，用于分开或伴随施用于有此需要的对象。

另外可替代地，用于本发明中的一种或多种免疫检查点调节剂可以通过重组手段使用合适的表达载体和宿主细胞来生产，用于作为重组多肽施用于有此需要的对象。

免疫检查点调节剂的生产

在表达载体内的插入可以通过常规分子生物学来执行，例如，如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory)中所述。在基于病毒的治疗疫苗内的插入可以通过如Chartier等人(1996,J.Virol.70:4805-10)和Paul等人(2002,Cancer Gene Ther.9:470-7)中所述的同源重组执行。

可以使用或构建各种宿主载体系统，以表达用于本发明中的一种或多种免疫检查点调节剂，包括原核生物例如细菌(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)；酵母(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞系统(例如Sf 9细胞和杆状病毒)；植物细胞系统(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)和哺乳动物细胞系统(例如培养细胞)。通常，这样的载体是商购可得的(例如在Invitrogen、Stratagene、Amersham Biosciences、Promega等中)，或可从保藏机构例如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.)获得，或已成为众多出版物的主题，所述出版物描述其序列、组构和生产方法，允许技术人员应用其。为了一般目的，这些载体通常包含使得核酸分子能够在宿主细胞中维持、增殖或表达的一种或多种元件。代表性元件包括但不限于标记物基因，以便促进重组宿主细胞的鉴定和分离(例如通过细胞营养缺陷型的互补或通过抗生素抗性)，稳定化元件(例如US 5,198,343中所述的DAP系统)和整合元件(例如LTR病毒序列和转座子)。

用于原核系统中的合适质粒载体包括但不限于(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pbluescript(Stratagene)、p Poly(Lathe等人，1987,Gene 57:193-201)、pTrc(Amann等人，1988,Gene 69:301-15)；pET lid(Studier等人，1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185:60-89)；pIN(Inouye等人，1985,Nucleic Acids Res.13:3101-9；Van Heeke等人，1989,J.Biol.Chem.264:5503-9)；和pGEX载体，其中核酸分子可以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)(Amersham Biosciences Product)融合表达。用于在酵母(例如酿酒酵母)中表达的合适载体包括但不限于pYepSec1(Baldari等人，1987,EMBO J.6:229-34)、pMFa(Kujan等人，1982,Cell 30:933-43)、pJRY88(Schultz等人，1987,Gene 54:113-23)、pYES2(Invitrogen Corporation)和pTEF-MF(Dualsystems Biotech Product)。质粒和病毒载体例如本文中与治疗疫苗结合描述的那些体也可以用于通过重组手段产生免疫检查点调节剂。

重组DNA技术也可以用于改善宿主细胞中编码免疫检查点调节剂的核酸分子的表达，例如通过使用高拷贝数载体，取代或修饰一种或多种转录调节序列(例如启动子、增强子等等)，优化密码子使用并且抑制负序列，所述负序列可以使与编码目的多肽的核酸分子结合的如本文所述的转录物不稳定。

如前，编码免疫检查点调节剂的核酸分子是适合于其在宿主细胞中表达的形式，这意味着将核酸分子置于对载体、宿主细胞和/或如上所述所需的表达水平适当的一种或多种调节序列的控制下。可以使用组成型启动子(例如PGK、CMV启动子等)、由外源供应的化合物调节的诱导型真核启动子(例如TRP和IPTG诱导型pTAC启动子、锌诱导型金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、四环素可阻遏和雷帕霉素诱导型启动子等)、以及下文描述的用于表达编码目的多肽的核酸分子的任何启动子。

用于免疫检查点调节剂的重组生产的方法是本领域常规的。通常，这样的方法包括(a)将本文描述的表达载体引入合适的生产者细胞中，以产生转染或感染的生产者细胞，(b)在适合于其生长的条件下，体外培养所述转染或感染的生产者细胞，(c)从细胞培养物中回收免疫检查点调节剂，和(d)任选地，纯化回收的免疫检查点调节剂。

在本发明的上下文中，生产者细胞包括原核细胞，低等真核细胞如酵母，以及其他真核细胞如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如人或非人)细胞。优选的大肠杆菌细胞包括但不限于大肠杆菌BL21(Amersham Biosciences)。优选的酵母生产者细胞包括但不限于酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母。优选的哺乳动物生产者细胞包括但不限于BHK-21(幼仓鼠肾)、CV-1(非洲猴肾细胞系)、COS(例如COS-7)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、鼠NIH/3T3细胞、HeLa细胞、Vero细胞、HEK293细胞和PERC.6细胞以及相应的杂交瘤细胞。

生产者宿主细胞的转染/感染是常规的，并且可以使用另外的化合物，以便改善载体的转染效率和/或稳定性。这些化合物在文献中有广泛的记录，例如聚阳离子聚合物(例如壳聚糖、聚甲基丙烯酸酯、PEI等)、阳离子脂质(例如DC-Chol/DOPE，现在可得自Promega的transfectam lipofectin)和脂质体。

生产者细胞可以在常规发酵生物反应器、烧瓶和培养皿中培养。培养可以在对于给定宿主细胞适当的温度、pH和氧含量下进行。在此不试图详细描述已知用于在原核细胞和真核细胞中生产蛋白质的各种方法。免疫检查点调节剂的生产可以是周质的、细胞内的或优选在生产者细胞外的分泌(例如在培养基中)。需要时，尤其是当免疫检查点调节剂不在生产者细胞外分泌或它不完全分泌时，它可以通过标准裂解程序进行回收，包括冻融、超声处理、机械破裂、裂解剂的使用等等。如果分泌，则它可以直接从培养基中回收。

任选地，免疫检查点调节剂然后可以通过众所周知的纯化方法进行纯化，包括硫酸铵沉淀、酸提取、凝胶电泳、过滤和色谱法(例如反相、尺寸排阻、离子交换、亲和、磷酸纤维素、疏水相互作用或羟磷灰石色谱等)。用于纯化特定蛋白质的条件和技术将取决于诸如净电荷、分子量、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员将是清楚的。此外，纯化水平将取决于预期用途。还应理解，取决于生产者细胞，免疫检查点调节蛋白可以具有各种糖基化模式，或可以是非糖基化的(例如当在细菌中产生时)，如本文所述。

期望地，本发明中使用的免疫检查点调节剂是至少部分纯化的，其含义为它基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体和/或其他细胞材料。此外，可以根据本领域常规使用的条件(例如WO2009/073569)配制免疫检查点调节剂。

根据本发明，可以在免疫检查点抑制剂中引入各种修饰，以便增加其生物半衰期、其亲和力、其稳定性和/或其生产。例如，可以包括信号肽用于促进如本文所述的免疫检查点调节剂在细胞培养中的分泌。作为另外的实例，还可以加入标签肽(通常是能够被可用的抗血清或化合物识别的短肽序列)，用于促进重组免疫检查点调节剂的纯化。在本发明的上下文中可以使用广泛多样的标签肽，包括但不限于PK标签、FLAG八肽、MYC标签、HIS标签(通常是4至10个组氨酸残基的段)和e标签(US 6,686,152)。标签肽可以独立地定位在蛋白质的N末端处，或者可替代地在其C末端处，或者可替代地在内部，或当采用几种标签时在这些位置的任何处。标签肽可以通过使用抗标签抗体的免疫检测测定来检测。

可以在本发明的上下文中追求的另一种方法是将免疫检查点调节剂与外部试剂偶联，所述外部试剂例如放射增敏剂、细胞毒素剂和/或标记试剂。偶联可以是共价的或非共价的。如本文使用的，术语“放射增敏剂”指使细胞对放射治疗更敏感的分子。放射增敏剂包括但不限于甲硝唑、米索硝唑、去甲基米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(iododeoxyuhdine)(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FUdR)、羟基脲和顺铂。

如本文使用的，术语“细胞毒素剂”指对细胞直接毒性，防止其繁殖或生长的化合物，例如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段)。如本文使用的，“标记试剂”指可检测的化合物。标记试剂本身可以检测(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶促标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物的化学修饰。

另一种修饰是聚乙二醇化例如以增加抗体的生物半衰期。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的(参见例如EP154316；EP401384；WO98/15293，WO01/23001等)。

组合产品和疗法

术语“组合疗法”以及任何变化例如“组合使用”指在相同对象中施用至少两个实体的动作是本发明的目的并在本文中描述。

在一个实施方案中，本发明涉及以组合物形式的组合产品，其包含治疗有效量的至少治疗疫苗和本文所述的一种或多种免疫检查点调节剂实体和药学可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于组合使用的不同组合物，一种包含至少治疗有效量的治疗疫苗和药学可接受的媒介物，并且另一种包含治疗有效量的一种或多种免疫检查点调节剂和药学可接受的媒介物。可以进行每个实体(或其组合物)的一次或多次施用，所述施用可以是经由相同或不同的途径伴随、序贯或间隔的。

“治疗有效量”对应于在本发明的组合或组合物中包含的每一个活性实体(治疗疫苗和一种或多种免疫检查点调节剂)的量，其足以产生一种或更有利的结果。这样的治疗有效量可以根据各种参数的功能而变化，例如施用模式；对象的年龄和重量；症状的性质和程度；对象响应治疗的能力，并发治疗种类；治疗的频率和/或预防或治疗的需要等。

当涉及“预防”用途时，组合以足够的剂量施用，以预防或延迟病理状况的发作和/或建立和/或复发，尤其是在处于风险的对象中。对于“治疗”用途，治疗疫苗和免疫检查点调节剂两者均施用于诊断为患有疾病或病理状态的对象，目的是治疗它，任选地与一种或多种常规治疗模式相结合。

术语“药学可接受的媒介物”预期包括与在哺乳动物且特别是人对象中施用相容的任何和所有载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、吸收剂等等。

治疗疫苗和一种或多种免疫检查点调节剂或其组合物各自可独立地置于适合于人或动物使用的溶剂或稀释剂中。特别地，每种或两者可以这样配制，以便确保其特别是在制造和长期贮存(即至少6个月，其中优选至少两年)条件下，在冷冻(例如-70℃、-20℃)、冷藏(例如4℃)或环境(例如20-25℃)温度下的稳定性。这样的制剂一般包括液体载体例如水溶液。可以使用生理盐水溶液、林格氏溶液、汉克氏溶液、糖类溶液(例如葡萄糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖等)和其他水性生理平衡盐溶液(参见例如最新版本的Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins)。动物油或植物油、矿物油或合成油也是合适的。有利地，对于治疗疫苗和一种或多种免疫检查点调节剂或其组合物合适的制剂适当地缓冲用于人使用，优选在生理或微碱性的pH(例如从大约pH 7到大约pH 9，其中特别优选包含在7和8之间的pH，且更特别接近于7.5)下。合适的缓冲液包括但不限于TRIS(三(羟甲基)甲胺)、TRIS-HCl(三(羟甲基)甲胺-HCl)、HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、磷酸盐缓冲液(例如PBS)、ACES(N-(2-乙酰胺基)-氨基乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸))、MOPSO(3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、DIPSO(3-[双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、HEPPSO(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-(2-羟基)-丙磺酸)、POPSO(2-羟基-3-[4-(2-羟基-3-磺丙基)哌嗪-1-基]丙烷-1-磺酸)、TEA(三乙醇胺)、EPPS(N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-3-丙磺酸)和TRICINE(N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)。优选地，所述缓冲液选自TRIS-HCl、TRIS、Tricine、HEPES以及包含Na₂HPO₄和KH₂PO₄的混合物或包含Na₂HPO₄和NaH₂PO₄的混合物的磷酸盐缓冲液。所述缓冲液(特别是上文提到的那些，且特别是TRIS-HCl)优选以10至50mM的浓度存在。在这种制剂中还包括一价盐以便确保适当的渗透压可以是有益的。所述单价盐可以特别地选自NaCl和KCl，优选地所述单价盐是NaCl，优选以10至500mM的浓度。

适用于本发明的上下文中的制剂，且尤其是液体或冷冻制剂，还可以包括冷冻保护剂，以便在低贮存温度下例如约+5℃和更低下，保护治疗疫苗和/或一种或多种免疫检查点调节剂(特别是基于病毒的组合物)。合适的冷冻保护剂包括但不限于蔗糖(sucrose)(或蔗糖(saccharose))、海藻糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油，优选以0.5至20％(以g表示的重量/以L表示的体积，称为w/v)的浓度。例如，蔗糖优选以5至15％(w/v)的浓度存在，其中特别优选约10％。

适用于本发明中的制剂且尤其是液体制剂可以进一步包含药学可接受的螯合剂，且特别是用于改善稳定性的螯合指示剂。药学可接受的螯合剂可以特别选自乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)。药学可接受的螯合剂优选以至少50μM的浓度存在，其中特别优选50至1000μM的浓度。优选地，所述药学可接受的螯合剂是以接近于150μM的浓度存在的EDTA。

可以进一步存在另外的化合物，以增加配制的治疗疫苗和/或免疫检查点调节剂或其组合物的稳定性。这些另外的化合物包括但不限于C₂-C₃醇(期望地以0.05至5％(体积/体积或v/v)的浓度)、谷氨酸钠(期望地以低于10mM的浓度)、非离子型表面活性剂(Evans等人2004,J Pharm Sci.93:2458-75，Shi等人，2005,J Pharm Sci.94:1538-51，US7,456,009，US2007/0161085)，例如以低于0.1％的低浓度的Tween 80(也称为聚山梨醇酯80)。已发现二价盐如MgCl₂或CaCl₂诱导液态的各种生物制品的稳定(参见Evans等人2004,JPharmSci.93:2458-75和US7,456,009)。已发现氨基酸，且特别是组氨酸、精氨酸或甲硫氨酸诱导液态的各种病毒的稳定(参见Evans等人，2004,JPharm Sci.93:2458-75，US7,456,009，US2007/0161085，US7,914,979，WO2014/029702和WO2014/053571)。

高分子量聚合物例如葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的存在特别适合于冷冻干燥制剂。冻干制剂一般通过涉及真空干燥和冷冻干燥的方法获得(参见例如WO03/053463；WO2006/0850082；WO2007/056847；WO2008/114021)，并且这些聚合物的存在帮助在冷冻干燥期间的滤饼形成(参见EP1418942和WO2014/053571)。

本领域可获得的以冷冻、液体或冷冻干燥形式的各种制剂可以独立地用于保存治疗疫苗和/或免疫检查点调节剂或其组合物(例如WO98/02522、WO00/29024、WO00/34444、WO01/66137、WO03/053463、WO2006/0850082、WO2007/056847和WO2008/114021等)。为了举例说明性目的，含有表面活性剂例如聚山梨醇酯80和保护剂例如蔗糖或甘露醇的无菌组氨酸、乙酸柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液盐水适于保存重组抗体，并且包括NaCl和/或糖的缓冲制剂特别适于保存载体化的治疗疫苗(例如具有蔗糖5％(w/v)、谷氨酸钠10mM和NaCl 50mM的Tris-HCl 10mM pH 8，或具有甘油(10％)和NaCl的磷酸盐缓冲盐水)。

制剂可以根据施用模式进行调整，以确保在体内的适当分布或延迟释放。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乙二醇。用于制备这些制剂的许多方法在本领域中描述(例如J.R.Robinsonin“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”,编辑，MarcelDekker,Inc.,New York,1978；WO01/23001；WO2006/93924；WO2009/53937)。肠溶胶囊和颗粒特别适合于经口施用，栓剂适合于直肠或阴道施用，任选与用于增加粘膜的孔径的吸收促进剂组合。这种吸收促进剂通常是与粘膜的磷脂结构域具有结构相似性的物质(例如脱氧胆酸钠、甘胆酸钠、二甲基-β-环糊精、月桂基-1-溶血磷脂酰胆碱)。

治疗疫苗和/或免疫检查点调节剂或其组合物各自还可以含有药学可接受的赋形剂，用于提供期望的药物或药效学性质，包括例如渗透压、粘度、透明度、颜色、不育性、稳定性、溶解、释放或吸收到对象内、或递送到特定器官。

治疗疫苗和免疫检查点调节剂的适当剂量以及每个实体的最佳比率可以通过本领域众所周知的技术来确定。根据相关情况，从业者可以定期作出使适当剂量适于对象或一组对象的所需计算的进一步完善。

当通过肠胃外注射使用时，免疫检查点调节剂的合适剂量从约0.01mg/kg到约50mg/kg不等，有利地约0.1mg/kg至约30mg/kg，期望地约0.5mg/kg至约25mg/kg，优选约1mg/kg至约20mg/kg，更优选约2mg/kg至约15mg/kg，其中特别优选约3mg/kg至约10mg/kg的剂量。然而，针对施用途径和待治疗的对象，剂量可以以包含在1.5和100之间的变化系数修改。在一些实施方案中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量落入所示的范围内。

取决于所使用的定量技术，对于基于病毒的治疗疫苗的合适剂量从大约10⁵到大约10¹³vp(病毒颗粒)、iu(感染单位)或pfu(噬斑形成单位)不等。作为一般指导，大约10⁶至大约5x10¹²vp的腺病毒剂量是合适的，优选大约10⁷vp至大约10¹²vp，更优选大约10⁸vp至大约5x10¹¹vp；大约5x10⁸vp至大约10¹¹vp的剂量特别优选尤其用于人使用。适合于基于MVA的治疗疫苗的个别剂量包含大约10⁴至大约10¹²pfu，优选大约10⁵pfu至大约10¹¹pfu，更优选大约10⁶pfu至大约10¹⁰pfu；大约10⁷pfu至大约10⁹pfu的剂量特别优选尤其用于人使用。适合于基于牛痘的治疗疫苗的个别剂量包含大约10⁵至大约10¹³pfu，优选大约10⁶pfu至大约10¹¹pfu，更优选大约10⁷pfu至大约10¹⁰pfu；大约10⁸pfu至大约5x10⁹vp的剂量特别优选尤其用于人使用。样品中存在的病毒数量可以通过常规滴定技术进行确定，例如通过计数在容许细胞(例如293或PER6C6用于Ad，BHK-21或CEF用于MVA，HeLa用于VV)感染后的噬斑数目，通过测量A260吸光度(vp滴度)或另外通过定量免疫荧光，例如使用抗病毒抗体(iu滴度)。基于质粒的治疗疫苗的合适剂量从10μg到20mg不等，有利地100μg至10mg，且优选大约0.5mg至大约5mg。

施用

本发明的组合产品适合于单一施用或一系列施用。特别是当考虑不同的组合物时，治疗疫苗和免疫检查点调节剂可以一起或分开施用于对象，并且以单个剂量或多个剂量施用。施用可能是伴随的(例如在相同的组合物中或在大约同时施用的不同组合物中混合)、序贯的(治疗疫苗随后为免疫检查点调节剂，或反之亦然)、或间隔的(以各种间隔混杂施用)，并且在相同部位或在替代部位通过相同或不同途径执行。

对于本发明的组合产品或组合物，任何常规施用途径在本发明的上下文中都可应用，包括肠胃外、局部或粘膜途径。肠胃外途径预期用于作为注射或输注施用，并且涵盖全身以及局部途径。可以用于施用本发明的组合产品的肠胃外注射类型是静脉内(进入静脉内，例如供给肝的门静脉)、血管内(进入血管内)、动脉内(进入动脉例如肝动脉内)、皮内(进入真皮内)、皮下(在皮肤下)、肌内(进入肌肉内)、腹膜内(进入腹膜内)和瘤内(进入瘤内或其附近)或另外通过划痕(scarification)。输注通常通过静脉内途径给予。粘膜施用包括但不限于经口/消化、鼻内、气管内、肺内、阴道内或直肠内途径。也可以使用经皮手段(例如贴片等等)执行局部施用。用于免疫检查点调节剂的优选施用途径包括静脉内(例如静脉内注射或输注)和瘤内。用于治疗疫苗的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮下和瘤内。例如，治疗疫苗的瘤内接种可以与免疫检查点调节剂的静脉内注射有利地组合。

施用可以使用常规注射器和针(例如Quadrafuse注射针)或者本领域中可获得的任何化合物或装置，其能够促进或改善对象中的活性剂递送(例如用于促进肌内施用的电穿孔)。替代方案是使用无针注射装置，以施用在本发明的组合产品中包含的至少一种活性实体(例如Biojector TM装置)。也可以设想经皮贴剂。

在一个实施方案中，序贯施用治疗疫苗和一种或多种免疫检查点调节剂或其组合物，例如首先施用疫苗并且其次施用免疫检查点调节剂，或反之亦然(首先施用免疫检查点调节剂并且其次施用治疗疫苗)。顺序可以改变。例如，施用次序可以在每个施用时间点逆转或保持相同次序。

还可以通过治疗疫苗和免疫检查点调节剂的间隔施用来进行。治疗疫苗的第一次施用与免疫检查点调节剂的第一次施用之间的时间段可以从大约数分钟到数周不等。还能够经由序贯施用循环对于每个实体进行，所述序贯施用循环在休息期后重复。每次施用之间的间隔可以是一小时到一年(例如24小时、48小时、72小时、每周、每两周、每月或每年)。间隔也可以是不规律的(例如在患者血液水平中测量单克隆抗体后)。剂量可以对于每次施用在上述范围内变化。优选地，每次治疗疫苗施用之间的时间间隔可以从大约1天到大约8周不等，有利地大约2天至大约6周，优选大约3天至大约4周，且甚至更优选大约1周至大约3周，其中特别优选约一周。组合时，免疫检查点调节剂的每次施用之间的时间间隔可以从大约2天到大约8周不等，有利地大约1周至大约6周，优选每3周。

优选的治疗方案涉及以大约1至3周间隔的4至15(4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)次10⁷或10⁹pfu基于MVA的治疗疫苗的施用，间隔有每2或3周的2至6次3至10mg/kg抗免疫检查点抗体的施用。为了举例说明性目的，优选的施用时间表包括以每周大约10⁸pfu的剂量皮下施用表达MUC1的MVA载体(例如TG4010)共6周，然后每三周间隔有以大约3mg/kg的剂量的抗CTLA4抗体例如伊匹单抗的静脉内施用，每3周总共4个剂量。

本发明的组合产品或组合物用于治疗或预防疾病或病理状况，尤其是由致病生物引起的那些或根据本文所述模式的不需要的细胞分裂。“疾病”(以及任何形式的疾病，例如“病症”或“病理状态”)的特征通常在于可鉴定的症状。示例性疾病包括但不限于起因于由致病生物(例如细菌、寄生虫、病毒、真菌等)的感染的传染病，以及涉及细胞异常增殖的增殖性疾病，例如肿瘤性疾病(例如癌症)、类风湿关节炎和再狭窄。

本发明还涉及治疗方法，其包括施用治疗疫苗和/或一种或多种免疫检查点调节剂的组合产品或组合物，其量足以治疗或预防有此需要的对象中的疾病或病理状况，或者减轻与疾病和病理状况相关或结合的一种或多种症状，根据本文所述的模式。在一个优选实施方案中，待治疗的疾病或病理状况是增殖性疾病或传染病(例如尤其是慢性感染)。相应地，本发明还涉及用于抑制肿瘤细胞生长的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗疫苗和/或一种或多种免疫检查点调节剂的组合产品或组合物。在本发明的上下文中，根据本发明的方法和用途旨在减缓、治愈、改善或控制靶向疾病的发生或进展。

如本文使用的，术语“癌症”包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语“癌症”涵盖原发性和转移性癌症两者。可以使用本发明的组合和方法治疗的癌症的代表性实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病，且更特别是骨癌、胃肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、食管癌、口咽癌、喉癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肺癌、头或颈癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、外阴癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、胶质母细胞瘤和各种类型的中枢神经系统(CNS)等。本发明可特别用于治疗表达PD-L1的癌症(Iwai等人，2005,Int.Immunol.17:133-44)，尤其是转移性癌症和过表达MUC1的癌症(尤其是其低糖基化形式)，例如肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌(例如转移性乳腺癌)、结肠直肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、胃癌、胆管癌、子宫内膜癌、胰腺癌和卵巢癌。优选地，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCL)。

可以使用本发明的组合和方法治疗的传染病的代表性实例包括但不限于：a)病毒性疾病，例如起因于通过下述的感染的那些：疱疹病毒(HSV1，HSV2或VZV)、乳头状瘤病毒(HPV)、引起天花或水痘的痘病毒、肠道病毒、逆转录病毒例如引起AIDS的HIV、巨细胞病毒、黄病毒(例如引起日本脑炎、丙型肝炎、登革热和黄热病)、嗜肝DNA病毒(例如HBV)、正粘病毒(例如例如流感病毒)、副粘病毒(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒(RSV))、冠状病毒(例如SARS)、弹状病毒和轮状病毒；b)起因于通过细菌的感染的疾病，所述细菌例如埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属、气杆菌属(Aerobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、衣原体属(Chlamydia)、支原体属(Mycoplasma)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、奈瑟球菌属(Neisseria)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrio)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登氏菌属(Providencia)、色杆菌属(Chromobacterium)、布鲁杆菌属(Brucella)、耶尔森菌属(Yersinia)、嗜血菌属(Haemophilus)或博德特氏菌属(Bordetella)；和(c)真菌性疾病，包括但不限于假丝酵母病、曲霉病、组织胞浆菌病、隐球菌性脑膜炎；和d)寄生虫病，包括但不限于疟疾、卡氏肺孢子虫肺炎、利什曼病、隐孢子虫病、弓形虫病和锥虫感染。

通常，在根据本文所述的方式施用时，本发明的组合产品对治疗对象提供的治疗益处超过基线状态或超过如果不治疗的预期状态，这可以通过临床状态超过基线状态或超过如果不以如本文所述的组合治疗的预期状态的可观察到的改善得到证明。可以通过通常经由医生或其他熟练的保健人员通常使用的任何相关临床测量容易地评价临床状态的改善。在本发明的上下文中，治疗益处可以是暂时的(在停止施用后一个月或几个月)或持续的(几个月或几年)。因为临床状态的自然过程可能从一个对象到另一个对象相当大地改变，所以不需要在治疗的每个对象中，而是在大量对象中观察到治疗益处(例如两组之间的统计学显著性差异可以通过本领域已知的任何统计检验进行确定，例如Tukey参数检验、Kruskal-Wallis检验、根据Mann和Whitney的U检验、斯氏t检验、Wilcoxon检验等)。

当该方法旨在治疗增殖性疾病，特别是癌症时，治疗益处可以通过例如下述得到证明：肿瘤数目中的减少；肿瘤大小的减少、转移灶的数目或程度中的减少、缓解长度中的增加、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展或严重性的延迟或减慢、延长的存活、对标准治疗的更好应答、生活质量的改善、降低的死亡率等。

当该方法旨在治疗传染病时，治疗益处可以通过例如下述得到证明：在被治疗的对象的血液、血浆或血清中定量的感染性致病生物的量减少，和/或传染病的稳定(不恶化)状态(例如通常与传染病如炎症状态相关的状况的稳定)，和/或特异性血清标记物水平的减少(例如通常在慢性丙型肝炎中观察到的与肝脏不良状况相关的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)的降低)，与传染病的发生相关的任何抗原水平中的降低和/或针对致病生物的抗体水平的出现或修饰，和/或治疗对象对常规疗法(例如抗生素)的改善应答，和/或与如果不接受组合治疗的预期存活相比的存活延长。

适当的测量例如血液测试、生物流体和活组织检查分析以及医学成像技术可以用于评价临床益处。它们可以在施用前(基线)和在治疗期间的各个时间点以及在治疗停止后执行。对于一般指导，这样的测量在医学实验室和医院中定期评估，并且大量试剂盒是商购可得的(例如免疫测定、定量PCR测定)。

优选地，使用或施用本发明的组合产品，用于引发或刺激和/或重指导受治疗的对象中的免疫应答。相应地，本发明还涵盖了用于引发或刺激和/或重定向免疫应答(例如针对肿瘤或受感染细胞)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗疫苗和/或一种或多种免疫检查点调节剂的组合产品或组合物，其量根据本文所述的模式是足够的，以便激活患者的免疫。

在一个特定实施方案中，可以根据本文所述的模式采用本发明的组合产品和方法，以破坏在慢性感染和癌性对象中通常遇到的免疫耐受性。

引发的、刺激的或重定向的免疫应答可以是特异性的(即针对表位/抗原)和/或非特异性的(先天的)、体液的和/或细胞的。在本发明的上下文中，免疫应答优选是针对多肽/表位的T细胞应答CD4+或CD8+介导的或两者，特别是与肿瘤或感染性致病生物相关联。

本文描述的组合产品引发、刺激或重定向免疫应答的能力可以在体外(例如使用从对象收集的生物样品)或体内进行评估，使用本领域标准的各种直接或间接测定。关于可用于评估免疫应答的起始和活化的技术的一般描述，参见例如Coligan等人(1992年和1994年，Current Protocols in Immunology；编辑J Wiley&Sons Inc,National Institute ofHealth或后续版本)。刺激体液应答的能力可以通过抗体结合和/或结合竞争来确定(参见例如Harlow,1989,Antibodies,Cold Spring Harbor Press)。非特异性免疫的评估可以通过例如下述来执行：NK/NKT细胞的测量(例如代表活性和活化水平)，以及IFN相关细胞因子和/或趋化因子生产级联，TLR和先天性免疫的其他标记物的活化(Scott-Algara等人，2010PLOS One 5(1),e8761；Zhou等人，2006,Blood 107,2461-2469；Chan,2008,Eur.J.Immunol.38,2964-2968)。细胞免疫的评估可以例如通过下述来执行：使用常规生物测定定量通过活化T细胞产生的细胞因子，包括衍生自CD4+和CD8+T细胞的细胞因子(例如通过ELISpot表征和/或定量T细胞，通过多参数流式细胞术或ICS，通过使用多路技术或ELISA的细胞因子概况分析)，测定T细胞的增殖能力(例如通过[³H]胸苷掺入测定的T细胞增殖测定)，测定抗原特异性T淋巴细胞在致敏对象中的细胞毒性能力，或免疫接种适当的动物模型。例如，常规用于实验室中的技术(例如流式细胞术、组织学)可以用于执行肿瘤监测。还可以使用各种可用的抗体，以便鉴定涉及治疗对象中存在的抗肿瘤应答的不同免疫细胞群体，例如细胞毒性T细胞、活化的细胞毒性T细胞、天然杀伤细胞和活化的天然杀伤细胞。

如果需要，则本发明的组合产品、组合物或方法可以与一种或多种常规治疗模式结合使用或进行，所述常规治疗模式可用于治疗或预防待治疗或预防的疾病或病理状态(例如化学疗法、放射和/或手术)。这样的常规疗法可以与根据本发明的组合或方法序贯地或伴随地施用于对象。

可以与本发明的组合产品、组合物或方法结合使用的常规治疗药物的代表性实例尤其包括亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂物质、抗病毒药物(例如干扰素α)、单克隆抗体、信号传导抑制剂以及常规用于癌症疗法中的化学治疗药物。可以更具体地列举：

√烷化剂，例如丝裂霉素C、环磷酰胺、白消安、异环磷酰胺、异磷酰胺(isosfamide)、美法仑、六甲基三聚氰胺、噻替派、苯丁酸氮芥或达卡巴嗪；

√抗代谢物，例如吉西他滨、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、2-氟脱氧胞苷、氨甲蝶呤、依达曲沙(idatrexate)、雷替曲塞或三甲曲沙；

√拓扑异构酶II抑制剂，例如多柔比星、表柔比星、依托泊苷、替尼泊苷或米托蒽醌；

√拓扑异构酶I抑制剂，例如伊立替康(CPT-11)、7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)或拓扑替康；

√抗有丝分裂药，例如紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱或长春瑞滨；

√铂衍生物，例如顺铂、奥沙利铂、螺铂或卡铂；

√酪氨酸激酶受体抑制剂，例如舒尼替尼(Pfizer)、索拉非尼(Bayer)、吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼；和

√抗体(特别是抗肿瘤性西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗)或人表皮生长因子受体-2的抑制剂(特别是曲妥珠单抗)；和影响血管生成的试剂，例如血管内皮生长因子抑制剂(特别是贝伐珠单抗或雷珠单抗)；

√常规用于对抗感染性致病生物的抗生素，例如氨基糖苷类、安莎霉素类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类、青霉素类、喹诺酮类(Qionolones)和四环素类及其他。可以特别列举在第一线治疗中目前用于治疗Mtb感染的抗生素，例如异烟肼、利福霉素(例如利福平、利福喷汀和利福布汀)、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺和氟喹诺酮类，以及在“第二线”治疗中在已证实耐药性的Mtb感染对象中使用的那些，例如氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素；

√抗病毒治疗，例如干扰素-α(IFNa和聚乙二醇化衍生物)和核苷/核苷酸类似物(NUC)。例如拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、阿德福韦和替诺福韦目前用于治疗HBV。其他抗病毒剂包括蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如Vertex的VX950)，适合于治疗丙型肝炎的聚合酶抑制剂和解旋酶抑制剂；

√TLR激动剂和N-糖基化抑制剂；

√白细胞介素(例如IL-2、IL-6、IL-15、IL-24等)、干扰素(例如IFNα、IFNβ或IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(例如GM-CSF、C-CSF、M-CSF等)和趋化因子(例如CXCL10、CXCL9、CXCL11等)；

√靶向感染性致病生物的基因或与靶向疾病相关的细胞基因的siRNA和反义寡核苷酸。

根据有利的实施方案，尤其是当治疗疫苗配备有自杀基因时，根据本发明的组合产品或方法可以与相应的前药(参见表1)结合使用。前药根据标准实践(例如口服、全身地等)施用。优选地，前药施用在治疗疫苗施用之后(例如在自杀基因编码治疗疫苗施用后至少3天)发生。经口途径是优选的。能够施用前药的单一剂量或对于一段时间重复的剂量，所述时间足够长以使得毒性代谢产物能够在对象内产生。作为举例说明，50至500mg/kg/天的剂量，有利地，200mg/kg/天的剂量，或优选地100mg/kg/天的剂量是适当的。

本发明的组合产品和方法还可以与一种或多种佐剂或“免疫刺激剂”组合使用，以增强免疫(尤其是T细胞介导的免疫)，例如通过toll样受体(TLR)，例如TLR-7、TLR-8和TLR-9。为了举例说明性目的，这些佐剂包括但不限于明矾、矿物油乳液例如弗氏完全和不完全(IFA)，脂多糖(Ribi等人，1986,Immunology and Immunopharmacology of BacterialEndotoxins,Plenum Publ.Corp.,NY，第407-419页)，皂苷例如ISCOMATRIX、AbISCO、QS21(Sumino等人，1998,J.Virol.72:4931；WO98/56415)，咪唑并喹啉化合物例如咪喹莫特(Suader,2000,J.Am Acad Dermatol.43:S6)，S-27609(Smorlesi,2005,Gene Ther.12:1324)和相关化合物，例如WO2007/147529中所述的化合物；阳离子肽例如IC-31(Kritsch等人，2005,J.Chromatogr Anal.Technol.Biomed.Life Sci.822:263-70)、多糖例如Adjuvax和角鲨烯例如MF59。其他合适的佐剂包括ds RNA如NAB2与Lipofectin(Claudepierre等人，2014,J.Virol 88:5242-55)或3pRNA(Hornung等人，2006,Science 314:994-7)，两者都经由活化细胞质解旋酶MDA-5和RIG-1来刺激IFNα应答。

可替代地或组合地，根据本发明的组合或方法也可以与放射治疗结合使用。本领域技术人员可以容易地制定适当的放射治疗方案和参数(参见例如Perez和Brady，1992,Principles and Practice of Radiation Oncology，第2版JB Lippincott Co；使用适当的适应和修饰，如对本领域技术人员显而易见的)。可以用于癌症治疗的放射类型是本领域众所周知的，并且包括电子束、来自线性加速器或来自放射源的高能光子例如钴或铯、质子和中子。

本发明还提供了以试剂盒形式的包括本发明组合产品的活性实体的试剂盒。试剂盒是包装组合，任选地包括用于任选与其他组分一起使用的说明书。在一个实施方案中，试剂盒包括至少在一个容器中的如本文所讨论的治疗疫苗，以及在另一个容器中的如本文所述的一种或多种免疫检查点调节剂。这种容器优选是无菌玻璃或塑料小瓶。优选的试剂盒包括基于MVA的治疗疫苗(例如表达肿瘤相关的MUC1抗原和人IL-2的MVA病毒)和特异性结合CTLA-4的免疫检查点调节剂(例如抗CTLA-4抗体，例如伊匹单抗)。另一个优选的试剂盒包括基于MVA的治疗疫苗(例如表达肿瘤相关的MUC1抗原和人IL-2的MVA病毒)和特异性结合PD-1的免疫检查点调节剂(例如抗PD-1抗体，例如纳武单抗或lanbrolizumab)。另一个优选的试剂盒包括基于MVA的治疗疫苗(例如表达肿瘤相关的MUC1抗原和人IL-2的MVA病毒)和特异性结合PD-L1的免疫检查点调节剂(例如抗PD-L1抗体，例如MPDL3280A或BMS936559)。任选地，试剂盒可以包括用于执行活性剂的施用的合适装置。试剂盒还可以包括包装说明书，其包括关于试剂盒中的组合物或各个组分和剂型的信息。

所有上文引用的专利、出版物和数据库条目的公开内容特别整体引入本文作为参考，其程度与每个这样的个人专利、出版物或条目被具体地和个别地指示引入作为参考一样。

附图说明

图1示出了在皮下CT26-CL25肿瘤模型中，制剂缓冲液(媒介物)、单独的MVATG18124、单独的抗PD-1克隆RMP1.14、MVATG18124和抗PD-1克隆RMP1.14两者的组合、以及MVATG18124和大鼠IgG2a同种型对照两者的组合的施用对肿瘤体积(图1A)和小鼠存活(图1B)的作用。

图2示出了在转移性CT26-CL25肿瘤模型中，空MVA(MVATGN33.1)、单独的MVATG18124、单独的抗CTLA-4抗体、其IgG2b同种型对照、MVATG18124和抗CTLA-4两者的组合、以及MVATG18124和IgG2b同种型对照两者的组合的施用对小鼠存活的作用。

图3A示出了从未处理的(即首次用于实验的)小鼠，或用MVATG18124、抗CTLA-4以及MVATG18124和抗CTLA-4两者处理的小鼠获得的解离肺中的门控的CD8⁺CD3^dim细胞(本文下文称为CD8^dimCD3^dim)的百分比。图3B示出了在来自用抗CTLA-4和MVATG18124处理的小鼠的CD3/CD8斑点印迹肺细胞中的CD8^dimCD3^dim(在图中称为CD8⁺CD3^dim)群体的实例。

图4表示从未处理的(即首次用于实验的)小鼠，或用MVATG18124、抗CTLA-4和两者处理的小鼠获得的肺样品中，在ConA诱导后获得的IFN-γ阳性CD8^dimCD3^dim细胞群体。图4A：在肺细胞与bmDC一起温育以促进活化后，ConA诱导的IFNγ⁺CD8^dimCD3^dim细胞百分比的倍数诱导。图4B：在肺细胞与抗CD28一起温育以促进活化后，ConA诱导的IFNγ⁺CD8^dimCD3^dim细胞百分比的倍数诱导。

图5示出了用β-gal特异性肽T9L3刺激的脾淋巴细胞的ELIspot分析，显示了在用MVATG18124处理的脾淋巴细胞中的β-gal特异性应答。原始数据被转化成直方图。结果表示为对于每个一式三份或一式四份的斑点形成单位(sfu)数目/1x 10⁶脾细胞(平均值)。

图6表示了在用单独的或与抗CTLA组合的空载体VATGN33.1、单独的或与抗CTLA-4组合的MVATG18124、或单独的抗CTLA-4处理后，在用T9L-3肽(阴影的)或无关的T8G肽(虚线的)刺激的肺样品中获得的CD8^dimCD3^dim细胞群体中的IFN-γ、CD107a和KLRG1阳性细胞的诱导。

图7示出了通过TG4010治疗对CT26-MUC1肿瘤模型中的小鼠存活和肿瘤体积提供的作用。图7A：CT26-MUC1肺肿瘤模型。CT26-MUC1细胞进行iv注射。第2天和第9天，静脉内注射5.10⁷pfu TG4010、空MVA载体(MVATGN33.1)或缓冲液(SO8)。小鼠每周称重两次，并且当重量减少10％时处死。监测存活百分比。图7B：CT26-MUC1s.c.肿瘤模型。CT26-MUC1细胞进行s.c.注射。第2天和第9天，1.10⁷pfu TG4010、空MVA载体(MVATGN33.1)或缓冲液(SO8)在同一侧腹中进行s.c.注射。当肿瘤达到2000mm³的大小时，处死小鼠。显示了平均肿瘤体积与SEM。

图8示出了在CT26-MUC1s.c.肿瘤模型中，通过与抗PD-1抗体组合的TG4010治疗提供的对小鼠存活(图8A)和肿瘤体积(图8B)的作用。BALB/c小鼠用2.10⁵CT26-MUC1细胞进行s.c.注射。在肿瘤植入后第2天和第9天时，小鼠用TG4010(也称为MVATG9931)或空对照载体以1.10⁶pfu的亚最佳剂量进行sc处理，随后为在第10、13、15和17天时250μg抗PD-1(RMP1.14,IgG2a,BioXCell)的i.p.施用。当肿瘤达到2000mm³的大小时，处死小鼠。在一段时间内监测存活百分比和平均肿瘤体积。

图9示出了BALB/C小鼠的存活，所述BALB/C小鼠用CT26-MUC1肿瘤细胞进行s.c.注射，并且用在D2和D9天时1x 10⁷PFU MVATGN33.1或MVATG9931的两次注射进行免疫，随后为在D10、D13、D15和D17天时250μg抗PD-1Ab的i.p.施用。(*:p<0.05；**::p<0.01；***:p<0.001)

实施例

我们着手将免疫检查点阻断方法与治疗性MVA载体组合，目的是用MVA诱导抗原特异性T细胞免疫应答，并且用免疫检查点抗体松开来自T细胞生成的刹车。与病毒载体组合的免疫检查点阻断剂的协同效应的临床前证据在小鼠肿瘤模型中得到证实。这暗示i)鼠特异性抗免疫检查点抗体和ii)表达抗原的MVA载体的使用。

选择用于这些研究的MVA载体(MVATG18124)含有在痘病毒启动子pH5R(SEQ IDNO:4)的控制下，编码β-半乳糖苷酶Ag模型(SEQ ID NO:3)的细菌LacZ基因。使用适当的引物，通过PCR扩增从牛痘病毒Copenhagen毒株中分离pH5R启动子。使用引物otg19678(SEQID NO:5)和otg19679(SEQ ID NO:6)，伴随pCMVBeta(Clontech)作为DNA模板，通过PCR扩增获得大肠杆菌LacZ基因。根据GenBank序列EF675191.1，将pH5R和LacZ基因克隆到从位置142006延伸到142987和位置142992至143992的MVA序列之间的穿梭质粒内。通过将穿梭质粒转染到先前MVA感染的CEF内，将MVATG18124生成到鸡胚成纤维细胞(CEF)内，导致穿梭质粒DNA和MVA基因组之间的同源重组，以及pH5R-LacZ盒插入缺失III内。使用常规技术(Lullo等人，2010,J Virol Methods 163:195-204)分离重组MVA克隆，并且通过PCR控制所选择的克隆，然后在CEF细胞中扩增。通过斑块测定在DF1细胞上滴定病毒原种。通过DNA测序检查所插入DNA和周围区域内的突变的不存在。

首先选择用适当的抗体靶向免疫检查点阻断剂鼠PD-1(mPD-1)。选择大鼠抗mPD-1抗体RMP1-14(BioXcell)。该抗体显示阻断mPD1与其配体的相互作用(Yamazaki等人，2005,J.Immunol.175(3):1586-92)。

在两个小鼠模型，分别为转移性和皮下肿瘤模型中，在体内测试mPD-1抑制剂与表达抗原的MVATG18124的组合。用LacZ基因转导并且因此稳定表达β-半乳糖苷酶的结肠癌细胞系CT26.CL25(ATCC CRL-2639)进行皮下注射，以生成可触及的肿瘤(皮下模型)，或进行静脉内注射，以生成肺转移。然后用表达β-半乳糖苷酶的MVATG18124和鼠特异性免疫检查点阻断剂如抗PD-1或抗CTLA-4抗体处理小鼠。

实施例1：MVATG18124与抗PD-1Mab的组合

在皮下肿瘤模型中体内测试了mPD-1抑制剂(商业克隆RMP1-14；BioXCell)与表达β-gal的MVATG18124的组合。Balb/c小鼠用2x10⁵CT26.CL25细胞进行皮下注射。在细胞植入后第2天和第9天，小鼠然后用1x10⁴pfu MVATG18124或作为阴性对照的制剂媒介物进行静脉内免疫，与在第10、13、15和17天时250μg鼠抗PD 1抗体RMP1.14(BioXcell)或其同种型对照IgG2a(克隆2A3)的4次腹膜内(ip)施用组合。换言之，测试了5组10只小鼠；第一组用MVATG18124进行处理，接受2次iv注射(组1)；第二组用抗PD-1抗体的4次ip注射进行处理(组2)；第三组用MVATG18124和抗PD-1抗体两者进行处理，接受治疗性MVA的2次iv注射和抗PD-1抗体的4次ip注射(组3)；第四组接受治疗性MVATG18124的2次iv注射和同种型抗体的4次ip注射(组4)，并且对照组接受制剂缓冲液(组5)。如图1所示，在一段时间内测量肿瘤生长和存活。

如预期的，肿瘤体积在接受制剂缓冲液的对照组中非常快速地增加。在接受mPD-1抗体的组中也观察到快速的肿瘤生长。在接受单独的或与同种型对照组合的MVATG18124的组中观察到肿瘤体积中的轻微延迟。在用MVATG18124和mPD-1抗体两者注射的“组合”组中，肿瘤生长极大降低(图1A)。对小鼠存活的作用更明显，因为用MVATG18124和mPD-1抗体两者处理的小鼠中约70％在肿瘤植入后仍然存活超过100天，相对于MVATG18124处理的动物组中的10％(显著性差异)。相比之下，对照、抗体处理和同种型处理的动物在小于50天内死亡(图1B)。

实施例2：MVATG18124与抗CTLA-4Mab的组合

在转移性CT26-CL25模型中体内检测CTLA-4抑制剂(商业克隆9D9；BioXCell)与抗原表达MVATG18124的组合。2x10⁵CT26.CL25细胞在Balb/c小鼠中进行静脉内(iv)注射。第2天和第9天，编码β-半乳糖苷酶的MVATG18124或其空载体对照MVAN33.1以1.10⁴pfu的剂量进行iv施用。在第3天和第10天时，腹膜内(ip)注射250μg鼠抗CTLA4抗体9D9(BioXCell)或其IgG2b同种型对照(克隆MPC-11BioXCell)。跟踪小鼠的存活超过60天。将1.10⁴pfu的病毒剂量鉴定为在该肿瘤模型中改善存活率的最佳剂量(数据未显示)。

如图2所示，使用单独的抗CTLA4抗体或其同种型对照的处理显示与用空MVA载体MVATGN33.1观察到的那些可比较的弱效应(对于所有三个组，在第20天时35％的存活)。相比之下，使用单独的或与同种型对照组合的MVATG18124处理增加小鼠存活(对于两个组，在第35天时35％的存活)。用MVATG18124和抗CTLA4抗体的组合处理的小鼠组将35％的存活百分比极大增加到超过60天。

因此，我们已清楚地证实了基于MVA的免疫治疗疫苗和免疫检查点阻断剂抗CTLA4治疗的明确抗肿瘤效应。

实施例3：在处理小鼠的解离肺中的淋巴样细胞群体研究

IFNγ阳性CD8dim CD3dim细胞的测定

在用抗CTLA-4抗体、抗原表达MVA或两者处理的小鼠中，以及在未处理的(即首次用于实验的)小鼠中，检查细胞应答。5只BALB/c小鼠/组第1天和第8天用MVATG18124(1.10⁴pfu)进行iv注射，或第2天和第9天用250μg抗CTLA-4(克隆9D9，BioXCell)进行ip注射，或两者。第15天处死小鼠，并且分离肺。合并来自所有5只小鼠/组的肺，在C-tubes(Miltenyi)中切成小片，并且根据制造商的建议，使用Gentle OctoMACS(Miltenyi)，使用组织解离试剂盒(Miltenyi,130-096-730)进行酶促解离。

将肺衍生的细胞在T细胞特异性培养基(TexMACS,Miltenyi)中以2.10⁶细胞/孔(96孔板)进行铺平板。通过与加载肽的骨髓衍生的鼠树突状细胞(bmDCs)共培养来激活细胞：来自BALB/c小鼠的bmDC由在鼠GM-CSF(Peprotech,100μg/ml)的存在下成熟10天的骨髓细胞生成。可替代地，通过与1μg抗CD28(克隆PV-1)温育来促进活化。伴刀豆球蛋白A(ConA,5μg/ml)充当非特异性活化物。加入抗CD107a抗体(克隆eBio1D4B)以标记脱颗粒细胞。通过添加GolgiPlug/Brefeldin(1:1000,BD Biosciences)，在温育1小时后阻断细胞因子的分泌。在5小时总温育时间后，细胞进行洗涤，并且就活力(LiveDead，可固定的紫色死细胞染色试剂盒)以及表面标记物CD8a(克隆53-6.7)和CD3ε(克隆145-2C11)进行染色。使用BDCytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)，细胞就IFN-γ(克隆XMG1.2)进行细胞内染色。细胞进行固定并且通过流式细胞术(Navios,Beckman Coulter)进行分析。

在首次用于实验的BALB/c小鼠中MVATG18124和抗CTLA-4的组合治疗导致在肺中命名为CD8^dimCD3^dim的淋巴细胞细胞亚群的出现。图3B表示来自用抗CTLA-4和MVATG18124处理的小鼠的CD3/CD8斑点印迹肺细胞中的CD8^dimCD3^dim群体的实例。门控活淋巴细胞，两个独立实验中门控的CD8^dimCD3^dim细胞百分比在图3A示出。更具体而言，CD8^dimCD3^dim的群体在用MVATG18124处理后明确增加，并且在用MVATG18124+抗CTLA-4组合处理后甚至更明确增加。

接下来，在CD8^dimCD3^dim群体中评价细胞内IFNγ+细胞的百分比。在该CD8^dimCD3^dim群体中，在用MVATG18124+抗CTLA-4处理的小鼠中观察到IFN-γ+细胞的最高诱导(图4A和4B)。

总之，在首次用于实验的BALB/c小鼠中MVATG18124和抗CTLA-4的组合处理导致肺中CD8^dimCD3^dim淋巴细胞群体的出现。在用ConA刺激后，可以诱导来自用MVATG18124+抗CTLA-4处理的小鼠的高百分比的CD8^dimCD3^dim分泌IFN-γ。

更详细地分析CD3^dimCD8^dim细胞群体。

●在我们的分析过程中，我们观察到CD3^dimCD8^dim群体对于杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1⁺)呈阳性，并且对于CD127(IL-7Rα)(CD127^-/low)呈阴性或更低。这种表型与抗原经历的短寿命效应细胞(SLEC)相关(Obar等人，2011,J Immunol.,doi:10.4049/jimmunol.1102335；Sarkar等人，2008,J Exp Med 205(3):625-40)。

●用MVATG18124和抗CTLA-4处理的小鼠肺中浸润/存在的CD3^dimCD8^dim KLRG1⁺群体响应抗原特异性刺激，具有IFN-γ分泌和脱颗粒(CD107a)。

CD8^dimCD3^dim细胞群体中的IFN-γ、CD107a和KLRG1阳性细胞的测定

如上所述，BALB/c小鼠用MVA-β-gal或空载体MVATGN33.1以1.10⁴pfu进行i.v.注射。在第3天和第10天时，小鼠i.p接受250μg抗CTLA-4。第14天获取肺并且进行酶促解离。将肺衍生的细胞在T细胞特异性培养基(TexMACS,Miltenyi)中以2.10⁶细胞/孔(96孔板)进行铺平板，通过与1μg抗CD28(克隆PV-1)温育进行激活，并且在抗CD107a抗体(克隆eBio1D4B)的存在下，用β-gal特异性肽(T9L-3)或对照肽(T8G)进行刺激，以标记脱颗粒细胞。通过添加GolgiPlug/Brefeldin(1:1000,BD Biosciences)，在温育1小时后阻断细胞因子的分泌。在5小时总温育时间后，细胞进行洗涤，并且就活力(LiveDead，可固定的紫色死细胞染色试剂盒)以及表面标记物CD8a(克隆53-6.7)、CD3ε(克隆145-2C11)和KLRG1(克隆2F1/KLRG1)进行染色。使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)，细胞就IFN-γ(克隆XMG1.2)进行细胞内染色。细胞进行固定并且通过流式细胞术(Navios,Beckman Coulter)进行分析。在5小时后，细胞就CD8a进行染色。

在首次用于实验的BALB/c小鼠中用MVATG18124或空对照载体、以及甚至MVATG18124和抗CTLA-4的组合的处理导致肺中CD8^dimCD3^dimKLRG1⁺淋巴细胞细胞群体的出现。在用β-gal肽T9L-3的离体刺激后，该群体分泌IFNγ并且脱颗粒(CD107a)，并且如图6所示，该百分率在用MVATG18124和抗CTLA-4处理后高于其他组中，所述其他组用对照载体(单独的或与抗CTLA-4一起的MVATGN33.1)、单独的MVATG18124或单独的抗CTLA-4进行处理。如预期的，用无关肽(T8G肽)的刺激不产生这种诱导。

总之，使用MVATG18124和抗CTLA-4的处理增加了肺中的CD3^dimCD8^dimKLRG1⁺细胞群体中的b-gal特异性应答。

实施例4：IFN-γ的分泌

此外，跟踪用MVATG18124或MVAN33.1以1.10⁴pfu(D1和8)和抗CTLA-4或其同种型对照(D2和D9，250μg ip)处理的BALB/c小鼠，研究IFNγ分泌脾淋巴细胞的数目。测量在第14天时通过ELISpot(酶联免疫斑点)测定执行。

板制备

在实验前一天，将膜ELISpot板(Millipore，参考MSIPS4W10)用15μL的35％乙醇/孔进行预润湿，具有2分钟的最大温育时间。将板用200μL/孔的无菌水洗涤5次。

用在无菌DPBS(Sigma，参考D8357)中以15μg/mL稀释的大鼠抗小鼠IFN-γ单克隆抗体(AN18Mabtech，参考3321-3-1000)包被ELISpot平板(100μL/孔)。将板覆盖并且在4℃下温育过夜。第二天，将板用无菌PBS(200μL/孔)洗涤3次，并且在37℃下用200μL/孔的完全RPMI 1640培养基(RPMI1640培养基，(Sigma R0883)；L-谷氨酰胺2mM，(Sigma G6392)；庆大霉素0.01g/L(Schering Plough U570036)；胎牛血清10％(JRH12003-1000M)550μl的5x10-²M b-巯基乙醇溶液)饱和1小时。

样品制备

对于通过免疫诱导的特异性CD8+T细胞频率的离体评估，将实施安乐死的动物在最后一次免疫后7天进行脾切除。将来自相同组的脾在含有5mL完全培养基的6孔培养板的孔中的细胞滤网中合并。脾用注射器活塞粉碎，并且弃去细胞滤网。用8mL完全培养基收集脾细胞，并且转移到15mL falcon管中。将脾细胞悬浮液铺在4mL的-M分离细胞培养基(Cedarlane，参考CL5035)上且离心(20分钟，1500xg，室温)。收集含相间淋巴细胞，并且用10mL PBS冲洗3次。在每个冲洗步骤之间，将细胞离心(以400xg 4分钟)，并且弃去上清液。剩余的红血细胞通过在淋巴细胞团块上添加在无菌水中稀释的2mL RBC裂解缓冲液1x(10x溶液：BD Pharm LyseTM裂解溶液，参考555899)进行裂解。在加入裂解溶液后立即使每个管轻轻涡旋，并且在室温下温育15分钟。通过加入10mLDPBS将裂解封顶，随后以400xg离心4分钟，将细胞重悬浮于10mL完全RPMI 1640培养基中。用Z2细胞计数器(BeckmanCoulter)计数细胞，并且将细胞浓度在完全RPMI 1640培养基中调整至1x 10⁷细胞/mL。

测定

为了执行ELISpot测定，将100μL来自每组的淋巴细胞悬浮液(1x 10⁶细胞)加入包被的96孔板的每个孔中。一个给定的条件一式三份或一式四次进行测试。将100微升不同的指示肽(在完全RPMI 1640培养基中的2μg/mL)加入细胞悬浮液中。ConA(Sigma，参考C5275)用作阳性对照(5μg/mL最终浓度)，MVA特异性肽(S9L-8)用于免疫对照。然后将板在37℃下在5％CO₂中温育16至20小时。然后，将板用DPBS(200μL)洗涤三次。将生物素化的大鼠抗小鼠IFN-γ单克隆抗体(Mabtech，参考3321-6-1000)在抗体混合缓冲液(PBS,0.5％SVF)中以1μg/mL稀释，并且以100μL/孔分配。使板在室温下在黑暗中温育2小时，然后在DPBS(200μL)中洗涤三次。向每孔加入100微升的Extravidin-碱性磷酸酶(SIGMA，参考E2636)(在抗体混合缓冲液中1/5000稀释)，使板在室温下在黑暗中温育1小时。板最后在DPBS(200μL)中洗涤三次。向每个孔中加入100微升的BCIP/NBT(Sigma，参考B5655，在10mL MilliQ水中的一个瓶盖(one caps))，直至产生蓝斑，然后将板在自来水中充分洗涤并干燥。

数据采集

用ELISpot读数器(CTL Immunospot读数器，S5UV)计数斑点。对每个孔执行视觉质量控制(比较机器扫描和板)，以确保由ELISpot读数器提供的计数符合图像的实际。结果表示为对于每个一式三份或一式四份的斑点形成单位(sfu)数目/1x 10⁶脾淋巴细胞(平均值)。使用DFR(eq)方法(Moodie等人，Cancer Immunol Immunother.2010Oct；59(10):1489-501)测定特异性ELISpot应答，或以经验截止值计算为来自空白孔的平均斑点数目加上该平均斑点数目的标准差的两倍。

如图5所示，用β-gal特异性肽T9L3刺激的脾淋巴细胞的ELIspot分析显示在用MVATG18124处理的脾淋巴细胞中的β-gal特异性应答。特异性应答在用抗CTLA-4的组合治疗后进一步增加，但用其同种型对照则没有进一步增加。用非特异性肽T8G的刺激显示IFN-β分泌细胞无增加。

实施例5：在MU1阳性的基于CT26的肿瘤模型中TG4010(MVA-MUC1-IL-2)和抗PD-1 (RMP1.14)的组合效应

TG4010是编码人MUC1和人IL-2的完整cDNA序列的MVA载体。在基于CT26的MUC1阳性细胞系中测试由该载体提供的抗肿瘤功效，所述细胞系在s.c.注射后产生MUC1阳性肿瘤，并且在i.v.注射后产生肺肿瘤。

CT26-MUC1细胞系的生成

用质粒pTG5077稳定转染鼠结肠癌细胞系CT26WT(ATCC CRL-2638)，所述质粒pTG5077编码在CMV启动子的控制下的人MUC1的完整cDNA序列以及在SV40启动子的控制下的G418抗性基因。CT26细胞借助于Lipofectamine LTX与pTG5077进行转染，并且在0.4mg/mlG418的存在下培养，以选择稳定转染子。在14天后，用针对MUC1的单克隆抗体(H23+第二抗体山羊抗鼠-FITC)标记活细胞。将阳性细胞分选(FACS ARIA)，以1个细胞/孔转移到96孔板中。长出的克隆通过流式细胞仪分析稳定的MUC1表达，直到转染后第60天。然后测试四个稳定的MUC1表达克隆在sc注射和iv注射后，在BALB/c小鼠中诱导肿瘤生长的能力。在验证s.c.植入的肿瘤后保留一个克隆，并且在iv注射后获得的肺肿瘤是MUC1阳性的。

TG4010在CT26-MUC1肿瘤模型中的疗效

2.10⁵CT26-MUC1细胞s.c.或i.v.注射到BALB/c小鼠中，以分别生成sc肿瘤或肺肿瘤。在肿瘤攻击后的第2天和第9天时，小鼠分别用1.10⁷TG4010或空对照载体MVATGN33.1进行s.c.或i.v.处理。在一段时间内监测平均肿瘤体积或存活百分比。TG4010显示在iv/iv肺肿瘤模型中存活的显著改善(p＝0,00642)，以及在sc/sc肿瘤模型中肿瘤生长的显著降低(分别参见图7A和7B)。

在CT26-MUC1肿瘤模型中与抗PD1组合的TG4010的疗效

BALB/c小鼠用2.10⁵CT26.MUC1细胞进行s.c.注射。在肿瘤植入后第2天和第9天时，小鼠用TG4010(也称为MVATG9931)或空对照载体(MVATGN33.1)以1.10⁶pfu的亚最佳剂量进行sc处理。在第10、13、15和17天时，小鼠接受250μg抗PD-1(RMP1.14,IgG2a,BioXCell)。当肿瘤达到2,000mm³的大小时，处死小鼠。在一段时间内跟踪肿瘤体积和动物存活。

如图8B所示，肿瘤在第16天时开始生长，并且如预期的，肿瘤体积在接受制剂缓冲液的对照组中在一段时间内快速且有规律地增加。在接受mPD-1抗体、单独的TG4010和单独的或与抗PD-1的空载体MVATGN33.1的组中观察到肿瘤生长中的延迟。相比之下，肿瘤生长在用TG4010和mPD-1抗体两者注射的“组合”组中极大降低。如图8A所示，还观察到对小鼠存活的作用。实际上，用TG4010和mPD-1抗体两者处理的大鼠中约70％在肿瘤移植后仍然存活超过60天，而用空对照(不连同或连同抗PD-1抗体)处理的动物中大约10％和20％仍然存活。分别用单独的或连同抗PD-1抗体的TG4010处理的动物中仅30％和40％在肿瘤植入后存活2个月。相比之下，用制剂缓冲液处理的对照组在小于45天内死亡。通过组合处理提供的增加的存活在一段时间内得到维持(在肿瘤植入后120天)(数据未显示)。

还进行如上文相同的实验，除了小鼠用1.10⁷pfu MVATG9931(即TG4010)或阴性MVATGN33.1对照载体的2次注射进行处理，任选随后为250μg抗PD1的4次i.p.施用之外。如图9所示，然而，与分别用MVATG9931和抗PD-1处理的小鼠的46和49.5天相比，对于组合治疗在70天的中值存活中的显著增加是引人注目的。还注意到，当MVATG9931和抗PD-1处理的组合与对照空病毒MVATGN33.1和抗PD-1模式进行比较时，存活增加是显著的(p＝0.008)，提示在这个病毒剂量下的MUC-1特异性相互作用。对于MVATG9931，在1x 10⁷PFU的最高剂量下，对于组合获得在所有测试条件中的最佳治疗活性，其中针对单独的每种处理模式达到显著性(针对MVATG9931为p＝0.014，并且针对抗PD-1为p<0.001；图9)。总之，与单独的每种处理相比，MVATG9931与抗PD-1抗体的组合允许在异位CT26-MUC1模型中获得最佳治疗指数，其为这种组合治疗方法的临床评估铺平了道路。

本领域技术人员将认识到或能够使用不超过例行实验来确定本文所述的具体方法和试剂的众多等价物，包括替代物、变体、添加、缺失、修饰和取代。这种等价物视为在本发明的范围内，并且由所附权利要求书涵盖。

Claims

1.一种组合产品，包含至少(i)治疗疫苗和(ii)一种或多种免疫检查点调节剂。

2.权利要求1的组合产品，其中所述治疗疫苗包含重组质粒或病毒载体。

3.权利要求2的组合产品，其中所述治疗疫苗包含痘病毒，优选牛痘病毒，且更优选MVA。

4.权利要求2的组合产品，其中所述治疗疫苗包含人或动物腺病毒，优选选自以下组中：Ad2、Ad3、Ad5、Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50以及黑猩猩Ad3和Ad63腺病毒。

5.权利要求4的组合产品，其中所述腺病毒是复制缺陷型的。

6.权利要求1至5中任一项的组合产品，其中所述治疗疫苗包含或编码选自下述的一种或多种多肽：自杀基因产物，免疫刺激多肽例如白细胞介素或集落刺激因子和抗原多肽，特别是肿瘤相关抗原或致病生物例如病毒、细菌、寄生虫的抗原和变应原。

7.权利要求6的组合产品，其中所述治疗疫苗包含或编码选自下述的一种或多种多肽：MUC1抗原，HPV E6和E7抗原，特别是其非致癌变体；人IL-2；人GM-CSF；FCU1自杀基因；HBV抗原，特别是HBV pol、HBsAg和/或核心抗原；分枝杆菌抗原和HCV非结构抗原。

8.权利要求7的组合产品，其中所述治疗疫苗包含编码MUC-1抗原和IL-2的MVA病毒；编码NS3和NS4HCV抗原和NS5b抗原融合物的MVA病毒；编码膜锚定的HPV-16非致癌E6和E7抗原和IL-2的MVA病毒；编码FCU1自杀基因的MVA病毒；编码TB抗原的组合的MVA病毒或编码HBV抗原的组合的Ad载体。

9.权利要求1至8中任一项的组合产品，其中所述一种或多种免疫检查点调节剂选自肽配体、天然受体的可溶性结构域、RNAi、反义分子、抗体和蛋白质支架。

10.权利要求9的组合产品，其中所述一种或多种免疫检查点调节剂是特异性结合PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA、SLAM、2B4、CD160、KLRG-1和CTLA4中的任一种的人或人源化单克隆抗体。

11.权利要求10的组合产品，其中所述一种或多种免疫检查点调节剂中的至少一种选自(a)特异性结合人PD-1的抗体，且特别是选自纳武单抗、Lanbrolizumab和pidilizumab的抗PD-1抗体；(b)特异性结合人PD-L1的抗体，以及(c)特异性结合人CTLA-4的抗体，且特别是选自伊匹单抗、曲美木单抗和单链抗CTLA4抗体的抗CTLA4抗体。

12.权利要求9至11中任一项的组合产品，其中所述一种或多种免疫检查点调节剂由所述治疗疫苗表达。

13.权利要求1至12中任一项的组合产品，其中所述组合产品是包含治疗有效量的至少所述治疗疫苗和所述一种或多种免疫检查点调节剂和药学可接受的载体的组合物。

14.权利要求1至13中任一项的组合产品，其包含约0.5mg/kg至约25mg/kg的免疫检查点调节剂，优选约1mg/kg至约20mg/kg，更优选约2mg/kg至约15mg/kg，其中特别优选约3mg/kg至约10mg/kg的剂量。

15.权利要求1至14中任一项的组合产品，其中所述组合包含大约10⁸vp至大约5x10¹¹vp；且优选大约5x10⁸vp至大约10¹¹vp的腺病毒载体或大约10⁶pfu至大约10¹⁰pfu；且优选大约10⁷pfu至大约10⁹pfu的MVA载体。

16.权利要求15的组合产品，其中在所述组合中包含的免疫检查点调节剂被配制用于静脉内或瘤内施用，并且其中在所述组合中包含的治疗疫苗被配制用于静脉内、肌内、皮下或瘤内施用。

17.权利要求1至16中任一项的组合产品，其中所述治疗疫苗和所述一种或多种免疫检查点抑制剂的施用是伴随的、序贯的或间隔的。

18.权利要求17的组合产品，其中所述治疗疫苗的施用在所述免疫检查点调节剂的施用之前开始。

19.根据权利要求1至18中任一项的组合产品，其包含以大约1至3周间隔的4至15次10⁷或10⁹pfu基于MVA的治疗疫苗的施用，间隔有每2或3周的2至6次3至10mg/kg抗免疫检查点抗体的施用。

20.一种组合物，其包含有效量的如权利要求2至8和15中任一项限定的所述治疗疫苗和如权利要求9至12和14中任一项限定的所述一种或多种免疫检查点调节剂。

21.权利要求1至19中任一项的组合产品或根据权利要求20的组合物，用于治疗增殖性疾病或传染病。

22.用于根据权利要求21使用的组合产品或组合物，其中所述增殖性疾病是癌症，且尤其是肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、胆管癌、子宫内膜癌、胰腺癌和卵巢癌，尤其是非小细胞肺癌(NSCL)，并且其中所述传染病起因于由选自下述病毒的感染：疱疹病毒、乳头状瘤病毒、痘病毒、逆转录病毒、HCV、HBV和流感病毒。

23.一种用于引发或刺激和/或重定向免疫应答的方法，其包括在有此需要的对象中施用权利要求1至19任一项的组合产品或根据权利要求20的组合物，以激活患者的免疫力。

24.用于根据权利要求21或22使用的组合产品或组合物或者根据权利要求23的方法，其与一种或多种常规治疗模式结合使用或进行。

25.一种试剂盒，包含至少(i)在容器中的如权利要求2至8和15中任一项限定的治疗疫苗，以及在另一容器中的如权利要求9至12和14中任一项限定的一种或多种免疫检查点调节剂。