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ES2677007T3 - Procedimientos para tratar enfermedades resistentes usando macrólidos que contienen triazol - Google Patents

Procedimientos para tratar enfermedades resistentes usando macrólidos que contienen triazol Download PDF

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ES2677007T3
ES2677007T3 ES09822827.3T ES09822827T ES2677007T3 ES 2677007 T3 ES2677007 T3 ES 2677007T3 ES 09822827 T ES09822827 T ES 09822827T ES 2677007 T3 ES2677007 T3 ES 2677007T3
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cem
tel
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compound
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ES09822827.3T
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English (en)
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David E. Pereira
Prabhavathi B. Fernandes
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Cempra Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Cempra Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula **Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que: R10 es hidrógeno o acilo; X e Y se toman junto con el carbono al que están unidos para formar carbonilo; V es C(O); W es H, F, Cl, Br, I u OH; A es CH2, C(O), C(O)O, C(O)NH, S(O)2, S(O)2NH, C(O)NHS(O)2; B es (CH2)n en el que n es un número entero que varía de 0-10, o B es una cadena carbonada insaturada de 2-10 carbonos; y C es hidrógeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, aminoarilo, alquilaminoarilo, acilo, aciloxi, sulfonilo, ureido o carbamoilo; para uso en el tratamiento de una enfermedad provocada, al menos en parte, por un organismo que es resistente a una o más penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, azitromicina, claritromicina o una combinación de las mismas.

Description

DESCRIPCION
Procedimientos para tratar enfermedades resistentes usando macrolidos que contienen triazol 5 CAMPO TECNICO
La invencion descrita en el presente documento se refiere al tratamiento de enfermedades resistentes o, mas particularmente, enfermedades provocadas, al menos en parte, por uno o mas organismos resistentes. En particular, la invencion descrita en el presente documento se refiere al tratamiento de enfermedades resistentes o, mas 10 particularmente, enfermedades provocadas, al menos en parte, por uno o mas organismos resistentes con antibioticos macrolidos y cetolidos que contienen triazol.
ANTECEDENTES Y RESUMEN DE LA INVENCION
15 Desde el descubrimiento de la eritromicina A (ERI), los antibioticos macrolidos (macrolidos) han sido una clase de moleculas importante para tratar una amplia variedad de infecciones bacterianas. Ademas, la investigacion sobre macrolidos ha proporcionado el descubrimiento de varias generaciones nuevas de antibioticos macrolidos. Un grupo es la clase de compuestos claritromicina (CLR), en la que la estructura de anillo fue estabilizada mediante la metilacion del hidroxilo del C-6. Otro grupo son los analogos aza con anillo de 15 miembros, de los que la 20 azitromicina (AZI) es un miembro destacado. Otro grupo son los analogos 3-desglicosil-3-oxo, tambien conocidos como cetolidos, de los que la telitromicina (TEL) y la cetromicina (CET) son miembros destacados. Sin embargo, al igual que ha ocurrido para otras clases de moleculas antibioticas, tales como las penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, la vancomicina y otras, han surgido organismos resistentes por todo el mundo. La resistencia a macrolidos, que actualmente es predominante en algunos pafses tales como Japon y Corea, se ha achacado al uso 25 excesivo de AZI y CLR durante los ultimos 15 anos. Tambien se ha observado que la resistencia a macrolidos generalmente tambien se produce acompanada de resistencia a la penicilina G (aunque no esta vinculada geneticamente). Por ejemplo, aunque todas las cepas de estreptococos del grupo A siguen siendo susceptibles a los betalactamicos, se ha producido resistencia a macrolidos, especialmente en Asia y en el sur, centro y este de Europa. Las infecciones provocadas por estreptococos del grupo A resistentes a farmacos se encuentran a escala 30 mundial y, algunas veces, se encuentran infecciones provocadas por estos organismos que suponen un peligro para la vida. Ademas, las cepas de Streptococcus pyogenes, aunque retienen su susceptibilidad a los betalactamicos, se estan volviendo mas resistentes a macrolidos. Se estima que, en los Estados Unidos, cerca del 40 % de cepas de estreptococos son resistentes tanto a penicilina como a antibioticos macrolidos.
35 De hecho, se ha sugerido que la introduccion de la TEL en el arsenal terapeutico estaba destinada a resolver el problema de la resistencia a macrolidos en los estreptococos. La TEL es efectiva contra S. pneumoniae resistente a penicilina y eritromicina y es un no inductor de resistencia a macrolidos-lincosamidas-estreptograminas B (MLEb). Sin embargo, incluso con TEL, que es activa contra muchos genotipos de S. pyogenes resistentes a macrolidos, han surgido y continuan haciendolo especies resistentes. En particular, se ha informado de especies resistentes a 40 cetolidos, es decir, a TEL, pero tambien posiblemente con resistencia cruzada con la CET, a escala mundial y, mas recientemente, en S. pyogenes de Europa. Ademas, la TEL no es activa contra los estreptococos del grupo A erm(B) (que son naturalmente resistentes a TEL). Asimismo, las toxicidades de la TEL observadas han limitado la utilidad clfnica de este farmaco. La rapida aparicion de cepas resistentes puede no resultar sorprendente; cuando se examina atentamente el ABC/la CMI libre de TEL contra neumococos resistentes a macrolidos, incluso con bajas 45 CMI, se observa que el numero no es significativamente superior a 25. Por tanto, se podrfa predecir que se va a producir una alta probabilidad de desarrollo de resistencia.
Ademas, aunque la vacuna conjugada pediatrica ha reducido drasticamente la meningitis y bacteriemia provocadas por la mayorfa de los clones neumococicos resistentes a farmacos habituales, se ha informado de brotes de casos 50 graves de otitis media provocados por cepas panresistentes con un serotipo (19A) no incluidas en la vacuna. Por tanto, el problema de los neumococos resistentes a farmacos que provocan infeccion respiratoria extrahospitalaria, especialmente en ninos, es probable que empeore con la propagacion de este clon.
Se ha informado de varios mecanismos de resistencia a macrolidos especfficos, incluyendo la resistencia por 55 metilacion ribosomica (erm(A), erm(B)), la resistencia por eflujo (mef(A), mef(E), mef(I)) y la resistencia generada por mutacion del ARNr o las protefnas ribosomicas, tal como mutaciones en 23S y L4.
Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad continua de nuevos antibioticos y agentes antibacterianos. Ademas, serfa deseable que esos nuevos agentes tuvieran la propiedad de un bajo potencial de desarrollo o 60 induccion de resistencia y un bajo potencial de resistencia presente de forma natural.
En el presente documento, sorprendentemente, se ha descubierto que los macrolidos que contienen triazol, cetolidos incluidos, presentan alta actividad in vitro e in vivo contra numerosos organismos. Asimismo, se ha descubierto que los macrolidos que contienen triazol descritos en el presente documento presentan alta actividad in 5 vitro e in vivo contra numerosos organismos resistentes, incluyendo organismos resistentes tanto a macrolidos como a cetolidos. En el presente documento se describen compuestos de Formula (I)
imagen1
10 o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, en los que:
R10 es hidrogeno o acilo;
X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar carbonilo;
V es C(O);
15 W es H, F, Cl, Br, I u OH;
A es CH2, C(O), C(O)O, C(O)NH, S(O)2, S(O)2NH, C(O)NHS(O)2;
B es (CH2)n, en el que n es un numero entero que varfa de 0-10, o B es una cadena carbonada insaturada de 2-10 carbonos; y
C es hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo 20 opcionalmente sustituido, aminoarilo, alquilaminoarilo, acilo, aciloxi, sulfonilo, ureido o carbamoilo;
para uso en el tratamiento de una enfermedad provocada, al menos en parte, por un organismo que es resistente a una o mas penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, azitromicina, claritromicina o una combinacion de las mismas.
25 En el presente documento se describen composiciones que incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos de formula (I), o los diversos subgeneros de los mismos. Las composiciones farmaceuticas pueden incluir vehfculos, diluyentes, y/o excipientes farmaceuticamente aceptables adicionales. En el presente documento se describen procedimientos para tratar enfermedades generadas por poblaciones de organismos patogenos. Los procedimientos incluyen la etapa de administrar una cantidad terapeutica de uno o mas compuestos 30 de formula (I), o los diversos subgeneros de los mismos descritos en el presente documento, a un paciente con necesidad de alivio o que padece una enfermedad provocada por un organismo patogeno. En el presente documento se describen usos para la fabricacion de medicamentos. Los medicamentos incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos de formula (I), o los diversos subgeneros de los mismos descritos en el presente documento, o una o mas composiciones de los mismos descritas en el presente documento. 35 Los medicamentos son adecuados para tratar enfermedades generadas por poblaciones de organismos patogenos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
FIG. 1. Susceptibilidades comparativas de S. aureus ATCC 25923 y L. monocytogenes EGD a CEM-101, TEL, AZI y 40 CLR, basadas en determinaciones de CMI en caldo a pH ajustado.
FIG. 2. Efecto destructivo en funcion del tiempo a corto plazo de CEM-101 y AZI sobre S. aureus (ATCC 25923) en caldo (paneles izquierdos; pH 7,4) o tras fagocitosis por macrofagos THP-1 (paneles derechos). Ambos farmacos se usaron en una concentracion extracelular de 0,7 (paneles superiores) o 4 (paneles inferiores) mg/litro. Las CMI de 45 CEM-101 y AZI fueron 0,06 y 0,5 mg/litro, respectivamente. Todos los valores son medias ± desviaciones estandar (DE) de tres experimentos independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas pequenas que los
sfmbolos).
FIG. 3. Relaciones concentracion-efecto para CEM-101, TEL, CLR y AZI hacia S. aureus (ATCC 25923) en caldo (paneles izquierdos) y tras fagocitosis por macrofagos THP-1 (paneles derechos). La ordenada muestra el cambio de 5 UFC (A log UFC) por mL (caldo) o por mg de protefna celular (macrofagos THP-1) a las 24 h en comparacion con el inoculo inicial. La abscisa muestra las concentraciones de los antibioticos como se indica a continuacion: (i) paneles superiores, concentraciones en peso (en mg/litro) en caldo (izquierda) o en el medio de cultivo (derecha) y (ii) paneles inferiores, multiplos de la CMI como se determina en caldo a pH 7,4. Todos los valores son medias ± desviaciones estandar (DE) de tres experimentos independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas 10 pequenas que los sfmbolos). Analisis estadfstico basado en el analisis global de los parametros de ajuste de curvas (analisis unidireccional de varianza); la unica diferencia significativa es entre CEM-101 y AZI en caldo (P = 0,04). Los valores numericos de los descriptores farmacologicos pertinentes y el analisis estadfstico de sus diferencias se muestran en la Tabla 1.
15 FIG. 4. Relaciones concentracion-efecto para CEM-101 y AZI hacia L. monocytogenes intrafagocitario (cepa EGD, paneles izquierdos) y L. pneumophila (cepa ATCC 33153, paneles derechos). La ordenada muestra el cambio de UFC (A log UFC) por mg de protefna celular a las 24 h (L. monocytogenes) o 48 h (L. pneumophila) en comparacion con el inoculo posfagocitosis inicial. La abscisa muestra las concentraciones de los antibioticos como se indica a continuacion: (i) paneles superiores, concentraciones en peso (en mg/litro); (ii) paneles inferiores, multiplos de la CMI 20 como se determina en caldo a pH 7,4. Todos los valores son medias ± desviaciones estandar (DE) de tres experimentos independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas pequenas que los sfmbolos).
FIG. 5. Acumulacion de CEM-101 frente a los comparadores en celulas THP-1 a 37 °C (todos los farmacos en una concentracion extracelular de 10 mg/litro). (A) Cinetica de acumulacion (AZI); Cc, concentracion intracelular; Ce, 25 concentracion extracelular); (B) influencia del pH del medio de cultivo en la acumulacion (30 min) de CEM-101 (sfmbolos solidos y lfnea continua) y AZI (sfmbolos abiertos y lfnea de puntos); (C) influencia de la monensina (50 pM; incubacion de 2 h), el verapamilo (150 pM; incubacion de 24 h) o el gemfibrozilo (250 pM; incubacion de 24 h) sobre la acumulacion celular de AZI y CEM-101. Todos los valores son medias ± desviaciones estandar (DE) de tres determinaciones independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas pequenas que los 30 sfmbolos).
FIG. 6. Actividad intracelular: estudios comparativos con otros agentes antiestafilococicos. Dosis-respuesta estatica comparativa de los antibioticos contra Staphylococcus aureus intracelular (cepa ATCC 25923) en macrofagos THP- 1. Las barras representan las CMI (en mg/L) o la dosis estatica extracelular.
35
FIG. 7. Actividad intracelular de CEM-101 en comparacion con AZI, CLR y TEL, expresada como una curva dosis- respuesta de A log UFC desde el tiempo 0 a las 24 horas frente a la dosis logarftmica.
DESCRIPCION DETALLADA
40
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento que incluyen macrolidos y cetolidos que contienen triazol son utiles en el tratamiento de diversas enfermedades provocadas por poblaciones de organismos patogenos resistentes a una o mas penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, azitromicina, claritromicina o una combinacion de las mismas. 45 Se sabe que tales organismos patogenos provocan una variedad de enfermedades y estados de enfermedad. Se entiende que, en algunos casos, la enfermedad o estado de enfermedad puede ser caracterizable como un sfntoma de otra enfermedad subyacente. En tales casos, se entendera que tal sfntoma o sfntomas son una enfermedad tratable usando los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento. Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento 50 son utiles para tratar infecciones del tracto respiratorio (ITR), incluyendo ITR extrahospitalarias, tales como las que generan, o se complican por, patogenos bacterianos susceptibles y/o patogenos resistentes a itiLEb. Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por H. influenzae, tales como infecciones del tracto respiratorio inferior, bacteriemia, neumonfa, otitis media, conjuntivitis, sinusitis y meningitis bacteriana aguda, tal como pueden producirse en 55 lactantes y ninos pequenos, y provocadas mas especfficamente por H. influenzae tipo b (Hib). En otra realizacion, las enfermedades incluyen celulitis, osteomielitis, epiglotitis e infecciones articulares.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, micoplasmas, incluyendo M. pneumoniae, M. hominis, M. genitalium y similares. Tanto los micoplasmas, incluyendo M. pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, y M. 60 fermentans, como los ureaplasmas, incluyendo U. parvum y U. urealyticum, pueden ser responsables de infecciones
en los tractos respiratorio y urogenital. Las enfermedades ilustrativas que pueden tratarse usando los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento que pueden ser provocadas por micoplasmas incluyen, pero no se limitan a, trastornos respiratorios, incluyendo neumonfa atfpica, neumonfa atfpica primaria (NAP) humana, neumonfa errante y similares, tal como pueden ser provocadas por M. pneumoniae, 5 enfermedades inflamatorias pelvicas, tal como pueden ser provocadas por M. genitalium, pleuroneumonfa contagiosa bovina (PCB), tal como puede ser provocada por M. mycoides, o subespecies de Mycoides SC (tipo colonia pequena) y similares. Las enfermedades ilustrativas que pueden tratarse usando los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento que pueden ser provocadas por ureaplasmas incluyen, pero no se limitan a, trastornos por amniolisis, trastornos por parto prematuro y similares. 10 M. pneumoniae es una bacteria muy pequena de la clase Mollicutes, y se sabe que provoca neumonfa por micoplasma, una forma de neumonfa bacteriana. M. hominis es una cepa bacteriana presente en la vagina, y se cree que es una causa de la enfermedad inflamatoria pelvica. Se sabe que M. hominis coloniza frecuentemente el tracto genital de hombre y mujeres sexualmente activos. Esta bacteria tambien se ha asociado a la fiebre posaborto y posparto. M. genitalium se aislo originalmente en 1980 a partir de muestras uretrales de dos pacientes masculinos 15 con uretritis no gonococica. La infeccion por M. genitalium es bastante comun y puede transmitirse entre parejas durante el coito sin proteccion. En otra realizacion, las composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento en una cantidad terapeutica de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, donde la cantidad terapeuticamente efectiva es capaz de presentar actividad bactericida contra uno o mas organismos de tipo micoplasma y/o ureaplasma. En otra realizacion, los compuestos, composiciones, 20 procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, micoplasmas que son resistentes a macrolidos, cetolidos incluidos. En otra realizacion, los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, micoplasmas que son resistentes a CLR.
25 Se entiende que, segun se ha informado, los macrolidos han sido los tratamientos de eleccion para infecciones respiratorias por M. pneumoniae de adultos y ninos, porque tienen las ventajas de ser seguros y bien tolerados en formulaciones orales, poseen propiedades antiinflamatorias independientes de sus actividades antibacterianas y actividad contra otros microorganismos que pueden provocar enfermedades clfnicamente similares. Estas propiedades tambien han hecho que los macrolidos sean atractivos para tratamiento empfrico, ya que la mayorfa de 30 infecciones por micoplasmas nunca se confirman mediante pruebas microbiologicas. Sin embargo, muchos macrolidos carecen de actividad contra M. fermentans y M. hominis. Asimismo, se ha sugerido la probabilidad de que es plausible que la resistencia a macrolidos se desarrolle naturalmente en M. pneumoniae, ya que solo hay un unico operon de ARNr en el genoma y las mutaciones puntuales en el dominio V del ARNr 23S seleccionadas in vitro reducen su afinidad por los ribosomas.
35
Por ejemplo, publicaciones recientes han confirmado la aparicion de resistencia a macrolidos en el 10-33 % de aislados de M. pneumoniae que puede tener implicaciones clfnicas en la evolucion del paciente. Se ha informado de que esos aislados habitualmente tienen mutaciones en el dominio V del ARNr 23S y CMI de eritromicina de 32- >64 pg/mL. Un informe reciente de Shanghai, China, describio que 39/50 (78 %) M. pneumoniae eran resistentes a 40 macrolidos. Los Centros para el control y la prevencion de enfermedades de Estados Unidos describieron 3 de 11 casos (27 %) de infecciones por M. pneumoniae de un brote reciente que eran resistentes a macrolidos y tenfan una mutacion en el ARNr 23S. Ademas, se ha informado de que dos pacientes pediatricos de Birmingham, Alabama, con infecciones del tracto respiratorio inferior por M. pneumoniae resistente a macrolidos no respondieron inicialmente a tratamiento con AZI y necesitaron varios dfas de hospitalizacion (Xiao y col., Emerging macrolide resistance in 45 Mycoplasma pneumoniae in children: detection and characterization of resistant isolates. Pediatr Infect Dis J In Press (2009)). Se ha descrito resistencia a fluoroquinolona en micoplasmas genitales (Bebear y col., In vitro activity of trovafloxacin compared to those of five antimicrobials against mycoplasmas including Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum fluoroquinolone-resistant isolates that have been genetically characterized. Antimicrob Agents Chemother 44:2557-60 (2000); Duffy y col., Fluoroquinolone resistance in Ureaplasma parvum in the United 50 States. J Clin Microbiol 44:1590-1 (2006)) y la resistencia a tetraciclina puede superar actualmente el 40 % en algunas poblaciones (Waites y col., Mycoplasmas and ureaplasmas as neonatal pathogens. Clin Microbiol Rev 18:757-89 (2005)). Tambien se ha documentado resistencia a AZI asociada a fracaso del tratamiento clfnico en M. genitalium (Jensen y col., AZI treatment failure in Mycoplasma genitalium-positive patients with nongonococcal urethritis is associated with induced macrolide resistance. Clin Infect Dis 47:1546-53 (2008)). A pesar de estos retos, 55 se ha descubierto que los macrolidos y cetolidos que contienen triazol descritos en el presente documento son utiles en el tratamiento de enfermedades provocadas, al menos en parte, por micoplasmas y/o ureaplasmas, tales como uretritis y otras infecciones de la uretra y el tracto urogenital que incluyen micoplasmas y/o ureaplasmas.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, Legionella sp., tales como L. pneumophila, y similares. 60 Se sabe que L. pneumophila provoca legionelosis, tambien conocida como enfermedad de los legionarios.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, organismos de tipo estafilococos y/o estreptococos, tales como infecciones cutaneas y de los tejidos blandos (ICTB). En una variacion, la ICTB es una ICTB complicada. En otra variacion, la ICTB es una ICTB no complicada. Las enfermedades ilustrativas provocadas por, o complicadas 5 por, S. aureus incluyen, pero no se limitan a, infecciones cutaneas menores, tales como acne, impetigo, diviesos, celulitis, foliculitis, forunculos, carbunculos, necrolisis epidermica toxica y abscesos, y enfermedades mas graves, o que incluso suponen un peligro para la vida, tales como neumonfa, meningitis, osteomielitis, endocarditis, sfndrome del shock toxico (SST) y septicemia.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles 10 para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, gonococos. Los sfntomas de infeccion por N. gonorrhoeae difieren dependiendo del sitio de infeccion. Las enfermedades ilustrativas provocadas por, o complicadas por, gonococos incluyen uretritis tanto gonococica como no gonococica, que pueden derivar en una descarga purulenta (o similar al pus) desde los genitales, inflamacion, enrojecimiento, tumefaccion, disuria y/o sensacion de ardor durante la miccion. La infeccion de los genitales en hembras con N. gonorrhoeae puede derivar 15 en enfermedad inflamatoria pelvica y, si no se trata, derivar en infertilidad. La enfermedad inflamatoria pelvica puede derivar, si no se trata, en que la N. gonorrhoeae se propague al peritoneo pelvico (a traves del cervix, el endometrio y las trompas de falopio). Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, una o mas neisserias, tales como N. meningitides, incluyendo organismos que son resistentes al acido nalidfxico. En el presente documento, se 20 entiende que la resistencia al acido nalidfxico puede correlacionarse con resistencia a fluoroquinolonas. Por consiguiente, los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, una o mas neisserias, tales como N. meningitides, que son resistentes a fluoroquinolonas. Pueden producirse infecciones por N. meningitides en la nasofaringe.
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N. gonorrhoeae puede provocar tambien conjuntivitis, faringitis, proctitis o uretritis, prostatitis y orquitis cuando esta presente en otros tejidos. Por ejemplo, segun se ha informado, la conjuntivitis es habitual en recien nacidos; por consiguiente, con frecuencia, se aplica nitrato de plata o antibioticos a los ojos de los recien nacidos como medida preventiva contra la gonorrea. La conjuntivitis neonatal por gonorrea se contrae cuando el lactante es expuesto a N. 30 gonorrhoeae en el canal del parto, y puede derivar en formacion de cicatrices o perforacion de la cornea. Tambien pueden producirse infecciones por N. gonorrhoeae diseminadas, que derivan en endocarditis, meningitis y/o sfndrome de artritis-dermatitis gonococica. Con frecuencia, el sfndrome de artritis-dermatitis va acompanado de artralgia, tenosinovitis y/o dermatitis no prurftica indolora.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles 35 para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis. Enterococcus spp., que provoca, o contribuye a, enfermedades tales como infecciones del tracto urinario, bacteriemia, endocarditis bacteriana, diverticulitis y meningitis. Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, Ureaplasma sp., tales como U. parvum, U. urealyticum y similares. Segun se ha informado, U. 40 urealyticum se ha asociado a diversas enfermedades en humanos, incluyendo uretritis no especffica (UNE), infertilidad, corioaminonitis, mortalidad al nacer, parto prematuro y, en el periodo perinatal, neumonfa, displasia broncopulmonar y meningitis.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, Chlamydia sp., incluyendo C. trachomatis, C. 45 pneumoniae y similares. Al igual que los gonococos, la clamidia provoca diferentes enfermedades dependiendo del organo o tejido infectados. Chlamydia sp., segun se ha informado, provocan enfermedades genitales. Por ejemplo, C. pneumoniae es bien conocida como un importante patogeno de infecciones del tracto respiratorio a escala mundial, siendo responsable de casi el 10 % de los casos de neumonfa extrahospitalaria. La infeccion por clamidia del cuello uterino (cervicitis) es una enfermedad de transmision sexual que es asintomatica para aproximadamente el 50 50-70 % de las mujeres infectadas con la enfermedad. Sin embargo, la infeccion puede transmitirse a traves del sexo vaginal, anal y/o oral. Incluso cuando es asintomatica, la infeccion por clamidia que no se detecta progresara a enfermedad inflamatoria pelvica (EIP) en aproximadamente la mitad de las personas afectadas. EIP es un termino generico para la infeccion de utero, trompas de falopio y/o ovarios. La EIP puede provocar formacion de cicatrices en los organos reproductivos, provocando posteriormente complicaciones mas graves, incluyendo dolor pelvico cronico, 55 dificultad para conseguir embarazo, embarazo ectopico (tubarico) y otras complicaciones peligrosas del embarazo. Ademas, se ha informado de que, las mujeres infectadas por clamidia, es hasta cinco veces mas probable que se infecten por el VIH, en caso de exposicion. En los hombres, segun se ha informado, la clamidia muestra sfntomas de uretritis infecciosa (inflamacion de la uretra) en aproximadamente el 50 % de los casos. En los hombres, si no se trata, es posible que la clamidia se propague a los testfculos provocando epididimitis que, si no se trata, en casos 60 raros puede provocar esterilidad. Tambien se ha sugerido que la clamidia es una causa potencial de la prostatitis en
hombres.
Segun se ha informado, la clamidia tambien provoca enfermedad ocular y, en particular, conjuntivitis debida a infeccion por clamidia. La conjuntivitis por clamidia o el tracoma fueron, en su dfa, la causa mas importante de 5 ceguera a escala mundial, pero, segun se ha informado, su papel ha disminuido. Los recien nacidos tambien pueden desarrollar infeccion ocular por clamidia en el parto por exposicion al organismo en el canal del parto. Segun se ha informado, la clamidia tambien provoca afecciones reumatologicas, tales como artritis reactiva o la tnada de artritis, conjuntivitis y uretritis, especialmente en hombres jovenes. Segun se ha informado, la clamidia tambien provoca infecciones perinatales. Se ha informado de que la mitad de todos los lactantes nacidos de madres con clamidia 10 naceran con la enfermedad. La clamidia puede afectar a los lactantes provocando aborto espontaneo; parto prematuro y conjuntivitis, que puede llevar a ceguera y neumoma. Tambien, segun se ha informado, la clamidia puede provocar otras afecciones, tales como linfogranuloma venereo, una infeccion de los nodulos y ganglios linfaticos provocada por C. trachomatis. Normalmente, el linfogranuloma venereo se presenta con ulceracion genital y aumento de los ganglios linfaticos de la ingle, pero tambien puede manifestarse como proctitis (inflamacion del 15 recto), fiebre o aumento de los ganglios linfaticos en otras regiones del cuerpo.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades provocadas por, o complicadas por, Streptococci sp., tales como S. pneumoniae, S. pyogenes, estreptococos alfa-hemoltticos, estreptococos del grupo viridans, los estreptococos beta-hemolfticos de los grupos A y B de Lancefield (tambien conocidos como «estreptococos del Grupo A» y «estreptococos del Grupo 20 B») y similares. Ademas de la faringitis estreptococica, tambien se ha informado de que ciertas especies de estreptococos son responsables de casos de meningitis, neumoma bacteriana, endocarditis, erisipelas y fascitis necrosante (tambien conocida como infeccion bacteriana devoradora de carne). Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre, tales como bacteriemia, que pueden ser provocadas por diversos organismos patogenos. 25 Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento son utiles para tratar enfermedades tales como infecciones del tracto respiratorio (ITR), incluyendo ITR extrahospitalarias, tales como neumoma extrahospitalaria (NEH), neumoma bacteriana extrahospitalaria (NBEH) e ITR nosocomiales, sinusitis, bronquitis cronica, faringitis, otitis media, asma y similares, infecciones cutaneas y de los tejidos blandos (ICTB), incluyendo ICTB tanto complicadas como no complicadas y similares, infecciones del tracto urinario (ITU), 30 incluyendo uretritis, gonorrea, uretritis no GC, prostatitis y similares, infecciones bacterianas transmitidas por la sangre, tales como bacteriemia y similares, diarrea del viajero y otras.
Se entendera que los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de enfermedades generadas por diversos organismos que son resistentes a otros compuestos, incluyendo organismos que son resistentes a penicilinas, cefalosporinas y/o 35 quinolona. Ilustrativamente, en el presente documento se describen compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos utiles para tratar enfermedades provocadas por especies de micoplasmas y ureaplasmas clmicamente importantes de humanos, incluyendo M. pneumoniae resistente a AZI.
Los procedimientos incluyen la etapa de administrar uno o mas compuestos de formula (I), y/o cualquiera de los diversos subgeneros de formula (I) descritos en el presente documento, y/o una composicion farmaceutica de uno o 40 mas de los compuestos anteriores. El uno o mas compuestos y la una o mas composiciones se administran a un paciente que padece, o con necesidad de alivio de, una enfermedad provocada, al menos en parte, por uno o mas de los organismos descritos en el presente documento. En una realizacion, la enfermedad es provocada, al menos en parte, por uno o mas de los organismos que presentan resistencia a una o mas penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, azitromicina, claritromicina o una combinacion de las mismas. En otra realizacion, la enfermedad es 45 provocada, al menos en parte, por uno o mas organismos seleccionados de entre SARM, SARM 300 (EH), SARV, neumococos MR, S. pneumoniae serotipo 19A (tambien conocida como serotipo 19A neumococico multirresistente). En otra realizacion, la enfermedad es provocada, al menos en parte, por uno o mas S. pyogenes. En otra realizacion, la enfermedad es provocada, al menos en parte, por uno o mas S. pneumoniae. En otra realizacion, la enfermedad es provocada, al menos en parte, por uno o mas organismos resistentes a CLR. En otra realizacion, la 50 enfermedad es provocada, al menos en parte, por uno o mas organismos resistentes a AZI. Los procedimientos incluyen la etapa de administrar uno o mas compuestos de formula (I), y/o cualquiera de los diversos subgeneros de formula (I) descritos en el presente documento, y/o una composicion farmaceutica de uno cualquiera, o mas, de los compuestos anteriores a un paciente que padece, o con necesidad de alivio de, una enfermedad provocada, al menos en parte, por uno o mas organismos seleccionados de entre gonococo, tal como Neisseria gonorrhoeae, 55 micoplasma, tal como M. pneumoniae, M. genitalium, M. fermentans y M. hominis, ureaplasma, incluyendo U. parvum y U. urealyticum, moraxella, incluyendo M. catarrhalis, enterococo, incluyendo E. faecalis, estafilococo, incluyendo S. aureus, S. epidermidis, SASM, SARM, SARM 300 y SARV, estreptococo, incluyendo S. pneumoniae, tal como S. pneumoniae serotipo 19A, S. pyogenes resistente a eritromicina, estafilococos coagulasa negativos, H. haemolyticus, incluyendo estreptococos beta hemolfticos, S. mitis y estreptococos del grupo viridans, clamidia, 60 incluyendo C. pneumoniae y C. trachomatis, H. influenzae, H. parainfluenzae, Legionella, tal como L. pneumophila,
listeria, tal como L. monocytogenes, neisseria, tal como N. meningitides, Mycobacterium leprae, Bacillus spp., Corynebacterium spp., Micrococcus spp., y organismos anaerobios. Los compuestos descritos en el presente documento presentan el espectro mas amplio y la mejor actividad contra patogenos de ITR entre todos los agentes cetolidos mLEB probados, AZI y CLR incluidas.
5 Por ejemplo, los valores de CMI de CEM-101 se encontraban en <0,5 y <4 pg/mL para S. pneumoniae, L. pneumophila y H. influenzae, respectivamente.
Sin cenirnos a la teorfa, se cree que la eficacia observable con los compuestos descritos en el presente documento puede deberse, al menos en parte, a una o mas caracterfsticas de los compuestos, incluyendo la acumulacion 10 intracelular, la actividad intracelular, la distribucion a muchos compartimentos a concentracion alta, la alta actividad sobre organismos resistentes, el bajo potencial de desarrollo de resistencia y la baja resistencia inducible, y la actividad bactericida de los compuestos descritos en el presente documento. Sorprendentemente, en el presente documento se descubrio que los compuestos descritos en el presente documento no son sustratos PGP, o son sustratos pobres de la GpP.
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Los cetolidos difieren estructuralmente de los macrolidos en que, (1) carecen de la 3-O-cladinosa, (2) incluyen la presencia del grupo 3-ceto y (3) en el caso de los compuestos descritos en el presente documento, incluyen la presencia de una funcionalidad aromatica para interactuar con el dominio II del ribosoma bacteriano. En el presente documento se cree que, ademas de las otras interacciones comunes a los macrolidos, los cetolidos, tales como los 20 compuestos descritos en el presente documento, tienen interacciones adicionales con el ribosoma, incluyendo enlaces de H al 2-fluoro, cuando esta presente, interacciones con el grupo 3-oxo e interacciones con el grupo aromatico pendiente unido al carbamato cfclico entre C-11 y C-12. Sin cenirnos a la teorfa, se cree que estas caracterfsticas pueden contribuir a la actividad contra organismos resistentes, la baja resistencia inducible observada y/o la actividad bactericida de los compuestos descritos en el presente documento.
25 En el presente documento se describen compuestos que son activos contra organismos resistentes a macrolidos, incluyendo cetolidos, y que tambien tienen un bajo potencial de desarrollo de resistencia y/o bajas tasas de resistencia inducible. Sin cenirnos a la teorfa, en el presente documento se cree que los compuestos se unen mas fuertemente al ribosoma del organismo infeccioso. Ademas, aunque nuevamente sin cenirnos a la teorfa, en el presente documento se cree que los compuestos se unen al ribosoma del organismo infeccioso mas fuertemente y/o 30 de una forma diferente a otros macrolidos o, incluso, otros cetolidos. En particular, en el presente documento se cree que los compuestos descritos en el presente documento se unen al ribosoma con una orientacion diferente. Ademas, en el presente documento se cree que los compuestos descritos en el presente documento tienen un sitio de union al ribosoma adicional a otros macrolidos o cetolidos, lo que permite una union mas fuerte. En cada uno de los anteriores, en el presente documento se cree que el 1,2,3-triazol es responsable de las diferencias en las 35 interacciones de union entre los compuestos descritos en el presente documento y otros macrolidos y cetolidos.
Por ejemplo, un mecanismo comun que lleva a la resistencia a macrolidos implica la metilacion mediada por Erm de un nucleotido del ribosoma bacteriano clave (A2058EC) encontrado en el domino V del ARN 23S. Se ha demostrado que este nucleotido juega un papel principal en la union al ribosoma de los antibioticos macrolidos a traves de 40 interacciones con el azucar desosamina del macrolido. La metilacion de A2058 interfiere efectivamente con la union del azucar desosamina, reduciendo de ese modo la afinidad de union del macrolido al ribosoma bacteriano. Una posible explicacion para la actividad mejorada de los compuestos descritos en el presente documento contra bacterias resistentes a macrolidos proviene de interacciones en el dominio II adicionales a traves de la cadena lateral pendiente aril-1,2,3-triazolilo. Se ha sugerido que esta interaccion adicional ayuda a compensar las 45 alteraciones en el sitio de union del dominio V en las bacterias resistentes. Ademas, aunque sin cenirnos a la teorfa, y a diferencia de otros macrolidos o cetolidos, se cree que los compuestos descritos en el presente documento son capaces de unir ambos dominios II y V del ARN ribosomico y son capaces de mantener actividad in vitro contra M. pneumoniae resistentes a macrolidos que tienen sitios de union alterados en el dominio V debido a la mutacion A2063G. Por ejemplo, uno de tales compuestos, CEM-101, tiene CMI inferiores a la TEL para los micoplasmas 50 humanos. CEM-101 mantuvo actividad in vitro contra dos M. pneumoniae resistentes a AZI con CMI de 0,5 pg/mL, mientras que las CMI de TEL de 4 pg/mL superaron el valor crftico de 1 pg/mL usado para determinar susceptibilidad a otras especies bacterianas. La diferencia entre la CMI50 para el grupo M. pneumoniae en general y las CMI para dos aislados resistentes fue la misma en 14 diluciones a la mitad para cada farmaco. Por lo tanto, la modesta reduccion de la CMI in vitro de CEM-101 puede ser mas profunda in vivo cuando se tratan enfermedades 55 provocadas, al menos en parte, por micoplasmas. Sorprendentemente, tambien se encontro que tanto CEM-101 como CEM-103 (3-cladinosa del 101) muestran union considerable al ribosoma dimetilado por erm en A2058. CEM- 103 es el analogo macrolido de CEM-101 que tiene una 3-cladinosa en lugar de un grupo 3-oxo y, por lo tanto, respalda la teorfa de que el 1,2,3-triazol es responsable de las diferencias en las interacciones de union entre los compuestos descritos en el presente documento y otros macrolidos y cetolidos.
Ademas, los compuestos descritos en el presente documento tienen bajo potencial de desarrollo de resistencia y/o baja resistencia inducible. En la resistencia mutacional monoetapa y tambien en el pase multietapa a resistencia, no se observo crecimiento de mutantes cuando se expusieron las cepas a 4X, 8X y 16X la CMI de CEM-101 con ninguna de las 4 cepas probadas. Las tasas de mutacion por organismo fueron: E. faecium a <4,0 x 10-9, S. aureus a 5 <6,0 x 10-9 y S. pneumoniae a <6,4 x 10-8 a <1,4 x 10-9. Entre los 18 aislados probados para seleccion de resistencia durante pases en concentraciones subinhibitorias de agentes antimicrobianos, no se observo variacion significativa (superior a ± un log2 de dilucion) de los valores de CMI de CEM-101 con ocho cepas (44,4 %), incluyendo un S. aureus, tres enterococos, tres S. pneumoniae y un estreptococo p-hemolftico. Las 10 cepas restantes presentaron aumentos modestos de las CMI de CEM-101 de cuatro veces (siete cepas) a ocho veces (tres cepas), sin reversion, 10 o tan solo con una reduccion a la mitad, en el valor de CMI tras tres pases diarios consecutivos en medio libre de antimicrobianos. La seleccion de resistencia durante pases en concentraciones subinhibitorias fue inferior, en general, para CEM-101 en comparacion con otros agentes evaluados.
En el presente documento se describen compuestos que son activos intracelularmente. Tambien se ha descubierto en el presente documento que la acumulacion intracelular y la actividad intracelular de los macrolidos que contienen 15 triazol no se vefa afectada por los inhibidores de la GpP o la protefna de multirresistencia (PMR). Por consiguiente, se cree que los compuestos descritos en el presente documento no son sustratos, o son sustratos pobres, de la glicoprotefna P (glicoprotefna plasmatica o de permeabilidad, GpP). Se entiende que la GpP es un mecanismo de eflujo que puede llevar a resistencia de algunos organismos contra ciertos antibioticos, tal como se ha informado para AZI y ERI en macrofagos en los que ambos antibioticos son sustratos de la glicoprotefna P. Por consiguiente, 20 sorprendentemente, se ha encontrado que los compuestos descritos en el presente documento se acumulan intracelularmente. Ademas de la acumulacion intracelular, sorprendentemente, se ha descubierto que los compuestos macrolidos y cetolidos que contienen triazol descritos en el presente documento tienen alta actividad intracelular. Sorprendentemente, tambien se ha encontrado en el presente documento que los compuestos descritos en el presente documento tienen una union a protefnas inferior a la habitual para macrolidos a pH inferior, tal como 25 el pH encontrado en las infecciones bacterianas, que incluyen, pero no se limitan a, abscesos. Se entiende que la falta de actividad intracelular observada habitualmente con los agentes antibacterianos, incluyendo otros macrolidos y cetolidos, puede deberse a una alta union a protefnas y/o al pH relativamente bajo de los compartimentos intracelulares, tal como el presente en los abscesos.
30 Sin embargo, incluso cuando no se eliminan mediante eflujo activo, la concentracion de otros agentes bacterianos, incluyendo otros macrolidos y cetolidos, en los macrofagos puede no ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad debido al bajo pH del compartimento lisosomal. Por ejemplo, el ambiente acido que prevalece en los fagolisosomas (en los que S. aureus reside durante su etapa intracelular) puede afectar a la actividad de antibioticos tales como AZI, CLR y TEL. Inesperadamente, se ha descubierto que los compuestos descritos en el presente documento 35 retienen su actividad antibacteriana a pH bajo. Se sabe que la actividad intracelular de los compuestos descritos en el presente documento puede ser un determinante importante para la erradicacion rapida y completa y, probablemente tambien, para la prevencion de resistencia en el organismo diana.
La falta de terapia antimicrobiana efectiva deriva en supervivencia intracelular de las bacterias, que sigue siendo la 40 causa principal de la propagacion bacteriana, fracasos terapeuticos con peligro para la vida y establecimiento de infecciones cronicas recidivantes. Estas situaciones se observan durante el curso de infecciones provocadas por muchos organismos, incluyendo meningitis por L. monocytogenes, invasion de macrofagos pulmonares por L. pneumophila y endocarditis, osteomielitis e infecciones cutaneas y de los tejidos blandos por S. aureus.
45 A pesar de que se ha informado de que la acumulacion intracelular de un antibiotico es indicativa de actividad eficiente contra las bacterias, la evaluacion farmacodinamica de una gran serie de antibioticos habitualmente usados ha revelado que otros parametros tales como la biodisponibilidad intracelular y la modulacion de la actividad en el compartimento infectado tambien son importantes. Las observaciones descritas en el presente documento confirman y amplfan las observaciones previas hechas para macrolidos en este contexto debido al comportamiento 50 sorprendentemente diferente presentado por los macrolidos que contienen triazol descritos en el presente documento en comparacion con macrolidos y cetolidos conocidos tales como TEL, AZI y CLR.
Sorprendentemente, se ha encontrado que los macrolidos que contienen triazol se acumulan en una magnitud considerablemente mayor que los comparadores, incluyendo AZI, y expresan consistentemente una potencia mayor 55 (valores reducidos de E50 y Cs) a la vez que muestran una eficacia maxima similar (Emax) a los comparadores. Sin cenirnos a la teorfa, se cree que esto indica que las mejoras resultantes de las modificaciones estructurales introducidas en CEM-101 se refieren a la modulacion de las propiedades farmacocineticas y la actividad intrfnseca (incluyendo su reducida susceptibilidad a las condiciones fisicoqufmicas que prevalecen en el compartimento infectado) en lugar de a un cambio en su modo de accion. Por tanto, los macrolidos que contienen triazol presentan 60 el caracter esencialmente bacteriostatico de los macrolidos, pero lo expresan mejor en el medio intracelular, y a
concentraciones extracelulares considerablemente inferiores, que los comparadores.
Sin cenirnos a la teorfa, se cree que la acumulacion celular de macrolidos que contienen triazol, tales como CEM- 101, es consecuencia del mecanismo general de captura protonica de las bases organicas debiles previsto para 5 todos los macrolidos, ya que la acumulacion se suprime practicamente por completo, en paralelo con la AZI, mediante exposicion a pH acido o al ionoforo de protones monensina. Basandonos en el modelo general de difusion/segregacion de bases debiles en los compartimentos limitados por membrana acidos, la acumulacion se determina mediante el numero de grupos ionizables y las proporciones entre los coeficientes de permeabilidad de membrana de las formas no ionizadas e ionizadas del farmaco. A pesar de que CEM-101 tiene dos funciones 10 ionizables, se calcula que el pKa del aminofeniltriazol es inferior a 4, lo que sugiere que la molecula es en gran medida monocatfonica (similar a CLR y TEL) a pH neutro e incluso lisosomal (~5). En cambio, la AZI tiene dos funciones ionizables con pKa >6 y, por lo tanto, es dicationica intracelularmente. Sin embargo, CEM-101 posee un sustituyente fluoro en la posicion 2, que deberfa hacerlo mas lipofflico que la CLR o TEL. Sin cenirnos a la teorfa, se cree que la relacion de las constantes de permeabilidad de las formas no ionizadas e ionizadas de CEM-101, en 15 comparacion con LR o TEL, puede ser tan importante como el numero de funciones ionizables para determinar el nivel de acumulacion celular de bases organicas debiles. Sin cenirnos a la teorfa, se cree que la mayor acumulacion celular de CEM-101 puede deberse parcialmente a su falta de susceptibilidad al eflujo mediado por GpP (que es expresada por los macrofagos THP-1 en nuestras condiciones de cultivo) a diferencia de la AZI.
20 Se ha observado que muchos macrolidos conocidos tienen un gran volumen de distribucion, que se cree que esta relacionado con su capacidad para acumularse en el interior de celulas eucariotas mediante difusion/segregacion en compartimentos acidos, es decir lisosomas y vacuolas relacionadas. Como consecuencia, los macrolidos conocidos se han considerado candidatos para el tratamiento de infecciones localizadas en estos compartimentos. Por tanto, basandonos en un amplio abanico de datos, tanto in vitro como clfnicos, se podrfa asumir que los macrolidos son 25 adecuados para tratar infecciones provocadas por patogenos intracelulares tfpicos tales como legionela y clamidia. Sin embargo, las comparaciones cuantitativas directas entre las actividades intracelular y extracelular usando patogenos intracelulares facultativos, tales como S. aureus o L. monocytogenes, sugieren que los macrolidos conocidos expresan solo una fraccion minima de su potencial antibacteriano intracelularmente, especialmente, considerando su gran acumulacion intracelular. Se cree que este potencial antibacteriano minimizado contra 30 organismos que se replican en fagolisosomas y vacuolas relacionadas esta relacionado con el pH acido, que se sabe que reduce la actividad de los macrolidos conocidos. Otro factor es que algunos organismos, tales como L. monocytogenes, en realidad pueden replicarse compartimentos subcelulares. Ademas, ciertos macrolidos, tales como AZI, estan sometidos a eflujo activo desde los macrofagos, lo que contribuye adicionalmente a la actividad intracelular suboptima.
35
En cambio, la acumulacion celular y la actividad intracelular de los compuestos que contienen triazol descritos en el presente documento, usando modelos que han sido desarrollados para el estudio de la farmacodinamica intracelular de los antibioticos, son sustancialmente mejores que las de macrolidos conocidos, incluyendo los cetolidos. Por tanto, los compuestos descritos en el presente documento mantienen la eficacia maxima de sus CMI y muestran 40 mayor potencia contra formas intracelulares de, por ejemplo, estafilococos, listeria y legionela en comparacion con la TEL, AZI y CLR. Sin cenirnos a la teorfa, se cree que esta potencia intracelular mejorada de los compuestos que contienen triazol descritos en el presente documento es consecuencia de la combinacion de la actividad intrfnseca mas alta contra estafilococos, listeria y legionela acoplada a la actividad retenida a pH bajo y la capacidad de distribuirse a una amplia variedad de compartimentos intracelulares.
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En otra realizacion, los compuestos macrolidos y cetolidos que contienen triazol tienen actividad intracelular, tal como actividad intracelular contra estafilococos tales como S. aureus. La supervivencia de S. aureus en el interior de las celulas eucariotas es crftica para la persistencia de la infeccion. Se sabe que las pruebas rutinarias de susceptibilidad normalmente se determinan unicamente contra bacterias extracelulares y, por lo tanto, pueden 50 inducir a error en su prediccion de la eficacia contra organismos intracelulares. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos, composiciones, procedimientos y usos para tratar una enfermedad provocada por, al menos en parte, una infeccion por estafilococos intracelulares. En otra realizacion, la enfermedad provocada por la infeccion por estafilococos es SARM extrahospitalaria (SARM-EH), neumonfa extrahospitalaria (N-EH) o una infeccion cutanea y de los tejidos blandos (ICTB). Se entiende ademas que S. aureus se considera una cepa 55 virulenta y, por tanto, el tratamiento con agentes bacteriostaticos puede resultar inefectivo. Por ejemplo, la recurrencia puede ser un problema cuando se tratan tales cepas. Inesperadamente, se ha descubierto en el presente documento que los compuestos descritos en el presente documento son tambien bactericidas y, por lo tanto, utiles en el tratamiento de enfermedades provocadas por estafilococos y, en particular, estafilococos intracelulares, tales como S. aureus, en cualquier caso.
60 Los compuestos macrolidos y cetolidos que contienen triazol tienen actividad intracelular, tal como actividad
intracelular contra listerias, tales como L. monocytogenes. En otra realizacion, los compuestos macrolidos y cetolidos que contienen triazol tienen actividad intracelular, tal como actividad intracelular contra legionelas, tales como L. pneumophila.
Los compuestos macrolidos y cetolidos que contienen triazol tienen actividad intracelular, tal como actividad 5 intracelular contra micobacterias, tales como M. leprae. En otra realizacion, se describen en el presente documento composiciones, procedimientos y medicamentos para tratar enfermedades provocadas, al menos en parte, por M. leprae, que incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Hansen (lepra). En un aspecto, las composiciones, procedimientos y medicamentos incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos, 10 composiciones, procedimientos y medicamentos para tratar enfermedades provocadas, al menos en parte, por M. leprae que son resistentes a CLR. Por ejemplo, se ha descubierto que CEM-101 es de 2-4 veces mas activo que otros antibioticos de la misma clase, principalmente CLR y TEL. Es activo contra cepas patogenas de S. aureus, S. pyogenes y S. pneumoniae resistentes a penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, azitromicina, claritromicina o una combinacion de las mismas.
15 Los compuestos, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, donde la cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad efectiva para presentar actividad antibacteriana intracelular.
En el presente documento se describen compuestos que son bactericidas. En otra realizacion, los compuestos, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento incluyen una cantidad terapeuticamente 20 efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, donde la cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad efectiva para presentar actividad bactericida, incluyendo actividad bactericida in vivo. Se ha informado de que los macrolidos son generalmente bacteriostaticos. Los compuestos bacteriostaticos no matan la bacteria, sino que, en su lugar, por ejemplo, inhiben el crecimiento y la reproduccion de bacterias sin matarlas; la muerte se logra mediante agentes bactericidas. Se entiende que los agentes bacteriostaticos deben trabajar con el 25 sistema inmune para eliminar los microorganismos del cuerpo. Los antibioticos bacteriostaticos pueden limitar el crecimiento de bacterias por medio de diversos mecanismos, tales como interfiriendo con la produccion de protefna bacteriana, la replicacion del ADN u otros aspectos del metabolismo celular bacteriano. En cambio, los antibioticos bactericidas matan las bacterias; los antibioticos bacteriostaticos solo ralentizan su crecimiento y reproduccion. La penicilina es un bactericida, al igual que las cefalosporinas, todas ellas pertenecientes al grupo de los antibioticos p30 lactamicos. Actuan de forma bactericida, alterando el precursor de la pared celular, lo que lleva a la lisis. Ademas, los antibioticos aminoglicosfdicos normalmente se consideran bactericidas, aunque pueden ser bacteriostaticos con algunos organismos. Actuan uniendose irreversiblemente a la subunidad ribosomica 30s, reduciendo la fidelidad de la traduccion, lo que lleva a sfntesis incorrecta de las protefnas. Ademas, inhiben la sfntesis de protefnas debido a la separacion prematura del complejo entre el ARNm y las protefnas ribosomicas. El resultado final es la muerte celular 35 bacteriana. Otros antibioticos bactericidas incluyen las fluoroquinolonas, los nitrofuranos, la vancomicina, los monobactamicos, el cotrimoxazol y el metronidazol.
Los compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos descritos en el presente documento incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, donde la cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad efectiva para presentar actividad bactericida contra uno o mas 40 neumococos. Se ha informado de que la resistencia por neumococos se produce muy rapidamente. Por consiguiente, sin cenirnos a la teorfa, en el presente documento se cree que el tratamiento de tales enfermedades usando agentes bacteriostaticos puede resultar infructuoso en dos sentidos. Primero, la simple detencion de la progresion de la enfermedad con un agente bacteriostatico puede resultar insuficiente porque el sistema inmune puede que no intervenga para ayudar a curar la enfermedad a un nivel necesario. Por ejemplo, algunos organismos 45 bacterianos no son destruidos por el sistema inmune porque residen en compartimentos intracelulares. Por tanto, una vez que el ciclo de tratamiento ha finalizado, puede producirse una rapida recurrencia de la enfermedad. Segundo, porque alguna parte de la poblacion bacteriana probablemente sera eliminada; la poblacion restante puede seleccionarse para desarrollo de resistencia. En el presente documento, se cree que un agente activo intracelularmente y/o un agente activo intracelularmente y bactericida seran eficaces en el tratamiento de tales 50 enfermedades. En una realizacion ilustrativa, se describen en el presente documento compuestos que consiguen una concentracion intracelular de 20X la CMI de la bacteria a la que van dirigidos. Se ha informado de que la mayorfa de, si no todos, los antibioticos macrolidos, aunque son bactericidas in vitro, solo son bacteriostaticos in vivo. Por ejemplo, como se describe a continuacion en el presente documento, cuando se prolongaba el tiempo entre la ultima dosis de compuesto, los niveles de reduccion de la biocarga permanecfan iguales para los 55 compuestos que contienen triazol descritos en el presente documento, lo que indica una respuesta bactericida. En cambio, los grupos de dosis de TEL y CLR demostraron aumentos de la biocarga cuando se prolongaba el intervalo de tiempo. Por tanto, esos dos ultimos agentes macrolidos/cetolidos demostraron una respuesta bacteriostatica mas clasica.
En el presente documento se describen compuestos, composiciones, procedimientos y medicamentos que tienen un 60 efecto posantibiotico largo (EPA). En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos,
composiciones, procedimientos y medicamentos que son sinergicos a otros agentes antibacterianos. En otra realizacion, los otros agentes antibacterianos se seleccionan de entre antibioticos aminoglicosfdicos, cefalosporinas e inhibidores de dihidrofolato reductasa y dihidropteroato sintetasa, tales como gentamicina (GEN), ceftriaxona (CRO), trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX). Se entendera que la enfermedad tratable con los compuestos, 5 composiciones y procedimientos descritos en el presente documento esta provocada por al menos un organismo distinto de uno o mas de los siguientes: S. aureus (ATCC 29213, SASM, mLE-S), E. faecium (ATCC 19434), K. pneumoniae (13883), E. coli (ATCC 25922), S. typhimurium (ATCC 14028), S. pneumoniae (ATCC 49619), S. pyogenes (ATCC 19615), S. pneumoniae (163, Mef A), S. pneumoniae (303, ErmB), S. aureus (SRAM, 33591), H. influenzae (ATCC 49247), S. pneumoniae (3773, ErmB), S. pneumoniae (5032), S. pyogenes (1721), S. pyogenes 10 (1850), S. pyogenes (3029) y S. pyogenes (3262). En el presente documento se describen compuestos de Formula (I) en los que W es fluoro. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I) en los que A y B se toman juntos para formar un grupo alquileno que incluye, pero no se limita a, propileno, butileno y pentileno. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I) en los que A y B se toman juntos para formar butileno. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de 15 Formula (I) en los que A y B se toman juntos para formar pentileno. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I) en los que A y B se toman juntos para formar butilenos y C es 2-piridinilo o aminofenilo, tal como 3-aminofenilo. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I) en los que A y B se toman juntos para formar propilenos, butilenos o pentilenos y C es aminofenilo, tal como 3-aminofenilo. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I) en los 20 que A y B se toman juntos para formar pentileno y C es 3-piridinilo o benzotriazol. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I) en los que C es un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I) en los que R10 es hidrogeno. En otra realizacion, C es 3-piridinilo o benzotriazolilo.
25 En otra realizacion, C es fenilo opcionalmente sustituido, tal como fenilo, halofenilo, haloalquilfenilo, aminofenilo y similares, piridinilo opcionalmente sustituido tal como 2-piridinilo y 3-piridinilo, benzotriazol opcionalmente sustituido, y similares.
En otra realizacion, A y B se toman juntos para formar butileno o pentileno y X e Y se toman junto con el carbono al 30 que estan unidos para formar un grupo C(O).
En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde W es H o F. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde A es CH2, B es (CH2)n y n es un numero entero de 2-4. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en 35 cualquiera de las realizaciones anteriores donde C es arilo o heteroarilo. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde C es 3-aminofenilo o 3-piridinilo. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde R10 es hidrogeno. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde A y B se toman juntos para formar butileno o pentileno y X e Y se toman junto con el carbono al que estan 40 unidos para formar un grupo C(O). En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde A y B se toman juntos para formar butileno o pentileno, X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar un grupo C(O) y W es F.
En el presente documento se describe una composicion antibacteriana, en la que la composicion incluye una cantidad efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, y un vehfculo, excipiente o 45 diluyente de los mismos farmaceuticamente aceptable, o una combinacion de los mismos.
Tal como se usa en este documento, el termino «composicion» se refiere generalmente a cualquier producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, asf como cualquier producto que procede, directa o indirectamente, de combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades 50 especificadas. Ilustrativamente, las composiciones pueden incluir uno o mas vehfculos, diluyentes y/o excipientes. Los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse en una cantidad terapeuticamente efectiva, en formas de dosificacion convencionales, para los procedimientos descritos en el presente documento que incluyen uno o mas vehfculos, diluyentes y/o excipientes de los mismos. Tales composiciones de la formulacion pueden administrarse mediante una amplia variedad de vfas convencionales para los procedimientos descritos en el 55 presente documento y en una amplia variedad de formatos de dosificacion, utilizando procedimientos conocidos en la tecnica. En general, vease, Remington's Pharmaceutical Sciences, (16' ed. 1980). Se entendera que las composiciones descritas en el presente documento pueden prepararse a partir de compuestos aislados descritos en el presente documento o a partir de sales, soluciones, hidratos, solvatos y otras formas de los compuestos descritos en el presente documento. Tambien se entendera que las composiciones pueden prepararse a partir de diversas 60 formas amorfas, no amorfas, parcialmente cristalinas, cristalinas y/o otras formas morfologicas de los compuestos
descritos en el presente documento.
El termino «cantidad terapeuticamente efectiva», tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de compuesto activo o agente farmaceutico que provoca la respuesta biologica o medicinal en un sistema tisular, un 5 animal o un ser humano al que atiende un investigador, un veterinario, un medico u otro clfnico, que incluye el alivio de los sfntomas de la enfermedad o el trastorno que se esta tratando. En un aspecto, la cantidad terapeuticamente efectiva es aquella que puede tratar o aliviar la enfermedad o los sfntomas de la enfermedad en una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico. Sin embargo, se entendera que el uso diario total de los compuestos y composiciones descritos en el presente documento puede ser decidido por el medico 10 responsable dentro del alcance de los criterios medicos fundados. El nivel de dosis terapeuticamente efectiva especffico para cualquier paciente concreto dependera de una variedad de factores, incluyendo el trastorno que se esta tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto especffico empleado; la composicion especffica empleada; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion del compuesto especffico empleado; la duracion del 15 tratamiento; los farmacos usados en combinacion con, o simultaneamente a, el compuesto especffico empleado; y factores similares bien conocidos en la tecnica medica.
En una realizacion, los compuestos descritos en el presente documento se administran a un humano oralmente en una dosis de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 8 mg/kg o de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal del paciente. En otra realizacion, la dosis diaria para un humano adulto es de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 mg, que pueden administrarse una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa y similares. En otra realizacion, la dosis diaria para un humano adulto es de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 mg, que pueden administrarse una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa y similares. Tales dosis pueden administrarse una vez, dos veces o tres 25 veces al dfa. Las dosificaciones unitarias orales ilustrativas son 50, 100, 200 y 400 mg (unicas o divididas). Sin cenirnos a la teorfa, se cree que tales dosificaciones ilustrativas son suficientes para conseguir niveles plasmaticos de aproximadamente 1 pg/mL, que pueden ser suficientes para observar actividad bactericida de los compuestos descritos en el presente documento, tal como para neumococos susceptibles a macrolidos. Se sabe que, como se describe en el presente documento, los compuestos descritos en el presente documento, incluyendo CEM-101, 30 alcanzan una concentracion alta en los tejidos, tal como en los tejidos pulmonares. Sin cenirnos a la teorfa, en el presente documento se cree que los compuestos descritos en el presente documento, incluyendo CEM-101, pueden conseguir niveles tisulares que son al menos 10 veces la CMI para cepas, incluyendo cepas resistentes a macrolidos, tales como, pero no limitadas a, H. influenzae y H. influenzae resistente a AZI, S. pyogenes y S. pneumoniae resistentes a una cualquiera de AZI o CLR y otros organismos resistentes descritos en el presente 35 documento.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse como se describe en el presente documento o segun la solicitud de patente de Estados Unidos n.° de publicacion 2006/0100164 y la publicacion internacional PCT n.° WO 2009/055557.
40 En resumen, la sfntesis de cetolidos que contienen triazol comienza con la conocida preparacion en dos etapas del producto intermedio 4 de 12-acil-imidazol (Esquema I) a partir de CLR (2). El producto intermedio 4 se convierte en los 11,12-carbamatos cfclicos 5a-c mediante reaccion con los correspondientes aminoalcoholes conectados por 3, 4 o 5 carbonos. El tratamiento de 5a-c con cloruro de tosilo proporciona los tosilatos 6a-c. El desplazamiento del grupo tosilo con NaN3 genera los correspondientes compuestos azido 7a-c. La escision del azucar cladinosa de 7a-c a 8a- 45 8c se logra mediante tratamiento con HCl en MeOH. La oxidacion de Swern del grupo 3-hidroxi de 8a-c genera los correspondientes cetolidos protegidos 9a-c que, posteriormente, se desprotegen con metanol para proporcionar los cetolidos azido requeridos 10a-c, respectivamente. Estos compuestos azido se hicieron reaccionar con alquinos sustituidos terminalmente en presencia de yoduro de cobre en tolueno a 60 °C para proporcionar regioselectivamente los correspondientes [1,2,3]-triazoles 4-sustituidos 11a-18a, 11 b-18b y 11 c-18c.
50
La azida de los productos intermedios 10a-c se convierte en los [1,2,3]-triazoles 4-sustituidos por medio de una reaccion de cicloadicion con acetilenos sustituidos. Los anillos de triazol pueden formarse por medio de una reaccion de cicloadicion (1+3) de Huisgen entre una azida y un alquino que genera una mezcla de 1,4- y 1,5-regioisomeros como se representa en la Via A del Esquema II. Como alternativa, se puede seguir el procedimiento de Rostovtsev y 55 col.8 usando la adicion de un catalizador de CuI a la reaccion para producir selectivamente o exclusivamente el 1,4- regioisomero como se representa en la Via B del Esquema II.
La cadena lateral del anillo de triazol tambien se incorpora al sistema de anillo de la CLR. En una realizacion, se elige una cadena lateral de butilalquilo. Basandonos en resultados de la CMI in vitro, se sabe que muchos analogos 60 de las cadenas laterales de butilo en las series de cetolidos han mejorado la actividad antibacteriana. El producto
intermedio 7b se convierte directamente en el [1,2,3]-triazol 4-sustituido por medio de ciclacion catalizada por cobre con acetilenos sustituidos terminalmente, como se muestra en el Esquema III. Los grupos protectores de acetato de 19a-e se eliminan con LiOH en metanol para proporcionar los correspondientes [1,2,3]-triazoles 4-sustituidos 20a-e.
5 La sustitucion del hidrogeno de la posicion 2 con un fluor se logra mediante fluorinacion electrofilica de 9b (Esquema IV) usando Selectfluor®. El grupo azido del producto intermedio 22 se convierte en una serie de [1,2,3]-triazoles 4- sustituidos 23a-b mediante las condiciones estandar.
imagen2
OMe
[OMe
Cul, Tolueno
Tolueno
Esquema I
jhoAC2°’no
DMAP cat)
Cul
: ? '
h2n^oh
NaNj
Piridina
DMF
- Mr
[ OMe
o
5a<
Ba-c
uxidacion
de Swern
10a-c
11 18a-C
Esquema II
,N“N
Via A
Via B
Esquema
imagen3
5
Se describen los siguientes compuestos:
R
imagen4
O
Concentracion minima inhibitoria ( pg/mL)a
Entrada
R n S. aureus S. pneumoniae H. influenzae
29213 Eri-S
96:11480 Eri-R ( MLEb) 49619 Eri-S 163 Eri-R (MefA) 303 Eri-R (ermB) 49247 Eri- S
TEL
<0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 4
AZI
<0,125 >64 <0,125 >64 >64 2
11a
3 1 1 <0,125 <0,125 >64 >64
11b
4 <0,125 0,25 <0,125 <0,125 2 8
11c
5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 0,25 16
12a
Br 3 0,25 0,5 <0,125 <0,125 8 64
12b
4 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 8 8
12c
5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 1 16
13a
□ wCFl 3 1 2 <0,125 <0,125 16 >64
13b
4 0,25 0,25 <0,125 <0,125 8 8
13c
p 5 0,5 1 <0,125 0,5 2 64
14a
3 2 2 <0,125 0,5 >64 >64
14b
4 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 4
14c
5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 0,25 64
15a
O 3 2 2 <0,125 1 >64 >64
15b
4 <0,125 4 <0,125 2 64 64
15c
□ X 5 <0,125 0,25 <0,125 0,25 4 16
16a
□ 3 0,5 nP <0,125 <0,125 >64 16
16b
p* 4 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 2
16c
5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 0,25 8
17a
c-Q 3 1 1 <0,125 <0,125 >64 >64
17b
4 <0,125 <0,125 <0,12 <0,12 1 16
17c
□ P 5 0,25 0,5 <0,125 <0,125 2 32
18a
CU 3 1 2 <0,125 0,5 >64 >64
18b
4 1 2 <0,125 4 64 32
18c
5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 64 8
a Comite nacional de normas de laboratories clfnicos. Procedimientos de determinacion de sensibilidad antimicrobiana de bacterias que crecen aerobicamente, 6a ed.; Norma homologada: NCCLS Documento M7-A6, 2003.__________________________________________________
Se describen tambien los siguientes compuestos:
imagen5
5
Entrada
R S. aureus S. pneumoniae H. influenzae
25923 Eri-S RN220 49619 Eri-S 163 Eri-R (MefA) 303 Eri-R (ermB) 49247 Eri- S
TEL
<0,25 2 <0,125 <0,125 <0,125 4
20a
0,25 8 <0,0625 0,125 2 NP
20b
0,25 8 <0,0625 <0,06 1 NP
20c
P >=!/^nh2 1 8 <0,0625 0,5 2 NP
20d
hP v' Cl 1 8 <0,0625 0,5 2 NP
20e
□ <0,25 8 <0,0625 0,5 2 NP
imagen6
Tambien se describen los siguientes compuestos:
5
imagen7
Entrada
R S. aureus S. pneumoniae H. influenzae
29213 Eri-S
96:11480 Eri R ( MLEb) 49619 Eri-S 163 Eri- R (MefA) 303 Eri- R (ermB) 49247 Eri- S
TEL
<0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 4
AZI
SD <0,125 >64 <0,125 >64 >64
23a
<0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 2
23b (CEM- 101)
Jfx <0,06 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 2
En cada una de las realizaciones anteriores, el panel de cribado primario consistio en S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae relevantes (incluyendo cepas resistentes a AZI y TEL). Las CMI contra todos los patogenos se determinaron usando el procedimiento de microdilucion en caldo segun las directrices del NCCLS. Se encontro que 10 los compuestos descritos en el presente documento, tales como CEM-101, eran muy potentes, con CMI contra S. pneumoniae (3773) de <0,125 pg/mL y S. pyogenes (1850) de 0,5 pg/mL, en comparacion con 1 y 8 pg/mL para TEL, respectivamente. Se encontro que CEM-103 (20c), un analogo de CEM-101 que contiene la 3-O-cladinosa, era menos activo. Los cetolidos que contenfan triazol no heteroaromatico sustituido eran menos activos.
15 Los cetolidos se probaron contra cepas de S. aureus sensibles a eritromicina (Eri-S) y resistentes a eritromicina (Eri-
R) (29213 (Eri-S) y 96:11480 (Eri-R)), S. pneumoniae (49619 (Eri-S) y 163 y 303 (Eri-R)) y H. influenzae (49247 (Eri-
S) ) (Tablas 1-3). El procedimiento de microdilucion en caldo se uso para determinar las concentraciones mfnimas inhibitorias (CMI) contra todos los patogenos segun el Instituto de normas clfnicas y de laboratorio (CLSI, por sus siglas en ingles)).
20
La longitud de cadena de la cadena lateral de alquilo afectaba a la actividad (Tabla 1). Por ejemplo, el triazol sustituido con fenilo conectado por 3 carbonos 11a era menos activo contra S. aureus Eri-S y Eri-R y era inactivo contra S. pneumoniae 303 (ermB) Eri-R en las concentraciones probadas, mientras que los triazoles sustituidos con fenilo conectados por 4 y 5 carbonos correspondientes 11b y 11c eran mas activos contra estos organismos. Se 25 observo una tendencia similar para los triazoles sustituidos con 2-piridilo 14a-c, los triazoles sustituidos con 3- aminofenilo 16a-c y los triazoles sustituidos con 2,5-diclorofenoxi 17a-c.
El triazol sustituido con 2-piridilo conectado por 4 carbonos 14b y el triazol sustituido con 3-aminofenilo 16b posefan la potencia mas alta contra S. pneumoniae 303, teniendo ambos valores de CMI (<0,125 pg/mL) comparables a la
TEL. El cetolido que contenfa triazol sustituido con 3-piridilo conectado por 4 carbonos 15b era menos activo contra esta cepa (CMI de 64 pg/mL). En esta serie, se mejoro la actividad antibacteriana prolongando el conector de carbono a 5 atomos; por ejemplo, la CMI contra S. pneumoniae 303 para el compuesto 15c mejoro de 64 a 4 pg/mL. Se observo un efecto similar para el cetolido que contenfa benzotriazol 18c contra S. aureus, pero 18c segufa siendo 5 inactivo contra S. pneumoniae 303. Se entiende que un equilibrio entre la longitud del conector y la naturaleza de la sustitucion aromatica del triazol puede afectar a la actividad general contra S. pneumoniae y S. aureus resistentes a macrolidos.
Se observo una correlacion entre la longitud del conector y la actividad para H. influenzae (49247), donde la serie de 10 cetolidos mas potente tenia el triazol sustituido conectado a traves de una cadena de 4 carbonos (11b-14b, 16b, 17b) o 5 carbonos (15c, 18c). Resulta interesante que la serie aromatica mas potente contra H. influenzae era la 3- aminofenilo con un conector de 3, 4 o 5 carbonos (16a, 16b, 16c), que tenia CMI de 16, 2 y 8 pg/mL, respectivamente.
15 Los macrolidos que contenfan cladinosa en la posicion 3 fueron todos muy activos contra S. pneumoniae Eri-S (49619) (Tabla 2). Sin embargo, estos analogos eran menos potentes que la TEL contra cepas Eri-R. Las CMI eran significativamente superiores para los analogos que contenfan cladinosa con sustituyentes del triazol tanto 2-piridilo, 2-aminofenilo como 2,6-diclorofenilo que para los cetolidos correspondientes (20a, 20c y 20d frente a 14b, 16b y 17b). En cambio, la actividad antibacteriana se reestablecfa para los analogos de cetolido 15b (3-piridilo) y 18b 20 (benzotriazol) sustituyendo el ceto por el grupo cladinosa en los analogos 20b (3-piridilo) y 20e (benzotriazol). Las CMI mejoraron de 64 pg/mL para 15b y 18b a 1 y 2 pg/mL para 20b y 20e, respectivamente. Se observo tambien una tendencia de actividad similar para S. pneumoniae 163 (MefA) Eri-R.
EJEMPLOS DE COMPUESTOS
25
imagen8
Se calento una mezcla de 11,12-carbamato de 11-N-(4-azidobutil)-6-O-metil-5-(3-dimetilamina-4-desoxi-6-O- acetilglucopiranosil)-2-fluoro-3-oxo-eritronolido A (15 mg, 0,019 mmol), 6-etinilpiridin-2-ilamina (4,7 mg, 0,4 mmol), 30 Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 mL) a 70 °C. Tras 16 h, se concentro la mezcla y se sometio directamente a cromatograffa en gel de sflice (9:1, cloroformo: metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 14 mg del compuesto deseado. EM: M+ calculada para C44H66FN7O12 = 903,5; encontrada: M+H+ = 904,5.
imagen9
35
11,12-carbamato cfclico de 11-N-4-(3-aminofenil)-[1,2,3]triazol-1-il]-butil}-5-desosaminil-3-oxo-2-fluoro-eritronolido A (CEM-101). Se calento una mezcla de 11,12-carbamato de 11-N-(4-azidobutil)-6-O-metil-5-desosaminil-3-oxo-2- fluoro-eritronolido A (17 mg, 0,023 mmol), 3-etinilfenilamina (5,4 mg, 0,046 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 mL) a 70 °C. Tras 16 h, se concentro la mezcla y se sometio directamente a cromatograffa en gel de sflice (9:1,
cloroformo: metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 17 mg del compuesto deseado, EM M+ calculada para C43H65 FN6O10 = 844,47; encontrada: M+H+ = 845,5
imagen10
5
11,12-carbamato cfclico de 11-N-{4-[4-(6-aminopiridin-2-il)-[1,2,3]triazol-1-il]-butil}-5-desosaminil-3-oxo-2-fluoro- eritronolido A. Se calento una mezcla de 11,12-carbamato de 11-N-(4-azidobutil)-6-O-metil-5-desosaminil-3-oxo-2- fluoro-eritronolido A (15 mg, 0,02 mmol), 6-etinilpiridin-2-ilamina (4,7 mg, 0,4 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 mL) a 70 °C. Tras 16 h, se concentro la mezcla y se sometio directamente a cromatograffa en gel de 10 sflice (9:1, cloroformo: metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 14 mg del compuesto deseado OP1357. EM: M+ calculada para C42H64FN7O10 = 845,5; encontrada: M+H+ = 846,5.
imagen11
15 11,12-carbamato de 11-N-[4-(4-benzotriazol-1-ilmetil-[1,2,3]triazol-1-il)-butil]-6-O-metil-5-O-desosaminil-3-oxo- eritronolido A. Se calento una mezcla de 11,12-carbamato de 11-N-(4-azidobutil)-6-O-metil-5-O-desosaminil-3-oxo- eritronolido A (3 mg, 0,0039 mmol), 1-prop-2-inil-1H-benzotriazol (3 mg, 0,4 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 mL) a 80 °C. Tras 16 h, se concentro la mezcla y se sometio directamente a cromatograffa en gel de sflice (9:1, cloroformo: metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 3 mg del compuesto deseado. EM: M+ calculada para 20 C44H66N8O10 = 866,5; encontrada: M+H+ 867,5.
imagen12
11,12-carbamato de 11-N-[4-(4-benzotriazol-1-ilmetil-[1,2,3]triazol-1-il)-butil]-6-O-metil-5-micaminosil-3-oxo- 25 eritronolido A. Se calento una mezcla de 11,12-carbamato de 11-N-(4-azidobutil)-6-O-metil-5-micaminosil-3-oxo-
eritronolido A (3 mg, 0,004 mmol), 1-prop-2-inil-1H-benzotriazol (3 mg, 0,4 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 mL) a 80 °C. Tras 16 h, se concentro la mezcla y se sometio directamente a cromatograffa en gel de sflice (9:1, cloroformo: metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 3 mg del compuesto deseado. EM: M+ calculada para C44H66N8O11 = 882,5; encontrada: M+H+ = 883,5.
5
EJEMPLOS DE PROCEDIMIENTOS
EJEMPLO. Se comparan las actividades in vitro de CEM-101 con las de AZI, CLR, TEL y doxiciclina contra 10 aislados de C. pneumoniae y 10 cepas de C. trachomatis en celulas HEp-2. La CMI a la que el 50 % y 90 % de los 10 aislados de C. pneumoniae fueron inhibidos por CEM-101 fue 0,25 pg/mL (intervalo: de 0,25 a 1,0 pg/mL). La CMI a la que el 50 % y 90 % de las cepas de C. trachomatis fueron inhibidas fue 0,25 pg/ mL (intervalo: de 0,125 a 0,5 pg/mL). Las CMI90 para ambas, C. trachomatis y C. pneumoniae, contra AZI, CLR, TEL y doxiciclina fueron 0,125, 0,06, 0,06 y 0,06 pg/mL, respectivamente. Las CMI de CEM-101 fueron consistentes de aislado a aislado, variando por solo una o dos diluciones, lo que es especialmente impresionante dada la amplia distribucion 15 geografica de los aislados probados. Estos resultados indican que CEM-101, y los compuestos descritos en el presente documento, es un antibiotico efectivo para tratar C. trachomatis e infecciones del tracto respiratorio provocadas por C. pneumoniae.
EJEMPLO. Se recogieron 36 M. pneumoniae del tracto respiratorio de adultos y ninos con neumonfa entre 1992 y 20 2006. 2 aislados recogidos de ninos en Birmingham (AL) en 2005 fueron resistentes a macrolidos (CMI de AZI >32 pg/mL); ambas habfan mostrado que tenfan una mutacion A2063G en el dominio V del gen del ARNr. 5 M. genitalium incluyeron cepas de referencia obtenidas de los tractos urogenitales de pacientes en los Estados Unidos (3 aislados) y Dinamarca (2) aislados. Se obtuvieron 15 M. fermentans de los tractos respiratorio o urogenital de la coleccion de micoplasmas en los Institutos nacionales de la salud de Estados Unidos y de pacientes en Birmingham 25 (AL) entre 1992 y 2004. Se obtuvieron 13 M. hominis de muestras clfnicas del tracto urogenital o heridas entre 1994 y 2007. 2 aislados fueron resistentes a doxiciclina (CMI 8-16 pg/mL). Se obtuvieron 10 Ureaplasma parvum de muestras urogenitales entre 2002 y 2005. 7 fueron resistentes a doxiciclina (CMI 4-16 pg/mL). Se obtuvieron 10 U. urealyticum de diversas muestras de tracto urogenital, placentas o secreciones respiratorias neonatales entre 1990 y 2005. 4 fueron resistentes a doxiciclina (CMI 4-32 pg/mL).
30
Todos los aislados de micoplasma y ureaplasma fueron inhibidos por CEM-101 a concentraciones <0,5 pg/mL, lo que lo hace el compuesto mas potente probado de todos. Las CMI de CEM-101 para M. pneumoniae variaron de 0,000000063-0,5 pg/mL con CMI90 = 0,000125, lo que hace esta actividad 4 veces mayor que la de la AZI y 8 veces mayor que la de la TEL. El LZD fue inactivo contra M. pneumoniae, pero algunas M. fermentans y M. hominis 35 tuvieron CMI <1 mg/mL. 2 MP resistentes a macrolidos con AZI y TEL con CMI superiores a 32 pg/mL fueron inhibidas por CEM-101 a 0,5 pg/mL. Las CBM de CEM-101 fueron mas de 16 veces superiores a las CMI para 9 M. pneumoniae, lo que indica que el farmaco es bacteriostatico contra este organismo. CEM-101 fue activo contra todas las M. hominis y Ureaplasma spp. resistentes a doxiciclina. A excepcion de 2 M. pneumoniae resistentes a macrolidos, ningun aislado de cualquiera de las especies probadas tuvo una CMI superior a 0,063 pg/mL para CEM- 40 101.
Pruebas de CMI. Se disolvieron los polvos antimicrobianos segun las instrucciones del fabricante y se congelaron en alfcuotas de 1 mL que contenfan 2048 pg/mL. Farmacos probados incluidos: CEM-101, AZI, TEL, doxiciclina, levofloxacina y linezolid. Se preparo una dilucion de trabajo de cada farmaco en el dfa de cada ensayo basada en 45 los intervalos de CMI previstos para cada farmaco. Se realizaron diluciones seriadas antimicrobianas a la mitad en caldo 10B para Ureaplasma spp. y en caldo SP4 para Mycoplasma spp. en placas de microtitulacion de 96 pocillos. Para los macrolidos y cetolidos probados contra M. pneumoniae, se redujeron las diluciones a 0,000000063 pg/mL para medir el criterio de valoracion CMI para estos potentes agentes. Se anadieron 0,175 mL de inoculo de 104105 UCC/mL, obtenido mediante inoculacion de organismos a partir de solucion madre congelada de concentracion 50 conocida en caldo precalentado e incubado 2 h a 37 °C, a las diluciones de farmaco. Las placas se sellaron, se incubaron aerobicamente a 37 °C en aire y se examinaron diariamente hasta que se detecto un cambio de color en el control de crecimiento libre de farmaco. CMI = la menor concentracion de un farmaco en la que se inhibio el metabolismo de los organismos, como se detecta por la falta de cambio de color en el momento en que el control libre de farmaco muestra por primera vez cambio de color.
55
Control de calidad. Se verifico el inoculo de cada aislado mediante diluciones seriadas y recuentos en placa. Las cepas de control de calidad usadas para validar la exactitud de las CMI para los agentes antimicrobianos comparadores incluyeron M. pneumoniae (UAB-834), M. hominis (UAB-5155) y U. urealyticum (UAB-4817); todas ellas son aislados clfnicos de bajo numero de pases para los que se ha establecido un intervalo de CMI de 3 60 diluciones.
M. pneumoniae (36 aislados)
Intervalo de CMI (pg/mL) CMI50 (pg/mL) CMI90 (pg/mL)
CEM-101
<0,000000063-0,5 0,000032 0,000125
AZI
<0,000016->32 0,00025 0,0005
TEL
0,000031->32 0,00025 0,001
Doxiciclina
0,016-0,25 0,125 0,25
Levofloxacina
0,125-1 0,5 0,5
Linezolid
32-128 64 128
M. genitalium (5 aislados)
CEM-101
<0,000032 NA NA
AZI
<0,000032-0,005 NA NA
TEL
<0,00003-0,00025 NA NA
Doxiciclina
<0,008-0,031 NA NA
Levofloxacina
0,125-1 NA NA
Linezolid
4-128 NA NA
M. fermentans (15 aislados)
CEM-101
<0,008 <0,008 <0,008
AZI
0,125-1 0,5 0,5
TEL
0,002-0,031 <0,008 0,016
CLN
<0,008-0,063 0,016 0,031
Doxiciclina
0,016-0,5 0,125 0,5
Levofloxacina
<0,008-0,25 0,031 0,125
Linezolid
0,5-4 1 4
M. hominis (13 aislados)
CEM-101
0,002-0,008 0,004 0,008
AZI
0,5-4 4 2
TEL
0,125-0,5 0,25 0,5
CLN
<0,008-0,031 <0,008 0,016
Doxiciclina
0,008-0,016 0,125 8
Levofloxacina
0,125-0,5 0,25 0,5
Linezolid
1-8 2 4
U. parvum (10 aislados)
CEM-101
0,002-0,031 0,008 0,016
AZI
0,5-4 2 4
TEL
0,008-0,063 0,063 0,125
Doxiciclina
0,031-16 8 16
Levofloxacina
0,125-2 0,5 2
Linezolid
128->256 >256 >256
U. urealyticum (10 aislados)
CEM-101
0,004-0,063 0,008 0,031
AZI
0,5-4 2 4
TEL
0,016-0,25 0,063 0,25
Doxiciclina
0,031-32 1 16
Levofloxacina
0,5-2 0,5 1
Linezolid
256->256 >256 >256
5
Distribucion de la CMI de macrolidos para M. pneumoniae. Todos excepto dos de los aislados probados contra CEM- 101 mostraron una CMI de 0,0001 pg/mL o inferior. En cambio, mas de la mitad de todos los aislados probados contra AZI o TEL mostraron una CMI de 0,0001 pg/mL o superior.
10 Pruebas de CBM. Se probaron 9 M. pneumoniae para determinar las CBM para CEM-101. Se anadieron alfcuotas (30 pl) de cada pocillo que no habfa cambiado de color en el momento en que se leyo la CMI a 2,97 mL de caldo (dilucion 1:100) para garantizar que el farmaco estuviera diluido por debajo de la concentracion inhibitoria y asf permitir que los organismos vivos crecieran a niveles detectables. El control de crecimiento se subcultivo para garantizar la presencia de organismos viables en ausencia de farmaco. Los caldos se incubaron a 37 °C. CBM = 15 concentracion de antimicrobiano en la que no hubo crecimiento aparente por ausencia de cambio de color en el
caldo tras incubacion prolongada. Las CBM para las 9 M. pneumoniae fueron todas >16 veces mayores que las CMI correspondientes, lo que indica que CEM-101 es bacteriostatico contra este organismo.
EJEMPLO. Se desarrollo un modelo in vitro de detencion del crecimiento micobacteriano usando de Mycobacterium 5 bovis BCG. Cuando se transferfa un cultivo en crecimiento exponencial a un tubo evacuado, el crecimiento continuaba; sin embargo, el tratamiento con una fuente de oxido nftrico (DETA-NO 50 mM) detenfa el crecimiento inmediatamente. Crecimiento restaurado por aireacion. Cuando el periodo de detencion del crecimiento superaba 4 h, se producfa un periodo de retardo antes de que la aireacion pudiera restaurar el crecimiento. Este periodo de tiempo era maximo tras 16 h de detencion del crecimiento, momento en el que el retardo antes de la restauracion del 10 crecimiento era de 24 h. Sin cenirnos a la teorfa, en el presente documento se cree que estos periodos de retardo pueden indicar que era necesario un periodo de transicion para conseguir la detencion total del crecimiento y otro para la recuperacion totalmente de la detencion del crecimiento. Sin cenirnos a la teorfa, en el presente documento tambien se cree que la detencion del crecimiento inducida por DETA-NO fracaso a la hora de proteger de los efectos letales del shock anaerobio, que puede haber provocado lisis celular rapida de las celulas tanto en crecimiento como 15 con crecimiento detenido. Mientras que la detencion del crecimiento no tuvo efecto alguno sobre la accion letal de la rifampicina, redujo la letalidad de la fluoroquinolona de 4 a 20 veces. Dos fluoroquinolonas, moxifloxacina y gatifloxacina, fueron igualmente letales con celulas en crecimiento exponencial, pero la moxifloxacina fue 2 veces mas activa durante la detencion del crecimiento.
20 EJEMPLO. La alta potencia de CEM-101 contra Streptococcus pneumoniae, estreptococos p-hemolfticos y del grupo viridans, Staphylococcus spp. y enterococos se ha documentado en estudios de cribado temprano realizados usando procedimientos de referencia del Instituto de normas clfnicas y de laboratorio (CLSI). Puesto que los mecanismos y las ocurrencias de resistencia aumentan tan rapidamente que pueden comprometer a la clase de cetolidos mLEB, cuando se probaron subgrupos de organismos resistentes de tipo salvaje (TS) y 25 fenotfpicamente/genotfpicamente definidos, se evaluaron los efectos posantibiotico (EPA), la actividad bactericida (CBM y curvas de muerte) y las sinergias potenciales de CEM-101 con cinco clases de agentes antimicrobianos seleccionadas. Las determinaciones de la CBM para CEM-101, TEL y CLR usaron procedimientos del CLSI para 40 cepas (6 grupos de especies). Las CM usaron 8 cepas (6 grupos de especies). Los EPA se probaron (5 cepas) a 4X la concentracion durante 1 o 2 horas de exposicion; control de TEL. Los estudios de interaccion de farmacos 30 (sinergia) se realizaron en 20 cepas (7 S. aureus, 6 estreptococos p-hemolfticos y 7 S. pneumoniae) mediante el procedimiento del tablero de ajedrez. Se combino CEM-101 con cinco agentes (ceftriaxona, gentamicina, levofloxacina, trimetoprim/sulfametoxazol [TMP/SMX] y vancomicina), representando cada uno una clase antimicrobiana distinta.
35 La caracterizacion de las interacciones antimicrobianas en categorfas se definio como: sinergia completa = reduccion de cuatro veces o mas de los valores de CMI de ambos agentes; sinergia parcial = reduccion de cuatro veces o mas del valor de CMI para un agente y una reduccion de dos veces en la CMI del otro; aditiva = reduccion de dos veces de los valores de CMI de ambos agentes probados; antagonismo = aumento de cuatro veces o mas de los valores de CMI de ambos agentes; e indiferencia = sin reduccion de los valores de CMI de los agentes o 40 unicamente una reduccion o aumento de la CMI de un agente.
Las categorfas de interaccion de farmacos (sinergia) para CEM-101 se probaron en combinacion con otros antimicrobianos.
Sinergia
Cofarmaco
Completa Parcial Aditiva Indiferente Antagonismo Indeterminada
CRO
0 2 5 12 0 1
GEN
2 2 4 12 0 0
LEV
0 0 3 17 0 0
TMP/SMX
0 2 4 14 0 0
VAN
0 1 6 13 0 0
Todos
2 7 22 68 0 1
45
La categorfa de interaccion mas comun observada para los estudios de combinacion del farmaco CEM-101 fue la indiferencia (68 ocurrencias), seguida de efectos aditivos (22) y de sinergia parcial (7). La sinergia solo se observo con CEM-101 y gentamicina para dos cepas de S. pneumoniae. Las combinaciones de CEM-101 con gentamicina, ceftriaxona, tMp/SMX, vancomicina y levofloxacina presentaron interacciones favorables (sinergia completa/parcial 50 o aditiva; 31 % de todos los resultados) cuando se probaron cepas de S. pneumoniae; pero predominaron las interacciones indiferentes entre las S. aureus y S. pyogenes probadas. Ninguna de las combinaciones evaluadas demostro antagonismo.
Estudios de CBM y curvas de muerte: se probo la CMI de un total de 40 cepas (10 S. pneumoniae, 10 S. aureus y 5 de cada una de estreptococos p-hemoltticos, estreptococos del grupo viridans, estafilococos coagulasa negativos [ECoN] y enterococos) seguida de determinaciones de la CBM usando los procedimientos del CLSI (intervalo de CMI 5 y CBM, 0,008-16 pg/mL). La concentracion mas baja de un agente probado que mato >99,9 % del inoculo inicial se definio como el criterio de valoracion de la CBM (Tablas 2 y 3). Se realizo el estudio de la actividad bactericida como muerte en funcion del tiempo para CEM-101, TEL, CLR y AZI en ocho cepas seleccionadas segun los procedimientos descritos por Moody & Knapp, NCCLS M21-A3 y M26-A. Los compuestos se probaron a 2X, 4X, 8X la CMI y los recuentos de colonias se realizaron a T0, T2, T4, T8 y T24.
10
CEM-101 presento bajas relaciones CBM/CMI (<4) para BSA, SA y estafilococos coagulasa negativos; y una potencia 2 veces mayor que la TEL. SA, los enterococos y algunas cepas resistentes (R) a macrolidos/CLN tuvieron relaciones mayores. Los resultados de las curvas MC mostraron una actividad bactericida mayor y mas rapida (dependiente de la concentracion) para CEM-101 en comparacion con TEL. Los EPA para CEM-101/TEL (horas) 15 fueron: SA (2,3/2,6 horas), SPN (3,0/1,9), BSA (6,1/3,4), H. influenzae (3,7/1,2), M. catarrhalis (5,3/4,0). Los resultados de la interaccion con CEM-101 mostraron no antagonismo y efectos aditivos o indiferentes dominantes. CEM-101 presento actividad bactericida contra varias especies gram-positivas con tasas y magnitud mayores que la TEL. El EPA para CEM-101 fue 2,3-6,1 y 3,7-5,3 horas para cepas gram-positivas y gram-negativas, respectivamente. No se encontro antagonismo alguno en los analisis de sinergia; con inhibicion mejorada mas 20 destacada para las combinaciones con CRO, GEN y TMP/SMX.
Distribucion de aislados segun la relacion CBM/CMI para CEM-101, TEL, CLR y AZI
Organismo/Agente antimicrobiano (n.° probado)
N.° de cepas con valor CBM/CMI de:
1
2 4 8 16 >32
S. pneumoniae (10)
CEM-101
3 5 0 0 0 2
Telitromicina
2 6a 0 0 0 2
Claritromicina
2 3 1 0 0 b
Azitromicina
2 4 0 0 0 b
Estreptococos p-hemoltticos (5)
CEM-101
0 1 2 0 0 2
Telitromicina
0 1 1 1 0 2
Claritromicina
0 0 1 1 0 2b
Azitromicina
0 0 0 0 2 2b
Estreptococos del grupo viridans (5)
CEM-101
3 0 1 0 0 1
Telitromicina
2 1 1 0 0 1
Claritromicina
0 0 1 0 0 3b
Azitromicina
0 0 0 0 1 3b
S. aureus (10)
CEM-101
1 0 0 0 1 8
Telitromicina
0 0 0 0 0 10
Claritromicina
0 0 0 0 0 6b
Azitromicina
0 0 0 0 0 6b
Estafilococos coagulasa neg. (5)
CEM-101
1 1 0 3 0 0
Telitromicina
0 0 0 0 2 3
Claritromicina
0 0 0 0 0 4b
Azitromicina
0 0 0 0 0 4b
Enterococcus spp. (5)
CEM-101
0 0 0 0 0 5
Telitromicina
0 0 0 0 0 5
Claritromicina
0 0 0 0 0 2b
Azitromicina
0 0 0 0 0 2b
a. Incluye seis aislados con una CMI de <0,008 pg/mL y una CBM de 0,015 pg/mL (comparaciones fuera de escala).
b. La CBM no se evaluo en aislados con resultados de CMI a nivel resistente.
CEM-101 mostro actividad bactericida rapida (reduccion de >3 log 10 UFC/mL) contra cepas susceptibles a macrolidos de S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae, S. pyogenes (solo a 8X la CMI) y estreptococos del grupo viridans, asf como contra un S. pyogenes resistente a macrolidos. CEM-101 produjo una mayor reduccion de 5 UFC/mL y una muerte mas rapida en comparacion tanto con TEL como con los macrolidos CLR y AZI.
Resumen de los resultados de las curvas de muerte en funcion del tiempo.
Organismo
Agente antimicrobiano Actividad antimicrobiana
S. aureus
CEM-101 Bactericida a 2X, 4X, 8X
(ATCC 29213)
Telitromicina Bactericida solo a 8X
Claritromicina Bactericida solo a 8X
Azitromicina Bactericida solo a 8X
S. epidermidis
CEM-101 Bactericida a 2X, 4X, 8X
(095-2777A)
Telitromicina Estatico
Claritromicina Estatico
Azitromicina Estatico
E. faecalis
CEM-101 Estatico
(ATCC 29212)
Telitromicina Estatico
Claritromicina Estatico
Azitromicina Estatico
S. pneumoniae
CEM-101 Bactericida a 2X, 4X, 8X
(ATCC 49619)
Telitromicina Bactericida a 2X, 4X, 8X
Claritromicina Bactericida a 2X, 4X, 8X (muerte lenta)
Azitromicina Bactericida a 2X, 4X, 8X (muerte lenta)
S. pneumoniae
CEM-101 Estatico
(075-241B)
Telitromicina Estatico
S. pyogenes
CEM-101 Bactericida solo a 8X
(117-1612A)
Telitromicina Bactericida solo a 8X (muerte lenta)
Claritromicina Bactericida solo a 8X (muerte lenta)
Azitromicina Bactericida solo a 8X (muerte lenta)
S. pyogenes
CEM-101 Bactericida a 2X, 4X, 8X
(088-11708A)
Telitromicina Bactericida a 2X, 4X, 8X (muerte lenta)
S. mitis
CEM-101 Bactericida a 2X, 4X, 8X
(112-1885A)
Telitromicina Bactericida a 2X, 4X, 8X
Claritromicina Bactericida solo a 8X (muerte lenta)
Azitromicina Bactericida a 4X y 8X (muerte lenta)
10 CEM-101 presento actividad bactericida cuando se probo contra estreptococos susceptibles a macrolidos, ECoN y S. pneumoniae resistente a macrolidos y susceptible a CLN. Las relaciones CBM/CMI para CEM-101 pueden ser altas para S. aureus, pero algunas cepas mostraron resultados de CBM que permanecfan dentro del intervalo de concentraciones susceptible.
15 Pruebas de EPA: los valores del EPA para CEM-101 y TEL se determinaron usando procedimientos establecidos que son consistentes con los recomendados por Craig y Gudmundsson. Ambos agentes antimicrobianos se probaron contra cada aislado a 4X y 8X la CMI. Los recuentos de colonias se realizaron en el momento preexposicion microbiana T0) y tras una o dos horas posexposicion microbiana (T1 o T2). Tras «diluir» los agentes antimicrobianos (1:1000), se realizaron recuentos de colonias cada hora hasta que se aprecio turbidez (hasta 10 20 horas posdilucion) para determinar la duracion del EPA. Los patogenos gram-positivos y gram-negativos probados fueron los siguientes: S. aureus ATCC 29213; H. influenzae ATCC 49247; S. pneumoniae ATCC 49619; S.
pyogenes WT (177-1612A) y M. catarrhalis WT (117-10142A).
Resultados del EPA para CEM-101 en comparacion con TEL medido en horas.
Concentracion antimicrobiana
S. aureus ATCC 29213 S. pneumoniae ATCC 49619 S. pyogenes 117-1612A H. influenzae ATCC 49247 M. catarrhalis 117-10142A
CEM-101 (4X la CMI)
2,3 3,0 6,1 3,2 6,3
Telitromicina (4X la CMI)
2,6 1,9 3,4 1,2 4,0
Exposicion (horas)
2 1 2 1 2
5
Tras dos horas de exposicion, el EPA de CEM-101 (2,3 horas) fue similar al de la TEL (2,6 horas) cuando se probaron contra S. aureus a un valor de 4X la CMI. Aumentando la concentracion durante la exposicion a 8X la CMI, el EPA de CEM-101 se prolongo a 3,9 horas (datos no mostrados). El EPA de CEM-101 probados contra S. pneumoniae y S. pyogenes fue de 3,0 y 6,1 horas, en comparacion con las 1,9 y 3,4 horas para TEL, 10 respectivamente. El EPA de CEM-101 contra patogenos gram-negativos tambien favorecio al agente nuevo frente al cetolido mas antiguo.
Los compuestos descritos en el presente documento muestran un EPA dependiente de la concentracion y exposicion significativo contra patogenos gram-positivos, como se muestra mediante CEM-101 (EPA promedio, 3,8 15 horas) y gram-negativos (EPA promedio, 4,5 horas) habitualmente asociados a ITR-EH e ICTB no complicadas. En general, el EPA de CEM-101 fue mas duradero que el de la TEL.
EJEMPLO. Actividad sobre clamidia. Se proporcionaron CEM-101, TEL, AZI, CLR y doxiciclina como polvos y se solubilizaron segun las instrucciones de los fabricantes. Se hicieron suspensiones de los farmacos frescas cada vez 20 que se realizaba un ensayo.
C. pneumoniae: los aislados de C. pneumoniae probados incluyeron una cepa de referencia (TW 183), 9 aislados de ninos y adultos de los Estados Unidos con neumonfa (AR39, t2023, T2043, W6805, CWL 029, CM-1), un aislado de un nino de Japon con neumonfa (J-21) y 2 cepas de muestras de lavado broncoalveolar de pacientes con infeccion 25 por el virus de la inmunodeficiencia humana y neumonfa de los Estados Unidos (BAL15 y BAL16).
C. trachomatis: 10 aislados de C. trachomatis, incluyendo aislados estandar de ATCC (E-BOUR, F-IC-CAL3, C- HAR32, J-UW-36, L2434, D-UW-57kx, B- HAR-36) y aislados clfnicos recientes (N18(cervical), N19(cervical), 7015(ojo de lactante)).
30
Pruebas de susceptibilidad in vitro: se realizaron pruebas de susceptibilidad de C. pneumoniae y C. trachomatis en cultivo celular usando celulas HEp-2 que crecieron en placas de microtitulacion de 96 pocillos. Cada pocillo se inoculo con 0,1 mL de la cepa probada diluida para producir de 103 a 104 UFI por mL, se centrifugo a 1700 x g durante 1 h y se incubo a 35 °C durante 1 h. Los pocillos se aspiraron y se recubrieron con 0,2 mL de medio que 35 contenfa 1 pg de cicloheximida por mL y se realizaron diluciones seriadas a la mitad del farmaco de prueba.
Se inocularon placas duplicadas. Tras incubacion a 35 °C durante 48-72 h, se fijaron los cultivos y se tineron para inclusiones con anticuerpo conjugado con fluorescefna para el antfgeno del genero lipopolisacarido (Pathfinder, Kallestad Diagnostics, Chaska, Minn). La concentracion minima inhibitoria (CMI) es la concentracion mas baja de 40 antibiotico a la que no se vieron inclusiones. La concentracion bactericida minima (CBM) se determino aspirando el medio que contenfa antibiotico, lavando los pocillos dos veces con solucion salina tamponada con fosfato y anadiendo medio libre de antibiotico. Los cultivos se congelaron a -70 °C, se descongelaron, se pasaron sobre celulas nuevas, se incubaron durante 72 h y, a continuacion, se fijaron y tineron como se indico anteriormente. La CBM es la concentracion mas baja de antibiotico que deriva en ausencia de inclusiones tras el pase. Todas las 45 pruebas se realizaron por triplicado.
Actividades de CEM-101 y otros antibioticos contra 10 aislados de C. pneumoniae
Farmaco
CMI (pg/mL) CBM (pg/mL)
Intervalo
50 % 90 % Intervalo 90 %
CEM-101
0,25-1,0 0,25 0,25 0,25-1,0 0,25
Telitromicina
0,015-0,25 0,06 0,06 0,015-0,25 0,06
Azitromicina
0,015-0,125 0,125 0,125 0,015-0,125 0,125
Claritromicina
0,015-0,125 0,06 0,06 0,015-0,125 0,06
Doxiciclina
0,015-0,06 0,06 0,06 0,015-0,06 0,06
Actividades de CEM-101 y otros antibioticos contra 10 aislados de C. trachomatis
Farmaco
CMI (pg/mL) CBM (pg/mL)
Intervalo
50 % 90 % Intervalo 90 %
CEM-101
0,125-0,5 0,25 0,25 0,125-0,5 0,25
Telitromicina
0,015-0,25 0,06 0,06 0,015-0,25 0,06
Azitromicina
0,015-0,125 0,125 0,125 0,015-0,125 0,125
Claritromicina
0,015-0,125 0,06 0,06 0,015-0,125 0,06
Doxiciclina
0,015-0,06 0,06 0,06 0,015-0,06 0,06
5
Los resultados de este estudio demostraron que CEM-101 tiene una actividad in vitro contra C. trachomatis y C. pneumoniae comparable a otros macrolidos y cetolidos.
EJEMPLO. Distribucion tisular. CEM-101 se absorbio y distribuyo bien en el tejido. En la rata a 250 mg/kg/d, las 10 concentraciones medias en pulmon e hfgado de CEM-101 fueron 17 y 15 veces superiores a las plasmaticas. Las concentraciones en pulmon e hfgado fueron 503 y 711 veces superiores a las concentraciones plasmaticas a la dosis de 200 mg/kg/d en monos. Las concentraciones de CEM-101 en el corazon fueron significativamente inferiores a los niveles encontrados en el pulmon o hfgado, con niveles 5 y 54 veces superiores a las concentraciones plasmaticas en rata y mono, respectivamente.
15
EJEMPLO. Actividad de CEM-101 contra aislados invasivos de N. meningitidis (NM) de una coleccion a escala mundial. La colonizacion de la nasofaringe (NF) por NM puede llevar a enfermedad meningococica invasiva. Se uso quimioprofilaxis para erradicar la colonizacion de NF e impedir la transmision a contactos no inmunes. En el presente documento se describe la determinacion de la actividad de CEM-101 probado contra aislados clfnicos invasivos de 20 NM. Se recogieron 62 aislados (91,9 % de cultivo sangufneo) de NM de 29 centros medicos de Norteamerica, Sudamerica y Europa (1997-2008). Se probo la susceptibilidad (S) de las cepas a CEM-101 y 10 comparadores que inclman p-lactamicos, fluoroquinolonas (FQ), macrolidos y otras tres clases mediante procedimientos de microdilucion en caldo del CLSI. Se realizo identificacion serologica para los serogrupos (SG) B, C, Y y W135.
25 La susceptibilidad a penicilina fue del 82.3 %, sin detecion de cepas resistentes (R). Todos los aislados fueron susceptibles a ceftriaxona, AZI, minociclina y rifampina. Los aislados fueron susceptibles a FQ (<0,015 pg/mL); sin embargo, 13 cepas tuvieron susceptibilidad reducida al acido nalidfxico (CMI >8 pg/mL), que puede correlacionarse con menor susceptibilidad a FQ. La resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol (T/S) fue del 59,7 %. Entre los agentes de la clase mLEB, CEM-101 fue el mas activo (CMI90, <0,015 pg/mL) en comparacion con la TEL (0,03 pg/mL), AZI y 30 CLR (0,12 pg/mL) y eritromicina (0,25 pg/mL). Las tasas de prevalencia (%) de los SG fueron C (41,7), B (38,3), Y (16,7) y W135 (3,3). CEM-101 fue el compuesto mas activo probado contra cepas de NM mLEB (todas las CMI, <0,06 pg/mL) con una potencia >2 a 32 veces superior a agentes de otra clase. CEM-101 fue activo contra aislados de NM no-S a p-lactamicos y T/S.
CMI (pg/mL)
Agente antimicrobiano
50 % 90 % Intervalo % de susc.a % de res.a
CEM-101
<0,015 <0,015 <0,015-0,06 b -
TEL
<0,015 0,03 <0,015-0,12 - -
AZI
0,06 0,12 <0,015-0,12 100,0 -
CLR
0,03 0,12 <0,015-0,25 - -
Eritromicina
0,12 0,25 0,03-0,5 - -
Penicilina
0,03 0,12 <0,015-0,25 82,3 0,0
Ceftriaxona
<0,015 <0,015 <0,015 100,0 -
Ciprofloxacina
<0,008 <0,008 <0,008-0,015 100,0 0,0
Levofloxacina
<0,008 <0,008 <0,008-0,015 100,0 0,0
Minociclina
0,12 0,12 <0,008-0,25 100,0 -
Rifampina
0,015 0,06 <0,008-0,12 100,0 0,0
Trimetoprim/sulfametoxazol
0,5 2 <0,06-4 37,1 59,7
a. Criterios de susceptibilidad basados en el CLSI (M100-S19, 2009).
b. No se han propuesto criterios de susceptibilidad, pero la AZI a <2 pg/mL se considera
susceptible.__________________________________________________________________
EJEMPLO. Capacidad de CEM-101 para seleccionar clones de S. pyogenes resistentes mediante el procedimiento multietapa. Se ha informado de que los S. pyogenes retienen la susceptibilidad a p-lactamicos, pero, a veces, son resistentes a macrolidos. La TEL es activa contra todos los genotipos de S. pyogenes resistentes a macrolidos 5 excepto erm(B). En el presente documento, se ha descubierto que CEM es de 2 a 4 veces mas activo que la TEL. En el presente documento, se describe la capacidad de CEM, AZI, CLR, TEL y CNL probada para seleccionar clones de S. pyogenes resistentes en 5 cepas con resistotipos variables.
Se probo una cepa de cada uno de los siguientes: susceptible a macrolidos, erm(B), mef(A), erm(A), mutacion en la 10 protefna ribosomica L4. Para las pruebas de CMI se uso macrodilucion segun el CLSI. Se realizaron diariamente pases seriados en caldo de Mueller-Hinton (MHB, por sus siglas en ingles) + 5 % de sangre de caballo lisada para cada cepa a concentraciones de farmaco subinhibitorias, tomando para cada pase posterior un inoculo del tubo 1-2 diluciones por debajo de la CMI que coincidfa con la turbidez de un control de crecimiento. Se continuaron los pases diarios hasta que la CMI aumento >4 veces (max. 50 pases). Los clones resistentes se subcultivaron 10x en medio 15 libre de farmaco para probar la estabilidad de la resistencia seleccionada. Se confirmo identidad entre clones parentales y resistentes mediante EGCP y se identificaron los fenotipos resistentes a macrolidos mediante RCP.
Las CMI parentales (pg/mL) fueron: CEM-101, 0,008-1; AZI, 0,06-4; CLR, 0,03-4; TEL, 0,03-8 y CLN, 0,06 (1 cepa con CMI de AZI, ClR y cLn >64 pg/mL no se probo). Las CMI de CEM-101 aumentaron tras 18-43 dfas en 3/5 20 cepas, subiendo de 0,03-1 pg/mL (parentales) ^ 0,25-8 pg/mL (clones resistentes). Las CMI para 2 de los clones no subieron por encima de 0,25 pg/mL cuando se continuaron los pases durante el plazo maximo de 50 dfas. La AZI tenia clones resistentes tras 5-35 dfas en 3/4 cepas probadas, con CMI que subfan de 0,06-4 pg/mL (parentales) ^ 1->64 pg/mL (clones R). La CLR tenia clones resistentes tras 6 dfas en 1/4 cepas probadas, con CMI que subfan de 0,5 pg/mL (parental) ^ >64 pg/mL (clon resistente). La TEL tenia clones resistentes tras 6-22 dfas en 2/4 cepas 25 probadas, con CMI que subfan de 0,03-8 pg/mL (parentales) ^ 0,25->64 pg/mL (clones resistentes). La CLN tenia clones resistentes tras 34-43 dfas en 2/3 cepas probadas, con CMI que subfan de 0,06 pg/mL (parentales) ^ 0,5- >64 pg/mL (clones resistentes). En 2 de los 3 clones resistentes con CEM-101 [parentales erm(A), L4], las CMI fueron de 0,25 pg/mL y, unicamente en la 1 cepa con erm(B), la CMI de CEM-101 subio de 1-8 pg/mL.
30 EJEMPLO. Capacidad de CEM-101 para seleccionar clones neumococicos resistentes (R) mediante el procedimiento multietapa. Las cepas de S. pneumoniae resistentes a farmacos se dan a escala mundial. En el presente documento, se ha descubierto que CEM-101 es de 2 a 4 veces mas activo que la TEL contra neumococos resistentes a macrolidos. En el presente documento, se describe la capacidad de CEM probada para seleccionar clones de S. pneumoniae resistentes en comparacion con AZI, CLR, TEL y CLN en 8 cepas neumococicas con 35 resistotipos variables.
Se probo una cepa de cada uno de los siguientes: susceptible a macrolidos, erm(B), mef(A), ermB + mefA, erm(A), mutaciones en la protefna ribosomica L4, L22 y ARNr 23S. Para las pruebas de CMI se uso macrodilucion segun el CLSI. Se realizaron diariamente pases seriados en MHB + 5 % de sangre de caballo lisada para cada cepa a 40 concentraciones de farmaco subinhibitorias, tomando para cada pase posterior un inoculo del tubo 1-2 diluciones < CMI que coincidfa con la turbidez de un control de crecimiento. Se continuaron los pases diarios hasta que la CMI aumento >4 veces (min. 14, max. 50 pases). Los clones resistentes se subcultivaron 10X en medio libre de farmaco para probar la estabilidad de la resistencia seleccionada. Se confirmo identidad entre clones parentales y resistentes mediante EGCP y se identificaron los fenotipos resistentes a macrolidos mediante RCP.
45
Las CMI parentales (pg/mL) fueron: CEM-101, 0,004-1; AZI, 0,03-8; CLA, 0,016-16; TEL, 0,004-0,5 y CLI, 0,016-1 (cuatro cepas con AZI, 2 CLR, 2 CLN de CMI >64 pg/mL no se probaron). Las CMI de CEM-101 aumentaron tras 1443 dfas en las 8 cepas probadas. Para 7 cepas, las CMI subieron de 0,004-0,03 pg/mL (parentales) ^ 0,060,5 pg/mL (clones resistentes) en 14-43 dfas. Para la octava cepa, que contenfa erm(B) + mef(A), las CMI subieron 50 de 1 pg/mL (parental) ^ 32 pg/mL (clon resistente) en 18 dfas. La AZI tenia clones resistentes tras 14-29 dfas en 3/4 cepas, con CMI que subfan de 0,03-2 pg/mL (parentales) ^ 0,5->64 pg/mL (clones resistentes). La CLR tenia clones resistentes tras 14-49 dfas en 5/6 cepas, con CMI que subfan de 0,03-16 pg/mL (parentales) ^ 16- >64 pg/mL (clones resistentes). La TEL tenia clones resistentes tras 14-38 dfas en 5/8 cepas, con CMI que subfan
de 0,004-0,5 pg/mL (parentales) ^ 0,06->64 pg/mL (clones resistentes). La CLN tenia clones resistentes tras 14-43 dias en 2/5 cepas, con CMI que subian de 0,03-0,06 pg/mL (parentales) ^ 0,25->64 pg/mL (clones resistentes). CEM-101 produjo clones con CMI superiores en las 8 cepas, pero 7 de 8 tuvieron clones con CMI de CEM-101 <0,5 pg/mL y, unicamente en la 1 cepa con erm(B) + mef(A) con una CMI parental = 1 pg/mL, se encontro un clon 5 resistente con una CMI = 32 pg/mL.
EJEMPLO. Se usaron macrofagos THP-1 humanos. La acumulacion se midio mediante ensayo microbiologico. Se determino la actividad intracelular contra S. aureus fagocitado (ATCC 25923; CMI: CEM-101, 0,125 mg/L; AZI, 0,5 mg/L) usando una estrategia de dosis-respuesta (AAC 2006;50:841-51). Se usaron verapamilo (100 pM) y 10 gemfibrozilo (250 pM) como inhibidores de la glicoproteina P y la PMR, respectivamente (AAC, 2007;51:2748-57).
Las acumulaciones y actividades tras incubacion de 24 h, con y sin inhibidores de los transportadores de eflujo, se muestran en la tabla siguiente, en la que Cc/Ce es la relacion de concentracion celular a extracelular aparente y Emax es la maxima reduccion de UFC intracelulares en comparacion con el inoculo posfagocitosis (calculada a partir 15 de regresion no lineal [sigmoidea] de experimentos de respuesta dosis-efecto).
Condicion
AZI CEM-101
Cc/Ce1 (24 h)
Actividad intracelular (A log UFC a 24 h) Cc/Ce1 (24 h) Actividad intracelular (A log UFC a 24 h)
Dosis estatica (mg/L)
E . 2 max Dosis estatica (mg/L) E . 2 max
control
127,7 ± 23,5 ~ 7,0 0,10 ± 0,09 268,1 ± 7,1 ~ 0,02 -0,85 ± 0,23(b)
Verapamilo
216,37 ± 46,6 (a) ~ 0,2 -0,37 ± 0,15 290,2 ± 12,9 ~ 0,03 -0,59 ± 0,22(b)
Gemfibrozilo
129,12 ± 2,69 ~ 3,8 -0,12 ± 0,20 308,2 ± 47,8 ~ 0,03 -0,73 ± 0,20(b)
la)Estadisticamente significativo tanto de control como de gemfibrozilo;lb)no estadfsticamente significativo._________________________________________________________________
EJEMPLO. Actividad intracelular de los antibioticos. Se determino la actividad antibiotica contra la cepa ATCC 25923 de S. aureus intrafagocitaria. Se realizaron estudios dosis-respuesta completos para evaluar el impacto del eflujo 20 activo en la modulacion de la actividad intracelular de CEM-101 y AZI contra S. aureus intrafagocitario (cepa ATCC 25923 [CMI: CEM-101, 0,125 mg/L; AZI, 0,5 mg/L]. Los antibioticos se compararon a las 24 h en cuanto a: (i) su concentracion estatica relativa (Cs) y (ii) su eficacia maxima relativa (E). Mientras que el verapamilo (pero no el gemfibrozilo) aumenta la actividad intracelular de la AZI, ningun inhibidor tiene un efecto significativo sobre la actividad de CEM-101, lo que sugiere que este ultimo, a diferencia de la AZI, no es un sustrato de los 25 correspondientes transportadores eucariotas.
EJEMPLO. Acumulacion celular de antibioticos. Se midio el contenido celular de macrolidos en macrofagos THP-1 mediante ensayo microbiologico usando S. aureus ATCC 25923 como organismo de prueba. Se ensayaron en paralelo las proteinas celulares usando el procedimiento de Folin-Ciocalteu/Biuret. El contenido de macrolidos 30 asociado a las celulas se expreso en funcion del contenido de proteina celular total y se convirtio en concentraciones aparentes usando un factor de conversion de 5 pL por mg de proteina celular (como se usa habitualmente para celulas cultivadas).
Primero, se midio la acumulacion celular de CEM-101 en comparacion con la de AZI en celulas THP-1, FIG. 5 (panel 35 A). A las 24 h, ambos antibioticos se concentran en grandes cantidades en las celulas, pero con un valor superior (Cc/Ce) para CEM-101. En una segunda etapa, se investigo si CEM-101 es un sustrato de la GpP o los transportadores de eflujo de PMR, FIG. 5 (panel B). Usando un inhibidor de la GpP (verapamilo) o las PMR (gemfibrozilo), no se observan variaciones significativas de la acumulacion celular de CEM-101, mientras que el verapamilo aumenta significativamente la acumulacion celular de AZI.
40
La absorcion de CEM-101 fue lineal a lo largo del tiempo, alcanzando niveles de acumulacion de aproximadamente 375 veces en 24 h (AZI, 160X, CLR, 30X, TEL, 21X). La acumulacion se suprimio mediante pH acido o adicion del ionoforo de protones monensina, pero no se vio modificada por el verapamilo o gemfibrozilo (inhibidores preferentes de la GpP y PMR, respectivamente). El panel B muestra que la acumulacion de CEM-101 y AZI se reducfa cuando 45 los experimentos se llevaban a cabo a pH acido, produciendose el cambio practicamente en su totalidad cuando el pH se llevaba de 7 a 6. El panel C muestra que la monensina, que se sabe que reduce la acumulacion celular de
muchas bases organicas debiles, tambien suprimfa casi completamente la acumulacion tanto de CEM-101 como de AZI. En cambio, el verapamilo, un inhibidor del transportador de eflujo de glicoprotefna P (GpP, tambien conocida como PMR1), aumentaba la acumulacion de AZI sin afectar a la de CEM-101, mientras que el gemfibrozilo, un inhibidor de las protefnas multirresistentes (PMR) y otros transportadores de aniones organicos, no afectaba a 5 ninguno de los compuestos. Ni el verapamilo ni el gemfibrozilo afectaron a la acumulacion de TEL o CLR (datos no mostrados). Se examino el eflujo de CEM-101 desde celulas incubadas con 10 mg/L de CEM-101 durante 1 h y, a continuacion, transferidas a medio libre de farmaco. El eflujo continuo de forma bimodal, siendo la mitad del farmaco asociado a las celulas liberado en aproximadamente 10 min, seguido de una fase de liberacion lenta de varias horas (datos no mostrados).
10
EJEMPLO. Los macrolidos se acumulan en celulas eucariotas y se consideran ventajosos para el tratamiento de infecciones intracelulares. Los cetolidos son activos contra organismos resistentes a eritromicina. La acumulacion celular y la actividad intracelular de CEM-101 hacia las formas intracelulares de Staphylococcus aureus (S. a.), Listeria monocytogenes (L. m.) y Legionella pneumophila (L. p.) en comparacion con AZI, CLR y TEL se muestra en 15 la tabla siguiente.
CMIa O (/) O Emax
CEM-101
S. a.
0,06 0,022 -0,86
L. m.
0,004 0,11 -0,66
L. p.
0,004 0,018 -1,03
AZI
S. a.
0,5 >50 0,04
L. m.
1 11,6 -0,81
L. p.
0,016 2,90 -0,83
CLR
S. a.
0,5 0,84 -0,18
L. m.
L. p.
0,007 0,12 -0,71
TEL
S. a.
0,25 0,63 -0,29
L. m.
L.p.___________
0,007 0,06 -0,63
a mg/L; b concentracion estatica (mg/L) a 24 h; c A log^UFC a 24 h en comparacion con el inoculo posfagocitosis
EJEMPLO. Se determinaron las CMI y las actividades extracelulares de los antibioticos en MHB a pH tanto neutro como acido. Se determino la actividad intracelular contra S. aureus (ATCC 25923) fagocitado por macrofagos THP-1 20 como se describio anteriormente (AAC, 2006, 50:841-851). Los resultados se expresaron como un cambio de eficacia en comparacion con el tiempo 0 h.
Condiciones
CEM-101 AZI CLR TEL
CMI (mg/L)
(i) pH 7,4
0,125 0,5 0,5 0,5
(ii) pH 5,5
1-2 256 16 8
Actividad extracelular (24 h): A log UFC
desde el tiempo 0 h
(i) Caldo a pH 7,4
Emax1
-1,4 ± 0,1 -1,2 ± 0,6 -1,4 ± 0,2 -1,0 ± 0,4
Dosis estatica2
~ 0,06 ~ 3,63 ~ 1,41 ~ 0,28
R2
0,964 0,860 0,965 0,868
(ii) Caldo a pH 5,5
Emax1
-1,6 ± 0,4 +2,1 ± 0,1 -1,5 ± 0,8 -1,4 ± 0,9
Dosis estatica2
~ 1,48 / ~ 10,47 ~ 9,33
R2
0,915 / 0,911 0,879
Actividad intracelular (24 h): A log UFC
desde el tiempo 0 h
Emax1
-0,8 ± 0,2 0,10 ± 0,0 -0,1 ± 0,1 -0,4 ± 0,2
Dosis estatica2
~ 0,02 ~ 7,8 ~ 0,98 ~ 0,23
R2
0,906 0,980 0,974 0,935
THP-1
Emax1
-0,8 ± 0,2 0,1 ± 0,1 -0,1 ± 0,1 -0,4 ± 0,1
Dosis estatica2
~ 0,02 ~ 10 ~ 0,98 ~ 0,28
1 - Maxima reduccion de UFC intracelulares en comparacion con el inoculo posfagocitosis inicial (calculado a partir de regresion no lineal [sigmoidea] de la respuesta dosis-efecto) llevada a cabo en caldo (extracel.) o con macrofagos infectados (intracel.). 2 - Concentracion extracelular (Ce en mg/L) que produce un efecto estatico aparente. Descriptores farmacologicos comparativos (Emax y concentraciones estaticas [Cs]) obtenidos de los estudios dosis-respuesta. Estudios dosis-respuesta en caldo de Mueller-Hinton. Contra S. aureus ATCC 25923 y en caldo, a pH 7,4, CEM-101 es sistematicamente mas activo que la AZI, CLR y TEL; a pH 5,5, la AZI, CLR y TEL muestran una reduccion significativa de sus potencias, mientras que CEM-101 muestra menos cambio.
En comparacion con AZI, CLR y TEL, la actividad de CEM-101 se vio menos afectada por el pH acido del caldo y mostro mayor potencia (menor dosis estatica) y mayor eficacia maxima (Emax) contra S. aureus intracelular.
5 EJEMPLO. Lfneas celulares. Los experimentos se realizaron con celulas THP-1 (ATCC TIB-202; coleccion de cultivos tisulares americana, Manassas, VA), una lfnea celular mielomonocftica humana que muestra actividad similar a los macrofagos (vease, p. ej., Barcia-Macay y col., Antimicrob. Agents Chemother. 50:841-851 (2006)). Ensayo de macrolidos asociados a las celulas y calculo de las relaciones de concentracion celular a extracelular aparentes. Los macrolidos se ensayaron mediante un procedimiento microbiologico, usando S. aureus ATCC 25923 10 como organismo de prueba. Las protefnas celulares se midieron en paralelo usando el procedimiento de Folin- Ciocalteu/Biuret. El contenido de macrolidos asociado a las celulas se expreso en funcion del contenido de protefna celular total y se convirtio en concentraciones aparentes usando un factor de conversion de 5 pL por mg de protefna celular, un valor promedio encontrado para muchas celulas cultivadas.
15 Cepas bacterianas, pruebas de susceptibilidad y estudios de las curvas dosis-respuesta a 24 h con caldo. En el presente estudio se usaron S. aureus ATCC 25923 (sensible a meticilina [meticilina]), cepa de L. monocytogenes EGD y cepa de L. pneumophila ATCC 33153. Las determinaciones de CMI se realizaron en caldo de Mueller-Hinton (para S. aureus) y en caldo de soja trfptico (para L. monocytogenes) tras una incubacion de 24 h, o en caldo de extracto de levadura tamponado con a-cetoglutarato (para L. pneumophila) tras una incubacion de 48 h. Para los 20 estudios de S. aureus, se realizaron experimentos concentracion-respuesta en medio acelular a 24 h en caldo de Mueller-Hinton.
Infeccion celular y evaluacion de las actividades intracelulares de los antibioticos. La infeccion de celulas THP-1 y la evaluacion de la actividad intracelular de los antibioticos se realizaron usando procedimientos convencionales para 25 S. aureus y L. monocytogenes o con adaptaciones menores para L. pneumophila usando (i) una multiplicidad de la infeccion de 10 bacterias por macrofago y (ii) gentamicina (50 mg/litro) durante de 30 a 45 min para la eliminacion de bacteria no fagocitada.
Analisis estadfsticos. Se realizaron analisis estadfsticos de ajuste de curvas con GraphPad Prism version 4.03 y 30 GraphPad Instat version 3.06 (GraphPad Software, San Diego, CA).
EJEMPLO. Susceptibilidad a S. aureus ATCC 25923, Listeria monocytogenes EGD y Legionella pneumophila ATCC 33153. CEM-101 mostro CMI inferiores a la AZI contra los tres organismos seleccionados (S. aureus, 0,06 y 0,5 mg/litro; L. monocytogenes, 0,004 y 1 mg/litro y L. pneumophila, 0,004 y 0,016 mg/litro) en las pruebas de 35 susceptibilidad convencionales. Las CMI de CEM-101, TEL, AZI y CLR contra S. aureus y L. monocytogenes se midieron en caldos ajustados a valores de pH que variaban de 5,5 a 7,4. El intervalo se selecciono para que cubriera los valores a los que los podfan estar expuestos los antibioticos en el medio extracelular o intracelularmente para los dos organismos considerados. Como se ilustra en la FIG. 1, los cuatro farmacos mostraron una marcada reduccion de potencia contra ambos organismos cuando el pH se reducfa de 7,4 a 5,5, demostrando la AZI la perdida de 40 actividad mas significativa. CEM-101 retuvo la mayor actividad, mostrando consistentemente las CMI mas bajas en todo el intervalo de pH investigado, con valores (mg/litro) que variaban de 0,06 (pH 7,4) a 0,5 (pH 5,5) para S. aureus (ATCC 25923) y de 0,0039 (pH 7,4) a 0,25 (pH 5,5) para L. monocytogenes (EDG). Para L. pneumophila (datos no mostrados), la CMI de CEM-101 aumento de 0,005 a 0,01 y la de AZI de aproximadamente 0,01 a 0,25 mg/litro cuando el pH del caldo se reducfa de 7,4 a 6,5 (no se podia realizar determinacion alguna a valores de 45 pH inferiores por ausencia de crecimiento).
EJEMPLO. Efectos del tiempo y la concentracion contra S. aureus extracelular e intrafagocitario. Se obtuvieron curvas de muerte en funcion del tiempo a corto plazo (6 h) para CEM-101, en comparacion con las de AZI, contra S. aureus (ATCC 25923) en caldo y tras fagocitosis por macrofagos THP-1 usando dos concentraciones fijas unicas de 0,7 y 4 mg/litro. La concentracion mas baja se eligio para que fuera relevante a la concentracion serica de AZI y 5 CEM-101 y la concentracion mas alta se selecciono para que estuviera por encima de la CMI de AZI para los organismos de interes. Los resultados presentados en la FIG. 3 muestran que, en estas condiciones, solo CEM-101 fue capaz de reducir significativamente las UFC en el caldo, asf como en los macrofagos THP-1, a la concentracion de 0,7 mg/litro. A la concentracion de 4 mg/litro en caldo, la AZI finalmente consegufa el mismo efecto antibacteriano que CEM-101, pero a una velocidad inferior (5 h en comparacion con 1 h). En los macrofagos THP-1, se detecto
10 actividad no consistente para la AZI, incluso a la concentracion de 4 mg/litros, mientras que CEM-101 consiguio de nuevo una reduccion de aproximadamente 1,5 log10 UFC, similar a la magnitud vista a la concentracion de 0,7 mg/litro. En todas las situaciones con CEM-101, la reduccion de UFC maxima se obtuvo en 1 h y se mantuvo a partir de entonces.
15 A continuacion, realizamos experimentos concentracion-respuesta en un momento temporal fijo (24 h) para obtener los descriptores farmacologicos de actividad de CEM-101 pertinentes (potencia relativa [concentracion efectiva del 50 % {CE50}], concentracion estatica aparente [Cs] y eficacia maxima relativa [Emax] en comparacion con la actividad de CLR, AZI y TEL (se describen detalles adicionales en Barcia-Macay y col., Pharmacodynamic evaluation of the intracellular activities of antibiotics against Staphylococcus aureus in a model of THP-1 macrophages Antimicrob.
20 Agents Chemother. 50:841-851 (2006)). Los datos se presentan en la FIG. 2 en funcion de (i) las concentraciones en peso (mg/litro) y (ii) multiplos de las CMI (como se determinan en caldo a pH 7,4). Los valores numericos de los descriptores farmacologicos correspondientes se muestran en la tabla. Parametros de regresion pertinentesa (con intervalos de confianza [IC]) y analisis estadfstico de las curvas dosis-respuesta ilustradas en la FIG. 2.
caldo +
antibiotico
Emax «(IC) o m cn o o Cs R2
CEM-101
-1,37 mg/L 0,03 0,06 0,973
(de -1,67 a -1,08) (de 0,02 a 0,06)
a; A a; A
x CMI 0,48 0,88
(de 0,26 a 0,91)
a; A
TEL
-1,00 mg/L 0,12 0,29 0,892
(de -1,78 a -0,22) (de 0,03 a 0,52)
a; A b; A
x CMI 0,46 0,96
(de 0,11 a 2,06)
a; A
AZI
-1,23 mg/L 1,78 3,4 0,872
(de -2,55 a 0,083) (de 0,45 a 7,02)
a; A c; A
x CMI 3,55 6,87
(de 0,90 a 14,0)
b; A
CLR
-1,41 mg/L 0,80 1,32 0,956
(de -1,95 a -0,87) (de 0,41 a 1,56)
a; A c; A
x CMI 1,59 2,65
(de 0,81 a 3,1)
a, b; A
Macrofagos THP-1++
antibiotico
Emax «(IC) o m cn o o C5 R2 (IC)
CEM-101
-0,86 mg/L 0,0068 0,022 0,927
(de -1,36 a -0,37) (de 0,0023 a 0,020)
a, B a, B
x CMI 0,11 0,35
(de 0,037 a 0,32)
a, B
TEL
-0,29 mg/L 0,024 0,63 0,954
(de -0,70 a 0,12) (de 0,007 a 0,088)
b; B b; B
x CMI 0,097 1,04
de 0,027 a 0,35
a, B
AZI
0,04 mg/L 0,11 >50 0,983
(de -0,23 a 0,32) (de 0,05 a 0,22)
b; B c; B
x CMI 0,22 >100
de 0,11 a 0,45
a, B
CLR
-0,18 mg/L 0,046 0,84 0,974
(de -0,52 a 0,16) (de 0,018 a 0,12)
b; B b, c; B
x CMI 0,093 1,68
de 0,035 a 0,25
a, B
a usando todos los puntos de datos mostrados en la FIG. 4 (datos de muestras sin antibiotico cuando la concentracion extracelular de un antibiotico es inferior a 0,01 x CMI (5) + inoculo original [tiempo = 0 h]: 0,97 ± 0,24 x 106 UFC/mL (n = 3) ++ inoculo original (posfagocitosis) [tiempo = 0 h]: 2,74 ± 0,55 x 106 UFC/mg de protefna (n = 3) ♦reduccion de UFC (en unidades log10) a tiempo = 24 h del inoculo original correspondiente, como se extrapola para la concentracion de antibiotico = las muestras que producen menos de 5 recuentos se consideraron por debajo del nivel de deteccion. ◊ concentracion (en mg/L o en x CMI) que provoca una reduccion del inoculo intermedia entre los valores inicial (E0) y maximo (Emax), como se obtiene a partir de la ecuacion de Hill (usando un factor de pendiente de 1); ◊ concentracion (en mg/L o en x MIC) que deriva en crecimiento bacteriano no aparente (numero de UFC identico al del inoculo original), como se determina mediante interpolacion grafica; Analisis estadfsticos. Analisis de las diferencias entre antibioticos (por columna para las filas correspondientes; analisis ANOVA unidireccional con prueba de Tuckey para comparaciones multiples entre cada parametro para todos los farmacos): las cifras con letras minusculas diferentes son significativamente entre si (p <0,05). Analisis de las diferencias entre caldo y macrofagos THP-1 (por fila para las columnas correspondientes; test t de Student de dos colas para muestras no apareadas): las cifras con letras mayusculas diferentes son significativamente diferentes entre si (p <0,05).
Las actividades tanto en caldo como en macrofagos THP-1 se desarrollaron de un modo dependiente de la concentracion, como denota la forma sigmoidea de cada funcion de ajuste optimo (ecuacion de Hill). En caldo, la eficacia relativa de CEM-101 (Emax de -1,37 log 10) fue similar a la de los otros farmacos (valores de Emax de -1,00 a - 5 1,41 log 10). En macrofagos THP-1, la eficacia relativa de CEM-101 se redujo significativamente en comparacion con la de en caldo (Emax de -0,86 log10), pero no con la misma magnitud que las de los otros farmacos, que se volvieron esencialmente solo bacteriostaticos (valores de Emax de 0,04 a -0,29 log10). En terminos ponderales, CEM-101 tuvo potencias relativas superiores (valores de E50 inferiores) y concentraciones estaticas inferiores (valores de Cs inferiores) que los tres farmacos comparadores. tanto en caldo como en macrofagos THP-1. Cuando se analizaron 10 los datos en funcion de la concentracion equipotente (multiplos de la CMI), estas diferencias en los valores de CE50 se redujeron, lo que indica que la CMI era el parametro motor principal en este contexto. En caldo, incluso cuando se analizaron como multiplos de la CMI, CEM-101 y CLR todavfa mostraron valores de CE50 significativamente inferiores a los de TEL y AZI.
15 Ejemplo. Actividad contra L. monocytogenes y L. pneumophila intrafagocitarios. Se uso la misma estrategia que la de S. aureus para evaluar las actividades de CEM-101 y AZI contra L. monocytogenes y L. pneumophila fagocitados con el fin de obtener informacion sobre las relaciones concentracion-efecto y sobre los correspondientes descriptores farmacologicos pertinentes. Como se muestra en la FIG. 4, se observo una relacion compatible con la ecuacion de Hill en todos los casos, aunque el crecimiento limitado de L. pneumophila hizo que el ajuste de 20 funciones fuera algo mas incierto. Cuando se representaron graficamente los datos frente a la concentracion en
peso, resulto que CEM-101 tenia una potencia relativa superior (EC50 inferior) a la AZI, tanto para L. monocytogenes como para L. pneumophila. Esta diferencia se redujo, pero, sin embargo, siguio siendo significativa, cuando se representaron graficamente los datos de L. pneumophila frente a multiplos de la CMI, lo que indica que la CMI era un motor importante, pero no exclusivo, de la actividad intracelular contra este organismo. Por el contrario, 5 no se vio diferencia en las respuestas para L. monocytogenes cuando se expresaron los datos como multiplos de la CMI. Los valores numericos de los descriptores farmacologicos pertinentes y el analisis estadistico de sus diferencias se muestran en la tabla.
Parametros de regresion pertinentes3 (con intervalos de confianza [IC]) y analisis estadistico de las curvas dosis- respuesta ilustradas en la FIG. 4.
10
L. monocytogenes EGD+
antibiotico
Emax«(IC) O m cn 0 0 /-\ w Cs R2
-0,66 mg/L 0,020 0,11 0,934
CEM-101
(de -1,28 a -0,037) (de 0,005 a 0,073)
a a
x CMI 5,00 0,88
(de 1,36 a 18,5)
a
AZI
-0,81 mg/L 2,66 11,6 0,953
(de -2,11 a 0,48) (de 0,91 a 7,73)
a b
x CMI 2,66 11,6
(de 0,81 a 3,1)
a
L. pneumophila ATCC 33153++
antibiotico
Emax«(IC) 0 m cn 0 0 ~ 00------- Cs R2
-1,03 mg/L 0,052 0,018 0,920
CEM-101
(de -1,34 a -0,72) (de 0,012 a 0,23)
a a
x CMI 13,1 4,56
(de 3,02 a 57,0)
a
AZI
-0,83 mg/L 2,86 2,90 0,903
(de -2,00 a 0,34) (de 0,17 a 48,6)
a b
x CMI 179,0 181
(de 10,5 a 3038)
b
a usando todos los puntos de datos mostrados en la FIG. 4 (no se usaron datos de muestras sin antibioticos por evidencia de crecimiento extracelular cuando la concentracion extracelular de un antibiotico es inferior a 0,01 x CMI (5).+ inoculo original (posfagocitosis) [tiempo = O h; UFC/mg de protefna]): L. monocytogenes, 1,67 ± 0,22 x 106(n = 3); L. pneumophila, 0,94 ± 0,60 x 106 <Reduccion de UFC (en unidades logarftmicas) a tiempo = 24 h (L. monocytogenes) o 48 h (L. pneumophila) del inoculo original correspondiente, como se extrapola para concentracion de antibiotico las muestras que producen menos de 5 recuentos se consideraron por debajo del nivel de detecion. ° concentracion (en mg/L o en x CMI) que provoca una reduccion del inoculo intermedia entre los valores inicial (E0) y maximo (Emax), como se obtiene a partir de la ecuacion de Hill (usando un factor de pendiente de 1). 00 concentracion (en mg/L o en x CMI) que deriva en crecimiento bacteriano no aparente (numero de UFC identico al inoculo original), como se determina mediante interpolacion grafica. Analisis estadfsticos: analisis de las diferencias entre los dos antibioticos (por columna para las filas correspondientes; test t de Student de dos colas para muestras no apareadas): las cifras con letras minusculas diferentes son significativamente diferentes entre si (p <0,05).
EJEMPLO. Estudios dosis-respuesta en macrofagos THP-1 infectados. Contra S. aureus ATCC 25923 intrafagocitario, CEM-101 es mas potente que la AZI, CLR y TEL (Cs inferiores). Ademas, CEM-101 es capaz de reducir el inoculo intracelular (Emax ~1 log), hecho que no se observa con AZI, CLR y TEL.
Absorcion de CEM-101 en las celulas (ii): papel del tipo de celula
Celulas
THP-1 (macrofagos humanos) J774 (macrofagos murinos) MDCK (celulas epit. caninas) MDCK que sobreexpresan transportadores de eflujo de PMR1
Cc/Ce a 5 h
~ 50-150 ~ 60 ~ 45 ~ 30
EJEMPLO. Ejemplo de estudios dosis-respuesta de CEM-101 frente a comparadores (AZI, CLR y TEL) contra S. 5 aureus ATCC 25923 intracelular (macrofagos THP-1). Vease la FIG. 7 y la tabla.
CEM-101 AZI CLR TEL
Emax
-0,80 ± 0,11 0,04 ± 0,11 -0,18 ± 0,13 -0,29 ± 0,16
Cs (mg/L)
~ 0,01 >50 ~ 0,86 ~ 0,27
EJEMPLO. Actividad intracelular: estudios comparativos con otros agentes antiestafilococicos. Se midio la dosis- respuesta estatica comparativa de los antibioticos contra Staphylococcus aureus (cepa ATCC 25923) intracelular en 10 macrofagos THP-1. Vease la FIG. 6, las barras representan las CMI (en mg/L) o la dosis estatica extracelular.
PROCEDIMIENTO. Se infectaron macrofagos peritoneales con M. leprae viable, se anadieron los farmacos y se incubaron a 33 °C durante 3 dfas. Despues de 3 dfas, se lisaron los macrofagos para liberar la M. leprae intracelular de la que, a continuacion, se ensayo su viabilidad mediante radioespirometrfa y tincion para determinacion de 15 viabilidad. CEM-101 muestra eficacia contra la viabilidad de M. leprae intracelular.
Se uso la cepa aislada Thai-53 de M. leprae, mantenida por pases seriados en almohadillas plantares de ratones nu/nu atfmicos, para todos los experimentos. Para las pruebas axenicas, se incubo M. leprae viable recien cosechada en medio junto con diferentes concentraciones de los farmacos (CEM-101, CLR y rifampina) durante 7 20 dfas a 33 °C. Al final de esta incubacion, la M. leprae tratada con farmaco se sometio a radioespirometrfa para evaluar su viabilidad con base en la oxidacion de palmitato y la tincion con colorantes de viabilidad para evaluar la magnitud de dano a la membrana. Para las pruebas intracelulares, se infectaron macrofagos peritoneales de ratones Swiss con M. leprae viable recien cosechada a una MOI de 20:1 durante 12 horas. Al final de la infeccion, se lavaron las bacterias extracelulares, se anadieron farmacos a diferentes concentraciones y se incubaron durante 3 dfas a 25 33 °C. Al final de los 3 dfas, se lisaron las celulas para obtener la M. leprae intracelular para pruebas de radioespirometrfa y tincion para determinacion de viabilidad.
CEM-101 a 0,15 pg/mL fue capaz de reducir significativamente (P <0,001) la viabilidad de M. leprae en cultivos tanto axenicos como intracelulares en comparacion con los controles. La inhibicion de CEM-101 no fue estadfsticamente 30 diferente de la inhibicion obtenida con CLR en condiciones identicas y a la misma concentracion.
EJEMPLO. Estreptococos p-hemolfticos (EBH) resistentes a telitromicina emergentes. Se probo CEM-101 contra una coleccion de 43 EBH TEL-R. Se identificaron un total de 53 (1,3 %) EBH de entre 3958 en el programa de vigilancia antimicrobiana SENTRY (2003-2006) que fueron TEL-R (MIC, >2 pg/mL). Para las pruebas, se disponfa de 35 43 cepas (36 del grupo A, 1 del grupo C, 6 del grupo G) procedentes de 20 hospitales de Europa (31 cepas), Norteamerica (11) y Latinoamerica. (1). Las pruebas de susceptibilidad (S) usaron procedimientos de microdilucion en caldo segun el CLSI y 3 cepas fueron eritromicina (ERI)-R, CLN (CC)-S, por lo que necesitaron pruebas por difusion en disco. Se probaron nueve agentes comparativos (4 en la tabla).
40 Distribuciones de CMI para CEM-101 como agentes comparativos de macrolidos mLEB: Ocurrencias a CMI (pg/mL)
Antimicrobiano
<0,015 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 >4
CEM-101
4 0 1 18 10 6 4 0 0 0
TEL
0 0 0 0 0 0 0 8 16 19
Eritromicina
0 0 0 0 0 0 0 0 - 43
CLN
- - - - 2 1 0 0 - 40
Q/D
- - - - 37 6 0 0 - 0
CEM-101 permanecio activo contra todos los TEL-R (CMI, >2 pg/mL) BHS con todas las CMI a <1 pg/mL (CMI50, 0,12 pg/mL). El numero de ocurrencias de cepas TEL-R mas alto fue en Europa (el mayor en Italia).
45 CEM-101 garantiza el desarrollo adicional de infecciones provocadas por EBH.
La potencia de CEM-101 contra cada serogrupo de EBH fue la misma con una CMI50 y CMI 90 generales de 0,12 y 0,5 pg/mL, respectivamente. La actividad de CEM-101 fue 32 veces superior (comparaciones de CMI50) a la de la TEL. Todas las cepas fueron resistentes a ERI, pero la quinupristina/dalfopristina (Q/D) fue100 % S. Tres cepas CC- 5 S (S. pyogenes) fueron (+) en la prueba de difusion en disco y 2 tuvieron induccion (+) de CEM-101. Las tasas de susceptibilidad para otros comparadores fueron: penicilina, tetraciclina, ceftriaxona, amoxicilina/clavulanato y levofloxacina (100,0 %); y tetraciclina (46,8 %).
EJEMPLO. Pruebas de susceptibilidad en caldo: estudios con cepas adicionales (incluyendo SARM-EH): CMI a pH 10 7,4
Cepas
SASM/SARM CEM-101 AZI CLR TEL
ATCC 25923
SASM 0,125 0,5 0,5 0,5
NRS 192 (US)
SARM-EH 0,25 1 0,5 0,25
N4090440(BE)
SARM-EH 0,06 0,5-1 0,5 0,5
N7112046 (BE; SARM animal)
SARM 0,06 2 1 0,25
STA 44 (Asia)
SARM-EH 0,5 256 128 8
CHU (Asia)
SARM-EH 2 256 256 32
STA 268 (Asia)
SARM-EH 0,5-1 128 128 16
MEH (Asia)
SARM-EH 0,125 1 0,5 0,25
In vivo: intraperitoneal (IP) - modelos de infeccion en raton (DE50)
MAC-S MAC-R
Compuesto
S. pneumoniae ATCC 49619 (CMI) S. pyogenes 3029 (CMI)
CEM-101
2,5 mg/kg (<= 0,125) 2,5 mg/kg (<= 0,125)
AZI
15 mg/kg (<= 0,125) >150 mg/kg (>64)
TEL
1 mg/kg (<= 0,125) >150 mg/kg (16)
15
EJEMPLO. Se evaluo la actividad antimicrobiana en un modelo de infeccion sistemica en murinos contra varias cepas bacterianas que inclufan aislados resistentes tales como SARM, SARM 300, S. pneumoniae mefR, un S. pyogenes resistente a eritromicina y un aislado de S. pneumoniae de serotipo 19A.
20 EJEMPLO. Se evaluo la eficacia en varios modelos de infeccion. Se infectaron IP ratones hembra CD-1; se administro CEM-101 o los comparadores como una unica dosis oral 1 h posinfeccion. Se determinaron las DP50 a las 24 h posinfeccion. CEM-101 se evaluo adicionalmente en un modelo de rata de absceso subcutaneo contra S. pneumoniae. Se infectaron ratones hembra CD-1 por medio de inyeccion SC de bacteria mezclada con perlas de ciclodextrano. Dos horas posinfeccion, los ratones recibieron una unica dosis oral de CEM-101 o los agentes de 25 control. A las 48 h posinyeccion, se practico la eutanasia a los ratones, se eliminaron asepticamente los abscesos y se realizo el recuento de bacterias. Se determinaron las UFC por absceso y se compararon con el control sin tratar. Se realizo una evaluacion adicional de CEM-101 en ratones con neutropenia inducida por ciclofosfamida. A las 1,5 h posinfeccion del muslo con S. pneumoniae, se dosifico oralmente a los ratones con CEM-101 o los farmacos de control. 24 h postratamiento, se procesaron los muslos y se determinaron las UFC/gramo.
30
Modelo de infeccion sistemica en raton (mg/kg)
CEM-101 TEL CLR
S. aureus
16,3 (11,221,3) >30 22,7 (11,334,1)
SARM
7,5 (6,0-8,9) SD 5,0
S. pneumoniae (susceptible a macrolidos)
6,0 (2,0-10,0) 19,9 (9,630,2) 32,1 (12,352,0)
S. pneumoniae (mef R)
23,2 (15,630,7) 10,6 (2,618,6) >30
S. pyogenes (susceptible a macrolidos)
9,4 (7,3-11,5) 7,8 (5,7-9,8) 24,8 (18,130,4)
S. pyogenes (R a eritromicina)
5,1 (4,2-6,1) 4,4 (3,8-4,9) 22,8 (14,630,9)
SD = sin determinar
En el absceso, una dosis de 10 mg/kg diaria de CEM-101 demostro una reduccion de 4,2 log 10, mientras que la CLR (CL) solo consiguio una reduccion de 1,5 log10 de los ratones sin tratar. El CEM-101 en el muslo necesito 8,0 mg/kg para conseguir una reduccion de 3 log10 de los ratones sin tratar. La TEL y CL necesitaron 15,5 y 13,5 mg/kg para 5 conseguir las mismas reducciones de log^UFC.
EJEMPLO. Medios. Placas de agar de soja Trypticase (TSA) - BBL, Franklin Lakes, NJ; Agar de soja Trypticase con 5 % de sangre de oveja (TSA-II) - BBL, Franklin Lakes, NJ; caldo de infusion de cerebro y corazon (BHI) - BBL, Franklin Lakes, NJ; mucina gastrica porcina Tipo III - Sigma Aldrich, St Louis MO; perlas de ciclodextrano -Sigma- 10 Aldrich, St. Louis, MO; ciclofosfamida Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
EJEMPLO. Diseno experimental. Se aclimataron ratones hembra CD-1 (que pesaban de 18 a 22 gramos) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) durante 5 dfas antes de iniciar los estudios. Todos los estudios se realizaron siguiendo protocolos del Comite institucional para el cuidado y uso de animales (IAUCU, por sus siglas en ingles) 15 homologados y de conformidad con las normas de la Oficina para el bienestar de animales de laboratorio (OLAW, por sus siglas en ingles). Los animales tuvieron acceso libre a comida y agua durante todo el estudio y se les proporciono enriquecimiento ambiental.
Estudios de infeccion sistemica en ratones. En este modelo se evaluaron ocho aislados bacterianos. Para cada 20 cepa, se utilizo un cultivo durante la noche. Las bacterias se resuspendieron en medio y se diluyeron en un 5 % de BHI o un 8 % de mucina gastrica porcina hasta una concentracion que derivarfa en una supervivencia del 0 % en los ratones por posinfeccion a las 48 horas, como se determino mediante los estudios de virulencia iniciales. Se realizaron recuentos bacterianos para determinar el tamano del inoculo. Los ratones recibieron tratamiento por medio de sonda esofagica 1 hora posinfeccion. A la finalizacion del estudio, se calculo el porcentaje de 25 supervivencia y se informo de la dosis que lograba una supervivencia del 50 %, la dosis protectora del 50 % (DP50), junto con intervalos de confianza del 95 %, como se calcularon mediante analisis Probit usando GraphPad Prism version 4.03 (GraphPad Software).
EJEMPLO. Absceso subcutaneo en raton. Las bacterias se prepararon a partir de un cultivo en placa durante la 30 noche resuspendiendo en solucion salina y ajustando la suspension a una DO de 0,1 a 625 nm de una dilucion 1:10. La suspension bacteriana ajustada se mezclo 1:2 con perlas de ciclodextrano preparadas segun las instrucciones del envase. Se afeitaron los flancos derechos de los ratones y se inyectaron subcutaneamente 0,2 mL del inoculo bacteriano. A las dos horas posinfeccion, se trataron los ratones por medio de sonda esofagica con el producto de prueba o el farmaco de control. A las 48 horas posinfeccion, se sometieron los ratones a eutanasia, se eliminaron 35 asepticamente los abscesos, se homogeneizaron, se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar para crecimiento bacteriano. Tras la incubacion durante la noche, se realizo el recuento de colonias y se determinaron las UFC/gramo de absceso.
EJEMPLO. Infeccion de muslo en raton neutropenico. Los ratones se volvieron neutropenicos con inyecciones IP de 40 ciclofosfamida en el dfa -4 y el dfa -1 de 150 mg/kg y 100 mg/kg, respectivamente. En el dfa 0, se infectaron los ratones con aproximadamente 5 x 105 UFC/mL de bacteria en un volumen de 0,1 mL en el muslo derecho. A las 1,5 horas posinfeccion, los ratones recibieron tratamiento por medio de sonda esofagica. Un grupo de ratones infectados se sometio a eutanasia y se procesaron sus muslos para que los tftulos bacterianos sirvieran como controles a T = 0. A las veinticuatro horas postratamiento, se sometieron a eutanasia los ratones restantes, se eliminaron 45 asepticamente los muslos, se pesaron, homogeneizaron, se diluyeron en serie y se sembraron en placas de medio de crecimiento bacteriano. Se calcularon las UFC por gramo tras incubacion durante la noche de las placas bacterianas. Se calculo la cantidad de producto de prueba necesaria para conseguir reducciones de 1, 2 y 3 log10 a partir de los muslos de control a las 24 horas. Se realizaron estudios adicionales que fraccionaron la dosis unica de tratamiento (Q24) en dos (Q12), tres (Q8) y cuatro (Q6) dosis equivalentes para determinar la naturaleza 50 farmacodinamica de este compuesto. El analisis adicional incluye la dosis estatica, CE50, muerte 1 log y el efecto maximo (Emax).
EJEMPLO. Farmacocinetica. Farmacocinetica de CEM-101 en raton
Dosis [mg/kg]
Via Tmax (h) Cmax(ng/mL) AUC0-24, (ng*h/mL) Semivida (h)
2,5
PO 1 359,15 1172,63 2,85
10,0
PO 0,5 1436,60 4757,93 2,85
En el presente documento, se entiende que el modelo de absceso subcutaneo y el modelo de muslo neutropenico en ratones descritos en el presente documento pueden ser mas relevantes para la comprension y/o previsibilidad de
la eficacia de los compuestos descritos en el presente documento en el tratamiento de infeccion humana in vivo que el modelo de proteccion en raton, que puede ser un modelo mejor para la comprension y/o previsibilidad de la eficacia de los compuestos descritos en el presente documento para tratar infecciones transmitidas por la sangre, tales como bacteriemia. Por ejemplo, en lo que respecta a CLR y TEL, si un compuesto que contiene triazol, tal 5 como CEM-101, tiene una Cmax inferior en el raton a dosis iguales, las CMI se reflejan con exactitud en las pruebas de proteccion en raton para las cepas susceptibles. Se observa que CEM-101 es muy activo cuando se ajusta la dosis para Cmax en el raton. Contra cepas resistentes, CEM-101 es efectivo incluso en las pruebas de proteccion en raton. En cambio, en modelos mas relevantes de infeccion humana, tales como el modelo de absceso subcutaneo o el modelo de muslo neutropenico, CEM-101 se comporta extraordinariamente bien y refleja su potencia in vitro.
10
EJEMPLO. La capacidad de CEM-101 para reducir la carga microbiana en el modelo de infeccion por absceso tambien se evaluo contra aislados de S. pneumoniae.
EJEMPLO. Infecciones sistemicas en raton.
15
CEM- 101 TEL CLR
CMI (pg/mL) DP50 (mg/kg; IC del 95 %)) CMI (pg/mL) DP50 (mg/kg; IC del 95 %)) CMI (pg/mL) DP50 (mg/kg; IC del 95 %))
S. aureus
0,12 16,3 (11,221,3) 0,06 >30 >16 22,7 (11,334,1)
SARM
0,12 7,5 (6,08,9) 0,5 SD >16 5,0
SARM 300 (EH)
0,12 9,5 (5,013,9) 0,25 9,2 (6,312,1) >16 19,5 (8,230,5)
S. pneumoniae (susceptible a macrolidos)
<0,03 6,0 (2,010,0) <0,06 19,9 (9,630,2) >16 32,1 (12,352,0)
S. pneumoniae (mefR)
<0,03 23,2 (15,630,7) 0,25 10,6 (2,618,6) 0,5 >30
S. pneumoniae serotipo 19A
0,25 6,6 (4,48,9) 0,5 5,7 (4,86,7) >16 5,03 (4,85,3)
S. pyogenes (susceptible a macrolidos)
0,015 9,4 (7,311,5) 0,015 7,8 (5,79,8) 0,015 24,8 (18,130,4)
S. pyogenes (R a eritromicina)
1,0 5,1 (4,2- _6,1)______ 1,0 4,4 (3,84,9) 1,0 22,8 (14,630,9)
SD = sin determinar
EJEMPLO. Absceso subcutaneo en raton ~ S. pyogenes ATCC 8668 (Log10UFC/gramo de absceso promedio). Procesamiento del absceso 48 horas posinfeccion.
Dosis (mg/kg) 48 h
Control
- 8,22
CEM-101
10 5,35
20
2,53
CLR
10 7,63
20
7,82
TEL
10 7,06
20
6,10
20
EJEMPLO. Modelo de muslo neutropenico. S. pneumoniae 1629 (dosis (mg/kg) al dfa, PO a las 2 h posinfeccion; reduccion a partir de los controles a 24 horas) en muslo de raton neutropenico.
Compuesto
Via de dosificacion: Reduccion de 1 log10 Reduccion de 2 log 10 Reduccion de 3 log 10 Max. cambio en log10UFC de los controles a 24 h
CEM-101
PO 6,0 7,0 8,0 -5,81
TEL
PO 11,0 13,2 15,5 -6,82
CLR
PO 4,5 9,0 13,5 -5,75
En el equivalente de absceso subcutaneo en raton ~ S. pneumoniae 1629 (10 mg/kg PO a las 2 horas posinfeccion), el log10UFC/gramo de absceso promedio de CEM-101 y CLR permanecio constante a las aproximadamente 3 y 5,5 horas, respectivamente, a partir de 24 horas y 48 horas; el de TEL aumento de aproximadamente 3 a 5 aproximadamente 4,5.
EJEMPLO. S. pneumoniae 6303 (dosis (mg/kg) al dfa, PO; reduccion a partir de los controles a 24 horas) en muslo de raton neutropenico.
Compuesto
Via de dosificacion: Reduccion de 1 log10 Reduccion de 2 log 10 Reduccion de 3 log 10 Max. cambio en log10UFC de los controles a 24 h
CEM-101
PO 1,2 3,0 5,0 -6,17
TEL
PO 4,75 6,5 8,75 -5,27
CLR
PO 5,5 9,2 14,0 -5,20
10
EJEMPLO. Estudios de dosificacion fraccionada en modelo de muslo de raton neutropenico: S. pneumoniae 6303 frente a CEM-101 PO
Q24 Q12 Q8 Q6
Dosis estatica (mg/kg)
8,2 19,2 12,1 20,5
CE50(mg/kg)
5,7 14,5 9,0 16,7
Muerte 1 log (mg/kg)
10,8 24,0 23,0 23,0
Emax (log10UFC/muslo)
6,38 4,95 5,01 5,83
15 EJEMPLO. Infeccion de pulmon en raton. Tambien se evaluo la capacidad de CEM-101 para reducir la carga microbiana en un modelo de infeccion de pulmon contra aislados de S. pneumoniae. Las bacterias se prepararon a partir de un cultivo en placa durante la noche resuspendiendo en solucion salina y ajustando la suspension a una DO de 0,1 a 625 nm de una dilucion 1:10. Los ratones, bajo anestesia suave, fueron inoculados con 50 pl del inoculo bacteriano de S. pneumoniae 1629 por medio de inhalacion intranasal. Los ratones recibieron tratamiento por medio 20 de sonda esofagica a las 5, 24 y 36 horas posinfeccion. A las 48 horas posfinalizacion del tratamiento, se sometieron los ratones a eutanasia, se eliminaron asepticamente los pulmones, se homogeneizaron, se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar para crecimiento bacteriano. Tras incubacion durante la noche, se realizo el recuento de colonias y se determinaron las UFC/gramo de pulmon. El log^UFC/gramo de pulmon promedio aumento mas en los ratones tratados con CLR, de 3 a mas de 7, en comparacion con los ratones tratados con CEM-101, de 5 a 25 aproximadamente 5,5, de 24 horas a 48 horas.
EJEMPLO. Una muestra de organismos a escala mundial incluyo S. pneumoniae (SPN; 168, 59,3 % de eritromicina [ERI]-R y 18 cepas 19A multirresistentes [MR]), M. catarrhalis (McAT; 21, 11 p-lactamasa[+]), H. influenzae (HI; 100, 48 p-lactamasa[+]), H. parainfluenzae y H. haemolyticus (12) y Legionella pneumophila (LPN; 30). Todas las pruebas 30 S se hicieron segun procedimientos del CLSI (M7-A7, M100-S18) y los valores crfticos segun el CLSI (2008) para agentes comparativos tales como AZI (AZ), CLR (CLR), ERI, TEL (TeL), CLN (CC), Synercid® (SYN), levofloxacina (LEV), linezolid y rifampina (RIF). Las SPN fueron muy sensibles a CEM (CMI90, 0,25 pg/mL; la CMI mas alta a 0,5 pg/mL) y CEM fue de 2 a 8 veces mas potente que la TEL y CC, respectivamente.
35 Dieciocho cepas del serogrupo 19A presentaron niveles altos de no susceptibilidad a: macrolidos (100,0 %), CLN (83,3 %), penicilina (83,3 %), amox/clav (88,9 %), ceftriaxona (33,3 %), tetraciclinas (83,3 %) y TMP/SmX (100,0 %). Pocas opciones terapeuticas permanecieron con solo TEL (CMI90, 1 pg/mL; 100,0 % susceptible), Q/D (CMI90, 1 pg/mL; 100,0 % susceptible) y fluoroquinolonas (CMI90, 1 pg/mL; 100,0 % susceptible) con potencias utiles (Tabla 3). CEM-101 mostro una potencia dos veces superior a la TEL. Las cepas de sustitucion 19a MR tambien fueron 40 CEM-S (CMI90, 0,5 pg/mL), en comparacion con TEL (CMI90, 1 pg/mL), ERI (CMI90, >32 pg/mL), AZI (CMI90, >16 pg/mL), CLR (CMI90, >32 pg/mL) y CLN (CMI90, >16 pg/mL).
LPN fue mas S a CEM con todos los valores de CMI en <0,015 pg/mL (CMI90 de TEL, 0,03 pg/mL). Los patogenos de ITR por Haemophilus fueron menos CEM-S (CMI90, CEM/TEL): HI (2/4 pg/mL) y otros (2/4 pg/mL) sin variaciones 45 para las cepas p-lactamasa (+). Las CMI de CEM-101 para MCAT estuvieron todas en <0,5 pg/mL, igual que la TEL.
Las S. pneumoniae fueron muy susceptibles a CEM-101, con una CMI90 de solo 0,25 pg/mL. Esta potencia documentada (Tabla 1) fue dos veces superior a la TEL y ocho veces superior al linezolid (CMI90, 2 pg/mL). Los estreptococos p-hemolfticos tambien fueron susceptibles a CEM-101 (CMI90, 0,03 pg/mL) mostrando este nuevo agente una ventaja cuatro veces superior (CMI90, 0,12 pg/mL; susceptibilidad del 100,0 %) a la TEL. Se probaron 5 cinco grupos de cepas p-hemolfticas y todas las cepas mostraron una distribucion de CMI (0,015 pg/mL) monomodal y la CMI de CEM-101 mas alta fue de tan solo 0,12 pg/mL (Tabla 1).
CEM-101, al igual que la TEL, fue activo contra todos los estreptococos del grupo viridans resistentes a macrolidos y CLN (cinco grupos de especies; 51 cepas), pero todos los valores de CMI de CEM-101 estuvieron en <0,12 pg/mL, 10 cuatro veces mas potente que la TEL y 64 veces mas potente que la eritromicina.
Todos los resultados de CMI de CEM-101 para Haemophilus spp. tuvieron un estrecho intervalo de tan solo 0,54 pg/mL (a excepcion de dos cepas de 0,12 pg/mL que no presentaron una bomba de eflujo). La CMI90 global para las cepas de este genero fue de 2 pg/mL, igual que la AZI y dos veces mas activo que la TEL. Las diversas especies 15 (H. influenzae, H. parainfluenzae) y la produccion de p-lactamasa no alteraron significativamente la actividad de CEM-101 (CMI90, 2 pg/mL; Tabla 1).
Entre los agentes mLEB, el orden jerarquico de potencia (CMI90 en pg/mL) contra M. catarrhalis fue: AZI (0,06) >CEM-101 = CLR (0,12) >eritromicina = TEL (0,25) >Q/D (0,5) >CLN (2; vease la Tabla 1). La actividad p-lactamasa 20 no tuvo un efecto significativo sobre los valores de CMI90 (0,12 pg/mL) de CEM-101.
CEM-101 (CMI 90, <0,015 pg/mL) fue el agente mas activo probado contra Legionella spp. (Tabla 1), superior a otros macrolidos, la levofloxacina y la rifampina. Cabe senalar que el contenido de carbon vegetal del medio de prueba puede interferir con las pruebas de CMI de referencia de esta especie.
25
CMI de CEM (MG/ML) CMI de TEL (MG/ML)
ORGANISMO (N.°)
50 % 90 % INTERVALO 50 % 90 % INTERVALO
SPN (150)
0,015 0,25 <0,008-0,5 0,03 0,5 <0,008-1
19A MR(18)
0,25 0,5 0,06-0,5 0,5 1 0,12-1
MCAT (21)
0,12 0,12 <0,008-0,5 0,12 0,25 <0,015-0,5
HI (100)
1 2 0,12-4 2 4 0,25-16
OTROS HAEMOPHILUS (12)
2 2 0,12-2 2 4 0,25-8
LPN (30)
<0,015 <0,015 <0,015 0,03A 0,03A 0,03-0,06a
1. Resultados de RIF, no TEL.
Los estudios de cribado in vitro de los compuestos descritos en el presente documento indican una potencia comparable o superior a la TEL, ERI, AZI y CLR, asf como actividad contra aislados gram-positivos con resistencias a macrolidos o lincosamidas documentadas. La actividad de CEM-101 generalmente se centra en los patogenos 30 gram-positivos, pero tambien posee potencias mensurables frente a especies gram-negativas fastidiosas (Haemophilus, Moraxella), algunas enterobacterias (Salmonella, Shigella) y patogenos que provocan diversas enfermedades de transmision sexual (ETS). La actividad de CEM-101 se midio segun los procedimientos del Instituto de normas clfnicas y de laboratorio (CLSI) cuando se probaron organismos asociados a ITR-EH (estreptococos, Haemophilus spp., Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila), subgrupos resistentes 35 emergentes (S. Pneumoniae del serotipo 19A) y diversos patrones de resistencia a cetolidos mLEB entre los estreptococos probados.
Coleccion de organismos: todos los organismos probados se recogieron de pacientes de centros medicos de los Estados Unidos y Europa de 2005 hasta la fecha. Las fuentes de aislados recuperadas incluyeron el torrente 40 sangufneo, la piel y los tejidos blandos, asf como infecciones del tracto respiratorio. Las especies y fenotipos de organismos inusuales/raros necesitaron el uso de cepas aisladas antes de 2005 o de otras areas geograficas. Organismos probados: estreptococos (319), S. pneumoniae (150 tipo salvaje), S. pneumoniae (18 serogrupo 19A, solo EE. UU.), especies p-hemolfticas (100, cinco grupos), grupo viridans (51, cinco especies), especies Haemophilus (111), H. influenzae (100, 48 productores de p-lactamasa), H. parainfluenzae (11), M. catarrhalis (21, 45 11 productores de p-lactamasa), L. pneumophila (30).
Pruebas de susceptibilidad: los paneles de ensayo en forma congelada de noventa y seis pocillos fueron producidos por los laboratorios JMI y consistieron en tres tipos de medios: caldo de Mueller-Hinton con ajuste de cationes, caldo de Mueller-Hinton con ajuste de cationes y un 2,5-5 % de sangre de caballo lisada (para probar los estreptococos) y 5 medio de prueba de Haemophilus (HTM, por sus siglas en ingles). Se usaron los procedimientos de microdilucion en caldo y dilucion en agar segun la norma M7-A7 [2006] del CLSI. Los intervalos de control de calidad (CC) y los criterios interpretativos para los compuestos comparadores fueron los publicados en el documento M100-S18 [2008]del CLSI. Las cepas de CC probadas incluyeron S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619 y H. influenzae ATCC 49247 y 49766. Todos los resultados del CC estuvieron dentro de 10 los lfmites publicados. Los procedimientos de dilucion en agar se usaron para L. pneumophila probada sobre agar de carbon vegetal tamponado y extracto de levadura (BCYE, por sus siglas en ingles). Los agentes comparativos se probaron mediante epsilometrfa, tambien en medio BCYE. Se usaron una amplia variedad de agentes comparativos, incluyendo: amoxicilina/clavulanato (amox/clav), AZI, cefdinir, CLR, CLN, eritromicina, levofloxacina, linezolid, quinupristina/dalfopristina (Q/D), TEL y trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX), todos ellos evaluados mediante 15 microdilucion en caldo; y la ciprofloxacina, tetraciclina, ampicilina y rifampina se probaron adicionalmente en agar.
La tabla muestra una excelente potencia de CEM-101 contra los estreptococos (todas las CMI, <0,5 pg/mL) y una actividad moderada contra patogenos de ITR-EH gram-negativos (CMI, <0,008-4 pg/mL).
20 Distribuciones de CMI de CEM-101 para todos los organismos ITR (398 cepas) que muestran ocurrencias a CMI (pg/mL).
ORGANISMO (N.° PROBADO)
<0,008 0,015 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 >16
S. PNEUMONIAE (150)
62 25 8 9 7 33 6 0 0 0 0 0
ESTREPTOCOCOS p- HEMOLITICOS (100)
21 65 4 8 2 0 0 0 0 0 0 0
ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO VIRIDANS (15)
27 11 4 7 2 0 0 0 0 0 0 0
M. CATARRHALIS (21)
1 1 1 5 12 0 1 0 0 0 0 0
H. INFLUENZAE (100)
0 0 0 0 1 0 5 48 42 4 0 0
HAEMOPHILUS, OTROS (12)
0 0 0 0 1 0 0 4 7 0 0 0
CEM-101 presento actividad potente contra los estreptococos (CMI50, 0,015 pg/mL) y varios otros cocos gram- 25 positivos, incluyendo cepas resistentes a eritromicina y CLN. CEM-101 mostro actividad completa contra neumococos del serogrupo 19A MR (16 de 18 valores de cMi a 0,25 o 0,5 pg/mL) y fue dos veces mas activo que la TEL y la Q/D. CEM-101 tambien inhibio especies gram-negativas asociadas a ITR-EH (H. influenzae [CMI90, 2 pg/mL], Legionella spp. [CMI90, <0,015 pg/mL] y M. catarrhalis [CMI90, 0,12 pg/mL]).
30 EJEMPLO. Se seleccionaron aislados resistentes a macrolidos (29) (con base en la determinacion de las CMI de CLR; 19 mLEB, 10 fenotipos M con base en disociacion de resistencia a eritromicina y CLN) (para los que 6 fueron TEL-I y 7 TEL-R, con base en los valores crfticos del Comite europeo de antibiogramas (EUCAST, por sus siglas en ingles) [S <= 0,25-R >0,5]). Las CMI se determinaron mediante microdilucion geometrica en caldo de Mueller-Hinton con ajuste de cationes (CAMH, por sus siglas en ingles) + 2,5 % de sangre de caballo lisada segun el CLSI, usando 35 SP aTcC-49619 como control.
EJEMPLO. Las CMI de ATCC-49619 fueron <0,008 mg/L para TEL y CEM-101. Los datos de aislados resistentes a mL se muestran en la tabla. En esta coleccion belga de S. pneumoniae de NEH confirmadas resistentes a macrolidos, CEM-101 muestra, en general, CMI inferiores en comparacion con TEL, especialmente con respecto a 40 aislados TEL-I y TEL-R.
Fenotipo*
N.° TEL CEM-101
intervalo media geom. CMI90 intervalo media geom. CMI90
TEL-S
16 0,008-0,25 0,021 0,25 0,008 0,063 0,022 0,063
TEL-I
6 0,5-0,5 0,5 0,5 0,063-0,5 0,223 0,5
TEL-R | 7 | 1-3_______| 1,426 | 3,0 | 0,5-1,0 | 0,906 | 1,0
* itiLEb para 7/16 aislados de TEL-S, 5/6 de TEL-I y 7/7 de TEL-R (S/I/R se definen con base en los valores criticos del EUCAST (S <0,25-R >0,5)_________________________________
CEM-101 muestra, en general, CMI inferiores, en comparacion con TEL, especialmente con respecto a aislados TEL-I y TEL-R probados contra esta coleccion belga de S. pneumoniae de casos confirmados de NEH que son resistentes a macrolidos. Como se describe en el presente documento, CEM-101 tiene potencial para ser util como 5 alternativa a la telitromicina en areas con alta resistencia a tL y resistencia emergente a TEL.
S. pneumoniae ATCC 49619 S. pneumoniae ErmB 303 S. pneumoniae 163 (Mef A) S. pneumoniae 3773 (Erm B) S. pneumoniae 5032
AZI
^0,125 >64 8 >64 >64
TEL
^0,125 ^0,125 ^0,125 1 0,5
CEM- 101
^0,125 ^0,125 ^0,125 0,5 0,5
S. pyogenes 1721 S. pyogenes 1850 S. pyogenes 3029 S. pyogenes 3262 H. influenzae ATCC 49247
AZI
>64 >64 >64 >64 2
TEL
64 8 16 32 4
CEM- 101
0,5 ^0,125 ^0,125 0,5 2
CMI50 y CMI90 [pg/mL]
CEM- 101 OP 1055 TEL
N.° de cepas CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90
S. pneumoniae PEN-S, TEL-S; Macr- S
10 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
S. pneumoniae PEN-R, TEL-I/R; Macr-R
12 0,5 0,5 4 4 2 8
S. pneumoniae PEN-S, TEL-S; Macr- R
24 0,03 0,03 0,06 0,06 0,06 0,06
S. pyogenes TEL-S; Macr-S
10 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
S. pyogenes TEL-R; Macr-R
10 0,125 0,25 2 2 32 32
S. pyogenes TEL-S; Macr-R
30 0,03 0,03 0,125 0,25 0,125 0,5
2-F-TEL AZI PEN
N.° de cepas CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90
S. pneumoniae PEN-S, TEL-S; Macr- S
10 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
S. pneumoniae PEN-R, TEL-I/R; Macr-R
12 1 8 >32 >32 4 8
S. pneumoniae PEN-S, TEL-S; Macr- R
24 0,03 0,06 >32 >32 0,03 0,03
S. pyogenes TEL-S; Macr-S
10 0,03 0,03 0,125 0,125 0,03 0,03
S. pyogenes
10 32 32 >32 >32 0,03 0,03
TEL-R; Macr-R
S. pyogenes
30 0,25 0,5 >32 >32 0,03 0,03
TEL-S; Macr-R
EJEMPLO. Cuando se dispuso de los resultados de CMI en escala, CEM-101 (CMI90, 0,015 pg/mL) fue dos y ocho veces mas activo que la CLR o la TEL y AZI, respectivamente, contra estreptococos susceptibles a eritromicina. Para los estreptococos no susceptibles a eritromicina, CEM-101 tuvo una CMI elevada (CMI90, 0,25 pg/mL); sin 5 embargo, CEM-101 fue al menos dos veces mas activo que la TEL o la CLN. Cuando se probo contra estreptococos no susceptibles a eritromicina y CLN, todas excepto una cepa siguieron siendo susceptibles a TEL, pero todas fueron inhibidas por CEM-101 a <0,5 pg/mL.
Actividad de cEM-101 y agentes comparativos seleccionados contra estreptococos con diversos patrones de resistencia a itiLEb (tres grupos, 300 cepas*).
10
CMI (pg/mL)
Patron de resistencia a cetolidos itLEb (N.° probado)a
Agente antimicrobiano 50 % 90 % Intervalo
ErI-S (164)b
CEM-101 gQ.008 0,015 10,008 0,03
TEL
0,03 0,03 0,008-0,06
CLR
0,03 0,03 <0,008-0,25
AZI
0,06 0,12 ^0,008-0,5
CLN
^0,12 <0,12 ^0,12-0,5
Q/D
0,5 0,5 ^0,12-2
Amox/clav
^0,25 2 g0,25->4
Levofloxacina
1 1 0,25->4
Linezolid
1 2 0,25-2
ERI-NS, CLN- y TEL-S (48)c
CEM-101 0,03 0,12 00 o ° LO o CM VII o'
TEL
0,12 0,5 0,03-1
CLN ^0,12 0,25 ^0,12-0,25
Q/D
0,5 1 0,25-2
Amox/clav
^0,25 2 ^0,25->4
Levofloxacina
1 2 0,25->4
Linezolid
1 2 0,5-2
ERI- y CLN-NS, TEL-S (88)d
CEM-101 0,06 0,25 ^0,008-0,5
TEL
0,12 1 0,03-1
Q/D
0,5 1 0,25-2
Amox/clav
2 >8 ^0,25->8
Levofloxacina
1 1 0,25-2
Linezolid
1 1 0,5-2
a. S = susceptible y NS = no susceptible, p. ej. incluye cepas intermedias y resistentes.
b. Incluye: Streptococcus anginosus (9 cepas), S. constellatus (8 cepas), S. intermedius (7 cepas), S. mitis (2 cepas), S. oralis (3 cepas), S. pneumoniae (61 cepas), estreptococos del grupo A (29 cepas), grupo B (17 cepas), grupo C (11 cepas), grupo F (6 cepas) y grupo G (11 cepas).
c. Incluye: Streptococcus anginosus (2 cepas), S. constellatus (2 cepas), S. intermedius (3 cepas), S. mitis (7 cepas), S. oralis (7 cepas), S. pneumoniae (14 cepas), estreptococos del grupo A (1 cepa), grupo B (7 cepas) y grupo G (5 cepas).
d. Incluye: Streptococcus constellatus (1 cepa), S. pneumoniae (75 cepas), estreptococos del
grupo B (7 cepas), grupo C (2 cepas) y grupo F (3 cepas)._____________________________
Una cepa (estreptococos del grupo C) fue NS a ER, CLN y TEL, pero tuvo una CMI de CEM-101 a 0,06 pg/mL. Este es un patron emergente importante, especialmente en Europa.
15 EJEMPLO. Estreptococos susceptibles a macrolidos y resistentes a macrolidos. Se probo la actividad de CEM-101 en comparacion con las de AZI, CLR, TEL, CLN, penicilina G, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina y moxifloxacina
contra una gama de neumococos. Tambien se probo la potencia de CEM-101, eritromicina, AZI, CLR, TEL, CLN, penicilina G, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina y moxifloxacina contra 124 cepas de S. pyogenes.
Valores de CMI50 y CMI90 neumococica (pg/mL)
5
fArmaco
SUSCEPTIBLE A MACROLIDOS (50) RESISTENTE A MACROLIDOS (171)
INTERVALO CMI50 CMI90 INTERVALO CMI50 CMI90
CEM-101
0,002-0,015 0,03 0,25 0,004-1 0,06 0,25
ERI
0,03-0,25 0,06 0,125 1->64 >64 >64
AZI
0,06-0,25 0,125 0,125 1->64 >64 >64
CLR
0,015-0,06 0,03 0,06 0,25->64 32 >64
TEL
0,015-0,03 0,03 0,03 0,03-2 0,125 0,5
CLN
0,015-0,06 0,03 0,06 0,03->64 0,125 >64
AMOX/CLAV
0,015-8 0,5 2 0,015-16 1 8
PENG
0,015-8 1 2 0,008->16 1 4
LEVO
1-32 1 16 0,06-32 1 2
MOXI
0,125-8 0,25 4 0,125-4 0,25 0,5
CMI para estreptococos del grupo A
fArmaco
SUSCEPTIBLE A MACROLIDOS (26) RESISTENTE A MACROLIDOS (98)
INTERVALO CMI50 CMI90 INTERVALO CMI50 CMI90
CEM-101
0,008-0,03 0,015 0,3 0,015-1 0,06 0,5
ERI
0,03-0,25 0,06 0,125 2->64 16 >64
AZI
0,06-0,25 0,125 0,25 0,5->64 8 >64
CLR
0,015-0,06 0,03 0,06 0,25->64 4 >64
TEL
0,03-0,06 0,06 0,06 0,03-16 0,25 8
CLN
0,03-0,125 0,06 0,06 0,03->64 0,125 >64
AMOX/CLAV
0,015-0,03 0,03 0,03 <0,015-0,125 0,03 0,03
PENG
<0,008-0,125 0,015 0,015 <0,008-0,125 0,015 0,015
LEVO
0,5-1 0,5 0,5 0,5-2 0,5 1
MOXI
0,125-0,25 0,25 0,25 0,125-0,5 0,25 0,25
10 Todas las cepas de estreptococos del grupo A fueron susceptibles a penicilina G. Contra cepas susceptibles a macrolidos, las CMI de cEM-101 fueron de 0,008-0,03 pg/mL y contra cepas resistentes a macrolidos (todos los fenotipos) las CMI fueron de 0,008-0,5 pg/mL. Las CMI de TEL fueron hasta cuatro veces mas altas que las de CEM-101. Significativamente, 11/13 cepas erm(B) fueron resistentes a TEL con CMI de 4 y 8 pg/mL (6), mientras que todas tuvieron CMI de CEM-101 bajas, similares a las de otros fenotipos resistentes (intervalo de 0,01615 0,5 pg/mL).
EJEMPLO. Bacterias y antimicrobianos. Se determinaron las CMI para 221 cepas neumococicas clfnicas, que inclufan 50 organismos susceptibles a macrolidos y 171 organismos resistentes a macrolidos. Todas las cepas resistentes a macrolidos tuvieron genotipos definidos y comprendieron cepas con erm(B) (54 cepas), mef(A) (51 20 cepas), erm(B) + mef(A) (31 cepas), erm(A) (4 cepas) y mutaciones en la protefna ribosomica L4 (27 cepas) y el ARNr 23S (4 cepas). Estas 221 cepas tambien incluyeron 27 fenotipos no susceptibles a quinolonas con regiones determinantes de resistencia a quinolonas (RDRQ) (CMI de levofloxacina de 4-32 pg/mL) y los fenotipos de resistencia a todo el espectro de penicilina G usando la ultima clasificacion de susceptibilidad a penicilina V oral del Instituto de normas clfnicas y de laboratorio (CLSI) (4). Los 124 estreptococos del grupo A probados mediante CMI 25 incluyeron 26 cepas susceptibles a macrolidos y 98 resistentes a macrolidos. Las ultimas incluyeron 19 cepas con erm(B), 38 mef(A), 40 erm(A) y 1 cepa con una mutacion en L4. Puesto que las cepas de ambas especies fueron elegidas por sus fenotipos de resistencia a macrolidos, solo las cepas susceptibles fueron aisladas consistentemente recientes (2003-2008); algunas cepas resistentes se aislaron hasta cinco anos antes (1998). Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 se incluyo como la cepa de control de calidad para cada especie en cada ciclo.
Para las pruebas de seleccion de resistencia, se probaron uno de cada uno de los fenotipos de resistencia neumococica siguientes: susceptible a macrolidos, erm(B) positivo, mef(A) positivo, erm(B) + mef(A) positivo, erm(A) positivo y con mutacion en las protefnas ribosomicas (L4, L22) y el ARNr 23S. Se probaron cinco cepas de
estreptococos del grupo A con uno de susceptible a macrolidos, erm(B) positivo, mef(A) positivo, erm(A) positivo y con mutacion en L4.
Las CMI se determinaron mediante la tecnica de dilucion en agar. Se uso agar Mueller-Hinton (BD Diagnostics, 5 Sparks, Md) + 5 % de agar sangre de ovino con 104 UFC/punto e incubacion durante la noche a 35 °C en aire ambiental. Las cepas de control de calidad habituales se incluyeron en cada ciclo. Para las pruebas de seleccion de resistencia, se uso macrodilucion segun el CLSI para las pruebas de CMI.
Se probo la presencia de los genes erm(B), erm(A), mef(E) y mef(A) en todas las cepas parentales resistentes a 10 macrolidos mediante amplificacion por RCP. Se examino la presencia de mutaciones en las protefnas ribosomicas L4 y L22 y el ARNr 23S (dominios II y V) en todos los aislados parentales y en clones resistentes a CEM-101 (CMI de CEM-101 >1 pg/mL) usando cebadores y condiciones convencionales. Las secuencias de nucleotidos se obtuvieron mediante secuenciacion directa con un sistema de analisis genetico CEQ8000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA).
15
Se realizaron diariamente pases seriados de cada cepa en concentraciones subinhibitorias de todos los antimicrobianos. En todos los casos, el medio del caldo fue 1 mL por tubo de caldo Mueller-Hinton con ajuste de cationes (BD Diagnostics, Sparks, MD) + 5 % de sangre de caballo lisada. Para cada pase diario sucesivo, se tomo un inoculo (10 pl) del tubo de una a dos diluciones por debajo de la CMI que coincidfa con la turbidez de un tubo de 20 control de crecimiento. Este inoculo se uso para determinar la siguiente CMI. Se realizaron pases diarios hasta que se obtuvo un aumento significativo de la CMI (>8 veces). Se realizo un mfnimo de 14 pases, a menos que se obtuvieran CMI >32 pg/mL. El numero maximo de pases fue de 50. La estabilidad de la resistencia adquirida se determino mediante determinaciones de CMI tras 10 pases diarios de los mutantes sobre agar sangre sin antibioticos. Las CMI de cada clon neumococico resistente a cada compuesto de determinaron mediante CMI por 25 macrodilucion. La identidad de los mutantes obtenidos y sus correspondientes parentales se confirmo mediante electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) al final del estudio. La EGCP del ADN digerido con Smal se realizo usando un equipo CHEF DR III (Bio-Rad, Hercules, CA) con los parametros de ciclo siguientes: tiempo de cambio de 5 a 20 s y tiempo de ciclo de 16 h.
30 La frecuencia de mutaciones monoetapa espontaneas se determino extendiendo suspensiones (aproximadamente 1010 UFC/mL) sobre agar de Mueller-Hinton (BD Diagnostics, Sparks, MD) con un 5 % de sangre de ovino a 2, 4 y 8 x CMI. Tras incubacion a 35 °C en CO2 al 5 % durante 48 h, se calculo la frecuencia de resistencia como el numero de colonias con CMI aumentadas al menos 4 x CMI parental por inoculo. No se realizaron estudios monoetapa con AZI, CLR, CLN y TEL para cepas con CMI >4 pg/mL. Los resultados de las pruebas de CMI neumococica se 35 presentan en las tablas siguientes.
CMI (pg/mL) de farmacos contra cepas neumococicas
Farmaco
Intervalo de CMI CMI50 CMI90
Penicilina G (221a)
0,008->16 1 4
Penicilina S (53)
0,008-0,06 ,03 ,06
Penicilina I (63)
0,125-1 ,5 1
Penicilina R (105)
2->16 4 8
Macrolido S (50)
0,015-8 1 2
erm(B) (54)
0,03-16 1 4
mef(A) (51)
0,008-4 0,125 4
erm(A) (4)
0,03-0,03
erm(B) + mef(A) (31)
0,03-8 2 4
L4 (27)
1->16 4 16
ARNr 23S (4)
0,015-0,5
Quinolona S (195)
0,008->16 1 4
Quinolona R (27)
0,015-8 0,25 4
CEM-101
0,002-1 0,03 0,25
Penicilina S
0,002-0,25 0,03 0,125
Penicilina I
0,002-0,25 0,03 0,25
Penicilina R
0,004-1 0,06 0,25
Macrolido S
0,002-0,015 0,008 0,015
erm(B)
0,004-1 0,03 0,5
mef(A)
0,008-0,25 0,03 0,125
erm(A)
0,008-0,015
erm(B) + mef(A)
0,015-1 0,125 0,25
L4
0,03-0,125 0,06 0,125
ARNr23S
0,002-0,03
Quinolona S
0,002-1 0,03 0,25
Quinolona R
0.004-,25 0,008 0,06
Eritromicina
0,03->64 64 >64
Penicilina S
0,03->64 4 >64
Penicilina I
0,03->64 >64 >64
Penicilina R
0,03->64 >64 >64
Macrolido S
0,03-0,25 0,06 0,125
erm(B)
16->64 >64 >64
mef(A)
1->64 4 32
erm(A)
2-4
erm(B) + mef(A)
4->64 >64 >64
L4
4->64 >64 >64
ARNr23S
8->64
Quinolona S
0,03->64 >64 >64
Quinolona R
0,03->64 0,06 >64
AZI
0,06->64 16 >64
Penicilina S
0,06->64 4 >64
Penicilina I
0,06->64 >64 >64
Penicilina R
0,06->64 >64 >64
Macrolido S
0,06-0,25 0,125 ,0125
erm(B)
>64 ->64 >64 >64
mef(A)
1->64 4 8
erm(A)
2-8
erm(B) + mef(A)
2->64 >64 >64
L4
2->64 >64 >64
ARNr23S
32->64
Quinolona S
0,06->64 >64 >64
Quinolona R
0,06->64 0,125 >64
CLR
0,125->64 8 >64
Penicilina S
0,015->64 1 >64
Penicilina I
0,03->64 16 >64
Penicilina R
0,015->64 16 >64
Macrolido S
0,015-0,06 0,03 0,06
erm(B)
4->64 >64 >64
mef(A)
0,5-32 2 4
erm(A)
0,25-0,5
erm(B) + mef(A)
1->64 >64 >64
L4
1-32 16 32
ARNr23S
8-16
Quinolona S
0,015 ->64 16 >64
Quinolona R
0,015->64 0,03 >64
TEL
0,015-2 0,06 0,5
Penicilina S
0,015-1 0,06 0,25
Penicilina I
0,015-1 0,06 0,5
Penicilina R
0,015-2 0,125 0,5
Macrolido S
0,015-0,03 0,03 0,03
erm(B)
0,03-2 0,06 1
mef(A)
0,03-0,5 0,125 0,25
erm(A)
0,03-0,06
erm(B) + mef(A)
0,03-2 0,5 1
L4
0,06-0,25 0,125 0,25
ARNr23S
0,03-0,06
Quinolona S
0,015-2 0,125 0,5
Quinolona R
0,015-1 0,03 0,125
CLN
0,015->64 0,06 >64
Penicilina S
0,03->64 0,06 >64
Penicilina I
0,03->64 0,125 >64
Penicilina R
0,015->64 0,06 >64
Macrolido S
0,015-0,06 0,03 0,06
erm(B)
0,06->64 >64 >64
mef(A)
0,03-0,125 0,06 0,06
erm(A)
0,125-0,25
erm(B) + mef(A)
0,03->64 0,06 >64
L4
0,03-0,125 0,06 0,125
ARNr23S
0,03-1
Quinolona S
0,015->64 0,06 >64
Quinolona R
0,03-64 0,03 64
Amoxicilina/Clavulanato
0,015-16 0,05 8
Penicilina S
0,015-0,125 0,03 0,06
Penicilina I
0,03-2 0,5 1
Penicilina R
0,125-16 2 8
Macrolido S
0,015-8 0,5 2
erm(B)
0,015-8 0,5 8
mef(A)
0,015-8 0,125 2
erm(A)
0,03-0,03
erm(B) + mef(A)
0,03-16 2 8
L4
0,125-8 4 8
ARNr23S
0,03-0,06
Quinolona S
0,015-16 1 8
Quinolona R
0,015-4 0,5 2
Levofloxacina
0,06-32 1 8
Penicilina S
0,06-32 1 16
Penicilina I
1-32 1 2
Penicilina R
0,5-16 1 2
Macrolido S
1-32 1 16
erm(B)
0,5-32 1 2
mef(A)
0,5-8 1 2
erm(A)
1-1
erm(B) + mef(A)
1-16 1 16
L4
0,5-16 1 2
ARNr23S
0,06-1
Quinolona S
0,06-2 1 2
Quinolona R
4-32 16 16
Moxifloxacina
0,125-8 0,25 2
Penicilina S
0,125-8 0,5 4
Penicilina I
0,125-4 0,25 0,5
Penicilina R
0,125-4 0,25 0,5
Macrolido S
0,125-8 0,25 4
erm(B)
0,125 0,25 0,5
mef(A)
0,125-4 0,25 0,5
erm(A)
0,25-0,5
erm(B) + mef(A)
0,125-2 0,25 0,5
L4
0,125-4 0,25 0,5
ARNr23S
0,25-0,5
Quinolona S
0,125-1 0,25 0,5
Quinolona R
0,5-8 4 4
a N.° de cepas probadas.
Valores de CMI50 y CMI90 (pg/mL) de cepas neumococicas con mecanismo de resistencia a macrolidos definido
Farmaco
erm(B) (54) mef(A) (51) erm(B) + mef(A) (31) Mutaciones en L4 (27)
CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90
CEM-101
0,03 0,5 0,03 0,125 0,125 0,25 0,06 0,125
Eritromicina
>64 >64 4 32 >64 >64 >64 >64
AZI
>64 >64 4 8 >64 >64 >64 >64
CLR
>64 >64 2 4 >64 >64 16 32
TEL
0,06 1 0,125 0,25 0,5 1 0,125 0,25
CLN
>64 >64 0,06 0,06 0,06 >64 0,06 0,125
Amoxicilina/Clavulanato
0,5 8 0,125 2 2 8 4 8
Levofloxacina
1 2 1 2 1 16 1 2
Moxifloxacina
0,25 0,5 0,25 0,5 0,25 0,5 0,25 0,5
Penicilina G
1 4 0,125 4 2 4 4 16
CEM-101 tuvo un intervalo de CMI contra neumococos susceptibles a macrolidos de 0,002-0,015 pg/mL y un intervalo contra neumococos resistentes a macrolidos (todos los fenotipos) de 0,004-1 pg/mL. Solo 3 cepas con 5 erm(B) [con y sin mef(A)] tuvieron CMI de CEM-101 de 1,0 pg/mL y 218/221 cepas tuvieron CMI de CEM-101 de <0,5 pg/mL. En cambio, los intervalos de CMI de TEL fueron de 0,015-0,03 pg/mL para cepas susceptibles a macrolidos y 0,015-2 pg/mL para cepas resistentes a macrolidos. Las CMI de CEM-101 fueron hasta cuatro veces mas bajas que las de la TEL contra cepas susceptibles a macrolidos y resistentes a macrolidos. Todas las cepas estreptococicas del grupo A fueron susceptibles a penicilina G. Las CMI se presentan en las tablas siguientes.
10
CMI (pg/mL) de farmacos contra estreptococos del grupo A
Farmaco
Intervalo de CMI CMI50 CMI90
CEM-101 (124a)
0,008-1 0,06 0,5
Macrolido S (26)
0,008-0,03 0,015 0,03
Erm(B) (19)
0,03-1 0,5 1
Mef(A) (38)
0,06-0,25 0,125 0,25
Erm(A) (40)
0,016-0,5 0,03 0,125
L4 (1)
0,06
Eritromicina
0,03->64 16 >64
Macrolido S
0,03-0,25 0,06 0,125
Erm(B)
>64 ->64 >64 >64
Mef(A)
8-32 16 32
Erm(A)
2->64 4 >64
L4
2
AZI
0,06->64 8 >64
Macrolido S
0,06-0,25 0,125 0,25
Erm(B)
>64 ->64 >64 >64
Mef(A)
0,5-16 8 8
Erm(A)
2->64 16 >64
L4
2
CLR
0,015->64 4 >64
Macrolido S
0,015-0,06 0,03 0,06
Erm(B)
32->64 >64 >64
Mef(A)
0,5-8 4 8
Erm(A)
0,25->64 2 >64
L4
1
TEL
0,03-16 0,125 8
Macrolido S
0,03-0,06 0,06 0,06
Erm(B)
0,03-16 8 16
Mef(A)
0,125-1 0,5 1
Erm(A)
0,03-0,25 0,06 0,125
L4
0,06
Amoxicilina/Clavulanato
<0,015-0,125 0,03 0,03
Macrolido S
0,015-0,03 0,03 0,03
Erm(B)
<0,015-0,125 <0,015 0,03
Mef(A)
<0,015-0,125 0,015 0,06
Erm(A)
<0,015-0,03 0,03 0,03
L4
0,03
Levofloxacina
0,5-2 0,5 1
Macrolido S
0,5-1 0,5 0,5
Erm(B)
0,5-1 0,5 1
Mef(A)
0,5-2 0,5 1
Erm(A)
0,5-2 0,5 1
L4
0,5
Moxifloxacina
0,0125-0,5 0,25 0,25
Macrolido S
0,125-0,25 0,25 0,25
Erm(B)
0,125-0,25 0,25 0,25
Mef(A)
0,25-0,5 0,25 0,25
Erm(A)
0,125-0,5 0,25 0,25
L4
0,25
Pen G
<0,008-0,125 0,015 0,015
Macrolido S
0,008-0,015 0,015 0,015
Erm(B)
<0,008-0,125 0,015 0,015
Mef(A)
<0,008-0,125 0,015 0,03
Erm(A)
<0,008-0,015 0,015 0,015
L4
0,015
CLN
0,03->64 0,125 >64
Macrolido S
0,03-0,125 0,06 0,06
Erm(B)
0,06->64 >64 >64
Mef(A)
0,03-0,125 0,06 0,125
Erm(A)
0,06-0,5 0,125 0,25
L4
0,06
a Numero de cepas probadas
Valores de CMI50 y CMI90 (pg/mL) de cepas estreptococicas del grupo A con mecanismos de resistencia a macrolidos definidos
erm(B) (19) mef(A) (38) erm(A) (40)
Farmaco
CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90
CEM-101
0,5 1 0,125 0,25 0,03 0,125
Eritromicina
>64 >64 16 32 4 >64
AZI
>64 >64 8 8 16 >64
CLR
>64 >64 4 8 2 >64
TEL
8 16 0,5 1 0,06 0,125
CLN
>64 >64 0,06 0,125 0,125 0,25
Amoxicilina/clavulanato
<0,015 0,03 0,015 0,06 0,03 0,03
Levofloxacina
0,5 1 0,5 1 0,5 1
Moxifloxacina
0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Penicilina G
0,015 0,015 0,015 0,03 0,015 0,015
5
Contra cepas susceptibles a macrolidos, las CMI de CEM-101 fueron de 0,008-0,03 pg/mL y contra las cepas resistentes a macrolidos (todos los fenotipos) las CMI fueron de 0,015-1 pg/mL. Las CMI de TEL fueron hasta cuatro veces mas altas que las de CEM-101. La mayorfa (17/19) de cepas erm(B) fueron resistentes a TEL con CMI de 4 y 16 pg/mL, mientras que todas tuvieron CMI de CEM-101 bajas, similares a las de otros fenotipos de resistencia 10 (intervalo de 0,03-1 pg/mL). Los resultados de los estudios de seleccion de resistencia neumococica multietapa se presentan en la tabla siguiente.
Resultados de la seleccion multietapa de S. pneumoniae.
N.° de cepa
Resistencia Volver a probar la CMI tras 10 subcultivos
Fenotipo [determinantes de
seleccionada antibiotico-n.° de cepa libres de farmaco
R1 Farmaco
CMI inicial (|jg/mL) CMI N.° de pases CEM AZI CLA TEL CLI
1077 Macrolido-S
CEM-101
0,008 0,06 43 0,06 0,03 0,06 0,06a 0,03
AZI
0,03 >64 29 0,03 >64 >64 0,125 4
CLR
0,016 0,008 50 - - - - -
TEL
0,004 0,25 15 0,06 >64 >64 0,25 8
CLN
0,016 4 49 0,06 >64 >64 0,06 8
24 Macrolido- R[erm(B)1
CEM-101
0,004 0,06 14 0,06 >64 >64 0,125 >64
AZI
>64 NP NP - - - - -
CLR
>64 NP NP - - - - -
TEL
0,25 32 14 0,06 >64 >64 16 >64
CLN
>64 NP NP - - - - -
3665 Macrolido-R [mef(A)1
CEM-101
0,03 0,5 14 0,5 16 4 0,25 0,03
AZI
8 16 50 - - - - -
CLR
2 16 26 0,06 8 8 0,06 0,03
TEL
0,125 2 14 0,03 4 2 0,25 0,03
CLN
0,016 0,03 50 - - - - -
1076 Macrolido-R [erm(B) + mef(A)1
CEM-101
1 32 18 32 >64 >64 32 >64
AZI
>64 NP NP - - - - -
CLR
>64 NP NP - - - - -
TEL
0,5 >64 14 2 >64 >64 >64 >64
CLN
64 NP NP - - - - -
1635 Macrolido-R [erm(A)1
CEM-101
0,008 0,06 32 0,125 4 1 0,03 0,03
AZI
2 >64 14 0,004 >64 >64 0,004 0,03
CLR
0,5 >64 49 0,008 >64 >64 0,016 0,25
TEL
0,004 0,008 50 - - - - -
CLN
0,06 >64 14 0,004 4 0,5 0,008 >64
2686 Macrolido-R [mutacion en L41
CEM-101
0,03 0,5 22 1 >64 32 0,25 0,03
AZI
>64 NP NP - - - - -
CLR
8 >64 14 0,03 >64 >64 0,06 0,03
TEL
0,06 0,5 25 0,016 >64 16 0,5 0,03
CLN
0,03 0,125 50 - - - - -
7127 Macrolido-S [S20N en L4, A105V en L221
CEM-101
0,008 0,125 16 0,06 0,06 0,125 0,06 0,03
AZI
0,06 0,5 29 0,016 1 0,5 0,016 0,06
CLR
0,03 16 15 0,008 >64 16 0,008 1
TEL
0,008 0,06 38 0,008 0,06 0,06 0,03 0,03
CLN
0,03 0,25 43 0,004 0,03 0,016 0,008 0,25
3009 Macrolido-R [mutacion en 23SrRNA1
CEM-101
0,016 0,25 20 0,25 >64 >64 0,06 1
AZI
>64 NP NP - - - - -
CLR
16 >64 25 0,03 >64 64 0,06 1
TEL
0,016 0,03 50 - - - - -
CLN
1 2 50 - - - - -
b Reactividad cruzada indicada en negrita.
Para neumococos, las CMI parentales (pg/mL) fueron: CEM-101, 0,004-1; AZI, 0,03-8; CLR, 0,016-16; TEL, 0,0040,5; CLN, 0,016-1. Cuatro cepas con cMi de AZI, dos con CLR y dos con CLN >64 pg/mL no se probaron. Las CMI de CEM-101 aumentaron tras 14-43 dfas en las 8 cepas probadas. Para 7 cepas, las CMI subieron de 0,0045 0,03 pg/mL (parentales) a 0,06-0,5 pg/mL (clones resistentes) en 14-43 dfas. Para la octava cepa, que contenfa erm(B) + mef(A), las CMI subieron de 1 pg/mL (parental) a 32 pg/mL (clon resistente) en 18 dfas. Este clon resistente a CEM-101 se sometio a analisis de secuenciacion, que revelo ausencia de alteraciones en las protefnas L4 y L22 y en los dominios II y V del ARNr 23S en comparacion con las secuencias parentales. La AZI tenia clones resistentes tras 14-29 dfas en 3/4 cepas, con CMI que subfan de 0,03-2 pg/mL (parentales) a 0,5->64 pg/mL (clones 10 resistentes). La CLR tenia clones resistentes tras 14-49 dfas en 5/6 cepas, con CMI que subfan de 0,03-16 pg/mL (parentales) a 16->64 pg/mL (clones resistentes). La TEL tenia clones resistentes estables tras 14-38 dfas en 5/8 probadas, con CMI que subfan de 0,004-0,5 pg/mL (parentales) a 0,06->64 pg/mL (clones resistentes). La CLR tenia clones resistentes tras 14-43 dfas en 2/5 cepas, con CMI que subfan de 0,03-0,06 pg/mL (parentales) a 0,25- >64 pg/mL (clones resistentes).
15
Los resultados para S. pyogenes se muestran en la tabla siguiente.
Resultados de la seleccion multietapa de S. pyogenes
N.° de cepa Fenotipo [determinantes de R] Antibiotico
CMI inicial (pg/mL) Resistencia seleccionada Volver a probar CMI tras 10 subcultivos libres de antibiotico
2132 Macrolido-S
CEM-101
0,008 0,016 50 CEM AZI CLA TEL CLI
AZI
0,06 1 28 0,016 1 0.25b 0,03 0,03
CLR
0,03 0,016 50 - - - - -
TEL
0,008 0,03 50 - - - - -
CLN
0,06 0,06 50 - - - - -
2368 Macrolido-R [erm(B)]
CEM-101
1 8 18 8 >64 >64 >64 >64
AZI
>64 NP NP - - - - -
CLR
>64 NP NP - - - - -
TEL
8 >64 6 0,5 >64 >64 >64 >64
CLN
>64 NP NP - - - - -
2094 Macrolido-R [erm(A)]
CEM-101
0,03 0,25 43 0,25 4 8 0,5 0,06
AZI
4 >64 5 0,016 >64 1 0,03 0,06
CLR
0,5 >64 6 0,016 >64 >64 0,03 0,06
TEL
0,03 0,25 22 0,03 >64 8 0,125 >64
CLN
0,06 >64 34 0,03 16 1 0,03 >64
2011 Macrolido-R [mef(A)]
CEM-101
0,125 0,125 50 - - - - -
AZI
4 32 35 0,06 16 4 0,25 0,06
CLR
4 8 50 - - - - -
TEL
0,5 1 50 - - - - -
CLN
0,06 0,06 50 - - - - -
237 Macrolido-R [mutacion en L4]
CEM-101
0,03 0,25 20 0,5 4 1 1 0,03
AZI
4 8 50 - - - - -
CLR
0,25 1 50 - - - - -
TEL
0,06 0,125 50 - - - - -
CLN
0,06 0,5 43 0,03 8 0,5 0,06 1
b Reactividad cruzada indicada en negrita.
Las CMI parentales (pg/mL) fueron: CEM-101, 0,008-1; AZI, 0,06-4; CLR, 0,03-4; TEL, 0,008-8; CLN, 0,06. Las CMI de una cepa con AZI, CLR y CLN >64 pg/mL no se probaron. Las CMI de CEM-101 aumentaron tras 18-43 dfas en 3/5 cepas, subiendo de 0,03-1 pg/mL (parentales) a 0,25-8 pg/mL (clones resistentes). El clon resistente con CMI de 5 CEM-101 de 8 pg/mL se sometio a analisis de secuenciacion, que no mostro cambios en ninguno de los genes (L4, L22 y los dominios II y V del ARNr 23S) probados. Las CMI de CEM-101 para los 2 clones restantes no subieron por encima de 0,25 pg/mL cuando se continuaron los pases durante el plazo maximo de 50 dfas. La AZI tema clones resistentes tras 5-35 dfas en 3/4 cepas probadas, con CMI que subfan de 0,06-4 pg/mL (parentales) a 1->64 pg/mL (clones resistentes). La CLR tema clones resistentes tras 6 dfas en 1/4 cepas probadas, con CMI que subfan de 10 0,5 pg/mL (parentales) a >64 pg/mL (clon resistente). La TEL tema clones resistentes tras 6-22 dfas en 2/5 cepas probadas, con CMI que subfan de 0,03-8 pg/mL (parentales) a 0,25->64 pg/mL (clones resistentes). La CLN tema clones resistentes tras 34-43 dfas en 2/4 cepas probadas, con CMI que subfan de 0,06 pg/mL (parentales) a 0,5- >64 pg/mL (clones resistentes). Resultados de los estudios de seleccion de resistencia monoetapa para neumococos se presentan en la tabla siguiente.
15
Frecuencias de mutacion monoetapa de S. pneumoniae
Numero de cepa
Fenotipo Tdeterminantes de R| Farmaco seleccionado 2x CMI 4x CMI 8x CMI
1077
Macrolido-Sa CEM-101 <9,1 x 10'9 <9,1 x 10'9 <9,1 x 10'9
Azitromicina
7,2 x 10'9 <1,9 x 10'10 <1,9 x 10'10
Claritromicina
1,1 x 10'9 <1,2 x 10'10 <1,2 x 10'10
Telitromicina
1,1 x 10'9 <5,5 x 10'10 <5,5 x 10'10
Clindamicina
<3,8 x 10'10 <3,8 x 10'10 <3,8 x 10'10
24
Macrolido-Ra [erm(B)j CEM-101 1,8 x 10'7 <5,0 x 10'9 <5,0 x 10'9
Azitromicina
NP NP NP
Claritromicina
NP NP NP
Telitromicina
1,3 x 10'4 2,5 x 10'6 1,7 x 10'6
Clindamicina
NP NP NP
3665
Macrolido-R [mef(A)] CEM-101 6,8 x 10'7 1,4 x 10'7 <4,5 x 10'10
Azitromicina
NP NP NP
Claritromicina
5,0 x 10'7 <5,0 x 10'10 <5,0 x 10'10
Telitromicina
7,5 x 10'9 2,5 x 10'9 <2,5 x 10'10
Clindamicina
<2,4 x 10'10 <2,4 x 10'10 <2,4 x 10'10
1076
Macrolido-R [erm(B) + mef(A)] CEM-101 <2,5 x 10'8 7,5 x 10'9 2,0 x 10'9
Azitromicina
NP NP NP
Claritromicina
NP NP NP
Telitromicina
6,5 x 10'6 9,7 x 10'6 4,8 x 10'6
Clindamicina
NP NP NP
1635
Macrolido-R [erm(A)] CEM-101 1,6 x 10'8 <2,0 x 10'10 <2,0 x 10'10
Azitromicina
<2,0 x 10'10 <2,0 x 10'10 <2,0 x 10'10
Claritromicina <3,1 x 10-9 <3,1 x 10-9 <3,1 x 10-9
Telitromicina
<2,7 x 10-9 <2,7 x 10-9 <2,7 x 10-9
Clindamicina
7,3 x 10-7 5,5 x 10-7 5,6 x 10-7
Frecuencias de mutacion monoetapa de S. pneumoniae (continuacion)
2686
Macrolido-R [mutacion en L4] CEM-101 <2,5 x 10-9 <2,5 10-9 x <2,5 10-9 x
Azitromicina NP NP NP
Claritromicina NP NP NP
Telitromicina 2,2 x 10-5 2,2 x 10 -9 <1,1 10-9 x
Clindamicina <1,2 x 10-9 <1,2 10-9 x <1,2 10-9 x
7127
Macrolido-S [S20N en L4, A105V en L22] CEM-101 <2,0 x 10-10 <2,0 10-10 x <2,0 10-10 x
Azitromicina <2,0 x 10-10 <2,0 10-10 x <2,0 10-10 x
Claritromicina <1,0 x 10-9 <1,0 10-9 x <1,0 10-9 x
Telitromicina <5,0 x 10-9 <5,0 10-9 x <5,0 10-9 x
Clindamicina <2,9 x 10'8 <2,9 10-8 x <2,9 10-8 x
3009
Macrolidos-R [mutacion en ARNr 23S] CEM-101 <5,9 x 10-9 <5,9 10-9 x <5,9 10-9 x
Azitromicina NP NP NP
Claritromicina NP NP NP
Telitromicina 3,8 x 10-7 <1,5 10-10 x <1,5 10-10 x
Clindamicina 1,7 x 10-4 7,3 x 10 -9 <1,2 10-10 x
a S = Susceptible; R = Resistente
5 De los mismos 4 comparadores usados en la seleccion multietapa, se probo su propension a producir mutaciones espontaneas. Las frecuencias de seleccion de mutantes para CEM-101 variaron de <2,0 x 10'10-6,8 x 10-7 at 2x CMI a <2,0 x 10-10-9,1 x 10-9 a 8x CMI. Estos comparadores tuvieron frecuencias de resistencia mas altas: TEL, 1,1 x 10' 9-1,3 x 10-4 a 2x CMI a <1,5 x 10-10-4,8 x 10-6 a 8xCMI; CLN, <2,4 x 10-10-1,7 x 10-4 a 2x CMI a <1,2 x 10-10-5,6 x 10-7 a 8x CMI; y CLR, <1,0 x 10-9-5,0 x 10-7 a 2x CMI a <1,2 x 10-10-<3,1 x 10-9 a 8x CMI. Se ensayo un numero pequeno, 10 3 cepas, con AZI; las frecuencias de seleccion de mutantes fueron <2,0 x 10-10-7,2 x 10-9 a 2xCMI a <1,9 x 10-<2,0 x 10-10 a 8x CMI. Los resultados de los estudios de seleccion de resistencia monoetapa para S. pyogenes se presentan en la tabla siguiente.
Frecuencias de mutacion monoetapa de S. pyogenes 15
Numero de cepa
Fenotipo [determinantes de R] Farmaco seleccionado 2x CMI 4x CMI 8x CMI
2132
Macrolido-Sa CEM-101 <1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10
Azitromicina
<1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10
Claritromicina
<1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10
Telitromicina
<8,3 x 10'11 <8,3 x 10'11 <8,3 x 10'11
Clindamicina
<7,7 x <7,7 x <7,7 x
10-11 10-11 10-11
2368
Macrolido-Ra [erm(B)] CEM-101 <5,9 x 10'11 <5,9 x 10'11 <5,9 x 10'11
Azitromicina
NP NP NP
Claritromicina
NP NP NP
Telitromicina
NP NP NP
Clindamicina
NP NP NP
2094
Macrolido-R [erm(A)] CEM-101 5,3 x 10'8 2,1 x 10'9 <5,3 x 10'10
Azitromicina
NP NP NP
Claritromicina
1,7 x 10'7 1,0 x 10'7 5,0 x 10'9
Telitromicina
7,7 x 10'8 <1,5 x 10'10 <1,5 x 10'10
Clindamicina
2,1 x 10'7 1,3 x 10'7 1,1 x 10'7
2011
Macrolido-R [mef(A)] CEM-101 3,9 x 10'8 <1,1 x 10'10 <1,1 x 10'10
Azitromicina
NP NP NP
Claritromicina
NP NP NP
Telitromicina
3,8 x 10'8 <6,3 x 10'10 <6,3 x 10'10
Clindamicina
<1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10
237
Macrolido-R [mutacion en L4] CEM-101 <1,3 x 10'10 <1,3 x 10'10 <1,3 x 10'10
Azitromicina
NP NP NP
Claritromicina
<3,3 x 10'10 <3,3 x 10'10 <3,3 x 10'10
Telitromicina
<2,0 x 10'10 <7,0 x 10'10 <2,0 x 10'10
Clindamicina
<1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10 <1,0 x 10'10
a S = Susceptible; R = Resistente
Al igual que con los neumococos, de los 4 comparadores usados en la seleccion multietapa se probo su propension a producir mutaciones espontaneas. Las frecuencias de seleccion de mutantes para CEM-101 variaron de <5,9 x 1011-5,3 x 10-8 a 2x CMI a <5,9 x 10-11-<5,3 x 10-10 a 8x CMI. Los siguientes comparadores tuvieron frecuencias de 5 resistencia mas altas que CEM-101: CLN, <7,7 x 10-11-2,1 x 10-7 a 2x CMI a <7,7 x 10-11-1,1 x 10-7 a 8x CMI; y CLR, <1,0 x 10-10-1,7 x 10-7 a 2x CMI a <1,0 x 10-10-5,0 x 10-9 a 8x CMI. Las frecuencias de TEL fueron similares a las de CEM-101: <8,3 x 10-11-7,7 x 10-8 a 2x CMI a <8,3 x 10-11 -<6,3 x 10-10 a 8x CMI. La frecuencia de mutacion para la unica cepa sensible a macrolidos probada con AZI fue <1,0 x 10-10 a 2x y 8x CMI.
10 Los compuestos descritos en el presente documento demuestran potencia mejorada en comparacion con la TEL, con actividad contra organismos TEL-intermedios y TEL-resistentes. Los compuestos descritos en el presente documento muestran una potencia significativamente superior contra S. aureus fagocitados, en comparacion con TEL, AZI y CLR. Los compuestos descritos en el presente documento tambien son 50 y 100 veces mas potentes que la AZI contra L. monocytogenes y L. pneumophila fagocitados. Los compuestos descritos en el presente documento 15 presentan el espectro de actividad mas amplio contra patogenos del tracto respiratorio, incluyendo los neumococos multirresistentes de tipo 19A, en comparacion con AZI, CLR, eritromicina, TEL, CLN y quinupristina/dalfopristina. Los compuestos descritos en el presente documento tambien son potentes contra C. trachomatis, C. pneumoniae, micoplasmas y ureaplasmas humanos, y las CMI tambien senalan utilidad clfnica contra la mayorfa de enterococos, gonococos y anaerobios gram-positivos. Los compuestos descritos en el presente documento son activos contra 20 organismos comunes que provocan gastroenteritis, tales como Campylobacter jejuni, Salmonella y Shigella, y tambien son activos contra Helicobacter pylori. Los compuestos descritos en el presente documento demuestran ser mas bactericidas contra varias especies gram-positivas que la TEL, con efectos posantibioticos de 2,3-6,1 y 3,7-5,3 contra cepas gram-positivas y gram-negativas, respectivamente. Los compuestos descritos en el presente documento demuestran actividad in vivo significativa en una variedad de modelos de infeccion en murinos. Los 25 estudios multietapa preliminares muestran que los compuestos descritos en el presente documento tienen una
variacion nula o baja de las CMI en una cepa de cada una de S. aureus, Enterococcus faecalis y 2 S. pneumoniae; se encuentran bajas tasas de mutantes espontaneos en los experimentos monoetapa.
Los compuestos descritos en el presente documento tienen CMI que son generalmente de al menos 1 o 2 diluciones 5 inferiores a las de TEL contra todos los fenotipos de resistencia de S. pneumoniae y S. pyogenes probados, incluyendo los neumococos tipo 19A resistentes a farmacos y los S. pyogenes erm(B) positivos. CEM-101 produjo clones con CMI superiores en las 8 cepas neumococicas, pero 7 de las 8 cepas tuvieron clones con CMI de CEM- 101 <0,5 pg/mL y en unicamente 1 cepa erm(B) + mef(A) con una CMI parental de 1 pg/mL se encontro un clon resistente con una CMI de 32 pg/mL. En 2 de los 3 clones de S. pyogenes resistentes a CEM-101 [parentales 10 erm(A), L4], las CMI fueron de 0,25 pg/mL y unicamente en la 1 cepa con erm(B) las CMI de CEM-101 subieron de 1 a 8 pg/mL. Los estudios monoetapa tambien mostraron baja produccion de mutaciones espontaneas en comparacion con otros agentes probados.
Con base en las farmacocineticas de los informes de ensayos clfnicos fase 1, las recomendaciones para los valores 15 crfticos de susceptibilidad de CEM-101 provisionales se han fijado en <1 pg/mL como susceptible y >4 pg/mL como resistente a estreptococos.
EJEMPLO. Estafilococos, estreptococos p-hemolfticos y del grupo viridans. Se realizaron pruebas S a una coleccion de aislados clfnicos de 2006-2007 mediante los procedimientos del CLSI (M7-A7) con criterios interpretativos 20 asociados (M100-S18) y suplementos (2-5 % de sangre lisada de caballo, LHB, por sus siglas en ingles) para pruebas estreptococicas. Se usaron CEM-101, TEL (TEL) y 10 comparadores frente a 201 S. aureus (75 SARM-TS, 75 SASM-TS, 30 SARM-EH, 17 SAIV o SAIVh, 7 SARV), 100 estafilococos coagulasa-negativos (ECoN; 10 especies), 100 estreptococos p-hemolfticos (EBH; 30 del grupo A, 31 del grupo B, 14 del grupo C, 9 del grupo F, 16 del grupo G) y 51 estreptococos del grupo viridans (EGV; 5 especies), vease la tabla.
25
Las cepas de SASM fueron ligeramente mas CEM-101-S (CMI50, 0,06 pg/mL) que las cepas SARM o SARM-EH (CMI50, 0,12 pg/mL). Las SAIV, SAIVh y SARV fueron generalmente mas refractarias a CEM-101 y TEL. CEM-101 fue 2 veces mas potente que la TEL contra todos los estafilococos. Los estreptococos fueron muy S a CEM-101 (CMI90, 0,03-0,06 pg/mL) y TEL fue 4 veces menos activa que los aislados no S de EBH observados. Los 30 estafilococos ERI-R permanecieron CEM-101-S excepto para aislados TEL- y CLN (CC)-R, pero todos los EBH y EGV fueron S a CEM-101.
CMI de CEM-101 ( pg/mL) CMI de TEL (pg/mL)
Organismos (n.°)
50 % 90 % Intervalo 50 % 90 % Intervalo
SASM (75)
0,06 0,12 0,03->16 0,12 0,25 0,06->16
SARM (75)
0,12 >16 0,03->16 0,25 >16 0,06->16
SARM-EH (30)
0,12 0,12 0,06-0,12 0,25 0,25 0,12-0,5
SAIV, SAIVh (14)
>16 >16 0,06->16 >16 >16 0,25->16
SARV (7)
>16 - 0,12->16 >16 - 0,12->16
ECoN (100)
0,06 >16 0,03->16 0,12 >16 0,03->16
EBH (100)
0,015 0,03 <0,008-0,12 0,03 0,12 <0,008-2
EGV (51)
<0,008 0,06 <0,008-0,12 0,015 0,25 <0,008-0,5
CEM-101 fue potente contra todos los estafilococos (CMI50, 0,06 pg/mL), excepto las cepas CC-R, e inhibio a todos 35 los estreptococos a <0,12 pg/mL. La actividad fue de 2 a 4 veces superior a la de la TEL.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto de la formula
    imagen1
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que:
    R10 es hidrogeno o acilo;
    X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar carbonilo;
    10 V es C(O);
    W es H, F, Cl, Br, I u OH;
    A es CH2, C(O), C(O)O, C(O)NH, S(O)2, S(O)2NH, C(O)NHS(O)2;
    B es (CH2)n en el que n es un numero entero que varfa de 0-10, o B es una cadena carbonada insaturada de 2-10 carbonos; y
    15 C es hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, aminoarilo, alquilaminoarilo, acilo, aciloxi, sulfonilo, ureido o carbamoilo; para uso en el tratamiento de una enfermedad provocada, al menos en parte, por un organismo que es resistente a una o mas penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, azitromicina, claritromicina o una combinacion de las mismas.
    20 2. Un compuesto para uso segun la reivindicacion 1, en el que A es CH2, B es (CH2)n y n es un numero
    entero de 2-4.
  2. 3. Un compuesto para uso segun una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que C es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido.
    25
  3. 4. Un compuesto para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que C es 3- aminofenilo o 3-piridinilo; preferiblemente C es 3-aminofenilo.
  4. 5. Un compuesto para uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R10 es 30 hidrogeno.
  5. 6. Un compuesto para uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que A y B se toman juntos para formar butileno o pentileno; preferiblemente A y B se toman juntos para formar butileno.
    35 7. Un compuesto para uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que W es H o F;
    preferiblemente W es F.
  6. 8. Un compuesto para uso segun la reivindicacion 1, en el que C es fenilo opcionalmente sustituido; preferiblemente C es fenilo, halofenilo, haloalquilfenilo o aminofenilo; mas preferiblemente C es aminofenilo.
    40
  7. 9. Un compuesto para uso segun la reivindicacion 1, en el que C es piridinilo opcionalmente sustituido; preferiblemente C es 2-piridinilo y 3-piridinilo; mas preferiblemente C es 3-piridinilo.
  8. 10. Un compuesto para uso segun la reivindicacion 1, en el que C es benzotriazol opcionalmente 45 sustituido.
  9. 11. Un compuesto para uso segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto es de la formula
    imagen2
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
    5
  10. 12. Un compuesto para uso segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto es de la formula
    imagen3
    10 13. Un compuesto para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el organismo
    es un SARM, neumococo MR o S. pneumoniae serotipo 19A.
  11. 14. Un compuesto para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el organismo es un Neisseria gonorrhoeae, micoplasma, ureaplasma, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis,
    15 Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae o clamidia.
  12. 15. Un compuesto para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la cantidad terapeuticamente efectiva es bactericida para al menos uno de S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae, S. pyogenes y S. mitis.
    20
  13. 16. Un compuesto para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el organismo es resistente a claritromicina.
  14. 17. Un compuesto para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el organismo es
    resistente a azitromicina.
  15. 18. Una composicion para uso en el tratamiento de una enfermedad provocada, al menos en parte, por un
    organismo que es resistente a una o mas penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, azitromicina, claritromicina o una 5 combinacion de las mismas,
    comprendiendo la composicion uno o mas compuestos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y uno o mas vehfculos, excipientes o diluyentes de los mismos farmaceuticamente aceptables, o una combinacion de los mismos.
    10
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