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MX2012005809A - Agentes de union diana contra b7-h1. - Google Patents

Agentes de union diana contra b7-h1.

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MX2012005809A
MX2012005809A MX2012005809A MX2012005809A MX2012005809A MX 2012005809 A MX2012005809 A MX 2012005809A MX 2012005809 A MX2012005809 A MX 2012005809A MX 2012005809 A MX2012005809 A MX 2012005809A MX 2012005809 A MX2012005809 A MX 2012005809A
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MX
Mexico
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antibody
amino acid
seq
human
acid sequence
Prior art date
Application number
MX2012005809A
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English (en)
Inventor
Ian Foltz
John Babcook
Jaspal Singh Kang
Christophe Queva
Michelle Morrow
Scott Hammond
Marat Alimzhanov
Laura Sekirov
Melanie Boyle
Matthieu Chodorge
Ross Stewart
Kathleen Ann Mulgrew
Original Assignee
Medimmune Ltd
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Filing date
Publication date
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Application filed by Medimmune Ltd filed Critical Medimmune Ltd
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Abstract

Se describen anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra la B7-H1 y los usos de estos anticuerpos en el diagnóstico y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o expresión de la B7-H1. Adicionalmente, se describen hibridomas u otras líneas celulares que expresan los anticuerpos.

Description

AGENTES DE UNION DIANA CONTRA B7-H1 Campo de la invención La invención se refiere a agentes de unión diana contra la proteína B7-H1 y los usos de los agentes. En algunas modalidades, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos a B7-H1 y los usos de estos anticuerpos. Aspectos de la invención también se refieren a líneas celulares que expresan los agentes de unión diana o anticuerpos. Los agentes de unión descritos son útiles como agentes de diagnóstico y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o expresión de B7-Hl.
Antecedentes de la invención Una respuesta inmunitaria adaptativa involucra la activación, selección y proliferación clonal de dos clases principales de linfocitos denominados células T y células B. Luego de encontrarse con un antígeno, las células T proliferan y se diferencian en células efectoras específicas del antígeno, mientras que las células B proliferan y se diferencian en células que secretan anticuerpos. La activación de células T es un proceso de múltiples pasos que requiere diversos eventos de señalización entre la célula T y una célula que presenta antígenos (APC, por sus siglas en inglés) . Para que ocurra la activación de células T, deben REF.: 230098 administrarse dos tipos de señales a una célula T en reposo. El primer tipo es mediado por el receptor de célula T (TcR, por sus siglas en inglés) específico del antígeno y confiere especificidad a la respuesta inmunitaria. El segundo tipo, co-estimulante , regula la magnitud de la respuesta y se administra a través de receptores accesorios en la célula T.
Una señal co-estimulante primaria se administra a través del receptor CD28 activante luego de la unión de sus ligandos B7-1 o B7-2. Por el contrario, la unión del receptor CTLA-4 inhibidor mediante los mismos ligandos B7-1 o B7-2 da como resultado la disminución de una respuesta de células T. Por lo tanto, las señales de CTLA-4 antagonizan la coestimulación mediada por CD28. En altas concentraciones de antígeno, la coestimulación de CD38 anula el efecto inhibidor de CTLA-4. La regulación temporal de la expresión de CD28 y CTLA-4 mantiene un equilibrio entra las señales de activación e inhibidoras y asegura el desarrollo de una respuesta inmunitaria eficaz, mientras que protege contra el desarrollo de la autoinmunidad.
Los homólogos moleculares de CD28 y CTLA-4 y sus ligandos similares a B-7 han sido identificados recientemente. ICOS es un receptor co-estimulante similar a CD28. PD-1 (muerte programada 1) es un receptor inhibidor y una contraparte de CTLA-4. La presente descripción se refiere a la modulación de respuestas inmunitarias mediadas por B7-H1.
B7-H1, también conocida como PD-L1, es una proteína transmembrana tipo I de aproximadamente 53kDa de tamaño. En humanos la B7-H1 se expresa en una cantidad de tipos celulares inmunitarios incluyendo células T activados y anérgicas/agotadas , en células B vírgenes y activados, así como en células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) mieloides, monocitos y mastocitos. También se expresa en células no inmunitarias incluyendo islotes del páncreas, células Kupffer del hígado, endotelio vascular y epitelio seleccionado, por ejemplo, epitelio de las vías respiratorias y epitelio del túbulo renal, donde su expresión es potenciada durante los episodios inflamatorios. La expresión de B7-H1 también se encuentra en niveles aumentados en una cantidad de tumores incluyendo, de modo" no taxativo, cáncer de colon, colorrectal, de pulmón, renal, incluyendo carcinoma de células renales, gástrico, de ve iga, de pulmón no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) , cáncer hepatocelular (HCC, por sus siglas en inglés) y cáncer pancreático, así como también melanoma.
B7-H1 es un miembro de la familia de proteínas B7, la cual contiene dos dominios Ig extracelulares, un dominio tipo V del extremo N seguido de un dominio tipo C. El dominio intracelular de 30 aminoácidos de longitud no contiene motivos de señalización obvios, pero porta un sitio potencial para la fosforilación de la proteína cinasa C. La forma murina de B7-H1 porta 69% de identidad de aminoácidos con la forma humana de B7-H1 y también comparte una estructura conservada .
Sé sabe que B7-H1 se une a dos ligandos alternativos, el primero de estos, PD-1, es un receptor de transmembrana tipo 1 de 50-55 kDa que fue identificado originalmente en una línea de células T sometida a apoptosis inducida por activación. PD-1 se expresa en células T, células B y monocitos activados, así como en otras células del sistema inmunitario y se une tanto a B7-H1 (PD-L1) como a la B7-DC (PD-L2) relacionada. La segunda es el miembro de la familia B7, B7-1, la cual se expresa en células T, células B, monocitos y células que presentan antígenos activadas.
PD-1 es un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina (Ig) que contiene un único dominio similar a Ig V en su región extracelular . El dominio citoplasmático de PD-1 contiene dos tirosinas, con la tirosina más próxima a la membrana (VAYEEL en PD-1 de ratón) ubicada dentro de un ITIM (motivo inhibidor inmunoreceptor basado en tirosina) . La presencia de un ITIM en PD-1 indica que esta molécula funciona para atenuar la señalización del receptor del antígeno mediante el reclutamiento de fosfatasas citoplasmáticas . Las proteínas PD-1 humanas y de murino comparten alrededor de 60% de la identidad de aminoácidos con conservación de cuatro sitios de N-glicosilación potencial y residuos que definen el dominio Ig-V. También se conservan el ITIM en la región citoplasmática y el motivo similar a ITIM que rodea la tirosina del extremo carboxi (TEYATI en humanos y ratones) entre ortólogos humanos y de murino.
Se cree que la señalización a través del eje PD-1/B7-H1 realiza funciones críticas no redundantes dentro del sistema inmunitario regulando negativamente las respuestas de las células T. Esta regulación se encuentra involucrada en el desarrollo de células T en el timo, en la regulación de respuestas inflamatorias crónicas y en el mantenimiento de tanto la tolerancia periférica como el privilegio inmunitario. La naturaleza crítica de estas funciones se ejemplifica en ratones con carencia de PD-1, los cuales exhiben un fenotipo autoinmunitario . La carencia en los ratones C57BL/6 da como resultado glomerulonef itis y artritis similares al lupus progresivas y crónicas. En ratones Balb/c, la carencia de PD-1 conduce a cardiomiopatía severa debido a la presencia de anticuerpos auto-reactivos específicos del tejido del corazón. La función de señalización a través de B7-H1/B7-1 es menos clara, pero se cree que también está involucrada en la administración de señales reguladoras negativas a tanto células T como células que presentan antígenos.
Se cree que la expresión de B7-H1 en células tumorales ayuda a los tumores a evadir la detección y eliminación por parte del sistema inmunitario. B7-H1 funciona, en lo que a eso refiere, a través de diversos mecanismos alternativos incluyendo dirigiendo el agotamiento y anergia del tumor infiltrando linfocitos T, estimulando la secreción de citocinas represivas inmunitarias en el microambiente del tumor, estimulando la función de células T reguladoras represivas y protegiendo las células tumorales que expresan B7-H1 de lisis mediante células T citotóxicas específicas de tumor celular.
En general, existe una necesidad de proporcionar métodos terapéuticos eficaces y seguros para trastornos asociados con la represión de una respuesta inmunitaria tal como, por ejemplo, cáncer e infecciones virales crónicas. La modulación de las respuestas inmunitarias involucradas en estos trastornos pueden lograrse mediante la manipulación de la vía B7-H1/PD-1.
Breve descripción de la invención La presente invención se refiere a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 e inhiben la actividad biológica de B7-H1. En una modalidad de la invención, la invención se refiere a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben la actividad de B7-H1. En otra modalidad de la invención, la invención se refiere a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben la unión de B7-H1 a PD-1. En aún otra modalidad de la invención, la invención se refiere a agentes de unión diana que bloquean la supresión de células T inducida por B7-H1 y por lo tanto potencian la inmunidad antitumoral. En aún otra modalidad de la invención, la invención se refiere a además a agentes de unión diana que además pueden estimular una o más de las siguientes actividades incluyendo proliferación de células T, secreción de IFN-? y/o IL-2 en reacciones mixtas de linfocitos. Las modalidades de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 e inhiben la actividad biológica de B7-H1. En una modalidad el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la actividad biológica que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
Las modalidades de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben la actividad de B7-H1. En una modalidad el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la actividad de B7-H1 que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
Las modalidades de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben la unión a PD-1. En una modalidad el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la unión receptor ligando B7-H1/PD-1 en comparación con lo que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
En otra modalidad, los agentes de unión diana de la invención pueden inhibir la unión de PD-l/Fc a la B7-H1 humana expresada en células ES-2. En una modalidad el agente de unión diana inhibe la unión con una IC50 menor a 1 nM, 0.5 nM, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07 o 0.06 nM. Además, en otra modalidad, los anticuerpos de la invención tienen una IC50 de alrededor de 1 nM a alrededor de 0.06 nM; o de alrededor de 0.5 nM a alrededor de 0.06 nM; o de alrededor de 0.1 nM a alrededor de 0.06 nM; o de alrededor de 1 nM a alrededor de 0.1 nM; o de alrededor de 1 nM a alrededor de 0.5 nM .
Las modalidades de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a la B7-H1 y por lo tanto inhiben la unión a su ligando B7-1. En una modalidad el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% la unión receptor ligando B7-H1/PD-1 en comparación con lo que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
Las modalidades de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 e inhiben la proliferación tumoral inducida por B7-H1. En una modalidad, el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la proliferación tumoral inducida por B7-H1 que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
Modalidades adicionales de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben la supervivencia de células tumorales inducida por B7-H1. En una modalidad el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la supervivencia de células tumorales inducida por B7-H1 que ocurriría en ausencia del agente de unión diana .
Modalidades adicionales de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben el crecimiento tumoral de las líneas celulares cancerosas A375 o HPAC. En una modalidad el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% el crecimiento de las células cancerosas en el día 30 comparado con un control de isotipo.
Modalidades adicionales de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben la supresión de células T reactivas tumorales mediada por B7-H1 potenciando, por consiguiente, la actividad citolítica antitumoral de las células T. En una modalidad, el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%. al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la supresión de actividad de células T reactivas tumorales mediada por B7-H1 que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
Modalidades adicionales de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto potencian la inmunidad antitumoral. En una modalidad, el agente de unión diana potencia en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la inmunidad antitumoral que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
Modalidades adicionales de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y por lo tanto inhiben la proliferación celular. En una modalidad, el agente de unión diana inhibe en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% la proliferación celular que ocurriría en ausencia del agente de unión diana.
Modalidades adicionales de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 y aumenta la actividad citolítica (CTL) específica contra las células tumorales que expresan B7-H1. En una modalidad, los anticuerpos de la invención tienen una EC50 igual o menor a 100 nM, 50 nM o 1 nM. Adicionalmente, en otra modalidad, los anticuerpos de la invención tienen una EC50 de alrededor de 100 nM a alrededor de 1 nM; o de alrededor de 50 nM a alrededor de 1 nM; o de alrededor de 20 nM a alrededor de 1 nM; o de alrededor de 100 nM a alrededor de 50 nM; o de alrededor de 100 nM a alrededor de 70 nM.
Modalidades adicionales de la invención se refieren a agentes de unión diana que se unen específicamente a B7-H1 e inhiben la supresión de la proliferación de células T mediada por B7-H1 con una EC50 menor o igual a 100 nM. En una modalidad, los anticuerpos de la invención tienen una EC50 igual o menor a 100 nM, por ejemplo, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nM. Adicionalmente, en otra modalidad, los anticuerpos de la invención tienen una EC50 de alrededor de 100 nM a alrededor de 10 nM; o de alrededor de 50 nM a alrededor de 10 nM; o de alrededor de 20 nM a alrededor de 10 nM; o de alrededor de 100 nM a alrededor de 50 nM; o de alrededor de 100 nM a alrededor de 70 nM; o de alrededor de 100 nM a alrededor de 80 nM.
Los agentes de unión diana también inhiben la adhesión, motilidad, invasión y metástasis celular de las células tumorales y además, los agentes de unión diana son útiles para reducir el crecimiento tumoral . Los mecanismos a través de los cuales esto puede lograrse pueden incluir, de modo no taxativo, la inhibición de la actividad de B7-H1.
En una modalidad de la invención, el agente de unión diana es un anticuerpo. En una modalidad de la invención, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad de la invención, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal completamente humano o un fragmento del mismo. En la presente puede referirse a los anticuerpos monoclonales como anticuerpos anti-B7-Hl o anticuerpos de la invención.
Anticuerpos, anticuerpos monoclonales y anticuerpos monoclonales humanos incluyen los anticuerpos de los isotipos IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4 , por ejemplo IgG2. En una modalidad de la invención, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgG2. Este isotipo ha reducido el potencial para provocar la función efectora en comparación con otros isotipos, los cuales pueden llevar a una toxicidad reducida. En otra modalidad de la invención, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGl. El isotipo IgGl tiene potencial aumentado para provocar la citotoxicidad mediada por células dirigidas por anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) en comparación con otros isotipos, lo cual puede llevar a una eficacia mejorada. El isotipo IgGl tiene estabilidad mejorada en comparación con otros isotipos, por ejemplo, IgG4 , lo cual puede llevar a una biodisponibilidad mejorada/facilidad de fabricación/semivida más larga. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGl es de alotipo z, za o f . En una modalidad de la invención, el agente de unión diana tiene propiedades terapéuticas deseables, seleccionadas de una o más de las siguientes; alta afinidad de unión para B7-H1, la capacidad de inhibir la actividad de B7-H1 in vitro e in vivo, la capacidad de inhibidor la supervivencia de células tumorales mediada por B7-H1 y la capacidad de inhibir la supresión de células T reactivas tumorales mediada por B7-H1, lo cual a su vez puede reducir la proliferación, motilidad, invasión, metástasis de las células tumorales y el crecimiento tumoral .
En una modalidad, la invención incluye anticuerpos que se unen específicamente a B7-H1 con afinidades muy altas (Kd) . En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una afinidad de unión (Kd) de menor a 5 nanomolar (nM) . En otras modalidades el agente de unión diana se une con una Kd menor a 4 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM o 1 nM. Adicionalmente , en algunas otras modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a B7-H1 con una Kd de alrededor de 5 nM a alrededor de 1 nM; o de alrededor de 5 nM a alrededor de 2 nM; o de alrededor de 5 nM a alrededor de 3 nM; o de alrededor de 5 nM a alrededor de 4 nM; o de alrededor de 3 nM a alrededor de 1 nM; o de alrededor de 2 nM a alrededor de 1 nM. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana se une a B7-H1 con Kd menor a 950 picomolar (pM) . En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana se une a B7-H1 con Kd menor a 900 pM. En otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 800 nM, 700 nM o 600 nM. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 500 pM. En otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 400 pM. En aun otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 300 pM. En aun otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 200 pM. En aun otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 100 pM. Además, en otras modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a B7-H1 con una Kd de alrededor de 900 pM a alrededor de 100 pM; a alrededor de 900 pM a alrededor de 200 pM; o alrededor de 900 pM a alrededor de 300 pM; o alrededor de 900 pM a alrededor de 400 pM; o alrededor de 900 pM a alrededor de 500 pM; o alrededor de 900 pM a alrededor de 600 pM; o alrededor de 900 pM a alrededor de 700 pM; o alrededor de 200 pM alrededor de 100 pM; o alrededor de 300 pM a alrededor de 200 pM; o alrededor de 400 pM a alrededor de 300 pM. En algunas otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 90 nM, 80 nM, 70 pM, 60 nM, 55pM o 50pM. En aun otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 60 pM. En aun otras modalidades, el agente de unión diana se une a B7-H1 con una Kd menor a 55 pM. Además, en algunas otras modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a B7-H1 con una Kd de alrededor de 100 pM a alrededor de 50 pM; o alrededor de 100 pM a alrededor de 70 pM; o alrededor de 100 pM a alrededor de 80 pM; o alrededor de 100 pM a alrededor de 90 pM; o alrededor de 70 pM alrededor de 50 pM; o alrededor de 60 pM a alrededor de 50 pM; o alrededor de 55 pM a alrededor de 50 pM. La Kd puede evaluarse utilizando un método descrito en la presente o conocido por un experto en la técnica (por ejemplo, un ensayo BIAcore, ELISA) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia) . Los agentes de unión diana de la invención tienen afinidades de unión considerablemente mejoradas para B7-H1 en comparación con los anticuerpos mencionados en la técnica previa.
Las propiedades de unión del agente de unión diana o anticuerpo de la invención también puede medirse mediante referencia a las velocidades de disociación o asociación (kdiSOCiacian y kasociación respectivamente) .
En una modalidad de la invención, una agente de unión diana o un anticuerpo de la invención pueden tener un velocidad kasociación (anticuerpo (Ac) + antígeno Agy«od«ita? Ac-Ag) de al menos 104 M'V1, al menos 5 X 104 M'V 1 , al menos 105 M'V1, al menos 2 X 105 M'V1, al menos 5 X 105 M'V1, al menos 106 M'V1, al menos 5 X 106 M'V1, al menos 107 M'V1, al menos 5 X 107 M'V1, al menos 108 M'V1, como se midió mediante un ensayo BIAcore . Además, en algunas otras modalidades, los anticuerpos de la invención tienen una velocidad kasociación de alrededor de 5 X 104 M'V1 a alrededor de 5 X 108 M'V1 ; o de alrededor de 5 X 105 M'V1 a alrededor de 5 X 108 M' 1; o de alrededor de 5 X 106 M'V1 a alrededor de 5 X 108 M'V1; o alrededor de 5 X 107 M'V1 a alrededor de 5 X 108 M'V1, como se midió mediante un ensayo BIAcore.
En otra modalidad de la invención, el agente de unión diana o un anticuerpo pueden tener una velocidad kdisociacion ((Ac-Ag)bdií0C^? anticuerpo (Ac) + antígeno (Ag) ) menor a 5x10" 1 s"1, menor a 10"1 s"1, menor a 5xl0"2 s"1, menor a 10"2 s"1, menor a 5xl0"3 s"1, menor a 10"3 s"1, menor a 5xl0"4 s"1, menor a 10"4 s"1, menor a 5xl0"5 s"1, menor a 10"5 s"1, menor a 5xl0"6 s"1, menor a 10"6 s"1, menor a 5xl0"7 s"1, menor a 10"7 s"1, menor a 5xl0"8 s"1, menor a 10"8 s"1, menor a 5xl0"9 s"1, menor a 10"9 s"1, o menor a 10"10 s"1 como se midió mediante un ensayo BIAcore. Además, en algunas otras modalidades, los anticuerpos de la invención tienen una velocidad kdiS0Ciación de alrededor de 1 X 10"4 s"1 a alrededor del X 10"5 s"1; o de alrededor de 1 X 10"4 s" 1 a alrededor de 5 X 10"4 s"1, como se midió mediante un ensayo BIAcore .
El agente de unión diana de la invención se une específicamente a la B7-H1 humana. En algunos ejemplos, el agente de unión diana de la invención no se una a otras proteínas co-moduladoras inmunitarias , por ejemplo, PD-L2 humana, B7-H2 humana, B7-H3 humana, CD28 humana, CTLA-4 humana y PD1 humana.
En otra modalidad, el agente de unión diana de la invención tiene reactividad cruzada con otras proteínas B7-H1 de otras especies. En una modalidad, el agente de unión diana de la invención tiene reactividad cruzada con la B7-H1 de mono cinomolgo. En otra modalidad, el agente de unión diana de la invención tiene reactividad cruzada con la B7-H1 de ratón, por ejemplo, 2.7 A4. En otra modalidad, el agente de unión diana de la invención tiene reactividad cruzada con la B7-H1 de mono cinomolgo y con la B7-H1 de ratón, por ejemplo, 2.7 A4. En otra modalidad, el agente de unión diana de la invención tiene reactividad cruzada con la B7-H1 de mono cinomolgo, pero no con la B7-H1 de ratón, por ejemplo, 2.9D10 y 2.14H9.
En una modalidad, el agente o anticuerpo de unión diana comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada (VH) mostradas en la Tabla 8. En otra modalidad, el agente o anticuerpo de unión diana comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT. La promiscuidad de cadena ligera está bien establecida en la técnica, por lo tanto, un agente de unión diana o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT u otro anticuerpo como se describe en la presente, puede además comprender cualquiera de las secuencias de cadena ligera (VL) mostradas en la Tabla 9 o de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT u otro anticuerpo como se describe en la presente. En otra modalidad, el agente o anticuerpo de unión diana comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT O 2.14H90PT y además comprende la secuencia de cadena ligera correspondiente de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena ligera mostradas en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena ligera de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada del anticuerpo 2.7 A4 y que además comprende la secuencia de cadena ligera del anticuerpo 2.7 A4. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada del anticuerpo 2.14H9 y que además comprende la secuencia de cadena ligera del anticuerpo 2.14H9. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada del anticuerpo 2.9D10 y que además comprende la secuencia de cadena ligera del anticuerpo 2.9D10. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada del anticuerpo 2.7A.40PT y que además comprende la secuencia de cadena ligera del anticuerpo 2.7A.40PT. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada del anticuerpo 2.14H90PT y que además comprende la secuencia de cadena ligera del anticuerpo 2.14H90PT.
En algunas modalidades, el agente de unión diana es cualquiera de los anticuerpos monoclonales como se muestra en la Tabla 1. En algunas modalidades, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consisten en: 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT. En una modalidad, el agente de unión diana comprende uno o más de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es el anticuerpo monoclonal 2.7 A4. En determinadas otras modalidades, el agente de unión diana es el anticuerpo monoclonal 2.14H9. En aun otras modalidades, el agente de unión diana es el anticuerpo monoclonal 2.9D10. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es el anticuerpo monoclonal 2.7A40PT. En determinadas otras modalidades, el agente de unión diana es el anticuerpo monoclonal 2.14H90PT. En modalidades adicionales, el agente de unión diana es derivable de cualquiera de los anticuerpos monoclonales antes mencionados.
En otra modalidad, el agente de unión diana puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de las CDR1, CDR2 o CDR3 de las secuencias variables de la cadena pesada codificadas por un polinucleótido en un plásmido designado 2.7A4_G, 2.14H9_G y 2.9D10_NG los cuales fueron depositados en NCIMB con el número 41598 el 19 de noviembre de 2008, con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008 y con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008, respectivamente.
En otra modalidad, el agente de unión diana puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de las CDR1, CDR2 o CDR3 de las secuencias de dominio variable de la cadena ligera codificadas por un polinucleótido en un plásmido designado 2.7A4_G, 2.14H9_G y 2.9D10_NG, los cuales fueron depositados con el número 41598 el 19 de noviembre de 2008, con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008 o con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008, respectivamente.
En una modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598 el 19 de noviembre de 2008.
En una modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCI B con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En una modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende un al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCI B con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En una modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En una modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que comprende un al menos una, al menos dos o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCI B con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia variable de cadena pesada de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número 41598 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia variable de cadena pesada de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número 41598 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número 41598 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.7A4_G que se depositó en el NCIMB con el número 41598 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.14H9_G que se depositó en el NCIMB con el número 41597 el 19 de noviembre de 2008.
En otra modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende un anticuerpo codificado por el polinucleótido en plásmido designado 2.9D10_NG que se depositó en el NCIMB con el número 41599 el 19 de noviembre de 2008.
En una modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDRl de cadena pesada (HCDR1) , una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) y una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) seleccionada de cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 8. En una modalidad, un agente de unión diana o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDRl de cadena ligera (LCDR1) , una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) seleccionada de cualquiera de las secuencias mostradas, en la Tabla 9. En una modalidad un agente de unión diana o un anticuerpo puede comprende una secuencia que comprende una HCDRl, HCDR2 y HCDR3 seleccionada de cualquiera de las CDR de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8 o 3.18G1. En una modalidad un agente de unión diana o un anticuerpo puede comprende una secuencia que comprende una LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 seleccionada de cualquiera de las CDR de los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8 o 3.18G1.
Una modalidad adicional es un agente de unión diana o un anticuerpo que se une específicamente a B7-H1 y comprende una secuencia que comprende una de las secuencias de la CDR2 y una de las de la CDR3 mostradas en la Tabla 9. En una modalidad adicional, el agente de unión diana o anticuerpo comprende además un secuencia que comprende: una secuencia de la CDR3 como se muestra en la Tabla 8. En una modalidad adicional, el agente de unión diana o anticuerpo comprende además un secuencia que comprende: una secuencia de la CDR2 y una de la CDR3 como se muestra en la Tabla 8 y/o en la Tabla 9. En una modalidad adicional, el agente de unión diana o anticuerpo comprende además una secuencia que comprende: una secuencia de la CDR1, una de la CDR2 y una de la CDR3 como se muestra en la Tabla 8 y/o en la Tabla 9.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de las CDR1, CDR2 o CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, como se muestra en la Tabla 8. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de las CDR1, CDR2 o CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A , 2.14H9 o 2.9D10, como se muestra en la Tabla 9. En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT, como se muestra en la Tabla 8. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT, como se muestra en la Tabla 9.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia de la CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.7A4 , como se muestra en la Tabla 8 y la secuencia de la CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.7A4 , como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia de la CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.14H9, como se muestra en la Tabla 8 y la secuencia de la CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.14H9, como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia de la CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.9D10, como se muestra en la Tabla 8 y la secuencia de la CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.9D10, como se muestra en la Tabla 9. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
Se observa que los expertos en la técnica pueden lograr fácilmente determinaciones de CDR. Véase por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), tomos 1-3. Kabat proporciona múltiples alineaciones de secuencias de cadenas de inmunoglobulina para numerosas especies de isotipos de anticuerpo. Las secuencias alineadas se enumeran conforme a un sistema de enumeración único, el sistema de enumeración de Kabat. Las secuencias de Kabat han sido actualizadas desde la publicación de 1991 y se encuentran disponibles como una base de datos de secuencias electrónica (actualmente disponible en el sitio web de base de datos de Kabat; véase también Nucleic Acids Research, 2000, 28(1), 214-218). Cualquier secuencia de inmunoglobulina se puede enumerar de acuerdo con Kabat desempeñando una alineación con la secuencia de referencia de Kabat . Por consiguiente, el sistema de enumeración de Kabat proporciona un sistema uniforme para enumerar cadenas de inmunoglobulina .
Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión diana o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende la secuencia contigua que abarca las regiones de marco variable y las CDR, específicamente desde FRl hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3, de cualquiera de las secuencias 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT o como se muestra en la Tabla 8 o en la Tabla 9. Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión diana o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende la secuencia contigua que abarca las regiones de marco variable y las CDR, específicamente desde FRl hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3, de cualquiera de las secuencias 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT o como se muestra en la Tabla 8 y en la Tabla 9. En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende las secuencias contiguas que abarcan las regiones de marco variable y las CDR, específicamente desde FRl hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3 , de cualquiera de las secuencias de los anticuerpos monoclonales 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT o como se muestra en la Tabla 8 o en la Tabla 9. Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión diana o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende la secuencia contigua que abarca las regiones de marco variable y las CDR, específicamente desde FRl hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3 , de cualquiera de las secuencias de los anticuerpos monoclonales 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A40PT o 2.14H90PT o como se muestra en la Tabla 8 y en la Tabla 9. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, un agente de unión diana o anticuerpo de la invención comprende una secuencia CDR3 como se muestra en las Tablas 8 o 9; o cualquiera de una secuencia de la CDR1, de la CDR2 o de la CDR3 como se muestra en las Tablas 8 o 9; o una secuencia de la CDR1, de la CDR2 y de la CDR3 de una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se muestra en la Tabla 8; una secuencia de la CDR1, de la CDR2 y de la CDR3 de una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 9.
Una modalidad proporciona un agente de unión diana o anticuerpo, o una porción del mismo que se une al antígeno, donde el agente o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:27, SEQ ID NO.:32, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:42, SEQ ID NO.:47, SEQ ID NO.:52, SEQ ID NO.:57, SEQ ID NO.:62, SEQ ID NO.:67, SEQ ID NO.:72 o SEQ ID NO.:77.
Una modalidad proporciona una agente de unión diana o anticuerpo, o una porción del mismo que se une al antígeno, donde el agente o anticuerpo, o la porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO . : 2. En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID N0.:7. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO : 2 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 7.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.: 12. En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.: 17. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 12 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 17.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.:22. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.:27. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 22 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 27.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. :32. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.: 37. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 32 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 37.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. :42. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.:47. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal com 1etamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 42 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 47.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. :52. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.: 57. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 52 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 57.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.:62. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.: 67. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 62 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 67.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.:72. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende además una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEQ ID NO.: 77. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo, o porción del mismo que se une al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 72 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 77.
En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo comprende variantes o derivados de los CDR descritos en la presente, las secuencias contiguas abarcando las regiones de marco variable y las CDR (específicamente de FRl hasta FR4 o CDRl hasta CDR3 ) , las secuencias de cadena ligera o pesada descritas en la presente o los anticuerpos descritos en la presente. Las variantes incluyen agentes de unión diana o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen hasta veinte, dieciséis, diez, nueve o menos, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis adiciones, sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos en cualquiera de las CDRl, CDR2 o CDR3 , como se muestra en la Tabla 8 o la Tabla 9, abarcando las secuencias contiguas las regiones de marco variable y las CDR (específicamente de FRl hasta FR4 o CDRl hasta CDR3) , como se muestra en la Tabla 8 o la Tabla 9, las secuencias de cadena ligera o pesada descritas en la presente o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. Las variantes incluyen agentes de unión diana o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen una, dos o tres adiciones, sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos en cualquiera de las CDRl, CDR2 o CDR3 como se muestra en la Tabla 8 o la Tabla 9, abarcando las secuencias contiguas las regiones de marco variable y las CDR (específicamente de FRl hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3) como se muestra en la Tabla 8 o la Tabla 9, las secuencias de cadena ligera o pesada descritas en la presente o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. Las variantes incluyen agentes de unión diana o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o alrededor de un 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las CDR1, CDR2 o CDR3 como se muestra en la Tabla 8 o la Tabla 9, abarcando las secuencias contiguas las regiones de marco variable y las CDR (específicamente de FRl hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3) como se muestra en la Tabla 8 o la Tabla 9, las secuencias de cadena ligera o pesada descritas en la presente o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluyendo, de modo no taxativo, alineación de proteínas emparejadas. En una modalidad, las variantes comprenden cambios en las secuencias de la CDR o en las secuencias de cadenas ligeras o pesadas descritas en la presente que son de origen natural o que se introducen mediante modificación genética in vitro de secuencias naturales usando técnicas de ADN recombinante o técnicas de mutagénesis . Las variantes de origen natural incluyen aquellas que se generan in vivo en las secuencia de nucleótidos germinales correspondientes durante la generación de un anticuerpo a un antígeno extraño.
En una modalidad, las variantes incluyen agentes de unión diana o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen (a) una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 3; (b) una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 4; (c) una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 5; (d) una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la CDR1 VL de la SEQ ID NO: 8 ; (e) una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO : 9; y (f) una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 10.
En otra modalidad las variantes incluyen agentes de unión diana o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen (a) una CDRl VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 23; (b) una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 24; (c) una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 25; (d) una CDRl VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la CDRl VL de la SEQ ID NO: 28; (e) una CD 2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 29; y (f) una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO : 30.
En una modalidad el derivado puede ser un heteroanticuerpo, es decir, un anticuerpo en el cual se unen dos o más anticuerpos. Los derivados incluyen anticuerpos que han sido modificados químicamente. Ejemplos incluyen la unión covalente de uno o más polímeros, tales como polímeros solubles en agua, carbohidratos unidos por N o unidos por O, carbohidratos, azúcares, fosfatos y/o otras moléculas. Los derivados se modifican de tal manera que son diferentes del anticuerpo de origen natural o inicial, ya sea en el tipo o ubicación de las moléculas unidas. Los derivados incluyen además la eliminación de uno o más grupos químicos que se encuentran presentes naturalmente en el anticuerpo.
En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2, donde la SEQ ID NO: 2 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 10. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2, donde la SEQ ID NO : 2 comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco cualquiera o todos los residuos germinales como se indica en la Tabla 10. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2, donde la SEQ ID NO: 2 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 10. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2, donde la SEQ ID NO : 2 comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco cualquiera o todos los residuos germinales como se indica en la Tabla 10.
En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 7, donde la SEQ ID NO: 7 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 11 y cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 11. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 7, donde la SEQ ID NO: 7 comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco cualquiera para los cinco residuos germinales como se indica en la Tabla 11.
En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 12, donde la SEQ ID NO: 12 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 12. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 12, donde la SEQ ID NO: 12 comprende uno, dos cualquiera o ambos residuos germinales como se indica en la Tabla 12.
En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 17, donde la SEQ ID NO: 17 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 13. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 17, donde la SEQ ID NO: 17 comprende uno, dos, tres, cuatro, cualquiera o los cinco residuos germinales como se indica en la Tabla 13.
En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 27. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 27, donde la SEQ ID NO: 27 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 14. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 27, donde la SEQ ID NO: 27 comprende uno, dos, tres cualquiera o los tres residuos germinales como se indica en la Tabla 14.
Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión diana o anticuerpo que compite por la unión a B7-H1 con el agente de unión diana o anticuerpos de la invención. En otra modalidad de la invención existe un anticuerpo que compite por la unión a B7-H1 con el agente de unión diana o anticuerpos de la invención. En otra modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo compite por la unión a B7-H1 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT. "Compite" indica que el agente de unión diana o anticuerpo compite por la unión a B7-H1 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT, es decir, la competencia es unidireccional.
Las modalidades de la invención incluyen un agente de unión diana o anticuerpo que compite de forma cruzada con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT para la unión a B7-H1. "Compite de forma cruzada" indica que el agente de unión diana o anticuerpo compite por la unión a B7-Hl con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10 , 2.7A40PT o 2.14H90PT, y viceversa, es decir, la competencia es bidireccional .
Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión diana o anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos en el dominio extracelular de la B7-H1 humana como el agente de unión diana o anticuerpos de la invención. Las modalidades de la invención también incluyen un agente de unión diana que se une al mismo epítopo o epítopos en el dominio extracelular de la B7-H1 humana como cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT.
En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo se une a un epítopo en la B7-H1 humana, incluyendo al menos uno o más de los siguientes aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Asp en la posición 122 y Arg en la posición 125. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención se une a un epítopo en la B7-H1 humana que comprende al menos dos de los tres siguientes residuos de aminoácidos de Asp en la posición 122, Arg en la posición 125 y Arg en la posición 113. En otra modalidad, el anticuerpo se une a un epítopo en la B7-H1 humana, donde el anticuerpo no exhibe unión a lie en la posición 54, Ser en la posición 117 y Ala en la posición 121 en la B7-H1 humana. En aun otra modalidad, un anticuerpo de la invención pierde su capacidad de unirse a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 113 muta a un Ala o a un Tyr o a un Leu, como se determina mediante un ensayo de competencia en comparación a la unión a la B7-H1 de tipo salvaje. En aun otra modalidad, un anticuerpo de la invención pierde su capacidad de unirse a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 125 muta a un Ala o a un Gln o a un Ser como se determina mediante un ensayo de competencia en comparación a la unión a la B7-H1 de salvaje. En aun otra modalidad, un anticuerpo de la invención retiene su capacidad de unirse a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 123 muta a un Ala o a un Phe o a un Thr como se determina mediante un ensayo de competencia en comparación a la unión a la B7-H1 de tipo salvaje. En este ejemplo, el anticuerpo es 2.14H9. En otro ejemplo, el anticuerpo es 2.14H90PT.
En una modalidad, el agente de unión diana o anticuerpo se une a un epítopo en el dominio extracelular de la B7-H1 humana que comprende al menos uno o más de los siguientes aminoácidos Asp en la posición 122 y Thr en la posición 20. En una modalidad, el anticuerpo se une a al menos dos de los tres siguientes residuos de aminoácidos de Phe en la posición 19, Thr en la posición 20 y Asp en la posición 122 en la B7-Hl humana. En otra modalidad, el [sic] no exhibe unión a al menos uno de los tres siguientes residuos de aminoácidos de lie en la posición 54, Met en la posición 115, Ser en la posición 117 y Ala en la posición 121 en la B7-H1 humana. En aun otra modalidad, un anticuerpo de la invención pierde su capacidad de unirse a la B7-H1 humana si el Phe en la posición 19 muta a un Ala o a un Gly o a un Ser como se determina mediante un ensayo de competencia en comparación a la unión a la B7-H1 de tipo salvaje. En aun otra modalidad, un anticuerpo de la invención pierde su capacidad de unirse a la B7-H1 humana si el Thr en la posición 20 muta a un Ala o a un Val o a un Asp como se determina mediante un ensayo de competencia en comparación a la unión a la B7-H1 de tipo salvaje. En aun otra modalidad, un anticuerpo de la invención pierde su capacidad de unirse a la B7-H1 humana si el Asp en la posición 122 muta a un Asn o a un Glu como se determina mediante un ensayo de competencia en comparación a la unión a la B7-H1 de tipo salvaje. En aun otra modalidad, un anticuerpo de la invención retiene su capacidad de unirse a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 123 muta a un Ala o a un Phe o a un Thr como se determina mediante un ensayo de competencia en comparación a la unión a la B7-H1 de tipo salvaje. En un ejemplo, el anticuerpo es 2.7A4. En otro ejemplo, el anticuerpo es 2.7A40PT.
En una modalidad, el agente de unión diana es un anticuerpo biespecífico . Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo que tiene especificidad de unión para al menos dos epítopos diferentes en la misma proteína o en proteínas diferentes. En la técnica se conocen procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos . (Véase, por ejemplo, Millstein et ál . , Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker et ál., EMBO J., 10:3655-3659 (1991); Suresh et ál . , Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelny et ál . , J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992); Hollinger et ál . , Proc . Natl Acad. Sci. EUA, 90:6444-6448 (1993); Gruber et ál . , J. I munol . , 152:5368 (1994); patentes estadounidenses N° 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; y 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; O 92/200373; WO 93/17715; O 92/08802; y EP 03089) .
Las modalidades de la invención descritas en la presente se relacionan con anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a B7-H1 y afectan la función de B7-H1. Otras modalidades se refieren a anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a B7-H1 y preparaciones de los mismos con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo alta afinidad de unión para B7-H1, alta selectividad para la inhibición de la señalización de B7-H1, baja toxicidad, la capacidad de bloquear la actividad del receptor de PD-1, la capacidad de inhibir la supervivencia de células tumorales inducida por B7-H1 a través de supresión inmunitaria, la capacidad de inhibir la represión de inmunidad antitumoral mediada por B7-H1, lo cual puede a su vez inhibir la enfermedades relacionadas con la proliferación o invasión, incluyendo enfermedades neoplásicas y/o la capacidad de las células tumorales de crecer in vitro e in vivo. Aun otras modalidades se refieren a un método de reprimir la inhibición de células T mediada por B7-H1 en un animal, administrándole a un animal que lo necesite un cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos de la invención. Aun otras modalidades se refieren a anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a B7-H1 y preparaciones de los mismo que no dan como resultado una respuesta de anticuerpo humano anti-quimérico (HACA, por sus siglas en inglés) significativa, permitiendo, por lo tanto, la administración repetida.
En una modalidad de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los agentes de unión diana o anticuerpos de la invención. En una modalidad es una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo de la invención. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera o la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera y la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT. La invención también abarca polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación restrictivas o de restricción más baja, como se describe en la presente, a polinucleótidos que codifican cualquiera de los agentes de unión diana o anticuerpos descritos en la presente.
En otra modalidad de la invención se proporciona un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico como se describe en la presente, donde el vector codifica un agente de unión diana como se describe en la presente. En una modalidad de la invención, se proporciona un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico como se describe en la presente, donde el vector codifica una cadena ligera y/o una cadena pesada de un anticuerpo como se describe en la presente. En una modalidad el vector comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. En una modalidad, el vector comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT. En otra modalidad, el vector comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT.
En una modalidad adicional, se proporciona una célula hospedadora transformada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico como se describe en la presente. En otra modalidad de la invención se proporciona una célula hospedadora que comprende el vector que comprende la molécula de ácido nucleico como se describe en la presente. En una modalidad, la célula hospedadora puede comprender más de un vector .
Como es conocido en la técnica, los anticuerpos pueden ser, de manera ventajosa, por ejemplo, anticuerpos policlonales , oligoclonales , monoclonales , quiméricos, humanizados y/o completamente humanos.
Se comprenderá que las modalidades de la invención no se encuentran limitadas por ninguna forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Por ejemplo, el agente de unión diana puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una región Fe humana intacta) o un fragmento de unión de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab' )2/ Fv/ dAb u otros fragmentos de anticuerpo conocidos como se describe con más detalle a continuación) . Además, los anticuerpos pueden ser anticuerpos de un solo dominio tales como dominios VH o VL únicos camélidos o humanos que se unen a B7-H1, tal como el fragmento dAb.
Las modalidades de la invención descritas en la presente también proporcionan células para producir estos anticuerpos. Ejemplos de células incluyen hibridomas o células creadas de forma recombinante , tales como células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , variantes de células CHO (por ejemplo DG44) y células NSO que producen anticuerpos contra la B7-H1. Información adicional sobre variantes de células CHO puede encontrarse en Andersen and Reilly (2004) Current Opinión in Biotechnology 15, 456-462 el cual se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. El anticuerpo puede fabricarse a partir de un hibridoma que segrega el anticuerpo o a partir de una célula modificada genéticamente de forma recombinante que ha sido transformada o transfectada con un gen o genes que codifican el anticuerpo.
Además, una modalidad de la invención es un método de producir un agente de unión diana o un anticuerpo de la invención cultivando células hospedadoras en condiciones donde se expresa una molécula de ácido nucleico para producir el agente de unión diana o anticuerpo seguido por la recuperación del agente de unión diana o anticuerpo. En una modalidad, es un método de producir un anticuerpo de la invención cultivando células hospedadoras en condiciones donde se expresa una molécula de ácido nucleico para producir el anticuerpo seguido por la recuperación del anticuerpo. Aun otras modalidades incluyen un anticuerpo de la invención producido mediante el método de cultivar una célula hospedadora la cual expresa un anticuerpo codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención y aislando el anticuerpo del cultivo.
Debe tenerse en cuenta que las modalidades de la invención también incluyen cualquier molécula de ácido nucleico la cual codifica un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo de la invención incluyendo secuencias de ácido nucleico optimizadas para aumentar los rendimientos de anticuerpos o fragmentos de los mismos transíectados en células hospedadoras para la producción de anticuerpos.
Una modalidad adicional de la presente incluye un método de producir anticuerpos que se unen específicamente a la B7-H1 e inhiben la actividad biológica de la B7-H1 inmunizando un mamífero con células que expresan la B7-H1, membranas celulares aisladas que contienen B7-H1, B7-H1 purificada o un fragmento de la misma y/o una o más secuencias ortólogas o fragmentos de las mismas.
Una modalidad adicional de la presente incluye un método de producir anticuerpos de alta afinidad que se unen específicamente a la B7-H1 e inhiben la actividad biológica de la B7-H1 inmunizando un mamífero con células que expresan la B7-H1, membranas celulares aisladas que contienen B7-H1, B7-H1 purificada o un fragmento de la misma y/o una o más secuencias ortólogas o fragmentos de las mismas.
Otras modalidades se basan en la generación e identificación de anticuerpos aislados que se unen específicamente a la B7-H1 e inhiben la actividad biológica de la B7-H1. La B7-H1 se expresa en una cantidad de tipos de tumores. Los anticuerpos que se unen específicamente a B7-H1 pueden prevenir la supervivencia de células tumorales mediada por B7-H1 e inhibir la represión mediada por B7-H1 de respuestas inmunitarias antitumorales a través de la supresión inmunitaria, esto puede, a su vez, reducir la invasión, metástasis de las células tumorales, el crecimiento tumoral y otras propiedades .
Además, el anticuerpo puede fabricarse a partir de un hibridroma que segrega el anticuerpo o de una célula modificada genéticamente de forma recombinante que ha sido transformada o transfectada con un gen o genes que codifican el anticuerpo.
En una modalidad existe un hibridoma que produce el agente de unión diana o anticuerpo de la invención. En una modalidad existe un hibridoma que produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de la invención. En una modalidad, el hibridoma puede producir una cadena ligera y/o una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otra modalidad, el hibridoma produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT. De manera alternativa, el hibridoma puede producir un anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos que los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT. De manera alternativa, el hibridoma puede producir un anticuerpo que compite por la unión a B7-H1 con los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT. De manera alternativa, el hibridoma puede producir un anticuerpo que compite de forma cruzada por la unión a B7-H1 con los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4 , 2.14H9, 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT.
En otras modalidades, la invención proporciona composiciones, incluyendo un agente de unión diana o anticuerpo de la invención o fragmento de unión del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable.
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos de tratar una enfermedad proliferativa o relacionada con la invasión en un animal, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal que necesite el tratamiento para una enfermedad proliferativa o relacionada con una invasión y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el animal es humano. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es un anticuerpo de la invención y puede seleccionarse del grupo que consiste en 2.7A4, 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT .
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos de inhibir las enfermedades relacionadas con la proliferación o invasión celular, con un componente mediado por B7-H1, en un animal, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal que necesite el tratamiento para una enfermedad relacionada con la proliferación o invasión y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el animal es humano. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es un anticuerpo de la invención y puede seleccionarse del grupo que consiste en 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT.
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos de inhibir la invasión de células tumorales, metástasis celular o crecimiento tumoral en un animal, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal que necesite el tratamiento para una invasión de células tumorales, metástasis celular o crecimiento tumoral y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el animal es humano. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En determinadas modalidades, el agente de unión diana es un anticuerpo de la invención y puede seleccionarse del grupo que consiste en 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT.
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos de tratar un animal que sufre de una enfermedad neoplásica, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades el método comprende además seleccionar un animal que necesite el tratamiento para una enfermedad neoplásica y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención.
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos de tratar un animal que sufre de una enfermedad no neoplásica, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal que necesite tratamiento para una enfermedad no neoplásica y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención.
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos para tratar un animal que sufre de una infección viral crónica, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal que necesite tratamiento para una infección viral crónica y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invenció .
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos de tratar un animal que sufre de un tumor maligno, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal que necesite tratamiento para un tumor maligno y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención.
Aun otras modalidades de la invención incluyen métodos para tratar un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de B7-H1, administrándole al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención. En determinadas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal que necesite tratamiento para una enfermedad o afección asociada con la expresión de B7-H1 y administrarle al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión diana de la invención .
Un tumor maligno puede seleccionarse del grupo que consiste en: tumores sólidos tales como melanoma, cánceres de la piel, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, glioma, carcinoma hepatocelular (del hígado) , cáncer de la vesícula biliar, tumor tiroideo, cáncer óseo, cáncer gástrico (de estómago) , cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de vulva, cáncer endometrial, cáncer testicular, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñon, carcinoma de células renales, cáncer de colon, colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma esofágico, cánceres cerebrales/del SNC, cánceres de cabeza y cuello, cánceres neuronales, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma) , adenocarcinoma del intestino delgado, neoplasias pediátricas, carcinoma epidermoide, sarcomas, cáncer de las membranas pleurales/peritoneales y leucemia, incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica aguda y mieloma múltiple.
Las enfermedades proliferativas o relacionadas a la invasión tratables incluyen enfermedades neoplásicas, tales como, melanoma, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, glándula salivar, glioma, carcinoma hepatocelular (del hígado) , cáncer de la vesícula biliar, tumor tiroideo, cáncer óseo, cáncer gástrico (de estómago) , cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de vulva, cáncer endometrial, cáncer testicular, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer tiroideo, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de colon, colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma esofágico, cánceres cerebrales/del SNC, cánceres neuronales, cánceres de cabeza y cuello, cánceres neuronales, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma) , adenocarcinoma del intestino delgado, neoplasias pediátricas, carcinoma epidermoide, sarcomas, cáncer de las membranas pleurales/peritoneales y leucemia, incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica aguda y mieloma múltiple. Las infecciones virales crónicas tratables incluyen VIH, virus de la hepatitis B (VHB) y virus de la hepatitis C (VHC) en humanos, virus de la inmunodeficiencia simia (SIV, por sus siglas en inglés) en monos y virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV, por sus siglas en inglés) en ratones.
La invasión y/o proliferación celular relacionada con enfermedad puede ser invasión y/o proliferación celular anormal, indeseable o patológica, por ejemplo, invasión y/o proliferación celular relacionada con tumor.
En una modalidad, la enfermedad neoplásica es un tumor sólido seleccionado de cualquiera de los siguientes carcinomas de mama, colón, colorrectal, próstata, estómago, gástrico, de ovario, esófago, páncreas, vesícula biliar, cáncer de pulmón no microcítico, tiroideo, del endometrio, cabeza y cuello, renal, carcinoma de células renales, de vejiga y gliomas.
En una modalidad, la presente invención es adecuada para inhibir la B7-H1 en pacientes con un tumor el cual es dependiente solo o en parte de B7-H1.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad proliferativa o relacionada con la invasión. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad proliferativa o relacionada con la invasión.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un una enfermedad proliferativa o relacionada con la invasión con un componente mediado por B7-H1 en un animal. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad proliferativa o relacionada con la invasión con un componente mediado por B7-H1.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una invasión de células tumorales, metástasis celular o crecimiento tumoral _ en un animal. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para la invasión de células tumorales, metástasis celular o tumor.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad neoplásica. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad neoplásica .
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad en la cual la etiología se encuentra asociada con un agente infeccioso, tal como, por ejemplo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o cáncer de cuello uterino. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad neoplásica.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad no neoplásica. En determinadas modalidades el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad no neoplásica.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una infección viral crónica. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad no neoplásica. En aun otras modalidades el uso comprende además enfermedades oculares, enfermedades inflamatorias, enfermedades cardiovasculares y sepsis.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de un tumor maligno. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para un tumor maligno.
Aun otras modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de la B7-H1. En determinadas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad o afección asociada con la expresión de la B7-H1.
Aun otras modalidades de la invención incluyen un agente de unión diana o anticuerpo de la invención para su uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad proliferativa o relacionada con la invasión.
Aun otras modalidades de la invención incluyen un agente de unión diana o anticuerpo de la invención para su uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de invasión de células tumorales, metástasis celular o crecimiento tumoral en un animal.
Aun otras modalidades de la invención incluyen un agente de unión diana o anticuerpo de la invención para su uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de la B7-H1.
En una modalidad, el tratamiento de una enfermedad proliferativa o relacionada con la invasión; una enfermedad neoplásica; una enfermedad no neoplásica; un tumor maligno; o una infección viral crónica o una enfermedad o afección asociada con la expresión de la B7-H1, comprende controlar, mejorar, prevenir, cualquiera de las enfermedades o afecciones que preceden.
En una modalidad, el tratamiento de una enfermedad neoplásica comprende la inhibición de crecimiento tumoral, el retraso de crecimiento tumoral, la regresión del tumor, el encogimiento del tumor, el aumento del tiempo que el tumor demora en volver a crecer luego de finalizado el tratamiento, el aumento de tiempo de la recurrencia del tumor, el retraso de la evolución de la enfermedad.
En una modalidad, el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la expresión de la B7-H1 comprende la inhibición del crecimiento de las células que expresan la B7-Hl.
En algunas modalidades, luego de la administración del agente de unión diana o anticuerpo de la invención, se administra un agente aclarador para quitar el exceso de anticuerpo que circula en la sangre.
En algunas modalidades de la invención, el animal a tratar es un humano.
En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.7A4, 2.14H9 y 2.9D10.
Las modalidades de la invención incluyen un conjugado que comprende un agente de unión diana, como se describe en la presente y un agente terapéutico. En algunas modalidades de la invención, el agente terapéutico es una toxina. En otras modalidades, el agente terapéutico es un radioisótopo. En aun otras modalidades, el agente terapéutico es una composición farmacéutica.
En otro aspecto, se proporciona un método de destruir de forma selectiva una célula cancerosa en un paciente. El método comprende administrar un conjugado de anticuerpo completamente humano a un paciente. El conjugado de anticuerpo completamente humano comprende un anticuerpo que puede unirse a B7-H1 y un agente. El agente es una toxina, un radioisótopo u otra sustancia que destruirá una célula cancerosa. Por lo tanto el conjugado de anticuerpo destruye de forma selectiva la célula cancerosa.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo completamente humano conjugado que se une específicamente a la B7-H1. Unido al anticuerpo se encuentra un agente y la unión del anticuerpo a una célula resulta en la administración del agente a la célula. En una modalidad, el anticuerpo completamente humano conjugado mencionado anteriormente se une a un dominio extracelular de B7-H1. En otra modalidad, el anticuerpo y la toxina conjugada son interiorizados por una célula que expresa la B7-H1. En otra modalidad, el agente es un agente citotóxico. En otra modalidad, el agente es, por ejemplo, saporina o inmunoconjugados basados en auristatina, exotoxina pseudomonas, gelonina, ricina, caliqueamicina o maitansina y similares. En aun otra modalidad, el agente es un radioisótopo .
El agente de unión diana o anticuerpo de la invención puede administrarse solo o puede administrarse en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación o vacunas terapéuticas. Por ejemplo, una mezcla monoclonal, oligoclonal o policlonal de anticuerpos B7-H1 que bloquean la represión de inmunidad antitumoral mediada por B7-H1 puede administrarse en combinación con un fármaco que se ha demostrado inhibe proliferación de células tumorales .
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente de unión diana o anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Otra modalidad de la invención incluye un método de diagnosticar enfermedades o afecciones en las cuales un anticuerpo como se describe en la presente se utiliza para detectar la presencia y/o nivel de B7-H1 en un paciente o muestra de un paciente. En una modalidad, la muestra del paciente es de sangre o suero sanguíneo u orina. En modalidades adicionales, se presentan los métodos para identificar los factores de riesgo, el diagnóstico de la enfermedad y la estadificación de la enfermedad, los cuales involucran la identificación de la expresión y/o sobreexpresión de B7-H1 usando anticuerpos anti-B7-Hl. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrarle a un paciente un conjugado de anticuerpo completamente humano que se une selectivamente a la B7-H1 en una célula. El conjugado de anticuerpo completamente humano comprende un anticuerpo que se une específicamente a B7-H1 y un marcador. Los métodos comprenden además observar la presencia del marcador en el paciente. Una cantidad relativamente alta del marcador indicará un riesgo relativamente alto de la enfermedad y una cantidad relativamente baja del marcador indicará un riesgo relativamente bajo de la enfermedad. En una modalidad, el marcador es una proteína fluorescente verde .
La invención proporciona además métodos de analizar para determinar la presencia y/o nivel de B7-H1 en una muestra de un paciente, que comprenden poner en contacto un anticuerpo como se describe en la presente con una muestra biológica de un paciente y detectar el nivel de unión entre el anticuerpo y la B7-H1 en la muestra. En modalidades más específicas, la muestra biológica es sangre, plasma o suero.
Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnosticar una afección asociada con la expresión de la B7-Hl en una célula, poniendo en contacto el suero o una célula con un anticuerpo como se describe en la presente y luego detectar la presencia de la B7-H1. En una modalidad la afección puede ser una enfermedad proliferativa o asociada con la invasión incluyendo, de modo no taxativo, una enfermedad neoplásica.
En otra modalidad, la invención incluye un kit de ensayo para detectar la B7-H1 en tejidos, células o fluidos corporales de mamíferos. El kit sería útil para detectar las enfermedades relacionadas con la B7-H1. El kit incluye un agente de unión diana o anticuerpo de la invención y un medio para indicar la reacción del agente de unión diana o anticuerpo con B7-H1, si se encuentra presente. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En una modalidad, el anticuerpo que se une a B7-H1 se encuentra marcado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo primario no marcado y el kit incluye además un medio de detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, los medios de detectar incluyen un segundo anticuerpo marcado que es una anti-inmunoglobulina . El anticuerpo puede marcarse con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un material radiopaco.
En algunas modalidades, los agentes de unión diana o anticuerpos como se describen en la presente pueden modificarse para potenciar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . En otras modalidades, los agentes de unión diana o anticuerpos pueden modificarse para potenciar su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) . En otras modalidades, los agentes de unión diana o anticuerpos pueden modificarse tanto para potenciar su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) como para potenciar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .
En algunas modalidades, los agentes de unión diana o anticuerpos como se describen en la presente pueden modificarse para reducir su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En otras modalidades, los agentes de unión diana o anticuerpos pueden modificarse para reducir su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) . En aun otras modalidades, los agentes de unión diana o anticuerpos como se describen en la presente pueden modificarse tanto para reducir su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) como para reducir su capacidad de fijar el complemento y participar . en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .
En determinadas modalidades, la semivida de un agente de unión diana o anticuerpo como se describe en la presente y de composiciones de la invención es de al menos alrededor de 4 a 7 días. En determinadas modalidades, la semivida media de un agente de unión diana o anticuerpo como se describe en la presente y de las composiciones de la invención es de al menos alrededor de 2 a 5 días, 3 a 6 días, 4 a 7 días, 5 a 8 días, 6 a 9 días, 7 a 10 días, 8 a 11 días, 8 a 12, 9 a 13, 10 a 14, 11 a 15, 12 a 16, 13 a 17, 14 a 18, 15 a 19 o 16 a 20 días. En otras modalidades, la semivida media de un agente de unión diana o anticuerpo como se describe en la presente y de las composiciones de la invención es de al menos alrededor de 17 a 21 días, 18 a 22 días, 19 a 23 días, 20 a 24 días, 21 a 25, días, 22 a 26 días, 23 a 27 días, 24 a 28 días, 25 a 29 días o 26 a 30 días. En aun otras modalidades, la semivida de un agente de unión diana o anticuerpo como se describe en la presente y de composiciones de la invención puede ser de hasta alrededor de 50 días. En algunas modalidades, las semividas de los anticuerpos y de las composiciones de la invención se pueden prolongar mediante métodos conocidos en la técnica. Tal prolongación puede a su vez reducir la cantidad y/o frecuencia de dosificación de las composiciones de anticuerpo. Los anticuerpos con semividas in vivo mejoradas y métodos para prepararlos se describen en la patente estadounidense N° 6,277,375 y publicaciones internacionales N° O 98/23289 y WO 97/3461.
En otra modalidad, la invención proporciona un artículo de fabricación incluyendo un recipiente. El recipiente incluye una composición que contiene un agente de unión diana o anticuerpo como se describe en la presente y un prospecto o etiqueta indicando que la composición puede usarse para tratar enfermedades relacionadas con la adhesión, invasión, angiogenia y/o proliferación celular incluyendo, de modo no taxativo, enfermedades caracterizadas por la expresión o sobreexpresion de la B7-H1.
En otras modalidades, la invención proporciona un kit para tratar enfermedades que involucran la expresión de la B7-H1 que comprende un agente de unión diana o anticuerpo como se describe en la presente e instrucciones para administrar los anticuerpos monoclonales a un sujeto que necesite tratamiento.
La presente invención proporciona la formulación de proteínas que comprenden una región Fe variante. Es decir, una región de Fe de origen no natural, por ejemplo una región de Fe que comprende uno o más residuos de aminoácidos de origen no natural. Las regiones Fe variantes de la presente invención también abarcan las regiones Fe que comprenden eliminaciones, adiciones y/o modificaciones de aminoácidos.
La semivida en suero de las proteínas que comprenden las regiones Fe se puede aumentar elevando la afinidad de unión de la región de Fe por FcRn. En una modalidad, la proteína variante de Fe tiene semivida en suero mejorada con relación a la molécula comparable.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 239, 330 y 332, numerado según el índice EU establecido en Kabat . En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, numerado según el índice EU establecido en Kabat. Opcionalmente, la región de Fe puede comprender además aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 252, 254 y 256, numerado según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante de Fe donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, numerado según el índice EU como se establece en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, numerado según el índice EU establecido en Kabat.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 234, 235 y 331, numerado según el índice EU establecido en Kabat . En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 234F, 235F, 235Y, 235E y 331S, numerado según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica adicional, una variante de Fe de la invención comprende los residuos de aminoácido de origen no natural 234F, 235F y 331S, numerados según el índice EU establecido en Kabat. En otra modalidad específica, una variante de Fe de la invención comprende los residuos de aminoácido de origen no natural 234F, 235Y y 331S, numerados según el índice EU establecido en Kabat. En otra modalidad específica, una variante de Fe de la invención comprende los residuos de aminoácido de origen no natural 234F, 235E y 331S, numerados según el índice EU establecido en Kabat . Opcionalmente , la región de Fe puede comprender además aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones, seleccionados del grupo que consiste en 252, 254 y 256, numerado según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante de Fe donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 234F, 235F, 235Y, 235E y 331S, numerado según el índice EU establecido en Kabat; al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, numerado según el índice EU como se establece en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, numerado según el índice EU establecido en Kabat. Tal como se usan en la presente, las designaciones "OPT" y "TM" son sinónimas y se utilizan para describir anticuerpos de la invención genéticamente modificados para introducir las tres mutaciones; L234F y L235E en la bisagra y P331S en el dominio CH2 de la molécula IgG para eliminar su capacidad de desencadenar la citotoxicidad mediada por las células dependiente del anticuerpo y la citotoxicidad dependiente del complemento (Oganesyan V. et ál . (2008), Acta Cryst . , D64 : 700-704) .
En otra modalidad, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe, donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionados del grupo que consiste en 239, 330 y 332, enumerado según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, enumeradas según el índice EU establecido en Kabat. Opcionalmente , la región de Fe puede comprender además aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256, enumeradas según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, enumerado según el índice EU como se establece en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, enumerado según el índice EU establecido en Kabat.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe, donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionados del grupo que consiste en 234, 235 y 331, enumerado según el índice EU establecido en Kabat . En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 234F, 235F, 235Y, 235E y 331S, numerado según el índice EU establecido en Kabat. Opcionalmente , la región de Fe puede comprender además aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256, enumeradas según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 234F, 235F, 235Y, 235E y 331S, enumerado según el índice EU como se establece en Kabat; y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, enumerado según el índice EU establecido en Kabat .
Los métodos para generar regiones Fe de origen no natural son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las sustituciones y/o eliminaciones de aminoácidos se pueden generar mediante métodos de mutagénesis, incluyendo, de modo no taxativo, mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:488-492 (1985) ), mutagénesis por PCR (Higuchi, en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, págs . 177-183 (1990)), y mutagénesis de cassette (Wells et ál . , Gene 34:315-323 (1985)). Preferentemente, la mutagénesis dirigida al sitio se lleva a cabo mediante el método PCR de extensión por solapamiento (Higuchi, en "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification ' ' , Stockton Press, Nueva York, págs. 61-70 (1989)). La técnica de PCR de extensión por solapamiento (Higuchi, ibid.) también se puede usar para introducir cualquier mutación o mutaciones deseadas en una secuencia diana (el ADN de partida) . Por ejemplo, el primer ciclo de PCR en el método extensión por solapamiento implica la amplificación de la secuencia diana con un cebador externo (cebador 1) y un cebador de mutagénesis interno (cebador 3) y de forma separada con un segundo cebador externo (cebador 4) y un cebador interno (cebador 2) proporcionando dos segmentos de PCR (segmentos A y B) . El cebador interno de mutagénesis (cebador 3) se diseña para contener incompatibilidades a la secuencia diana que especifican la o las mutaciones deseadas. En el segundo ciclo de PCR, los productos del primer ciclo de PCR (segmentos A y B) se amplificados mediante PCR usando los dos cebadores externos (cebadores 1 y 4) . El segmento de PCR de longitud completa resultante (segmento C) se digiere con enzimas de restricción y el fragmento de restricción resultante se clona en un vector apropiado. Como el primer paso de mutagénesis, el ADN de partida (por ej . , que codifica una proteína de fusión de Fe, un anticuerpo o simplemente una región Fe) se clona de forma operativa a un vector de mutagénesis. Los cebadores se diseñan para reflejar la sustitución de aminoácidos deseados. Otros métodos útiles para la generación de regiones Fe variantes son conocidos en la técnica (véase, por ej . , las patentes estadounidenses N° 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; la publicación de patente N° 2004/0002587 y las publicaciones PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351) .
En algunas modalidades de la invención, los modelos de glicosilación de los anticuerpos proporcionados en la presente se modifican para potenciar la función efectora de ADCC y CDC. Véase Shields RL et ál . , (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa T et ál . , (2003) JBC. 278:3466 y Okazaki A et ál . , (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239. En algunas modalidades, una proteína variante de Fe comprende una o más glicoformas genéticamente modificadas, es decir, una composición de carbohidrato que está covalentemente unida a la molécula que comprende una región Fe. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para diversos fines, incluyendo, de modo no taxativo, la mejora o reducción de la función efectora. Las glicoformas modificadas se pueden generar mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, usando cepas modificadas o de expresión variante, por coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo, DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) , por medio de la expresión de una molécula que comprende una región Fe en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos o por medio de la modificación de uno o más carbohidratos luego de que se ha expresado la molécula que comprende la región Fe. Los métodos para generar glicoformas modificadas son conocidos en la técnica e incluyen, de modo no taxativo, aquellos descritos en Umana et ál , 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies et ál . , 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et ál , 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et ál., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), patente estadounidense N° 6,602,684; N° de serie estadounidense 10/277,370; N° de serie estadounidense 10/113,929; PCT O 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1 ; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación de glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza) . Véase, por e . , WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et ál . , 2004, JMB, 336: 1239-49.
También se conoce en la técnica que la glicosilación de la región Fe puede modificarse para aumentar o disminuir la función efectora (véase, por ejemplo, Umana et ál, 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies et ál . , 2001 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et ál, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et ál . , 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) patente estadounidense N° 6,602,684; N° de serie estadounidense 10/277,370; N° de serie estadounidense 10/113,929; PCT O 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación de glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza) . Por consiguiente, en una modalidad las regiones Fe de los anticuerpos de la invención comprenden glicosilación alterada de residuos de aminoácidos. En otra modalidad, la glicosilación de los residuos de aminoácidos da como resultado una función efectora reducida. En otra modalidad, la glicosilación de los residuos de aminoácidos da como resultado una función efectora aumentada. En una modalidad específica, la región Fe tiene fucosilación reducida. En otra modalidad, la región Fe es afucosilada (véase por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense N° 2005/0226867) .
Breve descripción de las figuras La figura 1 es una gráfica de barras que muestra los efectos de los anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en la proliferación de células T en un ensayo de perlas.
La figura 2 es una gráfica de barras que muestra la potenciación de la proliferación de células T por medio de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en un ensayo DCMLR.
La figura 3 es una gráfica de barras que muestra la liberación de IFN-? llevada a cabo por los anticuerpos anti-B7-H1 de la invención en un ensayo DCMLR.
La figura 4 es una gráfica que muestra el 95% del intervalo de confianza para la IC50 de anti-B7-Hl mediante anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en el ensayo de inhibición de ligandos humanos PDl/humanos B7-H1 con el fin de evaluar el impacto del cambio y mutación germinal de clase IgG en la actividad de los anticuerpos.
La figura 5 es una gráfica lineal que muestra los resultados de un ensayo ELISA que fue realizado para evaluar la reactividad cruzada de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención con respecto a antígenos co-moduladores.
La figura 6 es una gráfica de barras que muestra los efectos de los anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en el ensayo Tet-recall in-vitro.
La figura 7 es una gráfica de barras que muestra los resultados del análisis de la actividad agonista de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención mediante el uso del ensayo Tet-recall.
Las figuras 8A, 8B y 8C son gráficas lineales que muestran el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células HPAC en un modelo de xenoin erto de ratón.
Las figuras 9A, 9B y 9C son gráficas lineales que muestran el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células A375 en un modelo de xenoinjerto de ratón.
Las figuras 10A y 10B son gráficas lineales que muestran el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células HPAC en un modelo de xenoinjerto de ratón.
Las figuras 11 es una gráfica lineal que muestra el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células HPAC en un modelo de xenoinjerto de ratón.
Las figuras 12A, 12B, 12C y 12D son gráficas lineales que muestran el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células A375 en un modelo de xenoinjerto de ratón.
Las figuras 13A y 13B son gráficas lineales que muestran el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células A375 en un modelo de xenoinjerto de ratón en presencia y ausencia de células T.
Las figuras 14A y 14B son gráficas lineales que muestran el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células A375 en un modelo de xenoinjerto de ratón en presencia y ausencia de células T.
La figura 15 es una gráfica lineal que muestra el efecto de anticuerpos anti-B7-Hl de la invención en células A375 en un modelo de xenoinjerto de ratón.
Descripción Detallada de la Invención Definiciones A menos que se definan de otro modo, los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tendrán los significados aceptados comúnmente por los especialistas en la técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, los términos en singular incluirán los plurales y los plurales incluirán el singular. En general, las técnicas y la nomenclatura utilizadas en relación con el cultivo de células y tejidos, la biología molecular, la química y la hibridación de proteínas y de oligo- o polinucleó idos que se describen en la presente son aquellas que se conocen y se utilizan comúnmente en la técnica.
Se utilizan técnicas estándares para el ADN recombinante , la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo y transformación de tejidos (por ej . , electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante, o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos que anteceden por lo general se llevan a cabo mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ej . , Sambrook et ál . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), el que se incorpora a la presente mediante esta referencia. Las técnicas de laboratorio y la nomenclatura utilizada en relación con los procedimientos de química analítica, de química sintética orgánica y de química medicinal y farmacéutica descritos en la presente son aquellos bien conocidos y de uso común en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación, formulación y administración farmacéuticas y el tratamiento de pacientes.
Tal como se utiliza según la presente descripción, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados: Un antagonista o inhibidor puede ser un polipéptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, compuesto de peso molecular bajo, un oligonucleótido, un oligopéptido, interferencia por ARN (ARNi) , antisentido, una proteína recombinante , un anticuerpo, o fragmentos de los mismos o conjugados o proteínas de fusión de los mismos. Para un estudio sobre ARNi, véase Milhavet 0, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. 2003 Dec ; 55 (4 ) : 629-48. Review) y antisentido (véase Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 28 de octubre de 2003/2003 (206):pe47.) Un compuesto se refiere a cualquier compuesto de peso molecular bajo con un peso molecular de menos de alrededor de 2000 daltones.
El término "B7-H1" se refiere a la B7-H humana, B7H1, B7-H1, homólogo 1 de B7 , antígeno CD274 , PDCD1L1, PDCD1LG1, ligando 1 de PDCD1, PDL1, PD-L1, precursor de ligando 1 de muerte celular programada 1 o ligando 1 de muerte celular programada .
El término "neutralizante" o "inhibe", cuando se refiere a un agente de unión diana, tal como un anticuerpo, se refiere a la capacidad del agente de eliminar, reducir o reducir de manera significativa la actividad de un antígeno diana. Por consiguiente, un anticuerpo anti-B7-Hl "neutralizante" de la invención tiene la capacidad de eliminar o reducir de manera significativa la actividad de B7-H1. Un anticuerpo neutralizante, antagonista o inhibidor que se une de manera específica a B7-H1 puede, por ejemplo, bloquear la unión de B7-H1 a sus ligandos afines. De forma ideal, un anticuerpo neutralizante contra la B7-H1 inhibe la represión de la inmunidad por células T mediada por la B7-H1. Un anticuerpo neutralizante, antagonista o inhibidor que se une de manera específica a la B7-H1 puede, por ejemplo, inhibir la unión de la B7-H1 a la PD-1 y/o a la B7-1.
La "inhibición de la actividad biológica de B7-H1" comprende una inhibición de la actividad de la B7-H1 en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% en comparación con la actividad biológica en ausencia de un agente de unión diana o anticuerpo de la invención .
El término "polipéptido" se utiliza en la presente como un término genérico para referirse a proteínas, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos naturales. Por lo tanto, las proteínas, fragmentos y análogos naturales son especies pertenecientes al género de los polipéptidos. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humanas y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humanas, así como moléculas de anticuerpos formados mediante combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o lambda, y viceversa, así como también fragmentos y análogos de los mismos. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención también pueden comprender únicamente las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humanas o fragmentos de las mismas.
El término "de origen natural", tal como se aplica en la presente a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por el ser humano en el laboratorio o de otra forma es de origen natural .
El término "secuencia de control", como se usa en la presente, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias tanto para llevar a cabo como para afectar la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están unidas. La naturaleza de las secuencias de control varía según el organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control incluyen por lo general un promotor, un sitio de unión ribosómico, y una secuencia de terminación de transcripción; en eucariotas, por lo general, tales secuencias de control pueden incluir promotores, potenciadores , intrones, secuencias de terminación de transcripción, secuencias de señales de poliadenilación y regiones 5' y 3' no traducidas. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y pueda también incluir componentes adicionales cuya presencia es beneficiosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias compañeras de fusión.
El término "polinucleótido" , tal como se menciona en la presente, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido o heterodúplex de ARN y ADN. El término incluye formas de ADN de cadena simple y doble.
El término "oligonucleótido" , mencionado en la presente, incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos mediante enlaces de origen natural y de origen no natural. Los oligonucleótidos son un subgrupo polinucleotídico que por lo general comprende una longitud de 200 bases o menos. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y, más preferentemente, de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos suelen ser de cadena simple, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de cadena doble, por ejemplo, para su uso en la construcción de una mutación génica. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido.
El término "nucleótidos de origen natural", mencionado en la presente, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados", mencionado en la presente, incluye nucleótidos con grupos de glúcidos modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" mencionado en la presente incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et ál . Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et ál . J. A . Chem. Soc . 106:6077 (1984); Stein et ál . Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et ál. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et ál . Oligonucleótidos y análogos: A Practical Approach, págs . 87-108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et á . La patente estadounidense N° 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia. Si se desea, un oligonucleótido puede incluir una marca para la detección.
El término "híbrida de manera selectiva" mencionado en la presente, significa unirse de manera detectable y específica. Los polinucleótidos , oligonucleótidos y fragmentos de los mismos se hibridan de manera selectiva a cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones de rigurosidad alta para lograr condiciones de hibridación selectiva como se conoce en la técnica y se discute en la presente. Por lo general, la homología de secuencias de ácido nucleico entre los polinucleótidos, los oligonucleótidos o fragmentos de anticuerpos y una secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos 80% y más típicamente con homologías preferentemente en aumento de al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100% .
Las condiciones de hibridación rigurosa incluyen, de modo no taxativo, la hibridación con ADN unido al filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) (0.9 M NaCl/90 mM Citrato de Na, pH 7.0) a alrededor de 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.2X/0.1% de SDS a alrededor de 50 a 65°C, condiciones de alta rigurosidad tales como la hibridación con ADN unido al filtro en SSC 6X a alrededor de 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.1X/0.2% de SDS a alrededor de 60°C, o cualquier otra condición de hibridación rigurosa conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et ál . , eds . 1989 Current Protocols in Molecular Biology, tomo 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., Y, páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3) .
Dos secuencias de aminoácidos son "homologas " si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, un 85% de homología significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para una compatibilidad máxima. Los huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se estén emparejando) se permiten en un ' emparejamiento maximizado; se prefieren longitudes de hueco de 5 o menos, siendo las más preferidas las de 2 o menos. De manera alternativa y preferida, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas de las mismas de al menos alrededor de 30 aminoácidos de longitud) son homologas, tal como este término se usa en la presente, si poseen un grado de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación estándar) mediante el uso del programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por hueco de 6 o más. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs . 101-110 (Tomo 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y suplemento 2 de este tomo, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferentemente homologas si sus aminoácidos son idénticos en un 50% o más cuando se alinean de manera óptima mediante el uso del programa ALIGN. Debe comprenderse que pueden haber regiones de homología divergente dentro de dos secuencias ortólogas . Por ejemplo, los sitios funcionales de ortólogos de ratón y de humano pueden tener un grado mayor de homología que las regiones no funcionales.
El término "corresponde a" se utiliza en la presente para decir que una secuencia de polinucleótidos es homologa (es decir, es idéntica, no está estrictamente relacionada de manera evolutiva) a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia.
En contraposición, el término "complementaria a" se utiliza en la presente para decir que la secuencia complementaria es homologa a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. A modo de ejemplo, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" .
El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se manifiestan la base de ácidos nucleicos (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o el residuo de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial", tal como se usa en la presente, denota una característica de una secuencia de polinucleótidos o aminoácidos, donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos de 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más preferentemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos) , con frecuencia en una ventana de al menos 24 a 48 posiciones de nucleótidos (8 a 16 aminoácidos), donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones que conforman un total de 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más grande. Tal como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (segunda Edición, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds . , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), el cual se incorpora a la presente mediante esta referencia. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como a, aminoácidos disustituidos a, N-alquil-aminoácidos , ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina , ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetillisina, e -N-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3 -metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4 -hidroxiprolina) . En la notación de polipéptidos utilizada en la presente, la dirección izquierda es la dirección del extremo amino y la dirección derecha es la dirección del extremo carboxi, según la convención y el uso estándares. De manera similar, a menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de secuencias de polinucleótidos de cadena simple es el extremo 5',· la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótidos de cadena doble se denomina dirección 51. La dirección de la adición 5' a 31 de las transcripciones de ARN naciente se denomina dirección de transcripción; las regiones de secuencia de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN que está del extremo 5' al 51 de la transcripción de ARN se denominan "secuencias dirección 5'"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN que se encuentran del extremo 3' al 3' de la transcripción de ARN se denominan "secuencias dirección 3'". Como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de polipéptidos, cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT, utilizando pesos de huecos por defecto, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferentemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y aun más preferentemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en las sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren al carácter intercambiable de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales hidroxialifáticas es la serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amidas es la asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina , tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es la lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores que se prefieren son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina. Como se indicó en la presente, las mínimas variaciones en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se encuentran comprendidos en la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 75%, más preferentemente al menos 80%, 90%, 95%, y aun más preferentemente 99% de identidad de secuencia con respecto a los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina descritos en la presente. En particular, se contemplan los reemplazos de aminoácidos conservadores. Los reemplazos conservadores son aquellos que ocurren dentro de una familia de aminoácidos que tiene cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen por lo general en familias: (1) acídico=aspartato, glutamato; (2) básico=lisina, arginina, histidina; (3) no polar=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargado=glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son una familia hidroxialifática; la asparagina y glutamina son una familia que contiene amidas; la alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y la fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o un remplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto mayor en la función o en las propiedades de unión de la molécula resultante, especialmente si el remplazo no comprende un aminoácido dentro del sitio de marco. Si un cambio de aminoácidos resulta en un péptido funcional puede determinarse fácilmente mediante el ensayo de la actividad específica derivado polipeptídico . Los ensayos se describen detalladamente en la presente. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden ser preparados fácilmente por los expertos en la técnica. Los extremos amínicos y carboxílicos de fragmentos o análogos preferidos ocurren cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos públicas o privadas de secuencias. Preferentemente, se utilizan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencias o dominios previstos de conformación de las proteínas que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida se conocen. Bowie et ál . Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos que anteceden demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir dominios estructurales y funcionales según los anticuerpos descritos en la presente. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente en los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Estos residuos se desamidan en condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos se encuentra dentro del alcance de esta invención.
Por lo general, los residuos de cisteína en las proteínas están unidos por enlaces de disulfuro de cisteína-cisteína o están protegidos estéricamente de la formación de enlaces de disulfuro cuando son una parte de la región de la proteína plegada. La formación de enlaces de disulfuro en las proteínas es un proceso complejo que se determina mediante el potencial de oxidorreducción del medio y de las enzimas de intercambio de tiol-disulfuro especializadas (Creighton, Methods Enzymol . 107, 305-329, 1984; Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44,2002) . Cuando un residuo de cisteína no tiene un par en la estructura proteínica y no se encuentra protegido estéricamente por el pliegue, puede formar un enlace de disulfuro con una solución libre de cisteína en un proceso que se conoce como reordenamiento de disulfuro. En otro proceso conocido como mezcla de disulfuros, las cisteínas libres también pueden interferir con los enlaces de disulfuro de origen natural (tales como aquellos presentes en estructuras de anticuerpos) y conducir a una unión débil, una actividad biológica pobre y/o una baja estabilidad.
Las sustituciones de aminoácidos que se prefieren son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteinólisis , (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión y (4) confieren o modifican otras propiedades quimicofísicas o funcionales de tales análogos . Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia que no sea la secuencia de péptidos de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservadoras) pueden realizarse en la secuencia de origen natural (preferentemente en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman contactos intermoleculares) . Una sustitución de aminoácidos conservadora no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, una sustitución de aminoácidos no debería tender a romper la hélice que se manifiesta en la secuencia original, ni a desestabilizar otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan la secuencia original) . Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipeptídicas reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); In roduc aon to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds . , Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); and Thornton et ál . Nature 354:105 (1991), los que se incorporan a la presente mediante esta referencia. Adicionalmente , se pueden utilizar los procedimientos para realizar sustituciones o eliminaciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de regiones variables que participan en un enlace disulfuro intracatenario para generar moléculas de anticuerpos que no tienen uno o más enlaces de disulfuro intracatenarios .
Se pretende que el término "región CDR" o "CDR" se refiera a las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo que confieren la especificidad de la unión del antígeno al anticuerpo. Las CDR pueden definirse según el sistema Kabat (Kabat, E.A. et ál . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), y ediciones posteriores. Un anticuerpo típicamente contiene 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término la CDR o las CDR se usa en la presente para indicar, conforme al caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables por la unión por afinidad del anticuerpo por el antígeno o el epítopo que este reconoce.
La tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una variabilidad de mayor tamaño (mayor diversidad debido esencialmente a los mecanismos de ordenamiento de genes que la originaron) . Puede ser tan corta como 2 aminoácidos pese a que el tamaño más largo conocido es de 26. La longitud de la CDR también puede variar según la longitud que la región de marco variable subyacente en particular pueda acomodar. Funcionalmente , la HCDR3 juega un papel importante en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal et ál.f PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit et ál . , Science, 233:747-753, 1986, Chothia et ál . , J. Mol. Biol . , 196:901-917, 1987, Chothia et ál . , Nature, 342:877- 883, 1989, Catón et ál . , J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon et ál . , PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon et ál . , J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat et ál . , J. Immunol., 147:1709-1719, 1991) .
El término un "grupo de CDR" mencionado en la presente comprende las CDR1, CDR2 y CDR3. Por consiguiente, un conjunto de HCDR hace referencia a HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y un conjunto de LCDR hace referencia a LCDRl, LCDR2 y LCDR3.
Las variantes de los dominios VH y VL y las CDR de la presente invención, incluyendo aquellos para los que se indican secuencias de aminoácidos en la presente y que se pueden utilizar para dirigirse a agentes de unión de la invención y anticuerpos contra B7-H1 se pueden obtener a través de métodos de mutación o alteración de secuencias y análisis para estudiar la selección de antígenos con características deseadas. Ejemplos de características deseadas incluyen, de modo no taxativo: la afinidad de unión incrementada para el antígeno en comparación con anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno; la neutralización incrementada de la actividad de un antígeno en comparación con anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno si la actividad es conocida; la capacidad competitiva especificada con un anticuerpo o ligando conocidos al antígeno en una relación molar específica; la capacidad de inmunoprecipitar el complejo de ligando y receptor; la capacidad de unirse a un epítopo específico; el epítopo lineal, por ejemplo, una secuencia de péptidos identificada mediante el uso de análisis de unión de péptidos, por ejemplo, utilizando péptidos analizados en conformación lineal y/o restringida; el epítopo conformacional , formado por residuos discontinuos; la capacidad para modular una nueva actividad biológica de B7-H1 o de una molécula dirección 3'; la capacidad de unirse a y/o neutralizar B7-H1 para conseguir cualquier otra propiedad deseada. Las técnicas necesarias para realizar sustituciones dentro de las secuencias de aminoácidos de CDR, dominios VH o VL de anticuerpo y sitios de unión a antígenos se encuentran disponibles generalmente en la técnica. Se pueden producir variantes de las moléculas de anticuerpos descritas en la presente y utilizarlas en la presente invención. Siguiendo los adelantos de la química computacional en la aplicación de técnicas multivariantes de análisis de datos a las relaciones entre estructura/propiedad y actividad (Wold, et ál. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed. : B. Kowalski) , D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holanda, 1984) las relaciones cuantitativas entre actividad y propiedad de anticuerpos se pueden obtener usando técnicas matemáticas bien conocidas, tales como la regresión estadística y el reconocimiento y clasificación de patrones (Norman et ál . Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; tercera edición (abril de 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (11 de mayo, 1995); Krzanowski, Wojtek. Principies of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, N° 22 (papel)). Oxford University Press; (diciembre de 2000) ; Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations . Morgan Kaufmann,- (11 de octubre, 1999); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrián F. M. Smith. Bayesian ethods for Nonlinear Classification and Regression (Serie Wiley de Probabilidad y Estadística). John Wiley & Sons; (julio de 2002) ; Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principies, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery) . En algunos casos, las propiedades de los anticuerpos pueden derivarse de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de posibles residuos de contacto o propiedad quimicofísica calculada) de secuencia de anticuerpos, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar de forma individual y combinadas. El sitio de unión al antígeno de un anticuerpo compuesto por un dominio VH y un dominio VL se forma típicamente mediante seis bucles de polipéptidos : tres del dominio variable de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) y tres del dominio variable de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) . El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha elucidado relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de sitios de combinación de anticuerpos. Estas relaciones implican que, salvo por la tercera región (bucle) en los dominios VH, los bucles del sitio de unión tienen una de una cantidad pequeña de conformaciones de cadena principal: estructuras canónicas. La estructura canónica formada en un bucle particular ha mostrado estar determinada por su tamaño y la presencia de determinados residuos en sitios clave tanto en el bucle como en regiones de marco variable.
Este estudio de la relación entre la secuencia y la estructura se puede utilizar para la predicción de esos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes para mantener la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y, por lo tanto, mantener la especificidad de unión. Estas predicciones se pueden respaldar mediante la comparación de las predicciones con el resultado de experimentos de optimización avanzados. En un enfoque estructural, se puede crear un modelo de la molécula de anticuerpo mediante el uso de cualquier paquete comercial o libremente disponible, tal como WAM. Luego puede utilizarse un paquete de software de análisis y visualización de proteínas, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) o Deep View para evaluar posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Esta información luego se puede utilizar para realizar sustituciones que posiblemente tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad o confieran otras propiedades deseables .
El término "fragmento polipeptídico" , tal como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación de un extremo amino y/o extremo carboxi, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos son típicamente de al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos de 14 aminoácidos de longitud, más preferentemente de al menos 20 aminoácidos de longitud, a menudo al menos de 50 aminoácidos de longitud, y aun más preferentemente de al menos de 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo", tal como se usa en la presente, se refiere a polipéptidos que comprenden un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con respecto a una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a la B7-H1, en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad de bloquear la unión de la B7-H1 a una proteína adecuada, o (3) la capacidad de inhibir la actividad de la B7-H1. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución de aminoácidos (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos son típicamente de al menos de 20 aminoácidos de longitud, preferentemente de al menos de 50 aminoácidos de longitud o más largos y pueden con frecuencia ser tan largos como un polipéptido de longitud completa de origen natural .
Los análogos péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellas del modelo péptidico. Estos tipos de compuesto no peptídico se llaman "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos " . Fauchere, J". Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et ál . J. Med. Chem. 30:1229 (1987), los que se incorporan a la presente mediante referencia. Tales compuestos son a menudo desarrollados con la ayuda de modelos moleculares computarizados . Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos útiles terapéuticamente pueden utilizarse para provocar un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Por lo general, los péptidomiméticos son similares estructuralmente a un polipéptido paradigmático (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-- (cis y trans) , --C0CH2--, - -CH (OH) CH2- - , y -CH2S0--, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina, en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporado a la presente mediante esta referencia) ; por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclicen al péptido.
Tal como se usa en la presente, "anticuerpo" y "anticuerpos" (inmunoglobulinas) pueden ser un anticuerpo oligoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa) , un anticuerpo camélido, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con injerto de CDR, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo catalítico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo anti-idiotípico y anticuerpos que pueden marcarse en forma soluble o unida así como también fragmentos, variantes o derivados de los mismos, ya sea solos o combinados con otras secuencias de aminoácidos proporcionadas por técnicas conocidas. Un anticuerpo puede ser de cualquier especie. Un anticuerpo comprende un polipéptido o grupo de polipéptidos que están conformados por al menos un dominio de unión, que está formado a partir del plegamiento de cadenas polipeptídicas que tienen espacios de unión tridimensionales con formas superficiales internas y distribuciones de carga complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno. Un anticuerpo típicamente tiene una forma tetramérica, que comprende dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas , cada par con una cadena "ligera" y una cadena "pesada" . Las regiones variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman un sitio de unión a anticuerpos. Los anticuerpos naturales son a menudo glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150,000 daltones, compuestos por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de uniones de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracatenarios espaciados en intervalos regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras se clasifican como cadenas lambda o cadenas kappa en función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera. El dominio variable de una cadena ligera kappa puede también denominarse en la presente como VK. El termino "región variable" puede también utilizarse para describir el dominio variable de una cadena pesada o una cadena ligera. Se cree que los residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las regiones variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman un sitio de unión a anticuerpos. Los anticuerpos pueden obtenerse de cualquier mamífero, incluyendo, de manera no taxativa, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc.
El término "anticuerpo" o "anticuerpos" incluye fragmentos de unión de los anticuerpos de la invención, fragmentos de ejemplo incluyen Fv de cadena simple (scFv) , anticuerpos de cadena simple, anticuerpo de dominio simple, anticuerpos de dominio, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab') # fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada, región variable estabilizada por disulfuro (dsFv) , región variable dimérica (Diacuerpo) , anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id a anticuerpos de la invención) , intracuerpos , anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los que anteceden. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígenos. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ej . , IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ej . , IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4, IgAl y IgA2) o subclase.
La digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, da como resultado dos fragmentos de unión a antígenos idénticos, también conocidos como fragmentos "Fab" y un fragmento "Fe, que no posee actividad de unión a antígenos pero que tiene la capacidad de cristalizarse. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, da como resultado el fragmento F(ab' )2 en el cual los dos grupos de la molécula de anticuerpo permanecen enlazados y comprenden dos sitios de unión a antígenos. El fragmento F(ab' )2 tiene la capacidad de entrecruzarse con el antígeno.
"Fv", cuando se utiliza en la presente, se refiere al mínimo fragmento de un anticuerpo que conserva tanto el reconocimiento de antígenos como los sitios de unión a antígenos. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una fuerte asociación covalente o no covalente . Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígenos en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígenos. Sin embargo, aun un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígenos, aunque a una afinidad menor que todo el sitio de unión.
"Fab", cuando se utiliza en la presente, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada . "dAb", cuando se utiliza en la presente, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que es la unidad de unión funcional más pequeña de un anticuerpo humano. Un "dAb" es un anticuerpo de dominio simple y comprende tanto el dominio variable de una cadena pesada de un anticuerpo (dominio VH) o el dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo (dominio VL) . Cada dAb contiene tres de las seis CDR de origen natural (Ward et ál . , Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989); Holt, et ál., Domain antibodies: protein for therapy, Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)). Con pesos moleculares que varían de 11 a 15 kDa, son cuatro veces más pequeños que una unión de antígeno y fragmento (Fab) 2 y la mitad del tamaño de una molécula de cadena simple Fv (scFv) .
"Camélido", cuando se utiliza en la presente, se refiere a moléculas de anticuerpo compuestas por dímeros de cadena pesada que están desprovistos de cadenas ligeras, pero que, sin embargo, tienen un repertorio de unión a antígenos extenso (Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363 :446-448) .
El término "diacuerpos " se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígenos, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) . Al utilizar un enlace que es muy corto como para permitir la unión entre dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a unirse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión a antígenos. Se describen diacuerpos con más detalle en, por ejemplo, EP 404,097; O 93/11161; y Hollinger et ál . , Proc . Nati. Acad. Sci . EUA, 90 : 6444-6448 (1993) .
Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo entero pueden desempeñar la función de unirse a antígenos. Los ejemplos de fragmentos de unión son ( ard, E.S. et ál . , (1989) Nature 341, 544-546) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1 (McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554); el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (Holt et ál (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et ál., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et ál (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et ál (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490] , que consiste en un dominio VH o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas Fv de cadena simple (scFv) , donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por medio de un enlace peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígenos (Bird et ál, (1988) Science, 242, 423-426, , Huston et ál, (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883) ; (viii) dímeros Fv biespecífieos de cadena simple (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecífieos construidos por fusión de genes (WO94/13804; Holliger, P. (1993) et ál, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 90 6444-6448,). Las moléculas Fv, scFv o de diacuerpos se pueden estabilizar mediante la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter, Y. et ál, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996) . También se pueden realizar minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu, S. et ál, (1996) Cáncer Res., 56, 3055-3061) . Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab' , que se diferencian de los fragmentos Fab en la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo y Fab' -SH, que es un fragmento Fab' donde el o los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos y son responsables por la especificidad de unión de cada anticuerpo en particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida de forma pareja a través de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) , tanto en los dominios variables de cadena ligera como en los de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman regiones de marco variable (FR, por sus siglas en inglés) . Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cuatro regiones FR cada uno, que en general adoptan una configuración de lámina ß, conectada por tres CDR, que forman bucles que conectan la estructura de lámina ß y en algunos casos forman parte de ella. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en proximidad mediante las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígenos de los anticuerpos (véase Kabat et ál . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes por lo general no intervienen directamente en la unión a antígenos, pero pueden influir en la afinidad de unión a antígenos y pueden exhibir varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la ADCC, CDC y/o apoptosis.
El término "región hipervariable" , cuando se usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que están relacionados con su unión al antígeno. Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos del 24 al 34 (Ll), 50 al 56 (L2) y 89 al 97 (L3) del dominio variable de cadena ligera y los residuos del 31 al 35 (Hl) , 50 al 65 (H2) y 95 al 102 (H3) del dominio variable de cadena pesada; Kabat et ál . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o esos residuos que forman un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26 a 32 (Ll) , 50 a 52 (L2) y 91 a 96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26 a 32 (Hl) , 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Los residuos "de marco variables" o FR son los residuos de dominio variable que flanquean a las CDR. Los residuos FR están presentes en anticuerpos de dominio quiméricos, humanizados, humanos, diacuerpos, anticuerpos vaccibodies, anticuerpos lineales y anticuerpos biespecíficos .
Tal como se usa en la presente, "agente de unión diana", "proteína de unión diana", "proteína de unión específica" y términos similares, se refieren a un agente, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que se une preferentemente a un sitio diana. En una modalidad, el agente de unión diana es específico para un único sitio diana. En otras modalidades, el agente de unión diana es específico para más de un sitio diana. En una modalidad, el agente de unión diana puede ser un anticuerpo monoclonal y el sitio diana puede ser un epítopo. Un agente de unión diana puede comprender al menos un dominio de unión a antígenos (por ejemplo, una CDR) de un anticuerpo, dondel dominio se fusiona o está contenido dentro de un armazón de proteína heteróloga, por ejemplo, un armazón de proteína que no sea de anticuerpo.
Los "fragmentos de unión" de un anticuerpo pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen a Fab, Fab', F(ab' )2/ Fv, dAb y anticuerpos de cadena simple. Se entiende que cada uno de sus sitios de unión de un anticuerpo que no sea un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional " son idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión a un receptor a un contrareceptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor que se une al contra-receptor en al menos alrededor de un 20%, 40%, 60% u 80%, y con más frecuencia en más de alrededor de un 85% (como se midió en un ensayo de competencia de unión in vitro) .
El término "epítopo" incluye cualquier proteína determinante que tiene la capacidad de unirse de manera específica a un receptor de inmunoglobulina o de células T. Los determinantes de epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de glúcidos y pueden, pero no siempre, tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es =1 |1M, preferentemente = 100 n y más preferentemente = 10 nM.
El término "agente" se utiliza en la presente para designar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto realizado a partir de sustancias biológicas.
"Activo" o "actividad", en relación con un polipéptido B7-H1, se refiere a una porción de un polipéptido B7-H1 que tiene una actividad biológica o inmunológica de un polipéptido B7-H1 natural. "Biológica" cuando se utiliza en la presente, se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido B7-H1 natural. Una actividad biológica de B7-H1 preferida incluye, por ejemplo, la proliferación, adhesión e invasión celular inducida por B7-Hl, .
"Mamífero", cuando se usa en la presente, se refiere a cualquier animal que se considere un mamífero. De preferencia, el mamífero es un ser humano.
"Animal", cuando se utiliza en la presente, comprende animales considerados mamíferos. De preferencia, el animal es un ser humano.
El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios .
El término "mAb" se refiere a un anticuerpo monoclonal. "Liposoma" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a una vesícula pequeña que puede ser útil para la administración a un mamífero de fármacos que pueden incluir el polipéptido B7-H1 de la invención o anticuerpos contra el polipéptido B7-H1.
"Marca" o "marcado", tal como se usa en la presente, se refiere a la adición de un resto detectable a un polipéptido, por ejemplo, una radiomarcador, una marca fluorescente, una marca enzimática, una marca quimioluminiscente o un grupo biotinilo. Los radioisótopos o radionúclidos pueden incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Te, "'in, 125I, 131I, las marcas fluorescentes pueden incluir rodamina, fósforos a base de lantánidos o FITC y las marcas enzimáticas pueden incluir peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina.
Las etiquetas adicionales incluyen, a modo de ejemplo y no taxativo: enzimas, tales como glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ( "G6PDH" ) , alfa-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa y peroxidasa; tintes; marcas fluorescentes o fluorescedores adicionales, que incluyen aquellos tales como fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, GFP (GFP por "Proteína fluorescente verde"), dansilo, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina; fluoróforos tales como criptatos y quelatos de lantánidos, por ejemplo, Europio, etc. (Ensayos de Perkin Elmer y Cisbio) ; marcas quimioluminiscentes o quimioluminiscentes, tales como isoluminol, luminol y los dioxetanos; sensibilizadores; coenzimas; sustratos de enzima; partículas, tales como látex o partículas de carbono; solución coloidal metálica; cristalita, liposomas, células, etc., que pueden además estar marcados con un tinte, catalista u otro grupo detectable; moléculas tales como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina ,- restos de toxina, tales como, por ejemplo, un resto de toxina seleccionado de un grupo de exotoxina de pseudomonas (PE o un fragmento citotóxico o mutante del mismo) , toxina de Difteria o un fragmento citotóxico o mutante del mismo, toxina botulínica A, B, C, D o F, ricina o un fragmento citotóxico del mismo, por ejemplo, ricina A, abrina o un fragmento citotóxico del mismo, saporina o un fragmento citotóxico del mismo, proteína antiviral de fitolaca o un fragmento citotóxico del mismo y briodina 1 o un fragmento citotóxico de la misma.
El término "agente farmacéutico o fármaco", tal como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra de manera adecuada a un paciente. Otros términos químicos en la presente se utilizan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), (incorporado en la presente mediante esta referencia) .
Tal como se usa en la presente, " sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie presente predominante (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y preferentemente una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos alrededor de 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Por lo general, una composición sustancialmente pura comprenderá más de alrededor de 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente más de alrededor de 85%, 90%, 95% y 99%. Aun más preferentemente, la especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante métodos de detección convencionales) , donde la composición consiste esencialmente en una especie macromolecular única.
"Citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe de Ig (FcR) (por ejemplo, células destructoras naturales (NK, por sus siglas en inglés) , monocitos, neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpos unidos en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, solo expresan FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI , FcyRII y FCYRIII. La expresión de los FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 9 de la página 464 de Annu de Ravetch y Kinet. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) . Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede llevar a cabo un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes estadounidenses N° 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para los ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células destructoras naturales (NK) . De manera alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como aquel descrito en Clynes et ál. PNAS (USA) 95:652-656 (1988).
La "citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren al mecanismo por medio del cual los anticuerpos llevan a cabo su función de destruir las células. Se inicia mediante la unión de Clq, un constituyente del primer componente del complemento, al dominio Fe de los Ig, IgG o IgM, los que se encuentran en un complejo con un antígeno (Hughs-Jones, N.C., and B. Gardner. 1979. Mol. Immunol. 16:697). Clq es una glicoproteína grande, de estructura compleja, de apróx. 410 kDa, presente en el suero humano en una concentración de 70 yg/ml (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151). Junto con dos proteasas de serina, Clr y Cls, Clq forma el complejo Cl, el primer componente del complemento. Al menos dos de las cabezas globulares del extremo N de Clq deben estar unidas a las Fe de las Ig para la activación de Cl, por lo tanto, para la iniciación de la cascada del complemento (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol . 37 : 151) .
El término "semivida del anticuerpo", tal como se usa en la presente, significa una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo medio de supervivencia de las moléculas de anticuerpo luego de su administración. La semivida del anticuerpo se puede expresar como el tiempo que se requiere para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de inmunoglobulina del organismo del paciente o de un compartimento del mismo, por ejemplo, como se midió en el suero o el plasma, es decir, la semivida circulatoria o en otros tejidos. La semivida puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otra. Por lo general, un aumento en la semivida del anticuerpo tiene como resultado un aumento en el tiempo de permanencia medio del anticuerpo administrado (MRT, por sus siglas en inglés) en la circulación .
El término "isotipo" se refiere a la clasificación de la región constante de cadena ligera o pesada de un anticuerpo. Los dominios constantes de anticuerpos no intervienen en la unión al antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras. Según la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada, un anticuerpo humano dado o inmunoglobulina puede asignarse a una de cinco clases principales de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Muchas de estas clases pueden dividirse además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl (gamma 1) IgG2 (gamma 2) , IgG3 (gamma 3) e IgG4 (gamma 4) e IgAl e IgA2. Las regiones constantes dé cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. De las varias clases de inmunoglobulinas humanas, solo se ha comprobado que las IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 e IgM humanas activan el complemento. Se conoce que las IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas se unen a receptores gamma Fe, que median varias funciones efectoras, incluyendo el ADCC. Las regiones constantes de cadena ligera humanas pueden clasificarse en dos grandes clases, kappa y lambda.
Si se desea, puede cambiarse el isotipo de un anticuerpo que se une específicamente a B7-H1, por ejemplo, para aprovechar una propiedad biológica de un isotipo diferente. Por ejemplo, en algunas circunstancias, puede ser deseable, en relación con la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos contra B7-H1, que los anticuerpos tengan la capacidad de fijar el complemento e intervenir en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . Hay algunos isotipos de anticuerpos que tienen la capacidad de hacerlo, incluyendo, de modo no taxativo, los siguientes: IgM murino, IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 murino, IgM humano, IgA humano, IgGl humano e IgG3 humano. En otras modalidades puede ser deseable, en relación con la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos contra B7-H1, que los anticuerpos tengan la capacidad de unirse a receptores Fe en células efectoras e intervengan en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) . Existe una cantidad de isotipos de anticuerpos que tienen la capacidad de hacerlo, incluyendo, de modo no taxativo, los siguientes: IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 murino, IgGl humano e IgG3 humano. Se comprenderá que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente tal isotipo sino que, en cambio, el anticuerpo al generarse puede poseer cualquier isotipo y puede cambiarse el isotipo del anticuerpo posteriormente mediante el uso de métodos convencionales que son bien conocidas en la técnica. Las técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 4,816,397), técnicas de fusión de células-células (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses N° 5,916,771 y 6,207,418), entre otras .
A modo de ejemplo, los anticuerpos anti-B7-Hl discutidos en la presente son anticuerpos completamente humanos. Si un anticuerpo poseyera la unión deseada a B7-H1, podría cambiársele el isotipo fácilmente para generar un isotipo IgM humano, IgGl humano o IgG3 humano, mientras todavía posee la misma región variable (lo que define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad) . Entonces la molécula sería capaz de fijar el complemento y participar en la CDC y/o ser capaz de unirse a receptores Fe en células efectoras e intervenir en la ADCC.
Los "ensayos de sangre entera" utilizan sangre no fraccionada como una fuente de efectores naturales. La sangre contiene complemento en el plasma, junto con los efectores celulares que expresan FcR, tales como células polimorfonucleares (PMN) y células mononucleares (MNC) . Por lo tanto, los ensayos de sangre entera permiten la evaluación simultánea de la sinergia de los mecanismos efectores de la ADCC y la CDC in vi tro.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en la presente, es una cantidad que proporciona una mejora o beneficio al sujeto. Dicho de otra manera, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que proporciona un alivio, mitigación y/o disminución en al menos un síntoma clínico. Los síntomas clínicos asociados con los trastornos que pueden tratarse mediante los métodos de la invención son bien conocidos para los expertos en la técnica. Además, los expertos en la técnica comprenderán que los efectos terapéuticos no tienen por qué ser totales o curativos, mientras se brinde algún beneficio al sujeto.
Los ejemplos de cánceres en seres humanos incluyen un tumor de vejiga, tumor de mama, tumor de próstata, carcinoma, de células básales, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer del sistema nervioso central y de cerebro (por ejemplo, tumor glioma) , cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon y rectal, cáncer de tejido conjuntivo, cáncer del sistema digestivo; cáncer de endometrio, cáncer de esófago; cáncer de ojo, cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico; neoplasia intraepitelial ; cáncer de riñon; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo, microcítico y no microcítico) ; linfomas incluyendo el linfoma de Hodgkin y el de no Hodgkin; melanoma, mieloma, neuroblastoma , cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, de labio, de lengua, de boca y de faringe) ; cáncer de ovario, cáncer de páncreas, retinoblastoma ; rabdomiosarcoma ; cáncer rectal, cáncer renal, cáncer del sistema respiratorio; sarcoma, cáncer de piel; cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides; cáncer de útero, cáncer del sistema urinario, así como también otros carcinomas y sarcomas.
Los ejemplos de infecciones crónicas en humanos incluyen el VIH, el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) .
El término "y/o", tal como se usa en la presente, se debe considerar una descripción específica de cada uno de los dos rasgos o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" se debe tomar como una descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada una se estableciera individualmente en la presente.
Estructura de los anticuerpos Se sabe que la unidad estructural del anticuerpo básica comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas , cada par con una cadena "ligera" (de alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (de alrededor de 50 a 70 kDa) . La porción del extremo amino de cada cadena incluye una región variable de aprox. 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables por el reconocimiento de antígenos. La porción del extremo carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable por la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de alrededor de 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de alrededor de 10 aminoácidos más. Véase, en general, Fundamental Immunology capítulo 7 (Paul, W., ed. , 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)), que se incorpora en la presente mediante esta referencia en su totalidad para todos los fines) . Las regiones variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman un sitio de unión a anticuerpos.
Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Los dos sitios de unión son los mismos, salvo en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos .
Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones de marco variable (FR) relativamente conservadas, unidas mediante tres regiones hipervariables , también llamadas CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones de marco variable, permitiendo la unión a un epítopo específico. Del extremo N al extremo C, ambas cadenas ligera y pesada contienen los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos para cada dominio se hace de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)) o Chothia & Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et ál . Nature 342:878-883 (1989).
Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada y ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos, que incluyen la fusión de hibridomas o el enlace de fragmentos Fab' . Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp . Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny et ál. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Los anticuerpos biespecífieos no existen en la forma de fragmentos que tienen un único sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab' y Fv) .
Típicamente, un dominio VH está emparejado con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión del anticuerpo con el antígeno, aunque un dominio VH o VL solo, puede utilizarse para unirse al antígeno. El dominio VH (véase la Tabla 9) puede emparejarse con el dominio VL (véase la Tabla 13) , de manera que el sitio de unión a antígenos de un anticuerpo se forme comprendiendo tanto al dominio VH como al dominio VL.
Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados a los anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables de rata o murinas. La presencia de tales proteínas murinas o derivadas de rata puede conducir a una rápida eliminación de los anticuerpos y puede conducir a la generación de un respuesta inmunitaria contra el anticuerpo en un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos murinos o derivados de rata, se pueden generar anticuerpos completamente humanos por medio de la introducción de sitios de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamífero o animal, de manera que el roedor, otro mamífero o animal produzca anticuerpos completamente humanos .
Un método para generar anticuerpos completamente ® humanos es por medio del uso de cepas XenoMouse de ratones que se han modificado genéticamente para que contengan fragmentos de línea germinal configurados de hasta, pero de menos de 1000 kb [sic] del sitio de la cadena pesada humana y el sitio de la cadena ligera kappa . Véase, Méndez et ál . Nafcure Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Las cepas XenoMouse® están disponibles en Amgen, Inc. (Fremont, California, EUA) .
Tales ratones, por lo tanto, son capaces de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y presentan una insuficiencia en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos . Las tecnologías utilizadas para lograrlo se describen en la solicitud de patente estadounidense N° de serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y en las solicitudes internacionales de patente N° WO 98/24893 publicada el 11 de junio de 1998 y WO N° 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia. Véase también Méndez et ál. Nature Genetics 15:146-156 (1997), cuya descripción se incorpora a la presente mediante esta referencia.
La producción de cepas de XenoMouse" de ratones se trata y define con más detalle en las solicitudes de patente estadounidense con N° de serie 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031,801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234,145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430, 938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464,584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463,191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996, 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996, Publicación estadounidense 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001 y las patentes estadounidenses N° 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181 y 5,939,598 y las patentes japonesas N° 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Véanse también la patente europea N° EP 0 463 151 Bl, otorgada y publicada el 12 de junio de 1996, la solicitud de patente internacional N° O 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la solicitud de patente internacional N° WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes y referencias citadas anteriormente se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc. han utilizado el enfoque "minisitio" . En el enfoque minisitio, se imita un sitio Ig exógeno por medio de la inclusión de piezas (genes individuales) del sitio Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y a menudo una segunda región constante (de preferencia, una región constante gamma) se forman en una construcción para insertar en un animal. Este enfoque se describe en la patente estadounidense N° 5,545,807 otorgada a Surani et ál . y las patentes estadounidenses N° 545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299 y 6,255,458 cada una otorgada a Lonberg y Kay, la patente estadounidense N° 5,591,669 y 6,023.010 otorgada a Krimpenfort y Berns, las patentes estadounidenses N° 5,612,205, 5,721,367 y 5,789,215 otorgada a Berns et ál . y la patente estadounidense N° 5,643,763 otorgada a Choi y Dunn, y la solicitud internacional de patente estadounidense de GenPharm con N° de serie 07/574,748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575,962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810,279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853,408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904,068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990,860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053,131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096,762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155,301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161,739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165,699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209,741, presentada el 9 de marzo de 1994, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia. Véase también la patente europea N° 0 546 073 Bl, las solicitudes internacionales de patente N° WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente estadounidense N° 5,981,175, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante en su totalidad mediante esta referencia. Véanse además Taylor et ál . , 1992, Chen et ál . , 1993, Tuaillon et ál., 1993, Choi et ál . , 1993, Lonberg et ál . , (1994), Taylor et ál., (1994) y Tuaillon et ál . , (1995), Fishwild et ál . , (1996) , cuyas descripciones se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los cuales, por medio de fusión de microcélulas , se introdujeron grandes porciones de cromosomas o cromosomas enteros. Véanse las solicitudes de patente europeas N° 773 288 y 843 961, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia. Adicionalmente, se generaron ratones KM™, que son el resultado de la cruza entre ratones Te de Kirin y ratones de minisitio de Medarex (Humab) . Estos ratones poseen el transcromosoma IgH humano de los ratones Kirin y el transgén de la cadena kappa de los ratones de Genpharm (Ishida efc ál . , Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse mediante métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen, de manera no taxativa, la expresión en fagos (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (antes Proliferon) , Affimed) la expresión en ribosomas (CAT) , la expresión en levadura y similares.
Preparación de Anticuerpos Los anticuerpos, tal como se describe en la presente, se prepararon por medio del uso de tecnología XenoMouse*, como se describe a continuación. Tales ratones son capaces de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y presentan una insuficiencia en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos . Las tecnologías utilizadas para lograrlo se describen en las patentes, solicitudes y referencias descritas en la sección de antecedentes de la presente. En particular, sin embargo, una modalidad preferida de producción transgénica de ratones y anticuerpos a partir de las mismas se describe en la solicitud de patente estadounidense N° de serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y en las solicitudes internacionales de patente N° WO 98/24893 publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia. Véase también Méndez et ál . Nature Genetics 15:146-156 (1997), cuya descripción se incorpora a la presente mediante esta referencia.
Por medio del uso de la tecnología, se produjeron anticuerpos monoclonales completamente humanos para una variedad de antígenos. Esencialmente, las líneas XenoMouse® de ratón se inmunizan con un antígeno de interés (por ejemplo, B7-H1) , se recuperan las células linfáticas (tales como las células B) de los ratones hiperinmunizados , y los linfocitos recuperados se fusionan con una línea celular de tipo mieloide con el fin de preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Estas líneas celulares de hibridoma se analizan y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producían anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En la presente se proporcionan métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos contra B7-H1. Además, en la presente se proporciona una caracterización de los anticuerpos producidos por las líneas celulares, incluyendo el análisis de secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos.
De manera alternativa, en lugar de fusionarse a células de mieloma con el fin de generar hibridomas, las células B pueden analizarse directamente. Por ejemplo, las células B CD19+ pueden aislarse de ratones XenoMouse® hiperinmunes y se puede dejar que proliferen y se diferencien entre las células plasmáticas que segregan anticuerpos. Luego los anticuerpos de los sobrenadantes de las células se analizan mediante ELISA para determinar la reactividad contra el inmunógeno de B7-H1. Los sobrenadantes también pueden analizarse para determinar la inmunoreactividad contra los fragmentos de B7-Hl con el fin de mapear adicionalmente los diferentes anticuerpos para la unión a dominios de interés funcional en B7-H1. Los anticuerpos también pueden analizarse [sic] otras proteínas humanas relacionadas y en contraste con los ortólogos de B7-H1 de rata, ratón y primate no humano, tal como el mono cinomolgo, el último para determinar la reactividad cruzada de la especie. Las células B de pocilios que contienen anticuerpos de interés pueden inmortalizarse mediante varios métodos que incluyen la fusión con el fin de crear hibridomas, ya sea a partir de pocilios individuales o grupales, o mediante la infección con EBV o transfección mediante genes inmortalizadores conocidos y luego la colocación en placas con un medio adecuado. De manera alternativa, las células plasmáticas solas que segregan anticuerpos con las especificidades deseadas luego se aislan mediante el uso de un ensayo en placa hemolítica específico de B7-H1 (véase, por ejemplo, Babcook et ál . , Proc Nati. Acad. Sci. EUA 93:7843-48 (1996)). Las células diana de la lisis son preferentemente glóbulos rojos de oveja (SRBC, por sus siglas en inglés) recubiertas con el antígeno B7-H1.
En presencia de un cultivo de células B que contiene células plasmáticas que segregan la inmunoglobulina de interés y el complemento, la formación de una placa indica la lisis específica mediada por B7-H1 de los glóbulos rojos de oveja que rodean la célula plasmática de interés. La célula plasmática única de antígeno específico en el centro de la placa se puede aislar y la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo se aisla de la célula plasmática única. Mediante el uso de la transcripción inversa seguida de PCR (RT-PCR) , se puede clonar el ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo. El ADN clonado puede luego insertarse adicionalmente en un vector de expresión adecuado, preferentemente un cassette de vector tal como un ADNpc, más preferentemente el vector ADNpc que contiene los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina. Los vectores generados pueden luego transíectarse en células hospedadoras , por ejemplo, células HEK293, células CHO y cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según corresponda para la inducción de la transcripción, la selección de transformadores o la amplificación de genes que codifican las secuencias deseadas.
Como podrá apreciarse, los anticuerpos, tal como se describen en la presente, pueden expresarse en líneas celulares que no sean líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden ser utilizadas para transformar una célula hospedadora de mamífero adecuada. La transformación puede realizarse mediante cualquier método conocido para la introducción de polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo, la envoltura del polinucleótido en un virus (o en un vector vírico) y la transducción de una célula hospedadora con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplificó en las patentes estadounidenses N° 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (las patentes se incorporan a la presente mediante referencia) . El procedimiento de transformación utilizado depende del hospedador a ser transformado. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen bien en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación de fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la encapsulación del o los polinucleótidos en liposomas y la microinyección directa de ADN en núcleos.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadoras para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de NCIMB, incluyendo, de modo no taxativo, células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK por células) , células de riñon de mono (COS por células) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ej . , Hep G2) , células 293 de riñon epiteliales humanas (Hek293) y una cantidad de otras líneas celulares. Las líneas celulares de particular preferencia se seleccionan determinando cuáles líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión de B7-H1 constitutivas.
En la técnica de fusión de células-células, se prepara un mieloma, célula CHO o cualquier otra línea celular que posea una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro mieloma, célula CHO u otra línea celular que posea una cadena ligera. Tales células pueden, a partir de ese momento, fusionarse y se puede aislar una línea celular que exprese un anticuerpo intacto.
Por consiguiente, mientras se generan anticuerpos candidatos que cumplen con los atributos "estructurales" deseados, como se trató anteriormente, pueden proporcionarse en general con al menos algunos de los atributos "funcionales" deseados por medio del cambio de isotipos.
En la técnica de fusión de células-células, se prepara un mieloma, célula CHO o cualquier otra línea celular que posea una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro mieloma, célula CHO u otra línea celular que posea una cadena ligera. Tales células pueden, a partir de ese momento, fusionarse y se puede aislar una línea celular que exprese un anticuerpo intacto.
Por consiguiente, mientras se generan anticuerpos candidatos que cumplen con los atributos "estructurales" deseados, como se discutió anteriormente, pueden proporcionarse en general con al menos algunos de los atributos "funcionales" deseados por medio del cambio de isotipos .
Secuencias de anticuerpos Las modalidades de la invención incluyen los anticuerpos enumerados a continuación en la Tabla 1. Esta tabla muestra el número de identificación de cada anticuerpo, junto con el número SEQ ID del dominio variable de los correspondientes genes y polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera, respectivamente. A cada secuencia de anticuerpos se le ha dado un número de identificación.
Tabla 1 Las modalidades de la invención incluyen formulaciones farmacéuticas estériles de anticuerpos anti B7-H1 que son útiles como tratamiento para enfermedades. Las formulaciones inhibirían la unión de B7-H1 a uno o más de sus ligandos afines, tratando de esta manera afecciones patológicas donde, por ejemplo, la B7-H1 es anormalmente elevada en el suero o tejidos. Los anticuerpos de la invención poseen preferentemente una afinidad adecuada para inhibir de forma potente la actividad de B7-H1 o inhibir la unión de B7-H1 a uno o más de sus ligandos afines, y preferentemente tienen una duración adecuada de acción para permitir una dosis poco frecuente en humanos. Una duración prolongada de acción permitirá dosificaciones menos frecuentes y más convenientes mediante vías parenterales alternadas tales como la inyección subcutánea o intramuscular.
Las formulaciones estériles pueden crearse, por ejemplo, mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o luego de la liofilización y reconstitución del anticuerpo. El anticuerpo se almacenará normalmente en una forma liofilizada o en una solución. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos por lo general se ubican en un recipiente que tiene una puerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa, que tiene un adaptador que permite el retiro de la formulación, como un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
La vía administración del anticuerpo se realiza según métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal , intracerebral , intramuscular, intraocular, intrarterial , intratecal, de inhalación o intralesional , inyección directa en el sitio tumoral, o mediante los sistemas de liberación sostenida como se indica a continuación. El anticuerpo puede administrarse preferentemente de manera continua mediante la infusión o mediante inyección en bolo.
Una cantidad eficaz de anticuerpo a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y la afección del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la vía de administración como sea necesario pora obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el médico administrará el anticuerpo hasta alcanzar una dosificación que logre el efecto deseado. La evolución de esta terapia se monitorea fácilmente mediante ensayos convencionales o mediante los ensayos descritos en la presente .
Los anticuerpos, tal como se describen en la presente, pueden prepararse en una mezcla con un portador farmacéu icamente aceptable. Esta composición terapéutica puede administrarse por vía intravenosa o por medio de la nariz o pulmones, preferentemente como un líquido o aerosol en polvo ( liofilizado) . La composición también puede administrarse parenteralmente o subcutáneamente, si se desea. Cuando se administra de modo sistemático, la composición terapéutica debería ser estéril, estar libre de pirógenos y en una solución parenteralmente aceptable que tenga en cuenta el pH, la isotonicidad y la estabilidad. Las condiciones son conocidas para los expertos en la técnica. En resumen, las formulaciones dosificadas de los compuestos descritos en la presente se preparan para su almacenamiento o administración mediante la mezcla del compuesto que posee el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables. Tales materiales no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales ácidas orgánicas; antioxidantes tales como el ácido ascórbico; péptidos de peso molecular bajo (menos de alrededor de diez residuos) , tales como la poliarginina, proteínas, tales como el suero, albúmina, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como la polivinilpirrolodinona; aminoácidos tales como la glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa o dextriñas,· agentes quelantes tales como EDTA; azúcares alcohólicos tales como el manitol o sorbitol; contraiones tales como el sodio y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol .
Las composiciones estériles para la inyección se pueden formular de acuerdo con prácticas farmacéuticas convencionales, tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20* ed, Lippincott Williams & ilkens Publishers (2003)) . Por ejemplo, se puede desear la disolución o suspensión del componente activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal de origen natural como sésamo, maní o semilla de algodón o en un vehículo graso sintético como el oleato etílico o similar. Pueden incorporarse amortiguadores, conservantes, antioxidantes y similares según las prácticas farmacéuticas aceptadas.
Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, cuyas matrices se encuentran en forma de artículos, películas o microcápsulas moldeadas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , como se describe en Langer et ál . , J. Biomed Res., (1981) 15:167-277 y Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o poli (vinilalcohol ) ) , polilácticos (patente estadounidense N° 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et ál . , Biopolymers, (1983) 22:547-556) acetato de etilenvinilo no degradable (Langer et ál . , supra) , copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico—ácido glicólico y acetato de leuprorrelina) y ácido poli -D- ( - ) -3 -hidroxibutírico (EP 133,988).
Si bien los polímeros tales como el acetato de etilenvinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsulados permanecen en el cuerpo por un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o aglomerar como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que da como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización según el mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de aglomeración es la formación de un enlace S--S intermolecular a través del intercambio de disulfuro, la estabilización se puede lograr mediante la modificación de los residuos de sulfhidrilo, la liofilización a partir de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos adecuados y el desarrollo de composiciones matrices específicas de polímero.
Las composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendido en formulaciones adecuadas con la capacidad de mantener cristales en suspensión. Estas preparaciones, cuando se inyectan por vía subcutánea o intraperitoneal , pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos atrapados en liposomas. Los liposomas que contienen los anticuerpos se preparan mediante métodos conocidos en sí mismos: patente estadounidense N° DE 3,218,121; Epstein et ál . , Proc . Nati. Acad. Sci. EUA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; pat . estadounidense N° 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324.
La dosis de la formulación de anticuerpos para un paciente dado la determinará el médico tratante teniendo en cuenta varios factores que se sabe modifican la acción de los fármacos, incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos pertinentes. Las dosificaciones terapéuticamente eficaces pueden determinarse tanto mediante métodos in v tro como in vivo.
Una cantidad eficaz de los anticuerpos descritos en la presente a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y la afección del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la vía de administración como sea necesario pora obtener un efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede variar de alrededor de O.OOOlmg/kg, O.OOlmg/kg, O.Olmg/kg, O.lmg/kg, lmg/kg, 10mg/kg a hasta 100mg/kg, 1000mg/kg, 10000mg/kg o más, del peso corporal del paciente, según los factores mencionados anteriormente. La dosis puede ser de entre 0.0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0.0001 y 2 mg/kg, 0.0001 y 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg a 0.25 mg/kg, 0.0001 a 0.15 mg/kg, 0.0001 a 0.10 mg/kg, 0.001 a 0.5 mg/kg, 0.01 a 0.25 mg/kg o 0.01 a 0.10 mg/kg del peso corporal del paciente, según los factores mencionados anteriormente. Típicamente, el médico administrará el anticuerpo terapéutico hasta alcanzar una dosificación que logre el efecto deseado. La evolución de esta terapia se monitorea fácilmente mediante ensayos convencionales o como se describe en la presente.
La dosis de anticuerpos de la invención puede repetirse y la administración puede dividirse en al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas, según las composiciones y métodos en la presente, se administrarán con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar transferencia, administración, tolerancia y similares mejorados. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicas o aniónicas) (tales como Lipofectin™) , conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones Carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares) , geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas que anteceden puede ser adecuada en los tratamientos y terapias según la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no se vea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance . " Regul . Toxicol . Phar acol . 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals . " Int. J. Pharm. 203 (1-2) : 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts . " J Pharm Sci .89 ( 8) : 967-78 (2000), Powell efc ál . "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol . 52:238-311 (1998) y las citas en los mismos para la información adicional relacionado con las formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos para los químicos farmacéuticos.
Diseño y generación de otros agentes terapéuticos Según la presente invención y en función de la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan en la presente en relación con B7-H1, se facilita y revela al experto en la técnica el diseño de otras modalidades terapéuticas además de los restos de anticuerpos. Tales modalidades incluyen, de modo no taxativo, agentes terapéuticos de anticuerpos avanzados, tales como anticuerpos biespecífieos , inmunotoxinas , agentes terapéuticos radiomarcados , y dominios V de anticuerpos simples, agente de unión similar al anticuerpo basado en armazones que no son de región V, anticuerpos de dominio único, generación de agentes terapéuticos peptídicos, dominios de unión a B7-H1 en armazones novedosos, terapias génicas, en particular intracuerpos , agentes terapéuticos antisentido y moléculas pequeñas .
Se puede proporcionar un sitio de unión a antígenos por medio del ordenamiento de CDR de armazones de proteínas que no son anticuerpos, tales como la fibronectina o citocromo B, etc. (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et ál. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et ál . (1997) Current Opinión in Structural Biology, 7: 463-469), o mediante la aleatorización o mutación de residuos de aminoácidos de un bucle con un armazón de proteína para otorgar especificidad de unión por una diana deseada. Los armazones para diseñar sitios de unión novedosos en proteínas han sido estudiados en detalle por Nygren et ál . (Nygren et ál . (1997) Current Opinión in Structural Biology, 7: 463-469) . Los armazones de proteínas para los miméticos de anticuerpos se describen en el documento WO/0034784, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad, en el cual los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un bucle aleatorizado . Un armazón adecuado en el cual se puede injertar una o más CDR, por ej . , un conjunto de HCDR, puede ser proporcionado por cualquier miembro del dominio de la superfamilia del gen de la inmunoglobulina. El armazón puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un armazón de proteína que no es de anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión al antígeno en una molécula del armazón que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas de las moléculas del anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de unión puede otorgar propiedades fisiológicas útiles, tal como una capacidad de ingresar a las células, penetrar profundamente en los tejidos o alcanzar dianas dentro de otras estructuras o de unirse dentro de cavidades de proteínas del antígeno diana. El uso de los sitios de unión a antígenos en armazones de proteína que no son anticuerpos se estudian en Wess, 2004 (Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004). Son típicas las proteínas que tienen una estructura principal estable y uno o más bucles variables, donde las secuencias de aminoácidos del bucle o bucles están mutadas de forma específica o aleatoria para crear un sitio de unión al antígeno que se une al antígeno diana. Tales proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de S.aureus, transferina, albúmina, tertranectina, fibronectina (por ejemplo, décimo dominio de fibronectina tipo III) , lipocalinas, así como también gamma-cristalina y otros armazones Affilin™ (Proteínas Scil) . Los ejemplos de otros enfoques incluyen "Microcuerpos" sintéticos basados en ciclótidos -pequeñas proteínas que tienen enlaces de disulfuro intramoleculares, microproteínas (Versabodies™ , Amunix) y proteínas de repetición de anquirina (DARPins, Molecular Partners) .
Además de las secuencias de anticuerpos y/o un sitio de unión a antígenos, un agente de unión diana conforme a la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ej . , que forman un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado o para otorgar a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unirse al antígeno. Los agentes de unión diana de la invención pueden portar una marca detectable o se pueden conjugar con una toxina o una porción o enzima de direccionamiento (por ej . , por medio de una unión o enlace peptidilo) . Por ejemplo, un agente de unión diana puede comprender un sitio catalítico (por ej . , en un dominio enzimático) , así como también un sitio de unión a antígenos, donde el sitio de unión a antígenos se une al antígeno y por lo tanto dirige el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ej . , por medio de escisión.
En cuanto a la generación de agentes terapéuticos de anticuerpos avanzados, donde la fijación del complemento es una característica deseable, puede ser posible evitar la dependencia del complemento para la destrucción de células a través del uso de anticuerpos biespecíficos , inmunotoxinas, o radiomarcadores , por ejemplo.
Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad para B7-H1 y otro para una segunda molécula, que se conjugan juntos, (ii) un único anticuerpo que tiene una cadena específica para B7-H1 y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de cadena simple que tiene especificidad para B7-H1 y la otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse mediante el uso de técnicas que son bien conocidas; por ejemplo, en relación con (i) y (ii) véase, por ejemplo, Fanger et ál . Immunol Methods 4:72-81 (1994) y right and Harris, supra. y en relación con (iii) véase, por ejemplo, Traunecker et ál . Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad puede realizarse como se desee. Por ejemplo, la segunda especificidad puede realizarse en los receptores de activación de cadena pesada, que incluyen, de modo no taxativo, CD16 o CD64 (véase, por ejemplo, Deo et ál . Immunol. Today 18:127 (1997)) o CD89 (véase, por ejemplo, Valerius et ál . Blood 90:4485-4492 (1997)).
Los anticuerpos pueden también ser modificados para actuar como inmunotoxinas mediante el uso de técnicas que son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también patente estadounidense N° 5,194,594. En relación con la preparación de anticuerpos radiomarcados , tales anticuerpos modificados pueden también prepararse fácilmente mediante el uso de métodos que son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Junghans et ál . en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (segunda edición, Chafner y Longo, eds . , Lippincott Raven (1996)). Véanse también las patentes estadounidenses N° 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 y 5,697,902. Es probable que cada inmunotoxina y molécula radiomarcada destruya a las células que expresen el dominio de oligomerización de la subunidad de la enzima multimérica.
Cuando un anticuerpo se une a un agente (por ejemplo, radioisótopo, composición farmacéutica o una toxina) se contempla que el agente posea una propiedad farmacéutica seleccionada del grupo de agentes antimitóticos , alquilantes, antimetabolitos, antiangiogénicos , apoptósicos, alcaloides, COX-2 y antibióticos y combinaciones de los mismos. El agente puede seleccionarse del grupo de mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, sulfonados de alquilo, nitrosoureas , triazenos, análogos de ácido fólico, antraciclinas , taxanos, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas , complejos de coordinación de platino, alcaloides de la vinca, ureas sustituidas, derivados de metil hidrazina, supresores adrenocorticales , antagonistas, endostatina, taxoles, camptotecinas , oxaliplatina, daxorubicinas y sus análogos, y una combinación de los mismos. Los ejemplos de toxinas incluyen además la gelonina, exotoxinas de pseudomonas (PE, por sus siglas en inglés), PE40, PE38, toxina de difteria, ricina, abrina, alfa toxina, saporina, ribonucleasa (RNasa) , DNasa I, enterotoxina A de estafilococo, proteína antiviral de fitolaca, gelonina, endotoxina de pseudomonas, miembros de la familia enedina de moléculas, tales como caliqueamicina y esperamicina, así como también derivados, combinaciones y modificaciones de los mismos. Las toxinas químicas pueden también tomarse del grupo que consiste en duocarmicina (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 5,703,080 y la patente estadounidense N° 4,923,990), metotrexato, doxorrubicina , melfalán, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cisplatino, etopósido, bleomicina y 5-fluorouracilo . Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos también incluyen adriamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, tiotepa, taxotere (docetaxel) , busulfán, citoxina, taxol , metrotexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (véase, patente estadounidense N° 4,675,187), melfalán y otras mostazas de nitrógeno relacionadas. Las toxinas y agentes quimioterapéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y en Goodman And Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics , 7a Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985) . Otras toxinas y/o agentes quimioterapéuticos adecuados son conocidas por los expertos en la técnica.
Los ejemplos de radioisótopos incluyen los emisores gamma, emisores positrón y emisores de rayos x, que pueden utilizarse para la localización y/o terapia, y los emisores beta y emisores alfa, que pueden usarse para terapia. Los radioisótopos descritos anteriormente como útiles para el diagnóstico, pronóstico y estadificación son también útiles para la terapia.
Los ejemplos no taxativos de agentes anticancerosos o antileucémicos incluyen antraciclinas tales como la doxorrubicina (adriamicina) , daunorrubicina (daunomicina) , idarrubicina, detorrubicina, carminomicina , epirrubicina, esorrubicina y morfolino y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de los mismos. Los ejemplos de agentes farmacéuticos incluyen el cisplatino, taxol, caliqueamicina, vincristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prendisona, daunorubicina, idarrubicina, fluradabina, clorambucilo, alfa interferón, hidroxiurea, temozolomida, talidomida, y bleomicina y derivados, combinaciones y modificaciones de los mismos. Preferentemente, el anticanceroso o antileucémico es doxorrubicina, morfolinodoxorrubicina o morfolinodaunorrubicina.
Los anticuerpos de la invención también comprenden anticuerpos que tienen semividas (por ejemplo, semividas de suero) más largas que la de un anticuerpo no modificado en un mamífero, de preferencia un humano. En una modalidad, la semivida del anticuerpo es mayor que alrededor de 15 días, mayor que alrededor de 20 días, mayor que alrededor de 25 días, mayor que alrededor de 30 días, mayor que alrededor de 35 días, mayor que alrededor de 40 días, mayor que alrededor de 45 días, mayor que alrededor de 2 meses, mayor que alrededor de 3 meses, mayor que alrededor de 4 meses, o mayor que alrededor de 5 meses . Las semividas aumentadas de los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos en un mamífero, preferentemente un ser humano, dan como resultado una titulación de suero más alta de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en el mamífero, y, de esta manera, se reduce la frecuencia de la administración de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y/o se reduce la concentración de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a ser administrada. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen semividas in vivo aumentadas pueden generarse mediante técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de los mismos con semividas in vivo aumentadas pueden generarse mediante la modificación (por ejemplo, la sustitución, eliminación o adición) de residuos de aminoácidos identificados como que intervienen en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales N° WO 97/34631 y WO 02/060919, que se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad) . Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen semividas in vivo aumentadas pueden generarse mediante la unión a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, moléculas poliméricas tales como el polietilenglicol de peso molecular alto (PEG) . El PEG puede unirse a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con o sin un enlace multifuncional a través de una conjugación de sitio especifico del PEG con el extremo N o el extremo C de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o mediante grupos épsilon-amino presentes en los residuos de lisina. Se usará la derivación de polímero lineal o ramificado que da como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se monitoreará de cerca por medio de SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación adecuada de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de conjugados de PEG y anticuerpo por medio de, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio de iones.
Como comprenderá el experto en la técnica, en las modalidades que anteceden, si bien los valores de afinidad pueden ser importantes, existen otros factores que pueden ser más o igual de importantes, según la función particular del anticuerpo. Por ejemplo, para una inmunotoxina (toxina asociada con un anticuerpo) , el acto de unir el anticuerpo a la diana puede ser útil, sin embargo, en algunas modalidades, es la internalización de la toxina en la célula el resultado final deseado. Por lo tanto, en estas situaciones pueden ser deseables los anticuerpos con un alto porcentaje de internalización. De esta manera, en una modalidad, se contemplan anticuerpos con una alta eficiencia en la internalización. Una alta eficiencia en la internalización se puede medir como el porcentaje de anticuerpo internalizado y puede ser de un valor bajo hasta 100%. Por ejemplo, en modalidades variantes, una eficiencia alta puede ser de un 0.1 a 5, 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 45, 45 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 99 y 99 a 100%. Como podrán ver los expertos en la técnica, la eficiencia deseable puede ser diferente en diferentes modalidades, según, por ejemplo, el agente asociado, la cantidad de anticuerpo que puede administrarse a un área, los efectos colaterales del complejo de anticuerpo y agente, el tipo (por ejemplo, el tipo de cáncer) y la gravedad del problema que se tratará.
En otras modalidades, los anticuerpos descritos en la presente proporcionan un kit de ensayo para la detección de la expresión de B7-H1 en tejidos o células de mamífero, con el fin de realizar un análisis para detectar una enfermedad o trastorno asociado con los cambios en la expresión de B7-H1. El kit comprende un anticuerpo que se une a B7-H1 y medios para indicar la reacción del anticuerpo ante el antígeno, si se encuentra presente .
En algunas modalidades, se proporciona un artículo fabricado que comprende un recipiente, que comprende una composición que contiene un anticuerpo que se une específicamente a B7-H1 y un prospecto o etiqueta que indica que la composición puede utilizarse para tratar la enfermedad mediada por la expresión de B7-H1. Preferentemente un mamífero y, más preferentemente un ser humano, recibe el anticuerpo que se une específicamente a B7-H1.
Combinaciones El tratamiento antitumoral definido en la presente puede ser aplicado como una única terapia o puede involucrar, además de los compuestos de la invención, cirugía convencional, trasplante de médula ósea y de células madre periféricas o radioterapia o quimioterapia. La quimioterapia puede incluir una o más de las siguientes categorías de agentes antitumorales : (i) otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, como se usa en la oncología médica, tales como agentes alquilantes (por ejemplo el cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalán, clorambucilo, busulfán, temozolamida y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo, la gemcitabina y antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, citarabina e hidroxiurea) ; antibióticos antitumorales (por ejemplo, las antraciclinas como la adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) ; agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca como la vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides, tales como taxol y taxotere e inhibidores de la polocinasa) ; e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas tales como el etopósido y tenipósido, ansacrina, topotecán y camptotecina) . (ii) agentes citostáticos tales como los antiestrógenos (por ejemplo tamoxifeno, fulvestrant, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e iodoxifeno) , antiandrógenos (por ejemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona) , antagonistas LHRH o agonistas LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina) , progestógenos (por ejemplo acetato de megestrol) , inhibidores de aromatasa (como por ejemplo anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5a-reductasa tales como finasterida; (iii) agentes anti-invasivos (por ejemplo, inhibidores de la familia de la c-Src cinasa como 4 - ( 6 -cloro-2 , 3 -metilenedioxianilino) -7- [2- (4-metilpiperazin-l-il) etoxi] -5-tetrahidropiran-4 - iloxiquinazolina (AZD0530 solicitud de patente internacional O 01/94341) y N- (2 -cloro-6 -metilfenil) -2-{6- [4- (2 -hidroxietil ) piperazin- 1- il] -2-metil irimidin-4 - ilamino} tiazol -5-carboxamida (dasatinib, BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661), e inhibidores de la metaloproteinasa como marimastat, inhibidores de la función del receptor del activador del plasminógeno tipo urocinasa o inhibidores de la actividad de la catepsina, inhibidores de proteasas de serina, por ejemplo, matriptasa, hepsina, urocinaza e inhibidores de la función a?ß6 de la integrina. (iv) agentes citotóxicos tales como la fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina, clorambucilo o doxorrubicina y combinaciones de los mismos tales como Fludarabina + ciclofosfamida, CVP : ciclofosfamida + vincristina + prednisona, ACVBP: doxorrubicina + ciclofosfamida + vindesina + bleomicina + prednisona, CHOP: ciclofosfamida + doxorrubicina + vincristina + prednisona, CNOP: ciclofosfamida + mitoxantrona + vincristina + prednisona, m-BACOD: metotrexato + bleomicina + doxorrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dexametasona + leucovorina . , ACOP-B: metotrexato + doxorrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dosis fijas de prednisona + bleomicina + leucovorina, o ProMACE CytaBOM: prednisona + doxorrubicina + ciclofosfamida + etopósido + citarabina + bleomicina + vincristina + metotrexato + leucovorina. (v) inhibidores de la función del factor de crecimiento: por ejemplo, tales inhibidores incluyen anticuerpos contra el factor de crecimiento y anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo antierbB2 trastuzumab [Herceptina™] , el anticuerpo anti-EGFR panitumumab, el anticuerpo anti-erbBl cetuximab [Erbitux, C225] y cualquier anticuerpo contra el factor de crecimiento o contra el receptor del factor de crecimiento descrito en Stern et ál . Critical reviews in oncology/haematology, 2005, tomo 54, págs . 11-29); tales inhibidores también incluyen inhibidores de la tirosina cinasa, por ejemplo, los inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, los inhibidores de la tirosina cinasa de la familia EGFR, tales como N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxi-6- (3 -morfolinopropoxi) quinazolin-4 -amina (gefitinib, ZD1839) , N- (3-etinilfenil) -6, 7-bis (2-metoxietoxi ) quinazolin-4 -amina (erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7- (3 -morfolinopropoxi) -quinazolin-4 -amina (CI 1033), inhibidores de la tirosina cinasa erbB2, tales como lapatinib, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas, tal como imatinib, inhibidores de cinasas de serina/treonina (por ejemplo, inhibidores de la señalización de Ras/Raf, tal como inhibidores de farnesil transferasa, por ejemplo, sorafenib (BAY 43-9006)), inhibidores de la señalización celular a través de cinasas MEK y/o AKT, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de c-kit, inhibidores de la cinasa abl, inhibidores de la cinasa del receptor IGF (factor de crecimiento similar a la insulina) ; inhibidores de la cinasa aurora (por ejemplo, AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 y AX39459) e inhibidores de la cinasa dependiente de la ciclina, tales como inhibidores de CDK2 y/o CDK4 , e inhibidores de proteínas de la señalización de la supervivencia, tales como Bel -2, Bcl-XL por ejemplo ABT-737; (vi) agentes antiangiogénicos tales como aquellos que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular, [por ejemplo, el anticuerpo contra el factor de crecimiento endotelial vascular bevacizumab (Avastin™) ] y los inhibidores de la tirosina cinasa del receptor de VEGF, tales como 4- (4-bromo-2-fluoroanilino) -6-metoxi-7- (1-metilpiperidin-4-ilmetoxi) quinazolina (ZD6474; Ejemplo 2 de WO 01/32651), 4- (4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi) -6-metoxi-7- (3-pirrolidin-l-ilpropoxi) quinazolina (AZD2171; Ejemplo 240 de WO 00/47212), vatalanib (PTK787; O 98/35985) y SU11248 (sunitinib; O 01/60814), compuestos como los descritos en las solicitudes de patente internacionales 097/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WOOO/47212 y WOOl/32651, anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular tales como anticuerpos anti-KDR y anticuerpos anti-fltl,) y compuestos que funcionan mediante otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función a?ß3 de la integrina y angiostatina) ] o el factor 1 estimulador de colonias (CSF1) o receptor CSF1; detalles adicionales sobre AZD2171 pueden encontrarse en Wedge et ál (2005) Cáncer Research. 65(10): 4389-400. Detalles adicionales sobre AZD6474 pueden encontrarse en Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cáncer. 92 Comp. 1:S6-13. Ambas publicaciones se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. (vii) agentes perjudiciales para el sistema vascular tales como Combretastatina A4 y compuestos descritos en las solicitudes de patente internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213; (viii) terapias antisentido, por ejemplo, aquellas que se dirigen a las dianas listadas anteriormente, tales como ISIS 2503, un antisentido anti-ras o G3139 (Genasense) , un antisentido anti bcl2; (ix) Enfoques de terapia genética, que incluyen, por ejemplo, enfoques para el reemplazo de genes anómalos, tales como p53 o BRCA1 o BRCA2 anómalos, enfoques de GDEPT (terapia con enzima-profármaco dirigida por genes) tales como aquellos que usan citosina deaminasa, timidina cinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y enfoques para el aumento de la tolerancia del paciente a la quimioterapia o radioterapia tal como la terapia génica de resistencia múltiple a fármacos; (x) enfoques de inmunoterapia , incluyendo, por ejemplo, el tratamiento con Alemtuzumab (campath- 1H™) , un anticuerpo monoclonal dirigido a CD52, o un tratamiento con anticuerpos dirigido a CD22, enfoques ex vivo e in vivo para aumentar la inmunogenicidad de las células tumorales de un paciente, la transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4, o el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, enfoques para disminuir la anergia de las células T, tal como el tratamiento con anticuerpos monoclonales que inhiben la función de CTLA-4, enfoques que utilizan células inmunitarias transíectadas tales como las células dendríticas transíectadas con citocina, enfoques que utilizan líneas celulares tumorales transíectadas con citocina y enfoques que utilizan anticuerpos antiidiotípicos , transferencia adoptiva de células T que utiliza células T que han sido activadas o dirigidas no específicamente a un antígeno específico de interés ex vivo; (xi) enfoques de vacunación, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento con una vacuna dirigida contra una infección vírica específica, tal como el VIH o VHB o el tratamiento con una vacuna dirigida contra un antígeno tumoral específico; (xii) inhibidores de la degradación de las proteínas, tal como el inhibidor del proteasoma, como Velcade (bortezomid) ; y (xiii) enfoques terapéuticos bioterapéuticos , por ejemplo, los que usan péptidos o proteínas (tales como los anticuerpos o las construcciones de dominio receptor externo solubles) que se apropian de los ligandos receptores, bloquean la unión del ligando al receptor o disminuyen la señalización del receptor (por ejemplo, debido a la degradación del receptor mejorado o los niveles de expresión disminuidos) .
En una modalidad, el tratamiento antitumoral definido en la presente puede implicar, además de los compuestos de la invención, el tratamiento con otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, como se utilizan en la oncología médica, tal como agentes alquilantes (por ejemplo, el cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, ciclofosfamida , mostaza de nitrógeno, melfalán, clorambucilo, busulfán, temozolamida y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo, la gemcitabina y antifolatos tales como las fluoropirimidinas, como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, citarabina e hidroxiurea) ; antibióticos antitumorales (por ejemplo, antraciclinas tales como la adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) ; agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca tales como la vincristina, vinblastina, vindesina y vinorrelbina y taxoides tales como el taxol y taxotere e inhibidores de la polocinasa) ; e inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas tales como el etopósido y tenipósido, ansacrina, topotecán y camptotecina) .
El tratamiento en conjunto puede llevarse a cabo a través de dosificaciones simultáneas, secuenciales o separadas de los compuestos individuales del tratamiento. Los productos combinados emplean los compuestos de esta invención o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, dentro del intervalo de dosificación descrito anteriormente y los otros agentes farmacéuticamente activos dentro del intervalo de dosificación aprobado.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos que se llevaron a cabo y los resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de las divulgaciones del presente documento.
EJEMPLO 1: EXPRESIÓN DE LA B7-H1 HUMANA RECOMBINANTE El ADNc de la B7-H1 humana (Dong, H. et ál . , 1999, Nat .
Med. 5:1365 - 1369) se amplificó a partir del Image clone 7262208 (ATCC) usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y después se clonó en los sitios Nhe 1 y EcoRl del vector pcr3.1 Bid. Esta construcción se lipofectó en células CHO ((American Type Tissue Collection, catálogo N° CCL-61) y la expresión en la superficie de la célula se confirmó mediante la selección de células activadas por fluorescencia (FACS) .
El dominio extracelular de la B7-H1 humana (residuos de aminoácidos 1-239) fusionado a la región Fe de la IgGl humana se adquirió en R&D Systems Inc., catálogo N° 156-B7-100.
EJEMPLO 2 : INMUNIZACIÓN Y TITULACIÓN Inmunización Los anticuerpos monoclonales contra la B7-H1 humana se desarrollaron mediante la inmunización secuencial de ratones XenoMouse® (cepas XenoMouse: XMG2 (IgG2 kappa/lambda) y XMG4 (IgG4 kappa/lambda) Amgen, Inc. Vancouver, Columbia británica, Canadá) ya sea con 5-10 ug de la B7-Hl/Fc de la proteína quimera o 1-2x10(6) de las células CHO que expresan la B7-H1 humana recombinante tal como se describe en el Ejemplo 1.
Las inmunizaciones se llevaron a cabo de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente estadounidense N° de serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y en las solicitudes internacionales de patente N° WO 98/24893 publicada el 11 de junio de 1998 y WO N° 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, las descripciones se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia. Los programas de inmunización se resumen en la Tabla 2.
Selección de animales para la recolección por titulación Se determinó la titulación de anticuerpos en suero a partir de los ratones inmunizados en un ensayo ELISA. Las placas (Corning Costar, cat. N° 3368) se recubrieron con la proteína B7-H1/FC (R&D Systems Inc., catálogo N" 156-B7-100) . Los anticuerpos específicos de la B7-H1 se detectaron con el anticuerpo de la IgG anti-humano de ratón y el anticuerpo de la IgG Fe anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. Típicamente, se seleccionan cinco animales con los títulos más altos dentro de cada cohorte de inmunización para el aislamiento del linfocito y la generación de hibridomas .
Tabla 2. Resumen de los programas de inmunización EJEMPLO 3: RECUPERACIÓN DE LINFOCITOS, AISLAMIENTO DE CÉLULAS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS Se sacrificaron ratones inmunizados mediante dislocación cervical, y los ganglios linfáticos que fueron drenados se cultivan y se agrupan a partir de cada cohorte.
Las células linfoides se disociaron mediante la molienda en DMEM para liberar las células de los tejidos y las células se suspendieron en DMEM. Se contaron las células, y se agregaron 0.9 mi de DMEM cada 100 millones de linfocitos al gránulo celular para resuspender las células cuidadosamente pero por completo. Usando 100 µ? de perlas magnéticas CD90+ cada 100 millones de células, las células se marcaron mediante la incubación de las células con las perlas magnéticas a 4 °C durante 15 minutos. La suspensión de células magnéticamente marcadas que contienen hasta 108 células positivas (o hasta 2xl09 células totales) se cargó a la columna LS+ y la columna se lavó con DMEM. El efluente total se recogió como la fracción negativa CD90 (se esperaba que la mayoría de estas células fueran células B) .
La fusión se realizó mediante la mezcla de las anteriores células B enriquecidas lavadas y las células P3X63Ag8.653 del mieloma no secretante adquiridas en ATCC, cat. N° CRL 1580 (Kearney et al, J. Immunol . 123, 1979, 1548-1550) en una relación de 1:1. La mezcla celular se formó cuidadosamente en gránulos mediante centrifugación a 800 x g. Después de la eliminación por completo del sobrenadante, las células se trataron con 2 a 4 mL de solución Pronasa (CalBiochem, cat. N° 53702; 0.5 mg/ml en PBS) por no más de 2 minutos . Luego se agregaron de 3 a 5 mi de FBS para detener la actividad de la enzima y la suspensión se ajustó a 40 mi del volumen total usando una solución de electrofusión de células, (ECFS, Sacarosa 0.3 M, Sigma, Cat . N° S7903, Acetato de Magnesio 0.1 mM, Sigma, Cat. N° M2545, Acetato de Calcio 0.1 mM, Sigma, Cat. N° C4705) . El sobrenadante se eliminó después de la centrifugación y las células se resuspendieron en 40 mi de ECFS. Esta etapa de lavado se repitió y las células se resuspendieron nuevamente en ECFS hasta una concentración de 2xl06 células/ml.
La electrofusión de células se realizó usando un generador de fusión (modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA) . El tamaño de la cámara de fusión utilizada fue de 2.0 mi, con las siguientes configuraciones instrumentales: • Condición de alineamiento: voltaje: 50 V, tiempo: 50 segundos .
· Rompimiento de la membrana a: voltaje: 3000 V, tiempo: 30 usegundos.
• Tiempo de retención postfusión: 3 segundos.
Después de la ECF, las suspensiones celulares se extrajeron cuidadosamente de la cámara de fusión en condiciones estériles y se transfirieron a un tubo estéril que contiene el mismo volumen que el Medio para Cultivo de Hibridomas (DMEM, JRH Biosciences) , 15% de FBS (Hyclone) , complementado con L-glutamina, pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim) . Las células se incubaron durante de 15 a 30 minutos a 37° C, y después se centrifugaron a 400 x g (1000 rpm) durante cinco minutos. Las células se resuspendieron cuidadosamente en un volumen reducido del Medio de Selección de Hibridomas (Medio de Cultivo de Hibridomas complementado con 0.5x HA (Sigma, cat . N° A9666) ) , y el volumen se ajustó adecuadamente con más del Medio de Selección de Hibridomas, basado en una distribución por placas final de 5xl06 células B totales por placa de 96 pocilios y 200 µ? por pocilio. Las células se mezclaron cuidadosamente y se pipetearon a una placa de 96 pocilios y se dejó que crecieran. En el día 7 o 10, se extrajo la mitad del medio, y las células se realimentaron con el Medio de Selección de Hibridomas.
Los hibridomas se cultivaron en el medio selectivo como rutina. Los sobrenadantes agotados que se recogieron a partir de los hibridomas se probaron en varios ensayos tal como se describe en los Ejemplos 4-5. A modo de aclaración, los anticuerpos que empiezan con el dígito 3, p. ej . , 3.15G8, son IgG4 y los anticuerpos que empiezan con un 2, p. ej . , 2.9D10, son IgG2.
EJEMPLO 4: UNIÓN A LAS B7-H1 HUMANA Y DE MONO CINOMOLGO LIGADAS A LA CÉLULA Los sobrenadantes recogidos a partir de las células hibridomas se probaron para evaluar la capacidad de los anticuerpos secretados para la unión a células 293T que expresan transitoriamente ya sea la B7-H1 humana o de mono cynomolgus cinomolgo de longitud completa. Se utilizó una línea celular 293T de control transfectada como control negativo. Las células diluidas en PBS que contiene 2% de FBS se sembraron a una densidad de 2500-3000 de expresión y 15000-17500 células de control transfectadas en 40 µ?/pocillo en placas de 384 pocilios (Corning Costar, catálogo N° 3712) . Inmediatamente después de la distribución en placas, se agregaron 10 ul/pocillo de sobrenadantes de hibridoma y las placas se incubaron durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Luego, se agregaron 10 µ?/pocillo de IgG Fe antihumana de cabra conjugada con Cy5 (700 ng/ml, Jackson Immunoresearch, catálogo N° 109-175-098) y las placas se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente antes de la lectura de la señal de fluorescencia en el instrumento FMAT 8200 (Applied Biosystems) . Los resultados de 6 sobrenadantes de hibridomas se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. La unión de los sobrenadantes de hibridomas a la B7- Hl humana o de cinomolgo ligadas a la célula EJEMPLO 5: INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DEL LIGANDO-RECEPTOR B7-H1/PD-1 A los efectos de determinar la potencia relativa de los sobrenadantes que contienen anticuerpos, se evaluó su capacidad de inhibir la unión de la proteína PD-l/Fc a la B7- Hl humana expresada en la superficie de las células CHO. Se distribuyeron en placas 25000 células/pocilio en 50 µ? del medio en pocilios de una placa de cultivo de tejido de 384 pocilios (Corning Costar, catálogo N° 3712) . Al día siguiente, se agregaron 50 µ?/pocillo de sobrenadante de hibridoma diluido (1:5) y se incubaron placas a 4o C durante 1 hora en un agitador. Se agregó una proteína PD-l/Fc humana biotinilada (R&D Systems, catálogo N° 1086-PD) a una concentración final de 1.25 ug/ml y las placas se incubaron a 4o C durante 1 hora en un agitador. Las células se lavaron y se fijaron a 100 ul de PBS que contiene 3.7% de formaldehído y 3% de albúmina de suero bovino durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se incubaron a 100 ul de PBS que contiene 0.6% de H202 y 3% de albúmina de suero bovino durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se incubaron a 50 ul de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante diluida a 1:4000 durante 30 minutos a 4o C. Las células se lavaron antes de la señal de detección. Los datos se representan como el porcentaje de (ODmax-ODmin) , donde ODmax es el valor promedio que se obtiene con las células incubadas con sobrenadantes de hibridomas irrelevantes en presencia de la proteína PD-l/Fc humana conjugada con biotina y ODmin es el valor obtenido con las células incubadas con sobrenadantes de hibridomas irrelevantes en ausencia de la proteína PD-l/Fc humana conjugada con biotina. El 0% de respuesta máxima indica 100% de inhibición de la unión de B7-H1/PD-1 mediante un sobrenadante de hibridoma (Tabla 4) .
Tabla . Inhibición de la unión de la PD1 humana a las células que expresan la B7-H1 humana mediante sobrenadantes de hibridomas.
EJEMPLO 6: UNIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 PURIFICADOS A LA B7-H1 HUMANA, B7-DC HUMANA, B7-H1 DE RATÓN Se determinó la capacidad de unión de los anticuerpos purificados a la B7-H1, B7-DC humanas, B7H1 de ratón y B7-H1 de mono cinomolgo mediante el análisis FACS. En resumen, las células 293T se transfectaron como control o se transfectaron transitoriamente con la B7-H1 humana o la B7-DC humana usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, catálogo N° 11668) . Las células de ratón J558 que expresan la B7-H1 de ratón se obtuvieron a partir de ATCC (catálogo N° TIB-6) . Las células se resuspendieron en PBS que contiene 2% de FBS (amortiguador FACS) y se sembraron a 50000 células/pocilio en placas con fondo en V. Se agregaron anticuerpos de control anti-B7-Hl e isotipos diluidos en un amortiguador FACS a una concentración final de 5 µg/ l y las placas se incubaron durante 1 hora a 4 °C. Después de lavarse con el amortiguador FACS, se agregaron anti Fe Cy5 humano de cabra (5 ug/ml , Jackson Immunoresearch, catálogo N° 109-175-098) y 7-AAD (5 g/ml) y las placas se incubaron durante 15 minutos a 4 °C antes de lavarse nuevamente con el amortiguador FACS y de ser leídas con un instrumento FACSCalibur. La Tabla 5 muestra la capacidad de los anticuerpos purificados (5 µ9/p?1) para la unión a las células 293T transfectadas con B7-H1 humana. Ninguno de los anticuerpos seleccionados se unen a las células 293T transfectadas con B7-DC humana o a las células J558 que expresan B7-H1 de ratón. El anticuerpo de ratón anti B7-DC (PD-L2) humano (R&D systems cat . N° MAB1224, detectado con anti Fe Cy5 de ratón de cabra, Jackson Immunoresearch) se utilizó como un control positivo de la expresión de B7-DC. El anticuerpo de rata anti B7-H1 de ratón conjugado con PE (eBioscience , clon de 1H5 , detectado con anti Fe Cy5 de rata de cabra, Jackson Immunoresearch) se utilizó como un control positivo de la expresión de B7-H1 de ratón.
Tabla 5. Unión de anticuerpos anti-B7-Hl purificados a B7-H1 humana, B7-H1 de ratón o B7-DC humana ligadas a células EJEMPLO 7: UNIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 HUMANOS PURIFICADOS A CÉLULAS T HUMANAS Y DE MONO CINOMOLGO ESTIMULADAS Se incubaron placas de 96 pocilios de alta unión con 100 ul/pocillo del anticuerpo anti-CD3 diluido a 1 ug/ml en PBS (clon de OKT3 , eBioscience, catálogo N° 160037) a 4 °C durante la noche. Las células T humanas se aislaron del paquete leucocitario congelado usando el kit de enriquecimiento de células T (StemCell Technologies, catálogo N° 19051) . Las placas de anticuerpos monoclonales anti-CD3 recubiertas se lavaron con PBS y las células T purificadas se agregaron en 200 ul de medios ICM a 360000 células/pocilio y se cultivaron durante 72 horas. Luego se recolectaron las células T, se lavaron en un amortiguador FACS y se mezclaron con anticuerpos anti-B7-Hl purificados diluidos o anticuerpos IgG2 o IgG4 humanos irrelevantes a una concentración final de 1 ug/ml en una placa de ensayo con fondo en forma de V de 96 pocilios (50 ul/pocillo) . Después de 2 horas de incubación a 4 °C, las células T se lavaron dos veces en el amortiguador FACS y luego se tiñeron con el anticuerpo de cabra anti IgG Fe humano conjugado con Cy5 (5 ug/ml , Jackson Immunoresearch, catálogo N° 109-175-098) y 7-AAD (10 ug/ml) . Las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C antes de lavarse nuevamente con el amortiguador FACS y de ser leídas con un instrumento FACSCalibur. La población de linfocitos vivos se seleccionó para el análisis con base en el esparcimiento frontal y lateral así como también la tinción negativa para 7-AAD.
Para la activación de las células T de mono cinomolgo, se incubaron placas de 96 pocilios de alta unión con 100 ul/pocillo de anticuerpo de cabra anti IgG Fe de ratón diluido a 1 ug/ml en PBS a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo anti-CD3 diluido a 1 ug/ml en medios ICM (clon de SP-34 , BD catálogo N° 556610) a 37 °C durante 2 horas. Las PBMC de mono cinomolgo se aislaron de la sangre periférica (Bioreclamation, catálogo N° CYNWBCPT) . Las placas de los anticuerpos monoclonales anti-CD3 recubiertas se lavaron con PBS y las células PBMC aisladas se agregaron en 200 ul de medios ICM a -200000 células/pocilio y se cultivaron durante 72 horas. Luego se recolectaron las células, se lavaron en un amortiguador FACS y se mezclaron con anticuerpos anti-B7-Hl purificados diluidos o anticuerpos IgG2 o IgG4 humanos irrelevantes a una concentración final de 1 ug/ml en una placa de ensayo con fondo en forma de V de 96 pocilios (50 ul/pocillo) . Después de 2 horas de incubación a 4 °C, las células se lavaron dos veces en el amortiguador FACS y luego se tiñeron con el anticuerpo de cabra anti IgG Fe humano conjugado con Cy5 (5 ug/ml, Jackson Immunoresearch, catálogo N° 109-175-098) , anticuerpo anti-CD3 conjugado con FITC (diluido de 1:25, Biospecialty) y 7-AAD (10 ug/ml) . Las células se incubaron durante 1 hora a 4 °C antes de lavarse nuevamente con el amortiguador FACS y de ser leídas con un instrumento FACSCalibur. La población de linfocitos T de mono se seleccionó para el análisis con base en el esparcimiento frontal y lateral así como también la tinción positiva para el marcador CD3 y la tinción negativa para 7-AAD. La Tabla 6 muestra la capacidad de los anticuerpos anti-B7-Hl purificados (lig/ml) para la unión a las células T humanas activadas así como también a las células T de mono cinomolgo activadas.
Tabla 6. Unión de anticuerpos anti-B7-Hl purificados a células T humanas o de cinomolgo estimuladas EJEMPLO 8: INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DEL LIGANDO-RECEPTOR B7-Hl/PD-1 Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-B7-Hl humanos purificados para inhibir la unión de la proteína PD-1/Fc humana a la B7-H1 humana expresada en la superficie de las células ES-2 (ATCC, catálogo N° CRL-1978) . En resumen, se distribuyeron en placas 50000 células/pocilio en 50 µ? de PBS en los pocilios de una placa de cultivo de tejido de 384 pocilios (Corning Costar, catálogo N° 3712) . Luego, se agregaron 50 µ?/pocillo de un anticuerpo monoclonal diluido a una concentración final de 2.5, 0.5, 0.1, 0.02, 0.004, 0.008, 0.00016 nM y las placas se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces y se agregaron 100 µ? de una proteína PD-l/Fc humana biotinilada (10 ug/ml, R&D Systems, catálogo N°1086-PD) y las placas se incubaron a 4o C durante 1 hora. Las células se lavaron una vez y se agregaron 100 µ?/pocillo de estreptavidina conjugada con Cy5 y las placas se incubaron a 4 °C durante 15 minutos antes de lavarse nuevamente con PBS que contiene 2% de FCS y de ser leídas con un instrumento FACSCalibur. Algunos pocilios se incubaron con anticuerpos monoclonales IgG2 e IgG4 humanos irrelevantes con o sin PD-l/Fc humanas conjugadas con biotina para establecer un nivel mínimo (0%) y máximo (100%) de inhibición de la unión de B7-H1/PD-1. El porcentaje de inhibición con relación a la concentración del anticuerpo se analizó utilizando una herramienta de ajuste de curvas (software GraphPad Prism) para calcular el valor IC50 para cada anticuerpo, los cuales se muestran en la tabla 7: Tabla 7. Inhibición de la unión de PD1 humana a la B7-H1 humana que expresa la célula ES-2 mediante anticuerpos anti-B7-H1 purificados.
EJEMPLO 9: DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 EN LA PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS T CD4 Se ha demostrado que la proteína B7-H1 presente en conjunto con el anticuerpo anti-CD3 en perlas inhibe la activación de la células T mediada por CD3 (Freeman et ál . , J. Exp. Med., 2000, 192 (7): 1027-1034; Bennet et ál . , The Journal of Immunology, 2003, 170: 711-718) . La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-B7-Hl humanos purificados de interferir en la supresión de la activación de las células T mediada por la B7-H1 se determinó como sigue a continuación .
En resumen, 5x10(8) perlas/ml de Dynabeads M-450 lavadas y activadas con tosilo (Invitrogen, Cat . N° 140.13) se recubrieron con 50 ug/ml de anticuerpo anti CD3 humano de ratón (BD Bioscience, Cat. N° 555329) en un amortiguador de 0.1 M de fosfato de sodio (pH 7.4 a 8.0) a 37 °C durante 24 horas con agitación. 4X10(8) de perlas recubiertas con CD3/ml se acoplaron adicionalmente con IgGl Fe humana recombinante (R&D Systems, cat. N° llO-HG-100) a 160 ug/ml o con la proteína B7-H1/FC humana recombinante (R&D Systems, Cat. N° 156-B7-100) a 80 ug/ml combinada con la proteína IgGl Fe humana a 80 ug/ml (concentración total a 160 ug/ml) y se incubaron a 37 °C durante 24 horas con agitación. Luego las perlas se incubaron en PBS que contiene 0.05% de albúmina de suero bovino a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavaron cuatro veces en 0.1% de BSA y 2 mM de EDTA en PBS (pH 7.4) y finalmente se resuspendieron en medios RPMI1640 que contiene 10% de FBS a 5x10 (7) perlas/ml.
Los monocitos en la sangre periférica se aislaron a partir de un paquete de leucaféresis usando la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03) , se resuspendieron en RPMI 1640 sin suero (Gibco 22400-089) , y las células T CD4+ se aislaron de la PBMC utilizando el kit de aislamiento negativo de CD4 Dynal (Invitrogen, cat . N° 113-37D) según las instrucciones del fabricante. 10 ul de perlas recubiertas se mezclaron con 10 ul de anticuerpo anti-B7-Hlo IgG2/4 de control en un tubo de muestra y se incubaron a TA de 3 a 4 horas en un agitador. Las células T CD4+ purificadas se distribuyeron en placas a 10(5) células/80 ul/pocillo en una placa de 96 pocilios (Corning, cat. N° 3603) y se agregó la mezcla de perla-anticuerpo en 20 ul/pocillo a un volumen total de 100 ul/pocillo. La activación de la célula T en ausencia del efecto inhibidor de la B7-H1 se determinó utilizando perlas recubiertas con un anticuerpo anti-CD3 y la proteína IgGl Fe humana. Las células se cultivaron durante 5 días y los sobrenadantes se recolectaron y se analizaron para determinar la liberación del IFN-? utilizando el BD ELISA Kit II del IFN-? humano (BD Cat. N° 550612) según las instrucciones del fabricante. La proliferación de las células se midió en el día 5 mediante la adición de 10 µ?/pocillo de AlamarBlue (Invitrogen DAL 1025) . Las células se incubaron durante 5 horas, y la fluorescencia se analizó cuantitativamente en un espectrómetro SpectraMax Gemini EM con una longitud de onda de excitación de 545 nm y una longitud de onda de emisión de 600 nm. Los datos se representan como el porcentaje de ODmax, donde ODmax es el valor promedio obtenido con las células T activadas con perlas anti-CD3/IgGl Fe. Véase la Figura 1.
EJEMPLO 10: DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 EN LA ACTIVACIÓN DE LAS CÉLULAS T CD4 EN EL ENSAYO MIXTO DE LINFOCITOS DE CÉLULAS DENDRITICAS-CÉLULAS T La optimización de la activación de las células T con anticuerpos dirigidos contra B7-H1 se determinó en un ensayo mixto de linfocitos de célula dendríticas-células T (DCMLR) . Las células dendríticas se generaron a partir de precursores monocíticos tal como se describió anteriormente (Curr. Protoc. Immunol . Mayo de 2001; Capítulo 7: Unidad 7.32). Los monocitos en la sangre periférica se aislaron a partir de un paquete de leucaféresis usando la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03) , se resuspendieron en RPMI 1640 sin suero (Gibco 22400-089) , y se dejaron adherir a matraces T150 de cultivo celular (Corning 430825) . Después de 1 hora a 37 °C, las células no adherentes se extrajeron y las células se cultivaron en RPMI complementado con 5% de suero humano (Invitrogen 34005100) . Las citocinas se agregaron a una concentración final de 2 ng/ml de GM-CSF (BD Biosciences 550068) y 10 ng/ml de IL-4 (BD Biosciences 554605) . Se agregaron medios frescos con citocinas cada 2-3 días. Al día 6 del cultivo, las células se sometieron a un proceso de maduración con 20 ng/ml de TNF-OÍ (BD Biosciences 554618) y se dejaron incubar durante 24 horas. Las células dendríticas maduras se recolectaron, fenotipificaron y congelaron para un uso posterior.
Las células T CD4+ se aislaron de la PBMC utilizando un kit de aislamiento magnético (Dynal 113.17) según las instrucciones del fabricante y se cultivaron en un MLR primario tal como se describe anteriormente (J Immunol . Abril de 2003; 170 (7) : 3637-44. Las células T CD4+ de respuesta alogénica 1.5E5 se cultivaron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocilios (Costar 3595) con células dendríticas en una relación célula T: célula dendrítica de 1:2.5. Las preparaciones de células dendríticas se trataron con 100 g/ml de mitomicina C (Sigma M4287) antes de la adición del cultivo conjunto para evitar toda proliferación a partir de los linfocitos contaminantes. Los anticuerpos se agregaron a varias concentraciones en un volumen final de 200 µ? de RPMI + 10% de suero humano. La incorporación de timidina se midió en el Día 5 mediante un pulso de 16-h con [3H] timidina (1 ci/pocillo, Perkin-Elmer NET027001MC) . Los sobrenadantes se recolectaron antes del marcado radioactivo y se analizaron para determinar la liberación del IFN-? con el ensayo Luminex (BioRad 171-B11921) según las instrucciones del fabricante. La optimización de la proliferación de las células T mediante anticuerpos anti-B7-Hl a partir de reiterados experimentos se muestra en la Figura 2. En la Figura 3 se muestra la liberación del IFN-? correspondiente.
EJEMPLO 11: ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LOS ANTICUERPOS B7-H1 Las secuencias de cadena pesada del dominio variable y las secuencias de cadena ligera del dominio variable de los anticuerpos se secuenciaron para determinar sus secuencias de ADN. La información completa de la secuencia para los anticuerpos anti-B7-Hl se proporciona en el listado de secuencia con secuencias de nucleótidos y aminoácidos para cada combinación de cadenas gamma y kappa o lambda. Las secuencias pesadas variables se analizaron para determinar la familia VH y la secuencia de la región J. Luego las secuencias se trasladaron para determinar la secuencia de aminoácidos primaria y se compararon con la línea germinal VH y las secuencias de la región J para evaluar las hipermutaciones somáticas.
Las tablas 8 y 9 son tablas que comparan las regiones de la cadena pesada del anticuerpo con su línea germinal de la región de la cadena pesada afín y las regiones de la cadena ligera del anticuerpo con su línea germinal de la región de la cadena ligera afín. La numeración de los aminoácidos es por numeración numérica.
Los genes de inmunoglobulina se someten a varias modificaciones durante la maduración de la respuesta inmunitaria, incluso la recombinación entre los segmentos de los genes V, D y J, cambio de isotipos, e hipermutación en las regiones variables. La recombinación y la hipermutación somática son las bases para la generación de diversidad de anticuerpos y afinidad de maduración, pero también pueden generar una responsabilidad secuencial que puede hacer que la producción comercial de las inmunoglobulinas como agentes terapéuticos sea difícil o aumentar el riesgo de inmunogenicidad del anticuerpo. En general, las mutaciones en las regiones CDR pueden contribuir a mejorar la afinidad y la función, en tanto que las mutaciones en las regiones de marco variable pueden aumentar el riesgo de inmunogenicidad. El riesgo se puede reducir al revertir las mutaciones de marco variable en la línea germinal, en tanto asegura que la actividad del anticuerpo no se vea afectada negativamente. Se pueden generar algunas responsabilidades estructurales mediante los procesos de diversificación o estas pueden existir dentro de las secuencias de líneas germinales que contribuyen a los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras. Independientemente de la fuente, puede ser deseable eliminar las responsabilidades estructurales potenciales que puedan resultar en inestabilidad, aglutinación, heterogeneidad del producto o aumento de la inmunogenic idad . Los ejemplos de responsabilidades indeseables incluyen cisteínas impares (lo cual pueda llevar a la recombinación del enlace de disulfuro o una formación de aducto de sulfhidrilo variable) , sitios de glicosilación unidos por enlaces N (que resultan en la heterogeneidad de la estructura y de la actividad) , así como también sitios de desamidación (p. ej . , NG, NS ) , i someri zac ion (DG) , oxidación (metionina expuesta) e hidrólisis (DP) .
Con el objeto de reducir el riesgo de inmunogenicidad y optimizar las propiedades farmacéuticas de los anticuerpos principales, puede ser deseable reducir la cantidad de mutaciones a partir de la línea germinal y/o eliminar las responsabilidades estructurales.
Por lo tanto, en una modalidad, donde un anticuerpo particular difiere de su respectiva secuencia germinal en el nivel del aminoácido, la secuencia del anticuerpo puede volver a mutar en la secuencia germinal. Las mutaciones correctivas pueden ocurrir en una, dos, tres o más posiciones o una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, utilizando técnicas biológicas moleculares estándares. Las tablas 10 a 14 a continuación ilustran las posiciones de las variaciones de regreso a la línea germinal para los anticuerpos monoclonales 2.9D10, 2.7A4 y 2.14H9. Cada fila representa una combinación única de residuos de la línea germinal y no germinal en la posición indicada por la letra en negrita. La posición del aminoácido se representa con numeración numérica.
En otra modalidad, la invención incluye reemplazar cualesquiera responsabilidades estructurales en la secuencia que pueden afectar la heterogeneidad de los anticuerpos de la invención. Las responsabilidades incluyen sitios de gl i eos i lac ión , cisteínas impares, metioninas expuestas en la superficie, etc. Para reducir el riesgo de la heterogeneidad se propone que se efectúen cambios para eliminar una o más de las responsabilidades estructurales.
En una modalidad, puede ser deseable eliminar uno o más de los sitios de consenso de glicosilación unidos por enlaces N de la línea germinal del anticuerpo o de la secuencia del anticuerpo. Un experto en la técnica será capaz de identificar fácilmente el sitio de glicosilación . Típicamente una secuencia del sitio de consenso de glicosilación unida por enlaces N presenta la secuencia de Asn-any AA-ser o Thr, donde el aminoácido del medio no puede ser prolina (Pro) . En otro ejemplo, las cisteínas impares se pueden reemplazar solas o en conjunto con otras modificaciones estructurales. Una cisteína impar puede mutar en un aminoácido adecuado que presenta propiedades de cadena lateral equiparables tal como una serina.
Según lo que se hace referencia en el presente documento, una secuencia que se encuentra optimizada es una secuencia que ha sido mutada en una o más posiciones de regreso a su secuencia germinal o que se puede modificar para eliminar una o más responsabilidades tal como las responsabilidades estructurales. Una secuencia optimizada también puede incluir una secuencia que ha sido mutada en una o más posiciones de regreso a su secuencia germinal y que se ha modificado adicionalmente para eliminar una o más responsabilidades estructurales.
Tabla 8 10 15 10 15 Tabla 9 Tabla 10. Mutaciones de ejemplo de 2.7 A4 de cadena pesada (SEQ. ID. N° : 2) en la linea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID N° : 2. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 2 comprende cualquiera de las combinaciones de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 10. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 2 comprende uno cualquiera, dos cualquiera, tres cualquiera, cuatro cualquiera, cinco cualquiera o los cinco residuos germinales como se indica en la Tabla 10. En determinadas modalidades, la SEQ ID N° : 2 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 10. En un ejemplo específico, la secuencia no germinal vuelve a mutar en una línea germinal en la posición 80 donde F cambia por una Y y en la posición 87 donde K cambia por una R. Un ejemplo específico de la secuencia es 2.7A4VH0PT según se muestra en la Tabla 15.
Tabla 11: Mutaciones de ejemplo de 2.7 A4 de cadena ligera (SEQ. ID. N° : 7) en la línea germinal en el número de residuo indicado 5 10 25 En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID N° : 7. En determinadas modalidades, la SEQ ID N° : 7 comprende cualquiera de las combinaciones de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 11. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 7 comprende uno cualquiera, dos cualquiera, tres cualquiera, cuatro cualquiera, cinco cualquiera o los cinco residuos germinales como se indica en la Tabla 11. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 7 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 11. Los ejemplos específicos de dominio variable ligero de 2.7 A , el cual ha sido mutado en secuencias germinales particulares, incluyen 2.7 A4 VLOPT (optimizada donde la secuencia no germinal ha sido mutada de A a T en la posición 17 y de R a K en la posición 104) según se muestra en la Tabla 15.
Tabla 12. Mutaciones de ejemplo de 2.9 DIO de cadena pesada (SEQ. ID. N° : 12) en la linea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID N° : 12. En algunas modalidades, la SEQ ID N°: 12 comprende cualquiera de las combinaciones de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 12. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 12 comprende uno cualquiera, dos cualquiera o ambos residuos germinales como se indica en la Tabla 12. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 12 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 12.
Tabla 13. Mutaciones de ejemplo de 2.9 DIO de cadena ligera (SEQ. ID. N° : 17) a la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID N° : 17. En determinadas modalidades, la SEQ ID N° : 17 comprende cualquiera de las combinaciones de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 13. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 17 comprende uno cualquiera, dos cualquiera, tres cualquiera, cuatro cualquiera o los cuatro residuos germinales como se indica en la Tabla 7. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 17 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 13. SEQ ID N° : 17 se puede alterar o alterar adicionalmente al efectuar cambios que no sean de línea germinal en la SEQ ID N° : 17. En un ejemplo, la SEQ ID N° : 17 se puede alterar de una F a una Y en la posición 37 y de una F a una Y en la posición 50.
Tabla 14. Mutaciones de ejemplo de 2.14 H9 de cadena ligera (SEQ. ID. N° : 27) en la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión diana o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la SEQ ID N° : 27. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 27 comprende cualquiera de las combinaciones de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 14. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 27 comprende uno cualquiera, dos cualquiera, tres cualquiera o los tres residuos germinales como se indica en la Tabla 14. En algunas modalidades, la SEQ ID N° : 27 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos germinales y no germinales indicados por cada fila de la Tabla 14. Los ejemplos específicos de dominio variable ligero de 2.7 A4 , el cual ha sido mutado en secuencias germinales particulares, incluyen 2.14H90PT (optimizada donde la secuencia no germinal ha sido mutada de una E a una K en la posición 104) según se muestra en la Tabla 15.
La cadena pesada de 2.14H9 se puede cambiar, en el aminoácido 31 de la SEQ ID N° : 22, de una R a una S.
Tabla 15 15 Ejemplos de mutaciones de líneas germinales específicas Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL de los anticuerpos anti-B7-Hl sin líneas germinales (NG, por sus siglas en inglés) de 2.7 A4 , 2.14H9 y 2.9D10 se alinearon con las secuencias germinales humanas conocidas en la base de datos VBASE (Tomlinson, 1997; http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), y la línea germinal más parecida se identificó mediante similitud de secuencia. La línea germinal más parecida a los anticuerpos anti-B7-Hl se describe en las Tablas 16 y 17. Sin tomar en consideración los residuos Vernier (Foote & Winter, J Mol Biol . Mar20 : 224 ( 2 ) : 487 - 99 , 1992) , que se dejaron sin modificar, las posiciones a ser modificadas se describen en la Tabla 18.
Tabla 16: Anti-B7-Hl de cadena pesada más parecido a las células germinales V y J Tabla 17: Anti-B7-Hl de cadena ligera más parecido a las células germinales V y J Tomando en cuenta el anticuerpo 2.7A4 , existen 2 cambios en los marcos variables del dominio VH y 2 cambios en los marcos variables del dominio VL. Estos residuos, ubicados con los números Kabat 79 y 83 (o los residuos 80 y 87, si es con numeración numérica) para el dominio VH y con los números Kabat 18 y 103 (o los residuos 17 y 104 si es con numeración numérica) para el dominio VL, se revirtieron a la línea germinal humana. Véase Tabla 18. Para el anticuerpo 2.14H9 no existen cambios en los marcos variables del dominio VH y hay 1 cambio en los marcos variables del dominio VL. Este residuo, ubicado con el número Kabat 103 en el dominio VL (o 104 si el residuo se calcula usando numeración numérica) , se revirtió a la línea germinal humana. Véase Tabla 18. En el anticuerpo 2.9D10 no se presentan cambios en los marcos variables del dominio VH y hay 2 cambios en el dominio VL, ubicado con la numeración Kabat en los números Kabat 36 y 49 (o los residuos de la numeración numérica 37 y 50) . Sin embargo, estos 2 residuos se ubican en la posición Vernier y no han sido mutados para no alterar las estructuras de bucle de la CDR .
Tabla 18: Ejemplos de residuos mutados durante la mutación germinal para los dominios V de anti-B7-Hl. Los residuos se numeran de acuerdo con la nomenclatura Kabat La mutación de línea germinal de estos residuos de aminoácidos se llevó a cabo usando técnicas estándares de mutagénesis dirigida al sitio con los cebadores mutagénicos adecuados. Las secuencias de línea germinal mutada tienen el prefijo [sic] "OPT" después de la denominación del anticuerpo, por ejemplo, 2.7A4VH0PT, 2.7VLOPT y 2.14H9VLOPT. Luego las IgG de línea germinal mutada se reevaluaron en el ensayo de inhibición del ligando de B7-Hl/hPDl humano para confirmar que no hubo una reducción de la actividad in vitro de1 anticuerpo .
Las actividades de ejemplo para los anticuerpos anti-B7-H1 de línea germinal mutada contra los de línea germinal no mutada se proporcionan en la Figura 4.
Ejemplo de síntesis de genes y reformateo como IgGl e IgGl-TM Los clones se convirtieron de scFv al formato IgG mediante la subclonación de los dominios VH y VL en vectores que expresan cadenas enteras del anticuerpo pesadas y ligeras respectivamente. Los dominios VH se clonaron en el vector pEU15.1 para expresar IgGl o en el vector pEU15.1-TM para expresar los anticuerpos IgGl-TM. Ambos vectores contienen los dominios constantes de cadena pesada humana y los elementos reguladores para expresar la cadena pesada IgG entera en células mamíferas. El vector pEU15.1-TM es un vector pEU15.1 IgGl humano modificado. Se modificó genéticamente para introducir las tres mutaciones; L234F y L235E en la bisagra y P331S en el dominio CH2 de la molécula IgG para eliminar su capacidad de desencadenar la citotoxicidad dependiente del anticuerpo mediada por células y la citotoxicidad dependiente del complemento (Oganesyan V. et al. (2008), Acta Cryst . , D64 : 700-704). La modificación del vector se realizó usando técnicas estándares de mutagénesis dirigida al sitio con los cebadores mutagénicos adecuados .
Los dominios VL se clonaron en vectores pEU4.4 y pEU3.4 para la expresión de los dominios constantes de las cadenas ligeras lambda y kappa humanas respectivamente, con elementos reguladores para expresar la cadena ligera de IgG entera en células mamíféras. Los vectores para la expresión de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras se describieron originalmente en Vaughan et ál . (Nature Biotechnology 14 (3 ): 309-314 , 1996). Estos vectores han sido diseñados simplemente mediante la introducción de un elemento OriP.
Para obtener las IgG, los vectores de expresión de las cadenas pesada y ligera de IgG se transfectaron en las células mamíféras EBNA-HEK293 (Invitrogen R620-07) . Las IgG se expresaron y secretaron en el medio. El producto recolectado se agrupó y se centrifugó antes de la purificación. La IgG se purificó utilizando cromatografía de Proteína A mediante un sistema de purificación AKTA Express (GE Healthcare) previamente esterilizado para evitar cualquier contaminación de la muestra con endotoxinas . Los sobrenadantes del cultivo se cargan a columnas HiTrap™ MabSelectSure™ (GE Healthcare, 11-0034-93) de 1 mL y se lavaron con Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 250 mM. La IgG unida se eluyó de la columna usando 0.1 M de citrato de sodio (pH 3.0) y se neutralizó mediante la adición de Tris-HCl 1M (pH 9.0). Al material eluido se le intercambió el amortiguador por PBS utilizando columnas NaplO (Amersham, 17-0854-02) y se filtró antes de determinar los niveles de concentración de proteínas y de endotoxinas. La concentración de IgG se determinó espectrofotométricamente utilizando un coeficiente de extinción basado en la secuencia de aminoácidos de la IgG (Vaughan et ál . supra) . El nivel de endotoxinas se determinó utilizando el sistema portátil de prueba Endosafe PTS (Charles River Laboratories) equipado con cartuchos LAL de 1-0.1 EU/mL y 10-0.1EU/mL (Charles River Laboratories, PT520) . La IgG purificada se analizó por degradación con SDS-PAGE.
Los anticuerpos anti-B7-Hl en el formato IgGl-TM se evaluaron y se compararon con los mismos anticuerpos pero en el formato IgGl con el ensayo de inhibición del ligando B7-Hl/hPDl humano para confirmar que no hubo una reducción en la actividad in vitro del anticuerpo debido al cambio de isotipo de IgG (Figura 4) .
EJEMPLO 12: ENSAYO HTRF® - UNIÓN DE B7H1/FC HUMANA A PDl/FC HUMANA El ensayo descrito es un ensayo TR-FRET homogéneo que utiliza la tecnología para ensayos HTRF® que no requiere etapas de lavado. Se agregó a una placa de microtitulación Costar 3676 de 5 µ?/pocillo de PDl/Fc biotinilado a 1 nM diluido en PBS . Esto fue seguido por la adición de 5µ1/??s?11? de estreptavidina XLent (CisBio) a 4nM diluida en un amortiguador de ensayo (PBS + 0.1% BSA + 0.8M KF) . Se agregó 5 µ?/pocillo de una titulación de material de muestra diluido en PBS a los pocilios pertinentes. Para la definición de la unión total, se agregó 5 µ? de PBS o un amortiguador de muestra pertinente por pocilio. Para definir la unión no específica, se utilizó un exceso (600 nM) de B7H1/Fc o PDl/Fc no marcadas. El proceso final fue la adición de 5 µ?/pocillo de B7H1/Fc marcada con criptatos (marca criptato - CisBio, B7H1/Fc - RnD Systems) diluida a 1:100 en un amortiguador de ensayo. La placa de ensayo se dejó durante 3 horas a temperatura ambiente antes de ser leída con un lector de placas compatible con HTRF® .
En la Tabla 19 se proporcionan ejemplos de las determinaciones de IC50 en el ensayo de inhibición del ligando PD1 humano/B7-Hl humano para los anticuerpos anti-B7-Hl . Todos los anticuerpos anti-B7-Hl humanos se encuentran en formato IgGl-TM.
Tabla 19. Ejemplo de determinación de IC50 (n=2) en el ensayo de inhibición del ligando PD1 humano/B7-Hl humano para IgG anti-B7-Hl EJEMPLO 13: ENSAYO HTRF® - UNIÓN DE B7H1/FC HUMANA A B7-1/FC HUMANA El ensayo descrito era un ensayo TR-FRET homogéneo que utiliza la tecnología para ensayos HTRF® que no requiere etapas de lavado. Se agregó a una placa de microtitulación Costar 3676 de 5 µ?/pocillo de B7-l/Fc biotinilado a 8 nM diluido en PBS. Esto fue seguido por la adición de 5 µ?/pocillo de estreptavidina XLent (CisBio) a 20 nM diluida en un amortiguador de ensayo (PBS + 0.1% BSA + 0.8 M KF) . Se agregó 5 µ?/pocillo de una titulación de material de muestra diluido en PBS a los pocilios pertinentes. Para la definición de la unión total, se agregó 5 µ? de PBS o un amortiguador de muestra pertinente por pocilio. Para definir la unión no específica, se utilizó un exceso (200 nM) de B7H1/Fc o B7-1/Fc no marcadas. El proceso final fue la adición de 5 µ?/pocillo de B7H1/Fc marcada con criptatos (marca criptato -CisBio, B7H1/FC - RnD Systems) diluida a 1:100 en un amortiguador de ensayo. La placa de ensayo se dejó durante la noche a 4 °C antes de permitir que recupere la temperatura ambiente y que se lea en un lector de placas compatible con HTRF® .
En la Tabla 20 se proporcionan ejemplos de las determinaciones de IC50 en el ensayo de inhibición del ligando B7-1 humano/B7-Hl humano para los anticuerpos anti-B7-H1. Todos los anticuerpos anti-humanos B7-H1 se encuentran en formato IgGl-TM.
Tabla 20: Ejemplo de determinación de IC50 (n=2) en el ensayo de inhibición del ligando B7-1 humano/B7-Hl humano para IgG anti-B7-Hl EJEMPLO 14: REACTIVIDAD CRUZADA DE ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 CON OTRAS PROTEÍNAS CO-MODULADORAS I MU ITARIAS Se efectuaron análisis ELISA para determinar la reactividad cruzada de los anticuerpos IgGl-TM anti-B7-Hl para otras moléculas co-moduladoras inmunitarias . Los análisis ELISA consistieron en recubrir las placas MaxiSorp (NUNC) a 4 °C durante la noche con 250 ng por pocilio del dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) de B7-H1 humana (R&D Systems, 156-B7) , PD-L2 humana (R&D Systems, 1224-PL) , B7-H2 humana (R&D Systems, 165-B7) , B7-H3 humana (R&D Systems, 1027-B3), CD28 humana (R&D Systems, 342-CD), CTLA-4 humana (R&D Systems, 325-CT) y PD1 humana (R&D Systems, 1086-PD) seguido por el bloqueo de las placas con PBS que contiene 3% de leche en polvo secada a temperatura ambiente durante 1 hora. También se investigó la reactividad cruzada murina mediante el recubrimiento del ECD de la B7-H1 de murino (R&D Systems, 1019-B7) . Los IgGl-TM anti-B7-Hl biotinilados diluidos a 100 nM en PBS que contiene 3% de leche en polvo secada, se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir la unión. Las IgG biotiniladas unidas se detectaron con estreptavina marcada con europio NI (Perkin Elmer, 1244-360) a 0.2 ug/mL. El experimento de control que demostró el recubrimiento del antígeno sobre la placa NUNC se llevó a cabo utilizando los anticuerpos comerciales IgG2a de ratón anti B7-H1 humano (R&D Systems, MAB156) , IgG2b de ratón anti PD-L2 humano (R&D Systems, MAB1224) , IgG2b de ratón anti B7-H2 humano (R&D Systems, MAB165) , IgGl de ratón anti B7-H3 humano (R&D Systems, MAB1027) , IgGl de ratón anti CD28 humano (R&D Systems, MAB342) , IgG2a de ratón anti CTLA-4 humano (Abcam, ab33320) , IgG2b de ratón anti PDl humano (R&D Systems, MAB1086) e IgG2a de ratón anti B7-H1 de rata (R&D Systems, MAB1019) . Los anticuerpos primarios se incubaron a 5 ug/mL en PBS que contiene 3% de leche en polvo secada durante 2 horas a temperatura ambiente. La detección se llevó a cabo mediante la incubación del anticuerpo anti IgG de ratón conjugado con peroxidasa (Sigma, A2554) o anti IgG de rata conjugado con peroxidasa (Sigma, A5795) diluido de 1:5000 en PBS que contiene 3% de leche en polvo secada durante 1 hora a temperatura ambiente y la posterior adición de TMB (Sigma, T0440) . Los ocho antígenos se pueden detectar en la placa axisorp NU C. No se determinó ninguna unión específica utilizando los pocilios recubiertos con el isotipo de control IgGl a 5 ug/mL. Las reactividades cruzadas se calcularon en un porcentaje de la unión específica del antígeno relacionado con la B7-H1 humana.
La reactividad cruzada de los 3 anticuerpos IgGl-TM anti-B7-Hl 2.7A40PT, 2.9D10 y 2.14H90PT frente al panel de ocho antígenos comcduladores inmunitarios se determinó por triplicado. A 100 nM de concentración del anticuerpo, los tres anticuerpos anti-B7-Hl no mostraron reactividad cruzada para ninguna de las siete moléculas humanas comoduladoras inmunitarias que se probaron (Figura 5) . El anticuerpo IgGl-TM anti-B7-Hl 2.7A40PT muestra una reactividad cruzada medible para la B7-H1 murina con un nivel de señal del 5.3% en promedio en comparación con la unión del 100% a la B7-H1 humana. Los otros dos anticuerpos anti-B7-Hl probados, 2.9D10 y 2.14H90PT, no mostraron reactividad cruzada alguna para la B7-H1 murina (Figura 5) .
EJEMPLO 15: AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 PARA LA B7-H1 HUMANA Y DE CIN0M0LG0 La afinidad de unión y los parámetros cinéticos de anticuerpos anti-B7-Hl en el formato IgGl-TM a la B7-H1 monomérica humana y de cinomolgo se determinaron por resonancia de plasmones superficiales utilizando un instrumento BIAcore T100 (BIAcore, Uppsala, Suiza). En resumen, los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C utilizando un amortiguador HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0.05% v/v de tensioactivo P20) como amortiguador de corrida. Las IgG se capturaron por afinidad en la superficie de un chip sensor CM5 (BIAcore) mediante la proteína G, la cual se acopló con amina a la superficie de CM5 para alcanzar la densidad de -500 Unidades de Respuesta (UR) , según las instrucciones del fabricante (BIAapplications Handbook, BIAcore) . Los dominios extracelulares (ECD) FlagHisio de B7-H1 humana o de cinomolgo monomérica recombinante se utilizaron como analitos. Las diluciones del ECD de B7-H1 (200-3.12 nM) en el amortiguador de corrida se inyectaron a una velocidad de flujo constante de 100 µ?/min durante 60 segundos. Todas las mediciones se corrigieron con el punto de referencia mediante la sustracción del sensograma obtenido con la célula de flujo de control (activada-desactivada) , así como también por referencia doble con inyecciones al vacío (concentración de analitos en cero) . Los datos se analizaron utilizando el paquete del software T-100 BIAevaluation y se ajustaron a un simple modelo' Langmuir 1:1 de unión con Rmax local y el índice de refracción aparente fijado en 0. Los datos se calcularon a partir de al mehos dos experimentos independientes. Los efectos del transporte de la masa se limitaron al mantener el nivel de las IgG capturadas por afinidad por debajo de 250 UR. Los sensogramas obtenidos con todos los anticuerpos probados se pueden ajustar fácilmente al modelo de unión monoexponencial 1:1 proporcionando excelentes ajustes con los valores de Chi2 consistentemente = 0.3.
La afinidad de los anticuerpos anti-B7-Hl 2.7A 0PT y 2.14H90PT para la B7-H1 humana monomérica es de 1 nM y 175 pM respectivamente (Tabla 21) .
Tabla 21: Análisis de parámetros de afinidad y cinéticos de los anticuerpos anti-B7-Hl para la unión a B7-H1 humana La afinidad de los anticuerpos anti-B7-Hl 2.7A40PT y 2.14H90PT para la B7-H1 de cinomolgo monomérica es de 835 pM y 367 pM respectivamente (Tabla 22) . Estos dos anticuerpos presentan una fuerte reactividad cruzada para la B7-H1 de cinomolgo ya que las afinidades son muy similares a las de la B7-H1 humana.
Tabla 22: Análisis de parámetros de afinidad y cinéticos de los anticuerpos anti-B7-Hl para la unión a B7-H1 de cinomolgo EJEMPLO 16: MAPEO DE EPÍTOPOS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 El mapeo de epítopos se llevó a cabo para identificar los residuos de B7-H1 humana implicados en la unión de los anticuerpos anti-B7-Hl. La estructura del dominio extracelular de la B7-H1 humana en un complejo con PD1 murina se describió previamente en la bibliografía (Lin, D et ál . , 2008, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA, Vol . 105, p3011-3016) y revela que catorce residuos de B7-H1 están implicados en la unión a PD1 (Tabla 23) .
Tabla 23: Los residuos de B7-H1 humana implicados en la unión a PD1 murina Los anticuerpos anti-B7-Hl compiten por la unión de B7-H1 humana a PD1 humana (ejemplos 5, 8 y 12) por lo que deben interactuar con algunos de estos 14 residuos si asumimos que existen diferencias insignificantes entre la interfaz de unión de B7H1 a la PD1 humana y de ratón (62% de identidad con el aminoácido entre la secuencia del dominio celular de las dos especies) . Se generarán B7-H1 mutantes únicos de aminoácidos para las 14 posiciones descritas en la Tabla 23. Los mutantes se analizarán para determinar la unión a los anticuerpos anti-B7-Hl mediante ELISA de fagos y la capacidad para competir en la unión de anticuerpos anti-B7-Hl a B7-H1 humana en los ensayos de competencia HTRF®. Todos los anticuerpos anti-B7-Hl descritos se encuentran en formato IgGl-TM.
La clonación del gen del dominio extracelular de 237-Hl humana en fusión con el gen III bacteriófago para la vi sual i zación de la expresión en fagos La codificación de los genes para el dominio extracelular de la proteína B7-H1 humana (Número de acceso Uniprot Q9NZQ7, aminoácido [19-238]) se sintetizó externamente con DNA2.0 Inc. y se amplificó con PCR utilizando los cebadores B7H1_F0R (5'-AATAATGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTTACCGTGACGGTACCG- 3 ' ) y B7H1_REV ( 5 ' -AATAATGCGGCCGCCCTTTCGTTTGGGGGATGC - 3 ' ) para introducir los sitios de restricción Sfi I y Not I en los extremos 5' y 3' respectivamente. Luego el producto PCR se clonó direcc ionalmente en el vector pCANTAB 6 (McCafferty J. et ál . , 1994, Ap l . Biochem. Biotechnol . , Vol . 47, pl57-173) utilizando los sitios de restricción Sfi I y Not I. La cepa E. coli TG1 se transformó con la ligación y las colonias individuales se analizaron mediante secuenciación para identificar un transformador B7-H1 denominado B7 -Hl_pCANTA6.
Generación e identificación de B7-H1 mutantes Los B7-H1 mutantes han sido generados por mutagénesis de saturación en los 14 residuos de la interfaz de PD1 utilizando cebadores NNS completamente aleatorios (Tabla 24) y el plásmido B7-Hl_pCANTA6 como una plantilla de AD . La mutagénesis se llevó a cabo con el kit de mutagénesis dirigida a sitios múltiples QuickChange de Stratagene (Catálogo N° 200513) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones mutagénicas se utilizaron para transformar la cepa de E. coli TG1 y las colonias individuales se analizaron mediante secuenciación para identificar variantes de B7-H1. Un total de 252 variantes se identificaron entre las posibles 280 (20 aminoácidos por 14 posiciones) y se seleccionaron con cuidado en 3 placas de cultivo de 96 pocilios.
Tabla 24: Cebadores mutagénicos utilizados para generar variantes de B7-H1 B7H1 _SDM_F19_f 5 ' -GC CGGC CATGGCCNN S ACCGTG ACGGT AC CG AAAG-3' B7H 1 _SDM_T20_f 5'-GCCGGCCATGGCCTTTNNSGTGACGGTACCGAAAG-3' B7H1 _SD _D26_f 5'-CCGTGACGGTACCGAAANNSrTGTATGTGGTGGAGTATGG-3' B7H 1 _SDM_I54_f 5'-GGATCTTGCTGCCCTTN SGTCTACTGGGAAATGGAGGACAAG-3' B7H1 _SDM_Y56_f 5'-GGATCTTGCTGCCCTTATCGTCNNSTGGGAAATGGAGGACAAG-3' B7H l_SDM_Q66_f 5'-GGAGGACAAGAACATCATCN STTTGTCCATGGAGAGGAGG-3' B7H1. SDM_R1 13_f 5'-ATGCCGGGGTCTACNNSTGTATGATCTCTTACGGCGG-3' B7H1_ SDM_M115_f 5' -ATGCCGGGGTC TACCGCTGTNN S ATCTCTT ACGGCGG-3 ' B7H 1 _SDM_S1 17_f 5'-CTACCGCTGTATGATCN STACGGCGGTGCCG-3' B7H1. _SDM_A121_f 5' -GATCTCTTACGGCGGTNNSGATT ACAAACGGATAACC-3 ' B7H1. _SDM_D122_f 5'-GATCTCTTACGGCGGTGCCNNSTACAAACGGATAACC-3' B7H1. _SDM_Y123_f 5'-CGGCGGTGCCGAT NSAAACGGATAACCGTAAAGG-3' B7H1. _SDM_ 124_f 5' -CGGCGGTGCCGATTACNN SCGGAT AACCGTA A AGG-3 ' B7H1. _SDM_R1 25_f 5'-GCGGTGCCGATTACAAANNSATAACCGTAAAGGTAAACG-3' ELISA de fagos de los B7-H1 mutantes para la unión a anticuerpos anti-B7-Hl La unión de los B7-H1 mutantes a anticuerpos anti-B7-Hl 2.14H90PT, 2.7A40PT o al Ac de referencia N° 1 se ha evaluado por ELISA de fagos después de asegurar que el dominio extracelular de B7-H1 en fusión con la proteína del gen III se pueda visualizar en la superficie del fago. Los cultivos de TG1 seleccionados cuidadosamente se cultivaron y sobreinfectaron con el fago ayudante M13K07 para producir partículas de fagos que expresan los B7-H1 mutantes en su superficie. Los sobrenadantes de fagos se bloquearon en PBS+3% de leche descremada y se incubaron en las placas NUNC MaxiSorb previamente recubiertas durante la noche con 1 ug/mL de 2.14H90PT, 2.7A40PT o Anticuerpo de referencia N° 1 en PBS y bloqueados con PBS+3% de leche descremada. Los fagos unidos se detectaron usando estreptavidina acoplada con europio (Perkin Elmer) después de la incubación con un anticuerpo secundario anti-ml3 biotinilado (Progen) .
Entre los 14 residuos de B7-H1 humana ubicados en la interfaz de PD1, cuatro no están implicados en la unión a cualquiera de los tres anticuerpos anti-B7-Hl probados (Asp26, Tyr56, Glu66 y Lysl24) . Sus reemplazos por una alanina o una glicina no afectan significativamente la señal de unión. Basados en datos de ELISA de fagos, se ha seleccionado un total de 28 mutantes representativos de 2 a 3 modificaciones claves para cada una de las otras 10 posiciones para confirmar su perfil de unión pero utilizando proteínas purificadas.
Ensayos de competencia bioquímica El dominio extracelular de B7-H1 humana de tipo salvaje y mutantes se expresaron en bacterias y se purificaron mediante cromatografía de afinidad tal como se describe anteriormente (Bannister D. et al., 2006, Biotechnology and bioengineering, 94, 931-937).
Los ensayos de competencia HTRF® midieron la unión del anticuerpo anti-B7-Hl a B7-H1 marcada con HIS FLAG. La titulación de muestras de B7-H1 sin marcar, preparada como se describe anteriormente, competirá con B7-H1 marcada con HIS FLAG para la unión al anticuerpo anti-B7-Hl, lo cual conduce a una reducción de la señal del ensayo. Los anticuerpos 2.14H90PT, 2.7A40PT y el Anticuerpo de referencia N° 1 se utilizaron para establecer ensayos de competencia para la caracterización de la unión relativa de B7-H1 de tipo salvaje o mutante purificadas. Esto confirmará cuáles residuos de B7-Hl se requieren para la unión del anticuerpo. Se agregaron 10 µ? de la muestra de B7-H1 a una placa de ensayo de poco volumen de 384 pocilios (Corning 3673) . Esto fue seguido por la adición de 5 pL de 2.14H9GPT 0.29 nM, o 2.7A40PT 1.15 nM o anticuerpo de referencia N° 1 conjugado con DyLight649 1.15nM según las instrucciones del fabricante (ThermoFisher, 53051) y 5 pL de una solución mixta de criptato anti-FLAG 0.43 nM (Cisbio International, 61FG2KLB) y B7-H1 humana marcada con HIS FLAG 1.25 nM. Las placas de ensayo se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente antes de leer la fluorescencia con resolución en el tiempo a 620 nm y 665nm de emisión de longitud de onda utilizando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer) .
Tres residuos de B7-H1 adicionales (Ile54, Serll7 y Alal21) no se implican en la unión a 2.14H90PT y 2.7A40PT como IC50 de B7-H1 mutantes para los residuos son similares o marginalmente modificadas en comparación con B7-H1 de tipo salvaje. Los datos de competencia para los 3 anticuerpos anti-B7-Hl para el tipo salvaje y todos los demás B7-H1 mutantes se resumen en la Tabla 25.
Tabla 25: La IC50 en nM en los ensayos de competencia de la B7-H1 humana para la unión a anticuerpos anti-B7-Hl. 1CM de ?neayo de competencia e Muestra de B7-H1 2.14H90PT IgGI-TM 2.7A40PT lgG1-TM Ac n«1 de referencia B7H1 de tipo salvaje 0.76 2.79 1.89 B7H1_F19A 0.56 Sin inhibición 27.6 B7H1_F 19G 0.56 Sin inhibición 15.3 B7H1_F19S 0.66 Sin inhibición 21.6 B7H1_T20A 0.45 Sin inhibición 2.3 B7H1_T20V 0.64 Sin inhibición 1.9 B7H1 T20D 0.83 Sin inhibición 1.9 B7H1_R113A Sin inhibición 4.6 172 B7H1_R113Y Sin inhibición Sin inhibición 3.9 B7H1_R113L Sin inhibición Sin inhibición 2 B7H1_M115A 3.9 6.9 86 B7H1_M 115G 30.4 4.6 Sin inhibición B7H1_M115D Sin inhibición 5.8 Sin inhibición B7H1_D122E 29.6 Sin inhibición 35.2 B7H 1_D122N 15.5 Sin inhibición 2.5 B7H1_Y123A 232 1.77 Sin inhibición B7H1_Y123F 0.5 2.21 Sin inhibición B7H1_Y123T 427 2.07 Sin inhibición B7H1_R125A Sin inhibición 3 11.7 B7H1_R125Q Sin inhibición 2.4 18.4 B7H1_R125S Sin inhibición 2.7 9.7 Argll3 y Arg 125 están fuertemente implicadas en la unión a 2.14H90PT. El reemplazo por un Ala u otros aminoácidos (Tyr o Leu en la posición 113 y Gln o Ser en la posición 125) conduce a una pérdida total de la unión al anticuerpo. El perfil de unión de los B7-H1 mutantes a 2.7A40PT o al anticuerpo de referencia N° 1 es similar al B7-Hl de tipo salvaje. Esto demuestra que la pérdida de unión no se debe a una modificación estructural general de la B7-H1 como por ejemplo una proteína desplegada, sino a una participación directa de los residuos con la unión de 2.14H90PT. Estos datos también demuestran que el epítopo de unión de 2.14H90PT es diferente a los epítopos de 2.7A40PT y al anticuerpo de referencia N° 1. Metll5, Aspl22 y Tyrl23 también están implicados en la unión a 2.14H90PT pero en menor medida. El reemplazo de Metll5 por un Ala no afecta la unión a 2.14H90PT o 2.7A40PT pero el reemplazo por un Asn conduce a una pérdida total de la actividad de unión a 2.14H90PT pero no a 2.7A40PT. De manera similar, el reemplazo de Aspl22 por un Asn afecta la unión a 2.14H90PT pero no al anticuerpo de referencia N° 1. La mutación de Tyrl23 mediante un Ala o un Thr modifica en gran medida el perfil de unión a 2.14H90PT pero no a 2.7A40PT. Resulta interesante que un reemplazo por Phe no modifique la unión a 2.14H90PT lo cual sugiere que el grupo hidroxilo de la tirosina 123 no está implicado en la interacción de unión.
Phel9, Thr20 y Aspl22 están fuertemente implicadas en la unión a 2.7A40PT. Todas las B7-H1 mutantes en las posiciones no presentan unión a ese anticuerpo pero sí se unen a 2.14H90PT o al anticuerpo de referencia N° 1 de manera similar al B7-H1 de tipo salvaje, excepto B7H1_D122E mutante que une a esos 2 anticuerpos con menor eficacia. Estos tres residuos son específicos para el epítopo de unión del anticuerpo monoclonal 2.7A40PT y no los comparten los epítopos de 2.14H90PT o el anticuerpo de referencia N° 1. Argll3 también se implica en el epítopo 2.7A40PT pero en menor medida. El reemplazo por un Ala no afecta la unión al anticuerpo pero las mutaciones de Tyr o Leu conducen a la pérdida total de unión. Las mutaciones en la posición 113 no afectan la unión al anticuerpo de referencia N° 1, lo cual muestra que las B7-H1 mutantes todavía se encuentran en una conformación correcta. Es posible que el reemplazo con un aminoácido voluminoso como un Tyr pueda introducir algunos impedimentos estéricos. Los resultados sugieren que el Arg 113 no está directamente implicado en el contacto con el anticuerpo 2.7A40PT pero es muy similar al epítopo de unión real .
Este ejemplo demuestra que los tres anticuerpos anti-B7-H1 2.14H90PT, 2.7A40PT o el anticuerpo de referencia N° 1 presentan epítopos de unión distintos en la interfaz de B7-H1 con PD1. Además, es posible que los anticuerpos también se puedan unir a otros residuos de B7-H1 humana pero los cuales no están ubicados en la interfaz de PD1.
EJEMPLO 17. DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 EN LA RESPUESTA DE MEMORIA INMUNOLÓGICA DE UNA CÉLULA T A CONCENTRACIONES SUB-ÓPTIMAS DE UN ANTÍGENO DE MEMORIA Se ha mostrado que la interacción de B7-H1 con PD-1 inhibe las respuestas específicas de la célula T sobre antígenos. Para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-B7-Hl en esta inhibición se realiza un ensayo sub-óptimo de memoria del antígeno.
Los monocitos de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) se aislaron de las capas leucocitarias de sangre humana usando la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03) según las instrucciones del fabricante. Después del aislamiento las células se resuspendieron en medios RPMI 1640 Glutamax I (GIBCO, 61870) complementado con 1% de pen/estrep (GIBCO, 15140) y 4% de suero humano AB (Invitrogen 34005) , y posteriormente cultivados en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocilios (Corning, 3799) a 37 °C, 5% de C02 , con o sin 0.1 ug/mL de toxoide de tétano (Calbiochem 582231) a una densidad de 1x105 células por pocilio. Después de tres días de cultivo, se agregaron los anticuerpos anti-B7-Hl en el formato IgGl-TM o de control isotípico en las concentraciones indicadas y los cultivos se regresaron a 37 °C por 2 días adicionales, en este punto los sobrenadantes se recolectaron y se analizaron mediante DELFIA para determinar los niveles del interferón-? . La optimización de la liberación del interferón-? por los anticuerpos anti-B7-Hl se muestra en la Figura 6.
Los anticuerpos anti-B7-Hl 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT son capaces de incrementar la liberación del interferón-? . Estos datos confirman la capacidad de 2.9D10, 2.7A40PT y 2.14H90PT para optimizar las respuestas específicas de la célula T sobre los antígenos.
EJEMPLO 18. DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 EN LA RESPUESTA DE MEMORIA INMUNOLÓGICA DE UNA CÉLULA T A CONCENTRACIONES ÓPTIMAS DE UN ANTÍGENO DE MEMORIA Se ha sugerido que la B7-H1 presenta propiedades de señalización inhibidora potenciales. El potencial de los anticuerpos anti-B7-Hl de actuar como agonistas que pueden transmitir la señalización inhibidora se probó mediante el examen de su capacidad para inhibir la respuesta de memoria de un antígeno.
Los monocitos de sangre periférica (PBMC) se aislaron de las capas leucocitarias de sangre humana usando la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03) , según las instrucciones del fabricante. Después del aislamiento, las células se resuspendieron en el medio RPMI 1640 Glutamax I (GIBCO, 61870) complementado con 1% de pen/estrep (GIBCO, 15140) y 4% de suero humano AB (Invitrogen 34005) , y posteriormente cultivados, a una densidad de 1x105 células por pocilios, en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocilios (Corning, 3799) a 37 °C, 5% de C02 , junto con 5 ug/mL de toxoide de tétano (Calbiochem 582231) y en la presencia o ausencia de concentraciones variantes de anticuerpos anti-B7-Hl en el formato IgGl-TM o de control isotípico. Se ha utilizado un anticuerpo contra el co-receptor de la célula T como control positivo. Después de 5 días de cultivo, las células se pulsaron con 0.5 yCi/pocillo de timidina titulada durante aproximadamente 16 horas para evaluar la actividad de proliferación .
No se observó ningún efecto inhibidor con los anticuerpos anti-B7-Hl 2.9D10, 2.7A4 y 2.14H9, en oposición al control positivo, tal como se muestra en la Figura 7. Esto sugiere que los anticuerpos 2.9D10, 2.7A4 y 2.14H9 son antagonistas puros, sin ninguna actividad agonista.
EJEMPLO 19. ACTIVIDAD DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL DE LOS ANTICUERPOS ANTI-B7-H1 La actividad in-vivo de los anticuerpos anti B7-H1 humana se investigó en modelos de xenoinjertos de ratón usando ratones inmunocomprometidos por NOD/SCID (inmunodeficiencia combinada diabética no obesa/grave) . A los ratones se les injertó subcutáneamente (SC) líneas de células cancerosas que expresan la B7-H1 humana y las células T CD4+ y CD8+ que se aislaron de las células mononucleares de sangre periférica de donantes saludables y fueron cultivadas para enriquecerse y obtener células T alorreactivas efectoras. Las dosis intraperitoneales (IP) de anticuerpos anti B7-H1 humana se le administraron a ratones inoculados con la línea celular HPAC de cáncer pancreático humano o la línea celular A375 de melanoma humano. El efecto de los anticuerpos se observó en el crecimiento del tumor hasta un volumen tumoral de 2000 rara3 o una necrosis tumoral macroscópica.
Para generar las líneas de células T CD4+ y CD8+, los PBMC humanos de donantes saludables se enriquecieron para obtener las células T CD4+ o CD8+ mediante la adición de 1 mL del producto de enriquecimiento de células T RosetteSep cada 20 mL de sangre entera. Esto fue seguido por una incubación de 20 minutos y el posterior aislamiento mediante la centrifugación en gradiente de densidad utilizando el medio de densidad RosetteSep DM-L. Después de la centrifugación, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en el medio RP I 1640 complementado con 10% de FBS . Las células T CD4+ y CD8+ enriquecidas se cultivaron de forma separada durante 7 a 10 días en un medio complementado con rhIL-2 y cada una combinada con las células A375 o HPAC tratadas con mitomicina C. Las células T se recogieron y se cultivaron nuevamente de forma separada durante 7 a 10 días en un medio complementado con rhIL-2 y combinadas con las células A375 o HPAC tratadas con mitomicina C. Las células T CD4+ y CD8+ se recogieron y se combinaron en una relación de 1:1.
Las líneas de células cancerosas A375 y HPAC y enriquecidas con PBMC para obtener las células T CD4+ y CD8+ se mezclaron inmediatamente después de la administración subcutánea en las relaciones efectora-a-diana (E:D) indicadas . El número de inoculación de células para cada línea celular cancerosa se determinó mediante estudios de dosis de formación empírica de tumores en general, se injertaron 2.5 x 106 células en un volumen total de 0.2 mL en cada animal .
A cada grupo experimental se le asignó seis animales. Los animales recibieron un anticuerpo IgG2a o IgGlOPT humano de control isotípico (también se refiere en el presente documento como "IgGITM") o los anticuerpos anti-B7-Hl 2.14H9 IgG2a, 2.14H90PT, 2.7A40PT o el anticuerpo de referencia N° 1 en el formato IgGlOPT. Se llevaron a cabo un total de ocho experimentos independientes y en las Tablas 26-33 se presentan diseños de estudio para cada experimento. Los anticuerpos anti-B7-Hl descritos se encuentran en el formato IgGlOPT excepto donde se especifica.
La primera dosis (200 µL) del artículo de prueba se administró por IP 1 hora después del injerto de células T cancerosas/efectoras ; los animales recibieron hasta 4 dosis adicionales del artículo de prueba en los días de estudio 3, 5, 8 y/o 10. Como un control positivo para optimizar la alorreactividad en algunos estudios, se administró rhIL-2 por IP 1 hora después del injerto de células T cancerosas/efectoras ; los animales recibieron 4 dosis diarias adicionales de rhIL-2 durante 4 días consecutivos. Se observó la formación de tumores en cada animal una o dos veces por semana. Los tumores se midieron con calibradores; los volúmenes tumorales (V) se calcularon usando la siguiente fórmula : V(mm3) = 0.5 (largo (mm) x ancho (mm) x ancho (mm)/2) . Para cada grupo, se reportaron los resultados como la media aritmética. El efecto anticancerígeno, expresado como un porcentaje de la inhibición del crecimiento tumoral (TGI), se calculó mediante el siguiente método: % de TGI = [1 - (media del tumor V del grupo de tratamiento) ÷ (media del tumor V del grupo de control)] x 100.
En el estudio 1, los anticuerpos anti-B7-Hl 2.14H9 IgG2a y 2.7A40PT inhibieron significativamente el crecimiento de las células cancerosas HPAC (del páncreas) en el día 30 en hasta un 61% y 50% respectivamente en comparación con el grupo de control isotípico (Figura 8 y Tabla 26) .
Tabla 26: Estudio 1 - Grupos de tratamiento y porcentaje de Inhibición del Crecimiento Tumoral en ratones con injertos de células cancerosas HPAC seguido de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl = no corresponde En el estudio 2 los anticuerpos anti-B7-Hl 2.14H90PT y 7A40PT inhibieron el crecimiento de células cancerosas HPAC (del páncreas) en el día 39 en hasta un 70% y 68% respectivamente en comparación con el grupo de control isotípico (Figura 9 y Tabla 27) .
Tabla 27: Estudio 2 - Grupos de tratamiento y porcentaje de Inhibición del Crecimiento Tumoral en ratones con injertos de células cancerosas HPAC seguido de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl NC = no corresponde En el estudio 3, el anticuerpo anti-B7-Hl 2.14H90PT inhibió significativamente el crecimiento de las células cancerosas HPAC (del páncreas) en el día 30 en hasta un 60% en comparación con el grupo de control isotípico (Figura 10 y Tabla 28) .
Tabla 28: Estudio 3 - Grupos de tratamiento y porcentaje de Inhibición del Crecimiento Tumoral en ratones con injertos de células cancerosas HPAC seguido de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl NC = no corresponde En el estudio 4, el anticuerpo anti-B7-Hl 2.14H90PT inhibió significativamente el crecimiento de las células cancerosas HPAC (del páncreas) en el día 22 en hasta un 74% en comparación con el grupo de control isotípico (Figura 11 y Tabla 29) .
Tabla 29: Estudio 4 - Grupos de tratamiento y porcentaje de Inhibición del Crecimiento Tumoral en ratones con injertos de células cancerosas HPAC seguido de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl En el estudio 5, la administración por IP de los anticuerpos IgG2a anti-B7-Hl 2.14H9 o 2.70PT en el modelo de xenoinjerto de A375 (melanoma) también inhibe significativamente el crecimiento tumoral en el día 29 en tanto como un 64% y 61% respectivamente según se compara con el grupo de control, isotípico (Figura 12 y Tabla 30) .
Tabla 30: Estudio - 5. Los grupos de tratamiento y el porcentaje de Inhibición del crecimiento tumoral en ratones con injertos de células cancerosas A375 luego de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl NC = no corresponde En el estudio 6, el anticuerpo 2.14H90PT anti-B7-Hl inhibe significativamente el crecimiento de las células cancerosas A375 (melanoma) cuando se combinan con células T en el día 25 en hasta un 77% en comparación con el grupo de control isotípico (Figura 13 y Tabla 31) .
Tabla 31: Estudio- 6. Los grupos de tratamiento y el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral en ratones con injertos de células cancerosas A375 luego de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl NC = no corresponde En el estudio 7, el anticuerpo 2.14H90PT anti-B7-H1 inhibe significati amente el crecimiento de las células cancerosas A375 (melanoma) cuando se combinan con células T en el día 25 en hasta un 82% en comparación con el grupo de control isotípico (Figura 14 y Tabla 32) .
Tabla 32: Estudio-7. Los grupos de tratamiento y el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral en ratones con injertos de células cancerosas A375 luego de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl NC = no corresponde En el estudio 8, el anticuerpo 2.14H90PT anti-B7-Hl inhibe significativamente el crecimiento de las células cancerosas A375 (melanoma) cuando se combinan con células T en el día 25 en hasta un 93% en comparación con el grupo de control isotípico (Figura 15 y Tabla 33) .
Tabla 33: Estudio- 8. Los grupos de tratamiento y el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral en ratones con injertos de células cancerosas ?375 luego de la administración intravenosa de anticuerpos anti-B7-Hl NC = no corresponde Estos resultados demostraron que los anticuerpos 2.14H9 IgG2a, 2.14H90PT y 2.7A40PT anti B7-H1 humana presentan una potente actividad anticancerosa in vivo en modelos de xenoinjertos de ratón de cánceres humanos y proporciona pruebas de que los anticuerpos anti B7-H1 humana pueden presentar una actividad como una terapia de agente único para el tratamiento de pacientes con cánceres que expresan B7-H1.
INCORPORACIÓN MEDIANTE REFERENCIA Todas las referencias que se citan en el presente documento, incluso las patentes, las solicitudes de patente, documentos, libros de texto y similares, y las referencias que se citan en el presente documento, en la medida en que ya no lo estén, por la presente se incorporan a este documento en su totalidad. La solicitud provisional de patente de Estados Unidos número de serie 61/264,061, presentada el 24 de noviembre de 2009, las figuras y las secuencias en la misma se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia.
EQUIVALENTES La precedente memoria descriptiva por escrito se considera suficiente para que un experto en la técnica sea capaz de poner en práctica la invención. La descripción precedente y los Ejemplos detallan ciertas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se entenderá, sin embargo, que no obstante lo detallado que pueda parecer lo precedente en papel, la invención se puede practicar de diferentes modos y la invención se debe interpretar de acuerdo con las reivindicaciones enmendadas y cualquier equivalente de las mismas .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (40)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a B7-H1, caracterizado porque exhibe una o más de las siguientes propiedades, seleccionadas del grupo que consiste de: unirse a la B7-H1 humana con una KD inferior a 2 nM, como se determinó por medio de BIAcore ; la reactividad cruzada con B7-H1 de mono cynomolgus; unirse a la B7-H1 de mono cynomolgus con una KD inferior a 2 nM, como se determinó por medio de BIAcore; exhibir activación de las células T CD4+ en el ensayo mixto de linfocitos de células dendríticas-células T; inhibir la unión de B7-H1 humana a PD-1 expresada en células ES-2 con una IC50 inferior a 0.2 nM; inhibir la unión de B7-H1 humana a B7-1 utilizando un ensayo TR-FRET homogéneo con una IC50 inferior a 0.1 nM; e inhibir el crecimiento tumoral de una línea de células cancerosas en un modelo de xenoinjerto según se compara con un anticuerpo de control isotípico.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe el crecimiento tumoral de una línea celular de cáncer pancreático humano (HPAC) en un modelo de xenoinjerto al día 30 por más del 40% en comparación con el control isotípico, según se determina mediante la medición de los volúmenes tumorales.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe el crecimiento tumoral de la línea de las células A375 (melanoma) en un modelo de xenoinjerto al día 30 por más del 50% en comparación con el control isotípico, según se determina mediante la medición de volúmenes tumorales.
4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se une al mismo epítopo en el dominio extracelular de la B7-H1 humana como cualquiera de los anticuerpos 2.7A4 , 2.14H9 o 2.9D10, 2.7A40PT o 2.14H90PT.
5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se une a un epítopo en el dominio extracelular de la B7-H1 humana que comprende al menos dos de los tres residuos siguientes de aminoácidos de Asp en la posición 122, Arg en la posición 125 o Arg en la posición 113.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque no exhibe unión a un epítopo que comprende lie en la posición 54, Ser en la posición 117, y Ala en la posición 121 en la B7-H1 humana, según se determina mediante un ensayo de competencia.
7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque pierde su capacidad de unión a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 113 en la B7-H1 humana muta a un Ala o a un Tyr o a un Leu, según se determina mediante un ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje.
8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque pierde su capacidad de unión a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 125 en la B7-H1 humana muta a un Ala o a un Gln o a un Ser, según se determina mediante un ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje.
9. El anticuerpo de de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque conserva su capacidad de unión a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 123 en la B7-H1 humana muta a un Ala o a un Phe o a un Thr, según se determina mediante un ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje.
10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se une a al menos dos de los tres residuos siguientes de aminoácidos de Phe en la posición 19, Thr en la posición 20 o Asp en la posición 122 en la B7-H1 humana.
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque no exhibe unión a un epítopo que comprende lie en la posición 54, Met en la posición 115, Ser en la posición 117, y Ala en la posición 121 en la B7-H1 humana, según se determina mediante el ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje .
12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque pierde su capacidad de unión a la B7-H1 humana si el Phe en la posición 19 en la B7-H1 humana muta a un Ala o a un Gly o a un Ser, según se determina mediante un ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje.
13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque pierde su capacidad de unión a la B7-H1 humana si el Thr en la posición 20 de la B7-H1 humana muta a un Ala o a un Val o a un Asp, según se determina mediante un ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje.
14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque pierde su capacidad de unión a la B7-H1 humana si el Asp en la posición 122 en la B7-H1 humana muta a un Asn o a un Glu, según se determina mediante un ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje.
15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque conserva su capacidad de unión a la B7-H1 humana si el Arg en la posición 123 en la B7-H1 humana muta a un Ala o a un Phe o a un Thr, según se determina mediante un ensayo de competencia en comparación con la unión a la B7-H1 de tipo salvaje.
16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a la B7-H1 humana con una Kd inferior a 1.0 nM, según se determina con BIAcore .
17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se une a la B7-H1 humana con una Kd inferior a 200 pM, según se determina con BIAcore .
18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .
19. El anticuerpo deconformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal completamente humano.
20. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es cualquiera de 2.9D10, 2.7A4 , 2.14H9, 2.7A40PT o 2.14H90PT.
21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque es un fragmento de unión seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, Fab' , F(ab')2, Fv y dAb.
22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque presenta una secuencia de aminoácidos que comprende: una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por un polinucleótido en un plásmido denominado 2.7A4_G, se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598 y una secuencia de aminoácidos de CDR variable de cadena ligera codificada por el polinucleótido en un plásmido denominado 2.7A4_G, el cual se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41598; o una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por un polinucleótido en un plásmido denominado 2.14H9_G el cual se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41597 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por el polinucleótido en un plásmido denominado 2.14H9_G el cual se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41597; o una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por un polinucleótido en un plásmido denominado 2.9D10_NG, el cual se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41599 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por el polinucleótido en un plásmido denominado 2.9D10_NG, el cual se depositó en el NCIMB con el número de depósito 41599.
23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque presenta una secuencia de aminoácidos que comprende: una CDR1 VH que presenta la secuencia de aminoácidos dé SEQ ID N° : 3; y una CDR2 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 4; y una CDR3 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 5; y una CDR1 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 8 ; y una CDR2 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 9; y una CDR3 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 10; o una CDR1 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 23 ; y una CDR2 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 24 ; y una CDR3 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 25 ; y una CDR1 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 28; y una CDR2 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 29; y una CDR3 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 30; o una CDR1 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 13 ; y una CDR2 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 14; y una CDR3 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 15; y una CDR1 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 18; y una CDR2 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 19; y una CDR3 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 20 ; O una CDR1 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 63 ; y una CDR2 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 64 ; y una CDR3 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 65; y una CDR1 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 68; y una CDR2 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 69; y una CDR3 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 70; o . una CDR1 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 73; y una CDR2 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 74; y una CDR3 VH que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 75; y una CDR1 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 78 ; y una CDR2 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 79; y una CDR3 VL que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° : 80.
24. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 22 o 23, caracterizado porque comprende además una variante Fe, donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 234F, 235F y 331S, numerado según el índice EU establecido en Kabat .
25. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque codifica el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24.
26. Una célula hospedadora transfectada con un vector caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25.
27. Un anticuerpo producido por un método caracterizado porque comprende, cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 26, que expresa un anticuerpo codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 25, y que aisla el anticuerpo del cultivo.
28. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22 o 23 o 24.
29. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 22 o 23 o 24 y un portador farmacéuticamente aceptable .
30. Un método de represión de la inhibición de células T mediada por la B7-H1 en un animal caracterizado porque comprende administrarle a un animal que lo necesite un cantidad eficaz de conformidad con la composición de la reivindicación 28.
31. Un método para el tratamiento de un tumor maligno en un animal, caracterizado porque comprende: seleccionar un animal que necesite el tratamiento de un tumor maligno; y administrarle al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de conformidad con la reivindicación 29.
32. El método de onformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el tumor maligno se selecciona del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de pulmón amicrocítico, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, cáncer de cuello de útero, cáncer de colon, cáncer colorrectal y cáncer pancreático.
33. El método de la reivindicación 30-32, caracterizado porque el animal es humano.
34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque es el anticuerpo monoclonal 2.14H90PT .
35. Un anticuerpo purificado o fragmento de anticuerpo, caracterizado porque se une inmunoespecíficamente a B7-H1 y comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad con los aminoácidos de la SEC ID NO: 72 y que comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 77, en donde el anticuerpo tiene la actividad de unión a B7-H1.
36. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35.
37. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35 y un portador farmacéuticamente aceptable.
38. Un método para reprimir la inhibición de linfocitos T mediada por B7-H1 en un animal, caracterizado porque comprende administrar a un animal en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la composición de conformidad con la reivindicación 36.
39. Un método para tratar un tumor maligno en un animal, caracterizado porque comprende seleccionar un animal en necesidad de tratamiento para un tumor maligno y administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de conformidad con la reivindicación 37.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el tumor maligno se selecciona del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de pulmón amicrocítico, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer colorrectal, y cáncer pancreático.
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