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CN109843927B - 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 Download PDF

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CN109843927B CN201880003854.1A CN201880003854A CN109843927B CN 109843927 B CN109843927 B CN 109843927B CN 201880003854 A CN201880003854 A CN 201880003854A CN 109843927 B CN109843927 B CN 109843927B
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Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

提供了抗B7‑H3的抗体、其抗原结合片段及包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。还提供了所述抗体或抗原结合片段在制备用于治疗B7‑H3介导的疾病或病症的药物中的用途。所述抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。所述药物组合物可以用于治疗癌症。

Description

抗B7-H3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
本申请要求申请日为2017年03月06日的中国专利申请CN201710129023.6的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明涉及一种对人B7-H3受体具有免疫反应性的抗B7-H3抗体，以及其抗原结合片段，包含所述抗B7-H3抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含人抗B7-H3抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。
背景技术
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域的长期热点，其中T细胞肿瘤免疫治疗又处于核心位置。肿瘤逃逸是肿瘤免疫治疗面临的一个巨大障碍，大部分肿瘤表达可不同程度地被宿主免疫系统识别的抗原，但在许多情况下，由于效应T细胞低效活化而引发不充分的免疫反应，因此肿瘤细胞利用其自身对免疫系统的抑制作用促进了肿瘤的疯狂生长。肿瘤免疫治疗即是充分利用、调动了肿瘤患者体内的杀伤性T细胞，对肿瘤进行杀伤作用。
对CD28受体及其配体的研究已促成对称为B7超家族的相关分子的表征。B7家族成员包括B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可诱导的共剌激因子的配体(ICOS-L/B7-H2)、程序性死亡-1配体(PD-L1/B7-H1)、程序性死亡-2配体(PD-L2/B7-DC)、B7-H3和B7-H4等，是具有免疫球蛋白V样结构域(IgV)和免疫球蛋白C样结构域(IgC)的免疫球蛋白超家族成员，分别由单一外显子编码而成，并被预测为在细胞表面形成背靠背、非共价的同二聚体。
近年来研究显示，B7-H3可能通过NFAT(用于活化的T细胞的核因子)、NF-κB(核因子κB)和AP-1(激活蛋白1)因子来抑制T细胞活化(Yi.K.H.等，Immunol.Rev.229：145-151)，并被认为在体内抑制Th1、Th2或Th17(Fukushima，A.等，Immunol.Lett.113：52-57；Yi.K.H.等，Immunol.Rev.229：145-151)。多个研究已表明人恶性肿瘤细胞在B7-H3蛋白表达方面表现出显著增加，且这种表达增加与疾病严重度增加有关，表明B7-H3被肿瘤作为免疫逃避通路利用(Hofmeyer，K.等，Proc.Nat l.Acad.Sci.105：10277-10278)。
目前已知人B7-H3表达在胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、成神经细胞瘤等多种癌症细胞上，并已在肿瘤细胞系中通过免疫组织化学检测到了B7-H3蛋白的表达。在心脏、肾、辜丸、肺、肝、胰、前列腺、结肠和成骨细胞中发现B7-H3 mRNA的表达，蛋白质水平上，在人的肝、肺、膀肮、睾丸、前列腺、乳房、胎盘和淋巴器官中已发现了B7-H3表达。
目前有多家跨国制药公司在研发针对B7-H3的单克隆抗体，提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的，相关专利如WO2011109400、WO2008116219、WO2012147713、WO2014160627、WO2016044383等。Macrogenics公司的抗B7-H3单克隆抗体目前已完成I期临床试验，在前列腺癌、膀胱癌和黑色素瘤患者中显示出了较好的安全性和抗肿瘤活性，可单用或与抗PD-1抗体联用。
本发明提供有着高亲和力，高选择性，高生物活性的抗B7-H3抗体，用于肿瘤的单克隆抗体免疫疗法及其相关应用。用于B7-H3阳性肿瘤治疗的药物、组合物以及方法。
发明内容
本发明提供一种抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其包含：
抗体轻链可变区，所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16；和
抗体重链可变区，所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13。
所述的LCDR优选包括LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一种或多种，所述的LCDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：14所示；所述的LCDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：7或者SEQ ID NO：15；所述的LCDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：8或者SEQ ID NO：16所示。
所述的HCDR优选包括HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一种或多种，所述HCDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：11所示；所述HCDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：12所示；所述HCDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：13所示。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体轻链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体轻链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体重链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体重链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含序列分别如：
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含序列分别如：
SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
特别优选地，所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段可选自下述任一种：
(1)抗体轻链可变区包含序列分别如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含序列分别如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(2)抗体轻链可变区包含序列分别如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含序列分别如：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
上述抗B7-H3抗体或其抗原结合片段优选为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者人抗体。
较佳地，所述的鼠源抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。
较佳地，所述的鼠源抗体进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
较佳地，所述的B7-H3嵌合抗体进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
较佳地，所述的B7-H3嵌合抗体进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗体或所述的嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.2所示；或其中所述鼠源抗体或所述嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所示。
较佳地，所述的人源化抗体的抗体轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区。所述的人源化抗体的轻链可变区上的轻链FR区序列，优选来源于如SEQ ID NO：24所示的人种系轻链IGKV 1-33序列；或来源于如SEQ ID NO：26所示的人种系轻链IGKV1-9序列。
较佳地，所述的人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：30或者SEQ ID NO：33所示。更佳地，所述的人源化抗体进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。进一步更佳地，所述人源化抗体的轻链序列为如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的序列或其变体；所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，优选为氨基酸位点在4和9的突变，第4位突变后的氨基酸为甲硫氨酸(M)。
较佳地，所述的人源化抗体的重链可变区进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链FR区，更优选使用氨基酸突变后增强ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。所述的人源化抗体的重链可变区上的重链FR区序列，优选来源于如SEQ ID NO：23所示的人种系重链IGHV3-23序列；或来源于如SEQ ID NO：25所示的人种系重链IGHV1-2序列。
较佳地，所述的人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：27或者SEQ ID NO：31所示。更佳地，所述的人源化抗体进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。进一步更佳地，所述的人源化抗体的重链序列为如SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：19所示的序列或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，优选为氨基酸位点在9、13和49的突变，第9位突变后的氨基酸为脯氨酸(P)，第13位突变后的氨基酸为谷氨酰胺(Q)，第49位突变后的氨基酸为丙氨酸(A)。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的人源化抗体为人源化抗体huA9或人源化抗体huA3；所述的人源化抗体huA9的重链可变区序列如SEQ ID NO：31所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：33所示；所述的人源化抗体huA3的重链可变区序列如SEQ ID NO：27所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：30所示。更佳地，所述的人源化抗体huA9包含重链抗体序列SEQ ID NO：19，和轻链抗体序列SEQ ID NO：20；其中所述人源化抗体huA3包含重链抗体序列SEQ ID NO：17，和轻链抗体序列SEQ ID NO：18。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。
本发明进一步提供一种编码如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段的DNA序列。
本发明进一步提供一种含有如上所述的DNA序列的表达载体。
本发明进一步提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞为酵母菌，优选为毕赤酵母。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)293细胞。
本发明还提供了一种多特异性抗体，含有如前所述的轻链可变区和重链可变区。
本发明还提供了一种单链抗体，含有如前所述的轻链可变区和重链可变区。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段和可药用的赋形剂、稀释或载体。
本发明进一步提供一种如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗B7-H3介导的疾病或病症的药物中的用途；其中所述的疾病优选为癌症；更优选为表达B7-H3的癌症；所述的癌症最优选为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
本发明进一步提供一种治疗和预防B7-H3介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的如上所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段、或包含其的的药物组合物；其中所述的疾病优选为癌症；更优选为表达B7-H3的癌症；所述的癌症最优选为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
附图说明
图1为抗体的ELISA体外结合实验，显示鼠源抗体A3和A9均对纯化h-B7H3-Fc抗原有结合活性，EC50约在0.03ug/mL。
图2为嵌合抗体与高表达B7-H3的CHO细胞体外结合活性实验。鼠源抗体A3和A9、嵌合抗体A3C和A9C均在纳摩尔(nM)浓度级对靶标细胞有明显结合活性。
图3为人源化抗体与高表达B7-H3的MDA-MB-231细胞体外结合活性实验。huA3和huA9均在纳摩尔浓度级对靶标细胞有明显结合活性。
发明详述
一、术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本发明所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1，2，3，4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合Kabat和Chothia编号规则(HCDR1)。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞利用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)、外用血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、B淋巴母细胞和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原和使它们能够被T细胞识别的过程，例如作为MHC-I/MHC-II偶联物的组分。
术语“B7-H3”指人B7蛋白质家族的成员，也称为CD276，是具有四个Ig样胞外结构域的I型跨膜蛋白。B7-H3是抗原呈递细胞或癌细胞表面表达的免疫检查点蛋白之一，对T细胞的功能激活有抑制作用。术语“B7-H3”包括由细胞天然表达的B7-H3的任何变体或同种型。本发明的抗体可与得自非人物种的B7-H3交叉反应。作为另一种选择，该抗体也可以是人B7-H3特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。B7-H3或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。优选地，抗B7-H3抗体靶向具有正常糖基化模式的人源B7-H3。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人B7-H3的单克隆抗体。制备时用B7-H3抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源B7-H3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、已共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
术语“单链抗体”是由抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的单链重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。
术语“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
本发明的术语“与B7-H3结合”，指能与人B7-H3相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
本发明所用的术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人B7-H3作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10-7M或甚至更小的平衡解离常数(KD)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的B7-H3结合的能力。例如，结合人B7-H3的本发明的抗体也可以结合另一物种的B7-H3。交叉反应性是通过在结合测定(例如SPR和ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达B7-H3的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。配体的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生配体结合时出现活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括与抗B7-H3抗体接触时，与未与抗B7-H3抗体接触的配体相比，任何可测量的配体结合亲和力降低。
术语“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的剌激(即，被动或适应性的)。针对诱导CDC或ADCC的术语“诱导”是指剌激特定的直接细胞杀伤机制。
本发明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，增强或降低降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人B7-H3或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。相应抗体的cDNA序列可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在FC区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体(mAb)，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
本发明所述的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1免疫抗原、筛选抗原的序列及制备
编码带His标签的人B7-H3(h-B7H3-his)序列、编码带huFc标签的人B7-H3(h-B7H3-Fc)序列由Integrated DNA Technology(IDT)公司合成(以上B7-H3重组蛋白均由本发明设计模版序列)，分别克隆到pTT5载体上(Biovector)。重组的B7-H3蛋白在293T细胞表达后，通过实施例2进行纯化。纯化的蛋白可用于下述各实施例实验中。
h-B7H3-Fc以及h-B7H3-his的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.21和22所示。
实施例2 B7-H3重组蛋白制备
1、带His标签的B7H3重组蛋白的纯化步骤：
将HEK293细胞表(购自美国模式菌种保藏中心，American type culturecollection，ATCC)达的上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。
收集的洗脱液用离子交换(SP柱)进一步纯化。配置A液：0.01M PB，pH8.0。配置B液：A液+1M NaCl。先将咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白置换到A液，并使用A液平衡SP柱，上样，B液浓度梯度0-100％，10倍柱体积洗脱，收集各洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定正确后分装备用。
2、带Fc标签的B7H3重组蛋白(h-B7H3-Fc)的纯化步骤：
将HEK293细胞表达的上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS。用含有10mM磷酸缓冲液平衡ProteinA亲和力柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱。用含有25倍柱体积缓冲液冲洗柱子，至A280读数降至基线。再用pH 3.5的0.8％醋酸缓冲液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰，分装后立刻加入1M Tris-Cl pH8.0缓冲液中和，然后使用Millipore’s Amico-15滤柱置换溶液为PBS。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定正确后分装备用。
3、表达人或猴B7-H3抗原的CHO稳转细胞株制备：
编码人或食蟹猴B7-H3蛋白(huB7H3或cyB7H3)的全长序列由Integrated DNATechnology(IDT)公司合成(以上B7-H3重组蛋白均由本发明设计模版序列)，分别克隆到pcDNA3.1/puro(Invitrogen#V79020)。CHO-S(ATCC)细胞于CD-CHO培养基(LifeTechnologies，#10743029)内培养至0.5×106/ml。将10μg编码huB7H3或cyB7H3基因的载体与50ul LF-LTX(Life Technologies，#A12621)在1ml Opti-MEM培养基(LifeTechnologies，#31985088)中混合，室温孵育20分钟后，加入CHO细胞培养液中并放入二氧化碳培养箱培养。24小时后更换新培养基并加入10μg/ml嘌呤霉素。之后每2-3天更换一次新培养液，经过10-12天筛选后得到稳定CHO-S细胞池。
实施例3抗体的制备
抗人B7H3单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用Swiss Webster白小鼠，雌性，6周龄(CharlesRiver公司)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。免疫抗原为带Fc标签的人B7H3重组蛋白(huB7H3-Fc)。用Titermax(sigma Lot Num：T2684)为佐剂。抗原与佐剂(titermax)比例为1∶1，抗原乳化后进行接种，时间为第0、21、35、49、63天。第0天腹膜内(IP)注射15μg+爪垫(footpad)25/只的乳化后抗原。21，35，49，63天腹膜内(IP)注射15μg+爪垫(footpad)15/只的乳化后抗原，在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射15μg+爪垫(footpad)15/只的生理盐水配制的抗原溶液。于第42，56，70天进行血检，用ELISA及FACS方法检测小鼠血清，确定小鼠血清中的抗体滴度。在第5次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，采用优化的电融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure GPA0000265053710000151
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。
融合后的杂交瘤细胞培养7-14天后，取培养基上清，使用B7-H3重组蛋白huB7H3-Fc，ELISA实验对杂交瘤上清进行抗体筛选，得到的阳性抗体株进一步使用稳转表达B7-H3的CHO-S细胞，对比空白CHO-S细胞以排除非特异性结合抗体杂交瘤株，用流式分选方法进行筛选，从而选定两株结合重组蛋白且也结合细胞表达抗原的杂交瘤。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA并反转录(PrimeScriptTM ReverseTranscriptase，Takara#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序，最终得到两株鼠源抗体A3和A9的序列。
鼠单抗A3的重链和轻链可变区序列如下：
A3 HCVR
Figure GPA0000265053710000152
A3 LCVR
Figure GPA0000265053710000153
表1鼠单抗A3的重链和轻链可变区含有的CDR
Figure GPA0000265053710000154
Figure GPA0000265053710000161
A9的重链和轻链可变区序列如下：
A9 HCVR
Figure GPA0000265053710000162
A9 LCVR
Figure GPA0000265053710000163
表2鼠单抗A9的重链和轻链可变区含有的CDR
名称 序列 编号
HCDR1 DYAMH SEQ ID NO：11
HCDR2 VISTYYGNTNYNQKFKG SEQ ID NO：12
HCDR3 PVTTMVPRGGYYFDY SEQ ID NO：13
LCDR1 RASKSINKYLA SEQ ID NO：14
LCDR2 SGSTLQS SEQ ID NO：15
LCDR3 QQHNEYPLT SEQ ID NO：16
将每株鼠抗的重链和轻链可变区分别克隆进入含人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区的pTT载体质粒(Biovector)，然后瞬转转染入HEK293细胞，得到了抗B7-H3的嵌合抗体A3C和A9C，按实施例2(带Fc标签蛋白纯化)所描述的方法纯化、鉴定，并如下所述进行活性检测。
实施例4抗体的体外结合活性测定
用PBS缓冲液将用于和生物素结合的中和亲和素稀释至1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置16h-20h。用PBST(pH7.4PBS含0.05％Tween-20)缓冲液洗板1次后，加入120μl/孔PBST/1％milk，室温孵育1h进行封闭。PBST缓冲液洗板1次后，加入用PBST/1％milk稀释的1μg/ml的生物素标记h-B7H3-Fc，置室温孵育1h。PBST缓冲液洗板3次后，加入用PBST/1％milk稀释至合适浓度的待测B7-H3抗体，置室温孵育1.5h。移去反应体系，用PBST洗板3次后，以100μl/孔加入用PBST/1％milk稀释辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)标记的抗鼠抗体二抗(The Jackson Laboratory)，室温孵育1h。PBST洗板3次后，加入100μl/孔TMB，于室温孵育5-10min。加入100μl/孔1M H2SO4终止反应，在450nm处读取吸收值，计算ELISA结合EC50值。结果如图1所示，抗体A3和A9的EC50均约为0.03μg/mL，鼠源抗体A3和A9均对纯化h-B7H3-Fc抗原有结合活性。
将高表达huB7-H3的CHO-S细胞以1000rpm的转速离心5分钟，收集沉淀并用10-15ml的预冷的流式缓冲液悬浮，细胞计数。用50ml的离心管中以1000rpm的转速离心5分钟收集细胞，丢掉上清，沉淀用预冷封闭缓冲液重悬，密度为0.5-1.0×107细胞/毫升。4℃孵育30分钟后，重悬以每孔100μl加入到96孔板。96孔板在1500rpm的转速下离心5分钟后，弃上清。向每个孔加入100μl待测抗体，浓度梯度为0.01nM至670nM，将细胞重悬，4℃避光孵育60分钟。离心弃上清，加入100μl的1∶400稀释的FITC标记二抗(BD Biosciences)。将细胞重悬，4℃避光孵育60分钟。用流式缓冲液洗两次细胞，并用1％的多聚甲醛重悬细胞进行固定，进行流式检测。检测结果如图2所示，A3、A9及其对应的嵌合抗体均在纳摩尔(nM)浓度级对huB7H3高表达细胞有明显结合，且其结合强于Macrogenics公司的参照抗体BRCA84D。
同样的方法，使用高表达cyB7-H3的CHO-S细胞，在10nM单点浓度下检测各抗体与食蟹猴B7-H3的结合，结果数据如下表3所示，A3C与猴抗原有明显结合信号，而A9C和参照抗体BRCA84D均无结合。
表3
抗体名称 A3C A9C BRCA84D 阴性对照
信号强度(MFI) 54.5 4.59 5.25 3.98
实施例5体外结合亲和力和动力学实验
本实验采用表面等离子共振(SPR)方法测定。利用由Biacore提供的试剂盒，采用标准氨基偶联法将抗鼠IgG多克隆抗体共价连接至CM5(GE)芯片上，然后用此抗体将本发明待测的纯化鼠源抗体捕捉至固定相。将稀释于同样缓冲液中的12.5-800nM浓度梯度的h-B7H3-Fc或h-B7H3-His蛋白(实施例1)于前后各个循环进样，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用GE的BIAevaluation软件以1∶1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定的ka(kon)、kd(koff)和KD值显示如下表4。
表4
Figure GPA0000265053710000171
Figure GPA0000265053710000181
实施例6小鼠抗体人源化实验
鼠源抗人B7-H3单克隆抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列，本发明将候选分子A3和A9进行人源化。
在所获得的鼠源抗体VH/VL CDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与人源抗体种系数据库比较，获得同源性高的人种系模板。其中人类种系轻链框架区来自人κ轻链基因，人类种系重链框架区来自人重链，本发明抗体优选以下所示的人种系抗体模版。
A3优选人种系重链模版IGHV3-23(SEQ ID NO：23)：
Figure GPA0000265053710000182
A3优选人种系轻链模板IGkV1-33(SEQ ID NO：24)：
Figure GPA0000265053710000183
A9优选人种系重链模版IGHV1-2(SEQ ID NO：25)：
Figure GPA0000265053710000184
A9优选人种系轻链模板IGkV1-9(SEQ ID NO：26)：
Figure GPA0000265053710000185
将鼠源抗体A3和A9的CDR区移植到选择好的相应人源化模板上，替换人源化可变区，再与IgG恒定区(优选重链为IgG1，轻链为κ)重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，设计并检测了由如下人源化轻重链可变区序列组合而成的抗体。
huA3H1(SEQ ID NO：27)：
Figure GPA0000265053710000191
huA3H2(SEQ ID NO：28)：
Figure GPA0000265053710000192
huA3L1(SEQ ID NO：29)：
Figure GPA0000265053710000193
huA3L2(SEQ ID NO：30)：
Figure GPA0000265053710000194
huA9H1(SEQ ID NO：31)：
Figure GPA0000265053710000195
huA9H2(SEQ ID NO：32)：
Figure GPA0000265053710000196
huA9L1(SEQ ID NO：33)：
Figure GPA0000265053710000197
huA9L2(SEQ ID NO：34)：
Figure GPA0000265053710000198
经表达测试和回复突变数量对比，选择出最终的人源化huA3(使用H1重链和L2轻链)和huA9抗体分子(使用H1重链和L1轻链)，其各自序列如SEQ ID NO：17-20所示。
下述基因序列SEQ ID NO：35～38的最后三位核苷酸“TGA”为终止密码子，不编码任何氨基酸。
huA3抗体重链序列：
Figure GPA0000265053710000201
huA3抗体重链序列编码基因序列：
Figure GPA0000265053710000202
Figure GPA0000265053710000211
huA3抗体轻链序列：
Figure GPA0000265053710000212
huA3抗体轻链序列编码基因序列：
Figure GPA0000265053710000213
huA9抗体重链序列：
Figure GPA0000265053710000214
Figure GPA0000265053710000221
huA9抗体重链序列编码基因序列：
Figure GPA0000265053710000222
Figure GPA0000265053710000231
huA9抗体轻链序列：
Figure GPA0000265053710000232
huA9抗体轻链序列编码基因序列(其中下述序列的前60位核苷酸不参与最终huA9抗体轻链的编码)：
Figure GPA0000265053710000233
根据以上各人源化抗体轻链和重链的基因序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表达载体(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。将表达载体和转染试剂PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1∶2的比例转染HEK293细胞(Life TechnologiesCat.No.11625019)，并置于CO2孵育箱中孵育4-5天。表达的抗体通过离心回收后，按实施例2方法(带Fc标签蛋白纯化)进行抗体纯化，得到本发明的人源化抗体蛋白。
实施例7人源化抗体活性测定
对huA3和huA9及其它衍生的人源化抗体在体外进行了以下实验测定：
1、细胞结合实验(方法步骤同实施例4)，结果如图3所示，人源化抗体huA3和huA9均与高表达B7-H3的MDA-MB-231细胞阳性结合，且结合能力与嵌合抗体A3C相当。
2、亲和力动力学实验(方法步骤同实施例5)，结果如下表所示，最终优选的人源化抗体huA3和huA9对人B7-H3抗原蛋白的KD均在1nM以下，显示出很强的亲和力。
表5
Figure GPA0000265053710000241
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (22)

1.一种抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链可变区和抗体重链可变区，其中：
所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
或者，所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
2.如权利要求1所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.如权利要求2所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述鼠源抗体或所述嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；或其中所述鼠源抗体或所述嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。
4.如权利要求2所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于如SEQ ID NO：24所示的人种系轻链IGK V1-33序列；或来源于如SEQ ID NO：26所示的人种系轻链IGK V1-9序列。
5.如权利要求2所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的序列。
6.如权利要求2所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的重链恒定区。
7.根据权利要求6所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。
8.根据权利要求6所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链为氨基酸突变后增强ADCC毒性的IgG1。
9.如权利要求2所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于如SEQ ID NO：23所示的人种系重链IGHV3-23序列；或来源于如SEQ ID NO：25所示的人种系重链IGHV1-2序列。
10.如权利要求2所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链序列为如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19所示的序列。
11.根据权利要求2所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体为人源化抗体huA9或人源化抗体huA3；
所述的人源化抗体huA9的重链可变区序列如SEQ ID NO：31所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：33所示；
所述的人源化抗体huA3的重链可变区序列如SEQ ID NO：27所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：30所示。
12.根据权利要求11所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体huA9包含重链抗体序列SEQ ID NO：19，和轻链抗体序列SEQ ID NO：20；其中所述人源化抗体huA3包含重链抗体序列SEQ ID NO：17，和轻链抗体序列SEQ ID NO：18。
13.一种编码如权利要求1-12任一项所述的抗B7-H3抗体或抗原结合片段的DNA。
14.一种含有如权利要求13所述的DNA的表达载体。
15.一种含有如权利要求14所述的表达载体的宿主细胞。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，所述的宿主细胞为细菌、酵母菌或者哺乳动物细胞。
17.如权利要求16所述的宿主细胞，所述的细菌为大肠杆菌；所述的酵母菌为毕赤酵母；所述的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)293细胞。
18.一种药物组合物，其含有如权利要求1-12任一项所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
19.如权利要求1-12任一项所述的抗B7-H3抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防B7-H3介导的疾病或病症的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述的疾病为癌症。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述癌症为表达B7-H3的癌症。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述的癌症为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
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