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WO2018182354A1 - 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 - Google Patents

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 Download PDF

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Publication number
WO2018182354A1
WO2018182354A1 PCT/KR2018/003768 KR2018003768W WO2018182354A1 WO 2018182354 A1 WO2018182354 A1 WO 2018182354A1 KR 2018003768 W KR2018003768 W KR 2018003768W WO 2018182354 A1 WO2018182354 A1 WO 2018182354A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tagatose
fructose
present application
enzyme
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/003768
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
양성재
이영미
박일향
조현국
김성보
이찬형
최은정
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Priority to EP18775140.9A priority Critical patent/EP3604514A4/en
Priority to US16/498,237 priority patent/US11180785B2/en
Priority to MX2019011758A priority patent/MX2019011758A/es
Priority to JP2019553228A priority patent/JP6927467B2/ja
Priority to CA3058415A priority patent/CA3058415A1/en
Priority to CN201880036243.7A priority patent/CN111344405B/zh
Priority to BR112019020520-9A priority patent/BR112019020520B1/pt
Publication of WO2018182354A1 publication Critical patent/WO2018182354A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01144—Tagatose-6-phosphate kinase (2.7.1.144)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01002—Glucokinase (2.7.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/0204—Tagatose-bisphosphate aldolase (4.1.2.40)

Definitions

  • the present application relates to a composition for producing tagatose comprising a fructose-4-epimerase and a method for producing tagatose using the same.
  • Tagatose is a natural sweetener present in small quantities in foods such as milk, cheese and cacao, and sweet natural fruits such as apples and tangerines.
  • Tagatose has a calories of 1.5 kcal / g, 1/3 of sugar, and GI (Glycemic Index) is 3, which is 5% of sugar, whereas sugar has similar physical properties and similar sweetness. Because of its health functionality, it can be used in many products as a sugar substitute sweetener that can satisfy both health and taste at the same time.
  • Tagatose-bisphosphate aldolase (EC 4.1.2.40) is a substrate of D-tagatose 1,6-diphosphate (D-tagatose 1,6-bisphosphate) as shown in Scheme 1 below. It is known to produce glycerone phosphate (D-glyceraldehyde 3-phosphate) and glycerone phosphate (D-glyceraldehyde 3-phosphate), and involved in galactose metabolism, but the tagatose-diphosphate aldolase There is no research on the activity of producing tagatose.
  • tagatose-bisphosphate aldolase (EC 4.1.2.40) was used to convert fructose to tagatose. This application was completed by confirming that there is a function to convert to.
  • Another object of the present application is to prepare a tagatose comprising the step of contacting the fructose-4-epimerase, the microorganism expressing the enzyme or the culture of the microorganism of the present application with fructose to convert the fructose to tagatose To provide.
  • the present application provides a tagatose-diphosphate aldolase, a microorganism expressing the same or a composition for producing tagatose comprising the culture of the microorganism.
  • the tagatose-diphosphate aldolase may be included without limitation as tagatose-bisphosphate aldolase (EC 4.1.2.40), for example, if tagatose can be produced based on fructose as a substrate.
  • the tagatose-diphosphate aldolase is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19, or SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 A polypeptide having at least 80%, 90%, 95%, 97% or 99% homology with an amino acid sequence of 9, 11, 13, 15, 17, or 19.
  • the SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 If the polypeptide has an amino acid sequence exhibiting a corresponding potency (ie, fructose-4-epimerization activity that epimerizes the carbon position 4 of fructose and converts it to tagatose), then some sequences are deleted, It is obvious that even those having modified, substituted or added amino acid sequences are included within the scope of the present application.
  • a corresponding potency ie, fructose-4-epimerization activity that epimerizes the carbon position 4 of fructose and converts it to tagatose
  • probes that can be prepared from known gene sequences for example, polypeptides encoded by polynucleotides that hybridize under stringent conditions with complementary sequences to all or part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, are fructose- Polypeptides having 4-epimerization activity may also be included without limitation.
  • the composition may comprise at least one of tagatose-diphosphate aldolase consisting of the amino acid sequence of 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19.
  • 'tagatose-diphosphate aldolase' exhibits fructose-4-epimerization activity which epimerizes the carbon position 4 of fructose to convert fructose to tagatose and thus herein Can be used interchangeably with 'epimerase'.
  • stringent conditions refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. Such conditions depend on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity and the variables are well known in the art and are specifically described in J. Sambrook et al., Homology. For example, genes with high homology, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, or at least 99% of homologous genes are hybridized, and genes with lower homology are not hybridized.
  • the probe used for hybridization may be part of the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • Such a probe can be constructed by PCR using an oligonucleotide made based on a known sequence as a primer as a template of a gene fragment containing such a nucleotide sequence.
  • those skilled in the art can adjust the temperature and wash solution salt concentration as needed depending on factors such as the length of the probe.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology may be sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules, such as score, identity, and similarity, using a computer program that aligns the sequence information and is readily available. Parameters can be determined by direct alignment (eg BLAST 2.0). In addition, homology between polynucleotides can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • the fructose-4-epimerase of the present application may be a heat resistant microorganism derived enzyme, for example, Some Air Rodriguez sp. Derived enzyme or variant thereof, Kosmoto sp. Derived enzymes or variants thereof, Rhodothermus sp. Derivative enzyme or variant thereof, Limnochoda sp. Derivative enzymes or variants thereof, Cardislith sp, Caldirini sp, Thermoerobacter sp, Ecidobacteria sp or Cardicellulose syrup sp. Enzymes or variants thereof.
  • a heat resistant microorganism derived enzyme for example, Some Air Rodriguez sp. Derived enzyme or variant thereof, Kosmoto sp. Derived enzymes or variants thereof, Rhodothermus sp. Derivative enzyme or variant thereof, Limnochoda sp. Derivative enzymes or variants thereof, Cardislith sp, Caldirini sp, Therm
  • Rhodothermus profundi DSM 22212 or Rhodothermus marinus Enzymes derived from ATCC 43812 or variants thereof.
  • the fructose-4-epimerase or variant thereof of the present invention is characterized by epimerizing the carbon position 4 of D-fructose (fructose) to D-tagatose.
  • the fructose-4-epimerase has tagatose-bisphosphate aldolase activity, and D-tagatose 1,6-bisphosphate is used as a substrate. It is known to produce glycerone phosphate and D-glyceraldehyde 3-phosphate, and is involved in galactose metabolism. It has now been newly found that the tagatose-diphosphate aldolase has fructose-4-epimerase activity.
  • one embodiment of the present application relates to a novel use of tagatose-diphosphate aldolase, comprising using tagatose-diphosphate aldolase as a fructose-4-epimerase in preparing tagatose from fructose.
  • tagatose-diphosphate aldolase comprising using tagatose-diphosphate aldolase as a fructose-4-epimerase in preparing tagatose from fructose.
  • the fructose-4-epimerase of the present application may be an enzyme having high heat resistance. Specifically, the fructose-4-epimerase of the present application exhibits 50% to 100%, 60% to 100%, 70% to 100% or 75% to 100% of the maximum activity at 50 ° C to 70 ° C. Can be. More specifically, the fructose-4-epimerase of the present application is 80% to 100% or 85% to 100% of the maximum activity at 55 ° C to 60 ° C, 60 ° C to 70 ° C, 55 ° C, 60 ° C, or 70 ° C. It can exhibit% activity.
  • the fructose-4-epimerase consisting of SEQ ID NO: 3 is prepared by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • the fructose-4-epimerase enzyme consisting of SEQ ID NO: 5 is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6;
  • the fructose-4-epimerase enzyme consisting of SEQ ID NO: 7 is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8;
  • the fructose-4-epimerase enzyme consisting of SEQ ID NO: 11 is prepared by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12;
  • Fructose-4-epimerase or a variant thereof of the present application is a DNA expressing the enzyme or a variant thereof, such as SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or After transformation to 20 strains such as E. coli, and cultured to obtain a culture, the culture may be obtained by crushing the culture, such as by purification through a column.
  • the transformation strain is Escherichia coli ) and Corynebacterum glutamicum , Aspergillus oryzae , or Bacillus subtilis .
  • such transformed strains include E. coli BL21 (DE3) / CJ_TD_F4E, E.coli BL21 (DE3) / CJ_KO_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_RP_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_RM_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_LP_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_Cab_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_Ckr_ or E. coli BL21 (DE3) / CJ_CAE_F4E, E.
  • KCCM11999P (Deposit: March 24, 2017), KCCM12097P (Deposit: August 11, 2017), KCCM12096P (Deposit: August 11, 2017), KCCM12095P (Deposit: August 11, 2017 KCCM12107P (Deposit date: September 13, 2017) and KCCM12108P (Deposit date: September 13, 2017), KCCM12233P (Deposit date: March 23, 2018), KCCM12234P (Deposit date: 3 2018) Month 23) and KCCM12237P (deposit date: March 23, 2018).
  • Fructose-4-epimerase used in the present application may be provided using a nucleic acid encoding it.
  • nucleic acid is meant to encompass DNA or RNA molecules inclusive, and the nucleotides that are the basic structural units in nucleic acids may include not only natural nucleotides, but also analogs with modified sugar or base sites (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • the nucleic acid is a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 of the present application or the fructose-4-epimerase of the present application Nucleic acids encoding polypeptides having at least 80%, 90%, 95%, 97% or 99% homology with fructose-4-epimerase activity.
  • the nucleic acid encoding the fructose-4-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is at least 80%, 90%, 95%, 97%, 99% or 100% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: Nucleic acids having homology.
  • the nucleic acid encoding the fructose-4-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is at least 80%, 90%, 95%, 97%, 99% or 100% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: It may be a nucleic acid having homology, which may also apply to nucleic acids encoding enzymes of other amino acid sequences described herein.
  • nucleic acid of the present application may include a nucleic acid that can be translated into the fructose-4-epimerase of the present application by codon degeneracy, and SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 And nucleic acids which hybridize under stringent conditions with nucleic acids consisting of base sequences complementary to the nucleotide sequences of 12, 14, 16, 18 or 20, and which encode polypeptides having fructose-4-epimerase activity of the present application. It can be obvious.
  • the microorganism expressing the fructose-4-epimerase which can be used in the present application may be a microorganism comprising a recombinant vector comprising the nucleic acid.
  • the vector may be in the form of operably linked nucleic acid of the present application.
  • operably linked may generally affect the expression of a base sequence that is operably linked to and encodes a base sequence encoding a protein of interest to perform a function. Operable linkages with vectors can be made using genetic recombination techniques known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be made using cleavage and linking enzymes, and the like, in the art.
  • vector in this application refers to any medium for cloning and / or transferring bases to an organism, such as a host cell.
  • the vector may be a replica that other DNA fragments can bind to and result in replication of the bound fragments.
  • replicaating unit means any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as an autologous unit of DNA replication in vivo, i.e., is replicable by its own regulation.
  • vector in the present application may include viral and nonviral mediators for introducing bases into an organism, such as a host cell, in vitro, ex vivo or in vivo, and may include minispherical DNA, Sleeping Beauty Transposons (Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302: 93-102 (2000)), or artificial chromosomes.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited and known recombinant vectors may be used.
  • the vector may be a recombinant vector, further comprising a variety of antibiotic resistance genes.
  • antibiotic resistance gene is a gene that has resistance to antibiotics, and since the cells having the cells survive in the environment treated with the antibiotic, they are useful as a selection marker in the process of obtaining plasmids in large quantities in E.
  • antibiotic resistance genes in the present application are not a factor that greatly affects the expression efficiency according to the optimal combination of vectors, which is the core technology of the present application, antibiotic resistance genes generally used as selection markers can be used without limitation.
  • resistance genes for ampicillin, tetratracyclin, kanamycin, kanamycin, chloroamphenicol, streptomycin, or neomycin may be used.
  • Microorganisms expressing a fructose-4-epimerase enzyme may use a method of introducing a vector containing a nucleic acid encoding the enzyme into a host cell, the method of transforming the vector Any method of introducing a nucleic acid into a cell can be included and can be carried out by selecting a suitable standard technique as is known in the art. Electroporation, calcium phosphate co-precipitation, retroviral infection, microinjection, DEAE-dextran, cationic liposome Law and heat shock method, and the like, but are not limited thereto.
  • the transformed gene may include both a form inserted into the chromosome of the host cell and a form located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • the gene may include DNA and RNA as a polynucleotide capable of encoding a polypeptide, and may be used without limitation as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the gene may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for self expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of a recombinant vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell in its own form or in the form of a polynucleotide structure, and may be operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • the microorganism of the present application may include both prokaryotic and eukaryotic microorganisms, as long as the microorganism capable of producing the fructose-4-epimerase of the present application, including the nucleic acid of the present application or the recombinant vector of the present application.
  • S. genus Escherichia Escherichia
  • An air Winiah Erwinia
  • Serratia marcescens Serratia
  • Providencia Providencia
  • Corynebacterium Corynebacterium
  • Brevibacterium Brevibacterium
  • It may include a microorganism strain belonging to, specifically, E.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium corynebacterium glutamicum
  • Examples of such microorganisms are E. coli BL21 (DE3) / CJ_TD_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_KO_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_RP_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_RM_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_LP_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_Cab_F4E, E.
  • E. coli BL21 (DE3) / CJ_Ckr_F4E E. coli BL21 (DE3) / CJ_CAE_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_TATH_F4E, or E. coli BL21 (DE3) / CJ_ .
  • the microorganism of the present application may include all microorganisms capable of expressing the fructose-4-epimerase enzyme of the present application by various known methods in addition to introducing the nucleic acid or the vector.
  • the culture of the microorganism of the present application may be prepared by culturing a microorganism expressing the tagatose-diphosphate aldolase of the present application in a medium.
  • the term "culture” means growing the microorganisms under appropriately controlled environmental conditions. Cultivation process of the present application can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like.
  • the culture conditions are not particularly limited, but using a basic compound (eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg phosphoric acid or sulfuric acid) to an appropriate pH (eg pH 5 to 9, specifically PH 7 to 9) can be adjusted.
  • a basic compound eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg phosphoric acid or sulfuric acid
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble formation, and in order to maintain the aerobic state of the culture, oxygen or oxygen-containing gas is injected into the culture, or anaerobic and microaerobic conditions are maintained. To maintain, it can be injected with no gas or with nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas.
  • the culture temperature may be maintained at 25 to 40 °C, specifically 30 to 37 °C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may continue until the desired amount of useful material is obtained, specifically, may be incubated for about 0.5 hours to 60 hours, but is not limited thereto.
  • the culture medium used may include sugars and carbohydrates (e.g.
  • fats and fats e.g. soybean oil, sunflower seeds
  • Oils, peanut oils and coconut oils fatty acids (e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (e.g. glycerol and ethanol) and organic acids (e.g. acetic acid) may be used individually or in combination. This is not restrictive.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like can be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • a source of phosphorus potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, a corresponding sodium-containing salt, and the like may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • the medium may also contain essential growth-promoting substances such as other metal salts (eg magnesium sulfate or iron sulfate), amino acids and vitamins.
  • composition for producing tagatose of the present application may further include fructose.
  • composition for producing tagatose of the present application includes tagatose-diphosphate aldolase having fructose-4-epimerization activity for directly converting fructose to tagatose, a microorganism expressing the same or a culture of the microorganism, It may be characterized by not including other enzymes other than phosphorus fructose.
  • ⁇ -glucan phosphorylase for example, ⁇ -glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase or sucrose phosphorylase, expressing it Microorganisms or cultures of the microorganisms;
  • Glucose glucokinase a microorganism expressing the same or a culture of the microorganism
  • Tagatose-6-phosphate dephosphorylase a microorganism expressing the same or a culture of the microorganism; And / or
  • ⁇ -amylase pullulanase, glucoamylase, sucrase or isoamylase
  • Microorganisms expressing the amylase, pullulanase, glucoamylase, sucrase or isoamylase Or it may be characterized in that it does not comprise a culture of microorganisms expressing the amylase, pullulanase, glucoamylase, sukrase or isoamylase.
  • composition for producing tagatose of the present application may further include any suitable excipient commonly used in the composition for producing tagatose.
  • excipients may be, for example, but not limited to, preservatives, wetting agents, dispersants, suspending agents, buffers, stabilizers or isotonic agents.
  • the composition for producing tagatose of the present application may further include a metal.
  • the metal of the present application may be a metal comprising a divalent cation.
  • the metal of the present application may be nickel, magnesium (Mg) or manganese (Mn). More specifically, the metal of the present application may be a metal ion or a metal salt, and even more specifically the metal salt may be MgSO 4 , NiSO 4 , NiCl 2 , MgCl 2 , It may be MnCl 2 or MnSO 4 .
  • the present application provides a method for converting fructose to tagatose by contacting fructose (D-fructose) with a fructose-4-epimerase of the present application, a microorganism expressing the enzyme or a culture of the microorganism. It provides a tagatose manufacturing method comprising.
  • the contact of the present application may be performed at pH 5.0 to pH 9.0 conditions, at 30 °C to 80 °C temperature conditions, and / or 0.5 to 48 hours.
  • the contact of the present application may be performed at pH 6.0 to pH 9.0 conditions or pH 7.0 to pH 9.0 conditions.
  • the contact of the present application is 35 °C to 80 °C, 40 °C to 80 °C, 45 °C to 80 °C, 50 °C to 80 °C, 55 °C to 80 °C, 60 °C to 80 °C, 30 °C to 70 °C, 35 ° C to 70 ° C, 40 ° C to 70 ° C, 45 ° C to 70 ° C, 50 ° C to 70 ° C, 55 ° C to 70 ° C, 60 ° C to 70 ° C, 30 ° C to 65 ° C, 35 ° C to 65 ° C, 40 ° C to 65 degreeC, 45 degreeC-65 degreeC, 50 degreeC-65 degreeC, 55 degreeC-65 degreeC, 30 degreeC-60 degreeC, 35 degreeC-60 degreeC, 40 degreeC-60 degreeC, 45 degreeC-60 degreeC, 50 degreeC
  • the contact of the present application is 0.5 hours to 36 hours, 0.5 hours to 24 hours, 0.5 hours to 12 hours, 0.5 hours to 6 hours, 1 hour to 48 hours, 1 hour to 36 hours, 1 3 hours to 24 hours, 3 hours to 24 hours, 3 hours to 12 hours, 3 hours to 1 hour to 12 hours, 1 hour to 6 hours, 3 hours to 36 hours
  • the contact of the present application may be performed in the presence of a metal.
  • Metals that can be used are the same as in the foregoing embodiments.
  • the manufacturing method of the present application may further comprise the step of separating and / or purifying the produced tagatose.
  • the separation and / or purification may use a method commonly used in the art of the present application. Non-limiting examples include dialysis, precipitation, adsorption, electrophoresis, ion exchange chromatography, fractional crystallization, and the like.
  • the purification may be carried out in only one method, or may be performed in combination of two or more methods.
  • the production method of the present application may further comprise the step of performing the decolorization and / or desalting before or after the separation and / or purification step.
  • the preparation method of the present application may further comprise the step of crystallizing the tagatose after the step of converting, separating and / or purifying, or decolorizing and / or desalting the tagatose of the present application.
  • the crystallization can be carried out using a conventionally used crystallization method.
  • crystallization may be performed using a cooling crystallization method.
  • the preparation method of the present application may further comprise the step of concentrating tagatose before the step of crystallizing.
  • the concentration can increase the crystallization efficiency.
  • the preparation method of the present application comprises contacting the unreacted fructose with an enzyme of the present application, a microorganism expressing the enzyme or a culture of the microorganism after the separation and / or purification of the present application.
  • the step of crystallizing the application may further comprise reusing the separated mother liquor into the separation and / or purification steps, or a combination thereof.
  • Tagatose-diphosphate aldolase a fructose-4-epimerase of the present application, is excellent in heat resistance, and thus can be industrially produced in tagatose, and has a high economical effect as it converts fructose, a common sugar, to tagatose.
  • CJ_TD_F4E tagatose-diphosphate aldolase enzymes (CJ_TD_F4E, CJ_KO_F4E) prepared in one embodiment of the present application have fructose-4-epimerase activity.
  • Figure 2 is a graph showing the degree of activity according to the temperature change in fructose-4-epimerization activity of tagatose-diphosphate aldolase enzymes (CJ_TD_F4E, CJ_KO_F4E) prepared in one embodiment of the present application.
  • FIG. 3 is an HPLC chromatography graph showing that tagatose-diphosphate aldolase enzymes CJ_RP_F4E and CJ_RM_F4E prepared in one embodiment of the present application have fructose-4-epimerase activity.
  • Figure 4a is a graph showing the fructose-4-epimerase activity according to the temperature change of the tagatose-diphosphate aldolase enzyme CJ_RP_F4E prepared in one embodiment of the present application.
  • Figure 4b is a graph showing the fructose-4-epimerase activity according to the temperature change of the tagatose-diphosphate aldolase enzyme CJ_RM_F4E prepared in one embodiment of the present application.
  • Figure 5a is a graph showing the fructose-4-epimerization activity according to the metal addition of the tagatose-diphosphate aldolase enzyme CJ_RP_F4E prepared in one embodiment of the present application.
  • Figure 5b is a graph showing the fructose-4-epimerization activity according to the metal addition of the tagatose-diphosphate aldolase enzyme CJ_RM_F4E prepared in one embodiment of the present application.
  • Figure 6 is an HPLC chromatography graph showing that the tagatose-diphosphate aldolase enzyme CJ_LP_F4E prepared in one embodiment of the present application has fructose-4-epimerase activity.
  • FIG. 8A is a graph showing HPLC chromatography results showing that tagatose-diphosphate aldolase CJ_Cab_F4E prepared in one embodiment of the present application has fructose-4-epimerase activity.
  • FIG. 8B is a graph showing HPLC chromatography results showing that CJ_Ckr_F4E prepared in one embodiment of the present application has fructose-4-epimerase activity.
  • 9b is It is a graph showing the fructose-4-epimerase activity according to the temperature of CJ_Ckr_F4E prepared in one embodiment of the present application.
  • 10B is a graph showing fructose-4-epimerization activity according to the metal addition of CJ_Ckr_F4E prepared in one embodiment of the present application.
  • FIG. 11 is a graph showing HPLC chromatography results showing that CJ_CAE_F4E prepared in one embodiment of the present application has fructose-4-epimerase activity.
  • FIG. 12 is a graph showing HPLC chromatography results showing that CJ_TATH_F4E prepared in one embodiment of the present application has fructose-4-epimerase activity.
  • FIG. 13 is a graph showing HPLC chromatography results showing that CJ_AB_F4 prepared in one embodiment of the present application has fructose-4-epimerase activity.
  • Example 1-1 Tagatose Diphosphate Aldolase Preparation of recombinant expression vectors and transformants comprising the gene
  • the tagatose-diphosphate aldolase which is registered in the KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), Thermone datrixis, Anerolinea thermophilia, and Cosmoto are targeting the Oelia gene sequences.
  • the gene sequence was selected, and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the Thermoneromyx dacensis, the amino acid sequence of Oelia (SEQ ID NO: 5) and nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) Based on the recombinant expression vector produced by inserting into the pBT7-C-His E. coli expression capable vector was submitted to Bioneer synthesis.
  • E. coli BL21 (DE3) / CJ_TD_F4E, E. coli BL21 (DE3) / CJ_KO_F4E were transformed into E. coli BL21 (DE3).
  • the E. coli BL21 (DE3) / CJ_TD_F4E was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms under the accession number KCCM11995P on March 20, 2017 under the Budapest Treaty and the E. coli BL21 (DE3) / CJ_KO_F4E Was deposited on March 24, 2017 with accession number KCCM11999P.
  • E.coli BL21 (DE3) / CJ_TD_F4E E manufactured. coli BL21 (DE3) / CJ_KO_F4E was inoculated into a culture tube containing 5 ml of LB liquid medium containing ampicillin (ampicillin), and the seed culture was carried out in a 37 ° C shaking incubator until the absorbance at 600 nm was 2.0.
  • the seed cultured culture was inoculated into a culture flask containing LB and a liquid medium containing lactose, a protein expression regulator, to carry out the main culture.
  • the stirring speed during the culture process is 180rpm, the culture temperature was maintained at 37 °C.
  • the culture solution was centrifuged for 20 minutes at 4 °C at 8,000rpm to recover the cells.
  • the recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer and resuspended in 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 10 mM imidazole and 300 mM NaCl.
  • the suspended cells were lysed using a sonicator, and the cell lysates were collected only after centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes at 13,000 rpm.
  • the supernatant was purified using His-taq affinity chromatography, and 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl was flowed at 10 times the amount of filler to remove nonspecific bindable protein. 50mM NaH2PO4 (pH8.0) buffer containing the final 250mM imidazole and 300mM NaCl was eluted and purified, and the enzyme for enzyme characterization was obtained after dialysis with 50mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer.
  • fructose in which 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM CoSO 4 , 20 mg / ml tablet separated in Example 2 above.
  • the enzyme was added and reacted at a temperature of 60 ° C. for 2 hours.
  • the concentration of tagatose converted by three fructose-4-epimerase enzymes, CJ_TD_F4E, and CJ_KO_F4E and the conversion rate from fructose to tagatose were 4.6% for CJ_TD_F4E and 16.0% for CJ_KO_F4E. .
  • tagatose, a fructose and a product remaining after the reaction was quantified using HPLC.
  • the column used was Shodex Sugar SP0810, the column temperature was 80 °C, the flow rate of the water of the mobile phase was flowed at 1ml / min.
  • HPLC chromatography was used to detect and quantify peaks representing the reaction of the enzyme with fructose as a substrate.
  • Example 2-1 Tagatose Diphosphate Aldolase Preparation of recombinant expression vector and transformant containing gene
  • Rhodothermus Rhodothermus for the discovery of novel heat-resistant fructose-4-epimerase according to the present application profundi ) DSM 22212 , Rhodothermus marinus Tagatose-diphosphate aldolase gene derived from ATCC 43812 was obtained to prepare E. coli-expressable vectors and transformed microorganisms.
  • the tagatose-diphosphate aldolase gene sequence is selected from Rhodomus Profundi, Rhodomus Mariners ATCC 43812 gene sequence registered in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and National Center for Biotechnology Information (NCBI), Recombinant vector pBT7-C-His-CJ_RP_F4E, pBT7 capable of expressing E. coli, including the nucleotide sequence of the enzyme based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7 and 9) and nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8 and 10) information of the two microorganisms -C-His-CJ_RM_F4E was manufactured (Bionia, South Korea).
  • E. coli BL21 Each of the recombinant vectors was transformed into E. coli BL21 (DE3) by heat shock transformation (Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001), and then stored in 50% glycerol and frozen.
  • the transgenic strains were named E. coli BL21 (DE3) / CJ_RP_F4E and E. coli BL21 (DE3) / CJ_RM_F4E, respectively, and the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty, 2017 It was deposited on August 11, 2011 and was given KCCM12097P and KCCM12096P, respectively.
  • KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
  • each transgenic microorganism was used as ampicillin. Inoculated into a culture tube containing 5 mL of LB liquid medium containing antibiotics, and spawn incubation in a 37 °C shaking incubator until the absorbance at 600 nm was 2.0. The culture solution obtained as a result of the seed culture was inoculated into a culture flask containing a liquid medium containing LB and a lactose which is a protein expression control factor, and the main culture was carried out.
  • the seed culture and the main culture were carried out at a stirring speed of 180 rpm and 37 °C conditions.
  • the culture solution was centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes at 4 °C to recover the cells.
  • the recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 10 mM imidazole and 300 mM NaCl. Resuspended.
  • the resuspended cells were disrupted using a sonicator, and centrifuged at 4 ° C. at 13,000 rpm for 20 minutes, and only the supernatant was taken.
  • the supernatant was purified using His-taq affinity chromatography, and 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl was flown at 10 times the amount of the filler to yield nonspecific binding. Possible protein was removed. Then, 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 250 mM imidazole and 300 mM NaCl was further eluted and purified, followed by dialysis with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer solution. Purified enzymes CJ_RP_F4E and CJ_RM_F4E, respectively, were obtained for enzyme characterization.
  • CJ_RP_F4E exhibited maximum activity at 65 ° C., and maintained at least 70% of the maximum activity at 60 ° C. to 70 ° C. and at least 50% of the maximum activity at all temperature ranges (FIG. 4A).
  • CJ_RM_F4E exhibited maximum activity at 70 ° C., and maintained at least 70% of the maximum activity at 55 ° C. to 70 ° C. and at least 40% of the maximum activity at all temperature ranges (FIG. 4B).
  • Example 3-1 Tagatose Diphosphate Aldolase Preparation of recombinant expression vector and transformant containing gene
  • the tagatose-diphosphate aldolase gene sequence is selected from the Limogkorda phylosa gene sequence registered in the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and the European Nucleotide Archive (ENA), and thus, Based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) and nucleotide sequence (SEQ ID NO: 12) of the derived tagatose-diphosphate aldolase CJ_LP_F4E, a recombinant expression vector pBT7-C-His-CJ_LP_F4E capable of expressing E. coli comprising the nucleotide sequence of the enzyme (Bionia, Korea).
  • the recombinant vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) by heat shock transformation (Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001), and then stored in 50% glycerol and frozen.
  • the transgenic strain was named E. coli BL21 (DE3) / CJ_LP_F4E, and was deposited on August 11, 2017 to the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty, and deposited accession number KCCM12095P. Was given.
  • Transformation strain E. coli prepared according to Example 3-1 In order to obtain the present application recombinant enzyme from BL21 (DE3) / CJ_LP_F4E, derived CJ_LP_F4E, each of said transforming microorganisms was inoculated into a culture tube containing 5 mL of LB liquid medium containing an ampicillin antibiotic, The spawn was incubated in a shaker at 37 ° C. until absorbance was 2.0 at 600 nm. The seed cultured culture was inoculated into a culture flask containing a liquid medium containing LB and lactose, a protein expression regulator, to carry out the main culture.
  • the seed culture and main culture were carried out at a stirring speed of 180 rpm and 37 °C conditions. Subsequently, the culture solution was centrifuged at 4 ° C. at 8,000 rpm for 20 minutes to recover the cells. The recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer and reproduced in 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 10 mM imidazole and 300 mM NaCl. It was cloudy. The resuspended cells were disrupted using a sonicator, and the cell debris was centrifuged at 4 ° C. at 13,000 rpm for 20 minutes, and only the supernatant was taken.
  • the supernatant was purified using His-taq affinity chromatography, followed by flowing 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl in 10 times the amount of the filler to make it nonspecific. The bindable protein was removed. Next, 50 mM NaH 2 PO 4 (pH8.0) buffer containing 250 mM imidazole and 300 mM NaCl was further eluted to purify and purified by dialysis with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer solution. Purified enzyme CJ_LP_F4E was obtained for analysis.
  • CJ_LP_F4E enzyme showed a maximum activity at 60 °C, it was confirmed that CJ_LP_F4E maintains more than 50% of the maximum activity at 45 °C to 70 °C (Fig. 7a).
  • CJ_LP_F4E 2 mg / mL of CJ_LP_F4E is added to 50 mM Tris HCl (pH 8.0) buffer containing 10 wt% fructose, and various metal ions NiSO 4 , CaCl 2 , ZnSO 4 , MgSO 4 , MnSO 4 , FeSO 4 , CuSO 4 , or (NH 4 ) 2 SO 4 was added 1 mM each to measure the enzyme activity. The case where no metal ion was treated was set as a control. After the reaction was completed, tagatose in the reaction solution was quantitatively analyzed using HPLC.
  • the CJ_LP_F4E enzyme of the present application was found to increase in activity by the addition of each of MnSO 4 and NiSO 4 , indicating that there was a requirement for metal ions such as manganese ions and nickel ions. In particular, it was confirmed that the maximum activity when added NiSO 4 (Fig. 7b).
  • Example 4-1 Tagatose Diphosphate Aldolase Preparation of Recombinant Vectors and Recombinant Microorganisms Comprising Genes
  • Kaldis Abyss registered with Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEG) and National Center for Biotechnology Information (NCBI) DSM 13497 And Caldicellulose Syrup Chronosukiensis Tagatose-diphosphate aldolase gene sequence is selected from the gene sequence, and the base sequence of the enzyme is included based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 13 and 15) and base sequence (SEQ ID NO: 14 and 16) information of each of the microorganisms.
  • E. coli-expressing recombinant vectors pBT7-C-His-CJ_Cab_F4E and pBT7-C-His-CJ_Ckr_F4E were synthesized (Bionia, Korea).
  • Each recombinant vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) by heat shock transformation (Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001) to produce a recombinant microorganism, and then used by freezing stored in 50% glycerol.
  • the recombinant microorganisms were named E. coli BL21 (DE3) / CJ_Cab_F4E and E. coli BL21 (DE3) / CJ_Ckr_F4E, respectively, and the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty, 2017. Deposited on September 13, each were assigned accession numbers KCCM12107P and KCCM12108P.
  • each recombinant microorganism ampicillin was inoculated into a culture tube containing 5 mL of LB liquid medium containing antibiotics, and the seed culture was carried out in a 37 ° C. shaking incubator until the absorbance was 2.0 at 600 nm.
  • the seed cultured culture was inoculated into a culture flask containing a liquid medium containing LB and lactose, a protein expression regulator, to carry out the main culture.
  • the seed culture and main culture were carried out at a stirring speed of 180 rpm and 37 °C conditions. Thereafter, the culture solution was recovered after centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes at 8,000 rpm.
  • the recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, and washed in 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 10 mM imidazole and 300 mM NaCl. Suspended.
  • the suspended cells were disrupted using a sonicator, and the cell debris was centrifuged at 4 ° C. at 13,000 rpm for 20 minutes, and only the supernatant was taken.
  • the supernatant was purified using His-taq affinity chromatography, and 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl was flown at 10 times the amount of the filler to yield nonspecific binding. Possible protein was removed. Thereafter, 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 250 mM imidazole and 300 mM NaCl was further eluted and purified. The enzyme was purified by dialysis with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer. Purification enzymes CJ_Cab_F4E and CJ_Ckr_F4E for characterization were obtained.
  • CJ_Cab_F4E and CJ_Ckr_F4E and 1 mM metal ions were added to 50 mM Tris HCl (pH8.0) buffer containing 5% by weight fructose at 60 ° C.
  • the reaction was carried out for 5 hours.
  • the case where no metal ions were treated was set as a control (w / o).
  • the tagatose of the reaction solution was quantitatively analyzed using HPLC.
  • CJ_Cab_F4E increased the activity about 2 times by the addition of MnSO 4 and 10 times or more by the addition of MgSO 4 so that manganese or magnesium ions (or salts thereof) increased the fructose-4-epimerization activity of CJ_Cab_F4E. It was confirmed that it can be (Fig. 10a).
  • CJ_Ckr_F4E showed similar activity to that of the control group when MgSO 4 was added, but the activity was increased by about 2 times by the addition of MnSO 4 to increase the fructose-4-epimerization activity of CJ_Ckr_F4E. It was confirmed that it can (Fig. 10b).
  • Example 5-1 Tagatose Diphosphate Aldolase Preparation of Recombinant Vectors and Recombinant Microorganisms Comprising Genes
  • tagatose-diphosphate aldolase gene information derived from Caldiline aerophila was obtained to prepare E. coli-expressable vectors and transformed microorganisms.
  • Tagatose-diphosphate aldolase gene sequence is selected from the gene sequence and E. coli can be expressed on the basis of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) and base sequence (SEQ ID NO: 18) information of each microorganism.
  • Recombinant vector pET21a-CJ_CAE_F4E was cloned
  • PCR conditions were denatured at 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C 30 seconds denaturation, 65 ° C. After 30 seconds of annealing and stretching at 72 ° C. for 2 minutes was repeated 35 times, an extension reaction was performed at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the recombinant vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) by heat shock transformation (Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001) to prepare a recombinant microorganism, and then used by freezing stored in 50% glycerol.
  • the recombinant microorganisms were named E. coli BL21 (DE3) / CJ_CAE_F4E, respectively, and deposited on March 23, 2018 at the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty. KCCM 12233P was given.
  • each recombinant microorganism E. coli BL21 (DE3) / prepared in Example 5-1 To prepare the recombinant enzyme CJ_CAE_F4E from CJ_CAE_F4E, the recombinant microorganism was inoculated into a culture tube containing 5 mL of LB liquid medium containing ampicillin antibiotics and a 37 ° C. shaker incubator at 600 nm until absorbance was 2.0. The seed culture was carried out at. The seed cultured culture was inoculated into a culture flask containing a liquid medium containing LB and lactose, a protein expression regulator, to carry out the main culture.
  • the seed culture and main culture were carried out at a stirring speed of 180 rpm and 37 °C conditions. Thereafter, the culture solution was recovered after centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes at 8,000 rpm. The recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, and washed in 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 10 mM imidazole and 300 mM NaCl. Suspended. The suspended cells were disrupted using a sonicator, and the cell debris was centrifuged at 4 ° C. at 13,000 rpm for 20 minutes, and only the supernatant was taken.
  • the supernatant was purified using His-taq affinity chromatography, and 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl was flown at 10 times the amount of the filler to yield nonspecific binding. Possible protein was removed. Thereafter, 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 250 mM imidazole and 300 mM NaCl was further eluted and purified. The enzyme was purified by dialysis with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer. Purified enzyme CJ_CAE_F4E for characterization was obtained.
  • Example 6-1 Tagatose Diphosphate Aldolase Preparation of Recombinant Vectors and Recombinant Microorganisms Comprising Genes
  • Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus to discover novel heat-resistant fructose-4-epimerase
  • the derived tagatose-diphosphate aldolase gene information was secured to prepare E. coli-expressable vectors and transformed microorganisms.
  • ThermoErobacter thermohydrosulfuricus is registered in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEG) and National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • KEG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • a tagatose-diphosphate aldolase gene sequence is selected from the gene sequence, and the E. coli-expressing recombinant vector comprising the base sequence of the enzyme based on the microbial amino acid sequence (SEQ ID NO: 19) and the base sequence (SEQ ID NO: 20) information pBT7-C-His-CJ_TATH_F4E was synthesized (Bionia, South Korea).
  • the recombinant vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) by heat shock transformation (Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001) to prepare a recombinant microorganism, and then used by freezing stored in 50% glycerol.
  • the recombinant microorganisms were named E. coli BL21 (DE3) / CJ_TATH_F4E, respectively, and were deposited on March 23, 2018 at the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty, with accession number KCCM12234P. Was given.
  • Recombinant microorganism E. coli BL21 (DE3) / prepared in Example 6-1 To prepare the recombinant enzyme CJ_TATH_F4E from CJ_TATH_F4E, the recombinant microorganism was inoculated into a culture tube containing 5 mL of LB liquid medium containing ampicillin antibiotics and a 37 ° C. shake incubator at 600 nm until absorbance was 2.0. The seed culture was carried out at. The seed cultured culture was inoculated into a culture flask containing a liquid medium containing LB and lactose, a protein expression regulator, to carry out the main culture. The seed culture and main culture were carried out at a stirring speed of 180 rpm and 37 °C conditions.
  • the culture solution was recovered after centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes at 8,000 rpm.
  • the recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, and washed in 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 10 mM imidazole and 300 mM NaCl. Suspended.
  • the suspended cells were disrupted using a sonicator, and the cell debris was centrifuged at 4 ° C. at 13,000 rpm for 20 minutes, and only the supernatant was taken.
  • the supernatant was purified using His-taq affinity chromatography, and 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl was flown at 10 times the amount of the filler to yield nonspecific binding. Possible protein was removed. Thereafter, 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 250 mM imidazole and 300 mM NaCl was further eluted and purified. The enzyme was purified by dialysis with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer. Purified enzyme CJ_TATH_F4E for characterization was obtained.
  • Example 7 Tagatose- Diphosphate Aldolize Manufacture and activity evaluation
  • Example 7-1 Tagatose Diphosphate Aldolase Preparation of Recombinant Vectors and Recombinant Microorganisms Comprising Genes
  • E. coli-expressing vectors and transformed microorganisms were prepared by obtaining tagatose-diphosphate aldolase gene information derived from Acidobacteriales bacterium.
  • Ecidobacteria bacterium registered in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEG) and National Center for Biotechnology Information (NCBI)
  • KEG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • a tagatose-diphosphate aldolase gene sequence is selected from the gene sequence, and the E. coli-expressable recombinant vector comprising the base sequence of the enzyme based on the microorganism amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and base sequence (SEQ ID NO: 4) information pBT7-C-His-CJ_AB_F4E was synthesized (Bionia, South Korea).
  • the recombinant vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) by heat shock transformation (Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001) to prepare a recombinant microorganism, and then used by freezing stored in 50% glycerol.
  • the recombinant microorganisms were named E. coli BL21 (DE3) / CJ_AB_F4E, respectively, and were deposited on March 23, 2018 at the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty, with accession number KCCM12237P. Was given.
  • Recombinant microorganism E. coli BL21 (DE3) / prepared in Example 7-1 To prepare the recombinant enzyme CJ_AB_F4E from CJ_AB_F4E, the recombinant microorganism was inoculated into a culture tube containing 5 mL of LB liquid medium containing ampicillin antibiotics and a 37 ° C. shake incubator at 600 nm until absorbance was 2.0. The seed culture was carried out at. The seed cultured culture was inoculated into a culture flask containing a liquid medium containing LB and lactose, a protein expression regulator, to carry out the main culture. The seed culture and main culture were carried out at a stirring speed of 180 rpm and 37 °C conditions.
  • the culture solution was recovered after centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes at 8,000 rpm.
  • the recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, and washed in 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 10 mM imidazole and 300 mM NaCl. Suspended.
  • the suspended cells were disrupted using a sonicator, and the cell debris was centrifuged at 4 ° C. at 13,000 rpm for 20 minutes, and only the supernatant was taken.
  • the supernatant was purified using His-taq affinity chromatography, and 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl was flown at 10 times the amount of the filler to yield nonspecific binding. Possible protein was removed. Thereafter, 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer containing 250 mM imidazole and 300 mM NaCl was further eluted and purified. The enzyme was purified by dialysis with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer. Purified enzyme CJ_AB_F4E for characterization was obtained.

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Abstract

본 출원은 과당-4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법
본 출원은 과당-4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.
타가토스는 우유, 치즈 및 카카오 등의 식품, 그리고 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연감미료이다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며, GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 물리적 성질이 유사하고, 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 설탕 대체 감미료로 여러 제품에 이용될 수 있다.
종래 공지되거나 공용된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적 방법(촉매 반응)과 생물학적 방법(이성화 효소반응)이 있다(PCT WO 2006/058092, 대한민국 등록특허 제10-0964091호 및 제10-1368731호 참조). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 주원료로 사용되는 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격이 불안정하여 안정적 수급에 한계가 있으므로, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 요구되어 연구된 바 상기 문헌들은 포도당과 갈락토스 및 과당으로부터 각각 갈락토스, 사이코스 및 타가토스를 생산하는 방법을 개시하고 있다(대한민국 등록특허 제10-744479호, 제10-1057873호 및 제10-1550796호).
한편, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)는 하기 [반응식 1]과 같이 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여함이 공지된 바 있으나, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 타가토스를 생산하는 활성을 가지는지에 대한 연구는 전무하다.
[반응식 1]
D-타가토스 1,6-이인산 <=> 글리세론 포스페이트 + D-글리세랄데하이드 3-포스페이트
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 가지는 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)가 과당을 타가토스로 전환시키는 기능이 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 목적은 타가토스 제조에 유용한 조성물을 제공하기 위한 것으로, 상기 조성물은 타가토스-이인산 알돌레이즈, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함한다.
본 출원의 다른 목적은 본 출원의 과당-4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시켜 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 일 양태로서 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.
상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)로서 예를 들어 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있다면 한정 없이 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율=타가토스 중량/초기 과당 중량 *100)이 0.01% 이상, 구체적으로 0.1% 이상, 더욱 구체적으로 0.3% 이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 40%의 범위, 0.1% 내지 30%의 범위, 0.3% 내지 25%의 범위, 또는 0.3% 내지 20%의 범위일 수 있다.
구체적으로 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이거나, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19 의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능(즉, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 과당-4-에피머화 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 이르러 '타가토스-이인산 알돌레이즈'가 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당을 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 나타냄을 밝혀내었으며 따라서 본원에서는'과당-4-에피머화 효소'와 호환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있고, 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 썸언에어로드릭스 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 코스모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 로도써무스 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 림노초르다 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 칼디스리스 sp, 칼디리네 sp, 써모언에로박터 sp, 에시도박테리알레스 sp또는 칼디셀룰로시럽터 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 구체적으로는, 썸언에어로드릭스 데센시스(Thermanaerothrix daxensis), 코스모토가 올레아리아(Kosmotoga olearia), 로도써무스 프로펀디(Rhodothermus profundi), 로도써무스 마리너스(Rhodothermus marinus), 림노초르다 필오사(Limnochorda pilosa), 칼디스리스 아비시 (Caldithrix abyssi), 칼디리네 에로필라 (Caldilinea aerophila) 써모언에로박터 써모하이드로썰퓨리쿠스 (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus), 에시도박테리알레스 박테리움 (Acidobacteriales bacterium) 또는 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스 (Caldicellulosiruptor kronotskyensis) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 보다 구체적으로는, Rhodothermus profundi DSM 22212, 또는 Rhodothermus marinus ATCC 43812 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있다.
본원의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환시키는 특징이 있다. 상기 과당-4-에피머화 효소는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase) 활성을 가지며, D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여하는 것으로 알려져 있었다. 본 출원에 이르러, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 새로이 밝혀 내었다. 이에, 본 출원의 일 구현예는 과당으로부터 타가토스를 제조함에 있어서 타가토스-이인산 알돌레이즈를 과당-4-에피머화 효소로 사용하는 것을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈의 신규 용도에 관한 것이다. 또한, 본 출원의 일 구현예는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 과당-4-에피머화 효소로 사용하여 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 55℃ 내지 60℃, 60℃ 내지 70℃, 55℃, 60℃, 또는 70℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다.
나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 서열번호 1로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 3로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 5로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 7로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 9로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 11로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 13로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 15로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열에 의해 ; 서열번호 17로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 19로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열에 의해 각각 암호화되는 것일 수 있다.
본 출원의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 본 출원의 상기 효소 또는 이의 변이체를 발현하는 DNA, 예컨대, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20 으로 E. coli 등의 균주에 형질전환시킨 다음, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제하여 수득한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주는 대장균(Escherichia coli) 외에도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다.
구체예에서, 이러한 형질전환된 균주로 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E.coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_RM_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_Cab_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_또는 E. coli BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E이며, 이들은 각각 순서대로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11995P(기탁일: 2017년 3월 20일), 기탁번호 KCCM11999P(기탁일: 2017년 3월 24일), KCCM12097P(기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12096P(기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12095P(기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12107P(기탁일: 2017년 9월 13일) 및 KCCM12108P(기탁일: 2017년 9월 13일), KCCM12233P(기탁일: 2018년 3월 23일), KCCM12234P(기탁일: 2018년 3월 23 일) 및 KCCM12237P(기탁일: 2018년 3월 23 일)로 기탁하였다.
본 출원에서 사용되는 과당-4-에피머화 효소는 이를 암호화하는 핵산을 이용하여 제공될 수 있다.
본 출원에서 용어 "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).
상기 핵산은 본 출원의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 과당-4-에피머화 효소와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지면서 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산일 수 있다. 구체적으로, 예컨데 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 2의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있다. 또한, 예컨데, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 과당-4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 4의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있으며, 이는 본원에 기술된 다른 아미노산 서열의 효소를 암호화하는 핵산에도 적용될 수 있다. 더불어, 본 출원의 핵산은 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소로 번역될 수 있는 핵산을 포함할 수 있고, 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 역시 포함할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 사용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 벡터는 본 출원의 핵산이 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다. 본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)와 같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 출원에서 이용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 핵산 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 미생물의 예로는 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_RM_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_Cab_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E 이 있다.
본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25 내지 40 ℃, 구체적으로는 30 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 추가로 과당을 포함할 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 과당을 직접 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 것으로서, 기질인 과당 이외에 다른 효소를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 전분 포스포릴라아제(starch phosphorylase), 말토덱스트린 포스포릴라아제(maltodextrin phosphorylase) 또는 수크로오스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물;
포도당 인산화 효소(glucokinase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물;
타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물; 및/또는
α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 또는 이소아밀라아제(isoamylase); 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈, 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 MgSO4, NiSO4, NiCl2, MgCl2, MnCl2 또는 MnSO4일 수 있다.
본 출원은 다른 양태로서, 과당(D-fructose)을 본 출원의 과당-4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.
일 구현예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속 존재하에서 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 금속은 전술한 양태에서와 같다.
본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.
다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결정화를 수행할 수 있다.
다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.
다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가 단계를 통해 타가토스를 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 과당의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.
본 출원의 과당-4-에피머화 효소인 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성이 우수하여 산업적으로 타가토스 생산이 가능하고, 보편화된 당인 과당을 타가토스로 전환하는 바 경제성이 높은 효과가 있다.
도 1은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소들 (CJ_TD_F4E, CJ_KO_F4E)이 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 2는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소들 (CJ_TD_F4E, CJ_KO_F4E)의 과당-4-에피머화 활성에 있어서 온도 변화에 따른 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 나타내는 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 4a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RP_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RM_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RP_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RM_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_LP_F4E 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 나타내는 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 7a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_LP_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 7b은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_LP_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 8a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 CJ_Cab_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 8b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Ckr_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 9a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Cab_F4E의 온도에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Ckr_F4E의 온도에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Cab_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Ckr_F4E의 금속첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 11은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_CAE_F4E 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 12는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_TATH_F4E 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 13은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_AB_F4 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1: 타가토스-이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가
실시예 1-1: 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터들 및 형질전환체들의 제조
신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 제공하기 위해 써마네로트릭스 다센시스 (Thermanaerothrix daxensis), 코스모토가 오엘리아 (Kosmotoga olearia)에서 유래한 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물(형질전환체)을 제조하였다.
구체적으로, 상기 유전자 3종 중 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 써마네로트릭스 다센시스, 아네로리네아 써모필리아, 코스모토가 오엘리아 유전자 서열들을 대상으로 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하였고, 써마네로트릭스 다센시스의 아미노산 서열 (서열번호 1)과 염기 서열 (서열번호 2), 코스모토가 오엘리아의 아미노산 서열 (서열번호 5)과 염기 서열 (서열번호 6)를 바탕으로 대장균 발현 가능 벡터인 pBT7-C-His에 삽입하여 제작된 재조합 발현벡터를 바이오니아에 합성 의뢰하였다.
단백질 발현을 유도하고자 대장균 발현용 균주인 BL21(DE3)에 형질 전환하였고, 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E로 명명하였다. 부다페스트 조약 하에 상기 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E는 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11995P로 기탁되었고, 상기 E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E는 2017년 3월 24일에 기탁번호 KCCM11999P로 기탁되었다.
실시예 1-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제
재조합 효소를 제조하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제조된 형질전환체인 E.coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E . coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E 를 앰피실린 (ampicillin)이 포함된 LB 액체배지 5ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질발현조절인자인 락토스가 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 배양 과정 중의 교반속도는 180rpm이며, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 10mM 이미다졸(imidazole)과 300mM NaCl이 포함되어 있는 50mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하였으며, 세포 파쇄물은 13,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액은 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제되었고, 20mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 최종 250mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 흘려주어 용출 정제하였으며, 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석 후 효소 특성 분석을 위한 효소를 확보하였다.
실시예 1-3 : 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가
상기 실시예 1-2에서 얻어진 효소들의 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당을 사용하였고, 여기에 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM CoSO4, 상기 실시예 2에서 분리된 20mg/ml 정제효소를 첨가하여 온도 60℃에서 2시간 반응하였다. 과당-4-에피머화 효소 3종, CJ_TD_F4E, 및 CJ_KO_F4E 에 의해 전환된 타가토스의 농도 및 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율을 확인한 결과, CJ_TD_F4E의 경우, 4.6 %였고, CJ_KO_F4E의 경우, 16.0 %였다. 상기 전환율은 다음 식으로 산출되었다: 전환율=타가토스 중량/초기과당 중량 X 100
또한, 반응 후 잔존하는 과당과 생성물인 타가토스의 경우 HPLC를 이용하여 정량하였다. 사용한 컬럼은 Shodex Sugar SP0810이고, 컬럼 온도를 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1ml/분으로 흘려주었다. 도 1에 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 과당을 기질로 하는 상기 효소의 반응을 나타내는 피크를 검출 정량하였다.
실시예 1-4 : 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향
본 출원의 효소의 에피머화 활성에 대한 온도 영향성을 조사하기 위하여 과당을 포함하는 50mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 상기 실시예 1-2에서 제조된 1mg/ml 정제효소를 각각 첨가하여 50℃ 내지 80℃에서 3시간 반응하였고, 반응 완료액은 HPLC를 이용하여 타가토스를 정량 분석하였다. 그 결과, 본 출원의 효소 2종은 모두 70℃에서 최대활성을 나타내었다(도 2).
실시예 2 : 타가토스-이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가
실시예 2-1: 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조
본 출원에 따른 신규한 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 로도써머스 프로펀디(Rhodothermus profundi) DSM 22212, 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus) ATCC 43812 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록된 로도써머스 프로펀디, 로도써머스 마리너스 ATCC 43812 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 2종 미생물의 아미노산 서열(서열번호 7 및 9)과 염기 서열(서열번호 8 및 10) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_RP_F4E, pBT7-C-His-CJ_RM_F4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).
상기 각각의 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/ CJ_RM_F4E로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 08월 11일자로 기탁하여 각각 KCCM12097P, KCCM12096P를 부여받았다.
실시예 2-2: 재조합 효소의 제조 및 정제
상기 실시예 2-1에서 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_RM_F4E로부터 재조합 효소를 제조하기 위하여, 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위하여 정제효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E를 각각 확보하였다.
실시예 2-3: 과당으로부터 타가토스로의 전환 및 활성 확인
상기 실시예 2-2에서 확보한 본 출원 재조합 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO4 및 각 20 mg/mL CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E를 첨가하여 60℃에서 10시간 동안 반응시켰다.
반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 사용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 3).
실험 결과, 본 출원 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E 효소반응에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 각각 5.7% 및 11.1%으로 확인되었다.
실시예 2-4: 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인
상기 실시예 2-2에서 제조한 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH8.0) 완충용액에, 각 1 mg/mL의 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 및 70℃의 다양한 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 완료 후 반응물 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
실험 결과, CJ_RP_F4E는 65℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 60℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 70% 이상, 모든 온도 범위에서 최대 활성의 50% 이상을 유지하였다(도 4a). 그리고, CJ_RM_F4E는 70℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 55℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 70% 이상, 모든 온도 범위에서 최대 활성의 40% 이상을 유지하였다(도 4b).
실시예 2-5: 금속이온 첨가에 따른 본 발명 재조합 효소의 활성 확인
상기 실시예 2-2에서 제조한 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 금속이온별 영향력을 확인하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 각 1 mg/mL의 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E와 각 1 mM의 다양한 금속이온(ZnSO4, MgCl2, MnCl2, NH4Cl, CaCl2, Na2SO4, CuSO4, MgSO4, MnSO4, (NH4)2SO4 또는 NiSO4)을 첨가하여 60℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 완료후 반응물의 타가토스를 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
실험 결과, CJ_RP_F4E는 NiSO4 각각의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 니켈 이온이 활성을 증가시킬 수 있고(도 5a), CJ_RM_F4E는 MnSO4 및 NiSO4 각각의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 망간 또는 니켈 이온이 본 출원 재조합 효소의 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 5b).
실시예 3 : 타가토스-이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가
실시예 3-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조
본 발명자들은 림노코르다 필로사(Limnochorda pilosa) DSM 28787 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
더욱 구체적으로는, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 ENA(European Nucleotide Archive)에 등록된 림노코르다 필로사 유전자 서열을 대상으로 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하여, 림노코르다 필로사 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 CJ_LP_F4E의 아미노산 서열(서열번호 11) 및 염기서열(서열번호 12)을 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 발현벡터 pBT7-C-His-CJ_LP_F4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).
상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 08월 11일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12095P를 부여받았다.
실시예 3-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제
상기 실시예 3-1에 따라 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E, 유래의 CJ_LP_F4E 로부터 본 출원 재조합 효소를 수득하기 위하여, 상기 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이어서, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 다음, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였고 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_LP_F4E 를 확보하였다.
실시예 3-3 : 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가
상기 실시예 3-2에서 확보한 본 출원 재조합 효소 CJ_LP_F4E의 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO4 , 및 각 20 mg/mL의 CJ_LP_F4E 를 첨가하여 60℃에서 10시간 동안 반응시켰다.
반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 6).
실험 결과, 본 출원 각 효소에 의하여 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율은 CJ_LP_F4E를 이용한 경우 9.5 %임을 확인하였다.
실시예 3-4 : 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인
상기 실시예 3-2에서 수득한 본 출원 재조합 효소 CJ_LP_F4E 의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에 1mg/mL CJ_LP_F4E 를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃의 다양한 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 반응액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
실험 결과, 본 출원 CJ_LP_F4E 효소는 60℃에서 최대활성을 나타내었으며, CJ_LP_F4E는 45℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 이상을 유지함을 확인할 수 있었다(도 7a).
실시예 3-5 : 금속이온 첨가에 따른 재조합 효소의 활성 확인
종래 공지된 이성화 효소, 예컨대 포도당 이성화 효소 및 아라비노스 이성화 효소 및 에피머효소, 예컨대 사이코스 3-에피머화 효소는 금속이온을 요구하는 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 실시예 3-2에서 수득한 본 출원 재조합 효소 CJ_LP_F4E도 금속이온이 과당-4-에피머화 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.
더욱 구체적으로, 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에, 2 mg/mL의 CJ_LP_F4E 를 첨가하고, 다양한 금속이온 NiSO4, CaCl2, ZnSO4, MgSO4, MnSO4, FeSO4, CuSO4, 또는 (NH4)2SO4 을 각 1 mM씩 첨가하여 효소활성을 측정하였다. 금속이온을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 설정하였다. 상기 반응이 완료된 후 반응액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
실험 결과, 본 출원 CJ_LP_F4E 효소는 각 MnSO4, NiSO4 의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 망간이온이나 니켈이온 등 금속이온의 요구성이 있음을 알 수 있었다. 특히, NiSO4를 첨가한 경우 최대 활성을 보임을 확인하였다(도 7b).
실시예 4 : 타가토스-이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가
실시예 4-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조
신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 칼디스리스 아비시 (Caldithrix abyssi) DSM 13497 및 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스 (Caldicellulosiruptor kronotskyensis ) DSM 18902 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 칼디스리스 아비시 DSM 13497 및 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 각각의 아미노산 서열(서열번호 13 및 15)과 염기 서열(서열번호 14 및 16) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_Cab_F4E 및 pBT7-C-His-CJ_Ckr_F4E를 합성하였다(㈜바이오니아, 대한민국).
상기 각 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 9월 13일자로 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM12107P 및 KCCM12108P를 부여받았다.
실시예 4-2: 재조합 효소의 제조 및 정제
상기 실시예 4-1에서 제조한 각 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E로부터 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 제조하기 위하여, 각각의 재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 확보하였다.
실시예 4-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가
상기 실시예 4-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 10 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO4 및 각 5 mg/ml의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 첨가하여 60℃에서 24시간 반응시켰다.
반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다.
그 결과, 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 각각 3.8% 및 4.0% 임을 확인하였다(도 8a 및 도 8b).
실시예 4-4: 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인
상기 실시예 4-2에서 수득한 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E 의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도 영향력을 조사하기 위하여 5 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH8.0) 완충용액에, 각 5 mg/ml의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E 를 첨가하여 각 37℃, 40℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃에서 5시간 반응시켰다. 반응 완료액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다. 그 결과, CJ_Cab_F4E는 55℃에서, CJ_Ckr_F4E는 60℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 두 효소 모두 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 75% 이상의 활성을 나타냄을 확인하였다(표 1, 도 9a 및 9b).
[표 1] 온도별 상대활성(%)
Figure PCTKR2018003768-appb-I000001
실시예 4-5: 금속 첨가에 따른 본 출원 재조합 효소의 활성 확인
상기 실시예 4-2에서 수득한 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E의 금속이 과당-4-에피머화 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 5 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 각 5 mg/mL의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E과 1 mM 금속이온(MgSO4 또는 MnSO4)을 첨가하여 60℃에서 5시간 반응시켰다. 금속이온을 처리하지 않은 경우를 대조군(w/o)으로 설정하였다. 상기 반응이 완료된 후 반응 완료액의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
그 결과, CJ_Cab_F4E은 MnSO4의 첨가에 의하여 약 2배, MgSO4의 첨가에 의하여 10배 이상 활성이 증가하여 망간 또는 마그네슘 이온(또는, 이의 염)이 CJ_Cab_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 10a). 또한, CJ_Ckr_F4E는 MgSO4 첨가시 대조군과 유사한 활성을 보였으나, MnSO4의 첨가에 의하여 활성이 약 2배 증가하여 망간 이온(또는, 이의 염)이 CJ_Ckr_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 10b).
실시예 5 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가
실시예 5-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조
신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 칼디리네 에로필라 (Caldilinea aerophila) 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 칼디리네 에로필라 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 각각의 아미노산 서열(서열번호 17)과 염기 서열(서열번호 18) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pET21a-CJ_CAE_F4E를 클로닝하였다
재조합 발현벡터를 사용하기 위해, 칼디리네 에로필라 Genomic DNA를 이용하여, 프라이머 1: ATATACATATGTCAACACTTCGCCACATCATTTTGCGA 과 프라이머 2: TGGTGCTCGAGTCCAAGCAATGTAGCGGCGTCGTA를 이용하여, PCR 조건은 94 ℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 65℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 신장을 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 신장반응을 수행하였다.
상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM 12233P 를 부여받았다.
실시예 5-2: 재조합 효소의 제조 및 정제
상기 실시예 5-1에서 제조한 각 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/ CJ_CAE_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_CAE_F4E 를 제조하기 위하여,재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_CAE_F4E 를 확보하였다.
실시예 5-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가
상기 실시예 5-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_CAE_F4E 의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 10 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO4 및 각 20mg/ml의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 첨가하여 60℃에서 24시간 반응시켰다.
반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다.
그 결과, 재조합 효소 CJ_CAE_F4E 에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 1.8% 임을 확인하였다(도 11).
실시예 6 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가
실시예 6-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조
신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 써모언에로박터 써모하이드로썰퓨리쿠스 (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus) 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 써모언에로박터 써모하이드로썰퓨리쿠스 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 아미노산 서열(서열번호 19)와 염기 서열(서열번호 20) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_TATH_F4E를 합성하였다(㈜바이오니아, 대한민국).
상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12234P를 부여받았다.
실시예 6-2: 재조합 효소의 제조 및 정제
상기 실시예 6-1에서 제조한 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/ CJ_TATH_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_TATH_F4E 를 제조하기 위하여,재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_TATH_F4E 를 확보하였다.
실시예 6-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가
상기 실시예 6-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_TATH_F4E 의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO4 및 각 5mg/ml의 CJ_TATH_F4E 를 첨가하여 60℃에서 24시간 반응시켰다.
반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다.
그 결과, 재조합 효소 CJ_TATH_F4E 에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 2.9% 임을 확인하였다(도 12).
실시예 7 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가
실시예 7-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조
신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 에시도박테리알레스 박테리움 (Acidobacteriales bacterium) 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 에시도박테리알레스 박테리움 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 아미노산 서열(서열번호 3)와 염기 서열(서열번호 4) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_AB_F4E 합성하였다(㈜바이오니아, 대한민국).
상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12237P를 부여받았다.
실시예 7-2: 재조합 효소의 제조 및 정제
상기 실시예 7-1에서 제조한 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/ CJ_AB_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_AB_F4E 를 제조하기 위하여,재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_AB_F4E 를 확보하였다.
실시예 7-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가
상기 실시예 7-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_AB_F4E 의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 1 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO4 및 각 10 mg/ml의 CJ_AB_F4E 를 첨가하여 55℃에서 24시간 반응시켰다.
반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다.
그 결과, 재조합 효소 CJ_AB_F4E 에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 각각 8% 임을 확인하였다(도 13).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2018003768-appb-I000002
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Figure PCTKR2018003768-appb-I000004
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Figure PCTKR2018003768-appb-I000007
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Figure PCTKR2018003768-appb-I000009
Figure PCTKR2018003768-appb-I000010
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Claims (6)

  1. 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈를 하나 이상 포함하는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 썸언에어로드릭스 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 언에어로리네 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 코스모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 로도써무스 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 림노초르다 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 칼디스리스 sp 또는 칼디셀룰로시럽터 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체로부터 유래된 것인, 타가토스 생산용 조성물.
  5. 과당을, 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행하는, 타가토스 제조방법.
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