[go: up one dir, main page]

WO2018208120A2 - 바이오매스에서 유래한 탄소원의 고성능 대사를 위한 신규 미생물 균주 - Google Patents

바이오매스에서 유래한 탄소원의 고성능 대사를 위한 신규 미생물 균주 Download PDF

Info

Publication number
WO2018208120A2
WO2018208120A2 PCT/KR2018/005437 KR2018005437W WO2018208120A2 WO 2018208120 A2 WO2018208120 A2 WO 2018208120A2 KR 2018005437 W KR2018005437 W KR 2018005437W WO 2018208120 A2 WO2018208120 A2 WO 2018208120A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
gene
represented
strain
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/005437
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2018208120A3 (ko
Inventor
정규열
곽동훈
서상우
임현규
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SNU R&DB Foundation
POSTECH Academy Industry Foundation
Original Assignee
Seoul National University R&DB Foundation
POSTECH Academy Industry Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seoul National University R&DB Foundation, POSTECH Academy Industry Foundation filed Critical Seoul National University R&DB Foundation
Priority to US16/612,300 priority Critical patent/US11535854B2/en
Publication of WO2018208120A2 publication Critical patent/WO2018208120A2/ko
Publication of WO2018208120A3 publication Critical patent/WO2018208120A3/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/625—Streptoverticillium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/63—Vibrio
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • C12Y306/03001—Phospholipid-translocating ATPase (3.6.3.1), i.e. Mg2+-ATPase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to novel microorganisms capable of rapidly metabolizing various carbon sources.
  • brown algae (Brown macroalgae, kelp, etc.) is attracting attention as a next-generation raw material.
  • Brown algae have a higher fixed carbon dioxide rate than existing land plants, and due to the fast growth rate, large amounts of biomass can be secured.
  • the fermentation process is not inhibited because there is no lignin, and an expensive pretreatment process is not necessary.
  • the carbon source abundant in brown algae is alginic acid (a homopolymer of ⁇ -L-guluornate and ⁇ -D-mannuuronate), and industrial microorganisms do not contain alginic acid metabolic cycles and cannot metabolize.
  • microorganisms capable of rapidly metabolizing various carbon sources, including alginic acid, and a technique for converting them into high value-added compounds through appropriate genetic engineering improvements. Securing and developing such strains can greatly contribute to the sustainable production of various materials such as biofuels, platform compounds, and pharmaceuticals from various biomasses.
  • the present inventors have completed the present invention by developing microorganisms capable of rapidly metabolizing various carbon sources in order to produce environmentally friendly compounds produced by conventional petrochemical processes.
  • Vibrio genus DHG strain ( Vibrio) having accession number KCTC13239BP having a carbon source high-performance metabolic circuit sp. DHG).
  • Another object of the present invention is to provide a transformed Vibrio genus DHG strain in which a gene encoding a gamma protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is introduced into the DHG strain.
  • Still another object of the present invention is to provide a transformed strain for lycopene production, wherein the transformed DHG strain has introduced the crtEBI gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • Still another object of the present invention is the budA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, the budB gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, and the budC gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 to the transformed DHG strain.
  • One or more genes selected from the group consisting of is introduced, to provide a transformation strain for producing 2,3-butanediol.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing lycopene, comprising culturing the transforming strain for lycopene production.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing 2,3-butanediol, comprising culturing the transformed strain for producing 2,3-butanediol.
  • Still another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the SXT recombination system expression cassette, flippase gene expression cassette, crtEBI gene expression cassette or BudACB operon expression cassette.
  • the present invention has a carbon source high-performance metabolic circuit, accession number KCTC13239BP, Vibrio genus DHG strain ( Vibrio sp. DHG).
  • the present invention provides a transformed Vibrio genus DHG strain wherein the gene encoding the gamma protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is introduced into the DHG strain.
  • the present invention provides a transformed strain for lycopene production that the crtEBI gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 is introduced into the transformed DHG strain.
  • the present invention is a group consisting of the budA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, the budB gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 and the budC gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 to the transformed DHG strain
  • the budA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 the budB gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14
  • the budC gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 to the transformed DHG strain
  • one or more genes selected from are introduced, 2,3-butanediol transformation strain.
  • the present invention provides a method for producing lycopene, comprising culturing the transforming strain for lycopene production.
  • the present invention provides a method for producing 2,3-butanediol, comprising culturing the transformed strain for producing 2,3-butanediol.
  • the present invention is selected from the group consisting of a gene encoding beta, exo and gamma proteins and a promoter represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of synthetic 5 'UTR (untranslated region), SEQ ID NOs: 22 to 35 and 56
  • An SXT recombinant system expression cassette is provided, comprising one or more genes.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the SXT recombination system expression cassette.
  • the present invention comprises a gene encoding a promoter and flippase (flippase) represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of synthetic 5 'UTR, SEQ ID NOs: 22 to 35 and 58, flippase gene expression Provide a cassette.
  • flippase flippase
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the flippase gene expression cassette.
  • the present invention also provides a crtEBI gene expression cassette comprising a crtEBI gene and a promoter represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of synthetic 5 ′ UTR, SEQ ID NOs: 22 to 35 and 60.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the crtEBI gene expression cassette.
  • the present invention is a synthetic 5 'UTR, a promoter represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22 to 35 and 68 and at least one gene selected from the group consisting of genes encoding BudA, BudC and BudB proteins It provides, BudACB operon expression cassette comprising.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the BudACB operon expression cassette.
  • Vibrio according to the invention sp. DHG strain has a very high growth rate compared to microorganisms such as Escherichia coli in the smallest medium / nutrition medium, shows resistance at high initial sugar / salt concentration, and can produce lycopene and 2,3-butanediol through genome manipulation. It can be used in various fields in the production of high value-added compounds using microorganisms.
  • FIG. 3 is Vibrio according to the present invention sp. Figure showing the resistance to salt concentration in the medium of the DHG strain.
  • FIG. 5 is Vibrio according to the present invention through colony PCR sp. Figure showing the results of confirming the introduction of the plasmid pACYC and pUC in the DHG strain.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of confirming the degree of fluorescence expression of the transformed strain according to the synthetic promoter sequence.
  • FIG. 8 is a view showing the results of confirming the degree of fluorescence expression of the transforming strain according to 5 'UTR sequence.
  • FIG. 9 is a diagram showing a cleavage map of the plasmid pACYCA_SXT according to the present invention for gamma protein expression.
  • FIG. 10 is a diagram showing a cleavage map of the plasmid pRSF_FLP containing the antibiotic resistance gene according to the present invention.
  • 11 is a vibrio according to the present invention sp. It is a figure which shows the schematic diagram of the genome manipulation method of DHG strain.
  • FIG. 12 is a vibrio according to the present invention sp.
  • Figure 2 shows the structure and targeting sites of double stranded DNA used for genome manipulation of DHG strains.
  • FIG. 13 is a vibrio according to the present invention sp.
  • FIG. 14 is a diagram showing a cleavage map of the plasmid pACYC_BudACB for 2,3-butanediol production according to the present invention.
  • Figure 15 shows the results of confirming the gene deletion of the transforming strain for producing 2,3-butanediol according to the present invention by colony PCR.
  • Figure 16 is a view showing the results of measuring the metabolite and 2,3-butanediol production of the transforming strain for producing 2,3-butanediol according to the present invention.
  • 17 is a diagram showing a cleavage map of the plasmid pACYC_idi_ispA_crtEBI for lycopene production according to the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram showing a cleavage map of the plasmid pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs for lycopene production according to the present invention.
  • the invention is Vibrio genus DHG strain ( Vibrio) , having accession number KCTC13239BP, having a carbon source high performance metabolic circuit sp . DHG).
  • carbon source means a carbon compound that is absorbed by a living body and used as a bioconstituent carbon, and in culturing a strain, a carbon source is used to identify a nutrient source and a physiological relationship. And growth characteristics.
  • the carbon source may be a saccharide or sugar alcohol, more specifically glucose, mannitol, sucrose, arabinose, galactose, glycerol, xylose, mannose, fructose, lactose, maltose, sucrose, alginic acid, cellulose, dextrin, glycogen , Hyaluronic acid, lentinan, zymoic acid, chitosan, glucan, lignin and pectin may be one or more selected from the group consisting of, preferably in the group consisting of glucose, mannitol, alginic acid, sucrose, arabinose, galactose and glycerol One or more selected, but is not limited thereto.
  • the "carbon source high performance metabolic circuit” means a metabolic circuit including an enzyme capable of metabolizing various sugars or sugar alcohols, and the microorganism having a carbon source high performance metabolic circuit includes one or more sugars or sugar alcohols. Mixed sugars can be used as the carbon source.
  • the strain comprises a 16S rDNA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • gene should be considered in the broadest sense and may encode structural or regulatory proteins.
  • the regulatory protein includes a transcription factor, a heat shock protein or a protein involved in DNA / RNA replication, transcription and / or translation.
  • the target gene to be suppressed expression may exist as an extrachromosomal component.
  • the strain comprises an SXT recombination system, and more specifically, the beta protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or the beta protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 It includes an exo gene represented by the nucleotide sequence or the exo protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. It may also include functional equivalents of the genes or proteins described above.
  • the term "functional equivalent” means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 70% of the nucleotide sequence of the beta or exo gene as a result of deletion, substitution or insertion of the base.
  • % sequence homology for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • Also functional equivalents have at least 80% or more, preferably 90%, more preferably 95% or more sequence homology (ie, identity) with beta or exo proteins as a result of the addition, substitution or deletion of amino acids.
  • Sequence homology and homogeneity herein is defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence relative to the amino acid sequence of the aforementioned protein after aligning the amino acid sequence and the candidate sequence of the aforementioned protein and introducing gaps. If necessary, conservative substitutions as part of sequence homogeneity are not considered in order to obtain maximum percentage sequence identity. N-terminal, C-terminal or internal elongation, deletion or insertion of the amino acid sequence of the aforementioned protein is not to be construed as a sequence affecting sequence homology or homology. The sequence homogeneity can also be determined by common standard methods used to compare similar portions of the amino acid sequences of two polypeptides.
  • Computer programs such as BLAST or FASTA align the two polypeptides so that each amino acid is optimally matched (along the full length sequence of one or two sequences or along the predicted portion of one or two sequences).
  • the program provides a default opening penalty and a default gap penalty and can be used in conjunction with a computer program (PAM250 (Standard Scoring Matrix; Dayhoff et al., In Atlas of Protein) Scoring metrics such as Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978).
  • PAM250 Standard Scoring Matrix; Dayhoff et al., In Atlas of Protein
  • Scoring metrics such as Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978.
  • the percent identity can be calculated as follows: multiply the total number of indentical matches by 100, and then align the two sequences with the length of the longer sequence in the corresponding depoted span. Divide by the sum of the number of gaps introduced into the long sequence.
  • the present inventors have isolated and identified Vibrio genus DHG strain from algae sludge, and the Vibrio genus DHG strain was deposited on April 6, 2017 at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and was given accession number KCTC13239BP.
  • the Vibrio genus DHG strain has a very high growth rate compared to microorganisms such as Escherichia coli in a minimal medium / nutrient medium, and exhibits resistance at high initial sugar / salt concentrations.
  • the genus Vibrio DHG Into the strain, a gene encoding a gamma protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 was introduced. Transformed Vibrio genus DHG Provide strains.
  • the gamma gene is preferably introduced into the Vibrio genus DHG strain using the vector pACYCA_SXT disclosed in FIG.
  • the transformed DHG strain of the present invention includes an SXT recombination system, there is an advantage that it can be transformed using a plasmid for improving E. coli, etc., which is conventionally used, and produces a high value-added compound through transformation. Strains can be produced.
  • the present invention provides a transformed strain for lycopene production, wherein the transformed DHG strain has introduced the crtEBI gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the lycopene production strain may be additionally introduced idi gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, in addition to this ispA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 is introduced It may have been.
  • the idi and ispA genes may be introduced simultaneously with the crtEBI gene, or may be introduced sequentially.
  • the crtEBI, idi and ispA genes were introduced into the transformed DHG strain using the vector pACYC_idi_ispA_crtEBI described in FIG.
  • the lycopene production strain may be additionally introduced dxs gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the dxs gene may be introduced simultaneously or sequentially with the crtEBI gene, and idi and / or ispA genes may be simultaneously or sequentially introduced with the crtEBI gene, but are not limited thereto.
  • the crtEBI, dxs, idi and ispA genes were introduced at the same time, and the genes were introduced into the transformed DHG strain using the vector pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs represented by the cleavage map shown in FIG.
  • the invention is represented by the budA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, the budB gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 to the transformed DHG strain
  • a transformation strain for producing 2,3-butanediol wherein one or more genes selected from the group consisting of the budC genes are introduced.
  • a BudABC operon composed of budA, budB and budC genes was introduced into a transformed DHG strain using the vector pACYC_BudACB represented by the cleavage map shown in FIG. 14.
  • the strain for producing 2,3-butanediol in order to improve the productivity and yield of 2,3-butanediol, the strain is idhA gene encoding the enzyme for producing lactic acid, succinic acid
  • the strain is idhA gene encoding the enzyme for producing lactic acid, succinic acid
  • frdABCD operon encoding the resulting enzyme
  • pflB gene encoding the enzyme converting pyruvate to acetyl coA are deleted.
  • 2,3-butanediol-producing strain is ldhA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, frdA gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, frdB represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18
  • frdC gene represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19
  • frdD gene represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20
  • a pflB gene represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 are deleted.
  • the gene deletion may use pRSF_FLP, which is a vector represented by a cleavage map disclosed in FIG. 10, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for producing lycopene, comprising culturing the transforming strain for lycopene production.
  • the present invention provides a method for producing 2,3-butanediol, comprising culturing the transforming strain for producing 2,3-butanediol.
  • the medium and other culture conditions used for the cultivation of the microorganism of the present invention can be used as long as the medium used for the cultivation of microorganisms of the general Vibrio genus, but must satisfy the requirements of the microorganism of the present invention as appropriate.
  • the microorganism of the present invention is cultured under aerobic conditions in a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, amino acids, vitamins and the like while controlling the temperature, pH and the like.
  • the medium may include a saccharide or sugar alcohol as a carbon source, more specifically glucose, mannitol, sucrose, arabinose, galactose, glycerol, xylose, mannose, fructose, It may be at least one selected from the group consisting of lactose, maltose, sucrose, alginic acid, cellulose, dextrin, glycogen, hyaluronic acid, lentinan, zymoic acid, chitosan, glucan, lignin and pectin, preferably glucose, mannitol, alginic acid It may include one or more selected from the group consisting of sucrose, arabinose, galactose and glycerol, but is not limited thereto.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, and the like may be used, and other amino acids, vitamins, and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without gas injection to maintain anaerobic and aerobic conditions.
  • the temperature of the culture can usually be set at 27 °C to 37 °C, preferably 30 °C to 35 °C.
  • the incubation period can continue until the desired amount of useful substance is obtained, preferably for 10 to 100 hours.
  • the compound (lycopene or 2,3-butanediol) produced in the culturing step of the present invention may further comprise the step of purifying or recovering, and the method for recovering itaconic acid from a microorganism or a culture is known in the art.
  • centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC may be used, but is not limited to these examples.
  • the recovery step may include a purification process, and those skilled in the art may select and utilize as needed from a variety of known purification processes.
  • an expression cassette comprising the synthetic 5 ′ UTR, promoter and target gene.
  • an SXT recombinant system expression cassette a flippase gene expression cassette, a crtEBI gene expression cassette and a BudACB operon expression cassette.
  • the SXT recombination system expression cassette is composed of a promoter encoding a beta, exo and gamma protein and a promoter represented by at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of synthetic 5 ′ untranslated region (UTR), SEQ ID NOs: 22 to 35 and 56. It includes one or more genes selected from the group. More specifically, the synthetic 5 ′ UTR is preferably represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57.
  • the flippase gene expression cassette is Synthetic 5 'UTR, SEQ ID NO: 22 to 35 and 58 includes a gene encoding a promoter and flippase (flippase) represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of. More specifically, the synthetic 5 'UTR is preferably represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 59.
  • the flipperase gene expression cassette may further include an idi gene expression cassette or an ispA gene expression cassette.
  • the idi gene expression cassette preferably includes an ispA gene and a promoter represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of synthetic 5 ′ UTRs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65, SEQ ID NOs: 22 to 35, and 64.
  • the ispA gene expression cassette preferably includes a promoter and dxs gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of synthetic 5 ′ UTR, SEQ ID NOs: 22 to 35, and 66 represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67.
  • the crtEBI gene expression cassette includes a promoter and a crtEBI gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of synthetic 5 ′ UTR, SEQ ID NOs: 22 to 35, and 60.
  • Synthetic 5 'UTR is preferably represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61.
  • the BudACB operon expression cassette is a synthetic 5 ′ UTR, a promoter represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22 to 35 and 68 and 1 selected from the group consisting of genes encoding BudA, BudC and BudB proteins. It includes the above genes.
  • the "5 'untranslated region” is an untranslated region at the 5' end and the 3 'end of the mRNA, and is generally a 5' untranslated region (5 'UTR).
  • 5 'UTR 5' untranslated region
  • the base sequence of the 5 'UTR in the immediate upper portion of the translation initiation codon has been reported to affect the efficiency of the translation step.
  • the 5' UTR has a length of 100 bases or more, and 3 UTRs are made up of several kilobases longer.
  • a sequence belonging to 5'UTR which is not a predetermined position such as a Shine-Dalgarno sequence, which is known as a ribosome binding site sequence located at 5 'UTR in prokaryotes, is a ribosome binding site sequence which is also called a ribosome binding site sequence in eukaryotes.
  • an "expression cassette” means a unit cassette which contains a promoter and a gene encoding a target protein, and which can be expressed to produce a target protein operably linked downstream of the promoter. Inside or outside of such an expression cassette may include a variety of factors that can help the efficient production of the target protein. Specifically, the target protein expression cassette may be one in which a gene encoding the target protein is operably linked downstream of the promoter sequence.
  • operably linked means that the gene sequence and the promoter sequence are functionally linked such that the nucleic acid sequence having the promoter activity of the present invention initiates and mediates the transcription of the gene encoding the protein of interest.
  • Operable linkages can be prepared using known genetic recombination techniques, and site-specific DNA cleavage and ligation can be made using, but are not limited to, cleavage and ligation enzymes in the art.
  • target protein refers to a protein to be expressed from a microorganism.
  • any protein to be expressed from a recombinant microorganism may be included without limitation, and examples thereof include, but are not limited to, a protein constituting the SXT recombination system, flippase, lycopene producing enzyme, and BudACB.
  • the recombinant gene expression cassette may be inserted into the chromosome of the host cell and used to prepare a recombinant microorganism.
  • the recombinant gene expression cassette may be inserted into the genomic chromosome of the host cell as described above. It is obvious that the recombinant vector will have the same effect as when introduced into the host cell.
  • the recombinant gene expression cassette may be inserted into the chromosome of the host cell and used to prepare a recombinant microorganism.
  • the recombinant gene expression cassette may be inserted into the genomic chromosome of the host cell as described above. It is obvious that the recombinant vector will have the same effect as when introduced into the host cell.
  • a commonly known genetic manipulation method may be used. Examples include a retroviral vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes simplex virus vector, The method using a poxvirus vector, a lentiviral vector, or a nonviral vector is mentioned.
  • a "promoter” includes a binding site for a polymerase and has a transcription initiation activity of a promoter lower gene into mRNA, which is a non-ready nucleic acid sequence upstream of the coding region, ie, a polymerase binds to it. DNA region for initiating transcription of a gene.
  • the promoter may be located at the 5 'region of the mRNA transcription start site.
  • Promoter nucleic acid molecules of the invention can be isolated or prepared using standard molecular biology techniques. For example, it may be prepared using standard synthesis techniques using an automated DNA synthesizer, but is not limited thereto.
  • the promoters can bring about the expression of the target gene operably linked to the nucleic acid molecule having the promoter activity in the desired microorganism.
  • the promoter sequence of the present invention can be easily modified by those skilled in the art by conventionally known mutagenesis, such as directional evolution and site-specific mutagenesis.
  • the promoter is at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90%, more specifically at least 95%, even more specifically at least 98% of the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 22 to 35 Most specifically, nucleotide sequences which exhibit 99% or more homology may be included without limitation.
  • nucleotide sequence having such homology if it is a nucleotide sequence having promoter activity, it should be interpreted that a nucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, or added is also included in the scope of the present invention.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology may be sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules, such as score, identity, and similarity, using a computer program that aligns the sequence information and is readily available. Parameters can be determined by direct alignment (eg BLAST 2.0). In addition, homology between polynucleotides can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • a recombinant vector comprising the SXT recombinant system expression cassette, flippase gene expression cassette, crtEBI gene expression cassette or BudACB operon expression cassette.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication, including several to hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with plasmid vectors. It has a structure that includes an antibiotic resistance gene that allows it to be used and a restriction enzyme cleavage site (c) into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no suitable restriction enzyme cleavage site is present, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods can be used to facilitate ligation of the vector and foreign DNA. After ligation, the vector should be transformed into the appropriate host cell. Transformation can be easily accomplished using calcium chloride method or electroporation or the like.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the gene of interest will be included in one recombinant vector containing the bacterial selection marker and the replication start point together.
  • recombinant vector means a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • the recombinant vector may preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, which corresponds to all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include, but are not limited to, antibiotic resistance genes such as ampicillin, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, and are not limited thereto. It can select suitably.
  • samples were taken from seaweed seaweed sludge and cultured in a laboratory.
  • composition of the medium used at this time is as follows.
  • Vibrio sp. It was named DHG and was deposited with the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology Resource Center on April 6, 2017 and was given accession number KCTC13239BP.
  • Detailed medium composition for culturing the microorganism is as follows.
  • Vibrio sp. DHG maintained high growth rates even at initial substrate concentrations of about 100 g / L.
  • Vibrio sp To test the resistance of DHG to salts in the medium, growth rates of salts, which can be included in the fermentation process, were compared. To do this, add 20 mL of different media to the flask in a 350 mL container and add Vibrio sp. DHG was inoculated so that the OD 600 was 0.05 and the initial growth rate was compared. The results are shown in FIG. 3.
  • the most basic method for transforming microorganisms is to introduce plasmids.
  • plasmids capable of expressing heterologous proteins were respectively introduced.
  • the plasmid capable of expressing the heterologous protein is designed to express the fluorescent protein GFP under different promoters (PJ23100, Plac, Ptac, PT7, Ptet, Para).
  • PJ23100, Plac, Ptac, PT7, Ptet, Para promoters
  • Each experimental group transformed with plasmids was cultured in nutrient medium (LBv2), and then the production of fluorescent protein GFP was confirmed. Vibrio sp.
  • the result of confirming the heterologous protein production of the DHG strain is shown in FIG.
  • Vibrio sp. The DHG strain was found to be capable of producing heterologous proteins under various promoters.
  • Vibrio sp In order to regulate transcription in the DHG strain, the sequence of the promoter was randomly changed and the expression level of sGFP was measured to confirm the change in transcription level. Specifically, random sequences were placed in the -35 and -10 regions using the constant promoter J23100 provided by partsregistry as a template, and plasmids having various sequence libraries were prepared after linking them to express the GFP gene. The promoters based on the promoter J23100 are shown in Table 1.
  • Microorganisms generally produce by-products (acetate, lactate, succinate, formate) for several purposes (such as achieving ATP and NAD / NADH balance). However, in order to maximize the production of the desired compound, it is necessary to prevent the production of such by-products.
  • the most representative method for suppressing the production of by-products is to delete the gene in the genome of the microorganism.
  • Vibrio is capable of genome manipulation using single-stranded DNA oligos when expressing SXT recombinase in the genome (doi: 10.1101 / 130088). For this purpose, Vibrio is based on the translated genome sequence. sp. The presence of SXT recombinase in the DHG strain was analyzed.
  • the beta protein is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the gene encoding the beta protein is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the exo protein is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the gene encoding the exo protein is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Vibrio sp In addition to beta and exo proteins, SXT recombinases require the help of gamma proteins. Vibrio sp. Analysis of the genome of the DHG strain reveals that Vibrio sp. It was confirmed that gamma protein does not exist in the DHG strain. Thus, Vibrio gene coding for gamma protein derived from lamda phage sp. Introduced to DHG strain. The gene encoding the gamma protein is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. Specifically, for efficient expression of these genes, Vibrio sp.
  • the recombinant enzyme was expressed in the tac promoter showing high transcription efficiency in the DHG strain, and the synthetic 5 'UTR was designed to have the maximum translation efficiency.
  • plasmid pACYCA_SXT was constructed.
  • the plasmid pACYCA_SXT is represented by the cleavage map disclosed in FIG. 9, and the sequence thereof is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51.
  • antibiotic resistance genes were inserted upon gene deletion and introduction.
  • the antibiotic resistance gene should easily be deleted again for further genome manipulation.
  • Gene deletion method is Saccharomyces represented by SEQ ID NO: 7 or 8
  • the expression of flp flippase derived from cerevisiae was performed to recognize the FRT sequences flanking the selection markers.
  • Escherichia coli uses a plasmid called pCP20, which is called Vibrio. sp. Since no DHG strain was transformed, a new plasmid pRSF_FLP was constructed.
  • the plasmid pRSF_FLP was intended to continuously express flp flippase for fast FRT sequence recognition and deletion of a selection marker, and was designed to be expressed under the J23100 promoter, which is a constitutive promoter.
  • the plasmid pRSF_FLP designed a synthetic 5 'UTR with high translation efficiency to facilitate protein expression.
  • the prepared plasmid pRSF_FLP is represented by the cleavage map shown in Fig. 10, the entire sequence is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52.
  • FIG. 11 A schematic diagram of the genome manipulation method of the DHG strain is shown in FIG. 11.
  • Double stranded DNA was introduced into the DHG strain by electroporation (0.8 kV).
  • the double stranded DNA is one to three kb homology around the targeted gene (homology) is placed next to the selection marker (preferably cat gene) (Fig. 12).
  • Transduced vibrio sp. 1 mL of BHI recovery medium was added to the DHG strain and incubated at 37 ° C. for 3 hours.
  • alginic acid is known to be pyruvate and G3P through metabolism.
  • Vibrio sp. Genomic sequence analysis was performed on the DHG strain. As a result, Vibrio sp. DHG strain was found to exist enzymes essential for alginic acid metabolism as follows.
  • Example 8 Vibrio sp . DHG Using strain Lycopene Production of transformed strains for production
  • Example 10 Vibrio as confirmed in Example 10 sp. Since the DHG strain can metabolize alginic acid, Vibrio capable of genome manipulation prepared in Example 9-4 sp. A lycopene-derived plasmid containing a biosynthetic enzyme gene was introduced into a DHG strain, thereby preparing a transformant strain for lycopene production.
  • the plasmid containing the lycopene biosynthetic enzyme gene is (i) the plasmid pACYC_idi_ispA_crtEBI (FIG. 17. SEQ ID NO: 53) or (ii) the newly constructed plasmid pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs (Fig. 18, SEQ ID NO: 54) was used to further express the dxs gene from E. coli .
  • the crtEBI gene (SEQ ID NO: 9) contained in the plasmid was Lamprocystis derived from purpurea , where idi (SEQ ID NO: 10), ispA (SEQ ID NO: 11), and dxs gene (SEQ ID NO: 12) are E. coli It is derived from K-12 W3110.
  • the genes are designed to increase the expression of genes by the J23100 promoter, which is a constant promoter, and a synthetic 5 'UTR having high translation efficiency.
  • the transformed strain VDHG102 for lycopene production was produced by transforming the DHG strain by the method of Example 5. After incubating the produced lycopene producing strain and alginic acid for 9 hours, the amount of lycopene was measured.
  • the composition of the medium used for the culture is as follows.
  • VDHG103 Vibrio was deleted from the dns gene using plasmid pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs. sp. Transformed into DHG strain, E. coli Corresponds to the lycopene producing strain in which the derived dxs gene is further expressed.
  • Experimental group VDHG103 (Alg 20) is cultured in the same manner as the VDHG103 strain, it is an additional supply of alginic acid during the culture. Lycopene production of the transforming strain for lycopene production is shown in FIG.
  • the experimental group VDHG102 confirmed that 3.74 mg / L of lycopene was produced.
  • Experimental group VDHG103 with additional expression of the dxs gene derived from E. coli produced 6 mg / L of lycopene, and about 9.4 mg / L of lycopene was produced when additional alginic acid was supplied (experimental group VDHG103 (Alg 20)).
  • the result is Vibrio sp. It suggests that the DHG strain can be used universally in the production of high value compounds such as lycopene.
  • Example 9 Vibrio sp . DHG 2,3- using strain Butanediol Production of transformed strains for production
  • 2,3-Butanediol is an industrially effective compound used in plastic synthesis, antifreeze and pesticides, and is widely used in fuel additives and rubber synthesis through chemical conversion.
  • Klebsiella pneumoniae for 2,3-butanediol It is known to produce by introducing and expressing the operon (budACB) consisting of the budA, budB and budC derived from.
  • a 2,3-butanediol producing strain was prepared by introducing a budACB operon composed of budA (SEQ ID NO: 13), budB (SEQ ID NO: 14), and budC gene (SEQ ID NO: 15) to the DHG strain.
  • a budACB operon composed of budA (SEQ ID NO: 13), budB (SEQ ID NO: 14), and budC gene (SEQ ID NO: 15)
  • 5 'UTR with tac promoter and high translation efficiency was designed for efficient expression of budACB operon, and the plasmid pACYC _ BudACB was designed using this.
  • the plasmid pACYC_BudACB is represented by the cleavage map disclosed in FIG. 14, and the entire sequence is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55.
  • the IdhA gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16
  • each gene constituting the frdABCD operon is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 to 20
  • the pflB gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the transformed strain for producing 2,3-butanediol having increased production efficiency was found to have deleted the metabolite producing genes ldhA, frdABCD operon and pflB, which compete with 2,3-butanediol production. Can be.
  • the prepared strains of Experimental Groups 1 and 2 were incubated at 30 ° C. and 250 rpm using media having the following compositions, respectively. After the incubation, the production of metabolites and 2,3-butanediol was measured, and the results are shown in FIG. 16.
  • the control is Vibrio prepared in Example 9-2 sp. It is a DHG strain and no plasmid pACYC_BudACB has been introduced.
  • the composition of the medium was as follows.
  • the carbon source was used to simulate and mix the composition of alginic acid, mannitol, and glucose obtained from brown algae, and the total amount was set to 50 g / L.
  • the control group to which the plasmid pACYC_BudACB was not introduced did not produce 2,3-butanediol at all.
  • experimental group 1 in which plasmid pACYC_BudACB was introduced produced 2,3-butanediol
  • experimental group 2 a strain in which enzymes of competitive metabolic pathways were deleted, showed that the production of 2,3-butanediol was significantly increased. The result is Vibrio sp. It suggests that the DHG strain can be used universally in the production of high value compounds such as 2,3-butanediol.
  • DHG strains were isolated, and the strains were found to have a very high growth rate compared to microorganisms such as Escherichia coli in minimal medium / nutritional medium, and showed resistance at high initial sugar / salt concentrations.
  • the strain is because the transformation is possible by accepting a plasmid system for improving existing such as E. coli, through the dielectric operation hayeotneun it confirmed that can produce a lycopene-butanediol and 2,3-bar, of the present invention Vibrio sp.
  • DHG strains can be used in various fields in the production of high value compounds using microorganisms.

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 다양한 탄소원을 빠른 속도로 대사할 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 미생물은 최소배지/영양배지 등에서 대장균 등과 같은 미생물에 비하여 성장속도가 매우 높으며, 높은 초기 당/염 농도에서 저항성을 보일 뿐만 아니라, 유전체 조작을 통해 라이코펜 및 2,3-부탄디올을 생산할 수 있음을 확인하였는바, 미생물을 이용한 고부가가치 화합물의 생산 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

바이오매스에서 유래한 탄소원의 고성능 대사를 위한 신규 미생물 균주
본 발명은 다양한 탄소원을 빠른 속도로 대사할 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다.
석유 자원의 고갈과 온실 가스 발생 등 각종 환경 문제의 대두로 인하여, 기존의 석유화학 공정으로부터 생산되던 많은 화합물들을 지속 가능하며 친환경적으로 생산할 수 있는 기술의 필요성이 대두되었다. 기존 산업의 근간이 되는 화석 연료는 결국 바이오매스가 오랜 시간을 거쳐 변형된 것이기 때문에, 실질적으로 이를 대체하기 위해서는 결국 탄소원인 바이오매스가 효율적으로 전환되어야 한다.
바이오매스를 목적 화합물로 전환하기 위해서는, 바이오매스에 포함되어 있는 당(sugar)을 미생물의 발효 과정을 거쳐 원하는 대사산물로 전환시켜야 한다. 지금까지는 옥수수 및 사탕수수 등과 같은 녹말 작물(starch crop)로부터 얻어낸 포도당(glucose)을 발효 공정에 사용하여 왔지만, 가까운 미래에 바이오 화합물의 수요량이 급증할 경우 곡물 가격 폭등으로 인한 많은 문제점이 발생될 것으로 예상되고 있다. 이 때문에, 바이오 공정에 필요한 원료를 자연에 풍부한 육상 및 해양 식물들로 대체하고자 하는 노력들이 지속되고 있다.
특히, 자연에 존재하는 다양한 바이오매스 중 갈조류(Brown macroalgae, 다시마 등)가 차세대 원료로서 가치를 주목 받고 있다. 갈조류는 기존 육상 식물에 비하여 높은 이산화탄소 고정 속도를 보이며, 빠른 성장 속도로 인하여 다량의 바이오 매스 확보가 가능하다. 또한, 리그닌이 없어 발효 공정이 저해 받지 않으며, 값비싼 전처리 공정 또한 필요하지 않다는 장점이 있다. 하지만 갈조류에 풍부한 탄소원은 알긴산(α-L-guluornate와 β-D-mannuuronate의 homopolymer)인데, 산업 미생물들은 알긴산 대사회로를 포함하고 있지 않아 대사할 수 없다는 문제점을 지니고 있다.
따라서 알긴산을 포함한 다양한 탄소원을 빠르게 대사할 수 있는 미생물의 확보가 필요하며, 또 적절한 유전 공학적 개량을 통하여 고부가가치 화합물로 전환할 수 있는 기술이 필요로 하다. 이러한 균주의 확보 및 개발은 다양한 바이오매스로부터 바이오 연료, 플랫폼 화합물, 의약품 등 다양한 물질들을 지속가능하도록 생산할 수 있는데 크게 기여할 수 있을 것이다.
이에 본 발명자들은 종래 석유화학 공정으로 생산되어온 화합물을 친환경적으로 생산하기 위하여, 다양한 탄소원을 빠르게 대사할 수 있는 미생물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 탄소원 고성능 대사 회로를 갖는, 수탁번호가 KCTC13239BP인, 비브리오 속 DHG 균주(Vibrio sp. DHG)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 DHG 균주에 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 gamma 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질전환된 DHG 균주에 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 crtEBI 유전자가 도입된 것인, 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질전환된 DHG 균주에 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 budA 유전자, 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 budB 유전자 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 budC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자가 도입된 것인, 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 라이코펜의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 합성 5‘ UTR, 프로모터 및 타켓 유전자를 포함하는 SXT 재조합 시스템 발현 카세트, 플립파아제 유전자 발현 카세트, crtEBI 유전자 발현 카세트 및 BudACB 오페론 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 SXT 재조합 시스템 발현 카세트, 플립파아제 유전자 발현 카세트, crtEBI 유전자 발현 카세트 또는 BudACB 오페론 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄소원 고성능 대사 회로를 갖는, 수탁번호가 KCTC13239BP인, 비브리오 속 DHG 균주(Vibrio sp. DHG)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 DHG 균주에 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 gamma 단백질을 코딩하는 유전자가 도입를 도입한, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환된 DHG 균주에 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 crtEBI 유전자가 도입된 것인, 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환된 DHG 균주에 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 budA 유전자, 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 budB 유전자 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 budC 유전자로 이루진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자가 도입된 것인, 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 라이코펜의 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 합성 5' UTR(untranslated region), 서열번호 22 내지 35 및 56으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 beta, exo 및 gamma 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는, SXT 재조합 시스템 발현 카세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SXT 재조합 시스템 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 58로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 플립파아제(flippase)를 코딩하는 유전자를 포함하는, 플립파아제 유전자 발현 카세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 플립파아제 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 60으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 crtEBI 유전자를 포함하는, crtEBI 유전자 발현 카세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 crtEBI 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 68으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 BudA, BudC 및 BudB 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는, BudACB 오페론 발현 카세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 BudACB 오페론 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 Vibrio sp. DHG 균주는 최소배지/영양배지 등에서 대장균 등과 같은 미생물에 비하여 성장속도가 매우 높으며, 높은 초기 당/염 농도에서 저항성을 보일 뿐만 아니라, 유전체 조작을 통해 라이코펜 및 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는바, 미생물을 이용한 고부가가치 화합물의 생산 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 Vibrio sp. DHG 균주의 탄소원에 따른 성장 속도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 Vibrio sp. DHG 균주의 초기 당 농도에 대한 저항성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 Vibrio sp. DHG 균주의 배지 내 염 농도에 대한 저항성을 나타낸 도이다.
도 4는 콜로니 PCR을 통해 본 발명에 따른 Vibrio sp. DHG 균주내에 플라스미드 pACYC 또는 pUC의 도입 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 콜로니 PCR을 통해 본 발명에 따른 Vibrio sp. DHG 균주내에 플라스미드 pACYC 및 pUC의 도입 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 Vibrio sp. DHG 균주를 이종 단백질인 형광 단백질 발현 플라스미드로 형질전환시킨 후, 형광 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 합성 프로모터 서열에 따른 형질전환 균주의 형광 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 5‘ UTR 서열에 따른 형질전환 균주의 형광 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 gamma 단백질 발현을 위한 본 발명에 따른 플라스미드 pACYCA_SXT의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 pRSF_FLP의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 vibrio sp. DHG 균주의 유전체 조작 방법의 모식도를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 vibrio sp. DHG 균주의 유전체 조작에 이용한 double stranded DNA의 구조 및 타켓팅 부위를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 vibrio sp. DHG 균주를 형질전환시켜 제작한 라이코펜 생산용 형질전환 균주의 라이코펜 생산량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명에 따른 2,3-부탄디올 생산을 위한 플라스미드 pACYC_BudACB의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 15는 콜로니 PCR을 통해 본 발명에 따른 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주의 유전자 결실 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에 따른 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주의 대사체 및 2,3-부탄디올 생산량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명에 따른 라이코펜 생산을 위한 플라스미드 pACYC_idi_ispA_crtEBI의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명에 따른 라이코펜 생산을 위한 플라스미드 pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs의 개열지도를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
이때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 탄소원 고성능 대사 회로를 갖는, 수탁번호가 KCTC13239BP인, 비브리오 속 DHG 균주(Vibrio sp . DHG)를 제공한다.
본 발명에 있어서, “탄소원”은 생체에 흡수되어 생체구성탄소로서 이용되는 탄소화합물을 의미하며, 균주의 배양에 있어서, 영양원과 생리학적 관계를 규명하기 위하여 탄소원을 이용하며, 이에 따른 균주의 분리 및 생장 특성을 확인한다.
상기 탄소원은 당류 또는 당알코올일 수 있으며, 보다 상세하게는 포도당, 만니톨, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스, 글리세롤, 자일로오스, 만노오스, 프락토오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 알긴산, 셀룰로오스, 덱스트린, 글리코겐, 히알루론산, 렌티난, 자이모산, 키토산, 글루칸, 리그닌 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 포도당, 만니톨, 알긴산, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “탄소원 고성능 대사 회로”는 다양한 당류 또는 당알코올을 대사할 수 있는 효소를 포함하는 대사 회로를 의미하며, 탄소원 고성능 대사회로를 갖는 미생물은 1종 이상의 당류 또는 당알코올을 포함하는 혼합당을 탄소원으로 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rDNA 유전자를 포함한다.
본 발명에 있어서, "유전자"는 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적 유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 균주는 SXT 재조합 시스템을 포함하며, 보다 상세하게는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 beta 유전자 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 beta 단백질 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 exo 유전자 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 exo 단백질을 포함한다. 또한 전술한 유전자 또는 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란 염기의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)의 결과, beta 또는 exo 유전자의 염기서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바랍직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 전술한 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한 기능적 동등물은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 전술한 beta 또는 exo 단백질과 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 전술한 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 전술한 단백질의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 전술한 단백질의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 전술한 단백질의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연개되어 사용될 수 있는 PAM250(표준스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명자들은 해조류 슬러지로부터 비브리오 속 DHG 균주를 분리 및 동정하였으며, 상기 비브리오 속 DHG 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2017년 4월 6일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC13239BP를 부여 받았다. 상기 비브리오 속 DHG 균주는 최소배지/영양배지 등에서 대장균 등과 같은 미생물에 비하여 성장속도가 매우 높으며, 높은 초기 당/염 농도에서 저항성을 보인다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 비브리오 속 DHG 균주에 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 gamma 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한. 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 gamma 유전자는 도 9에 개시된 벡터 pACYCA_SXT를 이용하여 비브리오 속 DHG 균주에 도입시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 형질전환된 DHG 균주는 SXT 재조합 시스템을 포함하고 있으므로, 종래 사용되던 대장균 등을 개량하기 위한 플라스미드를 그대로 이용하여 형질전환시킬 수 있다는 장점이 있으며, 형질전환을 통해 고부가가치 화합물을 생산하는 균주를 제작할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 형질전환된 DHG 균주에 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 crtEBI 유전자가 도입된 것인 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 라이코펜 생산용 형질전환 균주는 추가적으로 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 idi 유전자가 도입된 것일 수 있으며, 이에 추가적으로 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 ispA 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기 idi 및 ispA 유전자는 crtEBI 유전자와 동시에 도입될 수도 있으며, 순차적으로 도입될 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 crtEBI, idi 및 ispA 유전자는 도 17에 개시된 벡터 pACYC_idi_ispA_crtEBI를 이용하여 형질전환된 DHG 균주에 도입하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 라이코펜 생산용 형질전환 균주는 추가적으로 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 dxs 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기 dxs 유전자는 crtEBI 유전자와 동시에 또는 순차적으로 도입할 수 있으며, crtEBI 유전자와 함께 idi 및/또는 ispA 유전자를 동시에 또는 순차적으로 도입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, crtEBI, dxs, idi 및 ispA 유전자를 동시에 도입하였으며, 상기 유전자들은 도 18에 개시된 개열지도로 표시되는 벡터 pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs를 이용하여 형질전환된 DHG 균주에 도입하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 형질전환된 DHG 균주에 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 budA 유전자, 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 budB 유전자 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 budC 유전자로 이루진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자가 도입된 것인, 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 형질전환된 DHG 균주에 budA, budB 및 budC 유전자로 구성되는 BudABC 오페론을 도 14에 개시된 개열지도로 표시되는 벡터 pACYC_BudACB를 이용하여 도입하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주는 2,3-부탄디올의 생산성 및 수율을 향상시키기 위하여, 상기 균주는 젖산을 생산하는 효소를 코딩하는 idhA 유전자, 숙신산을 생성하는 효소를 코딩하는 frdABCD 오페론 및 피루베이트를 아세틸 coA로 전환시키는 효소를 코딩하는 pflB 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자가 결실된 것이다. 보다 상세하게는, 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주는 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 ldhA 유전자, 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 frdA 유전자, 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 frdB 유전자, 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 frdC 유전자, 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 frdD 유전자 및 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 pflB 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 유전자가 결실된 것이다. 상기 유전자 결실은 도 10에 개시된 개열지도로 표시되는 벡터인 pRSF_FLP를 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 라이코펜의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양조건은 통상의 비브리오 속 미생물의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용될 수 있으나, 본 발명의 미생물의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 배지는 탄소원으로서 당류 또는 당알코올을 포함할 수 있으며, 보다 상세하게는 포도당, 만니톨, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스, 글리세롤, 자일로오스, 만노오스, 프락토오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 알긴산, 셀룰로오스, 덱스트린, 글리코겐, 히알루론산, 렌티난, 자이모산, 키토산, 글루칸, 리그닌 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 포도당, 만니톨, 알긴산, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃로 설정할 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 화합물(라이코펜 또는 2,3-부탄디올)은 추가로 정제 또는 회수하는 단계를 포함할 수 있으며, 미생물 또는 배양물로부터 이타콘산을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당업자는 공지된 여러 정제 공정 중 필요에 따라 선택하여 활용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 합성 5‘ UTR, 프로모터 및 타켓 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, SXT 재조합 시스템 발현 카세트, 플립파아제 유전자 발현 카세트, crtEBI 유전자 발현 카세트 및 BudACB 오페론 발현 카세트를 제공한다.
상기 SXT 재조합 시스템 발현 카세트는 합성 5' UTR(untranslated region), 서열번호 22 내지 35 및 56으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 beta, exo 및 gamma 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함한다. 보다 상세하게는 상기 합성 5‘ UTR은 서열번호 57의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 플립파아제 유전자 발현 카세트는 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 58로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 플립파아제(flippase)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 보다 상세하게는 상기 합성 5‘ UTR은 서열번호 59의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다. 또한 상기 플립파아제 유전자 발현 카세트는 idi 유전자 발현 카세트 또는 ispA 유전자 발현 카세트을 더 포함할 수 있다. 상기 idi 유전자 발현 카세트는 서열번호 65의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 64로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 ispA 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 ispA 유전자 발현 카세트는 서열번호 67의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 66으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 dxs 유전자를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 crtEBI 유전자 발현 카세트는 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 60으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 crtEBI 유전자를 포함한다. 합성 5‘ UTR은 서열번호 61의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 BudACB 오페론 발현 카세트는 합성 5' UTR, 서열번호 22 내지 35 및 68으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 BudA, BudC 및 BudB 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함한다.
본 발명에 있어서, “5' UTR(untranslated region)”은 mRNA의 5' 말단과 3'말단에 있는 비번역부위로, 일반적으로 mRNA의 5' 비번역 부위(5' untranslated region: 5' UTR)는 유전자 발현 과정에서 여러 가지 기능을 수행하나 이러한 기능 중, 가장 큰 특징은 mRNA 번역 효율 조절에 관여하는 것이다. 번역개시 코돈의 인접한 상부에 존재하는 5' UTR의 염기서열은 번역 단계의 효율에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있으며, 이러한 5' UTR의 길이는 100 베이스 (base) 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 되어 있고, 3' UTR의 길이는 그보다 더 긴 몇 킬로베이스(kilo base)로 이루어져 있다. 또한, 원핵생물에 5' UTR에 위치한 리보솜 결합 부위 시퀀스로 알려진 샤인-달가노 시퀀스 (Shine-Dalgarno sequence)와 같이 정해진 위치는 아니지만 진핵생물에서도 리보솜 결합 부위 시퀀스라 할 수 있는 5’UTR에 속한 시퀀스들에 관한 연구 결과가 보고된 바 있다.
본 발명에 있어서, "발현 카세트"는 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 생산하기 위해 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 목적 단백질 발현 카세트는 구체적으로, 프로모터 서열 하류에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
상기 "작동 가능하게 연결"이란 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "목적 단백질"은 미생물로부터 발현시키고자 하는 단백질을 말한다. 구체적으로 재조합 미생물로부터 발현시키고자 하는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있으며, 그 예로 SXT 재조합 시스템을 구성하는 단백질, 플립파아제, 라이코펜 생산효소 및 BudACB를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 유전자 발현 카세트는 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 재조합 미생물을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 재조합 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다.
재조합 유전자 발현 카세트는 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 재조합 미생물을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 재조합 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다.
재조합 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말한다. 상기 프로모터는 mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 프로모터 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터들은 목적하는 미생물에서 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자와 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 발현을 가져올 수 있다.
또한, 본 발명의 프로모터 서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법 및 부위특이적 돌연변이법 등에 의하여 당업자에 의하여 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 상기 프로모터는 상기 서열번호 22 내지 35의 뉴클레오티드 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90 % 이상, 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 보다 더욱 구체적으로는 98 % 이상, 가장 구체적으로는 99 % 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열로서, 프로모터 활성을 가지는 뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 또는 부가된 뉴클레오티드 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 SXT 재조합 시스템 발현 카세트, 플립파아제 유전자 발현 카세트, crtEBI 유전자 발현 카세트 또는 BudACB 오페론 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다.
본 발명에 있어서, "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 해조류 슬러지로부터의 Vibrio sp . DHG 균주의 분리 및 동정
고농도 염에서 빠르게 성장할 수 있는 미생물을 확보하기 위하여, 바닷가 해조류 슬러지로부터 시료를 채취하여 이를 실험실에서 배양하였다.
이 때 사용한 배지의 조성은 다음과 같다.
NaCl 30 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L
K2HPO4 2 g/L
MgSO47H2O 0.5 g/L
Alginate 10 g/L
ATCC Trace mineral solution 2 ml/L
해당 배지에서 배양한 결과 빠르게 성장하는 것을 확인하였으며, 단일 콜로니를 분리하였다.
분리한 미생물의 종 특이성을 파악하기 위하여 16S rDNA 서열(서열번호 1)을 분석한 결과, Vibrio sp.에 속함을 확인하였다.
본 발명자들은 Vibrio sp. DHG로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2017년 4월 6일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC13239BP를 부여 받았다.
실시예 2. Vibrio sp . DHG의 대사 가능 탄소원 분석 및 성장 속도 측정
Vibrio sp. DHG가 대사할 수 있는 탄소원의 종류 및 상응하는 성장 속도를 측정하기 위하여 다양한 탄소원들을 유일 탄소원으로 한 최소배지에서 배양하였다. (30도, 250 rpm)
해당 미생물을 배양하기 위한 자세한 배지 조성은 다음과 같다.
NaCl 30 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L
K2HPO4 2 g/L
MgSO47H2O 0.5 g/L
Carbon source 10 g/L
ATCC Trace mineral solution 2 ml/L
Vibrio sp. DHG 균주의 비성장 속도를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 대장균의 글루코오스 대사 속도가 0.5 내지 0.6 임을 감안하였을 때, Vibrio sp. DHG 균주는 비교균에 있는 모든 탄소원을 유일 탄소원으로 이용할 수 있었으며, 빠른 속도(>0.8 h- 1)로 성장함을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 Vibrio sp. DHG 균주의 세포당 탄소원 대사 능력은 대장균의 포도당 대사 속도와 유사하거나 높은 것을 알 수 있다. 상기 결과는 바이오리파이너리 공정에서 빠르게 탄소원을 전환할 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 초기 당(기질) 농도에 대한 저항성 테스트
배양기 내의 초기 당 농도에 따른 성장속도를 확인하기 위하여 이전 실험에서 가장 성장속도가 높았던 포도당에 대한 저항성을 테스트하고자 하였다. 이를 위해 350 mL 용기의 플라스크에 20 mL의 초기 농도가 각기 다른 배지를 첨가하고 Vibrio sp. DHG를 OD600이 0.05가 되도록 접종한 후, 초기 성장속도를 비교하였다. 초기 당 농도에 따른 성장속도 확인 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Vibrio sp. DHG는 약 100 g/L의 초기 기질 농도에도 높은 성장 속도를 유지하였다.
실시예 4. 배지 내 염 농도에 대한 저항성 테스트
Vibrio sp. DHG의 배지 내 염에 대한 저항성을 테스트하기 위하여, 흔히 발효 과정에서 포함될 수 있는 염의 농도별 성장 속도를 비교하였다. 이를 위해, 350 mL 용기의 플라스크에 20 mL의 초기 농도가 각기 다른 배지를 첨가하고 Vibrio sp. DHG를 OD600이 0.05가 되도록 접종한 수, 초기 성장속도를 비교하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Vibrio sp. DHG는 NaCl의 경우 10~40 g/L, Na2SO4의 경우 10~60 g/L, NaH2PO4의 경우 약 10 내지 100 g/L 의 염 존재하에서 성장할 수 있음을 확인하였으며, 결론적으로 높은 염 내성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예 5. Vibrio sp . DHG 균주의 형질 전환을 위한 플라스미드 도입
일반적으로 미생물의 형질 전환을 하기 위한 가장 기본적인 방법은 플라스미드를 도입하는 방법이다. 효율적인 형질 전환을 위해선 대장균 등과 같은 미생물에 흔히 사용되는 플라스미드가 도입되는 것이 중요하다.
Vibrio sp. DHG 균주에 플라스미드가 도입되는 것을 확인하기 위하여 Vibrio natriegens의 형질전환 방법을 참고하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(1) 먼저 brain heat infusion (BD) 배지에서 밤새 배양한 seed를 새로운 배지에 1/100으로 접종한 뒤 OD가 0.6이 될 때까지 37도에서 200 rpm으로 배양하였다.
(2) OD가 0.6에 도달하면, 플라스크를 얼음에 20분간 둔 후 4500 rpm에서 약 15분간 원심분리를 하여 세포를 수집하였다.
(3) 세포를 수집한 뒤, 멸균된 일렉트로포레이션 버퍼(680 mM sucrose, 7 mM K2HPO4, pH 7) 10 mL 를 넣고 세포펠릿을 재부유시켜 세척 한 후 이를 다시 4500rpm에서 원심분리하였다.다.
(4) 이 과정을 4회 반복하였다.
(5) 최종적으로 일렉트로포레이션 버퍼를 적당량 첨가하여 재부유시켜 OD가 16이 되도록 조절하였다.
(6) 형질전환에 사용될 플라스미드를 500 ng이상을 첨가한 뒤, 0.8 kV의 전기 충격으로 전기천공법을 수행하였다.
형질전환 된 것을 확인하기 위하여 적당량의 항생제가 포함된 플레이트에서 밤새 배양한 뒤, 콜로니 PCR을 통하여 미생물 내에 플라스미드 존재 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pACYC와 pUC가 각각 도입되었음을 확인하였다.
또한, 같은 방법으로 미생물 내에 플라스미드가 2개 이상 도입될 수 있음을 추가적으로 확인하고자 하였으며, 플라스미드 pACYC 및 pUC를 순차적으로 형질전환하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, BHI 배지에서 액체 배양 후 플라스미드 정제를 실시한 뒤, 이를 전기영동하였을 때 2개의 플라스미드가 공존 및 확보됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6. Vibrio sp . DHG 균주에서의 이종 단백질 발현
Vibrio sp. DHG의 빠른 성장속도는 원하는 단백질을 빠른 속도로 생산할 수 있음을 시사하며, 이를 위하여 Vibrio sp. DHG 균주에서 이종 단백질의 발현 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 5의 형질전환 방법으로, 이종 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드를 각각 도입하였다. 상기 이종 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드는 다른 프로모터(PJ23100, Plac, Ptac, PT7, Ptet, Para) 하에서 형광 단백질인 GFP가 발현되도록 디자인된 것이다. 각각의 플라스미드로 형질전환된 실험군을 영양배지(LBv2)에서 배양한 후 형광 단백질인 GFP의 생산 여부를 확인하였다. Vibrio sp. DHG 균주의 이종 단백질 생산 여부를 확인한 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Vibrio sp. DHG 균주는 다양한 프로모터 하에서 이종 단백질을 생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 항시성 프로모터 서열을 통한 전사의 정량적 조절
미생물의 재설계를 위해선 유전자의 발현량을 정량적으로 조절하는 것이 매우 중요하며, 이는 유전자의 효율적인 과발현을 통한 대사 경로의 확대 및 최적 발현을 통한 탄소 흐름 최적화 등 바이오화합물 생산 증대에 효율적으로 적용될 수 있다. 대체로 이러한 발현량 조절은 크게 유전자 발현의 전사(transcription) 및 번역(translation)단계에서 수행되어 왔다. 전사 단계의 발현량은 RNA 중합효소와의 친화도(affinity)를 결정짓는 프로모터의 서열에 따라 달라지는데, 프로모터 서열중에서도 -35 및 -10 영역의 서열이 매우 중요한 것으로 알려져 있다.
Vibrio sp. DHG 균주에서의 전사 조절을 위하여, 프로모터의 서열을 무작위 적으로 변경한 뒤, sGFP의 발현양을 측정하여 전사 레벨(transcription level)의 변화를 확인하였다. 구체적으로, partsregistry에서 제공하는 항시성 프로모터 J23100을 주형으로 하여 -35 및 -10 영역에 랜덤 서열을 배치하였고, 이를 GFP 유전자를 발현할 수 있도록 연결한 뒤에 다양한 서열 라이브러리를 가지는 플라스미드를 제작하였다. 상기 프로모터 J23100을 주형으로 한 프로모터는 표 1에 나타내었다.
샘플 서열(5’->3’) 표준화된 상대적 강도 서열번호
주형 NNNNNNGCTAGCTCAGTCCTAGGKANNNNGCTAGC 서열번호 22
1 CTTATGGCTAGCTCAGTCCTAGGGACAGTGCTAGC 0.053 서열번호 23
2 TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGGATAGTGCTAGC 0.098 서열번호 24
3 CTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGGATAGTGCTAGC 0.143 서열번호 25
4 TTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGGATTATGCTAGC 0.171 서열번호 26
5 TTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC 0.254 서열번호 27
6 TTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTATTGTGCTAGC 0.288 서열번호 28
7 TTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTATGCTAGC 0.322 서열번호 29
8 TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTGTGCTAGC 0.420 서열번호 30
9 TTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC 0.514 서열번호 31
10 TTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAGTGCTAGC 0.579 서열번호 32
11 TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTATTGTGCTAGC 0.651 서열번호 33
12 TTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC 0.813 서열번호 34
13 TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC 1.000 서열번호 35
제작된 플라스미드를 Vibrio sp. DHG 균주에 도입한 후, 무작위적으로 콜로니를 선정한 뒤, 최소배지에서 배양하였다. 배양된 각 균주의 세포 당 형광을 비교하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 프로모터 서열에 따라 형광이 약 20배 정도로 달라지는 것을 확인하였다. 이를 통해 해당 프로모터를 바이오 화합물 생산에 필요한 목적 유전자의 발현량 조절에 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 8. 5‘ UTR 서열 변경을 통한 번역의 정량적 조절
번역 단계에서의 유전자 발현량 조절은 번역될 mRNA와 번역을 담당하는 리보솜과의 친화도(affinity)가 매우 중요하다. 이 친화도에 가장 결정적으로 작용하는 것은 5’UTR 서열로서 전체 번역 효율을 결정한다. 대장균을 대상으로 연구된 결과에 따르면 5’UTR의 서열에 변화를 줌으로써 원하는 단백질의 양을 정량적으로 조절할 수 있었으며, 역으로 원하는 단백질의 양이 만들어지도록 5’UTR을 설계할 수 있음을 의미한다. 이러한 방법은 web-based tool로 제공되고 있다.
마찬가지로, Vibrio sp. DHG 균주에서 번역 조절을 위하여, sGFP 유전자와 연결된 5’ UTR 서열에 변화를 주었으며, 이 때 UTR Library designer(10.1016/j.ymben.2012.10.006, 10.1038/srep04515) 라는 프로그램을 활용하여 편향되지 않는 라이브러리를 구축하였다. 구축된 5‘ UTR 라이브러리는 표 2에 나타내었다.
샘플 서열(5‘->3’) ΔGUTR 측정된 형광강도 서열번호
주형 ACGGAGAWTGCTYAAKSAGTCSTTT 서열번호 36
1 ACGGAGATTGCTTAAGCAGTCGTTT 0.28 0.02 서열번호 37
2 ACGGAGAATGCTTAATCAGTCGTTT 1.13 0.03 서열번호 38
3 ACGGAGATTGCTTAATCAGTCCTTT 5.98 0.04 서열번호 39
4 ACGGAGATTGCTTAAGCAGTCGTTT 0.28 0.04 서열번호 40
5 ACGGAGAATGCTCAATGAGTCGTTT -1.22 0.12 서열번호 41
6 ACGGAGATTGCTTAATGAGTCGTTT -2.07 0.17 서열번호 42
7 ACGGAGAATGCTTAATGAGTCGTTT -2.17 0.18 서열번호 43
8 ACGGAGAATGCTTAATGAGTCGTTT -2.17 0.21 서열번호 44
9 ACGGAGATTGCTTAATGAGTCGTTT -2.07 0.24 서열번호 45
10 ACGGAGAATGCTCAAGGAGTCGTTT -7.22 0.69 서열번호 46
11 ACGGAGAATGCTTAAGGAGTCGTTT -8.67 0.85 서열번호 47
12 ACGGAGATTGCTTAAGGAGTCCTTT -4.27 0.87 서열번호 48
13 ACGGAGAATGCTTAAGGAGTCGTTT -8.67 0.98 서열번호 49
14 ACGGAGATTGCTTAAGGAGTCGTTT -8.57 1.00 서열번호 50
표 2에 나타낸 5’ UTR의 조절을 받도록 디자인된 sgfp 발현 플라스미드를 Vibrio sp. DHG 균주에 형질전환한 후, 무작위적으로 콜로니를 선정하여 최소배지에서 배양하였다. 배양된 각 균주의 세포 당 형광을 비교하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 5‘ UTR 서열에 따라 형광이 약 70배 증가된 것을 확인하였다. 또한, 5’ UTR 서열을 확인한 결과, 세포 당 형광은 UTR 서열을 기반으로 예측된 발현값과 매우 높은 상관관계(R2=0.8145)를 가지는 것을 확인하였다. 상기 결과는 Vibrio sp. DHG 균주의 번역 조절은 다양한 화합물 생산 회로 최적화에 이용할 수 있음을 의미한다.
실시예 9. vibrio sp . DHG 균주의 유전체 조작(Genome engineering)
9-1. Vibrio sp . DHG 균주의 유전체 분석
일반적으로 미생물들은 목적 화합물만을 생산하는 것이 아니고, 여러 목적 (ATP 및 NAD/NADH 균형 달성 등)을 위하여 부산물(acetate, lactate, succinate, formate)을 생산한다. 하지만 원하는 목적화합물의 생산을 최대화하기 위하여, 해당 부산물을 생산하지 못하도록 할 필요가 있다. 가장 대표적인 부산물 생성 억제를 위한 방법은 미생물의 유전체에서 해당 유전자를 결실(deletion)시키는 것이다.
Vibrio는 유전체에 존재하는 SXT 재조합 효소를 발현할 경우 single-stranded DNA oligo를 활용하여 유전체 조작이 가능하다(doi:10.1101/130088). 이를 위하여, 해독된 유전체 서열(genome sequence)을 기반으로 Vibrio sp. DHG 균주에 SXT 재조합 효소의 존재 여부를 분석하였다.
그 결과, Vibrio sp. DHG 균주에 SXT 재조합 효소를 구성하는 beta 및 exo 단백질이 존재하는 것을 확인하였다. beta 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 beta 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시된다. 또한 exo 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 exo 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 표시된다.
9-2. gamma 단백질 발현을 위한 플라스미드 제작
beta 및 exo 단백질 외에도 SXT 재조합 효소에는 gamma 단백질의 도움이 필요하다. Vibrio sp. DHG 균주의 유전체를 분석한 결과, Vibrio sp. DHG 균주 내에는 gamma 단백질이 존재하지 않는다는 것을 확인하였다. 이에, lamda phage 유래의 gamma 단백질을 코딩하는 유전자를 Vibrio sp. DHG 균주에 도입하였다. 상기 gamma 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 표시된다. 구체적으로, 이들 유전자들의 효율적인 발현을 위하여, Vibrio sp. DHG 균주에서 높은 전사 효율을 보인 tac 프로모터에 해당 재조합 효소가 발현될 수 있도록 하였으며, 최대 번역 효율을 가질 수 있도록 합성 5‘ UTR을 설계하였다. 그 결과, 플라스미드 pACYCA_SXT를 구축하였다. 상기 플라스미드 pACYCA_SXT는 도 9에 개시된 개열지도로 표시되며, 그 서열은 서열번호 51의 염기서열로 표시된다.
9-3. 항생제 내성 유전자 및 flp 플립파아제 유전자를 포함하는 플라스미드 제작
재조합된 세포를 선택적으로 분리하기 위하여, 유전자 결실 및 도입 시 항생제 내성 유전자를 삽입하였다. 상기 항생제 내성 유전자는 추가적인 유전체 조작을 위해서 손쉽게 다시 결실되어야 한다. 유전자 결실방법은 서열번호 7 또는 8로 표시되는 Saccharomyces cerevisiae 유래의 flp 플립파아제를 발현시켜 선별 마커(selection marker) 양 옆에 있는 FRT 서열을 인식함으로써 결실이 일어나도록 하였다. 흔히 대장균에서는 pCP20이라는 플라스미드를 사용하게 되는데, 해당 플라스미드는 Vibrio sp. DHG 균주에 형질전환이 되지 않기 때문에 새로운 플라스미드 pRSF_FLP를 구축하였다. 상기 플라스미드 pRSF_FLP는 빠른 FRT 서열 인식 및 선별 마커 결실을 위하여 flp 플립파아제를 지속적으로 발현시키고자 하였으며, 이에 항시성 프로모터인 J23100 프로모터 하에서 발현되도록 설계하였다. 또한, 플라스미드 pRSF_FLP는 높은 번역 효율을 갖는 합성 5‘ UTR을 설계하여 단백질 발현이 원활하게 일어나게 하였다. 제작된 플라스미드 pRSF_FLP는 도 10에 개시된 개열지도로 표시되며, 그 전체서열은 서열번호 52의 염기서열로 표시된다.
9-4. vibrio sp . DHG 균주의 유전체 조작(Genome engineering)
vibrio sp. DHG 균주의 유전체 조작 방법의 모식도는 도 11에 나타내었다.
구체적으로, 실시예 9-2에서 제작된 플라스미드 pACYCA_SXT를 유전체 조작하고자 하는 vibrio sp. DHG 균주에 형질전환한 후 배양하였다. 배양된 vibrio sp. DHG 균주를 액체 LBv2 + ampicillin (100 ug/mL)배지에 접종한 후 밤새도록(overnight) 배양하고, 1mM IPTG가 첨가된 새로운 배지에 1/100 희석 접종하여 추가 배양하였다. 배양된 vibrio sp. DHG 균주의 OD가 0.7 내지 0.8에 다다르면, 얼음 등을 사용하여 10분 동안 차갑게 냉각시켰다. 냉각된 vibrio sp. DHG 균주를 원심분리하여 세포만을 얻어내고, 일렉트로포레이션 버퍼(Electroporation buffer)로 2회 세척하였다. 세척된 vibrio sp. DHG 균주에 double stranded DNA를 전기천공법(electroporation)(0.8 kV)으로 도입시켰다. 상기 double stranded DNA는 타게팅한 유전자 주변 1 내지 3 kb의 상동서열(homology)이 선별 마커(바람직하게 cat 유전자) 양 옆에 배치된 것이다(도 12). 형질 도입된 vibrio sp. DHG 균주에 BHI recovery medium 1mL를 넣고 37도에서 3시간 배양하였다.
배양된 균주를 선별 마커에(selection marker)에 해당하는 항생제가 포함된 플레이트에 도말하여 6시간 동안 배양하였다. 콜로니 PCR을 통해, 항생제 내성을 보이는 세포가 유전체 조작이 일어났는지 확인하였다. 유전체 조작이 일어난 세포에 gamma 단백질 발현을 위한 플라스미드인 pRSF_FLP를 도입하여, 선별 마커(selection marker)를 제거하였다. 콜로니 PCR을 통하여 선별 마커가 결실되었는지 최종적으로 확인하였다. 이 때, 선별 마커가 결실된 세포는 gamma 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 내성 유전자가 형질도입된 vibrio sp. DHG 균주이며, 상기 균주는 SXT 재조합 효소를 발현하므로 single-stranded DNA oligo를 이용하여 유전체 조작이 가능하다.
실시예 10. Vibrio sp . DHG 균주의 유전체 분석을 통한 알긴산 대사 효소 탐색
해조류에 포함되어 있는 알긴산 대사가 가능하다는 것은, Vibrio sp. DHG 균주에 알긴산 대사경로가 존재하다는 것을 의미한다. 알긴산은 대사과정을 통해 피루베이트(pyruvate) 및 G3P이 되는 것으로 알려져 있다.
알긴산 대사 관련 효소들을 탐색하기 위하여, Vibrio sp. DHG 균주에서 유전체 서열 분석을 진행하였다. 그 결과, Vibrio sp. DHG 균주는 다음과 같은 알긴산 대사에 필수적인 효소들이 존재함을 알 수 있었다.
* 알긴산 용해효소(Alginate lyase) 1 내지 5
*DHEU 환원효소(DEHU reductase, 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase) 1
*2-디하이드로-3-데옥시글루코네이트 키나아제(2-dehydro-3-deoxygluconate kinase) 1 내지 2
실시예 8. Vibrio sp . DHG 균주를 이용한 라이코펜 생산용 형질전환 균주 제작
실시예 10에서 확인한 바와 같이 Vibrio sp. DHG 균주가 알긴산을 대사할 수 있으므로, 실시예 9-4에서 제작한 유전체 조작이 가능한 Vibrio sp. DHG 균주에 라이코펜을 생합성 효소 유전자가 포함된 플라스미드를 도입하여 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 제작하였다.
구체적으로, 상기 라이코펜 생합성 효소 유전자가 포함된 플라스미드는 (i) 대장균내 라이코펜을 생산하기 위하여 개발된 플라스미드(pCDF_idi_ispA_crtEBI, doi: 10.1016/j.ymben.2016.10.003)를 기반으로 개량 된 플라스미드 pACYC_idi_ispA_crtEBI(도 17. 서열번호 53) 또는 (ii) E. coli유래의 dxs 유전자가 추가 발현되도록 새롭게 구축한 플라스미드 pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs(도 18, 서열번호 54)를 이용하였다. 상기 플라스미드에 포함된 crtEBI 유전자(서열번호 9)는 Lamprocystis purpurea로부터 유래한 것이며, idi(서열번호 10), ispA(서열번호 11) 및 dxs 유전자(서열번호 12)는 E. coli K-12 W3110로부터 유래한 것이다. 또한 상기 유전자들은 항시성 프로모터인 J23100 프로모터 및 높은 번역효율을 갖는 합성 5‘ UTR에 의해 유전자의 발현이 증가되도록 디자인된 것이다.
플라스미드 pACYC_idi_ispA_crtEBI를 이용하여 dns 유전자가 결실된 Vibrio sp. DHG 균주에 실시예 5의 방법으로 형질전환시켜 라이코펜 생산용 형질전환 균주 VDHG102를 제작하였다. 제작된 라이코펜 생산 균주와 알긴산을 9시간 동안 배양한 후 라이코펜을 생산량을 측정하였다. 상기 배양에 이용된 배지의 조성은 다음과 같다.
NaCl 30 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L
K2HPO4 2 g/L
MgSO47H2O 0.5 g/L
Alginate 10 g/L
ATCC Trace mineral solution 2 ml/L
Chloramphenicol 10 ug/mL
실험군 VDHG103은 플라스미드 pACYC_idi_ispA_crtEBI_dxs를 이용하여 dns 유전자가 결실된 Vibrio sp. DHG 균주에 형질전환시킨 것으로, E. coli 유래의 dxs 유전자가 추가 발현되는 라이코펜 생산 균주에 해당한다. 실험군 VDHG103(Alg 20)은 상기 VDHG103 균주와 동일하게 배양하되, 배양 중에 알긴산을 추가적으로 공급한 것이다. 라이코펜 생산용 형질전환 균주의 라이코펜 생산량은 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 실험군 VDHG102는 3.74mg/L의 라이코펜이 생산된 것을 확인하였다. E. coli 유래의 dxs 유전자가 추가 발현되는 실험군 VDHG103은 6mg/L의 라이코펜이 생산되었으며, 알긴산을 추가 공급한 경우(실험군 VDHG103(Alg 20)) 약 9.4mg/L의 라이코펜이 생산되었다. 상기 결과는 Vibrio sp. DHG 균주가 라이코펜과 같은 고부가가치 화합물의 생산에 범용적으로 이용될 수 있음을 시사한다.
실시예 9. Vibrio sp . DHG 균주를 이용한 2,3- 부탄디올 생산용 형질전환 균주 제작
2,3-부탄디올은 산업적으로 높은 효용성을 가지는 화합물로서 플라스틱 합성, 부동액, 살충제에 쓰이며, 화학적 전환을 통해 연료 첨가제, 고무 합성 등에 다양하게 활용된다. 2,3-부탄디올의 경우 Klebsiella pneumoniae 유래의 budA, budB 및 budC로 구성된 오페론(budACB)을 도입 및 발현시킴으로써 생산할 수 있다고 알려져 있다.
이에, 실시예 9-2에서 제작된 Vibrio sp. DHG 균주에 budA(서열번호 13), budB(서열번호 14) 및 budC 유전자(서열번호 15)로 구성된 budACB 오페론을 도입하여 2,3-부탄디올 생산 균주를 제작하였다. 구체적으로, budACB 오페론의 효율적인 발현을 위하여 tac 프로모터와 높은 번역 효율을 갖는 5‘ UTR을 설계하였으며, 이를 이용하여 플라스미드 pACYC _ BudACB를 설계하였다. 상기 플라스미드 pACYC_BudACB는 도 14에 개시된 개열지도로 표시되며, 그 전체서열은 서열번호 55의 염기서열로 표시된다. 상기 플라스미드 pACYC_BudACB를 실시예 9-2에서 제작된 Vibrio sp. DHG 균주에 도입하여 형질전환 시켜 2,3-부탄디올 생산 균주를 제작하였다(실험군 1).
또한 2,3-부탄디올의 생산성 및 수율을 높이기 위하여, budACB 오페론이 도입된 Vibrio sp. DHG 균주를 실시예 9의 유전체 조작 방법으로 2,3-부탄디올 생산과 경쟁관계에 있는 실시예 9-2의 flp 플립파아제 유전자가 포함된 플라스미드를 이용하여, 대사물질 생산 유전자인 ldhA(lactic acid), frdABCD 오페론(succinate 생산) 및 pflB(pyruvate의 acetyl-CoA로의 전환)를 순차적으로 결실시켜 생산 효율이 증대된 2,3-부탄디올 생산 균주를 제작하였다(실험군 2). 상기 IdhA 유전자는 서열번호 16의 염기서열로 표시되며, frdABCD 오페론을 구성하는 각각의 유전자는 서열번호 17 내지 20의 염기서열로 표시되고, pflB 유전자는 서열번호 21의 염기서열로 표시된다. 제작된 생산 효율이 증대된 2,3-부탄디올 생산 균주의 유전자 결실 여부의 확인을 위해 콜로니 PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 생산 효율이 증대된 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주는 2,3-부탄디올 생산과 경쟁관계에 있는 대사물질 생산 유전자인 ldhA, frdABCD 오페론 및 pflB가 결실된 것을 알 수 있다.
제작된 실험군 1 및 2의 균주를 각각 하기의 조성을 갖는 배지를 이용하여 섭씨 30도, 250 rpm 조건에서 배양하였다. 배양종료 후 대사체 및 2,3-부탄디올의 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 대조군은 실시예 9-2에서 제작된 Vibrio sp. DHG 균주이며, 플라스미드 pACYC_BudACB가 도입되지 않은 것이다.
상기 배지의 조성은 다음과 같으며, 탄소원으로는 갈조류로부터 얻을 수 있는 알긴산, 만니톨, 포도당의 조성을 모사하여 혼합한 것을 사용하였으며 총량은 50 g/L로 설정하였다.
NaCl 10 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L
Potassium buffer 100 mM (pH 7)
Yeast extracts 5 g/L
MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L
Carbon source 50 g/L
DSMZ Trace element solution 2 ml/L
도 16에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pACYC_BudACB가 도입되지 않은 대조군은 2,3-부탄디올을 전혀 생산되지 않은 것을 확인하였다. 반면에, 플라스미드 pACYC_BudACB가 도입된 실험군 1은 2,3-부탄디올이 생산되었으며, 경쟁 대사경로의 효소가 결실된 균주인 실험군 2는 2,3-부탄디올의 생산량이 현저히 증가된 것을 알 수 있다. 상기 결과는 Vibrio sp. DHG 균주가 2,3-부탄디올과 같은 고부가가치 화합물의 생산에 범용적으로 이용될 수 있음을 시사한다.
종합적으로 본 발명자들은 바닷물에서 Vibrio sp. DHG 균주를 분리하였으며, 상기 균주가 최소배지/영양배지 등에서 대장균 등과 같은 미생물에 비하여 성장속도가 매우 높으며, 높은 초기 당/염 농도에서 저항성을 보임을 확인하였다. 또한, 상기 균주는 기존 대장균 등을 개량하기 위한 플라스미드 시스템을 그대로 사용하여 형질전환이 가능하므로, 유전체 조작을 통해 라이코펜 및 2,3-부탄디올을 생산할 수 있음을 확인하였는바, 본 발명의 Vibrio sp. DHG 균주는 미생물을 이용한 고부가가치 화합물의 생산 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13239BP
수탁일자 : 20170406
Figure PCTKR2018005437-appb-I000001
Figure PCTKR2018005437-appb-I000002

Claims (32)

  1. 탄소원 고성능 대사 회로를 갖는, 수탁번호가 KCTC13239BP인, 비브리오 속 DHG 균주(Vibrio sp. DHG).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탄소원은 포도당, 만니톨, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스, 글리세롤, 자일로오스, 만노오스, 프락토오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 알긴산, 셀룰로오스, 덱스트린, 글리코겐, 히알루론산, 렌티난, 자이모산, 키토산, 글루칸, 리그닌 및 펙틴로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인, 비브리오 속 DHG 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rDNA 유전자를 포함하는, 비브리오 속 DHG 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 beta 유전자 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 beta 단백질을 포함하는, 비브리오속 DHG 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 exo 유전자 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 exo 단백질을 포함하는, 비브리오 속 DHG 균주.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 비브리오 속 DHG 균주에 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 gamma 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주.
  7. 제6항에 따른 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주에 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 crtEBI 유전자가 도입된 것인, 라이코펜 생산용 형질전환 균주.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 idi 유전자가 추가적으로 도입된 것인, 라이코펜 생산용 형질전환 균주.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 ispA 유전자가 추가적으로 도입된 것인, 라이코펜 생산용 형질전환 균주.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 dxs 유전자가 추가적으로 도입된 것인, 라이코펜 생산용 형질전환 균주.
  11. 제6항에 따른 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주에
    서열번호 13의 염기서열로 표시되는 budA 유전자,
    서열번호 14의 염기서열로 표시되는 budB 유전자 및
    서열번호 15의 염기서열로 표시되는 budC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자가 도입된 것인, 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 균주는
    서열번호 16의 염기서열로 표시되는 ldhA 유전자,
    서열번호 17의 염기서열로 표시되는 frdA 유전자,
    서열번호 18의 염기서열로 표시되는 frdB 유전자,
    서열번호 19의 염기서열로 표시되는 frdC 유전자,
    서열번호 20의 염기서열로 표시되는 frdD 유전자 및
    서열번호 21의 염기서열로 표시되는 pflB 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 유전자가 결실된 것인, 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주.
  13. 제7항의 라이코펜 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계;를 포함하는, 라이코펜 생산 방법.
  14. 제11항의 2,3-부탄디올 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계;를 포함하는, 2,3-부탄디올의 생산 방법.
  15. 합성 5' UTR(untranslated region),
    서열번호 22 내지 35 및 56으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및
    beta, exo 및 gamma 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는, SXT 재조합 시스템 발현 카세트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 합성 5’ UTR은 서열번호 57의 염기서열로 표시되는 것인, SXT 재조합 시스템 발현 카세트.
  17. 제15항의 SXT 재조합 시스템 발현 카세트를 포함하는, 재조합 벡터.
  18. 합성 5' UTR(untranslated region),
    서열번호 22 내지 35 및 58로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및
    플립파아제(flippase)를 코딩하는 유전자를 포함하는, 플립파아제 유전자 발현 카세트.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 합성 5’ UTR은 서열번호 59의 염기서열로 표시되는 것인, 플립파아제 유전자 발현 카세트.
  20. 제18항의 플립파아제 유전자 발현 카세트를 포함하는, 재조합 벡터.
  21. 합성 5' UTR(untranslated region),
    서열번호 22 내지 35 및 60으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및
    crtEBI 유전자를 포함하는, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 합성 5’ UTR은 서열번호 61의 염기서열로 표시되는 것인, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 crtEBI 유전자 발현 카세트는 idi 유전자 발현 카세트를 더 포함하는, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 idi 유전자 발현 카세트는
    서열번호 63의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR(untranslated region),
    서열번호 22 내지 35 및 63으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및
    idi 유전자를 포함하는 것인, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 crtEBI 유전자 발현 카세트는 ispA 유전자 발현 카세트를 더 포함하는, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 ispA 유전자 발현 카세트는
    서열번호 65의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR(untranslated region),
    서열번호 22 내지 35 및 64로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및
    ispA 유전자를 포함하는 것인, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  27. 제21항에 있어서,
    상기 crtEBI 유전자 발현 카세트는 dxs 유전자 발현 카세트를 더 포함하는, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 dxs 유전자 발현 카세트는
    서열번호 67의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR(untranslated region),
    서열번호 22 내지 35 및 66으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및
    dxs 유전자를 포함하는 것인, crtEBI 유전자 발현 카세트.
  29. 제21항의 crtEBI 유전자 발현 카세트를 포함하는, 재조합 벡터.
  30. 합성 5' UTR(untranslated region),
    서열번호 22 내지 35 및 68으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터 및
    BudA, BudC 및 BudB 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는, BudACB 오페론 발현 카세트.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 합성 5’ UTR은 서열번호 69의 염기서열로 표시되는 것인, BudACB 오페론 발현 카세트.
  32. 제30항의 BudACB 오페론 발현 카세트를 포함하는, 재조합 벡터.
PCT/KR2018/005437 2017-05-11 2018-05-11 바이오매스에서 유래한 탄소원의 고성능 대사를 위한 신규 미생물 균주 Ceased WO2018208120A2 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/612,300 US11535854B2 (en) 2017-05-11 2018-05-11 Microorganism strain for high-performance metabolism of biomass-derived carbon source

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170058781 2017-05-11
KR10-2017-0058781 2017-05-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2018208120A2 true WO2018208120A2 (ko) 2018-11-15
WO2018208120A3 WO2018208120A3 (ko) 2019-03-28

Family

ID=64105516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/005437 Ceased WO2018208120A2 (ko) 2017-05-11 2018-05-11 바이오매스에서 유래한 탄소원의 고성능 대사를 위한 신규 미생물 균주

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11535854B2 (ko)
KR (1) KR102106280B1 (ko)
WO (1) WO2018208120A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500484B (zh) * 2020-02-14 2022-07-26 上海交通大学 一种快速生长的弧菌及其应用
KR102304068B1 (ko) * 2020-02-28 2021-09-17 포항공과대학교 산학협력단 비브리오 속 dhg 균주 유래 고활성 mep 회로 효소 활용을 통한 라이코펜 생산
KR102771744B1 (ko) * 2022-04-15 2025-02-24 서울대학교산학협력단 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 dhg 균주

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9267158B2 (en) 2013-03-14 2016-02-23 Intrexon Corporation Biological production of multi-carbon compounds from methane

Also Published As

Publication number Publication date
US20200354755A1 (en) 2020-11-12
US11535854B2 (en) 2022-12-27
KR20180124782A (ko) 2018-11-21
KR102106280B1 (ko) 2020-05-04
WO2018208120A3 (ko) 2019-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019203435A1 (ko) 유기산 내성 효모 유래 신규 프로모터 및 이를 이용한 목적유전자의 발현방법
Zhou et al. Optimized expression and enhanced production of alkaline protease by genetically modified Bacillus licheniformis 2709
WO2018182354A1 (ko) 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법
WO2015194921A1 (ko) 신규한 피키아 쿠드리압즈비 ng7 균주 및 이의 용도
WO2016032279A1 (en) Recombinant Yeast Producing 3-Hydroxypropionic Acid and Method for Producing 3-Hydroxypropionic Acid Using the Same
WO2009125924A2 (ko) 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법
WO2018124440A2 (ko) 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
WO2014148743A1 (ko) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
WO2016153221A1 (ko) L-아스파르트산 유도체를 생산하는 변이미생물 및 이를 이용한 l-아스파르트산 유도체의 제조방법
WO2018208120A2 (ko) 바이오매스에서 유래한 탄소원의 고성능 대사를 위한 신규 미생물 균주
WO2019190192A1 (ko) 신규한 프로모터 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
WO2014003439A1 (ko) 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도
CN103740734A (zh) 厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株
US9206445B2 (en) Biocatalysts with enhanced inhibitor tolerance
WO2015093831A1 (ko) Ｄ（－）２，３－부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 ｄ（－）２，３－부탄디올의 생산 방법
WO2015163682A1 (ko) 2，3－부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2，3－부탄디올의 생산 방법
WO2015009074A2 (ko) 신규 변이 오르니틴 디카복실레이즈 단백질 및 이의 용도
WO2014148754A1 (ko) 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법
Jiménez-Bonilla et al. Identification and investigation of autolysin genes in Clostridium saccharoperbutylacetonicum strain N1-4 for enhanced biobutanol production
WO2021002630A1 (ko) 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 신규 프로모터 hasp1와 이의 신호 펩타이드 및 이의 용도
WO2020075943A1 (ko) 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법
WO2022098163A1 (ko) 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능을 가지는 미생물 및 이의 용도
WO2020085879A1 (ko) 아세틴 화합물의 생물학적 제조 방법
WO2010093150A2 (ko) 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
WO2016195439A1 (ko) O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18797863

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18797863

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2