CN106399427A - 塔格糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种塔格糖的制备方法，属于塔格糖的多酶催化制备领域。本发明以淀粉、纤维素或它们的衍生物或者以蔗糖为底物，在一个多酶反应体系中，通过体外多酶分子机器高效催化将底物高效转化为塔格糖。本发明通过添加能够促进淀粉、纤维素或蔗糖水解的酶以及利用副产物葡萄糖的酶，显著提升了原料的转化效率和塔格糖的产率。本发明方法制备塔格糖产率高、原料价廉、生产成本低，能够实现塔格糖的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种塔格糖的制备方法，尤其涉及一种体外多酶催化将淀粉或纤维素及其衍生物转化为塔格糖的方法，属于塔格糖的酶催化制备领域。
背景技术
塔格糖(D-Tagatose)是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体。甜味特性与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的三分之一，所以被称之为低热量甜味剂。塔格糖具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。塔格糖具有四大功能：低能量，降血糖，改善肠道菌群和抗龋齿(Oh D-K:Tagatose:properties,applications,and biotechnological processes.App.Microbiol.Biotechnol.2007,76:1-8)。
生产塔格糖的方法有化学合成法和生物转化法两种。一般都以半乳糖为原料，通过化学方法或生物转化进行异构化反应而成。半乳糖原料可由乳糖水解得到，也有研究使用半乳糖醇为原料，经生物氧化为塔格糖。但半乳糖醇价格较高，目前暂不适宜用作工业化生产原料。化学合成法是利用可溶性碱金属盐或碱土金属盐为催化剂，促使D-半乳糖在碱性条件下生成塔格糖，并形成金属氢氧化物-塔格糖复合物，再用酸中和获得D-塔格糖。生物转化法包括将半乳糖醇氧化成塔格糖，和利用微生物所产生的异构酶将半乳糖异构成塔格糖两种方法。因化学法能耗高，产物复杂，纯化困难，副反应多，产生化学污染，故生物转化法具有较好的应用前景。目前研究较多的生物转化生产塔格糖的方法是利用L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖转化为塔格糖，然而半乳糖的较高价格影响了塔格糖的最终价格，导致无法广泛的使用(Rhimi M,Aghajari N,Juy M,Chouayekh H,Maguin E,Haser R,BejarS:Rational design of Bacillus stearothermophilus US100l-arabinose isomerase:Potential applications for d-tagatose production.Biochim.2009,91:650-653.OhH-J,Kim H-J,Oh D-K:Increase in d-tagatose Production Rate by Site-directedMutagenesis of l-arabinose Isomerase from Geobacillusthermodenitrificans.Biotechnol.Lett.2006,28:145-149.Bosshart A,Hee CS,Bechtold M,Schirmer T,Panke S:Directed Divergent Evolution of a ThermostableD-Tagatose Epimerase towards Improved Activity for Two HexoseSubstrates.ChemBioChem 2015,16:592-601.Men Y,Zhu Y,Zhang L,Kang Z,Izumori K,Sun Y,Ma Y:Enzymatic conversion of D-galactose to D-tagatose:Cloning,overexpression and characterization of l-arabinose isomerase from Pediococcuspentosaceus PC-5.Microbiol.Res.2014,169:171-178.)。
韩国科学家发明一种多酶催化的方法将果糖转化为塔格糖，包括利用6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶将果糖转化为塔格糖(Oh DK,HONG SH,Lee SH:Aldolase,aldolase mutants and tagatose using the same production methods andcompositions for production.WO 2015016544 A1.Google Patents；2015.)，但是从果糖生产6-磷酸果糖需要ATP对果糖进行底物磷酸化，导致塔格糖生产成本高，不适应大规模生产。
因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的适合规模化生产塔格糖的新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种塔格糖的制备方法，该方法通过体外多酶催化淀粉或纤维素以及它们的衍生物，或者蔗糖制备塔格糖，具有塔格糖的产率和转化率高，生产成本低，无污染等优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种淀粉塔格糖的制备方法，包括以下步骤：以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入含有α-葡聚糖磷酸化酶(α-Glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1)、葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)、葡萄糖磷酸异构酶(PhosphoglucoseIsomerase，EC 5.3.1.9)、6-磷酸塔格糖差向异构酶(Tagatose 6-phosphate 4-epimerase)和6-磷酸塔格糖磷酸酶(Tagatose 6-phosphatase)的多酶催化物建立多酶反应体系，进行酶催化反应，即得。
为了达到更好的效果，优选的，将所得到酶催化反应产物按照常规的方法进行分离、纯化。
所述多酶反应体系中，所述底物的浓度为1-500g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL；优选的，所述底物的浓度为100g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL。所述酶催化反应的条件为：10-90℃反应1-100小时；优选为，37℃反应24-40小时。
本发明淀粉塔格糖的制备方法中，所述淀粉优选为可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括：部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。
作为本发明的优选技术方案，所述多酶催化物中还包括(1)、(2)或(3)中任何一种：(1)淀粉去分支酶或麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)中的任何一种或两种；(2)淀粉去分支酶或葡聚糖转移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)中的任何一种或两种；(3)淀粉去分支酶、麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶中的任意一种或三种；优选的，在多酶反应体系中，所述淀粉去分支酶的用量为0.1-500U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为0.1-500U/mL；更优选的，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)或普鲁兰酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)中的任意一种或两种。
进一步优选的，为了提高塔格糖的得率，将残余的葡萄糖转化为塔格糖，所述多酶催化物中还包括：聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC 2.7.1.63)和聚磷酸盐；优选的，在多酶反应体系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-500U/mL，所述聚磷酸盐的用量为1-100mM；更优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为1U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10mM。其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
反应结束后，残余的淀粉残渣将是纯的直链淀粉，此时可加入少量的α淀粉酶(EC3.2.1.1)促进淀粉残渣的水解，进一步提高塔格糖的产量。优选的，在多酶反应体系中，所述α淀粉酶的用量为0.01-100U/ml，更优选为0.1U/ml。
本发明所述多酶反应体系中还包括：缓冲液、无机磷酸根和二价镁离子；优选的，各成分的用量为：缓冲液10-500mM，无机磷酸根2-100mM、二价镁离子1-50mM；其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH为5.0-9.0；优选的，pH为7.0；更优选的，各成分的用量为：磷酸盐缓冲液30mM(采用磷酸缓冲液就不需要无机磷酸根)、二价镁离子5mM。
本发明以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由α-葡聚糖磷酸化酶将淀粉或淀粉衍生物中的一个葡萄糖单元转化为1-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸变位酶将1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸异构酶将6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；由6-磷酸塔格糖差向异构酶将6-磷酸果糖转化为塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶将塔格糖-6-磷酸脱磷转化为塔格糖和磷酸。由于由6-磷酸塔格糖磷酸酶将塔格糖-6-磷酸脱磷转化为塔格糖的酶催化反应是不可逆反应，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率，而高得率和高转化率可以大大降低塔格糖的分离成本。
由于淀粉是直链淀粉(20-30％)和支链淀粉(70-80％)的混合物。支链淀粉中的支链是以α-1,6糖苷键与主链相连的，而α-葡聚糖磷酸化酶不能分解α-1,6糖苷键。为了提高塔格糖的转化率，本发明在多酶反应体系中加入能够分解淀粉中α-1,6糖苷键的去分支酶—异淀粉酶或普鲁兰酶。由于α-葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最终产物是麦芽糖，为了利用麦芽糖，本发明进一步在反应体系中加入麦芽糖磷酸化酶，将麦芽糖分解为1-磷酸葡萄糖和葡萄糖；更优选的，本发明在多酶反应体系中再进一步加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，由6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶转化为塔格糖，最终将淀粉及其衍生物中所有的葡萄糖单元转化为塔格糖，从而提高塔格糖的得率和转化率。在这里，麦芽糖磷酸化酶可被葡聚糖转移酶替换，该酶可以将短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，而该长链的寡聚糖又可被α-葡聚糖磷酸化酶重新利用，从而能够提高淀粉的利用率。
本发明还公开了另一种纤维素塔格糖的制备方法，包括以下步骤：以纤维素或纤维素衍生物为底物，加入含有纤维素酶、纤维多糖磷酸化酶(cellodextrinphosphorylase，EC 2.4.1.49)、纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase，EC2.4.1.20)、葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)、葡萄糖磷酸异构酶(PhosphoglucoseIsomerase，EC 5.3.1.9)、6-磷酸塔格糖差向异构酶(Tagatose 6-phosphate 4-epimerase)和6-磷酸塔格糖磷酸酶(Tagatose 6-phosphatase)的多酶催化物建立多酶反应体系，进行酶催化反应，即得。
为了达到更好的效果，优选的，将所得到酶催化反应产物按照常规的方法进行分离、纯化。
优选为，先将纤维素或纤维素衍生物和纤维素酶在冰水浴上混合，4℃离心，去上清，得到纤维素酶和纤维素的混合物；然后在纤维素酶和纤维素的混合物中，再加入纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶建立多酶反应体系。其中，纤维素或纤维素衍生物的用量为1-500g/L、纤维素酶的用量为1-500U/ml；优选的，纤维素或纤维素衍生物的用量为100g/L，纤维素酶的用量为10U/ml。该处理能够去除商业化纤维素酶中几乎所有的葡萄糖苷酶，可以避免葡萄糖苷酶水解纤维二糖生成大量的葡萄糖，从而使主要的水解产物是纤维二糖和纤维多糖。
在所述多酶反应体系中，所述纤维素酶和纤维素的混合物的浓度为1-500g/L；所述纤维多糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL；优选的，所述纤维素酶和纤维素的混合物的浓度为100g/L；所述纤维多糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL。所述酶催化反应的条件为：10-80℃反应1-120小时；优选为，37℃反应48-96小时，最优选为72小时。
为了进一步提高纤维素塔格糖的得率，所述多酶催化物中还包括：聚磷酸葡萄糖激酶(EC 2.7.1.63)和聚磷酸盐；优选的，在多酶反应体系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-500U/mL，所述聚磷酸盐的用量为1-100mM；更优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为5U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10mM；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
本发明所述多酶反应体系中还包括：缓冲液、无机磷酸根和二价镁离子；优选的，各成分的用量为：缓冲液10-500mM、无机磷酸根2-100mM、二价镁离子1-50mM；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液；更优选的，所述磷酸缓冲液的pH值为5.0-9.0，最优选为7.2；进一步优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液30mM(采用磷酸缓冲液就不需要无机磷酸根)、二价镁离子5mM。
本发明所述纤维素衍生物包括：纤维素经过预处理后的产物，纤维多糖或纤维二糖中的任意一种。所述预处理方法包括：酸水解法、酶水解法或物理法；优选的，所述纤维素经过预处理后的产物为纤维素经过浓磷酸处理后的产物(Zhang,Y.H.P.,et al.(2006)."ATransition from Cellulose Swelling to Cellulose Dissolution by o-PhosphoricAcid:Evidence from Enzymatic Hydrolysis and Supramolecular Structure."Biomacromolecules 7(2):644-648.)。
本发明以纤维素或纤维素衍生物为底物，加入纤维素酶，纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由纤维素酶水解纤维素生成纤维多糖和纤维二糖；由纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶将纤维多糖或纤维二糖的一个葡萄糖单元转化为1-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸变位酶将1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸异构酶将6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；由6-磷酸塔格糖差向异构酶将6-磷酸果糖转化为塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶将塔格糖-6-磷酸脱磷转化为塔格糖。本发明在上述多酶反应体系中进一步加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸，将纤维素水解后的最终产物葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，再由葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶转化为塔格糖，最终将纤维素及其衍生物中所有的葡萄糖单元转化为塔格糖。
本发明进一步公开了一种蔗糖塔格糖的制备方法，包括以下步骤：以蔗糖为底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的多酶催化物建立多酶催化反应体系进行酶催化反应，即得。
为了达到更好的效果，优选的，将所得到酶催化反应产物按照常规的方法进行分离、纯化。
所述的多酶催化反应体系中，所述蔗糖的浓度为10-300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL；优选的，所述蔗糖的浓度为300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量为30U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为30U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为30U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为30U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为30U/mL。所述酶催化反应的条件是：20-70℃反应2-100h；优选为，37℃反应10-72h。
其中，所述多酶反应体系中还包括：缓冲液、无机磷酸根和二价镁离子；优选的，各成分的用量为：缓冲液10-500mM，无机磷酸根2-100mM、二价镁离子1-50mM；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH为5.0-9.0；优选的，pH为7.2；更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液30mM(采用磷酸缓冲液就不需要无机磷酸根)、二价镁离子5mM。
为了进一步提高蔗糖塔格糖的得率，所述多酶催化反应体系中还包括：葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；优选的，每10g/L蔗糖，葡萄糖异构酶的用量为1U/mL，聚磷酸葡萄糖激酶的用量为5U/mL，聚磷酸盐的用量为10mM；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
本发明以蔗糖为底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由蔗糖磷酸化酶将蔗糖中的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由葡萄糖磷酸异构酶将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖差向异构酶将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶将塔格糖-6-磷酸脱磷转化为塔格糖和磷酸。本发明在上述多酶反应体系中进一步加入葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐，将蔗糖水解后的终产物葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，再由葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶转化为塔格糖。
本发明体外多酶催化淀粉或纤维素以及它们的衍生物，或者蔗糖制备塔格糖的方法，所述酶催化反应可在一个或多个反应器分步进行，优选为在一个反应器中进行。
本发明多酶反应体系中的任何一种酶可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶。
本发明体外多酶催化将淀粉转化为塔格糖实验中，在一个反应体系中，以可溶性淀粉为底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶进行催化反应，塔格糖的转化率为37％。而在上述反应体系中进一步加入异淀粉酶、麦芽糖磷酸化酶、聚磷酸葡萄糖激酶、葡聚糖转移酶和聚磷酸钠，最终塔格糖的转化率达到72％，转化率显著提高。
本发明体外多酶催化将纤维素转化为塔格糖实验中，在一个反应体系中，以重生的非晶形的纤维素为底物，加入纤维素酶、纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶进行催化反应，塔格糖的转化率为35％。在上述反应体系中另外加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸钠，最终塔格糖的转化率达到68％以上，转化率显著提高。
本发明体外多酶催化将蔗糖转化为塔格糖实验中，在一个反应体系中，以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶、葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸钠进行催化反应，最终塔格糖的转化率达到63％。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)原料价格低廉。本发明以淀粉或纤维素以及它们的衍生物为原料，或者以蔗糖为原料，而不是使用昂贵的半乳糖。因此，塔格糖的生产成本低，适于大规模生产。
(2)塔格糖的得率高。本发明体外多酶催化反应的最后一步，即由6-磷酸塔格糖磷酸酶将塔格糖-6-磷酸脱磷转化为塔格糖的酶催化反应是不可逆过程，因此可以获得很高的塔格糖转化率，从而降低塔格糖的分离成本。
(3)本发明制备方法不用果糖作原料，不需要ATP进行底物磷酸化生产6-磷酸果糖，大大降低生产塔格糖的成本。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。
附图说明
图1为转化淀粉生成塔格糖的体外多酶催化途径的示意图；其中，IA，异淀粉酶；PA，普鲁兰酶；αGP，α-葡聚糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；PGI，葡萄糖磷酸异构酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向异构酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；MP，麦芽糖磷酸化酶(该酶可被葡聚糖转移酶替换)；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；
图2为利用HPLC检测以可溶性淀粉为底物，经过酶促反应后的产物，箭头所指表示塔格糖的特征峰；
图3为转化纤维素生成塔格糖的体外多酶催化途径的示意图；其中，Cellulase，纤维素酶；CDP，纤维多糖磷酸化酶；CBP，纤维二糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；PGI，葡萄糖磷酸异构酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向异构酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；
图4为转化蔗糖生成塔格糖的体外多酶催化途径的示意图；其中，SP，蔗糖磷酸化酶；GI，葡萄糖异构酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；PGI，葡萄糖磷酸异构酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向异构酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；
图5为用HPLC检测以蔗糖为底物，经过酶促反应后的产物，箭头所指表示塔格糖的特征峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料
可溶性淀粉，soluble starch，ACROS公司产品，产品编号：424490020；
麦芽糊精，ALDRICH公司产品，产品编号419672；
pET20b载体，Novagen，Madison，WI；
大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；
本发明中的大部分酶(除了塔格糖-6-磷酸差向异构酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶，聚磷酸葡萄糖激酶和葡聚糖转移酶)能在Sigma公司购买得到；但是都可以按照基因工程方法通过原核表达获得；
纤维素酶从Sigma公司购买，产品编号为C2730；
麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284；
α淀粉酶从Sigma公司购买，产品编号为10065；
Avicel，微晶形纤维素，从Sigma公司购买，产品编号为11365。
实验例1体外多酶催化将淀粉转化为塔格糖
通过一个体外多酶催化体系将淀粉转化为塔格糖(图1)。这些关键酶包括：(1)α-葡聚糖磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)，从淀粉的非还原端加上1个磷酸盐释放出1-磷酸葡萄糖；(2)葡萄糖磷酸变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)，催化1-磷酸葡萄糖到6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶，将6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；(4)6-磷酸塔格糖差向异构酶，将6-磷酸果糖转化为塔格糖-6-磷酸；(5)6-磷酸塔格糖磷酸酶将塔格糖-6-磷酸脱磷转化为塔格糖和磷酸。
在本发明中，α-葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM1168；葡萄糖磷酸变位酶也来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶来源于Clostridium thermocellum，基因在KEGG上的编号为Cthe0217；6-磷酸塔格糖差向异构酶来自于Agrobacterium fabrum，基因在KEGG上的编号为Atu3167；6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于Archaeoglobus fulgidus，基因在KEGG上的编号为AF_0444，这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这五个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b载体((Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET20b-TmαGP、pET20b-TmPGM、pET20b-CtPGI、pET20b-AtaT6E和pET20b-AfT6P。这五个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达与纯化。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在37℃进行催化反应，反应24个小时。
根据保持时间的不同，HPLC可以用来区分反应液中的塔格糖、葡萄糖、1-磷酸葡萄糖或6-磷酸葡萄糖；并且可以对塔格糖进行定量，塔格糖的浓度与HPLC中塔格糖特征峰的强度是成正比的；HPLC的流动相为5mM的稀硫酸。
反应结束后，最终塔格糖(图2)的终浓度是37g/L，转化率为37％。
实验例2体外多酶催化将淀粉转化为塔格糖
α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在20℃进行催化反应，反应24个小时。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是16g/L，转化率为16％。
实验例3体外多酶催化将淀粉转化为塔格糖
α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在50℃进行催化反应，反应24个小时。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是8g/L，转化率为8％。
实验例4通过过程优化和添加促进淀粉水解的酶，利用体外多酶催化将淀粉转化为塔格糖
由于淀粉是有分支链，单纯采用α-葡聚糖磷酸化酶并不能完全将淀粉水解，因为α-葡聚糖磷酸化酶只会作用于α-1，4糖苷键，而分支链是以α-1，6糖苷键与主链连接的。这需要加入异淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)水解α-1，6糖苷键。最后，淀粉被这两种酶水解的最终产物是麦芽糖和葡萄糖，为了将这些最终产物转化为塔格糖，还需要加入麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)和聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC 2.7.1.63)。
在本发明中，异淀粉酶来源于Sulfolobus tokodaii，基因在KEGG上的编号为ST0928，该菌株的基因组DNA是德国Albert-Ludwigs- Freiburg的GeorgFuchs教授友情提供。聚磷酸葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的编号为Tfu1811，该菌株的基因组DNA是美国康奈尔大学的David Wilson教授友情提供。葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis，基因在KEGG上的编号为OCC_10078，该菌株的基因组DNA可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这三个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."SimpleCloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichiacoli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-StIA，pET20b-TfuPPGK和pET20b-Ti4GT，这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达与纯化。
α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1；麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，1U/mL的异淀粉酶，1U/mL的麦芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖转移酶，10mM聚磷酸钠，100g/L的可溶性淀粉，在37℃进行催化反应，反应40个小时。塔格糖的检测方法同实验例1，最终塔格糖(图2)的终浓度为72g/L，转化率达到了72％。
实验例5通过过程优化和添加促进淀粉水解的酶，利用体外多酶催化将淀粉转化为塔格糖
α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制备同实验例4，普鲁兰酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)从Sigma公司购买，产品编号为P1067；麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，1U/mL的麦芽糖磷酸化酶，1U/mL的普鲁兰酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖转移酶，10mM聚磷酸钠，100g/L的可溶性淀粉，在37℃进行催化反应，反应40个小时。塔格糖的检测方法同实验例1，最终塔格糖的终浓度为73g/L，转化率达到了73％。
随后在反应体系中加入少量的α淀粉酶促进残渣淀粉的水解，提高塔格糖的产量，α淀粉酶的用量为0.1U/ml，继续在37℃反应24小时，最终塔格糖(图2)的终浓度为88g/L，转化率达到了88％。
实验例6体外多酶催化将麦芽糊精转化为塔格糖
α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1；异淀粉酶、聚磷酸葡萄糖激酶的制备同实验例4，麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，1U/mL的异淀粉酶，1U/mL的麦芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖转移酶，10mM聚磷酸钠，100g/L的麦芽糊精(ALDRICH公司产品，产品编号419672)，在37℃进行催化反应，反应40个小时。塔格糖的检测方法同实验例1，最终塔格糖的终浓度为78g/L，转化率达到了78％。
实验例7体外多酶催化将纤维素转化为塔格糖
通过一个体外多酶催化体系将纤维素转化为塔格糖的示意图见图3。
纤维素酶是来自于Sigma公司的产品，产品编号为C2730；葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1。
纤维多糖磷酸化酶(Cthe_2989)和纤维二糖磷酸化酶(Cthe_0275)都是来源于Clostridium thermocellum。这两个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA(基因组DNA可从ATCC的官方网站(www.atcc.org/)上获得)中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-CthCDP和pET20b-CthCBP。这两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达与纯化。
本实验采用微晶形纤维素(Avicel)为底物。首先将商业化的纤维素酶(10U/ml)和纤维素(100g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分钟，在4℃离心，去上清。沉淀为纤维素和能与纤维素结合的纤维素酶的混合物。该处理能够去除商业化纤维素酶中几乎所有的葡萄糖苷酶，这样可以避免葡萄糖苷酶水解纤维二糖生成大量的葡萄糖，从而使主要的水解产物是纤维二糖和纤维多糖。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.2)，5mM的二价镁离子，10U/mL的纤维多糖磷酸化酶，10U/mL纤维二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的如上所述的纤维素和纤维素酶的混合物，在37℃进行催化反应，反应72个小时。塔格糖的检测方法同实验例1，最终塔格糖的终浓度是14g/L，转化率为14％。
实验例8体外多酶催化将纤维素转化为塔格糖
纤维素酶是来自于Sigma公司的产品，产品编号为C2730；葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸塔格糖差向异构酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1；纤维多糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶的制备同实验例7。
本实验采用重生的非晶形的纤维素(Regenerated Amorphous cellulose(RAC)，这是Avicel经过浓磷酸处理后的产物)(Zhang,Y.H.P.,et al.(2006)."A Transitionfrom Cellulose Swelling to Cellulose Dissolution by o-Phosphoric Acid:Evidence from Enzymatic Hydrolysis and Supramolecular Structure."Biomacromolecules 7(2):644-648.)为底物。首先将商业化的纤维素酶(10U/ml)和该纤维素(100g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分钟，在4℃离心，去上清。沉淀为纤维素和能与纤维素结合的纤维素酶的混合物。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.2)，5mM的二价镁离子，10U/mL的纤维多糖磷酸化酶，10U/mL纤维二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的如上所述的纤维素和纤维素酶的混合物，在37℃进行催化反应，反应72个小时。塔格糖的检测方法同实验例1，最终塔格糖的终浓度是35g/L，转化率为35％。
实验例9体外多酶催化将纤维素转化为塔格糖
纤维素酶是来自于Sigma公司的产品，产品编号为C2730；葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1；纤维多糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶的制备同实验例7。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.2)，5mM的二价镁离子，10U/mL的纤维多糖磷酸化酶，10U/mL纤维二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的实验例8的纤维素和纤维素酶的混合物，在25℃进行催化反应，反应24个小时。最终塔格糖的终浓度是29g/L，转化率为29％。
实验例10体外多酶催化将纤维素转化为塔格糖
纤维素酶是来自于Sigma公司的产品，产品编号为C2730；葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1；纤维多糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶的制备同实验例7。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.2)，5mM的二价镁离子，10U/mL的纤维多糖磷酸化酶，10U/mL纤维二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的实验例8的纤维素和纤维素酶的混合物，在50℃进行催化反应，反应24个小时。最终塔格糖的终浓度是9g/L，转化率为9％。
实验例11体外多酶催化将纤维素转化为塔格糖
由于纤维素水解后的最终产物为葡萄糖，为了将其转化为塔格糖，还需要加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸。
纤维素酶是来自于Sigma公司的产品，产品编号为C2730；葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制备同实验例4；纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶的制备同实验例7。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.2)，5mM的二价镁离子，10U/mL的纤维多糖磷酸化酶，10U/mL纤维二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向异构酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的实验例8的纤维素和纤维素酶的混合物，5U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸钠，在37℃进行催化反应，反应72个小时。塔格糖的检测方法同实验例1，最终塔格糖的终浓度为68g/L，转化率达到了68％。
实验例12体外多酶催化将蔗糖转化为塔格糖
通过一个体外多酶催化体系将蔗糖转化为塔格糖的示意图见图4。
蔗糖磷酸化酶是来源于Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum JW/SL-YS485，该基因所编码的酶在NCBI数据库的编号是WP_015312040.1。这个基因用引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012),"SimpleCloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichiacoli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.))的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-SP。这个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达与纯化(Qi P,You C,Zhang YHP:One-Pot EnzymaticConversion of Sucrose to Synthetic Amylose by using Enzyme Cascades.ACSCatal.2014,4:1311-1317.)
葡萄糖异构酶是来自于Sigma公司的产品，产品编号为G4166；葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1。聚磷酸葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca YX，基因在KEGG上的编号为Tfu1811；这个基因用引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，这个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012))的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体。这个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达与纯化(Liao HH,Myung S,Zhang Y-HP.2012.One-step purification and immobilizationof thermophilic polyphosphate glucokinase from Thermobifida fusca YX:glucose-6-phosphate generation without ATP Appl.Microbiol.Biotechnol.93:1109-1117)。葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制备同实验例1。
在一个0.75毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.2)，300g/L蔗糖，5mM的二价镁离子，30U/mL的蔗糖磷酸化酶，30U/mL的葡萄糖磷酸变位酶，30U/mL的葡萄糖磷酸异构酶，30U/mL的6-磷酸塔格糖差向异构酶，30U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，30U/mL的葡萄糖异构酶，150U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，300mM聚磷酸钠，在37℃进行催化反应，反应72个小时。最终塔格糖的终浓度为188g/L，转化率达到了63％，HPLC图如5所示。
Claims (18)
1.一种塔格糖的制备方法，其特征在于，以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入含有α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根离子，建立多酶分子机器并进行多酶催化反应，即得塔格糖。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中，所述底物的浓度为1-500g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL，所述无机磷酸根的浓度为2-100mM；
优选的，所述底物的浓度为100g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，所述无机磷酸根的浓度为30mM。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述酶催化反应的条件为：10-90℃反应1-100小时；优选为，37℃反应24-40小时。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括(1)、(2)或(3)中任何一种：(1)淀粉去分支酶或麦芽糖磷酸化酶中的任何一种或两种；(2)淀粉去分支酶或葡聚糖转移酶中的任何一种或两种；(3)淀粉去分支酶、麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶中的任意一种或三种；
优选的，在多酶反应体系中，所述淀粉去分支酶的用量为0.1-500U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为0.1-500U/mL，所述葡聚糖转移酶的用量为0.1-500U/mL；
更优选的，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为1U/mL，所述葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；
其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。
6.按照权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括：聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；
优选的，在多酶反应体系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-500U/mL，所述聚磷酸盐的用量为1-100mM；更优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为1U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10mM；
其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
7.按照权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括α淀粉酶；优选的，在多酶反应体系中，所述α淀粉酶的用量为0.01-100U/ml，更优选为0.1U/ml。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还包括：缓冲液和二价镁离子；
优选的，各成分的用量为：缓冲液10-500mM，二价镁离子1-50mM；
其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH为5.0-9.0；优选的，pH为7.0；
更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液30mM，二价镁离子5mM。
9.一种塔格糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以纤维素或纤维素衍生物为底物，加入含有纤维素酶、纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根的多酶催化物建立多酶反应体系，进行酶催化反应，即得塔格糖。
10.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：先将纤维素或纤维素衍生物和纤维素酶混合，离心，去上清，得到纤维素酶和纤维素的混合物；再加入纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根，建立多酶分子机器反应体系；
其中，纤维素或纤维素衍生物的用量为1-500g/L、纤维素酶的用量为1-500U/ml；优选的，纤维素或纤维素衍生物的用量为100g/L，纤维素酶的用量为10U/ml。
11.按照权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于：在所述多酶反应体系中，所述纤维素酶和纤维素的混合物的浓度为1-500g/L；所述纤维多糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL，所述无机磷酸根的浓度为2-100mM；
优选的，所述纤维素酶和纤维素的混合物的浓度为100g/L；所述纤维多糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，所述无机磷酸根的浓度为30mM。
12.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述酶催化反应的条件为：10-80℃反应1-120小时；优选为，37℃反应48-96小时；
所述纤维素衍生物包括纤维素经过预处理后的产物；优选的，所述纤维素衍生物是纤维多糖或纤维二糖中的任意一种；
所述预处理方法包括酸水解法、酶水解法或物理法；优选的，所述纤维素经过预处理后的产物为纤维素经过浓磷酸处理后的产物。
13.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括：聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；
优选的，在多酶反应体系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-500U/mL，所述聚磷酸盐的用量为1-100mM；更优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为5U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10mM；
其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
14.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还包括：缓冲液、二价镁离子；
优选的，各成分的用量为：缓冲液10-500mM、二价镁离子1-50mM；
其中，优选缓冲液为磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液的pH值为5.0-9.0，优选为7.2；
更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液30mM、二价镁离子5mM。
15.一种塔格糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以蔗糖为底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根的多酶催化物建立多酶分子机器反应体系进行酶催化反应，即得塔格糖。
16.按照权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的多酶催化反应体系中，所述蔗糖的浓度为10-300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL，所述无机磷酸根的浓度为2-100mM；
优选的，所述蔗糖的浓度为300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量为30U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为30U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为30U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为30U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为30U/mL，所述无机磷酸根的浓度为30mM；
所述酶催化反应的条件是：20-70℃反应2-100h；优选为，37℃反应10-72h。
17.按照权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述多酶反应体系中还包括：缓冲液和二价镁离子；
优选的，各成分的用量为：缓冲液10-500mM，二价镁离子1-50mM；
其中，优选缓冲液为磷酸缓冲液，pH为5.0-9.0；优选的，pH为7.2；
更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液30mM、二价镁离子5mM。
18.按照权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系中还包括：葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；
优选的，每10g/L蔗糖，葡萄糖异构酶的用量为1U/mL，聚磷酸葡萄糖激酶的用量为5U/mL，聚磷酸盐的用量为10mM；
其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
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