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KR20180111666A - 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 - Google Patents

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 Download PDF

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KR20180111666A
KR20180111666A KR1020180036907A KR20180036907A KR20180111666A KR 20180111666 A KR20180111666 A KR 20180111666A KR 1020180036907 A KR1020180036907 A KR 1020180036907A KR 20180036907 A KR20180036907 A KR 20180036907A KR 20180111666 A KR20180111666 A KR 20180111666A
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씨제이제일제당 (주)
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Abstract

본 출원은 과당-6-인산-4-에피머화효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 {A composition for preparing tagatose and Methods for producing tagatose using The Same}
본 출원은 과당-6-인산 4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스-6-인산 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.
종래 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적 방법(촉매 반응)과 생물학적 방법(이성화 효소반응)이 있다(대한민국 등록특허 제10-0964091호 참조). 그러나 종래의 제조방법에서 주원료로 사용되는 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격이 불안정하여 안정적 수급에 한계가 있다. 이러한 종래 타가토스 제조방법의 문제점을 극복하기 위하여, 헥수론산 4-에피머화효소(hexuronate C4-epimerase)를 사용하여 수급 안정형 저가 원료인 과당(D-fructose)로부터 타가토스를 제조하는 방법들이 보고되었으나(2011. Appl Biochem Biotechnol. 163:444-451; 대한민국 등록특허 제10-1550796호), 상기 이성화 효소반응의 전환율(conversion ratio)이 낮은 한계가 있다.
타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)는 하기 [반응식 1]과 같이 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-디포스페이트(D-glyceraldehyde 3-diphosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여함이 공지된 바 있으나, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 활성을 가지는지에 대한 연구는 전무하다.
[반응식 1]
D-타가토스 1,6-이인산 <=> 글리세론 포스페이트 + D-글리세랄데하이드 3-디포스페이트
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 타가토스의 제조에 사용될 수 있는 효소를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)가 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 기능이 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
이에 포도당 또는 전분을 원료로 포도당-1-인산 및 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)을 순차적으로 제조한 후 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 이용하여 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)을 타가토스-6-인산(tagatose-6-phosphate)으로 전환시키고, 비가역 반응경로를 수행하는 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase)를 이용하여 타가토스를 생산할 수 있으면서, 포도당 또는 전분에서 타가토스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-0964091호 대한민국 등록특허 제10-1550796호
2011. Appl Biochem Biotechnol. 163:444-451
본 출원의 일 목적은 타가토스-6-인산 제조에 유용한 조성물을 제공하기 위한 것으로, 상기 조성물은 타가토스-이인산 알돌레이즈, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함한다.
본 출원의 다른 일 목적은 타가토스의 제조에 유용한 조성물을 제공하기 위한 것으로, 상기 조성물은 타가토스-이인산 알돌레이즈, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 및 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함한다.
본 출원의 다른 목적은 과당-6-인산에, 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 것을 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공하는 것으로 상기 방법은 상기 타가토스-6-인산을 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 일 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 일 양태로서 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스-6-인산 생산용 조성물을 제공한다.
타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)는 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-디포스페이트(D-glyceraldehyde 3-diphosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여하는 것으로 알려져 있는 것으로서, 예를 들어 과당-6-인산을 기질로 하여 타가토스-6-인산을 생산할 수 있다면 한정 없이 포함될 수 있다.
구체적으로 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9 의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이거나, 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9 의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능(즉, 과당-6-인산의 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스-6-인산으로 전환시키는 과당-6-인산 C4-에피머화 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 과당-6-인산 C4-에피머화 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다. 이에, 상기 타가토스-6-인산 생산용 조성물은 과당-6-인산을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1, 3, 5, 7, 또는 9 의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 이르러 '타가토스-이인산 알돌레이즈'가 과당-6-인산의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 과당-6-인산 4-에피머화 활성을 나타냄을 밝혀내었으며 따라서 본원에서는'타가토스-이인산 알돌레이즈' 는 '과당-6-인산-4-에피머화효소(Fructose-6-phosphate C4 epimerase)'와 호환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리펩티드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 동일성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화효소는 호열성 미생물 유래 효소 또는 이의 변이체일 수 있으며, 예를 들어, 썸언에어로드릭스 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 코스모토가 sp. 유래 효소 또는 이의 변이체, 로도써머스 sp. 유래 효소 또는 이의 변이체, 또는 림노코르다 sp. 유래 효소 또는 이의 변이체일 수 있고, 구체적으로는 구체적으로는, 썸언에어로드릭스 데센시스(Thermanaerothrix daxensis), 코스모토가 오엘리아(Kosmotoga olearia), 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus), 로더써머스 프로펀디(Rhodothermus profundi) 또는 림노코르다 필로사(Limnochorda pilosa) 유래 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 D-프럭토스(과당)-6-인산의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스-6-인산으로 전환시키는 특징이 있다. 본원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소로는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase) 활성을 가지는 것으로 알려진 효소를 사용할 수 있으며, 타가토스-이인산 알돌레이즈는 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)을 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-디포스페이트(D-glyceraldehyde 3-diphosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여한다. 본 출원에 이르러, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 새로이 밝혀 내었다. 이에, 본 출원의 일 구현예는 과당-6-인산으로부터 타가토스-6-인산을 제조함에 있어서 타가토스-이인산 알돌레이즈를 과당-6-인산-4-에피머화 효소로 사용하는 것을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈의 신규 용도에 관한 것이다. 또한, 본 출원의 일 구현예는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 과당-6-인산-4-에피머화 효소로 사용하여 과당-6-인산으로부터 타가토스-6-인산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예로, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 55℃ 내지 65℃, 60℃ 내지 70℃, 55℃, 60℃, 또는 70℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다.
나아가 이에 제한되는 것은 아니나 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-4-에피머화효소는 각각 순서대로 서열번호 2, 4, 6, 8, 또는 10의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 본 출원의 상기 효소 또는 이의 변이체를 발현하는 DNA, 예컨대, 서열번호 2, 4, 6, 8, 또는 10으 로 E. coli 등의 균주에 형질전환시킨 다음, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제하여 수득한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주는 대장균(Escherichia coli) 외에도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다. 구체예에서, 이러한 형질전환된 균주로 미생물은 E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_LP_F6P4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1 일 수 있다. 이들은 각각 순서대로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11999P (E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E) (기탁일: 2017년 3월 24일), KCCM12096P (E. coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E) (기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12097P(E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E) (기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12095P( E. coli BL21(DE3)/ CJ_LP_F6P4E) (기탁일: 2017년 8월 11일), 및 KCCM11995P(E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1)(기탁일: 2017년 3월 20일)로로 기탁되었다.
본 출원에서 사용되는 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 이를 암호화하는 핵산을 이용하여 제공될 수 있다.
본 출원에서 용어, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(참조문헌: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 출원의 핵산은 본 출원의 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지면서 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산일 수 있다. 예컨데, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 2의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 3, 5, 7 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 암호화하는 각각의 핵산은 이에 상응하는 서열번호 4, 6, 8, 또는 10의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있다. 더불어, 본 출원의 핵산은 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소로 번역될 수 있는 핵산을 포함할 수 있고, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 역시 포함할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 사용될 수 있는 과당-6-인산-4-에피머화효소를 발현하는 미생물은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기
벡터는 본 출원의 핵산이 작동가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 출원에서 이용될 수 있는 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 핵산 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 미생물의 구체예로는 E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_LP_F6P4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1등일 수 있다.
본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 또는 관련 효소를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈 또는 관련 효소를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25℃ 내지 40 ℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원은 다른 양태로서 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 및 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.
상기 타가토스-6-인산 생산용 조성물에 관한 사항은 타가토스 생산용 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 타가토스-6-인산의 인산기를 제거하여 타가토스로 전환시키는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 마리티마(Themotoga maritima) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 유전적 상동성 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 포도당-6-인산 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 효소의 존재하에 포도당-6-인산을 이성화하여 과당-6-인산을 생성할 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 이성화시키는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 마리티마 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 유전적 상동성 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 효소는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키거나, 포도당-6-인산을 포도당-1-인산으로 전환시키는 가역 반응을 촉매한다. 본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 또는 그 역으로 전환시킬 수 있는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 포스포글루코무타아제는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 네아폴리타나 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 포스포글루코무타아제는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 포스포글루코무타아제는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 포도당 인산화 효소(glucokinase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 포도당 인산화 효소는 포도당을 인산화하는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 포도당 인산화 효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 데이노코커스 sp. 또는 언에어로리네 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 데이노코커스 지오써말리스(Deinococcus geothermalis), 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 포도당 인산화 효소는 포도당을 포도당-6-인산으로 전환시킬 수 있는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 포도당 인산화 효소는 포스페이트 의존형 포도당 인산화 효소일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 포도당 인산화 효소는 서열번호 17 또는 19의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 포도당 인산화 효소는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있고, 본 출원의 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 포도당 인산화 효소는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 전분 포스포릴라아제(starch phosphorylase), 말토덱스트린 포스포릴라아제(maltodextrin phosphorylase) 또는 수크로오스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 포스포릴라아제는, 전분, 말토덱스트린, 또는 수크로오스를 포도당-1-인산으로 전환시킬 수 있는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 포스포릴라아제는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 네아폴리타나 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 포스포릴라아제는 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 포스포릴라아제는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 또는 이소아밀라아제(isoamylase); 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 타가토스 생산용 조성물은 본원에 기재된 타가토스 생산에 사용될 수 있는 2종 이상의 효소들 또는 이의 형질전환체들을 개별적으로 포함하거나, 2종 이상의 효소를 암호화하는 뉴클레오티드들로 형질전환된 형질전환체를 포함할 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 4-α-글루카노트랜스퍼라아제(4-α-glucanotransferase), 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 마리티마 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
상기한 구현예들에서 사용될 수 있는 미생물의 예로는, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2, 및 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4 등을 들 수 있다. 상기 재조합미생물 각각은, 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11990P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1), KCCM11991P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2), KCCM11992P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1), KCCM11993P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2), KCCM11994P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4) 로 기탁되었다.
본원의 타가토스 생산용 조성물은 상술한 효소들의 각각의 기질에 해당하는 물질, 성분, 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈, 코발트, 알루미늄, 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO4, MgSO4, MgCl2, NiCl2, CoCl2, CoSO4 , MnCl2 또는 MnSO4일 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 과당-6-인산을, 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 것을 포함하는, 타가토스-6-인산의 제조방법에 관한 것이다.
상기 타가토스-6-인산 생산용 조성물에 관한 사항은 타가토스 생산용 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.
또한 본 출원의 또 다른 양태는, 과당-6-인산을, 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 것을 포함하는, 타가토스의 제조방법에 관한 것이다. 상기 타가토스 제조방법은 상기 타가토스-6-인산을 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은, 포도당에 본원에 기술된 바와 같은 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 본원에 기술된 바와 같은 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 포도당에 본원에 기술된 바와 같은 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로오스로 전환시키는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법에서 각 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 36시간, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 36시간, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 12시간 내지 36시간 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속, 금속 이온 또는 금속염의 존재하에서 수행할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 본원에 기술된 타가토스 생산용 조성물을, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; 및 포스페이트(polyphosphate)와 접촉시키는 것을 포함하는 타가토스의 제조방법에 관한 것이다.
본 출원의 일 구체예에서,
포도당에, 본원에 기술된 바와 같은 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환시키고,
상기 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키고,
상기 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에, 본원에 기재된 과당-6-인산-4-에피머화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키고,
상기 타가토스-6-인산(tagatose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 타가토스-6-인산 탈인산화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 것을 포함하는 타가토스의 제조 방법이 제공된다.
상기 각 전환 반응은 순차적으로 실시되거나, 동일 반응계의 in situ 반응으로 실시될 수 있다. 상기 방법에서, 상기 탈인산화효소에 의해 타가토스-6-인산으로부터 유리된 인산이, 포도당 인산화 효소의 기질로 사용되어 포도당-6-인산의 생성에 사용되므로, 인산이 축적되지 않아 높은 전환율을 얻을 수 있다.
상기 방법에서 포도당은, 일 예에서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 본원에 기술된 바와 같은 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환시켜 제조된 것일 수 있다. 이에, 상기 구체예에 따른 방법은 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 구체예에서,
포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키고,
상기 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키고,
상기 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에, 본원에 기재된 과당-6-인산-4-에피머화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키고,
상기 타가토스-6-인산(tagatose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 타가토스-6-인산 탈인산화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 것을 포함하는 타가토스의 제조 방법이 제공된다.
상기 각 전환 반응은 순차적으로 실시되거나, 동일 반응계의 in situ 반응으로 실시될 수 있다.
상기 방법에서 포도당-1-인산은, 일 예에서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 본원에 기술된 바와 같은 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환시켜 제조된 것일 수 있다. 이에, 상기 구체예에 따른 방법은 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 탈인산화효소에 의해 타가토스-6-인산으로부터 유리된 인산이, 포스포릴라아제의 기질로 사용되어 포도당-1-인산의 생성에 사용되므로, 인산이 축적되지 않아 높은 전환율을 얻을 수 있다.
상기 방법은 추가로 제조된 타가토스를 정제하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 상기 정제는 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 타가토스 생성 반응물을 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 출원은 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 둘 다를 실시하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 타가토스 반응물을 얻을 수 있다.
본 출원에 따른 타가토스 제조 방법은 포도당 또는 전분을 원료로 사용하여 경제적이며, 인산이 축적되지 않아 높은 전환율을 얻을 수 있으며, 비가역 반응경로인 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase) 반응을 포함함으로써 타가토스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
또한, 포도당 또는 전분을 원료로 하여 복합 효소 반응을 통하여 타가토스를 생산할 수 있어, 제조 방법이 간단하면서도 경제적이며 수율이 개선된 이점이 있다.
도 1a 내지 1d는 본 출원의 일 실시예의 타가토스-이인산 알돌레이즈(CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E 및 CJ_LP_F6P4E)가 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 2a 및 2b는 본 출원의 일 실시예에서 과당-6-인산에 타가토스-이인산 알돌레이즈 (CJ_KO_F6P4E 및 CJ_RP_F6P4E) 및 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(CJ_T4)로 처리시 타가토스로 전환됨을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 3은 본 출원의 일 실시예의 효소인 T4가 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 4는 본 출원의 일 실시예에서 전분, 수크로스 또는 포도당으로부터 타가토스 제조의 반응 경로에 사용되는 효소들의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석한 결과를 나타낸다. M은 단백질 크기측정 마커(size marker, Bio-RAD, USA)이다.
도 5는 본 출원의 일 실시예의 효소인 TD1(CJ_TD1_F6P4E) 이 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 6은 본 출원의 말토덱스트린으로부터 타가토스 제조 경로에 관여하는 모든 효소를 동시에 첨가한 경우, 복합효소반응에 의하여 타가토스가 생성됨을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과로 타가토스-이인산 알돌레이즈로 TD1(CJ_TD1_F6P4E)을 이용한 것이다.
이하, 본 출원을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 각 효소들의 재조합 발현 벡터 및 형질전환체들의 제조
본 출원의 타가토스 제조 경로에 필요한 내열성 효소인 α-글루칸 포스포릴라아제 (α-glucan phosphorylase), 포스포글루코무타아제 (phosphoglucomutase), 포도당-6-인산-이성화효소 (glucose-6-phosphate-isomerase), 4-α-글루카노트랜스퍼라아제(4-α-glucanotransferase) 를 제공하기 위해 호열성 미생물인 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 또는 써모토가 마리티마의 Genbank에 등록된 유전자 서열들을 대상으로 상기 효소들로 예상되는 유전자 서열을 선발[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 22(CT1), 서열번호 16(CT2), 서열번호 14(TN1), 서열번호 24(TN2)]하였다.
상기 선발한 유전자의 서열을 기반으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 21: CT1-Fp, 서열번호 27: CT2-Fp, 서열번호 29: TN1-Fp, 서열번호 31: TN2-Fp) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 26: CT1-Rp, 서열번호 28: CT2-Rp, 서열번호 30: TN1-Rp, 서열번호 32: TN2-Rp)를 고안하여 합성하고, 이를 이용하여 써모토가 네아폴리타나의 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 각 효소의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각 효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ 또는 SalI 을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 각각 pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_tn1, pET21a-CJ_tn2이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다.
상기 발현벡터들은 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2 이라 명명된 형질전환체(형질전환 미생물)를 각각 제조하고, 상기 형질전환체를 부다페스트 조약 하에 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11990P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1), KCCM11991P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2), KCCM11992P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1), 및 KCCM11993P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2)로 각각 기탁하였다.
실시예 2: 재조합 효소의 제조
실시예 1에서 제조한 각 효소를 발현하는 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2를 5 ml LB 액체배지가 담긴 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다.
본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지가 담긴 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 배양 과정 중의 교반 속도는 180 rpm이며 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000Хg로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000Хg로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하고, 이로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 각 효소를 정제하였다. 정제된 재조합 효소액을 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석한 후 반응에 사용하였다.
정제된 각 효소는 SDS-PAGE 분석을 통하여 분자량을 확인하였으며, 그 결과, CT1(α-글루칸포스포릴레이즈)은 약 96 kDa, CT2(포스포글루코무타아제)는 약 53 kDa, TN1(포도당-6-인산-이성화효소)은 약 51 kDa 인 것을 확인하였다.
실시예 3: 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 과당-6-인산-4- 에피머화 효소 활성 확인
3-1. 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 재조합 미생물의 제조
신규 내열성의 과당-6-인산-4-에피머화효소(Fructose-6-phosphate-4-epimerase)를 발굴하기 위해 호열성 미생물인 코스모토가 오엘리아(Kosmotoga olearia), 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus), 로더써머스 프로펀디(Rhodothermus profundi) 및 림노코르다 필로사(Limnochorda pilosa) 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조하였다.
구체적으로, Genbank 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 에 등록된 코스모토가 오엘리아 또는 로도써머스 마리너스 ATCC 43812, 로더써머스 프로펀디 DSM 22212 및 림노코르다 필로사 DSM 28787 유전자 서열을 대상으로 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 4종 미생물의 아미노산 서열(서열번호 1, 3, 5 및 7)과 염기 서열(서열번호 2, 4, 6 및 8) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_KO_F6P4E, pBT7-C-His-CJ_RM_F6P4E, pBT7-C-His-CJ_RP_F6P4E 및 pBT7-C-His-CJ_LP_F6P4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).
상기 제조된 발현벡터들은 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E 및 E. coli BL21(DE3)/ CJ_LP_F6P4E로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM11999P(기탁일자 2017년 3월 24일), KCCM12096P(기탁일자 2017년 8월 11일), KCCM12097P(기탁일자 2017년 8월 11일) 및 KCCM12095P(기탁일자 2017년 8월 11일)를 부여 받았다.
추가의 신규 내열성의 과당-6-인산-4-에피머화효소(Fructose-6-phosphate-4-epimerase)를 발굴하기 위해 호열성 미생물인 썸언에어로드릭스 데센시스 의 Genbank에 등록된 유전자 서열들을 대상으로 상기 효소로 예상되는 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물의 아미노산 서열(서열번호 9) 과 염기서열(서열번호 10) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His(바이오니아社)에 삽입하여 pBT7-C-His-CJ_td1 이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. 상기 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1 이라 명명된 형질전환체(형질전환 미생물)를 제조하고, 상기 형질전환체를 부다페스트 조약 하에 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11995P(E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1) 로 기탁하였다.
3-2. 재조합 타가토스- 이인산 알돌레이즈 효소의 제조
상기 제조한 재조합 미생물로부터 재조합 효소 CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E, CJ_LP_F6P4E, 및 CJ_TD1_F6P4E 를 제조하기 위하여, 각각의 재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 5 ml LB 액체배지가 담긴 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지가 담긴 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 180 rpm 및 37℃ 조건에서 수행하였다. 본 배양한 배양액은 8,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 25 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 다음, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였고, 25 mM Tris-HCl(pH 7.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E, CJ_LP_F6P4E, 및 CJ_TD1_F6P4E 를 확보하였다.
3-3. 재조합 타가토스- 이인산 알돌레이즈 효소의 과당-6-인산-4- 에피머화 효소 활성분석
상기 실시예 3-2에서 확보한 재조합 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소의 과당-6-인산-4-에피머화 활성을 분석하였다. 구체적으로, 25 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 기질인 1 중량% 과당-6-인산을 현탁하고, 정제된 1 unit/ml CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E, CJ_LP_F6P4E, 및 CJ_TD1_F6P4E 을 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 인산 제거를 위하여 1 unit/ml 포스파테이즈(NEB사 Alkaline phosphatase, Calf Intestinal)를 첨가하여 온도 37℃에서 1시간 처리하였다. HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였으며, HPLC 분석 조건은 SP0810(Shodex) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상(물)을 1 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 시차굴절 검출기(Refractive Index Detector)로 결과물을 분석하였다.
그 결과, CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E 및 CJ_LP_F6P4E 모두 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환하는 활성이 있음을 확인할 수 있다(도 1a 내지 1d).
또한, CJ_TD1_F6P4E이 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환하는 활성이 있음을 확인할 수 있다(도 5).
실시예 4: 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(D- tagatose -6-phosphate phosphatase) 발굴
본 출원의 타가토스 제조 경로 중 과당-6-인산으로부터 타가토스의 생산을 동시 복합 효소반응에 의하여 진행하기 위하여 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소와 동시에 효소반응이 가능한 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발굴하였다.
4-1. 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 재조합 미생물의 제조
Genbank에 등록된 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유전자 서열들을 대상으로 타가토스-6-인산 탈인산화 효소로 예상되는 유전자(서열번호 12, 이하, t4로 기재) 및 아미노산 서열(서열번호 11)을 선발하고, 상기 선발한 유전자의 서열을 기반으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 33) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 34)를 고안하여 합성하였다. 상기 프라이머를 이용하여 써모토가 마리티마의 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 t4 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각 효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ 를 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen社)에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작하고 pET21a-CJ_t4로 명명하였다. 상기 제조된 발현벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 3월 20일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11994P를 부여 받았다.
4-2. 재조합 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 제조
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4를 5 ml LB 액체배지가 담긴 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지가 담긴 배양 플라스크에 접종하여 본배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반 속도 180 rpm 및 37℃에서 수행하였다. 본 배양한 배양액은 8,000Хg로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000Хg로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하고, 이로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 효소를 정제한 후 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석한 후 사용하였으며, 상기 정제된 재조합 효소를 CJ_T4로 명명하였다.
4-3. CJ_T4의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 활성 분석
CJ_T4의 활성 분석을 위하여 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 타가토스-6-인산을 현탁한 후 정제된 0.1 unit/ml CJ_T4와 10 mM MgCl2를 첨가하여 70℃ 에서 10분 동안 반응시킨 다음, HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 HPX-87H(Bio-Rad사) 컬럼을 사용하여 60℃에서 이동상(물)을 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 시차굴절 검출기로 타가토스와 타가토스-6-인산을 분석하였다.
그 결과, 반응 결과물에서 타가토스가 생성되었으며, 인산 및 타가토스 반응물에 상기 CJ_T4를 첨가한 후 동일 반응을 진행한 결과 타가토스가 형성되지 않았다. 따라서 CJ_T4는 비가역적인 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 활성이 있음을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 5: 동시 복합 효소반응에 의한 타가토스의 생산
1 unit/ml의 CJ_KO_F6P4E 또는 CJ_RP_F6P4E과 1 unit/ml의 CJ_t4 (기탁번호: KCCM11994P), 혼합 효소액에 25 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된1 %(w/v) 과당-6-인산을 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 SP0810(Shodex社) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상(물)을 1 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 시차굴절 검출기로 타가토스를 검출하였다.
그 결과, 타가토스 생성을 확인하였는바, 타가토스-이인산 알돌레이즈와 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 동시 복합 효소반응에 의하여 과당-6-인산으로부터 타가토스 생산이 가능함을 확인할 수 있었다(도 2a 및 2b).
실시예 6: 동시 복합 효소반응에 의한 말토덱스트린으로부터 타가토스이 생산
복합 효소에 의한 말토덱스트린으로부터 타가토스의 생산 활성을 분석하기 위하여 1 unit/ml CT1, 1 unit/ml CT2, 1 unit/ml TN1, 1 unit/ml T4, 1 unit/ml TD1, 20~50 mM의 인산화나트륨(sodium phosphate pH 7.0)이 포함된 반응액에 5%(w/v) 말토덱스트린을 첨가하여 온도 60에서 1시간 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 SP0810(Shodex사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 Refractive Index Detector로 타가토스를 검출하였다.
그 결과, 첨가된 CT1, CT2, TN1, T4, 그리고 TD1 의 복합 효소 반응을 이용하여 말토덱스트린으로부터 타가토스가 생성됨을 확인할 수 있었다(도 6).
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11990P
수탁일자 : 20170320
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11991P
수탁일자 : 20170320
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11992P
수탁일자 : 20170320
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11993P
수탁일자 : 20170320
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11994P
수탁일자 : 20170320
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11995P
수탁일자 : 20170320
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11999P
수탁일자 : 20170324
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12096P
수탁일자 : 20170811
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12097P
수탁일자 : 20170811
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12095P
수탁일자 : 20170811
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A composition for preparing tagatose and Methods for producing tagatose using The Same <130> P18-0073 <150> KR 17/0042165 <151> 2017-03-31 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of CJ_KO_F6P4E <400> 1 Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly 1 5 10 15 Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile 20 25 30 Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met 50 55 60 Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala Glu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Leu Pro Lys Asn Lys Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro 85 90 95 Asn Pro Trp Lys Gly Gln Pro Ser Asp Gln Ala Met Arg Asn Ala Ile 100 105 110 Glu Met Ile Arg Glu Tyr Ala Lys Ala Gly Phe Thr Lys Leu His Leu 115 120 125 Asp Ala Ser Met Arg Leu Ala Asp Asp Pro Gly Asn Glu Asn Glu Pro 130 135 140 Leu Asn Pro 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Arg Ile Lys Ala Arg Leu Met Asp 385 390 395 400 Tyr Phe Arg Ala Phe Asn Leu Ile His Phe Asn Glu Arg Leu Gln Ala 405 410 415 Phe Leu Pro Glu 420 <210> 4 <211> 1263 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of CJ_RM_F6P4E <400> 4 atgcaggcgc aggccctgct gaccgttcca tttgatcggg tggcgaccca cgcacgcggg 60 tttgtgggct gggtggccga actgctgcag gggcccctgg cctatcagca tacgctgctg 120 gctgtctgtc ccaattcgga agcggtaaca cgggccgcgc tggaggccgc cgccgaggcc 180 aacgccccgc tgctttttgc cgccacgctg aaccaggtgg acctcgacgg cggctacacc 240 ggctggacgc ccgccacgct ggcccggttc gtggcggacg aactggcccg cctggacctg 300 cacatccccg tcgtgctcgg cctggaccac ggcggcccct ggaaaaagga tctgcacgcc 360 cgcaaccgat tgtcctttga ggaaaccttc caggccgtgc tgcgggccat cgaggcctgt 420 ctggatgccg gctacggcct gctgcacctg gatccgacgg tcgatctgga gctatcgccc 480 ggcacgccgg tgcccatccc gcgcattgtc gaacgctcgg tagcgctttt gcgtcatgcc 540 gaaacctatc gacttcgacg taacctgccg ccggtcgcct acgaggtggg caccgaagaa 600 gtcggcggcg gcctgcaggc cgaagcgcgc atggcggagt ttctggatcg cctctggacc 660 gcactggacc gggaaggcct gccccatcca gtcttcgtgg tgggcgacat cggcacccgg 720 ctcgacacgc gcacgttcga cttcgagcgg gcccgacggc tggacgcgct ggtgcgccgc 780 tacggtgccc tcatcaaagg gcactacacc gacgacgtgg atcgcctcga tctgtacccg 840 aaggcgggca tcggcggggc caacgtgggc ccgggcctgg ccgccatcga gtttgaagcg 900 ctggaggcgc tggtggagga agcccgtcgc cgcggtcttt cggtgacgtt cgatcaggcc 960 atccgccggg ccgtcgtcga aagcggacgc tggacgaagt ggctccaacc ggaagagaaa 1020 ggccagccgt tcgatgcgct ggatcccgag cggcaacgct ggctggtggc caccggcagc 1080 cgctacgtgt ggacgcatcc ggccgtcctg caggcccgcc gcgaactcta cgaggcgctc 1140 gccccctggc tcgatgccga cgctttcgtg cgcacgcgca tcaaagcacg cctgatggac 1200 tactttcgtg ccttcaacct gatccatttc aacgagcggc tgcaggcctt tctccccgaa 1260 tga 1263 <210> 5 <211> 420 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of CJ_RP_F6P4E <400> 5 Met Gln Ala His Val Leu Leu Ala Pro Ser Phe Glu Gln Leu Ala Asp 1 5 10 15 His Arg His Gly Phe Val Gly Trp Leu Val Asp Leu Leu Arg Gly Pro 20 25 30 Leu 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Ala Leu Phe Ala Leu Asn Ala Leu Glu Ser Glu Val Leu Gly Thr 305 310 315 320 Asp Gly Arg Ala Arg Arg Ser Asn Val Glu Ala Ala Leu Glu Glu Ala 325 330 335 Met Leu Ala Asp Pro Arg His Trp Ser Ala Tyr Tyr Ser Gly Asp Glu 340 345 350 His Glu Leu Arg Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Leu Ser Asp Arg Cys Arg 355 360 365 Tyr Tyr Trp Pro Val Pro Ser Val Gln Glu Ala Val Gln Arg Leu Leu 370 375 380 Gly Asn Leu Arg Glu Ala Gly Ile Pro Leu Pro Leu Leu Ser Gln Phe 385 390 395 400 Leu Pro Arg Gln Tyr Glu Arg Val Arg Glu Gly Val Leu Arg Asn Asp 405 410 415 Pro Glu Glu Leu Val Leu Asp Arg Ile Arg Asp Val Leu Arg Gly Tyr 420 425 430 Ala Ala Ala Val Gly Thr Gly Ala Arg Arg Ala Glu Pro Ser Pro Ala 435 440 445 <210> 8 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of CJ_LP_F6P4E <400> 8 atgcaaacct cgacggcgta cgtgaggcag gtcatttggg gtcaagggac gagggacccc 60 cgcggcatct actcggtctg taccgcagac cccctcgtcc ttcgggccgc cctcaagcag 120 gcggtggagg atggctcccc cgcgctgatc gaggcgacgt ccaaccaggt gaaccagttc 180 ggcgggtata cggggatgga gcccccggcg ttcgtggagt tcgtgctggg acttgcccgc 240 gagatgggac tcccgcccga gcggctgatc ctcgggggcg atcacctcgg ccccaaccca 300 tggcagcggc tggcggccga agaggccatg cggcatgcct gcgacctcgt cgaggccttc 360 gtggcctgcg gcttcaccaa gattcacctg gacgccagca tgcccctggg ggaggaacgg 420 gcaggcggtg cgctttcgaa acgggtggtg gccgaacgga ccgcccagct ctgcgaggcg 480 gccgaggcgg ccttcaggaa gcggtcccag gcggaggggg cgtcggcgcc tccgctctac 540 gtcatcggct ccgacgtgcc tccgcccggc ggcgagacct ccgggagcca ggggcccaag 600 gtgaccacgc cggaggagtt cgaggagacg gtcgcgctga cgcgggcgac ctttcacgat 660 cggggcctgg acgacgcctg gggacgggtg atcgccgtgg tggtccagcc gggggtggac 720 ttcggcgagt ggcaggttca cccctacgat cgggccgccg cggcgagcct tacccgagcc 780 ttgacgcagc atccggggct ggccttcgaa gggcactcca ccgactacca gacgccgggg 840 cggcttcgcc agatggcgga agacggcatc gccatcctga aggtggggcc ggccctcacc 900 ttcgccaagc gggaagcgct cttcgccctg aacgccctgg agtccgaagt gctggggacg 960 gacggccgag cacggcgctc caacgtcgaa gccgccctcg aagaggcgat gctcgccgat 1020 ccccgtcact ggagcgccta ctacagcggg gacgagcacg agctccgtct caagcggaag 1080 tacggcctct ccgaccggtg tcgctactac tggcccgtcc cttcggtgca ggaggccgtc 1140 cagcgcctcc ttggcaacct gcgcgaggcg gggatcccct tgcccctgct gagccagttc 1200 ctgccgcgcc agtacgagcg ggtgcgggag ggcgtcctgc gcaacgaccc ggaggagctg 1260 gtcctggacc ggattcgtga cgtgttgcgg ggatatgcgg cggccgtggg gacgggcgct 1320 aggcgggcgg agccatcacc cgcgtga 1347 <210> 9 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose-6-phosphate C4 epimerase derived from Thermanaerothrix daxensis (TD1) <400> 9 Met Val Thr Tyr Leu Asp Phe Val Val Leu Ser His Arg Phe Arg Arg 1 5 10 15 Pro Leu Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Tyr Val Ile Glu 20 25 30 Ala Ala Leu Arg Asn Gly Met Met Thr His Thr Pro Val Leu Ile Glu 35 40 45 Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr 50 55 60 Pro Ala Asp Phe Val Arg Tyr Val Glu Asn Ile Ala Ala Arg Val Gly 65 70 75 80 Ser Pro Arg Glu Asn Leu Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu 85 90 95 Val Trp Ala His 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Pro Ser Arg Ile Leu Glu Val Leu Glu Thr Thr 305 310 315 320 Met Leu Ala Asn Pro Val Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Glu 325 330 335 Arg Ala Arg Arg Ile Ala Arg Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg 340 345 350 Tyr Tyr Trp Ser Ala Pro Ala Val Glu Gln Ala Phe Glu Arg Leu Arg 355 360 365 Ala Asn Leu Asn Arg Val Ser Ile Pro Leu Val Leu Leu Ser Gln Tyr 370 375 380 Leu Pro Asp Gln Tyr Arg Lys Val Arg Asp Gly Arg Leu Pro Asn Gln 385 390 395 400 Phe Asp Ala Leu Ile Leu Asp Lys Ile Gln Ala Val Leu Glu Asp Tyr 405 410 415 Asn Val Ala Cys Gly Val Arg Ile Gly Glu 420 425 <210> 10 <211> 1281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of fructose-6-phosphate C4 epimerase derived fromThermanaerothrix daxensis (TD1) <400> 10 atggttacct atttggattt tgtggtgctt tctcatcgtt ttaggcgccc cctgggcatt 60 acctcagtgt gttcggcgca tccgtatgtc attgaggcgg cgctgcgtaa tgggatgatg 120 acccatacac cggtcctaat cgaggccact tgcaatcaag tcaatcagta tgggggatat 180 acggggatga ccccggcaga tttcgtgcgg tatgtggaga atattgctgc acgggtaggc 240 tctccacgtg aaaacctcct tttgggtggc gatcatttgg gacccctggt ctgggctcat 300 gaacctgctg agagtgccat ggaaaaagct cgagctctgg tcaaagccta tgtagaggct 360 ggttttcgca aaattcatct ggattgctca atgccctgtg cggatgatcg cgatttttct 420 ccaaaggtca ttgctgagcg ggcagccgaa ttggctcagg tggcagagtc aacttgtgat 480 gttatgggct tgcccttgcc caactacgtc attggaaccg aggtgccccc agcaggtggc 540 gccaaggctg aagccgaaac tttgagggta acccgtccgg aggatgcagc ggagaccatt 600 gcactgacca gagcggcttt tttcaagcga ggtttagagt ctgcctggga acgtgtagtg 660 gcgttagtag tgcaacccgg tgttgaattc ggagatcatc agattcatgt ttaccgccgt 720 gaggaagcgc aggctctttc ccgcttcatt gaaagccagc ccggcttagt ctatgaggct 780 cactccaccg actatcagcc ccgtgatgcg ctgcgggctt tggttgagga tcatttcgca 840 atcctgaagg tgggtccggc gctaaccttt gcttttcgtg aggcagtttt tgccctggcc 900 agtatcgagg attgggtatg cgattcaccc agtcgcatcc tggaagtttt ggaaacaacc 960 atgctggcca acccggtcta ctggcaaaag tattacttgg gcgatgagcg agcgcgtcgg 1020 attgccagag ggtatagttt cagcgatcgc attcgttatt attggagtgc accagcggtt 1080 gaacaggcct ttgaacgctt gcgggcaaat ctgaatcgtg tttcgatccc ccttgtcctt 1140 ctcagtcagt atttgccgga tcaatatcgc aaagtgcggg atggacggct gcctaaccag 1200 tttgatgctt tgattctgga taaaatccaa gccgtactgg aagactacaa tgtggcgtgt 1260 ggtgtgagga taggggagtg a 1281 <210> 11 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tagatose-6-phosphate phosphatase derived from Thermotoga maritima(T4) <400> 11 Met Glu Gly Gly Ile Glu Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Ile Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Arg Val Gly His Phe Leu Met Leu His Trp Gly Lys Val Asp 20 25 30 Ser Val Glu Lys Lys Thr Gly Phe Lys Asp Ile Val Thr Glu Ile Asp 35 40 45 Lys Lys Ala Gln Glu Met Ile Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Phe Pro 50 55 60 Asp Glu Asn Ile Ile Ala Glu Glu Gly Ile Ser Glu Asn Gly Lys Lys 65 70 75 80 Leu Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Ile Asn Phe Val His Gly 85 90 95 Leu Pro Asn Phe Ser Ile Ser Ile Ala Tyr Val Glu Asn Gly Glu Val 100 105 110 Lys Met Gly Val Val His Ala Pro Ala Leu Asn Glu Thr Leu Tyr Ala 115 120 125 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tgatagtgga ggagatcaga 180 aaggtttttc cggatgagaa cataatagcg gaggagggaa tctcggagaa cggaaaaaaa 240 ctctggataa tagatcccat agacgggacg ataaacttcg ttcatggact tcccaacttt 300 tccatctcca tcgcttacgt ggagaatgga gaggtgaaga tgggagttgt gcacgctcct 360 gcactcaacg aaacactcta cgccgaagaa aacgggggtg cttttttgaa cggtgaaagg 420 atcagggtgt ctggaaacac aagtcttgaa gagtgcgtgg gatcaacggg aagctatgtg 480 gatttcaccg gaaagtttat cgagaagatg gaaaagaaaa caaggagagt gagaattctg 540 gggagtgcgg cgctgaacgc ctgctacgtg ggagcaggga gggtggattt cttcgtcact 600 tggaggatca atccgtggga catcgcagca ggcctgatag ttgtgaaaga ggcgggagga 660 acggtgacag attttgccgg aaaagaggca aacgttttct cgaagaattt tgtcttctcc 720 aacggactcg ttcacgaaga agttctcgaa gtggtgaacg aggttctgaa agagatagga 780 gaggggaagt ga 792 <210> 13 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glucose-6-phosphate isomerase derived from Thermotoga maritima(TN1) <400> 13 Met Lys Lys Met Ala Leu Lys Phe Asp Phe Ser Asn Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Asn Ile Ser Gly Gly Leu Arg Glu Glu 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ttcgagagat gcaagaagga agacctgttc 720 gaaaatccag cggcgatgat cgccctcaca cactatctct atctgaagag aggaaagagc 780 atctccgtca tgatggccta ctccaacagg atgacctacc tcgtggactg gtacagacag 840 ctgtgggcag aaagtctggg aaagagatac aacctgaaag gagaggaggt cttcacgggt 900 cagaccccgg tgaaggcaat aggagccacc gatcagcact ctcagataca gctttacaac 960 gagggcccaa acgacaaagt gataacgttt ttgcggttgg aaaacttcga tagagagatc 1020 ataataccgg acaccggaag agaagagctc aaataccttg caagaaaaag actctctgaa 1080 cttctccttg cagaacagac aggaacagag gaagccctaa ggaaaaacga cagaccgaac 1140 atgaaggtga tcttcgacag actcacctct tacaatgtgg gccagttctt cgcttattat 1200 gaagccgcaa ctgctttcat ggggtatctc ctcgagatca acccgtttga tcagccgggt 1260 gtggaacttg gaaagaagat cacgtttgcc ctcatgggaa gggaaggtta cgaatacgaa 1320 ataaaagatc gcaccaagaa ggtgatcata gaatga 1356 <210> 15 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphoglucomutase derived from Thermotoga neapolitana (CT2) <400> 15 Met Ile Leu Phe Gly Thr Gly Gly Ile Arg Gly Val Met Arg Lys Gly 1 5 10 15 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tcggtttcaa agtgagacct 600 gtggaagaac agatgaaacc cgatccaaac ttctccacag tcccaactcc aaatcccgaa 660 gaagatgaag cgctcgtttt gctgaacaaa aaggaagcga cccttggact tgcaaccgac 720 ccggactgcg acagggtggg agtggtgtac agaggaagaa ggctcacagg aaaccaggtt 780 ggagtgctcc ttacggactt tctcctcgaa cacgtgaagg tagaaaaccc tctcgtgata 840 aaaacgatcg tcaccacgga catggtgagg cccatctgtg aggaaagggg tgcctatctc 900 gaagaaacac caacaggttt caaattcatc ggtcatttga tagaagaaca cacaaagaaa 960 ggtgacagaa acttcgtctt tggtttcgag gaaagctgtg gatacctcgc aggagaccac 1020 gcaagggaca aagatggtgt tgtgggaagt gtcctctctg cgatagcctt cagcaactac 1080 gacccgtacg aaaaactcga agaactctac agaaagtacg gttactacat ggaaaaactc 1140 atcaacttca agttcgaaga cgtcagcaaa gcgatagaaa tatacaactc cctgaaagag 1200 tacgatggaa taatcgatta ctccagaggt tacaaaggaa taattccaaa cgaaaccata 1260 gccttcgtgt tcgaaaaatc cagaatcttc gtcagaccat ctggaacaga accgaagctc 1320 aaggtgtaca tccacgtgag aggggacaca agggaagagt cagagaatct gatgaaggaa 1380 agtgaaagaa agatcaggga gatcctgaaa ctgtga 1416 <210> 17 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cgaggttcgg ggccggggca 420 ggtgtgccgg gcgaggtgtt gctgttgacc tttgggacag gcatcggcag cgcgctgatc 480 tataacggcg tgctggtgcc caacaccgag tttgggcatc tgtatctcaa gggcgacaag 540 cacgccgaga catgggcgtc cgaccgggcc cgtgagcagg gcgacctgaa ctggaagcag 600 tgggccaaac gggtcagccg gtacctccag tatctggaag gtctcttcag tcccgatctc 660 tttatcatcg gtgggggcgt gagcaagaag gccgacaagt ggcagccgca cgtcgcaaca 720 acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780 atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813 <210> 19 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyphosphate-dependent glucokinase CJ at ppgk <400> 19 Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg 50 55 60 Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Ile His 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catcaaaggg 60 gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120 gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180 tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240 gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300 tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360 tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420 gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480 attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540 acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600 tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660 tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720 ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762 <210> 21 <211> 823 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a-glucanphosphorylase derived from Thermotoga neapolitana (CT1) <400> 21 Met Leu Lys Lys Leu Pro 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a-glucanphosphorylase derived from Thermotoga neapolitana (CT1) <400> 22 atgctgaaga aactcccgga gaatctggag catctggaag aactcgccta caacctctgg 60 tggagctggt ctaggcccgc tcagagactc tggagaaaga tagatccgga aggctgggag 120 gaacacagaa accccgttaa aatactgaaa gaagtttctg atgaaaggct cgaagaactt 180 tcaaaagatg atgatttcat atccctctac gaactcacca ttgaaaggtt caaggattac 240 atggagaaag aagacacctg gttcaacgtg aactaccccg aatgggacga gaagatcgtc 300 tacatgtgta tggagtacgg tttgaccaaa gcccttccga tctactccgg tggtcttgga 360 atcctcgcgg gagaccatct caaatccgca agcgatcttg gacttcctct catagcgatc 420 ggacttctct acaaacatgg atatttcacc cagcagatcg acagagatgg aaaacagata 480 gagattttcc ctgattacaa cccagaggac ttacccatga agcccctgaa ggatgaaaag 540 ggaaaccagg tgatcgtgga ggttcctctc gacagtaccg tggtgaaggc acgtgttttt 600 gaagtgaagg taggaagggt gagtctgtac ctgctcgatc cggacatcga ggaaaacgag 660 gaacgataca gaaagatctg caactacctt tacaacccgg aacccgatgt gagggtctcc 720 caggagatac tcctcggaat tgggggaatg aagcttctca gggctctgaa cctgaaacca 780 ggagtcatcc 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agttcaaaaa caggatcatc gtactggaaa actacgacat tggaatggca 1680 cggctcatgg tgtcgggagt ggatgtgtgg ctgaacaacc cgagaagacc catggaagca 1740 agtggaacaa gcggaatgaa ggcagcagcc aacggagttc ttaacgcgag tgtttacgat 1800 ggatggtggg ttgaagggta caacggcaga aacggctggg tcataggcga tgaaagcgtt 1860 cttccagaga cggaagtgga cgatcccagg gacgcagaag cactctacga tctcctcgaa 1920 aacgaaatca tcccaaccta ctacgaaaac aaagaaaagt ggatcttcat gatgaaagag 1980 agcataaaga gtgttgctcc aagattcagc accaccagaa tgctcaaaga atacacggag 2040 aagttctaca taaagggact tgtgaacaaa gaatggcttg aaagaaaaga aaacgccgaa 2100 aggtttggtg catggaagga aaggatcctc agaaactgga gcagcgtttc catagaaaga 2160 atcgtccttg aggacacaag gagtgttgag gtgacggtga aactgggaga cctttcacct 2220 gatgatgtac tggttgaact tttgattgga agaggagaaa gcatggaaga tctggagatc 2280 tggaaggtga tacagataag aaagcacaga agggaagggg atctgttcat ctacagttat 2340 gtcaacggtg ccctcggtca tcttggctct ccgggatggt tctacgcggt gagggtgcta 2400 ccttatcatc cgaaacttcc caccagattc ttgccggaga tacctgtggt gtggaaaaag 2460 gttctcgggt ga 2472 <210> 23 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-a-glucanotransferase derived from Thermotoga maritima(TN2) <400> 23 Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser 35 40 45 Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala 50 55 60 Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly 85 90 95 Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr 100 105 110 Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg 115 120 125 Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg 130 135 140 Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu 165 170 175 Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg 180 185 190 Asp Thr Leu Glu Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp 195 200 205 Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val 210 215 220 Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser 225 230 235 240 His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile 245 250 255 Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn 260 265 270 Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu 290 295 300 Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp 325 330 335 Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly 370 375 380 Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu 385 390 395 400 Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 <210> 24 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of 4-a-glucanotransferase derived from Thermotoga maritima(TN2) <400> 24 atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60 gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120 tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180 tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240 gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300 tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360 gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420 gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480 aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540 gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600 ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660 tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720 cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780 agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840 aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900 ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960 atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020 tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080 tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140 ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200 gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260 ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320 gtttga 1326 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of CT1 <400> 25 aggagaaact catatgctga agaaactccc ggag 34 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of CT1 <400> 26 agccccctcg agcccgagaa c 21 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of CT2 <400> 27 aaagggcata tgatcctgtt tggaac 26 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of CT2 <400> 28 ataccagtct cgagcagttt caggatc 27 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of TN1 <400> 29 ttactgaggg catatgaaaa agatggcttt gaaa 34 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of TN1 <400> 30 aagacgcgtc gacttctatg atcaccttct 30 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of TN2 <400> 31 atagagggca tatgataggc taccagatct a 31 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of TN2 <400> 32 atcttcatct cgagaaccac ctcc 24 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of T4 <400> 33 ttttcatatg gagggaggga tcgaattg 28 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of T4 <400> 34 catactcgag cttcccctct cctatct 27

Claims (20)

  1. 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스-6-인산 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 과당-6-인산을 추가로 포함하는, 타가토스-6-인산 생산용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈를 하나 이상 포함하는 것인, 타가토스-6-인산 생산용 조성물.
  4. 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 및
    타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 과당-6-인산을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포도당-6-인산 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 전분 포스포릴라아제(starch phosphorylase), 말토덱스트린 포스포릴라아제(maltodextrin phosphorylase) 또는 수크로오스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포도당 인산화 효소(glucokinase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은 α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 이소아밀라아제(isoamylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 또는 수크라아제(sucrase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  11. 과당-6-인산을, 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스-6-인산을 제조하는 것을 포함하는, 타가토스의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제조된 타가토스-6-인산을, 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스를 제조하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스의 제조 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 방법은 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 방법은 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  18. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 9.0 조건에서, 40℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 24 시간 동안 수행하는, 타가토스 제조방법.
  19. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9 의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진, 타가토스 생산용 조성물.
  20. (a) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합;
    (b) (i) 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, (ii) 타가토스-이인산 알돌레이즈; (iii) 포도당-6-인산-이성화효소, (iv) 포스포글루코무타아제 또는 포도당인산화 효소, (v) 포스포릴라아제 및 (vi) α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 이소아밀라아제(isoamylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 또는 수크라아제(sucrase) 중 하나 이상; 및
    (c) 포스페이트(phosphate)를 접촉시키는 것을 포함하는 타가토스 제조방법.

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