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WO2019004778A2 - 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법 - Google Patents

신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법 Download PDF

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WO2019004778A2
WO2019004778A2 PCT/KR2018/007407 KR2018007407W WO2019004778A2 WO 2019004778 A2 WO2019004778 A2 WO 2019004778A2 KR 2018007407 W KR2018007407 W KR 2018007407W WO 2019004778 A2 WO2019004778 A2 WO 2019004778A2
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WO
WIPO (PCT)
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amino acid
seq
homoserine
microorganism
aspartate
Prior art date
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WO2019004778A3 (ko
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김형준
김효진
배현원
김현아
서창일
이지선
장진숙
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CJ CheilJedang Corp
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CJ CheilJedang Corp
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02003—Phosphoglycerate kinase (2.7.2.3)

Definitions

  • the present invention relates to an aspartokinase mutant, a microorganism containing the mutant, and a method for producing an aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative using the microorganism.
  • Corynebacterium sp . In microorganisms, in particular Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum ) is a gram-positive microorganism that is widely used for the production of L-amino acids and other useful substances.
  • Corynebacterium glutamicum In order to produce the above-mentioned L-amino acids and other useful substances, various studies for developing a high-efficiency production microorganism and fermentation process technology have been conducted. For example, a specific substance-specific approach such as increasing the expression of a gene encoding an enzyme involved in L-lysine biosynthesis or removing a gene unnecessary for biosynthesis has been mainly used (Korean Patent No. 10- 0838038).
  • L-amino acids L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine and L-glycine are amino acids derived from aspartate (hereinafter referred to as Asp) aspartokinase , LysC, EC 2.7.2.4) (Fig. 1). Therefore, it is essential to maintain the activity of the enzymes used in the biosynthetic pathway above a certain level in order to produce the amino acids by the microbial fermentation method, and intensive researches have been made on them.
  • LysC which is the first enzyme in the biosynthesis pathway of aspartate-derived amino acids
  • LysC which is the first enzyme in the biosynthesis pathway of aspartate-derived amino acids
  • L-lysine and L-threonine J Mol Biol. 2007 Apr 27; 2): 521-36. Epub 2007 Feb 20.
  • There have been applications related to the above-mentioned feedback inhibition U.S. Patent No. 8062869 B, JP 3473042 B), but continuous research is still required to increase the productivity of aspartate-derived products.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that production of aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative is improved when a novel aspartokinase mutant is used.
  • One object of the present application is an aspartokinase mutant comprising at least one amino acid substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid substitution is asparagine-linked asparaginase, wherein the 377th amino acid is substituted with L- Tokinase variant.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding said variant.
  • Another object of the present invention is to provide a microorganism belonging to the genus Corynebacterium which produces an aspartate-derived L-amino acid or an amino acid derivative containing or having enhanced activity of the aspartokinase mutant.
  • Another object of the present application is to provide a method for culturing a microorganism, comprising culturing the microorganism in a medium; And recovering aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative from the cultured microorganism or culture medium.
  • the present invention also provides a method for producing an aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative.
  • Another object of the present application is to provide a method for culturing a microorganism, comprising culturing the microorganism in a medium; Producing acetyl homoserine or succinyl homoserine from the cultured microorganism or medium; And converting the acetyl homoserine or succinyl homoserine to methionine.
  • the present invention also provides a method for producing methionine.
  • the microorganism comprising the aspartokinase mutant according to the present application can obtain an aspartate-derived L-amino acid or aspartate-derived product at a high yield, without inhibiting the growth of the host cell, as compared with the microorganism containing the wild-type LysC polypeptide.
  • One aspect of the present application for achieving the above object is an aspartokinase mutant comprising at least one amino acid substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid substitution includes substitution of the 377th amino acid with another amino acid , And aspartokinase mutants.
  • one object of the present application is to provide an aspartokinase mutant in which the 377th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with L-lysine or L-methionine.
  • aspartokinase aspartic kinase
  • aspartic kinase in the present application is an enzyme that catalyzes the phosphorylation of amino acid aspartate, and includes three types of L-methionine, L-lysine and L- threonine It acts as a first step in essential amino acid biosynthesis.
  • the aspartokinase in the present application may be mixed with " LysC " or " LysC protein ".
  • the LysC protein can be obtained from GenBank of NCBI, a known database.
  • the LysC proteins genus Corynebacterium may be derived from LysC, more specifically, Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum- derived SEQ ID NO: 1, but are not limited thereto.
  • LysC in the present application may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having homology or identity of 80%, 85%, 90%, 95%, or 97%
  • polypeptides having amino acid sequences with deletion, modification, substitution, or addition of a part of the sequences are included within the scope of the present application, provided that they have such homology or identity and exhibit an effect corresponding to the polypeptides.
  • LysC aspartokinase
  • methods well known in the art include gene synthesis techniques that include codon optimization so as to obtain enzymes at a high efficiency in Corynebacterium sp.
  • Microorganisms which are commonly used for enzyme expression, and bioinformatic methods based on massive genome information of microorganisms And can be obtained through a screening method of available enzyme resources, but is not limited thereto.
  • variant in this application is intended to mean that one or more amino acids differ from the recited sequence in conservative substitution and / or modification, functions or properties of the polypeptide are retained.
  • Mutant polypeptides differ from the identified sequences by several amino acid substitutions, deletions or additions.
  • Such variants can generally be identified by modifying one of the polypeptide sequences and evaluating the properties of the modified polypeptide. That is, the ability of a variant may be increased, unchanged, or decreased relative to the native protein.
  • variants can generally be identified by modifying one of the polypeptide sequences and assessing the reactivity of the modified polypeptide.
  • variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or transmembrane domain, have been removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and / or C-terminus of the mature protein.
  • conservative substitution means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties.
  • the variant may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities.
  • Such amino acid substitutions can generally occur based on the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and / or similarity in the amphipathic nature of the moiety.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine;
  • the negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and arpartic acid;
  • Aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine, and hydrophobic amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine and tryptophan.
  • conservative substitutions have little or no effect on the activity of the resulting polypeptide.
  • variants can include deletions or additions of amino acids that have minimal impact on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • a polypeptide can be conjugated to a signal (or leader) sequence of a protein N-terminal that is involved in the transfer of proteins co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated to another sequence or linker so that the polypeptide can be identified, purified, or synthesized.
  • the aspartokinase mutant claimed in the present application means a mutant form of LysC having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 derived from Corynebacterium sp .
  • it may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which the 377th amino acid residue from the N-terminus is substituted with another amino acid.
  • the 'other amino acid' is not limited as long as it is other amino acid except L-leucine which is the 377th amino acid.
  • the 377th amino acid residue may be substituted with lysine or methionine.
  • L-lysine is an example of a basic amino acid, and the basic amino acid may be one of L-lysine, L-arginine, and L-histidine.
  • L-methionine is an example of a nonpolar amino acid, and the non-polar amino acid is L-methionine, L-phenylalanine, L-alanine, L-cysteine, L-glycine, L- isoleucine, L- leucine, L- - Balin can be either. However, it is not limited thereto.
  • aspartokinase variant in the present application can be used interchangeably with “mutated aspartokinase” or “mutated LysC”.
  • Such an aspartokinase mutant has an asparaginase activity-enhanced activity as compared to a polypeptide having an aspartokinase activity of SEQ ID NO: 1.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides is determined by standard alignment algorithms and default gap penalties established by the program used can be used together. Substantially homologous or identical sequences may be present in at least about 50%, 60%, 70%, 80%, or 80% of the entire sequence or total length in medium or high stringent conditions It will hybridize to more than 90%. The hybridization also contemplates polynucleotides that contain degenerate codons instead of codons in the polynucleotide.
  • BLAST Altschul, [S.] : 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; and CARILLO ETA /. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073)
  • BLAST or ClustalW, of the National Center for Biotechnology Information Database can be used to determine homology, similarity, or identity.
  • the homology, similarity or identity of polynucleotides or polypeptides is described, for example, in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2: 482, for example, in Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, by comparing the sequence information using a GAP computer program.
  • the GAP program defines the total number of symbols in the shorter of the two sequences, divided by the number of similar aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a linear comparison matrix (containing 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.
  • Another aspect of the present application provides polynucleotides encoding the aspartokinase variants.
  • polynucleotide in the present application means a polymer of a nucleotide in which a nucleotide monomer is linked in a long chain by covalent bonds, as a DNA or RNA strand of a predetermined length or more, Quot; polynucleotide "
  • the polynucleotide encoding the aspartokinase mutant is an aspartokinase mutant comprising at least one amino acid substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid substitution is selected from the group consisting of poly 0.0 > polynucleotides < / RTI > encoding peptides.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide in which the 377th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another L-lysine or L-methionine may be used.
  • the polynucleotide may be a polynucleotide encoding a lysC protein having an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • it may be a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • the polynucleotide may be modified in various ways so as not to change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region, taking into consideration the codon preference in the organism to which the protein is to be expressed. Can be achieved. therefore,
  • a polynucleotide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 by the codon degeneracy or a polynucleotide capable of being translated into a polypeptide having homology or homology thereto may also be included.
  • Any sequence that encodes a protein having the activity of a protein may be included without limitation.
  • stringent conditions means conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (e.g., J. Sambrook et al., Sangdong). For example, it is preferable that 80% or more, 85% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more, Hybridization of the genes having the above homology or identity with each other and hybridization of genes having less homology or homology with each other are carried out under the conditions of 60 ° C, 1 X SSC, 0.1% SDS, specific hybridization conditions Specifically, 2 to 3 times at 60 ⁇ ⁇ , 0.1 X SSC, 0.1% SDS, more specifically at a salt concentration and temperature equivalent to 68 ⁇ ⁇ , 0.1 X SSC, 0.1% SDS Can be listed.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have a complementary sequence, although mismatches between bases are possible, depending on the severity of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing with each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions that include a hybridization step at a Tm value of 55 ° C and using the conditions described above.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C, or 65 ° C, but is not limited thereto and may be suitably adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Suitable stringency to hybridize polynucleotides depends on the length and complementarity of the polynucleotide and the variables are well known in the art (see Sambrook et al., Supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • the present application provides a microorganism transformed with a vector comprising a host cell comprising the aspartokinase mutant and a polynucleotide encoding the aspartokinase mutant.
  • the present application provides a microorganism belonging to the genus Corynebacterium which produces an aspartate-derived L-amino acid or an amino acid derivative containing the above-mentioned aspartokinase mutant.
  • the microorganism containing the aspartokinase mutant of the present application has the characteristic that the activity of aspartokinase is enhanced as compared with the wild type or unmodified microorganism.
  • enhanced activity in the present application means that the activity of the protein is introduced, or the activity is enhanced as compared with the intrinsic activity or the pre-modification activity of the microorganism. &Quot; Introduction “ of the activity means that the activity of the specific protein, which is not naturally or artificially inherent to the microorganism, appears.
  • “Intrinsic activity” refers to the activity of a specific protein originally present in the parental strain before transformation when a microorganism is transformed by genetic variation caused by natural or anthropogenic factors.
  • the term " vector" means a DNA construct containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the desired protein operably linked to a suitable regulatory sequence so as to be capable of expressing the protein of interest in the appropriate host.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation.
  • the vector may be transcribed into an appropriate host cell and then cloned or functioned independently of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited as long as it can be expressed in a host cell, and any vector known in the art can be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in their natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector and the like can be used but are not limited thereto.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited, and known expression vectors can be used.
  • a polynucleotide encoding a target protein can be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome can be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. And may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted.
  • Selection markers are used to select cells that are transfected with a vector, that is, to confirm the insertion of a target nucleic acid molecule, and are provided with selectable phenotypes such as drug resistance, resistance to nutritional requirement, tolerance to cytotoxic agents, May be used. In the environment treated with the selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or express different phenotypes, so that the transformed cells can be selected.
  • transformed means introducing a vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • Transformed polynucleotides may include all of these, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, provided that the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding a target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as far as it is capable of being introduced into a host cell and expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette can typically include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operatively linked to the sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • Such a transformation method includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and may be carried out by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, A lithium acetate-DMSO method, and the like, but are not limited thereto.
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding the protein of interest of the present application.
  • Operable linkages can be made using known recombinant techniques in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be made using, but not limited to, cutting and linking enzymes in the art.
  • microorganism producing aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative in the present application means a microorganism or aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative which naturally has an ability to produce an L-amino acid or an amino acid derivative derived from aspartate Means a microorganism to which the ability to produce an aspartate-derived L-amino acid or an amino acid derivative is imparted to a parent strain having no productivity.
  • 'aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative' in the present application means a substance capable of biosynthesis using aspartic acid as a precursor, and may be mixed with 'aspartate-derived product'.
  • the 'amino acid derivative' means a substance that can be produced from L-amino acid and a precursor of L-amino acid, and is not limited as long as it can be produced through biosynthesis using aspartate as a precursor. More specifically, materials synthesized by commonly using acetyl phosphate are included without limitation.
  • Cadaverine may be biosynthesized directly with aspartate as a precursor and may be produced from lysine by lysine decarboxylase.
  • the L-methionine may be directly biosynthesized using aspartate as a precursor, or may be produced by converting O-acetyl homoserine, O-succinyl homoserine.
  • Aspartic acid is abbreviated as Asp or D, and is an aspartic acid, which is an alpha -amino acid used for protein biosynthesis. Like all other amino acids, amino group and carboxylic acid are included. L-lysine, L-homoserine, L-threonine, L-isoleucine, and the like in vivo after aspartate is produced by aspartate phosphate by aspartokinase (LysC) Can be converted.
  • an aspartokinase mutant of the present application can be used.
  • the aspartokinase mutant of the present application may be introduced or its activity may be enhanced.
  • the ability to produce aspartate-derived products can be further enhanced by introducing or enhancing the activity of a particular protein, or by inactivating the activity of a particular protein.
  • the method of introducing, enhancing or inactivating the activity of the specific protein may be carried out using a suitable method known in the art depending on the characteristics of the microorganism.
  • the microorganism producing the aspartate-derived product, L-amino acid or amino acid derivative may be any microorganism capable of producing aspartate-derived 'amino acid' or amino acid derivative including the aspartate mutant of the present application.
  • Escherichia Escherichia
  • Serratia marcescens Serratia
  • An air Winiah Erwinia
  • Enterobacter bacteria Enterobacter bacteria
  • Salmonella Salmonella
  • genus Streptomyces Streptomyces
  • Streptomyces Streptomyces
  • Pseudomonas Pseudomonas
  • Microbial strains such as genus Brevibacterium or genus Corynebacterium may be included.
  • it may be a microorganism belonging to the genus Corynebacterium. More specific examples thereof include Corynebacterium glutamicum ).
  • the present application is directed to a method for producing aspartate-derived L-amino acids, comprising culturing a microorganism as described and recovering an aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative from the cultured microorganism or culture medium Or an amino acid derivative thereof.
  • the method for producing the aspartate-derived L-amino acid or amino acid derivative can be easily determined by those skilled in the art under optimized culture conditions and enzyme activity conditions known in the art.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited, but may be carried out by a known batch culture method, a continuous culture method, a fed-batch culture method, and the like.
  • the culturing conditions are not particularly limited, but may be carried out at a suitable pH (for example, a pH of 5 to 9, specifically, a pH of 5 to 10, and a pH of 5 to 10) using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia or an acidic compound such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • the incubation temperature can be maintained at 20 to 45 ⁇ , specifically at 25 to 40 ⁇ , and can be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the aspartate-derived amino acid or amino acid derivative produced by the above culture may be secreted into the medium or left in the cells.
  • the culture medium used may be a carbon source such as sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower seeds Alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid may be used individually or in combination with each other, , But is not limited thereto.
  • a carbon source such as sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower seeds Alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid may be used individually or in combination with each other, , But is not limited thereto.
  • nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, juice, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium nitrate), and the like may be used individually or in combination, but the present invention is not limited thereto.
  • the phosphorus source potassium dihydrogenphosphate, dipotassium hydrogenphosphate, and the corresponding sodium-containing salt may be used individually or in combination, but the present invention is not limited thereto.
  • the medium may include essential growth-promoting substances such as other metal salts (e.g., magnesium sulfate or ferrous sulfate), amino acids and vitamins.
  • the method for recovering the aspartate-derived amino acid or amino acid derivative produced in the culturing step of the present application can be carried out by a suitable method known in the art according to the culture method to collect the desired amino acid from the culture.
  • a suitable method known in the art for example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC and the like can be used, and the desired aspartate-derived amino acid or amino acid derivative can be recovered from the culture medium or microorganism using a suitable method known in the art have.
  • the recovering step may further include a purification step and may be performed using a suitable method known in the art.
  • the present application discloses a method for producing a microorganism by culturing the described microorganism; Producing O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine from the cultured microorganism or culture medium; And converting O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine to L-methionine.
  • the step of converting to L-methionine is a step of reacting O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine with O-acetyl homoserine sulfhydrylase or O-succinyl homoserine sulfhydrylase in the presence of sulfide . ≪ / RTI >
  • the 'O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine' may be a fermentation broth containing O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine produced by the microorganism described in the present application, or it may be in a purified form .
  • the 'sulfide' may be, for example, methylmercaptan, and the methylmercaptan may be in the form of sodium methyl mercaptan (CH3S-Na), methyl mercaptan (CH3SH) in gas or liquefied state As well as methylmercaptan derivatives including forms capable of providing sulfur atoms such as methyl mercaptan, including dimethylsulfide (DMS), in the form described in WO2010 / 098629 .
  • the 'O-acetyl homoserine sulfhydrylase or O-succinyl homoserine sulfhydrylase' may be a fermentation broth of the microorganism producing the same or a purified form thereof.
  • the method for producing L-methionine can be easily determined by those skilled in the art under optimized culture conditions and enzyme activity conditions known in the art.
  • the specific culture method and medium are as described above.
  • Example 1 lysC Mutagenesis strain production
  • mutants that can be enhanced more active than the wild type were selected, and strains introduced with the mutations as described below were prepared.
  • the 377th amino acid was selected as the mutation site for the lysC gene (SEQ ID NO: 2) coding for aspartokinase (SEQ ID NO: 1) derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (hereinafter referred to as WT) L-lysine, which is a basic amino acid, and L-methionine, which is a nonpolar amino acid, were selected as representative examples of the non-polar amino acid.
  • SEQ ID NO: 2 coding for aspartokinase (SEQ ID NO: 1) derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (hereinafter referred to as WT) L-lysine, which is a basic amino acid
  • L-methionine which is a nonpolar amino acid
  • SEQ ID NOS: 7 and 8 or SEQ ID NOS: 7 and 10 and a pair of primers for amplifying the 3'-bottom region (SEQ ID NO: 9 and 12 or SEQ ID NOS: 11 and 12) (Table 1).
  • the primers of SEQ ID NOs: 7 and 12 were inserted at each end with an XbaI restriction enzyme site (underlined), and one pair of primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 or a pair of primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 were designed to cross each other, Substitution mutation (underlined) was located.
  • PCR was carried out using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 using the WT chromosome as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 30 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, lysC A 509 bp DNA fragment at the 5'-upper portion and a 520-bp DNA fragment at the 3'-lower portion were obtained from the mutation of the gene.
  • PCR was performed with the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 12 using the two amplified DNA fragments as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 60 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes.
  • lysC SEQ ID NO: 3
  • a DNA fragment of 1011 bp containing the mutation of the gene was amplified.
  • a 1011 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 6) containing the mutation of the lysC gene (SEQ ID NO: 5) coding for an aspartokinase mutant substituted with methionine at position 377 ≪ / RTI >
  • PDZ vectors Korean Patent No. 0924065
  • 1011 bp DNA fragments which can not be cloned in Corynebacterium glutamicum were treated with restriction enzyme XbaI, followed by ligating using DNA ligase, and then cloned to obtain plasmid And named pDZ- lysC (L377K) and pDZ- lysC (L377M).
  • CA1-2307 and CA01-2308 strains and WT strains obtained in the above Examples were cultured in the following manner in order to compare their ability of producing aspartate-derived major amino acids, and the content of the culture medium was analyzed.
  • a 250 ml corn-baffle flask containing 25 ml of seed culture was inoculated with each strain and cultured at 37 DEG C for 20 hours with shaking at 200 rpm.
  • a 250 ml corn-baffle flask containing 24 ml of production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture medium and cultured at 37 DEG C for 24 hours with shaking at 200 rpm.
  • the concentrations of L-lysine and L-threonine, representative amino acids derived from L-aspartate and aspartate, were analyzed by HPLC and the concentrations analyzed are shown in Table 2.
  • L-lysine concentration analysis showed that L-lysine production capacity of CA01-2307 containing lysC (L377K) mutation compared to WT strain was greatly increased as in the previous evaluation.
  • L-lysine production of CA01-2308 containing the lysC (L377M) mutation was also increased compared to the WT strain.
  • aspartokinase mutant SEQ ID NO: 3 substituted at position 377 with lysine
  • aspartate mutant SEQ ID NO: 5
  • a strain in which hom (G378E) mutation was introduced into WT was prepared as a control.
  • hom (G378E) defend the sequence WT genomic DNA as a template to produce a vector for introducing a 13 and 14, was carried out the PCR using 15, and 16.
  • the PCR conditions were denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 30 seconds. The reaction was carried out at 72 ° C for 7 minutes.
  • hom A 220-bp DNA fragment at the 5'-upper region and a 220-bp DNA fragment at the 3'-lower region were obtained centering on the mutation of the gene.
  • PCR was performed using SEQ ID NOS: 13 and 16 using these two PCR products as templates. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 30 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, hom A 440 bp DNA fragment containing the mutation of the gene was amplified.
  • the pDZ vector and the 440 bp DNA fragment used in Example 1 were treated with restriction enzyme XbaI, ligated using a DNA joining enzyme, and then cloned to obtain a plasmid, which was named pDZ- hom (G378E) .
  • the pDZ- hom (G378E) vector was introduced into the WT and CA01-2307 strains by the electric pulse method (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999, 52: 541-545) and then cultured in a selective medium containing 25 mg / L of kanamycin transformants were obtained from the conversion strain secondary recombination (cross-over) by the by the DNA fragment inserted into the chromosome is introduced into the hom gene nucleotide mutant strains, WT :: hom (G378E) and CA01-2307 :: hom (G378E) was obtained in the same manner as in Example 2. In order to compare the threonine producing ability of the obtained WT :: hom (G378E) and CA01-2307 :: hom (G378E) Nine concentrations were analyzed.
  • the threonine production concentration of WT :: hom (G378E) and CA01-2307 :: hom (G378E) Strain / concentration L-threonine (g / L) Batch 1 Batch 2 Batch 3 WT :: hom (G378E) 0.456 0.475 0.432 CA01-2307 :: hom (G378E) 1.210 1.132 1.211
  • lysC (L377K) mutant group known to determine the effect of neunge L- isoleucine produced by introducing threonine di Hydra hydratase (L-threonine dehydratase) gene encoding ilvA (V323A) mutation (Appl. Enviro. Microbiol. , Dec. 1996, p. 4345-4351).
  • SEQ ID NOs: 17 and 18 and a pair of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 19) for amplifying the 5'-upper region and the 3'-lower region of the ilvA gene in order to construct a mutation introduction vector, 20) was designed.
  • the primers of SEQ ID NOs: 17 and 20 inserted a BamHI restriction enzyme site (underlined) at each end, and the primers of SEQ ID NOs: 18 and 19 contained nucleotide substitution mutations Respectively.
  • PCR was carried out using the primers of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 using the WT chromosome as a template.
  • the PCR conditions were denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 30 seconds.
  • the reaction was carried out at 72 ° C for 7 minutes.
  • ilvA A 627 bp DNA fragment at the 5'-upper portion and a 608-bp DNA fragment at the 3'-lower portion were obtained centering on the mutation of the gene.
  • PCR was carried out using the primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 20 using the two amplified DNA fragments as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 60 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes.
  • ilvA coding for the IlvA mutant in which the 323nd valine was replaced with alanine A DNA fragment of 1217 bp containing the mutation of the gene was amplified.
  • pECCG117 (Korean Patent No. 10-0057684) vector and 1011 bp DNA fragment were treated with restriction enzyme BamHI, ligated using DNA joining enzyme, and cloned to obtain plasmid pECCG117- ilvA (V323A) Respectively.
  • the pECCG117- ilvA (V323A) vector was introduced into the WT :: hom (G378E) and CA01-2307 :: hom (G378E) strains prepared in Example 3 by electropulsing and then transformed with the kanamycin 25 mg / The transformed strain was obtained by shaking on the selection medium.
  • the culture was performed in the same manner as in the flask culture method shown in Example 2, and the concentration of L-isoleucine in the culture solution was analyzed (Table 7).
  • acetyl-homoserine production by lysC (L377K) mutation by lysC (L377K) mutation, the metB gene coding for the cystathionine gamma-synthase, an O-acetyl-homoserine degradation pathway, and the O-acetyl homoserine (thiol), - a defect metY gene encoding the rayiah and O- acetyl-metX encoding a dehydratase la homoserine biosynthesis enzyme homoserine O- acetyltransferase O-acetyl-homoserine production strain was constructed by overexpressing the gene.
  • PCR was carried out using the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 using the WT chromosome as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 90 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, metB A 450 bp DNA fragment at the 5'-upper portion of the gene and a 467-bp DNA fragment at the 3'-lower portion of the gene were obtained.
  • PCR was carried out with the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 24 using the two amplified DNA fragments as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 3 minutes were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, metB The central portion of the gene was deleted and a DNA fragment of 917 bp containing only the upper and lower ends was amplified.
  • the pDZ vector and the 917 bp DNA fragment were treated with restriction enzyme XbaI, ligated using a DNA joining enzyme, and cloned to obtain a plasmid, which was named pDZ-? metB .
  • PCR was carried out using the primers of SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 28 with the WT chromosome as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 90 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, metY A 512 bp DNA fragment at the 5'-upper portion of the gene and a 520-bp DNA fragment at the 3'-lower portion of the gene were obtained.
  • PCR was performed with the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 28 using the two amplified DNA fragments as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 3 minutes were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, the central portion of the metY gene was deleted, and a DNA fragment of 1032 bp containing only the upper and lower ends was amplified.
  • the pDZ vector and the 1032 bp DNA fragment were treated with restriction enzyme XbaI, ligated using a DNA joining enzyme, and cloned to obtain a plasmid, which was named pDZ- ? metY .
  • the pDZ-DELTA metY vector was constructed using the WT :: hom (G378E)? metB And CA01-2307 :: hom (G378E) ⁇ metB strains were introduced by electric pulse method and transformants were obtained from the selection medium containing 25 mg / L of kanamycin.
  • vectors were constructed to enhance metX gene expression. Primers for amplification from the promoter site (about 300 bp upstream of the initiation codon) to the terminator site (about 100 bp downstream of the termination codon) based on the reported sequence derived from WT to amplify homoserine O-acetyltransferase (MetX) (SEQ ID NOS: 29 and 30) by inserting a BamHI restriction enzyme site at both ends.
  • PCR was carried out using the primers of SEQ ID NOS: 25 and 26 with the WT chromosome as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 90 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, a 1546 bp DNA fragment containing the metX gene was obtained.
  • pECCG117 (Korean Patent No. 10-0057684) vector and metX DNA fragment were treated with restriction enzyme BamHI, ligated using a DNA joining enzyme, and cloned to obtain a plasmid, which was named pECCG117- metX .
  • O-acetyl-homoserine hereinafter, O-AH
  • O-AH O-acetyl-homoserine
  • a 250 ml corn-baffle flask containing 25 ml of O-AH production medium was inoculated with 1 pl of strain and cultured at 37 DEG C for 20 hours with shaking at 200 rpm.
  • the concentration of O-acetyl-homoserine was analyzed by HPLC and the concentrations analyzed are shown in Table 11.
  • O-acetyl homoserine concentration analysis showed that the production of O-acetyl homoserine by lysC mutation was increased.
  • O-succinyl homoserine producing strains were prepared.
  • Corynebacterium glutamicum wild-type strains naturally do not produce O-succinyl homoserine, so that the O-acetyltransferase (MetX) enzyme prepared in Example 5 can be converted into O- And to produce O-succinyl homoserine by modifying it to have succinyl transferase (MetA) activity.
  • MethodX O-acetyltransferase
  • MethodA succinyl transferase
  • SEQ ID NO: primer The sequence (5'-3 ') 31 Primer 25 tctagaATGCCCACCCTCGCGCCTTC 32 Primer 26 tctagaTTAGATGTAGAACTCGATG
  • PCR was carried out using the primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 using the WT chromosome as a template. After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 90 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 7 minutes. As a result, a DNA fragment of 1146 bp coding region of the metX gene was obtained.
  • the pDZ vector and the 1146 bp DNA fragment were treated with restriction enzyme XbaI, ligated using a DNA joining enzyme, and cloned to obtain a plasmid, which was named pDZ- metX .
  • SEQ ID NOS: 33 and 34 The pDZ vector and the 1146 bp DNA fragment were treated with restriction enzyme XbaI, ligated using a DNA joining enzyme, and cloned to obtain a plasmid, which was named pDZ- metX .
  • SEQ ID NOS: 33 and 34 SEQ ID NOS: 33 and 34
  • a pair of 313-th mutant primers SEQ ID NOS: 33 and 34
  • the mutant plasmids based on the existing wild-type plasmid pDZ- metX were named pDZ- metX (Q176N, L313R).
  • the pDZ- metX (Q176N, L313R) the WT produce a vector in Example 5 :: hom (G378E) ⁇ ⁇ metB and metY CA01-2307 :: hom (G378E) ⁇ ⁇ electric pulse method in the metB strain produced in the metY And kanamycin (25 mg / L) to obtain a transformant strain.
  • WT :: hom (G378E) metX ((Q176N, L313R) ⁇ metB ⁇ metY , in which the metX gene was replaced with metX ( Q176N , L313R ) by a DNA fragment inserted on the chromosome with a second round of recombination CA01-2307 :: hom (G378E) metX ((Q176N, L313R) DELTA metB DELTA metY strains were obtained.
  • vectors were constructed to enhance metX (Q176N, L313R) mutant gene expression.
  • (33 to 36) which is a primer in which the 176th amino acid having the O-succinyl transferase activity based on pECCG117- metX prepared in Example 5 is substituted with asparagine and the 313st amino acid is substituted with an amino acid
  • Mutation metX overexpression vector was constructed. Specifically, a site-directed mutagenesis kit (stratagene, USA) was used with each primer and a vector was constructed and named pECCG117- metX (Q176N, L313R).
  • O-succinyl homoserine concentration in the culture was analyzed by the following method.
  • Example 5 A 250 ml corn-baffle flask containing 25 ml of the same O-AH production medium composition used in Example 5 was inoculated with 1 pl of strain and cultured at 37 ° C for 20 hours with shaking at 200 rpm. The concentration of O-succinyl homoserine was analyzed by HPLC and the concentrations analyzed are shown in Table 14.
  • O-succinyl homoserine concentration analysis showed that the production of O-succinyl homoserine was increased by the lysC mutation.

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Abstract

본 출원은 아스파토키나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 호모세린 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산의 제조방법
본 출원은 아스파토키나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 (Corynebacterium sp .) 속 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를들어, L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다 (대한민국 등록특허 제10-0838038호).
한편, L-아미노산 중에서 L-라이신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글리신은 아스파테이트(aspartate, 이하 Asp)유래의 아미노산들로 Asp에서 아스파토키나제(aspartokinase, 이하, LysC, E.C. 2.7.2.4)에 의해 생성된 아스파틸 포스페이트(Aspartyl phosphate, 이하 App)를 공통적으로 이용한다(도 1). 따라서 상기 아미노산들을 미생물 발효법으로 생산하기 위해서 생합성 경로에서 이용되는 효소들의 활성을 일정 수준 이상으로 유지하는 것은 필수적이며, 이에 대한 집중적인 연구가 이루어져 왔다.
특히, 아스파테이트 유래의 아미노산들의 생합성 경로의 첫번째 효소로 작용하는 LysC는 L-라이신 및 L-쓰레오닌에 피드백 저해에 의해 활성이 조절되는 것으로 알려져 있다(J Mol Biol. 2007 Apr 27;368(2):521-36. Epub 2007 Feb 20). 이에 상기 피드백 저해에 관련된 출원이 있었으나(미국특허 등록번호 US 8062869 B, JP 3473042 B) 아스파테이트 유래 산물의 생산능 증가를 위해 지속적인 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명자는 신규한 아스파토키나제 변이체를 이용할 경우 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 아스파토키나제 변이체로서, 상기 아미노산 치환은 377번째 아미노산이 L-라이신 또는 L-메치오닌으로 치환된 것을 포함하는, 아스파토키나제 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 아스파토키나제 변이체를 포함하거나 이의활성이 강화된, 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 아세틸호모세린 또는 숙시닐호모세린를 생산하는 단계; 및 상기 아세틸호모세린 또는 숙시닐호모세린을 메티오닌으로 전환 하는 단계를 포함하는 메티오닌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원에 따른 아스파토키나제 변이체를 포함하는 미생물은, 야생형 LysC 폴리펩티드를 포함하는 미생물에 비하여 숙주세포의 성장 저해 없이 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아스파테이트 유래 산물을 고수율로 수득할 수 있다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 아스파테이트 유래 아미노산 및 아미노산 유도체 생합성 경로를 나타낸 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 아스파토키나제 변이체로서, 상기 아미노산 치환은 377번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하는, 아스파토키나제 변이체를 제공하는 것이다. 구체적으로는 본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 377번째 아미노산이 L-라이신 또는 L-메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "아스파토키나제 (aspartokinase, aspartic kinase)"는 아미노산 아스파테이트의 인산화를 촉매하는 효소로서, "aspartate family"로 알려진 L-메티오닌, L-라이신 및 L-쓰레오닌의 3 가지 필수 아미노산 생합성의 첫 번째 단계에 작용한다.
본 출원에서 아스파토키나제는, "LysC" 또는 "LysC 단백질"과 혼용될 수 있다. 상기 LysC 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 상기 LysC 단백질은 코리네박테리움 속 유래 LysC일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 유래 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 출원에서의 LysC은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 폴리펩타이드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에 있어서, LysC(aspartokinase)를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 효소 발현에 통상적으로 널리 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서 효소를 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 폴리펩티드의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이형 폴리펩티드는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)와 상이하다. 이러한 변이형은 일반적으로 상기 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이형의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 이러한 변이형은 일반적으로 상기 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형하고, 변형된 폴리펩티드의 반응성을 평가하여 식별될 수 있다. 또한, 일부 변이형은 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다. 다른 변이형은 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이형은 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다.
또한, 변이형은 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
예를 들어, 본 출원에서 청구하는 아스파토키나제 변이체는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp .) 미생물 유래 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 LysC의 변이형을 의미하며, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열의 N-말단으로부터 377번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 '다른 아미노산'은 377번째 아미노산인 L-류신을 제외한 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 구체적으로, 대표적인 예를 들어, 상기 377번째 아미노산 잔기는 라이신(lysine) 또는 메치오닌 (methionine)으로 치환될 수 있다. L-라이신은 염기성 아미노산의 예로서, 염기성 아미노산은 L-라이신, L-알지닌 및 L-히스티딘 중 하나 일 수 있다. L-메티오닌은 비극성 아미노산의 예로서, 비극성 아미노산은 L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-알라닌, L-시스테인, L-글리신, L-이소류신, L-류신, L-프롤린, L-트립토판 및 L- 발린 중 어느 하나 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "아스파토키나제 변이체"는 "변이된 아스파토키나제" 또는 "변이된 LysC"로 혼용될 수 있다.
이와 같은 아스파토키나제 변이체는 서열번호 1의 아스파토키나제의 활성을 갖는 폴리펩타이드에 비해 아스파토키나제 활성이 강화된 특징을 갖는다.
또한, 본원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질'이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 구체적으로, 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 보존적 치환, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (synonymous mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.본 출원에서 용어, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 이 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 "상동성" 및 "동일성"은 종종 상호 교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열전체 또는 전체길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 것이다. 상기 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(바람직하게는, 버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 “상동성” 또는 "동일성"은 서열들 간의 관련성(relevance)을 나타낸다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 "아스파토키나제 변이체"에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
상기 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호1의아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 아스파토키나제 변이체로서, 상기 아미노산 치환은 377번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 대표적인 예를 들어, 서열번호1의 아미노산 서열에서 377번째 아미노산 잔기가 다른 L-라이신 또는 L-메티오닌으로 치환된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 5로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는lysC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서,
코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브(probe), 예를 들면, 상기 폴리뉴크레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 아스파토키나제 변이체를 포함하는 숙주세포 및 상기 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 본 출원은 상기 아스파토키나제 변이체를 포함하는, 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.
상기 본 출원의 아스파토키나제 변이체를 포함하는 미생물은 야생형 또는비 변형 미생물에 비해 아스파토키나제의 활성이 강화된 특징을 갖는다.
본 출원에서 용어, "활성의 강화"는 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 자연적 혹은 인위적으로 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 나타나게 되는 것을 의미한다. "내재적 활성"은, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 미생물" 이란, 자연적으로 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산능이 없는 모균주에 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다.
본 출원에서 용어, '아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체'는 아스파테이트(Aspartic acid)를 전구체로하여 생합성할 수 있는 물질을 의미하며, '아스파테이트 유래 산물'과 혼용될 수 있다. 상기 '아미노산 유도체'는 L-아미노산으로부터 생산될 수 있는 물질 및 L-아미노산의 전구체를 포함하는 의미이며, 아스파테이트를 전구체로 하여 생합성 과정를 통해 생산될 수 있는 물질이라면 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 아세틸 포스페이트를 공통적으로 사용하여 합성되는 물질은 제한없이 포함된다. 예를 들어, L-라이신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-글리신, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, O-포스포호모세린, L-이소류신, 및 카다베린 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
카다베린은 아스파테이트를 전구체로 하여 직접 생합성 될 수도 있으며, 라이신 디카르복실라제에 의해 라이신으로부터 생성될 수도 있다. 상기 L-메티오닌은 아스파테이트를 전구체로 하여 직접 생합성 될 수도 있으며, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린으로부터 전환되어 생성될 수도 있다.
본 출원에서 용어 "아스파테이트 (Aspartic acid)는 Asp 또는 D로 약칭되며, 아스파르트 산으로, 단백질의 생합성에 사용되는 α-아미노산이다. 다른 모든 아미노산과 마찬가지로 아미노기와 카르복실산이 포함되어 있다. 일반적으로 아스파테이트는 아스파토키나제(LysC)에 의해 아스파틸 포스페이트(Aspartyl phosphate)로 생성된 뒤, 생체 내에서 L-라이신, L-메티오닌, L-호모세린, L-쓰레오닌, L-이소류신 등으로 변환될 수 있다.
상기 아스파테이트 유래 산물의 생합성을 강화하기 위하여, 본 출원의 아스파토키나제 변이체를 이용할 수 있다. 예를 들어, L-라이신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-글리신, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, O-포스포호모세린, L-이소류신 및 카다베린의 생합성을 강화하기 위하여 본 출원의 아스파토키나제 변이체를 도입하거나 이의 활성을 강화할 수 있다. 또한, 추가적으로, 특정 단백질의 활성을 도입 또는 강화하거나, 특정 단백질의 활성을 불활성화함으로써 아스파테이트 유래 산물의 생산능을 보다 더 향상시킬 수 있다.
상기 특정 단백질의 활성을 도입, 강화, 불활성화 하는 방법은 미생물이 가진 특징에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 아스파테이트 유래 산물, L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 미생물은 본 출원의 아스파테이트 변이체 포함하여 아스파테이트 유래 '아미노산' 또는 아미노산 유도체를 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 기술된 미생물을 배양하는 단계 및 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건 에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아스파테이트 유래 아미노산 또는 아미노산 유도체는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 아스파테이트 유래 아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아스파테이트 유래 아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 추가적으로 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 기술된 미생물을 배양하는 단계; 상기 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 생산하는 단계; 및 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 L-메티오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메티오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로 상기 'L-메티오닌으로 전환하는 단계'는 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린과 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 황화물의 존재하 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 'O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린'은, 본 출원의 기술된 미생물이 생산한 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 함유한 발효액이거나, 정제된 형태일 수 있다. 또한 상기의 '황화물'은 예를 들어 메틸머캅탄일 수 있고, 상기 메틸머캅탄은 액상의 소디움메틸머캅탄(sodium methyl mercaptan, CH3S-Na) 형태, 가스 또는 액화 상태의 메틸머캅탄(CH3SH) 뿐만 아니라 국제 공개특허 제WO2010/098629호에 언급된 형태로 디메칠설파이드(DMS, Dimethylsulfide)를 포함한 메틸머캅탄 등 황 원자를 제공할 수 있는 형태를 포함하고 있는 메틸머캅탄 유도체 모두를 의미할 수 있다. 또한 상기 'O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제'는 이를 생산하는 미생물의 발효액이거나, 정제된 형태일 수 있다.
상기 L-메티오닌을 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적인 배양 방법 및 배지는 상기 설명한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 실시예 1: lysC 변이 도입 균주 제작
아스파토키나제 단백질의 구조 모델링을 통해 야생형보다 활성이 강화될 수 있는 변이를 선별하였으며, 하기와 같이 상기 변이를 도입한 균주를 제작 하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(이하 WT) 유래의 아스파토키나제(서열번호 1)를 코딩하는 lysC 유전자(서열번호 2)를 대상으로 377번째 아미노산을 변이위치로 선정하였으며, 치환하기위한 다른 아미노산의 대표적인 예로, 염기성 아미노산인 L-라이신과, 비극성 아미노산인 L-메티오닌을 선정하였다.
상기 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 7 및 8 혹은 서열번호 7 및 10) 및 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 9 및 12 혹은 서열번호 11 및 12)을 고안하였다(표 1). 서열번호 7 및 12의 프라이머는 각 말단에 XbaⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 8 및 9의 프라이머 한쌍 혹은 서열번호 10 및 11의 프라이머 한쌍은 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
7 Primer 1 tcctctagaGCTGCGCAGTGTTGAATACG
8 Primer 2 TGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT
9 Primer 3 ACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATTC
10 Primer 4 TGGAAATCATTTCGATGTTCACGTTGACAT
11 Primer 5 ACATCGAAATGATTTCCACCTCTGAGATTC
12 Primer 6 gactctagaGTTCACCTCAGAGACGATTA
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8 혹은 서열번호 7 및 서열번호 10, 서열번호 9 및 서열번호 12 혹은 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 509 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 7 및 서열번호 12의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 3)를 코딩하는 lysC 유전자의 변이(서열번호 4)를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 또한, 377번째 아미노산 위치의 중요성을 확인하기 위하여, 377번째 루신이 메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 5)를 코딩하는 lysC 유전자의 변이(서열번호 6)를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(한국 등록특허 제0924065호)와 1011 bp의 DNA 단편들을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-lysC(L377K)과 pDZ-lysC(L377M)라 명명하였다.
pDZ-lysC(L377K)과 pDZ-lysC(L377M) 벡터를 각각 WT에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 LB 배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)과 WT::lysC(L377M)를 획득하였고, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2307 과 CA01-2308이라 각각 명명하였다. 이 중 CA01-2307과 CA01-2308은 2017년 3월 29일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12000P 및 KCCM12001P를 부여받았다.
실시예 2. lysC 변이 도입 균주의 아스파테이트 유래 아미노산 생산능 확인
상기 실시예에서 획득한 CA01-2307 및 CA01-2308 균주와 WT 균주의 아스파테이트 유래 주요 아미노산 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 성분을 분석하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각각 균주를 접종하고, 37 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 37 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-아스파테이트, 아스파테이트 유래 대표적인 아미노산인 L-라이신 및 L-쓰레오닌 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 [표 2]와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
CA01-2307 및 CA01-2308 균주의 아스파테이트 유래 아미노산 생산 농도
균주/농도 L-아스파테이트(mg/L) L-라이신(mg/L) L-쓰레오닌(mg/L)
WT 20.3 8.0 340.3
CA01-2307 29.7 3647.7 402.7
CA01-2308 30.2 1572.3 385.4
아스파테이트 유래 아미노산 농도 분석 결과, lysC 유전자 변이 도입시 WT과 비교하여 특히 L-라이신 농도가 급격히 증가하고 L-아스파테이트와 L-쓰레오닌 농도가 증가되는 패턴을 확인하였다. 상기의 결과를 바탕으로 CA01-2307 및 CA01-2308 균주와 WT 균주의 라이신 생산능을 상세 비교하고자 상기와 동일한 방법으로 배양하였으며, 배양액 중의 L-라이신 농도를 상기와 동일한 방법으로 분석하였다[표 3].
WT와 CA01-2307 및 CA01-2308 균주의 라이신 생산 농도
균주/농도 L-라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT 0.008 0.007 0.008
CA01-2307 3.664 3.665 3.598
CA01-2308 1.523 1.475 1.666
L-라이신 농도 분석 결과, 기존 평가와 동일하게 WT 균주 대비 lysC(L377K) 변이를 포함하고 있는 CA01-2307의 L-라이신 생산능이 크게 증가함을 확인하였다. 또한 lysC(L377M) 변이를 포함하고 있는 CA01-2308의 L-라이신 생산능도 WT 균주 대비 증가함을 확인하였다. 상기의 결과를 바탕으로 본 출원에서 선별된 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 3)와 377번째 루신이 메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 5)에 의해 아스파테이트 유래 아미노산 중 L-라이신 생산능이 크게 증가함을 확인하였다.
실시예 3. L- 쓰레오닌 강화균주 제작 및 L-쓰레오닌 생산능 확인
상기 실시예 2의 결과로부터 확인된, 보다 높은 라이신 생산능을 가진 lysC(L377K) 변이 도입에 의한 L-쓰레오닌 생산능 변화를 명확히 확인하기 위하여, L-쓰레오닌, L-이소류신, L-메치오닌 및 Homoserine 유도체 생합성 경로의 공통적 중간체인 호모세린(homoserine)을 생산하는 호모세린 디하이드로게나제(homoserin dehydrogenase)를 코딩하는 유전자에 변이를 도입하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 제작된 CA01-2307 균주에 기 공지된 hom(G378E) 변이(Appl . Microbiol . Biotechnol.　45, 612-620 (1996))가 도입된 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 WT에 hom(G378E) 변이가 도입된 균주도 제작하였다. hom(G378E)를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 WT genomic DNA를 주형으로 서열변호 13과 14, 15과 16를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 220 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 220 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 이 두 개의 PCR product를 주형으로 서열번호 13과 16를 이용하여 PCR을 진행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 포함하는 440 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
13 Primer 7 tcctctagaCTGGTCGCCTGATGTTCTAC
14 Primer 8 GCCAAAACCtCCACGCGATC
15 Primer 9 ATCGCGTGGaGGTTTTGGCT
16 Primer 10 gactctagaTTAGTCCCTTTCGAGGCGGA
앞서 실시예 1에서 사용된 pDZ 벡터와 440 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-hom(G378E)라 명명하였다.
pDZ-hom(G378E) 벡터를 WT 및 CA01-2307균주에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999, 52:541-545)으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 hom 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::hom(G378E)과 CA01-2307::hom(G378E)를 획득하였다. 획득한 WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E)의 쓰레오닌 생산능을 비교하고자 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였고, 배양액 중의 쓰레오닌 농도를 분석하였다.
WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E) 균주의 쓰레오닌 생산 농도
균주/농도 L-쓰레오닌(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E) 0.456 0.475 0.432
CA01-2307::hom(G378E) 1.210 1.132 1.211
L-쓰레오닌 농도 분석 결과, lysC 변이를 포함하는 균주에서 L-쓰레오닌 생산능이 급격히 증가함을 확인하였다[표 5].
실시예 4. L-이소류신 강화 균주 제작 및 L-이소류신 생산능 비교
lysC(L377K)변이 도입에 의한 L-이소류신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 기 공지된 쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자 ilvA(V323A) 변이(Appl . Enviro . Microbiol ., Dec. 1996, p.4345-4351) 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다.
ilvA 유전자를 대상으로 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 17 및 18)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 19 및 20)을 고안하였다. 서열번호 17 및 20의 프라이머는 각 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 18 및 19의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
17 Primer 11 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
18 Primer 12 ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
19 Primer 13 CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG
20 Primer 14 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 17 및 서열번호 20의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 323번째 발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 코딩하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 1011 bp의 DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117- ilvA(V323A) 라 명명하였다.
pECCG117-ilvA(V323A)벡터를 실시예3에서 제작된 WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환주를 획득하였다.
실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-이소류신 농도를 분석하였다[표 7].
균주 L-이소류신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E)/ pECCG117-ilvA(V323A) 0.102 0.072 0.062
CA01-2307::hom(G378E)/ pECCG117-ilvA(V323A) 0.876 0.900 0.918
L-이소류신 농도 분석 결과, lysC 변이를 포함하는 균주에서 L-이소류신 생산능이 크게 증가함을 확인하였다.
실시예 5: O-아세틸-호모세린 강화 균주 제작 및 O- 아세틸-호모세린 생산능 비교
lysC(L377K)변이 도입에 의한 O-아세틸-호모세린의 생산에 미치는 영향을 파악하기 위해 O-아세틸-호모세린 분해 경로인 시스타치오닌 감마-신타제를 코딩하는 metB 유전자와 O-아세틸호모세린 (티올)-라이아제를 코딩하는 metY 유전자를 결손하고 O-아세틸-호모세린 생합성 효소인 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 metX 유전자를 과 발현하여 O-아세틸-호모세린 생산균주를 제작하였다. 먼저 metB 유전자를 결손하기 위하여 WT 유래의 metB 유전자의 염기서열 정보를 기반으로 metB 유전자의 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 21 및 22)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 23 및 24)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
21 Primer 15 TCTAGATGCGCTGATTATCTCACC
22 Primer 16 ACTGGTGGGTCATGGTTGCATATGAGATCAACTCCTGTAA
23 Primer 17 TTACAGGAGTTGATCTCATATGCAACCATGACCCACCAGT
24 Primer 18 TCTAGACCTTGAAGTTCTTGACTG
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23, 및 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metB 유전자의 5` 상단 부위의 450 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 467 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 21 및 서열번호 24의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, metB 유전자의 중앙부분이 결손되어 상단과 하단만 포함하는 917 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pDZ 벡터와 917 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-△metB라 명명하였다.
pDZ-△metB 벡터를 실시예3에서 제작된 WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 metB 유전자가 결손된 균주인 WT::hom(G378E)△metB 와 CA01-2307::hom(G378E)△metB 를 획득하였다.
O-아세틸-호모세린의 또 하나의 분해경로인 metY 유전자를 결손하기 위하여 WT유래 metY 유전자의 염기서열 정보를 기반으로 metY 유전자의 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 25및 26)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 27 및 28)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
25 Primer 19 TCTAGAAGTAGCGTTGCTGTACAC
26 Primer 20 ATCAATGGTCTCGATGCCCATATGGCATTTGGAGGTCCTTAAG
27 Primer 21 CTTAAGGACCTCCAAATGCCATATGGGCATCGAGACCATTGAT
28 Primer 22 TCTAGATGGAACCGTTGCAACCAC
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 25 및 서열번호 26 서열번호 27, 및 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metY 유전자의 5` 상단 부위의 512 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 25 및 서열번호 28의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, metY 유전자의 중앙부분이 결손되어 상단과 하단만 포함하는 1032 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pDZ 벡터와 1032 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-△metY라 명명하였다.
pDZ-△metY 벡터를 상기에 제작된 WT::hom(G378E)△metB 와 CA01-2307::hom(G378E)△metB 균주에 각가 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 metY 유전자가 결손된 균주인 WT::hom(G378E)△metB△metY와 CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY 를 획득하였다.
O-아세틸-호모세린 생성 극대화를 위하여, metX 유전자 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다. 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제 (MetX) 코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여 WT 유래 보고된 서열에 근거하여 프로모터 부위(개시코돈 상단 약 300bp) 로부터 터미네이터 부위(종결코돈 하단 약 100bp)까지 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 29 및 30)의 양 말단에 BamHI 제한 효소 부위를 삽입하여 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
29 Primer 23 ggatccCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC
30 Primer 24 ggatccCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 25, 26번의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metX 유전자를 포함하는 1546 bp DNA 단편을 수득하였다.
pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 metX DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-metX라 명명하였다.
pECCG117-metX 벡터를 상기에 제작된 WT::hom(G378E)△metB△metY 와 CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다.
상기에 제작된 균주들 O-아세틸-호모세린(이하, O-AH) 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-아세틸호모세린 농도를 분석하였다.
O-AH 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주 1백금이를 접종하고, 37 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-아세틸-호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 [표 11]와 같다.
<O-AH 생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, L-methionine 0.3g (증류수 1리터 기준).
균주 O-아세틸호모세린(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E)△metB△metY/pECCG117-metX 0.135 0.209 0.175
CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY/pECCG117-metX 2.312 2.045 2.532
상기의 결과에서 보듯이 O-아세틸호모세린 농도 분석 결과, lysC 변이에 의한 O-아세틸호모세린 생산이 증가됨을 확인하였다.
실시예 6: O- 숙시닐호모세린 강화 균주 제작 및 O- 숙시닐호모세린 생산능 비교
lysC(L377K)변이 도입에 의한 O-숙시닐호모세린의 생산능에 대한 영향성을 파악하기 위해 O-숙시닐호모세린 생산균주를 제작하였다. 코리네박테리아 글루타미쿰 야생형 균주의 경우 자연적으로 O-숙시닐호모세린을 생산하지 못하기 때문에 실시예5에서 제작된 O-아세틸 트랜스퍼라아제 (MetX) 효소의 기질 접합부위 아미노산 교체를 통해 O-숙시닐 트랜스퍼라아제 (MetA) 활성을 가지도록 변형시켜 O-숙시닐호모세린을 생성하고자 하였다. 이에 WT 유래의 metX 유전자 서열 기반으로 실시예 metX 변이을 도입하기 위한 벡터를 제작하기 위하여 프라이머 한쌍(서열번호 31 및 32)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
31 Primer 25 tctagaATGCCCACCCTCGCGCCTTC
32 Primer 26 tctagaTTAGATGTAGAACTCGATG
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 27과 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metX 유전자의 코딩 부위 1146 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
pDZ 벡터와 1146 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-metX라 명명하였다. pDZ-metX 벡터를 기반으로 176번째 아미노산이 아스파라긴으로 313번째 아미노산이 알지닌으로 치환되는 변이벡터를 만들기 위해 176 번째 변이부여 프라이머 한쌍 (서열번호 33 및 34)과 313번째 변이부여 프라이머 한쌍 (서열번호 35 및 36)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
33 Primer 27 ACGCGCCAGCGCCTGGaacATCGGCATTCAATCCG
34 Primer 28 CGGATTGAATGCCGATgttCCAGGCGCTGGCGCGT
35 Primer 29 TAGATACCGATATTcgGTACCCCTACCACCAG
36 Primer 30 CTGGTGGTAGGGGTACcgAATATCGGTATCTAC
상기 각각의 프라이머와 함께 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하여 metX 변이 유전자를 제조하였다. 기존 야생형 플라스미드 pDZ-metX를 기반으로 한 변이형 플라스미드는 pDZ-metX(Q176N, L313R) 이라 명명하였다. 상기에 제작된 pDZ-metX(Q176N, L313R) 벡터를 실시예 5에서 제작된 WT::hom(G378E)△metB△metY와 CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 metX 유전자가 metX ( Q176N , L313R ) 로 교체된 WT::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 와 CA01-2307::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 균주를 획득하였다.
O-숙시닐-호모세린 생성 극대화를 위하여, metX(Q176N, L313R) 변이 유전자 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다. 실시예 5에서 제작한 pECCG117-metX 를 기반으로 O-숙시닐 트랜스퍼라아제 활성을 가지는 변이 176번째 아미노산이 아스파라긴으로 313번째 아미노산이 알지닌으로 치환하는 프라이머인 서열번호 (33~36)을 이용하여 변이 metX 과발현 벡터를 제작하였다. 구체적으로 각각의 프라이머와 함께 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하였고 벡터를 제작하였고 pECCG117-metX (Q176N, L313R) 이라 명명하였다.
pECCG117-metX (Q176N, L313R) 와 공벡터 pECCG117 벡터를 상기의 제작된O-숙시닐-호모세린 생산균주인 WT::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 와 CA01-2307::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환주를 획득하였다.
상기 균주의 O-숙시닐호모세린 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-숙시닐호모세린 농도를 분석하였다.
실시예 5에서 사용한 동일한 O-AH 생산배지 조성으로 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주 1백금이를 접종하고, 37 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-숙시닐호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 [표 14]와 같다.
균주 O-숙시닐호모세린(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY/ pECCG117-metX(Q176N, L313R) 0.052 0.120 0.087
CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY/ pECCG117-metX(Q176N, L313R) 1.529 1.632 1.874
상기의 결과에서 보듯이 O-숙시닐호모세린 농도 분석 결과, lysC 변이에 의한 O-숙시닐호모세린 생산이 증가됨을 확인하였다.
이상의 결과들은 본 발명의 변이체가 아스파테이트 유래 아미노산 및/또는 이의 유도체의 생산을 증가시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2018007407-appb-I000001
Figure PCTKR2018007407-appb-I000002

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 377번째 아미노산이 L-라이신 또는 L-메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체.
  2. 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1항의 아스파토키나제 변이체를 포함하는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체는 라이신, 쓰레오닌, 메티오닌, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, 이소류신, 및 카다베린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것인 코리네박테리움속 미생물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 미생물.
  6. 제3항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체는 라이신, 쓰레오닌, 메티오닌, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, 이소류신, 및 카다베린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것인 생산 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 생산 방법.
  9. 제3항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계;
    상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 생산하는 단계; 및
    상기 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 L-메티오닌으로 전환하는 단계를 포함하는 L-메티오닌 생산 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 생산 방법.
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