[go: up one dir, main page]

ES2884800T3 - Nuevo mutante de aspartoquinasa y método para la producción de L-aminoácido mediante su uso - Google Patents

Nuevo mutante de aspartoquinasa y método para la producción de L-aminoácido mediante su uso Download PDF

Info

Publication number
ES2884800T3
ES2884800T3 ES18824928T ES18824928T ES2884800T3 ES 2884800 T3 ES2884800 T3 ES 2884800T3 ES 18824928 T ES18824928 T ES 18824928T ES 18824928 T ES18824928 T ES 18824928T ES 2884800 T3 ES2884800 T3 ES 2884800T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amino acid
val
ala
leu
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18824928T
Other languages
English (en)
Inventor
Hyung Joon Kim
Hyo Jin Kim
Hyun Won Bae
Hyun Ah Kim
Chang Il Seo
Ji Sun Lee
Jin Sook Chang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2884800T3 publication Critical patent/ES2884800T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02003—Phosphoglycerate kinase (2.7.2.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Una variante de aspartoquinasa, en donde el aminoácido en la posición 377 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con L-lisina o L-metionina.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevo mutante de aspartoquinasa y método para la producción de L-aminoácido mediante su uso
[Campo técnico]
La presente descripción se refiere a una variante de aspartoquinasa, un microorganismo que comprende la variante, y un método para producir un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este mediante el uso de microorganismo.
[Antecedentes de la técnica]
Un microorganismo del género Corynebacterium, particularmente Corynebacterium glutamicum, es un microorganismo grampositivo que se usa ampliamente para la producción de L-aminoácidos y otras sustancias útiles. Para producir L-aminoácidos y otras sustancias útiles se realizaron varios estudios para desarrollar microorganismos de alta eficiencia de producción y tecnologías para procesos de fermentación. Por ejemplo, se han empleado principalmente métodos para abordar de manera específica sustancias diana por aumento de la expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de L-lisina o por eliminación de genes innecesarios para la biosíntesis (Patente coreana Núm. 10-0838038).
Mientras tanto, entre los L-aminoácidos, L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina y L-glicina son aminoácidos derivados del aspartato (Asp) y comúnmente estos aminoácidos usan aspartil fosfato (App) producido por la aspartoquinasa a partir de Asp (LysC, EC 2.7.2.4) (Figura 1). Por lo tanto, para producir los aminoácidos mediante un método de fermentación microbiana, es esencial mantener a un nivel determinado o superior las actividades de las enzimas que se usan en la vía biosintética, por lo que se realizó una investigación intensiva al respecto.
En particular, se sabe que la actividad de LysC, que actúa como la primera enzima en la ruta de biosíntesis de aminoácidos derivados del aspartato, se regula por la inhibición por retroalimentación de L-lisina y L-treonina (J Mol Biol. 27 de abril de 2007; 368(2):521-36. Epub 2007 20 de febrero). En este sentido, aunque se han presentado solicitudes relevantes para la inhibición por retroalimentación (Patente de Estados Unidos Núm. US 8062869 B y Patente Japonesa Núm. JP 3473042 B), aún se requieren investigaciones continuas para aumentar la productividad de los productos derivados del aspartato.
En tales circunstancias, los presentes inventores completaron la presente descripción confirmando que la producción de L-aminoácidos derivados de aspartato o derivados de aminoácidos de estos se mejora cuando se usa una nueva variante de aspartoquinasa.
[Descripción]
[Problema técnico]
Un objetivo de la presente descripción es proporcionar una variante de aspartoquinasa que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución de aminoácidos comprende que el aminoácido en la posición 377 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con L-lisina o L-metionina.
Otro objetivo de la presente descripción es proporcionar un polinucleótido que codifica la variante.
Otro objetivo más de la presente descripción es proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium que produzca un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este, que comprenda la variante de aspartoquinasa o tenga su actividad mejorada.
Otro objetivo más de la presente descripción es proporcionar un método para producir un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este, que comprende: cultivar el microorganismo en un medio; y recuperar el L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este a partir del microorganismo cultivado o medio cultivado.
Otro objetivo más de la presente descripción es proporcionar un método para producir metionina, que comprende: cultivar el microorganismo en un medio; producir acetilhomoserina o succinilhomoserina a partir del microorganismo cultivado o medio cultivado; y convertir la acetilhomoserina o succinilhomoserina en metionina.
[Solución técnica]
A continuación, la presente descripción se describirá en detalle.
Mientras tanto, cada una de las explicaciones y modalidades ilustrativas descritas en la presente descripción pueden aplicarse a otras explicaciones y modalidades ilustrativas. Es decir, todas las combinaciones de varios factores descritos en la presente descripción pertenecen al alcance de la presente descripción. Además, el alcance de la presente descripción no debería limitarse por la descripción específica que se proporciona a continuación.
Para lograr los objetivos anteriores, un aspecto de la presente descripción proporciona una variante de aspartoquinasa que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución de aminoácidos comprende que el aminoácido en la posición 377 se sustituye con otro aminoácido. Específicamente, un objetivo de la presente descripción es proporcionar una variante de aspartoquinasa, en donde el aminoácido en la posición 377 en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 se sustituye con L-lisina o L-metionina.
Como se usa en la presente descripción, el término "aspartoquinasa" se refiere a una enzima que cataliza la fosforilación de un aminoácido, aspartato, y actúa en el primer paso de biosíntesis de tres aminoácidos esenciales, L-metionina, L-lisina y L-treonina que se conocen como la familia del aspartato.
En la presente descripción, el término "aspartoquinasa" puede usarse de manera indistinta con "LysC" o "proteína LysC". La proteína LysC puede obtenerse de GenBank de NCBI, una base de datos conocida. La proteína LysC puede derivar de LysC del género Corynebacterium, y específicamente, puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que deriva de Corynebacterium glutamicum, pero no se limita a ello. Además, la LysC en la presente descripción puede ser un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En la presente descripción, pueden usarse varios métodos que se conocen en la técnica para el método para obtener aspartoquinasa (LysC). Ejemplos de tales métodos incluyen técnicas de síntesis de genes que incluyen la optimización de codones para obtener con alta eficiencia enzimas en un microorganismo del género Corynebacterium, que se usa comúnmente para la expresión de enzimas, y métodos para cribar recursos enzimáticos útiles mediante el uso de métodos bioinformáticos que se basan en el metagenoma de microorganismos, pero los métodos no se limitan a ello.
Como se usa en la presente descripción, el término "variante" es un polipéptido en el que al menos un aminoácido difiere del polipéptido mencionado en sustituciones y/o modificaciones conservadoras, de modo que se conservan las funciones o propiedades del polipéptido. Los polipéptidos variantes se diferencian de una secuencia identificada por sustitución, eliminación o adición de varios aminoácidos. Generalmente, tales variantes pueden identificarse modificando una de las secuencias polipeptídicas anteriores y evaluando las propiedades del polipéptido modificado. En otras palabras, la capacidad de una variante puede mejorarse, no modificarse o disminuirse en relación con la proteína natural. Generalmente, tales variantes pueden identificarse modificando una de las secuencias polipeptídicas anteriores y evaluando la reactividad del polipéptido modificado. Además, una parte de las variantes puede incluir aquellas en las que se eliminó una o más porciones, tales como una secuencia líder del extremo N o un dominio transmembrana. Otras variantes pueden incluir variantes en las que se eliminó una pequeña porción del extremo N y/o del extremo C de la proteína madura.
Como se usa en la presente descripción, una "sustitución conservadora" significa que un aminoácido se sustituye con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Por ejemplo, las variantes pueden tener al menos una sustitución conservadora y mantienen una actividad biológica más. Tales sustituciones de aminoácidos pueden realizarse generalmente con base en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos aromáticos incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina; y los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina y triptófano. Normalmente, las sustituciones conservadoras tienen poco o ningún impacto en la actividad de un polipéptido resultante.
Las variantes también pueden contener otras modificaciones, entre ellas la eliminación o adición de aminoácidos, las cuales tienen una influencia mínima en las propiedades y la estructura secundaria del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una secuencia señal (o líder) en el extremo N de la proteína que dirige la transferencia de la proteína cotraduccional o postraduccionalmente. El polipéptido también puede conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido.
Por ejemplo, el término "variante de aspartoquinasa" que se reivindica en la presente descripción puede referirse específicamente a un polipéptido modificado de LysC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que deriva de Corynebacterium sp. y puede comprender una variante que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Específicamente, una variante puede comprender que el residuo de aminoácido en la posición 377 se sustituya con otro aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El "otro aminoácido" no se limita siempre y cuando sea un aminoácido distinto de L-leucina, que es el aminoácido en la posición 377. Específicamente, por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 377 puede sustituirse con lisina o metionina. L-lisina es un ejemplo de un aminoácido básico, y el aminoácido básico puede ser uno de L-lisina, L-arginina y L-histidina. L-metionina es un ejemplo de un aminoácido no polar, y el aminoácido no polar puede ser uno de L-metionina, L-fenilalanina, L-alanina, L-cisteína, L-glicina, L-isoleucina, L -leucina, L-prolina, L-triptófano y L-valina. Sin embargo, estos no se limitan a ello.
Como se usa en la presente descripción, el término "variante de aspartoquinasa" puede usarse de manera indistinta con "aspartoquinasa modificada" o "LysC modificada".
Tal variante de aspartoquinasa se caracteriza por tener una actividad de aspartoquinasa mejorada en comparación con el polipéptido que tiene una actividad de la aspartoquinasa de SEQ ID NO: 1.
Como se usa en la presente descripción, el término "sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un determinado residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se conocen bien en la técnica. Ejemplos de tales familias pueden incluir aminoácidos que tienen una cadena lateral básica (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), aminoácidos que tienen una cadena lateral ácida (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), aminoácidos que tienen una cadena lateral polar no cargada. (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), aminoácidos que tienen una cadena lateral no polar (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), aminoácidos que tienen una cadena lateral ramificada en la posición p (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), aminoácidos que tienen una cadena lateral aromática (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina), aminoácidos que contienen grupo hidroxilo (por ejemplo, alcohólico, fenólico) en la cadena lateral (por ejemplo, serina, treonina, tirosina) y aminoácidos que tienen una cadena lateral que contiene azufre (por ejemplo, cisteína, metionina). Preferentemente, la sustitución conservadora de los aminoácidos puede ser la sustitución entre ácido aspártico y ácido glutámico, la sustitución entre arginina, lisina e histidina, la sustitución entre triptófano y fenilalanina, la sustitución entre fenilalanina y valina, la sustitución entre leucina, isoleucina y alanina y la sustitución entre glicina y alanina.
Como se usa en la presente descripción, el término "homología" o "identidad" se refiere al grado de relevancia entre dos secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos dadas y puede expresarse como un porcentaje.
Los términos "homología" e "identidad" se usan a menudo de manera indistinta entre sí.
La homología de secuencia o la identidad de las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos conservadas puede determinarse mediante algoritmos estándares de alineamiento y pueden usarse con la penalización por espacio predeterminada que se establece en el programa que se usa. Generalmente se espera que polinucleótidos o polipéptidos homólogos o idénticos en secuencia hibriden al menos en aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 % o aproximadamente el 90 % de la longitud total de los polinucleótidos o polipéptidos diana en condiciones moderadas o muy estrictas. Los polinucleótidos que contienen codones degenerados en lugar de codones también se consideran para la hibridación.
Se puede determinar si dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos cualesquiera tienen homología, similitud o identidad entre sí, mediante el uso de un algoritmo informático que se conoce como el programa "FASTA" (por ejemplo, Pearson y otros, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:2444) mediante el uso de parámetros predeterminados. Alternativamente, se puede determinar mediante el uso del algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), que se realiza en el programa Needleman del paquete EMBOSS (e MbOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y otros, 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (preferentemente, versión 5.0.0 o versiones posteriores) (paquete de programa GCG (Devereux, J., y otros, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [y otros, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, y [CARILLO y otros](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por ejemplo, la homología o identidad se puede determinar mediante el uso de BLAST o ClustalW del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).
La homología, similitud o identidad de secuencias de polinucleótidos o polipéptidos se puede determinar comparando la información de la secuencia mediante el uso, por ejemplo, del programa informático GAP (por ejemplo, Smith y Waterman, Adv. Apl. Math (1981) 2:482) según se publicó. En resumen, el programa GAP define la homología o identidad como el valor que se obtiene al dividir el número de símbolos alineados de manera similar (es decir, nucleótidos o aminoácidos) por el número total de símbolos en la secuencia más pequeña de las dos. Los parámetros predeterminados para el programa GAP pueden incluir (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y otros (1986), Nucl. Acids Res. 14: 6745, como se describió en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, Fundación Nacional de Investigación Biomédica, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 por cada espacio y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada espacio (o una penalización de apertura de espacio de 10 y una penalización de extensión de espacio de 0,5); y (3) sin penalización por espacios en los extremos. En consecuencia, como se usa en la presente descripción, el término "homología" o "identidad" se refiere a la relevancia entre secuencias.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica la variante de aspartoquinasa. La variante de aspartoquinasa es como se describió anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero de nucleótidos compuesto de monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena, y ejemplos del mismo son cadenas de ADN o ARN que tienen una longitud predeterminada o más larga. Específicamente, el polinucleótido se refiere a un fragmento de polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.
El polinucleótido que codifica la variante de aspartoquinasa puede ser un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución de aminoácidos comprende que el residuo de aminoácido en la posición 377 se sustituya con otro aminoácido. Específicamente, como ejemplo representativo, el polinucleótido que codifica la variante de aspartoquinasa puede ser un polinucleótido que codifica un polipéptido en el que se sustituye el residuo de aminoácido en la posición 377 con otro aminoácido de L-lisina o L-metionina en la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID NO: 1. Más específicamente, el polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica una proteína LysC que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. Pueden realizarse varias modificaciones en la región codificante siempre y cuando no cambien la secuencia de aminoácidos de la proteína que se expresa a partir de la región codificante, debido a la degeneración de codones o considerando los codones preferidos por un organismo en el que se va a expresar la proteína.
Por lo tanto, es evidente que, debido a la degeneración de codones, también puede incluirse en el alcance de la presente descripción el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 o el polinucleótido capaz de traducirse en un polinucleótido que tenga homología o identidad con este. Alternativamente, puede incluirse sin limitación una sonda que puede prepararse a partir de una secuencia genética conocida, por ejemplo, una secuencia que codifica una proteína que tiene la actividad de la enzima que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, la cual hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria en toda o una parte de la secuencia de polinucleótidos.
Las "condiciones rigurosas" se refieren a las condiciones que permiten la hibridación específica entre los polinucleótidos. Tales condiciones se describen específicamente en la literatura (por ejemplo, J. Sambrook y otros). Por ejemplo, las condiciones rigurosas pueden incluir una condición en la que genes que tienen una alta homología o identidad (por ejemplo, 80 % o más, 85 % o más, específicamente 90 % o más, más específicamente 95 % o más, incluso más específicamente 97 % o más, e incluso más específicamente el 99 % o más) pueden hibridar entre ellos, mientras que los genes que tienen una menor homología o identidad con estos no pueden hibridar entre sí; o condiciones para la hibridación de tipo southern convencional (es decir, condiciones para lavado una vez, y específicamente dos o tres veces, a una concentración de sal y temperatura correspondientes a 60 °C, 1*SSC y SDS al 0,1 %; específicamente por debajo de 60 °C, 0,1xSSC y SDS al 0,1%; y más específicamente por debajo de 68 °C, 0,1xSSC y SDS al 0,1 %).
La hibridación requiere que dos ácidos nucleicos tengan secuencias complementarias, aunque pueden ocurrir desapareamientos entre bases, en dependencia de la fortaleza de la hibridación. El término "complementario" se usa para describir la relación entre las bases de nucleótidos que pueden hibridar entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por tanto, la presente descripción también puede incluir secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares así como fragmentos de ácido nucleico aislados complementarios a la secuencia completa.
Específicamente, el polinucleótido que tiene homología o identidad puede detectarse usando las condiciones de hibridación que incluye una etapa de hibridación a un valor de Tm de 55 °C y usando las condiciones descritas anteriormente. Además, el valor de Tm puede ser, pero no se limita a, 60 °C, 63 °C, o 65 °C. Un experto en la técnica puede ajustar apropiadamente el valor de Tm de acuerdo con su propósito.
La fortaleza apropiada para la hibridación de los polinucleótidos depende de la longitud y el grado de complementariedad de los polinucleótidos, y las variables se conocen bien en la técnica (Sambrook y otros Supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona una célula hospedera que contiene la variante de aspartoquinasa y un microorganismo transformado con un vector que contiene un polinucleótido que codifica la variante de aspartoquinasa. Específicamente, la presente descripción proporciona un microorganismo del género Corynebacterium que produce un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este, que comprende la variante de aspartoquinasa.
El microorganismo que contiene la variante de aspartoquinasa de la presente descripción se caracteriza porque la actividad de la aspartoquinasa se mejora en comparación con el microorganismo de tipo silvestre o no modificado.
Como se usa en la presente descripción, el término "mejora de la actividad" significa que se introduce la actividad de una proteína, o que se mejora la actividad en comparación con la actividad intrínseca o la actividad previa a la modificación de un microorganismo. La "introducción" de la actividad significa que la actividad de una proteína específica que el microorganismo no tenía originalmente se expresa de forma natural o artificial. La "actividad intrínseca" se refiere a la actividad de una proteína específica, que está presente originalmente en una cepa parental antes de la transformación, cuando los rasgos microbianos se alteran por variación genética por factores naturales o artificiales.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a la construcción de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que codifica la proteína diana unida operativamente a la secuencia reguladora adecuada para expresar la proteína diana en el hospedero adecuado. La secuencia reguladora puede incluir el promotor que puede iniciar la transcripción, cualquier secuencia de operador para controlar la transcripción, la secuencia para codificar el sitio de unión del ribosoma al ARNm apropiado y la secuencia para controlar la terminación de la transcripción y traducción. El vector se puede transfectar en un hospedero adecuado y luego puede replicarse o funcionar independientemente del genoma del hospedero y puede integrarse en el genoma de este.
El vector que se usa en la presente descripción no se limita particularmente siempre y cuando pueda expresarse en el hospedero y puede usarse cualquier vector que se conozca en la técnica. Ejemplos de vectores que se usan comúnmente son un plásmido, cósmido, virus y bacteriófago en estado natural o estado recombinante. Por ejemplo, pueden usarse como vector de fago o vector de cósmido pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A y Charon21A; y pueden usarse como vector plasmídico el sistema pBR, el sistema pUC, el sistema pBluescriptII, el sistema pGEM, el sistema pTZ, el sistema pCL y el sistema pET. Específicamente, pueden usarse los vectores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 y pCC1BAC, pero estos no se limitan a ello.
El vector que puede usarse en la presente descripción no se limita particularmente y puede usarse un vector de expresión conocido. Además, un polinucleótido que codifica una proteína diana puede insertarse en un cromosoma a través de un vector para la inserción cromosómica intracelular. La inserción del polinucleótido en el cromosoma puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como recombinación homóloga, sin limitarse particularmente a ello. El vector puede incluir además un marcador de selección para indicar la inserción del vector en el cromosoma del hospedero. El marcador de selección se usa para seleccionar las células transformadas con el vector, es decir, para confirmar si se inserta una molécula de ácido nucleico diana. Por lo tanto, el marcador de selección puede dotar a la célula de la capacidad de mostrar resistencia a fármacos, resistencia a agentes citotóxicos, autotrofia o expresión de fenotipo seleccionable, tal como la expresión de una proteína de superficie. En presencia de un agente selectivo, las células transformadas pueden seleccionarse porque solo las células que expresan la representación del marcador de selección sobreviven o muestran otro fenotipo.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a la introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula hospedera de manera tal que la proteína codificada por el polinucleótido se expresa en la célula hospedera. Siempre y cuando el polinucleótido transformado pueda expresarse en la célula hospedera, puede ya sea integrarse o bien localizarse en el cromosoma de la célula hospedera o existir de manera extracromosómica. Además, el polinucleótido incluye ADN y ARN que codifican la proteína diana. El polinucleótido puede insertarse en cualquier forma siempre y cuando pueda introducirse en una célula hospedera y expresarse en esta. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en una célula hospedera en forma de un casete de expresión, que es una construcción génica que incluye todos los elementos que se requieren para su expresión autónoma. El casete de expresión puede incluir un promotor unido operativamente al polinucleótido, terminador de la transcripción, sitios de unión al ribosoma o terminador de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión autorreplicable. Además, el polinucleótido puede introducirse en la célula hospedera tal como es y puede unirse operativamente a secuencias que se requieren para la expresión en la célula hospedera, pero no se limita a ello. El método de transformación incluye cualquier método para introducir un ácido nucleico en una célula y puede realizarse seleccionando una técnica estándar adecuada que se conoce en la técnica, en dependencia de la célula hospedera. Ejemplos del método incluyen electroporación, precipitación con fosfato de calcio (CaPO4), precipitación con cloruro de calcio (CaCh), microinyección, una técnica de polietilenglicol (PEG), una técnica de DEAE-dextrano, una técnica de liposomas catiónicos, una técnica de acetato de litio-DMSO, etc., pero no se limitan a ello.
Además, el término "enlace operable" indica que la secuencia de polinucleótidos se une funcionalmente a una secuencia promotora que inicia e interviene en la transcripción del polinucleótido que codifica la proteína diana de la presente descripción. El enlace operable puede prepararse mediante el uso de una técnica de recombinación genética conocida en la técnica, y la escisión de sitio específico y el enlace de ADN pueden prepararse mediante el uso de una liasa y ligasa conocidas, pero estas no se limitan a ello.
Como se usa en la presente descripción, el término "microorganismo que produce un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este" se refiere a un microorganismo que produce naturalmente un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este, o se refiere a un microorganismo en el cual la productividad de un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este se proporciona a una cepa parental que carece de la capacidad de producir un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este.
Como se usa en la presente descripción, el término "L-aminoácido derivado de aspartato o derivado de aminoácido de este" se refiere a un material capaz de biosintetizarse usando ácido aspártico (aspartato) como precursor, y puede usarse de manera indistinta con el término "producto derivado de aspartato". El "derivado de aminoácido" se refiere a un material que se puede producir a partir de un L-aminoácido y un material que incluye un precursor de un L-aminoácido. Además, el derivado de aminoácido no se limita siempre y cuando sea un material que pueda producirse mediante biosíntesis usando aspartato como precursor. Específicamente, los materiales sintetizados mediante el uso común de acetilfosfato se incluyen sin limitación. Por ejemplo, el derivado de aminoácido puede ser L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-glicina, homoserina, O-acetilhomoserina, O-succinilhomoserina, O-fosfohomoserina, L-isoleucina y cadaverina, pero no se limitan a ello.
La cadaverina puede biosintetizarse directamente usando aspartato como precursor o puede producirse a partir de lisina por la lisina descarboxilasa. La L-metionina puede biosintetizarse directamente usando aspartato como precursor o puede producirse por conversión a partir de O- acetilhomoserina u O- succinilhomoserina.
Como se usa en la presente descripción, el término "aspartato (ácido aspártico)" se abrevia como Asp o D y se refiere al ácido aspártico, que es un a-aminoácido que se usa para la biosíntesis de proteínas. Como todos los demás aminoácidos, el aspartato incluye un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico. El aspartato se produce generalmente como aspartil fosfato por la aspartoquinasa (LysC) y luego se convierte en L-lisina, L-metionina, L-homoserina, L-treonina, L-isoleucina, etc., en la célula.
Para mejorar la biosíntesis del producto derivado de aspartato, puede usarse la variante de aspartoquinasa de la presente descripción. Por ejemplo, para mejorar la biosíntesis de L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-glicina, homoserina, O- acetilhomoserina, O-succinilhomoserina, O -fosfohomoserina, L-isoleucina y cadaverina, puede introducirse la variante aspartoquinasa de la presente descripción o puede mejorarse la actividad de esta. Además, la productividad del producto derivado de aspartato puede mejorarse aún más al introducir o mejorar la actividad de una proteína específica o al inactivar la actividad de una proteína específica.
El método de introducir, potenciar e inactivar la actividad de una proteína específica puede realizarse mediante el uso de un método adecuado conocido en la técnica, en dependencia de las características de los microorganismos. El microorganismo que produce el producto derivado de aspartato, L-aminoácido o derivado de aminoácido de este puede ser cualquier microorganismo capaz de producir el "aminoácido" derivado de aspartato o derivado de aminoácido de este que incluye la variante de aspartato de la presente descripción. Un ejemplo específico de estos puede incluir Escherichia sp., Serratia sp., Erwinia sp., Enterobacteria sp., Salmonella sp., Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp. O Corynebacterium sp., y más específicamente, el microorganismo puede ser Corynebacterium glutamicum, pero no se limita a ello.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para producir un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este, que comprende: cultivar el microorganismo descrito anteriormente y recuperar el L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este a partir del microorganismo cultivado o medio cultivado.
El método para producir el L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica, en condiciones de cultivo optimizadas y condiciones de actividad enzimática conocidas en la técnica. Específicamente, aunque no se limita particularmente a, la etapa de cultivar el microorganismo puede realizarse mediante cultivo discontinuo, cultivo continuo y cultivo discontinuo alimentado conocido en la técnica. En la presente descripción, las condiciones de cultivo no se limitan de manera particular, pero se puede mantener un pH óptimo (por ejemplo, pH 5 a 9, específicamente pH 6 a 8, y más específicamente pH 6,8) mediante el uso de una sustancia química básica (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, o amoniaco) o una sustancia química ácida (por ejemplo, ácido fosfórico o ácido sulfúrico). Además, se puede mantener una condición aeróbica al añadir a un cultivo celular oxígeno o una mezcla de gas que contenga oxígeno. La temperatura de cultivo puede mantenerse entre 20 °C y 45 °C, y específicamente entre 25 °C y 40 °C, y el cultivo puede realizarse por aproximadamente 10 horas a 160 horas, pero estos no se limitan a ello. El aminoácido derivado de aspartato o el derivado de aminoácido del mismo que se produce por el cultivo puede secretarse en un medio o puede permanecer en las células.
Además, un medio que se usará para el cultivo puede incluir azúcar y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa), aceite y grasa (por ejemplo, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, maní aceite y aceite de coco), ácido graso (por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico), alcohol (por ejemplo, glicerol y etanol) y ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético) individualmente o en combinación, como fuente de carbono; un compuesto orgánico que contiene nitrógeno (por ejemplo, peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, solución de maíz, polvo de harina de soja y urea) o un compuesto inorgánico (por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio) individualmente o en combinación, como fuente de nitrógeno; y dihidrogenofosfato de potasio, fosfato de potasio dibásico o una sal que contenga sodio correspondiente a estas, individualmente o en combinación, como fuente de fósforo; pero estos no se limitan a ello. Además, el medio puede contener materiales esenciales que promueven el crecimiento tales como otras sales metálicas (por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro), aminoácidos y vitaminas.
El método para recuperar el aminoácido derivado del aspartato o el derivado de aminoácido de este, que se produce en el método de cultivo de la presente descripción, puede realizarse para recuperar un aminoácido diana a partir del medio cultivado mediante el uso de un método adecuado conocido en la técnica, de acuerdo con el método de cultivo. Por ejemplo, pueden usarse centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización y HPLC, y el aminoácido derivado del aspartato diana o su derivado de aminoácido puede recuperarse del medio o microorganismo mediante el uso de un método adecuado conocido en la técnica.
Además, el método de recuperación puede incluir además una etapa de purificación y puede realizarse mediante el uso de un método adecuado conocido en la técnica.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para producir L-metionina, que comprende: cultivar el microorganismo de la presente descripción; producir O-acetilhomoserina u O- succinilhomoserina a partir del microorganismo cultivado o medio cultivado; y convertir O-acetilhomoserina u O- succinilhomoserina en L-metionina.
Específicamente, la "etapa de conversión en L-metionina" puede incluir una etapa de reacción de O-acetilhomoserina u O-succinilhomoserina con O- acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa en presencia de un sulfuro. La "O- acetilhomoserina u O- succinilhomoserina" puede ser un caldo de fermentación que contiene O- acetilhomoserina u O-succinilhomoserina producido por el microorganismo de la presente descripción, o puede estar en forma purificada. Además, el "sulfuro" puede ser, por ejemplo, metilmercaptano, y el metilmercaptano puede referirse a la forma de metilmercaptano de sodio (CH3S-Na) así como metilmercaptano (CH3SH) en un estado gaseoso o licuado y metilmercaptano que contiene dimetilsulfuro (DMS) en la forma descrita en la Publicación de Patente Internacional Núm. WO2010/098629; y metilmercaptano también puede referirse a un derivado de metilmercaptano que contiene una forma capaz de proporcionar átomos de azufre. Además, la "O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O- succinilhomoserina sulfhidrilasa" puede ser un caldo de fermentación del microorganismo que la produce, o puede ser una forma purificada.
El método para producir L-metionina puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica en condiciones de cultivo optimizadas y condiciones de actividad enzimática conocidas en la técnica. El método y el medio de cultivo específicos son como se describió anteriormente.
[Efectos Ventajosos]
El microorganismo que contiene la variante de aspartoquinasa de acuerdo con la presente descripción puede obtener el L-aminoácido derivado de aspartato o el producto derivado de aspartato con alto rendimiento sin inhibir el crecimiento de las células hospederas, en comparación con un microorganismo que porta LysC de tipo silvestre. [Breve descripción de los dibujos]
La Figura 1 muestra una ruta para la biosíntesis del aminoácido derivado del aspartato y los aminoácidos derivados de este de Corynebacterium glutamicum.
[Descripción Detallada De La Invención]
A continuación, la presente descripción se describirá en detalle con modalidades ilustrativas acompañantes. Sin embargo, las modalidades ilustrativas que se describen en la presente descripción son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente descripción.
Ejemplo 1: Preparación de la cepa que porta la variante lysC
Se seleccionó una variación, cuya actividad se puede mejorar en comparación con el tipo silvestre, mediante el modelado estructural de una aspartoquinasa, y se preparó una cepa que porta la variante como se describe a continuación.
En el gen lysC (SEQ ID NO: 2) que codifica aspartoquinasa (SEQ ID NO: 1) derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (en adelante denominado WT), se seleccionó el aminoácido en la posición 377 como el sitio de variación, y se seleccionaron L-lisina, que es un aminoácido básico, y L-metionina, que es un aminoácido no polar, como ejemplos representativos de otros aminoácidos para sustitución.
Para preparar un vector que porta la variación, con centro en el sitio de variación, se diseñó un par de cebadores (SEQ ID NOS: 7 y 8 o SEQ ID NOS: 7 y 10) para amplificar la región 5' aguas arriba y un par de cebadores (SEQ ID NOS: 9 y 12 o SEQ ID NOS: 11 y 12) para amplificar la región 3' aguas abajo (Tabla 1). Se insertó un sitio de enzima de restricción XbaI (subrayado) en cada extremo de los cebadores de SEQ ID NOS: 7 y 12. Además, se colocó una variación de sustitución de nucleótidos (subrayada) en un par de cebadores de SEQ ID NOS: 8 y 9 o un par de cebadores de SEQ ID NOS: 10 y 11, en el sitio diseñado para que se entrecruzasen entre sí.
[Tabla 1]
Figure imgf000009_0001
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 7 y 8, SEQ ID NOS: 7 y 10, SEQ ID NOS: 9 y 12, o SEQ ID NOS: 11 y 12 usando como molde el cromosoma de WT. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 30 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento de ADN (509 pb) de la región 5' aguas arriba y un fragmento de ADN (520 pb) de la región 3' aguas abajo, respectivamente, con centro en el sitio de variación del gen lysC.
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 7 y 12 usando como molde los dos fragmentos de ADN amplificados. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 60 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado se amplificó un fragmento de ADN (1011 pb) que incluye la variante (SEQ ID NO: 4) del gen lysC que codifica la variante de aspartoquinasa (SEQ ID NO: 3), en donde la leucina en la posición 377 se sustituye con lisina. Además, para confirmar la importancia del aminoácido en la posición 377, se obtuvo un fragmento de ADN (1011 pb) que incluye la variación (SEQ ID NO: 6) del gen lysC que codifica la variante de aspartoquinasa (SEQ ID NO: 5), en donde la leucina de la posición 377 se sustituye con metionina.
El vector pDZ (Patente Coreana Núm. 0924065), que no puede replicarse en Corynebacterium glutamicum, y el fragmento de ADN (1011 pb), se trataron con una enzima de restricción XbaI, y estos se ligaron mediante el uso de una ligasa de ADN y luego se clonaron para obtener plásmidos. Los plásmidos se denominaron pDZ-lysC (L377K) y pDZ-lysC (L377M).
Los vectores, pDZ-lysC (L377K) y pDZ-lysC (L377M), se transformaron cada uno en WT mediante el uso de un método de pulso eléctrico (Apl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), y luego se obtuvieron cepas transformantes en un medio LB que contenía kanamicina (25 mg/L). Se obtuvieron WT::lysC(L377K) y WT::lysC(L377M), las cepas en las que la variación de nucleótidos se introduce en el gen lysC por los fragmentos de ADN insertados en el cromosoma mediante un proceso recombinante secundario (entrecruzamiento), y estos se nombraron como Corynebacterium glutamicum CA01-2307 y CA01-2308, respectivamente. Se depositaron CA01-2307 y CA01-2308 en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea, que es una autoridad internacional de depósito en virtud del Tratado de Budapest, el 29 de marzo de 2017, y se asignaron los números de acceso KCCM12000P y KCCM12001P.
Ejemplo 2: Confirmación de la capacidad de la cepa que porta la variante lysC para producir aminoácidos derivados del aspartato
Con el propósito de comparar las capacidades de las cepas CA01-2307 y CA01-2308 obtenidas del Ejemplo 1 y la cepa Wt para producir los principales aminoácidos derivados del aspartato, las cepas se cultivaron mediante el uso del siguiente método y se analizaron los componentes en el medio de cultivo.
Cada cepa se inoculó en un matraz con deflector de esquina (250 ml) que contenía un medio de siembra (25 ml) y se cultivó a 37 °C por 20 horas mientras se agitaba a 200 rpm. La solución de cultivo de siembra (1 ml) se inoculó en un matraz con deflector de esquina (250 ml) que contenía un medio de producción (24 ml) y luego se cultivó a 37 °C por 24 horas mientras se agitaba a 200 rpm. Las concentraciones de L-lisina y L-treonina, que son aminoácidos derivados de L-aspartato representativos y aspartato, se analizaron por HPLC, y las concentraciones analizadas se muestran en la Tabla 2.
<Medio de siembra (pH 7,0)>
Glucosa (20 g), peptona (10 g), extracto de levadura (5 g), urea (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (100 |jg), tiamina HCl (1000 |jg), pentanoato de calcio (2000 |jg), y nicotinamida (2000 |jg) (en 1 L de agua destilada)
<Medio de producción (pH 7,0)>
Glucosa (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos de maceración de maíz (5 g), urea (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4'7H2O (0,5 g), biotina (100 jg), cloruro de tiamina (1000 jg), pentanoato de calcio (2000 jg), nicotinamida (3000 jg), CaCO3 (30 g) (en 1 L de agua destilada)
[Tabla 2] Concentraciones de aminoácidos derivados del aspartato producidos a partir de CA01-2307 y CA01-2308
Figure imgf000010_0001
Como resultado del análisis de las concentraciones de los aminoácidos derivados del aspartato, se confirmó que la concentración de L-lisina aumentó drásticamente cuando se introdujo la variación lysC, y las de L-aspartato y L-treonina también aumentaron en comparación con WT. Con base en los resultados anteriores, las cepas CA01-2307, CA01-2308 y WT se cultivaron de la misma manera que se describió anteriormente para comparar en detalle las sus capacidades para producir lisina. Además, se analizó la concentración de L-lisina en el medio de cultivo de la misma manera que se describió anteriormente (Tabla 3).
[Tabla 3] Concentraciones de L-lisina producidas a partir de las cepas WT, CA01-2307 y CA01-2308
Figure imgf000010_0002
Como resultado del análisis de la concentración de L-lisina, se confirmó que la productividad de L-lisina que se obtuvo a partir de CA01-2307 que porta la variación de lysC(L377K) aumentó grandemente, al igual que en la evaluación anterior, en comparación con la que se obtuvo a partir de la cepa WT. Además, se confirmó que la productividad de L-lisina que se obtuvo a partir de CA01-2308 que porta la variación de lysC (L377M) también aumentó en comparación con la que se obtuvo a partir de la cepa WT. Con base en los resultados anteriores, se confirmó que la productividad de L-lisina en los aminoácidos derivados del aspartato aumentó en gran medida debido a la variante de aspartoquinasa (SEQ ID NO: 3), en la que la leucina en la posición 377, que se selecciona en la presente descripción, se sustituye con lisina, y debido a la variante de aspartoquinasa (SEQ ID NO: 5), en la que la leucina en la posición 377 se sustituye con metionina.
Ejemplo 3: Preparación de cepa mejorada para L-treonina y confirmación de la productividad de L-treonina Con el propósito de confirmar claramente el cambio en la productividad de L-treonina mediante la introducción de la variación lysC(L377K), la cual tiene la mayor productividad de lisina como se confirmó en el Ejemplo 2, se introdujo una variación en el gen que codifica la homoserina deshidrogenasa que produce homoserina, que es un intermedio común en la ruta biosintética de derivados de L-treonina, L-isoleucina, L-metionina y homoserina. Específicamente, se preparó una cepa a la que se introdujo la variación hom(G378E) conocida en la técnica (Apl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996)) en la cepa CA01-2307, que se preparó en el Ejemplo 1. Además, también se preparó como grupo de control una cepa en la que se introduce la variación hom(G378E) en WT. Para preparar un vector que porta la hom(G378E), se realizó la PCR con las SEQ ID NOS: 13 y 14 y las SEQ ID NOS: 15 y 16 usando como molde ADN genómico de WT. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 30 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos.
Como resultado, se obtuvo un fragmento de ADN (220 pb) de la región 5' aguas arriba y un fragmento de ADN (220 pb) de la región 3' aguas abajo, con centro en la variación del gen hom. La PCR se realizó con las SEQ ID NOS: 13 y 16 usando como molde estos dos productos de PCR. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 30 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN (440 pb) que incluía la variación del gen hom.
[Tabla 4]
Figure imgf000011_0001
El vector pDZ, que se usó previamente en el Ejemplo 1, y el fragmento de ADN (440 pb) se trataron con una enzima de restricción, XbaI, y se unieron mediante el uso de un ADN ligasa y luego se clonaron para obtener un plásmido. El plásmido se denominó pDZ-hom(G378E).
El vector, pDZ-hom(G378E), se introdujo en las cepas WT y CA01-2307 mediante el uso de un método de pulso eléctrico (Apl. Microbiol. Biotechnol. (1999, 52:541-545).)), y luego se obtuvieron cepas transformantes en un medio de selección que contenía kanamicina (25 mg/L). Se obtuvieron WT::hom(G378E) y CA01-2307::hom(G378E), las cepas en las que se introdujo la variación de nucleótidos en el gen hom por el fragmento de ADN insertado en el cromosoma mediante un proceso recombinante secundario (entrecruzamiento). Para comparar las capacidades de WT::hom(G378E) y CA01-2307::hom(G378E) para producir treonina, las cepas se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 2, y se analizó la concentración de treonina en el medio de cultivo.
[Tabla 5] Concentraciones de treonina producidas a partir de cepas, WT::hom(G378E) y CA01-2307::hom(G378E)
Figure imgf000011_0003
Como resultado del análisis de la concentración de L-treonina, se confirmó que la productividad de L-treonina aumentó drásticamente en la cepa que porta la variación de lysC (Tabla 5).
Ejemplo 4: Preparación de la cepa mejorada para L-isoleucina y comparación de la productividad de L-isoleucina Para confirmar el efecto de la introducción de la variación lysC(L377K) en la productividad de L-isoleucina, se preparó un vector para mejorar la expresión de la variación /7vA(V323A) del gen (Apl. Enviro. Microbiol., Diciembre de 1996, pág. 4345-4351) que codifica la L-treonina deshidratasa, que se conoce en la técnica.
Para preparar un vector que porta la variación del gen ilvA, con el sitio de variación en el centro, se diseñó un par de cebadores (SEQ ID NOS: 17 y 18) para amplificar la región 5' aguas arriba y un par de cebadores (SEQ ID NOS: 19 y 20) para amplificar la región 3' aguas abajo. Se insertó un sitio de enzima de restricción BamHI (subrayado) en cada extremo de los cebadores de SEQ ID NOS: 17 y 20. Además, en los cebadores de SEQ ID nOs : 18 y 19, se colocó una variación de sustitución de nucleótidos (subrayada) en el sitio diseñado para entrecruzarse entre sí.
[Tabla 6]
Figure imgf000011_0002
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 17 y 18 y SEQ ID NOS: 19 y 20 usando como molde el cromosoma de WT. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 30 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento de ADN (627 pb) de la región 5' aguas arriba y un fragmento de ADN (608 pb) de la región 3' aguas abajo, con centro en el sitio de variación del gen ilvA.
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 17 y 20 usando como molde los dos fragmentos de ADN amplificados. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 60 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN (1217 pb) que porta la variación del gen ilvA que codifica la variante IlvA, en el que la valina en la posición 323 se sustituye con alanina.
El vector pECCG117 (Patente Coreana Núm. 10-0057684) y el fragmento de ADN (1011 pb) se trataron con una enzima de restricción, BamHI, y estos se unieron mediante el uso de una ligasa de ADN y luego se clonaron para obtener un plásmido. El plásmido se denominó pECCG117-ilvA(V323A).
El vector pECCG117-ilvA(V323A) se introdujo en las cepas WT::hom(G378E) y CA01-2307::hom(G378E), que se prepararon en el Ejemplo 3 mediante el uso de un método de pulso eléctrico y luego se esparcieron en un medio de selección que contenía kanamicina (25 mg/L) para obtener las cepas transformantes.
Las cepas se cultivaron de la misma manera que en el método de cultivo en matraz que se mostró en el Ejemplo 2, y se analizó la concentración de L-isoleucina en el medio de cultivo (Tabla 7).
[Tabla 7]
Figure imgf000012_0002
Como resultado del análisis de la concentración de L-isoleucina, se confirmó que la productividad de L-isoleucina aumentó en gran medida en la cepa que porta la variación de lysC.
Ejemplo 5: Preparación de cepa mejorada para O-acetilhomoserina y comparación de la productividad de O-acetilhomoserina
Para determinar el efecto de la introducción de la variación lysC(L377K) en la producción de O-acetilhomoserina, se eliminaron el gen metB, que codifica la cistationina gamma-sintasa involucrada en la vía de degradación de O-acetilhomoserina, y el gen metY, que codifica O-acetilhomoserina (tiol)-liasa, y luego se sobreexpresó el gen metX, que codifica la homoserina O-acetiltransferasa, que es una enzima biosintética de O-acetilhomoserina y, de esta manera, se preparó la cepa que produce O-acetilhomoserina. Primero, para eliminar el gen metB, con base en la información de la secuencia de nucleótidos del gen metB derivado de w T, se diseñó un par de cebadores (SEQ ID NOS: 21 y 22) para amplificar la región 5' aguas arriba del gen metB y un par de cebadores (SEQ ID NOS: 23 y 24) para amplificar la región 3' aguas abajo.
[Tabla 8]
Figure imgf000012_0001
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 21 y 22, SEQ ID NO: 23 y 24 usando como molde el cromosoma WT. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 90 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se obtuvieron un fragmento de ADN (450 pb) de la región 5' aguas arriba del gen metB y un fragmento de ADN (467 pb) de la región 3' aguas abajo.
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 21 y 24 usando como molde los dos fragmentos de ADN amplificados. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 3 minutos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos.
Como resultado, se eliminó la región central del gen metB y, por tanto, se amplificó un fragmento de ADN (917 pb) que incluye solo los extremos aguas arriba y aguas abajo.
El vector pDZ y el fragmento de ADN (917 pb) se trataron con una enzima de restricción, XbaI, y se unieron mediante el uso de un ADN ligasa y luego se clonaron para obtener un plásmido. El plásmido se denominó pDZ-AmetB.
El vector pDZ-AmetB se introdujo en las cepas WT::hom(G378E) y CA01-2307::hom(G378E), las cuales se prepararon en el Ejemplo 3 mediante un método de pulso eléctrico, y luego se obtuvieron las cepas transformantes de un medio de selección que contenía kanamicina (25 mg/L). Se obtuvieron WT::hom(G378E)AmetB y CA01-2307::hom(G378E)AmetB, las cepas en las que el gen metB se elimina por los fragmentos de ADN insertados en el cromosoma mediante un proceso recombinante secundario (entrecruzamiento).
Para eliminar el gen metY involucrado en otra vía de degradación de O-acetilhomoserina, con base en la información de la secuencia de nucleótidos del gen metY derivado de WT, se diseñó un par de cebadores (SEQ ID NOS: 25 y 26) para amplificar la región 5' aguas arriba del gen metY y un par de cebadores (SEQ ID NOS: 27 y 28) para amplificar la región 3' aguas abajo.
[Tabla 9]
Figure imgf000013_0001
La PCR se realizó con SEQ ID NOS: 25 y 26, SEQ ID NO: 27 y 28 usando como molde el cromosoma WT. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 90 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento de ADN (512 pb) de la región 5' aguas arriba del gen metY y un fragmento de ADN (520 pb) de la región 3' aguas abajo.
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 25 y 28 usando como molde los dos fragmentos de ADN amplificados. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 3 minutos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se eliminó la región central del gen metY y, por tanto, se amplificó un fragmento de ADN (1032 pb) que incluye solo los extremos aguas arriba y aguas abajo.
El vector pDZ y el fragmento de ADN (1032 pb) se trataron con una enzima de restricción, XbaI, y se unieron usando un ADN ligasa y luego se clonaron para obtener un plásmido. El plásmido se denominó pDZ-AmetY.
Se introdujo el vector pDZ-AmetY en cada una de las cepas WT::hom(G378E)AmetB y CA01-2307::hom(G378E)AmetB, las cuales se prepararon previamente, mediante el uso de un método de pulso eléctrico, y luego las cepas transformantes se obtuvieron en un medio de selección que contenía kanamicina (25 mg/L). Se obtuvieron WT::hom(G378E)AmetBAmetY y CA01-2307::hom(G378E)AmetB AmetY, las cepas en las que el gen metY se eliminó por los fragmentos de ADN insertados en el cromosoma mediante un proceso recombinante secundario (entrecruzamiento).
Se preparó un vector para potenciar la expresión del gen metX con el propósito de maximizar la producción de O-acetilhomoserina. Para amplificar el gen que codifica la homoserina O-acetiltransferasa (MetX), basándose en las secuencias derivadas de Wt informadas, el vector se diseñó insertando una región de enzima de restricción BamHI en ambos extremos de los cebadores (SEQ ID NOS: 29 y 30) para amplificar desde la región promotora (aproximadamente 300 pb cadena arriba del codón de inicio) hasta la región del terminador (aproximadamente 100 pb aguas abajo del codón de terminación).
[Tabla 10]
Figure imgf000014_0002
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 25 y 26 usando como molde el cromosoma de WT. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 90 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento de ADN (1546 pb) que porta el gen metX.
El vector pECCG117 (Patente Coreana Núm. 10-0057684) y el fragmento de ADN de metX se trataron con una enzima de restricción, BamHI, y estos se unieron mediante el uso de una ligasa de ADN y luego se clonaron para obtener un plásmido. El plásmido se denominó pECCG117-metX.
Se introdujo el vector pECCG117-metX en las cepas WT::hom(G378E)AmetBAmetY y CA01-2307;;hom(G378E)AmetB AmetY, que se prepararon en lo anterior, mediante el uso de un método de pulso eléctrico, y luego se esparció en un medio de selección que contenía kanamicina (25 mg/L) para obtener las cepas transformantes.
Para comparar las capacidades de las cepas preparadas anteriormente para producir O-acetilhomoserina (en lo sucesivo, O-AH), las cepas se cultivaron mediante el uso del método siguiente y se analizó la concentración de O-acetilhomoserina en el medio de cultivo.
Se inoculó un asa de platino de las cepas en un matraz con deflector de esquina (250 ml) que contenía un medio de producción de O-AH (25 ml) y se cultivó a 37 °C por 20 horas mientras se agitaba a 200 rpm. La concentración de O-acetilhomoserina se analizó por HPLC y la concentración analizada se muestra en la Tabla 11.
<Medio de producción de O-AH (pH 7,0)>
Glucosa (100 g), (NH^SO 4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos de maceración de maíz (5 g), urea (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4'7 H2O (0,5 g), biotina (100 |jg), cloruro de tiamina (1000 |jg), pantotenato de calcio (2000 |jg), nicotinamida (3000 jg), CaCO3 (30 g), L-metionina (0,3 g) (en 1 L de agua destilada).
[Tabla 11]
Figure imgf000014_0001
Como resultado del análisis de la concentración de O-acetilhomoserina como se muestra en la tabla anterior, se confirmó que aumentó la concentración de O- acetilhomoserina producida por la variación de lysC.
Ejemplo 6: Preparación de cepa mejorada para O-succinilhomoserina y comparación de la productividad de O-succinilhomoserina
Para determinar la influencia de la introducción de la variación lysC(L377K) en la producción de O-succinilhomoserina, se preparó la cepa que produce O-succinilhomoserina. Dado que Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre no produce naturalmente O-succinilhomoserina, la cepa se modificó para tener la actividad de O-succiniltransferasa (MetX) mediante la sustitución del aminoácido en la región de unión del sustrato de la O-acetiltransferasa, que se preparó en el Ejemplo 5, para producir O-succinilhomoserina. En consecuencia, con base en las secuencias del gen metX derivado de WT, se diseñó un par de cebadores (SEQ ID NOS: 31 y 32) para preparar el vector para introducir la variación de metX.
[Tabla 12]
Figure imgf000014_0003
La PCR se realizó con los cebadores de SEQ ID NOS: 27 y 28 usando como molde el cromosoma de WT. Después de la desnaturalización a 95 °C por 5 minutos, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 72 °C por 90 segundos. A continuación, se realizó la reacción de polimerización a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento de ADN (1146 pb) de la región codificante del gen metX.
El vector pDZ y el fragmento de ADN (1146 pb) se trataron con una enzima de restricción XbaI, y se unieron mediante el uso de un ADN ligasa y luego se clonaron para obtener un plásmido. El plásmido se denominó pDZ-metX. Con base en el vector pDZ-metX, para preparar un vector de variación en el que el aminoácido en la posición 176 se sustituye con asparagina y el aminoácido en la posición 313 se sustituye con arginina, se diseñaron un par de cebadores (SEQ ID NOS: 33 y 34) que causan una variación en el aminoácido en la posición 176 y un par de cebadores (SEQ ID NOS: 35 y 36) que causan una variación en el aminoácido en la posición 313.
[Tabla 13]
Figure imgf000015_0002
La variante del gen metX se preparó mediante el uso de un kit de mutagénesis sitio dirigida (Stratagene, Estados Unidos) junto con cada uno de los cebadores anteriores. El plásmido transformante basado en el plásmido de tipo silvestre existente pDZ-metX se denominó pDZ-metX(Q176N, L313R). El vector pDZ-metX (Q176N, L313R), que se preparó anteriormente, se transformó en las cepas WT::hom(G378E)AmetBAmetY y CA01-2307::hom(G378E)A metBAmetY preparadas en el Ejemplo 5 mediante el uso de un método de pulso eléctrico, y luego se obtuvieron las cepas transformantes en un medio de selección que contenía kanamicina (25 m g/L). WT::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)AmetBAmetY y CA01-2307::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)AmetBAmetY, las cepas en las que el gen metX se reemplaza por metX(Q176N, L313R) mediante el fragmento de ADN insertado en el cromosoma mediante un proceso recombinante secundario (entrecruzamiento).
Para maximizar la producción de O-succinilhomoserina, se preparó un vector para potenciar la expresión del gen variante metX(Q176N, L313R). Con base en pECCG117-metX preparado en el Ejemplo 5, se preparó un vector que sobreexpresa la variante metX mediante el uso de cebadores de SEQ ID NOS: 33 a 36, en el que el aminoácido variante en la posición 176, que tiene la actividad de O-succiniltransferasa, se sustituye con asparagina y el aminoácido de la posición 313 se sustituye con arginina. Específicamente, el vector se preparó mediante el uso de un kit de mutagénesis sitio dirigida (Stratagene, Estados Unidos) junto con cada uno de los cebadores, y el vector preparado se denominó pECCG117-metX(Q176N, L313R).
pECCG117-metX(Q176N, L313R) y el vector vacío pECCG117 se introdujeron en WT::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)AmetBAmetY y CA01-2307::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)AmetBAmetY, que son las cepas preparadas previamente que producen O-succinilhomoserina, mediante el uso de un método de pulso eléctrico, y se esparció en un medio de selección que contenía kanamicina (25 mg/L) para obtener la cepa transformante.
Para comparar la capacidad de la cepa para producir O- succinilhomoserina, la cepa se cultivó usando los siguientes métodos y se analizó la concentración de O-succinilhomoserina en el medio de cultivo.
Se inoculó la cepa con un asa de platino en un matraz con deflector de esquina (250 ml) que contenía 25 ml de la misma composición del medio de producción de O-AH que se usó en el Ejemplo 5, y se cultivó a 37 °C por 20 horas mientras se agitaba a 200 rpm. La concentración de O-succinilhomoserina se analizó por HPLC y la concentración analizada se muestra en la Tabla 14.
[Tabla 14]
Figure imgf000015_0001
Como resultado del análisis de la concentración de O-succinilhomoserina como se muestra en la tabla anterior, se confirmó que aumentó la producción de O-succinilhomoserina producida por la variación de lysC.
Estos resultados sugieren que la variante de la presente descripción puede aumentar la producción del aminoácido derivado del aspartato y/o el derivado de este.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Nuevo mutante de aspartoquinasa y método para la producción de L-aminoácido mediante su uso <130> OPA18147
<150> 10-2017-0083437
<151> 2017-06-30
<160> 36
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr
Figure imgf000016_0001
Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala
Figure imgf000016_0002
Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu
Figure imgf000016_0003
Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95
Asn Ala Arg
100 105 110
Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu
Figure imgf000016_0004
115 120 125
Lys Ile
Figure imgf000016_0006
Ile Val Ala Gly Phe Gln
Figure imgf000016_0005
Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg
Figure imgf000016_0007
Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175
Asp Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly
Figure imgf000017_0001
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 2
<211> 1266
<212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 3
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu
Figure imgf000018_0001
Ala 1 5 10
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys
Figure imgf000018_0002
Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95
Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255
Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln
Figure imgf000020_0001
Asn
Figure imgf000020_0002
Thr
325 330
Figure imgf000020_0003
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val
Figure imgf000020_0004
Ala
340 345 350
Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu
Figure imgf000020_0005
Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu
Figure imgf000020_0006
Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala
Figure imgf000020_0007
Ala 385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val
Figure imgf000020_0008
Tyr
405 410
Figure imgf000020_0009
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 4
<211> 1266
<212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct
Figure imgf000021_0001
cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaaaa gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 5
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr
Figure imgf000021_0002
Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala
Figure imgf000021_0003
Arg
Figure imgf000021_0004
Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala
Figure imgf000021_0005
Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu
Figure imgf000021_0006
Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95
Asn Ala Arg
100 105 110
Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu
Figure imgf000021_0007
115 120 125
Lys
Figure imgf000021_0008
Ile Val Ala Gly Phe Gln
Figure imgf000021_0009
Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg
Figure imgf000021_0010
Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu
Figure imgf000022_0001
Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val
Figure imgf000022_0002
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Met Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 6
<211> 1266
<212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt
Figure imgf000023_0001
120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaaat gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 7
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 1
<400> 7
tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29
<210> 8
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 2
<400> 8
tg g a a a tc t t t t c g a t g t t c a c g t tg a c a t 30
<210> 9
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 3
<400> 9
a ca tcg a a a a g a t t t c c a c c t c t g a g a t t c 30
<210> 10
<211 > 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 4
<400> 10
tg g a a a tc a t t t c g a t g t t c a c g t tg a c a t 30
<210> 11
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 5
<400> 11
a c a tc g a a a t g a t t t c c a c c t c t g a g a t t c 30
<210> 12
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 6
<400> 12
g a c tc ta g a g t t c a c c tc a g a g a c g a tta 29
<210> 13
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 7
<400> 13
t c c tc ta g a c tg g tc g c c tg a t g t t c t a c 29 <210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 8
<400> 14
gccaaaacct ccacgcgatc
<210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 9
<400> 15
atcgcgtgga ggttttggct
<210> 16
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 10
<400> 16
gactctagat tagtcccttt cgaggcgga
<210> 17
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 11
<400> 17
acggatccca gactccaaag caaaagcg
<210> 18
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 12
<400> 18
acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca <210> 19
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 13
<400> 19
ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg
<210> 20
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 14
<400> 20
acggatccaa ccaaacttgc tcacactc
<210> 21
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 15
<400> 21
tctagatgcg ctgattatct cacc
<210> 22
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 16
<400> 22
actggtgggt catggttgca tatgagatca actcctgtaa
<210> 23
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 17
<400> 23
ttacaggagt tgatctcata tgcaaccatg acccaccagt <210> 24
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 18
<400> 24
tctagacctt gaagttcttg actg
<210> 25
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 19
<400> 25
tctagaagta gcgttgctgt acac
<210> 26
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 20
<400> 26
atcaatggtc tcgatgccca tatggcattt ggaggtcctt aag
<210> 27
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 21
<400> 27
cttaaggacc tccaaatgcc atatgggcat cgagaccatt gat
<210> 28
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 22
<400> 28
tctagatgga accgttgcaa ccac
<210> 29
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 23
<400> 29
ggatcccctc gttgttcacc cagcaacc
<210> 30
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 24
<400> 30
ggatcccaaa gtcacaacta cttatgttag
<210> 31
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 25
<400> 31
tctagaatgc ccaccctcgc gccttc
<210> 32
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 26
<400> 32
tctagattag atgtagaact cgatg
<210> 33
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 27
<400> 33
acgcgccagc gcctggaaca tcggcattca atccg <210> 34
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 28
<400> 34
cggattgaat gccgatgttc caggcgctgg cgcgt 35
<210> 35
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
cebador 29
<400> 35
gtagataccg atattcggta cccctaccac cag 33
<210> 36
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 30
<400> 36
ctggtggtag gggtaccgaa tatcggtatc tac 33

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una variante de aspartoquinasa, en donde el aminoácido en la posición 377 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con L-lisina o L-metionina.
2. Un polinucleótido que codifica la variante de la reivindicación 1.
3. Un microorganismo del género Corynebacterium, que produce un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este, que comprende la variante de aspartoquinasa de la reivindicación 1, en donde el L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este se selecciona del grupo que consiste en lisina, treonina, metionina, homoserina, O-acetilhomoserina, O-succinilhomoserina, isoleucina y cadaverina.
4. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
5. Un método para producir un L-aminoácido derivado de aspartato o un derivado de aminoácido de este, que comprende:
cultivar el microorganismo de la reivindicación 3 en un medio; y
recuperar el L-aminoácido derivado de aspartato o el derivado de aminoácido de este a partir del microorganismo cultivado o medio cultivado, en donde el L-aminoácido derivado de aspartato o el derivado de aminoácido de este se selecciona del grupo que consiste en lisina, treonina, metionina, homoserina, O-acetilhomoserina, O-succinilhomoserina, isoleucina y cadaverina.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
7. Un método para producir L-metionina, que comprende:
cultivar el microorganismo de la reivindicación 3 en un medio;
producir O-acetilhomoserina u O-succinilhomoserina a partir del microorganismo cultivado o medio cultivado; y
convertir la O-acetilhomoserina u O-succinilhomoserina en L-metionina.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
ES18824928T 2017-06-30 2018-06-29 Nuevo mutante de aspartoquinasa y método para la producción de L-aminoácido mediante su uso Active ES2884800T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170083437A KR102011994B1 (ko) 2017-06-30 2017-06-30 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
PCT/KR2018/007407 WO2019004778A2 (ko) 2017-06-30 2018-06-29 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2884800T3 true ES2884800T3 (es) 2021-12-13

Family

ID=64742506

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18824928T Active ES2884800T3 (es) 2017-06-30 2018-06-29 Nuevo mutante de aspartoquinasa y método para la producción de L-aminoácido mediante su uso

Country Status (20)

Country Link
US (1) US10662450B2 (es)
EP (1) EP3517607B1 (es)
JP (1) JP6759484B1 (es)
KR (1) KR102011994B1 (es)
CN (1) CN110168083B (es)
AR (1) AR112431A1 (es)
AU (1) AU2018293281B2 (es)
BR (1) BR112019018036B8 (es)
DK (1) DK3517607T3 (es)
ES (1) ES2884800T3 (es)
HU (1) HUE054725T2 (es)
MX (1) MX388542B (es)
MY (1) MY195408A (es)
PH (1) PH12019502673A1 (es)
PL (1) PL3517607T3 (es)
RU (1) RU2730025C1 (es)
SG (1) SG11201912130RA (es)
TW (1) TWI718385B (es)
WO (1) WO2019004778A2 (es)
ZA (1) ZA201907864B (es)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3931853B1 (en) 2019-08-16 2024-06-19 Protochips, Inc. Automated application of drift correction to sample studied under electron microscope
KR102153534B1 (ko) 2019-09-02 2020-09-09 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법
KR102183209B1 (ko) 2019-09-09 2020-11-26 씨제이제일제당 주식회사 L-쓰레오닌 배출 단백질의 변이체 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
KR102182497B1 (ko) 2019-12-20 2020-11-24 씨제이제일제당 주식회사 내막 단백질의 변이체 및 이를 이용한 목적 산물 생산 방법
KR102207867B1 (ko) 2020-01-21 2021-01-26 씨제이제일제당 주식회사 Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR102285951B1 (ko) * 2020-01-30 2021-08-04 씨제이제일제당 주식회사 시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 신규한 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
CA3199126A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Byoung Hoon Yoon Mutant atp-dependent protease, and method for producing l-amino acid using same
KR102470602B1 (ko) 2020-12-11 2022-11-25 씨제이제일제당 주식회사 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
KR102464883B1 (ko) 2020-12-11 2022-11-09 씨제이제일제당 주식회사 신규한 감마-아미노부티르산 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
EP4060034B1 (en) * 2021-01-25 2024-10-02 CJ Cheiljedang Corporation Novel hydrolase variant, and method for producing l-tryptophan using same
CN114450400B (zh) * 2021-01-25 2022-10-04 Cj第一制糖株式会社 新型铜转运p型atp酶a变体及使用其生产l-色氨酸的方法
KR102377745B1 (ko) 2021-05-12 2022-03-23 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이의 용도
KR102685904B1 (ko) 2021-05-20 2024-07-19 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이의 용도
MY209952A (en) 2021-05-20 2025-08-15 Cj Cheiljedang Corp Novel promoter and use thereof
KR20230139597A (ko) 2022-03-28 2023-10-05 씨제이제일제당 (주) O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸 호모세린 또는 l-메치오닌 생산 방법
KR20230139598A (ko) 2022-03-28 2023-10-05 씨제이제일제당 (주) O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸 호모세린 또는 l-메치오닌 생산 방법
CN115725537B (zh) * 2022-07-11 2025-09-12 天津国家合成生物技术创新中心有限公司 天冬氨酸激酶突变体及其在生产l-高丝氨酸中的应用
KR20240143216A (ko) 2023-03-23 2024-10-02 씨제이제일제당 (주) 변이형 트레오닌/호모세린 배출 단백질 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
KR20240152455A (ko) 2023-04-12 2024-10-22 씨제이제일제당 (주) 피루브산 탈수소효소 복합체 디히드로리포일리신-잔기 아세틸트랜스퍼라제의 활성이 증가된 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
KR20240152456A (ko) 2023-04-12 2024-10-22 씨제이제일제당 (주) 피루브산 탈수소효소 복합체 서브유닛 e1의 활성이 증가된 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸호모세린 또는 그의 유도체의 생산 방법
WO2025005633A1 (ko) 2023-06-28 2025-01-02 씨제이제일제당 (주) 쓰레오닌 배출 단백질 rhtc를 발현하는 미생물 및 이의 l-이소류신 생산 용도
CN118773161B (zh) * 2024-06-13 2025-02-14 华南师范大学 丝氨酸激酶和硫裂解酶的突变酶及其发酵生产方法以及在生产含羞草素中的应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3473042B2 (ja) * 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
ATE203769T1 (de) * 1992-11-10 2001-08-15 Ajinomoto Kk Dna, die aspartokinase iii-mutanten kodiert und ihre verwendung zur herstellung von l-threonin durch fermentation
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JP4075087B2 (ja) * 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
AU2000230762A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-31 Ajinomoto Co. Inc. Process for producing l-lysine
RU2224793C1 (ru) * 2000-01-21 2004-02-27 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения l-лизина
WO2003040373A2 (en) * 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
JP2007068437A (ja) * 2005-09-05 2007-03-22 Chisso Corp 変異型アスパルトキナーゼとその利用方法
KR100838038B1 (ko) 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
US9005952B2 (en) * 2008-04-04 2015-04-14 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism
CN102753692A (zh) * 2010-06-15 2012-10-24 白光产业株式会社 使用微生物生产天冬氨酸族氨基酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112019018036B8 (pt) 2022-03-29
EP3517607A2 (en) 2019-07-31
MY195408A (en) 2023-01-19
AU2018293281A1 (en) 2019-12-12
PH12019502673A1 (en) 2020-06-08
AU2018293281B2 (en) 2022-02-03
MX388542B (es) 2025-03-20
BR112019018036B1 (pt) 2022-03-22
TW201907002A (zh) 2019-02-16
ZA201907864B (en) 2020-08-26
EP3517607A4 (en) 2020-05-13
US10662450B2 (en) 2020-05-26
TWI718385B (zh) 2021-02-11
BR112019018036A2 (pt) 2020-04-07
AR112431A1 (es) 2019-10-30
MX2019014609A (es) 2020-02-07
SG11201912130RA (en) 2020-01-30
HUE054725T2 (hu) 2021-09-28
US20200131545A1 (en) 2020-04-30
CN110168083B (zh) 2020-10-27
WO2019004778A2 (ko) 2019-01-03
CN110168083A (zh) 2019-08-23
DK3517607T3 (da) 2021-07-26
JP6759484B1 (ja) 2020-09-23
PL3517607T3 (pl) 2021-12-20
EP3517607B1 (en) 2021-05-05
KR102011994B1 (ko) 2019-08-20
WO2019004778A3 (ko) 2019-03-28
JP2020202834A (ja) 2020-12-24
KR20190003019A (ko) 2019-01-09
RU2730025C1 (ru) 2020-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2884800T3 (es) Nuevo mutante de aspartoquinasa y método para la producción de L-aminoácido mediante su uso
US11667936B2 (en) Modified polypeptide with attenuated activity of citrate synthase and method for producing L-amino acid using the same
ES2944588T3 (es) Homoserina deshidrogenasa modificada, y método para la producción de homoserina o L-aminoácido derivado de homoserina usando la misma
KR102112232B1 (ko) 신규한 o-숙시닐 호모세린 트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 o-숙시닐 호모세린의 제조방법
US10982245B2 (en) O-succinyl homoserine transferase mutant and method for producing O-succinyl homoserine using same
CN115175993B (zh) 柠檬酸合酶活性减弱的新型修饰多肽及使用其生产l-氨基酸的方法
RU2805253C1 (ru) Новый модифицированный полипептид с ослабленной активностью цитратсинтазы и способ получения L-аминокислоты с его использованием
HK40013580B (en) Novel aspartokinase variant and method for producing l-amino acid using the same
HK40013580A (en) Novel aspartokinase variant and method for producing l-amino acid using the same
BR112022012576B1 (pt) Polipeptídeo modificado, polinucleotídeo, vetor, microorganismo que produz um l-aminoácido, método para produzir um l-aminoácido e uso do dito micro-organismo
BR112019016462B1 (pt) Polipeptídeo modificado tendo atividade de citrato sintase, microrganismo do gênero corynebacterium e método para produzir um laminoácido