KR101636058B1

KR101636058B1 - 기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101636058B1
Application number: KR1020130103657A
Authority: KR
Inventors: 신홍식; 장승환; 이상왕; 백민석; 백진호; 김희정
Original assignee: (주)케비젠; 신홍식
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2016-07-05
Anticipated expiration: 2033-08-30
Also published as: KR20150025703A

Abstract

본 발명은 프럭토스(fructose)에 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈; 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈; 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제;를 첨가하여 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 타가토스 생산 방법은 새로운 효소를 이용하는 방법으로 환경친화적이고, 단가가 낮은 기질을 사용하며, 효소의 활성을 장기간 유지시킬 수 있으므로, 타가토스를 대량 생산하는데 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도{Composition for production of tagatose from fructose using enzyme combination reaction with substrates and uses thereof}

본 발명은 프럭토스로부터 타가토스를 생산하기 위한 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 (1) 프럭토스를 인산화시키는 프럭토카이네이즈 또는 헥소카이네이즈, (2) 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)를 타가토스 6-포스페이트(tagatose 6-phosphate)로 이성화시키는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 및 (3) 타가토스 6-포스페이트에서 인산기를 제거하는 타가토스-6-포스페이트 피타아제에 의한 고효율 타가토스 생산 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.

타가토스(D-tagatose)는 단당류(6탄당)의 일종으로서, 프럭토스(D-fructose)의 C-4 에피머이고 갈락토스(D-galactose)의 이성질체(isomer)이다. 타가토스의 당도는 흔히 설탕이라 부르는 자당(수크로스, sucrose)의 92% 정도인 것으로 알려져 있으며, 칼로리 생성율은 자당(4 kcal/g)의 37.5% (1.5kcal/g) 정도로 낮은 것으로 알려져 있다. 흡습성 또한 수크로스와 비슷하게 낮으며, 온도 안정성은 식품제조와 보관 동안 적용되는 전형적인 온도에는 안정하지만, 다른 환원당들(reducing sugars) 처럼 온도 상승에 따라 카라멜화(caramelization)되는 특성이 있다.

타가토스는 기능성 감미료로서 음식, 음료 및 제약 제품의 설탕 대용으로 사용할 수 있는 천연 단당류로서, 항 당뇨 및 비만 조절 약물로서의 효능에 대한 시험 중에 있다.

자연계에서, 타가토스는 카카오나무(Sterculia setigera)의 검 삼출물(gum exudate)의 한 성분으로 자연계에서 처음으로 확인되었으며, 지의류인 Rocella 종의 올리고당의 한 성분으로서도 검출되었다. 또한, 타가토스는 세균의 락토스 대사과정에서 L-아라비노오스 이성화효소의 이성화 작용 촉매로도 생성될 수 있다.

아쓰로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)와 같은 미생물을 이용하여 갈락티톨(D-galactitol)을 산화시켜서 타가토스를 생산할 수 있다. 이 경우 생체전환 최대 수율은 92%인 것으로 보고하였다. 그러나 갈락티톨의 원료로서의 사용불가능성과 높은 비용 때문에 대규모 타가 토스의 생산에는 사용되지 못하고 있다.

뮤코라세아(Mucoraceae) 곰팡이의 여러 변종을 이용한 생물전환법으로 사이코스(D-psicose)로부터 타가토스를 제조하는 방법이 제안되었다. 사이코스는 희귀한 당이지만, 슈도모나스 시코리(Pseudomonas cichorii)나 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 D-타가토스 3-에피머레이즈 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 D-사이코스 3-에피머레이즈를 사용하여 상대적으로 싼 원료인 프럭토스(D-fructose)을 에피머화하여 생산할 수 있다. 그러나 사이코스를 통해 프럭토스로부터 타가토스를 생산하는 방법은 상업적인 적용성은 매우 희박한 것으로 알려져 있다.

타가토스는 열처리 유제품에서 온도상승으로 인해 락토스로부터 소량 생성될 수 있지만, β-D-갈락토시데이즈에 의한 유당(락토스, lactose)의 가순분해와 이 반응으로 생성된 글루코스와 갈락토스의 분리 및 갈락토스의 화학적 또는 효소적 이성화반응(isomerisation)으로 제조할 수 있다. 갈락토스는 L-아라비노오스 이성화효소에 의해 체외에서도 타가토스로의 변환이 촉진되며, 타가토스 대규모 생산을 위한 가장 유망한 효소로 알려져 있다.

갈락토스 이성화는 타가토스의 생산을 위한 경제적 방법이다. 갈락토오스는 화학적 또는 효소 이성화할 수 있다. 타가토스의 생산을 위한 화학적 방법은 Biospherics Inc. (USA)에 의해 개발 및 특허되었다. 특허에 따르면, 수산화칼슘과 촉매로서 염화칼슘을 이용하여 갈락토오스를 이성화하여 타가토스를 생성할 수 있다고 보고했다. 수산화칼슘은 강 알칼리성 조건과 상대적으로 낮은 온도에서 타가토스와 불용성 복합체를 형성한다. 이러한 현탁액에 산, 바람직하게는 이산화탄소를 처리하면 복합체로부터 타가토스를 유리시킬 수 있다. 불용성 칼슘염은 여과과정을 통해 제거하고, 나머지 이온은 이온 교환 크로마토그래피를 이용해 제거할 수 있다. 이후 순수한 타가토스는 결정화를 통해 얻을 수 있다. 그러나 이 화학적 방법은 부산물 및 화학 폐기물 형성과 같은 몇 가지 단점을 가지고 있다. 이 방법에는 반응 혼합물의 집중적인 냉각을 필요로 하기 때문에 에너지 소비가 많은 공정이라는 단점을 가지고 있다.

갈락토오스에서 타가토스를 생산하는 효소 방법은 생체촉매로 L-아라비노스 이성화효소를 사용하는 방법이다. 대부분의 L-아라비노스 이성화효소는 최적활성을 보이는 온도가 60 내지 95℃로 매우 높고, 최적 pH도 7 이상이다. 더욱이, 대부분의 L-아라비노스 이성화효소가 고활성과 안정성을 위해서는 Mn² ⁺ 또는 Co² ⁺와 같은 금속이온을 필요로 하고 있다. 산업적 적용을 위한 산성 pH와 저에너지 공정을 위한 낮은 반응 온도 및 Co² ⁺와 같은 식품적용 부적합한 이온 사용 등은 개선해야 할 문제점으로 지적되고 있다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 원료의 수급이 안정적이고 낮은 가격의 포도당이나 프럭토스를 기질로 하며, 화학적인 전환법이나 고비용 효소전환법이 아닌 저비용 효소전환법을 이용하여 타가토스를 생산하는 방법이 활발히 연구되고 있는 실정이다.

현재, 단일 효소반응으로 프럭토스에서 타가토스를 생산하는 단일 효소반응은 알려져 있지 않다. 지금까지 알려진 에피머화 효소들의 메커니즘으로는 전환이 거의 일어나지 않고 생산수율이 현저히 낮은 것으로 알려져 있다.

한국등록특허 제0464061호에는 '아라비노스 이성화효소의 고정화에 의한 타가토스의 생산방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2008-0053708호에는 '높은 전환율의 갈락토스 이성화 반응을 이용한 타가토스의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 프럭토스를 기질로 하는 혼합 효소반응을 이용해 타가토스를 고효율로 제조하는 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 프럭토스를 기질로 하는 혼합 효소반응을 이용해 타가토스를 고효율로 제조하고자 한다. 구체적으로, 본 발명은 비교적 낮은 단가의 프럭토스를 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)로 인산화시키는 프럭토카이네이즈(fructokinase) 또는 헥소카이네이즈(hexokinase), 프럭토스 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(fructose 1,6-bisphosphate aldolase)와 타가토스 6-포스페이트로부터 인산기를 제거하는 피타아제(phytase) 효소를 혼합으로 이용하여 94% 이상의 높은 수율로 타가토스를 생산하는 기술이다.

본 발명에서는 프럭토스로부터 타가토스를 효소반응을 이용해 생산하기 위하여, 프럭토스, 프럭토카이네이즈, 프럭토스 6-비스포스페이트 알돌레이즈 및 피타아제를 하나의 반응기에 혼합하여 반응시키는 컴비네션 반응 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명에서는 생산비용절감을 위한 효소고정화 공정을 이용한 고효율 타가토스 생산방법을 제공하고, 여기에는 개별적으로 고정화된 프럭토카이네이즈, 프럭토스 6-비스포스페이트 알돌레이즈 및 피타아제를 순서적으로 통과시키는 공정으로 타가토스를 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 타가토스의 안정적인 생산을 위하여, 실제 공업적으로 유리한 알지네이트 등을 사용한 포괄법으로 세포를 고정화시켜서, 가격이 저렴하고, 고정화 후 별도의 강도처리공정이 필요 없으며, 장기간 연속운전에도 안정한 제반 특성을 갖춘 타가토스 생산 공정을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다양한 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 프럭토스(fructose)에 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈; 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈; 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제;를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 타가토스를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 종래 사이코스 생산과 비교하여 기질에 있어서는 단가가 낮은 기질을 사용하고, 수율에 있어서는 현저하게 높기 때문에 생산 경비를 크게 줄이는 한편 생산효과를 극대화할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 기재한 칵테일 반응에 의한 프럭토스에서 타가토스로의 생산을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리 정제한 3가지 효소인 헥소카이네이즈(1번 레인), 프럭토카이네이즈(2번 레인) 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(3번 내지 5번 레인)의 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래 헥소카이네이즈와 5 mM에서 50 mM의 프럭토스를 1시간 동안 반응하여 생산된 프럭토스 6-포스페이트의 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 금속 특이성(A), 최적 pH(B), 최적 온도(C) 및 반응 시간(D)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트의 전환율을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 피타아제 농도에 따른 타가토스 6-포스페이트에서 타가 토스로의 전환율을 나타낸 것이다.
도 6은 프럭토카이네이즈와 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 함께 클로닝할 목적으로 본 발명에서 사용한 duet vector 시스템을 도식화한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알카니보락스(Alcanivorax), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 지오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 마리노박터(Marinobacter), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 리조비움(Rhizobium), 스태필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈는 프럭토스 1,6-비스포스파타아제(fructose 1,6-bisphosphatase)와 동일한 의미로 사용된다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물은 상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 외에 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈; 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소와 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈를 포함할 수도 있고, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소와 타가토스-6-포스페이트 피타아제를 포함할 수도 있고, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소, 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제를 포함할 수도 있다. 또한, 상기 타가토스-6-포스페이트 피타아제 대신에 타가토스-6-포스파타아제 효소를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물에서, 상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis), 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 아조토포르만스(Bacillus azotoformans), 바실러스 셀룰로실리티쿠스(Bacillus cellulosilyticus), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 사이토톡시쿠스(Bacillus cytotoxicus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 마카우엔시스(Bacillus macauensis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus), 바실러스 닐소니(Bacillus nealsonii), 바실러스 슈도피르무스(Bacillus pseudofirmus), 바실러스 셀리니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 바실러스 바이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크로펜스테티(Corynebacterium kroppenstedtii), 엔테로코커스 아시니(Enterococcus asini), 엔테로코커스 카캐(Enterococcus caccae), 엔테로코커스 카셀리플라부스(Enterococcus casseliflavus), 엔테로코커스 세코룸(Enterococcus cecorum), 엔테로코커스 콜룸배(Enterococcus columbae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 플라베센스(Enterococcus flavescens), 엔테로코커스 길부스(Enterococcus gilvus), 엔테로코커스 해모페록시두스(Enterococcus haemoperoxidus), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus), 엔테로코커스 모라비엔시스(Enterococcus moraviensis), 엔테로코커스 문티(Enterococcus mundtii), 엔테로코커스 팔렌스(Enterococcus pallens), 엔테로코커스 페니쿨리콜라(Enterococcus phoeniculicola), 엔테로코커스 라피노수스(Enterococcus raffinosus), 엔테로코커스 사카로리티쿠스(Enterococcus saccharolyticus), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp .), 엔테로코커스 빌로룸(Enterococcus villorum), 지오바실러스 카우스토필루스(Geobacillus kaustophilus), 지오바실러스 종(Geobacillus sp.), 지오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 지오바실러스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans), 락토바실러스 애시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로리티쿠스(Lactobacillus amylolyticus), 락토바실러스 안트리(Lactobacillus antri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루에키 아종 불가르쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners), 락토바실러스 존슨아이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 뮤리누스(Lactobacillus murinus), 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei), 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp . plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminis), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 종(Lactobacillus sp .), 마리노박터 히드로카보노클라스티쿠스(Marinobacter hydrocarbonoclasticus), 메틸로바실러스 플라젤라투스(Methylobacillus flagellatus), 리조비움 그라하미(Rhizobium grahamii), 리조비움 레규미노사룸 비브이. 트리폴리아이(Rhizobium leguminosarum bv . trifolii), 리조비움 루피니(Rhizobium lupini), 리조비움 종(Rhizobium sp .), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토마이세스 아베미틸리스(Streptomyces avermitilis) 및 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용한 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 유전자는 기존에 이미 유전자가 알려져 있지만 프럭토스-6-포스페이트를 이용한 4번 탄소 에피머화 작용 특성이 규명이 안 된 유전자 생산 균주들인 표 3에 기재된 균주들 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소 유전자 또는 단백질에 대응되는 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 포함한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 과발현시켜 효소의 특성을 규명한 결과, 기질특이성이 프럭토스-6-포스페이트 4번 탄소 에피머화 작용을 나타내는 효소임을 입증하고, 상기 효소를 사용하여 타가토스-6-포스페이트를 생산 후 상업용 피타아제를 처리하여 타가토스를 생산하는 것을 특징으로 한다.

효소의 특성을 규명하기 위하여, 본 발명은 종래 실험을 통해 전혀 기능적으로 규명되지 않고 다만 염기서열의 특성만으로 평가되어 명명된 공지의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 유전자를 함유하고 있는 균주로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 코딩 유전자를 대량으로 수득한 후, 적절한 발현 벡터에 삽입하여 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조한 후 상기 재조합 벡터로 적절한 미생물에 형질전환시킨 균주를 발효 배지에서 배양하여 과발현시킨 효소를 정제하여 사용한다.

본 발명에 따라 수득한 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme)이다.

상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소와 프럭토스와의 반응 조건으로 기질 농도는 55-75%(w/v)의 범위로 pH 8.5에서 50℃로 반응시키는 것이 타가토스 생산수율에 있어 바람직하다. 이는 프럭토스의 기질 농도가 55-75%(w/v) 범위에서 타가토스 생산수율이 우수하였으며, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소의 최적 pH와 온도 범위이기 때문이다.

상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 서열번호 1 내지 72의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물에서, 상기 프럭토카이네이즈는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 에세리키아 콜라이 K12 균주(Escherichia coli strain K12), 푸소박테리움 모르티페룸(Fusobacterium mortiferum), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 락토코커스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis subsp . cremoris (Streptococcus cremoris)), 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp . lactis (Streptococcus lactis)), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 리조비움 레규미노사룸 비브이. 트리폴리아이(Rhizobium leguminosarum bv . trifolii), 살모넬라 톰슨(Salmonella thompson), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 뮤탄스 세로타입 c 균주(Streptococcus mutans serotype c strain), 비브리오 알지노리티쿠스(Vibrio alginolyticus) 및 자이모모나스 모빌리스 아종 모빌리스 균주(Zymomonas mobilis subsp . mobilis strain)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 프럭토카이네이즈는 서열번호 73 내지 86의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물에서, 상기 헥소카이네이즈는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 에메리셀라 니둘란스(Emericella nidulans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 네오사르토리아 푸미가타(Neosartorya fumigata), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 헥소카이네이즈는 서열번호 87 내지 93의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물에서, 상기 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈; 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈; 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제 효소들은 고정화된 효소일 수 있으며, 고정화 방법은 흡착법, 공유결합법 또는 가두기법(entrapment)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 프럭토스로부터 타가토스를 생산하기 위한 효소인 프럭토카이네이즈, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌에이즈 및 피타아제 효소를 각각 고정화시키기 위한 담체로 알긴산나트륨을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

산업적으로 대량생산을 위해서, 효소를 이용한 생물공정은 화학공정에 비해 온화한 반응조건에서 반응이 진행되어 화학공정에 비해 에너지가 절약되며, 공정이 단순하여 공정비용이 적게 드는 장점이 있다. 하지만 이용되는 효소의 가격이 고가이며, 효소의 낮은 안정성이 극복해야 할 단점이다. 이러한 문제를 해결하고 공정비용의 감소를 위해 효소의 고정화가 널리 이용되고 있다. 효소를 고정화하면 반응에 사용한 효소를 다음 반응에 재사용할 수 있어 효소의 높은 가격 문제를 해결하여 공정비용을 감소시킬 수 있으며, 고정화하지 않는 효소보다 안정성이 증대되어 공정에 더 효율적으로 이용할 수 있다.

생산성을 향상시키기 위한 방법으로 세포를 고정화시키는 방법이 있는데, 세포를 고정화하는 이유는 일반적으로, 이차대사산물의 생합성이 유도(induction)되면, 그 생합성 속도는 빠르게 증가하여 최고값에 도달한 후, 점차 생합성 속도가 감소한다고 알려져 있다. 특히, 연속배양 또는 장기간의 회분식 배양시 흔히 관찰되는 현상으로서 돌연변이에 의해 얻은 고생산성 균주를 장기간 배양할 경우에 균주의 복귀돌연변이(back mutation)가 발생한다. 복귀 돌연변이 발생에 의해 생산성이 낮은 세포는 원래 균주보다 생장속도가 빨라, 결국 이들 세포가 배양기를 차지함으로써 공정의 생산성을 떨어뜨린다. 이와 비슷한 경우가 재조합 단백질을 생산하는 공정에서도 많이 지적되고 있다. 이와 같은 공정 안정성(operational stability)에 대한 문제는 이차대사산물 생산공정 개발에 있어서 필수적으로 해결해야 할 문제들 중의 하나이다. 이를 해결할 수 있는 방법들 중의 하나가 고정화세포를 이용한 공정으로서, 세포를 고정화할 경우 유전적 안정성(genetic stability)이 증가한다고 알려져 있다.

효소 또는 세포를 고정화시켜 생물반응제품을 생산하는 방법은 제조원가의 절감 등 그 경제적인 유용성으로 인해 지금까지 많은 연구가 행하여져 왔으며, 글루코스 이소머라제(Glucose isomerase) 고정화에 의한 프럭토스의 생산, 아미노아실라제(Aminoacylase) 고정화에 의한 아미노산의 생산 등이 공업적으로 실제 이용되고 있다.

일반적인 고정화 방법으로는 흡착법, 공유결합법, 포괄법(가두기법) 등이 있는데, 흡착법은 담체에 효소 또는 세포가 물리적으로 고정화되므로 연속운전으로 공업적 응용시 탈착이 우려되고, 공유결합법은 결합력은 강하나 효소의 실활이 쉽게 일어나기 때문에 실제 공업적으로는 알지네이트 등을 사용한 포괄법이 많이 이용되고 있다. 포괄법으로 효소나 세포를 고정화시켜 공업적으로 이용하고자 할 때는 먼저 담체의 선택이 중요한데, 가격이 저렴하고, 고정화 후 별도의 강도처리공정이 필요 없으며, 장기간 연속운전에도 안정한 제반 특성을 갖춘 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 효소들은 고정화된 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈; 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈; 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제 효소는 전술한 바와 같다.

본 발명의 혼합효소 반응은 다른 한편으로는 프럭토카이네이즈, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소, 피타아제를 프럭토스와 함께 세포 내에서 반응시켜 타가토스를 대량으로 생산하기 위한 방법으로, 대량으로 발현된 카이네이즈 효소, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 과발현시켜 세포 내에서 사용하는 게 바람직하다. 이는 세포 내에 과발현된 효소는 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성해 주고, 반응 시 필요한 cofactor 재생 가능성 때문인데, 본 발명에서 사용 가능한 대장균은 효소들을 과발현할 수 있는 대장균이라면 그 어느 것을 사용해도 무방하다.

본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 프럭토스로부터 타가토생산을 이전에 없던 방법으로 전환시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 타가토스를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 장류, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1. 프럭토카이네이즈 효소 생산

프럭토카이네이즈 효소 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis str. 168)의 DNA 염기서열을 기본으로 프라이머(primer)를 도안하여 PCR 증폭하여 대량으로 얻은 다음, 제한효소 XhoI와 NdeI을 사용하여 pET Duet-1[Novagen]에 삽입하고, 재조합 벡터 프럭토카이네이즈/pET Duet-1를 제조하여, 이를 통상적인 형질전환 방법에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 대량생산을 위한 배양을 하기 전에 액체질소에서 냉동보관 하였다. 그런 다음, 프럭토카이네이즈 효소를 대량생산하기 위하여, 먼저, 냉동 보관된 BL(DE21) 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 종균배양을 하고, 상기 종균배양된 배양액을 발효 배지(글리세롤 10 g/l, 펩톤 1g/l, 효모 추출물 30 g/l, 이인산칼륨 0.14 g/l, 일인산나트륨 1 g/l) 5l가 들어있는 7l의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 본 배양을 수행하였다. 이때, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때, 1mM ITPG를 첨가하여 프럭토카이네이즈 효소의 대량생산을 유도하였다. 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다.

프럭토카이네이즈 효소의 정제를 위해서 DEAE-Sephacel, Blue-Sepharose CL-6B, 5'-AMP-Sepharose 4B 컬럼을 사용하여 정제하였다.

정제한 효소의 분자량을 측정한 결과 32,440 Da 단량체 두 개로 구성된 다이머(이량체)이고, 이의 아미노산 서열은 NCBI 등록번호(accession number) BAA19710와 동일함을 확인할 수 있었다(도 2, 레인 2).

실시예 2. 헥소카이네이즈 효소 생산

헥소카이네이즈 효소 유전자는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis ATCC8585)의 DNA 염기서열을 기본으로 프라이머(primer)를 도안하여 PCR 증폭하여 대량으로 얻은 다음, 제한효소 XhoI와 NdeI을 사용하여 pET Duet-1[Novagen]에 삽입하고, 재조합 벡터 헥소카이네이즈/pET Duet-1를 제조하여, 이를 통상적인 형질전환 방법에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 대량생산을 위한 배양을 하기 전에 액체질소에서 냉동보관 하였다. 그런 다음, 헥소카이네이즈 효소를 대량생산하기 위하여, 먼저, 냉동 보관된 BL(DE21) 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 종균배양을 하고, 상기 종균배양된 배양액을 발효 배지(글리세롤 10 g/l, 펩톤 1g/l, 효모 추출물 30 g/l, 이인산칼륨 0.14 g/l, 일인산나트륨 1 g/l) 5l가 들어있는 7l의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 본 배양을 수행하였다. 이때, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때, 1mM ITPG를 첨가하여 헥소카이네이즈 효소의 대량생산을 유도하였다. 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다.

헥소카이네이즈 효소를 정제하기 위해 DEAE-셀룰로즈, 포스포셀룰로즈(phosphocellulose)와 Sephadex G-200을 사용하였다.

정제한 효소의 분자량을 측정한 결과 53,610 Da의 단량체 두 개로 구성된 다이머(이량체)임을 알 수 있었으며, 이의 아미노산 서열은 NCBI 등록번호(accession number) CAA43855와 동일함을 확인할 수 있었다(도 2, 레인 1).

실시예 3. 프럭토카이네이즈 및 헥소카이네이즈에 의한 프럭토스로부터 프럭토스 6- 포스페이트로의 전환 활성분석

본 발명의 고농도의 타가토스의 생산을 위하여 첫 단계로 5, 10, 25, 50 mM 프럭토스를 동량의 ATP (Adenosine triphosphate)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisea) 유래의 헥소카이네이즈(sigma-aldrich에서 구매)를 반응하여 프럭토스 6-포스페이트를 생산하기 위하여, 250 unit/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 7.5, 온도 30℃에서 60분간 반응시켜서 생성된 프럭토스 6-포스페이트의 양으로 효소의 활성을 측정하였다. 효소 농도에 따른 프럭토스 6-포스페이트 생산량은 도 3에 나타내었다. 이의 결과, 5, 10, 25, 50 mM 모두의 농도에서 전환 수율 90% 정도로 생산되었다.

실시예 4. 균주별 프럭토카이네이즈 의 프럭토스에서 프럭토스 6-포스페이트로의 전환 활성 비교

다양한 균주 유래의 프럭토카이네이즈를 이용하여 상기 실시예 3에 기재된 방법과 같이 프럭토카이네이즈의 프럭토스에서 프럭토스 6-포스페이트로의 전환 활성을 비교한 결과는 표 1과 같다.

속명	균주명	서열번호	활성(%)
Bacillus	Bacillus subtilis	73	92
Escherichia	Escherichia coli	74	93
Escherichia	Escherichia coli strain K-12	75	93
Fusobacterium	Fusobacterium mortiferum	76	90
Klebsiella	Klebsiella pneumonia	77	92
Lactococcus	Lactococcus lactis	78,79	91
Pediococcus	Pediococcus pentosaceus	80	90
Rhizobium	Rhizobium leguminosarum	81	91
Salmonella	Salmonella thompson	82	90
Salmonella	Salmonella typhimurium	83	91
Streptococcus	Streptococcus mutans	84	92
Vibrio	Vibrio alginolyticus	85	92
Zymomonas	Zymomonas mobilis	86	93

실시예 5. 균주별 헥소카이네이즈의 프럭토스에서 프럭토스 6-포스페이트로의 전환 활성 비교

다양한 균주 유래의 헥소카이네이즈를 이용하여 상기 실시예 3에 기재된 방법과 같이 헥소카이네이즈의 프럭토스에서 프럭토스 6-포스페이트로의 전환 활성을 비교한 결과는 표 2와 같다.

속명	균주명	서열번호	활성(%)
Candida	Candida albicans	87	91
Emericella	Emericella nidulans	88	93
Kluyveromyces	Kluyveromyces lactis	89	92
Neosartorya	Neosartorya fumigata	90	90
Saccharomyces	Saccharomyces cerevisiae	91	91
Schizosaccharomyces	Schizosaccharomyces pombe	92	90
Schwanniomyces	Schwanniomyces occidentalis	93	89

실시예 6. 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 대량생산

프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 유전자는 바실러스 서브틸리스 아종 인아쿠오소룸(Bacillus subtilis subsp. inaquosorum) KCTC 13429, 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)의 DNA 염기서열을 기본으로 프라이머(primer)를 도안하여 PCR 증폭하여 대량으로 얻은 다음, 제한효소 XhoI와 NdeI을 사용하여 pET Duet-1[Novagen]에 삽입하고, 재조합 벡터 pET Duet-1/프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(도 6 참조)를 제조하여, 이를 통상적인 형질전환 방법에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 그리고, 대량생산을 위한 배양을 하기 전에 액체질소에서 냉동보관 하였다. 그런 다음, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 대량생산하기 위하여, 먼저, 냉동 보관된 BL(DE21) 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 종균배양을 하고, 상기 종균배양된 배양액을 발효 배지(글리세롤 10 g/l, 펩톤 1g/l, 효모 추출물 30 g/l, 이인산칼륨 0.14 g/l, 일인산나트륨 1 g/l) 5l가 들어있는 7l의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 본 배양하였다. 이때, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때, 1mM ITPG를 첨가하여 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 대량생산을 유도하였다. 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다.

실시예 7. 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 정제

프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 특성을 정확히 파악하기 위해서 어피니티 히스트랩 에이치피(affinity HisTrap HP) 컬럼, 탈염 하이프렙(HiPrep 16/60), 겔여과 세파크릴 에스-100 에치알 (gel filtration Sephacryl S-100 HR) 컬럼을 사용하여 정제하였다.

정제한 효소의 분자량을 측정한 결과 바실러스 서브틸리스 아종 인아쿠오소룸(Bacillus subtilis subsp. inaquosorum) KCTC 13429의 효소는 31,408 Da (도 2, 레인 3), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 효소는 37,214 Da (도 2, 레인 4), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)의 효소는 31,555 Da (도 2, 레인 5) 각각의 단량체 두 개로 구성된 이량체임을 알 수 있었으며, 이의 아미노산 서열은 NCBI 등록번호(accession number) 각각 ELS63303, CAA35190, AAV61498와 동일함을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 금속 특이성

이전 보고서에서는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 금속 아연에 의해서 프럭토스 1,6-비스포스페이트 기질이 디히드록시 아세트포스페이트와 글리세르 알데히드 3-포스페이트로 전환 시 관여되며 역가를 향상시킨다고 알려져 있으나, 본 발명에서는 기질을 프럭토스 6-포스페이트로 적용하였을 때 금속염 효과가 역가 향상에 영향을 미치지 않음을 보였다. 금속염 효과를 조사하기 위해서 효소활성은 도 4a에 나타낸 바와 같이, EDTA를 처리하거나 또는 1 mM 금속이온 첨가 후 측정하였으며, 이때 반응은 1.0%의 프럭토스와 0.04 unit/ml의 효소가 함유된 50 mM 피페스 완충용액에서 pH 8.5와 50℃에서 30분간 수행하였고 HCl 0.2M을 첨가하여 반응을 멈추어 측정하였다.

본 발명의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 금속이온에 의한 효소활성의 변화가 없었고, 이전 논문과 달리 아연 이온은 활성을 크게 저해하는 금속이온임을 알 수 있었다.

실시예 9. 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성

본 실시예는 pH 및 온도 변화에 따른 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 기질을 반응시키고, 효소 활성을 비교하고자 하였다. 이때, pH 효과를 조사하기 위해서 반응은 1.0%의 프럭토스와 0.04 unit/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스(Trizma base) 완충용액 pH 6.5에서부터 10까지의 범위에서 반응시켰다. 이때, 반응 온도는 37℃에서 30분간 반응을 시켰다. 그런 다음, 0.2 M HCl을 첨가하여 반응을 종료하고, 효소의 활성을 측정하여 그 결과를 도 4b에 나타내었다.

그리고, 온도 효과를 조사하기 위해서 반응은 온도 20℃에서 70℃까지 1.0%의 프럭토스 6-포스페이트와 0.04 unit/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액을 pH 8.5에서 30분간 반응을 시켰으며, 이때 0.2 M HCl을 첨가하여 반응을 종료하고 효소의 활성을 측정하여 그 결과를 도 4c에 나타내었다.

그 결과, 최적 pH와 온도는 각각 8.5와 50℃이었다. 위 결과를 토대로 최적의 온도와 pH에서 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 전환을 시간별로 나타내어 전환율이 85% 까지 도달하는 것을 확인하였고 도 4d에 나타내었다. 그러나 상기 반응에 있어 특정 pH와 온도를 규정하지 아니하고 원하는 수율이나 반응환경에 따라 어떠한 범주에서의 반응도 적용한다.

실시예 10. 균주별 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 활성(프럭토스 6- 포스페이트에서 타가토스 6- 포스페이트로의 전환 효율) 비교

다양한 균주별 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 활성을 상기 실시예 9에 기재된 방법에 따라 측정하여 비교한 결과는 하기 표 3과 같다.

속명	균주명	서열번호	전환율(%)
Alcanivorax	Alcanivorax borkumensis SK2	1	92
Bacillus	Bacillus alcalophilus ATCC 27647	2	93
	Bacillus amyloliquefaciens DSM 7	3	93
	Bacillus azotoformans LMG 9581	4	94
	Bacillus cellulosilyticus DSM 2522	5	92
	Bacillus coagulans 36D1	6	91
	Bacillus cytotoxicus NVH 391-98	7	94
	Bacillus halodurans C-125	8	94
	Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580	9	93
	Bacillus macauensis ZFHKF-1	10	94
	Bacillus megaterium DSM 319	11	93
	Bacillus methanolicus MGA3	12	94
	Bacillus nealsonii AAU1	13	94
	Bacillus pseudofirmus OF4	14	93
	Bacillus selenitireducens MLS10	15	92
	Bacillus sp. B14905	16	93
	Bacillus subtilis subsp . inaquosorum KCTC13429	17	95
	Bacillus weihenstephanensis KBAB4	18	94
Bifidobacterium	Bifidobacterium breve	19	93
Corynebacterium	Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032)	20	92
Corynebacterium	Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385	21	93
Enterococcus	Enterococcus asini ATCC 700915	22	93
	Enterococcus caccae ATCC BAA-1240	23	94
	Enterococcus casseliflavus ATCC 12755	24	94
	Enterococcus faecalis ATCC 29200	25	94
	Enterococcus faecium ATCC 8459	26	95
	Enterococcus flavescens ATCC 49996	27	94
	Enterococcus gilvus ATCC BAA-350	28	93
	Enterococcus haemoperoxidus ATCC BAA-382	29	94
	Enterococcus italicus DSM 15952	30	92
	Enterococcus moraviensis ATCC BAA-383	31	91
	Enterococcus mundtii ATCC 882	32	93
	Enterococcus pallens ATCC BAA-351	33	93
	Enterococcus phoeniculicola ATCC BAA-412	34	94
	Enterococcus raffinosus ATCC 49464	35	92
	Enterococcus saccharolyticus ATCC 43076	36	93
	Enterococcus sp . C1	37	90
	Enterococcus villorum ATCC 700913	38	91
Escherichia	Escherichia coli ATCC 25922, ATCC 700928	39	93
	Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655	40	94
	Escherichia sp. TW09231	41	92
Geobacillus	Geobacillus kaustophilus HTA426	42	93
	Geobacillus sp. C56-T3	43	94
	Geobacillus stearothermophilus	44	93
	Geobacillus thermodenitrificans NG80-2	45	94
Lactobacillus	Lactobacillus acidophilus ATCC 4796	46	93
	Lactobacillus amylolyticus DSM 11664	47	93
	Lactobacillus antri DSM 16041	48	92
	Lactobacillus casei BD-II	49	93
	Lactobacillus crispatus 125-2-CHN	50	94
	Lactobacillus curvatus CRL 705	51	93
	Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus PB2003/044-T3-4	52	94
	Lactobacillus helveticus DSM 20075	53	94
	Lactobacillus iners ATCC 55195	54	93
	Lactobacillus johnsonii ATCC 33200	55	92
	Lactobacillus murinus	56	94
	Lactobacillus paracasei subsp . paracasei 8700:2	57	93
	Lactobacillus plantarum subsp . plantarum ATCC 14917	58	94
	Lactobacillus reuteri 100-23	59	94
	Lactobacillus rhamnosus ATCC 21052	60	93
	Lactobacillus ruminis ATCC 25644	61	94
	Lactobacillus salivarius ATCC 11741	62	94
	Lactobacillus sp. ASF360	63	93
Marinobacter	Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 49840	64	94
Methylobacillus	Methylobacillus flagellatus KT	65	92
Rhizobium	Rhizobium leguminosarum bv . trifolii WSM1325	66	94
	Rhizobium lupini HPC(L)	67	92
	Rhizobium sp . AP16	68	93
Staphylococcus	Staphylococcus epidermidis 36-1	69	94
Streptococcus	Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002	70	95
Streptomyces	Streptomyces avermitilis MA-4680	71	95
Streptomyces	Streptomyces viridochromogenes DSM 40736	72	94

실시예 11. 피타아제에 의한 타가토스 6- 포스페이트로부터 타가토스 생산

본 발명의 고농도의 타가토스의 생산을 위하여 10 mM 프럭토스 6-포스페이트, 10에서 50 unit/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 5.5, 온도 60℃에서 60분간 반응을 수행하였다. 그런 다음, 효소의 활성을 측정하였다. 효소 농도에 따른 타가토스 생산량은 도 5에 나타내었다.

효소 농도 50 U/ml에 9 mM의 타가토스가 생산되었고 이것은 전환 수율 90%에 해당되는 것이다.

실시예 12. 프럭토카이네이즈 , 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 및 피타아제의 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산

앞선 실시예들을 통한 결과를 토대로 프럭토카이네이즈, 알돌레이즈, 피타아제의 칵테일 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산을 실시하였다. 5 mM의 프럭토스를 동량의 ATP (Adenosine triphosphate)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisea) 유래의 헥소카이네이즈(sigma-aldrich에서 구매)를 250 unit/ml로 하여 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 7.5, 온도 30℃에서 60분간 반응을 수행하여 프럭토스 6-포스페이트를 생산한 결과 5mM의 프럭토스를 5mM의 프럭토스 6-포스페이트로 100% 전환하였으며 연속반응으로 0.5 unit/ml의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액을 pH 8.5에서 30분간 반응을 시킨 결과 5mM의 프럭토스 6-포스페이트가 4.65mM의 타가토스 6-포스페이트로 93% 전환되었다. 이 후 50unit/ml의 피타아제 효소(제노포커스, GenoPos TM 10000P)가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 5.5, 온도 60℃에서 60분간 반응을 수행한 결과 4.65mM의 타가토스 6-포스페이트가 4.65mM의 타가토스로 100% 전환되었다. 결론적으로 5mM의 프럭토스를 이용하여 헥소카이네이즈, 알돌레이즈, 피타아제의 칵테일반응을 이용한 결과 4.65mM의 타가토스로 93% 전환하는데 성공하였다.

실시예 13. 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 고정화 효소를 이용한 타가토스 생산

효소를 고정화시키기 위한 담체로 알긴산나트륨을 선택하고, 2.0, 2.5, 3.0%의 알긴산나트륨 수용액을 각각 제조하였다. 상기와 같이 다양한 농도로 제조된 알긴산나트륨 수용액을 각각 10㎖씩 취하여 효소액 10㎖과 각각 혼합한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 하였다. 상기 효소-담체의 결합체 비드를 0.2% 글루타르알데하이드에서 1시간 동안 처리하여 가교시켰다.

기질 용액은 pH 7.0의 50mM 트리스 완충 용액에 프럭토스 6-포스페이트가 10g/ℓ의 농도로 존재하는 용액을 사용하였으며, 생물반응기에 기질 용액을 넣은 후 고정화된 효소를 40 U 첨가하여 적절한 온도를 유지시키면서 반응시켰다. 이때 효소 역가 1 U(unit)는 60℃, pH 7에서 1분간 타가토스 1마이크로몰(μmole)을 생산할 수 있는 효소 양으로 정의하였다. 기질이 고갈될 때마다 새로 기질을 공급하기 위해, 3시간마다 기질 용액을 새것으로 갈아주었으며, 이를 8회 반복하여 장기간 반응 시에도 효소의 활성이 유지되는지를 관찰하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

(단위: g/l)

교환횟수	알긴산 나트륨 농도(%)
교환횟수	2.0	2.5	3.0
1	5.6	9.0	8.5
2	5.8	9.2	8.3
3	5.4	9.1	8.6
4	5.5	8.9	8.4
5	5.7	9.0	8.7
6	5.4	9.2	8.8
7	5.6	9.1	8.5
8	5.7	9.2	8.6

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 알긴산 나트륨 농도는 2.5%가 가장 적합하였으며, 교환횟수 8회까지도 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 고정화 효소의 활성이 유지되었다.

실시예 14. 프럭토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 발현 세포의 고정화를 이용한 프럭토스 6- 포스페이트의 타가토스 6- 포스페이트로의 전환

액체 배지를 이용하여 배양하고 수확한 세포를 5000rpm에서 15분간 원심분리하여 증류수로 2회 세척한 뒤 2.5%(w/v)의 알지네이트 용액과 습세포 농도가 최종적으로 30%가 되게 충분히 혼합한 다음, 페리스탈틱 펌프에 연결된 시린지를 통해 0.5-3M의 염화칼슘 수용액 상에 적하시켜 비드(Bead) 형태의 고정화 세포를 얻었다. 얻어진 고정화 세포는 20-30℃에서 2-3시간 방치한 뒤, 0-8℃에서 16시간 동안 강화시킨다. 이때 시린지 게이지의 크기를 바꾸어 줌으로써 비드의 크기를 변화시킬 수가 있으며, 이에 따른 유효 인자를 구하였다. 유효 인자는 2%(w/v)로 알지네이트 내에 습세포를 최종농도 20%(w/v)로 포괄시켜 고정화 세포를 제조하고, 이 제조된 고정화 세포 5 unit를 pH 8.5, 50℃에서 50mM 프럭토스 6-포스페이트 용액 1리터와 60분간 반응시켜 생성되는 타가토스 6-포스페이트의 양을 측정하여 표 5에 나타내었다.

경과시간(분)	10	20	30	40	50	60
타가토스 생성량(mM)	6	18	26	34	39	45

실시예 15. 고정화 효소 및 연속반응기를 이용한 타가토스 생산

고정화된 프럭토카이네이즈 또는 헥소카이네이즈 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 각각의 효소를 각각 고정화한 후 연속반응으로 프럭토스로부터 타가토스를 생산하고자 한다. 각각의 효소를 고정화시키기 위한 담체로 알긴산나트륨을 선택하고, 2.5%의 알긴산나트륨 수용액을 각각 제조하였다. 상기와 같이 제조된 알긴산나트륨 수용액을 각각 10㎖씩 취하여 효소액 10㎖과 각각 혼합한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 하였다. 상기 효소-담체의 결합체 비드를 0.2% 글루타르알데하이드에서 1시간 동안 처리하여 가교시켰다.

첫 단계인 프럭토스 6-포스페이트 생산을 위한 반응에서, 기질 용액은 pH 7.0의 50mM 트리스 완충 용액에 50mM 프럭토스와 동량의 ATP를 녹여 제조한 용액을 사용하였으며, 생물반응기에 기질 용액을 넣은 후 고정화된 효소를 40 U 첨가하여 적절한 온도를 유지시키면서 반응시켰다. 타가토스 6-포스페이트 생산을 위한 두 번째 반응을 위해서 1차 반응물의 pH를 8.5로 조절하고, 고정화효소 40U를 첨가하여 50분간 반응시켰다. 마지막으로, 타가토스 생산을 위해서는 2차 반응물의 pH를 5.5로 조정하고 60℃에서 60분간 반응시켜 생성되는 타가토스의 양을 분석하여 하기 표 6에 나타내었다.

경과시간(분)	10	20	30	40	50	60
타가토스 생성량(mM)	5	17	24	33	41	47

<110> CHEBIGEN INC. <120> Composition for production of tagatose from fructose using enzyme combination reaction with substrates and uses thereof <130> PN13297 <160> 93 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 354 <212> PRT <213> Alcanivorax borkumensis <400> 1 Met Ala Leu Val Ser Met Arg Gln Leu Leu Asp His Ala Ala Glu Phe 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Val Pro Ala Tyr Asn Val Asn Asn Val Glu Gln Met Arg 20 25 30 Ala Ile Met Glu Ala Ala Asp Lys Thr Asn Ser Pro Val Ile Val Gln 35 40 45 Ala Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Gly Ala Pro Phe Leu Arg His 50 55 60 Leu Ile Leu Ala Ala Thr Glu Glu Phe Pro His Ile Pro Val Val Met 65 70 75 80 His Gln Asp His Gly Thr Ser Pro Ser Val Cys Gln Arg Ser Ile Gln 85 90 95 Leu Gly Phe Ser Ser Val Met Met Asp Gly Ser Leu Gly Glu Asp Gly 100 105 110 Lys Thr Pro Thr Asp Tyr Glu Tyr Asn Val Glu Val Thr Arg Arg Thr 115 120 125 Val Asp Met Ala His Ala Cys Gly Val Ser Val Glu Gly Glu Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Gly Ser Leu Glu Thr Gly Glu Ala Gly Glu Glu Asp Gly Ile 145 150 155 160 Gly Ala Ala Gly Lys Leu Thr His Glu Gln Met Leu Thr Asp Pro Glu 165 170 175 Glu Ala Ala Asp Phe Val Gln Lys Thr Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile 180 185 190 Ala Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Thr Arg Pro Pro Thr 195 200 205 Gly Asp Ile Leu Ala Ile Glu Gln Ile Lys Ala Ile His Lys Arg Ile 210 215 220 Pro Asp Thr His Leu Val Met His Gly Ser Ser Ser Val Pro Gln Asp 225 230 235 240 Trp Leu Ala Ile Ile Asn Glu Phe Gly Gly Glu Ile Pro Glu Thr Tyr 245 250 255 Gly Val Pro Val Glu Glu Ile Gln Glu Gly Ile Lys His Gly Val Arg 260 265 270 Lys Val Asn Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Ser Thr Gly Ala Ile 275 280 285 Arg Arg Phe Leu Ala Gln Asn Pro Ala Glu Phe Asp Pro Arg Lys Tyr 290 295 300 Leu Lys Glu Ser Ile Thr Ala Met Arg Asp Ile Cys Met Ala Arg Tyr 305 310 315 320 Glu Ala Phe Gly Thr Ala Gly Tyr Ala Asp Lys Ile Lys Pro Ile Ser 325 330 335 Leu Glu Lys Met Phe Gln Arg Tyr Glu Ser Gly Asp Leu Asp Pro Arg 340 345 350 Val Lys <210> 2 <211> 287 <212> PRT <213> Bacillus alcalophilus <400> 2 Met Pro Leu Val Ser Met Thr Glu Met Leu Asn Lys Ala Lys Ala Glu 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Gln Ala Ala Glu Glu Glu Lys Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg Tyr Met Gly Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Ser Met Val Lys Ala Leu Met Asp Glu Tyr Asn Val Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Leu Glu Lys Cys Val Gln Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser His His Pro 100 105 110 Leu Ala Glu Asn Ile Ala Ile Thr Lys Arg Val Val Glu Ile Ala His 115 120 125 Ala Val Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Ile Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Leu Ile Val Asp Asp Ala Glu Ala Ala Tyr Ala Ile Pro 145 150 155 160 Ala Glu Cys Lys Glu Leu Val Ala Ala Thr Gly Val Asp Cys Phe Ala 165 170 175 Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu 180 185 190 Gly Phe Asp His Met Lys Glu Ile Asp Ser Leu Val Gly Ile Pro Leu 195 200 205 Val Leu His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Ala Asp Ile Lys Lys Ala 210 215 220 Ile Glu Phe Gly His Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Ser Gln Ile 225 230 235 240 Ser Ser Ala Lys Ala Val Arg Glu Val Leu Ala Ala Asp Thr Asp Val 245 250 255 Tyr Asp Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Ala Ile Lys Glu 260 265 270 Thr Val Lys Gly Lys Met Lys Glu Phe Gly Ser Ser Asn Arg Ala 275 280 285 <210> 3 <211> 285 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 3 Met Pro Leu Val Ser Met Thr Glu Met Leu Asn Thr Ala Lys Glu Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Gln Ala Ala Gln Glu Glu Lys Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Gly Arg Tyr Met Gly Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Ala Met Val Lys Ala Leu Met Glu Glu Tyr Lys Val Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Ser Cys Ala Lys Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Ala Ser His His Pro 100 105 110 Phe Glu Glu Asn Val Ala Thr Thr Ala Lys Val Val Glu Leu Ala His 115 120 125 Phe His Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Val Ile Ala Glu Gly Val Ile Tyr Ala Asp Pro Lys Glu 145 150 155 160 Cys Gln Glu Leu Val Glu Arg Thr Gly Ile Asp Cys Leu Ala Pro Ala 165 170 175 Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu Gly Phe 180 185 190 Lys Glu Met Glu Asp Ile Gly Lys Thr Thr Gly Leu Pro Leu Val Leu 195 200 205 His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Ala Asp Ile Lys Lys Ser Ile Ser 210 215 220 Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile Ser Ser 225 230 235 240 Ala Lys Ala Val Arg Glu Thr Leu Ala Ala Lys Pro Asn Glu Tyr Asp 245 250 255 Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Ala Ile Lys Glu Thr Val 260 265 270 Ile Gly Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn Gln Ala 275 280 285 <210> 4 <211> 287 <212> PRT <213> Bacillus azotoformans <400> 4 Met Pro Leu Val Ser Met Thr Glu Met Leu Asn Lys Ala Lys Asn Glu 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Ile Asn Asn Leu Glu Tyr Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Gln Ala Ala Gln Ala Glu Asn Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Lys Tyr Met Gly Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Ala Met Val Lys Gly Leu Met Glu Tyr Tyr Glu Met Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Lys Cys Val Glu Ala 85 90 95 Met Tyr Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser His Tyr Pro 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Ile Glu Leu Thr Lys Arg Val Val Asp Val Ala His 115 120 125 Thr Ile Gly Ile Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Ile Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Leu Val Val Asp Asp Ala Glu Ala Met Tyr Ala Ile Pro 145 150 155 160 Ala Glu Cys Asp Arg Leu Val Arg Glu Thr Gly Val Asp Cys Phe Ala 165 170 175 Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Lys Leu 180 185 190 Gly Phe Asp Arg Met Lys Glu Val Met Glu Leu Thr Gly Val Pro Leu 195 200 205 Val Leu His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Lys Asp Ile Gln Lys Ala 210 215 220 Ile Ser Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile 225 230 235 240 Thr Ser Thr Lys Thr Val Arg Lys Val Leu Glu Glu Lys Pro Glu Leu 245 250 255 Tyr Asp Thr Arg Lys Phe Met Gly Pro Ala Arg Asp Thr Ile Lys Glu 260 265 270 Thr Val Ile Gly Lys Ile Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn Lys Ala 275 280 285 <210> 5 <211> 287 <212> PRT <213> Bacillus cellulosilyticus <400> 5 Met Pro Leu Val Ser Met Lys Glu Met Leu Glu Asp Ala Lys Ala Gly 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Leu Ala Ala Glu Glu Glu Gln Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg Tyr Met Gly Gly Phe Leu Thr Val Val 50 55 60 Ser Ile Val Glu Ala Leu Met Ala Asp Tyr Glu Ile Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Lys Cys Val Glu Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser His His Pro 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Gln Val Val Ala Val Ala His 115 120 125 Thr Leu Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Ile Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Leu Val Val Asp Asp Ala Asp Ala Ala Tyr Ala Ile Pro 145 150 155 160 Ser Glu Cys Asp Gln Leu Val Arg Glu Thr Gly Val Asp Cys Phe Ala 165 170 175 Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu 180 185 190 Gly Phe Asp Arg Met Glu Glu Val Ala Asn Leu Thr Gly Val Pro Leu 195 200 205 Val Leu His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr His Asp Ile Gln Lys Ala 210 215 220 Ile Ser Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile 225 230 235 240 Ser Ser Ala Lys Arg Val Arg Glu Val Leu Ala Glu Lys Pro Asn Glu 245 250 255 Tyr Asp Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Asp Ala Ile Lys Glu 260 265 270 Thr Val Ile Gly Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn Lys Ala 275 280 285 <210> 6 <211> 285 <212> PRT <213> Bacillus coagulans <400> 6 Met Pro Leu Val Ser Met Thr Glu Met Leu Asn Lys Ala Lys Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Val Asn Asn Leu Glu Tyr Ala Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Met Ala Ala Glu Glu Glu Lys Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Gly Arg Tyr Met Ser Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Lys Met Val Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Asn Val Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Asn Ala Lys Lys Ala 85 90 95 Ile Asp Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Ala Ser His His Pro 100 105 110 Phe Asp Glu Asn Val Glu Ile Thr Ser Lys Val Val Glu Tyr Ala His 115 120 125 Ala His Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Val Val Gly Lys Gly Ile Ile Tyr Ala Asp Pro Glu Glu 145 150 155 160 Cys Lys Lys Leu Val Asp Ala Thr Lys Ile Asp Ala Leu Ala Pro Ala 165 170 175 Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr His Gly Glu Pro Asn Leu Gly Phe 180 185 190 Lys Glu Met Glu Glu Ile Ser Lys Ile Thr Gly Met Pro Leu Val Leu 195 200 205 His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Glu Ala Asp Ile Lys Lys Ala Ile Ser 210 215 220 Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile Ala Ser 225 230 235 240 Ala Lys Thr Val Arg Glu Val Leu Ala Ala Asp Pro Asp Val Tyr Asp 245 250 255 Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Thr Ile Lys Gln Thr Val 260 265 270 Ile Gly Lys Ile Arg Glu Phe Gly Ser Asn Gln Lys Ala 275 280 285 <210> 7 <211> 285 <212> PRT <213> Bacillus cytotoxis <400> 7 Met Pro Leu Val Ser Met Lys Glu Met Leu Asn Lys Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Ile Asn Asn Leu Glu Trp Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Ala Ala Ala Glu Glu Glu Lys Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg His Met Thr Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Ala Met Val Lys Ala Leu Ile Glu Glu Met Asn Ile Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Lys Cys Lys Glu Ala 85 90 95 Ile Asp Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Ala Ser His His Pro 100 105 110 Phe Glu Glu Asn Val Glu Thr Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His 115 120 125 Ala Arg Asn Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Val Ile Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Ala Asp Pro Glu Glu 145 150 155 160 Cys Lys His Leu Val Glu Ala Thr Gly Ile Asp Cys Leu Ala Pro Ala 165 170 175 Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu Gly Phe 180 185 190 Lys Glu Met Glu Gln Val Arg Asp Leu Thr Gly Val Pro Leu Val Leu 195 200 205 His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Ala Asp Ile Lys Lys Ala Ile Ser 210 215 220 Leu Gly Thr Ser Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile Ala Phe 225 230 235 240 Thr Lys Ala Val Arg Glu Val Leu Asn Lys Asp Gln Glu Val Tyr Asp 245 250 255 Pro Arg Lys Phe Ile Gly Pro Gly Arg Glu Ala Ile Lys Ala Thr Val 260 265 270 Ile Gly Lys Ile Arg Glu Phe Gly Ser Asn Gly Lys Ala 275 280 285 <210> 8 <211> 287 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 8 Met Pro Leu Val Ser Met Thr Glu Met Leu Asn Lys Ala Lys Ala Glu 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Gln Ala Ala Glu Glu Glu Lys Ser Pro Val Ile Cys Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg Tyr Met Gly Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Gly Met Val Lys Asn Leu Met Gln Glu Tyr Asn Val Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Lys Cys Val Glu Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser His His Pro 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Arg Val Val Asp Val Ala His 115 120 125 Ala Leu Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Ile Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Leu Val Val Asp Glu Ala Glu Ala Ala Tyr Ala Ile Pro 145 150 155 160 Ser Glu Cys Lys Glu Leu Val Glu Ala Thr Gly Val Asp Cys Phe Ala 165 170 175 Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu 180 185 190 Gly Phe Asp Arg Met Lys Glu Ile Asn Glu Leu Val Gly Ile Pro Leu 195 200 205 Val Leu His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Lys Asp Ile Gln Lys Ala 210 215 220 Ile Ser Leu Gly His Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Ser Gln Ile 225 230 235 240 Ser Ser Ala Lys Ala Val Arg Gln Val Leu Glu Glu Lys Pro Glu Leu 245 250 255 Tyr Asp Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Ala Ile Lys Asp 260 265 270 Thr Val Lys Gly Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn Lys Ala 275 280 285 <210> 9 <211> 283 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 9 Met Leu Thr Asn Thr Lys Lys Met Leu Leu Asp Ala Gln Ala Asn Gly 1 5 10 15 Tyr Ala Val Pro Ala Phe Asn Ile His Asn Leu Glu Thr Val Gln Ala 20 25 30 Val Thr Glu Ala Ala Glu Ala Leu Arg Ser Pro Val Ile Leu Ala Ala 35 40 45 Thr Pro Gly Thr Phe Ser Tyr Ala Gly Arg Asp Tyr Ile Gln Ala Ile 50 55 60 Ala Glu Thr Ala Ala Ala Arg Cys Ser Ile Pro Val Ala Leu His Leu 65 70 75 80 Asp His His Glu Glu Ile Asp Asp Ile Arg Glu Ser Leu Ser Leu Gly 85 90 95 Thr Lys Ser Val Met Ile Asp Ala Ser His His Pro Phe Ala Glu Asn 100 105 110 Thr Ala Ile Thr Ala Ser Val Val Gln Tyr Ala Arg Gln Lys Asp Ala 115 120 125 Thr Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Leu Gly Gly Gln Glu Asp Asp Leu 130 135 140 Ile Val Asp Glu Ala Asp Ala Tyr Tyr Thr Asp Pro Asp Ala Ala Lys 145 150 155 160 Glu Phe Val Glu Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Ala Val Ala Ile Gly 165 170 175 Thr Ala His Gly Leu Tyr Ser Lys Glu Pro Asn Ile Asp Phe Glu Arg 180 185 190 Leu Ala Ala Ile Gln Lys Arg Val Ser Val Pro Leu Val Leu His Gly 195 200 205 Ala Ser Gly Ile Ser Glu Gln Asp Val Arg Lys Cys Ile Lys Leu Gly 210 215 220 Cys Ala Lys Val Asn Ile Ala Thr Glu Leu Lys Ile Pro Phe Ser Asp 225 230 235 240 Lys Leu Arg Arg Tyr Leu His Glu His Ala Asp Ala Ser Asp Pro Arg 245 250 255 Lys Tyr Met Ala Pro Ala Lys Glu Ala Met Lys Lys Ile Val Gln Glu 260 265 270 Lys Ile Leu Met Cys Met Ser Asn Asp Arg Tyr 275 280 <210> 10 <211> 287 <212> PRT <213> Bacillus macauensis <400> 10 Met Pro Leu Val Ser Met Lys Glu Met Leu Glu Lys Gly Lys Ala Glu 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Ile Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Lys Ala Ala Gln Glu Glu Asn Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg Tyr Met Gly Gly Phe Lys Leu Val Val 50 55 60 Ala Met Thr Lys Ala Leu Met Glu Glu Tyr Ser Ile Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Asn Cys Ala Lys Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser His Phe Pro 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Leu Ala His 115 120 125 Ile His Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Ile Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Leu Ile Val Asp Asp Ala Asp Ala Ala Tyr Ala Ile Pro 145 150 155 160 Ser Glu Cys Asp Gln Leu Val Arg Glu Thr Gly Val Asp Cys Phe Ala 165 170 175 Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu 180 185 190 Gly Phe Asp Arg Met Lys Glu Val Asn Glu Leu Thr Gly Val Pro Leu 195 200 205 Val Leu His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr His Asp Ile Gln Lys Ala 210 215 220 Ile Ser Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Ser Gln Ile 225 230 235 240 Ser Ser Phe Asn Ala Ile Asn Glu Phe Ile Ala Ala Asn Pro Asp Lys 245 250 255 Tyr Asp Pro Arg Lys Tyr Leu Thr Ala Gly Arg Glu Ala Ile Leu Ala 260 265 270 Thr Val Lys Ala Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn Lys Ala 275 280 285 <210> 11 <211> 285 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 11 Met Pro Leu Val Ser Met Lys Glu Met Leu Ile Thr Ala Lys Glu Gln 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Gln Ala Ala Lys Glu Glu Asn Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg Tyr Met Gly Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Ala Met Val Glu Ala Leu Ile Glu Asp Tyr Asp Val Gln Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Ser Cys Ala Lys Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Ala Ser His His Pro 100 105 110 Phe Glu Glu Asn Ile Ala Ile Thr Ser Lys Val Val Glu Leu Ala His 115 120 125 Phe His Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Val Ile Ala Glu Gly Val Ile Tyr Ala Asp Ala Asn Glu 145 150 155 160 Cys Glu Glu Leu Val Asn Arg Thr Gly Ile Asp Cys Leu Ala Pro Ala 165 170 175 Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu Gly Phe 180 185 190 Ala Glu Met Lys Glu Ile Gly Asp Arg Thr Gly Leu Pro Leu Val Leu 195 200 205 His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Lys Asp Ile Gln Lys Ser Val Ser 210 215 220 Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile Ala Ser 225 230 235 240 Ala Lys Ala Val Arg Glu Val Leu Ala Ala Gln Pro Glu Gln Tyr Asp 245 250 255 Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Ala Ile Lys Glu Thr Val 260 265 270 Gln Gly Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn Lys Ala 275 280 285 <210> 12 <211> 284 <212> PRT <213> Bacillus methanolicus <400> 12 Met Pro Leu Val Ser Met Lys Asp Met Leu Asn His Gly Lys Glu Asn 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Ile Asn Asn Leu Glu Phe Gly Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Gln Ala Ala Glu Glu Glu Lys Ser Pro Val Ile Ile Gly 35 40 45 Val Ser Val Gly Ala Ala Asn Tyr Met Gly Gly Phe Lys Leu Ile Val 50 55 60 Asp Met Val Lys Ser Leu Met Asp Ser Tyr Asn Val Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Pro Ser Leu Glu Lys Cys Val Gln Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser His Leu Pro 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Ile Glu Leu Thr Lys Arg Val Val Glu Ile Ala His 115 120 125 Ser Val Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Ile Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Val Val Ala Glu Ser Phe Tyr Ala Ile Pro Ser Glu Cys 145 150 155 160 Glu Gln Leu Val Arg Glu Thr Gly Val Asp Cys Phe Ala Pro Ala Leu 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Ala Glu Lys Lys Gly Ile 85 90 95 Val Pro Phe Leu Lys Ile Asp Lys Gly Leu Ala Glu Leu Thr Asn Gly 100 105 110 Val Gln Leu Met Lys Pro Ile Thr Asp Leu Asp Asp Ile Leu Arg Arg 115 120 125 Ala Lys Glu Arg His Ile Phe Gly Thr Lys Met Arg Ser Val Ile Lys 130 135 140 Glu Ala Asn Pro Glu Ser Ile Lys Ala Val Val Asp Gln Gln Phe Glu 145 150 155 160 Ile Gly Lys Gln Ile Ile Ala Ala Gly Leu Val Pro Ile Ile Glu Pro 165 170 175 Glu Val Asp Ile Asn Ser Pro Asp Lys Glu Gln Ser Glu Ala Ile Leu 180 185 190 Lys Gln Glu Leu Leu Lys His Leu His Asn Leu Lys Glu Asp Glu Asn 195 200 205 Val Met Leu Lys Leu Ser Ile Pro Thr Val Ala Asn Thr Tyr Lys Glu 210 215 220 Leu Thr Thr His Ser Arg Val Val Arg Val Val Ala Leu Ser Gly Gly 225 230 235 240 Tyr Ser Arg Glu Glu Ala Asn Gln Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asn Ile 245 250 255 Ile Ala Ser Phe Ser Arg Ala Leu Ser Glu Glu Leu Asn Val Asn Gln 260 265 270 Ser Glu Glu Glu Phe Asn Asn Thr Leu Lys Glu Ala Val Thr Ser Ile 275 280 285 Tyr Glu Ala Ser Thr Ala Lys Thr Gly Arg 290 295 <210> 14 <211> 287 <212> PRT <213> Bacillus pseudofirmus <400> 14 Met Pro Leu Val Ser Met Lys Asp Met Leu Asn Lys Ala Lys Ala Glu 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Gln Ala Ala Gln Glu Glu Asn Ser Pro Val Ile Cys Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg Tyr Met Gly Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Lys Met Val Glu Ser Leu Met Glu Glu Tyr Asn Val Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Lys Cys Val Glu Ala 85 90 95 Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser His Tyr Pro 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Arg Val Val Asp Val Ala His 115 120 125 Ala Leu Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Arg Ile Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Leu Ile Val Asp Asp Ala Glu Ala Ala Tyr Ala Ile Pro 145 150 155 160 Ser Glu Cys Lys Glu Leu Val Glu Ala Thr Gly Val Asp Cys Phe Ala 165 170 175 Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu 180 185 190 Gly Phe Asp His Met Lys Glu Ile 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Gly Met 130 135 140 Glu Asp Gly Leu Val Gly Gly Val Arg Tyr Ala Asp Ile Thr Glu Cys 145 150 155 160 Glu Arg Ile Val Lys Glu Thr Asn Ile Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu 165 170 175 Gly Ser Val His Gly Lys Tyr Gln Gly Glu Pro Asn Leu Gly Phe Lys 180 185 190 Glu Met Glu Ala Ile Ser Arg Met Thr Asp Ile Pro Leu Val Leu His 195 200 205 Gly Ala Ser Gly Ile Pro Gln Asp Gln Ile Lys Lys Ala Ile Thr Leu 210 215 220 Gly His Ala Lys Ile Asn Ile Asn Thr Glu Cys Met Val Ala Trp Thr 225 230 235 240 Asp Glu Thr Arg Arg Met Phe Gln Glu Asn Ser Asp Leu Tyr Glu Pro 245 250 255 Arg Gly Tyr Met Thr Pro Gly Ile Glu Ala Val Glu Glu Thr Val Arg 260 265 270 Ser Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ala Gly Lys Ala Ala Lys Gln Gln 275 280 285 Val Gly 290 <210> 18 <211> 285 <212> PRT <213> Bacillus weihenstephanensis <400> 18 Met Pro Leu Val Ser Met Lys Glu Met Leu Asn Thr Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Met Asn Asn Leu Glu Trp Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Ala Ala Ala Glu Glu Glu Lys Ser Pro Val Ile Leu Gly 35 40 45 Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg His Met Thr Gly Phe Lys Thr Val Val 50 55 60 Ala Met Val Lys Ala Leu Ile Glu Glu Met Asn Ile Ser Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Lys Cys Lys Glu Ala 85 90 95 Ile Asp Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Ala Ser His His Pro 100 105 110 Phe Asp Glu Asn Val Glu Thr Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His 115 120 125 Ala Arg Asn Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly Gln 130 135 140 Glu Asp Asp Ile Ile Ala Glu Gly Val Ile Tyr Ala Asp Pro Ala Glu 145 150 155 160 Cys Lys His Leu Val Glu Ala Thr Gly Ile Asp Cys Leu Ala Pro Ala 165 170 175 Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Asn Leu Gly Phe 180 185 190 Ala Glu Met Glu Gln Val Arg Asp Phe Thr Gly Val Pro Leu Val Leu 195 200 205 His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Ala Asp Ile Val Lys Ala Ile Ser 210 215 220 Leu Gly Thr Ser Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile Glu Phe 225 230 235 240 Thr Lys Ala Val Arg Glu Ala Leu Asn Lys Asp Gln Glu Val Tyr Asp 245 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Ile Leu Phe Glu Met Thr Met Asp Arg 65 70 75 80 Glu Ile Glu Gly Ile Pro Thr Ala Gln Tyr Leu Trp Glu Lys Lys Gly 85 90 95 Ile Val Pro Leu Leu Lys Ile Asp Lys Gly Leu Ala Asp Glu Glu Asn 100 105 110 Asp Val Gln Val Met Lys Pro Met Pro Glu Leu Asp Lys Leu Leu Asp 115 120 125 Arg Gly Val Glu Lys Gly Ile Phe Gly Thr Lys Glu Arg Ser Val Ile 130 135 140 Asn Ala Ala Asn Gly Glu Gly Ile Gln Ala Val Val Asp Gln Gln Phe 145 150 155 160 Glu Ile Gly Lys Gln Val Leu Ala Lys Gly Met Val Pro Ile Leu Glu 165 170 175 Pro Glu Val Thr Ile Ser Ile Asp Asp Lys Glu Glu Ala Glu Glu Leu 180 185 190 Leu Lys Ala Ala Leu Leu Lys Gly Leu Asp Asp Ile Pro Glu Gly Gln 195 200 205 Gln Val Met Ile Lys Val Ser Ile Pro Thr Val Asp Asn Phe Tyr Glu 210 215 220 Asp Leu Ile Asn His Pro Lys Val Met Arg Val Val Ala Leu Ser Gly 225 230 235 240 Gly Tyr Glu Arg Asp Asp Ala Asn Glu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Gly 245 250 255 Leu Ile Ala Ser Phe Ser Arg Ala Leu Leu Glu Gly Leu Thr Ala Asp 260 265 270 Gln Ser Gln Glu Glu Phe Asp Asn Thr 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24 Met Glu His Thr Tyr Met Leu Ile Asn Met Lys Gln Leu Leu Thr Val 1 5 10 15 Ala Lys Glu Asn Gln Phe Ala Val Gly Ala Phe Asn Val Ala Asp Ser 20 25 30 Asn Phe Leu Arg Val Val Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Asp Ala Pro 35 40 45 Ala Ile Ile Ala Ile His Pro Thr Glu Leu Ala Phe Thr Lys Asp Glu 50 55 60 Phe Phe His Tyr Ala Val Ser Arg Ala Lys Asn Ser Ser Val Pro Ile 65 70 75 80 Val Ile His Met Asp His Gly Asp Ser Leu Ala Ser Ile Met Arg Ala 85 90 95 Ile His Cys Gly Phe Ser Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Leu Leu Pro 100 105 110 Phe Glu Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Gln Ile Thr Glu Ile Cys His 115 120 125 Pro Ile Gly Val Ser Val Glu Gly Glu Leu Gly Thr Ile Gly Asn Thr 130 135 140 Gly Thr Ser Val Glu Gly Gly Val Ser Glu Val Ile Tyr Thr Arg Pro 145 150 155 160 Glu Asp Ala Gln Glu Phe Ile Glu Lys Thr Gly Ile Asp Thr Leu Ala 165 170 175 Val Ala Ile Gly Thr Ala His Gly Ile Tyr Pro Lys Asp Ile Lys Pro 180 185 190 Glu Leu Lys Met Asp Val Leu Gln Glu Ile Lys Asp Arg Val Asp Ile 195 200 205 Pro Leu Val Leu His 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270 Val Lys Asp Ala Glu Glu His Ile Asp Trp Phe Gly Ser Ala Gly Lys 275 280 285 Ala <210> 38 <211> 289 <212> PRT <213> Enterococcus villorum <400> 38 Met Pro Val Val Ser Gly Ala Glu Phe Leu Lys Ala Ala Arg Lys Gly 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gly Phe Asn Thr Asn Asn Leu Glu Trp Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Glu Ala Ala Glu Ala Lys Lys Ala Pro Val Leu Ile Gln 35 40 45 Thr Ser Met Gly Ala Ala Lys Tyr Met Gly Gly Tyr Lys Val Ala Lys 50 55 60 Asp Ile Ile Cys Asp Leu Val Glu Ser Met Asn Ile Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly Asp Tyr Asp Ala Ala Met Glu Cys Ile 85 90 95 Glu Val Gly Tyr Thr Ser Val Met Phe Asp Gly Ser His Leu Pro Phe 100 105 110 Glu Glu Asn Leu Lys Leu Ala Lys Glu Val Val Glu Lys Ala His Ala 115 120 125 Lys Gly Ile Ser Val Glu Cys Glu Val Gly Ser Ile Gly Gly Glu Glu 130 135 140 Asp Gly Ile Ile Gly Ser Gly Glu Leu Ala Asp Ile Glu Glu Cys Lys 145 150 155 160 Gln Met Val Ala Thr Gly Ile Asp Tyr Leu Ala Cys Gly Ile Gly Asn 165 170 175 Ile His Gly Gln Tyr Pro 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flagellatus <400> 65 Met Ala Leu Ile Ser Leu Arg Gln Leu Leu Asp His Ala Ala Glu His 1 5 10 15 Asp Tyr Gly Val Pro Ala Phe Asn Val Asn Asn Leu Glu Gln Val Gln 20 25 30 Ala Ile Met Arg Ala Ala Asp Ser Cys His Ser Pro Val Ile Leu Gln 35 40 45 Ala Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Gly Glu Ala Phe Leu Leu Lys 50 55 60 Leu Ala Glu Ala Ala Ile Ala Ser Tyr Pro His Leu Pro Val Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp His Gly Ala Ser Pro Ala Ile Cys Leu His Ala Ile Gln 85 90 95 Ser Gly Phe Ser Ser Val Met Met Asp Gly Ser Leu Leu Glu Asp Gly 100 105 110 Lys Thr Pro Ala Ser Tyr Glu Tyr Asn Val Glu Val Thr Arg Gln Val 115 120 125 Val Met Ala Ala His Ala Val Gly Val Ser Val Glu Gly Glu Leu Gly 130 135 140 Val Leu Gly Ser Leu Glu Thr Gly Leu Ala Gly Glu Glu Asp Gly Val 145 150 155 160 Gly Ala Glu Gly Arg Leu Asp Arg Ser Gln Leu Leu Thr Ser Pro Glu 165 170 175 Glu Ala Val Asp Phe Val Ala Arg Thr Gly Val Asp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Ala Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Arg Pro Pro Thr 195 200 205 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<400> 73 Met Leu Gly Gly Ile Glu Ala Gly Gly Thr Lys Phe Val Cys Ala Val 1 5 10 15 Gly Arg Glu Asp Gly Thr Ile Ile Asp Arg Ile Glu Phe Pro Thr Lys 20 25 30 Met Pro Asp Glu Thr Ile Glu Lys Val Ile Gln Tyr Phe Ser Gln Phe 35 40 45 Ser Leu Gln Ala Ile Gly Ile Gly Ser Phe Gly Pro Val Asp Asn Asp 50 55 60 Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Gly Thr Ile Thr Ala Thr Pro Lys Ala Gly 65 70 75 80 Trp Arg His Tyr Pro Phe Leu Gln Thr Val Lys Asn Glu Met Lys Ile 85 90 95 Pro Val Gly Phe Ser Thr Asp Val Asn Ala Ala Ala Leu Gly Glu Phe 100 105 110 Leu Phe Gly Glu Ala Lys Gly Leu Asp Ser Cys Leu Tyr Ile Thr Ile 115 120 125 Gly Thr Gly Ile Gly Ala Gly Ala Ile Val Glu Gly Arg Leu Leu Gln 130 135 140 Gly Leu Ser His Pro Glu Met Gly His Ile Tyr Ile Arg Arg His Pro 145 150 155 160 Asp Asp Val Tyr Gln Gly Lys Cys Pro Tyr His Gly Asp Cys Phe Glu 165 170 175 Gly Leu Ala Ser Gly Pro Ala Ile Glu Ala Arg Trp Gly Lys Lys Ala 180 185 190 Ala Asp Leu Ser Asp Ile Ala Gln Val Trp Glu Leu Glu Gly Tyr Tyr 195 200 205 Ile Ala Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile Leu Ala Pro Lys Lys 210 215 220 Ile Ile Leu Gly Gly Gly Val Met Gln Gln Lys Gln Val Phe Ser Tyr 225 230 235 240 Ile Tyr Gln Tyr Val Pro Lys Ile Met Asn Ser Tyr Leu Asp Phe Ser 245 250 255 Glu Leu Ser Asp Asp Ile Ser Asp Tyr Ile Val Pro Pro Arg Leu Gly 260 265 270 Ser Asn Ala Gly Ile Ile Gly Thr Leu Val Leu Ala His Gln Ala Leu 275 280 285 Gln Ala Glu Ala Ala Ser Gly Glu Val Arg Ser 290 295 <210> 74 <211> 307 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 74 Met Ser Ala Lys Val Trp Val Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Leu Leu 1 5 10 15 Pro Glu Ser Asp Gly Arg Leu Leu Pro Cys Pro Gly Gly Ala Pro Ala 20 25 30 Asn Val Ala Val Gly Ile Ala Arg Leu Gly Gly Thr Ser Gly Phe Ile 35 40 45 Gly Arg Val Gly Asp Asp Pro Phe Gly Ala Leu Met Gln Arg Thr Leu 50 55 60 Leu Thr Glu Gly Val Asp Ile Thr Tyr Leu Lys Gln Asp Glu Trp His 65 70 75 80 Arg Thr Ser Thr Val Leu Val Asp Leu Asn Asp Gln Gly Glu Arg Ser 85 90 95 Phe Thr Phe Met Val Arg Pro Ser Ala Asp Leu Phe Leu Glu Thr Thr 100 105 110 Asp Leu Pro Cys Trp Arg His Gly Glu Trp Leu His Leu Cys Ser Ile 115 120 125 Ala Leu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Thr Ser Ala Phe Thr Ala Met Thr 130 135 140 Ala Ile Arg His Ala Gly Gly Phe Val Ser Phe Asp Pro Asn Ile Arg 145 150 155 160 Glu Asp Leu Trp Gln Asp Glu His Leu Leu Arg Leu Cys Leu Arg Gln 165 170 175 Ala Leu Gln Leu Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Glu Glu Glu Trp Arg 180 185 190 Leu Ile Ser Gly Lys Thr Gln Asn Asp Arg Asp Ile Cys Ala Leu Ala 195 200 205 Lys Glu Tyr Glu Ile Ala Met Leu Leu Val Thr Lys Gly Ala Glu Gly 210 215 220 Val Val Val Cys Tyr Arg Gly Gln Val His His Phe Ala Gly Met Ser 225 230 235 240 Val Asn Cys Val Asp Ser Thr Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Ala Gly 245 250 255 Leu Leu Thr Gly Leu Ser Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp Glu Arg Glu 260 265 270 Met Arg Arg Ile Ile Asp Leu Ala Gln Arg Cys Gly Ala Leu Ala Val 275 280 285 Thr Ala Lys Gly Ala Met Thr Ala Leu Pro Cys Arg Gln Glu Leu Glu 290 295 300 Ser Glu Lys 305 <210> 75 <211> 302 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 75 Met Arg Ile Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Lys Thr Glu Val Ile Ala 1 5 10 15 Leu Gly Asp Ala Gly Glu Gln Leu Tyr Arg His Arg Leu Pro Thr Pro 20 25 30 Arg Asp Asp Tyr Arg Gln Thr Ile Glu Thr Ile Ala Thr Leu Val Asp 35 40 45 Met Ala Glu Gln Ala Thr Gly Gln Arg Gly Thr Val Gly Met Gly Ile 50 55 60 Pro Gly Ser Ile Ser Pro Tyr Thr Gly Val Val Lys Asn Ala Asn Ser 65 70 75 80 Thr Trp Leu Asn Gly Gln Pro Phe Asp Lys Asp Leu Ser Ala Arg Leu 85 90 95 Gln Arg Glu Val Arg Leu Ala Asn Asp Ala Asn Cys Leu Ala Val Ser 100 105 110 Glu Ala Val Asp Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gln Thr Val Phe Ala Val 115 120 125 Ile Ile Gly Thr Gly Cys Gly Ala Gly Val Ala Phe Asn Gly Arg Ala 130 135 140 His Ile Gly Gly Asn Gly Thr Ala Gly Glu Trp Gly His Asn Pro Leu 145 150 155 160 Pro Trp Met Asp Glu Asp Glu Leu Arg Tyr Arg Glu Glu Val Pro Cys 165 170 175 Tyr Cys Gly Lys Gln Gly Cys Ile Glu Thr Phe Ile Ser Gly Thr Gly 180 185 190 Phe Ala Met Asp Tyr Arg Arg Leu Ser Gly His Ala Leu Lys Gly Ser 195 200 205 Glu Ile Ile Arg Leu Val Glu Glu Ser Asp Pro Val Ala Glu Leu Ala 210 215 220 Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Arg Leu Ala Lys Ser Leu Ala His Val Val 225 230 235 240 Asn Ile Leu Asp Pro Asp Val Ile Val Leu Gly Gly Gly Met Ser Asn 245 250 255 Val Asp Arg Leu Tyr Gln Thr Val Gly Gln Leu Ile Lys Gln Phe Val 260 265 270 Phe Gly Gly Glu Cys Glu Thr Pro Val Arg Lys Ala Lys His Gly Asp 275 280 285 Ser Ser Gly Val Arg Gly Ala Ala Trp Leu Trp Pro Gln Glu 290 295 300 <210> 76 <211> 291 <212> PRT <213> Fusobacterium mortiferum <400> 76 Met Lys Phe Gly Ala Ile Asp Ala Gly Gly Lys Lys Phe Ile Cys Gly 1 5 10 15 Ile Thr Asp Glu Gln Gly Asn Thr Leu Glu Lys Thr Ser Phe Leu Thr 20 25 30 Glu Thr Pro Glu Lys Thr Ile Pro Leu Val Ile Asp Phe Phe Arg Asn 35 40 45 Lys Asp Ile Ser Ala Leu Gly Val Gly Cys Phe Gly Pro Leu Asp Leu 50 55 60 Asn Pro Asn Ser Asp Thr Tyr Gly Tyr Ile Thr Ser Ser Pro Lys Thr 65 70 75 80 Asp Trp Lys Asn Tyr Asn Ile Leu Gly Asn Leu Lys Ser Ala Phe Asn 85 90 95 Ile Pro Ile Phe Leu Asp Thr Asn Met Asn Val Gly Val Leu Gly Glu 100 105 110 Ala Met Trp Gly Ala Gly Lys Gly Leu Lys Asn Thr Ile Phe Leu Thr 115 120 125 Ile Gly Asn Gly Ile Gly Gly Gly Ala Ile Val Glu Gly Lys Ile Val 130 135 140 His Gly Met Leu His Pro Glu Met Gly His Met Phe Val Ser Arg His 145 150 155 160 Pro Arg Asp Lys Phe Ala Gly Thr Cys Pro Phe His Gly Gly Asn Cys 165 170 175 Leu Glu Gly Met Ala Ser Val Pro Ala Ile Glu Lys Arg Trp Gly Lys 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Leu Pro Ile Glu His Pro Ala Trp Asp Leu Glu Ala 195 200 205 Phe Tyr Ile Ala His Ala Leu Val Asn Tyr Ile Leu Ile Leu Ser Pro 210 215 220 Glu Lys Ile Ile Leu Gly Gly Glu Val Met Lys Tyr Lys Gln Leu Leu 225 230 235 240 Pro Ile Val Lys Lys Ala Val Ile Lys Leu Leu Asn Gly Tyr Ile Gln 245 250 255 Thr Asn Gln Ile Phe Arg Glu Ile Asp Asp Tyr Ile Val Leu Pro Asp 260 265 270 Leu Gly Glu Asn Ser Gly Phe Phe Gly Ala Ala Ala Leu Cys Ile Lys 275 280 285 Asn Phe Lys 290 <210> 77 <211> 307 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 77 Met Asn Gly Lys Ile Trp Val Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Leu Leu 1 5 10 15 Pro Asp Gly Glu Gly Arg Leu Leu Gln Cys Pro Gly Gly Ala Pro Ala 20 25 30 Asn Val Ala Val Gly Val Ala Arg Leu Gly Gly Asp Ser Gly Phe Ile 35 40 45 Gly Arg Val Gly Asp Asp Pro Phe Gly Arg Phe Met Arg His Thr Leu 50 55 60 Ala Gln Glu Gln Val Asp Val Asn Tyr Met Arg Leu Asp Ala Ala Gln 65 70 75 80 Arg Thr Ser Thr Val Val Val Asp Leu Asp Ser His Gly Glu Arg Thr 85 90 95 Phe Thr Phe Met Val Arg Pro Ser Ala Asp Leu Phe Leu Gln Pro Glu 100 105 110 Asp Leu Pro Pro Phe Ala Ala Gly Gln Trp Leu His Val Cys Ser Ile 115 120 125 Ala Leu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Ser Thr Thr Phe Ala Ala Leu Glu 130 135 140 Ala Ile Lys Arg Ala Gly Gly Tyr Val Ser Phe Asp Pro Asn Ile Arg 145 150 155 160 Ser Asp Leu Trp Gln Asp Pro Gln Asp Leu Arg Asp Cys Leu Asp Arg 165 170 175 Ala Leu Ala Leu Ala Asp Ala Ile Lys Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ala 180 185 190 Phe Ile Ser Gly Ser Asp Asp Ile Val Ser Gly Ile Ala Arg Leu Asn 195 200 205 Ala Arg Phe Gln Pro Thr Leu Leu Leu Val Thr Gln Gly Lys Ala Gly 210 215 220 Val Gln Ala Ala Leu Arg Gly Gln Val Ser His Phe Pro Ala Arg Pro 225 230 235 240 Val Val Ala Val Asp Thr Thr Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Ala Gly 245 250 255 Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ala His Gly Ile Pro Asp Asn Leu Ala Ala 260 265 270 Leu Ala Pro Asp Leu Ala Leu Ala Gln Thr Cys Gly Ala Leu Ala Thr 275 280 285 Thr Ala Lys Gly Ala Met Thr Ala Leu Pro Tyr Lys Asp Asp Leu Gln 290 295 300 Arg Ser Leu 305 <210> 78 <211> 290 <212> PRT <213> Lactococcus lactis subsp. cremoris <400> 78 Met Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Ile Glu Ala Gly Gly Thr Lys Phe Val 1 5 10 15 Leu Ala Ile Ala Asp Glu His Phe Asn Ile Ile Lys Lys Phe Lys Phe 20 25 30 Ala Thr Thr Thr Pro Gln Glu Thr Ile Ser Lys Thr Ile Lys Tyr Phe 35 40 45 Lys Glu Asn Arg Val Ser Ala Ile Gly Leu Gly Ser Phe Gly Pro Ile 50 55 60 Asp Leu Asn Leu Ser Ser Lys Thr Tyr Gly Tyr Ile Thr Ser Thr Pro 65 70 75 80 Lys Val Gly Trp Lys Asn Ile Asn Leu Val Gly Gln Leu Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Asp Ile Pro Ile Tyr Phe Thr Thr Asp Val Asn Ala Ser Ala Tyr 100 105 110 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Gly Arg Leu Gly Ile Pro Thr Ala Phe 35 40 45 Phe Thr Gly Ile Ala Asp Asp Met Met Gly Glu Ile Leu Leu Glu Thr 50 55 60 Leu Lys Ala Ser Asn Val Asp Tyr Ser Pro Cys Ala Ile Thr Pro Arg 65 70 75 80 Pro Ser Thr Ile Ala Phe Val Lys Leu Val Asn Gly Gln Ala Thr Tyr 85 90 95 Ala Phe Tyr Asp Glu Gly Thr Ala Gly Arg Met Ile Thr Thr Ala Asp 100 105 110 Leu Pro Asp Leu Gly Asp Asp Cys Glu Ala Leu His Phe Gly Ala Ile 115 120 125 Ser Leu Ile Pro Ser Pro Cys Gly Glu Thr Tyr Glu Ala Leu Leu Asp 130 135 140 Arg Glu Ala Ala Ser Arg Val Ile Ser Leu Asp Pro Asn Ile Arg Pro 145 150 155 160 Gly Phe Ile Lys Asp Lys Pro Ser His Met Ala Arg Ile Lys Arg Met 165 170 175 Ala Ala Lys Ser Asp Ile Val Lys Phe Ser Asp Glu Asp Leu Asp Trp 180 185 190 Phe Gly Leu Gln Gly Asp His Asp Ala Leu Ala Ala His Trp Leu Asn 195 200 205 His Gly Ala Lys Leu Val Val Ile Thr Lys Gly Ala Glu Gly Ala Ser 210 215 220 Gly Tyr Thr Lys Asp Arg Lys Val Thr Val Pro Ser Glu Arg Val Thr 225 230 235 240 Val Val Asp Thr Val Gly Ala Gly Asp Thr Phe Asp Ala Gly Ile Leu 245 250 255 Ala Ser Leu Lys Met Asp Asn Leu Leu Thr Lys Arg Gln Val Ala Ser 260 265 270 Leu Asp Glu Gln Ala Leu Arg Asn Gly Pro Asp Pro Arg Arg Gln Ser 275 280 285 Arg Arg Arg His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Gln Ser Thr Leu Gly Ala 290 295 300 Arg Asp Trp Ser Leu Arg Leu Glu Gln Asp Ser Asp Pro His Pro Pro 305 310 315 320 Asp Asp Thr Phe Ser Pro 325 <210> 82 <211> 221 <212> PRT <213> Salmonella thompson <400> 82 Val Asp Leu Asp Asp Gln Gly Glu Arg Thr Phe Thr Phe Met Val Arg 1 5 10 15 Pro Ser Ala Asp Leu Phe Leu Val Glu Glu Asp Leu Pro Gln Phe Ala 20 25 30 Ala Gly Gln Trp Leu His Val Cys Ser Ile Ala Leu Ser Ala Glu Pro 35 40 45 Ser Arg Ser Thr Thr Phe Ala Ala Met Glu Ser Ile Arg Ser Ala Gly 50 55 60 Gly Arg Val Ser Phe Asp Pro Asn Ile Arg Pro Asp Leu Trp Gln Asp 65 70 75 80 Gln Ala Leu Leu Leu Ala Cys Leu Asp Arg Ala Leu His Met Ala Asn 85 90 95 Val Val Lys Leu Ser Glu Glu Glu Leu Val Phe Ile Ser Ser Ser Asn 100 105 110 Asp Leu Ala Tyr Gly Ile Ala Ser Val Thr Glu 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Met Val Arg Pro Ser Ala Asp Leu Phe Leu Val Glu Glu 100 105 110 Asp Leu Pro Gln Phe Ala Ala Gly Gln Trp Leu His Val Cys Ser Ile 115 120 125 Ala Leu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Ser Thr Thr Phe Ala Ala Met Glu 130 135 140 Ser Ile Arg Ser Ala Gly Gly Arg Val Ser Phe Asp Pro Asn Ile Arg 145 150 155 160 Pro Asp Leu Trp Gln Asp Gln Ala Leu Leu Leu Ala Cys Leu Asp Arg 165 170 175 Ala Leu His Met Ala Asn Val Val Lys Leu Ser Glu Glu Glu Leu Val 180 185 190 Phe Ile Ser Ser Ser Asn Asp Leu Ala Tyr Gly Ile Ala Ser Val Thr 195 200 205 Glu Arg Tyr Gln Pro Glu Leu Leu Leu Val Thr Arg Gly Lys Ala Gly 210 215 220 Val Leu Ala Ala Phe Gln Gln Lys Phe Thr His Phe Asn Ala Arg Pro 225 230 235 240 Val Ala Ser Val Asp Thr Thr Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Ala Gly 245 250 255 Leu Leu Ala Ser Leu Ala Ala Asn Gly Met Pro Thr Asp Met Thr Ala 260 265 270 Leu Glu Pro Thr Leu Thr Leu Ala Gln Thr Cys Gly Ala Leu Ala Thr 275 280 285 Thr Ala Lys Gly Ala Met Thr Ala Leu Pro Tyr Gln Arg Asp Leu Asn 290 295 300 Arg Gln Phe 305 <210> 84 <211> 293 <212> PRT <213> Streptococcus mutans serotype c <400> 84 Met Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ile Glu Ala Gly Gly Thr Lys Phe Val 1 5 10 15 Cys Ala Val Gly Asp Glu Asn Phe Gln Ile Leu Glu Lys Val Gln Phe 20 25 30 Pro Thr Thr Thr Pro Tyr Glu Thr Ile Glu Lys Thr Val Ala Phe Phe 35 40 45 Lys Lys Phe Glu Ala Asp Leu Ala Ser Val Ala Ile Gly Ser Phe Gly 50 55 60 Pro Ile Asp Ile Asp Gln Asn Ser Asp Thr Tyr Gly Tyr Ile Thr Ser 65 70 75 80 Thr Pro Lys Pro Asn Trp Ala Asn Val Asp Phe Val Gly Leu Ile Ser 85 90 95 Lys Asp Phe Lys Ile Pro Phe Tyr Phe Thr Thr Asp Val Asn Ser Ser 100 105 110 Ala Tyr Gly Glu Thr Ile Ala Arg Ser Asn Val Lys Ser Leu Val Tyr 115 120 125 Tyr Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Ala Gly Thr Ile Gln Asn Gly Glu 130 135 140 Phe Ile Gly Gly Met Gly His Thr Glu Ala Gly His Val Tyr Met Ala 145 150 155 160 Pro His Pro Asn Asp Val His His Gly Phe Val Gly Thr Cys Pro Phe 165 170 175 His Lys Gly Cys Leu Glu Gly Leu Ala Ala Gly Pro Ser Leu Glu Ala 180 185 190 Arg Thr Gly Ile Arg Gly Glu Leu Ile Glu Gln Asn Ser Glu Val Trp 195 200 205 Asp Ile Gln Ala Tyr Tyr Ile Ala Gln Ala Ala Ile Gln Ala Thr Val 210 215 220 Leu Tyr Arg Pro Gln Val Ile Val Phe Gly Gly Gly Val Met Ala Gln 225 230 235 240 Glu His Met Leu Asn Arg Val Arg Glu Lys Phe Thr Ser Leu Leu Asn 245 250 255 Asp Tyr Leu Pro Val Pro Asp Val Lys Asp Tyr Ile Val Thr Pro Ala 260 265 270 Val Ala Glu Asn Gly Ser Ala Thr Leu Gly Asn Leu Ala Leu Ala Lys 275 280 285 Lys Ile Ala Ala Arg 290 <210> 85 <211> 307 <212> PRT <213> Vibrio alginolyticus <400> 85 Met Asn Gln Val Trp Val Thr Gly Asp Ala Val Val Asp Leu Ile Pro 1 5 10 15 Glu Ser Glu Thr Ser Leu Leu Lys Cys Pro Gly Gly Ala Pro Ala Asn 20 25 30 Val Ala Val Ala Ile Ala Arg Leu Ser Gly Lys Ser Ala Phe Phe Gly 35 40 45 Arg Val Gly Asp Asp Pro Phe Gly Arg Phe Met Gln Ser Ile Leu Asp 50 55 60 Gln Glu Gly Val Cys Thr Glu Phe Leu Ile Lys Asp Pro Glu Gln Arg 65 70 75 80 Thr Ser Thr Val Val Val Asp Leu Asp Asp Gln Gly Glu Arg Ser Phe 85 90 95 Thr Phe Met Val Lys Pro Ser Ala Asp Gln Phe Met Ser Val Glu Asp 100 105 110 Met Gly Asn Phe Lys Gln Gly Asp Trp Leu His Val Cys Ser Ile Ser 115 120 125 Leu Ala Asn Glu Pro Ser Arg Ser Ser Thr Phe Glu Ala Ile Lys Arg 130 135 140 Ala Lys Ala Ala Gly Gly Phe Ile Ser Phe Asp Pro Asn Leu Arg Asp 145 150 155 160 Glu Val Trp Gln Asp Gln Ser Glu Ile Gln Ala Val Val Met Lys Ala 165 170 175 Val Ala Met Ala Asp Val Val Lys Phe Ser Glu Glu Glu Leu Leu Phe 180 185 190 Leu Thr Asp Ser Thr Ser Met Ala Gln Gly Leu Gln Gln Ile Ala Ala 195 200 205 Met Asn Ile Ala Leu Val Leu Val Thr Gln Gly Ala Lys Gly Val Trp 210 215 220 Arg Val Phe Glu Ser Gln Ser Glu Leu Ile Thr Gly Gln Val Val Ser 225 230 235 240 Pro Ile Asp Thr Thr Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Gly Gly Leu Leu 245 250 255 Ala Cys Leu Ser Arg His Ala Asp Trp Lys Asn His Pro Val Val Ser 260 265 270 Ser Ala Ile Gln Trp Ala Asn Gly Cys Gly Ala Leu Ala Thr Thr Gln 275 280 285 Lys Gly Ala Met Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Glu Leu Leu Arg Phe 290 295 300 Ile Gly Gln 305 <210> 86 <211> 301 <212> PRT <213> Zymomonas mobilis subsp. mobilis <400> 86 Met Lys Asn Asp Lys Lys Ile Tyr Gly Cys Ile Glu Gly Gly Gly Thr 1 5 10 15 Lys Phe Met Leu Ala Leu Ile Asp Ser Asp Arg Lys Met Leu Ala Val 20 25 30 Glu Arg Val Pro Thr Thr Thr Pro Glu Glu Thr Leu Gly Lys Ser Val 35 40 45 Glu Phe Phe Lys Lys Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Asp Ser Phe Ala Ser 50 55 60 Phe Gly Ile Ala Ser Phe Gly Pro Leu Cys Leu Asp Arg Lys Ser Pro 65 70 75 80 Lys Trp Gly Tyr Ile Thr Asn Thr Pro Lys Pro Phe Trp Pro Asn Thr 85 90 95 Asp Val Val Thr Pro Phe Lys Glu Ala Phe Gly Cys Pro Val Glu Ile 100 105 110 Asp Thr Asp Val Asn Gly Ala Ala Leu Ala Glu Asn Phe Trp Gly Ala 115 120 125 Ser Lys Gly Thr His Thr Ser Val Tyr Val Thr Val Gly Thr Gly Phe 130 135 140 Gly Gly Gly Val Leu Ile Asp Gly Lys Pro Ile His Gly Leu Ala His 145 150 155 160 Pro Glu Met Gly His Gly Ile Pro Ile Arg His Pro Asp Asp Arg Asp 165 170 175 Phe Glu Gly Cys Cys Pro Tyr His Gly Gly Cys Tyr Glu Gly Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Thr Ala Ile Arg Lys Arg Trp Gly Lys Ala Leu Asn Glu Met 195 200 205 Glu Pro Ala Glu Phe Glu Lys Ala Arg Glu Ile Ile Ala Phe Tyr Leu 210 215 220 Ala His Phe Asn Val Thr Leu Gln Ala Phe Ile Ser Pro Glu Arg Ile 225 230 235 240 Val Phe Gly Gly Gly Val Met His Val Asp Gly Met Leu Ala Ser Val 245 250 255 Arg Arg Gln Thr Ala Glu Ile Ala Asn Ser Tyr Phe Glu Gly Ala Asp 260 265 270 Phe Glu Lys Ile Ile Val Leu Pro Gly Leu Gly Asp Gln Ala Gly Met 275 280 285 Met Gly Ala Phe Ala Leu Ala Leu Ala Ala Glu Asn Lys 290 295 300 <210> 87 <211> 484 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 87 Met Val His Leu Gly Pro Lys Pro Ala Gln Lys Arg Lys Gly Thr Phe 1 5 10 15 Thr Asp Val Ser Pro Gln Leu Leu Glu Ala Leu Lys Pro Ile Gln Glu 20 25 30 Gln Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Leu Arg Ala Ile Val Lys His Phe 35 40 45 Ile Ser Glu Leu Asp Arg Gly Leu Ser Lys Ala Gly Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Met Ile Pro Gly Trp Val Met Asp Phe Pro Thr Gly Lys Glu Thr Gly 65 70 75 80 Ser Tyr Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu 85 90 95 Val Lys Leu Gly Gly Asn Arg Asp Phe Asp Thr Thr Gln Ser Lys Phe 100 105 110 Ala Leu Pro Ala His Met Arg Thr Ala Thr Ser Asp Glu Leu Trp Asp 115 120 125 Phe Ile Ala Lys Cys Leu Lys Glu Phe Val Asp Glu Ile Tyr Pro Asp 130 135 140 Gly Cys Ser Glu Pro Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro Ala 145 150 155 160 Ser Gln Asn Arg Ile Asn Glu Gly Ile Leu Gln Arg Trp Thr Lys Gly 165 170 175 Trp Ser Ile Asp Gly Ile Glu Gly Lys Asp Val Val Pro Met Leu Gln 180 185 190 Lys Ala Ile Lys Lys Val Gly Val Pro Ile Asp Val Val Ala Leu Ile 195 200 205 Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Val Ala Ser Met Tyr Thr Asp Pro Glu 210 215 220 Ala Lys Met Gly Leu Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Gly Ala Tyr Phe 225 230 235 240 Asp Val Val Lys Asp Ile Pro Lys Leu Glu Gly Lys Cys Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Pro Pro Glu Ser Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ser Phe 260 265 270 Asp Asn Glu Lys Tyr Ile Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Val Gln Ile 275 280 285 Asp Glu Glu Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Thr Phe Glu Lys Met Ile 290 295 300 Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Val Leu Arg Leu Ile Leu Leu Glu Phe 305 310 315 320 Ala Glu Glu Lys Lys Leu Ile Phe Lys Gly Gln Asn Leu Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Val Pro Tyr Val Met Asp Ala Ser Tyr Pro Ser Lys Ile Glu Glu 340 345 350 Asp Pro Phe Glu Asn Leu Ser Asp Val Ala Asp Leu Phe Arg Glu Lys 355 360 365 Leu Gly Ile Glu Thr Thr Glu Pro Glu Arg Lys Ile Ile Arg Cys Leu 370 375 380 Ala Glu Leu Ile Gly Glu Arg Ser Ala Arg Phe Ser Val Cys Gly Ile 385 390 395 400 Ala Ala Ile Cys Gln Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Ala His Cys Ala Ala 405 410 415 Asp Gly Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro Gly Phe Lys Glu Arg Thr Ala 420 425 430 Gln Ala Leu Arg Asp Ile Tyr Glu Trp Pro Ala Asp Val Lys Asp Pro 435 440 445 Ile Ile Ile Val Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Val Gly Ala Ala Val 450 455 460 Ile Ala Ala Leu Thr Glu Lys Arg Leu Lys Glu Gly Lys Ser Val Gly 465 470 475 480 Leu Leu Gly Ala <210> 88 <211> 490 <212> PRT <213> Emericella nidulans <400> 88 Met Val Gly Val Gly Pro Lys Arg Pro Pro Ser Arg Lys Gly Ser Met 1 5 10 15 Ser Asp Val Pro Gln Asn Leu Leu Glu His Ile Lys His Phe Glu Glu 20 25 30 Ile Phe Thr Val Asp Thr Ala Thr Leu Lys Lys Ile Val Asp His Phe 35 40 45 Val Asn Glu Leu Thr Lys Gly Leu Ser Val Glu Gly Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Met Asn Val Thr Trp Val Leu Gly Phe Pro Asp Gly Lys Glu Thr Gly 65 70 75 80 Thr Phe Leu Ala Leu Asp Met Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Cys Glu 85 90 95 Ile Thr Leu Thr Glu Glu Lys Gly Gly Phe Asp Ile Ile Gln Ser Lys 100 105 110 Tyr Arg Met Pro Glu Glu Leu Lys Thr Gly Glu Ala Glu Glu Leu Trp 115 120 125 Gln Tyr Ile Val Asp Cys Val Glu Gln Phe Ile Gln Phe His His Glu 130 135 140 Asn Glu Asn Leu Ser Lys Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Thr Gln Asp Tyr Ile Asp His Gly Val Leu Gln Arg Trp Thr Lys 165 170 175 Gly Phe Asp Ile Asp Gly Val Glu Gly Lys Asp Val Val Pro Pro Leu 180 185 190 Glu Lys Val Phe Lys Glu Arg Gly Leu Pro Ile Lys Val Ala Ala Leu 195 200 205 Ile Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Ile Ala Ser Ser Tyr Thr Asp Pro 210 215 220 Ala Met Lys Ile Gly Cys Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Ala Ala Tyr 225 230 235 240 Met Glu Asn Ala Gly Ser Ile Pro Lys Leu Ala His Met Asn Leu Pro 245 250 255 Pro Asp Met Pro Val Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ala Phe Asp Asn 260 265 270 Glu His Ile Val Leu Pro Leu Thr Lys Tyr Asp His Ile Ile Asp Arg 275 280 285 Asp Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ala Phe Glu Lys Met Thr Ala Gly 290 295 300 Leu Tyr Leu Gly Glu Ile Phe Arg Leu Ala Leu Val Asp Ile Leu Asp 305 310 315 320 Thr Gln Pro Gly Leu Ile Phe Lys Asp Gln Asp Thr Ser Gln Leu Arg 325 330 335 Ile Pro Tyr Leu Leu Asp Ser Ser Phe Pro Ala Ala Ile Glu Glu Asp 340 345 350 Pro Tyr Glu Asn Leu Ile Glu Thr Ala Glu Leu Val Gln Asn Met Leu 355 360 365 Lys Ile Lys Ala Thr Arg Ser Glu Leu Glu Leu Met Arg Arg Leu Ala 370 375 380 Glu Leu Ile Gly Thr Arg Ala Ala Arg Leu Ser Ala Cys Gly Val Ala 385 390 395 400 Ala Ile Cys Lys Lys Lys Asn Ile Glu Ser Cys His Val Gly Ala Asp 405 410 415 Gly Ser Val Phe Thr Lys Tyr Pro His Phe Lys Ala Arg Gly Ala Gln 420 425 430 Ala Leu Arg Glu Ile Leu Asp Trp Ala Pro Ser Glu Lys Asp Lys Val 435 440 445 Thr Ile His Ala Ala Glu Asp Gly Ser Gly Val Gly Ala Ala Leu Ile 450 455 460 Ala Ala Leu Thr Leu Lys Arg Val Lys Ala Gly Asn Thr Ala Gly Ile 465 470 475 480 Arg Asp Ala Gln Ala Met Leu Ala Met Cys 485 490 <210> 89 <211> 485 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 89 Met Val Arg Leu Gly Pro Lys Lys Pro Pro Ala Arg Lys Gly Ser Met 1 5 10 15 Ala Asp Val Pro Ala Asn Leu Met Glu Gln Ile His Gly Leu Glu Thr 20 25 30 Leu Phe Thr Val Ser Ser Glu Lys Met Arg Ser Ile Val Lys His Phe 35 40 45 Ile Ser Glu Leu Asp Lys Gly Leu Ser Lys Lys Gly Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Met Ile Pro Gly Trp Val Val Glu Tyr Pro Thr Gly Lys Glu Thr Gly 65 70 75 80 Asp Phe Leu Ala Leu Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu 85 90 95 Val Lys Leu Gly Gly Asn His Asp Phe Asp Thr Thr Gln Asn Lys Tyr 100 105 110 Arg Leu Pro Asp His Leu Arg Thr Gly Thr Ser Glu Gln Leu Trp Ser 115 120 125 Phe Ile Ala Lys Cys Leu Lys Glu Phe Val Asp Glu Trp Tyr Pro Asp 130 135 140 Gly Val Ser Glu Pro Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro Ala 145 150 155 160 Ser Gln Lys Lys Ile Asn Ser Gly Val Leu Gln Arg Trp Thr Lys Gly 165 170 175 Phe Asp Ile Glu Gly Val Glu Gly His Asp Val Val Pro Met Leu Gln 180 185 190 Glu Gln Ile Glu Lys Leu Asn Ile Pro Ile Asn Val Val Ala Leu Ile 195 200 205 Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Val Ala Ser Leu Tyr Thr Asp Pro Gln 210 215 220 Thr Lys Met Gly Ile Ile Ile Gly Thr Gly Val Asn Gly Ala Tyr Tyr 225 230 235 240 Asp Val Val Ser Gly Ile Glu Lys Leu Glu Gly Leu Leu Pro Glu Asp 245 250 255 Ile Gly Pro Asp Ser Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ser Phe 260 265 270 Asp Asn Glu His Leu Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Val Ile Ile 275 280 285 Asp Glu Glu Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ala Phe Glu Lys Met Thr 290 295 300 Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Ile Met Arg Leu Val Leu Leu Asp Leu 305 310 315 320 Tyr Asp Ser Gly Phe Ile Phe Lys Asp Gln Asp Ile Ser Lys Leu Lys 325 330 335 Glu Ala Tyr Val Met Asp Thr Ser Tyr Pro Ser Lys Ile Glu Asp Asp 340 345 350 Pro Phe Glu Asn Leu Glu Asp Thr Asp Asp Leu Phe Lys Thr Asn Leu 355 360 365 Asn Ile Glu Thr Thr Val Val Glu Arg Lys Leu Ile Arg Lys Leu Ala 370 375 380 Glu Leu Val Gly Thr Arg Ala Ala Arg Leu Thr Val Cys Gly Val Ser 385 390 395 400 Ala Ile Cys Asp Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Ala His Ile Ala Ala Asp 405 410 415 Gly Ser Val Phe Asn Arg Tyr Pro Gly Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Gln 420 425 430 Ala Leu Lys Asp Ile Tyr Asn Trp Asp Val Glu Lys Met Glu Asp His 435 440 445 Pro Ile Gln Leu Val Ala Ala Glu Asp Gly Ser Gly Val Gly Ala Ala 450 455 460 Ile Ile Ala Cys Leu Thr Gln Lys Arg Leu Ala Ala Gly Lys Ser Val 465 470 475 480 Gly Ile Lys Gly Glu 485 <210> 90 <211> 549 <212> PRT <213> Neosartorya fumigata <400> 90 Met Thr Ala Pro Leu Val Lys Val Leu His Arg Met Gln Glu Leu Phe 1 5 10 15 Ser Asn Ile Val Ala Ala Leu Glu Ala Met Ile Val Phe Pro Ser Leu 20 25 30 Phe Arg Asp Pro Ser Arg Lys Arg Arg Lys Thr Phe His Gly Ala Tyr 35 40 45 Trp Arg Arg Arg Thr Leu Asp Asn Phe Ala Glu Glu Val Asp Arg Leu 50 55 60 Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Arg Asn Met Ile Ile Met Ser Glu Lys 65 70 75 80 Ile Arg Glu Gln Phe Lys Ser Cys Leu Gln Ser Ser Pro Val Cys Met 85 90 95 Leu Pro Ser Tyr Asn His Ala Leu Pro Ser Gly Thr Glu Lys Gly Thr 100 105 110 Tyr Leu Ala Leu Asp Val Gly Gly Ser Thr Phe Arg Val Ala Leu Ile 115 120 125 Glu Leu Gly Gly Ala Gly Ala Met Lys Ile Leu Gln Glu Ser Ser Ser 130 135 140 Pro Ile Asp Asn Asp Val Lys Leu Leu Glu Gly Thr Leu Phe Phe Asp 145 150 155 160 Trp Met Ala Glu Lys Ile Glu Ser Met Leu Ser Ala Val Gly Ala Asp 165 170 175 Tyr Gly Arg Glu Ala Val Pro Leu Ser Met Gly Leu Ser Trp Ser Phe 180 185 190 Pro Ile Glu Gln Thr Ser Ile Ser Ser Gly Leu Val Ile His Met Gly 195 200 205 Lys Gly Phe Leu Cys Ser Asn Gly Thr Leu Gly Gln Glu Leu Gly Asp 210 215 220 Leu Ile Val Gln Ser Cys Arg Arg Arg Ser Leu Asn Val Arg Val Asp 225 230 235 240 Ala Ile Val Asn Asp Ser Ser Ala Ala Leu Leu Ser Arg Ala Tyr Val 245 250 255 Asp Pro Lys Thr Arg Met Ser Leu Ile Leu Gly Thr Gly Thr Asn Val 260 265 270 Ala Val His Phe Pro Val Arg Glu Ile Gly Leu Thr Lys Phe Gly Thr 275 280 285 Arg Pro Pro Gly Trp Phe Asp Tyr Ala Lys His Val Ile Ile Asn Ser 290 295 300 Glu Leu Ser Met Phe Gly Gly Gly Ile Leu Pro Met Thr Arg Trp Asp 305 310 315 320 Asp Ile Leu Asn Gln Thr His Leu Arg Pro Asp Tyr Gln Pro Leu Glu 325 330 335 Tyr Met Val Thr Gly Arg Tyr Leu Gly Glu Ile Val Arg Leu Ile Ile 340 345 350 Thr Glu Ala Val Glu Thr Ala Asn Leu Phe Arg Gly Glu Leu Pro His 355 360 365 Ser Met Arg Asp Pro Tyr Ser Phe Asp Thr Ser Ile Val Ala Phe Leu 370 375 380 Glu Ala Asp Thr Ser Pro Ser Leu Val Pro Ser Ala Ala Leu Leu Gln 385 390 395 400 Lys Glu His Thr Phe Pro Val Ser Pro Ser Val Glu Asp Leu Arg Phe 405 410 415 Leu Arg Arg Ile Cys Gln Ile Val Ser Lys Arg Ala Ala Gly Tyr Leu 420 425 430 Ala Thr Ala Ile His Ser Met Trp Cys Leu Arg Asn Asp Ala Glu Phe 435 440 445 Ser Asp Pro Thr Glu Ser Lys Ala Ser Ser Val Lys Asp Thr Gln Glu 450 455 460 Ile Thr Ile Val Glu Ser Glu Glu Asp Ser Arg Ser Leu Ser Ile Ala 465 470 475 480 Cys Asp Gly Ser Val Ile Asn Lys Tyr Pro Gly Phe Arg Asp Arg Cys 485 490 495 Gln Gly Tyr Leu Asn Gln Leu Thr Gln Gln Thr Asn Ser Ser Gln Gly 500 505 510 Pro Leu Asp Pro Ala Thr Ser Pro Tyr Ile Arg Leu Glu Leu Ala Pro 515 520 525 Glu Ser Ala Ile Leu Gly Ala Ala Val Ala Val Ala Val Ala Val Glu 530 535 540 Asp Gln Lys Ser Gly 545 <210> 91 <211> 485 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 91 Met Val His Leu Gly Pro Lys Lys Pro Gln Ala Arg Lys Gly Ser Met 1 5 10 15 Ala Asp Val Pro Lys Glu Leu Met Asp Glu Ile His Gln Leu Glu Asp 20 25 30 Met Phe Thr Val Asp Ser Glu Thr Leu Arg Lys Val Val Lys His Phe 35 40 45 Ile Asp Glu Leu Asn Lys Gly Leu Thr Lys Lys Gly Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Met Ile Pro Gly Trp Val Met Glu Phe Pro Thr Gly Lys Glu Ser Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu 85 90 95 Val Lys Leu Ser Gly Asn His Thr Phe Asp Thr Thr Gln Ser Lys Tyr 100 105 110 Lys Leu Pro His Asp Met Arg Thr Thr Lys His Gln Glu Glu Leu Trp 115 120 125 Ser Phe Ile Ala Asp Ser Leu Lys Asp Phe Met Val Glu Gln Glu Leu 130 135 140 Leu Asn Thr Lys Asp Thr Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asn Lys Ile Asn Glu Gly Ile Leu Gln Arg Trp Thr Lys 165 170 175 Gly Phe Asp Ile Pro Asn Val Glu Gly His Asp Val Val Pro Leu Leu 180 185 190 Gln Asn Glu Ile Ser Lys Arg Glu Leu Pro Ile Glu Ile Val Ala Leu 195 200 205 Ile Asn Asp Thr Val Gly Thr Leu Ile Ala Ser Tyr Tyr Thr Asp Pro 210 215 220 Glu Thr Lys Met Gly Val Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Gly Ala Phe 225 230 235 240 Tyr Asp Val Val Ser Asp Ile Glu Lys Leu Glu Gly Lys Leu Ala Asp 245 250 255 Asp Ile Pro Ser Asn Ser Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ser 260 265 270 Phe Asp Asn Glu His Leu Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Val Ala 275 280 285 Val Asp Glu Gln Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ala Phe Glu Lys Met 290 295 300 Thr Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Leu Leu Arg Leu Val Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asn Glu Lys Gly Leu Met Leu Lys Asp Gln Asp Leu Ser Lys Leu 325 330 335 Lys Gln Pro Tyr Ile Met Asp Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Ile Glu Asp 340 345 350 Asp Pro Phe Glu Asn Leu Glu Asp Thr Asp Asp Ile Phe Gln Lys Asp 355 360 365 Phe Gly Val Lys Thr Thr Leu Pro Glu Arg Lys Leu Ile Arg Arg Leu 370 375 380 Cys Glu Leu Ile Gly Thr Arg Ala Ala Arg Leu Ala Val Cys Gly Ile 385 390 395 400 Ala Ala Ile Cys Gln Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Gly His Ile Ala Ala 405 410 415 Asp Gly Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro Gly Phe Lys Glu Ala Ala Ala 420 425 430 Lys Gly Leu Arg Asp Ile Tyr Gly Trp Thr Gly Asp Ala Ser Lys Asp 435 440 445 Pro Ile Thr Ile Val Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ala 450 455 460 Val Ile Ala Ala Leu Ser Glu Lys Arg Ile Ala Glu Gly Lys Ser Leu 465 470 475 480 Gly Ile Ile Gly Ala 485 <210> 92 <211> 484 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 92 Met Ser Leu His Asp Ala Tyr His Trp Pro Ser Arg Thr Pro Ser Arg 1 5 10 15 Lys Gly Ser Asn Ile Lys Leu Asn Lys Thr Leu Gln Asp His Leu Asp 20 25 30 Glu Leu Glu Glu Gln Phe Thr Ile Pro Thr Glu Leu Leu His Arg Val 35 40 45 Thr Asp Arg Phe Val Ser Glu Leu Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Asn Pro 50 55 60 Gly Asp Val Pro Met Val Pro Thr Trp Ile Ile Gly Thr Pro Asp Gly 65 70 75 80 Asn Glu His Gly Ser Tyr Leu Ala Leu Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu 85 90 95 Arg Val Cys Ala Val Glu Val Gln Gly Asn Gly Lys Phe Asp Ile Thr 100 105 110 Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Pro Gln Glu Leu Lys Val Gly Thr Arg Glu 115 120 125 Ala Leu Phe Asp Tyr Ile Ala Asp Cys Ile Lys Lys Phe Val Glu Glu 130 135 140 Val His Pro Gly Lys Ser Gln Asn Leu Glu Ile Gly Phe Thr Phe Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Cys Val Gln Arg Ser Ile Asn Asp Ala Ser Leu Val Ala Trp 165 170 175 Thr Lys Gly Phe Asp Ile Asp Gly Val Glu Gly Glu Ser Val Gly Pro 180 185 190 Leu Leu Ser Ala Ala Leu Lys Arg Val Gly Cys Asn Asn Val Arg Leu 195 200 205 Asn Ala Ile Leu Ser Asp Thr Thr Gly Thr Leu Val Ala Ser Asn Tyr 210 215 220 Ala Ser Pro Gly Thr Glu Ile Gly Val Ile Phe Gly Thr Gly Cys Asn 225 230 235 240 Ala Cys Tyr Ile Glu Lys Phe Ser Glu Ile Pro Lys Leu His Lys Tyr 245 250 255 Asp Phe Pro Glu Asp Met Asn Met Ile Ile Asn Cys Glu Trp Cys Asp 260 265 270 Phe Asp Asn Gln His Val Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Val Ala 275 280 285 Ile Asp Glu Glu Ser Pro Arg Pro Gly Leu Gln Thr Tyr Glu Lys Met 290 295 300 Ile Ala Gly Cys Tyr Leu Gly Asp Ile Leu Arg Arg Ile Leu Leu Asp 305 310 315 320 Leu Tyr Glu Gln Gly Ala Leu Phe Asn Gly Gln Asp Val Thr Lys Ile 325 330 335 Arg Asp Pro Leu Ala Met Asp Thr Ser Val Leu Ser Ala Ile Glu Val 340 345 350 Asp Pro Phe Glu Asn Leu Asp Glu Thr Gln Thr Leu Phe Glu Glu Thr 355 360 365 Tyr Gly Leu Lys Thr Thr Glu Glu Glu Arg Gln Phe Ile Arg Arg Ala 370 375 380 Cys Glu Leu Ile Gly Thr Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Cys Gly Val 385 390 395 400 Cys Ala Leu Val Arg Lys Met Asn Lys Pro Ser Met Ile Val Gly Thr 405 410 415 Asp Gly Ser Val Tyr Asn Leu Tyr Pro Arg Phe Lys Asp Arg Leu Ala 420 425 430 Gln Ala Phe Lys Asp Ile Leu Gly Glu Glu Ile Gly Ser Lys Val Val 435 440 445 Thr Ile Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Val Gly Ala Ala Leu Val Ser 450 455 460 Ala Leu Glu Ala Lys Gly Lys Ala Leu Thr Ser Asp Ile Leu Ala Glu 465 470 475 480 His Leu Lys Asn <210> 93 <211> 478 <212> PRT <213> Schwanniomyces occidentalis <400> 93 Met Val His Leu Gly Pro Lys Pro Pro Gln His Arg Lys Gly Ser Phe 1 5 10 15 Leu Asp Val Pro Glu Tyr Leu Leu Lys Glu Leu Thr Glu Leu Glu Gly 20 25 30 Leu Leu Thr Val Ser Gly Glu Thr Leu Arg Lys Ile Thr Asp His Phe 35 40 45 Ile Ser Glu Leu Glu Lys Gly Leu Ser Lys Gln Gly Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Met Ile Pro Gly Trp Val Met Asp Phe Pro Thr Gly Lys Glu Met Gly 65 70 75 80 Asp Tyr Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu 85 90 95 Val Lys Leu Gly Gly Asn Arg Asp Phe Asp Thr Thr Gln Ser Lys Phe 100 105 110 Ala Leu Pro Glu Asn Met Arg Thr Ala Lys Ser Glu Glu Leu Trp Glu 115 120 125 Phe Ile Ala Glu Cys Leu Gln Lys Phe Val Glu Glu Glu Phe Arg Asn 130 135 140 Gly Val Leu Ser Asn Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro Ala 145 150 155 160 Ser Gln Gly Ser Ile Asn Glu Gly Tyr Leu Gln Arg Trp Thr Lys Gly 165 170 175 Phe Asp Ile Glu Gly Val Glu Gly His Asp Val Val Pro Met Leu Gln 180 185 190 Ala Ala Ile Glu Lys Arg Lys Val Pro Ile Glu Val Val Ala Leu Ile 195 200 205 Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Val Ala Ser Met Tyr Thr Asp Pro Glu 210 215 220 Ala Lys Met Gly Leu Phe Ser Gly Thr Gly Cys Asn Gly Ala Tyr Tyr 225 230 235 240 Asp Val Val Asp Asn Ile Pro Lys Leu Glu Gly Lys Val Pro Asp Asp 245 250 255 Ile Lys Ser Ser Ser Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ala Phe 260 265 270 Asp Asn Glu His Ile Ile Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Ile Gln Ile 275 280 285 Asp Glu Glu Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ala Phe Glu Lys Met Ile 290 295 300 Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Val Leu Arg Leu Ile Leu Leu Asp Leu 305 310 315 320 Thr Ser Lys Gln Leu Ile Phe Lys Asp Gln Asp Leu Ser Lys Leu Gln 325 330 335 Val Pro Phe Ile Leu Asp Thr Ser Ile Pro Ala Arg Ile Glu Glu Asp 340 345 350 Pro Phe Glu Asn Leu Ser Asp Val Gln Glu Leu Phe Gln Glu Ile Leu 355 360 365 Gly Ile Gln Thr Thr Ser Pro Glu Arg Lys Ile Ile Arg Arg Leu Ala 370 375 380 Glu Leu Ile Gly Glu Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ile Cys Gly Ile Ala 385 390 395 400 Ala Ile Cys Lys Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Ala His Cys Ala Ala Asp 405 410 415 Gly Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro Gly Phe Lys Glu Arg Ala Ala Lys 420 425 430 Gly Leu Arg Asp Ile Phe Gln Trp Glu Ser Glu Glu Asp Pro Ile Val 435 440 445 Ile Val Pro Ala Glu Asp Gly Leu Gly Ala Gly Ala Ala Ile Ile Ala 450 455 460 Ala Leu Thr Glu Lys Arg Leu Lys Asp Gly Leu Pro Leu Val 465 470 475

Claims

알카니보락스(Alcanivorax), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 지오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 마리노박터(Marinobacter), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 리조비움(Rhizobium), 스태필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물로서,
상기 바실러스는 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 아조토포르만스(Bacillus azotoformans), 바실러스 셀룰로실리티쿠스(Bacillus cellulosilyticus), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 사이토톡시쿠스(Bacillus cytotoxicus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 마카우엔시스(Bacillus macauensis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus), 바실러스 닐소니(Bacillus nealsonii), 바실러스 슈도피르무스(Bacillus pseudofirmus), 바실러스 셀리니티레두센스(Bacillus selenitireducens) 및 바실러스 바이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈; 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제2항에 있어서, 상기 타가토스-6-포스페이트 피타아제 대신에 타가토스-6-포스파타아제 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소들은 고정화된 효소인 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제4항에 있어서, 상기 고정화 방법은 흡착법, 공유결합법 또는 가두기법(entrapment)인 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis), 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 아조토포르만스(Bacillus azotoformans), 바실러스 셀룰로실리티쿠스(Bacillus cellulosilyticus), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 사이토톡시쿠스(Bacillus cytotoxicus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 마카우엔시스(Bacillus macauensis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus), 바실러스 닐소니(Bacillus nealsonii), 바실러스 슈도피르무스(Bacillus pseudofirmus), 바실러스 셀리니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 바실러스 바이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크로펜스테티(Corynebacterium kroppenstedtii), 엔테로코커스 아시니(Enterococcus asini), 엔테로코커스 카캐(Enterococcus caccae), 엔테로코커스 카셀리플라부스(Enterococcus casseliflavus), 엔테로코커스 세코룸(Enterococcus cecorum), 엔테로코커스 콜룸배(Enterococcus columbae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 플라베센스(Enterococcus flavescens), 엔테로코커스 길부스(Enterococcus gilvus), 엔테로코커스 해모페록시두스(Enterococcus haemoperoxidus), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus), 엔테로코커스 모라비엔시스(Enterococcus moraviensis), 엔테로코커스 문티(Enterococcus mundtii), 엔테로코커스 팔렌스(Enterococcus pallens), 엔테로코커스 페니쿨리콜라(Enterococcus phoeniculicola), 엔테로코커스 라피노수스(Enterococcus raffinosus), 엔테로코커스 사카로리티쿠스(Enterococcus saccharolyticus), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp .), 엔테로코커스 빌로룸(Enterococcus villorum), 지오바실러스 카우스토필루스(Geobacillus kaustophilus), 지오바실러스 종(Geobacillus sp.), 지오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 지오바실러스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans), 락토바실러스 애시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로리티쿠스(Lactobacillus amylolyticus), 락토바실러스 안트리(Lactobacillus antri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루에키 아종 불가르쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners), 락토바실러스 존슨아이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 뮤리누스(Lactobacillus murinus), 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei), 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp . plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminis), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 종(Lactobacillus sp .), 마리노박터 히드로카보노클라스티쿠스(Marinobacter hydrocarbonoclasticus), 메틸로바실러스 플라젤라투스(Methylobacillus flagellatus), 리조비움 그라하미(Rhizobium grahamii), 리조비움 레규미노사룸 비브이. 트리폴리아이(Rhizobium leguminosarum bv . trifolii), 리조비움 루피니(Rhizobium lupini), 리조비움 종(Rhizobium sp .), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토마이세스 아베미틸리스(Streptomyces avermitilis) 및 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소인 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제6항에 있어서, 상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 서열번호 1 내지 38 및 서열번호 42 내지 72의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제2항에 있어서, 상기 프럭토카이네이즈는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 푸소박테리움 모르티페룸(Fusobacterium mortiferum), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 리조비움 레규미노사룸(Rhizobium leguminosarum), 살모넬라 톰슨(Salmonella thompson), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 비브리오 알지노리티쿠스(Vibrio alginolyticus) 및 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소인 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제8항에 있어서, 상기 프럭토카이네이즈는 서열번호 73 내지 86의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제2항에 있어서, 상기 헥소카이네이즈는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 에메리셀라 니둘란스(Emericella nidulans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 네오사르토리아 푸미가타(Neosartorya fumigata), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소인 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
제10항에 있어서, 상기 헥소카이네이즈는 서열번호 87 내지 93의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.
프럭토스(fructose)에 헥소카이네이즈 또는 프럭토카이네이즈; 알카니보락스(Alcanivorax), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 지오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 마리노박터(Marinobacter), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 리조비움(Rhizobium), 스태필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈; 및 타가토스-6-포스페이트 피타아제;를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법으로서,
상기 바실러스는 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 아조토포르만스(Bacillus azotoformans), 바실러스 셀룰로실리티쿠스(Bacillus cellulosilyticus), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 사이토톡시쿠스(Bacillus cytotoxicus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 마카우엔시스(Bacillus macauensis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus), 바실러스 닐소니(Bacillus nealsonii), 바실러스 슈도피르무스(Bacillus pseudofirmus), 바실러스 셀리니티레두센스(Bacillus selenitireducens) 및 바실러스 바이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물인 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 효소들은 고정화된 효소인 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 효소 반응은 세포 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 프럭토스(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법.
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