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WO2017216472A2 - Variants d'une adn polymérase de la famille polx - Google Patents

Variants d'une adn polymérase de la famille polx Download PDF

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WO2017216472A2
WO2017216472A2 PCT/FR2017/051519 FR2017051519W WO2017216472A2 WO 2017216472 A2 WO2017216472 A2 WO 2017216472A2 FR 2017051519 W FR2017051519 W FR 2017051519W WO 2017216472 A2 WO2017216472 A2 WO 2017216472A2
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WO
WIPO (PCT)
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variant
residue
dna polymerase
nucleic acid
seq
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2017/051519
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English (en)
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WO2017216472A3 (fr
Inventor
Thomas YBERT
Marc Delarue
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
DNA Script SAS
Institut Pasteur
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
DNA Script SAS
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US16/309,414 priority patent/US20200002690A1/en
Priority to EP17746156.3A priority patent/EP3469075A2/fr
Priority to CN201780037427.0A priority patent/CN109477080A/zh
Priority to IL263503A priority patent/IL263503B2/en
Priority to AU2017286477A priority patent/AU2017286477C1/en
Priority to CA3024184A priority patent/CA3024184A1/fr
Priority to KR1020187034921A priority patent/KR102522263B1/ko
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, DNA Script SAS, Institut Pasteur filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to SG11201809961TA priority patent/SG11201809961TA/en
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Publication of WO2017216472A3 publication Critical patent/WO2017216472A3/fr
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Priority to US17/815,490 priority patent/US20230167421A1/en
Priority to US18/516,616 priority patent/US20240124855A1/en
Priority to AU2023282219A priority patent/AU2023282219A1/en
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
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    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1264—DNA nucleotidylexotransferase (2.7.7.31), i.e. terminal nucleotidyl transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07031—DNA nucleotidylexotransferase (2.7.7.31), i.e. terminal deoxynucleotidyl transferase

Definitions

  • the present invention falls within the field of enzyme enhancement.
  • the present invention relates to an improved variant of a polX family DNA polymerase, a nucleic acid encoding this variant, the production of this variant in a host cell, its use for the synthesis of a nucleic acid molecule without a template strand and a kit for synthesizing a nucleic acid molecule without a template strand.
  • polymerase DNAs of the polX family are involved in a wide range of biological processes, particularly in the mechanisms of DNA repair or error correction occurring in DNA sequences. These enzymes are capable of introducing nucleotides into the excised nucleic acid strands following the identification of errors in the sequence.
  • Polymerase DNAs of the polX family include ⁇ (Pol ⁇ ), ⁇ (Pol ⁇ ), ⁇ (Pol ⁇ ), yeast IV (Pol IV) and terminal deoxyribonucleotidyl transferase (TdT) polymerase DNAs.
  • the TdT in particular is widely used in enzymatic synthesis processes of nucleic acid molecules.
  • DNA polymerases generally allow only the incorporation of natural nucleotides. In all cases, the natural DNA polymerases lose their catalytic activity in the presence of unnatural nucleotides, and in particular nucleotides modified in 3 'OH, having a greater steric hindrance than the natural nucleotides.
  • modified nucleotides may be useful for some specific applications. It has therefore been necessary to develop enzymes capable of catalyzing the synthesis of a nucleic acid strand by incorporating such nucleotides. DNA polymerase variants have thus been developed for the purpose of functioning with nucleotides having important structural modifications.
  • the present invention removes certain technological barriers that prevent the use on an industrial scale of DNA polymerases for the enzymatic synthesis of nucleic acids.
  • the present invention thus provides variants of DNA polymerases of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid in the absence of a template strand and able to use modified nucleotides.
  • the variants developed have modified nucleotide incorporation capabilities much higher than those of natural DNA polymerases from which they are derived.
  • the variants of DNA polymerases that are the subject of the present invention are particularly effective for the incorporation of nucleotides exhibiting changes in the sugar level.
  • the inventors have developed variants having an increased catalytic pocket volume relative to that of the DNA polymerases from which they originate, favoring the incorporation of modified nucleotides which are more cumbersome than the natural nucleotides.
  • the variants of DNA polymerases of the polX family that are the subject of the present invention comprise at least one mutation on an amino acid intervening directly at the level of the catalytic cavity of the enzyme, or allowing the deformation of the contours of this cavity to accommodate the steric hindrance due to the changes present at the nucleotide level.
  • the introduced mutations allow the broadening of the catalytic cavity of the enzyme in which the 3'-OH end of the modified nucleotides is housed.
  • the mutations carried out allow the inflation or increase of the volume of the catalytic cavity, the increase of the access to the catalytic pocket by the nucleotides modified in 3'-OH and / or confer the necessary flexibility to the structure of the enzyme to allow it to accommodate sterically important modifications of nucleotides modified in 3'-OH.
  • the modified nucleotide penetrates into the heart of the catalytic pocket whose access is enlarged and adopts an optimal spatial conformation, a phosphodiester bond between the 3'-OH end of the last nucleotide of the nucleic acid strand and the 5'-triphosphate end of the modified nucleotide is created.
  • the subject of the invention is therefore a variant of a DNA polymerase of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid molecule without a template strand, or a variant of a functional fragment of such a polymerase, said variant comprising at least one a mutation of a residue at at least one position selected from the group consisting of T331, G332, G333, F334, R336, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399 D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, R454, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 and A510, or a functionally equivalent residue, the positions indicated being determined by alignment with SEQ ID No. 1.
  • the variant is capable of synthesizing a strand of DNA or an RNA strand.
  • the present invention relates in particular to a variant of a DNA polymerase of the polX family and in particular of a yeast Pol IV, Pol ⁇ or wild-type TdT, and comprising the selected mutation (s).
  • the variant according to the present invention is a variant of the TdT of sequence SEQ ID No. 1 or a homologous sequence which has at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identity with the sequence of SEQ ID No. 1, and carries the selected mutation (s).
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a variant of a DNA polymerase of the polX family according to the present invention, an expression cassette comprising a nucleic acid according to the present invention and a vector comprising a nucleic acid or a cassette of expression according to the present invention.
  • the nucleic acid encoding the variant of the present invention may be that of the mature form or the precursor form of the DNA polymerase according to the present invention.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid, an expression cassette or a vector according to the present invention to transform or transfect a host cell. It further relates to a host cell comprising a nucleic acid, an expression cassette or a vector encoding a DNA polymerase of the polX family according to the present invention. It relates to the use of such a nucleic acid, such an expression cassette, such a vector or such a host cell to produce a variant of a DNA polymerase of the polX family according to the present invention. .
  • It also relates to a method for producing a variant of a polX family DNA polymerase according to the present invention comprising the transformation or transfection of a host cell with a nucleic acid, an expression cassette or a vector according to the invention. the present invention, culturing the transformed / transfected host cell under culture conditions permitting expression of the nucleic acid encoding said variant, and optionally harvesting the variant of a DNA polymerase of the polX family produced by the host cell.
  • the host cell may be prokaryotic or eukaryotic.
  • the host cell may be a microorganism, preferably a bacterium, a yeast or a fungus.
  • the host cell is a bacterium, preferably E. coli.
  • the host cell is a yeast, preferably P. pastoris or K. lactis.
  • the host cell is a mammalian cell, preferably a COS7 or CHO cell.
  • the invention also relates to the use of a variant of a DNA polymerase of the polX family according to the present invention for synthesizing a nucleic acid molecule without strand. matrix, from nucleotides modified in 3'-OH.
  • the DNA polymerase variant of the polX family according to the present invention can also be used, in the context of the invention, to synthesize a nucleic acid molecule without a template strand, from unmodified nucleotides or from a mixture of modified and unmodified nucleotides.
  • the invention also proposes a process for the enzymatic synthesis of a nucleic acid molecule without a template strand, according to which a primer strand is contacted with at least one nucleotide, preferably a nucleotide modified at 3 '-OH, in the presence of a variant of a DNA polymerase of the polX family according to the invention.
  • the implementation of the method may in particular be carried out using a purified variant, a culture medium of a host cell transformed to express said variant, and / or a cell extract of such a host cell.
  • the subject of the invention is also a kit for the enzymatic synthesis of a nucleic acid molecule without a template strand comprising at least one variant of a DNA polymerase of the polX family according to the invention, nucleotides, preferably modified nucleotides. at 3'-OH, and optionally at least one primer strand, or nucleotide primer, and / or a reaction buffer.
  • Figure 1 SDS-PAGE gel of fractions of a TdT variant according to an exemplary embodiment of the invention
  • M Molecular weight marker, 1: Centrifugate before loading, 2: Centrifugate after loading, 3: Wash buffer after loading; 4: Elution fraction 3 mL; 5: Elution fraction 30 mL; 6: Peak elution pool; 7: Concentration);
  • FIG. 2 Alignment of the amino acid sequences of DNA polymerases Poi ⁇ of Homo sapiens (UniProtKB Q9NP87), Pol ⁇ of Pan troglodytes (UniProtKB H2QUI0), Pol ⁇ of Mus musculus (Uni ProtKB Q924W4), TdT of Canis lupus familiaris (UniProtKB F1 P657), Mus musculus TdT (UniProtKB Q3UZ80), Galius gailus TdT (UniProtKB P36195) and Homo sapiens TdT (Uni ProtKB P04053) obtained using the Mutalin online alignment software (in uv rni: ii dno ii ... inra. jY s or k ; :;; - m- ÎÎ to in.hh on;
  • FIG. 3 Comparison of the activity of a truncated wild-type TdT of sequence SEQ ID No. 3 and of several variants of this truncated TdT comprising various substitutions given by the Table 1, in the presence of a primer previously radiolabeled 5 'and modified nucleotides 3'-O-amino-2', 3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate (gel ONH2) or modified nucleotides 3'-biot- EDA-2 ', 3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate (Biot-EDA gel); on SDS-PAGE gel (No: no enzyme present, wt: truncated wild tdT of sequence SEQ ID No. 3, DSi: Variants i defined in Table 1);
  • FIG. 4 Study of the activity of the DS124 variant according to the invention (see Table 1), in the presence of a primer previously radioactively labeled at 5 'and various nucleotides modified with 3'-O-amino-2', 3 ' -dideoxyadenosine-5'-triphosphate on SDS-PAGE gel;
  • FIG. 5 Study of the activity of the DS22, DS24, DS124, DS125, DS126, DS127 and DS128 variants in the presence of a primer previously radioactively labeled at 5 'and various nucleotides modified with 3'-O-amino-2', 3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate on SDS-PAGE gel;
  • Figure 6 Synthesis of a strand of sequence DNA: 5'-GTACGCTAGT-3 '(SEQ ID NO: 15) following the 5' sequence primer - AAAAAAAAAAGGGG-3 '(SEQ ID NO: 14) ) using a variant of TDT according to the invention having the combination of substitutions R336N - R454A - E457G (DS125).
  • amino acids are represented in this document by the one-letter or three-letter code according to the following nomenclature:
  • A Ala (alanine); R: Arg (arginine); N: Asn (asparagine); D: Asp (aspartic acid); C: Cys (cysteine); Q: Gin (glutamine); E: Glu (glutamic acid);
  • F Phe (phenylalanine); P: Pro (proline); S: Ser (serine); T: Thr (threonine); W: Trp (tryptophan); Y: Tyr (tyrosine); V: Val (valine).
  • percent identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention, it is meant to designate a percentage of nucleotides or identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length.
  • the best alignment or alignment is the alignment for which the percentage identity between the two sequences to be compared, as calculated below, is the highest.
  • sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being made by segment or comparison window to identify and compare the local regions of the sequence. sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be performed, besides manually, using the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) (Ad App Math 2: 482), by means of the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) (J. Mol Biol 48: 443), using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) (Proc Natl Acad Sci USA). 85: 2444), using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), using the alignment software. Mutalin line
  • the percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences by comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. may include additions or deletions relative to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences.
  • the subject variants of the present invention are described according to their mutations on specific residues, whose positions are determined by alignment with, or reference to, the enzymatic sequence SEQ ID No. 1.
  • any variant bearing these same mutations on functionally equivalent residues is also targeted.
  • functionally equivalent residue is meant a residue in a sequence of a DNA polymerase of the polX family of sequence homologous to SEQ ID No. 1 and having an identical functional role.
  • Functionally equivalent residues are identified using sequence alignments, for example using Mutalin online alignment software 10881-10890). After alignment, the functionally equivalent residues are at homologous positions on the various sequences considered.
  • sequence alignments and the identification of functionally equivalent residues can be between any of the polX family DNA polymerases and their natural variants, including interspecies variants.
  • the residue L40 of the human TdT (UniProtKB P04053) is functionally equivalent to the residue M40 of the chicken TdT (UniProtKB P36195) and to the residue V40 of the tr ⁇ of Pan troglodytes (UniProtKB H2QUI0), said residues being considered after sequence alignment ( Figure 2).
  • “functional fragment” is meant a DNA polymerase fragment of the polX family exhibiting DNA polymerase activity.
  • the fragment may comprise 100, 200, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 or more consecutive amino acids of a DNA polymerase of the polX family.
  • the fragment comprises 380 consecutive amino acids of a DNA polymerase of the polX family consisting of the catalytic fragment of said enzyme.
  • the terms "mutant” and “variant” may be used interchangeably to refer to polypeptides derived from DNA polymerases of the polX family, or derived from functional fragments of such DNA polymerases, and in particular a TdT such as Murine TdT according to the sequence SEQ ID No.
  • variants comprising an alteration, namely a substitution, an insertion and / or deletion, at one or more positions and having a DNA polymerase activity.
  • the variants can be obtained by various techniques well known in the art.
  • exemplary techniques for modifying the DNA sequence encoding the wild-type protein include, but are not limited to, site-directed mutagenesis, random mutagenesis and the construction of synthetic oligonucleotides.
  • substitution or “mutation” as used herein with respect to an amino acid position or residue means that the amino acid in the position under consideration has been modified with respect to the amino acid of the amino acid protein. wild type of reference. Such modifications include substitutions, deletions and / or insertions of one or more amino acids, and especially 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 amino acids, at one or more positions, and especially 1 , 2, 3, 4, 5 or more positions.
  • substitution in connection with an amino acid position or residue, means that the amino acid in the particular position has been replaced by another amino acid than that in the wild-type or parent DNA polymerase.
  • substitution refers to the replacement of one amino acid residue with another selected from the 20 natural amino acid residues, the naturally occurring rare amino acid residues (e.g. hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methylsilyl, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, pyroglutamine, aminobutyric acid, ornithine), and rare unnatural amino acid residues, often made synthetically (eg, norleucine, norvaline and cyclohexyl-alanine).
  • rare amino acid residues e.g. hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methylsilyl, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methyl
  • substitution refers to the replacement of one amino acid residue with another selected from the 20 naturally occurring standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M , C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T).
  • the substitution can be a conservative or non-conservative substitution.
  • the conservative substitutions are made within the same group of amino acids, among the basic amines (arginine, lysine and histidine), the acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), the polar amino acids (glutamine and asparagine) , hydrophobic amino acids (methionine, leucine, isoleucine and valine), aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine) and small amino acids (glycine, alanine, serine and threonine).
  • the basic amines arginine, lysine and histidine
  • the acidic amino acids glutmic acid and aspartic acid
  • the polar amino acids glutamine and asparagine
  • hydrophobic amino acids methionine, leucine, isoleucine and valine
  • aromatic amino acids phenylalanine, tryptophan and tyrosine
  • small amino acids glycine, alanine, serine and threon
  • R454F indicates that the amino acid residue at position 454 of SEQ ID NO: 1 (arginine, R) is replaced by a phenylalanine (F).
  • N474S / T / N / Q means that the amino acid residue at position 474 (Asparagine, N) can be replaced by serine (S), threonine (T), asparagine (N) or glutamine (Q) .
  • the sign "+" indicates a combination of substitutions.
  • the invention relates to DNA polymerase variants of the polX family (EC 2.7.7.7, Advances in Protein Chemistry, Vol 71, 401-440) capable of synthesizing a nucleic acid molecule without a template strand, and in particular a strand of DNA or RNA.
  • the DNA polymerases of the polX family include DNA polymerase ⁇ (UniProt P06746 in humans, Q8K409 in mice), ⁇ , ⁇ (UniProt Q9UGP5 in humans, Q9QUG2 and Q9QXE2 in mice) and ⁇ (UniProt Q9NP87 in humans, Q9JIW4 in mice), Pol4 (UniProt A7TER5 in yeast Vanderwaltozyma polyspora, P25615 in yeast Saccharomyces cerevisiae), and terminal deoxyribonucleotidyl transferase or TdT (EC 2.7.7.31, UniProt P04053 in human, P09838 in mice).
  • the invention more particularly relates to a DNA polymerase variant of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid molecule without template strand, or a variant of a functional fragment of such a polymerase, said variant comprising at least mutating a residue at at least one position selected from the group consisting of T331, G332, G333, F334, R336, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399, D434, V436, A446, L447 , L448, G449, W450, G452, R454, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 and A510, or a functionally equivalent residue, the indicated positions being determined by alignment with, or reference to, the sequence SEQ ID No. 1.
  • the variant is capable of one strand of DNA and / or one strand of RNA.
  • compositions comprising at least one mutation or “comprising at least one mutation”, it is meant that the variant has one or more mutations as indicated with respect to the polypeptide sequence SEQ ID No. 1, but that it may exhibit other modifications, including substitutions, deletions or additions.
  • the mutation of one or more residues at the above positions allows the expansion of the catalytic pocket (targeting, for example, the positions W450, D434, D435, H342, D343, T331, R336, D399, R461, and / or R508), increasing accessibility to the catalytic bag (targeting for example positions R458, E455, R454, A397, K338, and / or N509), and / or providing greater flexibility to the structure of the enzyme allowing it to receive modified nucleotides having a large steric hindrance (targeting for example the positions V436, F346, V344, F334, M330, L448, E491, E457 and / or N474).
  • the variant objects of the present invention may be variants of Pol IV, Pol ⁇ , ⁇ , ⁇ or TdT, preferentially variants of Pol IV, Pol ⁇ , or TdT.
  • the variants may be chimeric enzyme variants, for example combining portions of different sequences of at least two DNA polymerases of the polX family.
  • the variant has at least 60% identity with the sequence according to SEQ ID No. 1, preferably at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%. , 98%, 99% and less than 100% identity with the sequence according to SEQ ID No. 1.
  • the mutation may consist of a substitution, deletion or addition of one or more amino acid residues.
  • the annotation X is used, which indicates that the codon coding for the residue in question is replaced by a STOP codon, therefore all the following amino acids and the residue in question are deleted.
  • the D501X mutation means that the enzyme terminates at the residue preceding aspartic acid (D) at position 501, i.e. leucine (L) at position 500, all residues above beyond having been deleted.
  • the annotation 0 denotes a simple one-off deletion of the residue under consideration.
  • the D5O10 mutation means that aspartic acid (D) at position 501 has been deleted.
  • the variant according to the invention comprises at least one mutation of a residue at at least one position selected from the group consisting of T331, G332, G333, F334, R336, D343, L447, L448, G449, W450, G452, R454, Q455, E457 and R508, or a functionally equivalent residue, preferentially at least one mutation of a residue at at least one position selected from the group consisting of R336, R454, E457, or a functionally equivalent residue, the positions indicated being determined by alignment with SEQ ID No. 1.
  • said variant comprises at least one mutation of a residue at at least two positions selected from the group consisting of R336, R454 and E457, preferentially a mutation of a residue at said three positions R336, R454 and E457 , or a functionally equivalent residue, the positions indicated being determined by alignment with SEQ ID No. 1.
  • the variant further comprises at least one mutation of a residue in at least the semi-conserved region of sequence X1X2GGFR1R2GKX3X4 (SEQ ID NO: 4), wherein
  • Xi represents a residue selected from M, I, V, L
  • X2 represents a residue selected from T
  • A M
  • Q X3 represents a residue selected from M, K, E, Q, L, S, P, R, D
  • X 4 represents a residue selected from T, I, M, F, K, V, Y, E, Q, H, S, R, D.
  • said variant has at least one substitution of a residue at at least one position Ri, R 2 and / or K of the semi-conserved region of sequence SEQ ID No. 4.
  • the variant further comprises at least one mutation of a residue in at least one semi-conserved region of XiX 2 sequence LGX 3 X4GSRiX 5 X 6 ER 2 (SEQ ID NO: 5) in which
  • Xi represents a residue selected from A, C, G, S
  • X 2 represents a residue chosen from L, T, R
  • X 3 represents a residue selected from W, Y
  • X 4 represents a residue selected from T, S, I
  • X5 represents a residue selected from Q, L, H, F, Y, N, E, D or O
  • X 6 represents a residue selected from F, Y
  • said variant has at least one substitution of a residue at at least one position S, Ri and / or E of the semi-conserved region of sequence SEQ ID No. 5.
  • the variant further comprises at least one mutation of a residue in at least one semi-conserved region of LXiYX sequence 2 X 3 PX 4 X5RNA (SEQ ID No. 6) in which
  • Xi represents a residue selected from D, E, S, P, A, K
  • X 2 represents a residue selected from I, L, M, V, A, T
  • X 3 represents a residue selected from E, Q, P, Y, L, K, G, N
  • X4 represents a residue selected from W, S, V, E, R, Q, T, C, K, H
  • X5 represents a residue selected from E, Q, D, H, L.
  • said variant has at least one deletion of the residue at the X1 position and / or at least one substitution at the R and / or N positions of the semi-conserved region of sequence SEQ ID No. 6.
  • the variant comprises a substitution of a residue for at least one position selected from the group consisting of R336, K338, H342, A397, S453, R454, E457, N474, D501, Y502, 1503, R508.
  • a functionally equivalent residue preferably a substitution of a residue at at least one position selected from the group consisting of R336, A397, R454, E457, N474, D501, Y502 and 1503, or a functionally equivalent residue, plus preferably at least one substitution of a residue at at least one position selected from the group consisting of R336, R454, E457, or a functionally equivalent residue, the positions indicated being determined by alignment with SEQ ID No. 1.
  • the invention preferably relates to a variant of a polX family DNA polymerase comprising at least one of the group consisting of R336K / H / G / N / D, K338A / C / G / S / T / N, H342A.
  • the variant comprises a substitution of a residue at at least two positions selected from the group consisting of R336, R454, E457, or a functionally equivalent residue, preferably a substitution of a residue at said three positions, or a functionally equivalent residue, the positions indicated being determined by alignment with SEQ ID No. 1.
  • the substitutions are chosen from the group consisting of R336K / H / G / N / D, R454F / Y / W / A and E457N / D / G / S / T, preferentially from the group consisting of R336N / G, R454A and E457G / N / S / T.
  • the variant comprises at least one substitution according to E457G / N / S / T.
  • the variant comprises a combination of substitutions selected from the group mentioned above.
  • the combination may consist of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 substitutions selected from this group.
  • the invention more particularly relates to variants of a DNA polymerase of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid molecule, such as a strand of DNA or RNA without a template strand, or of a fragment functional group of such a polymerase, said variants comprising at least one combination of mutations described in Table 1, the positions indicated being determined by alignment with SEQ ID No. 1.
  • the polX family DNA polymerase variant comprises a combination of R336G-E457N substitutions; R336N - E457N; R336N - R454A - E457N; R336N - R454A - E457G; R336N - E457G; and R336G - R454A - E457N.
  • the variant is a chimeric construction of DNA polymerases of the polX family.
  • chimeric construction is meant a chimeric enzyme constituted by the addition, and especially the fusion or conjugation, of one or more determined sequences of a member of the polX family enzyme to replace one or more homologous sequences. in the variant DNA polymerase considered.
  • the invention provides a TdT variant of sequence SEQ ID No. 1 comprising, besides one or more point mutations at one and / or the other of the above positions, a substitution of residues between the positions. C378 to L406, or functionally equivalent residues, by residues H363 to C390 of the ⁇ polymerase of sequence SEQ ID No. 2, or functionally equivalent residues.
  • the subject variants of the present invention may have a deletion of one or more successive amino acid residues at the N-terminal portion. These deletions may in particular target one or more enzymatic domains involved in binding with other proteins and / or involved in cellular localization.
  • the polypeptide sequence of the TdT comprises at the N-terminal a BRCT domain of interaction with other proteins such as Ku70 / 80 and a nucleus localization domain (NLS).
  • the variant is a TdT variant of sequence SEQ ID No. 1 having, in addition to one or more of the mutations described above, a deletion of residues 1-129 corresponding to the N-terminus of the wild TdT.
  • mutagenesis strategies may be guided by known information such as natural variant sequences, sequence comparison with bound proteins, physical properties, study of a three-dimensional structure or computer simulations involving several entities.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a variant of a polX family DNA polymerase capable of synthesizing a template-free nucleic acid molecule according to the present invention.
  • the present invention also relates to a cassette for expressing a nucleic acid according to the present invention. It also relates to a vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the present invention.
  • the vector may be selected from a plasmid and a viral vector.
  • the nucleic acid encoding the DNA polymerase variant may be DNA (cDNA or gDNA), RNA, a mixture of both. It can be in simple chain or duplex form or a mixture of both. It may comprise modified nucleotides, including for example a modified linkage, a modified purine or pyrimidine base, or a modified sugar. It can be prepared by any method known to those skilled in the art, including chemical synthesis, recombination, mutagenesis, etc.
  • the expression cassette comprises all the elements necessary for the expression of the variant of a DNA polymerase of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid molecule without a template strand according to the present invention, in particular the elements necessary for the transcription and to translation in the host cell.
  • the host cell may be prokaryotic or eukaryotic.
  • the expression cassette comprises a promoter and a terminator, optionally an amplifier.
  • the promoter may be prokaryotic or eukaryotic.
  • prokaryotic promoters are: LacI, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, T3 or T7 bacteriophage RNA polymerase promoters, polyhedrin promoter, phage lambda PR or PL promoter.
  • preferred eukaryotic promoters are: early CMV promoter, HSV thymidine kinase promoter, SV40 early or late promoter, mouse L-metallothionein promoter, and LTR regions of some retroviruses.
  • the skilled person can advantageously refer to the work of Sambrook et al. (1989) or the techniques described by Fuller et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biology.
  • the present invention relates to a vector carrying a nucleic acid or an expression cassette encoding a variant of a DNA polymerase of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid molecule without a template strand according to the present invention.
  • the vector is preferably an expression vector, i.e. it comprises the elements necessary for the expression of the variant in the host cell.
  • the host cell may be a prokaryote, for example E. coli, or a eukaryotic.
  • the eukaryote may be a lower eukaryote such as a yeast (for example, P. Pastoris or K.
  • the cell may be a mammalian cell, for example COS (green monkey cell line) (e.g., COS 1 (ATCC CRL-1650), COS7 (ATCC CRL-1651), CHO (US 4,889,803; US 5,047,335, CHO- K1 (ATCC CCL-61)), mouse cells and human cells
  • COS green monkey cell line
  • the vector may be a plasmid, a phage, a phagemid, a cosmid, a virus, a YAC, a BAC, an Agrobacterium pTi plasmid, etc.
  • the vector may preferably comprise one or more elements selected from an origin of replication, a multiple cloning site and a selection gene.
  • the vector is a plasmid.
  • prokaryotic vectors are: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, and pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen).
  • Non-exhaustive examples of eukaryotic vectors are: pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); and pQE-30 (QLAexpress).
  • the viral vectors may be non-exhaustively adenoviruses, AAVs, HSVs, lentiviruses, etc.
  • the expression vector is a plasmid or a viral vector.
  • the sequence coding for the variant according to the present invention may comprise or not comprise a signal peptide.
  • a signal peptide In the case where it does not include a methionine may be optionally added to the N-terminus.
  • a heterologous signal peptide can be introduced. This heterologous signal peptide can be derived from a prokaryote such as E. coli or from a eukaryotic, especially a mammalian, insect or yeast cell.
  • the present invention relates to the use of a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention to transform or transfect a cell.
  • the present invention relates to a host cell comprising a nucleic acid, an expression cassette or a vector encoding a variant of a polX DNA polymerase capable of synthesizing a nucleic acid molecule without a template strand and its use to produce a variant of a polX family DNA polymerase capable of synthesizing a nucleic acid molecule without a recombinant template strand according to the present invention.
  • the term "host cell” encompasses the daughter cells resulting from the culture or growth of this cell.
  • the cell is non-human and non-embryonic. It also relates to a method for producing a variant of a DNA polymerase of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid molecule without recombinant template strand according to the present invention comprising the transformation or transfection of a cell with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the variant of a DNA polymerase of the polX family capable of synthesizing a nucleic acid molecule without template strand produced by the cell.
  • the method for producing a variant of a polX family DNA polymerase capable of synthesizing a recombinant template-free nucleic acid molecule according to the present invention comprising providing a cell comprising a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the variant of a polX family DNA polymerase capable of synthesizing a template-free nucleic acid molecule produced by the cell.
  • the cell may be transformed / transfected transiently or stably by the nucleic acid encoding the variant.
  • This nucleic acid may be contained in the cell as an episome or in a chromosomal form.
  • the DNA polymerase variants according to the present invention are particularly interesting for the synthesis of nucleic acids without a template strand. More particularly, the variants according to the invention have an increased catalytic pocket particularly adapted for the synthesis of nucleic acid by means of modified nucleotides having a bigger bulk than the natural nucleotides.
  • the variants according to the invention may in particular make it possible to incorporate modified nucleotides, such as those described in application WO2016 / 034807, into a nucleic acid strand.
  • the kinetics of incorporation of DNA polymerase variants is greatly improved compared with the kinetics of incorporation of wild-type DNA polymerase.
  • variants may advantageously be used in the context of a high performance enzymatic DNA synthesis method.
  • the subject of the invention is therefore also a use of a variant of a DNA polymerase of the polX family according to the present invention for synthesizing a nucleic acid molecule. without template strand, from nucleotides modified in 3 '-OH, and in particular those described in application WO2016034807.
  • the subject of the invention is also a process for the enzymatic synthesis of a nucleic acid molecule without a template strand, according to which a primer strand is brought into contact with at least one nucleotide, preferably a nucleotide modified with 3'-OH, in presence of a variant of a DNA polymerase of the polX family according to the invention.
  • variants according to the invention can be used to implement the synthesis method described in application WO2015 / 159023.
  • the subject of the invention is also a kit for the enzymatic synthesis of a nucleic acid molecule without a template strand comprising at least one variant of a DNA polymerase of the polX family according to the invention, nucleotides, preferably modified nucleotides. in 3'-OH, and optionally at least one nucleotide primer.
  • the truncated mouse TdT gene was generated from plasmid pET28b whose construction is described in [Boulé et al., 1998, Mol. Biotechnol, 10, 199-208].
  • the corresponding sequence SEQ ID No. 3 (corresponding to SEQ ID No. 1 truncated of the first 120 amino acids) was amplified using the following primers:
  • T7-pro TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO: 7)
  • ⁇ T7-ter GCTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID NO: 8) according to standard PCR and molecular biology techniques. It was cloned into a plasmid pET32 to give the vector pET32-SEQ ID No. 3.
  • the plasmid pET32-SEQ ID No. 3 was first sequenced and then transformed into commercial E. coli strains BL21 (DE3) (Novagen). Colonies capable of growing on kanamycin / chloramphenicol dishes have been isolated and noted Ec-SEQ ID No. 3.
  • the vector pET32-SEQ ID No. 3 was used as the starting vector. Primers with point mutation (or in some cases point mutations, if close enough) were generated from Agilent's online tool:
  • the QuickChange II kit (Agilent) was used to generate the plasmids of the variants comprising the desired mutation (s).
  • the mutagenesis protocol given by the manufacturer has been scrupulously respected in order to obtain a plasmid pET32-DSi (i is the number of the variant considered given in Table 1).
  • plasmid pET32-DSx was first sequenced and then transformed into the commercial E. coli strains BL21 (DE3) (Novagen). Colonies capable of growing on kanamycin / chloramphenicol dishes were isolated and noted Ec-DSx.
  • Ec-SEQ ID NO: 3 and Ec-DSx cells were precultured in a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of LB medium to which appropriate amounts of kanamycin and chloramphenicol were added. The culture was incubated at 37 ° C with stirring overnight. The preculture was then used to seed a 5 L Erlenmeyer flask containing 2 L of LB medium supplemented with appropriate amounts of kanamycin and chloramphenicol. The optical density (OD) of departure was 0.01. The culture was incubated at 37 ° C with shaking. OD was regularly measured to a value between 0.6 and 0.9.
  • the cell pellet frozen in the previous step was thawed in a water bath heated to 25-37 ° C. Once completely thawed it was resuspended in about 100 mL of lysis buffer. Particular attention has been paid to the re-suspension which should lead to a very homogeneous solution and in particular to the total absence of aggregates.
  • the cells were lysed using a French press under a pressure of 14,000 psi.
  • the lysate collected was centrifuged at high speed, 10,000 g for 1 h to 1:30.
  • the centrifugate was filtered through a 0.2 ⁇ filter and collected in a tube of sufficient volume.
  • TdT was purified on an affinity column. 5 mL His-Trap Crude columns (GE Life Sciences) were used with peristaltic pumps (Peristaltic Pump - MINIPULS® Evolution, Gilson). In a first step the column was equilibrated using 2 to 3 CV (column volume) of lysis buffer. The centrifugate from the previous step was then loaded onto the column at a rate of between about 0.5 and 5 mL / min. After the entire centrifugate was loaded, the column was washed with 3 CV of lysis buffer and then 3 CV of wash buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 0.5 M NaCl, 60 mM imidazol).
  • the elution buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 0.5 M NaCl, 1 M imidazol) was injected into the column at about 0.5 to 1 ml / min for a total volume of 3 HP. Throughout the elution phase the column outlet was collected in 1 mL fractions. These fractions were analyzed by SDS-PAGE to determine which fractions contain the elution peak. Once determined, these were pooled in a single fraction and dialyzed against dialysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM NaCl, 50 mM MgOAc, 100 mM [NH 4 ] 2 SO 4 .
  • the activity of different variants according to the invention was determined by the following test. The results were compared with those obtained with the natural enzyme from which each of the variants is derived. Activity test
  • the primer used of sequence 5 '-AAAAAAAAAAGGGG-3' (SEQ ID No. 14), was previously radioactively labeled at 5 'by means of a standard labeling protocol involving the enzyme PNK (NEB) and the use of radioactive ATP (PerkinElmer).
  • Buffer 10x of 250 mM Tris-HCl pH 7.2, 80 mM MgC, 3.3 mM ZnSO 4 was used.
  • the modified nucleotides used are 3'-O-amino-2 ', 3'-dideoxynucleotide-5'-triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences) or 3'-biot-EDA-2', 3'-dideoxynucleotide-5 ' -triphosphate (Biot-EDA, Jena Biosciences), such as 3'-O-amino-2 ', 3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate or 3'-biot-EDA-2', 3'-dideoxyadenosine-5 ' -triphosphate for example.
  • the 3'-O-amino group is a larger group attached to the 3'-OH end.
  • the 3'-biot-EDA group is an extremely bulky and non-flexible group attached to the 3'-OH end.
  • the performance of incorporation of a modified nucleotide given by the variants listed in Table 1, relative to the natural TdT (SEQ ID No. 3) were evaluated by carrying out simultaneous activity tests, for which only the enzyme varies.
  • a denaturing 16% polyacrylamide gel (Biorad) was used for the analysis of the previous activity test.
  • the gel was previously cast and allowed to polymerize. It was then mounted on an appropriately sized electrophoresis tank filled with TBE buffer (Sigma). The different samples were directly loaded onto the gel without pre-treatment.
  • the gel was then subjected to a potential difference of 500 to 2000 V for 3 to 6 hours. Once the migration is satisfactory, the gel was disarmed and then transferred to an incubation cassette.
  • a phosphor screen (Amersham) was used for 10 to 60 min for revelation using a Typhoon instrument (GE Life Sciences) previously set with a suitable detection mode.
  • the natural TdT (wt column) is incapable of incorporating the modified nucleotides 3'-O-amino-2 ', 3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate as shown in FIG. comparison with the negative control (column No).
  • a first group of variants (DS7 to DS34 columns) is capable of about 50% incorporation.
  • a second group of variants (columns DS46 to DS73) is capable of more than 95% incorporation, sometimes more than 98%.
  • a third group of variants (columns DS83 to DSI 06) is capable of incorporation between 60 and 80%.
  • a first group of variants (columns DS7 to DS34) is capable of incorporation between 5 and 10% approximately.
  • a second group of variants (columns DS46 to DS73) is capable of incorporation at more than 30%, sometimes more than 40%.
  • a third group of variants (columns DS83 to DSI 06) is capable of incorporation between 10 and 25%.
  • TdT variants according to the invention are all capable of using modified nucleotides, in particular 3'-OH, as substrate, unlike the wild-type enzyme.
  • certain variants have very high levels of incorporation, even in the presence of nucleotides carrying modifications tending to increase very significantly the steric hindrance of said nucleotide.
  • the enzymes are brought into contact with modified nucleotides ONH2 and incubated at 37 ° C. according to different times. The reactions are stopped in order to observe the kinetics of incorporation of DS124 and to compare it with the kinetics of the natural enzyme WT (SEQ ID No. 3).
  • the primer and the buffer used are in accordance with Example 3.
  • the modified nucleotides used are 3'-O-amino-2 ', 3'-dideoxynucleotides-5'-triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences): 3'-O-amino-2', 3'-dideoxyguanosine-5'- triphosphate, 3'-O-amino-2 ', 3'-dideoxycytidine-5'-triphosphate and 3'-O-amino-2', 3'-dideoxythymidine-5'-triphosphate.
  • the 3'-O-amino group is a larger group attached to the 3'-OH end.
  • the negative control (column No) gives the expected size of the primer used when it has not been lengthened, that is to say when there has been no incorporation of nucleotides.
  • the natural TdT (WT column) is not able to incorporate modified nucleotides (here ONH2-dGTP): we observe a band at the same level as that of column No.
  • the DS124 variant is able to incorporate the modified nucleotides with an apparent efficiency of 100%.
  • the different variants were put in the presence of a mixture of natural nucleotides and highly concentrated modified nucleotides.
  • the concentration of the enzyme is also increased in order to shorten the incubation time and to obtain quantitative addition (see Example 4).
  • the primer and the buffer used are identical to Example 3.
  • the nucleotide mixture consists of natural nucleotides 2'-deoxynucleotide 5'-triphosphate (Naked, Sigma-Al drich) such as 2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate (dGTP) and modified nucleotides 3 -O-amino-2 ', 3'-dideoxynucleotide-5'-triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences) such as 3'-O-amino-2', 3'-dideoxyguanosine-5'-triphosphate for example.
  • the 3'-O-amino group is a larger group attached to the 3'-OH end.
  • the mixture consists of 90% ONH2-dGTP modified nucleotides and 10% dGTP natural nucleotides.
  • the negative control (column No) gives the expected size of the primer used when it has not been elongated, that is to say when there has been no incorporation of nucleotides.
  • the following samples go in pairs, each pair corresponding to the same enzyme variant tested under both conditions: in the absence and in the presence of nucleotides (in the form of a mixture when they are present).
  • the first group is the DS128 variant, constituting a negative control.
  • This variant has extremely low levels of nucleotide incorporation: between 5% and 10% incorporation is observed when the nucleotide mixture is present; which corresponds to the proportion of natural nucleotides present in the mixture.
  • the second group consists of DS127 and DS22 variants. These variants have high levels of nucleotide incorporation: between 50% and 60% incorporation is observed when the nucleotide mixture is present. Still in this case, an over-addition band corresponding to the successive incorporation of two nucleotides is observed for these two variants. The intensity of this band corresponds to the proportion of natural nucleotides present in the nucleotide mixture.
  • the last group consists of DS124, DS24, DS125 and DS126 variants. These variants have extremely high incorporation rates of nucleotides: between 80%> and 100%, for DS 124 and DS 125, when the nucleotide mixture is present. In this case, no over-addition band is present. In the case of the DS24 and DS126 variants, the proportion of non-incorporation is similar to the proportion of natural nucleotides present in the mixture.
  • variants of the TdT according to the invention are capable of preferentially using the modified nucleotides among a mixture of modified nucleotides and natural nucleotides.
  • these variants have extremely high levels of incorporation of the modified nucleotides and are capable of discriminating the natural nucleotides so as not to incorporate them and thus greatly improve the quality of the DNA synthesize by avoiding over-additions.
  • TdT variant having the combination of R336N - R454A - E457G substitutions was generated and produced according to Example 1.
  • the DS125 variant is used to synthesize the sequence: 5 '- GTACGCTAGT-3' (SEQ ID NO: 15) following the 5 '-AAAAAAAAAAGGGG-3' sequence primer (SEQ ID NO: 14).
  • the primer was radioactively labeled in 5 'by means of a standard labeling protocol involving the enzyme PNK (NEB) and the use of radioactive ATP (PerkinElmer).
  • the primer is attached to a solid support by interaction with a sequence capture fragment: 5'-CCTTTTTTTTTT -3 'complementary (SEQ ID No. 16).
  • the capture moiety has on its 3 'end a group allowing it to react covalently with a reaction group attached to a surface.
  • this group may be NH 2, the reaction group N-hydroxysuccinimide and the surface a magnetic ball (Dynabeads, Thermo Feher).
  • the interaction of the primer with the capture fragment is performed under standard DNA fragment hybridization conditions.
  • the modified nucleotides used are 3'-O-amino-2 ', 3'-dideoxynucleotides-5'-triphosphate (ONH 2, Firebird Biosciences) such as 3'-O-amino-2', 3'-dideoxyguanosine-5 ' -triphosphate, 3'-O-amino-2 ', 3'-dideoxycytidine-5'-triphosphate, 3'-O-amino-2', 3'-dideoxythymidine-5'-triphosphate or 3'-O-amino- 2 ', 3'-5'-triphosphate dideoxytadénosine.
  • the 3'-O-amino group is a larger group attached to the 3'-OH end.
  • the 10x buffer consisting of 250 mM Tris-HCl pH 7.2, 80 mM MgCl2, 3.3 mM ZnSO4 was used.
  • Wash buffer L used was 25 mM Tris-HCl pH 7.2.
  • the deprotection buffer D used consists of 50 mM sodium acetate pH 5.5 in the presence of 10 mM MgCl 2.
  • the beads constituting the solid support on which the primers were hybridized for an equivalent total amount of primer of 35 pmol were washed several times with the buffer L. After these washes, the beads were held on a magnet and the supernatant removed in its entirety.
  • the beads are collected by means of a magnet and the supernatant is removed in its entirety.
  • the analysis of the activity test is carried out by migration of the different samples in a polyacrylamide gel according to the protocol described in Example 3.

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Abstract

L'invention concerne des variants d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléiquesans brin matrice, ou d'un fragment fonctionnel d'une telle polymérase, comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position particulière, et des utilisations de ces variants, notamment pour la synthèse de molécules d'acide nucléiques comprenant des nucléotides modifiés en 3'-OH.

Description

Variants d'une ADN polymérase de la famille polX
Introduction
La présente invention relève du domaine de l'amélioration des enzymes. La présente invention est relative à un variant amélioré d'une ADN polymérase de la famille polX, un acide nucléique codant pour ce variant, la production de ce variant dans une cellule hôte, son utilisation pour la synthèse d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice et un kit pour la synthèse d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice.
La synthèse chimique de fragments d'acide nucléique est une technique largement utilisée dans les laboratoires (Adams et al, 1983, J. Amer. Chem. Soc. 105 :661 ; Froehler et al, 1983, Tetrahedron Lett. 24 :3171). Elle permet d'obtenir de manière rapide des molécules d'acide nucléique comprenant la séquence de nucléotides voulue. A l'inverse des enzymes qui effectuent la synthèse dans le sens 5' vers 3', la synthèse chimique s'effectue dans le sens 3' vers 5'. La synthèse chimique connaît cependant certaines limites. En effet, elle nécessite l'utilisation de multiples solvants et réactifs. En outre, elle ne permet d'obtenir que des fragments courts d'acide nucléique, qu'il est ensuite nécessaire d'assembler entre eux pour obtenir les brins d'acides nucléiques finaux souhaités.
Une solution alternative mettant en œuvre des enzymes pouvant réaliser la réaction de couplage entre nucléotides à partir d'un fragment d'acide nucléique initial (amorce) et en l'absence de brin matrice a été développée. Plusieurs enzymes de type polymérase semblent adaptées à ce genre de méthodes de synthèse.
Il existe un très grand nombre d'ADN poiymérases capables de catalyser la synthèse d'un brin d'acide nucléique, en présence ou non d'un brin matrice. Ainsi, les ADN poiymérases de la famille polX sont impliquées dans un large éventail de processus biologiques, en particulier dans les mécanismes de réparation de l'ADN ou de correction des erreurs apparaissant dans les séquences d'ADN. Ces enzymes sont capables d'introduire des nucléotides dans les brins d'acide nucléique ayant subi des excisions suite à l'identification d'erreurs dans la séquence. Les ADN poiymérases de la famille polX regroupent les ADN poiymérases β (Pol β), λ (Pol λ), μ (Pol μ), IV de levure (Pol IV) et la desoxyribonucléotidyl-transferase terminale (TdT). La TdT notamment est très utilisée dans les procédés de synthèse enzymatique de molécules d'acide nucléique.
Cependant, ces ADN polymérases ne permettent le plus souvent que l'incorporation de nucléotides naturels. Dans tous les cas, les ADN polymérases naturelles perdent de leur activité catalytique en présence de nucléotides non naturels, et notamment des nucléotides modifiés en 3' OH, présentant un encombrement stérique plus important que les nucléotides naturels.
Or, l'utilisation de nucléotides modifiés peut s'avérer utile pour certaines applications spécifiques. Il a donc été nécessaire de développer des enzymes capables de catalyser la synthèse d'un brin d'acide nucléique en incorporant de tels nucléotides. Des variants d'ADN polymérase ont ainsi été développés, dans le but de fonctionner avec des nucléotides comportant des modifications structurales importantes.
Les variants actuellement disponibles ne donnent cependant pas entièrement satisfaction, notamment du fait de leur faible activité, compatible seulement avec la synthèse enzymatique à l'échelle du laboratoire. Il existe donc un besoin en ADN polymérases capables de synthétiser, si possible à l'échelle industrielle, un acide nucléique en l'absence de brin matrice et en utilisant des nucléotides modifiés.
Résumé de l'invention
La présente invention lève certains verrous technologiques qui empêchent l'utilisation à l'échelle industrielle d'ADN polymérases pour la synthèse enzymatique d'acides nucléiques. La présente invention propose ainsi des variants d'ADN polymérases de la famille polX capables de synthétiser un acide nucléique en l'absence de brin matrice et aptes à utiliser des nucléotides modifiés. Les variants développés présentent des capacités d'incorporation de nucléotides modifiés très supérieures à celles des ADN polymérases naturelles dont ils sont dérivés. En particulier, les variants d'ADN polymérases objet de la présente invention sont particulièrement efficaces pour l'incorporation de nucléotides présentant des modifications au niveau du sucre. En effet, les inventeurs ont développé des variants présentant un volume de poche catalytique accru par rapport à celui des ADN polymérases dont ils sont issus, favorisant l'incorporation de nucléotides modifiés plus encombrants que les nucléotides naturels. Plus particulièrement, les variants d'ADN polymérases de la famille polX objets de la présente invention comprennent au moins une mutation sur un acide aminé intervenant directement au niveau de la cavité catalytique de l'enzyme, ou permettant la déformation des contours de cette cavité afin d'accommoder l'encombrement stérique dû aux modifications présentes au niveau des nucléotides. Par exemple, les mutations introduites permettent l'élargissement de la cavité catalytique de l'enzyme dans laquelle vient se loger l'extrémité 3'-OH des nucléotides modifiés. De manière alternative ou additionnelle, les mutations réalisées permettent l'inflation ou augmentation du volume de la cavité catalytique, l'accroissement de l'accès à la poche catalytique par les nucléotides modifiés en 3'-OH et/ou confèrent la flexibilité nécessaire à la structure de l'enzyme pour lui permettre d'accommoder des modifications stériquement importantes des nucléotides modifiés en 3'-OH. Grâce à de telles mutations, une fois la polymérase fixée au fragment d'acide nucléique à allonger, le nucléotide modifié pénètre au cœur de la poche catalytique dont l'accès est élargi et y adopte une conformation spatiale optimale, une liaison phosphodiester entre l'extrémité 3'-OH du dernier nucléotide du brin d'acide nucléique et l'extrémité 5'-triphosphate du nucléotide modifié se créant.
L'invention a donc pour objet un variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, ou un variant d'un fragment fonctionnel d'une telle polymérase, ledit variant comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en T331, G332, G333, F334, R336, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399 D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, R454, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 et A510, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N° 1.
Dans un mode de réalisation particulier, le variant est capable de synthétiser un brin d'ADN ou un brin d'ARN.
La présente invention concerne notamment un variant d'une ADN polymérase de la famille polX et notamment d'une Pol IV de levure, Pol μ ou TdT sauvage, et comprenant la ou les mutations sélectionnées. Dans un exemple de réalisation particulier, le variant selon la présente invention est un variant de la TdT de séquence SEQ ID N°l ou une séquence homologue qui présente au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% d'identité avec la séquence de la SEQ ID No 1, et porte la ou les mutations sélectionnées.
L'invention concerne également un acide nucléique codant un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention, une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la présente invention et un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. L'acide nucléique codant pour le variant de la présente invention peut être celui de la forme mature ou de la forme précurseur de l'ADN polymérase selon la présente invention.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule hôte. Elle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention. Elle concerne l'utilisation d'un tel acide nucléique, d'une telle cassette d'expression, d'un tel vecteur ou d'une telle cellule hôte pour produire un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention.
Elle concerne également un procédé de production d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention comprenant la transformation ou la transfection d'une cellule hôte par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention, la mise en culture de la cellule hôte transformée/transfectée dans des conditions de culture permettant l'expression de l'acide nucléique codant ledit variant, et optionnellement la récolte du variant d'une ADN polymérase de la famille polX produit par la cellule hôte.
La cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. Notamment, la cellule hôte peut être un microorganisme, de préférence une bactérie, une levure ou un champignon. Dans un mode de réalisation, la cellule hôte est une bactérie, de préférence E. coli. Dans autre un mode de réalisation, la cellule hôte est une levure, de préférence P. pastoris ou K. lactis. Dans un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule de mammifère, de préférence une cellule COS7 ou CHO.
L'invention concerne également l'utilisation d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention, pour synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides modifiés en 3'-OH. Bien entendu, le variant d'ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention peut également être utilisé, dans le contexte de l'invention, pour synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides non modifiés ou d'un mélange de nucléotides modifiés et non modifiés. L'invention propose également un procédé de synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, selon lequel on met en contact un brin amorce avec au moins un nucléotide, préférentiellement un nucléotide modifié en 3 '-OH, en présence d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'invention. La mise en œuvre du procédé peut notamment être réalisée en utilisant un variant purifié, un milieu de culture d'une cellule hôte transformée pour exprimer ledit variant, et/ou un extrait cellulaire d'une telle cellule hôte.
L'invention a également pour objet un kit pour la synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice comprenant au moins un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'invention, des nucléotides, préférentiellement des nucléotides modifiés en 3 '-OH, et optionnellement au moins un brin amorce, ou amorce nucléotidique, et/ou un tampon réactionnel.
Description des figures
Figure 1 : Gel SDS-PAGE de fractions d'un variant de TdT selon un exemple de réalisation de l'invention (M : Marqueur de poids moléculaire ; 1 : Centrifugat avant chargement ; 2 : Centrifugat après chargement ; 3 : Tampon de lavage après chargement ; 4 : Elution fraction 3 mL ; 5 : Elution fraction 30 mL ; 6 : Rassemblement pic d'élution ; 7 : Concentration) ;
Figure 2 : Alignement des séquences d'acides aminés des ADN polymérases Poi μ d'Homo sapiens (UniProtKB Q9NP87), Pol μ de Pan troglodytes (UniProtKB H2QUI0), Pol μ de Mus musculus (Uni ProtKB Q924W4), TdT de Canis lupus familiaris (UniProtKB F1 P657), TdT de Mus musculus (UniProtKB Q3UZ80), TdT de Galius gailus (UniProtKB P36195) et TdT d'Homo sapiens (Uni ProtKB P04053) obtenu au moyen du logiciel d'alignement en ligne Mutalin ( in uv rni: îi d n o ii ... inra. jY s ou k;: ] ; ; - m- ÎÎ à in.hh o n ;
Figure 3 : Comparaison de l'activité d'une TdT sauvage tronquée de séquence SEQ ID N°3 et de plusieurs variants de cette TdT tronquée comprenant différentes substitutions données par le tableau 1, en présence d'une amorce préalablement marquée radioactivement en 5' et de nucléotides modifiés 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate (gel ONH2) ou nucléotides modifiés 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate (gel Biot-EDA) ; sur gel SDS-PAGE (No : pas d'enzyme présente ; wt : TdT sauvage tronquée de séquence SEQ ID N°3; DSi : Variants i définis dans le tableau 1) ;
Figure 4 : Etude de l'activité du variant DS124 selon l'invention (voir tableau 1), en présence d'une amorce préalablement marquée radioactivement en 5' et différents nucléotides modifiés avec 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate sur gel SDS-PAGE ;
Figure 5 : Etude de l'activité des variants DS22, DS24, DS124, DS125, DS126, DS127 et DS128 en présence d'une amorce préalablement marquée radioactivement en 5' et différents nucléotides modifiés avec 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate sur gel SDS- PAGE ;
Figure 6 : Synthèse d'un brin d'ADN de séquence : 5'- GTACGCTAGT-3 ' (SEQ ID N°15) à la suite de l'amorce de séquence 5 ' - AAAAAAAAAAGGGG-3 ' (SEQ ID N°14) au moyen d'un variant de la TDT selon l'invention présentant la combinaison de substitutions R336N - R454A - E457G (DS125).
Description détaillée de l'invention
Définitions
Les acides aminés sont représentés dans ce document par le code à une lettre ou à trois lettres selon la nomenclature suivante : A : Ala (alanine) ; R : Arg (arginine) ; N : Asn (asparagine) ; D : Asp (acide aspartique) ; C : Cys (cystéine) ; Q : Gin (glutamine) ; E : Glu (acide glutamique) ; G : Gly (glycine) ; H : His (histidine) ; I : Ile (isoleucine) ; L : Leu (leucine) ; K : Lys (lysine) ; M : Met (méthionine) ; F : Phe (phénylalanine) ; P : Pro (proline) ; S : Ser (sérine) ; T : Thr (thréonine) ; W : Trp (tryptophane) ; Y : Tyr (tyrosine) ; V : Val (valine). Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) (J. Mol. Biol. 48 : 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), au moyen du logiciel d'alignement en ligne Mutalin
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(22), .10881-10890). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Les variants objets de la présente invention sont décrits en fonction de leurs mutations sur des résidus spécifiques, dont les positions sont déterminées par alignement avec, ou référence à, la séquence enzymatique SEQ ID N°l . Dans le contexte de l'invention, tout variant portant ces mêmes mutations sur des résidus fonctionnellement équivalents est également visé. Par « résidu fonctionnellement équivalent », on entend un résidu dans une séquence d'une ADN polymérase de la famille polX de séquence homologue à SEQ ID N°l et présentant un rôle fonctionnel identique. Les résidus fonctionnellement équivalents sont identifiés en ayant recours à des alignements de séquences, par exemple au moyen du logiciel d'alignement en ligne Mutalin 10881-10890). Après alignement, les résidus fonctionnellement équivalents se trouvent à des positions homologues sur les différentes séquences considérées. Les alignements de séquences et l'identification de résidus fonctionnellement équivalents peuvent se faire entre n'importe quelles ADN polymérases de la famille polX et leurs variants naturels, y compris inter-espèces. A titre d'exemple, le résidu L40 de la TdT humaine (UniProtKB P04053) est fonctionnellement équivalent au résidu M40 de la TdT de poulet (UniProtKB P36195) et au résidu V40 de la Ροΐμ de Pan troglodytes (UniProtKB H2QUI0), lesdits résidus étant considérés après alignement des séquences (figure 2). Par « fragment fonctionnel » est entendu un fragment d'ADN polymérase de la famille polX présentant l'activité ADN polymérase. Le fragment peut comprendre 100, 200, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 ou plus acides aminés consécutifs d'une ADN polymérase de la famille polX. Préférentiellement le fragment comporte 380 acides aminés consécutifs d'une ADN polymérase de la famille polX consistant en le fragment catalytique de ladite enzyme. Les termes «mutant» et «variant» peuvent être utilisés de manière interchangeable pour faire référence à des polypeptides dérivés d'ADN polymérases de la famille polX, ou dérivés de fragments fonctionnels de telles ADN polymérases, et notamment d'une TdT telle que la TdT murine selon la séquence SEQ ID N ° 1, et comprenant une altération, à savoir une substitution, une insertion et / ou délétion, à une ou plusieurs positions et ayant une activité d'ADN polymérases. Les variants peuvent être obtenus par diverses techniques bien connues dans l'art. En particulier, des exemples de techniques de modification de la séquence d'ADN codant pour la protéine de type sauvage, comprennent, mais sans s'y limiter, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse aléatoire et la construction d'oligonucléotides synthétiques.
Le terme «modification» ou «mutation» tel qu'utilisé ici par rapport à une position ou un résidu d'acide aminé signifie que l'acide aminé dans la position considéré a été modifié par rapport à l'acide aminé de la protéine de type sauvage de référence. De telles modifications comprennent les substitutions, délétions et / ou insertions d'un ou plusieurs acides aminés, et notamment 1 à 5, 1 à 4, 1 à 3, 1 à 2 acides aminés, à une ou plusieurs positions, et notamment à 1, 2, 3, 4, 5 ou plus positions. Le terme «substitution», en relation avec une position ou un résidu d'acides aminés, signifie que l'acide aminé dans la position particulière a été remplacé par un autre acide aminé que celui dans l'ADN polymérase sauvage ou parente. De préférence, le terme "substitution" désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus naturels d'acides aminés standards, les résidus d'acide aminé d'origine naturelle rares (par exemple, l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-methylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-ethylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N- méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique, ornithine), et les résidus d'acide aminé non naturels rares, souvent fabriqués synthétiquement (par exemple, la norleucine, la norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, le terme "substitution" désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards d'origine naturelle (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La substitution peut être une substitution conservatrice ou non conservatrice. Les substitutions conservatrices se font au sein d'un même groupe d'acides aminés, parmi les aminés basiques (arginine, lysine et histidine), les acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), les acides aminés polaires (glutamine et asparagine), les acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine et valine), les acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane et tyrosine) et les petits acides aminés (glycine, alanine, serine et thréonine). Dans le présent document, la terminologie suivante est utilisée pour désigner une substitution: R454F indique que le résidu d'acide aminé en position 454 de la SEQ ID N °1 (arginine, R) est remplacé par une phénylalanine (F). N474S/T/N/Q signifie que le résidu d'acide aminé en position 474 (Asparagine, N) peut être remplacé par une sérine (S), une thréonine (T), une asparagine (N) ou une glutamine (Q). Le signe "+" indique une combinaison de substitutions.
L'invention a trait à des variants d'ADN polymérases de la famille polX (EC 2.7.7.7 ; Advances in Protein Chemistry, Vol. 71 , 401 -440) capables de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, et notamment un brin d'ADN ou d'ARN. Les ADN polymérases de la famille polX comprennent notamment l'ADN polymérase Ροΐβ (UniProt P06746 chez humain ; Q8K409 chez la souris), la Ροΐσ, la Ροΐ (UniProt Q9UGP5 chez humain ; Q9QUG2 et Q9QXE2 chez la souris) et la Ροΐμ (UniProt Q9NP87 chez humain ; Q9JIW4 chez la souris), la Pol4 (UniProt A7TER5 chez la levure Vanderwaltozyma polyspora ; P25615 chez la levure Saccharomyces cerevisiae), et les Désoxyribonucléotidyl-transférase terminale ou TdT (EC 2.7.7.31 ; UniProt P04053 chez humain ; P09838 chez la souris).
L'invention a plus particulièrement pour objet un variant d'ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, ou un variant d'un fragment fonctionnel d'une telle polymérase, ledit variant comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en T331, G332, G333, F334, R336, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399, D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, R454, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 et A510, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec, ou référence à, la séquence SEQ ID N°l .
Dans un mode de réalisation, le variant est capable de un brin d'ADN et/ou un brin d' ARN.
Par « comprendre au moins une mutation » ou « comprenant au moins une mutation », on entend que le variant présente une ou plusieurs mutations telles qu'indiquées par rapport à la séquence polypeptidique SEQ ID N°l, mais qu'il peut présenter d'autres modifications, notamment des substitutions, des délétions ou des additions.
D'une manière générale, la mutation d'un ou plusieurs résidus aux positions ci-dessus permet l'élargissement de la poche catalytique (en ciblant par exemple les positions W450, D434, D435, H342, D343, T331, R336, D399, R461, et/ou R508), l'accroissement de l'accessibilité à la poche catalytique (en ciblant par exemple les positions R458, E455, R454, A397, K338, et/ou N509), et/ou confère une plus grande flexibilité à la structure de l'enzyme lui permettant de recevoir des nucléotides modifiés présentant un encombrement stérique important (en ciblant par exemple les positions V436, F346, V344, F334, M330, L448, E491, E457 et/ou N474).
Les variants objets de la présente invention peuvent être des variants de Pol IV, Pol μ, Ροΐβ, Ροΐ ou de TdT, préférentiellement des variants de Pol IV, Pol μ, ou TdT. De manière alternative, les variants peuvent être des variants d'enzymes chimères, combinant par exemple des portions de séquences différentes d'au moins deux ADN polymérases de la famille polX. Dans un mode de réalisation particulier, le variant présente au moins 60% d'identité avec la séquence selon SEQ ID N°l, préférentiellement au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et moins de 100% d'identité avec la séquence selon SEQ ID N°l .
Selon l'invention, la mutation peut consister en une substitution, une délétion ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acide aminé. Dans le cas de délétion, l'annotation X est utilisée, qui indique que le codon codant pour le résidu considéré est remplacé par un codon STOP, tous les acides aminés suivant ainsi que le résidu en question sont donc supprimés. Ainsi, la mutation D501X signifie que l'enzyme se termine au niveau du résidu précédent l'acide aspartique (D) à la position 501, c'est-à-dire la leucine (L) en position 500, tous les résidus au-delà ayant été supprimés. L'annotation 0 désigne par contre une simple délétion ponctuelle du résidu considéré. Ainsi, la mutation D5O10 signifie que l'acide aspartique (D) à la position 501 a été supprimé.
Préférentiellement, le variant selon l'invention comprend au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en T331, G332, G333, F334, R336, D343, L447, L448, G449, W450, G452, R454, Q455, E457 et R508, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, R454, E457, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°1. Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une mutation d'un résidu à au moins deux positions sélectionnées dans le groupe consistant en R336, R454 et E457, préférentiellement une mutation d'un résidu auxdites trois positions R336, R454 et E457, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l . Dans un mode de réalisation particulier, le variant comprend en outre au moins une mutation d'un résidu dans au moins la région semi-conservée de séquence X1X2GGFR1R2GKX3X4 (SEQ ID N°4), dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi M, I, V, L
X2 représente un résidu choisi parmi T, A, M, Q X3 représente un résidu choisi parmi M, K, E, Q, L, S, P, R, D
X4 représente un résidu choisi parmi T, I, M, F, K, V, Y, E, Q, H, S, R, D.
Préférentiellement, ledit variant présente au moins une substitution d'un résidu à au moins une position Ri, R2 et/ou K de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°4. Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant comprend en outre au moins une mutation d'un résidu dans au moins une région semi-conservée de séquence XiX2LGX3X4GSRiX5X6ER2 (SEQ ID N°5) dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi A, C, G, S
X2 représente un résidu choisi parmi L, T, R
X3 représente un résidu choisi parmi W, Y
X4 représente un résidu choisi parmi T, S, I
X5 représente un résidu choisi parmi Q, L, H, F, Y, N, E, D ou 0
X6 représente un résidu choisi parmi F, Y
Préférentiellement, ledit variant présente au moins une substitution d'un résidu à au moins une position S, Ri et/ou E de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°5.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant comprend en outre au moins une mutation d'un résidu dans au moins une région semi-conservée de séquence LXiYX2X3PX4X5RNA (SEQ ID N°6) dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi D, E, S, P, A, K
X2 représente un résidu choisi parmi I, L, M, V, A, T
X3 représente un résidu choisi parmi E, Q, P, Y, L, K, G, N
X4 représente un résidu choisi parmi W, S, V, E, R, Q, T, C, K, H
X5 représente un résidu choisi parmi E, Q, D, H, L.
Préférentiellement, ledit variant présente au moins une délétion du résidu à la position Xi et/ou au moins une substitution au niveau des positions R et/ou N de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°6. Dans un mode de réalisation particulier, le variant comprend une substitution d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, K338, H342, A397, S453, R454, E457, N474, D501, Y502, 1503, R508 et N509, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement une substitution d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, A397, R454, E457, N474, D501, Y502 et 1503, ou un résidu fonctionnellement équivalent, plus préférentiellement au moins une substitution d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, R454, E457, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°1. L'invention concerne de préférence un variant d'une ADN polymérase de la famille polX comprenant au moins une substitution parmi le groupe consistant en R336K/H/G/N/D, K338A/C/G/S/T/N, H342A/C/G/S/T/N, A397R/H/K/D/E, S453A/C/G/S/T, R454F/Y/W/A, E457G/N/S/T, N474S/T/N/Q, D501A/G/X, Y502A/G/X, I503A/G X, R508A/C/G/S/T, N509A/C/G/S/T. Dans un mode de réalisation particulier, le variant comprend une substitution d'un résidu à au moins deux positions sélectionnées dans le groupe consistant en R336, R454, E457, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement une substitution d'un résidu auxdites trois positions, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°l . Notamment, Les substitutions sont choisies parmi le groupe consistant en R336K/H/G/N/D, R454F/Y/W/A et E457N/D/G/S/T, préférentiellement parmi le groupe consistant en R336N/G, R454A et E457G/N/S/T.
Dans un mode de réalisation, le variant comprend au moins une substitution selon E457G/N/S/T.
Avantageusement, le variant comprend une combinaison de substitutions sélectionnées dans le groupe mentionné ci-dessus. La combinaison peut consister en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 substitutions sélectionnées dans ce groupe.
L'invention a plus particulièrement pour objet des variants d'une ADN polymérase de la famille polX capables de synthétiser une molécule d'acide nucléique, tel qu'un brin d'ADN ou d'ARN sans brin matrice, ou d'un fragment fonctionnel d'une telle polymérase, lesdits variants comprenant au moins une combinaison de mutations décrites dans le tableau 1, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N° 1.
Dans un mode de réalisation, le variant d'ADN polymérase de la famille polX comprend une combinaison de substitutions parmi R336G - E457N ; R336N - E457N ; R336N - R454A - E457N ; R336N - R454A - E457G ; R336N - E457G ; et R336G - R454A - E457N.
Tableau 1 : Exemples de combinaisons de mutations de variants d'ADN polymérase de la famille polX
Combinaisons de mutations
DSI R454F - E457N - A397D
DS2 R454F - E457N
DS3 R454Y - E457N - A397D
DS4 R454Y - E457N
DS5 R454W - E457N - A397D
DS6 R454W - E457N
DS7 R335A - E457N - A397D
DS8 R335A - E457N
DS9 R335G - E457N - A397D
DS10 R335G - E457N
DS11 R335N - E457N - A397D
DS12 R335N - E457N
DS13 R335D - E457N - A397D
DS14 R335D - E457N
DS15 R336K - E457N - A397D
DS16 R336K - E457N
DS17 R336H - E457N - A397D
DS18 R336H - E457N
DS21 R336G - E457N - A397D
DS22 R336G - E457N
DS23 R336N - E457N - A397D
DS24 R336N - E457N
DS25 R336D - E457N - A397D
DS26 R336D - E457N
DS27 R454A - E457N
DS28 R454A - E457A
DS29 R454A - E457G
DS30 R454A - E457D DS31 E457N
DS32 E457D
DS33 R454A - E457N - A397D
DS34 R454A - E457N - A397K
DS35 R454A - E457N - N474S
DS36 R454A - E457D - A397D
DS37 D501X
DS38 D501X- E457N
DS39 D501X- E457N - A397D
DS40 R454F- E457S-A397D
DS41 R454F - E457S
DS42 R454Y- E457S-A397D
DS43 R454Y - E457S
DS44 R454W - E457S - A397D
DS45 R454W - E457S
DS46 R335A- E457S-A397D
DS47 R335A- E457S
DS48 R335G - E457S-A397D
DS49 R335G - E457S
DS50 R335N - E457S- A397D
DS51 R335N - E457S
DS52 R335D- E457S-A397D
DS53 R335D- E457S
DS54 R336K- E457S- A397D
DS55 R336K- E457S
DS56 R336H - E457S- A397D
DS57 R336H - E457S
DS60 R336G - E457S-A397D
DS61 R336G - E457S
DS62 R336N - E457S- A397D
DS63 R336N - E457S
DS64 R336D- E457S-A397D DS65 R336D- E457S
DS66 R454A - E457S
DS70 E457S
DS72 R454A - E457S - A397D
DS73 R454A - E457S - A397K
DS74 R454A - E457S - N474S
DS75 D501X - E457S
DS76 D501X- E457S- A397D
DS77 R454F - E457T - A397D
DS78 R454F - E457T
DS79 R454Y- E457T- A397D
DS80 R454Y - E457T
DS81 R454W - E457T - A397D
DS82 R454W - E457T
DS83 R335A- E457T- A397D
DS84 R335A- E457T
DS85 R335G - E457T- A397D
DS86 R335G - E457T
DS87 R335N - E457T- A397D
DS88 R335N - E457T
DS89 R335D- E457T- A397D
DS90 R335D- E457T
DS91 R336K- E457T- A397D
DS92 R336K- E457T
DS93 R336H - E457T- A397D
DS94 R336H - E457T
DS97 R336G - E457T- A397D
DS98 R336G - E457T
DS99 R336N - E457T- A397D
DS100 R336N - E457T
DS101 R336D- E457T- A397D
DS102 R336D- E457T DS103 R454A - E457T
DS104 E457T
DS105 R454A - E457T - A397D
DS106 R454A - E457T - A397K
DS107 R454A - E457T - N474S
DS108 D501X - E457T
DS109 D501X- E457T- A397D
DS110 D502X
DS111 D502X- E457N
DS112 D502X- E457TN - A397D
DS113 D502X - E457S
DS114 D502X- E457S- A397D
DS115 D502X - E457T
DS116 D502X- E457T- A397D
DS117 D503X
DS118 D503X- E457N
DS119 D503X- E457TN - A397D
DS120 D503X - E457S
DS121 D503X- E457S- A397D
DS122 D503X - E457T
DS123 D503X- E457T- A397D
DS124 R336N-R454A-E457N
DS125 R336N-R454A-E457G
DS126 R336N-E457G
DS127 R336G-R454A-E457N
Dans un mode de réalisation particulier, le variant est une construction chimérique d'ADN polymérases de la famille polX. Par « construction chimérique », on entend une enzyme chimère constituée par l'apport, et notamment la fusion ou la conjugaison, d'une ou plusieurs séquences déterminées d'une enzyme membre de la famille polX en remplacement d'une ou plusieurs séquences homologues dans le variant d'ADN polymérase considéré. Ainsi, l'invention propose un variant de la TdT de séquence SEQ ID N°l comprenant, outre une ou plusieurs mutations ponctuelles à l'une et/ou l'autre des positions ci-dessus, une substitution des résidus compris entre les positions C378 à L406, ou les résidus fonctionnellement équivalents, par les résidus H363 à C390 de la polymérase Ροΐμ de séquence SEQ ID N°2, ou les résidus fonctionnellement équivalents.
De manière alternative ou additionnelle, les variants objets de la présente invention peuvent présenter une délétion d'un ou plusieurs résidus successifs d'acides aminés au niveau de la partie N-terminale. Ces délétions peuvent notamment cibler un ou des domaines enzymatiques impliqués dans la liaison avec d'autres protéines et/ou impliqués dans la localisation cellulaire. Par exemple la séquence polypeptidique de la TdT comprend en N-terminal un domaine BRCT d'interaction avec d'autres protéines telles que Ku70/80 et un domaine de localisation au niveau du noyau (NLS).
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le variant est un variant de la TdT de séquence SEQ ID N°l présentant, outre une ou plusieurs des mutations décrites ci- dessus, une suppression des résidus 1-129 correspondant à l'extrémité N-terminale de la TdT sauvage.
Dans certains cas particuliers, les stratégies de mutagénèse peuvent être guidées par des informations connues telles que les séquences de variants naturels, la comparaison de séquence avec des protéines liées, des propriétés physiques, l'étude d'une structure tridimensionnelle ou de simulations informatique impliquant plusieurs entités.
La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice selon la présente invention. La présente invention concerne également une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un plasmide et un vecteur viral.
L'acide nucléique codant pour le variant d'ADN polymérase peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN, un mélange des deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Il peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, la recombinaison, la mutagenèse, etc..
La cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression du variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice selon la présente invention, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette d'expression comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d' ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology).
La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une cassette d'expression codant pour un variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice selon la présente invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire qu'il comprend les éléments nécessaires à l'expression du variant dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple E. coli, ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, P. Pastoris ou K. lactis) ou un champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une cellule d'insecte (Sf9 ou Sf21 par exemple), de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS (lignée cellulaire de singe vert) (par exemple, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651), CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335, CHO-K1 (ATCC CCL-61)), des cellules de souris et des cellules humaines. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non- humaine et non-embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc.. Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233- 3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE-30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non- exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc.. De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide ou un vecteur viral.
La séquence codant le variant selon la présente invention peut comprendre ou ne pas comprendre de peptide signal. Dans le cas où elle n'en comprend pas, une méthionine peut être éventuellement ajoutée à l'extrémité N-terminale. Dans une autre alternative, un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal hétérologue peut être dérivé d'un procaryote tel que E. coli ou d'un eucaryote, notamment une cellule mammifère, d'insecte ou d'une levure.
La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice et son utilisation pour produire un variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice recombinant selon la présente invention. Le terme « cellule hôte » englobe les cellules filles résultant de la culture ou de la croissance de cette cellule. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Elle concerne également une méthode de production d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice produit par la cellule. Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de production d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice recombinant selon la présente invention comprenant la fourniture d'une cellule comprenant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice produit par la cellule. En particulier, la cellule peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l'acide nucléique codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de protéines recombinantes sont bien connues par l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446 582, Wang et al. (Sci. Sin. B 24: 1076-1084, 1994 et Nature 295, page 503) pour une production dans E. coli, et JAMES et al. (Protein Science (1996), 5 :331-340) pour une production en cellules mammifères.
Les variants d'ADN polymérase selon la présente invention sont particuliers intéressants pour la synthèse d'acides nucléiques sans brin matrice. Plus particulièrement, les variants selon l'invention présentent une poche catalytique accrue particulièrement adaptée pour la synthèse d'acide nucléique au moyen de nucléotides modifiés présentant un encombrement plus important que les nucléotides naturels. Les variants selon l'invention peuvent notamment permettre d'incorporer dans un brin d'acide nucléique des nucléotides modifiés tels que ceux décrits dans la demande WO2016/034807.
La cinétique d'incorporation des variants d'ADN polymérase, et notamment des variants de la TdT selon l'invention, présentant les mutations ou les combinaisons de mutations spécifiques décrites ci-dessus, est largement améliorée comparativement à la cinétique d'incorporation d'un ADN polymérase sauvage. Ces variants peuvent avantageusement être utilisés dans le cadre d'une méthode de synthèse d'ADN enzymatique à hautes performances.
L'invention a donc également pour objet une utilisation d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la présente invention, pour synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides modifiés en 3' -OH, et notamment ceux décrits dans la demande WO2016034807.
L'invention a également pour objet un procédé de synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, selon lequel on met en contact un brin amorce avec au moins un nucléotide, préférentiellement un nucléotide modifié en 3'-OH, en présence d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'invention.
De manière avantageuse, les variants selon l'invention peuvent être utilisés pour mettre en œuvre le procédé de synthèse décrit dans la demande WO2015/159023.
L'invention a également pour objet un kit pour la synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice comprenant au moins un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'invention, des nucléotides, préférentiellement des nucléotides modifiés en 3'-OH, et optionnellement au moins une amorce nucléotidique.
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif.
Exemples
Exemple 1 - Génération, production et purification de variants d'ADN polymérase de la famille polX selon l'invention
Génération des souches productrices
Le gène tronqué de la TdT de souris a été généré à partir du plasmide pET28b dont la construction est décrite dans [Boulé et al, 1998, Mol. Biotechnol, 10, 199-208]. La séquence correspondante SEQ ID N°3 (correspondant à SEQ ID N°l tronquée des 120 premiers acides aminés) a été amplifiée en utilisant les amorces suivantes:
❖ T7-pro: TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID N°7)
❖ T7-ter: GCTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID N°8) selon des techniques d'amplification PCR et de biologie moléculaire usuelles. Elle a été clonée dans un plasmide pET32 pour donner le vecteur pET32- SEQ ID N°3.
Le plasmide pET32- SEQ ID N°3 a d'abord été séquencé puis transformé dans les souches E. coli commerciales BL21 (DE3) (Novagen). Les colonies capables de pousser sur boites kanamycine/chloramphénicol ont été isolées et notées Ec- SEQ ID N°3
Génération des variants
Le vecteur pET32- SEQ ID N°3 a été utilisé comme vecteur de départ. Des amorces comportant la mutation ponctuelle (ou dans certains cas les mutations ponctuelles si celles-ci sont suffisamment proches) ont été générés à partir de l'outil en ligne d'Agilent :
Figure imgf000025_0001
Le kit QuickChange II (Agilent) a été utilisé pour générer les plasmides des variants comportant la/les mutation(s) désirée(s). Le protocole de mutagénèse donner par le fabriquant a été respecté scrupuleusement afin d'obtenir un plasmide pET32-DSi (i est le numéro du variant considéré donné par le tableau 1). A la fin de la procédure, le plasmide pET32-DSx a été d'abord séquencé puis transformé dans les souches E. coli commerciales BL21 (DE3) (Novagen). Les colonies capables de pousser sur boites kanamycine/chloramphénicol ont été isolées et notées Ec-DSx.
Production
Les cellules Ec- SEQ ID N°3 et Ec-DSx ont été mises en préculture dans un erlen de 250 mL contenant 50 mL de milieu LB auquel ont été ajoutées des quantités appropriées de kanamycine et chloramphénicol. La culture a été incubée à 37°C sous agitation durant toute une nuit. La préculture a ensuite été utilisée pour ensemencer un erlen de 5 L contenant 2 L de milieu LB additionné des quantités appropriées de kanamycine et chloramphénicol. La densité optique (DO) de départ était de 0,01. La culture a été incubée à 37°C sous agitation. La DO a été régulièrement mesurée jusqu'à atteindre une valeur comprise entre 0,6 et 0,9. Une fois cette valeur atteinte, 1 mL d'isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside 1 M a été ajouté au milieu de culture. La culture a été de nouveau incubée à 37°C jusqu'au lendemain. Les cellules ont alors été récoltées par centrifugation sans excéder les 5 000 rpm. Les différents culots obtenus ont été rassemblés dans un culot unique au cours de lavage avec du tampon de lyse (20 mM Tris- HC1, pH 8.3, 0.5 M NaCI). Le culot de cellules a été congelé à -20°C. Il peut être conservé ainsi durant plusieurs mois. Extraction
Le culot de cellule congelé lors de l'étape précédente a été décongelé dans un bain-marie porté entre 25 et 37°C. Une fois entièrement décongelé il a été re-suspendu dans environ 100 mL de tampon de lyse. Une attention particulière a été portée à la re-suspension qui doit aboutir à une solution très homogène et notamment à l'absence totale d'agrégats. Ainsi re-suspendue, les cellules ont été lysées à l'aide d'une presse de French sous une pression de 14 000 psi. Le lysat recueillit a été centrifugé à haute vitesse, 10 000 g durant lh à lh30. Le centrifugat a été filtré sur filtre 0,2 μΜ et recueilli dans un tube de volume suffisant.
Purification La TdT a été purifiée sur colonne d'affinité. Des colonnes 5 mL His-Trap Crude (GE Life Sciences) ont été utilisées avec des pompes péristaltiques (Peristaltic Pump - MINIPULS® Evolution, Gilson). Dans un premier temps la colonne a été équilibrée à l'aide de 2 à 3 CV (volume de colonne) de tampon de lyse. Le centrifugat de l'étape précédente a alors été chargé sur la colonne à une vitesse comprise entre 0,5 et 5 mL/min environ. Une fois la totalité de centrifugat chargée, la colonne a été lavée à l'aide de 3 CV de tampon de lyse puis 3 CV de tampon de lavage (20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 0.5 M NaCI, 60 mM imidazol). A la fin de cette étape le tampon d'élution (20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 0.5 M NaCI, 1 M imidazol) a été injecté dans la colonne à environ 0,5 à 1 ml/min pour un volume total de 3 CV. Durant toute la phase d'élution la sortie de colonne a été collectée par fractions de 1 mL. Ces fractions ont été analysées par SDS-PAGE afin de déterminer quelles sont les fractions contenant le pic d'élution. Une fois déterminées, celles-ci ont été rassemblées dans une fraction unique et dialysée contre du tampon de dialyse (20 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM NaCI, 50 mM MgOAc, 100 mM [NH4]2S04. La TdT a alors été concentrée (Filtres à centrifuger Amicon Ultra-30, Merk Millipore) jusqu'à une concentration finale de 5 à 15 mg/mL. La TdT concentrée a été congelée à -20°C pour le stockage à long terme après addition de 50% glycérol. Durant l'intégralité de la phase de purification, des aliquotes des différents échantillons ont été prélevés (environ 5 μί) pour une analyse en gel SDS-PAGE dont les résultats sont présentés par la figure 1. Exemple 2 - Alignement de séquences entre différentes polymérases de la famille des Pol X susceptibles d'être utilisées pour la création de variants selon l'invention
Différentes ADN polymérases de la famille des Pol X ont été alignées en utilisant le logiciel d'alignement en ligne Mutalin (http://m¾ltalinioulou einra r/½ultalin,½ultaliri.html. accédé le 04/04/2016).
Tableau 2 : Séquences alignées
Figure imgf000027_0001
Les alignements obtenus sont présentés à la figure 2.
Exemple 3 - Etude d'activité des variants en présence de substrats non naturels
L'activité de différents variants selon l'invention a été déterminée par l'essai suivant. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec l'enzyme naturelle dont chacun des variants est issu. Test d'activité
Tableau 3 : Mélange réactionnel
Figure imgf000028_0001
L'amorce utilisée, de séquence 5 '-AAAAAAAAAAGGGG-3 ' (SEQ ID N°14), a été préalablement marquée radioactivement en 5' au moyen d'un protocole standard de marquage impliquant l'enzyme PNK (NEB) et l'usage d'ATP radioactif (PerkinElmer).
Le tampon lOx constitué de 250 mM Tris-HCl pH 7,2, 80 mM MgC , 3,3 mM ZnS04 a été utilisé.
Les nucléotides modifiés utilisés sont des 3'-0-amino-2',3'-dideoxynucléotides-5'-triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences) ou des 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxynucléotides-5'-triphosphate (Biot-EDA, Jena Biosciences), tels que 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate ou 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate par exemple. Le groupement 3'-0-amino est un groupement plus volumineux fixé sur l'extrémité 3'-OH. Le groupement 3'-biot-EDA est un groupement extrêmement volumineux et non flexible fixé sur l'extrémité 3'-OH. Les performances d'incorporation d'un nucléotide modifié données par les variants listés dans le table 1, par rapport à la TdT naturelle (SEQ ID N°3) ont été évaluées en réalisant des tests d'activité simultanés, pour lesquels seuls l'enzyme varie.
Les réactifs ont été ajoutés dans l'ordre donné dans le tableau 3 ci-dessus puis incubés à 37°C pendant 90min. La réaction a alors été stoppée par l'ajout de bleu formamide (formamide 100%, 1 à 5 mg de bleu de bromophénol; Simga) Gel et radiographie
Un gel dénaturant de polyacrylamide 16% (Biorad) a été utilisé pour l'analyse du test d'activité précédent. Le gel a été préalablement coulé et laissé à polymériser. Il a ensuite été monté sur une cuve à électrophorèse de dimensions appropriées remplie de tampon TBE (Sigma). Les différents échantillons ont été directement chargés sur le gel sans pré-traitement.
Le gel a alors été soumis à une différence de potentiel de 500 à 2 000 V durant 3 à 6 heures. Une fois la migration satisfaisante, le gel a été désincarcé puis transféré dans une cassette d'incubation. Un écran phosphore (Amersham) a été utilisé pendant 10 à 60 min pour la révélation effectuée à l'aide d'un instrument Typhoon (GE Life Sciences) préalablement paramétré avec un mode de détection adéquat.
Résultats
Les résultats comparatifs des deux enzymes utilisées sont présentés par la figure 3.
Plus précisément, sur le premier gel (Incorporation ONH2), la TdT naturelle (colonne wt) est incapable d'incorporer les nucléotides modifiés 3'-0-amino-2',3'-dideoxyadenosine-5'- triphosphate comme le montre la comparaison avec le contrôle négatif (colonne No).
Parmi les différents variants, 3 groupes différents peuvent être observés :
Un premier groupe de variants (colonnes DS7 à DS34) est capables d'une incorporation à 50% environ.
Un second groupe de variants (colonnes DS46 à DS73) est capables d'une incorporation à plus de 95%, parfois plus de 98%.
Un troisième groupe de variants (colonnes DS83 à DSI 06) est capable d'une incorporation entre 60 et 80%.
Sur le second gel (Incorporation Biot-EDA), la TdT naturelle (colonne wt) est également incapable d'incorporer les nucléotides modifiés 3'-biot-EDA-2',3'-dideoxyadenosine-5'- triphosphate comme le montre la comparaison avec le contrôle négatif (colonne No). Parmi les différents variants, 3 groupes différents peuvent être observés :
Un premier groupe de variants (colonnes DS7 à DS34) est capable d'une incorporation entre 5 et 10% environ.
Un second groupe de variants (colonnes DS46 à DS73) est capable d'une incorporation à plus de 30%, parfois plus de 40%.
Un troisième groupe de variants (colonnes DS83 à DSI 06) est capable d'une incorporation entre 10 et 25%.
Ces résultats confirment que les variants de TdT selon l'invention sont tous capables d'utiliser comme substrat des nucléotides modifiés, notamment en 3'-OH, contrairement à l'enzyme sauvage. De manière particulièrement avantageuse, certains variants présentent des taux d'incorporation très élevés et cela même en présence de nucléotides portant des modifications tendant à augmenter de manière très importante l'encombrement stérique dudit nucléotide.
Exemple 4 - Etude de la cinétique des variants selon l'invention
Un mutant présentant la combinaison de substitutions R336N - R454A - E457N (DS124) a été généré et produit suivants l'exemple 1 précédent.
Test d'activité
Dans le test d'activité les enzymes sont mises en présence de nucléotides modifiés ONH2 et incubé à 37°C suivant différent temps. Les réactions sont arrêtées afin d'observer la cinétique d'incorporation de DS124 et la comparer à la cinétique de l'enzyme naturelle WT (SEQ ID N°3).
Tableau 4 : Mélange réactionnel
Figure imgf000030_0001
L'amorce et le tampon utilisés sont conformes à l'exemple 3.
Les nucléotides modifiés utilisés sont des 3'-0-amino-2',3'-dideoxynucléotides-5'-triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences) : 3'-0-amino-2',3'-dideoxyguanosine-5'-triphosphate, 3'-0- amino-2',3'-dideoxycytidine-5'-triphosphate et 3'-0-amino-2',3'-dideoxythymidine-5'- triphosphate. Le groupement 3'-0-amino est un groupement plus volumineux fixé sur l'extrémité 3 '-OH.
Les performances d'incorporation du mélange de nucléotides par l'enzyme DS124 ont été évaluées en réalisant des tests d'activité pour lesquels des premix contenant tous les réactifs (ajouté dans l'ordre du tableau 4) mis à part l'amorce, sont préparés. Ils sont distribués dans différent puits réactionnels. Au temps initial t=0 l'amorce est ajoutée dans tous les puits de façon simultanée. Aux différents temps t=2min, t=5min, t=10min, t=15min, t=30min et t=90min la réaction est stoppée par l'ajout de bleu formamide (formamide 100%, 1 à 5 mg de bleu de bromophénol; Simga).
Gel et radiographie L'analyse du test d'activité est réalisée par migration des différents échantillons dans un gel de polyacrylamide suivant le protocole décrit dans l'exemple 3.
Résultats
Les résultats comparatifs des deux enzymes (DS124 et WT) sont présentés par la figure 4.
Plus précisément, sur ce gel le contrôle négatif (colonne No) donne la taille attendue de l'amorce utilisée lorsqu'elle n'a pas été allongée, c'est-à-dire lorsqu'il n'y a pas eu d'incorporation de nucléotides. La TdT naturelle (colonne WT) n'est pas capable d'incorporer les nucléotides modifiés (ici ONH2-dGTP) : on observe une bande au même niveau que celle de la colonne No.
Pour tous les nucléotides testés et pour tous les temps allant de 90min (ici utilisé comme un contrôle positif) à 2min, soit une réduction du temps d'incubation d'un facteur 45, le variant DS124 est capable d'incorporer les nucléotides modifiés avec une efficacité apparente de 100%. Ces résultats confirment que les variants de la TdT selon l'invention sont capables de performances d'incorporation bien supérieures à celles de la TdT naturelle, tant en termes d'efficacité d'incorporation que de rapidité d'incorporation. La cinétique des variants de la TdT selon l'invention est largement améliorée par les mutations ou combinaisons de mutations spécifiques décrites par la présente invention.
Exemple 5 - Etude de la spécificité des variants selon l'invention
Les mutants présentant une combinaison de substitution selon le tableau 5 ci-dessous ont été générés et produits suivant l'exemple 1.
Tableau 5 : Liste des variants enzymatiques utilisés
Figure imgf000032_0001
Test d'activité
Dans ce test d'activité les différents variants ont été mis en présence d'un mélange de nucléotides naturels et de nucléotides modifiés hautement concentré. La concentration de l'enzyme est également augmentée afin de raccourcir le temps d'incubation et de parvenir à une addition quantitative (cf. exemple 4).
L'activité de différents variants générés a été déterminée par l'essai suivant : Chaque variant est testé selon deux conditions : (1) en l'absence de nucléotides (remplacés par H20) ou (2) en présence du mélange de nucléotides. Les résultats des différents variants sont comparés entre eux. Un échantillon de contrôle a été ajouté, il ne contenait ni nucléotide ni enzyme (remplacés par H20). Tableau 6 : Mélange réactionnel
Figure imgf000033_0001
L'amorce et le tampon utilisés sont identiques à l'exemple 3.
Lorsqu'il est présent, le mélange de nucléotides est constitué de nucléotides naturels 2'- deoxynucleotide 5'-triphosphate (Nue, Sigma- Al drich) tels que des 2'-deoxyguanosine 5'- triphosphate (dGTP) et de nucléotides modifiés 3'-0-amino-2',3'-dideoxynucléotides-5'- triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences) tels que 3'-0-amino-2',3'-dideoxyguanosine-5'- triphosphate par exemple. Le groupement 3'-0-amino est un groupement plus volumineux fixé sur l'extrémité 3'-OH. Le mélange est constitué à 90% de nucléotides modifiés ONH2-dGTP et à 10% de nucléotides naturels dGTP.
Les performances d'incorporation du mélange de nucléotides par les variants listés dans le tableau 5 entre eux ont été évaluées en réalisant des tests d'activité simultanés, pour lesquels seule l'enzyme varie.
Les réactifs ont été ajoutés dans l'ordre donné dans le tableau 6 ci-dessus, puis incubés à 37°C pendant 15min. La réaction a alors été stoppée par l'ajout de bleu formamide (formamide 100%, 1 à 5 mg de bleu de bromophénol; Simga). Gel et radiographie
L'analyse du test d'activité a été réalisée par migration des différents échantillons dans un gel de polyacrylamide suivant le protocole décris dans l'exemple 3. Résultats
Les résultats comparatifs des enzymes utilisées sont présentés à la figure 5.
Plus précisément, sur ce gel le contrôle négatif (colonne No) donne la taille attendu de l'amorce utilisée lorsqu'elle n'a pas été allongée, c'est-à-dire lorsqu'il n'y a pas eu d'incorporation de nucléotides. Les échantillons suivants vont par paire, chaque paire correspondant à un même variant enzymatique testé dans les deux conditions : en l'absence et en présence de nucléotides (sous forme de mélange lorsqu'ils sont présents).
Parmi les différents variants testés, 3 groupes différents peuvent être observés :
Le premier groupe est le variant DS128, constituant un contrôle négatif. Ce variant présente des taux extrêmement faibles d'incorporation des nucléotides : entre 5% et 10% d'incorporation sont observés lorsque le mélange de nucléotides est présent ; ce qui correspond à la proportion de nucléotides naturels présents dans le mélange.
Le second groupe est constitué par les variants DS127 et DS22. Ces variants présentent des taux d'incorporation élevés des nucléotides: entre 50% et 60%> d'incorporation sont observés lorsque le mélange de nucléotides est présent. Toujours dans ce cas, une bande de sur-addition correspondant à l'incorporation successive de deux nucléotides est observée pour ces deux variants. L'intensité de cette bande correspond à la proportion de nucléotides naturels présents dans le mélange de nucléotides.
Le dernier groupe est constitué par les variants DS124, DS24, DS125 et DS126. Ces variants présentent des taux d'incorporation extrêmement élevés des nucléotides: entre 80%> et 100%, pour DS 124 et DS 125, lorsque le mélange de nucléotides est présent. Dans ce cas, aucune bande de sur-addition n'est présente. Dans le cas des variants DS24 et DS126 la proportion de non incorporation est semblable à la proportion de nucléotides naturels présents dans le mélange.
Ces résultats confirment que les variants de la TdT selon l'invention sont capables d'utiliser préférentiellement les nucléotides modifiés parmi un mélange de nucléotides modifiés et de nucléotides naturels. De manière particulièrement avantageuse ces variants présentent des taux d'incorporation extrêmement élevés des nucléotides modifiés et sont capables de discriminer les nucléotides naturels de façon à ne pas les incorporer et ainsi améliorer grandement la qualité de l'ADN synthétiser en évitant les sur-additions.
Exemple 6 - Exemple de synthèse d'un brin d'ADN sans brin matrice
Un variant de TdT présentant la combinaison de substitutions R336N - R454A - E457G (DS125) a été généré et produit selon l'exemple 1.
Le variant DS125 est utilisé afin de synthétiser la séquence : 5 '- GTACGCTAGT-3 ' (SEQ ID N°15) à la suite de l'amorce de séquence 5 '-AAAAAAAAAAGGGG-3 ' (SEQ ID N°14). L'amorce a été préalablement marquée radioactivement en 5' au moyen d'un protocole standard de marquage impliquant l'enzyme PNK (NEB) et l'usage d'ATP radioactif (PerkinElmer). L'amorce est fixée à un support solide par interaction avec un fragment de capture de séquence : 5'- CCTTTTTTTTTT -3' complémentaire (SEQ ID N°16). Le fragment de capture possède sur son extrémité 3' un groupement lui permettant de réagir de façon covalente avec un groupe réactionnel fixé sur une surface. Par exemple ce groupement peut être NH2, le groupe réactionnel N-hydroxysuccinimide et la surface une bille magnétique (Dynabeads, Thermo fïsher). L'interaction de l'amorce avec le fragment de capture est réalisée dans des conditions standard d'hybridation de fragment d'ADN.
Les nucléotides modifiés utilisés sont des 3'-0-amino-2',3'-dideoxynucléotides-5'-triphosphate (ONH2, Firebird Biosciences) tels que 3'-0-amino-2',3'-dideoxyguanosine-5'-triphosphate, 3'- 0-amino-2',3'-dideoxycytidine-5'-triphosphate, 3'-0-amino-2',3'-dideoxythymidine-5'- triphosphate ou 3'-0-amino-2',3'-dideoxytadénosine-5'-triphosphate. Le groupement 3'-0- amino est un groupement plus volumineux fixé sur l'extrémité 3'-OH.
Synthèse
Tableau 7: Mélange réactionnel
Figure imgf000035_0001
Le tampon 10x constitué de 250 mM Tris-HCl pH 7,2, 80 mM MgC12, 3,3 mM ZnS04 a été utilisé.
Le tampon de lavage L utilisé est constitué de Tris-HCl 25 mM à pH 7,2.
Le tampon de déprotection D utilisé est constitué d'acétate de sodium 50 mM pH 5,5 en présence de 10 mM MgC12.
Avant le démarrage de la synthèse, les billes constituant le support solide sur lesquelles ont été hybridées les amorces pour une quantité total équivalente d'amorce de 35 pmol, ont été lavées plusieurs fois avec le tampon L. Après ces lavages, les billes ont été maintenues sur un aimant et le surnageant retiré dans sa totalité.
Plusieurs premix constitués des différents réactifs ajoutés dans l'ordre du tableau 7 ont été préparés. Chacun de ces premix contient des nucléotides différents suivant le tableau 8 ci- dessous.
Tableau 8 : Composition des premix
Figure imgf000036_0001
La synthèse commence lorsque le premix 1 est ajouté aux billes préalablement lavées et débarrassées de leur surnageant. Les étapes de synthèse selon le tableau 9 ci-dessous s'enchaînent, afin de produire la nouvelle séquence 5'- GTACGCTAGT-3'. Tableau 9 : Etape du procédé de synthèse d'un brin d'ADN sans brin matrice
Etapes Action Volume Durée
Elongation 1 Ajout premix 1 350 [il 15min
Prélèvement 1 Prélèvement 5 [il <lmin
1er Lavage 1 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 1 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 1 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 1 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 2 Ajout premix 2 350 [il 15min
Prélèvement 2 Prélèvement 5 [il <lmin
1er Lavage 2 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 2 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 2 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 2 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 3 Ajout premix 3 350 [il 15min
Prélèvement 3 Prélèvement 5 [il <lmin
1er Lavage 3 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 3 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 3 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 3 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 4 Ajout premix 4 350 [il 15min
Prélèvement 4 Prélèvement 5 [il <lmin
1er Lavage 4 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 4 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 4 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 4 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 5 Ajout premix 5 350 [il 15min
Prélèvement 5 Prélèvement 5 [il <lmin
1er Lavage 5 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 5 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 5 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 5 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 6 Ajout premix 6 350 [il 15min
Prélèvement 6 Prélèvement 5 [il <lmin
1er Lavage 6 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 6 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 6 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 6 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 7 Ajout premix 7 350 [il 15min
Prélèvement 7 Prélèvement 5 μί <lmin
1er Lavage 7 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 7 Ajout tampon D 350 μί 15min
2nd Déprotection 7 Ajout tampon D 350 μί 15min
2nd Lavage 7 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 8 Ajout premix 8 350 μί 15min
Prélèvement 8 Prélèvement 5 [il <lmin 1er Lavage 8 Ajout tampon L 350 μΐ 5min
1er Déprotection 8 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 8 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 8 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 9 Ajout premix 9 350 [il 15min
Prélèvement 9 Prélèvement 5 [il <lmin
1er Lavage 9 Ajout tampon L 350 [il 5min
1er Déprotection 9 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Déprotection 9 Ajout tampon D 350 [il 15min
2nd Lavage 9 Ajout tampon L 350 [il 5min
Elongation 10 Ajout premix 10 350 [il 15min
Prélèvement 10 Prélèvement 5 [il <lmin
Entre chaque étape, hormis celle de prélèvement, les billes sont collectées au moyen d'un aimant et le surnageant est retiré dans sa totalité.
Chaque prélèvement est ajouté à une solution de 15μΙ, de bleu formamide (formamide 100%, 1 à 5 mg de bleu de bromophénol; Simga) afin de stopper la réaction et préparer l'analyse.
Gel et radiographie
L'analyse du test d'activité est réalisée par migration des différents échantillons dans un gel de polyacrylamide suivant le protocole décrit dans l'exemple 3.
Résultats
Les résultats de cette synthèse sont présentés à la figure 6.
La colonne 0 (No, pas de nucléotides) donne la taille attendue de l'amorce utilisée lorsqu'elle n'a pas été allongée, c'est-à-dire lorsqu'il n'y a pas eu d'incorporation de nucléotides.
Les colonnes 1 à 10 correspondent aux prélèvements 1 à 10 lors de la synthèse. Chaque incorporation de nucléotides a été réalisée par l'enzyme avec une performance maximale. Aucune étape de purification supplémentaire n'est réalisée.
Une expérience similaire de synthèse a été réalisée avec la TdT naturelle. Celle-ci étant incapable d'incorporer des nucléotides modifiés il n'a pas était possible de synthétiser la séquence désirée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, ou d'un fragment fonctionnel d'une telle polymérase, ledit variant comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en E457, T331, G332, G333, F334, R336, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399, D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, R454, Q455, F456, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 et A510, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°1.
2. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 1, ledit variant étant capable de synthétiser un brin d'ADN et/ou un brin d' ARN.
3. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 1 ou 2, ledit variant étant un variant de Pol IV, Pol μ, ou de la désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT).
4. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, et présentant au moins 60% d'identité avec la séquence selon SEQ ID N°l, préférentiellement au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% d'identité avec la séquence selon SEQ ID N° 1.
5. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, dans lequel au moins une mutation consiste en une substitution, une délétion ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acide aminé.
6. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en T331, G332, G333, F334, R336, D343, L447, L448, G449, W450, G452, R454, Q455, E457, R461 et R508, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, R454 et E457, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N° 1.
7. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins deux positions sélectionnées dans le groupe consistant en R336, R454 et E457, préférentiellement une mutation d'un résidu auxdites trois positions R336, R454 et E457.
8. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant présentant au moins une mutation d'un résidu dans au moins une région semi-conservée de séquence
(i) X1X2GGFR1R2GKX3X4 (SEQ ID N°4),
dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi M, I, V, L
X2 représente un résidu choisi parmi T, A, M, Q
X3 représente un résidu choisi parmi M, K, E, Q, L, S, P, R, D
X4 représente un résidu choisi parmi T, I, M, F, K, V, Y, E, Q, H, S, R, D
(ii) X1X2LGX3X4GSR1X5X6ER2 (SEQ ID N°5)
dans laquelle
Xi représente un résidu choisi parmi A, C, G, S
X2 représente un résidu choisi parmi L, T, R
X3 représente un résidu choisi parmi W, Y
X4 représente un résidu choisi parmi T, S, I
X5 représente un résidu choisi parmi Q, L, H, F, Y, N, E, D ou 0
X6 représente un résidu choisi parmi F, Y
(iii) LX1YX2X3PX4X5RNA (SEQ ID N°6)
Xi représente un résidu choisi parmi D, E, S, P, A, K
X2 représente un résidu choisi parmi I, L, M, V, A, T
X3 représente un résidu choisi parmi E, Q, P, Y, L, K, G, N
X4 représente un résidu choisi parmi W, S, V, E, R, Q, T, C, K, H
X5 représente un résidu choisi parmi E, Q, D, H, L.
9. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 8, ledit variant présentant au moins une substitution d'un résidu à au moins une position Ri, R2 et/ou K de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°4 ; et/ou
au moins une substitution d'un résidu à au moins une position S, RI et/ou E de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°5 ; et/ou
- une délétion du résidu à la position XI et/ou au moins une substitution au niveau des positions R et/ou N de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°6.
10. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant comprenant une substitution d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, K338, H342, A397, S453, R454, E457, R461 , N474, D501 , Y502, 1503, R508 et N509, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement une substitution d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, A397, R454, E457, R461 , N474, D501 , Y502 et 1503, ou un résidu fonctionnellement équivalent, plus préférentiellement une substitution d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en R336, R454 et E457, ou un résidu fonctionnellement équivalent, encore plus préférentiellement au moins une substitution sur le résidu à la position E457, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N° 1.
1 1. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 10, dans lequel les substitutions sur les positions R336, K338, H342, A397, S453, R454, E457, R461 , N474, D501 , Y502, 1503, R508 et N509 sont sélectionnées parmi le groupe consistant en R336K/H/N/G/D, K338A/C/G/S/T/N, H342A/C/G/S/T.N, A397R/H/K/D/E, S453A/C/G/S/T, R454F/Y/W/A, E457G/N/S/T, N474S/T/N/Q, D501A/G/X, Y502A/G/X, I503A/G/X, R508A/C/G/S/T, N509A/C/G/S/T.
12. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le variant comprend ou présente une substitution, délétion, combinaisons de substitutions et/ou de délétions listées dans le tableau 1 , les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N° 1.
13. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant étant un variant de la TdT de séquence SEQ ID N° 1 et comprenant en outre une substitution des résidus compris entre les positions C378 à L406, ou les résidus fonctionnellement équivalents par les résidus H363 à C390 de la polymérase Ροΐμ de séquence SEQ ID N°2, ou les résidus fonctionnellement équivalents.
14. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le variant comprend une combinaison de substitution choisie parmi R336G-E457N ; R336N-E457N ; R336N-R454A-E457N ; R336N-E457N ; R336N-R454A- E457G ; R336N-E457G ; R336G-R454A-E457N ; R336G-E457N, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N° 1.
15. Acide nucléique codant un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Cassette d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 15.
17. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 15 ou une cassette d'expression selon la revendication 16.
18. Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 15 ou une cassette d'expression selon la revendication 16 ou un vecteur selon la revendication 17.
19. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 15, d'une cassette d'expression selon la revendication 16, d'un vecteur selon la revendication 17 ou d'une cellule selon la revendication 18, pour produire un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-14.
20. Procédé de production d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-14, selon lequel on cultive une cellule hôte selon la revendication 18 dans des conditions de culture permettant l'expression de l'acide nucléique codant ledit variant, et optionnellement on récupère ledit variant ainsi exprimé à partir du milieu de culture ou desdites cellules hôtes.
21. Utilisation d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-14, pour synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides modifiés en 3'-OH.
22. Utilisation selon la revendication 21, pour synthétiser un brin d'ADN ou un brin d'ARN.
23. Procédé de synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, selon lequel on met en contact un brin amorce avec au moins un nucléotide, préférentiellement un nucléotide modifié en 3'-OH, en présence d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-14.
24. Kit pour la synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice comprenant au moins un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-14, des nucléotides, préférentiellement des nucléotides modifiés en 3'-OH, et optionnellement au moins une amorce nucléotidique.
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Cited By (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018215803A1 (fr) 2017-05-26 2018-11-29 Nuclera Nucleics Ltd Utilisation d'enzyme transférase terminale dans la synthèse d'acides nucléiques
WO2019135007A1 (fr) * 2018-01-08 2019-07-11 Dna Script Variants de la désoxynucléotidyle transférase terminale et leurs utilisations
WO2020020608A1 (fr) 2018-07-23 2020-01-30 Dna Script Synthèse enzymatique massivement parallèle de brins d'acides nucléiques
WO2020099451A1 (fr) 2018-11-14 2020-05-22 Dna Script Variants de désoxynucléotidyltransférase et utilisations correspondantes
WO2020120442A2 (fr) 2018-12-13 2020-06-18 Dna Script Synthèse d'oligonucléotides directe sur des cellules et des biomolécules
WO2020141143A1 (fr) 2019-01-03 2020-07-09 Dna Script Synthèse monotope d'ensembles d'oligonucléotides
WO2020161480A1 (fr) * 2019-02-04 2020-08-13 Nuclera Nucleics Ltd Enzymes de désoxynucléotidyl transférase terminale (tdt) modifiées
WO2020165137A1 (fr) 2019-02-12 2020-08-20 Dna Script Clivage efficace de produit dans la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
US10752887B2 (en) 2018-01-08 2020-08-25 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
EP3744854A1 (fr) * 2019-05-28 2020-12-02 DNA Script Variants de désoxynucléotidyle transférase terminale et leurs utilisations
WO2020239737A1 (fr) * 2019-05-28 2020-12-03 Dna Script Variants de la désoxynucléotidyle transférase terminale et leurs utilisations
WO2021018919A1 (fr) 2019-07-30 2021-02-04 Dna Script Synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides à l'aide de poly(a) et poly(u) polymérases
WO2021018921A1 (fr) 2019-08-01 2021-02-04 Dna Script Augmentation des rendements de séquence longue dans la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
WO2021048142A1 (fr) 2019-09-09 2021-03-18 Dna Script Synthèse de polynucléotides enzymatiques sans matrice à l'aide de liaisons photoclivables
WO2021058438A1 (fr) 2019-09-23 2021-04-01 Dna Script Augmentation de rendements de séquence longue dans la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
WO2021094251A1 (fr) 2019-11-13 2021-05-20 Dna Script Synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides à efficacité élevée
WO2021116270A1 (fr) 2019-12-12 2021-06-17 Dna Script Désoxynucléotidyltransférases terminales chimériques pour la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
WO2021122539A1 (fr) 2019-12-16 2021-06-24 Dna Script Synthèse de polynucléotides enzymatiques sans matrice à l'aide de variants de désoxynucléotidyltransférases terminales sans dismutation
WO2021170524A1 (fr) 2020-02-25 2021-09-02 Dna Script Procédé et appareil de synthèse enzymatique de polynucléotides
WO2021213903A1 (fr) 2020-04-20 2021-10-28 Dna Script Variants de désoxynucléotidyl transférase et utilisations correspondantes
WO2021250265A2 (fr) 2020-06-12 2021-12-16 Synhelix Synthèse d'acides nucléiques ab-initio indépendante de la matrice, à l'aide d'enzymes thermostables
WO2021254934A1 (fr) 2020-06-16 2021-12-23 Dna Script Systèmes, appareil et kits pour la synthèse enzymatique de polynucléotides
WO2022013094A1 (fr) 2020-07-15 2022-01-20 Dna Script Synthèse enzymatique massivement parallèle de polynucléotides
WO2022063835A1 (fr) 2020-09-22 2022-03-31 Dna Script Variants stabilisés de désoxynucléotidyl transférase terminale tronqués à l'extrémité n-terminale et utilisations associées
WO2022090323A1 (fr) 2020-10-29 2022-05-05 Dna Script Synthèse enzymatique de sondes polynucléotidiques
US11390856B2 (en) 2017-08-07 2022-07-19 Dna Script Variants of family a DNA polymerase and uses thereof
WO2022207934A1 (fr) 2021-04-02 2022-10-06 Dna Script Procédés et kits pour la synthèse enzymatique de polynucléotides susceptibles de former des structures g4
WO2022258809A1 (fr) 2021-06-10 2022-12-15 Dna Script Synthèse enzymatique de polynucléotides à l'aide de monomères de 3'-o-amino-2'-désoxyribonucléoside triphosphate
WO2023025488A1 (fr) 2021-08-23 2023-03-02 Dna Script Procédé de génération d'acide nucléique double brin
WO2023035003A1 (fr) 2021-09-03 2023-03-09 Elegen Corp. Dispositifs de tri par billes à voies multiples, systèmes et procédés d'utilisation de ceux-ci au moyen de sources de pression
WO2023083997A2 (fr) 2021-11-10 2023-05-19 Dna Script Nouveau désoxynucléotidyl terminal
WO2023083999A2 (fr) 2021-11-10 2023-05-19 Dna Script Nouvelles variantes de la désoxynucléotidyl transférase terminale (tdt)
JP2023526061A (ja) * 2020-05-12 2023-06-20 イルミナ インコーポレイテッド 熱安定性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
WO2023170259A1 (fr) 2022-03-11 2023-09-14 Dna Script Support d'accessoire modulaire
WO2023170286A2 (fr) 2022-03-11 2023-09-14 Dna Script Montant d'alignement et mécanisme sécurisé pour synthèse enzymatique de polynucléotides
WO2023170258A1 (fr) 2022-03-11 2023-09-14 Dna Script Appareil de synthèse enzymatique d'une pluralité de polynucléotides comprenant un piège à condensation
WO2023170266A1 (fr) 2022-03-11 2023-09-14 Dna Script Station d'automatisation pour la synthèse enzymatique de polynucléotides
US11993801B2 (en) 2020-07-21 2024-05-28 Illumina Singapore Pte. Ltd. Base-modified nucleotides as substrates for TdT-based enzymatic nucleic acid synthesis
WO2024121022A1 (fr) 2022-12-05 2024-06-13 Dna Script Variants de poly (a) polymérase et leurs utilisations
WO2024121360A1 (fr) 2022-12-09 2024-06-13 Dna Script Synthèse enzymatique in vitro d'arn
WO2024141628A1 (fr) 2022-12-31 2024-07-04 Dna Script Encres à viscosité variable pour l'administration par jet d'encre de réactifs enzymatiques
WO2024153643A1 (fr) 2023-01-16 2024-07-25 Dna Script Synthèse enzymatique d'acides nucléiques assistée par jet d'encre
WO2024153642A1 (fr) 2023-01-16 2024-07-25 Dna Script Synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides sans cicatrice
WO2024156896A2 (fr) 2023-01-26 2024-08-02 Dna Script Synthèse enzymatique de sondes polynucléotidiques
WO2024227846A2 (fr) 2023-05-03 2024-11-07 Dna Script Réactif utilisé dans la déprotection de polynucléotides 3'-o-amino
WO2024256604A1 (fr) 2023-06-15 2024-12-19 Dna Script Addition de sels pendant la synthèse enzymatique de polynucléotides
WO2025003434A1 (fr) 2023-06-30 2025-01-02 Dna Script Synthèse d'acide nucléique sur un support réutilisable
US12209266B2 (en) 2020-05-12 2025-01-28 Illumina, Inc. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
WO2025021984A1 (fr) 2023-07-27 2025-01-30 Dna Script Procédé de génération d'une pluralité de polynucléotides
WO2025088024A1 (fr) 2023-10-24 2025-05-01 Dna Script Nouveaux variants de désoxynucléotidyl transférase terminale (tdt) et leurs utilisations
WO2025093659A1 (fr) 2023-11-04 2025-05-08 Dna Script Nucléotides bloqués en 3'-o-aminooxyméthyle et leur utilisation dans la synthèse enzymatique de polynucléotides

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10774316B2 (en) * 2014-10-20 2020-09-15 Molecular Assemblies, Inc. Modified template-independent enzymes for polydeoxynucleotide synthesis
CN110331136B (zh) * 2019-09-05 2019-12-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用
JP2023528477A (ja) * 2020-06-03 2023-07-04 モレキュラー アッセンブリーズ， インコーポレイテッド ポリデオキシヌクレオチド合成のための改変された鋳型非依存的酵素
EP4192947A1 (fr) * 2020-08-04 2023-06-14 Nuclera Nucleics Ltd Enzymes de désoxynucléotidyl transférase terminale (tdt) modifiées
GB2598152B (en) * 2020-08-21 2025-04-16 Nuclera Ltd Modified terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) enzymes
US12391970B2 (en) 2020-11-11 2025-08-19 Microsoft Technology Licensing, Llc Spatial control of polynucleotide synthesis by strand capping
CN112322715B (zh) * 2020-11-17 2022-11-25 清华大学 一种核酸测序方法
CN116555216A (zh) * 2022-01-28 2023-08-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 可控合成单链dna的末端转移酶变体及应用
WO2023240202A2 (fr) * 2022-06-08 2023-12-14 Ansa Biotechnologies, Inc. Polymérases désoxynucléotidyl transférases terminales modifiées
WO2024013278A1 (fr) 2022-07-13 2024-01-18 Dna Script Procédé de purification d'une solution comprenant des polynucléotides
WO2024241324A1 (fr) * 2023-05-24 2024-11-28 Scintium Ltd Procédé d'entraînement d'un modèle d'intelligence artificielle (ia) et de génération d'une conception assistée par ordinateur (cao) 3d et système associé
WO2025137872A1 (fr) * 2023-12-26 2025-07-03 华大工程生物学长荡湖研究所 Mutant de désoxyribonucléoside transférase terminale, procédé de préparation s'y rapportant et utilisation associée
WO2025155239A1 (fr) * 2024-01-17 2025-07-24 Agency For Science, Technology And Research Adn polymérases de la famille x et leurs utilisations
EP4653525A1 (fr) * 2024-05-21 2025-11-26 Uab "Biomatter Designs" Polymerases de desoxynucleotidyl transferases terminales modifiees

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4889803A (en) 1984-04-27 1989-12-26 Yeda Research & Development Co., Ltd. Production of interferon gamma
US5004689A (en) 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
EP0446582A1 (fr) 1990-01-24 1991-09-18 Pharmagen Ltd. Méthode de production de l'interféron gamma humain recombinant sans cystéine et sa méthionine à l'extrémité NH2-terminale
WO2015159023A1 (fr) 2014-04-17 2015-10-22 Dna Script Procédé de synthèse d'acides nucléiques, notamment d'acides nucléiques de grande longueur, utilisation du procédé et kit pour la mise en œuvre du procédé
WO2016034807A1 (fr) 2014-09-02 2016-03-10 Dna Script Nucléotides modifiés pour la synthèse d'acides nucléiques, un kit renfermant de tels nucléotides et leur utilisation pour la production de gènes ou séquences d'acides nucléiques synthétiques

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
WO2010062776A2 (fr) * 2008-11-03 2010-06-03 Kapabiosystems Adn polymérases chimériques
US20120244209A1 (en) * 2011-03-02 2012-09-27 Roth Jack A Tusc2 therapies
EP3080158A4 (fr) * 2013-12-09 2018-03-21 Adimab, LLC Mélanges polyclonaux d'anticorps et leurs méthodes de fabrication et d'utilisation
EP3209781B8 (fr) * 2014-10-20 2020-01-15 Molecular Assemblies Inc. Enzymes indépendantes de la matrice modifiées pour la synthèse de polydésoxynucléotides

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004689A (en) 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
US4889803A (en) 1984-04-27 1989-12-26 Yeda Research & Development Co., Ltd. Production of interferon gamma
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
EP0446582A1 (fr) 1990-01-24 1991-09-18 Pharmagen Ltd. Méthode de production de l'interféron gamma humain recombinant sans cystéine et sa méthionine à l'extrémité NH2-terminale
WO2015159023A1 (fr) 2014-04-17 2015-10-22 Dna Script Procédé de synthèse d'acides nucléiques, notamment d'acides nucléiques de grande longueur, utilisation du procédé et kit pour la mise en œuvre du procédé
WO2016034807A1 (fr) 2014-09-02 2016-03-10 Dna Script Nucléotides modifiés pour la synthèse d'acides nucléiques, un kit renfermant de tels nucléotides et leur utilisation pour la production de gènes ou séquences d'acides nucléiques synthétiques

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"EC 2.7.7.7", ADVANCES IN PROTEIN CHEMISTRY, vol. 71, pages 401 - 440
ADAMS ET AL., J. AMER. CHEM. SOC., vol. 105, 1983, pages 661
BOULÉ ET AL., MOL. BIOTECHNOL.,, vol. 10, 1998, pages 199 - 208
E. COLI; JAMES ET AL., PROTEIN SCIENCE, vol. 5, 1996, pages 331 - 340
FROEHLER ET AL., TETRAHEDRON LETT, vol. 24, 1983, pages 3171
FULLER ET AL., IMMUNOLOGY IN CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1996
NATURE, vol. 295, pages 503
NEDDLEMAN; WUNSCH, J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 443
NUCL. ACIDS RES., vol. 16, no. 22, 1988, pages 10881 - 10890
PEARSON; LIPMAN, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444
SMITH; WATERMAN, AD. APP. MATH., vol. 2, 1981, pages 482
WANG ET AL., SCI. SIN. B, vol. 24, 1994, pages 1076 - 1084

Cited By (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018215803A1 (fr) 2017-05-26 2018-11-29 Nuclera Nucleics Ltd Utilisation d'enzyme transférase terminale dans la synthèse d'acides nucléiques
US11390856B2 (en) 2017-08-07 2022-07-19 Dna Script Variants of family a DNA polymerase and uses thereof
US12173333B2 (en) 2017-08-07 2024-12-24 Dna Script Variants of family a DNA polymerase and uses thereof
US10752887B2 (en) 2018-01-08 2020-08-25 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
JP2021510074A (ja) * 2018-01-08 2021-04-15 ディーエヌエー スクリプト ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの改変体およびその使用
US12071638B2 (en) 2018-01-08 2024-08-27 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
US10435676B2 (en) 2018-01-08 2019-10-08 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
WO2019135007A1 (fr) * 2018-01-08 2019-07-11 Dna Script Variants de la désoxynucléotidyle transférase terminale et leurs utilisations
US11208637B2 (en) 2018-01-08 2021-12-28 Dna Script Sas Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
US12286652B2 (en) 2018-01-08 2025-04-29 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
CN112105725A (zh) * 2018-01-08 2020-12-18 Dna斯克瑞普特公司 末端脱氧核苷酸转移酶的变体及其用途
WO2020020608A1 (fr) 2018-07-23 2020-01-30 Dna Script Synthèse enzymatique massivement parallèle de brins d'acides nucléiques
US12421628B2 (en) 2018-07-23 2025-09-23 Dna Script Massively parallel enzymatic synthesis of nucleic acid strands
WO2020099451A1 (fr) 2018-11-14 2020-05-22 Dna Script Variants de désoxynucléotidyltransférase et utilisations correspondantes
US12371680B2 (en) 2018-11-14 2025-07-29 Dna Script Sas Terminal deoxynucleotidyl transferase variants and uses thereof
JP2022513031A (ja) * 2018-11-14 2022-02-07 ディーエヌエー スクリプト 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼバリアントおよびその使用
US11859217B2 (en) 2018-11-14 2024-01-02 Dna Script Terminal deoxynucleotidyl transferase variants and uses thereof
US11268091B2 (en) 2018-12-13 2022-03-08 Dna Script Sas Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
US11993773B2 (en) 2018-12-13 2024-05-28 Dna Script Sas Methods for extending polynucleotides
WO2020120442A2 (fr) 2018-12-13 2020-06-18 Dna Script Synthèse d'oligonucléotides directe sur des cellules et des biomolécules
EP4464778A2 (fr) 2018-12-13 2024-11-20 DNA Script Synthese directe d'oligonucleotides sur l'adnc
US12428668B2 (en) 2019-01-03 2025-09-30 Dna Script One pot synthesis of sets of oligonucleotides
WO2020141143A1 (fr) 2019-01-03 2020-07-09 Dna Script Synthèse monotope d'ensembles d'oligonucléotides
US12312611B2 (en) 2019-02-04 2025-05-27 Nuclera, Ltd. Modified terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) enzymes
CN113454212A (zh) * 2019-02-04 2021-09-28 纽克莱生物科技有限公司 修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)
WO2020161480A1 (fr) * 2019-02-04 2020-08-13 Nuclera Nucleics Ltd Enzymes de désoxynucléotidyl transférase terminale (tdt) modifiées
WO2020165137A1 (fr) 2019-02-12 2020-08-20 Dna Script Clivage efficace de produit dans la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
US11359221B2 (en) 2019-02-12 2022-06-14 Dna Script Sas Efficient product cleavage in template-free enzymatic synthesis of polynucleotides
US11905541B2 (en) 2019-02-12 2024-02-20 Dna Script Sas Efficient product cleavage in template-free enzymatic synthesis of polynucleotides
CN113423840B (zh) * 2019-02-12 2024-03-08 Dna斯克瑞普特公司 多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解
JP7538807B2 (ja) 2019-02-12 2024-08-22 ディーエヌエー スクリプト テンプレートなしの酵素によるポリヌクレオチド合成における効率的生成物切断
JP2022520574A (ja) * 2019-02-12 2022-03-31 ディーエヌエー スクリプト テンプレートなしの酵素によるポリヌクレオチド合成における効率的生成物切断
CN113423840A (zh) * 2019-02-12 2021-09-21 Dna斯克瑞普特公司 多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解
AU2020281709B2 (en) * 2019-05-28 2024-08-08 Centre National De La Recherche Scientifique Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof.
EP4407026A3 (fr) * 2019-05-28 2025-01-15 DNA Script Variants de désoxynucléotidyle transférase terminale et leurs utilisations
EP3744854A1 (fr) * 2019-05-28 2020-12-02 DNA Script Variants de désoxynucléotidyle transférase terminale et leurs utilisations
WO2020239737A1 (fr) * 2019-05-28 2020-12-03 Dna Script Variants de la désoxynucléotidyle transférase terminale et leurs utilisations
WO2021018919A1 (fr) 2019-07-30 2021-02-04 Dna Script Synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides à l'aide de poly(a) et poly(u) polymérases
WO2021018921A1 (fr) 2019-08-01 2021-02-04 Dna Script Augmentation des rendements de séquence longue dans la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
WO2021048142A1 (fr) 2019-09-09 2021-03-18 Dna Script Synthèse de polynucléotides enzymatiques sans matrice à l'aide de liaisons photoclivables
WO2021058438A1 (fr) 2019-09-23 2021-04-01 Dna Script Augmentation de rendements de séquence longue dans la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
WO2021094251A1 (fr) 2019-11-13 2021-05-20 Dna Script Synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides à efficacité élevée
WO2021116270A1 (fr) 2019-12-12 2021-06-17 Dna Script Désoxynucléotidyltransférases terminales chimériques pour la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides
WO2021122539A1 (fr) 2019-12-16 2021-06-24 Dna Script Synthèse de polynucléotides enzymatiques sans matrice à l'aide de variants de désoxynucléotidyltransférases terminales sans dismutation
WO2021170524A1 (fr) 2020-02-25 2021-09-02 Dna Script Procédé et appareil de synthèse enzymatique de polynucléotides
WO2021213903A1 (fr) 2020-04-20 2021-10-28 Dna Script Variants de désoxynucléotidyl transférase et utilisations correspondantes
JP2023526061A (ja) * 2020-05-12 2023-06-20 イルミナ インコーポレイテッド 熱安定性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
US12110516B2 (en) 2020-05-12 2024-10-08 Illumina, Inc. Thermostable terminal deoxynucleotidyl transferase
US12209266B2 (en) 2020-05-12 2025-01-28 Illumina, Inc. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
WO2021250265A2 (fr) 2020-06-12 2021-12-16 Synhelix Synthèse d'acides nucléiques ab-initio indépendante de la matrice, à l'aide d'enzymes thermostables
WO2021254934A1 (fr) 2020-06-16 2021-12-23 Dna Script Systèmes, appareil et kits pour la synthèse enzymatique de polynucléotides
EP4578954A2 (fr) 2020-06-16 2025-07-02 DNA Script Procede de synthese enzymatique de polynucleotides
US12377397B2 (en) 2020-06-16 2025-08-05 Dna Script Systems, apparatus and kits for enzymatic polynucleotide synthesis
WO2022013094A1 (fr) 2020-07-15 2022-01-20 Dna Script Synthèse enzymatique massivement parallèle de polynucléotides
US11993801B2 (en) 2020-07-21 2024-05-28 Illumina Singapore Pte. Ltd. Base-modified nucleotides as substrates for TdT-based enzymatic nucleic acid synthesis
WO2022063835A1 (fr) 2020-09-22 2022-03-31 Dna Script Variants stabilisés de désoxynucléotidyl transférase terminale tronqués à l'extrémité n-terminale et utilisations associées
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DE102022107811A1 (de) 2021-04-02 2022-10-06 Dna Script Methoden und kits für die enzymatische synthese von zu-g4-neigenden polynukleotiden
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WO2023170266A1 (fr) 2022-03-11 2023-09-14 Dna Script Station d'automatisation pour la synthèse enzymatique de polynucléotides
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