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WO2004065594A2 - Mannuronane c5-epimerases d’algues brunes, procedes d’obtention et utilisations - Google Patents

Mannuronane c5-epimerases d’algues brunes, procedes d’obtention et utilisations Download PDF

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Publication number
WO2004065594A2
WO2004065594A2 PCT/FR2003/003720 FR0303720W WO2004065594A2 WO 2004065594 A2 WO2004065594 A2 WO 2004065594A2 FR 0303720 W FR0303720 W FR 0303720W WO 2004065594 A2 WO2004065594 A2 WO 2004065594A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequences
seq
enzyme
mannuronan
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2003/003720
Other languages
English (en)
Other versions
WO2004065594A3 (fr
Inventor
Catherine Boyen
Bernard Kloareg
Sylvie Gueguen-Rousvoal
Florent Crepineau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER) filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to AU2003300607A priority Critical patent/AU2003300607A1/en
Publication of WO2004065594A2 publication Critical patent/WO2004065594A2/fr
Publication of WO2004065594A3 publication Critical patent/WO2004065594A3/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • the invention relates to the field of biopolymers extracted from brown algae, useful as gelling agents, such as alginates, and is more particularly interested in the means making it possible to control the structure and the gelling properties of said biopolymers.
  • the subject of the present invention is nucleotide sequences of brown algae coding for mannuronan C5-epimerases, the enzymes thus coded, as well as methods for obtaining and using said enzymes.
  • Brown algae are eukaryotic photosynthetic organisms found in abundance on the rocky coasts of temperate seas in the sub-Antarctic and Arctic. These organisms belong to the class of pheophyceae, otherwise called "brown algae”.
  • Brown algae such as Lamina ⁇ a sp.
  • gametophytes are uniseriate filaments a few millimeters long, sporophytes have separate organs, namely spikes, stipes and blades, and can reach up to 50 meters in length depending on the species.
  • Kelp sporophytes form an important ecological habitat, providing food and substrates for many species of invertebrates, fish and epiphytic algae. They also represent significant marine wealth: they are cultivated in East Asia and harvested from natural populations of kelp in Europe and North America. The laminaria thus cultivated and Harvests are mainly used in industry and represent in particular the main source of alginates.
  • Alginates are characterized by their solubility in water, their viscosity, their atoxicity and their gelling and stabilizing properties. They are therefore abundantly used as thickening agents in the food industry, for example for the preparation of sauces, ice creams, desserts, processed cheeses and other dairy products, jams, light beers, etc. They also form part of the composition cosmetic and pharmaceutical products (excipients, controlled release formulations, dental impressions and appliances, treatment of gastric reflux), automotive varnishes, paints, insecticides, etc. Finally, alginates find applications in medicine, in the textile industry (printing, dyeing of fabrics, etc.), for paper processing (standardization and coating of surfaces, etc.), etc. (Onsoyen, 1996).
  • alginates are mainly found in brown algae and are, to a lesser extent, produced by soil bacteria such as Azotobacter vinelandii and various species of Pseudomonas.
  • Alginate represents the most abundant polysaccharide in brown algae, constituting up to 40% of the dry matter (Skjak-Braek, 1992). Its main biological function is to give strength, resistance and flexibility to the tissues.
  • Alginate is an unbranched polysaccharide, composed of two types of uronic acids, ⁇ -1, 4-D-mannuronic acid (M) and its C5 epimer, ⁇ -1, 4-L- guluronic (G).
  • the alginate polymers are formed from blocks of co-polymers distributed in homopolymeric regions, namely blocks M and G, spaced by regions of alternating polymer structure, the MG blocks.
  • alginates are closely linked to their primary structure, which depends on both the amounts of M and G and the relative proportions of the three types of blocks in the chain. These characteristics vary on the one hand according to the nature and age of the tissues, and on the other hand according to the season and the growth area of brown algae (sheltered or exposed to currents, waves and wind).
  • the Laminaria stipe contains a high proportion of G blocks, while the blade contains a higher amount of M blocks.
  • L. digitata there are approximately 41% G units and 59% units M, organized at a rate of at least about 25% of G blocks and 43% of M blocks (Skjak-Braek, 1992).
  • alginates rich in G blocks form a gel with high force in the presence of divalent cations such as calcium, and confer increased mechanical rigidity on the stipes. and algae crampons.
  • alginates rich in M and / or MG blocks are more flexible polymers suitable for blades which are subjected to the current and movement of sea water.
  • brown algae alginates can contain between about 25% and 75% of guluronic acid.
  • the final stage of alginate biosynthesis consists of the epimerization of ⁇ -1,4-D-mannuronic acid into ⁇ -1,4-L-guluronic acid ( Figure 1).
  • This epimerization reaction is catalyzed by a C5-epimerase mannuronan.
  • the structural change induced by this enzyme modifies the quantity of M and G units and, consequently, the proportion of blocks M, G and MG in the polymer. This structural modification significantly alters the physico-chemical properties of the latter.
  • alginates In all fields of application of alginates (see above), in particular in the fields of biotechnology and medicine, it is necessary to "profile" the alginates from natural alginates, in order to modify their acid content. guluronic, reduce it or, on the contrary, increase it, depending on the desired physicochemical properties. For example, immunostimulants based on alginates will contain from 0 to 10% approximately of guluronic acid (Otterlei et al., 1991). Conversely, for immobilization of the cells, the alginates will preferably have a strong excess of guluronic acid in their composition (possibly, beyond 80%) (Martinsen et al., 1989).
  • the subject of the invention is therefore an isolated nucleotide sequence coding for a C5 mannuronan epimerase from brown algae, in particular from L. digitata.
  • This nucleotide sequence is chosen from the sequences ManC5-E3 to ManC5-E6 (SEQ ID No. 3 to SEQ ID No. 6), the functional fragments thereof, the sequences complementary thereto, the sequences similar to the at least 50% to these or to the sequences complementary to these, and the sequences hybridizable under strict conditions to at least 50% with them or with the sequences complementary to these.
  • a nucleotide sequence in accordance with the present invention is chosen from the sequences ManC5-E3 to ManC5-E6, the functional fragments thereof, the sequences complementary thereto, the sequences similar to these or to the sequences at least 60% complementary, preferably at least 70%, and more preferably at least 80%, and the sequences hybridizable under strict conditions therewith or with the sequences complementary thereto to at least 60%, preferably at least 70%, and more preferably, at least 80%.
  • nucleotide sequence and a “nucleic acid” according to the invention are in accordance with the usual meaning in the field of biology. These two expressions indifferently cover DNA and RNA, the former being for example genomic, plasmid, recombinant, complementary (cDNA), and the latter, messenger (mRNA), ribosomal (rRNA), transfer (tRNA).
  • the nucleotide and nucleic acid sequences of the invention are DNA.
  • nucleotide sequences defined above and the nucleic acids which will be discussed below.
  • the nucleotide sequences targeted here encode mannuronan C5-epimerases of brown algae.
  • Nucleic acids can be of any origin, of any kind, and include nucleotide sequences encoding C5 mannuronan brown algae epimerases.
  • a nucleic acid may in particular comprise one or more different nucleotide sequences each coding for a given brown alga C5-epimerase mannuronan.
  • nucleotide sequence coding for a protein having a given biological activity, parts of this sequence comprising at least all the regions essential for the biological activity of the coded protein.
  • the portions of the sequence in question can be of varying length as long as the biological activity of the protein which they encode is conserved.
  • Two “complementary” nucleotide sequences are such that each base of one is paired with the base complementary of the other, the orientation of the two sequences being reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U in the case of RNAs), and C and G.
  • sequences “similar to at least X%” to a reference nucleotide sequence, coding for a protein having a given biological function designate variants of this sequence, said variants having, over their entire length, at least X% of identical bases. to those of said sequence.
  • Identical bases can be consecutive, in whole or in part only.
  • the variants thus envisaged can be the same length as the reference nucleotide sequence, or of a different length, as long as the biological function of the encoded protein is conserved.
  • nucleotide sequences have a certain level of similarity (at least X% according to the present invention) can nevertheless taking into account the degeneration of the genetic code on the one hand, and the preferential use of certain codons according to organisms (bacteria, yeasts ...) on the other hand, code proteins including the biological function of interest is preserved. These proteins can themselves be identical or similar. In the present species, these proteins are C5-epimerase mannuronans.
  • the above definition can be extended to amino acid sequences, or protein sequences, similar to at least X% to a reference amino acid sequence.
  • protein variants having at least X% of amino acids similar to those of the reference sequence are considered. Again, similar amino acids may be consecutive, in whole or in part only.
  • the protein variants can be of the same length or of different length, as long as the biological function of the reference protein sequence is preserved.
  • similar amino acids is understood here to mean amino acids having the same reactivity at the level of their side chain.
  • a comparable polarity and ionization properties have made it possible to define groups of similar amino acids known to those skilled in the art.
  • the amino acids dicarboxylic, aspartic acid and glutamic acid are similar.
  • serine and threonine belong to the same group in that they both carry an esterifiable alcohol group. Mention may also be made of lysine, arginine and histidine as being similar basic amino acids, etc.
  • X is worth 50.
  • X is worth 60, preferably 70, and more preferably, 80.
  • the “strict hybridization conditions” obey the conventional definition known to those skilled in the art (Sambrook and Russel, 2001).
  • “Strict hybridization conditions” are, for example, conditions allowing specific hybridization of two single-stranded nucleotide sequences, and this, after at least one washing step as described below.
  • the hybridization step can in particular be carried out at approximately 65 ° C., for 12 hours in a solution comprising SSC 6X, 0.5% SDS, a solution of Denhardt 5X and 100 ⁇ g of non-specific DNA (for example of salmon sperm DNA), or any other solution of equivalent ionic strength.
  • the next step comprising at least one washing, is for example carried out at approximately 65 ° C., in a solution comprising SSC at most 0.2X and SDS at most 0.1%, or in any other solution of equivalent ionic strength.
  • the parameters defining the hybridization conditions depend on the temperature Tm at which 50% of the paired strands separate.
  • Tm 81.5 + 0.41x [% G + C] + 16.6xLog (cation concentration) - 0.63x [% formamide] - (600 / number of bases).
  • Hybridization conditions can therefore. be adapted by those skilled in the art according to the size of the sequences involved, their GC content, and other parameters, as indicated in particular in the protocols described in Sambrook and Russel (2001, supra).
  • the present invention also relates to an isolated nucleic acid comprising at least one nucleotide sequence as described above.
  • a nucleic acid according to the invention is as defined above.
  • several different C5-mannuronan epimerases can be produced from such a nucleic acid, said nucleic acid nucleic acid comprising in this case several different nucleotide sequences, as indicated above.
  • the invention further relates to molecular biology tools, namely, recombinant vectors and host cells.
  • the subject of the present invention is a recombinant vector, said vector comprising a nucleotide sequence or a nucleic acid in accordance with the definitions given above.
  • vector and “piasmid” are used here to designate indifferently the same tool for cloning the nucleotide sequences and nucleic acids of the invention, this tool being known to those skilled in the art.
  • a vector can be a vector for expressing a nucleotide sequence or a nucleic acid according to the invention. In such cases, this vector makes it possible to produce the enzyme (s) of interest.
  • the invention relates to a recombinant host cell characterized in that it hosts a recombinant vector, as defined above.
  • such a host cell is an Escherichia coli, Pichia pasto s, Saccharomyces cerevisiae or insect cell.
  • the present invention relates to an enzyme. exhibiting C5-epimerase mannuronan activity, said enzyme being encoded by a nucleotide sequence or a nucleic acid according to the invention.
  • an “enzyme” is a “protein” and corresponds to an "amino acid sequence".
  • an “enzyme” is a protein with a particular biological function.
  • One such enzyme is a C5-epimerase mannuronan.
  • these terms can be used interchangeably to designate the same biological entity.
  • the sequence of said enzyme is chosen from the sequences SEQ ID No. 9 to
  • SEQ ID N ° 12 (ManC5-E3 to ManC5-E6), and the sequences similar to these at least 50%, in particular at least 60%, preferably at least 70%, and even more preferably, at least 80%.
  • the enzymes which are the subject of the present invention have different amino acid sequences, it can be deduced therefrom that they have specific and complementary mannuronan C5-epimerase activities in brown algae.
  • the number and choice of enzymes seem to have an impact on the composition, and therefore the physico-chemical properties, of the polymer finally obtained.
  • the present invention relates to a process for obtaining an enzyme as mentioned above.
  • said method comprises at least: a) cloning of a nucleotide sequence or of a nucleic acid in accordance with the invention, in a recombinant expression vector; b) the transformation of a recombinant host cell capable of expressing said nucleotide sequence or said nucleic acid, with said recombinant expression vector; and c) expressing said nucleotide sequence or said nucleic acid from said recombinant host cell.
  • the method which is the subject of the present invention further comprises a step d) of purification of the enzyme and / or of the activity of the enzyme obtained after steps a), b) and c) above.
  • This additional step d) consisting in the purification of the protein as such and / or of the biological activity thereof, that is to say in the present case of the mannuronan C5-epimerase activity, can be put implemented according to conventional methods, known to those skilled in the art, [see for example in Methods in Enzymology, Volume 182: Guide to protein purification. Press Academy. (1990) Murray P. Deutsher].
  • step d) consists in purifying the mannuronan C5-epimerase activity from the enzyme, and not the enzyme itself.
  • the presence of contaminating substances, including that of other proteins, in a minority amount is not excluded, since the mannuronan C5-epimerase activity d interest is preserved, and only this activity is detected.
  • the detection of the enzymatic activity of interest can be carried out by conventional methods, (see for example Ertesvag and Skjak-Braek (1999) In Methods in Biotechnology - Carbohydrate Biotechnology Protocols. Eds. Walkere and Bucke, Humanoria Press, London. Pp71-78).
  • the recombinant host cell used during step b) is preferably an Escherichia coli cell, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae or insect.
  • the invention relates to uses of mannuronan C5- ManC5-E1 to ManC5-E6 epimerases, and in particular of the enzymes ManC5-E3 to ManC5-E6 as defined above.
  • the present invention relates to uses of at least one enzyme exhibiting mannuronan C5-epimerase activity, encoded by a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 6 (ManC5-E1 to ManC5-E6), functional fragments thereof, sequences complementary thereto, sequences similar to at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at at least 80%, to these or to the sequences complementary to these, and the sequences hybridizable under strict conditions to at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%>, more preferably at least 80%, with these or with the sequences complementary to these.
  • a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 6 (ManC5-E1 to ManC5-E6), functional fragments thereof, sequences complementary thereto, sequences similar to at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at at least
  • the enzyme or enzymes used have one or more sequences chosen from the sequences SEQ ID No. 7 to SEQ ID No. 12 (ManC5-E1 to ManC5-E6), and the similar sequences to these at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, and more preferably at least 80%.
  • the invention aims to use at least one of these enzymes, to determine the gelling properties of an alginate.
  • the enzyme or enzymes thus used in that they encode specific C5-epimerase mannuronan, make it possible to modify the ratio of the quantities of ⁇ -1,4-D-mannuronic acid and of ⁇ -1 acid, 4-L-guluronic in the starting alginate.
  • the term “modifying” the ratio of the amounts of the two uronic acids is understood to mean increasing, by a factor of 0 to 100, the amount of guluronic acid relative to the amount of mannuronic acid, and this, by epimerization of the latter by means of one or more C5-epimerase mannuronan. So we can consider the following different scenarios: i) first extreme case: no epimerization of mannuronic acid to guluronic acid (increase by a factor o); ii) second extreme case: total epimerization (increase by a factor of 100); and iii) between these two extremes, a more or less significant epimerization of the mannuronic acid into guluronic acid.
  • the invention relates to the use of at least one enzyme as mentioned above, for modifying an alginate by epimerization of ⁇ -1, 4-D-mannuronic acid to -1, 4-L-guluronic acid.
  • the invention relates to the use of at least one of these enzymes, for modifying a polymer containing ⁇ -1, 4-D-mannuronic acid, by epimerization of said ⁇ -1 acid, 4-D-mannuronic acid ⁇ -1, 4-L-guluronic.
  • a polymer can be an oxidation product of mannan, in particular glucomannan or galactomannan.
  • the uses which are the subject of the present invention are such that the level of modification of the starting alginate or of the polymer containing mannuronic acid is controlled by the number and the choice of the enzymes used.
  • this control we will place our as desired, in particular between the two extremes indicated above [scenario iii)], in order to generate an alginate, or a polymer, the gelling properties of which will meet the requirements of the specific application envisaged.
  • alginate gels intended to be implanted in the form of capsules in the body of a mammal, in particular of man, in order to mimic insulin-producing cells must have , among other characteristics, high mechanical and chemical stability. To this end, it is therefore useful that the alginate contains a high proportion of guluronic acid.
  • Figure 1 Diagram representing the biosynthetic pathway of alginates in acute brown.
  • P phosphate
  • GMP Guanosine-monophosphate
  • GDP Guanosine diphosphate
  • GTP Guanosine triphosphate
  • PPi inorganic pyrophosphate
  • Pi inorganic phosphate
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide.
  • Figure 2 Schematic representation of the 6 cDNAs isolated from L. digitata. The thick lines represent the open reading frames; fine lines indicate hypothetical 5 'and 3' untranslated reading frames.
  • Figure 3 Auto-radiogram of a Southern transfer of total DNA isolated from L. digitata. The molecular size is indicated in kb.
  • Figure 4 HCA graphs of the sequence ManC5-E1 of L. digitata, of the envelope protein GP-1 of the virus Ectocarpus siliculosus, as well as of the mannuronan C5-epimerases AlgG of Pseudomonas aeruginosa and the module A of AlgE5 of Azotobacter vinelandii .
  • the vertical lines delimit the structural elements and the different colors reflect the levels of similarity.
  • the putative localization of the elements of secondary structure appears under the AlgG epimerase.
  • the arrows 1D and 2D respectively indicate the primary and secondary structures.
  • Figure 5 Phylogenetic tree of mannuronan C5-epimerases.
  • the numbers located at the nodes correspond to the initialization values (on 100 replicas) used respectively in the distance and maximum parsimony analyzes. Dashes in place of numbers indicate that the node was unreliable in the corresponding analysis.
  • the scale line represents the expected number of changes per sequence position.
  • Figure 6 Auto-radiogram and photograph of an electrophoresis gel relating to the expression of mannuronan C5-epimerase ManC5-E1 in sporophytes of L. digitata.
  • Figure 7 Graph representing the epimerase activity in the culture medium of prototypes of L. digitata at different culture times. The samples were tested in triplicate. The error bars indicate standard deviations.
  • Figure 8 Graphs representing the 1 H NMR spectra of M-alginate before and after epimerization. A: Before epimerization; B: After epimerization.
  • Figure 9 Auto-radiogram of a Western transfer of total proteins from a culture medium of L. digitata protoplasts, at different culture times.
  • Figure 10 Auto-radiogram and photograph of an electrophoresis gel relating to the expression of mannuronan C5-epimerase ManC5-E1 in the protoplasts of L. digitata at different culture times.
  • Figure 11 Diagram representing the genomic clone EpiG and its alignment with the sequence ManC5-E6.
  • the upper line represents the restriction map of the entire EpiG clone, with the positions of the restriction sites of Sal I (S), Xho I (X) and Eco RI
  • the middle line indicates the part of EpiG which has been subcloned and then aligned with the sequence ManC5-E6.
  • the white rectangles indicate the introns and the black rectangles indicate the exons.
  • the PCR primers used for RT-PCR are indicated by arrows.
  • the bottom line represents ManC5-E6. Untranslated 5 'and 3' reading frames (5 'utr and 3' utr) are indicated in gray, while the open reading frame is indicated in black.
  • Figure 12 Alignment of the protein sequences of the putative active site of several mannuronan C5-epimerases. The aspartic acid (D) necessary for the activity is indicated by a star and the amino acids conserved in all the sequences are under-colored in black.
  • ManC5-E1 from L.
  • GP1 EsV-1 GP1 envelope protein (Q8QN64) of the Ectocarpus siliculosus virus
  • AlgE1-A1 A (gE1 (Q44494) from Azotobacter vinelandii
  • AlgG-Azo AlgG (P70805) from A. vinelandii
  • AlgG-Pse AlgG (Q51371) from Pseudomonas aeruginosa.
  • C5-epimerases [ManC5-E1 (SEQ ID No. 1) and ManC5-E2 (SEQ ID No. 2)] were identified in a group of 905 EST sequences (for
  • Expressed Sequence Tag made up of two oriented cDNA libraries, sporophytes and gametophytes of L. digitata (Crépineau et al., 2000). Screening of the sporophyte cDNA library with these clones made it possible to identify 4 additional cDNA clones (ManC5-E3 to ManC5-E6, respectively SEQ ID No. 3 to SEQ ID No. 6). A 1 kb fragment from the open reading frame (ORF) of ManC5-E1 was used to screen a genomic library of L. digitata. This library was constructed with DNA from L. digitata sporophytes, first isolated according to the method described by Apt et al.
  • the sequence of the protein ManC5-E1 from L. digitata was compared with the epimerases AlgE5 from Azotobacter vinelandii (GenPept AAA87309) and AlgG from Pseudomonas aeruginosa (TrEMBL: Q51371), and the protein GP-1 from the Ectocarpus virus (GenPept . CAA53944 .1) using, hydrophobic group analysis or HCA (Callebaut et al., 1997).
  • HCA hydrophobic group analysis
  • the amino acid sequences of the L. digitata epimerase clones were manually aligned with a representative set of amino acid sequences obtained from recent versions of GenBank over a region of 107 amino acids, using Seaview software ( Galtier et al., 1996). HCA alignments were used as references to ensure that only homologous regions were compared. The distance matrix and maximum parsimony methods (Fitch, 1971) have been applied as implemented by the Phylo-Win software (Galtier et al., Supra).
  • AIgE1 (Q44494), AlgE2 (Q44495), AlgE3 (QQ44496), AlgE4 (Q44493), AlgE5 (Q44492), AlgE6 (Q9ZFH0), AlgE7 (Q9ZFG9), AlgY (Q9ZFG8), AlgG (P70805), mannuronan C-5 epimerases from P. aeruginosa AlgG (Q51371), GP-1 envelope protein of Ectocarpus siliculosus virus: EsV-1 GP1 (Q8QN64 ) and C5-epimerase mannuronan identified in L. digitata, ManC5-E1 to ManC5-E6, respectively (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 6).
  • the betadine solution was removed by filtration and the algae tissue was washed and resuspended in 70% sterile water (diluted with deionized water), and finally incubated for 45 min at 8 ° C. From this stage, the protocol of Butler et al. (1989) was applied, except that artificial seawater containing osmotic agents (MgCI 2 and KCI) was used as the medium during the digestion step. After digestion, the protoplasts were decanted through nylon filters whose pore sizes were 200 and 45 ⁇ m. The protoplast suspension was distributed into 50 ml Falcon tubes. These tubes were centrifuged for 15 min at 50 x g. The pellets were washed twice by resuspension in 12 ml of culture medium and then centrifugation as indicated above. After the washing steps, the pellets were resuspended in 12 ml of culture medium.
  • artificial seawater containing osmotic agents MgCI 2 and KCI
  • Protoplasts were grown at 12 ° C in 9 cm diameter plastic petri dishes containing 10 ml of sterile seawater enriched with osmotic agents and nutrients, as well as 0.4 ⁇ g / rifampicin. ml and carbenicillin at 4.8 ⁇ g / ml. The cell density was 1.5 x 10 6 cells / ml.
  • the protoplasts incubated in total darkness, then in low light, in a sequence of 14 hours of light and then 10 hours of darkness.
  • Protoplast and culture medium samples were taken at 0, 24, 45, 68 and 92 hours, and separated by centrifugation at 50 xg for 10 min. The samples were frozen in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C.
  • the medium was concentrated 15 times in a stirred ultrafiltration cell (Amicon, MA, United States) using a YP3 membrane (Millipore, Saint-Quentin en Yvelines, France) having a cutoff threshold of 3000 kDa, before to be used for testing.
  • the Northern blot was hybridized with a 405 bp fragment of ManC5-E1.
  • a 400 bp fragment of the ribosomal protein rpl-14 was used as a control.
  • Total RNA 300 ng was used as a template for PCR using the “RT-PCR Beads Ready to go” system (Amersham-Pharmacia Biotech, England) according to the manufacturer's instructions.
  • a pair of specific primers [A) iepi3 (SEQ ID No. 13) and Aliepi4 (SEQ ID No. 14)] was constructed against the ORF region whose sequence was conserved in the 6 cDNA clones.
  • the primers made the junction between two introns in the genomic sequence, which generated fragments of different sizes from mRNA and DNA, respectively 230 and 700-900 bp.
  • the hybridization temperature was 53 ° C.
  • Two negative controls were carried out by adding water to the reaction medium in place of the RNA, and by heating the reaction for 10 min at 95 ° C. before the RT-PCR reaction.
  • the sequence of the 230 bp fragment was repeatedly determined and corresponded to the sequence of the epimerase cDNAs.
  • Polyclonal antibodies have been produced against two peptides of 16 amino acids each, from the amino acid sequence of
  • ManC5-E6 by Eurogentec SA (Angers, France).
  • the peptides have been mixed and used to immunize two rabbits.
  • Antibodies against ManC5-E6 SEQ ID No. 6
  • SEQ ID No. 6 Antibodies against ManC5-E6
  • the serum of the two rabbits was mixed and then diluted 2,000 times before being used for the detection of protein epimerases in the context of Western blotting.
  • the protein extracts were mixed with sample buffer and brought to the boil for 5 min before deposition on polyacrylamide gel containing a 3.9% concentration gel and a 12% migration gel.
  • the gels migrated to a mini-proteanli vertical gel electrophoresis cell (BioRad, supra) with a discontinuous tris-glycine buffer system.
  • the proteins were transferred to a nylon membrane for immunostaining.
  • the immunostaining of the protein epimerases was carried out using rabbit antibodies directed against peptides derived from the sequence ManC5-E6 (SEQ ID No. 6) as primary antibodies (see paragraph 1.8 above), and an antibody anti-rabbit goat conjugated with horseradish peroxidase as a secondary antibody.
  • the labeled proteins were detected using the ECL system (Amersham Pharmacia Biotech, supra) and viewed on film with X-rays.
  • the epimerization reactions for NMR spectroscopy were carried out using unlabeled poly-mannuronate, degraded by mild acid hydrolysis, as a substrate.
  • the epimerization reaction was carried out in a volume of 20 ml, consisting of 20 mg of poly-mannuronate and 10 ml of concentrated protoplast medium mixed with buffer, at a final concentration of 20 mM MOPS and 2 mM CaCl 2 .
  • the sample was incubated at 32 ° C for 8 days.
  • the reaction was dialyzed against water (5 x 5 L), lyophilized and then transmitted to NTNU (Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Norway) where it was dissolved in D 2 O and analyzed by 1 H NMR spectroscopy at 90 ° C, using a Bruckner AM-300 spectrometer (300 MHz). 3- (trimethylsilyl) propane sulfonate was used as an internal control. The chemical displacement of the internal H-1 of the glycine residues was obtained by Grasdalen (1983).
  • the nucleotide sequence data of ManC5-E1 (SEQ ID N ° 1), ManC5-E2 (SEQ ID N ° 2), ManC5-E3 (SEQ ID N ° 3), ManC5-E4 (SEQ ID N ° 4), ManC5-E5 (SEQ ID N ° 5), ManC5-E6 (SEQ ID N ° 6) have been deposited in the EMBL database under the following respective access numbers: AJ496449, AJ496450, AJ496451, AJ496452, AJ496453 and AJ496454 . 2.
  • the coding region of the ManC5-E1 cDNA was used as a homologous probe to cribe a cDNA library of L. digitata sporophytes, leading to the identification of 4 new cDNAs whose sequence has been completely determined.
  • the ManC5-E1 sequence (SEQ ID No. 1) of L. digitata was tested for similarity against a non-redundant protein database from NCBI using BLASTX software. This revealed that the more similar sequences were those of the GP-1 envelope proteins of the Ectocarpus siliculosis virus and the unclassified Ectocarpus fasciculatus virus. The scores obtained were approximately 45% identity and 65% similarity from the sequence data. Other sequences thus identified corresponded to those of the non-modular C5-epimerases AlgG from Azotobacter vinelandii and Pseudomonas aeruginosa with 26% and 27% identity respectively.
  • Proteins that have a comparable distribution of their hydrophobic groups are considered to be superposable in their 3D structure.
  • the HCA analysis was carried out using the deduced protein sequence of ManC5-E1 (SEQ ID No. 1), together with the sequence of the envelope protein GP-1 of the virus E. siliculosus, of AlgG of P. aeruginosa and of module A of AlgE5 of A. vinelandii ( Figure 4).
  • the sequence of L. digitata exhibited the strongest structural similarity, although over a short domain (from the lysine residue 150 to the phenylaninine residue 373 ), with the protein GP-1.
  • the ManC5-E1 sequence also showed strong structural similarity (from leucine 66 to leucine 332 ) with the AlgG sequence of P. aeruginosa (from leucine 126 to leucine 374 ).
  • the catalytic domain (module A) of AlgE ⁇ exhibited some structural similarities over a domain of 130 amino acids comprising the conserved motif (FIG. 12).
  • the structural identities observed were confirmed in their entirety by the presence of a few hydrophilic residues strictly conserved across the sequences (stained negatively in Figure 4).
  • the proteins compared were rich in beta sheets and could adopt a similar three-dimensional folding at the level of the conserved domain (Figure 4).
  • the phylogenetic relationships between C5 mannuronan and epimerases The amino acid sequences deduced from the ManC5-E of L. digitata were aligned with those of various bacterial epimerases as well as with the viral capsid protein GP-1. A phylogenetic tree was constructed by the Neighbor-Joining method using the Dayhoff distance matrix ( Figure 5). A tree based on parsimony presented the same topology and the bootstrap values were introduced in FIG. 5.
  • the ManC5-E proteins of L. digitata constituted a monophyletic group including the GP-1 protein of EsV-1, with the sequences of AlgG of Azotobacter and Pseudomonas as the closest group.
  • the ManC5-E proteins formed 3 different subgroups, with one of them having the highest bootstrap value (99) and comprising ManC5-E1 (SEQ ID No. 1) , ManC5-E2 (SEQ ID No.2) and ManC5-E4 (SEQ ID No.4).
  • the modular epimerases of A. vinelandii formed a well-supported group and was the group least related to the epimerases of L. digitata.
  • L. digitata probably belong to a multigene family. Furthermore, it cannot be excluded that L. digitata contains other epimerase genes not yet identified.
  • the presence of a multigene family of mannuronan C5-epimerases in L. digitata suggests that each member of the family could be involved in various metabolic functions and pathways.
  • different epimerases could be necessary and complementary to specifically modulate the relative content of G-blocks, M-blocks and MG-blocks of alginates according to the type of tissue, season and age of the plant.
  • a suspension of isolated protoplasts lacking a cell wall could provide an appropriate system for studying the biosynthesis of components of the cell wall. It was likely that cells without a wall would preferentially orient their metabolism towards the synthesis of a new cell wall.
  • the use of protoplasts made it possible to avoid all the technical problems linked to the presence of large amounts of cell wall polysaccharides, such as alginates, which interfere with protein extractions and electrophoresis, and can also bind or interact with enzymes of cell wall metabolism during the extraction stages.
  • Protoplasts were therefore used as tools to analyze the expression of epimerase genes during the cell wall regeneration process. Experiments were also carried out in order to correlate the expression of genes with enzymatic activity and protein levels.
  • the protoplasts were prepared from young sporophytes of L. digitata, and cultured for 4 days.
  • the regeneration of the cell wall was controlled by staining with Calcofluor.
  • Protoplasts with a wall containing regenerated cellulose were observed after two days of culture.
  • the epimerase activity was monitored in the protoplast pellet and in the culture medium using the [5- 3 H] poly-mannuronate test. Most of the epimerase activity was present in the surrounding environment. Only a low level of activity could be detected in the protoplast pellets (data not shown).
  • the measurement of the epimerase activity in the culture medium over a period of 4 days revealed that the maximum activity was observed at the very beginning (T0), when the protoplasts were prepared. After which, the activity decreased over time.
  • the T0 sample had the highest epimerase concentration, while the intensity of the band gradually decreased during culture (Figure 9). The same trend was observed for the expression of epimerases at the level of the mRNA, as shown by Northern blot and RT-PCR (FIG. 10).

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Abstract

La présente invention a pour objets des séquences nucléotidiques d’algues brunes codant des mannuronane C5-épimérases, les enzymes ainsi codées, ainsi que des procédés d’obtention et des utilisations desdites enzymes.

Description

MANNURONANE C5-EPIMERASES D'ALGUES BRUNES, PROCEDES D'OBTENTION ET UTILISATIONS
L'invention se rapporte au domaine des biopolymères extraits d'algues brunes, utiles comme gélifiants, tels que les alginates, et s'intéresse plus particulièrement aux moyens permettant de contrôler la structure et les propriétés gélifiantes desdits biopolymères.
La présente invention a pour objets des séquences nucléotidiques d'algues brunes codant des mannuronane C5-épimérases, les enzymes ainsi codées, ainsi que des procédés d'obtention et des utilisations desdites enzymes.
Les algues brunes sont des organismes eucaryotes photosynthétiques présents en abondance sur les côtes rocheuses des mers tempérées à sous-antarctique et arctique. Ces organismes appartiennent à la classe des phéophycées, autrement appelées « algues brunes ».
Les algues brunes, telles que Laminaήa sp., possèdent un cycle de vie haplo-diplophasique hétéromorphe, celles-ci se présentant alternativement sous la forme de gamétophytes microscopiques et de sporophytes macroscopiques.
Tandis que les gamétophytes sont des filaments unisériés de quelques millimètres de long, les sporophytes possèdent des organes distincts, à savoir des crampons, des stipes et des lames, et peuvent atteindre jusqu'à 50 mètres de long selon les espèces.
Les sporophytes des laminaires forment un habitat écologique important, fournissant de la nourriture et des substrats à nombre d'espèces d'invertébrés, de poissons et d'algues épiphytes. Ils représentent en outre une richesse marine importante : ils sont cultivés en Asie de l'Est et récoltés à partir des populations naturelles de laminaires en Europe et en Amérique du Nord. Les laminaires ainsi cultivées et récoltées sont essentiellement utilisées dans l'industrie et représentent en particulier la source principale d'alginates.
- L'exploitation industrielle des laminaires est principalement liée à l'extraction des biopolymères glucidiques, tels les alginates ou sels de l'acide alginique, constituant la partie amorphe de la paroi des cellules.
Les alginates sont caractérisés par leur solubilité dans l'eau, leur viscosité, leur atoxicité et leurs propriétés gélifiantes et stabilisantes. Ils sont donc abondamment utilisés comme agents épaississants dans l'industrie agro-alimentaire, par exemple pour la préparation de sauces, crèmes glacées, entremets, fromages fondus et autres produits laitiers, confitures, bières légères, etc.. Ils entrent également dans la composition de produits cosmétiques et pharmaceutiques (excipients, formulations à libération contrôlée, empreintes et appareils dentaires, traitement des reflux gastriques), de vernis automobiles, peintures, insecticides, etc.. Enfin, les alginates trouvent des applications en médecine, dans l'industrie textile (impression, teinture des tissus...), pour le traitement du papier (uniformisation et revêtement des surfaces...), etc.. (Onsoyen, 1996).
A l'état naturel, les alginates se trouvent majoritairement dans les algues brunes et sont, dans une moindre mesure, produits par des bactéries du sol telles que Azotobacter vinelandii et diverses espèces de Pseudomonas.
L'alginate représente le polysaccharide le plus abondant dans les algues brunes, constituant jusqu'à 40% de la matière sèche (Skjak-Braek, 1992). Il a pour fonction biologique principale de conférer à la fois force, résistance et flexibilité aux tissus.
L'alginate est un polysaccharide non branché, composé de deux types d'acides uroniques, l'acide β-1 ,4-D-mannuronique (M) et son épimère en C5, l'acide α-1 ,4-L-guluronique (G).
Les polymères d'alginates sont formés de blocs de co-polymères répartis en régions homopolymériques, à savoir des blocs M et G, espacées par des régions dont la structure polymérique est alternée, les blocs MG.
Les propriétés biologiques des alginates sont étroitement liées à leur structure primaire, laquelle dépend à la fois des quantités de M et G et des proportions relatives des trois types de blocs dans la chaîne. Ces caractéristiques varient d'une part selon la nature et l'âge des tissus, et d'autre part selon la saison et la zone de croissance des algues brunes (zone abritée ou exposée aux courants, aux vagues et au vent). Par exemple, le stipe de Laminaria contient une forte proportion de blocs G, tandis que la lame renferme une quantité plus élevée de blocs M. Chez L. digitata, l'on trouve environ 41% d'unités G et 59% d'unités M, organisées à raison d'au moins environ 25% de blocs G et 43% de blocs M (Skjak- Braek, 1992).
Une telle disparité entre les quantités d'unités M et d'unités G d'une part, ainsi qu'entre les quantités de blocs M, G et MG d'autre part, d'un organe à l'autre au sein d'un même organisme reflète les propriétés physico-chimiques de chaque organe, imposées par l'environnement Ainsi, des alginates riches en blocs G forment un gel à force élevée en présence de cations divalents tels que le calcium, et confèrent une rigidité mécanique accrue aux stipes et aux crampons des algues. En revanche, des alginates riches en blocs M et/ou MG sont des polymères plus flexibles convenant aux lames qui sont soumises au courant et au mouvement de l'eau de mer.
A l'état naturel, les alginates d'algues brunes peuvent contenir entre environ 25% et 75% d'acide guluronique.
L'étape finale de biosynthèse de l'alginate consiste en l'épimérisation de l'acide β-1 ,4-D-mannuronique en acide α-1,4-L- guluronique (Figure 1). Cette réaction d'épimérisation est catalysée par une mannuronane C5-épimérase. Le changement structural induit par cette enzyme modifie la quantité d'unités M et G et, par-là même la proportion de blocs M, G et MG dans le polymère. Cette modification de structure altère de manière significative les propriétés physico-chimiques de ce dernier.
Dans tous les domaines d'application des alginates (voir supra), en particulier dans les domaines de la biotechnologie et de la médecine, il est nécessaire de « profiler » les alginates à partir d'alginates naturels, afin de modifier leur contenu en acide guluronique, le réduire ou, au contraire, l'augmenter, en fonction des propriétés physico-chimiques désirées. Par exemple, des immunostimulants à base d'alginates vont contenir de 0 à 10% environ d'acide guluronique (Otterlei et al., 1991). A l'inverse, pour l'immobilisation des cellules, les alginates présenteront de préférence un fort excès d'acide guluronique dans leur composition (éventuellement, au- delà de 80%) (Martinsen et al., 1989).
Pour ce faire, l'homme du métier, doit mettre au point des outils, faciles d'utilisation en routine, qui permettent de « profiler » à la demande les alginates naturels extraits des algues brunes.
Le brevet US 5,939,289 délivré le 17 août 1999 au nom de Ertesvag et al. a apporté un premier élément de réponse, en proposant des enzymes bactériennes présentant une activité mannuronane C5- épimérase. Cependant, utiliser des enzymes d'origine bactérienne pour modifier un produit extrait d'un organisme eucaryote n'est pas . sans présenter des inconvénients. En particulier, l'enzyme procaryote ne se trouve pas dans des conditions optimales, notamment en termes de spécificité et sélectivité vis-à-vis du(des) substrat(s) et/ou du(des) produit(s) obtenu(s), ainsi qu'en terme de cinétique de réaction, pour réagir rapidement et efficacement avec un substrat issu d'un organisme eucaryote.
Jusqu'à la présente invention, aucun gène impliqué dans la voie métabolique de biosynthèse des alginates n'avait été isolé chez les algues brunes. L'invention a donc pour objet une séquence nucléotidique isolée, codant une mannuronane C5-épimérase d'algues brunes, notamment de L. digitata. Cette séquence nucléotidique est choisie parmi les séquences ManC5-E3 à ManC5-E6 (SEQ ID N°3 à SEQ ID N°6), les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à au moins 50 % à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci, et les séquences hybridables en conditions strictes à au moins 50 % avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci. En particulier, une séquence nucléotidique conforme à la présente invention est choisie parmi les séquences ManC5-E3 à ManC5-E6, les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci à au moins 60%, de préférence au moins 70%, et de manière encore préférée, au moins 80%, et les séquences hybridables en conditions strictes avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci à au moins 60%, de préférence au moins 70%, et de manière encore préférée, au moins 80%.
Une « séquence nucléotidique » et un « acide nucléique » selon l'invention sont conformes à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie. Ces deux expressions couvrent indifféremment les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt). De manière préférée, les séquences nucléotidiques et acides nucléiques de l'invention sont des ADN.
Dans le cadre de la présente invention, l'on distinguera les séquences nucléotidiques définies ci-dessus des acides nucléiques dont il sera question plus loin. Les séquences nucléotidiques ici visées codent des mannuronane C5-épimérases d'algues brunes. Les acides nucléiques, quant à eux, peuvent être de toute origine, de toute nature, et comprennent des séquences nucléotidiques codant des mannuronane C5- épimérases d'algues brunes. Comme indiqué infra, un acide nucléique peut notamment comprendre une ou plusieurs séquences nucléotidiques différentes codant chacune une mannuronane C5-épimérase d'algues brunes donnée.
L'on entend par « fragment fonctionnel » d'une séquence nucléotidique, ladite séquence nucléotidique codant une protéine présentant une activité biologique donnée, des parties de cette séquence, comprenant au moins toutes les régions essentielles à l'activité biologique de la protéine codée. Les parties de séquence en question peuvent être de taille plus ou moins longue dès lors que l'activité biologique de la protéine qu'elles codent est conservée.
Les termes et expressions « activité », « fonction », « activité biologique » et « fonction biologique » sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Une telle activité est par exemple de nature enzymatique.
Deux séquences nucléotidiques « complémentaires » sont telles que chaque base de l'une est appariée avec la base complémentaire de l'autre, l'orientation des deux séquences étant inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U dans le cas des ARN), et C et G.
Les séquences « similaires à au moins X% » .à une séquence nucléotidique de référence, codant une protéine présentant une fonction biologique donnée, désignent des variants de cette séquence, lesdits variants ayant, sur toute leur longueur, au moins X% de bases identiques à celles de ladite séquence. Les bases identiques peuvent être consécutives, en tout ou en partie seulement. Les variants ainsi envisagés peuvent être de même longueur que la séquence nucléotidique de référence, ou d'une longueur différente, dès lors que la fonction biologique de la protéine codée est conservée. En effet, il est connu de l'homme du métier que des séquences nucléotidiques présentent un certain niveau de similitude (au moins X% selon la présente invention) peuvent néanmoins compte tenu de la dégénérescence du code génétique d'une part, et de l'utilisation préférentielle de certains codons en fonction des organismes (bactéries, levures...) d'autre part, coder des protéines dont la fonction biologique d'intérêt est préservée. Ces protéines peuvent elles mêmes être identiques ou similaires. Dans la présente espèce, ces protéines sont des mannuronanes C5-épimérases.
La définition ci-dessus peut être élargie à des séquences en acides aminés, ou séquences protéiques, similaires à au moins X% à une séquence en acides aminés de référence. L'on considère en ce cas des variants protéiques ayant, sur toute leur longueur, au moins X% d'acides aminés similaires à ceux de la séquence de référence. Là encore, les acides aminés similaires peuvent être consécutifs, en tout ou en partie seulement. Les variants protéiques peuvent être de même longueur ou de longueur différente, dès lors que la fonction biologique de la séquence protéique de référence est conservée.
L'on entend ici par « acides aminés similaires » des acides aminés possédant la même réactivité au niveau de leur chaîne latérale. Ainsi, une polarité et des propriétés d'ionisation comparables ont permis de définir des groupes d'acides aminés similaires, connus de l'homme du métier. A titre d'exemple, il est d'usage de classer au sein, d'un même groupe, les acides aminés aliphatiques que sont la glycine, l'alanine, la valine, la leucine et Pisoleucine. De même, sont similaires les acides aminés dicarboxyliques, acide aspartique et acide glutamique. Egalement, la serine et la thréonine appartiennent à un même groupe en ce qu'elles portent toutes deux un groupement alcool estérifiable. L'on peut encore citer la lysine, l'arginine et l'histidine comme étant des acides aminés basiques similaires, etc..
Dans le cadre de la présente invention, X vaut 50. En particulier, X vaut 60, de préférence 70, et de manière encore préférée, 80. Les « conditions strictes d'hybridation » obéissent à la définition classique connue de l'homme du métier (Sambrook et Russel, 2001). Des « conditions strictes d'hybridation » sont, par exemple, des conditions permettant l'hybridation spécifique de deux séquences nucléotidiques simple brin, et ce, après au moins une étape de lavage telle que décrite ci- dessous. L'étape d'hybridation peut notamment être réalisée à environ 65°C, pendant 12h dans une solution comprenant du SSC 6X, du SDS 0,5%, une solution de Denhardt 5X et 100 μg d'ADN non spécifique (par exemple de l'ADN de sperme de saumon), ou dans une quelconque autre solution de force ionique équivalente. L'étape suivante, comprenant au moins un lavage, est par exemple effectuée à environ 65°C, dans une solution comprenant du SSC à au plus 0,2X et du SDS à au plus 0,1%, ou dans une quelconque autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions d'hybridation dépendent de la température Tm à laquelle 50% des brins appariés se séparent. S'agissant des séquences de plus de 30 bases, la température Tm est calculée suivant la formule : Tm = 81,5 + 0,41x[% G+C] + 16,6xLog(concentration en cations) - 0,63x[% formamide] - (600/nombre de bases). Pour les séquences de moins de 30 bases, la température Tm est définie par la relation suivante : Tm = 4x(nombre de G+C) + 2x(nombre de A+T). Les conditions d'hybridation peuvent donc . être adaptées par l'homme du métier selon la taille des séquences mises en jeu, leur teneur en GC, et d'autres paramètres, comme indiqué notamment dans les protocoles décrits dans Sambrook et Russel (2001 , supra). La présente invention vise également un acide nucléique isolé comprenant au moins une séquence nucléotidique telle que décrite ci- dessus.
Un acide nucléique selon l'invention est tel que défini précédemment. Par exemple, plusieurs mannuronane C5-épimérases différentes peuvent être produites à partir d'un tel acide nucléique, ledit acide nucléique comprenant en ce cas plusieurs séquences nucléotidiques différentes, comme indiqué supra.
L'invention concerne en outre des outils de biologie moléculaire, à savoir des vecteurs et cellules hôtes recombinants. Ainsi, la présente invention a pour objet un vecteur recombinant, ledit vecteur comprenant une séquence nucléotidique ou un acide nucléique conformes aux définitions données ci-dessus.
Les termes « vecteur » et « piasmide » sont utilisés ici pour désigner de manière indifférente le même outil de clonage des séquences nucléotidiques et des acides nucléiques de l'invention, cet outil étant connu de l'homme du métier. En particulier, un tel vecteur peut être un vecteur d'expression d'une séquence nucléotidique ou d'un acide nucléique selon l'invention. En pareil cas, ce vecteur permet de produire la ou les enzymes d'intérêt. De plus, l'invention a trait à une cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle héberge un vecteur recombinant, comme défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, une telle cellule hôte est une cellule de Escherichia coli, Pichia pasto s, Saccharomyces cerevisiae ou d'insecte.
Par ailleurs, la présente invention concerne une enzyme. présentant une activité mannuronane C5-épimérase, ladite enzyme étant codée par une séquence nucléotidique ou un acide nucléique selon l'invention.
Dans le contexte de l'invention, une « enzyme » est une « protéine » et correspond à une « séquence en acides aminés ». De manière préférée, une « enzyme » est une protéine dotée d'une fonction biologique particulière. Une telle enzyme est notamment une mannuronane C5-épimérase. Néanmoins, dans le cadre de l'invention, ces termes peuvent être utilisés de manière indifférente pour désigner la même entité biologique. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence de ladite enzyme est choisie parmi les séquences SEQ ID N°9 à
SEQ ID N°12 (ManC5-E3 à ManC5-E6), et les séquences similaires à celles-ci à au moins 50 %, en particulier au moins 60%, de préférence, au moins 70%, et de manière encore préférée, au moins 80%.
Dans la mesure où les enzymes objets de la présente invention possèdent des séquences en acides aminés différentes, l'on peut en déduire qu'elles présentent des activités mannuronane C5-épimérases spécifiques et complémentaires les unes des autres chez les algues brunes. En particulier, le nombre et le choix des enzymes semblent avoir une incidence sur la composition, donc les propriétés physico-chimiques, du polymère finalement obtenu.
En outre, la présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'une enzyme telle que susvisée. Selon un premier mode de mise en oeuvre, ledit procédé comprend au moins : a) le clonage d'une séquence nucléotidique ou d'un acide nucléique conforme à l'invention, dans un vecteur d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante apte à exprimer ladite séquence nucléotidique ou ledit acide nucléique, avec ledit vecteur d'expression recombinant ; et c) l'expression de ladite séquence nucléotidique ou dudit acide nucléique à partir de ladite cellule hôte recombinante. Selon un deuxième mode de mise en oeuvre, le procédé objet de la présente invention comprend en outre une étape d) de purification de l'enzyme et/ou de l'activité de l'enzyme obtenue après les étapes a), b) et c) ci-dessus.
Cette étape supplémentaire d), consistant en la purification de la protéine en tant que telle et/ou de l'activité biologique de celle-ci, c'est-à- dire en l'espèce de l'activité mannuronane C5-épimérase, peut être mise en œuvre selon les méthodes classiques, connues de l'homme du métier, [voir par exemple dans Methods in Enzymology, Volume182: Guide to protein purification. Académie Press. (1990) Murray P. Deutsher].
De manière préférée, au sens de la présente invention, l'étape d) consiste à purifier l'activité mannuronane C5-épimérase de l'enzyme, et non l'enzyme elle-même. En ce cas, à l'issue de l'étape supplémentaire d), la présence de substances contaminantes, y compris celle d'autres protéines, en quantité minoritaire n'est pas exclue, dès lors que l'activité mannuronane C5-épimérase d'intérêt est préservée, et que seule cette activité est détectée. La détection de l'activité enzymatique d'intérêt peut être effectuée par des méthodes conventionnelles, (voir par exemple Ertesvag et Skjak-Braek (1999) In Methods in Biotechnology - Carbohydrate Biotechnology Protocols. Eds. Walkere and Bucke, Humanoria Press, London. Pp71-78). Lors de la mise en œuvre d'un procédé d'obtention d'une enzyme, tel que décrit ci-dessus, la cellule hôte recombinante utilisée au cours de l'étape b) est, de préférence, une cellule de Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae ou d'insecte.
Enfin, l'invention concerne des utilisations des mannuronane C5- épimérases ManC5-E1 à ManC5-E6, et en particulier des enzymes ManC5-E3 à ManC5-E6 telles que définies précédemment.
Plus précisément, la présente invention a trait à des utilisations d'au moins une enzyme présentant une activité mannuronane C5-épimérase, codée par une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°6 (ManC5-E1 à ManC5-E6), les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%, à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci, et les séquences hybridables en conditions strictes à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%>, de manière encore préférée au moins 80%, avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la ou les enzymes utilisées présentent une ou des séquences choisies parmi les séquences SEQ ID N°7 à SEQ ID N°12 (ManC5-E1 à ManC5-E6) , et les séquences similaires à celles-ci à au moins 50%, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, et de manière encore préférée au moins 80%.
Selon un premier aspect, l'invention vise à utiliser au moins une de ces enzymes, pour déterminer les propriétés gélifiantes d'un alginate. En effet, la ou les enzymes ainsi utilisées, en ce qu'elles codent des mannuronane C5-épimérases spécifiques, permettent de modifier le rapport des quantités d'acide β-1,4-D-mannuronique et d'acide α-1 ,4-L- guluronique dans l'alginate de départ. Au sens de l'invention, l'on entend par « modifier » le rapport des quantités des deux acides uroniques, augmenter, d'un facteur 0 à 100, la quantité d'acide guluronique par rapport à la quantité d'acide mannuronique, et ce, par épimérisation de ce dernier au moyen d'une ou plusieurs mannuronane C5-épimérases. Ainsi peut-on envisager les différents cas de figure suivants : i) premier cas extrême : aucune épimérisation de l'acide mannuronique en acide guluronique (augmentation d'un facteur o) ; ii) deuxième cas extrême : épimérisation totale (augmentation d'un facteur 100) ; et iii) entre ces deux extrêmes, une épimérisation plus ou moins importante de l'acide mannuronique en acide guluronique. En particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une enzyme telle que susvisée, pour modifier un alginate par épimérisation de l'acide β-1 ,4-D-mannuronique en acide -1 ,4-L-guluronique. Selon un autre aspect, l'invention a trait à l'utilisation d'au moins une de ces enzymes, pour modifier un polymère contenant de l'acide β- 1 ,4-D-mannuronique, par épimérisation dudit acide β-1,4-D-mannuronique en acide α-1 ,4-L-guluronique. Par exemple, un tel polymère peut être un produit d'oxydation du mannane, notamment le glucomannane ou le galactomannane.
De manière préférée, les utilisations objets de la présente invention sont telles que le niveau de modification de l'alginate ou du polymère contenant de l'acide mannuronique de départ est contrôlé par le nombre et le choix des enzymes utilisées. En particulier, par ce contrôle, l'on se placera comme souhaité, notamment entre les deux extrêmes indiqués ci- dessus [cas de figure iii)], afin de générer un alginate, ou un polymère, dont les propriétés gélifiantes répondront aux exigences de l'application spécifique envisagée. Par exemple, dans le domaine médical, des gels d'alginate destinés à être implantés sous forme de capsules dans l'organisme d'un mammifère, notamment de l'homme, afin d'y mimer des cellules productrices d'insuline, doivent présenter, entre autres caractéristiques, une haute stabilité tant mécanique que chimique. A cette fin, il est donc utile que l'alginate contienne une proportion élevée d'acide guluronique.
A cet égard, le choix des enzymes, ainsi que leur nombre, permet précisément de profiler un alginate conformément au degré d'épimérisation escompté.
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures suivantes :
Figure 1 : Schéma représentant la voie de biosynthèse des alginates chez les aiguës brunes. P : phosphate, GMP : Guanosine-monophosphate ; GDP : Guanosine-diphosphate ; GTP : Guanosine-triphosphate ; PPi : pyrophosphate inorganique ; Pi : phosphate inorganique ; NAD : nicotinamide adénine dinucléotide. Figure 2 : Représentation schématique des 6 ADNc isolés chez L. digitata. Les traits épais représentent les cadres ouverts de lecture ; les traits fins indiquent les cadres de lecture 5' et 3' non traduits hypothétiques.
Figure 3 : Auto-radiogramme d'un transfert Southern de l'ADN total isolé chez L. digitata. La taille moléculaire est indiquée en kb.
Figure 4 : Graphiques HCA de la séquence ManC5-E1 de L. digitata, de la protéine d'enveloppe GP-1 du virus Ectocarpus siliculosus, ainsi que des mannuronane C5-épimérases AlgG de Pseudomonas aeruginosa et le module A de AlgE5 de Azotobacter vinelandii. Les traits verticaux délimitent les éléments structurels et les différentes couleurs reflètent les niveaux de similitudes. La localisation putative des éléments de structure secondaire figure sous l'épimérase AlgG. Les flèches 1D et 2D indiquent respectivement les structures primaire et secondaire.
Figure 5 : Arbre phylogénétique des mannuronane C5-épimérases.
Les nombres situés au niveau des nœuds (intersections) correspondent aux valeurs d'initialisation (sur 100 répliques) utilisées respectivement dans les analyses de distances et de parcimonie maximale. Des tirets à la place des nombres indiquent que le nœud n'était pas fiable dans l'analyse correspondante. Le trait d'échelle représente le nombre attendu de changements par position de séquence.
Figure 6 : Auto-radiogramme et photographie d'un gel d'électrophorèse relatifs à l'expression de la mannuronane C5-épimérase ManC5-E1 dans les sporophytes de L. digitata.
Figure 7 : Graphique représentant l'activité épimérase dans le milieu de culture de protoplastes de L. digitata à différents temps de culture. Les échantillons ont été testés en triple exemplaire. Les barres d'erreurs indiquent les écarts types.
Figure 8 : Graphiques représentant les spectres RMN 1H du M-alginate avant et après épimérisation. A : Avant épimérisation ; B : Après épimérisation.
Figure 9 : Auto-radiogramme d'un transfert Western de protéines totales d'un milieu de culture de protoplastes de L. digitata, à différents temps de cultures.
Figure 10 : Auto-radiogramme et photographie d'un gel d'électrophorèse relatifs à l'expression de la mannuronane C5-épimérase ManC5-E1 dans les protoplastes de L. digitata à différents temps de culture.
Figure 11 : Schéma représentant le clone génomique EpiG et son alignement avec la séquence ManC5-E6.
La ligne supérieure représente la carte de restriction du clone EpiG entier, avec les positions des sites de restrictions de Sal I (S), Xho I (X) et Eco RI
(E).
La ligne médiane indique la partie de EpiG qui a été sous-clonée puis alignée avec la séquence ManC5-E6. Les rectangles blancs indiquent les introns et les rectangles noirs les exons. Les amorces PCR utilisées pour la RT-PCR sont indiquées par des flèches.
La ligne inférieure représente ManC5-E6. Les cadres de lecture 5' et 3' non traduits (5' utr et 3' utr) sont indiqués en gris, tandis que le cadre ouvert de lecture est indiqué en noir. Figure 12 : Alignement des séquences protéiques du site actif putatif de plusieurs mannuronane C5-épimérases. L'acide aspartique (D) nécessaire à l'activité est signalé par une étoile et les acides aminés conservés dans toutes les séquences sont sous-colorés en noir. ManC5-E1 de L. digitata (AJ496449) ; GP1 EsV-1 : protéine d'enveloppe GP1 (Q8QN64) du virus Ectocarpus siliculosus ; AlgE1-A1 : A(gE1 (Q44494) de Azotobacter vinelandii ; AlgG-Azo : AlgG (P70805) de A. vinelandii et AlgG-Pse : AlgG (Q51371) de Pseudomonas aeruginosa.
EXEMPLES
1. MATERIELS ET METHODES
1.1 Clones de mannuronane C5- épimérases:
Deux clones d'ADNc présentant une similitude avec les mannuronane
C5-épimérases [ManC5-E1 (SEQ ID N°1) et ManC5-E2 (SEQ ID N°2)] ont été identifiés dans un groupe de 905 séquences EST (pour
« Expressed Séquence Tag »), constituées à partir de deux banques d'ADNc orientées, de sporophytes et de gamétophytes de L. digitata (Crépineau et al., 2000). Un criblage de la banque d'ADNc de sporophytes avec ces clones a permis d'identifier 4 clones additionnels d'ADNc (ManC5-E3 à ManC5-E6, respectivement SEQ ID N°3 à SEQ ID N°6). Un fragment de 1 kb issu du cadre ouvert de lecture (ORF) de ManC5-E1 a été utilisé pour cribler une banque génomique de L. digitata. Cette banque a été construite avec de l'ADN de sporophytes de L. digitata, d'abord isolé selon la méthode décrite par Apt et al. (1995), puis digérée partiellement avec Saι/3AI. Les fragments dont la taille était située entre 8 et 12 kb ont été sélectionnés, puis ligués dans un vecteur Lambda Dash II (Stratagene, La Jolla, CA, Etats-Unis) digéré par BamHl. Le vecteur a été encapside en utilisant l'extrait Gigapack III Gold Packaging (Stratagene, supra). Le titre de la banque amplifiée était de 56 x 1011 pfu. A partir de cette banque, 8 clones génomiques différents ont été isolés.
1.2 Procédures de laboratoire standard :
Les électrophorèses sur gel d'agarose, les digestions par des enzymes de restriction, ainsi que les ligatures ont été effectuées conformément à Sambrook et Russei (2001). Les concentrations protéiques ont été mesurées en utilisant le test de protéines basé sur le bleu brillant de Coomassie (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) avec de l'albumine de sérum bovin comme référence. La détermination des séquences d'ADN a été effectuée en utilisant le système « ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing kit » et l'analyseur ABI PRISM 3100 Genetic (PerkinElmer Life Sciences, Courtaboeuf, France).
1.3 Graphiques HCA :
La séquence de la protéine ManC5-E1 de L. digitata a été comparée aux épimérases AlgE5 de Azotobacter vinelandii (GenPept AAA87309) et AlgG de Pseudomonas aeruginosa (TrEMBL : Q51371), et à la protéine GP-1 du virus Ectocarpus (GenPept. CAA53944.1) en utilisant, l'analyse par groupe hydrophobe ou HCA (Callebaut et al., 1997). Les graphiques HCA ont été réalisés en utilisant le logiciel Draw HCA [http://www.lmcp.jussieu.fr/~callebau/hca_method.html ].
1.4 Arbres phyloqénétiques:
Les séquences en acides aminés des clones d'épimérases de L. digitata ont été alignées manuellement avec un jeu représentatif de séquences d'acides aminés obtenues à partir de versions récentes de GenBank sur une région de 107 acides aminés, en utilisant le logiciel Seaview (Galtier et al., 1996). Les alignements HCA ont été utilisés comme références pour s'assurer que seules les régions homologues étaient comparées. La matrice des distances et les méthodes de parcimonie maximale (Fitch, 1971) ont été appliquées telles que mise en œuvre par le logiciel Phylo- Win (Galtier et al., supra). La méthode dite de « neighbor-joining » (Saitou et Nei, 1987) a été utilisée avec différents facteurs de correction des distances (données non montrées) et l'analyse des valeurs d'initialisation a fourni des estimations de confiance pour les topoiogies des arbres phylogénétiques (Felsenstein, 1985). Les séquences utilisées dans l'analyse phylogénétique étaient celles des mannuronane C5-épimérases de A. vinelandii : AIgE1 (Q44494), AlgE2 (Q44495), AlgE3 (QQ44496), AlgE4 (Q44493), AlgE5 (Q44492), AlgE6 (Q9ZFH0), AlgE7 (Q9ZFG9), AlgY (Q9ZFG8), AlgG (P70805), des mannuronane C-5 épimérases de P. aeruginosa AlgG (Q51371), de la protéine d'enveloppe GP-1 du virus Ectocarpus siliculosus : EsV-1 GP1 (Q8QN64) et des mannuronane C5-épimérases identifiées chez L. digitata, ManC5-E1 à ManC5-E6, respectivement (SEQ ID N°1 à SEQ ID N°6).
1.5 Isolement des protoplastes:
Des sporophytes de L. digitata, de 15 à 50 cm de longueur ont été collectés à l'Ile de Sieck (Bretagne, France) en février 2002. Les algues ont été conservées en eau de mer courante et utilisées 1 à 7 jours plus tard. Immédiatement avant utilisation, la surface des lames a été raclée avec une lame de rasoir afin d'éliminer les organismes contaminants. Les méristèmes ont été extraits par coupure et placés dans de l'eau de mer stérile. Le tissu a été grossièrement coupé en morceaux dans de l'eau de mer stérile avec une lame de rasoir, recueilli par filtration- et incubé 10 mn à 8°C dans de l'eau de mer contenant 1% de bétadine. La solution de bétadine a été éliminée par filtration et le tissu d'algue a été lavé puis resuspendu dans de l'eau stérile à 70% (diluée avec de l'eau désionisée), et enfin incubé pendant 45 mn à 8°C. A partir de ce stade, le protocole de Butler et al. (1989) a été appliqué, excepté que de l'eau de mer artificielle additionnée d'agents osmotiques (MgCI2 et KCI) a été utilisée comme milieu lors de l'étape de digestion. Après digestion, les protoplastes ont été décantés à travers des filtres en nylon dont la taille des pores étaient de 200 et 45 μm. La suspension de protoplastes a été répartie dans des tubes Falcon de 50 ml. Ces tubes ont été centrifugés 15 mn à 50 x g. Les culots ont été lavés 2 fois par resuspension dans 12 ml de milieu de culture puis centrifugation comme indiqué ci-dessus. Après les étapes de lavage, les culots ont été resuspendus dans 12 ml de milieu de culture.
1.6 Culture des protoplastes :
Les protoplastes ont été cultivés à 12°C dans des boîtes de pétri en plastique de 9 cm de diamètre contenant 10 ml d'eau de mer stérile enrichie avec des agents osmotiques et des nutriments, ainsi que de la rifampicine à 0,4 μg/ml et de la carbénicilline à 4,8 μg/ml. La densité de cellules était de 1 ,5 x 106 cellules/ml. Pendant les 24 premières heures, les protoplastes ont incubé dans l'obscurité totale, puis sous faible lumière, selon un enchaînement de 14 heures de lumière puis 10 heures d'obscurité. Des échantillons de protoplastes et milieu de culture ont été prélevés à 0, 24, 45, 68 et 92 heures, et séparés par centrifugation à 50 x g pendant 10 mn. Les échantillons ont été congelés dans de l'azote liquide puis conservés à -80°C. Le milieu a été concentré 15 fois dans une cellule d'ultrafiltration agitée (Amicon, MA, Etats-Unis) en utilisant une membrane YP3 (Millipore, Saint-Quentin en Yvelines, France) présentant un seuil de coupure de 3 000 kDa, avant d'être utilisé pour les tests.
1.7 Analyses de l'expression des gènes : L'ARN total a été isolé à partir de sporophytes de L. digitata collectés à l'Ile de Sieck entre septembre 2000 et avril 2001 , et à partir de protoplastes, après 0 à 92 heures de culture en utilisant le protocole de Apt et al. (1995). Le transfert Northern a été effectué selon Sambrook et Russel (2001 , supra), avec 20 μg d'ARN par piste.
Le transfert Northern a été hybride avec un fragment de 405 bp de ManC5-E1. Un fragment de 400 bp de la protéine ribosomale rpl-14 a été utilisé comme contrôle. L'ARN total (300 ng) a été utilisé comme matrice pour la PCR en utilisant le système « RT-PCR Beads Ready to go » (Amersham-Pharmacia Biotech, Angleterre) selon les instructions du fabricant. Une paire d'amorces spécifiques [A)iepi3 (SEQ ID N°13) et Aliepi4 (SEQ ID N°14)] a été construite contre la région de l'ORF dont la séquence était conservée dans les 6 clones d'ADNc. Les amorces faisaient la jonction entre deux introns dans la séquence génomique, ce qui générait des fragments de différentes tailles à partir de l'ARNm et de l'ADN, respectivement de 230 et 700-900 pb. La température d'hybridation était de 53°C. Deux contrôles négatifs ont été réalisés par addition d'eau au milieu de réaction à la place de l'ARN, et en chauffant la réaction 10 mn à 95°C avant la réaction de RT-PCR. La séquence du fragment de 230 pb a été déterminée à plusieurs reprises et correspondait à la séquence des ADNc d'épimérases. La séquence de la paire d'amorces spécifiques est la suivante : Aliepi3 : 5' CGTWGAAGAYGGCATCAC 3' (SEQ ID N°13) Aliepi4 : 5' TCGGTGATGAYCTCCGA 3' (SEQ ID N°14)
1.8 Construction des anticorps contre ManC5-E6 :
Des anticorps polyclonaux ont été produits contre deux peptides de 16 acides aminés chacun, à partir de la séquence en acides aminés de
ManC5-E6 par Eurogentec SA (Angers, France). Les peptides ont été mélangés et utilisés pour immuniser deux lapins. Des anticorps contre ManC5-E6 (SEQ ID N°6) étaient déjà présents après la première immunisation, mais leurs quantités ont été augmentées grâce à des immunisations répétées. Le saignement final a été effectué après 6 immunisations. Le sérum des deux lapins a été mélangé puis dilué 2 000 fois avant d'être utilisé pour la détection de protéines épimérases dans le cadre de transfert Western.
1.9 Méthodes de transfert Western :
Les extraits protéiques ont été mélangés avec du tampon d'échantillon et portés à ébullition pendant 5 mn avant le dépôt sur gel de polyacrylamide contenant un gel de concentration à 3,9 % et un gel de migration à 12%. Les gels ont migré dans une cellule d'électrophorèse sur gel vertical mini- proteanli (BioRad, supra) avec un système de tampon tris-glycine discontinu. Après électrophorèse, les protéines ont été transférées sur une membrane de nylon pour immuno-coloration. L'immuno-coloration des protéines épimérases a été effectuée en utilisant des anticorps de lapin dirigés contre des peptides issus de la séquence ManC5-E6 (SEQ ID N°6) comme anticorps primaires (voir paragraphe 1.8 ci-dessus), et un anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la péroxydase de raifort comme anticorps secondaire. Les protéines marquées ont été détectées en utilisant le système ECL (Amersham Pharmacia Biotech, supra) et visualisées sur film aux rayons X.
1.10 Activité mannuronane C5-épimérase
L'activité a été mesurée en utilisant le protocole de Ertesvag et Skjak-
Braek (1999) en utilisant du [5-3H] poly-mannuronate (70 000 dpm/mg) comme substrat. Les mélanges réactionnels avaient un volume final de
0,5 ml et étaient constitués de 100 μl de [5-3H] poly-mannuronate (1 mg/ml dans de l'eau), jusqu'à 350 μl d'extrait cellulaire, et du tampon à une concentration finale de 20 mM de MOPS, pH 7,0, et 2mM de CaCl2. Les réactions ont été incubées à 32°C pendant 24 à 96 heures. Les réactions ont été stoppées par addition de 15 μl de NaCI 5M et de 800 μl d'alcool isopropylique, puis incubées à -80°C pendant 1 heure. Après centrifugation à 13 000 x g pendant 35 mn, la quantité de radioactivité libérée dans 1 ml de surnageant a été déterminée par comptage de scintillation liquide. Les réactions d'épimérisation pour la spectroscopie RMN ont été réalisées en utilisant du poly-mannuronate non marqué, dégradé par une hydrolyse acide douce, comme substrat. La réaction d'épimérisation a été effectuée dans un volume de 20 ml, constitué de 20 mg de poly-mannuronate et de 10 ml de milieu protoplaste concentré mélangé à du tampon, à une concentration finale de 20 mM de MOPS et 2mM de CaCI2. L'échantillon a été incubé à 32°C pendant 8 jours. La réaction a été dialysée contre l'eau (5 x 5 L), lyophilisée puis transmise au NTNU (Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Norvège) où elle a été dissoute dans du D2O et analysée par spectroscopie RMN 1H à 90°C, en utilisant un spectromètre Bruckner AM-300 (300 MHz). Du 3-(triméthylsilyl) propane sulfonate a été utilisé comme contrôle interne. Le déplacement chimique du H-1 interne des résidus glycines a été obtenu par Grasdalen (1983).
1.11 Numéros d'accès des séquences nucléotidiqυes
Les données de séquences nucléotidiques de ManC5-E1 (SEQ ID N°1), ManC5-E2 (SEQ ID N°2), ManC5-E3 (SEQ ID N°3), ManC5-E4 (SEQ ID N°4), ManC5-E5 (SEQ ID N°5), ManC5-E6 (SEQ ID N°6) ont été déposées dans la base de données EMBL sous les numéros d'accès respectifs suivants : AJ496449, AJ496450, AJ496451 , AJ496452, AJ496453 et AJ496454. 2. RESULTATS
2.1 Les mannuronane C5-épimérases de Laminaha forment une famille multigénique:
La région codante de l'ADNc de ManC5-E1 a été utilisée comme sonde homologue pour cribier une banque d'ADNc de sporophytes de L. digitata, conduisant à l'identification de 4 nouveaux ADNc dont la séquence a été complètement déterminée. L'alignement des séquences en acides aminés déduites ainsi que celui des séquences nucléotidiques, ont indiqué que 2 des 6 ADNc étaient de longueur complète [ManC5-E1 (SEQ ID N°1) et ManC5-E6 (SEQ ID N°6)] tandis que les autres n'étaient que des ADNc partiels, comme montré dans la Figure 2. Tous les ADNc contenaient une longue région non codante 3' non traduite (3'UTR), qui variait en longueur de 1 318 pb à 1 825 bp. La présence de longues 3'UTR est une caractéristique commune des gènes de L. digitata. Les 2 ADNc de longueur complète contenaient de courtes 5'UTR et des ORF codant des protéines d'approximativement 55 kDa. Les 6 ADNc partageaient un niveau d'identité élevé (87%) sur les 802 pb de la région codante, tandis que les extrémités 3' et 5' étaient variables. Un alignement des séquences en acides aminés correspondantes (266 acides aminés) a montré 84% d'identité entre les ManC5-E de L. digitata. La présence de plusieurs gènes codant des mannuronane C5-épimérases dans le génome de L. digitata a été confirmée par analyse Southern. Pour ce faire, l'ADN a été digéré avec Sal I et Eco RI, et un fragment de 1250 pb issu de la région codante de ManC5-E5 (SEQ ID N°5) a été utilisé comme sonde. Un grand nombre de bandes a été détecté (Figure
3). II apparaît donc que ces gènes forment une famille multigénique chez L. digitata, ladite famille comprenant plus de 10 gènes différents. 2.2 Les similitudes des structures des mannuronane C5-épimérases de différents organismes ont été évaluées par la méthode HCA :
La séquence ManC5-E1 (SEQ ID N°1) de L. digitata a été soumise à une recherche de similitude contre une banque de données de protéines non redondantes de NCBI en utilisant le logiciel BLASTX. Ceci a révélé que les séquences ies plus similaires étaient ceiies des protéines d'enveloppe GP-1 du virus Ectocarpus siliculosis et virus non classifié Ectocarpus fasciculatus. Les scores obtenus étaient d'environ 45% d'identité et 65% de similitude à partir des données de séquences. D'autres séquences ainsi identifiées correspondaient à celles des C5-épimérases non modulaires AlgG de Azotobacter vinelandii et Pseudomonas aeruginosa avec respectivement 26% et 27% d'identité. Finalement, les modules A de AlgE1-7 et AlgY, correspondant au domaine catalytique des C5- épimérases de A. vinelandii, ont été retrouvés avec des scores d'identité de 20%. Ces résultats ont été obtenus grâce à la présence d'un motif conservé dans toutes les séquences, situé de la tyrosine 278 à l'aspartate 284 [Positionnement dans la séquence ManC5-E1 (voir Figure 12)]. L'homologie entre ces protéines a été étudiée de manière plus approfondie par analyse de groupes hydrophobes HCA. Cette méthode a été développée par comparaison de protéines qui sont faiblement apparentées au niveau de leur structure primaire. Elle permet la définition d'homologies structurelles. Dans les graphiques HCA, les groupes de résidus hydrophobes sont présumés représentatifs d'éléments de structures secondaires définis. Les protéines qui présentent une distribution comparable de leurs groupes hydrophobes sont considérées comme superposabfes dans leur structure 3D. L'analyse HCA a été effectuée en utilisant la séquence protéique déduite de ManC5-E1 (SEQ ID N°1), conjointement à la séquence de la protéine d'enveloppe GP-1 du virus E. siliculosus, de AlgG de P. aeruginosa et du module A de AlgE5 de A. vinelandii (Figure 4). Comme attendu d'après les résultats BL-AST, la séquence de L. digitata présentait la similitude structurale la plus forte, bien que sur un court domaine (du résidu lysine150 au résidu phénylaninine373), avec la protéine GP-1. La séquence ManC5-E1 présentait également une forte similitude de structure (de la leucine66 à la leucine332) avec la séquence de AlgG de P. aeruginosa (de la leucine126 à la leucine374). Le domaine catalytique (module A) d'AlgEδ présentait quelques similitudes de structure sur un domaine de 130 acides aminés comprenant le motif conservé (Figure 12). De plus, les identités de structure observées ont été confirmées dans leur intégralité par la présence de quelques résidus hydrophiles strictement conservés à travers les séquences (colorés négativement dans la Figure 4). Les protéines comparées étaient riches en feuillets beta et pouvaient adopter un repliement tridimensionnel similaire au niveau du domaine conservé (Figure 4).
Ainsi, les protéines présentées dans la Figure 4 peuvent toutes, vraisemblablement, catalyser l'épimérisation de l'acide alginique. Le motif conservé Tyr-Gly-Phe-Asp-Pro-His-Asp (Figure 12) détecté initialement par recherche BLAST existait dans toutes les séquences utilisées pour le graphique HCA.
Il a récemment été rapporté (Svanem et al., 2001) que le motif conservé en question était probablement le site catalytique du module A des épimérases AlgE. La présence du site catalytique dans ManC5-E1, ainsi que le fait que les épimérases bactériennes et ManC5-E1 partagent des similitudes significatives au niveau de leur séquence, de même que des structures secondaires et tertiaires conservées, représentent des indices forts suggérant que les enzymes ManC5 possèdent une activité épimérase et utilisent l'acide alginique comme substrat.
2.3 Les relations phylogénétiques entre les mannuronane C5- épimérases : Les séquences en acides aminés déduites des ManC5-E de L. digitata ont été alignées avec celles de différentes épimérases bactériennes ainsi qu'avec la protéine de capside virale GP-1. Un arbre phylogénétique a été construit par la méthode du Neighbor-Joining en utilisant la matrice de distance Dayhoff (Figure 5). Un arbre basé sur la parcimonie présentait la même topologie et les valeurs de bootstrap ont été introduites dans la Figure 5. Les protéines ManC5-E de L. digitata constituaient un groupe monophylétique incluant la protéine GP-1 de EsV-1, avec les séquences de AlgG de Azotobacter et Pseudomonas comme groupe le plus proche. Dans le groupe de L. digitata, les protéines ManC5-E formaient 3 sous- groupes différents, avec l'un d'entre eux présentant la plus forte valeur de bootstrap (99) et comprenant ManC5-E1 (SEQ ID N°1), ManC5-E2 (SEQ ID N°2) et ManC5-E4 (SEQ ID N°4). Les épimérases modulaires de A. vinelandii formaient un groupe bien soutenu et constituait le groupe le moins apparenté aux épimérases de L. digitata.
Comme il ressort de la Figure 5, les gènes ManC5-E de L. digitata appartiennent vraisemblablement à une famille multigénique. L'on ne peut en outre exclure que L. digitata contienne d'autres gènes épimérases non encore identifiés. La présence d'une famille multigénique de mannuronane C5-épimérases chez L. digitata suggère que chacun des membres de la famille pourrait être impliqué dans des fonctions et des voies métaboliques variées. En particulier, les épimérases différentes pourraient être nécessaires et complémentaires pour moduler de manière spécifique le contenu relatif en blocs-G, blocs-M et blocs-MG des alginates selon le type de tissu, de saison et selon l'âge de la plante.
2.4 Dans les sporophytes de L. digitata, la mannuronane C5- épimérase ManC5-E1 est exprimée de manière différentielle sur l'année : L'expression des gènes d'épimérases a été examinée dans les sporophytes collectés à intervalles réguliers sur une année, par transfert Northern et RT-PCR (Figure 6). Un seul transcrit d'environ 3,5 kb a hybride avec la sonde d'ADNc homologue, sur des transferts de gel d'ARN total de sporophytes de L. digitata. Le clonage et la détermination de la séquence de plusieurs réplicons du fragment amplifié par RT-PCR ont indiqué que les gènes d'épimérases exprimés dans ies sporophytes sont diffférents de ceux exprimés par les protoplastes isolés. A la fois, les transferts Northern et l'analyse par RT-PCR ont montré une fluctuation de la quantité de transcrits selon la période de l'année. Seule une faible expression de l'épimérase a été observée en septembre et en novembre. L'expression augmentait en janvier, restait élevée en février, puis décroissait lentement mais restait cependant supérieure jusqu'en avril à celle obtenue à partir des échantillons d'automne. Aucun transcrit n'a pu être détecté par transfert Northern d'ARN extrait de sporophytes collectés entre mai et août (données non montrées). La période d'expression accrue correspondait bien au moment où L. digitata présentait sa phase de croissance la plus active en Bretagne, ainsi que la plus forte augmentation du contenu en acide alginique (Pérez, 1971).
2.5 Le protoplaste comme modèle d'étude de l'expression et de l'activité des mannuronane C5-épimérases chez L. digitata :
Une suspension de protoplastes isolés dépourvus de paroi cellulaire a pu fournir un système approprié pour étudier la biosynthèse des composants de la paroi cellulaire. Il était probable que les cellules dépourvues de paroi orienteraient préférentiellement leur métabolisme vers la synthèse d'une nouvelle paroi cellulaire. De plus, l'utilisation de protoplastes permettait d'éviter tous les problèmes techniques liés à la présence de grandes quantités de polysaccharides de la paroi cellulaire, tels que les alginates, qui interfèrent avec les extractions de protéines et l'électrophorèse, et peuvent également se lier ou interagir avec les enzymes du métabolisme de la paroi cellulaire pendant les étapes d'extraction. Les protoplastes ont donc été utilisés comme outils pour analyser l'expression des gènes d'épimérases pendant le processus de régénération de la paroi cellulaire. Des expériences ont également été conduites de manière à corréler l'expression des gènes avec l'activité enzymatique et les niveaux de protéines. Pour ce faire, les protoplastes ont été préparés à partir de sporophytes jeunes de L. digitata, et cultivés pendant 4 jours. La régénération de la paroi cellulaire a été contrôlée par coloration au Calcofluor. Des protoplastes avec une paroi contenant de la cellulose régénérée ont été observés après deux jours de culture. L'activité épimérase a été contrôlée dans le culot de protoplastes et dans le milieu de culture en utilisant le test au [5-3H] poly-mannuronate. L'essentiel de l'activité épimérase était présent dans le milieu environnant. Seul un faible niveau d'activité a pu être détecté dans les culots de protoplastes (données non montrées). La mesure de l'activité épimérase dans le milieu de culture sur une période de 4 jours (Figure 7) a révélé que l'activité maximale était observée au tout début (T0), lorsque les protoplastes étaient préparés. Après quoi, l'activité diminuait au cours du temps.
L'activité épimérase observée dans le milieu de culture des protoplastes à l'aide du test au [5-3H] poly-mannuronate, a été confirmée par spectroscopie RMN (Figure 8). Les résultats ont montré que le milieu de protoplastes, était capable d'introduire des résidus guluroniques dans le poly-mannuronane alginate, après incubation du substrat avec le milieu de protoplastes le pic apparaissant au déplacement chimique 5,1, correspondait à l'hydrogène interne du guluronate et montrait que l'épimérisation avait eu lieu. Des échantillons de milieu de culture de protoplastes ont également été analysés par immuno-transfert en utilisant un anti-sérum dirigé contre des peptides synthétisés à partir de la séquence d'ADNc de ManC5-E6 (SEQ ID N°6, voir paragraphe 1.8 ci-dessus). Deux bandes spécifiques ont été détectées sur le transfert (Figure 9), correspondant à des tailles de 60 et 80 kDa. Ces bandes pouvaient représenter deux isoformes ou deux états de maturation différents de l'enzyme. Les deux bandes avaient un poids moléculaire plus élevé que celui prédit à partir de la séquence. Le même phénomène a été observé avec la protéine GP-1 de EsV-1 et avec les épimérases de A. vinelandii, et peut être dû à la composition en acides aminés des épimérases.
L'échantillon à T0 présentait la concentration en épimérases la plus élevée, tandis que l'intensité de la bande diminuait progressivement au cours de la culture (Figure 9). La même tendance a été observée pour l'expression des épimérases au niveau de l'ARNm, tel que montré par transfert Northern et RT-PCR (Figure 10).
2.6 Séquences génomiques :
8 clones génomiques différents d'épimérases ont été identifiés par criblage d'une banque génomique à partir de L. digitata, en utilisant un fragment de 1 kb de la région codante de ManC5-E1 comme sonde. Les expériences d'hybridation en utilisant les sondes spécifiques 3' UTR de chacun des 6 ADNc a permis d'identifier un clone génomique EpiG, coïncidant avec l'ADNc de ManC5-E6 (SEQ ID N°6). Une cartographie physique de EpiG a été effectuée (Figure 11). Puis le clone génomique entier a été sous-cloné et sa séquence déterminée (6 kb). Le clone génomique EpiG couvrait l'ORF entière du gène, commençant avant le codon début et allant jusqu'à la fin de la 3' UTR. La comparaison des séquences nucléotidiques d'EpiG et de ManC5-E6 a révélé que les deux séquences n'étaient pas identiques à 100%. Un niveau d'identité élevé (89%) a été trouvé dans la région codante, tandis que les parties 3' UTR étaient bien moins conservées. ManC5-E6 et EpiG partageaient 55% d'identité dans la 3' UTR, 57% dans la région utilisée comme sonde, (ce qui expliquait le signal d'hybridation positif mentionné ci-dessus). Il s'agissait du même degré d'identité qu'entre les extrémités 3' de ManC5- E1 (SEQ ID N°1), ManC5-E2 (SEQ ID N°2) et ManC5-E4 (SEQ ID N°4) (43 à 58%), lesquelles formaient un groupe dans l'arbre phylogénétique. Ceci indiquait que EpiG et ManC5-E6 appartenaient également à un groupe commun. La comparaison des séquences d'EpiG et des clones d'ADNc a permis de localiser 6 introns, d'une taille allant de 295 bp à 513 bp, dans la région codante du gène (Figure 11). Toutes les transitions exons/introns/exons, à l'exception d'une seule, étaient marquées par des séquences consensus des sites d'épissages universels, pour les gènes eucaryotes nucléaires G|GTXXG....AGlC/G (Brathnach et Chambon, 1981).
Les similitudes structurales des épimérases de L. digitata vis-à-vis d'autres mannuronane C5-épimérases, de même que la présence du site actif conservé et la concordance entre les profils d'expression des ARN, celui des protéines, et l'activité épimérase montrent que les ADNc isolés identifiés chez les algues brunes codent des mannuronane C5- épimérases actives.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique isolée, codant une mannuronane C5- épimérase, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID N°6, les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à au moins 50 % à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci, et les séquences hybridables en conditions strictes à au moins 50 % avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences similaires auxdites séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID N°6 ou auxdites séquences complémentaires de celles-ci à au moins 60%, de préférence au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%.
3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences hybridables en conditions strictes avec lesdites séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID N°6 ou lesdites séquences complémentaires de celles-ci à au moins 60%, de préférence au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%.
4. Acide nucléique isolé comprenant au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou un acide nucléique selon la revendication 4.
6. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle héberge un vecteur recombinant selon la revendication 5.
7. Cellule selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est une cellule de Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisae ou d'insecte.
8. Enzyme présentant une activité mannuronane C5-épimérase, caractérisée en ce qu'elle est codée par une séquence nucléotidique seion i'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un acide nucléique selon la revendication 4.
9. Enzyme selon la revendication 8, caractérisée en ce sa séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N°9 à SEQ ID N°12, et les séquences similaires à au moins 50% à celles-ci.
10. Enzyme selon le revendication 9, caractérisée en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences similaires auxdites séquences SEQ ID N°9 à SEQ ID N°12 à au moins 60%, de préférence au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%.
11. Procédé d'obtention d'une enzyme présentant une activité mannuronane C5-épimérase selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, ledit procédé comprenant au moins : a) le clonage d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou d'un acide nucléique selon la revendication 4, dans un vecteur d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante apte à exprimer ladite séquence nucléotidique ou ledit acide nucléique, avec ledit vecteur d'expression recombinant ; et c) l'expression de ladite séquence nucléotidique ou dudit acide nucléique à partir de ladite cellule hôte recombinante.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d) de purification de l'enzyme et/ou de son activité mannuronane C5-épimérase.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, dans lequel ladite cellule hôte recombinante dans l'étape b) est une cellule de Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisae ou d'insecte.
14. Utilisation d'au moins : - une enzyme selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ; et/ou
- une enzyme présentant une activité mannuronane C5~épimérase, codée par une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%, à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci, et les séquences hybridables en conditions strictes à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%, avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci ; pour déterminer les propriétés gélifiantes d'un alginate, caractérisée en ce que la ou lesdites enzymes modifient le rapport des quantités d'acide β- 1,4-D-mannuronique et d'acide α-1 ,4-L-guluronique.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit rapport est modifié par épimérisation de l'acide β-1 ,4-D-mannuronique en acide α-1 ,4-L-guluronique, ladite épimérisation étant catalysée par la ou lesdites enzymes.
16. Utilisation d'au moins :
- une enzyme selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ; et/ou
- une enzyme présentant une activité mannuronane C5-épimérase, codée par une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences
SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%, à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci, et les séquences hybridables en conditions strictes à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%, avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci ; pour modifier un alginate, caractérisée en ce que la ou lesdites enzymes catalysent l'épimérisation de l'acide β-1 ,4-D-mannuronique en acide α-1 ,4- L-guluronique.
17. Utilisation d'au moins :
- une enzyme selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ; et/ou
- une enzyme présentant une activité mannuronane C5-épimérase, codée par une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%, à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci, et les séquences hybridables en conditions strictes à au moins 50 %, de préférence au moins 60%, de préférence encore au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%, avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci ; pour modifier un polymère contenant de l'acide β-1 ,4-D-mannuronique, caractérisée en ce que la ou lesdites enzymes catalysent l'épimérisation dudit acide β-1,4-D-mannuronique en acide α-1,4-L-guluronique.
18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que la séquence de ladite enzyme présentant une activité mannuronane C5-épimérase est choisie parmi les séquences SEQ iD N°7 et SEQ ID N°8 , et les séquences similaires à au moins 50% à celles-ci.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que ladite séquence de ladite enzyme présentant une activité mannuronane C5- épimérase est choisie parmi les séquences similaires auxdites séquences SEQ ID N°7 et SEQ ID N°8 à au moins 60%, de préférence au moins 70%, de manière encore préférée au moins 80%.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, caractérisée en ce que le niveau de modification est contrôlé par le nombre et le choix desdites enzymes.
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