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WO2005106031A1 - ハイブリダイゼーション方法 - Google Patents

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WO2005106031A1
WO2005106031A1 PCT/JP2005/008248 JP2005008248W WO2005106031A1 WO 2005106031 A1 WO2005106031 A1 WO 2005106031A1 JP 2005008248 W JP2005008248 W JP 2005008248W WO 2005106031 A1 WO2005106031 A1 WO 2005106031A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
region
probe
side region
hybridization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/008248
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Chikako Hakii
Mitsugu Usui
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eisai Co Ltd
Eisai R&D Management Co Ltd
Original Assignee
Eisai Co Ltd
Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to AU2005238378A priority patent/AU2005238378B2/en
Priority to KR1020067019546A priority patent/KR101146251B1/ko
Priority to CA002564838A priority patent/CA2564838A1/en
Priority to US11/579,063 priority patent/US7745124B2/en
Priority to EP05737054A priority patent/EP1741793B1/en
Priority to DE602005023002T priority patent/DE602005023002D1/de
Priority to AT05737054T priority patent/ATE478158T1/de
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    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention provides an effective reaction in a hybridization reaction using an oligonucleotide by partially forming a reaction temperature region in a reaction solution and performing a hybridization reaction in the reaction temperature region.
  • a hybridization method, a gene detection method using the hybridization method, and a DNA chip or DNA microarray using the hybridization method (Non-Patent Document 1, etc.)
  • a DNA chip and a DNA microarray are collectively referred to as a DNA microarray.
  • the present invention relates to a signal amplification method capable of improving detection sensitivity.
  • Microplates, DNA microarrays, magnetic particles and the like as reaction equipment (hereinafter referred to as a reaction platform) for detecting genes are inexpensive, easy to control reaction temperature uniformly, and special equipment.
  • temperature control of these reaction platforms is performed by a device called a general thermostat.
  • a device called a general thermostat.
  • an enzyme or the like is labeled on a gene of interest or a gene amplified by a PCR method or the like, and a uniform reaction temperature in a thermostat is used as a general biochemical reaction.
  • Patent Documents 1 to 4 are schematic explanatory diagrams of the method described in Patent Document 1.
  • FIG. 1 the method described in Patent Document 1 is a method using a pair of oligonucleotides' Probe 18 (HoneyComb Probe; hereinafter, referred to as HCP) composed of three regions as shown in FIG. The three regions of each of the first HCP (X region, Y region and Z region) and the second HCP (Z, region, Y 'region and X' region) are complementary bases.
  • HCP oligonucleotides' Probe 18
  • Fig. 4 shows an example of a signal amplification method in a microplate using the PALSAR method.
  • the capture probe 14 of the target gene 12 (capture probe) is bound to a reaction device such as a microplate 10 as shown in FIG. 4 (a), and then the target gene 12 as shown in FIG. 4 (b).
  • a reaction device such as a microplate 10 as shown in FIG. 4 (a)
  • the target gene 12 as shown in FIG. 4 (b).
  • an oligonucleotide DNA16 having a region complementary to the HCP and the target gene as shown in FIG. 4 (c) (joint probe of Patent Document 5.
  • the target gene to be detected A probe having both a sequence complementary to the nucleic acid (probe) and a sequence complementary to the nucleic acid (probe) forming a self-assembly is referred to as an assist probe.) Further, as shown in FIG. By adding a plurality of pairs of HCP18 as described above, a self-assembly reaction can be performed to form a self-assembly 20 and amplify the signal.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3267576
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3310662
  • Patent Document 3 International Publication No.02Z31192
  • Patent Document 4 JP-A-2002-355081
  • Patent Document 5 International Publication No. 03Z029441
  • Patent Document 6 International Publication No. 92Z20702
  • Non-Patent Document 2 Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998.54, 3607-3630.,
  • Non-Patent Document 3 Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253.
  • Non-Patent Document 4 Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97, 5633-5638.
  • Non-Patent Document 5 HC Birnboim J. Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979) Disclosure of the invention
  • Fig. 5 is a schematic diagram showing an example of signal amplification by the PALSAR method using a uniform reaction temperature.
  • (A) shows the formation of a self-assembly at a uniform reaction temperature
  • (b) shows the formation of a self-assembly.
  • the cells were washed, and the self-assemblies bound to the target gene after washing are shown.
  • a sufficient signal amplification effect can be obtained by the self-assembly formed on the target gene as shown in Fig. 5, the self-assembly formed in the reaction solution other than on the target gene can be washed by subsequent washing. It was found that signal amplification was reduced compared to the actual total amount of self-assembly due to removal.
  • the present invention provides a hybridization method that enables an efficient hybridization reaction, a method for detecting a target gene with high sensitivity using the hybridization method, and a target. It is an object of the present invention to provide a signal amplification method capable of significantly improving gene detection sensitivity.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies to improve the efficiency of self-assembly of HCP on a target gene in order to solve the above-mentioned problems. By setting the region, it was found that the efficiency of HCP self-assembly formation on the target gene can be significantly increased.In addition, not only the HCP self-assembly reaction but also the general hybridization reaction In particular, the present inventors have found that, by partially setting the reaction temperature region in the reaction solution, the efficiency of hybridization on the target gene can be significantly increased, and have reached the present invention.
  • the hybridization method of the present invention provides an oligonucleotide in a reaction solution.
  • a reaction temperature region is partially formed in a reaction solution, and a hybridization reaction is performed in the reaction temperature region. .
  • the hybridization reaction is not particularly limited, but may be carried out using a plurality of types of oligonucleotide probes having complementary nucleotide sequence regions that can be mutually and / or hybridized. It is more preferable that the hybridization includes a self-assembly reaction in which the oligonucleotides self-assemble to form a double-stranded self-assembly.
  • oligonucleotide probes As a first example of the plural kinds of oligonucleotide probes, at least a nucleic acid region X, a nucleic acid region Y, and a nucleic acid region z are provided in the order of 5, end force, and the structure represented by the following chemical formula (1) is provided.
  • a pair of oligonucleotide probes that also have a force at three or more nucleic acid regions Patent Documents 1 and 2.
  • Figs. 1 to 3 show self-assembly using a pair of oligonucleotide 'probes (a pair of HCPs) with a first probe (first HCP) and a second probe (second HCP) that have three nucleic acid regions. It is a schematic explanatory view showing an example of the reaction.
  • the chemical formula (1) as shown in FIGS. 1 to 3 Using a pair of oligonucleotides having the structure of (2) and a plurality of pairs of probes 18 (FIG. 1), the oligonucleotides are hybridized so that they intersect alternately (FIG. 2). Assemble to form a double-stranded self-assembly (polymer) 20 (Fig. 3
  • each oligonucleotide of the pair of oligonucleotides No. 1 and No Into two regions, each containing a central region complementary to each other as base sequences complementary to each other, and a 3′-side region and a 5′-side region including non-complementary base sequences to each other. From the first system to the (2n-1) th (n ⁇ 1) system, n dimer-forming probe-containing systems were formed in order, and a pair of No. 1 and No.
  • Each oligonucleotide is divided into two regions, a 3 'side region and a 5' side region, and a plurality of pairs of cross-links in which the 3 'side region and the 5' side region of each oligonucleotide have non-complementary base sequences to each other.
  • 2nd to 2nth systems each containing a probe A cross-linking probe-containing system formed in order of n, and wherein the base sequence of the cross-linking probe is a base sequence capable of cross-linking a dimer formed from the dimer-forming probe.
  • Nucleotide 'probes Patent Document 4).
  • a self-assembly reaction in which oligonucleotides self-assemble to form a self-assembly by subjecting the oligonucleotide 'probe to hybridization is exemplified.
  • the hybridization of the probe is carried out by hybridizing a dimer-forming probe to form a dimer of each system (dimer probe), and then hybridizing the dimer and a cross-linking probe.
  • a No. 1 oligonucleotide 3, side region of the first system and a No. 1—oligonucleotide 3 ′ side region of the second system,
  • the No. 2 oligonucleotide 3, side region of the second system and the No. 2—oligonutaletide 3 ′ region of the first system,
  • the complementary base sequences of the No. 1-oligonucleotide 5 side region of the second system and the 5 'side region of the first system No. 1-oligonucleotide can be used.
  • a No. 1 oligonucleotide 3, side region of the first system and a No. 1—oligonucleotide 3 ′ side region of the second system,
  • a complementary base sequence can be used for the No. 1—oligonucleotide 5 side region of the first system and the 5 ′ side region of the second system No. 2—oligonucleotide, respectively.
  • each oligonucleotide of the pair of oligonucleotides No. 1 and No. 2 is divided into 3, side region, central region, and 3 System comprising a pair of dimer-forming probes in which the central region of each oligonucleotide is a complementary base sequence, and the 3'-side region and the 5'-side region are non-complementary base sequences.
  • k-th k ⁇ 2
  • each oligonucleotide of a pair of oligonucleotides is divided into three regions, a side region, a central region, and a fifth region, and the central region of each oligonucleotide is a complementary base sequence, and the 3 ′ region,
  • a plurality of systems including a pair of dimer-forming probes whose 5′-side regions are non-complementary base sequences are formed in order from the first system to the k-th (k ⁇ 2) system,
  • oligonucleotides' probes a plurality of pairs of dimer forming probes from the first system to the k-th system are hybridized.
  • a self-assembly reaction in which oligonucleotides self-assemble to form a self-assembly can be mentioned.
  • the hybridization of the dimer formation probe is carried out by subjecting the dimer formation probe to hybridization for each system to form a dimer (dimer probe), and then dimerizing the dimer probe of each system. It is preferable to form a self-assembly by hybridization.
  • the oligonucleotides are self-assembled by hybridization using a plurality of types of oligonucleotide 'probes having complementary base sequence regions capable of hybridizing with each other, whereby two A signal amplification method for improving detection sensitivity of a target gene in a reaction device for detecting a gene by utilizing a self-assembly reaction for forming a self-assembly of a chain, wherein the self-assembly reaction is performed according to the present invention. It is carried out by using a hybridization method.
  • the base sequence of the target gene and the base sequence of at least one oligonucleotide used for the formation of the self-assembly are complementary to the base sequence of the probe. It is preferable to use an assist probe having a special region. Further, at least one of the oligonucleotide 'probes used for forming the self-assembly may be configured to include a sequence complementary to the target gene.
  • the signal amplification method of the present invention enables highly sensitive detection of a target gene by detecting a formed self-assembly.
  • the method for detecting the self-assembly is not particularly limited.For example, at least one of the oligonucleotide 'probes used in the self-assembly reaction is labeled with a labeling substance in advance, and the labeling substance is detected. Therefore, it is preferable to detect a self-assembly.
  • the labeling substance is not particularly limited, and known labeling substances can be widely used. For example, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, a chromogenic substance, a chromogenic enzyme or a luminescent enzyme can be used.
  • the presence of the self-assembly can be detected by hybridizing a labeled probe to the self-assembly formed by the self-assembly reaction of the oligonucleotide bound to the target gene. It is. Labeling probes include chromogenic enzymes, luminescence Those labeled with a system enzyme or a radioisotope can be used.
  • a fluorescent substance having a property of binding to nucleic acid to the above-mentioned self-assembly, and to detect the presence of the self-assembly by a photochemical change of the fluorescent substance.
  • the fluorescent substance a fluorescent substance having a property of being inserted into a double-stranded base pair is preferable.
  • the first embodiment of the method for detecting a target gene of the present invention is characterized in that the target gene is detected using the signal amplification method of the present invention.
  • a second aspect of the method for detecting a target gene of the present invention is a method for detecting a target gene, which detects a gene by utilizing a hybridization reaction of an oligonucleotide in a reaction solution.
  • the hybridization reaction comprises a hybridization reaction carried out by using the hybridization method of the present invention, and the hybridization reaction of the oligonucleotide used for the hybridization reaction is carried out.
  • at least one is configured to have a sequence complementary to a part of the target gene.
  • the reaction equipment for detecting the gene is not particularly limited, and is applicable to various reaction equipment for gene detection.
  • microplates, DNA microarrays, and magnetic particles And the like are particularly limited, and is applicable to various reaction equipment for gene detection.
  • microplates, DNA microarrays, and magnetic particles And the like are particularly limited.
  • single-stranded DNA and Z or RNA and double-stranded DNA and Z or RNA can be used as the target gene.
  • a gene containing SNPs nucleotide polymorphism
  • the oligonucleotide used in the hybridization reaction is labeled with a labeling substance in advance, and the target gene is detected by detecting the labeling substance.
  • the labeling substance is not particularly limited, and known labeling substances can be widely used.
  • a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, a chromogenic substance, a chromogenic enzyme or a luminescent enzyme can be used.
  • the above oligonucleotide may be a nucleic acid analog usually composed of DNA or RNA.
  • the nucleic acid analog include peptide nucleic acid (PNA, Patent Document 6) and Locked Nucleic Acid (LNA, Non-Patent Documents 2 to 4).
  • a pair of oligonucleotides The probe is usually composed of the same kind of nucleic acid, but for example, the DNA probe and the RNA probe may be paired. That is, the type of the nucleic acid of the probe can be selected from DNA, RNA or a nucleic acid analog (for example, PNA or LNA).
  • one nucleic acid composition in one probe does not need to be composed of only DNA, such as an oligonucleotide 'probe (chimeric probe) composed of DNA and RNA as necessary. Can also be used and are included in the present invention.
  • each complementary base sequence region of the oligonucleotide 'probe is at least 5 bases in terms of the number of bases, preferably 10 to: LOO bases, and more preferably 15 to 30 bases.
  • probes can be synthesized by a known method.
  • a DNA probe it can be synthesized by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 394 from Applied Biosystems Inc.
  • a phosphoric triester method there are a phosphoric triester method, an H-phosphonate method, a thiophosphonate method and the like, but any method may be used.
  • the number of oligonucleotide 'probe used Te is used particularly in limited it! ⁇ force 10 2 to 10 15 pieces of range.
  • the composition and concentration of the reaction buffer are not particularly limited, and ordinary buffers commonly used for nucleic acid amplification can be suitably used.
  • the pH is also suitable in a usual range, and preferably a pH in the range of 7.0 to 9.0 can be used.
  • the reaction temperature applied to the partial reaction temperature zone is between 40 and 80 ° C, preferably between 55 and 65 ° C.
  • any sample that may contain the nucleic acid can be applied.
  • the target gene may be prepared or isolated from a sample as appropriate, and is not particularly limited. Examples include biological samples such as blood, serum, urine, feces, cerebrospinal fluid, tissue fluid, and cell culture, and samples containing or possibly containing viruses, bacteria, and mold. Further, a nucleic acid such as DNA or RNA obtained by amplifying a target gene in a sample by a known method can also be used.
  • the detection sensitivity of a target gene can be significantly improved easily. Further, according to the present invention, the efficiency of hybrid formation in the hybridization reaction Can be improved. Further, according to the present invention, formation of a self-assembly used for detection can be increased, and signal amplification can be improved.
  • FIG. 1 is a schematic explanatory diagram showing a pair of HCPs.
  • FIG. 2 is a schematic explanatory view showing a binding mode of a pair of HCPs.
  • FIG. 3 is a schematic explanatory view showing a self-assembly formed by a plurality of pairs of HCPs.
  • FIG. 4 is a schematic explanatory view showing an example of a signal amplification method in a microplate using the PALSAR method.
  • FIG. 5 is a schematic explanatory view showing an example of a signal amplification method by a PALSAR method using a uniform reaction temperature.
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view showing one example of a method for detecting a target gene using a partial reaction temperature region using a microplate.
  • FIG. 7 is a schematic explanatory diagram showing one example of a method for detecting a target gene by signal amplification using a partial reaction temperature region according to the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic explanatory view showing another example of a method for detecting a gene by signal amplification using a partial reaction temperature region according to the present invention.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 11 is a schematic explanatory view showing a process chart of Example 1.
  • FIG. 12 is a schematic explanatory view showing a process chart of Example 2.
  • FIG. 13 is a schematic explanatory view showing a process chart of Example 3.
  • FIG. 14 is a schematic explanatory view showing a process chart of Example 4.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of Example 4 and Comparative Example 4.
  • This partial setting of the reaction temperature range can be applied to gene detection using the hybridization reaction, especially by signal amplification using the PALSAR method shown in Figs. 4 and 8. It is preferably applied to gene detection.
  • a reaction temperature region is partially formed in the vicinity of the target gene fixing site, for example, at the bottom of the detection platform, and the hybridization reaction is preferentially performed at the bottom of the detection platform. This makes it possible to detect the gene with high sensitivity.
  • the hybridization reaction proceeds efficiently only locally, and the target gene using the hybridization is used. It is shown that the detection of can be performed with high sensitivity.
  • the invention is included in the present invention, but it is preferable to provide a high-temperature region and a low-temperature region in the reaction solution, It is more preferable that a temperature gradient is generated in the inside so that only the local temperature becomes the reaction temperature. More preferably, the high temperature region is generated by heating, and the low temperature region is generated by cooling.
  • the reaction solution is preferably cooled in advance so that the hybridization reaction does not proceed.
  • a hybridization method using a partial reaction temperature region using a microplate schematically illustrated in Fig. 6.
  • the method for detecting a target gene according to the present invention will be specifically described by taking a case where a microplate is used as a reaction platform as an example.
  • other platforms are applied similarly to the microplate.
  • the entire microplate 10 is cooled to, for example, 4 ° C. [FIG. 6 (a)].
  • a heating means such as a hot plate 22 which has been adjusted to a temperature suitable for the hybridization reaction to be performed, and the applied force is also increased.
  • the hybridization reaction is carried out by covering with a cooling means 24 (for example, a cooling agent (at 120 ° C.) or a similar cooling plate, for example, a cooled aluminum block) [FIG. 6 (c)].
  • a cooling means 24 for example, a cooling agent (at 120 ° C.) or a similar cooling plate, for example, a cooled aluminum block
  • the hybridization reaction is performed by heating and cooling the reaction solution using an apparatus having the heating means and the cooling means, and the heating means and the cooling means can control the temperature. Is preferred ⁇ .
  • both the heating means and the cooling means have a structure which comes into contact with the microplate in a plane, and it is particularly preferable that both the heating and cooling can be performed on the bottom surface.
  • FIG. 7 is a schematic explanatory diagram showing an example of a method for detecting a gene by signal amplification in which a partial reaction temperature region is set on a microplate.
  • the self-assembly reaction of steps (e) and (f) in FIG. This is an example in which the hybridization method of the present invention is used.
  • a plurality of types of oligonucleotide 'probes used for the self-assembly reaction are added to the microplate 10 capturing the target gene, followed by cooling.
  • the optimal temperature for the self-assembly reaction is set in the hierarchy W (bottom of the microplate) close to the target gene, so that hybridization is performed only at that site. The reaction takes place.
  • the temperature from the bottom to the top of the microplate reached the optimal temperature for the self-assembly reaction over time.
  • a large self-assembly binds only to the target gene as shown in Fig. 7 (c), and the gene can be detected with high sensitivity.
  • FIG. 8 is a schematic explanatory view showing another example of a method for detecting a gene by signal amplification in which a partial reaction temperature region is set in a microplate.
  • FIG. 8 shows signal amplification using a pair of HCPs, and shows an example in which one region of the pair of HCPs uses a pair of HCPs which are regions complementary to a target gene.
  • a capture probe 14 for capturing genes is bound to the bottom of a detection platform (microplate 10, DNA microarray, etc.),
  • the target gene 12 for example, E. coli 16S rRNA is captured according to the procedure shown in FIGS.
  • HCP 17 having a region complementary to the target gene is included in the target gene 12.
  • the target gene 12 is linked to HCP17 [Fig. 8 (c)], and a plurality of pairs of HCP18 as shown in Fig. 8 (d) are added.
  • the aggregate 20 can be formed, and the signal can be amplified.
  • a reaction temperature region is formed partially at the bottom of the detection platform where the target gene is present, and the detection platform
  • the efficiency of self-assembly formation on the target gene can be significantly increased [Fig. 8 (e)].
  • FIG. 8 one of the pair of HCPs used for the self-assembly reaction is labeled in advance with a labeling substance, and the self-assembly is detected by detecting the labeling substance, thereby detecting the target gene.
  • the method for detecting a self-assembly is not particularly limited.
  • PALSAR method using a pair of probes Reaction temperature 'Self-assembly by time difference.
  • the following reagents were prepared and used as a hybridization solution.
  • the following pair of probes (HCP-1 and HCP-2) were dissolved in the hybridization solution 1 so as to have a concentration of 2 ⁇ 1 / 1 / ⁇ L, and this was used as a hybridization 'HCP solution.
  • HCP-1 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1)
  • HCP 2 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) (5, terminal digoxigenin labeling)
  • the hybridization H HCP solution was dispensed into 128 mL microtubes in 20 ⁇ L aliquots into 128 tubes, and each 1Z2 was placed in each ⁇ Experimental Example 1: Heated tubes at 94 ° C for 30 seconds '' Or ⁇ Experimental Example 2: Cooling the tubes after dispensing on ice all the time '' and then reacting at each reaction temperature (37.0, 39.6, 41.4, 43.8, 46.4, 48.7, 50.5, 53.0, 55.0, 57.1, 58. The reaction was performed at 7, 60.6, 62.8, 64.6, 66.0 or 68.0 for 30 minutes, 1 hour, or 3 hours, and the mixture was quenched on ice, and confirmed by 0.5% agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of Experimental Example 1
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of Experimental Example 2.
  • 9 and 10 (a) shows the results when the reaction was performed at each reaction temperature for 30 minutes, (b) shows the results when the reaction was performed at each reaction temperature for 1 hour, and (c) shows the results when the reaction was performed at each reaction temperature for 3 hours.
  • the temperature conditions of the samples in each lane are as follows.
  • HCP-1 and HCP-2 a case where a self-assembly reaction is performed using a pair of HCPs (HCP-1 and HCP-2) is referred to as "2HCP”.
  • HCP-2 a case where a self-assembly reaction is performed using 1 or HCP-2
  • a suspension of Staphylococcus aureus cultivated in tryptic soyger for 18 hours in physiological saline was used as a stock culture solution. This was diluted to a predetermined number with physiological saline and lysed according to the alkaline-SDS method (Non-Patent Document 5).
  • the lysate containing the target rRNA used in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 below was used. Liquid.
  • a predetermined number of bacteria was calculated from the number of viable bacteria obtained by preparing a dilution series of the cultured bacterial stock solution and culturing with tryptic soyger.
  • FIG. 11 is a schematic explanatory diagram of the first embodiment.
  • the probe mixture is added to a 15 mL coral tube into which 3.9 mL of the above hybridization solution 2 has been dispensed, and mixed well with a mixer.This is used for hybridization of the target rRNA and the capture probe.
  • the first hybridization 'probe solution (final concentration of each probe was 0.25 pmol / ⁇ L) was used.
  • GAGAAAGTTCATAGATATAC ⁇ ⁇ region (CATGTCTCGTGTCTTGCATC) ⁇ ⁇ region (CTGCTACAGTGAACACCATC) region (GTTCTCGACATAGACCAGTC)-Nucleotide sequence of 3 'assist probe 2 (51 in FIG. 11) (SEQ ID NO: 4) 5 area X area (CATGTCTCGTGTCTTGCATC) ⁇ Y area (
  • Nucleotide sequence of probe A (53 in FIG. 11) (SEQ ID NO: 5)
  • HCP1 100 pmolZ wL
  • HCP2 100 pmolZ ⁇ L
  • This HCP mixture was added to a 15 mL conical tube into which 1.9 mL of the above Hybridization Solution 1 was dispensed, and mixed well with a mixer to obtain a second Hybridization 'HCP solution (final concentration of each probe of 1). 5 pmol Z L) and used in Example 1-1 and Comparative Example 1-1. Also, HCP-1 was used as the second hybridization solution in Example 1-2 and Comparative Example 1-2. Instead, 30 / z L of sterile distilled water was used to prepare a solution in the same manner.
  • Nucleotide sequence of capture probe 1 (reference numeral 54 in FIG. 11) (SEQ ID NO: 6)
  • the 96-well microphone plate was washed with a washing solution (50 mM-Tris, 0.3 M-NaCl, 0.01% -Triton X-100, pH 7.6).
  • Example 1-1 and Example 1-2 half of the strip wells of the microplate were used and reacted under “CZH” conditions.
  • the “C ZH” conditions in Example 1 are as follows.
  • the cooled strip well is cooled by an aluminum block for microplates of an aluminum block thermostat (Coolstat, Anatech) (weight: 828 g, width 12. lcm). With a diameter of 8.2 cm and a height of 4.2 cm), put the cooling means (strata cooler lid, made by STRATAGENE) on the microplate, and set the temperature chamber to 45 ° C or 55 ° C. For 1 hour.
  • an aluminum block thermostat Coolstat, Anatech
  • Comparative Example 1 ie, Comparative Examples 11 and 12, the remainder of the strip well was used and reacted under "HZH” conditions.
  • the “HZH” conditions in Comparative Example 1 are as follows.
  • Example 1 under the CZH condition was higher than the measured value of Comparative Example 1 under the HZH condition using the CZH condition.
  • the hybridization reaction was efficiently performed on the target gene.
  • Example 1 under CZH conditions the measured value of Example 11 using 2HCP was higher than that of Example 1-2 using 1HCP, whereas in Comparative Example 1 under HZH conditions, The measured value of Comparative Example 12 using 2HCP was equal to or less than that of Comparative Example 12 using 1HCP. From this result, it was confirmed that the self-aggregation by HCP was formed on the target gene in CZH in which the reaction temperature in the solution was prepared stepwise, than in HZH with a uniform reaction temperature.
  • FIG. 12 is a schematic explanatory diagram of the second embodiment.
  • Nucleotide sequence of assist probe 3 (55 in FIG. 12) (SEQ ID NO: 7)
  • the probe solution was added to a 15 mL coral tube into which 7.9 mL of Hybridization Solution 2 was dispensed, and mixed well with a mixer. This was mixed with the target rRNA and the hybridization of the capture probe.
  • the first hybridization 'probe solution (final concentration of probe: 0.25 pmol / ⁇ L) was used.
  • This HCP mixture was added to each of three 15 mL cocal tubes into which 1.5 mL of Hybridization Solution 1 was dispensed, mixed well with a mixer, and mixed with a second hybridization HCP solution (each final concentration). 2pm 0 lZ w L).
  • Example 2-2 As the second hybridization HCP solution used in Example 2-2 and Comparative Example 2-2, sterilized distilled water was used in place of HCP-1 at 32 / zL, and solutions were similarly prepared. .
  • the following capture probe 2 having a sequence complementary to S. aureus rRNA was immobilized on a strip well type 96-well mic opening plate, and was used in Example 2 and Comparative Example 2. Used in.
  • Nucleotide sequence of capture probe 2 (reference numeral 56 in FIG. 12) (SEQ ID NO: 8)
  • FIG. 12 is a schematic explanatory diagram of this reaction step. As a control, a similar reaction was performed using physiological saline instead of the lysate.
  • the plate was washed with a washing solution using a plate washer.
  • Second Hybridization (Self-Assembly or Hybridization Reaction by HCP) After washing, the second hybridization • 50 HCP solution was placed in a 96-well microphone-mouth plate in which the washing solution was thoroughly removed. Aliquots of 100 ⁇ L or 100 ⁇ L were dispensed and sealed tightly with a plate sealer.
  • Example 2 ie, Example 2-1 and Example 2-2, half of the strip wells of the microplate were reacted at 50 ° C. or 55 ° C. for 1 hour under “CZH” conditions.
  • the rC / Hj conditions were the same as in Example 1 except that a cooling agent was used as the cooling means and the set temperature of the thermostat was changed.
  • Comparative Example 2 ie, Comparative Examples 2-1 and 2-2, the remainder of the strip well was reacted at 50 ° C or 55 ° C for 1 hour under “H / H” conditions.
  • the “HZH” conditions were the same as in Comparative Example 1 except that a microplate heater (manufactured by DIGENE) was used instead of the incubator and the set temperature was changed.
  • the absorbance was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Tables 3 and 4.
  • the values of each absorbance shown in Tables 3 and 4 are values obtained by subtracting the measured values of the control experiment using physiological saline instead of the lysate from the measured values.
  • Example 2 under the CZH condition the measured value of Example 2-1 using 2HCP was higher than that of Example 2-2 using 1HCP.
  • the measured value was higher than Comparative Example 2-1 using 2HCP in Comparative Example 2 under HZH conditions.
  • Comparative Example 2-1 using 2HCP in Comparative Example 2 under HZH conditions For 1HCP, in Example 2-2 under CZH conditions, the measured value increased when the reaction solution volume was increased from 50 ⁇ L to 100 ⁇ L, but in ⁇ Comparative Example 2-2 under conditions, the reaction solution volume was increased. Even when I changed the power, there was no difference.
  • reaction temperature in the solution is made more stepwise in CZH, self-assembly by the HCP is easily formed on the target gene, and at the same time, ordinary single-chain hybrid It was also confirmed that the efficiency of the solution was improved.
  • FIG. 13 is a schematic explanatory diagram of the third embodiment.
  • Assist probe 1 described in Example 1 in a 2 mL microtube (lOOpmolZ ⁇ L) Add 10 ⁇ L each of Assist Probe-2 and 100 ⁇ L of Assist Probe-2 and 80 / zL of Hybridization Solution-2, mix well with a mixer, and heat at 80 ° C for 30 seconds. Immediately on ice to obtain a probe mixture.
  • This probe mixture is added to a 15 mL coal tube into which 3.9 mL of the cooled hybridization solution 2 has been dispensed, mixed well with a mixer, and used for hybridization with the target rRNA.
  • the first hybridization 'probe solution 1 final concentration of each probe: 0.25 pmolZL.
  • This probe mixture is added to a 15 mL coral tube into which 1.9 mL of the cooled hybridization solution 2 has been dispensed, mixed well with a mixer, and mixed with the target rRNA and the capture probe.
  • the first hybridization / probe solution-1 (final concentration of probe: 0.25 pmol / ⁇ L) used for the sillon was used.
  • the plate was washed with a washing solution using a plate washer.
  • the plate was washed with a washing solution using a plate washer.
  • Second Hybridization (Self-Assembly or Hybridization Reaction by HCP) After the above-mentioned washing, 50 ⁇ L of the second hybridization 'HCP solution was added to a 96-well microphone well plate in which the washing solution was thoroughly removed. Alternatively, 100 ⁇ L was dispensed at a time, and sealed tightly with a plate sealer.
  • Example 3 ie, Examples 3-1 and 3-2, half of the strip wells of the microplate were used and reacted under "CZH" conditions.
  • Example 3 "C
  • Comparative Example 3 ie, Comparative Examples 3-1 and 3-2, the rest of the strip well was reacted at 55 ° C for 1 hour under “HZH” conditions.
  • the “HZH” conditions were the same as in Comparative Example 2 except that the set temperature was changed.
  • Example 3 in order to increase the adhesion to the strip well, before the reaction, Mineral oil was dripped on the slipping block!
  • the absorbance was measured in the same manner as in Example 1.
  • Table 5 shows the results.
  • the values of each absorbance shown in Table 5 are values obtained by subtracting the measured values of the control experiment using physiological saline instead of the lysate from the measured values.
  • Example 4 using a labeled oligonucleotide DNA, a uniform reaction temperature solution was used as a control (Comparative Example 4), and the detection efficiency of the target gene when a partial reaction temperature region was created in the reaction solution was evaluated. Compared.
  • probe B was added to the hybridization solution-2 [4XSSC, 0.2% SDS, l% Blocking reagent (Roche), 20% formamide, Salmon sperm DNA (10 ⁇ g / mL)] at 0.025 pmol / L. This was dissolved to obtain a hybridization solution (probe solution 1A).
  • Nucleotide sequence of probe B symbol 57 in FIG. 14 (SEQ ID NO: 9)
  • hybridization solution-probe solution B The following probe C having a DIG label at the 5 'end was dissolved in the above hybridization solution-2 at a concentration of 0.005 pmol / L, and this was designated as hybridization solution-probe solution B. .
  • Nucleotide sequence of probe C (symbol 59 in FIG. 14) (SEQ ID NO: 10) (5'-terminal digoxigenin label)
  • T region (TTATCACGTTAGCTACGGGCGC)-3 '
  • Haemophilus influenzae which had been cultured on a chocolate agar medium for 18 hours, was suspended in physiological saline and used as a culture stock solution. This was diluted with physiological saline to a bacterial concentration of 1 ⁇ 10 7 CFU / mL, and lysed according to the alkali-SDS method (Non-Patent Document 5) to obtain a lysate. Regarding the number of bacteria, a dilution series of the cultured bacterial stock solution was prepared, and the viable cell count obtained by culturing on a chocolate agar medium was calculated. In addition, what was made to react similarly using physiological saline instead of the lysate was used as a control.
  • the following capture probes 3 each having a sequence complementary to the rRNA of Haemophilus influenzae were immobilized on a 96-well microphone plate of strip well type, and used in Example 4 and Comparative Example 4.
  • Nucleotide sequence of capture probe 3 (reference numeral 58 in FIG. 14) (SEQ ID NO: 11) 5 T region (CAGAGTTAAACCCCAACCCCC)
  • FIG. 14 (a) is a schematic explanatory view of this reaction step.
  • the plate was washed with a washing solution (50 mM-Tris, 0.3 M-NaCl, 0.01% -TritonX-100, pH 7.6).
  • a washing solution 50 mM-Tris, 0.3 M-NaCl, 0.01% -TritonX-100, pH 7.6.
  • 50 ⁇ L of the lysate prepared above and 50 ⁇ L of Hybridization 'Probe Solution B' were dispensed into a 96-well microphone well plate containing well-washed washing solution, and firmly sealed with a plate sealer. And sealed.
  • the number of bacteria was 4 10 5 CFU / well.
  • Example 4 the reaction was carried out for 1 hour under the condition that the lower part of the microplate was controlled at 45 ° C and the upper part was controlled electrically at 20 ° C.
  • FIG. 14 (b) is a schematic explanatory view of this reaction step. After the reaction, it was washed with a washing solution.
  • Comparative Example 4 the same reaction and washing were performed under the condition that the microplate was set at 45 ° C.
  • Example 4 in which the lower part was controlled at 45 ° C. and the upper part was controlled electrically at 20 ° C., the measured value was higher than Comparative Example 4 and the sensitivity was improved. From these results, it was confirmed that the sensitivity was improved not only in the signal amplification by the self-assembly reaction of HCP but also in the detection when the labeled oligo DNA was used.

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Abstract

　効率的なハイブリダイゼーション反応を可能とするハイブリダイゼーション方法、該ハイブリダイゼーション方法を用いた、高感度なターゲット遺伝子の検出方法、並びにターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上せしめるシグナル増幅方法を提供する。 　反応溶液中でのオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション方法であって、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成し、当該反応温度領域においてハイブリダイゼーション反応を行わせるようにした。

Description

明 細 書
ハイブリダィゼーシヨン方法
技術分野
[0001] 本発明は、オリゴヌクレオチドを用いたノ、イブリダィゼーシヨン反応において、反応 溶液中に反応温度領域を部分的に形成し、当該反応温度領域においてハイブリダ ィゼーシヨン反応を行 ヽ、効果的にハイブリッドを形成させるようにしたハイブリダィゼ ーシヨン方法、該ハイブリダィゼーシヨン方法を用いた遺伝子の検出方法、並びに該 ハイブリダィゼーシヨン方法を用いて、 DNAチップ又は DNAマイクロアレイ（非特許 文献 1等参照。本明細書において、 DNAチップと DNAマイクロアレイを総称して DN Aマイクロアレイと称する。）、マイクロプレート、及び磁性体粒子等の遺伝子を検出す るための反応機材に結合しているターゲット遺伝子の検出感度を向上させることがで きるようにしたシグナル増幅方法に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子を検出するための反応機材 (以下、反応プラットフォームと称する。 )として、 マイクロプレート、 DNAマイクロアレイ、磁性体粒子等は、安価で反応温度を均一に 制御し易ぐかつ特殊な機器を必要としないために、発色系酵素や発光系酵素を用 V、た遺伝子診断キットが多く市販されて 、る。
[0003] 現在、これらの反応プラットフォームの温度制御は一般的な恒温槽と呼ばれる機器 で行われている。特に遺伝子の検出においては、目的とする遺伝子、又は PCR法等 により増幅された遺伝子に酵素等を標識し、一般的な生化学反応として恒温槽によ る均一な反応温度を用いて 、る。
[0004] 一方、本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法 (プローブ自己集合 体の形成方法)を提案した (特許文献 1〜4)。図 1〜図 3は特許文献 1記載の方法の 概略説明図である。例えば、特許文献 1記載の方法は、図 1に示したように 3個所の 領域から構成される 1対のオリゴヌクレオチド 'プローブ 18 (HoneyComb Probe,以下 、 HCPと称する。）を用いる方法であり、第 1HCP (X領域， Y領域及び Z領域)と第 2 HCP (Z，領域， Y'領域及び X'領域)の各々の 3個所の領域は互いに相補的な塩基 配列を有し、両者を反応させた場合、領域の 1個所のみとハイブリダィズする様に各 領域の塩基配列を工夫したものである（図 2)。この工夫により、複数の 1対の HCPを 反応させた場合、図 9に示されるように反応温度に依存して互いにハイブリダィズして プローブの自己集合体 20 (図 9の矢印）を形成させることができる（図 3)。本明細書 において、これらオリゴヌクレオチド 'プローブの自己集合反応（Probe alternation link self-assembly reaction)による集合体の形成法を、 PALSAR法と称する。
また、本発明者らは、 PALSAR法を利用することにより、ターゲット遺伝子の検出 感度を向上させることができることを見出した (特許文献 5)。図 4に、 PALSAR法を 利用したマイクロプレートにおけるシグナル増幅方法の一例を示す。図 4 (a)に示した 如ぐマイクロプレート 10等の反応機材にターゲット遺伝子 12のキヤプチヤープロ一 ブ 14 (捕捉用プローブ）を結合させ、次に図 4 (b)に示した如ぐターゲット遺伝子 12 を捕捉した後、図 4 (c)に示した如ぐ HCPとターゲット遺伝子に相補的な領域を持 つオリゴヌクレオチド DNA16 (特許文献 5のジョイント ·プローブ。本発明にお 、て、 検出するターゲット遺伝子と相補的な配列、及び自己集合体を形成する核酸 (プロ ーブ）と相補的な配列の両方を有するプローブをアシストプローブと称する。 )をカロえ 、更に、図 4 (e)に示した如ぐ複数対の HCP18を加えて、自己集合反応により自己 集合体 20を形成させ、シグナルを増幅させることができるものである。
特許文献 1：特許第 3267576号公報
特許文献 2：特許第 3310662号公報
特許文献 3 :国際公開第 02Z31192号公報
特許文献 4 :特開 2002— 355081号公報
特許文献 5：国際公開第 03Z029441号公報
特許文献 6：国際公開第 92Z20702号公報
特 §午文献 1 : Marshall,A.,Hodgson,J.DNA chips: an array of possioilities.Nat Biotechnol.16,27- 31,1998.
非特許文献 2 : Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998.54,3607-3630.,
非特許文献 3 : Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253., 非特許文献 4 :Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638. 非特許文献 5 : H.C.BirnboimJ.Doly,Nucleic Acids Res. ,7, 1513(1979) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] しカゝしながら、本発明者らが鋭意研究を行った結果、均一な反応温度による PALS AR法は反応溶液中では均一に自己集合体が形成するために、均一な反応温度を 用いたシグナル増幅による遺伝子の検出では、固相に結合しているターゲット遺伝 子上での HCPの自己集合体形成反応よりも、ターゲット遺伝子上以外の反応溶液 中での HCPの自己集合体の形成反応が優先されてしまうことが明らかとなった。 図 5は均一な反応温度を用いた PALSAR法によるシグナル増幅の一例を示す概 略説明図であり、（a)は均一な反応温度による自己集合体の形成、（b)は自己集合 体の形成反応を行った後、洗浄し、洗浄後のターゲット遺伝子に結合した自己集合 体をそれぞれ示す。図 5に示した如ぐターゲット遺伝子上で形成された自己集合体 により十分なシグナル増幅効果が得られるものの、ターゲット遺伝子上以外の反応溶 液中で形成された自己集合体は、その後の洗浄により除去されてしまう為、実際の自 己集合体の総形成量に比べてシグナル増幅が減少することが判明した。
[0007] 本発明は、効率的なハイブリダィゼーシヨン反応を可能とするハイブリダィゼーショ ン方法、該ハイブリダィゼーシヨン方法を用いた、高感度なターゲット遺伝子の検出 方法、並びにターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上せしめるシグナル増幅方法 を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記問題を解決するために、ターゲット遺伝子上での HCPの自己 集合体形成効率を高めるベぐ鋭意研究を重ねた結果、反応溶液中に部分的に反 応温度領域を設定することにより、ターゲット遺伝子上での HCPの自己集合体形成 効率を著しく高めることができることを見出し、またさらに、 HCPの自己集合体反応の みならず一般的なハイブリダィゼーシヨン反応にぉ 、ても、反応溶液中に部分的に 反応温度領域を設定することにより、ターゲット遺伝子上でのハイブリッド形成効率を 著しく高めることができることを見出し、本発明に到達したものである。
[0009] 即ち、本発明のハイブリダィゼーシヨン方法は、反応溶液中でのオリゴヌクレオチド を用いるノ、イブリダィゼーシヨン方法であって、反応溶液中に反応温度領域を部分的 に形成し、当該反応温度領域にぉ ヽてハイブリダィゼーシヨン反応を行わせることを 特徴とする。
[0010] 本発明において、前記ハイブリダィゼーシヨン反応としては、特に限定されないが、 互 ヽにノ、イブリダィズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオ チド.プローブを用いてハイブリダィゼーシヨンさせることにより、オリゴヌクレオチドが 自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を含むことがより好適 である。
[0011] 前記複数種のオリゴヌクレオチド ·プローブの第 1の例として、 5，端側力 順に少な くとも核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 zが設けられ、下記化学式（1)の構造を 有する、 3箇所以上の核酸領域力もなる第 1プローブと、 5'端側から順に少なくとも核 酸領域 X'、核酸領域 Y'及び核酸領域 Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有 する、 3箇所以上の核酸領域力もなる第 2プローブと、力もなる一対のオリゴヌクレオ チド ·プローブが挙げられる（特許文献 1及び 2)。
[0012] [化 1]
X Y Z
[化 2]
Z， Y' X，
(前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Yと Y，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィ ズ可能な相補的核酸領域である。 )
[0013] 図 1〜図 3は 3箇所の核酸領域力 なる第 1プローブ (第 1HCP)と第 2プローブ (第 2HCP)と力もなる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ（一対の HCP)を用いた自己 集合反応の例を示した概略説明図である。図 1〜図 3に示した如ぐ前記化学式（1) 及び（2)の構造を有する一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ 18の複数対を用いて（ 図 1)、互い違いに交差するようにハイブリダィゼーシヨンさせることにより（図 2)、オリ ゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体 (ポリマー） 20が形成される（図 3
) o
[0014] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 2の例として、 No. 1及び No. 2の 一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域、中央領域、及び 5，側 領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基 配列とし、 3 '側領域及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダ イマ一形成用プローブを含む第 1番目の系から第（2n— 1)番目（n≥ 1)の系まで順 番に n個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、 No. 1及び No. 2の一対の オリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3 '側領域及び 5 '側領域の 2つの領域に 分け、各オリゴヌクレオチドの 3 '側領域及び 5 '側領域を互!、に非相補的な塩基配列 とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第 2番目の系から第 2n番目の系まで順 番に n個形成された架橋プローブ含有系とを有し、該架橋プローブの塩基配列が、 該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列 である複数のオリゴヌクレオチド 'プローブが挙げられる（特許文献 4)。
[0015] 該オリゴヌクレオチド 'プローブをノヽイブリダィゼーシヨンさせることにより、オリゴヌク レオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応が挙げられる。前記 プローブのハイブリダィゼーシヨンは、ダイマー形成用プローブをハイブリダィゼーシ ヨンさせて、各系のダイマー (ダイマープローブ)を形成させた後、該ダイマーと架橋 プローブをハイブリダィゼーシヨンさせて、自己集合体を形成させることが好ましい。
[0016] 上記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 2の例において、 n= lの場合、第 1 の系のダイマー形成用プローブと第 2の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組 み合わせは、 2通り存在する。
n= 1の場合の 1例として、前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 5'側領域、
第 2の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 2の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 5 '側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
[0017] n= lの場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 5'側領域、
第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 5 '側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
[0018] 上記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 2の例において、 n≥2の場合、第 1 、第 3、 · ·、第（2n— 1)の系のダイマー形成用プローブと第 2、第 4、 · ·、第 2nの系の 架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、 2通り存在する。 n≥2の場合の 1例として、上記プローブの塩基配列を、
第（2n— 3)番目の系の No . 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 3)番目の系の No . 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、 ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5'側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを 用!/、ることができる。
[0019] n≥ 2の場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、
第（2n— 3)番目の系の No . 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 3)番目の系の No . 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1番目の系の
No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
[0020] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 2の例を用いた自己集合反応を具 体的に説明する。例えば、 n= lの場合、一対のダイマー形成用プローブを用いて形 成された下記化学式 (3)の構造を有するダイマープローブと、下記化学式 (4)の構 造を有する一対の架橋プローブ又は下記化学式 (5)の構造を有する一対の架橋プ ローブとを用いて、これらプローブをハイブリダィゼーシヨンさせることにより、下記化 学式 (6)の構造を有する自己集合体が形成される。
[0021] [化 3]
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
[0023] [化 5] 3
Figure imgf000010_0003
D C
(式（3)〜式（5)において、 Aと A'、 Bと B'、 Cと C'、 Dと D'及び Fと F'はそれぞれハ イブリダィズ可能な相補的核酸領域である。 )
[0025] [化 6]
Figure imgf000011_0001
[0026] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 3の例として、 No. 1及び No. 2の 一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域、中央領域、及び 5，側 領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基 配列とし、 3 '側領域、及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイ マー形成用プローブを含む系を第 1番目の系から第 k番目（k≥ 2)の系まで順番に 複数個形成し、
(a)第 (k— 1)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 k番目の系の N o. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
(b)第 (k— 1)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 k番目の系の N o. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
(c)最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2 オリゴヌ クレオチドの 3，側領域、
(d)最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 1 オリゴヌ クレオチドの 5，側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第 1番目の系から第 k番 目の系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブが挙げられる (特許文献 3)
[0027] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 4の例として、 No. 1及び No. 2の 一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域、中央領域、及び 5，側 領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基 配列とし、 3 '側領域、及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイ マー形成用プローブを含む系を第 1番目の系から第 k番目（k≥ 2)の系まで順番に 複数個形成し、
(a)第 (k— 1)番目の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 k番目の系の N o. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
(b)第 (k— 1)番目の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 k番目の系の N o. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
(c)最後の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌ クレオチドの 3，側領域、
(d)最後の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌ クレオチドの 5，側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第 1番目の系から第 k番 目の系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブが挙げられる (特許文献 3)
[0028] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 3及び第 4の例において、第 1番目 の系から第 k番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダィゼーシ ヨンさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、 自己集合体を形成させる自己 集合反応が挙げられる。ダイマー形成用プローブのハイブリダィゼーシヨンは、各系 毎にダイマー形成用プローブをノヽイブリダィゼーシヨンさせて、それぞれダイマー（ダ イマ一プローブ）を形成させた後、各系のダイマープローブをハイブリダィゼーシヨン させて、自己集合体を形成させることが好ましい。
[0029] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの第 3又は第 4の例を用いた自己集合 反応を具体的に説明する。例えば、 k= 2の場合、一対のダイマー形成用プローブを 用いて形成された下記化学式（7)の構造を有するダイマープローブと、一対のダイマ 一形成用プローブを用いて形成された下記化学式 (8)の構造を有するダイマープロ ーブ又は一対のダイマー形成用プローブを用いて形成された下記化学式（9)の構 造を有するダイマープローブとを用いて、これらプローブをハイブリダィゼーシヨンさ せることにより、下記化学式（10)の構造を有する自己集合体が形成される。
[0030] [化 7]
Figure imgf000013_0001
[0031] [ィ匕 8]
( 8；
Figure imgf000013_0002
[0032] [化 9]
Figure imgf000013_0003
(式（7)〜式（9)にお!/ヽて、 Aと A' Bと B'、 Cと C'、 Dと D'及び Fと F'はそれぞれハ イブリダィズ可能な相補的核酸領: eある。）
[0034] [化 10]
Figure imgf000014_0001
[0035] 本発明のシグナル増幅方法は、互いにハイブリダィズ可能な相補的塩基配列領域 を有する複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブを用いてハイブリダィゼーシヨンさせる ことにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己 集合反応を利用して、遺伝子を検出するための反応機材におけるターゲット遺伝子 の検出感度を向上させるシグナル増幅方法であって、該自己集合反応が前記本発 明のハイブリダィゼーシヨン方法を用いて行われることを特徴とする。
[0036] 前記ターゲット遺伝子と前記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配 列と自己集合体の形成に使用する少なくとも 1つのオリゴヌクレオチド 'プローブの塩 基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシストプローブを用いることが好 ましい。また、前記自己集合体の形成に使用するオリゴヌクレオチド 'プローブの少な くとも 1つを、ターゲット遺伝子と相補的な配列が含まれるように構成してもよ ヽ。
[0037] 本発明のシグナル増幅方法は、形成された自己集合体を検出することにより、ター ゲット遺伝子の高感度な検出を可能とするものである。 自己集合体を検出する方法と しては、特に限定はないが、例えば、前記自己集合反応に使用するオリゴヌクレオチ ド 'プローブの少なくとも一つを、あらかじめ標識物質で標識し、標識物質を検出する ことにより自己集合体を検出することが好ましい。前記標識物質は特に限定されず、 公知の標識物質を広く使用することができる。例えば、放射性同位元素、蛍光物質、 発光物質、発色物質、発色系酵素又は発光系酵素等が挙げられる。
[0038] また、上記ターゲット遺伝子に結合したオリゴヌクレオチドの自己集合反応により形 成された自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダィゼーシヨンさせて自己集 合体の存在を検出することが可能である。標識プローブとしては、発色系酵素、発光 系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。
[0039] さらにまた、上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加 え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが 可能である。蛍光物質としては、 2本鎖の塩基対の中に挿入する性質を持った蛍光 物質が好ましい。
[0040] 本発明のターゲット遺伝子の検出方法の第 1の態様は、前記本発明のシグナル増 幅方法を用いてターゲット遺伝子を検出することを特徴とする。
[0041] 本発明のターゲット遺伝子の検出方法の第 2の態様は、反応溶液中でのオリゴヌク レオチドのハイブリダィゼーシヨン反応を利用して、遺伝子を検出するターゲット遺伝 子の検出方法であって、該ハイブリダィゼーシヨン反応が前記本発明のノ、イブリダイ ゼーシヨン方法を用いて行われるハイブリダィゼーシヨン反応を含むことを特徴とする 前記ノ、イブリダィゼーシヨン反応に用いるオリゴヌクレオチドの少なくとも 1つを、前 記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有するように構成することが好ま 、。
[0042] 本発明において、前記遺伝子を検出するための反応機材は特に限定されず、遺伝 子検出の為の種々の反応機材に適用可能である力 特に、マイクロプレート、 DNA マイクロアレイ、及び磁性体粒子等に好適に用いられる。
[0043] 本発明にお!/、て、前記ターゲット遺伝子として、一本鎖の DNA及び Z又は RNA、 並びに二本鎖の DNA及び Z又は RNAを用いることができる。また、上記ターゲット 遺伝子として SNPs (—塩基多形)を含んで!/ヽる遺伝子を用いることができる。
[0044] 本発明にお 、て、前記ハイブリダィゼーシヨン反応に使用するオリゴヌクレオチドを 、あらかじめ標識物質で標識し、標識物質を検出することによりターゲット遺伝子を検 出することが好ましい。前記標識物質は特に限定されず、公知の標識物質を広く使 用することができる。例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、発 色系酵素又は発光系酵素等が挙げられる。
[0045] 上記オリゴヌクレオチドは、通常 DNA又は RNAで構成される力 核酸類似体でも 構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸 (PNA、特許文献 6)や Locked Nucleic Acid (LNA、非特許文献 2〜4)が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチ ド 'プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえば DN Aプローブと RN Aプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は DNA、 R NAまたは核酸類似体 (たとえば PNAや LNA等)から選択することができる。又、一 つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえば DNAのみカゝら構成される必要は なぐ必要に応じて、たとえば、 DNAと RNAから構成されるオリゴヌクレオチド 'プロ ーブ (キメラプローブ)を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
[0046] 上記オリゴヌクレオチド 'プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にし て、少なくとも 5塩基であり、好ましくは 10〜： LOO塩基、さらに好ましくは 15〜30塩基 である。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえば DNAプローブ の場合、アプライドバイオシステムズ社 (Applied Biosystem Inc.)の DNAシンセサイ ザ一 394型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法とし てリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、チォホスホネート法等があるが、いかな る方法で合成されたものであってもょ 、。
[0047] 本発明にお 、て使用するオリゴヌクレオチド 'プローブの本数は特に限定されな!ヽ 力 102〜1015本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、 核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。 pHも常用の範囲で好適 であり、好ましくは pH7. 0〜9. 0の範囲のものが使用できる。部分的な反応温度領 域に適用される反応温度は 40〜80°C、好ましくは 55〜65°Cである。
[0048] 本発明におけるターゲット遺伝子 (DNAまたは RNA)測定用試料は、該核酸を含 む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製ま たは単離したものでもよぐ特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳 脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウィルス、細菌、カビ等の含有ま たは感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を 公知の方法で増幅した DNAまたは RNA等の核酸も使用できる。
発明の効果
[0049] 本発明によれば、簡便にターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上することができ る。また、本発明によればハイブリダィゼーシヨン反応におけるハイブリッド形成効率 を向上させることができる。更に本発明によれば、検出に用いられる自己集合体の形 成を増大させ、シグナル増幅を向上させることができる。
図面の簡単な説明
[0050] [図 1]一対の HCPを示す概略説明図である。
[図 2]—対の HCPの結合態様を示す概略説明図である。
[図 3]複数対の HCPにより形成された自己集合体を示す概略説明図である。
[図 4]PALSAR法を利用したマイクロプレートにおけるシグナル増幅法の一例を示す 概略説明図である。
[図 5]均一な反応温度を用いた PALSAR法によるシグナル増幅方法の一例を示す 概略説明図である。
[図 6]マイクロプレートを用いた部分的な反応温度領域を用いたターゲット遺伝子の 検出方法の一例を示す概略説明図である。
[図 7]本発明の部分的な反応温度領域を用いたシグナル増幅によるターゲット遺伝 子の検出方法の一例を示す概略説明図である。
[図 8]本発明の部分的な反応温度領域を用いたシグナル増幅による遺伝子の検出方 法の他の例を示す概略説明図である。
[図 9]実験例 1の結果を示す写真である。
[図 10]実験例 2の結果を示す写真である。
[図 11]実施例 1の工程図を示す概略説明図である。
[図 12]実施例 2の工程図を示す概略説明図である。
[図 13]実施例 3の工程図を示す概略説明図である。
[図 14]実施例 4の工程図を示す概略説明図である。
[図 15]実施例 4及び比較例 4の結果を示すグラフである。
符号の説明
[0051] 10 :マイクロプレート、 12 :ターゲット遺伝子、 14 :キヤプチヤープローブ、 15 :標識 物質、 16 :アシストプローブ、 17 :—対の HCPの一方、 18 :—対の HCP、 20 :自己集 合体、 22 :ホットプレート、 24 :冷却手段、 50 :アシストプローブ 1、 51 :アシストプロ 一ブー 2、 52 :ターゲット遺伝子、 53 :プローブ A、 54 :キヤプチヤープローブ 1、 55 ：アシストプローブ 3、 56 :キヤプチヤープローブ 2、 57 :プローブ B、 58 :キヤプチ ヤープローブ 3、 59 :プローブ C、 60 :ターゲット遺伝子。
発明を実施するための最良の形態
[0052] 以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的 に示されるもので、本発明の技術思想力 逸脱しない限り種々の変形が可能なことは いうまでもない。
[0053] 熱の伝わり方には、熱伝導 (分子の衝突）、対流 (物質の移動）、及び放射 (電磁波 )の 3種類がある。本発明のハイブリダィゼーシヨン方法は、この熱の伝わり方を利用 してマイクロプレート等の検出プラットフォーム内の反応溶液の温度を不均一とし、反 応溶液内に反応温度領域を部分的に作製することにある。
この部分的な反応温度領域の設定を、ハイブリダィゼーシヨン反応を利用した遺伝 子検出に適用することが可能であり、特に図 4や図 8に示した PALSAR法を利用し たシグナル増幅による遺伝子検出に適用することが好ましい。本発明においては、タ 一ゲット遺伝子の固定部位付近、例えば、検出用プラットフォームの底部等、に部分 的に反応温度領域を形成し、該検出用プラットフォームの底部でのハイブリダィゼー シヨン反応を優先的に行うことにより、遺伝子検出を高感度に検出することが可能で ある。
[0054] 以下、ハイブリダィゼーシヨン反応における部分的な反応温度領域の形成の例を具 体的に説明する。
本発明は、反応溶液の一部のみをノヽイブリダィゼーシヨンに適した温度とすることに より、その局所でのみハイブリダィゼーシヨン反応が効率的に進み、ハイブリダィゼー シヨンを用いたターゲット遺伝子の検出を感度良く行うことができることを示したもので ある。局所のみを反応温度としてハイブリダィゼーシヨン反応を行うものであれば、本 発明に含まれるものであるが、好ましくは、反応溶液中に高温の領域及び低温の領 域を設けて、反応溶液中に温度勾配を生じさせ、局所のみが反応温度となるように することが望ましぐ更に好ましくは、高温の領域を加熱により、低温の領域を冷却に より生じさせることが好ましい。また、ハイブリダィゼーシヨン反応が進まないように、反 応溶液は予め冷却しておくことが好ま 、。 [0055] 具体的には、図 6に概略説明図を示したマイクロプレートを用いた部分的な反応温 度領域を用いたハイブリダィゼーシヨン方法の例が挙げられる。以下、反応プラットフ オームとしてマイクロプレートを用いた場合を例に、本発明のターゲット遺伝子の検出 方法を具体的に説明する。なお、他のプラットフォームもマイクロプレートと同様に適 用されるものである。
まず、ターゲット遺伝子を捕捉したマイクロプレート 10に、ハイブリダィゼーシヨン反 応に使用するオリゴヌクレオチドをカ卩えた後、マイクロプレート 10全体を例えば 4°Cに 冷却する [図 6 (a) ]。冷却後、図 6 (b)に示した如ぐマイクロプレート 10を、行われる ハイブリダィゼーシヨン反応に適した温度に調整済みのホットプレート 22等の加熱手 段の上に乗せ、その上力も冷却手段 24 (例えば、保冷剤（一 20°C)、又はそれに類 する冷却プレート、例えば、冷却したアルミブロック等）を被せてハイブリダィゼーショ ン反応を行う [図 6 (c) ]。
[0056] ハイブリダィゼーシヨン反応は、上記加熱手段及び冷却手段を備えた機器を用い て、反応溶液を加熱及び冷却して行うことが好ましぐ上記加熱手段及び冷却手段 は温度を制御できることが好まし ヽ。マイクロプレートでハイブリダィゼーシヨン反応を 行う場合は、上記加熱手段及び冷却手段ともに平面でマイクロプレートと接触する構 造であることが更に好ましぐ特に底面は加熱及び冷却の両方できることが好ましい。
[0057] ハイブリダィゼーシヨン反応として自己集合反応を行う例にっ 、て更に具体的に説 明する。図 7は、マイクロプレートに部分的な反応温度領域を設定したシグナル増幅 による遺伝子の検出方法の一例を示す概略説明図であり、図 4におけるステップ (e) 一（f)の自己集合反応を本発明のハイブリダィゼーシヨン方法を用いて行った例であ る。
前述した図 4 (e)に示したようにターゲット遺伝子を捕捉したマイクロプレート 10に自 己集合反応に用いられる複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブを加えた後、冷却す る。冷却後、図 7 (a)に示したように、 自己集合反応に最適な温度をターゲット遺伝子 に近い階層 W (マイクロプレートの底部）に設定することにより、その部位でのみハイ ブリダィゼーシヨン反応が行われる。図 7 (b)に示したように、反応時間の経過とともに マイクロプレートの底部から上部へ向けて自己集合反応に最適な温度に到達するた めに、洗浄後は図 7 (c)に示したようにターゲット遺伝子にのみ大きな自己集合体が 結合して、遺伝子を高感度に検出できる。
[0058] 図 8は、マイクロプレートに部分的な反応温度領域を設定したシグナル増幅による 遺伝子の検出方法の他の例を示す概略説明図である。図 8は、一対の HCPを用い たシグナル増幅であり、一対の HCPの一方の一領域が、ターゲット遺伝子に相補的 な領域である一対の HCPを用いた例を示す。 PALSAR法によれば、図 8 (a)に示し たように、検出用プラットフォーム（マイクロプレート 10や DNAマイクロアレイ等）の底 部に遺伝子を捕捉するためのキヤプチヤープローブ 14を結合させておき、図 8 (b)〜 図 8 (d)のような手順でターゲット遺伝子 12 (例えば、 E.col卜 16SrRNA等）を捕捉し、 該ターゲット遺伝子 12にターゲット遺伝子に相補的な領域を有する HCP 17を加え て [図 8 (b) ]、該ターゲット遺伝子 12と HCP17を結合させ [図 8 (c) ]、図 8 (d)に示し た如ぐ複数対の HCP18を加えて、自己集合反応により自己集合体 20を形成させ、 シグナルを増幅させることができる。
[0059] 本発明においては、このステップ (d)—（e)の自己集合反応において、ターゲット遺 伝子の存在する検出用プラットフォームの底部に部分的に反応温度領域を形成させ 、該検出用プラットフォームの底部での自己集合反応を優先的に行うことにより、ター ゲット遺伝子上での自己集合体形成効率を著しく高めることができ [図 8 (e) ]、遺伝 子検出を高感度に検出することができる。なお、図 8においては、自己集合反応に用 いる一対の HCPの一方を標識物質で予め標識しておき、標識物質を検出することに より自己集合体を検出し、それによりターゲット遺伝子を検出する例を示したが、自己 集合体の検出方法は特に限定されないものである。
実施例
[0060] 以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する力 これらの実施例は例 示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでな 、ことは 、うまでもな!/、。
[0061] (実験例 1及び 2)
一対のプローブを用いた PALSAR法の反応温度 '時間の違いによる自己集合体 の形成。
〈各溶液の調製方法〉 (1)ハイブリダィゼーシヨン溶液の調製
以下の試薬を調製し、ハイブリダィゼーシヨン溶液として使用した。
ハイブリダィゼーシヨン溶液 1
[4XSSC、 0.2%SDS、 l%Blocking reagent (Roche製）]
[0062] (2)ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液の調製
前記ハイブリダィゼーシヨン溶液 1に下記一対のプローブ (HCP— 1及び HCP— 2)を 2ρπιο1//ζ Lになるように溶解し、これをノヽイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液とし た。
HCP— 1の塩基配列 (配列番号 1)
5 ' - X領域（CATGTCTCGTGTCTTGCATC) · Υ領域（
CTGCTACAGTGAACACCATC) 領域 (GTTCTCGACATAGACCAGTC) - 3'
HCP 2の塩基配列 (配列番号 2) (5，末端ジゴキシゲニン標識）
DIG- 5 ' -X'領域（GATGCAAGACACGAGACATG) · Y'領域（
GATGGTGTTCACTGTAGCAG) · Z '領域（GACTGGTCTATGTCGAGAAC) -3 ' [0063] 〈反応及び検出方法〉
前記ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液を 0.2mLマイクロチューブに 20 μ Lずつ 1 28本に分注し、この 1Z2ずつを各々「実験例 1:分注後のチューブを 94°Cで 30秒 加熱」、又は「実験例 2:分注後のチューブをいつたん氷上で冷却」した後、各反応温 度（37.0、 39.6、 41.4、 43.8、 46.4、 48.7、 50.5、 53.0、 55.0、 57.1、 58 .7、 60.6、 62.8、 64.6、 66.0又は 68.0。 で 30分、 1時間、又は 3時間反応さ せ、氷上で急冷させた。これらを 0.5%ァガロースゲル電気泳動で確認した。
[0064] 図 9は実験例 1の結果を示す写真であり、図 10は実験例 2の結果を示す写真であ る。図 9及び図 10において、（a)は各反応温度で 30分間反応、（b)は各反応温度で 1時間反応、（c)は各反応温度で 3時間反応させたの場合の結果である。また、図 9 及び図 10において、各レーンのサンプルの温度条件は、下記の通りである。
M:サイズマーカー、 1:37.0°C, 2:39.6°C, 3:41.4°C, 4:43.8°C, 5:46.4 °C, 6:48.7°C, 7:50.5°C, 8:53.0°C, 9:55.0°C, 10:57. 1°C, 11:58.7°C, 12:60.6°C, 13:62.8°C, 14:64.6°C, 15:66.0°C, 16:68.0。C。 [0065] 図 9に示した如ぐ 94°Cの熱変性を行った実験例 1においては、いずれの反応時 間においても 55°C以上でァガロースゲルのゥエルに留まる大きさの自己集合体の形 成が確認された（図中の矢印)。一方、図 10に示した如ぐ熱変性を行わな力つた実 験例 2においては、 55°C以上では実験例 1と同様に自己集合体の形成が確認され た力 55°C未満では HCPの非特異的な凝集とみられるスメァなバンドが確認され、 反応時間を延長しても同じ傾向がみられた。よって、本実験例で用いたハイブリダィ ゼーシヨン 'HCP溶液の条件における一対のプローブ（HCP— 1及び 2)の自己集合 体形成の至適反応温度は 55°C付近であった。
[0066] (実施例 1〜3及び比較例 1〜3)
部分的な反応温度領域を用いたハイブリダィゼーシヨン反応によるターゲット遺伝 子の検出感度の測定
実施例 1〜3は、 HCPを用いたノヽイブリダィゼーシヨン反応において、均一な反応 溶液を用いた場合を対照 (比較例 1〜3)とし、反応溶液中に部分的な反応温度領域 を作成した場合の効果を確認したものである。以下、部分的な反応温度領域を作成 し反応させる条件を「CZH」、対照である均一な反応温度において反応させる条件 を「HZH」とそれぞれ称する。
[0067] また、 HCPを用いた反応を行う場合に、一対の HCP (HCP—1及び HCP— 2)を 用いて自己集合反応を行う場合を「2HCP」、 HCPのうち一本鎖のみ (HCP— 1又は HCP- 2)を用いてハイブリダィゼーシヨン反応を行う場合を「1HCP」と記載する。
[0068] 〈各溶液の調製〉
(1)ハイブリダィゼーシヨン溶液の調製
以下の試薬を調製し、ハイブリダィゼーシヨン溶液として下記実施例 1〜3及び比較 例 1〜3で使用した。
ハイブリダィゼーシヨン溶液 1：
[4XSSC、 0.2%SDS、 l%Blocking reagent (Roche製）]
ノヽイブリダィゼーシヨン溶液 2：
[4XSSC、 0.2%SDSゝ l%Blocking reagent (Roche製）、 20%ホノレムアミド、 Salmon sperm DNA(10 μ g/mL)] ノヽイブリダィゼーシヨン溶液 3：
[4XSSC、 0.2%SDS、 l%Blocking reagent (Roche製）、 5%PEG20000]
[0069] (2)溶菌液の調製
トリプチックソィァガーで 18時間培養した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus) を生理食塩水に懸濁させたものを培養菌原液とした。これを生理食塩水で所定の菌 数に希釈し、アルカリ— SDS法 (非特許文献 5)に従って溶菌させたものを下記実施 例 1〜3及び比較例 1〜3に用いるターゲット rRNAを含有する溶菌液とした。菌数に ついては、培養菌原液の希釈系列を作成して、トリプチックソィァガーで培養して得ら れた生菌数から所定の菌数を算出した。
[0070] (実施例 1及び比較例 1)
「CZH」及び「HZH」条件におけるターゲット遺伝子の検出感度及びターゲット遺 伝子上の自己集合体の形成効率への効果を比較した。実施例 1の概略説明図を図 11に示す。
[0071] 〈各溶液の調製方法〉
(1)第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液の調製
0. 2mLマイクロチューブに下記アシストプローブ 1 (lOOpmolZ μ L)を 10 μ L、 下記アシストプローブ 2 (lOOpmolZ μ L)を 10 μ L、下記プローブ A(100pmolZ μ L)を L、ハイブリダィゼーシヨン溶液 2を 70 L加え、ミキサーでよく混和し て 94°Cで 30秒加熱した後、直ちに氷冷しプローブ混液とした。
前記ハイブリダィゼーシヨン溶液 2を 3. 9mL分注した 15mLコ-カルチューブに 前記プローブ混液を加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲット rRNAとキヤプチャ 一プローブのハイブリダィゼーシヨンに使用する第 1ハイブリダィゼーシヨン 'プローブ 溶液 (各プローブの終濃度 0. 25pmol/ μ L)とした。
[0072] アシストプローブ 1 (図 11の符号 50)の塩基配列（配列番号 3)
5 -T領域（TAGCTAATGCAGCGCGGATCC) ' S領域（
1
GAGAAAGTTCATAGATATAC) ·Χ領域（CATGTCTCGTGTCTTGCATC) ·Υ領域 (CTGCTACAGTGAACACCATC) 領域 (GTTCTCGACATAGACCAGTC) - 3' アシストプローブ 2 (図 11の符号 51)の塩基配列（配列番号 4) 5し X領域 (CATGTCTCGTGTCTTGCATC) · Y領域（
CTGCTACAGTGAACACCATC) ·Ζ領域（GTTCTCGACATAGACCAGTC)，S，領 域（GTATATCTATGAACTTTCTC) ·Τ領域 (ATCTATAAGTGACAGCAAGAC)
2
- 3'
プローブ A (図 11の符号 53)の塩基配列（配列番号 5)
5，- K領域（CGACGACGACGACGACGACG) ·Τ領域（
1 3
GCGGTTCAAAATATTATCCGG) -3 '
[0073] (2)第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液の調製
0. 2mLマイクロチューブに、前記実験例 1記載の HCP l (lOOpmolZ w L)及 び HCP 2 (lOOpmolZ μ L)を各 30 μ L、ハイブリダィゼーシヨン溶液 1を 40 μ L 加え、ミキサーでよく混和して 94°Cで 30秒加熱した後、直ちに氷冷し HCP混液とし た。
この HCP混液を、前記ハイブリダィゼーシヨン溶液 1を 1. 9mL分注した 15mLコ 二カルチューブへ加え、ミキサーでよく混和し第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液（ 各プローブの終濃度 1. 5pmolZ L)とし、実施例 1—1及び比較例 1—1で用いた また、実施例 1— 2及び比較例 1— 2で用いる第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液 として、 HCP— 1のかわりに滅菌蒸留水を 30 /z L使用し、同様に溶液を調製した。
[0074] 〈マイクロプレートの調製〉
黄色ブドウ球菌の rRNAに相補的な配列を有する下記キヤプチヤープローブ 1を ストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレート上に固定し、実施例 1、実施例 3、 比較例 1及び比較例 3で使用した。
キヤプチヤープローブ 1 (図 11の符号 54)の塩基配列（配列番号 6)
5，- T領域（CGTCTTTCACTTTTGAACCAT) ·Κ '領域（
4 1
CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG) - 3， -Amino link
[0075] 〈反応及び検出方法〉
(1)第 1ハイブリダィゼーシヨン
2. OmLマイクロチューブに前記調製した溶菌液 (菌濃度： 1 X 105CFU/mL)を 8 00 /z L、第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液を 800 /z L加え、ミキサーでよく混 和し、 45°Cで 1時間反応させた。図 11の（a)及び (b)はこの反応工程の概略説明図 である。また、対照として、溶菌液の代わりに生理食塩水を用いて同様に反応を行つ た。
この反応液を前記調製したストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレートに 100 Lずつ分注し、プレートシ一ラーでしっかりとシールし、更に 45°Cで 1時間反応させ た。図 11の（c)及び (d)はこの反応工程の概略説明図である。
前記反応後、 96ウェルマイク口プレートを洗浄液（50mM- Tris, 0.3M- NaCl,0.01% - TritonX- 100,pH7.6)で洗浄した。
[0076] (2)第 2ハイブリダィゼーシヨン (HCPによる自己集合体又はハイブリッド形成反応） 前記洗浄後、洗浄液をよくきった 96ウェルマイク口プレートへ第 2ハイブリダィゼー シヨン 'HCP溶液を 50 μ Lずつ分注し、プレートシ一ラーでしっかりとシールした。
[0077] 実施例 即ち実施例 1—1及び実施例 1—2では、前記マイクロプレートのストリツ プゥエルのうち半分を使用し、「CZH」条件により反応させた。実施例 1における「C ZH」条件は下記の通りである。
ストリップゥエルを 4°Cの保冷庫で 30分間冷却した後、冷却したストリップゥエルをァ ルミブロック恒温槽（クールスタツト、アナテック製）のマイクロプレート用アルミブロック (重さ： 828g、幅 12. lcm、直径 8. 2cm、高さ 4. 2cm)上に設置し、マイクロプレー トの上に冷却手段 (ストラタクーラーの蓋、 STRATAGENE製)を載せ、恒温槽を 45°C 又は 55°Cに設定して 1時間反応させた。
[0078] 比較例 1、即ち比較例 1 1及び比較例 1 2では、前記ストリップゥエルの残りを使 用し、「HZH」条件により反応させた。比較例 1における「HZH」条件は下記の通り である。
ストリップゥエルを室温で 30分間放置した後、 45°C又は 55°Cに設定したインキュべ 一ターで 1時間反応させた。
[0079] (3)検出
マイクロプレートウエルを洗浄後、 50mM-Tris(pH7.6)に溶解した POD標識抗ジゴキ シゲニン（60mU/mL)を 50 /z L加え、 37°Cのインキュベーターで反応させた。洗浄液 で洗浄後、 0. 2M酢酸緩衝液 (pH5.0)、 0.06%TMB及び 0.04%H Oを含む発色液を 5
2 2
カロえ、暗所で 15分間放置し、 655nmの吸光度を測定した。吸光度の結果を表 1及び表 2に示す。
[表 1] 第 2ハイブリダイゼーションの反応温度 45°Cでの吸光度
Figure imgf000026_0001
[0082] 表 1及び表 2に示したように、 1HCP、 2HCPのいずれにおいても CZH条件下の 実施例 1の測定値は HZH条件下の比較例 1の測定値よりも高ぐ CZH条件を用い ることによりターゲット遺伝子上で効率的にハイブリダィゼーシヨン反応が行われてい た。
また、 CZH条件下の実施例 1においては、 1HCPを用いた実施例 1—2よりも 2H CPを用いた実施例 1 1の測定値が高ぐ一方、 HZH条件下の比較例 1において は、 1HCPを用いた比較例 1 2と比較して 2HCPを用いた比較例 1 2の測定値は 同等かそれ以下であった。この結果より、溶液中の反応温度を段階的に作成した C ZHの方が均一な反応温度の HZHよりもターゲット遺伝子上で HCPによる自己集 合体が形成されて ヽることが確認された。
[0083] (実施例 2及び比較例 2)
C/Hにおける段階的な反応温度の作成について、 HCPによるハイブリッド形成又 は自己集合体形成の反応液量をかえて確認した。実施例 2の概略説明図を図 12に 示す。
[0084] 〈各溶液の調製方法〉
(1)第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液の調製
0. 2mLマイクロチューブに下記アシストプローブ一 3 (lOOpmolZ μ L)を 20 μ L、 ハイブリダィゼーシヨン溶液 2を 80 L加え、ミキサーでよく混和して 94°Cで 30秒 加熱した後、直ちに氷冷しプローブ液とした。
アシストプローブ 3 (図 12の符号 55)の塩基配列（配列番号 7)
5し X領域 (CATGTCTCGTGTCTTGCATC) · Y領域（CTGCTACAGTG
AACACCATC) ·Ζ領域（GTTCTCGACATAGACCAGTC) ·Τ領域（
2
ATCTATAAGTGACAGCAAGAC) -3'
[0085] ハイブリダィゼーシヨン溶液 2を 7. 9mL分注した 15mLコ-カルチューブに前記 プローブ液を加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲット rRNAとキヤプチヤープロ ーブのハイブリダィゼーシヨンに使用する第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液（ プローブの終濃度： 0. 25pmol/ μ L)とした。
[0086] (2)第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液の調製
0. 2mLマイクロチューブに、実験例 1記載の HCP— l (lOOpmolZ w L)及び HC
P— 2 (lOOpmolZ μ L)を各 32 μ L、ハイブリダィゼーシヨン溶液— 1を 36 μ Lカロえ、 ミキサーでよく混和して 94°Cで 30秒加熱した後、直ちに氷冷し HCP混液としたもの を 3本用意した。
この HCP混液を、ハイブリダィゼーシヨン溶液 1を 1. 5mL分注した 15mLコ-カ ルチューブ 3本へ各々加え、ミキサーでよく混和し、第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP 溶液 (各終濃度 2pm0lZ w L)とした。
また、実施例 2— 2及び比較例 2— 2で用いる第 2ハイブリダィゼーシヨン' HCP溶液 として、 HCP— 1のかわりに滅菌蒸留水を 32 /z L使用し、同様に溶液を調製した。
[0087] 〈マイクロプレートの調製〉
黄色ブドウ球菌の rRNAに相補的な配列を有する下記キヤプチヤープローブ 2を ストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレート上に固定し、実施例 2及び比較例 2 で使用した。
キヤプチヤープローブ 2 (図 12の符号 56)の塩基配列（配列番号 8)
5 ' - T領域（CGTCTTTCACTTTTGAACCAT) -3 ' - Amino link
4
[0088] 〈反応及び検出方法〉
(1)第 1ハイブリダィゼーシヨン
前記調製したストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレートに前記調製した溶 菌液 (菌濃度： 1 X 105CFU/mL)をそれぞれ 50 レ第 1ハイブリダィゼーシヨン' プローブ溶液を 50 μ Lずつ分注し、プレートシ一ラーでしっかりとシールし、 45°Cで 1 時間反応させた。図 12はこの反応工程の概略説明図である。また、対照として、溶菌 液の代わりに生理食塩水を用いて同様に反応を行った。
反応後、プレートウォッシャーを用いて洗浄液で洗浄した。
[0089] (2)第 2ハイブリダィゼーシヨン (HCPによる自己集合体又はハイブリッド形成反応） 洗浄後、洗浄液をよくきった 96ウェルマイク口プレートへ第 2ハイブリダィゼーシヨン •HCP溶液を 50 μ L又は 100 μ Lずつ分注し、プレートシ一ラーでしっかりとシール した。
実施例 2、即ち実施例 2—1及び実施例 2— 2では、前記マイクロプレートのストリツ プゥエルのうち半分を「CZH」条件により 50°C又は 55°Cで 1時間反応させた。なお、 rC/Hj条件は冷却手段として保冷剤を用い且つ恒温槽の設定温度を変更した以 外は実施例 1と同様に行った。
[0090] 比較例 2、即ち比較例 2— 1及び比較例 2— 2では、前記ストリップゥエルの残りを「 H/H」条件により 50°C又は 55°Cで 1時間反応させた。なお、「HZH」条件はインキ ュベータ一の代わりにマイクロプレートヒーター（DIGENE製）を用い且つ設定温度 を変更した以外は比較例 1と同様に行った。
[0091] (3)検出
実施例 1と同様の方法により吸光度を測定した。結果を表 3及び表 4に示す。なお、 表 3及び表 4中に示した各吸光度の数値は、測定された数値から溶菌液の代わりに 生理食塩水を用いた対照実験の測定数値を差し引いた数値である。
[0092] [表 3] 第 2ハイブリダイゼーションの反応温度 50°Cでの吸光度
[0093] [表 4]
Figure imgf000029_0001
[0094] 表 3及び表 4に示したように、 CZH条件下の実施例 2においては、 1HCPを用いた 実施例 2— 2よりも 2HCPを用いた実施例 2—1の測定値が高ぐ HZH条件下の比 較例 2における 2HCPを用いた比較例 2— 1と比較しても高 、測定値であった。また、 1HCPについて、 CZH条件下の実施例 2— 2では反応液量を 50 μ L力ら 100 μ L へ増やすと測定値が高くなるが、 ΗΖΗ条件下の比較例 2— 2では反応液量をかえ ても差がみられな力つた。これらの結果より、 CZHにおいて溶液中の反応温度がより 段階的に作成され、ターゲット遺伝子上で HCPによる自己集合体が形成され易くな ると同時に、 PALSAR法ではない通常の一本鎖のハイブリダィゼーシヨンの効率も 高くなることが確認された。
[0095] (実施例 3及び比較例 3)
部分的な反応温度領域を適用する第 2ハイブリダィゼーシヨンの反応液量をかえて 、一本鎖のプローブのハイブリダィゼーシヨン効率及び HCPによる自己集合体の形 成効率への効果を確認した。実施例 3の概略説明図を図 13に示す。
[0096] 〈各溶液の調製〉
(1)第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液— 1の調製
0. 2mLマイクロチューブに実施例 1記載のアシストプローブ 1 (lOOpmolZ μ L) 及びアシストプローブ—2 (lOOpmolZ μ L)を各 10 μ L、ハイブリダィゼーシヨン溶 液ー2を 80 /z Lカ卩え、ミキサーでよく混和して 80°Cで 30秒加熱した後、直ちに氷冷し プローブ混液とした。
このプローブ混液を、冷却したハイブリダィゼーシヨン溶液 2を 3. 9mL分注した 1 5mLコ-カルチューブに加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲット rRNAとのハ イブリダィゼーシヨンに使用する第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液 1 (各プ ローブの終濃度： 0. 25pmolZ L)とした。
[0097] (2)第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液 2の調製
0. 2mLマイクロチューブに実施例 1記載のプローブ A (lOOpmolZ β L)を 10 μ L 、ハイブリダィゼーシヨン溶液 2を 90 /z L加え、ミキサーでよく混和して 80°Cで 30秒 加熱した後、直ちに氷冷しプローブ混液とした。
このプローブ混液を、冷却したハイブリダィゼーシヨン溶液 2を 1. 9mL分注した 1 5mLコ-カルチューブに加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲット rRNAとキヤプ チヤ一プローブのハイブリダィゼーシヨンに使用する第 1ハイブリダィゼーシヨン ·プロ ーブ溶液一 2 (プローブの終濃度： 0. 25pmol/ μ L)とした。
[0098] (3)第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液の調製
0. 2mLマイクロチューブに、実験例 1記載の HCP— l (lOOpmolZ w L)及び HC P— 2 (lOOpmolZ μ L)を各 40 μ L、ハイブリダィゼーシヨン溶液— 1を 20 μ Lカロえ、 ミキサーでよく混和して 80°Cで 30秒加熱した後、直ちに氷冷し HCP混液とした。 この HCP混液を、ハイブリダィゼーシヨン溶液 1を 1. 9mL分注した 15mLコ-カ ルチューブへ加え、ミキサーでよく混和し第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液 (各 プローブの終濃度： 2pmolZ μ L)とし、実施例 3— 1及び比較例 3— 1で用いた。 また、実施例 3— 2及び比較例 3 - 2で用いる第 2ハイブリダィゼーシヨン' HCP溶液 として、 HCP— 1のかわりに滅菌蒸留水を 40 /z L使用し、同様に溶液を調製した。
[0099] 〈反応及び検出方法〉
(1)第 1ハイブリダィゼーシヨン
実施例 1記載のストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレートに、第 1ハイブリダ ィゼーシヨン'プローブ溶液 2を 50 μ L加え、プレートシ一ラーでしっかりとシールし 、 45°Cで 1時間反応させた。図 13の（c)及び (d)はこの反応工程の概略説明図であ る。
反応後、プレートウォッシャーを用いて洗浄液で洗浄した。
[0100] 同時に、 1. 5mLマイクロチューブに、前述した方法により 5 X 104CFUZmLに調 製された溶菌液又は生理食塩水 (対照）を 500 μ L、第 1ハイブリダィゼーシヨン'プロ ーブ溶液— 1を 500 Lカ卩え、ミキサーでよく混和し、 45°Cで 1時間反応させた。図 1 3の（a)及び (b)はこの反応工程の概略説明図である。
この反応液を前記第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液— 2による反応後のマ イク口プレートに 100 Lずつ分注し、プレートシ一ラーでしっかりとシールし、更に 4 5°Cで 1時間反応させた。図 13の (b)、（d)及び (e)はこの反応工程の概略説明図で ある。
反応後、プレートウォッシャーを用いて洗浄液で洗浄した。
[0101] (2)第 2ハイブリダィゼーシヨン (HCPによる自己集合体又はハイブリッド形成反応） 前記洗浄後、洗浄液をよくきった 96ウェルマイク口プレートへ第 2ハイブリダィゼー シヨン 'HCP溶液を 50 μ L又は 100 μ Lずつ分注し、プレートシ一ラーでしっかりとシ ールした。
[0102] 実施例 3、即ち実施例 3— 1及び実施例 3— 2では、前記マイクロプレートのストリツ プゥエルのうち半分を使用し、「CZH」条件により反応させた。実施例 3における「C
ZH」条件は下記の通りである。
ストリップゥエルを 4°Cの保冷庫で 30分間冷却した後、冷却したストリップゥエルをマ イク口プレートヒーター（DIGENE製）に設置し、マイクロプレートの上に予め 4°Cの保 冷庫で冷却したアルミブロックを載せ、その上に冷却手段 (ストラタクーラーの蓋、 STRATAGENE製）を載せ、マイクロプレートヒーターを 55°Cに設定して 1時間反応さ せた。
[0103] 比較例 3、即ち比較例 3— 1及び比較例 3— 2では、前記ストリップゥエルの残りを「 HZH」条件により 55°Cで 1時間反応させた。なお、「HZH」条件は設定温度を変更 した以外は比較例 2と同様に行った。
なお、実施例 3及び比較例 3では、ストリップゥエルとの密着性を高める為、反応前 に!、ずれのブロック上にもミネラルオイルを滴下してお!、た。
[0104] (3)検出
実施例 1と同様の方法により吸光度を測定した。結果を表 5に示す。なお、表 5中に 示した各吸光度の数値は、測定された数値から溶菌液の代わりに生理食塩水を用い た対照実験の測定数値を差し引いた数値である。
[0105] [表 5]
Figure imgf000032_0001
[0106] 表 5に示したように、 1HCP、 2HCPのいずれにおいても、 CZHの方が HZHより も測定値が高ぐ反応液量を 50 Lから 100 Lへ増やすと、通常のハイブリダィゼ ーシヨンである 1HCPについて特に CZHの測定値が高くなつた。これらの結果より、 CZHにおいて溶液中の反応温度がより段階的に作成され、ターゲット遺伝子上で H CP〖こよる自己集合体が形成され易くなると同時に、 PALSAR法ではない通常の一 本鎖のハイブリダィゼーシヨンの効率も高くなることが確認された。
[0107] (実施例 4及び比較例 4)
実施例 4は、標識オリゴヌクレオチド DNAを用いて、均一な反応温度溶液を対照（ 比較例 4)とし、反応溶液中に部分的な反応温度領域を作成した場合のターゲット遺 伝子の検出効率を比較した。
[0108] 〈各溶液の調製方法〉
(1)ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液 Aの調製
ハイブリダィゼーシヨン溶液—2[4XSSC、 0.2%SDS、 l%Blocking reagent (Roche製）、 20%ホルムアミド、 Salmon sperm DNA(10 μ g/mL)]に下記プローブ Bを 0. 025pmol / Lになるように溶解し、これをノヽイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液一 Aとした。 プローブ B (図 14の符号 57)の塩基配列（配列番号 9)
5，- K領域（CGACGACGACGACGACGACG) ·Τ領域（ AAATCGACAGCGTTTACAGCG) -3'
[0109] (2)ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液 Bの調製
前記ノ、イブリダィゼーシヨン溶液ー2に 5'末端が DIGラベルされた下記プローブ C を 0. O25pmol/ Lになるように溶解し、これをハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶 液 Bとした。
プローブ C (図 14の符号 59)の塩基配列（配列番号 10) (5 '末端ジゴキシゲニン標 識）
DIG- 5し T領域 (TTATCACGTTAGCTACGGGCGC) - 3'
6
[0110] (3)溶菌液の調製
チョコレート寒天培地で 18時間培養したインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae )を生理食塩水に懸濁させたものを培養菌原液とした。これを菌濃度 1 X 107CFU/ mLになるように生理食塩水で希釈し、アルカリ— SDS法 (非特許文献 5)に従って溶 菌させ、これを溶菌液とした。菌数については、培養菌原液の希釈系列を作成して、 チョコレート寒天培地で培養して得られた生菌数力 所定の菌数を算出した。なお、 溶菌液のかわりに生理食塩水を用いて同様に反応させたものを対照とした。
[0111] 〈マイクロプレートの調製〉
インフルエンザ菌の rRNAに相補的な配列を有する下記キヤプチヤープローブ 3 を各々ストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレート上に固定し、実施例 4及び 比較例 4で用いた。
キヤプチヤープローブ 3 (図 14の符号 58)の塩基配列（配列番号 11) 5し T領域（CAGAGTTAAACCCCAACCCCC) ·Κ '領域（
7 1
CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG) - 3し Amino link
[0112] 〈反応及び検出方法〉
(1)ハイブリダィゼーシヨン反応
前記調製したストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレートにハイブリダィゼー シヨン'プローブ溶液 Aを 50 L分注し、マイクロプレートを 45°Cに設定した条件下 で 1時間反応させた。図 14 (a)はこの反応工程の概略説明図である。
反応後、洗浄液（50mM- Tris, 0.3M- NaCl,0.01%- TritonX- 100,pH7.6)で洗浄した [0113] 洗浄後、洗浄液をよくきった 96ウェルマイク口プレートへ前記調製した溶菌液を 50 μ L、ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液 Bを 50 μ Lずつ分注し、プレートシーラ 一でしっかりとシールした。なお菌数は 4 Χ 105CFU/wellであった。
実施例 4は、前記マイクロプレートの下部を 45°C、上部を電気的に 20°Cに制御した 条件下で 1時間反応させた。図 14 (b)はこの反応工程の概略説明図である。反応後 、洗浄液で洗浄した。
一方、比較例 4はマイクロプレートを 45°Cに設定した条件で同様の反応及び洗浄 を行った。
[0114] (2)検出
マイクロプレートウエルを洗浄後、 50mM-Tris(pH7.6)に溶解した POD標識抗ジゴキ シゲニン（60mU/mL)を 50 /z L加え、 37°Cのインキュベーターで反応させた。洗浄液 で洗浄後、 0. 2M酢酸緩衝液 (pH5.0)、 0.06%TMB及び 0.04%H 0を含む発色液を 5
2 2
カロえ、暗所で 15分間放置し、 655nmの吸光度を測定した。結果を表 6及び図 15に示す。
[0115] [表 6]
Figure imgf000034_0001
表 6及び図 15に示した如ぐ下部を 45°C、上部を電気的に 20°Cに制御した実施例 4は、比較例 4よりも測定値が高ぐ感度が向上した。この結果より、 HCPの自己集合 反応によるシグナル増幅においてのみならず、標識オリゴ DNAを用 V、た場合の検出 にお 、ても感度が向上して 、ることが確認できた。

Claims

請求の範囲
[1] 反応溶液中でのオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダィゼーシヨン方法であって、 反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成し、当該反応温度領域においてハイブ リダィゼーシヨン反応を行わせることを特徴とするハイブリダィゼーシヨン方法。
[2] 前記ノ、イブリダィゼーシヨン反応力 互いにハイブリダィズ可能な相補的塩基配列 領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブを用いてハイブリダィゼーシヨンさ せることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる 自己集合反応であることを特徴とする請求項 1記載のハイブリダィゼーシヨン方法。
[3] 前記複数種のオリゴヌクレオチド ·プローブが、 5 '端側力 順に少なくとも核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式 (1)の構造を有する、 3箇所 以上の核酸領域力 なる第 1プローブと、 5'端側から順に少なくとも核酸領域 X'、核 酸領域 Y'及び核酸領域 Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有する、 3箇所以 上の核酸領域力 なる第 2プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブで あることを特徴とする請求項 2記載のハイブリダィゼーシヨン方法。
[化 1]
X Y Z
[化 2]
Ζ' Y， X，
(前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Υと Υ，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィ ズ可能な相補的核酸領域である。 )
[4] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブが、
No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域、 中央領域、及び 5'側領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を 互！ヽに相補的な塩基配列とし、 3 '側領域及び 5 '側領域を互!、に非相補的な塩基配 列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第 1番目の系から第（2n— 1)番目 (n≥ 1)の系まで順番に n個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域及 び 5 '側領域の 2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの 3 '側領域及び 5 '側領域を 互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第 2番目 の系から第 2n番目の系まで順番に n個形成された架橋プローブ含有系とを有し、 該架橋プローブの塩基配列が、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを 架橋することが可能な塩基配列であることを特徴とする請求項 2記載のハイブリダィ ゼーシヨン方法。
[5] 前記 n= lであり、前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 5'側領域、
第 2の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 2の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 5'側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 4記載のノ、イブリダィゼ ーシヨン方法。
[6] 前記 n= lであり、前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレ ォチドの 5'側領域、
第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 3'側領域、
第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレ ォチドの 5'側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 4記載のノ、イブリダィゼ ーシヨン方法。
[7] 前記 n≥ 2であり、前記プローブの塩基配列を、
第（2n— 3)番目の系の No . 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 3)番目の系の No . 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1番目の系の
No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 4記載のノ、イブリダィゼ ーシヨン方法。
[8] 前記 n≥ 2であり、前記プローブの塩基配列を、
第（2n— 3)番目の系の No . 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 3)番目の系の No . 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（ 2n— 2)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
第（2n— 2)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（2n— 1)番目の 系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と架 橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1番目の系の
No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 4記載のノ、イブリダィゼ ーシヨン方法。
前記複数種のオリゴヌクレオチド ·プローブが、
No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域、 中央領域、及び 5 '側領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を 互いに相補的な塩基配列とし、 3 '側領域、及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基 配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第 1番目の系から第 k番目（k ≥ 2)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第 (k— 1)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 k番目の系の N o. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
(b)第 (k— 1)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 k番目の系の N o. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
(c)最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2 オリゴヌ クレオチドの 3，側領域、
(d)最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 1 オリゴヌ クレオチドの 5，側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第 1の系から第 k番目の 系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブであることを特徴とする請求項 2 記載のハイブリダィゼーシヨン方法。
[10] 前記複数種のオリゴヌクレオチド ·プローブが、
No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域、 中央領域、及び 5'側領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を 互いに相補的な塩基配列とし、 3'側領域、及び 5'側領域を互いに非相補的な塩基 配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第 1番目の系から第 k番目（k ≥ 2)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第 (k— 1)番目の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 k番目の系の N o. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域、
(b)第 (k— 1)番目の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 k番目の系の N o. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域、
(c)最後の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌ クレオチドの 3，側領域、
(d)最後の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌ クレオチドの 5，側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第 1の系から第 k番目の 系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブであることを特徴とする請求項 2 記載のハイブリダィゼーシヨン方法。
[11] 前記オリゴヌクレオチド力 DNA、 RNA、 PNA及び LNAからなる群から選択され た少なくとも 1種のヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項 1〜： L0のいず れカ 1項記載のハイブリダィゼーシヨン方法。
[12] 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも 1つが、標識物質で標識されていることを特徴と する請求項 1〜11の 、ずれ力 1項項記載のハイブリダィゼーシヨン方法。
[13] 前記標識物質が、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、発色系酵素 又は発光系酵素であることを特徴とする請求項 12記載のハイブリダィゼーシヨン方法 [14] 互いにハイブリダィズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオ チド.プローブを用いてハイブリダィゼーシヨンさせることにより、オリゴヌクレオチドが 自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用して、遺伝子を 検出するための反応機材におけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させるシグナ ル増幅方法であって、該自己集合反応が請求項 2〜： LOのいずれか 1項記載のハイ ブリダィゼーシヨン方法を用いて行われることを特徴とするシグナル増幅方法。
[15] 前記反応機材が、マイクロプレート、 DNAマイクロアレイ又は磁性体粒子であること を特徴とする請求項 14記載のシグナル増幅方法。
[16] 前記ターゲット遺伝子が一本鎖の DNA及び Z又は RNAであることを特徴とする請 求項 14又は 15記載のシグナル増幅方法。
[17] 前記ターゲット遺伝子が二本鎖の DNA及び Z又は RNAであることを特徴とする請 求項 14又は 15記載のシグナル増幅方法。
[18] 前記ターゲット遺伝子が SNPs (—塩基多形)を含むことを特徴とする請求項 14〜1
7の 、ずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
[19] 前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも 1つが前記タ 一ゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項 14〜18のい ずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
[20] 前記ターゲット遺伝子と前記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配 列と前記オリゴヌクレオチド 'プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領 域を持つアシストプローブを用いることを特徴とする請求項 14〜19のいずれ力 1項 記載のシグナル増幅方法。
[21] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブ力 DNA、 RNA、 PNA及び LNAからなる群から 選択された少なくとも 1種のヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項 14〜
20の!、ずれ力 1項記載のシグナル増幅方法。
[22] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも 1つが、標識物質で標識されているこ とを特徴とする請求項 14〜21のいず力 1項記載のシグナル増幅方法。
[23] 前記標識物質が、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、発色系酵素 又は発光系酵素であることを特徴とする請求項 22記載のシグナル増幅方法。
[24] 前記ターゲット遺伝子に結合した自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダ ィゼーシヨンさせて前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項 14〜
21の!、ずれ力 1項記載のシグナル増幅方法。
[25] 前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識し た標識プローブであることを特徴とする請求項 24記載のシグナル増幅方法。
[26] 前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍 光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする 請求項 14〜21のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
[27] 請求項 14〜26の 、ずれか 1項記載のシグナル増幅方法を用いたターゲット遺伝 子の検出方法。
[28] 反応溶液中でのオリゴヌクレオチドのハイブリダィゼーシヨン反応を利用して、遺伝 子を検出するターゲット遺伝子の検出方法であって、該ハイブリダィゼーシヨン反応 が請求項 1〜13のいずれか 1項記載のハイブリダィゼーシヨン方法を用いて行われる ノ、イブリダィゼーシヨン反応を含むことを特徴とするターゲット遺伝子の検出方法。
[29] 前記遺伝子を検出するための反応機材力 マイクロプレート、 DNAマイクロアレイ 又は磁性体粒子であることを特徴とする請求項 28記載のターゲット遺伝子の検出方 法。
[30] 前記ノ、イブリダィゼーシヨン反応に用いるオリゴヌクレオチドの少なくとも 1つが前記 ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項 28又は 29 記載のターゲット遺伝子の検出方法。
[31] 前記ターゲット遺伝子が一本鎖の DNA及び Z又は RNAであることを特徴とする請 求項 28〜30のいずれか 1項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
[32] 前記ターゲット遺伝子が二本鎖の DNA及び Z又は RNAであることを特徴とする請 求項 28〜30のいずれか 1項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
[33] 前記ターゲット遺伝子が SNPs (—塩基多形)を含むことを特徴とする請求項 28〜3
2のいずれか 1項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
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